JP2023522013A - 多重特異性分子の形成を監視するための逆相高速液体クロマトグラフィ（ｒｐ－ｈｐｌｃ）のためのシステム、材料、及び方法 - Google Patents

多重特異性分子の形成を監視するための逆相高速液体クロマトグラフィ（ｒｐ－ｈｐｌｃ）のためのシステム、材料、及び方法 Download PDF

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Abstract

多重特異性分子製造又は開発プロセス後に、多重特異性分子形成を検出するための高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法が本明細書に提供される。ＨＰＬＣ法は、多重特異性分子形成の高速で定量的なリアルタイム処理を提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は２０２０年４月１６日に出願された米国仮出願第６３／０１０，９０７号、同第６３／０１０，９１２号、同第６３／０１０，９２０号、及び同第６３／０１０，９２６号の利益を主張するものである。前述の出願の全内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
（発明の分野）
本発明は、多重特異性分子製造又は開発プロセス後に多重特異性分子形成を検出するための高圧液体クロマトグラフィ（high-pressure liquid chromatography、ＨＰＬＣ）法に関する。ＨＰＬＣ法は、多重特異性分子形成の高速で定量的なリアルタイム処理を提供する。
多重特異性分子（例えば、多重特異性抗体）の製造又はプロセスの研究開発（research and development、Ｒ＆Ｄ）中に、多重特異性分子（例えば、多重特異性抗体）の不完全な形成の可能性は、製造プロセスに関係なく残る。非還元キャピラリードデシル硫酸ナトリウム（non-reduced capillary sodium dodecyl sulfate、ＮＲ ｃＳＤＳ）は、不完全な多重特異性抗体の形成を監視するために以前から採用されてきた。しかしながら、この技術は、プロセス製造環境において、又は多重特異性分子（例えば、多重特異性抗体）開発中に、多重特異性形成を研究する際に必要な高速で定量的なリアルタイムの結果をもたらすためには実用的ではない。
したがって、多重特異性分子（例えば、多重特異性抗体）の形成を監視する高速で定量的なリアルタイムプロセスが必要である。
本明細書では、多重特異性分子の形成を検出する方法が提供される。本方法は、（ａ）多重特異性分子試料を得ることと、（ｂ）逆相高速液体クロマトグラフィ（reversed-phase high performance liquid chromatography、ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを得ることと、（ｃ）極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料をＲＰ－ＨＰＬＣカラムと接触させることであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、接触させることと、（ｄ）有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムと接触させることであって、有機非極性相が、イオンペアリング剤を含む、接触させることと、（ｅ）多重特異性分子試料を溶出することと、（ｆ）溶出された多重特異性分子試料中の多重特異性分子形成の量を監視することと、を含む。特定の実施形態では、多重特異性分子は、多重特異的抗体である。
本明細書ではまた、多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施しながら、多重特異性抗体の形成を検出する方法が提供される。本方法は、（ａ）多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施することであって、製造プロセスが、ある量の多重特異性抗体を含む多重特異性抗体試料をもたらす、実施することと、（ｂ）逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、（ｃ）ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中に多重特異性抗体試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、（ｄ）勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、（ｅ）多重特異性分子試料を溶出することと、（ｆ）溶出された試料中の多重特異性抗体の量を監視することと、を含む。
本明細書ではまた、二重特異性抗体を生成するために、制御されたＦＡＢアーム交換（controlled FAB arm exchange、ｃＦＡＥ）を実施しながら、二重特異性抗体の形成を検出する方法が提供される。本方法は、（ａ）ｃＦＡＥ試料を生成するために、制御されたＦＡＢアーム交換（ｃＦＡＥ）を実施することであって、ｃＦＡＥ試料が、ある量の二重特異性抗体を含む、実施することと、（ｂ）逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、（ｃ）ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中にｃＦＡＥ試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、（ｄ）勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、（ｅ）ｃＦＡＥ試料を溶出することと、（ｆ）溶出された試料中の二重特異性抗体形成の量を監視することと、を含む。
本明細書ではまた、安定した多重特異性抗体を設計する方法が提供される。本方法は、（ａ）多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施することであって、製造プロセスが、ある量の多重特異性抗体を含む多重特異性抗体試料をもたらす、実施することと、（ｂ）逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、（ｃ）ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中に多重特異性抗体試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、（ｄ）勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、（ｅ）多重特異性抗体試料を溶出することと、（ｆ）溶出された試料中の多重特異性抗体形成の量を監視することと、を含み、対照と比較した、多重特異性抗体形成の増加量が、安定した多重特異性抗体の設計を示す。
本明細書ではまた、多重特異性抗体を生成するための製造プロセス中に、多重特異性抗体の安定性プロファイルを得る方法が提供される。本方法は、（ａ）多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施することであって、ある量の多重特異性抗体試料が、製造プロセス中に異なる時点において得られる、実施することと、（ｂ）逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、（ｃ）ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中に各時点から多重特異性抗体試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、（ｄ）勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、（ｅ）多重特異性抗体試料を溶出することと、（ｆ）溶出された試料中の多重特異性抗体形成の量を監視することと、を含み、各時点における量の多重特異性抗体形成が、多重特異性抗体の安定性プロファイルを提供する。
本明細書ではまた、多重特異性抗体を生成するための製造プロセス中に、多重特異性抗体の分解フラグメント種プロファイルを得る方法が提供される。本方法は、（ａ）多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施することであって、ある量の多重特異性抗体試料が、製造プロセス中に異なる時点において得られる、実施することと、（ｂ）逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、（ｃ）ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中に各時点から多重特異性抗体試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、（ｄ）勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、（ｅ）多重特異性抗体試料を溶出することと、（ｆ）溶出された試料中の分解フラグメント種の量を監視することと、を含み、各時点における量の分解フラグメント種が、多重特異性抗体製造プロセスの分解フラグメント種プロファイルを提供する。
本明細書ではまた、多重特異性分子の形成を検出するための逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）部材を備えるシステムが提供される。本システムは、（ａ）極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料であって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、多重特異性分子試料と、（ｂ）ＲＰ－ＨＰＬＣカラムと、（ｃ）有機非極性移動相Ｂであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、有機非極性移動相Ｂと、を備える。ＲＰ－ＨＰＬＣカラムは、極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料と接触するように構成されており、ＲＰ－ＨＰＬＣは、有機非極性移動相Ｂと接触して、多重特異性分子試料を溶出するように更に構成されている。多重特異性分子形成の量は、溶出された多重特異性分子試料中で特定され得る。
また、多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、（ａ）極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料であって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、多重特異性分子試料と、（ｂ）ＲＰ－ＨＰＬＣカラムと、（ｃ）有機非極性移動相Ｂであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、有機非極性移動相Ｂと、を備える、手段が提供される。ＲＰ－ＨＰＬＣカラムは、極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料と接触するように構成されており、ＲＰ－ＨＰＬＣカラムは、有機非極性移動相Ｂと接触して、多重特異性分子試料を溶出するように更に構成されている。多重特異性分子形成の量は、溶出された多重特異性分子試料中で特定され得る。
特定の実施形態では、極性水系移動相Ａは、約１％～約５％のイソプロパノールを含む溶液である。溶液は、例えば、約２％のイソプロパノールを含み得る。
特定の実施形態では、極性水系移動相Ａ中のイオンペアリング剤は、トリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid、ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（difluoroacetic acid、ＤＦＡ）、及びギ酸（formic acid、ＦＡ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、イオンペアリング剤は、ＴＦＡである。ＴＦＡは、極性水系移動相Ａ中に約０．１％～約２％で存在し得る。特定の実施形態では、ＴＦＡは、極性水系移動相Ａ中に約０．１％で存在する。
特定の実施形態では、有機非極性移動相は、約６０％～約８０％のイソプロパノール及び約１５％～約２５％のアセトニトリルを含む溶液である。溶液は、例えば、約７０％のイソプロパノールを含み得る。溶液は、例えば、約２０％のアセトニトリルを含み得る。
