TW202026314A - 用於親和毛細管電泳之系統及方法 - Google Patents

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大衛 約翰 費雪
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Abstract

目前揭示之標的物係關於在多肽之複合混合物中篩選一或多種多肽物質、例如多亞單位蛋白質之組合物、系統及方法。舉例而言，該標的物係關於結合親和毛細管電泳使用之配位體以及用於偵測包括多特異性抗體、例如雙特異性抗體之多聚體混合物中之多肽的方法及系統。

Description

用於親和毛細管電泳之系統及方法
目前揭示之標的物係關於在多肽之複合混合物中篩選一或多種多肽物質之組合物、系統及方法。具體而言，本文所揭示之標的物係關於結合親和毛細管電泳使用之配位體以及用於偵測包括多特異性抗體(例如雙特異性抗體)之多聚體混合物中之多肽的方法及系統。
近年來，雙特異性抗體(BsAb)因其識別兩種不同抗原靶之獨特能力而引起了廣泛的治療興趣。儘管人們對BsAb之治療用途很感興趣，但其商業化生產一直很有挑戰性，此乃因習用生產方法會產生不期望之副產物且需要複雜的純化過程。舉例而言，某些BsAb已經由隆凸於孔洞技術產生，由此在重鏈之CH3結構域中產生互補突變，形成「隆凸」及「孔洞」結構。與可能依賴於相同重鏈/輕鏈亞單位之二聚化之習用抗體之生產不同，當使用隆凸於孔洞技術時，大的胺基酸側鏈引入一個重鏈之CH3結構域中，並且彼等側鏈適合於另一重鏈之CH3結構域中經適當設計之空腔。可以觀察到鏈錯配(例如，相同重鏈肽之同二聚化或不適當之重鏈/輕鏈締合)，導致一組獨特之產物相關雜質，包括隆凸-隆凸及孔洞-孔洞同二聚體(HD)物質。該等同二聚體變異體很難量化，此乃因其可以低水準存在，並且具有與預期BsAb產物及其他BsAb分子變異體高度相似之物理化學特徵。
因此，仍然需要自不合意蛋白質產物中純化及量化靶BsAb之系統及技術。
目前揭示之標的物係關於在多肽之複合混合物中篩選一或多種多肽物質之組合物、系統及方法。具體而言，本文所揭示之標的物係關於結合親和毛細管電泳使用之配位體以及用於偵測包括多特異性抗體(例如雙特異性抗體)之多聚體混合物中之多肽之方法及系統。
在某些實施例中，本揭示案係關於用於分離樣品中之多亞單位蛋白質之系統，該系統包括：a)配位體，b)背景電解質緩衝液，c)樣品，d)毛細管，e)在毛細管一端或附近之陽極，及f)在毛細管另一端或附近之陰極，其中將樣品與配位體混合以形成至少一種配位體-蛋白質複合物且在毛細管之陽極端加載至毛細管中，且其中毛細管填充有與配位體混合之背景電解質緩衝液。
在某些實施例中，本揭示案之系統進一步包括位於毛細管之陰極端附近之偵測器，其中偵測器偵測210 nm至220 nm吸光度或雷射誘導之螢光。
在某些實施例中，本揭示案之系統包括樣品，其中樣品包含至少一種同二聚體、至少一種異二聚體或其組合。在某些實施例中，本揭示案之系統包括第一配位體-蛋白質複合物，該第一配位體-蛋白質複合物在配位體結合至至少一種異二聚體之第一亞單位且不與至少一種異二聚體之第二亞單位結合時形成。在某些實施例中，本揭示案之系統包括第二配位體-蛋白質複合物，該第二配位體-蛋白質複合物在配位體結合至同二聚體之至少兩個相同的第一或第二亞單位時形成。在某些實施例中，至少一種配位體-蛋白質複合物經構形以在配位體結合至多亞單位蛋白質之亞單位時具有螢光(或以其他方式可偵測)標記或改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合。在某些實施例中，第二配位體-蛋白質複合物具有低於第一配位體-蛋白質複合物之電泳遷移率。
在某些實施例中，本揭示案之系統包括配位體，其中配位體為多肽或多肽片段。在某些實施例中，配位體為螢光標記之多肽或螢光標記之多肽片段。在某些實施例中，配位體係選自由以下組成之群：人類CD3多肽、小鼠CD3多肽、大鼠CD3多肽、兔CD3多肽及食蟹猴CD3多肽。在某些實施例中，配位體藉由將一或多個胺基酸添加至配位體之非結合區來修飾。在某些實施例中，一或多個胺基酸係選自由麩胺酸、天冬胺酸及其組合組成之群。在某些實施例中，添加的一或多個胺基酸經構形以改變配位體之電荷及質量。
在某些實施例中，本揭示案之系統包括樣品，其中將樣品進一步與配位體於低pH尿素緩衝液中混合。在某些實施例中，本揭示案係關於方法，其進一步包括將高pH HEPES緩衝液及0.1% PS20與樣品及配位體之混合物混合。在某些實施例中，本揭示案之系統包括背景電解質緩衝液，其中背景電解質緩衝液包含胺基-正己酸(EACA)、三伸乙基四胺(TETA)及羥丙基甲基纖維素(HPMC)。在某些實施例中，背景電解質緩衝液包含結合至上述方法之至少一種異二聚體之第一亞單位且不與至少一種異二聚體之第二亞單位結合的配位體。
在某些實施例中，本揭示案係關於用於分離樣品中之多亞單位蛋白質之方法，其包括以下步驟：(a)產生樣品及配位體之混合物以形成至少一種配位體-蛋白質複合物，(b)將混合物施加至毛細管，其中毛細管填充有與配位體混合之背景電解質緩衝液，(c)在毛細管兩端施加電壓，及(d)使多亞單位蛋白質及至少一種配位體-蛋白質複合物移動穿過毛細管，其中配位體-蛋白質複合物經構形以在配位體結合至多亞單位蛋白質之亞單位時具有螢光(或以其他方式可偵測)標記、改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合，從而使樣品中之多亞單位蛋白質分離。
在某些實施例中，本揭示案係關於用於分離樣品混合物中之靶蛋白之方法，其包括以下步驟：(a)產生樣品及配位體之混合物以形成至少一種配位體-蛋白質複合物，(b)將混合物施加至毛細管，其中毛細管填充有與配位體混合之背景電解質緩衝液，(c)在毛細管兩端施加電壓，(d)使多亞單位蛋白質及至少一種配位體-蛋白質複合物移動穿過毛細管，其中配位體-蛋白質複合物經構形以在配位體結合至多亞單位蛋白質之亞單位時具有螢光(或以其他方式可偵測)標記、改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合，及(e)分離靶蛋白，該靶蛋白與非靶蛋白分開。
在某些實施例中，本揭示案係關於使用毛細管之方法，其中毛細管包括陰極端、陽極端及偵測器。在某些實施例中，毛細管之內徑為約50 µm。在某些實施例中，毛細管與偵測器之距離為約20 cm。在某些實施例中，毛細管之總長度為約30 cm。在某些實施例中，偵測器在毛細管之陰極端附近且偵測210 nm至220 nm吸光度或雷射誘導之螢光。在某些實施例中，電壓為30千伏。
在某些實施例中，本揭示案係關於使用樣品之方法，其中樣品包含至少一種同二聚體、至少一種異二聚體或其組合，其中至少一種異二聚體包含第一亞單位及第二亞單位，且至少一種同二聚體包含至少兩個相同的第一或第二亞單位。在某些實施例中，至少一種異二聚體包含雙特異性抗體。在某些實施例中，至少一種同二聚體包含單株抗體。
在某些實施例中，本揭示案係關於使用配位體之方法，其中配位體為肽或肽片段。在某些實施例中，配位體為螢光標記之肽或螢光標記之肽片段。在某些實施例中，配位體係選自由以下組成之群：人類CD3肽、小鼠CD3肽、大鼠CD3肽、兔CD3肽及食蟹猴CD3肽。在某些實施例中，配位體經構形以藉由將一或多個胺基酸添加至配位體之非結合區來修飾。在某些實施例中，一或多個胺基酸係選自由麩胺酸、天冬胺酸及其組合組成之群。在某些實施例中，添加的一或多個胺基酸經構形以改變配位體之電荷及質量。
在某些實施例中，本揭示案係關於方法，其中第一配位體-蛋白質複合物在配位體結合至至少一種異二聚體之第一亞單位且不與至少一種異二聚體之第二亞單位結合時形成。在某些實施例中，本揭示案係關於方法，其中第二配位體-蛋白質複合物在配位體結合至同二聚體之至少兩個相同的第一或第二亞單位時形成。
在某些實施例中，本揭示案係關於方法，其進一步包括將低pH尿素緩衝液與樣品及配位體之混合物混合。在某些實施例中，本揭示案係關於方法，其進一步包括將高pH HEPES緩衝液及0.1% PS20與樣品及配位體之混合物混合。在某些實施例中，本揭示案係關於方法，其中背景電解質緩衝液包含胺基-正己酸(EACA)、三伸乙基四胺(TETA)及羥丙基甲基纖維素(HPMC)。在某些實施例中，背景電解質緩衝液包含結合至上述方法之至少一種異二聚體之第一亞單位且不與至少一種異二聚體之第二亞單位結合的配位體。
在某些實施例中，本揭示案係關於方法，其進一步包括量化樣品中靶蛋白之量。
相關申請案的交叉參考
本申請案主張於2018年9月10日提出申請之美國臨時專利申請案第62/729,384號之優先權，該申請案之內容之全文皆以引用方式併入本文中。
本揭示案之標的物係關於用於在多肽之複合混合物中篩選一或多種多肽物質之組合物、系統及方法。舉例而言而非以限制方式，本文所揭示之標的物適用於親和毛細管電泳(ACE)之方法以偵測多聚體混合物中之靶抗體，包括例如多特異性抗體，例如雙特異性抗體。本揭示案之標的物亦係關於用於偵測及分離該等靶抗體之配位體及電泳系統。本文揭示之所揭示電泳方法可單獨使用或可進一步與本領域已知之習用純化製程及單元操作組合使用，以達成特定雙特異性抗體純度，例如用於治療及/或診斷應用。
出於揭示清楚而非限制之目的，將詳細描述分成以下子部分： 1.    定義 2.    用於分離及量化靶多亞單位蛋白質之配位體 3.    用於分離及量化靶多亞單位蛋白質之系統 4.    用於分離及量化靶多亞單位蛋白質之方法 1. 定義
