TW202222824A - Egfr結合複合物及其製備和使用方法 - Google Patents

Egfr結合複合物及其製備和使用方法 Download PDF

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Abstract

對人EGFR(上皮生長因子受體)具有結合專一性之結合域包含VH域及VL域，其中該VH域及該VL域各自獨立地包含與如所揭示之胺基酸序列具有至少90%序列一致性的序列。本申請進一步提供包含該結合域之抗體。

Description

EGFR結合複合物及其製備和使用方法
相關申請的交叉引用
本申請根據專利法主張2020年9月21日提交之美國臨時申請系列第63/081,315號，及2020年11月5日提交之美國臨時申請系列第63/109,877號的申請日的利益，其全部揭示內容藉由引用的方式併入本文中。
本揭示案一般係關於使用抗體之癌症療法的技術領域，更具體地係關於製備和使用多專一性抗體。
西妥昔單抗為一種靶向人表皮生長因子受體(epithelium growth factor receptor，EGFR)之嵌合(小鼠/人)單株抗體。它於2004年在美國及歐盟被批准用於治療結直腸癌，且亦用於治療頭頸癌。 1–3除了mAb，西妥昔單抗亦已用於T細胞重定向雙專一性抗體， 4抗體-肽融合物及抗體-藥物結合物。 5
西妥昔單抗可與EGFR胞外域之域III結合，該域通常在腫瘤細胞上過度表現。西妥昔單抗在腫瘤細胞上之結合競爭性地抑制了EGF及其他配位體的結合，阻止了EGFR的二聚化，且阻止了受體酪胺酸的自磷酸化。由於抑制及減少EGFR介導之信號傳導，西妥昔單抗的結合有效下調腫瘤細胞增殖、血管生成及轉移，同時誘導細胞凋亡。除了靶向EGFR外，西妥昔單抗之Fc域亦可以與CD16a及其他Fc受體結合且募集及激活免疫機制，諸如抗體依賴性細胞毒性。 4西妥昔單抗的此等抗腫瘤特性非常適合開發組合療法，作為單一藥劑抑或作為方案的組成部分。然而，令人擔憂的為西妥昔單抗之可變區(VH/Vk)自與小鼠雜交瘤分離後仍保留在小鼠構架上。已經表明，當向人患者投與蛋白質時，使用小鼠序列，諸如小鼠VH/Vk，可以增加免疫原性的發生率。因此，具有人源化VH/Vk區之蛋白質治療劑可能會降低人中西妥昔單抗源之免疫原性的風險。
以下發明內容僅為說明性的，且不旨在以任何方式進行限制。除了上述說明性態樣、實施例及特徵之外，藉由參考圖式及以下詳細描述，其他態樣、實施例及特徵將變得顯而易見。
本申請提供了對人上皮生長因子受體(EGFR)具有結合專一性之結合域及肽、併入如本文揭示之抗EGFR結合域及肽之抗體樣蛋白、併入如本文揭示之抗EGFR結合域及肽的免疫結合物及藥物組合物、製備和使用此類抗EGFR結合域、肽及抗體樣蛋白之方法。在一個實施例中，抗EGFR抗體樣蛋白包括抗體、單株抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在一個實施例中，抗EGFR抗體可為單專一性或多專一性的。在一個實施例中，多專一性抗EGFR抗體可為雙專一性、三專一性、四專一性、五專一性或六專一性的。在一個實施例中，抗EGFR抗體可為對稱的或不對稱的。
在一個態樣中，本申請提供了對人EGFR具有結合專一性之人EGFR結合肽。肽可包括與SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、57、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、其組合具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，EGFR結合肽包括可變重(variable heavy，VH)鏈及可變輕(variable light，VL)鏈。在一個實施例中，VH鏈包含與SEQ ID NO.1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，VL鏈包含與SEQ ID NO.3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，EGFR結合肽包括scFv域且scFv域包含如本文揭示之VH鏈及VL鏈。
在一個實施例中，本申請提供了一種抗EGFR scFv域或形成此類scFv域之肽。在一個實施例中，scFv域包含與SEQ ID NO.57、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，scFv域包含如本文揭示之VH鏈及VL鏈。
在一個實施例中，EGFR結合肽可包括連接至scFv域(例如，ScFV-HIS)的至少一端的組胺酸殘基。在一個實施例中，EGFR結合肽可包括與57具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，EGFR結合肽可包括Fab域，且Fab域包含如本文揭示之VH鏈及VL鏈。在一個實施例中，EGFR結合肽可進一步包括連接至Fab域之Fc域以提供Fab-單Fc融合蛋白。在一個實施例中，Fc域包含與選自SEQ ID NO.45及47之胺基酸序列具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在另一個態樣中，本申請提供了一種對人EGFR具有結合專一性之抗體樣蛋白。抗體樣蛋白可包括具有可變重(VH)鏈及可變輕(VL)鏈之EGFR結合域。在一個實施例中，VH鏈包含與SEQ ID NO.1、5、9、13、17、21、25、29、33、37或41具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，VL鏈可包括與SEQ ID NO.3、7、11、15、19、23、27、31、35、39或43具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗體樣蛋白可包括具有與SEQ ID NO. 57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81或83具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之的胺基酸序列的scFv域。
在一個實施例中，抗體樣蛋白可為單專一性抗體。在一個實施例中，抗體可包括與SEQ ID NO.137、139、141、143；141、149、151、139、145、147或其組合具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，單專一性抗體可包括選自SEQ ID NO.137及139；141及143；141及149；151及139；145及147之序列組合的輕鏈及重鏈或其片段的對。
在一個實施例中，抗體樣蛋白可對選自腫瘤抗原、免疫信號抗原或其組合的至少2種不同抗原具有結合專一性。
在一個實施例中，抗體樣蛋白可為雙專一性抗體。在一個實施例中，雙專一性抗體可包括與SEQ ID NO.137、145、139、147、141、145、143、147、141、145、149、147、151、145、139、147或其組合具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，雙專一性抗體可包括選自SEQ ID NO.137及145及139及147；141及145及143及147；141及145及149及147；151及145及139及147之序列組合的輕鏈及重鏈(或其片段)的組合。
在一個實施例中，抗體樣蛋白可對選自腫瘤抗原、免疫信號抗原或其組合之至少3種不同抗原具有結合專一性。
在一個實施例中，抗體樣蛋白可對選自腫瘤抗原、免疫信號抗原或其組合之至少4種不同抗原具有結合專一性。
在一個實施例中，抗體樣蛋白可對選自腫瘤抗原、免疫信號抗原或其組合之至少5種不同抗原具有結合專一性。在一個實施例中，抗體樣蛋白可為五專一性抗體。
在一個實施例中，五專一性抗體可包括與SEQ ID NO.85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107或其組合具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，五專一性抗體可包括選自SEQ ID NO.85及87；89及91；93及95；97及99；101及103；105及107之序列組合的輕鏈及重鏈或其片段的對。
在一個實施例中，抗體樣蛋白可以對選自腫瘤抗原、免疫信號抗原或其組合之至少6種不同抗原具有結合專一性。在一個實施例中，抗體樣蛋白可為六專一性抗體。
在一個實施例中，六專一性抗體可包括與SEQ ID NO.109、111、113、115、117、119或其組合具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，六專一性抗體可包括選自SEQ ID NO.109及111；113及115；117及119之組合之輕鏈及重鏈或其片段的組合。
在一個實施例中，抗體樣蛋白可包括重鏈(HC)及輕鏈(LC)。在一個實施例中，HC包含與SEQ ID NO.85、89、93、97、101、105、109、113、117、137、141、145、151具有至少98%、95%或92%序列一致性之胺基酸序列；且LC包含與SEQ ID NO.87、91、95、99、103、107、111、115、119、139、143、147、149具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗體樣蛋白可包括重鏈單體及輕鏈單體，其中重鏈單體具有N端及C端，自N端至C端串聯包含：N端視情況可選之第一結合域(D1)、包含輕鏈之作為第二結合域(D2)的Fab區、Fc域、視情況可選之第三結合域(D3)及C端視情況可選之第四結合域(D4)。輕鏈可包含共價連接至C端之視情況可選的第五結合域(D5)、共價連接至N端之視情況可選的第六結合域(D6)或其組合。D1、D2、D3、D4、D5及D6中的至少一個包含如本文揭示之EGFR結合域。
在一個實施例中，D1包含EGFR結合域。在一個實施例中，D2包含EGFR結合域。在一個實施例中，D3、D4、D5及D6中的每一個都包含EGFR結合域。在一個實施例中，D1、D2、D3、D4、D5及D6各自具有對不同抗原之結合專一性，其中抗原可為腫瘤抗原、免疫信號抗原或其組合。
在一個實施例中，抗體樣蛋白可為雙專一性抗體。在一個實施例中，雙專一性抗體與包含EGFR結合域之D2不對稱，且D3對CD3具有結合專一性。
在一個實施例中，雙專一性抗體可包括與SEQ ID NO.137、145、139、147、141、145、143、147、141、145、149、147、151、145、139、147或其組合具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，雙專一性抗體可包括選自147；141及145及149及147；151及145及139及147之序列組合之輕鏈及重鏈或其片段的組合。
在一個實施例中，抗體樣蛋白可包括與SEQ ID NO.137、139、141、143、141、149、151、139、145、147或其組合具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，雙專一性抗體可包括選自SEQ ID NO.137及139、141及143、141及149、151及139、145及147之序列組合之輕鏈及重鏈或其片段的組合。
在一個態樣中，本申請提供了一種具有Fab-Fc結構之抗體樣蛋白，其中一個或多個結合域連接至Fab-Fc結構。在一個實施例中，抗體樣蛋白具有N端及C端且包括第一單體及第二單體。第一單體自N端至C端包括第一結合域(mD1)、可變重(VH)鏈、CHl域、第一鉸鏈、第一CH2域、第一CH3域及第四結合域(mD4)。第二單體自N端至C端包括第二結合域(mD2)、可變輕(VL)鏈、CL域、第二鉸鏈、第二CH2域及第二CH3域及第五結合域(mD5)。CH鏈及CL鏈形成第三結合域(mD3)。第一單體及第二單體可以藉由CHl域與CL域之間的至少一個二硫鍵以及第一鉸鏈與第二鉸鏈之間的至少一個二硫鍵共價配對，且抗體樣蛋白為至少雙特異性的。
在一個實施例中，抗體樣蛋白中的mD1、mD2、mD3、mD5及mD5中的至少一個可包括如本文揭示之EGFR結合域。在一個實施例中，mD3域包含EGFR結合域。在一個實施例中，mD2域包含EGFR結合域。在一個實施例中，mD2、mD4、mD5各自包含EGFR結合域。
在一個實施例中，抗體樣蛋白可包括與SEQ ID NO 121、123、125、127、129、131、133、135或其組合具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，抗體樣蛋白可包括選自121及123；125及127；129及131；133及135之序列組合的肽或其片段的組合。
在一個態樣中，該申請提供重鏈。在一個實施例中，重鏈可包括與SEQ ID NO.121、125、129、133具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
在一個態樣中，該申請提供輕鏈。在一個實施例中，輕鏈可包括與SEQ ID NO.123、127、131、135具有至少70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
在一個態樣中，本申請提供了編碼如本文揭示之抗體樣蛋白、輕鏈、重鏈及肽序列的經分離核酸序列。
在一個態樣中，本申請提供包含如本文揭示之經分離核酸序列的表現載體。
在一個態樣中，本申請提供了用於產生抗體樣蛋白、輕鏈、重鏈或其組合的宿主細胞。在一個實施例中，宿主細胞包括如本文揭示之經分離核酸序列。在一個實施例中，宿主細胞可為原核的或真核的。
在一個態樣中，本申請可包括免疫結合物。在一個實施例中，免疫結合物可包括如本文揭示之抗體樣蛋白、抗體、抗EGFR結合域或肽，以及細胞毒性劑。在一個實施例中，細胞毒性劑可包括化療劑、生長抑制劑、毒素或放射性同位素。
在一個態樣中，本申請提供用於治療疾病或健康狀況之藥物組合物。在一個實施例中，藥物組合物可包括如本文揭示之抗體樣蛋白、抗體、免疫結合物、抗EGFR結合域或肽，以及藥學上可接受之載劑。
在一個實施例中，藥物組合物可進一步包含治療劑。在一個實施例中，治療劑可為化學治療劑、生長抑制劑、毒素、放射性同位素或其組合。在一個實施例中，治療劑可為例如卡培他濱、順鉑、曲妥珠單抗、氟維司群、他莫昔芬、來曲唑、依西美坦、阿那曲唑、胺基魯米特、睾丸內酯、伏洛唑、福美坦、法卓唑、來曲唑、厄洛替尼、拉法替尼、達莎替尼、吉非替尼、伊馬替尼、帕唑匹尼、拉帕替尼、舒尼替尼、尼羅替尼、索拉非尼、白蛋白-帕利他賽、其衍生物或組合。
在一個態樣中，本申請提供了治療或預防個體之癌症、自體免疫疾病或傳染病的方法。在一個實施例中，方法可包括向個體投與藥物組合物之步驟，該藥物組合物包含如本文揭示之經純化抗體樣蛋白、抗體、抗EGFR域或肽。在一個實施例中，個體為哺乳動物。在一個實施例中，個體為人。
在一個實施例中，方法可進一步包括共同投與有效量之治療劑的步驟。在一個實施例中，治療劑可為抗體、化療劑、酶或其組合。
在一個實施例中，癌症可包括表現HER3或EGFR之細胞。在一個實施例中，癌症可為例如乳腺癌、結腸直腸癌、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神經膠質瘤、食道癌、鼻咽癌、腎癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、宮頸癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤
在一個態樣中，本申請提供了產生如本文揭示之抗體樣蛋白、抗體、抗EGFR域或肽的方法。在一個實施例中，方法可包括培養宿主細胞使得編碼如本文揭示之抗體樣蛋白、抗EGFR域或肽的DNA序列得以表現的步驟，以及純化如本文揭示之該等多專一性抗體樣蛋白、抗EGFR域或肽的步驟。
在一個態樣中，本申請提供了一種溶液，其包含有效濃度之如本文揭示之抗體樣蛋白、抗EGFR域或肽。在一個實施例中，溶液為個體之血漿。在一個實施例中，個體為人。
在下列實施方式中，參考了構成實施方式之一部分之附圖。在附圖中，除非上下文另有說明，否則相似之符號通常標識相似之組件。在實施方式、附圖及申請專利範圍中描述之說明性實施例不意味著為限制性的。在不脫離本文提出之主題的精神或範疇的情況下，可以利用其他實施例，且可以做出其他改變。將容易理解，本揭示案之態樣，如在此一般描述且在附圖中示出的，可以以多種不同的組態進行佈置、取代、組合、分離及設計，所有此等組態明確涵蓋於本文中。
本揭示案提供了經分離抗體；製備此類抗體、單株及/或重組單專一性抗體、多專一性抗體、抗體-藥物結合物及/或由此類抗體或抗原結合片段構成的免疫結合物之方法；含有抗體、單株及/或重組單專一性抗體、多專一性抗體、抗體-藥物結合物及/或免疫結合物之藥物組合物，製備抗體及組合物之方法，以及使用本文揭示之抗體及組合物治療癌症的方法。具體而言，本揭示案提供對人EGFR具有結合專一性之經分離單株抗體(monoclonal antibodies，mAb)或其抗原結合片段(表1，第1圖)，其中該等經分離mAb或抗原結合片段包含與選自SEQ ID NO.1及3；5及7；9及11；13及15；17及19；21及23；25及27；29及31；33及35；37及39；41及43；55；57；59；61；63；65；67；69；71；73；75；77；79；81；83；85及87；89及91；93及95；97及99；101及103；105及107；109及111；113及115；117及119；121及123；125及127；129及131；133及135；137及139；141及143；141及149；151及139；145及147；137、145、139及147；141、145、143及147；141、145、149及147；151、145、139及147之序列具有一致性的胺基酸序列。