特定の実施形態では、有機非極性移動相Ｂ中のイオンペアリング剤は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、イオンペアリング剤は、ＴＦＡである。ＴＦＡは、例えば、有機非極性移動相Ｂ中に約０．１％～約２％で存在し得る。特定の実施形態では、ＴＦＡは、有機非極性移動相Ｂ中に約０．１％で存在する。
特定の実施形態では、勾配溶出は、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体試料がＲＰ－ＨＰＬＣカラムに注入される時に、約７５％の極性移動相Ａ溶液及び約２５％の有機非極性移動相Ｂ溶液を含む溶液を含む。勾配溶出は、例えば、多重特異性抗体試料がＲＰ－ＨＰＬＣカラムに注入された後、約１６分で、約６６％の極性移動相Ａ溶液及び約３４％の有機非極性移動相Ｂ溶液を含む溶液を含み得る。勾配溶出は、例えば、多重特異性抗体試料がＲＰ－ＨＰＬＣカラムに注入された後、約２０分で、約５％の極性移動相Ａ溶液及び約９５％の有機非極性移動相Ｂ溶液を含む溶液を含み得る。勾配溶出は、例えば、多重特異性抗体試料がＲＰ－ＨＰＬＣカラムに注入された後、約２１分で、約７５％の極性移動相Ａ溶液及び約２５％の有機非極性移動相Ｂ溶液を含む溶液を含み得る。
特定の実施形態では、多重特異性抗体を生成するための製造プロセスは、ノブインホールプロセス、鎖交換操作ドメインプロセス、化学結合二重特異性抗体（bispecific antibody、ＢｓＡｂ）プロセス、免疫グロブリンドメインクロスオーバプロセス、並びに制御されたＦａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）及び二重可変ドメインプロセスからなる群から選択される。
特定の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。
上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）単一スタック構成の概略図を示す。 代表的なブランククロマトグラムを明示するグラフを示す。 抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の（完全に酸化された）参照材料の代表的なクロマトグラムを明示するグラフを示す。 部分的に酸化された抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の代表的なクロマトグラムを明示するグラフを示す。 抗ＣＤ３３／抗ＣＤ３二重特異性抗体の（完全に酸化された）参照材料の代表的なクロマトグラムを明示するグラフを示す。 部分的に酸化された抗ＣＤ３３／抗ＣＤ３二重特異性抗体の代表的なクロマトグラムを明示するグラフを示す。 抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体の（完全に酸化された）参照材料の代表的なクロマトグラムを明示するグラフを示す。 部分的に酸化された抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体の代表的なクロマトグラムを明示するグラフを示す。 抗ＣＤ１２３／抗ＣＤ３二重特異性抗体の（完全に酸化された）参照材料の代表的なクロマトグラムを明示するグラフを示す。 部分的に酸化された抗ＣＤ１２３／抗ＣＤ３二重特異性抗体の代表的なクロマトグラムを明示するグラフを示す。 抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の（完全に酸化された）参照材料の代表的なクロマトグラムを明示するグラフを示す。 部分的に酸化された抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の代表的なクロマトグラムを明示するグラフを示す。
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参考文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物を認識するか、又は確認することができよう。かかる均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
本明細書で使用するとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」、又はこれらの任意の他の変形形態は、述べられている整数又は整数群を含むことが意図されるが、これら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される。
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用するとき、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの１つ又は２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。
本明細書で使用するとき、用語「からなる（consists of）」又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含するが、追加の整数又は整数群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されることはないことを示す。
本明細書で使用するとき、用語「から本質的になる（consists essentially of）」又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数群も包含することを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。
好ましい発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外するものではないことを示すことも理解すべきである。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
本明細書で使用するとき、「ポリヌクレオチド」なる用語は、同義的に、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、これらに限定されるものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語には、１つ又は２つ以上の改変された塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性又は他の理由により改変された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「改変された」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に改変された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。
本明細書で使用するとき、「ベクター」なる用語は、別の核酸セグメントを機能的に挿入することによってそのセグメントの複製又は発現を行うことができるレプリコンのことである。
本明細書で使用するとき、「宿主細胞」なる用語は、本発明の核酸分子を含む細胞を指す。「宿主細胞」は、例えば、初代細胞、培養中の細胞、又は細胞株由来の細胞のいずれのタイプの細胞であってもよい。一実施形態では、「宿主細胞」は、本発明の核酸分子をトランスフェクトした細胞である。別の実施形態では、「宿主細胞」は、かかるトランスフェクトされた細胞の子孫又は潜在的な子孫である。ある細胞の子孫は、例えば、後続の世代で生じ得る変異若しくは環境の影響、又は宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みによって、親細胞との同一性を有していない場合がある。
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。かかる用語には、遺伝子のＲＮＡへの転写が含まれる。また、かかる用語には、ＲＮＡの１つ又は２つ以上のポリペプチドへの翻訳も含まれ、全ての天然に生じる、転写後及び翻訳後修飾も更に含まれる。発現される二重特異性抗体は、宿主細胞の細胞質内、細胞培養の成長培地などの細胞外環境中に存在し得るか、又は細胞膜に固定され得る。
本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。本明細書では、アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードが使用される。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用することができる。ポリマーは、直鎖又は分枝鎖であってよく、修飾されたアミノ酸を含むことができ、かつ非アミノ酸により中断されてもよい。本用語はまた、自然に修飾されているか、又は介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。介入の例としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識構成成分とのコンジュゲートが挙げられる。また、定義には、例えば、アミノ酸の１つ又は２つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾が含まれる。
最も広い意味で、本明細書で使用するとき、「検出する（detecting）」、「検出する（detect）」という用語、又はそれらの変形は、標的分子（例えば、多重特異性抗体）の定性的測定及び定量的測定の両方を含む。検出する（detecting）は、試料中の標的分子の単なる存在を特定すること、及び標的分子が検出可能なレベルで試料中に存在するかどうかを判定することを含む。
本明細書で使用するとき、「試料」という用語は、より多量の材料のごく一部分を指す。概して、本明細書に記載の方法による試験は、試料上で実施される。試料は、典型的には、例えば、以下に記載されるように、多重特異性分子を生成するための製造プロセスから得られる多重特異性分子調製物（例えば、多重特異性抗体調製物）から得られる。
本明細書で使用される「注入する（inject）」又は「注入する（injecting）」という用語は、水相中のＨＰＬＣカラム内の試料の充填を指し得る。試料は、検出及び／又は精製される組成物の注入及び／又は充填の前に、平衡緩衝液で平衡化することができる。
本明細書で使用される「溶出する（elute）」、「溶出する（eluting）」、及び／又は「溶出（elution）」という用語は、クロマトグラフィ材料からの生成物（例えば、多重特異性抗体）の除去を指し得る。溶出緩衝液は、クロマトグラフィ材料から多重特異性抗体を溶出するために使用される緩衝液である。
多重特異性分子形成を検出するためのシステム、材料、及び方法
本明細書では、多重特異性分子形成を検出する方法が提供される。本方法は、（ａ）多重特異性分子試料を得ることと、（ｂ）逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを得ることと、（ｃ）極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料をＲＰ－ＨＰＬＣカラムと接触させることであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、接触させることと、（ｄ）有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムと接触させることであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、接触させることと、（ｅ）多重特異性分子試料を溶出することと、（ｆ）溶出された多重特異性分子試料中の多重特異性分子形成の量を特定することと、を含む。特定の実施形態では、多重特異性分子は、多重特異的抗体である。特定の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。
本明細書では、多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施しながら、多重特異性抗体の形成を検出する方法が提供される。本方法は、（ａ）多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施することであって、製造プロセスが、ある量の多重特異性抗体を含む多重特異性抗体試料をもたらす、実施することと、（ｂ）逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、（ｃ）ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中に多重特異性抗体試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、（ｄ）勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、（ｅ）多重特異性分子試料を溶出することと、（ｆ）溶出された試料中の多重特異性抗体の量を監視することと、を含む。