除非另有指示，否則本揭示案之實踐將採用本領域技術範圍內之分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學及生物化學之習用技術。該等技術充分解釋於例如以下等文獻中：「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」，第2版(Sambrook等人，1989)；「Oligonucleotide Synthesis」 (M.J. Gait編輯，1984)；「Animal Cell Culture」 (R.I. Freshney編輯，1987)；「Methods in Enzymology」 (Academic Press, Inc.)；「Handbook of Experimental Immunology」，第4版(D.M. Weir及C.C. Blackwell編輯，Blackwell Science Inc., 1987)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」 (J.M. Miller及M.P. Calos編輯，1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」 (F.M. Ausubel等人編輯，1987)；及「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullis等人編輯，1994)。
除非另有定義，否則本文使用之所有技術術語、符號及其他科學術語意欲具有本揭示案所屬領域之技術人員通常理解之含義。在一些情況下，為了清楚及/或便於參考起見，本文中定義了具有通常理解之含義之術語，並且在本文中包括該等定義不一定應理解為與本領域中通常理解之內容有實質性差異。適當時，除非另外註明，否則涉及使用市售套組及試劑之程序通常根據製造商定義之方案及/或參數來實施。因此，在闡述本方法、套組及用途之前應理解，本揭示案之標的物並不限於如此闡述之特定方法、方案、細胞株、動物物種或屬、構築物及試劑當然可以變化。亦應理解，本文使用之術語僅用於闡述特定實施例之目的，且不欲限制本揭示案之範圍，本揭示案之範圍僅由所附申請專利範圍限定。
除非上下文另有明確指示，否則如本文及所附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a、an)」及「該」包括複數個指代物。
如本文所用之術語「約」或「大約」可意指在由熟習此項技術者確定之特定值之可接受誤差範圍內，其將部分取決於量測或確定該值之方式，例如量測系統之限制。舉例而言，「約」可意指在給定值之實踐中，1個或1個以上之標準偏差。在申請及申請專利範圍中闡述特定值之情況下，除非另有說明，否則術語「約」可意指特定值之可接受誤差範圍，例如由術語「約」修飾之值之±10%。
術語「親和力」係指分子(例如抗體)之單個結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間非共價相互作用之總和之強度。除非另有指示，否則如本文所用之「結合親和力」係指反映結合對成員(例如抗體及抗原)之間之1:1相互作用之固有結合親和力，但在某些情況下，相互作用可能涉及不同的相互作用比率，例如在aCD3同二聚體之情況下，相互作用可能為2:1，此乃因兩種抗原結合每個aCD3同二聚體。分子X對其配偶體Y之親和力通常可藉由解離常數(Kd )來表示。親和力可藉由本領域已知之常用方法來量測，包括本文所述之方法。下文闡述用於量測結合親和力之具體說明性及例示性實施例。
術語「抗體」在本文中以最廣泛之意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望抗原結合活性即可；以及去免疫抗體、嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體及/或衍生自任何合適動物來源(例如衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、山羊、綿羊、狗、馬、牛、猴、猿及/或雞)之抗體、免疫結合物、合成抗體、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段、二硫鍵連接之Fv (sdFv)、內抗體及上述任一者之決定基結合片段。
「抗體片段」係指除完整抗體外之分子、該分子包含與完整抗體所結合之抗原結合之完整抗體之一部分。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2 ；雙鏈抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
「結合相關抗原之抗體」為以足夠親和力結合該抗原之抗體，使得該抗體可用作分析試劑，例如用作捕獲抗體或偵測抗體。通常，該抗體不會與其他多肽發生顯著之交叉反應。關於多肽與靶分子之結合，術語「特異性結合」或「特異性結合至」或「特異性針對」特定多肽或特定多肽靶上之決定基意指與非特異性相互作用明顯不同之結合。特異性結合可藉由例如與對照分子之結合相比確定靶分子之結合來量測，該對照分子通常為不具結合活性但具有相似結構之分子。
術語「抗CD20抗體」係指能夠以足夠之親和力結合CD20、使得該抗體可用作靶向CD20之劑、例如用作本文所述分析中之劑的抗體。在某些實施例中，抗CD20抗體與不相關之非CD20蛋白之結合程度為抗體與CD20結合之約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合至CD20之抗體之解離常數(Kd )為≤ 1 M、≤ 100 mM、≤ 10 mM、≤ 1 mM、≤ 100 μM、≤ 10 μM、≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM。在某些實施例中，本文所揭示結合至CD20之抗體之Kd 可為10-3 M或更小或10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M。在某些實施例中，本文所揭示結合至CD20之抗體之Kd 可為10-10 M至10-13 M。在某些實施例中，抗CD20抗體結合至CD20之決定基，該決定基在來自不同物種之CD20中係保守的。
術語「抗CD3抗體」係指能夠以足夠之親和力結合CD3、使得該抗體可用作靶向CD3之劑、例如用作本文所述分析中之劑的抗體。在某些實施例中，抗CD3抗體與不相關之非CD3蛋白之結合程度為抗體與CD3結合之約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合至CD3之抗體之解離常數(Kd )為≤ 1 M、≤ 100 mM、≤ 10 mM、≤ 1 mM、≤ 100 μM、≤ 10 μM、≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM。在某些實施例中，本文所揭示結合至CD3之抗體之Kd 可為10-3 M或更小或10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M。在某些實施例中，本文所揭示結合至CD3之抗體之Kd 可為10-10 M至10-13 M。在某些實施例中，抗CD3抗體結合至CD3之決定基，該決定基在來自不同物種之CD3中係保守的。
「結合結構域」意指化合物或分子之特異性結合至靶決定基、抗原、配位體或受體之部分。結合結構域包括(但不限於)抗體(例如單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類化抗體及嵌合抗體)、抗體片段或其部分(例如Fab片段、Fab′2、scFv抗體、SMIP、結構域抗體、雙鏈抗體、微抗體、scFv-Fc、親和抗體、奈米抗體及抗體之VH及/或VL結構域)、受體、配位體、適配體及具有所鑑別結合配偶體之其他分子。
術語「嵌合」抗體係指其中重鏈及/或輕鏈之一部分衍生自特定來源或物種、而重鏈及/或輕鏈之剩餘部分來自不同來源或物種之抗體。
如本文所用之術語「分化簇3」或「CD3」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然CD3，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及囓齒類動物(例如小鼠及大鼠)，除非另有指示，否則該天然CD3包括例如CD3ε鏈、CD3γ鏈、CD3α鏈及CD3β鏈。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。抗體有五大類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中幾類可進一步分為子類(同種型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
貫穿本說明書及申請專利範圍，詞語「包括(comprise)」或變化形式(例如「包括(comprises或comprising)」)應理解為暗示包含所述整數或整數群，但不排除任何其他整數或整數群。
術語「相關聯(correlate或correlating)」係指以任何方式將第一分析或方案之效能及/或結果與第二分析或方案之效能及/或結果進行比較。例如，可使用第一分析或方案之結果來實施第二方案，及/或可使用第一分析或方案之結果來確定是否應實施第二分析或方案。關於基因表現分析或方案之實施例，可使用基因表現分析或方案之結果來確定是否應實施特定之治療方案。
