MXPA05014155A - Anticuerpos dirigidos a los mutantes de delecion de receptor de factor de crecimiento epidermico y sus usos. - Google Patents

Anticuerpos dirigidos a los mutantes de delecion de receptor de factor de crecimiento epidermico y sus usos.

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Abstract

La presente invencion refiere a anticuerpos novedosos, particularmente anticuerpos dirigidos contra mutantes de delecion de receptor de factor de crecimiento epidermico y particularmente al mutante de delecion III, EGFRvIII. La invencion tambien se refiere a anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra mutantes de delecion de receptor de factor de crecimiento apidermico y particularmente a EGFRvIII. Tambien se proporcionan formulaciones de diagnostico y terapeuticas de estos anticuerpos y sus inmunoconjugados.

Description

ANTICUERPOS DIRIGIDOS A LOS MOTANTES DE DELECION DE RECEPTOR DE FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO Y SUS USOS Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama prioridad de las Solicitudes de Patentes de los E.U.A. Número de Serie 60/562,453 presentada en abril 15, 2004, Número de Serie 60/525570, presentada en noviembre 26, 2003, y Número de Serie 60/483,145, presentada en junio 27, 2003. CAMPO DE LA INVENCIÓN Las presentes modalidades se refieren a novedosos anticuerpos, particularmente a anticuerpos dirigidos contra imitantes de deleción del receptor de factor de crecimiento epidérmico y particularmente al mutante de deleción tipo III, a EGFRvIII. Las modalidades también se refieren a anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra mutantes de deleción del receptor de factor del crecimiento epidérmico y particularmente a EGFRvIII. Las modalidades también se refieren a variantes de dichos anticuerpos. También se proporcionan ormulaciones de diagnóstico y terapéuticas de dichos anticuerpos y sus inmunoconjugados . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Moléculas específicas de tumor para ayudar en mejor diagnóstico y tratamiento de cáncer en humanos y animales se han buscado desde el último siglo. Evidencia sólida de sustancias especificas de tumor, con base en datos estructurales moleculares, ha sido difícil de proporcionar en la mayoría de los tipos de cáncer humano excepto aquellos basados en cáncer inducido viralmente y que involucran estructuras moleculares especificadas por el genoma del virus. Hay extremadamente pocos ejemplos de moléculas específicas de tumor con base en estructuras moleculares novedosas . En el caso de gliomas humanos malignos y otros tumores potencialmente asociados con amplificación o cambios en la molécula receptora del factor de crecimiento epidérmico, tal como carcinoma de pecho y otros carcinomas humanos, no ha habido demostraciones inequívocas de moléculas estructuralmente alteradas con secuencias únicas . El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF ) es el producto de la glicoproteína de membrana de 170 kilodaltons del proto-oncógeno c-erb B. La secuencia del gen EGFR se conoce (Ullrich et al . (1984) . Human Epidermal Growth Factor Receptor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the Amplified Gene in A431 Epidermoid Carcinoma Cells. (La secuencia de ADNc receptor del factor de crecimiento epidérmico humano y la expresión aberrante del gen amplificado en células de carcinoma epidermoide A431) Nature 309:418-425). El gen EGFR es el homólogo celular del oncógeno erb B identificado originalmente en virus de eritroblastosis aviar (Downward et al. (1984). Cióse Similarity of Epidermal Growth Factor Receptor and v-erb B Oncogene Protein Sequence . Nature 307:521-527, Ullrich, et al. (1984) ) . La activación de este oncógeno por amplificación de gen se ha observado en una variedad de tumores humanos (Haley et al. (1987A) . The Epidermal Growth Factor Receptor Gene in: Oncogenes, Genes, and Growth Factors Edited by: Guroff, G. 12th Edition. Chapter 2. pp. 40-76. Wiley, N.Y.), y en particular aquellos de origen glial (Libermann et al. (1985). Amplification, Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin. Nature 313:144-147; Wong et al. (1987) . Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:6899-6903; Yamazaki et al. (1988). Amplification of the Structurally and Functionally Altered Epidermal Growth Factor Receptor Gene (c-erbB) in Human Brain Tumors . Molecular and Cellular Biology 8:1816-1820; Malden et al., (1988). Selective Amplification of the Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme.
Cáncer Research 4:2711-2714) . Se ha demostrado que EGF-r se sobreexpresa en muchos tipos de tumores sólidos humanos. Mendelsohn Cáncer Cells 7:359 (1989), Mendelsohn Cáncer Biology 1:339-344 (1990), Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994). Por ejemplo, la sobre expresión de EGFR se ha observado en ciertos carcinomas de pulmón, pecho, colón, gástrico, de cerebro, de vejiga, cabeza y cuello o de varios de riñon y próstata. Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994). Tanto el factor de crecimiento epidérmico (EGF) como el factor alfa de crecimiento de transformación (TGF-alpha.) se ha demostrado que ligan con EGF-r y llevan a proliferación celular y crecimiento de tumor. ¦ Una diferencia principal entre los oncógenos v-erb B y el gen EGFR normal es que los oncógenos virales son versiones amino-truncadas del receptor normal; carecen de la mayoría del dominio extracitoplásmico pero retienen los dominios transmembrana y tirosina quinasa (Fung et al., (1984) Activation of the Cellular Oncogene c-erb B by LTR Insertion: Molecular Basis for Induction of Erythroblastosis by Avian Leukosis Virus. Cell 33:357-368; Yamamoto et al., (1983). Un nuevo virus de Eritroblastosis aviario, AEV-H transporta el gen erbB responsable por la inducción tanto de Eritroblastosis como de Sarcoma. Cell 34:225-232, Nilsen et al., (1985). c-erbB Activation in ALV-Induced Erythroblastosis: Novel RNA Processing and Promoter Insertion Results in Expression of an Amino-Truncated EGF Receptor. Cell 41:719-726; Gammett et al., (1986). Differences in Sequences Encoding the Carboxy- erminal Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potential of Viral erbB Genes. Proc. Nati. Acad. Sci . USA 83:6053-6057). Esto resulta en una proteína que es incapaz de ligar el factor de crecimiento epidérmico (EGF) pero todavía fosforila otros substratos (Gilmore et al., (1985). Protein Phosphorlytion at Tyrosine is Induced by the v-erb B Gene Product in Vivo and In Vitro. Cell 40:609-618; Kris et al., (1985). Antibodies Against a Synthetic Peptide as a Probé for the Kinase Activity of the Avian EGF Receptor and v-erB Protein. Cell 40:619-625), y ha llevado a especulación de que las proteínas v-erb B son oncógenoicas debido a que el dominio quinasa no esta regulado y constitutivamente activo (Downward et al., 1984) . Una variedad de alteraciones genéticas pueden ocurrir en oncógenos virales erb B, por ejemplo substituciones y eliminaciones de aminoácido en el extremo carboxi del gen. Evidencia disponible, sin embargo argumenta que el truncado amino es crítico para carcinogénesis . Los truncados amino son una característica de todos los oncógenos v-erb B, incluyendo aquellos que surgen por inserción de promotor o transducción retroviral (Milsen et al., (1985). c-erbB Activation in ALV-Induced Erythroblastosis : Novel RNA Processing and Promoter Insertion Results in Expression of an Amino-Truncated EGF Receptor. Cell 41:719-726; Gammett et al., (1986). Differences in Sequences Encoding the Carboxy- erminal Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potential of Viral erbB Genes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:6053-6057). En contraste, eliminaciones terminales carboxi parecen estar asociadas solo con tumores que surgen a través de transducción retroviral y parecen determinar el intervalo del huésped y especificidad de tipo de tumor (Gammett et al., 1986; Raines et al., (1985). c-erbB Activation in Avian Leukosis Virus-Induced Erythroblastosis: Clustered Integration Sites and the Arrangement of Provirus in the c-erbB Alíeles. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:2287-2291). Experimentos de transfección con genes c-erb B aviario amino truncados o receptores EGF humano-oncógeno viral quimérico demuestran que esta eliminación es suficiente sola para criar una proteína de transformación (Pelley et al., (1988). Proviral-Activated c-erbB is Leukemogenic but not Sarcomagenic : Characterization of a Replication--Competent Retrovirus Containing the Activated c-erbB. Journal of Virology 62: 1840-1844; Wells et al., (1988). Genetic Determinants of Neoplastic Transíormation by the Retroviral Oncogene v-erbB. Proc. Nati. Acad. Sci . USA 85 : 7597-7601) . La amplificación del gen EGFR ocurre en 40 por ciento de los gliomas humanos malignos (Libermann et al., (1985) Amplification, Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin. Nature 313:144-147; Wong et al., (1987) . Increased Expression of the Epidermal Gro th Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:6899-6903), rearreglo del gen receptor es evidente en muchos de los tumores con amplificación del gen. Las alteraciones estructurales parecen afectar preferencialmente la mitad amino terminal del gen (Yamazaki et al., (1985). Amplification, Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin. Nature 313:144-147; Malden et al., (1988). Selective Amplification of the Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme. Cáncer Research 4:2711-2714), pero la naturaleza de los rearreglos en este momento no se había caracterizado en forma precisa en ningún tumor. Genes y amplificación EGFR variantes en tamaño se han reportado en varios cánceres humanos . (Humphrey et al., (1988). Amplification and Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Human Glioma Xenografts . Cáncer Research 48:2231-2238; Bigner et al., (1988) J. Neuropathol. Exp. Neurol . , 47:191-205; Wong et al., (1987). Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:6899-6903; y Humphrey y colaboradores Amplification and expression of the epidermal growth factor receptor gene in human glioma xenografts. Cáncer Res. 48(8):2231-8 (1988)). No ha habido determinación sin embargo de la base molecular para las moléculas EGFR alteradas en células . En 1989, el trabajo de los doctores Bigner y Vogelstein elucidó la secuencia de un imitante receptor EGF que se ha conocido como el mutante tipo III (también referido como delta-EGFr o EGFrvIII) . Este trabajo se describe en las Patentes de los E.U.A. Números 6,455,498, 6,127,126, 5,981,725, 5,814,317, 5,710,010, 5,401,828, y 5,212,290. Variantes EGFR se provocan por rearreglo de genes acompañado por amplificación de genes EGFR. Hay ocho variantes principales de EGFr que se conocen: (i) EGFRvI carece de una mayoría de dominio extracelular de EGFR, (ii) EGFRvII consiste de una eliminación en cuadro 83 aa en el dominio extracelular de EGFR, (iii) EGFRvIII consiste de una eliminación en-cuadro de 267 aa en el dominio extracelular de EGFR, (iv) EGFRvIV contiene deleciones en el dominio citoplásmico de EGFR, (v) EGFRvV contiene deleciones en dominio citoplásmico de EGFR, (vi) EGFR.TDM/2-7 contiene una duplicación de exones 2-7 en el dominio extracelular de EGFR, (vii) EGFR.TDM/18-25 contiene una duplicación de exones 18-26 en el dominio tirosina quinasa de EGFR, y (viii) EGFR.TD /18-26 contiene una duplicación de los exones 18-26 en el dominio de tirosina quinasa de EGFR (Kuan et al . EGF mutant receptor viII as a molecular target in cáncer therapy. Endocr Relat C ncer. 8(2):83-96 (2001)). Además, hay un segundo mutante EGFRvIII más raro (EGFRvIIl/Á12-13) que posee una segunda deleción que introduce un novedoso residuo histidina en la unión de los exones 11 y 14 (Kuan et al. EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cáncer therapy. Endocr Relat Cáncer. 8(2):83-96 (2001)).