本明細書ではまた、二重特異性抗体を生成するために、制御されたＦＡＢアーム交換（ｃＦＡＥ）中に、二重特異性抗体の形成を検出する方法が提供される。本方法は、（ａ）ｃＦＡＥ試料を生成するために、制御されたＦＡＢアーム交換（ｃＦＡＥ）を実施することであって、ｃＦＡＥ試料が、ある量の二重特異性抗体を含む、実施することと、（ｂ）逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、（ｃ）ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中にｃＦＡＥ試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、（ｄ）勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、（ｅ）ｃＦＡＥ試料を溶出することと、（ｆ）溶出された試料中の二重特異性抗体形成の量を監視することと、を含む。
特定の実施形態では、形成された多重特異性抗体の量は、参照試料を調製及び試験することによって決定され得る。部分的に形成された多重特異性抗体の量は、参照試料（完全に形成された）と比較することによって決定され得る。参照試料は、８０～１００％の完全に形成された多重特異性抗体を有する試料を含み得る。プロセス製造試料を参照試料と比較することにより、完全に形成された多重特異性抗体の量、及びその部分的に形成された抗体フラグメントの両方を決定することができることによって、多重特異性抗体を生成するための製造プロセスの効率及び有効性の判定を提供することができる。
多重特異性抗体を開発するためのプロセス開発動態研究においてこのアッセイを利用する方法も提供される。本方法は、（ａ）多重特異性抗体を生成するための研究開発プロセスを実施することであって、研究開発プロセスが、ある量の多重特異性抗体を含む多重特異性抗体試料をもたらす、実施することと、（ｂ）逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、（ｃ）ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中に多重特異性抗体試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、（ｄ）勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、（ｅ）多重特異的抗体試料を溶出することと、（ｆ）溶出された試料中の多重特異性抗体形成の量を監視することと、を含み、参照試料と比較した、多重特異性抗体形成の増加量は、多重特異性抗体の設計の成功を示す。
本明細書ではまた、多重特異性抗体を生成するための製造プロセス中に、多重特異性抗体の安定性プロファイルを得る方法が提供される。本方法は、（ａ）多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施することであって、ある量の多重特異性抗体試料が、製造プロセス中に異なる時点において得られる、実施することと、（ｂ）逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、（ｃ）ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中に各時点から多重特異性抗体試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、（ｄ）勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、（ｅ）多重特異性抗体試料を溶出することと、（ｆ）溶出された試料中の多重特異性抗体形成の量を監視することと、を含み、各時点における量の多重特異性抗体形成は、多重特異性抗体の安定性プロファイルを提供する。
プロセス製造試料を参照試料と比較することにより、完全に形成された多重特異性抗体の量、及びその部分的に形成された抗体フラグメントの両方を決定することができることによって、多重特異性抗体を生成するための製造プロセスの効率及び有効性の判定を提供することができる。参照試料と比較した、完全に形成された多重特異性抗体の量の増加は、多重特異性抗体の設計が、未形成及び／又は部分的に形成された多重特異性抗体フラグメントを含まない多重特異性抗体を生成するのに好ましいことを示すことができる。
本明細書ではまた、多重特異性分子の形成を検出するための逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）部材を備えるシステムが提供される。本システムは、（ａ）極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料であって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、多重特異性分子試料と、（ｂ）ＲＰ－ＨＰＬＣカラムと、（ｃ）有機非極性移動相Ｂであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、有機非極性移動相Ｂと、を備える。ＲＰ－ＨＰＬＣカラムは、極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料と接触するように構成されており、ＲＰ－ＨＰＬＣは、有機非極性移動相Ｂと接触して、多重特異性分子試料を溶出するように更に構成されている。多重特異性分子形成の量は、溶出された多重特異性分子試料中で特定され得る。
また、多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、（ａ）極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料であって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、多重特異性分子試料と、（ｂ）ＲＰ－ＨＰＬＣカラムと、（ｃ）有機非極性移動相Ｂであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、有機非極性移動相Ｂと、を備える、手段が提供される。ＲＰ－ＨＰＬＣカラムは、極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料と接触するように構成されており、ＲＰ－ＨＰＬＣカラムは、有機非極性移動相Ｂと接触して、多重特異性分子試料を溶出するように更に構成されている。多重特異性分子形成の量は、溶出された多重特異性分子試料中で特定され得る。
本明細書に開示されるように、逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）は、疎水性固定相（例えば、固定相粒子に共有結合したアルキル鎖を含む固定相）を使用するクロマトグラフィ技術である。疎水性固定相の使用は、移動相及び固定相の極性が反転されるため、順相クロマトグラフィの逆である。ＲＰ－ＨＰＬＣは、極性水系移動相を採用する。結果として、極性移動相中の疎水性分子は、疎水性固定相に吸着する傾向があり、移動相中の親水性分子は、カラムを通過し、最初に溶出される。疎水性分子は、疎水性相互作用を低減する有機（非極性）溶媒を使用して移動相の極性を低下させることによって、カラムから溶出することができる。分子は、より疎水性であるほど、固定相により強く結合し、分子を溶出するのに必要な有機溶媒の濃度が高くなる。
特定の実施形態では、極性水系移動相は、約１％～約５％のイソプロパノールを含む溶液である。溶液は、例えば、イソプロパノールを約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、又はその間の任意の値で含み得る。好ましい実施形態では、極性水系移動相は、約２％のイソプロパノールを含む。
特定の実施形態では、極性水系移動相は、アセトニトリル、プロパノール、及びテトラヒドロフラン（tetrahydrofuran、ＴＨＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む溶液である。溶液は、例えば、アセトニトリル、プロパノール、及び／又はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、又はそれらの間の任意の値で含み得る。好ましい実施形態では、極性水系移動相は、約２％のアセトニトリル、プロパノール、及び／又はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を含む。
特定の実施形態では、移動相Ａ中のイオンペアリング剤は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、イオンペアリング剤は、ＴＦＡである。ＴＦＡは、例えば、極性水系移動相中に約０．１％～約２％で存在し得る。ＴＦＡは、例えば、極性水系移動相中に約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、又はそれらの間の任意の値で存在し得る。好ましい実施形態では、ＴＦＡは、極性水系移動相中に約０．１％で存在する。
特定の実施形態では、イオンペアリング剤は、ＤＦＡである。ＤＦＡは、例えば、極性水系移動相中に約０．１％～約２％で存在し得る。ＤＦＡは、例えば、極性水系移動相中に約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、又はそれらの間の任意の値で存在し得る。好ましい実施形態では、ＤＦＡは、極性水系移動相中に約０．１％で存在する。
特定の実施形態では、イオンペアリング剤は、ＦＡである。ＦＡは、例えば、極性水系移動相中に約０．５％～約５％で存在し得る。ＦＡは、例えば、極性水系移動相中に、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％、約３．０％、約３．１％、約３．２％、約３．３％、約３．４％、約３．５％、約３．６％、約３．７％、約３．８％、約３．９％、約４．０％、約４．１％、約４．２％、約４．３％、約４．４％、約４．５％、約４．６％、約４．７％、約４．８％、約４．９％、約５．０％、又はそれらの間の任意の値で存在し得る。
特定の実施形態では、有機非極性移動相は、約６０％～約１００％のイソプロパノール及び約０％～約２５％のアセトニトリルを含む溶液である。有機非極性移動相溶液は、例えば、イソプロパノールを約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約１００％、又はそれらの間の任意の値で含み得る。好ましい実施形態では、有機非極性移動相溶液は、約７０％のイソプロパノールを含む。有機非極性移動相溶液は、例えば、アセトニトリルを約０％、約５％、約１０％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、又はそれらの間の任意の値で含み得る。好ましい実施形態では、有機非極性移動相は、約２０％のアセトニトリルを含む。
特定の実施形態では、有機非極性移動相は、アセトニトリル、イソプロパノール、及びプロパノール（例えば、ノルマルプロパノール（ｎ－プロパノール））からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む溶液である。溶液は、例えば、アセトニトリル、イソプロパノール、及び／又はプロパノールを約０％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、又はそれらの間の任意の値で含み得る。特定の実施形態では、有機非極性移動相は、約７０％のイソプロパノール、約２０％のアセトニトリル、及び約１０％の水；約７０％のｎ－プロパノール、約２０％のアセトニトリル、及び約１０％の水；約７０％のアセトニトリル、約２０％のイソプロパノール、及び約１０％の水；約８０％のイソプロパノール、及び約２０％のアセトニトリル；約８０％アセトニトリル、及び約２０％イソプロパノール；約７５％のイソプロパノール、及び約２５％のアセトニトリル；約２５％のイソプロパノール、及び約７５％のアセトニトリル；約５０％のイソプロパノール、及び約５０％のアセトニトリル、を含む。
特定の実施形態では、移動相Ｂ中のイオンペアリング剤は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、イオンペアリング剤は、ＴＦＡである。ＴＦＡは、例えば、極性水系移動相中に約０．１％～約２％で存在し得る。ＴＦＡは、例えば、極性水系移動相中に約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、又はそれらの間の任意の値で存在し得る。好ましい実施形態では、ＴＦＡは、極性水系移動相中に約０．１％で存在する。