如本文所用之術語「偵測」包括靶分子(例如CD20或其經處理形式)之定性及定量量測。在某些實施例中，偵測包括鑑別樣品中靶分子之存在，以及確定靶分子是否以可偵測之水準存在於樣品中。
如本文所用之術語「偵測方法」係指用於經由信號報告、然後在分析中讀出該信號報告來偵測可偵測抗體之存在之部分或技術。通常，偵測方法採用試劑，例如偵測劑，其擴增經固定標記，例如捕獲至微量滴定板上之標記，例如抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白-HRP或鏈黴抗生物素蛋白-β-D-吡喃半乳糖。
本文之術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C末端區域，該C末端區域含有恆定區之至少一部分。該術語包括天然序列Fc區及變異Fc區。在某些實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非本文另有說明，否則Fc區或恆定區胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU指數，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。
「框架」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基以外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常由四個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，在VH (或VL)中，HVR及FR序列通常以下列序列出現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「整個抗體」在本文中可互換使用且係指具有與天然抗體結構實質上相似之結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈之抗體。
「異多聚體」、「異多聚體複合物」或「異多聚體蛋白質」係指包含至少第一含鉸鏈多肽及第二含鉸鏈多肽之分子，其中第二含鉸鏈多肽在胺基酸序列上與第一含鉸鏈多肽相差至少一個胺基酸殘基。異多聚體可包含由第一含鉸鏈多肽及第二含鉸鏈多肽形成之「異二聚體」，或者可形成更高階之三級結構，其中除了第一含鉸鏈多肽及第二含鉸鏈多肽外亦存在多肽。異多聚體之多肽可藉由非肽鍵共價鍵(例如二硫鍵)及/或非共價相互作用(例如氫鍵、離子鍵、范德華力(van der Waals force)及/或疏水相互作用)來相互作用。
如本文所用之「異多聚化結構域」係指改變或添加生物分子以促進異多聚體形成並阻礙同多聚體形成。任何對形成異二聚體之偏好強於對同二聚體之偏好之異二聚化結構域皆在目前揭示之標的物之範圍內。說明性實例包括(但不限於)例如美國專利申請案20030078385 (Arathoon等人-Genentech；闡述隆凸於孔洞中)；WO2007147901 (Kjærgaard等人-Novo Nordisk：闡述離子相互作用)；WO 2009089004 (Kannan等人-Amgen：闡述靜電轉向效應)；美國臨時專利申請案61/243,105 (Christensen等人-Genentech；闡述捲曲螺旋)。亦參見例如Pack, P.及Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992)闡述亮胺酸拉鏈或Pack等人，Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993)闡述螺旋-轉角-螺旋基元。片語「異多聚化結構域」及「異二聚化結構域」在本文中可互換使用。
如本文可互換使用之術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」係指已經引入外源核酸中之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，包括初級轉型細胞及其衍生之子代，而不考慮傳代次數。子代之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文包括在最初轉型之細胞中篩選或選擇之具有相同功能或生物活性之突變體子代。
「人類抗體」為具有與人類或人類細胞產生之抗體相對應之胺基酸序列、或者衍生自非人類來源之胺基酸序列的抗體，該非人類來源利用人類抗體庫或其他人類抗體編碼序列。人類抗體之此定義特別排除了包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類一致框架」為在人類免疫球蛋白VL或VH框架序列之選擇中代表最常見胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇來自可變結構域序列之亞組。通常，序列亞組為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991)，第1-3卷中之亞組。在某些實施例中，對於VL，亞組為如上文Kabat等人中之亞組κ I。在某些實施例中，對於VH，亞組為如上文Kabat等人中之亞組III。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上所有的至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有的HVR (例如HVR)對應於非人類抗體之彼等HVR，並且所有或實質上所有的FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況地可包含衍生自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經過人類化之抗體。
如本文所用之術語「超變區」或「HVR」係指抗體可變結構域中序列超變(在本文中亦稱為「互補決定區」或「HVR」)及/或形成結構上定義之環(「超變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸」)之每個區域。除非另有指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中根據上文Kabat等人進行編號。通常，抗體包含六個HVR：三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。本文之例示性HVR包括： (a)  在胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)出現之超變環(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))； (b)  在胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)出現之HVR (Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))； (c)  在胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)出現之抗原接觸(MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及 (d)  (a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)及94-102 (H3)。
「免疫結合物」係指與一或多種異源分子(包括但不限於細胞毒性劑)結合之抗體。
「經分離」抗體係自其天然環境之組分中分離出來之抗體。在某些實施例中，抗體純化至大於95%或99%之純度，如例如藉由電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或反相HPLC)測定。關於評價抗體純度之方法之綜述參見例如Flatman等人，J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
如本文可互換使用之「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，例如猴)、兔及囓齒類動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體或受試者係人類。
「經分離」核酸係指已經自其自然環境之組分中分離出來之核酸分子。經分離核酸包括含於通常含有核酸分子之細胞中之核酸分子，但核酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置。