如本文所用，術語「一個」、「一」及「該」係定義為表示「一個或多個」且包括複數，除非上下文不合適。
如本文所用，術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」係可互換的且定義為指由藉由肽鍵連接之胺基酸構成之生物分子。
術語「抗原」係指可以在生物體，尤其動物，更尤其包括人在內之哺乳動物中誘導免疫反應之實體或其片段。該術語包括免疫原及其負責抗原性或抗原決定子之區域。
術語「抗原-或表位結合部分或片段」、「可變區」、「可變區序列」或「結合域」係指能夠結合抗原(諸如本申請中之EGFR)之抗體片段。抗原結合片段(antigen-binding fragment，Fab)係抗體上與抗原結合之區域(Fab區)。此等片段可能具有完整抗體之抗原結合功能及附加功能。結合片段之實例包括但不限於單鏈Fv片段(scFv)，該scFv由在單個多肽中藉由合成連接子連接之抗體單臂的可變輕鏈(variable light chain，VL)及可變重鏈(variable heavy chain，VH)域組成，或Fab片段，該Fab片段為由VL、恆定輕鏈(constant light，CL)、VH及恆定重鏈1(constant heavy 1，CH1)域組成之單價片段。
抗體片段甚至可為更小的亞片段，且可以由小到單個CDR域之域，尤其為來自VL及/或VH域之CDR3區組成(例如參見Beiboer等人，J. Mol. Biol. 296:833-49(2000))。使用熟習此項技術者已知之習知方法產生抗體片段。可以使用與完整抗體所用相同之技術針對效用篩選抗體片段。
「抗原-或表位結合部分或片段」、「可變區」、「可變區序列」或「結合域」可以藉由多種本領域已知技術源自本揭示案之抗體。例如，經純化單株抗體可以用酶(諸如胃蛋白酶)裂解，且進行HPLC凝膠過濾。抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，每個片段都有一個單一抗原結合位點，及一個殘留「Fc」片段，其名稱反映了其易於結晶的能力。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原組合位點且仍然能夠交聯抗原之F(ab') 2片段。然後可以藉由膜過濾及其類似手段收集及濃縮含有Fab片段之適當部分。對於分離抗體活性片段之一般技術的進一步描述，參見例如，Khaw, B. A.等人J. Nucl. Med. 23:1011-1019(1982)；Rousseaux等人Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986。
術語「抗體」以最廣泛的含義使用，具體涵蓋單株抗體及/或重組抗體(包括激動劑及拮抗劑抗體)、具有多表位專一性之抗體組合物以及抗體片段(例如，Fab、F(ab') 2及Fv)，只要它們表現出所需生物活性。在一些實施例中，抗體可為單株、多株、嵌合、單鏈、多專一性或多效、人及人源化抗體，以及其活性片段。結合已知抗原之分子之活性片段的實例包括Fab、F(ab') 2、scFv及Fv片段，包括Fab免疫球蛋白表現文庫之產物及任何上述抗體及片段的表位結合片段。
術語「Fv」係指含有完整抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此區域由緊密非共價締合之一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域之二聚體組成。正是在此組態中，每個可變域之三個CDR相互作用以定義VH-VL二聚體表面上的抗原結合位點。總的來說，六個CDR賦予抗體抗原結合專一性。然而，即使單個可變域(或僅包含三個對抗原具有專一性之CDR的Fv的一半)亦具有識別及結合抗原之能力，儘管親和力低於整個結合位點。
在一些實施例中，抗體可包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有結合位點且免疫專一性結合抗原之分子。典型的抗體係指通常包含兩條重(heavy，H)鏈及兩條輕(light，L)鏈之異四聚體蛋白。每條重鏈包含重鏈可變域(縮寫為VH)及重鏈恆定域。每條輕鏈包含輕鏈可變域(縮寫為VL)及輕鏈恆定域。根據恆定域之胺基酸序列，來自任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)的輕鏈可以分為兩種明顯不同的類型之一，稱為κ及λ。VH及VL區可以進一步細分為高變互補決定區(complementarity determining region，CDR)之區域及稱為構架區(framework region，FR)之更保守區。每個可變域(VH或VL)通常由三個CDR及四個FR構成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在輕鏈及重鏈之可變區內存在與抗原相互作用之結合區。
根據其重鏈恆定域之胺基酸序列，免疫球蛋白可分為不同類別。免疫球蛋白主要有五類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中一些可以進一步分為子類(同型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3及IgG-4；IgA-1及IgA-2。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別免疫球蛋白之次單元結構及三維組態為眾所周知的。
如本文所用，術語「單株抗體」係指自基本上同質的抗體群體中獲得之抗體，即，除了可能以少量存在之天然存在的突變之外，構成群體之個別抗體為相同的。單株抗體具有高度專一性，針對單個抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定子(表位)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑相比，每種單株抗體針對抗原上的單個決定子。除了專一性之外，單株抗體之優勢在於它們係由雜交瘤培養物合成，不受其他免疫球蛋白的污染。修飾語「單株」表示自基本上同質的抗體群體中獲得之抗體的特徵，不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，根據本揭示案使用之單株抗體可以藉由Kohler & Milstein, Nature,256:495(1975)首先描述之雜交瘤方法製備，或者可以藉由重組DNA方法製備(參見例如，美國專利第4,816,567號)。「重組」係指在外源宿主細胞中使用重組核酸技術產生抗體。
可以使用多種方法產生單株抗體，包括但不限於小鼠雜交瘤、噬菌體顯示、重組DNA、直接自原代B細胞分子選殖抗體及抗體發現方法(參見Siegel. Transfus. Clin. Biol.2002；Tiller. New Biotechnol. 2011；Seeber等人PLOS One. 2014)。單株抗體可包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈的一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體之片段，只要它們表現出所需生物活性(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81:6851-6855 [1984])。
如本文所用，術語「多專一性」抗體表示具有至少兩個結合位點之抗體，每個結合位點對抗原之表位具有結合親和力。如本文所用，術語「雙專一性、三專一性、四專一性、五專一性或六專一性」抗體表示具有兩個、三個、四個、五個或六個抗原結合位點之抗體。例如，本文揭示之具有五個結合位點的抗體為五專一性的，具有六個結合位點為六專一性的。
術語「導引及導航控制(GNC)」蛋白係指能夠結合至少一種效應細胞(如免疫細胞)抗原及至少一種標靶細胞(諸如腫瘤細胞、免疫細胞、或微生物細胞)抗原(WO2019191120A1，藉由引用的方式整體併入本文)之多專一性蛋白。GNC蛋白可以採用包括Fab區及Fc區之抗體核心結構，其中各種結合域連接至抗體核心，在這種情況下，GNC蛋白亦稱為GNC抗體。GNC蛋白可以採用抗體樣結構，在這種情況下，Fv片段可以替換為非基於抗體之結合域，諸如NKG2D、4-1BBL(4-1BB受體配位體)、用於4-1BB之4-1BBL三聚體，或受體。
術語「GNC抗體」係指具有能夠同時與至少一種效應細胞(諸如免疫細胞)及至少一種標靶細胞(諸如腫瘤細胞、免疫細胞、或微生物細胞)結合之抗體結構的GNC蛋白。如本文所用，術語「雙GNC、三GNC、四GNC、五GNC或六GNC」抗體表示具有兩個、三個、四個、五個或六個抗原結合位點之GNC抗體，其中至少一個抗原結合位點具有對免疫細胞之結合親和力，且至少一個抗原結合位點具有對腫瘤細胞之結合親和力。在一個實施例中，本文揭示之GNC抗體具有四至六個結合位點(或結合域)且分別為四GNC、五GNC及六GNC抗體。在一些實施例中，GNC抗體包括抗體結合域(諸如Fab及scFv)，而無需在Fc區中進行額外的蛋白質工程化。在一個實施例中，GNC抗體另外具有保留對於每種靶向抗原之二價性的優點。又在一個實施例中，GNC抗體具有親合力效應之優勢，其導致對抗原之更高親和力及更慢的解離速率。每種抗原的此二價性與許多多專一性平台形成鮮明對比，此等平台對每個靶向抗原都是單價的，因此通常會失去使抗如此強體結合之有益親合力效應。
術語「人源化抗體」係指一類工程化抗體，其CDR源自非人供體免疫球蛋白，分子的其餘免疫球蛋白源部分源自一種(或多種)人免疫球蛋白。此外，可以改變構架支持殘基以保持結合親和力。獲得「人源化抗體」之方法係熟習此項技術者熟知的。(參見例如，Queen等人，Proc.Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032(1989)，Hodgson等人, Bio/Technology, 9:421(1991))。
術語「經分離」或「經純化」係指不含至少一些天然存在之組分的生物分子。「經分離」或「經純化」，當用於描述本文揭示之各種多肽時，係指已經自表現它的細胞或細胞培養物中鑑定及分離及/或回收的多肽。通常，經純化多肽將藉由至少一個純化步驟來製備。「經分離」或「經純化」抗體係指基本上不含具有不同抗原結合專一性之其他抗體的抗體。
術語「免疫原性」係指引發或增強針對免疫原性試劑之抗體、T細胞或其他反應性免疫細胞的產生且有助於人或動物之免疫反應的物質。當個體針對投與之本揭示案的免疫原性組合物產生足夠抗體、T細胞及其他反應性免疫細胞以緩和或減輕待治療之病症時，發生免疫反應。雖然免疫原性反應通常包括免疫反應之細胞(T細胞)與體液(抗體)臂，但針對治療性蛋白之抗體(抗藥抗體，ADA)可能由IgM、IgG、IgE及/或IgA同型組成。
術語「專一性結合」、「專一性結合至」或「對特定抗原或表位具有專一性」係指該結合與非專一性相互作用可量測地不同。例如，可以藉由與對照分子之結合相比決定分子之結合來量測專一性結合，對照分子通常為不具有結合活性之類似結構的分子。例如，專一性結合可以藉由與類似於標靶之對照分子的競爭來決定。
術語「親和力」係指兩個多肽之間的吸引力的度量，諸如抗體/抗原、受體/配位體等。兩個多肽之間的內在吸引力可以表示為特定相互作用之結合親和力平衡解離常數(KD)。KD結合親和力常數可以例如藉由生物層干涉術量測，其中KD為kdis(解離速率常數)與kon(締合速率常數)之比率，如KD=kdis/kon。
對特定抗原或表位之專一性結合可以例如藉由對於抗原或表位具有至少約10-4 M、至少約10-5 M、至少約10-6 M、至少約10-7 M、至少約10-8 M、至少約10-9 M，或者至少約10-10 M、至少約10-11 M、至少約10-12 M或更大之KD的抗體來展示，其中KD係指特定抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。通常，專一性結合抗原之抗體對於對照分子之KD相對於抗原或表位大20-、50-、100-、500-、1000-、5,000-、10,000-或更多倍。
此外，對於特定抗原或表位之專一性結合可以例如藉由對於表位相對於對照具有至少20-、50-、100-、500-、1000-、5,000-、10,000-或更多倍之KA或Ka的抗體來展示，其中KA或Ka係指特定抗體-抗原相互作用之締合速率。
西妥昔單抗之一個潛在缺點為它的可變區在小鼠中發現的，此等區域保留了非人序列。已經證明，與人源化或人抗體相比，嵌合抗體可能具有增加之免疫原性能力。 6在另一個態樣中，人源化可以藉由使構架區更加相容來增加抗體的穩定性。 7另一個問題為VH N85(Kabat)上佔據之聚醣位點，其中Fab醣化可能會影響抗體之生物學特性，且引入必須在製造過程中得到良好控制的聚醣異質性。 8,9雖然基於抗西妥昔單抗IgG反應之低發生率(5%)，西妥昔單抗之免疫原性似乎較低，但超敏反應很常見，主要係由於預先存在的抗半乳糖-α-1,3-半乳糖寡糖之IgE抗體會改變在SP2/0細胞中表現之VH。 10–12
為了克服此等缺陷，西妥昔單抗經人源化，目的在於移除翻譯後修飾位點、穩定抗體且降低免疫原性之可能性，同時保持對EGFR的高親和力。人源化策略包括直接CDR移植至穩定之人構架上，序列導引移植至最相似之生殖系或共同構架上，以及基於人源化突變之經預測穩定性作用的結構導引方法。結果為一組具有優異生物物理特性之人源化西妥昔單抗序列，其中結構建模方法最成功地生成穩定的結合物，而不會損失EGFR親和力。
在非人物種中發現之抗體的人源化是一種常見的做法，不僅可以降低免疫原性，亦可以增加穩定性且消除序列不利條件。在此研究中，使用三種不同的策略對西妥昔單抗scFv人源化，包括無偏CDR移植、序列導引之人源化及模型導引之人源化(表2)。儘管每種方法都成功地產生了人性增強之EGFR結合劑，但在整個人源化策略中，穩定性及親和力保留有明顯的趨勢。儘管簡單CDR移植導致不穩定性及抗原親和力之最大損失(4倍)，而序列同源性方法導致穩定性及親和力較適度降低(2倍)，模型導引之方法最成功，具有顯著的穩定性且抗原親和力沒有變化。
當表現為mAb時，人源化形式H7相對於西妥昔單抗具有更高之效價及熱穩定性、未改變的結合動力學以及在轉化為雙專一性αEGFR x αCD3 格式時類似的 TDCC 效力(表8)。
除了卓越的生物物理特性外，人源化形式消除了與西妥昔單抗之小鼠可變區相關的序列不利條件。所有人源化之VH及VL的人性都顯著增加，且基於對MHCII等位基因之預測親和力，免疫原性肽的存在似乎減少(表1)。儘管難以預測治療性抗體之免疫原性，但人性之增加及T細胞表位數量之減少可能會降低免疫原性的發生率。 17,18,20此外，醣化及脫醯胺位點之移除降低了批次間表徵的複雜性，且消除了免疫原性Fab醣的潛力，即使在非人細胞中表現時亦是如此。
人源化後，嘗試對VL之三個C端殘基進行額外修飾，以此作為減少scFv聚集之手段。 13,15,16由於沒有CH1/CL域，scFv之表面不自然地暴露於溶劑。由於人Vλ比Vκ具有更疏水C端以及更少帶電殘基(LTVL相對於LEIK)，因此它的最後一個β片可能具有更好的填充。事實上，此修飾在所有三種情況下都減少了聚集(平均降低了8%)，且在三種情況中的兩種情況下增加了效價及熱穩定性(表6)。
此外，IgG抗體在N297處有一個保守的N-醣化位點，位於上部Fc域內的CH2域中。此外，由於可變區有時存在N-醣化模體，少數抗體在Fab區中醣化(8)。抗體治療劑之的聚醣概況必須按批次進行常規表徵，以確保在大規模表現及純化過程中獲得一致及均質的蛋白質。當聚醣位點位於抗體之Fab及Fc內時，就會出現一個挑戰，因為必須對分子進行消化或以其他方式解卷積才能清楚地識別每個位點的聚醣概況。然而，移除Fab域內之聚醣通常會損害其對靶向抗原的親和力，因為聚醣可以穩定活性抗原結合構形。在西妥昔單抗之情況下，抗體在VH域(9)之N99(AHo)處醣化，由於需要額外的品質控制步驟來表徵其聚醣位點，醣化增加了商品成本。在保留對於EGFR之原始親和力的同時移除Fab聚醣代表了產生更容易表徵且仍保持全部功效之抗體的重大飛躍。
西妥昔單抗之前已經使用其他策略進行了人源化。西妥昔單抗之一項CDR移植研究產生了一種抗體，該抗體可以與過表現EGFR之細胞結合，但親和力降低了9倍。 21,22K D之此增加反映了本研究中觀察到之CDR移植的親和力變化。此外，西妥昔單抗已被醣工程化以移除α-1,3-半乳糖表位，展示了一種降低此抗體免疫原性的替代方法。 23總的來說，此處提供之資料表明，西妥昔單抗之蛋白質工程化可以提高其穩定性及免疫原性特性，更普遍地表明，序列導引方法，尤其結構導引方法可用於生成具有優異穩定性及結合特性之人源化抗體。
藉由參考本文所包括之特定實施例及實例之以下詳細描述，可以更容易地理解本揭示案。儘管已經參考某些實施例之具體細節描述了本揭示案，但不應將此等細節視為對本揭示案範疇的限制。 實例 實例1.人源化EGFR結合序列
使用Lake Pharma抗體分析儀(https://dm.lakepharma.com/bioinformatics/)計算序列之人性，該分析儀提供T20分數(範圍0至100，100為最人性化的)(表1，第2C圖)。值得注意的是，當僅計算構架區之分數時，野生型小鼠序列的分數較低，為66.44(VH)及70.38(VK)。相比之下，人源化變體(例如H1-H11)之序列具有顯著更高的T20人性分數，範圍自76.95至88.10(VH)及自81.44至91.04(VK)。因此，由於較低的MHCII結合及較高的人性程度，預計人源化變體之序列具有比小鼠序列更低的免疫原性。