特定の実施形態では、イオンペアリング剤は、ＤＦＡである。ＤＦＡは、例えば、極性水系移動相中に約０．１％～約２％で存在し得る。ＤＦＡは、例えば、極性水系移動相中に約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、又はそれらの間の任意の値で存在し得る。好ましい実施形態では、ＤＦＡは、極性水系移動相中に約０．１％で存在する。
特定の実施形態では、イオンペアリング剤は、ＦＡである。ＦＡは、例えば、極性水系移動相中に約１．０％～約５％で存在し得る。ＦＡは、例えば、極性水系移動相中に、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％、約３．０％、約３．１％、約３．２％、約３．３％、約３．４％、約３．５％、約３．６％、約３．７％、約３．８％、約３．９％、約４．０％、約４．１％、約４．２％、約４．３％、約４．４％、約４．５％、約４．６％、約４．７％、約４．８％、約４．９％、約５．０％、又はそれらの間の任意の値で存在し得る。
特定の実施形態では、勾配溶出は、多重特異性抗体試料がＲＰ－ＨＰＬＣカラムに注入される時に、約７５％の極性移動相Ａ溶液及び約２５％の有機非極性移動相Ｂ溶液を含む溶液を含む。勾配溶出は、例えば、多重特異性抗体試料がＲＰ－ＨＰＬＣカラムに注入された後、約１６分で、約６６％の極性移動相Ａ溶液及び約３４％の有機非極性移動相Ｂ溶液を含む溶液を含み得る。勾配溶出は、例えば、多重特異性抗体試料がＲＰ－ＨＰＬＣカラムに注入された後、約２０分で、約５％の極性移動相Ａ溶液及び約９５％の有機非極性移動相Ｂ溶液を含む溶液を含み得る。勾配溶出は、例えば、多重特異性抗体試料がＲＰ－ＨＰＬＣカラムに注入された後、約２１分で、約７５％の極性移動相Ａ溶液及び約２５％の有機非極性移動相Ｂ溶液を含む溶液を含み得る。
抗体
本明細書では、多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施しながら、多重特異性抗体形成を検出する方法、安定した多重特異性抗体を設計する方法、及び多重特異性抗体を生成するための製造プロセス中に安定性プロファイルを得る方法、又は製造プロセス中に分解フラグメント種プロファイルを得る方法が提供される。特定の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。
本明細書で使用するとき、「抗体」という用語は、広義で使用され、免疫グロブリン、又はモノクローナル又はポリクローナルであり、ヒト、ヒト化、複合、及びキメラ抗体を含む抗体分子並びに抗体フラグメントを含む。全般的には、抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。抗体の構造は、公知である。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて５つの主なクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）に割り当てることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。したがって、本発明の抗体は、５つの主要なクラス又は対応する下位クラスのいずれかのものであることができる。本発明の抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４であることが好ましい。脊椎動物種の抗体軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、すなわちκ及びλのうちの一方に割り当てることができる。したがって、本発明の抗体は、κ又はλ軽鎖定常ドメインを含有することができる。特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、ラット又はヒト抗体由来の重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む。重及び軽定常ドメインに加えて、抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなる抗原結合領域を含有し、これらのそれぞれは３つのドメイン（すなわち相補性決定領域１～３；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有する。軽鎖可変領域ドメインは、代替的にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と称され、重鎖可変領域ドメインは、代替的にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と称される。
本明細書で使用するとき、「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、２つ又は３つ以上の抗原に特異的に結合する単離された多重特異性抗体は、２つ又は３つ以上の抗原に結合しない多重特異性抗体を実質的に含まない）。更に、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない。
本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在する可能性のある自然発生変異を除いて同一である。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術、又は組換えＤＮＡ法によって作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウス又はラットから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成され得、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。
本明細書で使用するとき、「抗原結合フラグメント」という用語は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ又は２つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部分から形成される多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントを指す。抗原結合フラグメントは、親抗体又は親抗体フラグメントが結合する同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態によれば、抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、及び重鎖のＦｄフラグメントを含む。他の特定の実施形態によれば、抗原結合フラグメントはＦａｂ及びＦ（ａｂ’）を含む。
本明細書で使用するとき、用語「単鎖抗体」は、約１５～約２０個のアミノ酸の短いペプチドによって接続される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、この分野において従来既知の単鎖抗体を指す。本明細書で使用するとき、用語「単一ドメイン抗体」は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含むか、又は重鎖可変領域のみを含む、この分野において従来既知の単一ドメイン抗体を指す。
本明細書で使用するとき、用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体、又は当該技術分野において既知の任意の技術を用いて作製される、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、インタクトな若しくは完全長の抗体、そのフラグメント、並びに／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／若しくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。
本明細書で使用するとき、用語「ヒト化抗体」とは、抗体の抗原結合特性が保持されるが、人体における抗原の抗原性が低下するように、改変によりヒト抗体への配列相同性を増加させた非ヒト抗体を意味する。
本明細書で使用するとき、用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ又は３つ以上の種に由来する抗体を指す。軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、多くの場合、所望の特異性、親和性、及び能力を有する１つの種の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方で定常領域は、その種における免疫応答の誘発を回避するために、別の種の哺乳動物（例えば、ヒト）に由来する抗体の配列に対応する。
本明細書で使用するとき、「多重特異性抗体」という用語は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む抗体を指し、複数のうちの第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原上、例えば、同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複するか、又は実質的に重複する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複しないか、又は実質的に重複しない。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。一実施形態では、多重特異性抗体は、第３、第４、又は第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分子、又は四重特異性抗体分子である。
本明細書で使用するとき、「二重特異性抗体」という用語は、２つ以下のエピトープ又は２つ以下の抗原に結合する多重特異性抗体を指す。二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列、及び第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原上、例えば、同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複するか、又は実質的に重複する。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列とを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメントと、第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメントとを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメントと、第２のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ又はそのフラグメントとを含む。
本明細書では、多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施した後に、多重特異性抗体の形成を検出する方法が提供される。また、多重特異性抗体の安定性プロファイルを得る方法、及び多重特異性抗体を生成するための製造プロセス中に分解フラグメント種プロファイルを得る方法が提供される。特定の実施形態では、多重特異性抗体を生成するための製造プロセスは、制御されたアーム交換（ｃＦＡＥ）プロセス、ノブインホールプロセス、重鎖ヘテロ二量体化プロセス、及びインビトロジスルフィド結合異性化プロセスからなる群から選択される。
本発明の完全長二重特異性抗体は、例えば、２つの単一特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を用い、インビトロにおいて、無細胞環境下又は共発現使用下のいずれかで、別個の特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロ二量体形成に有利になるように各半分子において重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することにより生成することができる。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離－会合の結果である。単一特異性親抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は、低減される。親単一特異性抗体のうち１つの得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離－会合により解放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体形成よりヘテロ二量体形成を有利にするように操作され得る。得られた生成物は、各々が異なるエピトープ、すなわち、第１の抗原上のエピトープと第２の抗原上のエピトープに結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
