TW202300529A - 特定性增強雙專一性抗體 - Google Patents

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Abstract

一種對一人上皮生長因子受體(EGFR)具有一結合專一性之雙專一性四價抗體，自N端至C端包含對人EGFR具有一第一結合專一性之一Fab區，其中該Fab區包含一可變區，該可變區具有與本文揭示之序列具有至少90%序列一致性之一胺基酸序列；一Fc域，及對HER3具有一第二結合專一性之一scFv域。

Description

特定性增強雙專一性抗體
相關申請的交叉引用
本申請根據35 USC 119(e)主張2020年9月21日提交之美國臨時申請系列第63/081,315號，及2020年11月5日提交之美國臨時申請系列第63/109,877號的申請日的利益，其全部揭示內容藉由引用的方式併入本文中。
本揭示案一般係關於抗體癌症治療劑之技術領域，更具體地係關於雙專一性四價抗體。
人表皮生長因子受體(EGFR，亦稱為ErbB1，HER1)家族有四個成員，EGFR、HER2、HER3及HER4。每個成員因突變、擴增及過度表現而失調在腫瘤發生及腫瘤轉移中起著重要作用。過度表現與多種腫瘤之發展有關。藉由阻斷受體胞外域上之EGFR結合位點或抑制胞內酪胺酸激酶活性，阻斷EGFR信號傳導，可以阻止表現EGFR之腫瘤的生長且改善患者之病況。例如，30%乳腺癌患者中出現HER2過度表現，此表明疾病復發增加及預後不良。亦已知過度表現發生在胃癌、卵巢癌及胃癌、肺腺癌、侵襲形式之子宮癌及唾液管癌中。在非小細胞肺癌中發現了HER2突變。潛在的HER2突變及擴增會產生異常生長信號，該等信號激活其下游信號路徑，導致腫瘤發生。在許多情況下，HER2與腫瘤細胞表面上之HER3二聚化，此會激活PI3K/AKT信號，促進腫瘤生長及存活 1。
已批准幾種針對EGFR及HER2的治療性抗體及小分子抑制劑用於治療癌症 25。已批准諸如西妥昔單抗、帕尼單抗及尼妥珠單抗之治療性抗EGFR抗體用於治療轉移性結直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌及神經膠質瘤 26,27。針對EGFR或HER2之單株抗體在結腸癌 28頭頸部鱗狀細胞癌 29、乳腺癌及胃癌 25中顯示出良好的臨床反應。
曲妥珠單抗(赫賽汀)及其他靶向HER2之藥劑對表現HER2之乳腺癌及胃癌患者具有抗腫瘤功效。曲妥珠單抗為一種與HER2結合之單株抗體，且該結合會增加p27(一種阻止細胞增殖之蛋白質)的活性。曲妥珠單抗僅對HER2過度表現之癌症有效。對於亦接受化療之所有HER2陽性乳腺癌患者，推薦接受為期一年的曲妥珠單抗療法，並且超過12個月沒有額外的益處。帕妥珠單抗為另一種能夠抑制HER2與其他受體(諸如HER3)二聚化之單株抗體，且為FDA批准的可與曲妥珠單抗及多西他賽組合使用的治療劑，用於治療轉移性HER2陽性乳腺癌 2,4。
儘管取得了此等成功，但對某些患者的長期益處似乎有限。最初對此等治療劑有反應之許多形式的腫瘤最終由於對此等藥劑之獲得性耐藥性而發展。耐藥性之發展降低了此等治療的功效。在HER2靶向療法之情況下，耐藥性可以經由上調HER3或其配位體HRG發生 5。因此，目前旨在抑制HER2/HER3信號傳導路徑激活之治療方法未能提供有意義的臨床益處 31,32。
總之，目前批准用於臨床使用之靶向HER2及/或HER3的之單專一性、雙專一性及組合抗體療法具有治療反應率低或患者對治療產生耐藥性的缺點。對於此等癌症，仍然需要更好的治療方法。
本申請通常係關於抗體治療劑之技術領域，更具體地係關於針對EGFR家族成員的雙專一性四價抗體。
在一個態樣中，本申請提供了對人EGFR(上皮生長因子受體)具有結合專一性之雙專一性四價抗體。在一個實施例中，抗體自N端至C端包含Fab區、Fc域及scFv域。Fab區對人EGFR具有第一結合專一性。Fc域對HER3具有第二結合專一性。在一個實施例中，Fab區可包括具有與SEQ ID NO1或3具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的可變區。
在一個實施例中，雙專一性四價抗體可包括與SEQ ID NO.11、13或其組合具有至少98%、95%或92%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，第一結合親和力可以比第二結合親和力高2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或100倍。在一個實施例中，第一結合親和力之KD小於20 nM，第二結合親和力之KD大於約50 nM。在一個實施例中，第一結合親和力之KD小於10 nM，第二結合親和力之KD大於約100 nM。在一個實施例中，第一結合親和力之KD小於5 nM，第二結合親和力之KD大於約50 nM。
在一個實施例中，第一結合親和力之KD為約0.1至約150 nM、約0.5至約50 nM、約1至約10 nM、約1 nM至約25 nM、約0.1、0.5或1.0 nM至約10、25或50 nM。在一個實施例中，第一結合親和力之KD為約4.61 nM。
在一個實施例中，第二結合親和力之KD為約10至約500 nM、約10至250 nM、約50至約250 nM、約10或50 nM至約250或500 nM。在一個實施例中，第二結合親和力之KD為約117 nM。
在一個實施例中，Fab區可以用二硫鍵釘合。
在一個實施例中，四價雙專一性抗體可以為經分離單株抗體、人源化抗體、嵌合抗體或重組抗體。
在一個實施例中，雙專一性四價抗體包括人構架區。
在一個態樣中，本申請提供重鏈、輕鏈或其組合。在一個實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO.9、13或其組合具有至少98%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO.11具有至少98%序列一致性之胺基酸序列。
在一個態樣中，本申請提供與本文揭示之胺基酸序列具有至少98%序列一致性的CDR序列。
在一個態樣中，本申請提供了編碼如本文所揭示之四價雙專一性抗體、輕鏈或重鏈的經分離核酸。
在一個態樣中，本申請提供了包含如本文所揭示之經分離核酸的表現載體。在一個實施例中，表現載體可在細胞中表現。
在一個態樣中，本申請提供包含本文揭示之核酸的宿主細胞。在一個實施例中，宿主細胞包含如本文所揭示之表現載體。宿主細胞可以為原核細胞或真核細胞。
在一個態樣中，本申請提供了產生如本文揭示之四價雙專一性抗體、輕鏈或重鏈的方法。在一個實施例中，本申請包括培養本文揭示之宿主細胞以產生四價雙專一性抗體、輕鏈、重鏈的步驟。
在一個態樣中，本申請提供包含本文揭示之四價雙專一性抗體及細胞毒劑的免疫結合物。在一個實施例中，細胞毒劑可以為化學治療劑、生長抑制劑、毒素或放射性同位素，或其組合。
在一個態樣中，本申請提供藥物組合物。在一個實施例中，藥物組合物包含本文揭示之四價雙專一性抗體或免疫結合物及藥學上可接受之載劑。
在一個實施例中，藥物組合物包含放射性同位素、放射性核素、毒素、治療劑、化學治療劑或其組合。
在一個態樣中，本申請提供了治療患有癌症之個體的方法。在一個實施例中，本申請包含向個體投與有效量之如本文所揭示之四價雙專一性抗體或免疫結合物。在一個實施例中，該方法可進一步包括共同投與有效量之治療劑的步驟。