EGFRvIII es la variante de ocurrencia más común del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF) en cánceres humanos (Kuan et al. EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cáncer therapy. Endocr Relat Cáncer. 8(2):83-96 (2001)). Durante el proceso de amplificación de gen, una eliminación de 267 aminoácidos ocurre en el dominio extracelular creando una unión novedosa a la cual pueden dirigirse anticuerpos monoclonales específicos de tumor. Esta variante del receptor EGF contribuye a avance de tumor a través de tumor de señalización constitutiva en una forma independiente de ligandos. EGFrVIII no se sabe que se exprese en ninguno de los tejidos normales (Wikstrand, CJ. et al. Monoclonal antibodies against EGFRVIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. Cáncer Research 55(14): 3140-3148 (1995); Olapade-Olaopa, EO. et al. Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cáncer. Br J Cáncer. 82(1) .186-94 (2000) ) . Sin embargo, EGFRvIII muestra expresión significante en células del tumor, por ejemplo 27 a aproximadamente 76 por ciento de biopsias de cáncer de pecho expresan EGFRvIII (Wikstrand, CJ. et al. Monoclonal antibodies against EGFRVIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. Cáncer Research 55(14): 3140-3148 (1995); Ge H. et al. Evidence of high incidence of EGFRvIII expression and coexpression ith EGFR in human invasive breast cáncer by láser capture microdissection and immunohistochemical analysis. Int J Cáncer. 98 (3) -.357-61 (2002)), 50 a aproximadamente 70 por ciento de gliomas expresan EGFRvIII (Wikstrand, CJ. et al. Monoclonal antibodies against EGFRVIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. Cáncer Research 55(14): 3140-3148 (1995); Moscatello, G. et al. Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in múltiple human tumors. Cáncer Res. 55 (23) : 5536-9 (1995)), 16 por ciento de cánceres NSCL expresan EGFRvIII (García de Palazzo, IE. et al. Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell lung carcinomas. Cáncer Res. 53 (14) .-3217-20 (1993)), 75 por ciento de cánceres de ovario expresan EGFRvIII (Moscatello, G. et al. Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in múltiple human tumors. Cáncer Res. 55 (23) -.5536-9 (1995) ) , y 68 por ciento de cánceres de próstata expresan EGFRvIII (Olapade-Olaopa, EO. et al. Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cáncer. Br J Cáncer. 82(l):186-94 (2000) ) . La deleción de 267 aminoácidos con una sustitución glicina crea una unión única que puede ser capaz de hacer diana en anticuerpos. Además, en vista de la expresión de EGFRvIII's en ciertos tumores y su falta de expresión en tejidos normales, EGFRvIII puede ser una diana idéntica para hacer blanco de droga en terapias de tumor. En particular, EGFRvIII parecerá ser un candidato ideal para terapia de inmunoconjugado de tumores (por ejemplo un anticuerpo conjugado a un agente antineoplástico o toxina) . Otro método de tratamiento de cánceres que sobreexpresan EGFRvIII involucra el uso de una ribozima específica de tumor dirigida específicamente al receptor de variante que no escinde EGFR normal . La ribozima se encuentra que inhibe significativamente el crecimiento de cáncer de pecho en ratones desnudos atímicos (Luo et al. Int. J. Cáncer. 104 (6) : 716-21 (2003) ) . Se han descrito anticuerpos generales para toda la proteína EGFRvIII. Ver la solicitud de Patente Internacional Número WO 01/62931 y Kuan y colaboradores EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cáncer therapy. Endocr Relat Cáncer. 8(2):83-96 (2001), Kuan y colaboradores EGFRvIII as a promising target for antibody-based brain tumor therapy. Brain Tumor Pathol . 17(2):71-78 (2000), Kuan y colaboradores Increased binding affinity enhances targeting of glioma xenografts by EGFRvIII-specific scFv. International Journal of Cáncer. 88 (6) : 962-969 (2000), Landry et al . Antibody recognition of a conformational epitope in a peptide antigen: Fv-peptide complex of an antibody fragment specific for the mutant EGF receptor, EGFRvIII. Journal of Molecular Biology. 308 (5) : 883-893 (2001), Reist et al . Astatine-211 labeling of internalizing anti-EGFRvIII monoclonal antibody using N-succinimidyl 5- [211At] astato-3-pyridinecarboxylate . Nuclear Medicine and Biology. 26 (4) :405-411 (1999), Reist et al. Astatine-211 labeling of internalizing anti-EGFRvIII monoclonal antibody using N-succinimidyl 5- [211At] astato-3-pyridinecarboxylate .
Nuclear Medicine and Biology. 24 (7) : 639-647 (1997), Wikstrand et al. Generation of anti-idiotypic reagents in the EGFRvIII tumor-associated antigen system. C ncer Immunology, Immunotherap . 50 (12 ): 639-652 (2002), Wikstrand et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. Cáncer Research. 55 (14) :3140-3148 (1995), Wikstrand et al. The class III variant of the epidermal growth factor receptor (EGFRvIII) : characterization and utilization as an immunotherapeutic target. J.Neurovirol . 4(2):148-158 (1998), Wikstrand et al. The class III variant of the epidermal growth factor receptor (EGFRvIII) : characterization and utilization as an immunotherapeutic target. J. Neurovirol . 4(2):148-158 (1998), Jungbluth et al . ? monoclonal antibody recognizing human cancers with amplification/overexpression of the human epidermal growth factor receptor. Proc Nati Acad Sci U S A. 100 (2) : 639-44 (2003), Mamot et al. Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) -targeted Immunoliposomes Medíate Specific and Efficient Drug Delivery to EGFR- and EGFRvIII-overexpressing Tumor Cells. Cáncer Research 63:3154-3151 (2003)). Cada uno de estos anticuerpos anteriormente mencionados sin embargo posee o contiene secuencias murinas ya sea en las regiones variables y/o constantes . La presencia de dichas proteínas derivadas murinas puede llevar a la liberación rápida de los anticuerpos o puede llevar a la generación de una inmunorespuesta contra el anticuerpo en un paciente. Además, estos anticuerpos son de afinidad relativamente baja en el orden de 2.2 x 10"8 a 1.5 x 10"9 aún después de maduración por afinidad (Kuan et al . EGF mutant receptor vIII as a molecular target in c ncer therapy. Endocr Relat Cáncer. 8(2):83-96 (2001)). A fin de evitar la utilización de anticuerpos derivados de rata o murinos, los investigadores han introducido función de anticuerpo humano en roedores, de manera tal que los roedores pueden producir anticuerpos totalmente humanos. Ver por ejemplo Méndez et al. Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. Nat Genet.15 (2) :146-56 (1997). Este enfogue se ha empleado en conexión con la generación de anticuerpos exitosos dirigidos contra EGFR de tipo silvestre. Ver e.g., Yang X et al. Development of ABX-EGF, a fully human anti-EGF receptor monoclonal antibody, for c ncer t erapy. Crit Rev Oncol Hemato 38(l):17-23 (2001); Yang X-D et al. Eradication of Established Tumors by a Fully Human Monoclonal Antibody to the Epidermal Growth Factor Receptor without Concomitant Chemotherap . Cáncer Research 59 (6) : 1236-1243 (1999); y la Patente de los E.U.A. Número 6,235,883. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la invención comprende un anticuerpo monoclonal humano aislado que liga específicamente con EGFRvIII y un péptido que comprende la secuencia L E E K K G N Y V V T D H C (SEQ ID NO: 56) . En otra modalidad, la invención comprende un anticuerpo monoclonal humano aislado que liga específicamente a un epítopo contenido dentro de una secuencia que comprende L E E K K G N Y V V T D H C (SEQ ID NO: 56), en donde los residuos requeridos para ligar, como se determina por exploración de alanina en una matriz SPOTs, se eligen del grupo que consiste de EEK, KKNYV, LEK, EKNY y EEKGN. Adicionales modalidades incluyen un anticuerpo monoclonal humano aislado que comprende una amino secuencia de región variable de cadena pesada que está codificada por un gen VH3-33. La amino secuencia de región variable de cadena pesada puede incluir una secuencia de aminoácidos que está codificada por un gen JH4b o una secuencia de aminoácidos que está codificada por un gen D que se elige del grupo que consiste de D6-13 y D3-9. Otras modalidades incluyen un anticuerpo monoclonal humano aislado que comprende una secuencia amino de región variable de cadena ligera que está codificada por un gen A23 (VK2) . La amino secuencia de región variable de cadena ligera puede incluir una secuencia de aminoácidos que esta codificada por un gen JK1. Otras modalidades incluyen un anticuerpo aislado o su fragmento, que liga a EGFRvIII y que comprende una secuencia aminoácido de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 y 333 como se identifica en (SEO ID NO: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, y 17) . El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. El anticuerpo o fragmento pueden estar asociados con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y puede conjugarse a un agente terapéutico. El agente terapéutico puede ser una toxina. El agente terapéutico puede ser una toxina tal como DM-1, AEFP, AURISTATIN E, o ZAP . El agente puede estar asociado con el anticuerpo mediante un enlazador. La toxina puede estar asociada con el anticuerpo mediante un anticuerpo secundario. Adicionales modalidades incluyen una línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo y una célula transformada que comprende un gen que codifica el anticuerpo. La célula puede ser por ejemplo una célula de ovario de hámster chino . Adicionales modalidades incluyen un método para inhibir proliferación celular asociada con la expresión de EGFRvIII, que comprende tratar células que expresan EGFRvIII con una cantidad efectiva del anticuerpo o fragmento. En una modalidad, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo 13.1.2 (SEQ ID NO: 138), 131 (SEQ ID NO: 2), 170 (SEQ ID NO: 4), 150 (SEQ ID NO: 5), 095 (SEQ ID NO: 7), 250 (SEQ ID NO: 9), 139 (SEQ ID NO: 10), 211 (SEQ ID NO: 12), 124 (SEQ ID NO: 13), 318 (SEQ ID NO: 15), 342 (SEQ ID NO: 16), y 333 (SEQ ID NO: 17). El método puede realizarse in vivo, y realizarse en un mamífero, tal como un humano, que sufre de un cáncer que involucra proliferación de células epiteliales tales como de pulmón, colon, gástrico, renal, de próstata, de pecho, glioblastoma o carcinoma de ovarios. Adicionales modalidades incluyen un método para exterminar una célula diana. Esto se logra al contactar la célula diana con un anticuerpo asociado con una toxina. El anticuerpo liga a un peptido LEEKKGNY (SEQ ID NO: 133) . En una modalidad, el anticuerpo tiene una afinidad de enlace mayor que 1.3*10"SM al peptido. En una modalidad, la toxina se elige de AEFP, MMAE, DM-1, y ZAP . En una modalidad, el compuesto toxina de anticuerpo es 10 veces más tóxico a las células dirigidas o diana que a las células sin el péptido. En una modalidad, el anticuerpo comprende una secuencia aminoácido de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de secuencia de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo 13.1.2 (SEQ ID NO: 138), 131 (SEQ ID NO: 2), 170 (SEQ ID NO: 4), 150 (SEQ ID NO: 5), 095 (SEQ ID NO: 7), 250 (SEQ ID NO: 9), 139 (SEQ ID NO: 10), 211 (SEQ ID NO: 12), 124 (SEQ ID NO: 13), 318 (SEQ ID NO: 15), 342 (SEQ ID NO: 16), y 333 (SEQ ID NO: 17) . En otra modalidad, el anticuerpo está asociado con una toxina mediante un enlazador péptido o un segundo anticuerpo. Adicionales modalidades de la invención incluyen un anticuerpo aislado que liga a EGFRvIII y que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende las siguientes regiones de determinación de complementariedad (CDRs) : (a) CDR1 que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos para la región CDR1 de anticuerpos 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 y 333 como se identifica en SEQ ID NO: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, y 17; (b) CDR2 consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácido para la región CDR2 de anticuerpos 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 y 333 como se identifica en SEQ ID NO: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, y 17; y (c) CDR3 que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácido para la región CDR3 de anticuerpos 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 y 333 como se identifica en SEQ ID NO: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, y 17. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, humano o anticuerpo humanizado. En una modalidad, el anticuerpo se asocia con un portador diluyente farmacéuticamente aceptable y/o agente terapéutico. En una modalidad, el agente terapéutico es una toxina. En una modalidad, la toxina es DM-1 o Auristatin E. También se incluye un anticuerpo aislado o su fragmento que liga a EGFRvIII y que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de anticuerpos 13.1.2, 131, 170, 150, 123, 095, 139, 250, 211, 318, 342, y 333 como se identifica en SEQ ID NO: 140, 19, 20, 21, 29, 23, 25, 26, 28, 33, 31 y 32. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. Puede asociarse con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable o conjugarse con un agente terapéutico tal como una toxina, por ejemplo DM1 o AURISTATIN E. En una modalidad, se contempla una línea celular de hibridoma o una célula transformada que produce un anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera del anticuerpo 13.1.2, 131, 170, 150, 123, 095, 139, 250, 211, 318, 342, y 333 como se identifica en SEQ ID NO: 140, 19, 20, 21, 29, 23, 25, 26, 28, 33, 31 y 32. Adicionales modalidades incluyen una línea celular de hibridoma que produce dicho anticuerpo y una célula transformada tal como célula de ovario de hámster chino, que comprende un gen que codifica el anticuerpo. Todavía otra modalidad incluye un método para inhibir proliferación celular asociada con la expresión de EGFRvIII, que comprende tratar células que expresan EGFRvIII con una cantidad efectiva de los anticuerpos o los fragmentos descritos anteriormente. El método puede realizarse xa vivo y en un mamífero tal como un humano, que sufre de cáncer que involucra proliferación de células epiteliales tales como carcinoma de pulmón, de colon, gástrico, renal, de próstata, de pecho, glioblastoma o de ovarios. Todavía otra modalidad incluye un anticuerpo aislado que liga a EGFRvIII y que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende las siguientes regiones de determinación de complementariedad (CDRs) : (a) CDRl consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos para la región CDRl de anticuerpos 13.1.2, 131, 170, 150, 123, 095, 139, 250, 211, 318, 342, y 333 como se identifica en SEQ ID NO: 140, 19, 20, 21, 29, 23, 25, 26, 28, 33, 31 y 32; (b) CDR2 que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos para la región CDRl de anticuerpos 13.1.2, 131, 170, 150, 123, 095, 139, 250, 211, 318, 342, y 333 como se identifica en SEQ ID NO: 140, 19, 20, 21, 29, 23, 25, 26, 28, 33, 31 y 32; y (c) CDR3 que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos para la región CDRl de anticuerpos 13.1.2, 131, 170, 150, 123, 095, 139, 250, 211, 318, 342, y 333 como se identifica en SEQ ID NO: 140, 19, 20, 21, 29, 23, 25, 26, 28, 33, 31 y 32. El anticuerpo identificado en el párrafo previo puede incluir además una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende las siguientes regiones para determinación de complementariedad (CDRs) : (a) CDRl que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos para la región CDRl de anticuerpos 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 y 333 como se identifica en SEQ ID NO: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, y 17; (b) CDR2 que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácido para la región CDR2 de anticuerpos 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 y 333 como se identifica en SEQ ID NO: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, y 17; y (c) CDR3 que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácido para la región CDR3 de anticuerpos 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 y 333 como se identifica en SEQ ID NO: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, y 17. Adicionales modalidades incluyen un método para inhibir proliferación celular asociada con la expresión de EGFRvIII, que comprende tratar células que expresan EGFRvIII con una cantidad efectiva del anticuerpo o fragmento descrito anteriormente. El método puede realizarse in vivo, en un mamífero tal como un humano, que sufre de un cáncer que involucra proliferación de células epiteliales tales como carcinoma de pulmón, carcinoma de pecho, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma de próstata o glioblastoma . Otras modalidades incluyen una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena pesada o su fragmento, seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de anticuerpos 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342, y 333 como se identifica en SEQ ID NO: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, y 17, o una molécula de polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de cadena ligera o su fragmento seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de anticuerpos 13.1.2, 131, 170, 150, 123, 095, 139, 250, 211, 318, 342, y 333, como se identifica en SEQ ID NO: 140, 19, 20, 21, 29, 23, 25, 26, 28, 33, 31 y 32. Adicionales modalidades incluyen un artículo de manufactura que comprende un recipiente, una composición ahí contenida y un inserto o etiqueta de paquete que indica que la composición puede utilizarse para tratar cáncer, caracterizado por la expresión de EGFRvIII, en donde la composición comprende un anticuerpo como se describió anteriormente. Dichos cánceres incluyen un carcinoma de pulmón, carcinoma de pecho, cáncer de cabeza Y cuello, carcinoma de próstata o glioblastoma. También se incluye un equipo de ensayo para la detección de EGFRvIII en tejidos o células de mamífero a fin de supervisar carcinomas de pulmón, de colon gástrico, renal, de próstata o de varios, EGFRvIII es un antígeno expresado por cánceres epiteliales, el equipo comprende un anticuerpo que liga la proteína de antígeno y medios para indicar la reacción del anticuerpo con el antígeno, de estar presente. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal etiquetado, o el anticuerpo puede ser un primer anticuerpo no etiquetado y los medios para indicar la reacción comprenden un segundo anticuerpo etiquetado que es anti-inmunoglobulina . El anticuerpo que ligue el antígeno puede ser etiquetado con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un fluorócromo , una enzima, un radionuclido y un material radioopaco. El anticuerpo que liga el antígeno también puede ligar a wtEGFR sobreexpresado . El equipo puede ser utilizado clínicamente para selección del paciente. Una modalidad adicional incluye un anticuerpo que reconoce específicamente el epítopo de EGFRvIII que contiene el residuo Gly novedoso. Una modalidad adicional incluye una variante de proteína de EGFRvIII. La variante puede tener un inserto pFLAG, puede consistir de los aminoácidos en SEQ ID NO: 56, y puede existir in silico. Otra modalidad incluye un anticuerpo o su variante que liga a la secuencia de reconocimiento EEK GNYWT (SEQ ID NO : 57) . Otra modalidad incluye una variante de anticuerpo que liga específicamente a EGFRvIII. La variante de anticuerpo puede además ligar a un péptido que comprende SEQ ID NO: 57. La variante de anticuerpo puede tener residuos que interactúan con los residuos E NY o EEKGN en el péptido. En una modalidad, la variante de anticuerpo liga a la.secuencia de péptido 10 veces más apretadamente que con una proteína EGFR de tipo silvestre. En una modalidad, el anticuerpo liga específicamente a EGFRvIII y el péptido de SEQ ID NO: 56. En una modalidad, el anticuerpo aislado o variante tiene una región para determinación de complementariedad que comprende una cavidad profunda, en donde la cavidad se crea por CDR2 y CDR3 de la cadena pesada, CDR3 de la cadena ligera y una pequeña porción de CDRl de la cadena ligera. En una modalidad, el anticuerpo o variante aislado tiene residuos 31, 37, 95-101, 143- 147, 159, 162-166, 169-171, 211-219, 221, y 223 dentro de 5 angstroms de una cavidad de enlace. En una modalidad, el anticuerpo o variante aislado tiene una región para determinación de complementariedad que comprende una ranura estrecha en donde la ranura se crea por CDR2 Y CDR3 de cadena pesada y CDRl, CDR2, y CDR3 de cadena ligera. En una modalidad, el anticuerpo aislado o variante tiene residuos 31, 33, 35-39, 51, 54-56, 58-61, 94-101, 144-148, 160, 163-166, 172, y 211-221 dentro de 5 angstroms de una ranura de enlace. En una modalidad, el anticuerpo aislado o variante tiene residuos 31-33, 35, 37, 55, 96-101, 148, 163, 165, 170, 172, 178, 217, y 218 dentro de 5 ángstroms de una ranura de enlace. En una modalidad, el anticuerpo aislado o variante tiene un parátopo configurado de manera tal que cuando el epítopo del péptido EEKKGN (SEQ ID NO 127) liga al parátopo del anticuerpo, al menos un enlace se forma entre dos residuos seleccionados del grupo que consiste E2 y Y172, 3 y H31, K4 y H31, N6 y D33, N6 y Y37, y N6 y K55. En una modalidad, el anticuerpo aislado o variante tiene un parátopo configurado de manera tal que cuando el epítopo del péptido EEKKGNY (SEQ ID 131) liga al parátopo del anticuerpo, al menos un enlace se forma entre dos residuos seleccionados del grupo que consiste de K4 y Q95, K4 y Q95, N6 y Q98, G5 y H31, Y7 y H31, Y7 y W165. En una modalidad, el anticuerpo tiene una estructura o interacción con una estructura que se determina in silico. Otra modalidad proporciona un método para seleccionar variantes que ligan a EGFRvIII con características de enlace particulares, el método comprende el uso de una estructura molecular para crear un parátopo, el uso de una estructura molecular para crear un epítopo, calcular la energía de interacción entre los dos y comparar ese nivel de energía con el nivel de energía del epítopo y un segundo parátopo de una variante mAb y seleccionar una variante con base en las diferencias en los niveles de energía. El método además puede incluir utilizar una energía de interacción entre una segunda variante del parátopo y el epítopo para determinar una tercer energía de interacción y comparar la tercer energía de interacción y la segunda energía de interacción para determinar que variante seleccionar. En una modalidad, la variante se crea y prueba para enlace. Otra modalidad proporciona un método para seleccionar variantes que ligan a EGFRvIII con características de enlace particulares, el método comprende examinar residuos de un epítopo que interactua con un parátopo, seleccionar residuos importantes para crear una secuencia de reconocimiento, utilizar esta secuencia para crear una variante EGFRvIII y utilizar la variante EGFRvIII para seleccionar la variante mAb. Otra modalidad proporciona un método para producir variantes de anticuerpo a EGFRvIII, el método comprende analizar los residuos de un epítopo que interactúan por un parátopo, seleccionar los residuos más importantes de un epítopo para crear una secuencia de reconocimiento, utilizar la secuencia de reconocimiento para crear una variante EGFRvIII y utilizar la variante EGFRvIII para seleccionar variantes de anticuerpo. En una modalidad, la selección de los anticuerpos se logra in silico. En una modalidad, la selección de los anticuerpos a través del uso de la variante EGFRvIII se logra al desarrollar anticuerpos contra la variante EGFRvIII . En la modalidad en donde la variante de anticuerpo aislado liga a EGFRvIII y el péptido de SEQ ID NO: 57, el anticuerpo además puede comprender una mutación punto de los siguientes: Tyrl72Arg, Leu99Glu, ArglOlGlu, Leu217Glu, Leu99Asn, Leu99His, L99T, ArglOlAsp, o alguna combinación de los mismos. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. En una modalidad, el anticuerpo o su variante liga a la secuencia EEKKGNYWT (SEQ ID NO: 57), y el anticuerpo o variante tiene habilidad de enlace subnanomolar . En una modalidad adicional, el anticuerpo liga a EGFRvIII y el anticuerpo tiene un parátopo que liga a un epítopo, y el epítopo tiene un conjunto de residuos que interactúan con el parátopo que incluyen E, K, N, y Y. En una modalidad, el anticuerpo es el anticuerpo 131. En una modalidad adicional, el anticuerpo liga a EGFRvIII y el anticuerpo tiene un parátopo que liga a un epítopo que tiene un conjunto de residuos que interactúan con el parátopo que comprenden: E, E, K, G, y N. En una modalidad, la estructura primaria del epítopo es EEKKGNY (SEQ ID NO: 131) . En una modalidad, el anticuerpo es 13.1.2. En una modalidad adicional, el anticuerpo que liga a EGFRvIII y tiene una KD menor a 1.3*10~9 M, menor a 1.0*10"9 M, o menor que 500 pM. En una modalidad, el anticuerpo es específico para SEQ ID NO: 56 en comparación con un péptido EGFR de tipo silvestre. En una modalidad, el enlace no específico del anticuerpo con el péptido EGFR de tipo silvestre (SEQ ID NO: 134) es menor que el 10 por ciento de aquél del enlace específico del anticuerpo a EGFRVIII (SEQ ID NO: 135) . En una modalidad, el anticuerpo se elige del grupo que consiste de 131, 139, y 13.1.2. En una modalidad, el anticuerpo es internalizado. En una modalidad, la internalización ocurre para cuando menos aproximadamente 70 por ciento o al menos aproximadamente 80 por ciento del anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal humano variante preferencialmente liga a un epítopo que es sustancialmente único a una proteína EGFRvIII comparada con una proteína EGFR de tipo silvestre o su variante (SEQ ID NO: 134) . En una modalidad, la variante comprende una región para determinación de complementariedad de cadena pesada (CDR1) que corresponde a una clase canónica 1. En una modalidad, la variante comprende una región para determinación de complementariedad de cadena pesada (CDR2) que corresponde a la clase canónica 3. En una modalidad, la variante comprende una región para determinación de complementariedad de cadena ligera (CDR1) que corresponde a la clase canónica . En una modalidad, la variante comprende una región para determinación de complementariedad de cadena ligera (CDR2) que corresponde a la clase canónica 1. En una modalidad, la variante comprende una región para determinación de complementariedad de cadena ligera (CDR3) que corresponde a la clase canónica 1. En una modalidad, la variante comprende una primera región para determinación de complementariedad de cadena pesada (CDR1) que corresponde a la clase canónica 1 , una segunda región para determinación de complementariedad de cadena pesada (CDR2) que corresponde la clase canónica 3, una primera región para determinación de complementariedad de cadena ligera (CDR1) que corresponde a la clase canónica 4, una segunda región para determinación de complementariedad de cadena ligera (CDR2) que corresponde a la clase canónica 1; y una tercera región para determinación de complementariedad de cadena ligera (CDR3) que corresponde a la clase canónica 1, en donde las regiones para determinación de complementariedad se configuran para permitir que la variante ligue un epitopo que es sustancialmente único a una proteina EGFRvIII en comparación con una proteina EGFR. En una modalidad adicional, se proporciona un método para inhibir proliferación celular asociada con la expresión de EGFRvIII. El método involucra tratar células que expresan EGFRvIII con una cantidad efectiva de un anticuerpo o su fragmento, en donde el anticuerpo o su fragmento ligan a EGFRvIII, en donde el anticuerpo se conjuga con una toxina y en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada del anticuerpo 13.1. 2 (SEQID NO: 138), 131 (SEQ ID NO: 2), 170 (SEQ ID NO: 4), 150 (SEQ ID NO: 5), 095 (SEQ ID NO: 7), 250 (SEQ ID NO: 9), 139 (SEQID NO: 10), 211 (SEQ ID NO: 12), 124 (SEQ ID NO: 13), 318 (SEQ ID NO: 15), 342 (SEQ ID NO: 16), y 333 (SEQ ID NO: 17) . El método puede realizarse in vivo, en un mamífero, el mamífero puede ser humano y puede sufrir de un cáncer que involucra proliferación de células epiteliales y el cáncer puede involucrar pulmón, colon, gástrico, renal, próstata, pecho, glioblastoma o carcinoma de ovarios. La toxina puede ser DM-1, AEFP, MAE, AURISTATIN E, o ??? . En una modalidad adicional, se proporciona un método para inhibir proliferación celular de células que expresan EGFRvIII. El método involucra tratar células que expresan EGFRvIII con una cantidad efectiva de un anticuerpo o su fragmento, en donde el anticuerpo se conjuga con una toxina, y en donde el anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de los anticuerpos 13.1. 2,131, 170, 150, 123, 095, 139, 250, 211, 342, 333, y 318 como se identifica en SEQ ID NOs : 19, 20, 21, 29, 23, 25, 26, 28, 33, 31 y 32, en donde la molécula de polinucleótido aislado ligará un péptido con una secuencia identificada en SEQ ID NO: 56. El método puede realizarse in vivo, en un mamífero, el mamífero puede ser humano y puede sufrir de un cáncer que involucra proliferación de células epiteliales y el cáncer puede involucrar carcinoma de pulmón, de colon, gástrico, renal, de próstata, de pecho, glioblastoma o de ovarios. La toxina puede ser byDM-1, AEFP, MMAE, AURISTATIN E, o ZAP. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un alineamiento entre EGFR y EGFRvIII del tipo silvestre que muestra la deleción de 267 aminoácidos y sustitución G. La Figura 2 es un diagrama del diseño del péptido 14-mero EGFRvIII PEP3. En la Figura 2A, la secuencia N-terminal de EGFRvIII con los aminoácidos LEEKK (SEQ ID NO: 58) (1-5) que son idénticos a la secuencia N-terminal de EGFR seguidos por el residuo Glicina único, seguido por aminoácidos que son idénticos a los residuos 273 a 280 en EGFR. La Figura 2B representa los aminoácidos de EGFR que se eliminan en EGFRvIII (6-272) . Las Figuras 3A-L proporcionan secuencias de anticuerpos de la invención. Por cada anticuerpo proporcionado, se proporciona una secuencia de nucleótidos y aminoácidos tanto para una región variable de cadena pesada como una región variable de cadena ligera. De acuerdo con esto, se proporcionan 4 secuencias por cada anticuerpo citado. La Figura 4 es una tabla que compara las regiones de cadena pesada de anticuerpo 13.1.2 con una región de cadena pesada de línea germinal particular. "-"s indica que el residuo de aminoácidos de la región de cadena pesada de hibridoma es la misma que la linea germinal para esa posición particular. Desviación de la línea germinal se indica por el residuo de aminoácido apropiado. La Figura 5 es una tabla que compara las regiones de cadena ligera de anticuerpo 13.1.2 a una región de cadena ligera de línea germinal particular. "-"s indica que el residuo de aminoácidos de la región de cadena ligera de hibridoma es el mismo que la línea germinal para esa posición particular. La desviación de la línea germinal se indica por el residuo de aminoácido apropiado . La Figura 6 es una tabla que compara diversas regiones de cadena pesada de anticuerpo derivadas de hibridoma a una región de cadena pesada de línea germinal particular, "-"s indica que el residuo de aminoácidos de la región de cadena pesada de hibridoma es el mismo que la línea germinal para esa posición particular. La desviación de la línea germinal se indica por el residuo de aminoácido apropiado. La Figura 7 es una tabla que compara diversas regiones de cadena ligera de anticuerpo derivadas de hibridoma con una región de cadena ligera de línea germinal particular, "-"s indica que el residuo de aminoácidos de la región de cadena ligera de hibridoma es el mismo que la línea germinal para esa posición particular. La desviación de la línea germinal es indicada por el residuo de aminoácidos apropiado. La Figura 8 es una Figura representativa que muestra el enlace de EGFRvIII mAbs recombinantes con células que expresan EGFRvIII (células NR6) . Los diamantes representan 95, triángulos representan 133, cuadrados representan 139, "x" representa 150, los asteriscos representan 170, los círculos representan 221, las líneas 230, y los rectángulos representan 250. La Figura 9A muestra análisis de tinción FACS para el anticuerpo anti-GFR humano (ABX-EGF) a H80. La Figura 9B muestra análisis de tinción FACS para el anticuerpo 131 a H80. La Figura 9C muestra análisis de tinción FACS para el anticuerpo 139 a H80. La Figura 9D muestra análisis de tinción FACS para el anticuerpo 13.1.2 a H80. La Figura 9E muestra análisis de tinción FACS para ABX-EGF a H1477. La Figura 9F muestra análisis de tinción FACS para el anticuerpo 131 a H1477. La Figura 9G muestra análisis de tinción FACS para el anticuerpo 139 a H1477. La Figura 9H muestra análisis de tinción FACS para el anticuerpo 13.1.2 a H1477. La Figura 91 muestra análisis de tinción FACS para ABX-EGF a A549. La Figura 9J muestra análisis de tinción FACS para el anticuerpo 131 a A549. La Figura 9K muestra análisis de tinción FACS para el anticuerpo 139 a A549.
La Figura 9L muestra análisis de tinción FACS para el anticuerpo 13.1.2 a A549. La Figura 9M es una gráfica que exhibe el enlace de EGFRvIII mAbs a células de glioblastoma . Los triángulos llenos representan anticuerpos 131 que liga a H1477. Los cuadrados llenos representan anticuerpos 13.1.2 que liga a H1477. Triángulos vacíos representan anticuerpos 131 que liga a H80. Cuadrados vacíos representan anticuerpos 13.1.2 que liga a H80. La Figura 9N es una gráfica que exhibe el enlace EGFRvIII mAbs con la línea celular de carcinoma de epidermoide humano A431. Los cuadrados llenos representan anticuerpos 13.1.2. Los triángulos llenos representan anticuerpos 131. La Figura 90 es una gráfica que exhibe el enlace del anticuerpo 13.1.2 a líneas celulares de fibroblastos murinos NR6. Los cuadrados representan NR6. Los triángulos llenos representan NR6 con EDFR de tipo silvestre. Los círculos representan NR6 con EGFRvIII. La Figura 9P es una gráfica que exhibe el enlace del anticuerpo 131 a líneas celulares de fibroblastos murinos. Los cuadrados representan R6. Los triángulos representan NR6 con EGFR de tipo silvestre. Los círculos representan NR6 con EGFRvIII. La Figura 10A muestra análisis de tinción FACS para un anticuerpo anti-EGFR humano (ABX-EGF) que enlaza a células que expresan EGFR (A431) . La Figura 10B muestra análisis de tinción FACS para un anticuerpo 131 con células que expresan EGFR (A431) . La Figura 10C muestra análisis de tinción FACS para anticuerpo 139 con células que expresan EGFR (A431) . La Figura 10D muestra análisis de tinción FACS para anticuerpo 13.1.2 a células que expresan EGFR (A431) . La Figura 11A muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 13.1.2 EGFRvIII indirectamente conjugado con AEFP en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 11B muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 13.1.2 EGFRvIII indirectamente conjugado con DM1 en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 11C La Figura 11A muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 13.1.2 ZAP EGFRvIII indirectamente conjugado con AEFP en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) .