本明細書で使用するとき、「ホモ二量体形成」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用するとき、「ホモ二量体」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
本明細書で使用するとき、「ヘテロ二量体形成」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用するとき、「ヘテロ二量体」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
「ノブインホール（knob-in-hole）」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照のこと）を使用して、完全長二重特異性抗体を生成することができる。簡潔に述べると、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進するように、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換の対は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表現）。
他の戦略、例えば、１つのＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体形成の促進が、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載されるように使用され得る。他の戦略では、ヘテロ二量体形成は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されるように、下記置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ Ｋ４０９Ｆ Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表現）により促進され得る。
上記の方法に加えて、本発明の二重特異性抗体は、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載の方法に従って、２つの単一特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域に非対称な変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下において２つの親単一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することによって、無細胞環境でインビトロにおいて生成することができる。この方法において、第１の単特異性二価抗体（例えば、抗ＣＤ３３抗体）及び第２の単特異性二価抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおける特定の置換を有するように操作される。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下において共にインキュベーションされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る例示的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びベータ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートが使用され得る。
実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
実施形態１は、多重特異性分子の形成を検出する方法であって、
ａ．多重特異性分子試料を得ることと、
ｂ．逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを得ることと、
ｃ．極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料をＲＰ－ＨＰＬＣカラムと接触させることであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、接触させることと、
ｄ．有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムと接触させることであって、有機非極性相が、イオンペアリング剤を含む、接触させることと、
ｅ．多重特異性分子試料を溶出することと、
ｆ．溶出された多重特異性分子試料中の多重特異性分子形成の量を監視することと、を含む、方法である。
実施形態２は、極性水系移動相Ａが、約１％～約５％のイソプロパノールを含む溶液である、実施形態１に記載の方法である。
実施形態３は、溶液が、約２％のイソプロパノールを含む、実施形態２に記載の方法である。
実施形態４は、極性水系移動相Ａ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態４に記載の方法である。
実施形態６は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％で存在する、実施形態５に記載の方法である。
実施形態７は、有機非極性移動相Ｂが、約６０％～約８０％のイソプロパノール及び約１５％～約２５％のアセトニトリルを含む溶液である、実施形態１に記載の方法である。
実施形態８は、溶液が、約７０％のイソプロパノールを含む、実施形態７に記載の方法である。
実施形態９は、溶液が、約２０％のアセトニトリルを含む、実施形態７又は８に記載の方法である。
実施形態１０は、有機非極性移動相Ｂ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態７～９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１は、ＴＦＡが、有機非極性水系移動相Ｂ中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態１０に記載の方法である。
実施形態１２は、ＴＦＡが、有機非極性水系移動相Ｂ中に約０．１％で存在する、実施形態１１に記載の方法である。
実施形態１３は、多重特異性分子が多重特異性抗体であり、好ましくは、多重特異性抗体が二重特異性抗体である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１４は、多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施しながら、多重特異性抗体の形成を検出する方法であって、
ａ．多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施することであって、製造プロセスが、ある量の多重特異性抗体を含む多重特異性抗体試料をもたらす、実施することと、
ｂ．逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、
ｃ．ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中に多重特異性抗体試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、
ｄ．勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、
ｅ．多重特異性抗体試料を溶出することと、
ｆ．溶出された試料中の多重特異性抗体形成の量を監視することと、を含む、方法である。
実施形態１５は、極性水系移動相Ａが、約１％～約５％のイソプロパノールを含む溶液である、実施形態１４に記載の方法である。
実施形態１６は、溶液が、約２％のイソプロパノールを含む、実施形態１５に記載の方法である。
実施形態１７は、極性水系移動相Ａ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１８は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態１７に記載の方法である。
実施形態１９は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％で存在する、実施形態１８に記載の方法である。
実施形態２０は、有機非極性移動相が、約６０％～約８０％のイソプロパノール及び約１５％～約２５％のアセトニトリルを含む溶液である、実施形態１４に記載の方法である。
実施形態２１は、溶液が、約７０％のイソプロパノールを含む、実施形態２０に記載の方法である。
実施形態２２は、溶液が、約２０％のアセトニトリルを含む、実施形態２０又は２１に記載の方法である。
実施形態２３は、有機非極性移動相Ｂ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２４は、ＴＦＡが、非極性水系移動相中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態２３に記載の方法である。
実施形態２５は、ＴＦＡが、非極性水系移動相中に約０．１％で存在する、実施形態２４に記載の方法である。
実施形態２６は、勾配溶出が、多重特異性抗体試料がＲＰ－ＨＰＬＣカラムに注入される時に、約７５％の極性移動相Ａ溶液及び約２５％の有機非極性移動相Ｂ溶液を含む溶液を含む、実施形態１４～２５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７は、勾配溶出が、多重特異性抗体試料がＲＰ－ＨＰＬＣカラムに注入された後、約１６分で、約６６％の極性移動相Ａ溶液及び約３４％の有機非極性移動相Ｂ溶液を含む溶液を含む、実施形態２６に記載の方法である。
実施形態２８は、勾配溶出が、多重特異性抗体試料がＲＰ－ＨＰＬＣカラムに注入された後、約２０分で、約５％の極性移動相Ａ溶液及び約９５％の有機非極性移動相Ｂ溶液を含む溶液を含む、実施形態２６に記載の方法である。
実施形態２９は、勾配溶出が、多重特異性抗体試料がＲＰ－ＨＰＬＣカラムに注入された後、約２１分で、約７５％の極性移動相Ａ溶液及び約２５％の有機非極性移動相Ｂ溶液を含む溶液を含む、実施形態２６に記載の方法である。
実施形態３０は、多重特異性抗体を生成するための製造プロセスが、ノブインホールプロセス、鎖交換操作ドメインプロセス、化学結合二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）プロセス、免疫グロブリンドメインクロスオーバプロセス、並びに制御されたＦａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）及び二重可変ドメインプロセスからなる群から選択される、実施形態１４～２９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１は、多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、実施形態１４～３０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３２は、二重特異性抗体を生成するための制御されたＦＡＢアーム交換（ｃＦＡＥ）を実施しながら、二重特異性抗体の形成を検出する方法であって、
ａ．ｃＦＡＥ試料を生成するための制御されたＦＡＢアーム交換（ｃＦＡＥ）を実施することであって、ｃＦＡＥ試料が、ある量の二重特異性抗体を含む、実施することと、
ｂ．逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、
ｃ．ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中にｃＦＡＥ試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、
ｄ．勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、
ｅ．ｃＦＡＥ試料を溶出することと、
ｆ．溶出された試料中の多重特異性抗体形成の量を監視することと、を含む、方法である。