在一個實施例中，治療劑可以為抗體、化學治療劑、酶或其組合。在一個實施例中，治療劑可以包括例如卡培他濱、順鉑、曲妥珠單抗、氟維司群、他莫昔芬、來曲唑、依西美坦、阿那曲唑、胺基魯米特、睾丸內酯、伏洛唑、福美坦、法卓唑、來曲唑、厄洛替尼、拉法替尼、達莎替尼、吉非替尼、伊馬替尼、帕唑匹尼、拉帕替尼、舒尼替尼、尼羅替尼、索拉非尼、白蛋白-帕利他賽、其衍生物或組合。
在一個實施例中，癌症包含表現HER3或EGFR之細胞。在一個實施例中，癌症包括乳腺癌、結腸直腸癌、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神經膠質瘤、食道癌、鼻咽癌、腎癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、宮頸癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤。
在另一態樣中，本申請提供了包含有效濃度之四價雙專一性抗體或其免疫結合物的溶液。在一個實施例中，溶液為個體之血漿。
在一個實施例中，個體為哺乳動物。在一個實施例中，個體為人。
本發明提供了具有優於目前已知抗EGFR抗體之治療特性或功效的雙專一性四價抗體。在一個實施例中，抗體靶向EGFR家族之成員，包括但不限於EGFR、HER2及HER3。此等雙專一性四價抗體可以同時抑制不同受體介導之致癌信號傳導，藉此克服EGFR抑制劑或單株抗體治療中的耐藥性。
如本文所用，術語「一個」、「一」及「該」係定義為表示「一個或多個」且包括複數，除非上下文不合適。
如本文所用，術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」係可互換的且定義為指由藉由肽鍵連接之胺基酸構成之生物分子。
術語「抗原」係指可以在生物體，尤其動物，更尤其包括人在內之哺乳動物中誘導免疫反應之實體或其片段。該術語包括免疫原及其負責抗原性或抗原決定子之區域。
術語「抗原-或表位結合部分或片段」、「可變區」、「可變區序列」或「結合域」係指能夠結合抗原(諸如本申請中之EGFR)之抗體片段。此等片段可能具有完整抗體之抗原結合功能及附加功能。結合片段之實例包括但不限於單鏈Fv片段(scFv)，該scFv由在單個多肽中藉由合成連接子連接之抗體單臂的可變輕鏈(variable light chain，VL)及可變重鏈(variable heavy chain，VH)域組成，或Fab片段，該Fab片段為由VL、恆定輕鏈(constant light，CL)、VH及恆定重鏈1(constant heavy 1，CH1)域組成之單價片段。抗體片段甚至可為更小的亞片段，且可以由小到單個CDR域之域，尤其為來自VL及/或VH域之CDR3區組成 33。使用熟習此項技術者已知之習知方法產生抗體片段。可以使用與完整抗體所用相同之技術針對效用篩選抗體片段。
「抗原-或表位結合部分或片段」、「可變區」、「可變區序列」或「結合域」可以藉由多種本領域已知技術源自本揭示案之抗體。例如，抗原結合片段(Fab)為抗體上與抗原結合之區域(Fab區)。例如，經純化單株抗體可以用酶(諸如胃蛋白酶)裂解，且進行HPLC凝膠過濾。抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，每個片段都有一個單一抗原結合位點，及一個殘留「Fc」片段，其名稱反映了其易於結晶的能力。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原組合位點且仍然能夠交聯抗原之F(ab') 2片段。然後可以藉由膜過濾及其類似手段收集及濃縮含有Fab片段之適當部分。為了進一步描述分離抗體活性片段之一般技術 34,35。
術語「抗體」以最廣泛的含義使用，具體涵蓋單株抗體及/或重組抗體(包括激動劑及拮抗劑抗體)、具有多表位專一性之抗體組合物以及抗體片段(例如，Fab、F(ab') 2及Fv)，只要它們表現出所需生物活性。在一些實施例中，抗體可為單株、多株、嵌合、單鏈、多專一性或多效、人及人源化抗體，以及其活性片段。結合已知抗原之分子之活性片段的實例包括Fab、F(ab') 2、scFv及Fv片段，包括Fab免疫球蛋白表現文庫之產物及任何上述抗體及片段的表位結合片段。
術語「Fv」係指含有完整抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此區域由緊密非共價締合之一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域之二聚體組成。正是在此組態中，每個可變域之三個CDR相互作用以定義VH-VL二聚體表面上的抗原結合位點。總的來說，六個CDR賦予抗體抗原結合專一性。然而，即使單個可變域(或僅包含三個對抗原具有專一性之CDR的Fv的一半)亦具有識別及結合抗原之能力，儘管親和力低於整個結合位點。
在一些實施例中，抗體可包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有結合位點且免疫專一性結合抗原之分子。典型的抗體係指通常包含兩條重(heavy，H)鏈及兩條輕(light，L)鏈之異四聚體蛋白。每條重鏈包含重鏈可變域(縮寫為VH)及重鏈恆定域。每條輕鏈包含輕鏈可變域(縮寫為VL)及輕鏈恆定域。根據恆定域之胺基酸序列，來自任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)的輕鏈可以分為兩種明顯不同的類型之一，稱為κ及λ。VH及VL區可以進一步細分為高變互補決定區(complementarity determining region，CDR)之區域及稱為構架區(framework region，FR)之更保守區。每個可變域(VH或VL)通常由三個CDR及四個FR構成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在輕鏈及重鏈之可變區內存在與抗原相互作用之結合區。
根據其重鏈恆定域之胺基酸序列，免疫球蛋白可分為不同類別。免疫球蛋白主要有五類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中一些可以進一步分為子類(同型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3及IgG-4；IgA-1及IgA-2。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別免疫球蛋白之次單元結構及三維組態為眾所周知的。
術語「效價」係指抗體之效價，指個別抗體分子可以結合的抗原決定子之數量。所有抗體之效價至少為2，而「抗體親和力」係指抗體與抗原表面特定表位結合之趨勢，即相互作用的強度。
如本文所用，術語「單株抗體」係指自實質上同質之抗體群體中獲得之抗體，即，除了可能以少量存在之天然存在的突變之外，構成群體之個別抗體為相同的。單株抗體具有高度專一性，針對單個抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定子(表位)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑相比，每種單株抗體針對抗原上的單個決定子。除了專一性之外，單株抗體之優勢在於它們係由雜交瘤培養物合成，不受其他免疫球蛋白的污染。修飾語「單株」表示自實質上同質的抗體群體中獲得之抗體的特徵，不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，根據本揭示案使用之單株抗體可以藉由由Kohler&Milstein 36首先描述之雜交瘤方法製備，或者可以藉由重組DNA方法製備(參見例如美國專利第4,816,567號) 37。「重組」係指在外源宿主細胞中使用重組核酸技術產生抗體。