為了增加西妥昔單抗可變區之人性且降低免疫原性的潛力，將小鼠VH及Vk域轉化為更人性化的構架(第1圖)。H1形式係基於將Kabat CDR殘基簡單移植至穩定的人構架上。 13H8、H9、H10及H11形式係根據與人生殖系序列之序列同源性來設計。特定而言，對於H10及H11形式，構架殘基經突變以匹配最相似之人生殖系序列。對於H8及H9形式，構架殘基突變為人抗體中之共同殘基。其餘人源化形式(H2、H3、H4、H5、H6、H7)係根據西妥昔單抗之結構分析，藉由將構架殘基突變為在人生殖系中以至少5%頻率出現之彼等殘基來設計，導致電腦模擬中最穩定的結構。由於此類人源化之能量分析取決於輸入模型，因此檢查了幾種輸入結構。H2形式使用西妥昔單抗晶體結構1YY9。 14H3、H4、H5、H6及H7形式使用自Discovery Studio之抗體建模特征生成的scFv模型，基於西妥昔單抗 可變域之序列。H4、H5、H6及H7形式在輸入序列中併入了變化，以增加VH C端與人共同序列之相似性，或使Vκ C端更像Vλ。在Discovery Studio中進行人源化後，藉由將Vκ域之最後三個殘基轉化為來自λJ基因之相應殘基來進一步修飾H7、H9及H11。由於最後一個VLβ鏈在決定scFv穩定性及聚集傾向方面之已知重要性，以及Vλ端之疏水性更強，可以提供填充能量以穩定相互作用，因此評估了此變化。 13,15,16所有人源化策略總結在表2中。
對於人源化形式H1，西妥昔單抗Kabat CDR經移植至先前描述的穩定構架上。 13所有其他人源化形式均使用Discovery Studio 2020套件設計。H8-H11形式係使用完全基於西妥昔單抗之胺基酸序列作為查詢序列之預測人源化突變方案來設計。一致性閾值設為50，頻繁殘基取代耐受性設為20，生殖系取代耐受性設為0，排除Kabat CDR殘基、IMGT CDR殘基、遊標區殘基及人生殖系殘基之取代。H10及H11形式係基於生殖系取代生成，而H8及H9形式使用頻繁殘基取代。使用不同的西妥昔單抗輸入模型設計H2-H7形式，將計算突變能設為真(CHARMm力場)，以生成最佳單一突變序列。查詢結構為西妥昔單抗之各種模型，如表2所示。H2形式使用PDB 1YY9之西妥昔單抗組分(西妥昔單抗與EGFR複合)以捕獲結合狀態下CDR的姿態。H3-H7形式使用由Discovery Studio的Antibody Modeling Cascade生成的西妥昔單抗模型。輸入序列對於H3為西妥昔單抗VH及VL、對於H4及H7為西妥昔單抗VH(以TVSS結束而非TVSA)及VL、對於H5為西妥昔單抗VH及VL(以LTVL結束而非LELK)且對於H6為西妥昔單抗VH(以TVSS結束而非TVSA))及VL(以LTVL結束而非LELK)用於。使用的前5個構架模板之序列相似性截止值為10。CDR環路定義設為Honegger，每個環路之最大模板數設為3，優化級別設為高。生成人源化序列後，H10、H8及H4形式分別修改為H11、H9及H7，方法是將VL之最後四個殘基取代為LTVL，以模擬λ抗體之穩定FR4。
西妥昔單抗可變域及其人源化形式之序列顯示在(第1圖)中。圖A及B分別顯示了VH及VL序列之比對。CDR區側翼及結構上重要之構架區中的遊標區殘基亦經保守以維持抗原結合。序列之間胺基酸一致性之檢查(表3)表明人源化VH序列與西妥昔單抗具有84-87%一致性，且彼此間具有79-100%一致性。排除具有經修飾λJ區之形式的比較，根據定義，具有經修飾λJ區之形式與相應未經修飾人源化具有100%VH一致性，人源化VH序列之間的最大一致性為95%。人源化VL序列與西妥昔單抗具有79-86%一致性，彼此間具有76-98%一致性。值得注意的為，當僅比較構架區時，序列一致性降低(西妥昔單抗VH及人源化VH之一致性為70-82%，西妥昔單抗VL及人源化VL之一致性為60-82%)。
除了Fc聚醣，野生型西妥昔單抗在VH域(Kabat N85，已知被醣化)及VK域(Kabat N41，NGS醣化模體之一部分)中分別具有2個潛在醣化位點。此外，此相同VK N49可以經脫醯胺，因為它形成了一個NG脫醯胺模體。為了去除與此等翻譯後修飾位點的之穩定性及製造評估相關的不利條件，在所有人源化序列H1-H11中去除了所有3個不利條件(2個醣化及1個脫醯胺化)(第1圖)。特定而言，在西妥昔單抗中包含佔據之NDT醣化模體的Kabat殘基VH N85在人源化中經修飾為A、D或E胺基酸，從而消除了此已知聚醣位點。類似地，在西妥昔單抗中包含NGS醣化模體之VL N41在所有人源化中經更改為更典型的G殘基。
野生型西妥昔單抗及人源化可變區之人性係使用基於構架區序列之T20人性分數來計算。 17西妥昔單抗為一種具有小鼠可變區之嵌合抗體，其T20分數較低，分別為66.44(VH)及70.38(Vκ)。人源化VH域之T20分數自66.44增加至76.95-88.10的範圍(表1，第2A圖)，而人源化Vκ域之分數自70.38增加至81.44-91.04的範圍(表1，第2B圖)。因此，西妥昔單抗可變區之人源化顯著改善了此等序列之人性化，這可以基於與人生殖系序列同源性增加來降低免疫原性。
雖然生物製劑中非人序列的存在會以抗藥抗體(ADA)的形式導致免疫原性，但只有當攻擊B細胞被激活以進行類別轉換重組為IgG亞型時，才會發生強大之高親和力ADA。此B細胞激活需要呈遞之MHCII肽與CD4+T細胞上的相容T細胞受體結合。因此，若治療性抗體包含與MHCII類穩定結合之肽，則更可能發生不希望的ADA反應。
MixMHC2pred算法(https://github.com/GfellerLab/MixMHC2pred)用於預測抗體序列內之MHCII結合配位體。 18該算法檢測給定胺基酸序列中『核心』肽之數量，該等肽將以足夠親和力與MHCII結合以形成穩定的T細胞表位。序列中鑑定出之MHCII結合肽的數量越多，該序列包含之潛在T細胞表位就越多。值得注意的為，該算法無法區分免疫原性肽及耐受性肽；然而，大量之核心肽增加了含有一些促免疫原性肽之可能性。MixMHC2pred算法係自其GitHub儲存庫購買及下載。在包含(G 4S) 4連接子之VL/VH scFv序列上運行算法後，計算不同序列之核心肽的數量且製成表格。對多個等位基因進行評分，從而可以評估序列中是否存在MHCII之任何等位基因的強配位體。根據序列中可以與任何MHCII等位基因結合之肽數量計算核心肽的數量，其中分數在前0.2%之相互作用中。
為了評估西妥昔單抗可變區中MHCII表位之存在，藉由預測MHCII結合親和力之計算器運行VH及VL序列。MixMHC2pred算法係基於約100,000個肽與不同HLA-II等位基因之結合。 18根據輸入序列，MixMHC2pred評估序列中每個肽與每個HLA-II等位基因之結合，且根據每個殘基與任何等位基因之最強相互作用返回每個殘基的排名分數。根據所有相互作用中排名前0.2%之獨特肽的數量計算與MHC結合之核心肽的數量。為了將評分系統簡化為每個VH-VL對的單個值，序列作為scFv[VL-(G 4S) 3-VH]運行，這說明了VH與VL兩者內的肽。使用此系統，計算了西妥昔單抗及人源化序列之MHCII核心肽的數量(表1，第2C圖)。儘管未將MHCII結合用作人源化之標準，但所有人源化序列所具有的分數在0.2%之相互作用內之肽數量減少。西妥昔單抗有12個核心肽，而人源化序列有7-11個核心肽。MHCII結合之此減少，結合更多之人序列，可能會降低人源化可變區之免疫原性的可能性。此外，在小鼠序列中鑑定了CDR內的12個殘基，此等殘基經預測為MHCII結合肽之一部分。在許多人源化變體中，包括H2、H3、H4、H5、H6、H7、H10及H11，MHCII結合肽中CDR殘基之數量減少。 實例2.製備及表徵人源化EGFR結合肽、域、抗體及抗體樣蛋白之方法
為了表徵各種單一治療劑形式之人源化抗EGFR可變區，即藉由以下方法產生及表徵EGFR結合複合物，α huEGFR變體(α huEGFR)、帶His標籤之scFv蛋白(scFv-6His)、重組scFv-單Fc單體(scFv-單Fc)、單株抗體(mAb)、雙專一性抗體(雙專一性)、五-GNC抗體(五GNC)、六-GNC抗體(六GNC)及五-微型GNC抗體(微型GNC)，如表4中所列。 2a. EGFR結合複合物之表現及純化
蛋白質穩定性為由折疊狀態與展開狀態之間的自由能差值所定義之關鍵參數。對於蛋白質治療劑，穩定性可能會影響免疫原性、藥代動力學，甚至功效(7)，且減少聚集有助於開發更易於製造且對患者更安全的治療劑。此外，表現效率及蛋白質產量直接決定了蛋白質治療劑的成本。若可以更有效地表現蛋白質以達到更高之效價且增加純化蛋白質之產量，則可以顯著降低製造成本。
藉由在ExpiCHO系統(Thermo Fisher)中轉染帶His標籤之scFv或scFv-單Fc(單質體)的表現質體或共轉染重鏈及輕鏈(用於其他格式)來表現蛋白質，統稱為EGFR結合複合物。簡而言之，用OptiPRO SFM培養基將10 μg各表現質體(或20 μg未配對質體)達到1 ml。將1 ml含有80 ul Expifectamine CHO試劑之OptiPRO SFM培養基添加至DNA中，且在室溫下溫育2.5分鐘。然後將所得混合物加入至125毫升錐形瓶中之25 ml ExpiCHO細胞中，每毫升6×10 6個細胞，且在37℃，5%CO 2，150 rpm下溫育。細胞在轉染後24小時用8.75 ml ExpiCHO飼料及150 μl CHO強化子餵養，且轉移至32℃、5% CO 2、150 rpm。在轉染後48小時再次用8.75 ml ExpiCHO飼料餵養細胞。轉染後8天收集培養物上清液，以4500 rpm離心1小時以沉澱細胞，然後通過0.2毫米過濾器。
使用1 ml MabSelect PrismA蛋白質A管柱(GE Healthcare)自收集之上清液中純化含Fc之蛋白質。管柱用磷酸鹽緩衝鹽水平衡。然後上清液以2 ml/min之流速通過管柱。用10 ml PBS+0.1% Triton X-100、然後10ml PBS+300 mM NaCl、最後10 ml PBS洗滌管柱。然後藉由使5 ml 50 mM 醋酸鈉，pH 3.5 通過管柱來溶析蛋白質。藉由添加0.5 ml 1M Tris-Cl，pH8.0立即中和溶析的蛋白質。
使用1 ml HisTrap HP管柱或1 ml蛋白質L(CaptoL)管柱(GE)自收集之上清液中純化帶His標籤之scFv蛋白。管柱用含有 0.5 M NaCl及20 mM 咪唑，pH 7.4(HisTrap)或PBS(蛋白質L)之磷酸鹽緩衝鹽水平衡。上清液中加入10x 結合緩衝液以達到 0.5 M NaCl及20 mM咪唑(僅His trap)，且以2 ml/min之流速流過管柱。用10 管柱體積之含有0.5 M NaCl及20 mM 咪唑(HisTrap)或PBS(蛋白質L)之PBS 洗滌管柱，使用含有0.5 M NaCl及500 mM咪唑，pH 7.4(HisTrap)或50 mM 醋酸鈉pH 3.5之PBS溶析蛋白質，隨後用0.5 ml 1M Tris pH 8.0(蛋白質L)中和。
在第一步蛋白質A或His標籤純化後，立即使用 Waters Acquity UPLC H-Class及ACQUITY UPLC® Protein BEH SEC 200Å，4.6 mm×150 mm，1.7 µm管柱藉由分析型SEC分析scFv-單Fc蛋白。PBS(125 mM 磷酸鈉，137 mM 氯化鈉，pH 6.8)用作流動相，以 0.3 ml/min的速度運行 10 分鐘，注入 10 µg 蛋白質。為了獲得更高解析度，替代使用 Acquity Arc Waters HPLC及XBridge BEH SEC 300Å、7.8×300 mm、3.5 µm 管柱藉由分析型SEC來分析 mAb。PBS(150 mM 磷酸鈉，100 mM 氯化鈉，pH 6.8)用作流動相，以0.714 ml/min的速度運行20分鐘，注入50 µg 蛋白質。對每種蛋白質進行了兩次單獨的純化評估，感興趣之峰值百分比報告為平均值±標準偏差。 2b. 用於表徵EGFR結合複合物之結合專一性及親和力之分析
在Octet96或Octet384儀器上進行生物層干涉術(Octet)結合分析，以確保含有人源化西妥昔單抗結合域之蛋白質保留與其同源抗原之結合。藉由以10 μg/ml加載180秒，將含Fc之蛋白質捕獲至抗人Fc(AHC)感測器尖端。或者，使用製造商協定，以10 ug/ml將帶His標籤之蛋白質共價結合至AR2G尖端。在60秒的基線步驟後，以分析緩衝液(含有0.1% BSA、0.05% Tween20之磷酸鹽緩衝鹽水)中的連續稀釋(0-200 nM；1:2.5稀釋因子)或單一100 nM濃度之純化人EGFR進行180至300秒之締合階段，然後在分析緩衝液中進行300至600秒之解離階段。使用10 mM甘胺酸，pH 1.5實現再生。結合曲線與1:1模型整體擬合以提取解離常數K D。每種蛋白質的結合動力學一式兩份進行評估，列表值報告為平均值±標準偏差。 2c. 用於表徵EGFR結合複合物之TDCC之分析
多專一性抗體(統稱為GNC抗體)中之人源化抗EGFR域的腫瘤靶向特性係藉由測試它們在參與T細胞活化、重定向T細胞介導之細胞溶解且最終殺死標靶細胞的同時誘導腫瘤專一性細胞毒性之能力進行評估。基於發光之T細胞依賴性細胞毒性(TDCC)分析用於藉由經螢光素酶之組成型表現定量細胞生存力來量測抗體誘導之細胞毒性的程度。
螢光化BXPC3腫瘤細胞(ATCC)在37℃、5% CO2下在含有10%胎牛血清之 RPMI 1640 培養基中培養。用Vi-CELL自動細胞計數器(Beckman Coulter)監測細胞生存力。將每孔500個腫瘤細胞(20 µL)接種至384孔、白色、平底聚苯乙烯TC處理之微孔板(Corning)中，且在37℃、5% CO2下溫育。24小時後，加入人泛T細胞以達到5:1之效應子與靶標(E-T)比，且加入5倍稀釋系列(0–30 nM)之抗體。使用Multidrop散裝液體分配器(BIOTEK)分配細胞。加入抗體稀釋液(10 µL/孔)，將板在37℃、5% CO2下再溫育72小時，然後進行基於發光之細胞生存力定量。
為了定量由組成型表現之螢火蟲螢光素酶產生的發光，使用了Bright-Glo螢光素酶分析系統(Promega)。在室溫下加入BrightGlo試劑(每孔20 µL)，且用發光偵測板讀數器(BMG Labtech)定量發光。藉由在Microsoft Excel中轉換資料且用GraphPad Prism 6軟體「log(激動劑)相對於反應-可變斜率(四個參數)」進行分析來決定抗體EC50。報告得到之EC50值。TDCC分析一式四份進行，具有良好的板間重現性，且在板上的不同位置沒有看到顯著的變異性。 實例3.帶His標籤之EGFR結合scFv蛋白。
將編碼人源化(H1)抗EGFR結合域之序列選殖至帶His標籤之scFv表現格式中，在scFv之C端含有殘基GSHHHHHH。將表現載體轉染至25 mL ExpiCHO中且表現8天，然後收集且經由蛋白質L親和力層析進行純化。H1變體之效價顯著高於小鼠形式(表5)。
蛋白質L純化後之分析SEC資料表明，人源化scFv的聚集顯著少於野生型小鼠序列所編碼之scFv(第3圖，表5)。此外，主峰向右移動，這與醣化位點之修飾及VH之所得無醣化一致。
Octet用於驗證人源化scFv蛋白可以與人EGFR結合(第4圖)。帶His標籤之scFv蛋白係經由共價結合以10 ug/ml加載於AR2G感測器上，且結合至帶His標籤之人EGFR的連續稀釋液(最高200 nM，1:2.5稀釋)。由此產生之與1:1結合模型之整體擬合表明，野生型小鼠scFv與人源化scFv蛋白均以低奈米莫耳濃度範圍內之親和力結合至EGFR(表5)。
動態光散射用於比較scFv蛋白的熱穩定性(第5圖)。溫度以0.5℃/min自25℃上升至75℃，同時藉由Wyatt DynaPro板讀數器III監測scFv蛋白(1 mg/ml)之半徑。資料表明H1形式具有顯著更高之Tm值(表5)，與增加的穩定性一致。
亦使用胍及尿素展開分析檢查了對化學變性的穩定性(第6圖)。將濃度為0.1 mg/ml之蛋白質與24種濃度為0至5.4 M之鹽酸胍或濃度為0至7.2 M之尿素一起溫育隔夜。在CLARIOstar板讀數器上量測螢光強度(激發295 nm，發射360 nm)，將螢光強度歸一化以表示展開蛋白之分數，且使用S形擬合提取EC50值以進行穩定性比較。根據所得EC50值，人源化變體H1比野生型更能抵抗胍變性導致的展開(表5)。 實例4.人源化EGFR結合scFv-單Fc融合蛋白
為了評估人源化西妥昔單抗VH及VL域之生物物理特性，將序列選殖至scFv格式中且融合至單Fc以促進純化及Octet分析。 19scFv域處於VL-VH定向，且在VH與VL域之間包括一個(G 4S) 4連接子。值得注意的為，生成scFv小組比生成相應的mAb小組更有效，後者需要單獨選殖重鏈及輕鏈。作為對照，亦產生野生型西妥昔單抗scFv及由修飾的天冬醯胺殘基突變產生的無醣化形式(VH N85E)。
在ExpiCHO細胞中瞬時轉染編碼野生型、無醣化(N85E)及人源化scFv-單Fc蛋白之質體，且使用蛋白質A親和力層析自細胞上清液中純化蛋白質。如表6所示，儘管包含相同單Fc域且使用相同的密碼子優化算法，但大多數人源化蛋白質之表現效價優於西妥昔單抗之野生型及簡單無醣化形式。野生型及無醣化西妥昔單抗之平均效價分別為163及116 µg/ml，而對於H8及H7，人源化形式之平均效價分別在220至506 µg/ml範圍內。
在第一步蛋白質A純化後，使用分析型尺寸排阻層析(SEC)來評估scFv-單Fc蛋白之聚集(第7A圖，表6)。由於少量聚集，野生型及無醣化西妥昔單抗分別具有93.6%及94.9%的所關注蛋白質，而人源化形式之聚集程度平均相似。聚合最少之形式(H9)具有97.4%的所關注蛋白質，而聚合最多之形式(H4)具有82.6%的所關注蛋白質。Vκ C端包括來自Vλ之序列的修飾似乎減少了聚集。含有此等Vλ殘基(H11、H9及H7)之人源化形式比使用原始Vκ殘基之相應形式(分別為H10、H8及H4)具有更少的聚集。對所有蛋白質進行製備型SEC以移除聚集體，交換至儲存緩衝液中，且確保後續受益於使用高純度蛋白質之生物物理分析的準確性。經純化scFv-單Fc蛋白之SDS-PAGE證明N85E及所有人源化形式相對於野生型西妥昔單抗的遷移率增加，證實此等變體缺乏醣化(第7C圖)。
使用NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝膠(Thermo Fisher，NP0323BOX)及MES運行緩衝液(Thermo Fisher，NP0002)藉由SDS-PAGE分析scFv-單Fc蛋白。在含有或不含10 mM DTT之LDS樣品緩衝液(Thermo Fisher，NP0007)中製備3 µg的每種蛋白質，且在70℃下加熱10分鐘。凝膠在150V下運行50分鐘，用SimplyBlue(Thermo Fisher，LC6065)染色，且用水脫色然後成像。