術語「編碼抗體之經分離核酸」(包括特定抗體之參考)係指一或多種編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之核酸分子，包括單個載體或單獨載體中之該(等)核酸分子，以及存在於宿主細胞中一或多個位置之該(等)核酸分子。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上均一之抗體群體中獲得之抗體，即包括群體之個別抗體係相同的及/或結合相同的決定基，但可能的變異體抗體除外，例如含有天然突變或在單株抗體製劑之生產過程中產生之變異體，該等變異體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定簇(決定基)之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每種單株抗體針對抗原上之單個決定簇。因此，修飾詞「單株」指示抗體之特徵為自實質上均一之抗體群體中獲得，且不應理解為需要藉由任何特定之方法產生抗體。舉例而言，根據目前揭示之標的物使用之單株抗體可藉由多種技術製備，包括(但不限於)雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法及利用含有全部或部分人類免疫球蛋白基因座之基因轉殖動物之方法，該等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法闡述於本文中。
術語「多特異性」及「雙特異性」意指抗原結合分子能夠特異性結合至至少兩種不同之抗原決定簇。通常，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，每個位點特異性針對不同之抗原決定簇。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩種抗原決定簇，特別是在兩種不同細胞上表現之兩種抗原決定簇。在一個實施例中，雙特異性抗體為T細胞依賴性雙特異性(TDB)抗體，該T細胞依賴性雙特異性抗體包含結合至CD3之第一抗原結合位點及結合至細胞表面抗原之第二抗原結合位點。在一些實施例中，細胞表面抗原為腫瘤抗原，例如CD20、FcRH5、HER2、CEA、LYPD1、LY6G6D、PMEL17、LY6E、CD19、CD33、CD22、CD79A、CD79B、EDAR、GFRA1、MRP4、RET、Steap1、TenB2等。參見WO/2015/095392。TDB經由CD3結合臂接合並活化T細胞，且任何抗CD3同二聚體(CD3 HD)雜質之存在可能經由TCR之二價接合及二聚化而觸發不期望之脫靶T細胞活化。在某些實施例中，雙特異性抗體包含少於2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.05%或0.01%之同二聚體。在非限制性實施例中，雙特異性抗體為TDB抗體，並且同二聚體為CD3同二聚體。
除非另有指示，否則如本文所用之術語「蛋白質」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然蛋白質，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及囓齒類動物(例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」未經處理之蛋白質以及在細胞中處理產生之任何形式之蛋白質。該術語亦涵蓋蛋白質之天然變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。
如本文所用之「經純化」蛋白質或多肽(例如抗體)係指純度已經提高、使得其以比其天然環境中及/或最初在實驗室條件下合成及/或擴增時更純之形式存在之多肽。純度為相對術語且不一定意指絕對純度。
如本文所用之術語「多肽」係指任何長度之胺基酸聚合物。聚合物可為直鏈或具支鏈，其可包含經修飾之胺基酸，並且其可雜有非胺基酸。該術語亦涵蓋天然或藉由干預修飾之胺基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，例如與標記組分結合。定義中亦包括例如含有一或多種胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及本領域已知之其他修飾之多肽。如本文所用之術語「多肽」及「蛋白質」具體涵蓋抗體。
如本文所用之「樣品」係指大量材料中之一小部分。在某些實施例中，樣品包括(但不限於)培養物中之細胞、細胞上清液、細胞溶解物、血清、血漿、生物流體(例如血液、血漿、血清、糞便、尿液、淋巴液、腹水、導管灌洗液、唾液及腦脊液)及組織樣品。樣品之來源可為固體組織(例如，來自新鮮、冷凍及/或保存之器官、組織樣品、生檢或抽吸物)、血液或任何血液成分、體液(例如，尿液、淋巴液、腦脊液、羊水、腹膜液或間質液)，或者來自個體之細胞，包括循環細胞。
當提及兩種或更多種組分之混合物時，「混合物」係指混合物中之每種組分基本上保持其在混合物中之物理及化學穩定性，如藉由一或多種分析型分析所評估。用於此目的之例示性分析型分析包括：顏色、外觀及透明度(CAC)、濃度及濁度分析、顆粒分析、尺寸排阻層析(SEC)、離子交換層析(IEC)、毛細管區帶電泳(CZE)、影像毛細管等電聚焦(iCIEF)及功效分析。在一個實施例中，混合物在5℃或30℃下顯示穩定高達約8小時，或高達約12小時，或高達約24小時。在另一實施例中，混合物在5℃或30℃下顯示穩定至少約8小時，或至少約12小時，或至少約24小時。
如本文所用之術語「亞單位」係指多聚體(例如同二聚體及異二聚體)之組分。亞單位可為多肽，該多肽可為三個胺基酸至幾千個胺基酸長之任一大小。
術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈之參與抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)之可變結構域通常具有相似之結構，每個結構域包含四個保守框架區(FR)及三個超變區(HVR)。(參見例如Kindt等人，Kuby Immunology ，第6版，W.H. Freeman and Co.，第91頁(2007)。)單個VH或VL結構域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用VH或VL結構域自結合抗原之抗體中分離，以分別篩選互補之VL或VH結構域文庫。參見例如Portolano等人，J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628 (1991)。
如本文所用之術語「化合價」表示抗原結合分子中存在特定數量之抗原結合位點。因此，術語「與抗原之單價結合」表示抗原結合分子中存在一個(且不超過一個)抗原特異性結合位點。
如本文所用之「治療」係指試圖改變所治療個體或細胞之自然病程並且可在臨床病理過程之前或期間進行之臨床干預。治療之期望效果包括預防疾病或其病狀或症狀之發生或復發，減輕疾病之病狀或症狀，減少疾病之任何直接或間接病理後果，降低疾病進展之速率，改善或減輕疾病狀態，以及達成緩解或改善預後。在某些實施例中，本揭示案之方法及組合物可用於試圖延緩疾病或病症之發展。
劑之「有效量」係指在投與藥劑之細胞或組織中產生生理變化所必需之量。 2. 用於分離及量化靶多亞單位蛋白質之配位體
在某些實施例中，本揭示案之標的物係關於可用於一或多種分析型分析中之配位體。在某些實施例中，本揭示案之分析型分析可分離(separate)、分離(isolate)及/或量化靶蛋白。例示性分析型分析可包括：離子交換層析(IEC)、毛細管區帶電泳(CZE)、影像毛細管等電聚焦(iCIEF)及親和毛細管電泳(ACE)分析。
在某些實施例中，本揭示案之配位體能夠結合至(在本文中用於指結合至或被結合)靶蛋白。舉例而言，當靶蛋白處於其天然構形、部分展開或完全展開時，配位體可結合靶蛋白。根據本揭示案，配位體並不限於結合靶蛋白之識別功能區之劑，例如酶之活性位點、抗體之抗原組合位點、受體之激素結合位點或輔因子結合位點。在某些實施例中，配位體可為結合至靶蛋白之表面或內部序列以及構形結構域之劑。此外，配位體可結合至靶蛋白之一或多個亞單位(例如，第一亞單位或第二亞單位或兩者)。因此，本揭示案之配位體涵蓋本身可能沒有明顯生物功能、超出了其以上述方式結合至靶蛋白之能力之劑。
在某些實施例中，配位體為多肽或多肽片段。在某些實施例中，配位體包含由靶蛋白(例如抗體)結合之決定基。
在某些實施例中，配位體經構形以與未改變之配位體相比具有螢光(或以其他方式可偵測)標記、改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合。在某些實施例中，配位體為螢光標記之多肽或螢光標記之多肽片段。在某些實施例中，配位體藉由將一或多個胺基酸添加至配位體之非結合區來修飾。在某些實施例中，一或多個胺基酸係選自由麩胺酸、天冬胺酸及其組合組成之群。在某些實施例中，添加的一或多個胺基酸經構形以改變配位體之電荷及質量。
在某些實施例中，配位體係選自由以下組成之群：人類CD3多肽、小鼠CD3多肽、大鼠CD3多肽、兔CD3多肽及食蟹猴CD3多肽。在某些實施例中，配位體為CD3肽。在某些實施例中，配位體為具有以下序列之CD3肽：Pyr DGNEEMGGITQTPYKE酸。在一些實施例中，CD3肽可具有以下序列：Pyr DGNEEMGGITQTPYKD酸、Pyr DGNEEMGGITQTPYKDD酸或Pyr DGNEEMGGITQTPYKDDD酸。在非限制性實施例中，配位體可包括可由靶同二聚體識別之任何配位體。