可以使用多種方法產生單株抗體，包括但不限於小鼠雜交瘤、噬菌體顯示、重組DNA、直接自原代B細胞分子選殖抗體及抗體發現方法 38,39,40。單株抗體可包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈的一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體之片段，只要它們表現出所需生物活性 41,42。
術語「人源化抗體」係指一類工程化抗體，其CDR源自非人供體免疫球蛋白，分子的其餘免疫球蛋白源部分源自一種(或多種)人免疫球蛋白。此外，可以改變構架支持殘基以保持結合親和力。獲得「人源化抗體」之方法係熟習此項技術者熟知的 43,44。
術語「經分離」或「經純化」係指不含至少一些天然存在之組分的生物分子。「經分離」或「經純化」，當用於描述本文揭示之各種多肽時，係指已經自表現它的細胞或細胞培養物中鑑定及分離及/或回收的多肽。通常，經純化多肽將藉由至少一個純化步驟來製備。「經分離」或「經純化」抗體係指實質上不含具有不同抗原結合專一性之其他抗體的抗體。
術語「免疫原性」係指引發或增強針對免疫原性試劑之抗體、T細胞或其他反應性免疫細胞的產生且有助於人或動物之免疫反應的物質。當個體針對投與之本揭示案的免疫原性組合物產生足夠抗體、T細胞及其他反應性免疫細胞以緩和或減輕待治療之病症時，發生免疫反應。雖然免疫原性反應通常包括免疫反應之細胞(T細胞)與體液(抗體)臂，但針對治療性蛋白之抗體(抗藥抗體，ADA)可能由IgM、IgG、IgE及/或IgA同型組成。
術語「專一性結合」、「專一性結合至」或「對特定抗原或表位具有專一性」係指該結合與非專一性相互作用可量測地不同。例如，可以藉由與對照分子之結合相比決定分子之結合來量測專一性結合，對照分子通常為不具有結合活性之類似結構的分子。例如，專一性結合可以藉由與類似於標靶之對照分子的競爭來決定。
術語「親和力」係指兩個多肽之間的吸引力的度量，諸如抗體/抗原、受體/配位體等。兩個多肽之間的內在吸引力可以表示為特定相互作用之結合親和力平衡解離常數(KD)。KD結合親和力常數可以例如藉由生物層干涉術量測，其中KD為kdis(解離速率常數)與kon(締合速率常數)之比率，如KD=kdis/kon。
對特定抗原或表位之專一性結合可以例如藉由對於抗原或表位具有至少約10-4 M、至少約10-5 M、至少約10-6 M、至少約10-7 M、至少約10-8 M、至少約10-9 M，或者至少約10-10 M、至少約10-11 M、至少約10-12 M或更大之KD的抗體來展示，其中KD係指特定抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。通常，專一性結合抗原之抗體對於對照分子之KD相對於抗原或表位大20-、50-、100-、500-、1000-、5,000-、10,000-或更多倍。
此外，對於特定抗原或表位之專一性結合可以例如藉由對於表位相對於對照具有至少20-、50-、100-、500-、1000-、5,000-、10,000-或更多倍之KA或Ka的抗體來展示，其中KA或Ka係指特定抗體-抗原相互作用之締合速率。
本申請認為雙專一性抗體可能比任何組合治療具有優勢，組合治療通常比單一藥劑治療具有更大的毒性。雙專一性藥劑，諸如本申請中揭示之雙專一性抗體，可以作為單一藥劑靶向與組合療法相同之抗原，但與組合療法相比具有提高的功效與反應率以及降低的毒性。與使用兩種單株抗體之組合療法相比，由於結合專一性增加，雙專一性抗體治療劑對患者的毒性更小及/或更有效。
在一個態樣中，本申請提供具有N端及C端的雙專一性抗體，其包含至少兩個結合域，其中該結合域包含Fab區及scFv域。scFv域可以連接至抗體之N端或C端。Fab區及scFv域各自獨立地對EGFR家族中的不同蛋白質具有結合專一性。
在一些實施例中，本文描述之scFv分子含有可操作地連接VH及VL之(G mS) n連接子，而不管V區方向(LH或HL)。雙專一性抗體中之其餘位置可由人IgG Fc或IgG無Fc重鏈VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3及其相應κ或λ輕鏈VL-CL組成。此等scFv域係經由(G mS) n連接子與IgG重鏈之N端或C端基因連接，產生連續的約75 kDa重鏈單體肽。當與合適之輕鏈共轉染時，最終的對稱雙專一性分子可以經由人IgG Fc(蛋白 A)進行純化，且進行分析以評估功能活性。
在一個實施例中，對EGFR具有結合專一性之結合域包括西妥昔單抗、帕尼單抗及尼妥珠單抗。西妥昔單抗為一種EGFR抑制劑藥物，用於治療轉移性結直腸癌及頭頸癌。西妥昔單抗為一種藉由靜脈輸注給藥之小鼠/人嵌合單株抗體。
在一個實施例中，對HER3具有結合專一性的結合域包含MM-111，一種雙專一性HER2及HER3結合蛋白。MM-111為一種人血清白蛋白(HSA)支持之雙專一性抗體片段，包含一種與HER3之治療性結合，但其與HER2的單獨結合不足以被視為治療性結合。相比之下，曲妥珠單抗包含一種與HER2之單一治療性結合。
本文揭示之雙專一性抗體具有概括使用單一藥劑同時結合至EGFR及HER3之協同效應的優點。雙專一性四價抗體可以包括具有兩條重鏈及兩條輕鏈的免疫球蛋白G(IgG)部分及兩個scFv部分，它們經由連接子共價連接至重鏈或輕鏈之C或N端，諸如(Gly-Gly -Gly-Gly-Ser) n連接子或(Gly-Gly-Gly-Ser) n連接子或(G mS) n連接子。
眾所周知，由於結合部分及骨架結構之選擇可能會影響患者的體內結合效率及治療功效，因此具有單一治療劑會帶來重大挑戰。例如，ALM為一種靶向HER2/HER3之雙專一性抗體，其在體外對腫瘤細胞具有抗增殖活性。但由於快速的腎臟清除，短循環半衰期使其不太可能成為候選藥物 3。
西妥昔單抗及帕尼單抗都為靶向EGFR之單株抗體(表1)。它們的同型不同，即分別為IgG1及IgG2。這意味著結合親和力之KD值差異可能超出CDR及FR之序列。事實上，將「二合一」二價雙專一性抗體重新格式化為IgG1會分別影響與EGFR及HER3之結合親和力的KD值。SI-1XC6.4(C3)(WO2016106157A1 20，藉由引用整體併入本文，在臨床試驗中亦稱為SI-B001，NCT04603287)為一種靶向EGFR及HER3之四價雙專一性抗體，當與度戈妥珠單抗(亦稱為MEHD7945A、「二合一」抗體或SI-1C4，如WO2016106157A1 20中所述)直接相比時具有改善的EC50。SI-1X6.4(C3)包含與西妥昔單抗相同之抗EGFR結合域，且顯示出親和力KD值的差異(表1a)。SI-1X6.4(C3)包含與MM-111相同之抗HER3結合域，且其親和力KD值明顯彼此不同(表1a)。每種雙專一性抗體之結構組態可能會導致殺死腫瘤細胞之功效差異。由於許多形式的人癌症過度表現EGFR或HER2而非HER3，抗HER3結合域親和力KD降低之不可預見的好處可能允許 SI-B001僅在EGFR陽性腫瘤細胞上，而非在HER3陽性正常細胞上與HER3結合。
術語治療性結合係指已在臨床試驗中以抗體治療劑形式進行安全性測試的結合域。專一性增強之雙專一性抗體(SEBA)的概念定義了雙專一性抗體，其組態為與同一腫瘤細胞而非正常細胞上的兩種腫瘤抗原具有治療性結合的組合。以EGFR家族為例，有多個治療結合域，包括源自西妥昔單抗、曲妥珠單抗、MM-111及「二合一」的彼等，SEBA的目標為將雙專一性抗體作為單一治療劑來開發及/或改進，包含與EGFR家族之兩個成員(例如EGFR/HER2、EGFR/HER3或HER2/HER3對)的治療性結合。每種組態都可能在結合專一性、親和力及親合力、調蛋白結合、抑制EGFR/HER3二聚化及下游信號傳導以及最終對患者之治療功效與細胞毒性方面展現出不同的功效。