La Figura 11D muestra toxicidades in vi tro para anticuerpo 95 EGFRvIII indirectamente conjugado con AEFP en células que expresan EGFRvIII (H1477, circuios) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados), La Figura 11E muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 95 EGFRvIII indirectamente conjugado con DM1 en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 11F muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 95 EGFRvIII indirectamente conjugado con ??? en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 11G muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 131 EGFRvIII indirectamente conjugado con AEFP en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 11H muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 131 EGFRvIII indirectamente conjugado con DM1 en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 111 muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 131 EGFRvIII indirectamente conjugado con ZAP en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) .
La Figura 12A muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 139 EGFRvIII conjugado indirectamente con AEFP en células que expresan EGFRvIII (H1477, circuios) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 12B muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 131 EGFRvIII indirectamente conjugado con DMI en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 12C muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 131 EGFRvIII indirectamente conjugado con ZAP en células que expresan EGFRvIII (H1477, circuios) contra **células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados).
La Figura 12D muíistra toxicidades in vitro para anticuerpo 150 EGFRvIII indirectamente conjugado con AEFP en células que expresan EGFRvIII (H1477, circuios) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 12E muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 150 EGFRvIII indirectamente conjugado con DMI en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 12F muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 150 EGFRvIII indirectamente conjugado con ZAP en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) .
La Figura 12G muestra toxicidades in vi tro para anticuerpo 170 EGFRvIII indirectamente conjugado con AEFP en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 12H muestra toxicidades in vi tro para anticuerpo 150 EGFRvIII indirectamente conjugado con DMI en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 121 muestra toxicidades in vi tro para anticuerpo 150 EGFRvIII indirectamente conjugado con ZAP en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 13A muestra toxicidades in vi tro para el anticuerpo 211 conjugado indirectamente con AEFP en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados). La Figura 13B muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 211 EGFRvIII indirectamente conjugado con DMI en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados). La Figura 13C muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 211 EGFRvIII indirectamente conjugado con ZAP en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) .
La Figura 13D muestra toxicidades in v tro para anticuerpo 250 EGFRvIII indirectamente conjugado con AEFP en células que expresan EGFRvIII (H1477, circuios) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 13E muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 250 EGFRvIII indirectamente conjugado con DMI en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 13F muestra toxicidades in vitro para anticuerpo 250 EGFRvIII indirectamente conjugado con ZAP en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados). La Figura 13G muestra toxicidades in vitro para anticuerpo IgGl, un control negativo, conjugado indirectamente con EGFRvIII en células que expresan (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 13H muestra toxicidades in vitro para anticuerpo IgGl, un control negativo, conjugado indirectamente con EGFRvIII en células que expresan (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados). La Figura 131 muestra toxicidades in vitro para anticuerpo IgGl, un control negativo, conjugado indirectamente con ZAP EGFRvIII en células que expresan (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 14 es una gráfica de barras que demuestra que los anticuerpos EGFRvIII (13.1. 2,131, y 139) inhiben formación de colonias en células H1477 en un ensayo clonogénico cuando se conjugan con AEFP. La Figura 14B es una gráfica de barras que demuestra que los anticuerpos EGFRvIII (13.1. 2,131, y 139) inhiben formación de colonias en células H1477 en un ensayo clonogénico cuando se conjugan con DM1. La Figura 15A es una gráfica que muestra que toxicidades in vitro de conjugado directo de anticuerpos anti-EGFRvIII (13.1. 2) con toxina, MMAE, en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados). La Figura 15B es una gráfica que muestra toxicidades in vitro de conjugados directos de anticuerpos anti-EGFRvIII (13.1. 2) con toxina, AEFP, en células que expresan EGFRvIII (H1477, círculos) contra células que no expresan EGFRvIII (H80, cuadrados) . La Figura 15C es una gráfica que muestra toxicidades in vitro de conjugados directos de anticuerpos anti-EGFRvIII (13.1. 2) con toxina, DM1, en células que expresan EGFRvIII (H1477) contra células que no expresan EGFRvIII (H80) .
La Figura 16 muestra los resultados de un modelo de animal in vivo en donde ratones que tienen un xenoinjerto de tumor establecido, se trataron con un anticuerpo (13.1.2) anti-EGFRvIII (o dEGFR) que se conjugó directamente con una toxina (DM1, ????, o AEFP) . Cuadros rellenos representan 250 microgramos de dEGFR-DM1. Triángulos con punta hacia arriba rellenos representan 75 microgramos del mismo. Triángulos con punta hacia abajo rellenos representan 75 microgramos de dEGFR-MMAE. Diamantes representan 250 microgramos del mismo. El cuadro más claro representa 75 microgramos de dEGFR-AEFP. El cuadro vacío representa 250 microgramos del mismo. El triángulo con punta hacia abajo vacío representa dEGFR y DM1 libre. El anticuerpo con punta hacia abajo vacío representa PBS. Todos los anticuerpos empleados fueron 13.1.2. Las flechas indican tratamientos pro-droga . La Figura 17 muestra la superficie molecular de modelo estructural de anticuerpo 131. Las seis regiones CDRs están sombreadas con diferentes tonos para marcar sus fronteras. La capacidad de enlace se localiza cerca del centro. La Figura 18 muestra un modelo estructural de la superficie molecular del anticuerpo 13.1.2. Las seis regiones CDR están sombreadas e identificadas por número. La ranura larga se ubica aproximadamente sobre la linea central vertical. La Figura 19A es un modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles del anticuerpo 13.1.2 y el complejo péptido EEKKGN (SEC ID NO: 127). Las regiones CDR están sombreadas para denotar fronteras . La Figura 19B muestra los enlaces de hidrógeno en el modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles del complejo anticuerpo 13.1.2 y péptido EEKKGN (SEQ ID NO: 127) . El sombreado de los bucles CDR y residuos es el mismo que la Figura 18. El residuo péptido se enumera desde el extremo N, en la parte superior de la Figura al extremo C como 1 a 6. Seis uniones de hidrógeno se indican por las líneas punteadas. Los seis pares de aminoácidos que forman enlaces de hidrógeno son: E2...Y172, K3...H31, K4...H31, N6...D33, N6...Y37, y N6...K55. La Figura 20 es una gráfica que demuestra una correlación entre la energía de unión epitopo-anticuerpo y el logaritmo de d para uno de los modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles selectos . La Figura 21 es una ilustración de un modelo refinado de exploración computacional de modos de enlace posibles para el complejo péptido anticuerpo 13.1.2. El péptido se presenta en una forma que llena el espacio . La Figura 22 es una ilustración que representa las uniones de hidrógeno en el modelo refinado de exploración computacional de modos de enlace posibles . La Figura 23 es una gráfica que ilustra el ajuste lineal de la energía de enlace anticuerpo-antígeno contra el logaritmo de afinidad relativos . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Como se discutió anteriormente, EGFRvIII es un mutante de deleción de EGFR en donde 267 aminoácidos en el dominio extracelular de EGFr se eliminan en una sola substitución de aminoácido de glicina en la unión. Estas características se ilustran en un alineamiento de secuencia entre EGFR de tipo silvestre en EGFR y EGFRvIII en la Figura 1. En vista de la substitución de aminoácido de glicina y la unión de la deleción, se vuelve teóricamente posible el generar anticuerpos al epítopo novedoso presente en EGFRvIII que no está presente en EGFR tipo silvestre. De esta manera, se diseña un péptido para inmunización y supervisión, denominado PEP, como se ilustra en la Figura 2 (Kuan y colaboradores, EGF mutant receptor vlll as a molecular target in cáncer therapy. Endocr Relat Cáncer. 8(2):83-96 (2001)). Este péptido 14-mer posee los 5 aminoácidos n-terminales comunes a EGFRvIII y EGFR tipo silvestre, el sitio de unión glicina único y ocho residuos aminoácidos contenidos en las secuencias conservadas entre EGFR tipo silvestre (que corresponde a los residuos 273-280) y EGFRvIII (que corresponde a los residuos 7-14) . Además, células de glioblastoma y células (células B300.19) transfectadas con el gen que codifica EGFRvIII también se utilizaron para inmunización y supervisión (en ocasiones referidos aquí como transfectantes B300.19/EGFRvIII) . A fin de generar anticuerpos humanos contra EGFRvIII, se inmunizaron ratones Xeno ouse® transgénicos con combinaciones de células de glioblastoma EGFRvIII, células B300.19/EGFRvIII , y péptidos (PEP3) dirigidos a la región de unión en el dominio extracelular novedoso representado en EGFRvIII en comparación con EGFR tipo silvestre. Células B de ratones inmunizados se aislaron y ya sea se emplearon para producir hibridomas seguidos por supervisión para enlace a EGFRvIII o emplearon directamente en supervisión para enlace EGFRvIII utilizando tecnologías XenoMax^/SLAM™* (Babcook y colaboradores . A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities . Proc Nati Acad Sci U S A.93 (15) :7843-8 (1996), y la patente de los E.U.A. No. 5,627,052). Anticuerpos identificados que ligan a EGFRvIII se supervisaron en una serie de ensayos para evaluar reconocimiento específico de EGFRvIII. A través de este proceso, paneles de anticuerpos monoclonales humanos se ligan a y son específicos para EGFRvIII se generaron aislaron y caracterizaron. Subsecuente cartografía de epítopo demostró especificidades únicas pero superpuestas . Todos los anticuerpos fueron adicionalmente evaluados in vitro por su habilidad para internalizarse por células con el propósito de suministrar drogas citotóxicas a la célula. Anticuerpos que demuestran suministro eficiente de drogas fueron conjugados directamente con una droga citotóxica y examinaron por su habilidad para exterminar células de tumor que expresan EGFRvIII in vitro e in vivo. Estos estudios proporcionan la base para la siguiente generación de conjugado de droga anticuerpo para tratar cáncer en pacientes cuyo tumor tiene lesiones genéticas específicas. A través de los procesos descritos anteriormente, paneles de anticuerpos anti-EGFRvIII totalmente humanos fueron generados. Utilizando el enfoque de hibridoma, varios anticuerpos incluyendo los anticuerpos 13.1, 13.2, 13.3, y 13.4 que fueron constituidos en ELISA para enlace con PEP3 se generaron con reactividad cruzada limitada, con EGFR tipo silvestre. De estos, el anticuerpo 13.1 (y particularmente, su subclon 13.1.2) se elige para mayor investigación y desarrollo. Utilizando el enfoque XenoMax un panel de anticuerpos incluyendo los anticuerpos 131, 139, 250, y 095, se generaron que eran altamente específicos para enlace con el oligonucleótido pep3 y tuvieron reactividad cruzada limitada con EGFR tipo silvestre. De estos, el anticuerpo 131 tiene propiedades interesantes. Las secuencias para cada uno de los anticuerpos se exhiben en las Figuras 4-7 (SEQ ID NO: 1-33 y 141-144) . Una comparación de las secuencias y habilidades de enlace de los diversos anticuerpos se realiza y los resultados se exhiben en las Figuras 4-10. Como puede verse en las Figuras 9A-9L, y las Figuras 10A-10D los anticuerpos 131, 139, y 13.1.2 todos demuestran superior selectividad para células que expresan EGFRvIII (H1477) en comparación con ABX-EGF. Algunos de los resultados se ilustran en forma gráfica en las Figuras 9M-9P, en que al menos dos de los anticuerpos, 13.1.2 y 131 demuestran superior especificidad para células que expresan EGFRvIII en comparación con simplemente células EGFRvIII. Finalmente, con base en modelos estructurales pronosticados, se elaboraron variantes de anticuerpos a fin de obtener anticuerpos con características de enlace alteradas . Además, anticuerpos de la invención son altamente útiles para la supervisión de otros anticuerpos que ligan al mismo o similares epítopos . Anticuerpos de la invención pueden ser utilizados en estudios de competencia cruzada para la elucidación de otros anticuerpos que se espera tengan los mismos efectos esperados respecto a características del complejo del antígeno-anticuerpo que se forma. Cada uno del anticuerpo 131 y el 13.1.2 poseen afinidades muy altas para EGFRvIII, en donde fueron