藉由生物層干涉術評估scFv-單Fc蛋白與人EGFR之結合，以表明人源化過程是否改變了結合動力學(表6，第8A圖)。使用單Fc域將蛋白質加載至抗人Fc(AHC)感測器上，然後將scFv結合至人EGFR細胞外域之連續稀釋液。野生型西妥昔單抗scFv之親和力為3.18 nM，與之前的報告一致。無醣化變體(N85E)具有非常相似之結合動力學，KD為3.16 nM，表明醣化對於抗原結合並非為所必需的。
人源化形式之KD值分為三個主要類別。對於在穩定的人構架(H1)上使用直接CDR移植物的人源化形式，結合親和力降低了4倍，此係由於解離速率增加所致。對於基於與單個人生殖系之序列同源性(H10、H11)或人生殖系之全域資料集(H8、H9)的人源化，結合親和力持續降低2倍，其中更快的解離再次成為動力學決定因素。最後，對於基於結構同源性(H2至H7)之人源化，結合親和力沒有顯著降低。
scFv-單Fc蛋白之熱穩定性係藉由動態光散射(表6，第9A圖)藉由觀察隨著溫度自25℃上升至85℃時流體動力學半徑的增加來評估。
由於不同樣品之展開曲線形狀複雜且不均勻，因此使用半徑超過10 nm時之溫度來客觀比較蛋白質穩定性。使用該指標，野生型西妥昔單抗蛋白在47.2℃時展開，而無醣化N85E變體似乎不太穩定，在44.5℃時展開。因此，佔據的醣化位點可能有助於穩定野生型西妥昔單抗scFv之折疊構象。
與結合結果相似，觀察到三個主要類別之穩定性。對於基於CDR移植至無關人構架之人源化，穩定性相對於野生型西妥昔單抗略有下降。相對於西妥昔單抗，五個人源化形式表現出相似或略微增強的穩定性。其中兩個係基於與人生殖系(H8、H9)全域資料集之序列同源性，而三個係基於結構建模(H4、H5、H7)。最後，五個人源化形式似乎比其他蛋白質顯著更穩定。H10及H11係藉由CDR移植至序列最同源之人構架上產生，而H2、H3及H6係基於同源模型。與SEC資料顯示藉由使用來自λJ基因之C端殘基系統地減少聚集相反，DLS資料沒有顯示此等殘基對穩定性的一致影響。儘管H11及H7形式之穩定性分別相對於H10及H4略有增加，但H9實際上似乎不如其相對的H8穩定。 實例5.人源化抗EGFR單株抗體
為瞭解scFv-單Fc蛋白之特性是否會轉化為IgG格式，針對野生型西妥昔單抗、無醣化變體N85E及西妥昔單抗之人源化形式生成mAb。基於最高蛋白質表現、低聚集、改良之熱穩定性及不變之結合親和力，選擇人源化形式H7用於轉換為mAb格式。藉由在ExpiCHO細胞中瞬時轉染產生三種mAb蛋白，且在表現9天後收集。
反映scFv-單Fc結果，人源化H7之表現效價相對於野生型或無醣化西妥昔單抗之表現效價增加(表8)，儘管效價差異不如scFv-mFc格式明顯。蛋白質A純化後，所有蛋白之純度藉由分析型SEC評估均＞99%(表8，第7B圖)。值得注意的為，mAb之聚集顯著少於相應的scFv-mFc蛋白，這可能歸因於IgG主鏈相對於scFv及單Fc域之內在穩定性。SEC資料還表明，野生型西妥昔單抗之保留時間顯著短於無醣化N85E或人源化H7形式。這種表觀分子大小之差異可歸因於西妥昔單抗的醣化，而N85E及人源化形式中不存在這種醣化。
藉由生物層干涉術評估mAb與人EGFR之結合動力學(表8，第8B圖)，且證明不同形式之間的結合親和力或動力學沒有差異。此等結果證實了scFv-單Fc蛋白之結果，這表明無醣化突變N85E及H7之人源化突變不會破壞西妥昔單抗CDR與其抗原的相互作用。mAb之結合親和力與相應的scFv-單Fc蛋白之結合親和力相似。
最後，重複DLS實驗以表徵mAb之穩定性(表8，第9B圖)。野生型及無醣化西妥昔單抗具有非常相似的穩定性(分別在68.3及68.1℃時展開)，而H7形式之展開溫度升高，為72.5℃。因此，無論scFv抑或mAb格式，人源化形式H7似乎都比野生型西妥昔單抗更穩定。 實例6：具有T細胞接合器及人源化EGFR結合之雙專一性抗體
作為功能活性之最終評估，產生雙專一性形式的西妥昔單抗且用於T細胞依賴性細胞毒性(TDCC)分析。西妥昔單抗的三個形式(野生型、N85E、H7)在CH3域中含有K409R突變，當與含有互補F405L突變之抗CD3抗體一起溫育時，允許發生受控之Fab臂交換。由互補的抗EGFR及抗CD3 mAb形成的αEGFR x αCD3雙專一性抗體係藉由陽離子交換層析得到證實(第10圖)。使用Agilent 1260無限四元HPLC及Thermo Scientific ProPac™ SCX-10 HPLC管柱，4×250 mm，10 µm，在35℃下藉由陽離子交換層析來分析抗體。Thermo Scientific CX-1 pH梯度緩衝液用作流動相(表7含有梯度步驟)。加載50 µg蛋白質樣品且以0.5 ml/min之流速分離，在35分鐘內以下表所示的梯度溶析。
為了評估TDCC活性，在384孔板中以5:1的效應子：標靶比將雙專一性抗體及對照mAb之系列稀釋液與活化之T細胞及螢光素化攜帶EGFR之BxPC3標靶細胞一起溫育(第11圖，表8)。在37℃下溫育3天後，加入BrightGlo試劑讀取發光，發光與剩餘標靶細胞志數量成正比。雙專一性西妥昔單抗x αCD3抗體顯示出有效之腫瘤細胞殺死，EC50值為24.6 nM。無醣化N85E及人源化H7顯示出相似之EC50值(分別為30.7及20.3 pM)，具有重疊的95%置信區間。相比之下，對照mAb(αCD3、西妥昔單抗或西妥昔單抗H7)均未顯示任何高達30 nM之BxPC3殺死，表明細胞毒性需要同時靶向腫瘤細胞與T細胞兩者。因此，當在TDCC分析中測試時，西妥昔單抗之人源化形式保留了西妥昔單抗之生物學功能。 實例7. 具有人源化抗EGFR scFv或Fab 域之五-GNC抗體
人源化EGFR結合變體H1、H4及H7經組態且選殖至五GNC格式中的四個scFv位置之一或Fab位置(第12圖，D1或D2位置)。將蛋白質轉染至25 mLExpiCHO中且表現8天，然後藉由蛋白質A親和力層析進行收集及純化。蛋白質以良好的效價表現(表9)。
蛋白質A純化後之分析型SEC資料表明，包含scFv或Fab形式之人源化抗EGFR域之五GNC抗體可以低聚集表現(第13圖，表9)。
Octet用於驗證具有人源化抗EGFR域(例如H1、H4、H7)之五-GNC抗體可以結合至人EGFR(第14圖)。五-GNC抗體係經由AHC感測器以10 ug/ml加載，且與連續稀釋(最高200 nM，1:2.5稀釋)或單一100-nM濃度之帶His標籤的人EGFR結合。由此產生之與1:1結合模型之整體擬合表明，五-GNC抗體以低奈莫耳濃度範圍內之親和力結合至EGFR(表10)。
使用螢光素化BXPC3細胞作為標靶細胞測試了兩種五-GNC抗體之TDCC活性(第15圖)。將五GNC抗體之5倍系列稀釋液(0-30 nM)加入500個BxPC3細胞及2500個活化T細胞(效應子：靶標為5:1)之混合物中，溫育72小時，然後量測對應於標靶細胞之生存力的發光讀數。由此產生之與S形函數的擬合表明，五-GNC抗體之EGFR結合域(H7)有效地靶向BxPC3腫瘤細胞，藉由共同溫育之T細胞殺死，如亞皮莫耳濃度範圍內的EC50值所示(表9)。 實例8.具有人源化抗EGFR scFv或Fab域之六-GNC抗體
人源化抗EGFR結合變體H7經組態且在五個scFv位置之一或Fab位置(第12圖，D1或D2位置)選殖至六GNC格式中。將蛋白質轉染至25 mL ExpiCHO中且表現8天，然後藉由蛋白質A親和力層析進行收集及純化。蛋白質以良好的效價表現(表11)。
蛋白質A純化後之分析型SEC資料表明，含有人源化抗EGFR域(scFv或Fab)之六GNC分子可以低聚集表現(第16圖，表11)。值得注意的為，與含有西妥昔單抗之蛋白質相比，含有H7形式之兩種蛋白質的聚集顯著減少。
Octet用於驗證含有人源化抗EGFR域之六GNC抗體可以結合至人EGFR(第17圖)。六-GNC蛋白係經由AHC感測器以10 ug/ml加載，且與連續稀釋(最高200 nM，1:2.5稀釋)或單一100-nM濃度之帶His標籤的人EGFR結合。由此產生之與1:1結合模型之整體擬合表明，六GNC抗體以低奈莫耳濃度範圍內的親和力結合至EGFR(表11)。
在使用螢光素化BXPC3細胞作為標靶細胞之TDCC生物分析中測試了一種六GNC的活性(第18圖)。將六GNC抗體之5倍系列稀釋液(0-30 nM)加入500個BxPC3細胞及2500個活化T細胞的混合物中，溫育72小時，然後量測對應於標靶細胞之生存力的發光讀數。由此產生之與S形函數的擬合表明六-GNC抗體之EGFR結合域(H7)有效地靶向BxPC3腫瘤細胞，藉由共同溫育之T細胞殺死，如亞皮莫耳濃度範圍內之EC50值所示(表11)。 實例9.具有人源化抗EGFR scFv或Fab域之五-微型GNC抗體
人源化EGFR結合變體H1、H4及H7經組態且在四個scFv位置(mD1、mD2、mD4、mD5)或Fab(mD3)位置選殖至五-微型GNC格式(PCT/US2021/022847，藉由引用的方式整體併入本文)(第19圖)。將蛋白質轉染至25 mL ExpiCHO中且表現8天，然後藉由蛋白質A親和力層析進行收集及純化。蛋白質以良好的效價表現(表12)。
蛋白質A純化後的分析型SEC資料表明含有人源化抗EGFR域之五-微型GNC分子可以低聚集表現(第20圖，表12)。
Octet用於驗證含有人源化抗EGFR域(H4、H7)之五-微型GNC抗體可以結合至人EGFR(第21圖)。五-微型GNC抗體經由AHC感測器以10 ug/ml加載，且與連續稀釋(最高200 nM，1:2.5稀釋)或單一100-nM濃度之帶His標籤的人EGFR結合。由此產生之與1:1結合模型之整體擬合表明，五-微型GNC以低奈莫耳濃度範圍內的親和力結合至EGFR(表12)。
使用螢光素化BXPC3細胞作為標靶細胞測試了兩種五-微型GNC抗體之TDCC活性(第22圖)。將5倍系列稀釋(0-30 nM)之五-微型GNC抗體加入500個BxPC3細胞及2500個活化T細胞(效應子：標靶標為5:1)的混合物中，溫育72小時，然後量測對應於標靶細胞之生存力的發光讀數。由此產生之與S形函數之擬合表明，五-微型GNC抗體之EGFR結合變體H7有效靶向BxPC3腫瘤細胞，藉由共同溫育的T細胞殺死，如亞皮莫耳濃度範圍內之EC50值所示(表12)。 表 表1. VH/VK 區域之人源化預測免疫原性降低及人性分數增加(僅限構架區)
形式 核心肽 核心肽中之CDR殘基 序列長度 VH T20分數 VK T20分數
西妥昔單抗 13 12 241 66.44 70.38
H1 9 12 241 88.10 87.69
H2 10 6 241 77.07 81.44
H3 11 6 241 76.95 82.56
H4 11 6 241 77.47 86.26
H5 8 10 241 78.56 82.88
H6 9 10 241 77.30 83.63
H7 11 6 241 77.47 84.04
H8 11 12 241 81.09 86.31
H9 11 12 241 81.09 82.63
H10 7 10 241 85.11 91.04
H11 7 10 241 85.11 87.44
表2. 產生人源化西妥昔單抗變體之方法
人源化形式 方法 基礎 啟動序列/模型 修飾
H1 CDR 移植至穩定構架上 序列 西妥昔單抗，FW1.4gen 沒有任何
H2 DS最佳單一突變 模型 PDB 1YY9 沒有任何
H3 DS最佳單一突變 模型 西妥昔單抗模型 沒有任何
H4 DS最佳單一突變 模型 西妥昔單抗模型(TVSS) 沒有任何
H5 DS最佳單一突變 模型 西妥昔單抗模型(LTVL) 沒有任何
H6 DS最佳單一突變 模型 西妥昔單抗模型(TVSS-LTVL) 沒有任何
H7 DS最佳單一突變 模型 西妥昔單抗模型(TVSS) λJ
H8 DS頻繁殘基取代 序列 西妥昔單抗 沒有任何
H9 DS頻繁殘基取代 序列 西妥昔單抗 λJ
H10 DS生殖系取代 序列 西妥昔單抗 沒有任何
H11 DS生殖系取代 序列 西妥昔單抗 λJ
表3. 分別野生型西妥昔單抗、無醣化西妥昔單抗(N85E)及人源化西妥昔單抗形式(H1-H11)之整個VH域(A)、VH構架區(整個VH域，除Kabat CDR殘基外)(B)、整個VL域(C)及VL構架區(整個VL域，除Kabat CDR殘基外)(D)之序列單位矩陣。
Figure 02_image001
表4. 人源化EGFR結合序列變體(可變區H1-H11)、帶His標籤之scFv蛋白(scFv-6His)、重組scFv-單Fc單體(scFv-單Fc)、單株抗體(mAb)、雙專一性抗體(雙專一性)、五-GNC抗體(五GNC)、六-GNC抗體(六GNC)及五-微型GNC抗體(微型GNC)形式之EGFR結合複合物。
西妥昔單抗形式 scFv-6His scFv-單Fc 單株抗體 雙專一性 五GNC 六GNC 微型GNC
野生型 SI-79R1 SI-79SF1 SI-79C1 SI-79X1 SI-77H5
無醣化(N85E) SI-79SF2 SI-79C5 SI-79X5
H1 SI-79R2 SI-79SF3 SI-55P3 SI-55P4 SI-68P7
H2 SI-79SF12
H3 SI-79SF10
H4 SI-79SF4 SI-79C2 SI-79X2 SI-79P2 SI-79P3 SI-79P1
H5 SI-79SF11
H6 SI-79SF9
H7 SI-79SF6 SI-79C3 SI-79X3 SI-55P9 SI-77P1 SI-55H11 SI-77H4 SI-68P13 SI-68P17
H8 SI-79SF5
H9 SI-79SF7
H10 SI-79SF8
H11 SI-79SF13
表5. 帶His標籤之人源化抗EGFR scFv的表徵。
蛋白質 αhuEGFR 效價 (微克/毫升) aSEC %POI DLS Tm (℃) Gdn EC50 (M) huEGFR KD (nM)
SI-79R1 西妥昔單抗 13.8 39.5 47.87 1.42 2.08
SI-79R2 H1 108.2 84.5 71.37 2.92 12.0
表6. 西妥昔單抗源之scFv-單Fc蛋白之生物物理特性。數值是兩個獨立實驗之平均值及標準偏差。
形式 效價 (微克/毫升) aSEC %POI DLS溫度(℃) EGFR K D(nM) k a[1/(M·s)] × 10 5 k d(1/s) × 10 -3
WT 163 ± 39 93.6 ± 2.6 47.2 ± 1.0 3.18 ± 0.18 4.44 ± 1.13 1.42 ± 0.44
N85E 116 ± 6 94.9 ± 3.1 44.5 ± 1.3 3.16 ± 0.35 4.44 ± 0.91 1.42 ± 0.44
H1 309 ± 26 91.5 ± 7.1 46.2 ± 0.9 13.1 ± 1.2 7.18 ± 1.68 9.27 ± 1.34
H2 411 ± 59 86.8 ± 2.1 52.4 ± 2.1 3.08 ± 0.68 4.81 ± 0.91 1.51 ± 0.61
H3 418 ± 8 88.1 ± 2.7 52.3 ± 2.0 3.45 ± 0.81 5.04 ± 0.92 1.77 ± 0.73
H4 412 ± 5 82.6 ± 5.5 49.7 ± 1.4 3.05 ± 0.62 4.50 ± 0.54 1.39 ± 0.44
H5 394 ± 23 85.6 ± 6.2 50.2 ± 1.5 2.27 ± 0.38 4.74 ± 1.31 1.10 ± 0.48
H6 372 ± 73 88.0 ± 3.4 52.2 ± 2.0 3.42 ± 0.36 4.76 ± 1.33 1.65 ± 0.62
H7 506 ± 14 92.7 ± 2.3 50.5 ± 2.4 3.14 ± 0.53 4.47 ± 0.97 1.43 ± 0.54
H8 220 ± 3 92.2 ± 0.0 51.3 ± 1.1 6.79 ± 1.35 5.71 ± 0.78 3.93 ± 1.30
H9 211 ± 22 97.4 ± 0.9 48.7 ± 1.3 6.92 ± 1.58 5.63 ± 0.67 3.95 ± 1.35
H10 308 ± 3 83.7 ± 1.9 52.6 ± 1.3 6.77 ± 2.10 6.65 ± 0.73 4.58 ± 1.89
H11 376 ± 12 88.6 ± 2.4 53.0 ± 1.3 6.74 ± 1.61 6.61 ± 1.11 4.54 ± 1.81
表7：αEGFR及αCD3 抗體之陽離子交換分離的梯度方法。
梯度 時間(分鐘) %B
0.00 0.0
3.00 0.0
5.00 25.0
20.00 70.0
20.01 100.0
25.00 100.0
25.01 0.0
35.00 0.0
表8. 西妥昔單抗源之單株抗體的生物物理特性。數值是兩個獨立實驗之平均值及標準偏差。
形式 效價 (微克/毫升) aSEC %POI DLS溫度(℃) EGFR KD (nM) ka[1/(M·s)] ×105 kd(1/s) ×10-4 *EC50 (pM)
WT 203 ± 13 99.9 ± 0.2 68.3 ± 0.1 2.68 ± 0.07 3.46 ± 0.27 9.26 ± 0.48 24.6 [10.4-58.4]
N85E 209 ± 9 99.4 ± 0.3 68.1 ± 0.9 2.46 ± 0.28 3.26 ± 0.41 7.96 ± 0.09 30.7 [11.3-83.8]
H7 249 ± 1 99.1 ± 0.4 72.5 ± 1.2 2.41 ± 0.15 3.37 ± 0.20 8.12 ± 0.05 20.3 [13.9-29.9]
*使用 αCD3×αEGFR雙專一性抗體耗盡EGFR+ BxPC3 細胞之EC50 值，括號中顯示了95%置信區間。 表9. 包含人源化抗EGFR scFv域或人源化抗EGFR Fab區之五-GNC抗體的表徵。
GNC抗體 αEGFR變體 GNC域 GNC結合域 效價 (微克/毫升) aSEC %POI huEGFR K D(nM) TDCC EC50 (pM)