西妥昔單抗之一個潛在缺點為其可變區係來源於小鼠。已經證明，與人源化或人抗體相比，保留非人序列之嵌合抗體可能具有增強的免疫原性能力。 6另一方面，人源化可以藉由使構架區更加相容來增加抗體的穩定性。 7另一個問題為VH N85(Kabat)上佔據之聚醣位點，其中Fab醣化可能會影響抗體之生物學特性，且引入必須在製造過程中得到良好控制的聚醣異質性。 8,9雖然基於抗西妥昔單抗IgG反應之低發生率(5%)，西妥昔單抗之免疫原性似乎較低，但超敏反應很常見，主要係由於預先存在的抗半乳糖-α-1,3-半乳糖寡糖之IgE抗體會改變在SP2/0細胞中表現之VH 10。為了克服此等缺點，可能會選擇西妥昔單抗進行人源化且移除翻譯後修飾位點以穩定抗體，且降低免疫原性之可能性，同時保留對EGFR的高親和力。在此情況下，帶有來自西妥昔單抗之治療性結合域之人源化EGFR結合域可以改善現有SEBA，SI-B001之治療效果。 實例
雖然以下實例僅作為說明而非作為限制提供。熟習此項技術者將容易地認識到可以改變或修改以產生基本上相同或相似結果之各種非關鍵參數。 實例1：SI-71X14，一種雙專一性四價抗EGFRxHER3抗體
西妥昔單抗之人源化係使用不同的輸入模型設計的，其中計算突變能量設置為真(CHARMm力場)，以生成最佳單突變序列。使用由Discovery Studio之Antibody Modeling Cascade生成的西妥昔單抗模型。輸入序列為西妥昔單抗VH(以TVSS結尾而非TVSA)及西妥昔單抗VL。為了增加VH C端與人共有序列之相似性(第1圖)，或使Vκ C端更像Vλ，人源化在輸入序列中併入了變化。在Discovery Studio中進行人源化後，藉由將Vκ域之最後三個殘基轉化為來自λJ基因之相應殘基，進一步修飾了VL。由於最後一個VLβ鏈在決定scFv穩定性及聚集傾向方面的已知重要性，以及Vλ端之疏水性更強，可以提供填充能量以穩定相互作用 22 、 23 、 24 ，因此評估了此變化。使用的前5個構架模板之序列相似性截止值為10。CDR環圈定義設置為Honegger，每個環圈之最大模板數設置為3，優化級別設置為高。生成人源化序列後，藉由將VL之最後四個殘基取代為LTVL來進一步修飾 VL，以模擬λ抗體之穩定FR4。
人源化西妥昔單抗SI-71M1係基於西妥昔單抗之結構分析，藉由使構架殘基突變為以至少5%頻率出現於人生殖系中的彼等殘基 ，導致最穩定的電腦模擬結構來設計。由於此類人性化之能量分析取決於輸入模型，因此檢查了幾種輸入結構。SI-71X14係藉由將MM-111之HER3 scFV經由(GmS)n連接子連接至SI-71M1重鏈的C端來生成。
因此，SI-71X14為對SI-1X6.4之修飾，其中西妥昔單抗小鼠可變區經人源化西妥昔單抗可變區替換。除了與SI-1X6.4不同的一級序列外，SI-71X14亦為αEGFR及αHER3雙專一性四價抗體。
胺基酸變化示於第1圖中。圖A顯示重鏈序列中的17個殘基差異位於抗EGFR西妥昔單抗VH域。圖B顯示輕鏈序列中的22個胺基酸差異位於抗EGFR西妥昔單抗VK域。圖C放大VH區域以顯示重鏈中之所有胺基酸差異，而圖D放大VK區域以顯示輕鏈中之所有差異。
除了此等兩種雙專一性蛋白質之外，許多雙專一性及單專一性分子亦包括在隨後的分析中，其特性描述於表1b 中。此允許比較不同EGFR及HER3結合域以及不同類型的結構。
藉由在ExpiCHO系統(Thermo Fisher)中轉染SI-1C7及SI-1R12之表現質體(單質體)或共轉染SI-1C3、SI-1C5、SI-1C6、SI-71M1、SI-1X2、SI-1X6.4、SI-71X14及SI-1C4之重鏈及輕鏈來表現蛋白質。簡而言之，用OptiPRO SFM培養基將10 μg各表現質體(或20 μg未配對質體)達到1 ml。將1 ml含有80 ul Expifectamine CHO試劑之OptiPRO SFM培養基添加至DNA中，且在室溫下溫育2.5分鐘。然後將所得混合物加入至125毫升錐形瓶中之25 ml ExpiCHO細胞中，每毫升6×10 6個細胞，且在37℃，5%CO 2，150 rpm下溫育。細胞在轉染後24小時用8.75 ml ExpiCHO飼料及150 μl CHO強化子餵養，且轉移至32℃、5% CO 2、150 rpm。在轉染後48小時再次用8.75 ml ExpiCHO飼料餵養細胞。轉染後8天收集培養物上清液，以4500 rpm離心1小時以沉澱細胞，然後通過0.2毫米過濾器。
使用1 ml MabSelect PrismA蛋白質A管柱(GE Healthcare)自收集之上清液中純化含Fc之蛋白質。管柱用磷酸鹽緩衝鹽水平衡。然後上清液以2 ml/min之流速通過管柱。用10 ml PBS+0.1% Triton X-100、然後10ml PBS+300 mM NaCl、最後10 ml PBS洗滌管柱。然後藉由使5 ml 50 mM 醋酸鈉，pH 3.5通過管柱來溶析蛋白質。藉由添加0.5 ml 1M Tris-Cl，pH8.0立即中和溶析的蛋白質。
使用1 ml HisTrap HP管柱(GE)自收集之上清液中純化帶His標籤之scFv蛋白。管柱用含有 0.5 M NaCl及20 mM 咪唑，pH 7.4之磷酸鹽緩衝鹽水平衡。上清液中加入10x 結合緩衝液以達到0.5 M NaCl及20 mM咪唑，且以2 ml/min之流速流過管柱。用含有0.5 M NaCl及20 mM咪唑之10管柱體積PBS洗滌管柱，且使用含有 0.5 M NaCl及500 mM咪唑，pH 7.4之之PBS溶析蛋白質。
在第一步蛋白質A或His標籤純化後，立即使用 Waters Acquity UPLC H-Class及ACQUITY UPLC® Protein BEH SEC 200Å，4.6 mm×150 mm，1.7 µm管柱藉由分析型SEC分析蛋白質。PBS(125 mM磷酸鈉，137 mM氯化鈉，pH 6.8)用作流動相，以0.3 ml/min之速度運行10分鐘，注入10 µg蛋白質。
西妥昔單抗有兩個內在N-醣基化位點，N85(Kabat)及N297(Eu)，分別位於Fab及Fc。N85位置中可能的免疫原性N-聚醣可能會影響藥代動力學概況且產生抗藥抗體(ADA)。在人源化型式中，位置85自N突變為D，消除了共有N-醣基化位點，在任何表現的蛋白質中均未偵測到醣基化。此策略有助於蛋白質純化及表徵，但對結合親和力沒有影響，如表2、4所示。 實例2：與人EGFR之結合動力學
在Octet Red 384儀器(Sartorius)上以生物層干涉術(BLI)結合分析來量測單體EGFR胞外域結合。將10 μg/mL之SI-71X14、SI-71M1、SI-1X6.4、SI-1C3、SI-1X2、SI-1C6、SI-1X4.2、SI-1C4或SI-1C5稀釋於分析緩衝液(含有1%牛血清白蛋白及0.05% Tween 20之PBS)中且在抗 huIgG Fc(AHC)生物感測器尖端上捕獲 180秒。將尖端在分析緩衝液中洗滌60秒，然後移至人EGFR(內部表現及純化)樣品中，按1:2自100 nM連續稀釋至0 nM。在180秒的締合時間內，將EGFR胞外域與尖端之結合記錄為生物層干涉術信號(Δnm)。將尖端移至分析緩衝液中且觀察解離420秒。使用10 mM甘胺酸pH 1.5再生感測器。將每種抗體之數據整體擬合至1:1結合模型以提取動力學參數k on、k dis及K D(第2圖，表2)。