在某些實施例中，靶蛋白可包括多亞單位蛋白質。亞單位可經由任何一或多個分子間鍵(例如共價鍵及非共價鍵)結合在一起形成多亞單位蛋白質。在非限制性實施例中，多亞單位蛋白質可為抗體。例示性多亞單位蛋白質可包括單株抗體、免疫結合物、合成抗體、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段、二硫鍵連接之Fv (sdFv)、內抗體及上述任一者之決定基結合片段。在一些實施例中，抗體可包括促效劑、拮抗劑及中和抗體，以及去免疫抗體、嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體及/或衍生自任何合適動物來源(例如衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、山羊、綿羊、狗、馬、牛、猴、猿及/或雞)之抗體。
在某些實施例中，多亞單位蛋白質可為異二聚體蛋白質。異二聚體蛋白質可包含至少第一含鉸鏈多肽及第二含鉸鏈多肽，其中第二含鉸鏈多肽在胺基酸序列上與第一含鉸鏈多肽相差至少一個胺基酸殘基。異二聚體可由第一含鉸鏈多肽及第二含鉸鏈多肽形成，或者可形成更高階之三級結構，其中除了第一含鉸鏈多肽及第二含鉸鏈多肽之外亦存在多肽。異多聚體之多肽可藉由非肽共價鍵(例如二硫鍵)及/或非共價相互作用(例如氫鍵、離子鍵、范德華力及/或疏水相互作用)來相互作用。具體而言，異二聚體蛋白質可為雙特異性抗體，如熟習此項技術者所理解，且在某些實施例中，可包含來自至少兩種或更多種不同抗體之結構域。在非限制性實施例中，雙特異性抗體可包含兩個不同重鏈(每一個衍生自不同抗體)及兩個不同輕鏈(每一個衍生自不同抗體)，及/或可包含重鏈及輕鏈，每一個包含來自兩種或更多種不同抗體之片段。此外，雙特異性抗體可包含來自去免疫抗體、鼠類抗體、嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體之重鏈及/或輕鏈，以及來自去免疫抗體、鼠類抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體及其片段(例如其可變及/或恆定結構域)之重鏈及/或輕鏈之組合。本揭示案之雙特異性抗體亦可包含抗體之決定基結合片段(例如但不限於單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段及二硫鍵連接之Fv (sdFv))，特別是連接至一或多個重鏈或輕鏈恆定結構域，例如連接至重鏈CH1/CH2/CH3結構域之scFv。在一些實施例中，本揭示案之雙特異性抗體包含Fc結構域。如熟習此項技術者所理解，Fc結構域之存在使得雙特異性抗體易於使用Fc結合部分純化。如本領域所公認，重鏈之CH1-鉸鏈-CH2-CH3結構域之特定結構及胺基酸序列決定免疫球蛋白類型及子類。本揭示案之雙特異性抗體不以任何方式限於特定之重鏈結構或胺基酸序列；因此，本揭示案之雙特異性抗體可為任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。
在某些實施例中，多亞單位蛋白質可包括同二聚體蛋白質。同二聚體蛋白可具有至少兩條相同或功能等同之多肽鏈。舉例而言，CD20或CD3單株抗體可包括兩條相同之重鏈及輕鏈。在某些實施例中，配位體可結合至多亞單位蛋白質以形成配位體-蛋白質複合物。配位體可具有針對多亞單位分子之結合結構域(例如Fc結構域、κ結構域或λ結構域)之特異性。與多亞單位蛋白質相比，配位體-蛋白質複合物可具有至少一種改變之性質。在一些實施例中，改變之性質可包括電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率及其組合。 3. 用於分離及量化靶多亞單位蛋白質之系統
在某些實施例中，本揭示案係關於用於分離樣品中之蛋白質(例如多亞單位蛋白質)之系統。在某些實施例中，系統包括：a)配位體，b)背景電解質緩衝液，c)樣品，d)毛細管，e)在毛細管一端或附近之陽極，及f)在毛細管另一端或附近之陰極。在某些實施例中，系統將包括與配位體混合以形成至少一種配位體-蛋白質複合物之樣品。在某些實施例中，系統包括在毛細管之陽極端加載至毛細管中之該等配位體-蛋白質複合物。在某些實施例中，系統包括毛細管，其中毛細管填充有與配位體混合之背景電解質緩衝液。
在某些實施例中，本揭示案之系統進一步包括位於毛細管之陰極端附近之偵測器。舉例而言而非以限制方式，偵測器將偵測210 nm至280 nm吸光度或雷射誘導之螢光。在非限制性實施例中，偵測器可包括螢光偵測器及/或化學發光偵測器。螢光偵測器可偵測用螢光標籤標記之配位體。螢光偵測器可偵測用螢光標籤標記之抗體。
如上所述，本揭示案之系統亦包括樣品(或經構形以接收樣品)。在某些實施例中，樣品包含至少一種同二聚體、至少一種異二聚體或其組合。在某些實施例中，本揭示案之系統包括第一配位體-蛋白質複合物，該第一配位體-蛋白質複合物在配位體結合至至少一種異二聚體之第一亞單位且不與至少一種異二聚體之第二亞單位結合時形成。在某些實施例中，本揭示案之系統包括第二配位體-蛋白質複合物，該第二配位體-蛋白質複合物在配位體結合至同二聚體之至少兩個相同的第一或第二亞單位時形成。在某些實施例中，至少一種配位體-蛋白質複合物經構形以在配位體結合至多亞單位蛋白質之亞單位時具有改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合。在某些實施例中，第二配位體-蛋白質複合物可具有低於第一配位體-蛋白質複合物之電泳遷移率，或反之亦然。
在某些實施例中，本揭示案之系統包括背景電解質緩衝液，其中背景電解質緩衝液包含胺基-正己酸(EACA)、三伸乙基四胺(TETA)及羥丙基甲基纖維素(HPMC)。在非限制性實施例中，本揭示案之系統包括毛細管電泳緩衝液。舉例而言，毛細管電泳緩衝液包括磷酸鹽、甲酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、六氫吡嗪-N,N′-雙(2-乙磺酸) (PIPES)、磷酸鹽、三嗪、植酸、硼酸鹽/硼酸、Tris、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、4-(2-羥乙基)-1-六氫吡嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、N-環己基-3-胺基丙磺酸(CAPS)、甘胺酸及二羥乙甘胺酸。參見Handbook of capillary and microchip electrophoresis and associated microtechniques，第3版，表1.3 「commonly used CE buffers and their associated properties」，第25頁。在一些實施例中，本揭示案之系統包括毛細管電泳添加劑。舉例而言，毛細管電泳添加劑包括甲基纖維素、十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙二醇(PEG)/聚環氧乙烷(PEO)及/或乙腈。在某些實施例中，本揭示案之系統包括組合物，該組合物包含雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含小於5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.05%或0.01%之同二聚體。在非限制性實施例中，雙特異性抗體為T細胞依賴性雙特異性(TDB)抗體，且同二聚體為CD3同二聚體。在一些實施例中，TDB抗體包含結合至CD3之第一抗原結合位點及結合至細胞表面抗原之第二抗原結合位點。TDB經由CD3結合臂接合並活化T細胞且任何抗CD3同二聚體(CD3 HD)雜質之存在可能經由TCR之二價接合及二聚化而觸發不期望之脫靶T細胞活化。 4. 用於分離及量化靶多亞單位蛋白質之方法
在某些實施例中，本揭示案係關於用於分離樣品中之蛋白質(例如多亞單位蛋白質)之方法。在某些實施例中，該方法包括以下步驟：(a)產生包含至少一種蛋白質之樣品及配位體之混合物以形成至少一種配位體-蛋白質複合物，(b)將混合物施加至毛細管，其中毛細管填充有與配位體混合之背景電解質緩衝液，(c)在毛細管兩端施加電壓，及(d)使蛋白質(例如多亞單位蛋白質)及至少一種配位體-蛋白質複合物移動穿過毛細管。在某些實施例中，配位體-蛋白質複合物經構形以在配位體結合時具有改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合。在某些實施例中，該變化促進樣品中之蛋白質分離。
在某些實施例中，本揭示案係關於用於分離樣品混合物中之靶蛋白之方法，其包括以下步驟：(a)產生包含蛋白質之樣品及配位體之混合物以形成至少一種配位體-蛋白質複合物，(b)將混合物施加至毛細管，其中毛細管填充有與配位體混合之背景電解質緩衝液，(c)在毛細管兩端施加電壓，(d)使蛋白質及至少一種配位體-蛋白質複合物移動穿過毛細管。在某些實施例中，配位體-蛋白質複合物經構形以在配位體結合至蛋白質時具有改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合。在某些實施例中，該方法進一步包括分離靶蛋白，該靶蛋白已與樣品中存在之非靶蛋白分開。
在某些實施例中，本揭示案之方法使用毛細管，其中毛細管包括陰極端、陽極端及偵測器。在某些實施例中，偵測器在毛細管之陰極端附近且偵測210 nm至280 nm吸光度或雷射誘導之螢光。在某些實施例中，電壓可高達30千伏。在非限制性實施例中，毛細管之長度可增加以改善樣品中靶分子之分離。
在某些實施例中，本揭示案係關於方法，其中欲分析之樣品包含至少一種同二聚體、至少一種異二聚體或其組合。在某些實施例中，至少一種異二聚體包含第一亞單位及不同的第二亞單位。在某些實施例中，至少一種同二聚體包含至少兩個相同的第一或第二亞單位。在某些實施例中，至少一種異二聚體為雙特異性抗體。在某些實施例中，至少一種同二聚體為單株抗體。