実施形態３３は、極性水系移動相Ａが、約１％～約５％のイソプロパノールを含む溶液である、実施形態３２に記載の方法である。
実施形態３４は、溶液が、約２％のイソプロパノールを含む、実施形態３３に記載の方法である。
実施形態３５は、極性水系移動相Ａ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態３２～３４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３６は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態３５に記載の方法である。
実施形態３７は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％で存在する、実施形態３６に記載の方法である。
実施形態３８は、有機非極性移動相が、約６０％～約８０％のイソプロパノール及び約１５％～約２５％のアセトニトリルを含む溶液である、実施形態３２に記載の方法である。
実施形態３９は、溶液が、約７０％のイソプロパノールを含む、実施形態３８に記載の方法である。
実施形態４０は、溶液が、約２０％のアセトニトリルを含む、実施形態３８又は３９に記載の方法である。
実施形態４１は、有機非極性移動相Ｂ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態３８～４０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４２は、ＴＦＡが、非極性水系移動相中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態４１に記載の方法である。
実施形態４３は、ＴＦＡが、非極性水系移動相中に約０．１％で存在する、実施形態４２に記載の方法である。
実施形態４４は、多重特異性分子の形成を検出するための逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）部材を備えるシステムであって、
ａ．極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料であって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、多重特異性分子試料と、
ｂ．ＲＰ－ＨＰＬＣカラムと、
ｃ．有機非極性移動相Ｂであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、有機非極性移動相Ｂと、を備え、
ＲＰ－ＨＰＬＣカラムが、極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料と接触するように構成されており、
ＲＰ－ＨＰＬＣが、有機非極性移動相Ｂと接触して、多重特異性分子試料を溶出するように更に構成されており、多重特異性分子形成の量が、溶出された多重特異性分子試料中で特定され得る、システムである。
実施形態４５は、極性水系移動相Ａが、約１％～約５％のイソプロパノールを含む溶液である、実施形態４４に記載のシステムである。
実施形態４６は、溶液が、約２％のイソプロパノールを含む、実施形態４５に記載のシステムである。
実施形態４７は、極性水系移動相Ａ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載のシステムである。
実施形態４８は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態４７に記載のシステムである。
実施形態４９は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％で存在する、実施形態４８に記載のシステムである。
実施形態５０は、有機非極性移動相Ｂが、約６０％～約８０％のイソプロパノール及び約１５％～約２５％のアセトニトリルを含む溶液である、実施形態４４に記載のシステムである。
実施形態５１は、溶液が、約７０％のイソプロパノールを含む、実施形態５０に記載のシステムである。
実施形態５２は、溶液が、約２０％のアセトニトリルを含む、実施形態５０又は５１に記載のシステムである。
実施形態５３は、有機非極性移動相Ｂ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態５０～５２のいずれか１つに記載のシステムである。
実施形態５４は、ＴＦＡが、有機非極性水系移動相Ｂ中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態５３に記載のシステムである。
実施形態５５は、ＴＦＡが、有機非極性水系移動相Ｂ中に約０．１％で存在する、実施形態５４に記載のシステムである。
実施形態５６は、多重特異性分子が多重特異性抗体であり、好ましくは、多重特異性抗体が二重特異性抗体である、実施形態４４～５５のいずれか１つに記載のシステムである。
実施形態５７は、多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、
ａ．極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料であって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、多重特異性分子試料と、
ｂ．ＲＰ－ＨＰＬＣカラムと、
ｃ．有機非極性移動相Ｂであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、有機非極性移動相Ｂと、を備え、
ＲＰ－ＨＰＬＣカラムが、極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料と接触するように構成されており、
ＲＰ－ＨＰＬＣカラムが、有機非極性移動相Ｂと接触して、多重特異性分子試料を溶出するように更に構成されており、多重特異性分子形成の量が、溶出された多重特異性分子試料中で特定され得る、手段である。
実施形態５８は、実施形態５７に記載の多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、極性水系移動相Ａが、約１％～約５％のイソプロパノールを含む溶液である、手段である。
実施形態５９は、実施形態５８に記載の多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、溶液が、約２％のイソプロパノールを含む、手段である。
実施形態６０は、実施形態５７～５９のいずれか１つに記載の多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、極性水系移動相Ａ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、手段である。
実施形態６１は、実施形態６０に記載の多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％～約２％で存在する、手段である。
実施形態６２は、実施形態６１に記載の多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％で存在する、手段である。
実施形態６３は、実施形態５７に記載の多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、有機非極性移動相Ｂが、約６０％～約８０％のイソプロパノール及び約１５％～約２５％のアセトニトリルを含む溶液である、手段である。
実施形態６４は、実施形態６３に記載の多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、溶液が、約７０％のイソプロパノールを含む、手段である。
実施形態６５は、実施形態６３又は６４に記載の多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、溶液が、約２０％のアセトニトリルを含む、手段である。
実施形態６６は、実施形態６３～６５のいずれか１つに記載の多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、有機非極性水系移動相Ｂ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、手段である。
実施形態６７は、実施形態６６に記載の多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、ＴＦＡが、有機非極性水系移動相Ｂ中に約０．１％～約２％で存在する、手段である。
実施形態６８は、実施形態６７に記載の多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、ＴＦＡが、有機非極性水系移動相Ｂ中に約０．１％で存在する、手段である。
実施形態６９は、実施形態５７～６８のいずれか１つに記載の多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、多重特異性分子が多重特異性抗体であり、好ましくは、多重特異性抗体が二重特異性抗体である、手段である。
実施形態７０は、安定した多重特異性抗体を設計する方法であって、
ａ．多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施することであって、製造プロセスが、ある量の多重特異性抗体を含む多重特異性抗体試料をもたらす、実施することと、
ｂ．逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、
ｃ．ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中に多重特異性抗体試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、
ｄ．勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、
ｅ．多重特異性抗体試料を溶出することと、
ｆ．溶出された試料中の多重特異性抗体形成の量を監視することと、を含み、
対照と比較した、多重特異性抗体形成の増加量が、安定した多重特異性抗体の設計を示す、方法である。
実施形態７１は、極性水系移動相Ａが、約１％～約５％のイソプロパノールを含む溶液である、実施形態７０に記載の方法である。
実施形態７２は、溶液が、約２％のイソプロパノールを含む、実施形態７１に記載の方法である。
実施形態７３は、極性水系移動相Ａ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態７０～７２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態７４は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態７３に記載の方法である。
実施形態７５は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％で存在する、実施形態７４に記載の方法である。
実施形態７６は、有機非極性移動相が、約６０％～約８０％のイソプロパノール及び約１５％～約２５％のアセトニトリルを含む溶液である、実施形態７０に記載の方法である。
実施形態７７は、溶液が、約７０％のイソプロパノールを含む、実施形態７６に記載の方法である。
実施形態７８は、溶液が、約２０％のアセトニトリルを含む、実施形態７６又は７７に記載の方法である。
実施形態７９は、有機非極性移動相Ｂ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態７６～７８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８０は、ＴＦＡが、非極性水系移動相中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態７９に記載の方法である。
実施形態８１は、ＴＦＡが、非極性水系移動相中に約０．１％で存在する、実施形態８０に記載の方法である。
実施形態８２は、多重特異性抗体を生成するための製造プロセスが、ノブインホールプロセス、鎖交換操作ドメインプロセス、化学結合二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）プロセス、免疫グロブリンドメインクロスオーバプロセス、並びに制御されたＦａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）及び二重可変ドメインプロセスからなる群から選択される、実施形態７０～８１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８３は、多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、実施形態７０～８２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８４は、多重特異性抗体を生成するための製造プロセス中に、多重特異性抗体の安定性プロファイルを得る方法であって、