SI-55P3 H1 scFv (1) αCD3 (2), αPD-L1 (3), α4-1BB (4), αCD19 (6) 175.9 86.13 18.1 nd
SI-55P4 H1 scFv (1) αCD3 (2), αPD-L1 (3), 41BBLT (4), αCD19 (6) 59.6 93.22 nd nd
SI-79P2 H4 scFv (1) αCD3 (2), αPD-L1 (3), α4-1BB (4), αCD19 (6) 68.9 87.74 4.30 nd
SI-79P3 H4 scFv (1) αCD3 (2), αPD-L1 (3), 41BBLT (4), αCD19 (6) 70.3 92.80 5.21 nd
SI-55P9 H7 scFv (1) αCD3 (2), αPD-L1 (3), α4-1BB (4), αCD19 (6) 118.0 85.96 6.88 0.5727
SI-77P1 H7 Fab (2) αCD3 (1), αPD-L1 (3), α4-1BB (4), αCD19 (6) 98.1 77.94 2.17 0.0826
表10. EGFR結合複合物之Octet結合分析。
蛋白質 Octet結合動力學
K D(nM) k a(M -1s -1) k d(s -1)
SI-79R1 2.08 657000 0.00137
SI-79R2 12.00 894000 0.01070
SI-55P3 18.10 601000 0.01090
SI-79P2 4.30 328000 0.00141
SI-79P3 5.21 284000 0.00148
SI-55P9 6.88 297000 0.00204
SI-77P1 2.17 212000 0.00046
SI-77H5 3.39 286000 0.00097
SI-55H11 4.65 268000 0.00125
SI-77H4 3.29 214000 0.00122
SI-79P1 3.03 425000 0.00158
SI-68P13 5.64 389000 0.00219
SI-68P17 2.46 259000 0.00064
表11. 包含人源化抗EGFR scFv域或人源化抗EGFR Fab區之六GNC抗體的表徵。
GNC抗體 αEGFR變體 GNC域 GNC結合域 效價 (微克/毫升) aSEC %POI huEGFR K D(nM) TDCC EC50 (pM)
SI-77H5 西妥昔單抗 Fab (2) αCD3 (1), αPD-L1 (3), α4-1BB (4), αHER3 (5), αCD19 (6) 35.0 72.02 3.39 nd
SI-77H4 H7 Fab (2) αCD3 (1), αPD-L1 (3), α4-1BB (4), αHER3 (5), αCD19 (6) 61.1 77.25 3.29 nd
SI-55H11 H7 scFv (1) αCD3 (2), αPD-L1 (3), α4-1BB (4), αHER3 (5), αCD19 (6) 30.0 84.42 4.65 0.09387
表12. 包含人源化抗EGFR scFv域或人源化抗EGFR Fab域之五-微型GNC抗體的表徵。
GNC抗體 αEGFR變體 微型GNC域 GNC結合域 效價 (微克/毫升) aSEC %POI huEGFR K D(nM) TDCC EC50 (pM)
SI-68P7 H1 scFv (1) αCD19 (2), αCD3 (3), 41BBLT (4), αPD-L1 (5) 85.2 84.60 nd nd
SI-79P1 H4 scFv (1) αCD19 (2), αCD3 (3), α4-1BB (4), αPD-L1 (5) 75.3 72.61 3.03 nd
SI-68P13 H7 scFv (1) αCD19 (2), αCD3 (3), α4-1BB (4), αPD-L1 (5) 76.6 87.69 5.64 0.259
SI-68P17 H7 Fab (3) αCD3 (1), αCD19 (2), α4-1BB (4), αPD-L1 (5) 62.0 54.87 2.46 0.322
序列表 人源化EGFR結合序列變體(H1-H11)之序列
序列 胺基酸序列ID 核苷酸序列ID
H1 VH 1 2
H1 VL 3 4
H2 VH 5 6
H2 VL 7 8
H3 VH 9 10
H3 VL 11 12
H4 VH 13 14
H4 VL 15 16
H5 VH 17 18
H5 VL 19 20
H6 VH 21 22
H6 VL 23 24
H7 VH 25 26
H7 VL 27 28
H8 VH 29 30
H8 VL 31 32
H9 VH 33 34
H9 VL 35 36
H10 VH 37 38
H10 VL 39 40
H11 VH 41 42
H11 VL 43 44
抗體恆定區、連接子模體及標籤之序列
序列 胺基酸序列ID 核苷酸序列ID
單Fc 45 46
人IgG1 47 48
人Cκ 49 50
(G4S)4連接子 51 52
His標籤 53 54
αEGFR scFv-His 蛋白之序列
序列 胺基酸序列ID 核苷酸序列ID
SI-79R1 55 56
SI-79R2 57 58
αEGFR scFv-單Fc蛋白之序列
序列 胺基酸序列ID 核苷酸序列ID
SI-79SF1 59 60
SI-79SF2 61 62
SI-79SF3 63 64
SI-79SF4 65 66
SI-79SF5 67 68
SI-79SF6 69 70
SI-79SF7 71 72
SI-79SF8 73 74
SI-79SF9 75 76
SI-79SF10 77 78
SI-79SF11 79 80
SI-79SF12 81 82
SI-79SF13 83 84
含有人源化EGFR結合域之五GNC蛋白之序列
序列 胺基酸序列ID 核苷酸序列ID
SI-55P3 HC 85 86
SI-55P3 LC 87 88
SI-55P4 HC 89 90
SI-55P4 LC 91 92
SI-79P2 HC 93 94
SI-79P2 LC 95 96
SI-79P3 HC 97 98
SI-79P3 LC 99 100
SI-55P9 HC 101 102
SI-55P9 LC 103 104
SI-77P1 HC 105 106
SI-77P1 LC 107 108
含有人源化EGFR結合域之六GNC蛋白的序列
序列 胺基酸序列ID 核苷酸序列ID
SI-77H5 HC 109 110
SI-77H5 LC 111 112
SI-55H11 HC 113 114
SI-55H11 LC 115 116
SI-77H4 HC 117 118
SI-77H4 LC 119 120
含有人源化EGFR結合域之五-微型GNC蛋白的序列
序列 胺基酸序列ID 核苷酸序列ID
SI-68P7 HC 121 122
SI-68P7 LC 123 124
SI-79P1 HC 125 126
SI-79P1 LC 127 128
SI-68P13 HC 129 130
SI-68P13 LC 131 132
SI-68P17 HC 133 134
SI-68P17 LC 135 136
αEGFR mAb及αCD3 mAb之序列
序列 胺基酸序列ID 核苷酸序列ID
SI-79C1 HC 137 138
SI-79C1 LC 139 140
SI-79C2 HC 141 142
SI-79C2 LC 143 144
SI-79C3 HC 141 142
SI-79C3 LC 149 150
SI-79C5 HC 151 152
SI-79C5 LC 139 140
SI-9C21 HC 145 146
SI-9C21 LC 147 148
αEGFR x αCD3雙專一性抗體之序列
序列 胺基酸序列ID 核苷酸序列ID
SI-79X1 HC1 137 138
SI-79X1 HC2 145 146
SI-79X1 LC1 139 140
SI-79X1 LC2 147 148
SI-79X2 HC1 141 142
SI-79X2 HC2 145 146
SI-79X2 LC1 143 144
SI-79X2 LC2 147 148
SI-79X3 HC1 141 142
SI-79X3 HC2 145 146
SI-79X3 LC1 149 150
SI-79X3 LC2 147 148
SI-79X5 HC1 151 152
SI-79X5 HC2 145 146
SI-79X5 LC1 139 140
SI-79X5 LC2 147 148
＞序列ID 1：西妥昔單抗H1 VH胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKVSGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS ＞序列ID 2：西妥昔單抗H1 VH核苷酸序列 GAAGTTCAGCTGGTGGAATCCGGCGGAGGATTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCCTGTAAGGTGTCTGGCTTCTCCCTGACCAACTACGGCGTGCACTGGGTCCGACAGGCACCTGGAAAAGGACTGGAATGGGTCGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCTCTCGGGACACCTCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCTAGAGCCCTGACCTACTATGACTACGAGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTCTCCTCT ＞序列ID 3：西妥昔單抗H1 VL胺基酸序列 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQSIGTNIHWYQQKPGKAPKLLIYYASESISGIPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQNNNWPTTFGQGTKLTVL ＞序列ID 4：西妥昔單抗H1 VL核苷酸序列 GAGATCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACACTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGATCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTACGCCTCCGAGTCTATCAGCGGCATCCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGATCTGGCGCTGAGTTTACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGCCTGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGACAGTTCTT ＞序列ID 5：西妥昔單抗H2 VH胺基酸序列 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTISKDNSKNQVYFKLRSLRAEDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS ＞序列ID 6：西妥昔單抗H2 VH核苷酸序列 CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTCGTGAAGCCTTCTCAGACCCTGTCTATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCTCCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGTGCTAGAGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTCTCTTCT ＞序列ID 7：西妥昔單抗H2 VL胺基酸序列 EIVLTQSPSILSVSPGERATFSCRASQSIGTNIHWYQQRPGKPPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTEFTLTITSVQSEDIAVYYCQQNNNWPTTFGPGTKLELK ＞序列ID 8：西妥昔單抗H2 VL核苷酸序列 GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCATCCTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGCCTGGCAAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCTATCAGCGGCATCCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGATCTGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCACCTCCGTGCAGTCCGAGGATATCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGACCCGGCACCAAGCTGGAATTGAAA ＞序列ID 9：西妥昔單抗H3 VH胺基酸序列 QVQLVQSGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRSEDTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS ＞序列ID 10：西妥昔單抗H3 VH核苷酸序列 CAAGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCCCTGGCCTCGTGAAGCCTTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGCACCGTGTCTGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGAGATCCGTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCTAGAGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTCTCTTCT ＞序列ID 11：西妥昔單抗H3 VL胺基酸序列 EIVLTQSPSILSVSPGERVTFSCRASQSIGTNIHWYQQRPGKPPRLLIKYASESISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFATYYCQQNNNWPTTFGPGTKLELK ＞序列ID 12：西妥昔單抗H3 VL核苷酸序列 GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCATCCTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGTGACCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGCCTGGCAAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCCATCAGCGGCATCCCTGCCAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGCAGTCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGACCCGGCACCAAGCTGGAATTGAAA ＞序列ID 13：西妥昔單抗H4 VH胺基酸序列 QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS ＞序列ID 14：西妥昔單抗H4 VH核苷酸序列 CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTGAGACACTGTCCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGAGCGTGCGGGCTGATGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCT ＞序列ID 15：西妥昔單抗H4 VL胺基酸序列 EIVLTQSPSTLSVSPGERATFSCRASQSIGTNIHWYQQKPGKPPRLLIKYASESISGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYCQQNNNWPTTFGPGTKLELK ＞序列ID 16：西妥昔單抗H4 VL核苷酸序列 GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCACACTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCCATCAGCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGCAGTCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGACCCGGCACCAAGCTGGAATTGAAA ＞序列ID 17：西妥昔單抗H5 VH胺基酸序列 QVQLLQSGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWIGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTISKDNSKNQVYFKLRSLTSEDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS ＞序列ID 18：西妥昔單抗H5 VH核苷酸序列 CAAGTTCAGCTGTTGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCCGAAACACTGTCTCTGACCTGCACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTATGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGATCGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCTCCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGTCCCTGACCTCTGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCTAGAGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTCTCTTCT ＞序列ID 19：西妥昔單抗H5 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23：西妥昔單抗H6 VL胺基酸序列 EIVLTQSPSTLSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTGQPPRLLIKYASESISGIPARFSGSGSGTEFTLTITSVQSEDFAVYYCQQNNNWPTTFGQGTKLDIK ＞序列ID 24：西妥昔單抗H6 VL核苷酸序列 GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCACACTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGTGTCCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGAGAACCGGCCAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCCATCAGCGGCATCCCTGCCAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCACCTCCGTGCAGTCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGATATCAAA ＞序列ID 25：西妥昔單抗H7 VH胺基酸序列 QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS ＞序列ID 26：西妥昔單抗H7 VH核苷酸序列 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34：西妥昔單抗H9 VH核苷酸序列 CAAGTTCAGCTGGTGGAATCTGGCCCTGGCCTGGTTCAGCCTTCTGGCTCTCTGTCTCTGACCTGCACCGTGTCTGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGGTTCGACAGGCTCCAGGCAAAGGACTGGAATGGGTCGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCTCCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACCTGAAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTCTCCTCT ＞序列ID 35：西妥昔單抗H9 VL胺基酸序列 DIVLTQSPSSLSVSPGERVTISCRASQSIGTNIHWYQQKPGQAPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSVESEDFAVYYCQQNNNWPTTFGQGTKLTVL ＞序列ID 36：西妥昔單抗H9 VL核苷酸序列 GACATCGTGCTGACCCAGTCTCCATCCAGCCTGTCTGTGTCTCCTGGCGAGAGAGTGACCATCTCTTGCCGGGCCTCTCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCTATCAGCGGCATCCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCGTGGAATCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGACAGTTCTT ＞序列ID 37：西妥昔單抗H10 VH胺基酸序列 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＞序列ID 77：SI-79SF10胺基酸序列 EIVLTQSPSILSVSPGERVTFSCRASQSIGTNIHWYQQRPGKPPRLLIKYASESISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFATYYCQQNNNWPTTFGPGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRSEDTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSGSGGSPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK ＞序列ID 78：SI-79SF10核苷酸序列 GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCATCCTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGTGACCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGCCTGGCAAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCCATCAGCGGCATCCCTGCCAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGCAGTCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGACCCGGCACCAAGCTGGAATTGAAAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGAGGCGGAGGAAGCGGTGGCGGCGGATCTCAAGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCCCTGGCCTCGTGAAGCCTTCTCAGACCCTGTCTCTGACCTGCACCGTGTCTGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGAGATCCGTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCTAGAGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTCTCTTCTGGATCCGGCGGCTCTCCCGTCGCTGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCTAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAGATGCCACGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGAAGCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCACCCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTCCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAATGA ＞序列ID 79：SI-79SF11胺基酸序列 EIQLTQSPSTLSVSPGERATFSCRASQSIGTNIHWYQQKTGQPPRLLIKYASESISGIPDRFSGSGSGTEFTLSITSVQSEDFAVYYCQQNNNWPTTFGPGTKLEILGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLLQSGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWIGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTISKDNSKNQVYFKLRSLTSEDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSGSGGSPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK ＞序列ID 80：SI-79SF11核苷酸序列 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＞序列ID 81：SI-79SF12胺基酸序列 EIVLTQSPSILSVSPGERATFSCRASQSIGTNIHWYQQRPGKPPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTEFTLTITSVQSEDIAVYYCQQNNNWPTTFGPGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTISKDNSKNQVYFKLRSLRAEDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSGSGGSPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK ＞序列ID 82：SI-79SF12核苷酸序列 GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCATCCTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGCCTGGCAAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCTATCAGCGGCATCCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGATCTGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCACCTCCGTGCAGTCCGAGGATATCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGACCCGGCACCAAGCTGGAATTGAAAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGAGGCGGAGGAAGCGGTGGCGGCGGATCTCAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTCGTGAAGCCTTCTCAGACCCTGTCTATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCTCCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGTGCTAGAGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTCTCTTCTGGATCCGGCGGCTCTCCCGTCGCTGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCTAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAGATGCCACGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGAAGCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCACCCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTCCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAATGA ＞序列ID 83：SI-79SF13胺基酸序列 DIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSIGTNIHWYQQKPGQAPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQSEDFAVYYCQQNNNWPTTFGQGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSESLSLTCTVSGFSLTNYGVHWVRQPPGKGLEWIGVIWSGGNTDYNTPFTSRVTISKDNSKNQVSLKMNSLTAADTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSGSGGSPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLRCHVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTKPVLDSDGSFFLYSTLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK ＞序列ID 84：SI-79SF13核苷酸序列 GACATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCACACTGAGTGTGTCTCCAGGCGAGAGAGCTACCCTGTCCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCTATCAGCGGCATCCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGCAGTCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGACAGTTCTTGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGAGGCGGAGGAAGCGGTGGCGGCGGATCTCAAGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCCGAATCTCTGTCTCTGACCTGCACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTATGGCGTGCACTGGGTTCGACAGCCTCCAGGCAAAGGCCTGGAATGGATCGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCTCTAGAGTGACCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTCCCTGAAGATGAACAGCCTGACCGCTGCCGACACCGCTGTGTACTATTGTGCTAGAGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTCTCCTCTGGATCCGGCGGCTCTCCCGTCGCTGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCTAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAGATGCCACGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGAAGCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCACCCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTCCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAATGA ＞序列ID 85：SI-55P3重鏈胺基酸序列 