值得注意的為，所有基於西妥昔單抗之蛋白質都與人EGFR具有相似的結合動力學。例如，mAb SI-1C6(西妥昔單抗)及SI-71M1(人源化西妥昔單抗)之K D值分別為5.34及4.76 nM。雙專一性(EGFR x HER3)分子SI-1X6.4(包含具有小鼠構架之西妥昔單抗可變區)及SI-71X14(人源化西妥昔單抗構架)具有相似EGFR結合動力學，K Ds分別為5.38及4.61 nM。同時，基於帕尼單抗之mAb(SI-1C3)及雙專一性(SI-1X2)蛋白具有略高的親和力，KD值分別為2.28及2.77 nM，此係由較慢解離速率驅動。基於較慢結合動力學及較快解離動力學，基於尼妥珠單抗之mAb(SI-1C5)及雙專一性(SI-1X4.2)蛋白具有較弱親和力，KD值分別為15.8及18.8 nM。二合一雙專一性抗體度戈妥珠單抗(SI-1C4)之EGFR親和力為14.6 nM，解離速率最快。 實例3：與人HER3之結合動力學
在Octet Red 384儀器(Sartorius)上以生物層干涉術(BLI)結合分析來量測單體HER3胞外域結合。將10 μg/mL之SI-71X14、SI-1C7、SI-1C4、SI-1X6.4、SI-1X2或SI-1X4.2稀釋於分析緩衝液(含有1%牛血清白蛋白及0.05% Tween 20之PBS)中且在抗 huIgG Fc(AHC)生物感測器尖端上捕獲180秒。將尖端在分析緩衝液中洗滌60秒，且移至人HER3(Acro ER3-H5223)樣品中，按1:2自400 nM連續稀釋至0 nM。在180秒的締合時間內，將HER3胞外域與尖端之結合記錄為生物層干涉術信號(Δnm)。將尖端移至分析緩衝液中且觀察解離420秒。使用10 mM甘胺酸pH 1.5再生感測器。將每種抗體之數據整體擬合至1:1結合模型，以提取動力學參數k on、k dis及K D(第3圖，表3)。
值得注意的為，所有抗HER3域源自MM-111之蛋白質都與人HER3具有相似的結合動力學。例如，基於西妥昔單抗之雙專一性蛋白SI-1X6.4(具有小鼠構架之西妥昔單抗可變區)及SI-71X14(人源化西妥昔單抗構架)的K D值分別為107及117 nM。基於帕尼單抗及尼妥珠單抗之雙專一性抗體SI-1X2及SI-1X4.2的HER3 K D值分別為131及146 nM。最後，具有相同抗HER3域(SI-1C7)之對照Fc-scFv蛋白具有相似的結合動力學，K D為149 nM。具有與其他雙專一性蛋白不同之抗HER3可變區的二合一雙專一性抗體度戈妥珠單抗(SI-1C4)具有顯著更緊密之HER3結合，K D為4.29 nM。
由於缺乏Fc域，使用AR2G感測器在同一 Octet儀器上以不同的分析型式測試了另一種比較雙專一性蛋白(SI-1R12 = MM-111，HER2 x HER3白蛋白融合物)。將20 μg/mL之SI-1R12稀釋於10 mM醋酸鹽pH 6.0中，且根據製造商說明書使用600秒加載步驟使用EDC/NHS共價偶合。固定SI-1R12後，將尖端在分析緩衝液中清洗120秒，且移至人HER3(Acro ER3-H5223)樣品中，按1:2自400 nM連續稀釋至0 nM。在180秒的締合時間內，將HER3胞外域與尖端之結合記錄為生物層干涉術信號(Δnm)。將尖端移至分析緩衝液中且觀察解離420秒。將每種抗體之數據整體擬合至1:1結合模型，以提取動力學參數k on、k dis及K D(第3圖，表3)。SI-1R12與HER3結合之動力學與測試的其他雙專一性蛋白之動力學相似，K D值為95.6 nM。 實例4：同時結合人EGFR及HER3
在Octet RED 384 儀器(Sartorius)上以夾心型生物層干涉術(BLI)結合分析來量測與EGFR及HER3胞外域的雙專一性結合。在分析緩衝液(含1% BSA及0.05% Tween 20之PBS)中進行180秒的基線步驟後，將生物素化人EGFR(Acro EGF-H82E3)以5 µg/ml之濃度在分析緩衝液中加載到SA感測器上240 秒。在另一個180秒的基線步驟之後，與SI-1C7、SI-1X2、SI-1X4.2、SI-1X6.4、SI-71M1或SI-71X14之2倍系列稀釋液(0至100 nM)締合在分析緩衝液中進行240秒，然後在不含任何蛋白質的分析緩衝液中解離600秒。在此抗體結合步驟之後，立即進行另一與500 nM HER3 ECD(內部表現)之締合步驟，然後為600秒解離階段。使用1:1結合模型分別擬合每個締合/解離事件，以提取雙專一性EGFR及HER3結合之結合動力學。
在該此分析中量測之第一結合事件係抗體與固定化EGFR結合的事件，這代表了相互作用之親合力，因為它可能發生在細胞表面。此等數據示於第4圖中，動力學參數示於表4中。數據表明，包括人源化西妥昔單抗(SI-71M1)及雙專一性西妥昔單抗x抗HER3抗體SI-1X6.4(具有小鼠構架之西妥昔單抗可變區)及SI-71X14(人源化西妥昔單抗構架)之基於西妥昔單抗之抗體都具有對固定化EGFR之高親合力，其中相互作用的K D太緊而無法精確定量，但估計小於1 pM。此高親合力係由非常緩慢的解離速率驅動。同樣，基於帕尼單抗之EGFR x HER3雙專一性抗體SI-1X2亦具有高親合力，估計K D小於1 pM。基於尼妥珠單抗之EGFR x HER3雙專一性抗體SI-1X4.2亦具有強親合力，擬合K D值為398 pM。正如預期的那樣，對HER3具有專一性之Fc-scFv蛋白SI-1C7沒有顯示出與EGFR的結合。
第二個所關注之事件係捕獲的抗體(已經經由其抗EGFR域結合)與溶液中之HER3蛋白結合。此等相互作用的動力學參數列於表5中。基於西妥昔單抗之EGFR x HER3雙專一性抗體SI-1X6.4(具有小鼠構架之西妥昔單抗可變區)及SI-71X14(人源化西妥昔單抗構架)具有相似HER3 K D值，分別為617及922 nM。基於帕尼單抗及尼妥珠單抗之EGFR x HER3雙專一性抗體SI-1X2及SI-1X4.2具有相似HER3親合力，分別為770及165 nM。值得注意的為，由於缺乏對HER3之專一性，人源化西妥昔單抗 mAb(SI-71M1)在此分析步驟中未顯示出結合，而靶向HER3之Fc-scFv蛋白SI-1C7由於沒有在EGFR結合步驟期間加載而未顯示出結合反應。因此，夾心分析證明EGFR x HER3雙專一性抗體能夠同時結合EGFR及HER3，而僅對EGFR或HER3具有專一性之蛋白質在該分析中沒有顯示反應。 實例5：改良之熱穩定性
在Wyatt DynaPro Plate Reader III上進行動態光散射用於蛋白質熱穩定性分析。蛋白質在25 mM醋酸鈉、75 mM氯化鈉、5%(w/v)蔗糖、pH 5.5中以30 µl/孔稀釋至1 mg/ml。溫度以1.0℃/min自25℃上升至85℃，同時監測半徑。由於難以重現地擬合不同形狀的展開曲線，將半徑超過15 nm的溫度用作熱穩定性之客觀度量。樣品一式兩份運行，單獨運行緩衝液作為陰性對照。