ａ．多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施することであって、ある量の多重特異性抗体試料が、製造プロセス中に異なる時点において得られる、実施することと、
ｂ．逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、
ｃ．ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中に各時点から多重特異性抗体試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、
ｄ．勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、
ｅ．多重特異性抗体試料を溶出することと、
ｆ．溶出された試料中の多重特異性抗体形成の量を監視することと、を含み、
各時点での量の多重特異的抗体形成が、多重特異性抗体の安定性プロファイルを提供する、方法である。
実施形態８５は、極性水系移動相Ａが、約１％～約５％のイソプロパノールを含む溶液である、実施形態８４に記載の方法である。
実施形態８６は、溶液が、約２％のイソプロパノールを含む、実施形態８５に記載の方法である。
実施形態８７は、極性水系移動相Ａ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態８４～８６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８８は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態８７に記載の方法である。
実施形態８９は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％で存在する、実施形態８８に記載の方法である。
実施形態９０は、有機非極性移動相が、約６０％～約８０％のイソプロパノール及び約１５％～約２５％のアセトニトリルを含む溶液である、実施形態８４に記載の方法である。
実施形態９１は、溶液が、約７０％のイソプロパノールを含む、実施形態９０に記載の方法である。
実施形態９２は、溶液が、約２０％のアセトニトリルを含む、実施形態９０又は９１に記載の方法である。
実施形態９３は、有機非極性移動相Ｂ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態９０～９２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９４は、ＴＦＡが、非極性水系移動相中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態９３に記載の方法である。
実施形態９５は、ＴＦＡが、非極性水系移動相中に約０．１％で存在する、実施形態９４に記載の方法である。
実施形態９６は、多重特異性抗体を生成するための製造プロセスが、ノブインホールプロセス、鎖交換操作ドメインプロセス、化学結合二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）プロセス、免疫グロブリンドメインクロスオーバプロセス、並びに制御されたＦａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）及び二重可変ドメインプロセスからなる群から選択される、実施形態８４～９５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９７は、多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、実施形態８４～９６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９８は、多重特異性抗体を生成するための製造プロセス中に、多重特異性抗体の分解フラグメント種プロファイルを得る方法であって、
ａ．多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施することであって、ある量の多重特異性抗体試料が、製造プロセス中に異なる時点において得られる、実施することと、
ｂ．逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、
ｃ．ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中に各時点から多重特異性抗体試料を注入することであって、極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、注入することと、
ｄ．勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相ＢをＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、適用することと、
ｅ．多重特異性抗体試料を溶出することと、
ｆ．溶出された試料中の分解フラグメント種の量を監視することと、を含み、
各時点における量の分解フラグメント種が、多重特異性抗体製造プロセスの分解フラグメント種プロファイルを提供する、方法である。
実施形態９９は、極性水系移動相Ａが、約１％～約５％のイソプロパノールを含む溶液である、実施形態９８に記載の方法である。
実施形態１００は、溶液が、約２％のイソプロパノールを含む、実施形態９９に記載の方法である。
実施形態１０１は、極性水系移動相Ａ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態９８～１００のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１０２は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態１０１に記載の方法である。
実施形態１０３は、ＴＦＡが、極性水系移動相Ａ中に約０．１％で存在する、実施形態１０２に記載の方法である。
実施形態１０４は、有機非極性移動相が、約６０％～約８０％のイソプロパノール及び約１５％～約２５％のアセトニトリルを含む溶液である、実施形態９８に記載の方法である。
実施形態１０５は、溶液が、約７０％のイソプロパノールを含む、実施形態１０４に記載の方法である。
実施形態１０６は、溶液が、約２０％のアセトニトリルを含む、実施形態１０４又は１０５に記載の方法である。
実施形態１０７は、有機非極性移動相Ｂ中のイオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、実施形態１０４～１０６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１０８は、ＴＦＡが、非極性水系移動相中に約０．１％～約２％で存在する、実施形態１０７に記載の方法である。
実施形態１０９は、ＴＦＡが、非極性水系移動相中に約０．１％で存在する、実施形態１０８に記載の方法である。
実施形態１１０は、多重特異性抗体を生成するための製造プロセスが、ノブインホールプロセス、鎖交換操作ドメインプロセス、化学結合二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）プロセス、免疫グロブリンドメインクロスオーバプロセス、並びに制御されたＦａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）及び二重可変ドメインプロセスからなる群から選択される、実施形態９８～１０９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１１は、多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、実施形態９８～１１０のいずれか１つに記載の方法である。
実施例１：制御されたＦＡＢアーム交換（ＦＡＥ）後の二重特異性抗体形成を決定するための逆相高速液体クロマトグラフィ。
逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）は、疎水性固体支持体にわたる疎水性吸収／脱着プロセスに基づいて分子を分離する。極性移動相を増加して使用すると、タンパク質と固体支持体との間の疎水性結合相互作用は、カラムからの分析物の脱着をもたらした。抗体形成が親ｍＡｂの再酸化を通して確立されるこの特定の方法では、ＲＰ－ＨＰＬＣを採用して、部分的に再酸化されたフラグメントから、インタクトな完全に酸化された二重特異性ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）（抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３３／抗ＣＤ３、抗ＴＭＥＦＦ２／抗ＣＤ３、抗７９５９／抗ＣＤ３、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３）を定量化した。試験物を、制御されたＦＡＢアーム交換（ＦＡＥ）の後にサンプリングし、ピーク形状及び分子保持を改善するために使用されるイオンペアリング剤（トリフルオロ酢酸）を含有する高度に極性の水系移動相でカラムに注入した。次いで、同じくトリフルオロ酢酸を含む有機非極性移動相を増加して、勾配溶出でカラムに適用し、分子をその疎水性特性に基づいて溶出した。カラム溶出液を２８０ｎｍで連続的に監視し、各ＩｇＧの相対量を、ピーク面積カウントをサブフラグメントＩｇＧ種と比較することによって測定した。
実施例２：二重特異性抗体用の試薬／溶液の調製
注Ａ：異なる総体積の移動相Ａ及び移動相Ｂを調製することができるが、各成分の比率を維持する必要がある。
注Ｂ：トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は低沸点及び高揮発性を有する。ＴＦＡは、ピペッティングにより正確に分注するために、＋２～８℃で保管することが推奨される。
Figure 2023522013000002
移動相Ａを調製するために、ドラフト内で、約８００ｍＬの脱イオン水を１リットルのビーカに添加した。５０ｍＬのメスシリンダで、２０ｍＬのイソプロパノールを添加した。２０ｍＬのイソプロパノールを１リットルのビーカに添加し、脱イオン水及びイソプロパノールを撹拌子で３分間混合した。１ｍＬの冷蔵ＴＦＡを注意深くピペッティングし、イソプロパノール及び脱イオン水を入れた１リットルのビーカに添加した。ＴＦＡを溶液表面の下に送達し、混合物を更に３分間撹拌した。（注：ＴＦＡは揮発性が高いため、アッセイ保持時間にわたる溶液表面下へのＴＦＡの送達が重要であった）。１リットルのビーカからの溶液を１リットルのメスシリンダに移し、脱イオン水で１リットルの目盛まで充填した。次いで、溶液を移動相Ａボトルに移した。
Figure 2023522013000003
移動相Ｂを調製するために、ドラフト内で、約９９ｍＬの脱イオン水を１リットルビーカに添加し、次に２００ｍＬのアセトニトリルを添加した。溶液を撹拌子で３分間一緒に混合した。１ｍＬの冷蔵ＴＦＡを注意深くピペッティングし、アセトニトリル及び脱イオン水を入れた１リットルのビーカに添加した。ＴＦＡを溶液表面の下に送達し、混合物を更に３分間撹拌した。（注：ＴＦＡは揮発性が高いため、アッセイ保持時間にわたる溶液表面下へのＴＦＡの送達が重要であった）。溶液を１リットルビーカから１リットルのメスシリンダに移し、イソプロパノールで１リットルの目盛まで充填した。次いで、溶液を移動相Ｂボトルに移した。
実施例３：試料及び標準調製物
二重特異性抗体は、親ホモ二量体二重特異性抗体を還元し、ｃＦＡＥを介してこれらの反応物を再酸化して、ヘテロ二量体二重特異性抗体を生成することから作製される。試験用のポストｃＦＡＥ二重特異性抗体プロセス試料を調製するために、プロセス試料は、Ａ２８０によって決定されたｃＦＡＥ ＵＦ／ＤＦ濃度から、２ｍｇ／ｍＬの最終試験濃度（移動相Ａで希釈）に、表３に従って希釈される。
Figure 2023522013000004
２ｍｇ／ｍＬで参照材料試料を調製するために、ストック濃度の二重特異性抗体を、表４に従って試料希釈剤として移動相Ａに希釈した。
Figure 2023522013000005
実施例４：ＨＰＬＣ機器の設定
機器パラメータが、表５及び表６に提供される。カラムモジュールサーモスタットを８０℃に制御して、右側区画と左側区画の両方を加熱する。接続サーモスタット毛細管は、左側（３μＬ）の発熱体に配管された。ＬＣシステムの過剰加圧及びカラムへの損傷を回避するために、８０℃のサーモスタット温度に達してから、システムへの流し込みを開始した。