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQSIGTNIHWYQQKPGKAPKLLIYYASESISGIPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQNNNWPTTFGQGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSVSGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSQVQLQESGGRLVQPGEPLSLTCKTSGIDLSSNAIGWVRQAPGKGLEWIGVIFGSGNTYYASWAKGRFTISRSTSTVYLKMNSLRSEDTAIYYCARGGYSSDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKGLEWIACIAAGSAGITYDANWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAFSFDYAMDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSWGNVDNVFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGRSLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTISSYHMQWVRQAPGKGLEYIGTISSGGNVYYASSARGRFTISRPSSKNTVDLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGYSDPMWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQNIRTYLSWYQQKPGKAPKLLIYAAANLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISDLEPGDAATYYCQSTYLGTDYVGGAFGGGTKVEIK ＞序列ID 86：SI-55P3重鏈核苷酸序列 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＞序列ID 87：SI-55P3輕鏈胺基酸序列 ENVLTQSPASLSASPGERVTITCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPKLWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGNDHTLTISSMEPEDFATYYCFQGSVYPFTFGQGTKVTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGLVQPGQTLRLTCAFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKGLEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVYLQMNSLDAEDTAVYYCARMELWSYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSDPVLTQSPSSLSASVGDRVTISCQSSQSVAKNNNLAWFQQKPGQAPKLLIYSASTLAAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCSARDSGNIQSFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ＞序列ID 88：SI-55P3輕鏈核苷酸序列 GAAAATGTATTGACACAGAGCCCCGCCTCCCTCAGTGCCTCACCTGGGGAAAGGGTAACTATCACTTGCTCTGCATCAAGCAGCGTCTCATACATGCATTGGTATCAACAAAAGCCTGGACAGGCCCCCAAGCTCTGGATATACGATACGAGCAAGCTGGCTTCCGGCGTACCTAGCCGCTTCAGTGGTTCCGGCTCAGGCAACGATCACACCCTTACGATTTCCAGTATGGAACCCGAAGATTTTGCAACTTATTATTGTTTCCAGGGGAGCGTGTACCCATTCACTTTCGGGCAGGGGACAAAAGTGACGGTACTGGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCCGGCGGTGGCGGCTCCGGTGGAGGCGGCTCTCAGGTCACATTGAAGGAATCTGGCCCCGGCCTTGTTCAGCCAGGACAGACCCTTAGGCTCACCTGTGCCTTCAGTGGTTTTTCTCTTAGCACTAGCGGTATGGGGGTCGGCTGGATTCGGCAGCCTCCCGGCAAAGGTCTTGAGTGGTTGGCTCACATTTGGTGGGACGACGACAAACGGTATAATCCTGCCTTGAAAAGTCGGCTGACCATTAGTAAGGATACCTCAAAAAATCAAGTGTACTTGCAAATGAATAGCCTTGACGCCGAGGATACGGCTGTATATTATTGCGCGCGGATGGAACTCTGGTCTTACTACTTTGATTATTGGGGGCAGGGGACTCTCGTCACGGTCTCGAGTGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCGATCCAGTTCTGACACAAAGTCCATCCAGCCTGTCTGCCTCAGTCGGCGACAGAGTGACCATCAGTTGCCAGAGCTCACAGTCTGTGGCTAAGAACAACAACTTGGCGTGGTTCCAACAGAAACCTGGACAGGCTCCGAAATTGCTGATCTATTCTGCTTCCACGCTTGCTGCTGGTGTTCCTTCCCGCTTTTCAGGTAGTGGTAGCGGGACAGACTTCACTTTGACTATAAGCAGCGTGCAGCCTGAAGATTTTGCGACCTACTATTGTTCTGCTAGAGACAGTGGAAATATTCAGTCCTTTGGGGGGGGAACGAAGGTCGAAATAAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA ＞序列ID 89：SI-55P4重鏈胺基酸序列 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＞序列ID 90：SI-55P4重鏈核苷酸序列 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＞序列ID 94：SI-79P2重鏈核苷酸序列 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＞序列ID 98：SI-79P3重鏈核苷酸序列 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＞序列ID 106：SI-77P1重鏈核苷酸序列 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＞序列ID 114：SI-55H11重鏈核苷酸序列 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＞序列ID 122：SI-68P7重鏈核苷酸序列 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130：SI-68P13重鏈核苷酸序列 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＞序列ID 131：SI-68P13輕鏈胺基酸序列 ENVLTQSPASLSASPGERVTITCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPKLWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGNDHTLTISSMEPEDFATYYCFQGSVYPFTFGQGTKVTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGLVQPGQTLSLTCAFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKGLEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVYLQMNSLDAEDTAVYYCARMELWSYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSWGNVDNVFGGGTKVTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKGLEWIACIAAGSAGITYDANWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAFSFDYAMDLWGQGTLVTVSS ＞序列ID 132：SI-68P13輕鏈核苷酸序列 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＞序列ID 133：SI-68P17重鏈胺基酸序列 DVVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSDVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQNIRTYLSWYQQKPGKAPKLLIYAAANLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISDLEPGDAATYYCQSTYLGTDYVGGAFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTISSYHMQWVRQAPGKGLEYIGTISSGGNVYYASSARGRFTISRPSSKNTVDLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGYSDPMWGQGTLVTVSS ＞序列ID 134：SI-68P17重鏈核苷酸序列 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＞序列ID 137：SI-79C1 HC及SI-79X1 HC1胺基酸序列 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ＞序列ID 138：SI-79C1 HC及SI-79X1 HC1核苷酸序列 CAAGTTCAGCTCAAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTTCAGCCTTCTCAGAGCCTGAGCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGGTTCGACAGAGCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCTCTCGGCTGTCTATCAACAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACTCCCTGCAGTCCAACGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTGCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTGA ＞序列ID 139：SI-79C1 LC、SI-79C5 LC、SI-79X1 LC1及SI-79X5 LC1胺基酸序列 DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ＞序列ID 140：SI-79C1 LC、SI-79C5 LC、SI-79X1 LC1及SI-79X5 LC1核苷酸序列 GACATCCTGCTGACCCAGTCTCCAGTGATCCTGTCCGTGTCTCCTGGCGAGAGAGTGTCCTTCAGCTGCAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGCGGACCAACGGCTCCCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCTATCAGCGGCATCCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGTCCATCAACTCCGTGGAATCCGAGGATATCGCCGACTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGCGCTGGCACCAAGCTGGAATTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG ＞序列ID 141：SI-79C2 HC、SI-79C3 HC、SI-79X2 HC1、SI-79X3 HC1胺基酸序列 QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ＞序列ID 142：SI-79C2 HC、SI-79C3 HC、SI-79X2 HC1、SI-79X3 HC1核苷酸序列 CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTGAGACACTGTCCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGAGCGTGCGGGCTGATGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTGA ＞序列ID 143：SI-79C2 LC及SI-79X2 LC1胺基酸序列 EIVLTQSPSTLSVSPGERATFSCRASQSIGTNIHWYQQKPGKPPRLLIKYASESISGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYCQQNNNWPTTFGPGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ＞序列ID 144：SI-79C2 LC及SI-79X2 LC1核苷酸序列 GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCACACTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCCATCAGCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGCAGTCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGACCCGGCACCAAGCTGGAATTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG ＞序列ID 145：SI-9C21 HC、SI-79X1 HC2、SI-79X2 HC2、SI-79X3 HC2及SI-79X5 HC2胺基酸序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWVGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ＞序列ID 146：SI-9C21 HC、SI-79X1 HC2、SI-79X2 HC2、SI-79X3 HC2及SI-79X5 HC2核苷酸序列 GAAGTCCAATTGGTAGAAAGTGGCGGTGGTCTGGTGCAACCTGGTGGATCTCTTCGCCTCTCATGCACGGCTAGTGGCTTTACTATTTCAACTAATGCGATGAGCTGGGTTCGCCAGGCCCCCGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGGCGTCATCACCGGCAGGGACATTACATACTATGCGAGTTGGGCAAAGGGCAGGTTCACGATTAGCCGCGATACTTCAAAGAATACCGTTTACCTTCAAATGAATAGCTTGCGCGCGGAAGACACAGCTGTGTATTACTGCGCGCGGGATGGAGGTAGTTCCGCCATAACTTCCAACAACATATGGGGACAAGGCACGCTGGTTACTGTGTCGTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCCTGCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTGA ＞序列ID 147：SI-9C21 LC、SI-79X1 LC2、SI-79X2 LC2、SI-79X3 LC2及SI-79X5 LC2胺基酸序列 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGQGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ＞序列ID 148：SI-9C21 LC、SI-79X1 LC2、SI-79X2 LC2、SI-79X3 LC2及SI-79X5 LC2核苷酸序列 GAAATCGTTATGACGCAGAGTCCCTCCACGCTCTCCGCTAGTGTCGGGGATCGCGTCATTATCACATGCCAGGCCTCCGAGTCAATCAGCAGCTGGCTTGCATGGTATCAACAGAAGCCGGGAAAAGCTCCTAAATTGCTGATCTATGAAGCGTCAAAATTGGCGTCTGGTGTCCCATCTAGGTTCTCCGGCTCTGGGTCTGGTGCGGAATTTACTTTGACAATCTCCAGTCTTCAACCAGACGATTTCGCTACCTACTACTGCCAAGGGTATTTCTATTTTATAAGCCGGACATATGTAAACTCCTTCGGCCAAGGAACAAAGTTGACTGTTCTTCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG ＞序列ID 149：SI-79C3 LC及SI-79X3 LC1胺基酸序列 EIVLTQSPSTLSVSPGERATFSCRASQSIGTNIHWYQQKPGKPPRLLIKYASESISGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYCQQNNNWPTTFGPGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ＞序列ID 150：SI-79C3 LC及SI-79X3 LC1核苷酸序列 GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCACACTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCCATCAGCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGCAGTCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGACCCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG ＞序列ID 151：SI-79C5 HC及SI-79X5 HC1胺基酸序列 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSEDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ＞序列ID 152：SI-79C5 HC及SI-79X5 HC1核苷酸序列 CAAGTTCAGCTCAAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTTCAGCCTTCTCAGAGCCTGAGCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGGTTCGACAGAGCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCTCTCGGCTGTCTATCAACAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACTCCCTGCAGTCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTGCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTGA 參考文獻