第5圖顯示了SI-71X14、SI-71M1、SI-1C7、SI-1C4、SI-1X6.4、SI-1C6、SI-1R12、SI-1C5、SI-1C3、SI-1X2及SI-1X4.2之熱熔曲線，表6顯示了此等蛋白質之Tm值。EGFR mAb帕尼單抗(SI-1C3)、尼妥珠單抗(SI-1C5)、西妥昔單抗(SI-1C6)及人源化西妥昔單抗(SI-71M1)之Tm 值分別為77.05、65.79、68.39及77.80℃。因此，西妥昔單抗之人源化不僅將熱穩定性提高了 ＞9℃，而且亦產生所測試四種中最穩定的EGFR mAb。基於帕尼單抗(SI-1X2)、尼妥珠單抗(SI-1X4.2)、西妥昔單抗(SI-1X6.4)及人源化西妥昔單抗(SI-71X14)之雙專一性EGFR x HER3抗體的Tm值分別為63.73、63.79、62.33及64.10℃。因此，向EGFR mAb之C端添加抗HER3 scFv趨於標準化且降低熱穩定性。值得注意的為，基於人源化西妥昔單抗之雙專一性EGFR x HER3抗體具有該組中最高的熱穩定性，且將親本西妥昔單抗蛋白之穩定性提高了1.77℃。基於與抗HER3 scFv(SI-1C7)融合之抗體Fc的對照蛋白具有63.17℃的Tm，這與包含此抗HER3 scFv域之雙專一性分子的Tm相似。雙專一性抗體SI-1C4之Tm為69.80℃，證實了mAb樣平台的高穩定性。最後，MM-111雙專一性HSA融合物(SI-1R12)具有最低熱穩定性，Tm為60.41℃。此結果表明抗體型式與其他蛋白質支架相比之有利的穩定性。 實例6：與人EGFR及HER3的依序結合
與EGFR及HER3胞外域之雙專一性結合在Octet RED 384儀器(Sartorius)上以串聯生物層干涉術(BLI)結合分析來量測。
在一種型式中，抗體蛋白係捕獲至AHC感測器上，然後為與EGFR之第一締合步驟，然後為與HER3之第二締合步驟，然後為解離步驟(第6圖)。特定言之，在分析緩衝液(含1% BSA及0.05% Tween 20的PBS)中之20秒基線步驟後，加載10 µg/ml抗體蛋白180秒，然後為60秒基線步驟。接下來，與100 nM EGFR(內部純化)之第一締合步驟進行720秒，然後與100 nM EGFR及400 nM HER3(Acro ER3-H5223)之第二締合步驟進行720秒。值得注意的為，第二步驟含有HER3蛋白，但另外含有與第一步驟中相同量之EGFR(100 nM)，因此EGFR的解離不會使第二步驟中觀察到之動力學複雜化。最後，進行了720秒的解離步驟。
在串聯進行EGFR及HER3步驟之分析中，對照EGFR mAb SI-1C6及SI-71M1在EGFR階段顯示出較大的反應，在HER3階段期間反應沒有顯著增加，表明在第一步驟中與EGFR結合，但第二步中沒有與HER3結合。靶向HER3之對照Fc-scFv蛋白SI-1C7在第一EGFR步驟期間沒有表現出結合，但在第二HER3步驟期間表現出很大的反應。二合一對照mAb SI-1C4在EGFR及HER3步驟期間顯示出結合，表明第一EGFR步驟不足以使抗體結合飽和，因此其他HER3分子可以在第二步驟中結合。雙專一性EGFR x HER3抗體 SI-1X6.4及SI-71X14在EGFR及HER3步驟期間顯示出顯著的結合反應，證實此等蛋白質能夠同時結合EGFR及HER3分子。
在分析中，吾人亦觀察到，對於EGFR及EGFR/HER3締合步驟，SI-71X14具有比SI-1X6.4好的結合反應(Y軸為nm)，約為0.1 nm，此意味著SI-71X14之結合量高於SI-1X6.4。
在另一種型式中，抗體蛋白係捕獲至AHC感測器上，然後為與HER3之第一締合步驟，然後為與EGFR之第二締合步驟，然後為解離步驟(第7圖)。特定言之，在分析緩衝液(含1% BSA及0.05% Tween 20的PBS)中之20秒基線步驟後，加載10 µg/ml抗體蛋白180秒，然後為60秒基線步驟。接下來，與400 nM HER3(Acro ER3-H5223)之第一締合步驟進行720 秒，然後與100 nM EGFR(內部純化)及400 nM HER3之第二締合步驟進行720秒。值得注意的為，第二步驟含有EGFR蛋白，但另外含有與第一步驟中相同量的HER3(400 nM)，因此HER3之解離不會使第二步驟中觀察到的動力學複雜化。最後，進行720秒的解離步驟。
在串聯進行HER3及EGFR步驟之分析中，對照EGFR mAb SI-1C6及SI-71M1在HER3結合步驟期間沒有顯示出反應，隨後在EGFR步驟期間顯示出較大反應，正如預期的那樣。正如預期的那樣，靶向HER3之對照Fc-scFv蛋白SI-1C7在第一HER3步驟期間顯示出結合，但在第二EGFR步驟期間沒有顯示結合。二合一對照 mAb SI-1C4在第一HER3步驟期間顯示出顯著結合，但在第二EGFR結合步驟期間沒有額外的結合。解釋為此抗體之兩個Fab區在第一步驟期間都與HER3結合，使得在第二步驟期間沒有遊離Fab與EGFR結合。雙專一性EGFR x HER3抗體 SI-1X6.4及SI-71X14在EGFR及HER3步驟期間顯示出顯著的結合反應，證實此等分子能夠同時結合EGFR及HER3分子。重要的為，SI-1X6.4及SI-71X14結構之四價性質，以及每個抗原的單獨結合域，允許此等抗體同時結合EGFR及HER3，而此現像對於二合一對照 mAb SI-1C4係不可能的。
在該分析中，我們亦觀察到，對於HER3及EGFR/HER3締合步驟，SI-71X14具有比SI-1X6.4好的結合反應(Y軸為nm)，約為0.1 nm，這意味著 SI-71X14之結合量高於SI-1X6.4。
總之，結合動力學之表徵暗示了SEBA的作用模式，即專一性增強的雙專一性抗體，諸如SI-71X14及SI-1X6.4。與 體外動力學不同，雙專一性抗體治療的反應及有效性可能取決於EGFR及HER3之組織分佈。在各種形式的實體瘤患者中，EGFR之表現可能藉由腫瘤細胞而失調，而HER3可能藉由正常細胞及腫瘤細胞表現。附帶地，許多抗HER3抗體療法因安全問題而失敗，表明在體內靶向正常細胞可能超過了腫瘤細胞。在此申請中，結果表明SI-1X6.4與SI-71X14兩者都可以實現依序結合模式，且具有人源化EGFR結合域之SI-71X14揭示了改良的結合動力學。EGFR(強)與HER3(弱)之間的差異KD值為SI-71X14及SI-1X6.4選擇性結合的基礎，有利於相對於HER3陽性正常細胞結合至表現EGFR之癌細胞。在此情況下，SEBA可能有助於減少體內副作用。此外，藉由強及弱KD值所量測到之具有對兩種腫瘤相關抗原(TAA)之差異化結合親合力可能為設計SEBA以靶向致癌受體的新策略。 實例7：抑制腫瘤細胞增殖
為了評估含有抗EGFR域之抗體的生長抑制潛力，比較了西妥昔單抗來源之EGFR域(wt)及人源化EGFR結合域在不同治療型式中的作用。針對表現EGFR與HER3蛋白以及HER2蛋白之Fadu細胞株(下嚥鱗狀細胞癌，ATCC HTB-43)測試生長抑制作用(第8圖)。藉由Fadu細胞與對EGFR、HER3或HER2具有專一性之螢光結合抗體以及同型匹配對照抗體一起孵育來決定專一性抗原呈現。使用FACS方法(BD Bioscience LSR-Fortessa)對細胞上之抗體結合進行定量。
將細胞株以每孔5000個細胞之密度於200 ul含有1% FBS之RPMI-1640培養基中接種於96孔組織培養板中。在90 nM至85.8 fM之劑量範圍內添加治療。細胞在存在測試抗體下在一式三份板中培養63小時。使用時間序列顯微鏡(Incucyte Zoom)基於核定位螢光報告蛋白mKate2之Fadu細胞株穩定表現獲得細胞核計數。在基線及培養期間的間隔收集數據。基於接種孔及未處理的對照條件報告標準化增殖。wt西妥昔單抗及人源化西妥昔單抗抗增殖作用之比較效應在劑量反應曲線中表示，抑制作用的IC-50係基於使用S形、4PL、最小二乘擬合之迴歸分析來提供，其中X為濃度，曲線擬合提供為圖中之R 2值(Graphpad Prism 9)。
當wt西妥昔單抗域與HER3以雙專一性型式(SI-X6.4)使用時，與單獨的EGFR mAb(SI-1C6)相比，IC-50降低了3倍，而添加了HER3域則提供了更大的整體抗增殖作用(第9圖)。然而，與單獨的人源化西妥昔單抗(SI-71M1)相比，人源化西妥昔單抗域與HER3結合域組合(SI-71X14)時可恢復抗增殖IC-50，且在更高濃度下保留更大的整體抗增殖作用(第10圖)。