Figure 2023522013000006
Figure 2023522013000007
Figure 2023522013000008
Figure 2023522013000009
 注：配列は複数の試料について拡張することができる。
実施例５：統合結果
注：手作業の統合を使用し、処理方法と統合した。
参照材料のピーク統合。
主成分の統合：参照材料主成分は、主成分ピーク及び主成分のショルダピークを含む、２つのピークで構成されていた（図３、図５、図７、図９、及び図１１）。これらの２つのピークは、最後のプレピークの谷とメインピークとの間で互いに統合され、ショルダメインピークの谷と最初のポストピークとの間で終わっていた（図３、図５、図７、図９、及び図１１）。メインピーク及び主なメインショルダピークに対するプレピーク及びポストピークは、参照材料（対照）に含有された未酸化フラグメント及び／又は残留親ホモ二量体二重特異性抗体で構成されていた。
参照材料（ＲＭ）におけるプレピークの統合は、１つのピークとして統合された。参照材料（ＲＭ）におけるポストピークの統合は、１つのピークとして統合された。
ｃＦＡＥ試験試料のピーク統合
ポストｃＦＡＥ試験物の主成分の統合：ポストｃＦＡＥ試験二重特異性抗体は、主成分ピーク及び主成分ショルダピークを含む２つのピークで構成されていた（図４、図６、図８、図１０、及び図１２）。これらの２つのピークは、最後のプレピークの谷とメインピークとの間で互いに統合され、ショルダメインピークの谷と最初のポストピークとの間で終わっていた（図４、図６、図８、図１０、及び図１２）。
主成分より前の非基線分解ピーククラスタは単一のプレピークとして互いに統合し、個々の基線分解ピークは個別に統合された。主成分のショルダピーク以降のポストピークは全て、１つのピークとして統合された。プレピーク及びポストピークは、未酸化二重特異性種を表す（図４、図６、図８、図１０、及び図１２）。
参照材料のピーク特定：二重特異性抗体参照材料に対応する２つのピークを、主成分及び主成分のショルダピークとしてラベル付けした。二重特異性抗体の前の複数のクラスタピークを互いに統合し（図３～図１２）、プレピークとしてラベル付けした。主成分に対するポストピークと主成分のショルダピークを互いに統合し（図３～図１２）、ポストピークとラベル付けした。
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明される実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。

Claims (29)

  1. 多重特異性分子の形成を検出する方法であって、
    ａ．多重特異性分子試料を得ることと、
    ｂ．逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを得ることと、
    ｃ．極性水系移動相Ａ中の前記多重特異性分子試料を前記ＲＰ－ＨＰＬＣカラムと接触させることであって、前記極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、前記接触させることと、
    ｄ．有機非極性移動相Ｂを前記ＲＰ－ＨＰＬＣカラムと接触させることであって、前記有機非極性相が、イオンペアリング剤を含む、前記接触させることと、
    ｅ．前記多重特異性分子試料を溶出することと、
    ｆ．前記溶出された多重特異性分子試料中の多重特異性分子形成の量を監視することと、を含む、方法。
  2. 前記極性水系移動相Ａが、約１％～約５％のイソプロパノールを含む溶液である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記溶液が、約２％のイソプロパノールを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記極性水系移動相Ａ中の前記イオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ＴＦＡが、前記極性水系移動相Ａ中に約０．１％～約２％で存在する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ＴＦＡが、前記極性水系移動相Ａ中に約０．１％で存在する、請求項５に記載の方法。
  7. 前記有機非極性移動相Ｂが、約６０％～約８０％のイソプロパノール及び約１５％～約２５％のアセトニトリルを含む溶液である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記溶液が、約７０％のイソプロパノールを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記溶液が、約２０％のアセトニトリルを含む、請求項７に記載の方法。
  10. 前記有機非極性移動相Ｂ中の前記イオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ＴＦＡが、前記有機非極性水系移動相Ｂ中に約０．１％～約２％で存在する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ＴＦＡが、前記有機非極性水系移動相Ｂ中に約０．１％で存在する、請求項１１に記載の方法。
  13. 多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施しながら、多重特異性抗体の形成を検出する方法であって、
    ａ．多重特異性抗体を生成するための製造プロセスを実施することであって、前記製造プロセスが、ある量の多重特異性抗体を含む多重特異性抗体試料をもたらす、前記実施することと、
    ｂ．逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、
    ｃ．前記ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中に前記多重特異性抗体試料を注入することであって、前記極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、前記注入することと、
    ｄ．勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相Ｂを前記ＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、前記有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、前記適用することと、
    ｅ．前記多重特異性抗体試料を溶出することと、
    ｆ．前記溶出された試料中の多重特異性抗体形成の量を監視することと、を含む、方法。
  14. 前記極性水系移動相Ａが、約１％～約５％のイソプロパノールを含む溶液である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記溶液が、約２％のイソプロパノールを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記極性水系移動相Ａ中の前記イオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ＴＦＡが、前記極性水系移動相Ａ中に約０．１％～約２％で存在する、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＴＦＡが、前記極性水系移動相Ａ中に約０．１％で存在する、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記有機非極性移動相Ｂが、約６０％～約８０％のイソプロパノール及び約１５％～約２５％のアセトニトリルを含む溶液である、請求項１３に記載の方法。
  20. 前記溶液が、約７０％のイソプロパノールを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記溶液が、約２０％のアセトニトリルを含む、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記有機非極性移動相Ｂ中の前記イオンペアリング剤が、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、及びギ酸（ＦＡ）からなる群から選択される、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記ＴＦＡが、前記有機非極性水系移動相Ｂ中に約０．１％～約２％で存在する、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＴＦＡが、前記有機非極性水系移動相Ｂ中に約０．１％で存在する、請求項２３に記載の方法。
  25. 多重特異性抗体を生成するための前記製造プロセスが、ノブインホールプロセス、鎖交換操作ドメインプロセス、化学結合二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）プロセス、免疫グロブリンドメインクロスオーバプロセス、並びに制御されたＦａｂアーム交換（ｃＦＡＥ）及び二重可変ドメインプロセスからなる群から選択される、請求項１３～１５、１７～２１、２３、又は２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項１３～１５、１７～２１、２３、又は２４のいずれか一項に記載の方法。
  27. 二重特異性抗体を生成するための制御されたＦＡＢアーム交換（ｃＦＡＥ）を実施しながら、二重特異性抗体の形成を検出する方法であって、
    ａ．ｃＦＡＥ試料を生成するための制御されたＦＡＢアーム交換（ｃＦＡＥ）を実施することであって、前記ｃＦＡＥ試料が、ある量の二重特異性抗体を含む、前記実施することと、
    ｂ．逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）カラムを設定することと、
    ｃ．前記ＲＰ－ＨＰＬＣカラム内の極性水系移動相Ａ中に前記ｃＦＡＥ試料を注入することであって、前記極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、前記注入することと、
    ｄ．勾配溶出を形成するために、有機非極性移動相Ｂを前記ＲＰ－ＨＰＬＣカラムに適用することであって、前記有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、前記適用することと、
    ｅ．ｃＦＡＥ試料を溶出することと、
    ｆ．前記溶出された試料中の二重特異性抗体形成の量を監視することと、を含む、方法。
  28. 多重特異性分子の形成を検出するための逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）部材を備えるシステムであって、
    ａ．極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料であって、前記極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、多重特異性分子試料と、
    ｂ．ＲＰ－ＨＰＬＣカラムと、
    ｃ．有機非極性移動相Ｂであって、前記有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、有機非極性移動相Ｂと、を備え、
    前記ＲＰ－ＨＰＬＣカラムが、極性水系移動相Ａ中の前記多重特異性分子試料と接触するように構成されており、
    前記ＲＰ－ＨＰＬＣが、前記有機非極性移動相Ｂと接触して、多重特異性分子試料を溶出するように更に構成されており、多重特異性分子形成の量が、前記溶出された多重特異性分子試料中で特定され得る、システム。
  29. 多重特異性分子形成の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）検出のための手段であって、
    ａ．極性水系移動相Ａ中の多重特異性分子試料であって、前記極性水系移動相が、イオンペアリング剤を含む、多重特異性分子試料と、
    ｂ．ＲＰ－ＨＰＬＣカラムと、
    ｃ．有機非極性移動相Ｂであって、前記有機非極性移動相が、イオンペアリング剤を含む、有機非極性移動相Ｂと、を備え、
    前記ＲＰ－ＨＰＬＣカラムが、極性水系移動相Ａ中の前記多重特異性分子試料と接触するように構成されており、
    前記ＲＰ－ＨＰＬＣカラムが、前記有機非極性移動相Ｂと接触して、多重特異性分子試料を溶出するように更に構成されており、多重特異性分子形成の量が、前記溶出された多重特異性分子試料中で特定され得る、手段。
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