Figure 02_image003
Figure 02_image005
無
結合附圖，自以下描述及所附申請專利範圍，本揭示案之前述及其他特徵將變得更加明顯。應理解，此等附圖僅描繪了根據本揭示案佈置之幾個實施例且因此不被認為對其範疇的限制，將藉由使用附圖以額外的專一性及細節來描述本揭示案，其中： 第1圖描繪了Kabat編號中西妥昔單抗源之VH(A)及VL(B)序列的比對，其中N85E為無醣化之西妥昔單抗，H1至H11為人源化變體； 第2圖顯示了基於MixMHC2pred算法之西妥昔單抗源之VH(A)及Vk(B)域的T20人性分數，及(C)西妥昔單抗源之可變區中MHCII結合肽的預測數量； 第3圖顯示了帶His標籤之抗EGFR scFv域的SEC概況，表明將SI-79R1(西妥昔單抗)人源化為SI-79R2(H1)導致較低聚集； 第4圖顯示了帶His標籤之抗EGFR scFv域的Octet結合分析，表明人源化西妥昔單抗H1與人EGFR之結合與小鼠scFv相似； 第5圖顯示了帶His標籤之抗EGFR scFv域的熱穩定性分析結果，表明人源化西妥昔單抗SI-79R2比SI-79R1顯著更穩定，如由DLS所量測(在更高溫度下展開)； 第6圖顯示了帶His標籤之抗EGFR scFv域的化學變性穩定性分析結果，表明人源化西妥昔單抗SI-79R2比SI-79R1顯著更穩定，如由胍及尿素變性所量測(展開需要更高濃度的胍/尿素)； 第7圖顯示了第一步蛋白質A純化後立即對scFv-單Fc(A)及mAb蛋白質(B)的分析尺寸排阻層析圖以及對經純化scFv-單Fc蛋白質(C)的非還原性SDS-PAGE，其中資料代表兩個獨立之表現及純化，N85E為無醣化之西妥昔單抗，且H1至H11為人源化變體； 第8圖顯示了西妥昔單抗源之scFv-單Fc蛋白(A)及mAb(B)之結合動力學，如使用抗人Fc(AHC)感測器及人EGFR之可溶性重組胞外域藉由生物層干涉術所決定，其中資料代表兩個獨立實驗，K D值示於表6-8中，N85E為無醣化之西妥昔單抗，且H1至H11為人源化變體； 第9圖顯示了西妥昔單抗源之scFv-單Fc蛋白(A)及mAb(B)之熱穩定性，如藉由動態光散射所測定，其中資料代表兩個獨立實驗，展開溫度(半徑超過10 nm的點)示於表7-8中，N85E為無醣化之西妥昔單抗，且H1至H11為人源化變體； 第10圖顯示了αCD3×αEGFR雙專一性抗體及其親本αCD3及αEGFR抗體之陽離子交換層析，顯示了它們的特徵保留時間； 第11圖顯示了αCD3×αEGFR雙專一性抗體之T細胞依賴性細胞毒性(T cell-dependent cellular cytotoxicity，TDCC)，使用螢光素化之攜帶EGFR之BxPC-3細胞株作為標靶細胞，與活化的T細胞及αEGFR臂一起溫育，該等抗體包括野生型西妥昔單抗、無醣化西妥昔單抗(N85E)及人源化形式H7，發光信號作為72小時後存活之BxPC-3細胞的終點(EC50值示於表8中)； 第12圖在示意圖中展示了GNC抗體，顯示了如下組態：1)Fab可變區(D2)為黑色，Fab恆定區與Fc區均為白色；2)陰影框中的額外scFv抗原結合域(每個都可經受體-配位體結合替換)；3)經由D4將D1連接至其N端及/或D3及/或D4串聯連接至其C端之重鏈單體；及4)將D5及/或D6連接至其N-及C端之輕鏈單體，分別產生六-GNC及五-GNC抗體； 第13圖顯示了抗huEGFR五-GNC抗體之分析型SEC概況，該等抗體包含人源化抗EGFR scFv(SI-55P3，H1 scFv；SI-55P4，H1 scFv；SI-79P2，H4 scFv；SI-79P3，H4 scFv；及SI-55P9，H7 scFv)或Fab區(SI-77P1，H7 Fab)，在蛋白質A純化後具有低聚集。 第14圖顯示了抗huEGFR五-GNC抗體之Octet結合分析，表明具有人源化抗EGFR scFv(SI-55P3、H1 scFv；SI-79P2，H4 scFv；及SI-79P3，H4 scFv)或Fab區(SI-77P1，H7 Fab)之五-GNC抗體保持緊密結合； 第15圖證明具有人源化抗EGFR scFv(SI-55P9，H7 scFv)或Fab(SI-77P1，H7 Fab)的五-GNC抗體引發對表現EGFR之腫瘤細胞的有效TDCC； 第16圖顯示了抗-huEGFR六-GNC抗體之分析型SEC概況，表明具有人源化抗-EGFR scFv(SI-55H11，H7 scFv)或Fab區(SI-77H4，H7 Fab)之六-GNC抗體比具有源自西妥昔單抗之抗EGFR域的六-GNC具有更低聚集； 第17圖顯示了抗-huEGFR六-GNC抗體之Octet結合分析，表明具有人源化抗-EGFR scFv(SI-55H11，H7 scFv)或Fab區(SI-77H4，H7 Fab)之六-GNC抗體保留與西妥昔單抗源之六-GNC抗體SI-77H4類似的與EGFR之結合； 第18圖顯示了具有人源化抗EGFR scFv(SI-55H11，H7 scFv)之六GNC抗體對表現EGFR之腫瘤細胞引發有效的TDCC； 第19圖描繪了(A)不對稱雙專一性抗體之示意圖，其中αEGFR Fab源自三個西妥昔單抗Fab之一(野生型，有或沒有N85E，或人源化VH/VL；第二個Fab為αCD3 Fab；且CH3域含有K409R突變；及(B)示意圖中的微型GNC抗體樣蛋白，顯示異二聚體組態：1)單個Fab的可變區為黑色(mD3)，Fab恆定區及Fc區均為白色；2)陰影框中的額外scFv抗原結合域(每個都可經受體-配位體結合替換)；3)將mD1連接至其N端及mD4連接至其C端的A鏈單體；及4)將mD2連接至其N端及mD5連接至其C端的B鏈單體； 第20圖顯示了抗huEGFR五-微型GNC抗體之分析型SEC概況，表明具有人源化抗EGFR scFv(SI-68P7，H1 scFv；SI-79P1，H4 scFv及SI-68P13，H7 scFv)或Fab 域(SI-68P17，H7 Fab)之五-微型GNC抗體具有低聚集； 第21圖顯示了抗-huEGFR五-微型GNC抗體之Octet結合分析，表明具有人源化抗-EGFR scFv(SI-709P1，H4 scFv；SI-68P13，H7 scFv)或Fab區(SI-68P17，H7 Fab)之五-微型GNC抗體保留與 EGFR之結合；及 第22圖顯示了具有人源化抗EGFR scFv(SI-68P13，H7 scFv)或Fab區(SI-68P17，H7 Fab)之五-微型GNC抗體引發對表現EGFR之腫瘤細胞的有效TDCC。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims (34)

  1. 一種對一人上皮生長因子受體(epithelium growth factor receptor，EGFR)具有結合專一性之人EGFR結合肽，包含與SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、57、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83具有至少98%、95%或92%序列一致性之一胺基酸序列。
  2. 如請求項1之EGFR結合肽，包含一可變重(VH)鏈及一可變輕(VL)鏈， 其中該VH鏈包含與SEQ ID NO.1、5、9、13、17、21、25、29、33、37或41具有至少98%、95%或92%序列一致性之一胺基酸序列；且 其中該VL鏈包含與SEQ ID NO.3、7、11、15、19、23、27、31、35、39或43具有至少98%、95%或92%序列一致性之一胺基酸序列。
  3. 如請求項2之EGFR結合肽，包含一scFv域，其中該scFv域包含該VH鏈及該VL鏈，且其中該scFv域包含與SEQ ID NO.57、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81或83具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列。
  4. 如請求項3之EGFR結合肽，包含與該scFv域之至少一端連接的一組胺酸殘基，且其中該EGFR結合肽包含與57具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列。
  5. 如請求項2之EGFR結合肽，包含一Fab域，其中該Fab域包含該VH鏈及該VL鏈。
  6. 如請求項5之EGFR結合肽，進一步包含與該Fab域連接之Fc域以提供一Fab-單Fc融合蛋白，其中該Fc域包含與選自SEQ ID NO.45及47之胺基酸序列具有至少98%序列一致性的一序列。
  7. 一種對人EGFR具有結合專一性之抗體樣蛋白，包含具有一可變重(VH)鏈及一可變輕(VL)鏈之一EGFR結合域， 其中該VH鏈包含與SEQ ID NO.1、5、9、13、17、21、25、29、33、37或41具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列；且 其中該VL鏈包含與SEQ ID NO.3、7、11、15、19、23、27、31、35、39或43具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列。
  8. 如請求項7之抗體樣蛋白，包含具有與SEQ ID NO.57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83或其組合具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列的scFv域。
  9. 如請求項7之抗體樣蛋白，其中該抗體樣蛋白係包含與SEQ ID NO.137、139；141、143；141、149、151、139；145、147或其組合具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列的一單專一性抗體。
  10. 如請求項7之抗體樣蛋白，其中該抗體樣蛋白係包含與SEQ ID NO.137、145、139、147、141、145、143、147、141、145、149、147、151、145、139、147或其組合具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列的一雙專一性抗體。
  11. 如請求項7之抗體樣蛋白，其中該抗體樣蛋白係包含與SEQ ID NO.85、87；89、91；93、95、97、99、101、103、105、107或其組合具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列的一五專一性抗體。
  12. 如請求項7之抗體樣蛋白，其中該抗體樣蛋白係包含與SEQ ID NO.109、111、113、115、117、119或其組合具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列的一六專一性抗體。
  13. 如請求項7之抗體樣蛋白，包含一重鏈(HC)及一輕鏈(LC)， 其中該HC包含與SEQ ID NO.85、89、93、97、101、105、109、113、117、137、141、145或151具有至少98%、95%或92%序列一致性之一胺基酸序列；且 其中該LC包含與SEQ ID NO.87、91、95、99、103、107、111、115、119、139、143、147或149具有至少98%、95%或92%序列一致性之一胺基酸序列。
  14. 如請求項7之抗體樣蛋白，包含一重鏈單體及一輕鏈單體，其中該重鏈單體具有一N端及一C端，自該N端至該C端串聯包含： 該N端視情況可選之一第一結合域(D1)， 包含一輕鏈之作為一第二結合域(D2)的一Fab域， 一Fc域， 一視情況可選之第三結合域(D3)，及 該C端視情況可選之一第四結合域(D4)， 其中該輕鏈包含共價連接至該C端之一視情況可選的第五結合域(D5)、共價連接至該N端之一視情況可選的第六結合域(D6)或其組合，且其中D1、D2、D3、D4、D5及D6中之至少一個包含該EGFR結合域。
  15. 如請求項14之抗體樣蛋白，其中D1或D2中的至少一個包含該EGFR結合域。
  16. 如請求項14之抗體樣蛋白，其中D3、D4、D5及D6中的每一個都包含該EGFR結合域。
  17. 如請求項14之抗體樣蛋白，其中該抗體樣蛋白係包含與SEQ ID NO.137、145、139、147；141、145、143、147；141、145、149、147；151、145、139或147具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列的雙專一性抗體。
  18. 如請求項17之抗體樣蛋白，其中該雙專一性抗體與包含該EGFR結合域之D2不對稱，且該D3對CD3具有一結合專一性。
  19. 如請求項7之抗體樣蛋白，其具有一N端及一C端，包含： 一第一單體，自該N端至該C端包含一第一結合域(mD1)、一可變重(VH)鏈、一CHl域、一第一鉸鏈、一第一CH2域、一第一CH3域及一第四結合域(mD4)， 一第二單體，自該N端至該C端包含一第二結合域(mD2)、一可變輕(VL)鏈、一CL域、一第二鉸鏈、一第二CH2域及一第二CH3域以及一第五結合域(mD5)， 其中該CH鏈及該CL鏈形成一第三結合域(mD3)， 其中該第一單體及該第二單體係經由該CH1域與該CL域之間的至少一個二硫鍵及該第一鉸鏈與該第二鉸鏈之間的至少一個二硫鍵共價配對，且 其中該多專一性抗體樣蛋白至少為雙專一性的。
  20. 如請求項19之抗體樣蛋白，其中mD1、mD2、mD3、mD5及mD5中的至少一個包含該EGFR結合域。
  21. 如請求項19之抗體樣蛋白，其中該mD3或mD2域中的至少一個包含該EGFR結合域。
  22. 如請求項19之抗體樣蛋白，其中該mD2、mD4、mD5各自包含該EGFR結合域。
  23. 如請求項19之抗體樣蛋白，包含與SEQ ID NO 121、123、125、127、129、131、133、135或其組合具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列。
  24. 一種重鏈，包含與SEQ ID NO 121、125、129或133具有至少98%序列一致性之胺基酸序列。
  25. 一種輕鏈，包含與123、127、131或135具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列。
  26. 一種編碼如請求項7之抗體樣蛋白的經分離核酸序列。
  27. 一種包含如請求項26之經分離核酸序列的表現載體。
  28. 一種包含如請求項26之經分離核酸序列的宿主細胞。
  29. 一種藥物組合物，包含如請求項7之抗體樣蛋白及藥學上可接受之載劑。
  30. 一種免疫結合物，包含如請求項7之抗體樣蛋白及細胞毒性劑。
  31. 一種藥物組合物，包含如請求項30之免疫結合物及藥學上可接受之載劑。
  32. 一種治療或預防個體之癌症、自體免疫疾病或傳染病的方法，該方法包括以下步驟：向該個體投與包含如請求項7之純化抗體樣蛋白的藥物組合物。
  33. 一種產生如請求項7之抗體樣蛋白的方法，包含以下步驟 培養一宿主細胞使得編碼如請求項9之抗體樣蛋白的DNA序列得以表現，及 純化該多專一性抗體樣蛋白。
  34. 一種包含有效濃度之如請求項7之抗體樣蛋白的溶液，其中該溶液為個體的血漿。
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