internalizados bien por células, y aparecieron altamente efectivos en exterminio celular cuando se conjugan con toxinas. De manera intrigante, ambos de los anticuerpos, a pesar de haber sido generados en diferentes inmunizaciones de ratones XenoMouse y utilizando diferentes tecnologías, fueron derivados de genes de línea germinal muy similares. Con base en trabajo de cartografía de epítopo, sin embargo, cada uno de los anticuerpos parece ligar a epítopos ligeramente diferentes en la molécula EGFRvIII y tienen residuos ligeramente diferentes en EGFRvIII que son esenciales para enlace. Estos resultados indican que la utilización de gen de línea germinal es de importancia para la generación de terapéuticos de anticuerpo que hacen diana en EGFRvIII y que cambios pequeños pueden modificar el enlace y efectos del anticuerpo en formas que permiten adicional diseño de anticuerpos y otros terapéuticos con base en estos hallazgos estructurales. Anticuerpos que ligan al mismo epítopo que, o compiten para enlazar con, los anticuerpos 13.1.2 y 131 son altamente convenientes. Como se discute con mayor detalle a continuación, a través de exploración de alanina en conjuntos ordenados SPOTs, residuos importantes para enlace de ciertos anticuerpos se han elucidado. De acuerdo con esto, anticuerpos que comparten residuos de enlace críticos son altamente convenientes . Definiciones A menos que de otra forma se defina, los términos científicos y técnicos aquí empleados tendrán los significados que se entienden comúnmente por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Además, a menos de que de otra forma se requiera por concepto, términos en singular habrán de incluir pluralidades y término en plural habrán de incluir los singulares. En general, nomenclaturas utilizadas en conexión con, y técnicas de, cultivos de células y tejido, biología molecular y química de proteínas y oligo- o polinucleótidos e hibridización aquí descritas, son aquellas bien conocidas y comúnmente empleadas en la especialidad. Técnicas estándar se emplean para ADN recombinante, síntesis de oligonucleotidos y cultivo de tejido y transformación (por ejemplo electroporación, lipofección) . Reacciones enzimáticas y técnicas de modificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la técnica o como se describió aquí . Las técnicas y procedimientos anteriores en general se realizan de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la especialidad y como se describe en diversas referencias generales y más específicas citadas y discutidas a través de la presente especificación. Ver por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Clonlng: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Las nomenclaturas utilizadas en conexión con y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica de síntesis y química medicinal y farmacéutica aquí descritas, son aquellas bien conocidas y comúnmente empleadas en la especialidad. Técnicas estándar se emplean para síntesis química, enlaces químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro y tratamiento de pacientes. El término "polinucleótido aislado" como se emplea aqui significará un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos que en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido en donde el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) se enlaza operativamente con un polinucleótido que no está enlazado en la naturaleza o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia más grande . El término "proteína aislada" referido aquí, significa una proteína de ADNc, ARN recombinante o de origen sintético o alguna combinación de las mismas, que por virtud de su origen o fuente de derivación, la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas que se encuentran en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo libre de proteínas murinas, (3) se expresa por una célula de especies diferentes o (4) no ocurre en la naturaleza. El término "polipéptido" se emplea aquí como un término genérico para referirse a proteína nativa, fragmentos o análogos de una secuencia polipéptido. Por lo tanto, proteína nativa, fragmentos y análogos son especies del género polipéptido.
Polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana, así como moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera tales como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa o moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera lambda y viceversa así como sus fragmentos y análogos . El término "de origen natural" como se emplea aquí, aplicado a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que pueden aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se han modificado intencional ente por humanos en el laboratorio o de otra forma es de origen natural . El término "enlazado operativamente" como se emplea aquí, se refiere a posiciones de componentes así descritos, están en una relación que les permite funcionar en su forma pretendida. Una secuencia de control "enlazada operativamente" a una secuencia de codificación se liga de manera tal que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. El término "secuencia de control" como se emplea aquí, se refiere a secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias de codificación a las cuales se ligan. La naturaleza de estas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, estas secuencias de control en general incluyen promotor, sitio de enlace ribosomal y secuencia de terminación de transcripción; en eucariotas, en general dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de transcripción. El término "secuencias de control" se pretende que incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para expresión y procesamiento y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo secuencias líder y secuencias de socio de fusión. El término "polinucleótido" como se refiere aquí, significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o deoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótidos. El término incluye formas de hebra sencilla y doble de ADN. El término "oligonucleótido" referido aquí incluye nucleótidos de origen natural y modificados enlazados en conjunto por enlaces oligonucleótido de origen natural o de origen no natural . Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que generalmente comprende una longitud de 200 bases o menos. De preferencia los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud y más preferiblemente de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos usualmente son de hebra sencilla, por ejemplo para sondas; aunque oligonucleótidos pueden ser de doble hebra, por ejemplo para uso en la construcción de un mutante de gen. Oligonucleótidos de la invención ya pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido. El término "nucleótidos de origen natural" aquí referidos incluyen deoxiribonucleótidos y ribonucleótidos . El término "nucleótidos modificados" aquí referido incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y semejantes. El término "enlaces oligonucleótido" aquí referidos incluye enlaces oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y semejantes. Ver, LaPlanche et al. Nucí. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. iVucl . Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti -Cáncer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al.
Oligonucleotides and Analogues: A Practícal Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed. , Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al . en la Patente de los E.U.A. Número. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta para detección, si se desea. El término "variante" como se emplea aquí, es un polipéptido, polinucleótido o molécula que difiere del polipéptido o polinucleótido descrito, pero solo tal que la actividad de la proteína no se altere en forma nociva . Puede haber variantes de epítopos . Puede haber variantes de anticuerpos. En una ' modalidad preferida, la habilidad de una variante de proteína para ligar el epítopo no se altera en forma nociva. En una modalidad la variante de proteína puede ligar con 10 a 500 por ciento la habilidad del mAb de tipo silvestre. Por ejemplo, la variante de proteína puede ligar con 10 por ciento, 50 por ciento, 110 por ciento, 500 por ciento, o más que 500 por ciento la habilidad de mAb de tipo silvestre. En una modalidad, el intervalo de habilidades de enlace entre 10-500 por ciento se incluye. La habilidad de enlace puede ser reflejada en muchas formas, incluyendo, pero no limitadas a ka, k¿, o KD de la variante a un epítopo. En una modalidad preferida, el epítopo es aquél descrito en la presente especificación.
En una modalidad, anticuerpos variantes pueden diferir de la secuencia de tipo silvestre por sustitución, eliminación o adición de 5 aminoácidos o menos . Dichas variantes pueden en general ser identificadas al modificar una de las secuencias polipéptido descritas y evaluar las propiedades de enlace del polipéptido modificado, utilizando por ejemplo los procedimientos representativos descritos aguí . En otra modalidad, variantes polipéptido de preferencia exhiben cuando menos aproximadamente 70 por ciento, más preferible al menos aproximadamente 90 por ciento y en particular al menos aproximadamente 95 por ciento de identidad a los polipéptidos identificados. De preferencia, la variante solo difiere en sustituciones y/o modificaciones conservadoras. Proteínas variantes incluyen aquellas que son estructuralmente similares y aquellas que son funcionalmente equivalentes a las estructuras de proteína descritas en la presente especificación. En otra modalidad, la proteína es una variante si es funcionalmente equivalente a las proteínas descritas en esta especificación, siempre que el parátopo de la variante sea similar a los parátopos descritos en la especificación. En una modalidad, cualquier sustancia con una forma que sea similar al parátopo descrito en la Figura 17, es una variante. En una modalidad, cualquier sustancia con una forma que es similar al parátopo descrito en la Figura 18 es una variante. En una modalidad, cualquier sustancia que tiene una forma similar a la superficie de interacción descrita en la Figura 19A y 19B, es una variante. En una modalidad, el anticuerpo es una variante si la secuencia de ácido nucléico puede hibridizar en forma selectiva a secuencia de tipo silvestre bajo condiciones rigurosas. En una modalidad, condiciones moderadamente rigurosas convenientes incluyen prelavado en una solución de 5xSSC; 0.5 por ciento SDS, 1.0 m EDTA (pH 8.0); hibridizar a 50 grados C - 65 grados C, 5xSSC, durante la noche o en el caso de homología a través de especies a 45 grados C con 0.5xSSC; seguido por lavado dos veces a 65 grados C por 20 minutos con cada uno de 2x, 0.5x y 0.2xSSC que contiene 0.1 por ciento SDS . Dichas secuencias de ADN de hibridización están también dentro del alcance de esta invención al igual que secuencias nucleótido que, debido a degeneración de código, codifican un polipéptido anticuerpo que se codifica por una secuencia ADN de hibridización. El término "hibridizan selectivamente" referido aqui, significa ligar en forma detectable y específica. Polinucleótidos , oligonucleótidos y sus fragmentos de acuerdo con la invención hibridizan selectivamente hebras de ácido nucleico bajo condiciones de hibridización y lavado que reducen cantidades apreciables de enlace detectable con ácidos nucleicos no específicos. Condiciones de alto rigor pueden emplearse para lograr condiciones de hibridización selectiva como se conoce en la técnica y discute aquí. En general, la homología de secuencia de ácido nucléico entre los polinucleótidos, oligonucleó idos y fragmentos de la invención y una secuencia de ácido nucleico de interés será cuando menos 80 por ciento, y más típicamente con homologías preferiblemente crecientes de cuando menos 85 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 99 por ciento, y 100 por ciento. Dos secuencias de aminoácidos son homologas si hay una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85 por ciento de homología significa que 85 por ciento de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para máximo apareamiento. Espacios (en cualquiera de las dos secuencias que se aparean) se permiten para maximizar apareamiento: longitudes de espacio de 5 o menos se prefieren con 2 o menos que son más preferidas . En forma alterna y de preferencia, dos secuencias de proteína (o secuencias polipéptido derivadas de ellas de al menos 30 aminoácidos de longitud) son homologas como este término se emplea aquí, si tienen una calificación de alineamiento de cuando más 5 (en unidades de desviación estándar) utilizando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalidad de espacio de 6 o mayor. Ver Dayhoff, M.O. , en Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972) ) y el suplemento 2 a este volumen, pp. 1-10. Las dos secuencias o sus partes son más preferiblemente homologas si sus aminoácidos son mayores que o iguales a 50 por ciento idénticos cuando se alinean en forma óptima utilizando el programa ALIGN. El término "corresponde a" se emplea aquí para significar que una secuencia de polinucleotido es homologa (es decir es idéntica, no relacionada estrictamente en el sentido de evolución) a todo o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia o que una secuencia de polipéptidos es idéntica a una secuencia de