在某些實施例中，本揭示案係關於方法，其中第一配位體-蛋白質複合物在配位體結合至上述方法之至少一種異二聚體之第一亞單位且該配位體不與至少一種異二聚體之第二亞單位結合時形成。在某些實施例中，本揭示案係關於方法，其中第二配位體-蛋白質複合物在上述配位體結合至同二聚體之至少兩個相同的第一或第二亞單位時形成。
在某些實施例中，本揭示案係關於方法，其中背景電解質緩衝液包含胺基-正己酸(EACA)、三伸乙基四胺(TETA)及羥丙基甲基纖維素(HPMC)。在某些實施例中，背景電解質緩衝液包含結合至上述方法之至少一種異二聚體之第一亞單位且不與至少一種異二聚體之第二亞單位結合的配位體。
在某些實施例中，本揭示案之方法可包括使用特定緩衝液及/或其他步驟來最小化不期望蛋白質寡聚化。舉例而言而非以限制方式，在進行分析之樣品中存在之某些蛋白質(例如下面實例中所述之抗CD3及抗CD20同二聚體物質)可形成高分子量寡聚物物質。在某些實施例中，該等寡聚物物質可與相關蛋白質共同遷移，或者以其他方式阻礙分析之效用。在某些實施例中，例如當期望量測溶液中之所有同二聚體時，該等寡聚物物質可在分離前解離。在某些實施例中，此可藉由在低pH緩衝液或高pH緩衝液中製備樣品來實現。在非限制性實施例中，可將尿素添加至溶液中以在分離之前解離高分子量寡聚物物質。在一些實施例中，溶液(例如背景緩衝液、毛細管電泳緩衝液及/或毛細管電泳添加劑)之濃度可增加，以最小化不期望之蛋白質寡聚化。已顯示該等條件足以使寡聚物解離，但足夠溫和以維持配位體-蛋白質複合物形成，而不會使蛋白質(例如BsAb)結構變性。
在某些實施例中，本揭示案之方法可包括使用特定緩衝液及/或其他步驟來最小化相關蛋白質之不期望帶電變異體。舉例而言而非以限制方式，在進行分析之樣品中存在之某些蛋白質(例如下面實例中所述之抗CD3 HD)可展現電荷變化。在某些實施例中，該電荷變化具有pH依賴性。在某些實施例中，使用某些緩衝液會引起構形變化，導致流體動力學尺寸之可觀察差異。因此，在某些實施例中，期望在緩衝液中製備樣品，此將最小化該電荷變化或構形變化。舉例而言而非以限制方式，在某些實施例中，可使用pH 3.5緩衝液將蛋白質物質驅動至單一之低pH狀態。在某些實施例中，此為合意之原因在於其可提高信噪比，從而降低分析之量化限值。然而，在某些實施例中，可使用與0.1% PS20結合之pH 7.5 HEPES緩衝液(例如pH 7.5之10 mM HEPES緩衝液)將蛋白質物質驅動至單一狀態。在某些實施例中，此合意之原因在於其可提高信噪比，從而降低分析之量化限值。
可包括使用特定緩衝液及/或其他步驟來最小化蛋白質表面吸附。舉例而言而非以限制方式，在進行分析之樣品中存在之某些蛋白質(例如下面實例中所述之抗CD3 HD)可展現不期望之表面吸附。該表面吸附(例如至瓶壁之吸附)會導致抗CD3同二聚體峰面積之回收率較低。為了控制該吸附並提高回收率，本揭示案之方法可在樣品中包括洗滌劑，例如約0.1%至約0.4%之聚山梨醇酯20 (PS20)。在某些實施例中，本揭示案之方法可包括表面活性劑，其中表面活性劑可包括tween 80、泊洛沙姆188 (p188)、triton、SDS、Brij、PEO/PEG及/或甘油。在非限制性實施例中，本揭示案之方法可包括離液劑，例如蔗糖、鹽酸胍及/或環糊精(例如各種同種型)。
在某些實施例中，本揭示案係關於方法，其進一步包括量化樣品中靶蛋白之量 *                 *                 *
除了所繪示及主張之各種實施例之外，所揭示之標的物亦係關於具有本文揭示及主張之特徵之其他組合之其他實施例。因此，在所揭示標的物之範圍內，本文呈現之特徵可以其他方式彼此組合，使得所揭示之標的物包括本文所揭示特徵之任何合適之組合。出於說明及描述之目的，已經呈現了所揭示標的物之特定實施例之前述描述。其並不意欲窮舉或將所揭示之標的物限於所揭示之彼等實施例。
熟習此項技術者應明瞭，可在不脫離所揭示標的物之精神或範圍之情況下，對所揭示標的物之組合物及方法進行各種修改及變化。因此，所揭示之標的物意欲包括在所附申請專利範圍及其等同物之範圍內之修改及變化。
本文引用了各種出版物、專利及專利申請案，其內容之全文皆以引用方式併入本文中。本揭示案之實施例
以下為本揭示案之非限制性實施例。 1. 一種用於分離樣品中之多亞單位蛋白質之系統，包括：a)配位體，b)背景電解質緩衝液，c)樣品，d)毛細管，e)在毛細管一端或附近之陽極，及f)在毛細管另一端或附近之陰極，其中將樣品與配位體混合以形成至少一種配位體-蛋白質複合物且在毛細管之陽極端加載至毛細管中，且其中毛細管填充有與配位體混合之背景電解質緩衝液。 2. 如實施例1之系統，進一步包括位於毛細管之陰極端附近之偵測器，其中偵測器偵測210 nm至220 nm吸光度或雷射誘導之螢光。 3. 如實施例1至2中任一者之系統，其中樣品包含至少一種同二聚體、至少一種異二聚體或其組合。 4. 如實施例1至3中任一者之系統，其中第一配位體-蛋白質複合物在配位體結合至至少一種異二聚體之第一亞單位且不與至少一種異二聚體之第二亞單位結合時形成。 5. 如實施例1至4中任一者之系統，其中第二配位體-蛋白質複合物在配位體結合至同二聚體之至少兩個相同的第一或第二亞單位時形成。 6. 如實施例1至5中任一者之系統，其中至少一種配位體-蛋白質複合物經構形以在配位體結合至多亞單位蛋白質之亞單位時具有改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合。 7. 如實施例1至6中任一者之系統，其中第二配位體-蛋白質複合物具有低於第一配位體-蛋白質複合物之電泳遷移率。 8. 如實施例1至7中任一者之系統，其中配位體為肽或肽片段。 9. 如實施例1至8中任一者之系統，其中配位體為螢光標記之肽或螢光標記之肽片段。 10. 如實施例1至9中任一者之系統，其中配位體係選自由以下組成之群：人類CD3肽、小鼠CD3肽、大鼠CD3肽、兔CD3肽及食蟹猴CD3肽。 11. 如實施例1至10中任一者之系統，其中配位體藉由將一或多個胺基酸添加至配位體之非結合區來修飾。 12. 如實施例11之系統，其中一或多個胺基酸係選自由麩胺酸、天冬胺酸及其組合組成之群。 13. 如實施例11至12中任一者之系統，其中添加的一或多個胺基酸經構形以改變配位體之電荷及質量。 14. 如實施例11至13中任一者之系統，其中將樣品進一步與配位體在以下緩衝液中混合：(A)低pH尿素緩衝液；或(B)與0.1%聚山梨醇酯20組合之高pH HEPES緩衝液。 15. 如實施例11至14中任一者之系統，其中背景電解質緩衝液包含胺基-正己酸(EACA)、三伸乙基四胺(TETA)及羥丙基甲基纖維素(HPMC)。 16. 一種用於分離樣品中之多亞單位蛋白質之方法，其包括以下步驟：(a)產生樣品及配位體之混合物以形成至少一種配位體-蛋白質複合物，(b)將混合物施加至毛細管，其中毛細管填充有與配位體混合之背景電解質緩衝液，(c)在毛細管兩端施加電壓，及(d)使多亞單位蛋白質及至少一種配位體-蛋白質複合物移動穿過毛細管，其中配位體-蛋白質複合物經構形以在配位體結合至多亞單位蛋白質之亞單位時具有改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合，從而使樣品中之多亞單位蛋白質分離。 17. 一種用於分離樣品混合物中之靶蛋白之方法，其包括以下步驟：(a)產生樣品及配位體之混合物以形成至少一種配位體-蛋白質複合物，(b)將混合物施加至毛細管，其中毛細管填充有與配位體混合之背景電解質緩衝液，(c)在毛細管兩端施加電壓，(d)使多亞單位蛋白質及至少一種配位體-蛋白質複合物移動穿過毛細管，其中配位體-蛋白質複合物經構形以在配位體結合至多亞單位蛋白質之亞單位時具有改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合，及(e)分離靶蛋白，該靶蛋白與非靶蛋白分開。 18. 如實施例16或申請專利範圍第17項之方法，其中毛細管包括陰極端、陽極端及偵測器。 19. 如實施例18之方法，其中偵測器在毛細管之陰極端附近且偵測210 nm至220 nm吸光度或雷射誘導之螢光。 20. 如實施例16至19中任一者之方法，其中電壓為30千伏。 21. 如實施例16至20中任一者之方法，其中樣品包含至少一種同二聚體、至少一種異二聚體或其組合，其中至少一種異二聚體包含第一亞單位及第二亞單位，且至少一種同二聚體包含至少兩個相同的第一或第二亞單位。 22. 如實施例21之方法，其中至少一種異二聚體包含雙特異性抗體。 23. 如實施例21之方法，其中至少一種同二聚體包含單株抗體。 24. 如實施例16至23中任一者之方法，其中配位體為肽或肽片段。 25. 如實施例16至24中任一者之方法，其中配位體為螢光標記之肽或螢光標記之肽片段。 26. 如實施例16至24中任一者之方法，其中配位體係選自由以下組成之群：人類CD3肽、小鼠CD3肽、大鼠CD3肽、兔CD3肽及食蟹猴CD3肽。 27. 如實施例16至24中任一者之方法，配位體經構形以藉由將一或多個胺基酸添加至配位體之非結合區來修飾。 28. 如實施例27之方法，其中一或多個胺基酸係選自由麩胺酸、天冬胺酸及其組合組成之群。 29. 如實施例27至28中任一者之方法，其中添加的一或多個胺基酸經構形以改變配位體之電荷及質量。 30. 