與HER3在雙專一性型式中增強EGFR抑制功能的作用一致，帕尼單抗(SI-1C3)在具有HER3域之雙專一性形成(SI-1X2)中進行工程化時可實現更大的整體抗增殖作用(第11圖)。然而，EGFR抗體尼妥珠單抗(SI-1C5)在此分析系統中顯示出抑制Fadu細胞增殖之能力較差，並且在雙專一性形成(SI-1X4.2)中向尼妥珠單抗添加HER3未觀察到提供益處，證明了關鍵需求EGFR域促進抗增殖益處而使得阻斷HER3在雙專一性藥物設計中受益(第12圖)。
Fadu對雙專一性型式(SI-71X14)之與HER3結合域組合之人源化西妥昔單抗的反應達成的抗增殖IC-50比相同型式(SI-1X6.4)之wt西妥昔單抗好3倍。SI-71X14中人源化EGFR在更高濃度下進一步實現了顯著更大的整體抗增殖作用(第13圖)。相比之下，SI-1C4為一種針對EGFR及HER3的雙專一性抗體，建立在Schaefer描述之二合一平台上 30。IC4具有與單株抗體相似的結構。該分子可以與每個Fab臂上之EGFR或HER3結合，但不能同時與每個Fab臂上之兩個靶標接合。在阻斷EGFR或HER3以及過量的兩種受體時，二合一的抗增殖效能不如SI-71X14及SI-1X6.4之雙專一性型式(第14圖)。作為比較，SI-1R12為MM-111，一種HER2 X HER3雙專一性抗體，據報告具有抗增殖作用。然而，雖然Fadu表現HER2與HER3，但並未實現抑制。此證明了EGFR與HER3之關鍵組合促進阻斷抗增殖作用，而非此細胞株上之HER2及HER3(第13圖)。
與wt西妥昔單抗相比，在多專一性形成中工程改造時西妥昔單抗抗體之再次工程改造能夠實現更大的抗增殖效力，如在T細胞接合物雙專一性及五專一性結構中以及與HER3結合域組合時所證明。與野生型西妥昔單抗相比，人源化西妥昔單抗域與HER3結合域組合時亦實現了更大的整體抗增殖作用。 表 表1a. TAA結合域之KD值可能因不同的治療性抗體而變化。
治療劑 候選物 Mab類型 標靶 EGFR親和力KD (nM) HER2親和力KD (nM) HER3親和力KD (nM) EC 50(nM)
西妥昔單抗 11 二價 EGFR 0.2      
帕尼單抗 12 二價 EGFR 0.05      
尼妥珠單抗 13 二價 EGFR 67      
耐昔妥珠單抗 21 二價 EGFR 0.28      
曲妥珠單抗 14 二價 HER2   1.8    
帕妥珠單抗 15 二價 HER2   0.8    
帕曲妥珠單抗 16 二價 HER3     1-3  
MM-121 17 二價 HER3     0.75  
MM-111 18 單價雙專一性HSA-scFv* HER2 & HER3   0.3 16  
度利妥珠單抗 (MEHD7945A) 19 「二合一」單價雙專一性 EGFR或HER3 19.9   2.63 0.068–0.589 #
SI-1X6.4(C3) 二價雙專一性 EGFR & HER3 5.38   107  
#分別使用Fadu及NCI-H1975細胞進行ADCC分析之結果。 表1b. 具有靶向EGFR、HER3或兩者之治療性結合域的抗體。
蛋白質 專一性 抗EGFR Fab之來源 EGFR效價 抗HER3 scFv之來源 HER3效價
SI-1C3 EGFR 帕尼單抗 雙 n/a n/a
SI-1C5 EGFR 尼妥珠單抗 雙 n/a n/a
SI-1C6 EGFR 西妥昔單抗 雙 n/a n/a
SI-71M1 EGFR 人-西妥昔單抗 雙 n/a n/a
SI-1C7 HER3 Fc-scFv n/a MM-111 雙
SI-1X2 EGFR x HER3 帕尼單抗 雙 MM-111 雙
SI-1X4.2 EGFR x HER3 尼妥珠單抗 雙 MM-111 雙
SI-1X6.4 EGFR x HER3 西妥昔單抗 雙 MM-111 雙
SI-71X14 EGFR x HER3 人-西妥昔單抗 雙 MM-111 雙
SI-1C4 EGFR x HER3 度利妥珠單抗 單 度利妥珠單抗 單
SI-1R12 HER2 x HER3 n/a n/a MM-111 單
表2. 藉由生物層干涉術量測之抗EGFR蛋白與帶His標籤之人EGFR胞外域的結合動力學(親和力)。
蛋白質 KD (M) kon (1/Ms) kdis (1/s)
SI-71X14 4.61E-09 2.64E+05 1.22E-03
SI-71M1 4.76E-09 2.72E+05 1.30E-03
SI-1X6.4 5.38E-09 2.89E+05 1.56E-03
SI-1C6 5.34E-09 2.71E+05 1.45E-03
SI-1C3 2.28E-09 1.95E+05 4.45E-04
SI-1X2 2.77E-09 1.97E+05 5.46E-04
SI-1C4 1.46E-08 3.00E+05 4.38E-03
SI-1C5 1.58E-08 1.13E+05 1.78E-03
SI-1X4.2 1.88E-08 1.08E+05 2.02E-03
表3. 藉由生物層干涉術量測之抗HER3蛋白與帶His標籤之人HER3胞外域的結合動力學(親和力)。請注意，與使用AHC感測器決定之所有其他量測相比，由於缺乏Fc域，SI-1R12需要使用AR2G感測器進行設置。
蛋白質 KD (M) kon (1/Ms) kdis (1/s)
SI-71X14 1.17E-07 2.65E+05 3.08E-02
SI-1C7 1.49E-07 2.24E+05 3.33E-02
SI-1C4 4.29E-09 2.05E+05 8.77E-04
SI-1X6.4 1.07E-07 2.82E+05 3.02E-02
SI-1X2 1.31E-07 2.75E+05 3.61E-02
SI-1X4.2 1.46E-07 2.60E+05 3.80E-02
SI-1R12 9.56E-08 4.41E+05 4.22E-02
表4. 藉由生物層干涉術量測之抗EGFR蛋白與生物素化人EGFR胞外域之結合動力學(親合力)。
蛋白質 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
SI-1C7 N.D. N.D. N.D.
SI-1X2 ＜1.0E-12 2.81E+05 ＜1.0E-07
SI-1X4.2 3.98E-10 1.07E+05 4.25E-05
SI-1X6.4 ＜1.0E-12 3.20E+05 ＜1.0E-07
SI-71M1 ＜1.0E-12 4.66E+05 ＜1.0E-07
SI-71X14 ＜1.0E-12 3.53E+05 ＜1.0E-07
表5. 在夾心型Octet分析中與生物素化人EGFR結合後，抗EGFR x HER3蛋白及對照與人帶His標籤之HER3的結合動力學(親和力)。請注意，正如預期的那樣，單專一性抗EGFR(SI-71M1)及抗HER3(SI-1C7)蛋白在HER3締合步驟期間沒有顯示任何結合信號。
蛋白質 KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
SI-1C7 N.D. N.D. N.D.
SI-1X2 7.70E-07 3.45E+04 2.65E-02
SI-1X4.2 1.65E-07 2.79E+05 4.59E-02
SI-1X6.4 6.17E-07 2.09E+05 1.29E-01
SI-71M1 N.D. N.D. N.D.
SI-71X14 9.22E-07 7.59E+04 7.00E-02
表6. 藉由生物層干涉術量測之抗HER3蛋白與帶His標籤之人EGFR胞外域的結合動力學。請注意，與使用AHC感測器決定之所有其他量測相比，由於缺乏Fc域，SI-1R12需要使用AR2G感測器進行設置。
蛋白質 Tm (℃)
SI-71X14 64.1
SI-71M1 77.8
SI-1C7 63.17
SI-1C4 69.8
SI-1X6.4 62.33
SI-1C6 68.39
SI-1R12 60.41
SI-1C5 65.79
SI-1C3 77.05
SI-1X2 63.73
SI-1X4.2 63.79
序列表 αEGFR可變域之序列
序列 胺基酸序列ID 核苷酸序列ID
SI-71M1 / SI-71X14 αEGFR VH 1 2
SI-71M1 / SI-71X14 αEGFR VL 3 4
SI-71X14 αHER3 VH 5 6
SI-71X14 αHER3 VL 7 8
單株抗體及雙專一性抗體的序列
序列 胺基酸序列ID 核苷酸序列ID
SI-71M1 HC 9 10
SI-71M1 LC 11 12
SI-71X14 HC 13 14
SI-71X14 LC 11 12
＞序列ID 1：SI-71X14 αEGFR VH胺基酸序列 QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS ＞序列ID 2：SI-71X14 αEGFR VH核苷酸序列 CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTGAGACACTGTCCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGAGCGTGCGGGCTGATGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCT ＞序列ID 3：SI-71X14 αEGFR VL胺基酸序列 EIVLTQSPSTLSVSPGERATFSCRASQSIGTNIHWYQQKPGKPPRLLIKYASESISGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYCQQNNNWPTTFGPGTKLTVL ＞序列ID 4：SI-71X14 αEGFR VL核苷酸序列 GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCACACTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCCATCAGCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGCAGTCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGACCCGGCACCAAGCTGACCGTGCTG ＞序列ID 5：SI-71X14 αHER3 VH胺基酸序列 QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGVGYFDLWGRGTLVTVSS ＞序列ID 6：SI-71X14 αHER3 VH核苷酸序列 CAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCGCGATGGAAGTGCGAGTTACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTGGGGTGGGCTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC ＞序列ID 7：SI-71X14 αHER3 VL胺基酸序列 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVL ＞序列ID 8：SI-71X14 αHER3 VL核苷酸序列 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATCTATGATGTCAGTGATCGGCCCTCAGGGGTGTCTGATCGCTTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGATCATCTCTGGCCTCCAGGCTGACGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGGGAGCAGCAGCACTCATGTGATTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGACCGTCCTA ＞序列ID 9：SI-71M1 HC胺基酸序列 QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ＞序列ID 10：SI-71M1 HC核苷酸序列 CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTGAGACACTGTCCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGAGCGTGCGGGCTGATGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG ＞序列ID 11：SI-71M1及SI-71X14 LC胺基酸序列 EIVLTQSPSTLSVSPGERATFSCRASQSIGTNIHWYQQKPGKPPRLLIKYASESISGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYCQQNNNWPTTFGPGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ＞序列ID 12：SI-71M1及SI-71X14 LC核苷酸序列 GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCACACTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCCATCAGCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGCAGTCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGACCCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG ＞序列ID 13：SI-71X14 HC胺基酸序列 QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSQVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGVGYFDLWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVL ＞序列ID 14：SI-71X14 HC核苷酸序列 CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTGAGACACTGTCCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGAGCGTGCGGGCTGATGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCACAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCGCGATGGAAGTGCGAGTTACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTGGGGTGGGCTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCCGGCGGTGGCGGCTCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATCTATGATGTCAGTGATCGGCCCTCAGGGGTGTCTGATCGCTTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGATCATCTCTGGCCTCCAGGCTGACGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGGGAGCAGCAGCACTCATGTGATTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGACCGTCCTATAA 參考文獻
Figure 02_image001
Figure 02_image003
Figure 02_image005
Figure 02_image007
無
結合附圖，自以下描述及所附申請專利範圍，本揭示案之前述及其他特徵可變得更加明顯。應理解，此等附圖僅描繪了根據本揭示案佈置之幾個實施例且因此不被認為對其範疇的限制，可藉由使用附圖以額外的專一性及細節來描述本揭示案，其中：
第1圖顯示了SI-1X6.4及SI-71X14在重鏈(A，其中所有差異都位於VH)、輕鏈(B，其中所有差異都位於VK)、VH(C)及VK(D)之間的序列比對；
第2圖描繪了使用生物層干涉術感測圖可得之雙專一性抗體及對照抗體與帶His標籤之人EGFR胞外域的結合動力學(親和力)；
第3圖顯示了生物層干涉術感測圖，該圖顯示了與帶His標籤之人HER3胞外域的結合動力學(親和力)。蛋白質ID顯示在每個圖的頂部。請注意，與使用AHC感測器決定之所有其他量測相比，由於缺乏Fc域，SI-1R12需要使用AR2G感測器進行設置。
第4圖顯示了使用生物層干涉術感測圖於SA感測器上捕獲到之與生物素化人EGFR胞外域的結合動力學(親合力)；
第5圖顯示了使用動態光散射之雙專一性抗體的熱穩定性(A)，以及SI-1X6.4及SI-71X14之SEC概況，表明 SI-71X14與源自西妥昔單抗之人源化EGFR結合域的較低聚集(B);
第6圖展示了雙專一性抗體(SI-1X6.4及SI-71X14)與EGFR隨後HER3之串聯結合；
第7圖展示了雙專一性抗體(SI-1X6.4及SI-71X14)與HER3隨後EGFR之串聯結合；
第8圖顯示EGFR家族成員在Fadu癌細胞上的表面表現；
第9圖顯示SI-1X6.4及其親本抗體SI-1C6及對Fadu細胞增殖的效力；
第10圖顯示SI-71X14及其親本抗體SI-71M1對Fadu細胞增殖的效力；
第11圖顯示SI-1X2及其親本抗體SI-1C3對Fadu細胞增殖的效力；
第12圖顯示SI-1X4.2及其親本抗體SI-1C5對Fadu細胞增殖的效力；
第13圖顯示了抗體SI-1X6.4、SI-71X14、SI-1C4及SI-1R12對Fadu細胞增殖的比較效力；及
第14圖顯示了抗體SI-1X6.4、SI-71X14、SI-1C4、SI-71M1、SI-1C6及SI-1C7對Fadu細胞增殖的比較效力。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims (28)

  1. 一種對一人EGFR(上皮生長因子受體)具有一結合專一性之雙專一性四價抗體，自N端至C端包含 對人EGFR具有一第一結合專一性之一Fab區，其中該Fab區包含一可變區，該可變區具有與SEQ ID NO.1、3或其組合具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列； 一Fc域，及 對HER3具有一第二結合專一性之一scFv域。
  2. 如請求項1之雙專一性四價抗體，包含與SEQ ID NO.11、13或其組合具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列。
  3. 如請求項1之雙專一性四價抗體，其中該第一結合親和力之KD為約0.1至約50 nM。
  4. 如請求項1之雙專一性四價抗體，其中該第二結合親和力之KD為約10 nM至約500 nM。
  5. 如請求項1之雙專一性四價抗體，其中該第一結合親和力之KD小於20 nM，且該第二結合親和力之KD大於約50 nM。
  6. 如請求項1的雙專一性四價抗體，其中該Fab區用二硫鍵釘合。
  7. 如請求項1之雙專一性四價抗體，其中該四價雙專一性抗體為經分離單株抗體。
  8. 如請求項1之雙專一性四價抗體，包含人構架區。
  9. 如請求項1之雙專一性四價抗體，其中該抗體為一人源化抗體、一嵌合抗體或一重組抗體。
  10. 一種重鏈，包含與SEQ ID NO.9、13或其組合具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列。
  11. 一種輕鏈，包含與SEQ ID NO.11具有至少98%序列一致性之一胺基酸序列。
  12. 一種編碼如請求項1之四價雙專一性抗體的經分離核酸。
  13. 一種包含如請求項12之經分離核酸的表現載體。
  14. 一種包含如請求項12之核酸的宿主細胞。
  15. 一種產生一四價雙專一性抗體之方法，包含以下步驟：培養如請求項14之宿主細胞以產生該四價雙專一性抗體。
  16. 一種藥物組合物，包含如請求項1之四價雙專一性抗體及一藥學上可接受之載劑。
  17. 如請求項16之藥物組合物，進一步包含放射性同位素、放射性核素、一毒素、一治療劑、一化學治療劑或其一組合。
  18. 一種免疫結合物，包含如請求項1之四價雙專一性抗體及一細胞毒劑。
  19. 如請求項18之免疫結合物，其中該細胞毒劑包含一化學治療劑、一生長抑制劑、一毒素或一放射性同位素。
  20. 一種藥物組合物，包含如請求項18之免疫結合物及一藥學上可接受之載劑。
  21. 一種治療患有癌症之個體的方法，包含以下步驟：向該個體投與一有效量之如請求項1之四價雙專一性抗體。
  22. 如請求項24之方法，其中該癌症包含表現HER3或EGFR之細胞。
  23. 如請求項24之方法，其中該癌症包含乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神經膠質瘤、食道癌、鼻咽癌、腎癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、宮頸癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤。
  24. 如請求項24之方法，進一步包含以下步驟：共同投與一有效量之一治療劑。
  25. 如請求項24之方法，其中該治療劑包含一抗體、一化學治療劑、一酶或其一組合。
  26. 如請求項24之方法，其中該治療劑包含卡培他濱、順鉑、曲妥珠單抗、氟維司群、他莫昔芬、來曲唑、依西美坦、阿那曲唑、胺基魯米特、睾丸內酯、伏洛唑、福美坦、法卓唑、來曲唑、厄洛替尼、拉法替尼、達莎替尼、吉非替尼、伊馬替尼、帕唑匹尼、拉帕替尼、舒尼替尼、尼羅替尼、索拉非尼、白蛋白-帕利他賽、其一衍生物或一組合。
  27. 如請求項24之方法，其中該個體為一人。
  28. 一種包含有效濃度之如請求項1之四價雙專一性抗體的溶液，其中該溶液為一個體之血漿。
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