如實施例16至29中任一者之方法，其中第一配位體-蛋白質複合物在配位體結合至至少一種異二聚體之第一亞單位且不與至少一種異二聚體之第二亞單位結合時形成。 31. 如實施例16至30中任一者之方法，其中第二配位體-蛋白質複合物在配位體結合至同二聚體之至少兩個相同的第一或第二亞單位時形成。 32. 如實施例16至31中任一者之方法，其進一步包括：(A)將低pH尿素緩衝液與樣品及配位體之混合物混合；或(B)將與0.1%聚山梨醇酯20組合之高pH HEPES緩衝液與樣品及配位體之混合物混合。 33. 如實施例16至32中任一者之方法，其中背景電解質緩衝液包含胺基-正己酸(EACA)、三伸乙基四胺(TETA)及羥丙基甲基纖維素(HPMC)。 34. 如實施例16至33中任一者之方法，其進一步包括量化樣品中靶蛋白之量。 35. 一種親和毛細管電泳配位體，其包含結合區，其中該結合區結合相關蛋白質或由相關蛋白質結合；及修飾，其中該修飾促進相關蛋白質之分離。 36. 如實施例35之配位體，其中相關蛋白質為同二聚體。 37. 如實施例35之配位體，其中相關蛋白質為異二聚體。 38. 如實施例35之配位體，其中結合區為多肽。 39. 如實施例35之配位體，其中結合區為小分子。 40. 如實施例35之配位體，其中修飾為添加螢光標記或將一或多個胺基酸添加至配位體。 41. 如實施例35之配位體，其中修飾提供螢光標記，在配位體結合至靶蛋白時提供改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合。 實例
以下實例僅為對目前揭示之標的物之說明且不應視為以任何方式進行限制。實例 1 ：用於偵測雙特異性產物中之同二聚體之高特異性親和毛細管電泳 (ACE) 方法
在此實例中，利用BsAb靶對抗原之特異性及親和力，使用毛細管區帶電泳(CZE)基於電泳遷移率差異達成分離。材料及方法
製備蛋白質樣品，使得最終樣品含有3 g/L蛋白質、50 mM甲酸鹽、2M尿素、0.1% PS20及50 µM CD3肽，pH 3.5 (「低pH製劑」)，或3 g/L蛋白質、10 mM HEPES、0.1% PS20及50 µM CD3肽，pH 7.5 (「高pH製劑」)。
藉由CZE使用配備有UV偵測器及214 nm過濾器之Sciex PA800 Plus儀器分離蛋白質。分離使用具有20/30 cm柱(毛細管長度對偵測器/總長度)之毛細管柱進行分離。毛細管本身係內徑為50 μm之裸露熔融二氧化矽毛細管。
根據習用CZE製程策略分離樣品，本文所概述除外。簡而言之，使用壓力注射在0.5 psi下注射樣品20秒。藉由施加30 kV之電壓30分鐘來分離樣品。背景電解質含有400 mM胺基-正己酸(EACA)緩衝液，該緩衝液含有2 mM三伸乙基四胺(TETA)、0.5%羥丙基甲基纖維素(HPMC)及50 µM CD3肽，pH為5.7。結果
CZE 方法之效能： 在經典毛細管區帶電泳中，在外加電場之影響下，物質基於速度差異遷移及分離。由於同二聚體及雙特異性物質(圖1)在電荷及流體動力學尺寸性質上高度相似，故藉由該等CZE方法分離該等物質可能並不足夠(圖2及3)。
使用 CD3 肽之 ACE ： 應用親和CZE之原理，將CD3肽添加至樣品混合物中，以達成該等物質之間之額外分離(圖2)。當肽在分離前與樣品混合時，CD3結合物質之遷移時間由於電荷或流體動力學尺寸或兩者之組合之明顯變化而發生偏移。然而，所得分離概況顯示較差峰形，此與不完全結合一致。此亦可能歸因於抗CD3-CD3肽複合物之較高解離常數。
為了改善峰形狀並驅動CD3肽之完全及持續結合，樣品及背景電解質中皆包含濃度為50 μM之肽(圖4)。
修飾 CD3 肽： 如圖4所示，使用CD3肽使得抗CD3 HD與雙特異性抗體之間之分離。然而，該等物質並未經完全(或基線)解析。由於期望對抗CD3同二聚體進行低水準之精確量化，故尋求兩種物質之間之進一步解析。為此，藉由在肽之非結合N末端添加各種低等電點(pI)胺基酸(例如麩胺酸及天冬胺酸)來修飾CD3肽。此過程有效地將電荷及質量添加至肽，且最終改變所結合肽-抗體複合物之電荷及質量。
CD3肽使用幾個胺基酸標籤進行修飾，包括添加一個麩胺酸以及一個、兩個及三個天冬胺酸(圖5A)。然後將該等肽用於ACE分離，如圖5B所示。CD3肽之電荷及質量貢獻越大，物質之間之解析度越高。然而，該等經修飾之CD3肽亦在同二聚體及雙特異性物質之帶電變異體內提供更大之解析度。同二聚體之不同帶電變異體內之此提高的解析度降低了同二聚體峰之總信噪比，使得此區域之整合更具挑戰性，並最終降低分析之靈敏度及量化限值。因此，對肽之修飾在達成足夠之解析度以最小化雙特異性干擾與最大化抗CD3同二聚體物質之信號之間提供了平衡。例如但不限於，一個麩胺酸標籤(即CD3-E)在抗CD20物質與抗CD3物質之間提供了足夠之分離，而不損害靈敏度，且因此經選擇用於此分析(圖6)。
低 pH 及尿素樣品處理： 發現當抗CD3及抗CD20同二聚體物質一起存在於溶液中時會形成高分子量寡聚物物質(圖9)。此寡聚物與BsAb共同遷移，並且不能藉由此親和分析以可量化方式偵測到。具體而言，當將aCD20 HD摻入樣品中時，經由aCD3 HD之消失間接偵測到高分子量寡聚物。由於高分子量寡聚物及BsAb共同遷移，高分子量寡聚物物質在BsAb存在下無法量化。為了量測溶液中之所有同二聚體物質，該等寡聚物需要在分離前解離。此藉由在含有2M尿素之低pH緩衝液中製備樣品來實現。顯示該等條件使寡聚物解離，但足夠溫和以維持肽-抗體複合物形成，並且不會使BsAb結構變性。
此外，顯示抗CD3 HD之帶電變異體具有pH依賴性。BsAb (及相關之電荷變異體)之電荷可具有不同之總電荷狀態及隨pH變化之電荷分佈。總電荷狀態(例如電荷總數)及電荷位置(例如電荷補丁、掩埋、溶劑暴露)在高pH及低pH條件下可不同。藉由在pH 3.5緩衝液中製備樣品，將物質驅向單一之低pH構形。此提高了信噪比，從而降低了分析之量化限值(圖7)。
樣品基質中高 pH 及 0.1% PS20 提高 aCD3 HD 回收率： 顯示抗CD3 HD隨著時間之推移吸附至瓶上，使得抗CD3同二聚體峰面積之回收率較低。為了控制吸附及提高抗CD3-HD之回收率，在樣品基質中添加0.1%聚山梨醇酯20 (PS20)。(圖8)。
經由摻入雜質在抗CD3區域中之間接峰鑑別(圖10A-10B)。使用pH 7.5及0.1% PS20之10 mM HEPES樣品緩衝液，觀察到BsAb、aB半mAb及同二聚體之間之解析度提高(圖10A)，包括在允許完全轉化為高pH構形之時間後(圖10B)。
在ACE及尺寸排阻層析(SEC)中觀察到藉由兩種同二聚體之相互作用形成寡聚物。舉例而言，ACE顯示抗CD3 HD及抗CD20 HD可相互作用並形成與BsAb共同遷移之新峰(圖11)。近峰「HD複合物」或「寡聚物」在ACE中與BsAb共同遷移，但在SEC中以高分子量形式遷移。因此藉由SEC，該等近峰不會與BsAb共同遷移，而是在BsAb之前與其他高分子量形式或聚集體一起遷移。然而，藉由SEC，無法區分HD複合物與其他BsAb相關之聚集體。低pH及尿素會阻止該相互作用。舉例而言，抗CD3 HD及抗CD20 HD之相互作用由低pH (例如pH 3.5)及尿素阻止及解離(圖12)。低pH處理揭露以前為寡聚且藉由其他方法無法偵測之同二聚體(圖13)。
此外，可進行各種修改以提高親和毛細管電泳之效能。舉例而言，如圖14所示，背景緩衝液之濃度可隨著/不隨樣品之改變(例如pH調節、ps20處理、添加配位體、尿素處理等)而增加。圖14繪示例示性低pH親和毛細管電泳方法。所揭示之系統及方法提供改善之ACE效能(圖15)。
圖 1 繪示具有相似的物理化學性質之例示性雙特異性抗體及產物相關雜質(包括半抗體及同二聚體)，此使得藉由傳統分析方法之偵測具有挑戰性。
圖 2 繪示藉由親和毛細管電泳對特定抗體樣品之理論分離機制。
圖 3 繪示用於同二聚體偵測之例示性親和毛細管電泳。在分離前，當配位體與樣品混合時，觀察到不完全及間歇之複合物形成。
圖 4 繪示在背景電解質中添加過量配位體之親和電泳之例示性效能。
圖 5A 繪示改進親和電泳效能之例示性經修飾配位體。圖 5B 繪示用經修飾之配位體進行親和電泳之例示性效能。
圖 6 繪示CD3 + E肽之例示性效能
圖 7 繪示抗CD3同二聚體之pH依賴性構形異構物。低pH樣品處理推動單一確認並改善信噪比，如本文所述，此亦係藉由高pH處理來達成。
圖 8 繪示樣品中之抗CD3同二聚體回收率隨時間提高了0.1% PS20。
圖 9 繪示例示性寡聚物相互作用機制。
圖 10A-10B 繪示經由摻入雜質在抗CD3區域中之間接峰鑑別。10A繪示與HEPES緩衝液初始混合後之結果，而10B繪示完全轉化為高pH構形後之結果。
圖 11 繪示藉由兩種同二聚體之相互作用之例示性寡聚物形成。
圖 12 繪示藉由低pH及尿素之例示性寡聚物解離。樣品緩衝液之pH為3.5且包含尿素。尿素及低pH防止抗CD3與抗CD20 HD之相互作用(藉由SEC確認)。
圖 13 繪示揭露BsAb參考標準中之寡聚物之例示性親和毛細管電泳分析。
圖 14 繪示例示性低pH親和毛細管電泳方法。
圖 15 繪示親和毛細管電泳分析與完整質譜方法相比之例示性效能。

Claims (41)

  1. 一種用於分離樣品中之多亞單位蛋白質之系統，其包括：  a) 配位體， b) 背景電解質緩衝液， c) 該樣品， d) 毛細管， e) 在該毛細管一端或附近之陽極，及 f) 在該毛細管另一端或附近之陰極， 其中將該樣品與該配位體混合以形成至少一種配位體-蛋白質複合物且在該毛細管之陽極端加載至該毛細管中，且 其中該毛細管填充有與該配位體混合之該背景電解質緩衝液。
  2. 如申請專利範圍第1項之系統，其進一步包括位於該毛細管之陰極端附近之偵測器，其中該偵測器偵測210 nm至220 nm吸光度或雷射誘導之螢光。
  3. 如申請專利範圍第1項至第2項中任一項之系統，其中該樣品包含至少一種同二聚體、至少一種異二聚體或其組合。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之系統，其中第一配位體-蛋白質複合物在該配位體結合至該至少一種異二聚體之第一亞單位且不與該至少一種異二聚體之第二亞單位結合時形成。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之系統，其中第二配位體-蛋白質複合物在該配位體結合至該同二聚體之至少兩個相同的第一或第二亞單位時形成。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之系統，其中當該配位體結合至該多亞單位蛋白質之亞單位時，該至少一種配位體-蛋白質複合物經構形以具有改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之系統，其中該第二配位體-蛋白質複合物具有低於該第一配位體-蛋白質複合物之電泳遷移率。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之系統，其中該配位體為肽或肽片段。
  9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之系統，其中該配位體為螢光標記之肽或螢光標記之肽片段。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之系統，其中該配位體係選自由以下組成之群：人類CD3肽、小鼠CD3肽、大鼠CD3肽、兔CD3肽及食蟹猴CD3肽。
  11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之系統，其中藉由將一或多個胺基酸添加至該配位體之非結合區來修飾該配位體。
  12. 如申請專利範圍第11項之系統，其中該一或多個胺基酸係選自由麩胺酸、天冬胺酸及其組合組成之群。
  13. 如申請專利範圍第11項至第12項中任一項之系統，其中該等添加的一或多個胺基酸經構形以改變該配位體之電荷及質量。
  14. 如申請專利範圍第11項至第13項中任一項之系統，其中將該樣品進一步與該配位體在以下緩衝液中混合：(A)低pH尿素緩衝液；或(B)與0.1%聚山梨醇酯20組合之高pH HEPES緩衝液。
  15. 如申請專利範圍第11項至第14項中任一項之系統，其中該背景電解質緩衝液包含胺基-正己酸(EACA)、三伸乙基四胺(TETA)及羥丙基甲基纖維素(HPMC)。
  16. 一種用於分離樣品中之多亞單位蛋白質之方法，其包括以下步驟： (a) 產生該樣品及配位體之混合物以形成至少一種配位體-蛋白質複合物， (b) 將該混合物施加至毛細管，其中該毛細管填充有與該配位體混合之背景電解質緩衝液， (c) 在該毛細管兩端施加電壓，及 (d) 使該等多亞單位蛋白質及該至少一種配位體-蛋白質複合物移動穿過該毛細管， 其中該配位體-蛋白質複合物經構形以在該配位體結合至該多亞單位蛋白質之亞單位時具有改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合，從而分離該樣品中之該等多亞單位蛋白質。
  17. 一種用於分離樣品混合物中之靶蛋白之方法，其包括以下步驟： (a) 產生該樣品及配位體之混合物以形成至少一種配位體-蛋白質複合物， (b) 將該混合物施加至毛細管，其中該毛細管填充有與該配位體混合之背景電解質緩衝液， (c) 在該毛細管兩端施加電壓， (d) 使該等多亞單位蛋白質及該至少一種配位體-蛋白質複合物移動穿過該毛細管，其中該配位體-蛋白質複合物經構形以在該配位體結合至該等多亞單位蛋白質之亞單位時具有改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合，及 (e) 分離該靶蛋白，該靶蛋白與非靶蛋白分開。
  18. 如申請專利範圍第16項或第17項之方法，其中該毛細管包括陰極端、陽極端及偵測器。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該偵測器在該毛細管之該陰極端附近且偵測210 nm至220 nm吸光度或雷射誘導之螢光。
  20. 如申請專利範圍第16項至第19項中任一項之方法，其中該電壓為30千伏。
  21. 如申請專利範圍第16項至第20項中任一項之方法，其中該樣品包含至少一種同二聚體、至少一種異二聚體或其組合，其中該至少一種異二聚體包含第一亞單位及第二亞單位，且該至少一種同二聚體包含至少兩個相同的第一或第二亞單位。
  22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該至少一種異二聚體包含雙特異性抗體。
  23. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該至少一種同二聚體包含單株抗體。
  24. 如申請專利範圍第16項至第23項中任一項之方法，其中該配位體為肽或肽片段。
  25. 如申請專利範圍第16項至第24項中任一項之方法，其中該配位體為螢光標記之肽或螢光標記之肽片段。
  26. 如申請專利範圍第16項至第24項中任一項之方法，其中該配位體係選自由以下組成之群：人類CD3肽、小鼠CD3肽、大鼠CD3肽、兔CD3肽及食蟹猴CD3肽。
  27. 如申請專利範圍第16項至第24項中任一項之方法，該配位體經構形以藉由將一或多個胺基酸添加至該配位體之非結合區來修飾。
  28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該一或多個胺基酸係選自由麩胺酸、天冬胺酸及其組合組成之群。
  29. 如申請專利範圍第27項至第28項中任一項之方法，其中該等添加的一或多個胺基酸經構形以改變該配位體之電荷及質量。
  30. 如申請專利範圍第16項至第29項中任一項之方法，其中第一配位體-蛋白質複合物在該配位體結合至該至少一種異二聚體之該第一亞單位且不與該至少一種異二聚體之該第二亞單位結合時形成。
  31. 如申請專利範圍第16項至第30項中任一項之方法，其中第二配位體-蛋白質複合物在該配位體結合至該同二聚體之該至少兩個相同的第一或第二亞單位時形成。
  32. 如申請專利範圍第16項至第31項中任一項之方法，其進一步包括：(A)將低pH尿素緩衝液與該樣品及該配位體之混合物混合；或(B)將與0.1%聚山梨醇酯20組合之高pH HEPES緩衝液與該樣品及該配位體之混合物混合。
  33. 如申請專利範圍第16項至第32項中任一項之方法，其中該背景電解質緩衝液包含胺基-正己酸(EACA)、三伸乙基四胺(TETA)及羥丙基甲基纖維素(HPMC)。
  34. 如申請專利範圍第16項至第33項中任一項之方法，其進一步包括量化該樣品中該靶蛋白之量。
  35. 一種親和毛細管電泳配位體，其包含結合區，其中該結合區結合相關蛋白質或由相關蛋白質結合；及修飾，其中該修飾促進該相關蛋白質之分離。
  36. 如申請專利範圍第35項之配位體，其中該相關蛋白質為同二聚體。
  37. 如申請專利範圍第35項之配位體，其中該相關蛋白質為異二聚體。
  38. 如申請專利範圍第35項之配位體，其中該結合區為多肽。
  39. 如申請專利範圍第35項之配位體，其中該結合區為小分子。
  40. 如申請專利範圍第35項之配位體，其中該修飾為添加螢光標記或將一或多個胺基酸添加至該配位體中。
  41. 如申請專利範圍第35項之配位體，其中該修飾提供螢光標記或在該配位體結合至該靶蛋白時提供改變的電荷、質量、流體動力學尺寸、電泳遷移率或其組合。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030207346A1 (en) * 1997-05-02 2003-11-06 William R. Arathoon Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
CA2463301A1 (en) * 2004-04-22 2005-10-22 Atanas Iliev Lalev Method for detecting protein interactions - affinity purification with switching the ligand
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
PE20210648A1 (es) 2013-12-17 2021-03-26 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd3 y metodos de uso
MA56416A (fr) * 2015-05-12 2022-05-04 Regeneron Pharma Détermination de la pureté de protéines multimériques

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