polipéptidos de referencia. En distinción por contraste, el término "complementario a" se emplea aquí para significar que la secuencia complementaria es homologa a todo o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótido "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA" . Los siguientes términos se emplean para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias polinucleótido o aminoácido: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia" , "por ciento de identidad de secuencia" y "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida empleada como una base para comparación de secuencia; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo un segmento de ADNc de longitud íntegra o secuencia de genes dada en un listado de secuencia o puede comprender un ADNc completo o secuencia de genes . En general, una secuencia de referencia es de al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos de longitud, frecuentemente cuando menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de longitud y a menudo de al menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos de longitud. Ya que 2 secuencias polinucleótidos o aminoácidos puede cada una (1) comprender una secuencia (es decir una porción de la secuencia de aminoácidos o polinucleótidos completa) es similar entre las dos moléculas y (2) además puede comprender una secuencia que diverge entre las dos secuencias polinucleótidos o aminoácidos, comparaciones de secuencia entre dos (o más) moléculas típicamente se realizan al comparar secuencias de las dos moléculas sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similaridad de secuencia. Una "ventana" de comparación" como se emplea aquí, se refiere a un segmento conceptual de cuando menos 18 posiciones de nucleotido contiguas o 6 aminoácidos en donde una secuencia de polinucleotidos o secuencia de aminoácidos puede compararse a una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos contiguos o 6 secuencias de aminoácido en donde la porción de la secuencia de polinucleotidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones, eliminaciones, sustituciones y semejantes (es decir espacios) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para alineamiento óptimo de las dos secuencias . Alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol . 48:443 (1970), por el método de búsqueda por similaridad de Pearson y Lipman Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks, o los paquetes de programas MacVector) , o por inspección y se elige el mejor alineamiento (es decir que resulta en el porcentaje más alto de homología sobre la ventana de comparación) generado por los diversos métodos . El término "identidad de secuencia" significa que las dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos son idénticas (es decir en una base nucleótido-por-nucleótido o residuo-por-residuo) sobre la ventana de comparación. El término "por ciento de identidad de secuencia" se calcula al comparar dos secuencias alineadas en forma óptima sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo A, T, C, G, U, o I) o residuo ocurre en ambas secuencias para dar el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir el tamaño de ventana) y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. Los términos "identidad sustancial" como se emplea aquí denota una característica de una secuencia de polinucleótidos o de aminoácidos, en donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene cuando menos 85 por ciento de identidad de secuencia, de preferencia de cuando menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más usualmente cuando menos 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia frente a una ventana de comparación de al menos 18 posiciones nucleótido (6 aminoácidos) frecuentemente sobre una ventana de cuando menos las posiciones 24 a 48 nucleótidos (8 a 16 aminoácidos) en donde el por ciento de identidad de secuencia se calcula al comparar las secuencias de referencias con la secuencia que puede incluir eliminaciones o adiciones que totalizan 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande. Aminoácidos o ácidos nucleicos con identidad sustancial a la proteína o ácido nucleico de tipo silvestre son ejemplos de variantes de la proteína o ácido nucleico de tipo silvestre. Como se emplea aquí, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Ver Iwmunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds . , Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Estereoisómeros (por ejemplo D-amino ácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a-, a-disubstituidos , N-alquil amino ácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes convenientes para polipeptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, épsilon-N,N,N-trimetilisina, épsilon-N-acetilisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, sigma-N-metilarginina, y otros similares aminoácidos e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la notación polipéptido aqui empleada, la dirección a mano izquierda es la dirección aminoterminal y la dirección a mano derecha es la dirección carboxi terminal, de acuerdo con uso y convención estándar. Similarmente, a menos que se especifique de otra forma, el extremo a mano izquierda de las secuencias de polinucleotido de hebra sencilla es el extremo 5'; la dirección a mano izquierda de las secuencias de polinucleotido de doble hebra se refiere como la dirección 51. La dirección de adición 51 a 31 de transcripciones ARN nacientes se refiere como la dirección de transcripción; regiones de secuencia en la hebra ADN que tiene la misma secuencia que AR y que son 51 al extremo 5 ' de la transcripción ARN, se refieren como "secuencias corriente arriba"; regiones de secuencia en la hebra ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que son 31 respecto al extremo 3 ' de la transcripción ARN, se refieren como "secuencias corriente abajo".
Como se aplica a polipéptidos, el término "identidad substancial" significa que dos secuencias péptido, cuando se alinean en forma óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT utilizando pesos de espacio predefinidos, comparten cuando menos 80 por ciento de identidad de secuencia, de preferencia al menos 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferible al menos 95 por ciento de identidad de secuencia, y en particular cuando menos 99 por ciento de identidad de secuencia. De preferencia, posiciones de residuo que no son idénticas difieren por substituciones de amino ácido conservadoras. Substituciones de amino ácido conservadoras se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales hidroxil alifáticas es serina y treonina; un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales amidas es asparagina y glutamina; un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptofano; un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales que contiene azufre es cisteína y metionina. Grupos de substitución amino ácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tiroxina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamico-aspártico, y asparagina-glutamina . Polipéptidos con identidad substancial pueden ser variantes . Proteínas variantes también incluyen proteínas con variaciones menores. Como se discute aquí, variaciones menores en las secuencias amino ácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se contemplan abarcadas por la presente invención, siempre que las variaciones en la secuencia de amino ácidos mantengan cuando menos 75 por ciento, más preferible al menos 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, y más preferiblemente 99 por ciento. En particular, se contemplan reemplazos de amino ácido conservadores. Reemplazos conservadores son aquellos que se llevan a cabo dentro de una familia de amino ácidos relacionados en sus cadenas laterales . Amino ácidos genéticamente codificados en general se dividen en familias: (1) acídicos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) no-polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polares sin carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Familias preferidas son: serina y treonina y la familia hidroxi alifática; asparagina y glutamina son una familia que contiene amida; alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptofano, y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un amino ácido con un amino ácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto principal en el enlace o propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no involucra un amino ácido dentro del sitio de marco. Si un cambio amino ácido resulta en un péptido funcional puede determinarse fácilmente al ensayar la actividad especifica del derivado polipéptido. Se describen ensayos aquí en detalle. Fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden prepararse fácilmente por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Extremos amino y carboxi preferidos de fragmentos o análogos ocurren cerca de fronteras de dominios funcionales. Dominios estructurales y funcionales pueden identificarse por comparación de los datos de secuencia de nucleótidos y/o amino ácidos a bases de datos de secuencia de propiedad o pública. De preferencia, métodos de comparación computarizados se emplean para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteínas pronosticados que ocurren en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Métodos para identificar secuencias de proteínas que pliegan en una estructura tridimensional conocida se conocen. Bowie y colaboradores. Science 253:164 (1991). De esta manera, los ejemplos anteriores demuestran que aquellos con destreza en la técnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden emplearse para definir dominios estructurales y funcionales de acuerdo con los anticuerpos aquí descritos . Sustituciones de amino ácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reduce la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de enlace para formar complejos de proteínas, (4) alteran afinidad de enlace, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia diferente a la secuencia péptido de origen natural. Por ejemplo, substituciones de amino ácido sencillas o múltiples (de preferencia substituciones de amino ácido conservadoras) pueden realizarse en la secuencia de origen natural (de preferencia en la porción de polipeptido fuera del o de los dominios que forman contactos intermoleculares . Una substitución de amino ácidos conservadora no deberá cambiar substancialmente las características estructurales de la secuencia padre (por ejemplo un amino ácido de reemplazo no deberá tender a romper una hélice que ocurre en la secuencia padre, o interrumpir o romper otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia padre) . Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias polipéptido reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed. , W. H. Freeman y Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Bryen y J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); y Thornton y colaboradores Nature 354:105 (1991) . El término "fragmento polipéptido" como se emplea aquí, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino terminal y/o carboxi terminal, pero en donde la secuencia amino ácido restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, de una secuencia ADNc en longitud íntegra. Los fragmentos típicamente son de al menos 5, 6, 8 o 10 amino ácidos de largo, de preferencia al menos 14 amino ácidos de largo, más preferible cuando menos 20 amino ácidos de largo, usualmente cuando menos 50 amino ácidos de largo y aún más preferible cuando menos 70 amino ácidos de largo. El término "análogo" como se emplea aquí se refiere a polipéptidos que están constituidos por un segmento de al menos 25 amino ácidos que tiene, identidad substancial a una porción de una secuencia de amino ácidos deducida. Análogos típicamente son cuando menos de 20 amino ácidos de largo, de preferencia al menos 50 amino ácidos de largo o más largos, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido de origen natural de longitud íntegra. Tanto fragmentos como análogos son formas de variantes. Análogos péptido se emplean comúnmente en la industria farmacéutica como drogas no péptido con propiedades análogas a aquellas del péptido patrón o plantilla. Estos tipos de compuesto no péptido se denominan "péptido miméticos" o "peptidomiméticos" . Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans y colaboradores. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Estos compuestos a menudo se desarrollan con el auxilio de modelado molecular computarizado . Péptido miméticos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles, pueden emplearse para producir un efecto profiláctico o terapéutico equivalente. En general, los péptido miméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica) , tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces péptido reemplazados opcionalmente por un enlace seleccionado del grupo que consiste de: --C¾NH--, C¾S--, --CH2-CH2--, --CH=CH-- (cis y trans) , --COCH2--, --CH(0H)CH2--, y -CH2SO--, por métodos bien conocidos en la especialidad. Substitución sistemática de uno o más amino ácidos de una secuencia consenso con un D-amino ácido del mismo tipo (por ejemplo D-lisina en lugar de L-lisina) pueden emplearse para generar péptidos más estables. Además, péptidos restringidos comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso substancialmente idéntica pueden generarse por métodos conocidos en la especialidad (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)); por ejemplo, al agregar residuos cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclisan el péptido. Péptido miméticos y péptidomiméticos son ambas formas de variantes. "Anticuerpo" o "péptido (s) de anticuerpo" se refieren a un . anticuerpo intacto, o su fragmento de enlace que compite con el anticuerpo intacto para enlace específico. Fragmentos de enlace se producen por técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos . Fragmentos de enlace incluyen Fab, Fab ' , F(ab')2/ Fv, y anticuerpos de cadena sencilla. Un anticuerpo diferente a un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional " se entiende que tenga cada uno de sus sitos de enlace idénticos. Un anticuerpo substancialmente inhibe adhesión de un receptor a un contra receptor cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de receptor ligado al contra receptor en al menos aproximadamente 20 por ciento, 40 por ciento, 60 por ciento o 80 por ciento, y más usualmente mayor a aproximadamente 85 por ciento (como se mide en un ensayo de enlace competitivo in vitro) . El término "epítopo" incluye cualquier proteína determinante capaz de enlace específico con un receptor de célula T o inmunoglobulina o de otra forma que interactúa con una molécula. Determinantes epitópicos generalmente consisten de agrupamientos de moléculas tensio activos químicamente tales como amino ácidos o cadenas laterales carbohidrato o azúcar y en general tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específica. Un epítopo puede ser "lineal" o "conformacional . " En un epítopo lineal, todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula de interacción (tal como un anticuerpo) ocurren linealmente sobre la secuencia amino cido primaria de la proteina. En un epítopo conformacional , los puntos de interacción ocurren a través de residuos amino ácidos en la proteína que están separados entre si. Un anticuerpo se dice que liga específicamente un antígeno cuando la constante de disociación es < 1 µ?, de preferencia < 100 nM y más preferiblemente < 10 nM, y todavía más preferible < 1 nM. Una vez que un epítopo deseado en un antígeno se determina, es posible generar anticuerpos a ese epítopo, por ejemplo utilizando las técnicas descritas en la presente invención. En forma alterna, durante el proceso de descubrimiento, la generación y caracterización de anticuerpos pueden elucidar información respecto a epítopos convenientes . De esta información, luego es posible supervisar en forma competitiva anticuerpos para enlace al mismo epítopo. Un enfoque para lograr esto es conducir estudios de competencia cruzada para encontrar anticuerpos que ligan en forma competitiva entre sí, por ejemplo, los anticuerpos compiten para ligar al antígeno. Un proceso de alto rendimiento para "asignar" con base en su competencia cruzada, se describe en la solicitud de patente internacional No. WO 03/48731. Como se apreciará por una persona con destreza en la técnica, prácticamente todo a lo cual pueda ligarse específicamente un anticuerpo puede ser un epítopo. Un epítopo puede comprender aquellos residuos a los cuales se liga el anticuerpo. En una modalidad, el epítopo es el epítopo EGFRvIII. En una modalidad más preferida, el epítopo es aquel descrito en el Ejemplo 4 de esta especificación. En una modalidad, el epítopo es el epítopo descrito en el Ejemplo 14. En una modalidad, el epítopo comprende la secuencia LEEKKG YWTD (SEQ ID NO: 59) . En una modalidad, el epítopo comprende la secuencia EE KGYWT (SEQ ID NO: 57) . En una modalidad, el epítopo comprende la secuencia EKNY (SEQ ID NO: 60) . En una modalidad, el epítopo comprende la secuencia EEKGN (SEQ ID NO: 61) . Una persona con destreza en la técnica apreciará que estos no requieren ser de hecho ensamblados en este orden en un solo péptido, más bien estos son los residuos que forman el epítopo que interactúa con el parátopo. Como se apreciara por una persona con destreza en la técnica, el espacio ocupado por un residuo o cadena lateral que crea la forma de una molécula ayuda a determinar lo que es un epítopo. Igualmente, cualesquiera grupos funcionales asociados con el epítopo, interacciones de van der Waals, grado de movilidad de cadenas laterales, etc. Todos pueden determinar que es de hecho un epítopo. De esta manera un epítopo también puede incluir interacciones energéticas . El término "parátopo" se entiende que describa la estructura general de una región de enlace que determina enlace a un epítopo. Esta estructura influencia si o no y en que forma la región de enlace pueda ligar a un epítopo. Paratopo puede referirse a un sitio antigénico de un anticuerpo que es responsable por un anticuerpo o su fragmento, para ligar con un determinante antigénico. Paratopo también se refiere como al idiotipo del anticuerpo y la región que determina complementariedad (CDR) que liga al epítopo. En una modalidad, el parátopo es la región del anticuerpo que es Ll 10, L2 30, L3 50, Hl 20, H2 40, y H3 60 en FIG. 17. En una modalidad, el parátopo es la región del anticuerpo que comprende las secuencias CDR en el Ejemplo 16 para Ll, L2, L3 , Hl, H2 , y H3. En una modalidad, el parátopo es la región del anticuerpo que es Ll 110, L2 130, L3 150, Hl 120, H2 140, y H3 160 en la Figura 18. En una modalidad, el parátopo es la región del anticuerpo que comprende la secuencia CDR en el Ejemplo 18 para Ll, L2, L3, Hl, H2 , y H3. En una modalidad, el parátopo comprende las secuencias citadas en el Ejemplo 18. En una modalidad, el parátopo comprende los residuos que interactúan con el epítopo, como se muestra en FIG. 19A y FIG. 19B. La estructura negra sólida es la estructura péptido. En una modalidad, el parátopo comprende el residuo Tyr 172Arg de 13.1.2 mAb. En una modalidad, el parátopo de 13.1.2 mAb comprende cuando menos un residuo seleccionado del grupo que consiste de: Tyr 172Arg, ArglOlGlu, Leu99Asn, Leu99His, ArglOlAsp, Leu217Gln, Leu99Thr, Leu217Asn, ArglOlGln, y Asn35Gly. Como se apreciara por una persona con destreza en la técnica, el parátopo de cualquier anticuerpo o su variante, puede determinarse en la forma establecida por la presente solicitud. Se consideran residuos "importantes" si se pronostica que contribuyen con el 10 por ciento de la energía de enlace. En una modalidad, se consideran residuos "importantes" si se pronostica que contribuyen 2 por ciento de la energía de enlace. En una modalidad, se consideran residuos "importantes" si se pronostica que contribuye 50 por ciento de la energía de enlace. En una modalidad, se consideran residuos "importantes" si se pronostica que interactúan con la superficie del epítopo, o la superficie del parátopo. En una modalidad, se consideran residuos "importantes" si cambiar el residuo resulta en una pérdida de enlace. Los términos "específicamente" o "preferencialmente" se ligan a, o frases similares no se pretende que denoten que el anticuerpo ligue exclusivamente a este epítopo. Por el contrario, lo que se quiere dar a entender es que el anticuerpo o su variante puedan ligar a ese epítopo, en un grado superior que el anticuerpo liga a cuando menos otra sustancia a la cual se expone el anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo de enlace especifico ligará a la proteína EGFRvIII con una afinidad mayor que (más firme o ajustado o menor KE) será a la región EGFR. Por ejemplo, el anticuerpo de enlace especifico enlazará más firmemente por al menos un incremento mínimo a 1, 1-2, 2-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-50, 50-70, 70-90, 90-120, 120-150, 150-200, 200-300, 300-500, 500-1000 por ciento o más. La abreviatura de amino ácido, número, amino ácido, por ejemplo Leu217Gln, denota una mutación en el amino ácido numerado, desde el primer amino ácido, al segundo amino ácido. De esta manera, Tyrl72Arg significará que mientras que la proteína tipo silvestre tiene una tirosina en la posición 172, el mutante tiene arginina en la posición 172. El término "agente" se emplea aquí para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos. "Mamífero" cuando se emplea aquí se refiere a cualquier animal que se considera un mamífero. De preferencia, el mamífero es humano. Digestión de anticuerpos con la enzima, papaína, resulta en dos fragmentos de enlace antígeno idénticos, conocidos como fragmentos "Fab", y un fragmento "Fe", que no tiene actividad de enlace antigeno pero que tiene la habilidad para cristalizarse. La digestión de anticuerpos con la enzima, pepsina, resulta en el fragmento F(ab' )2 en donde los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen enlazados y comprenden dos sitios de enlace antígeno. El fragmento F(ab')2 tiene la capacidad para entrelazar el antígeno. "Fv" cuando se utiliza aquí se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que retiene tanto sitios de reconocimiento antígeno como sitios de enlace antígeno. Estos fragmentos también pueden considerarse variantes del anticuerpo. "Fab" cuando se utiliza aquí se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. El término "mAb" se refiere al anticuerpo monoclonal . La descripción de las secuencias del anticuerpo generadas por el método XenoMax se codifica como sigue: "AB"-se refiere a anticuerpo, "EGFRvIII " -se refiere a especificidad de enlace de anticuerpo, "X" se refiere a derivado de ratón XenoMouse, "Gl" se refiere a isotipo IgGl o "G2" se refiere al isotipo IgG2 , los últimos tres dígitos se refieren al número de células sencillas de las cuales se derivó el anticuerpo, por ejemplo: AB-EGFRvIII -XG1-095 será un anticuerpo con especificidad de enlace a EGFRvIII del ratón XenoMouse de un isotipo IgGl y número de célula 95. El término "SC" se refiere a una célula sencilla y un anticuerpo derivado del método XenoMax particular, puede referirse como un SC seguido por tres dígitos, o solo tres dígitos refiriéndose al número de células sencillas de las cuales se derivó el anticuerpo aquí . La descripción de secuencias de anticuerpo derivadas de hibridoma se codifica como sigue: "AB" se refiere a anticuerpo, "EGFRvIII" se refiere a la especificidad de enlace del anticuerpo, "X" se refiere a derivado de ratón XenoMouse, "Gl" se refiere al isotipo IgGl o "G2" se refiere a isotipo IgG2 , "K" se refiere a kappa, "L" se refiere a lambda. Los últimos tres dígitos se refieren al clon del cual el anticuerpo se derivó, por ejemplo: AB-EGFRvIII-XGlK-13.1.2 "Etiqueta" o "etiquetado" como se emplea aquí se refiere a la adición de una porción detectable a un polipéptido, por ejemplo una radioetiqueta, etiqueta fluorescente, etiqueta enzimática etiquetado quimioluminiscente o grupo biotinilo. Radioisótopos o radionúclidos pueden incluir 3H; 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, etiquetas fluorescentes pueden incluir rodamina, lantánido fósforos o FITC y etiquetas enzimáticas pueden incluir peroxidasas de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina. El término "agente o droga farmacéutica" como se emplea aqui se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente. Otros términos de química aquí se emplean de acuerdo con el uso convencional en la especialidad como se ejemplifica por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985) ) . Como se emplea aquí, "substancialmente puro" significa una especie de objeto que es la especie predominante presente (es decir que en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) , y de preferencia una fracción substancialmente purificada es una composición en donde la especie objeto comprende cuando menos aproximadamente 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En general, una composición substancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferible más de aproximadamente 85 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 99 por ciento, y 99.9 por ciento. Más preferible, la especie objeto se purifica a homogeneidad esencial (especies contaminantes no pueden detectarse en la composición por métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente de una sola. especie macromolecular . El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios . El término "Tecnología SLAIV ' se refiere al "Selected Lymphocyte Antibody Method (Método de Anticuerpo de linfocitos selecto) " (Babcook y colaboradores., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, ±93 : 7843-7848 (1996) , Schrader y de patente de los E.U.A No. 5,627,052. El término "XenoMax™" se refiere al uso de la Tecnología SLAM con ratones XenoMouse* (como se describe a continuación) . Estructura de Anticuerpo La unidad estructural de anticuerpo básica se conoce que comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipéptido, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más amino ácidos responsables primordialmente por reconocimiento de antígeno. La porción carboxi terminal de cada cadena define una región constante responsable primordialmente por función efectora. Cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon y define el isotipo de anticuerpo como IgM, IgD, ¾G, IgA, y IgE respectivamente. Dentro de cadenas ligeras y pesadas, las regiones variable y constante se unen con una región "J" de aproximadamente 12 o más amino ácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de aproximadamente 10 amino ácidos más. Ver en general Fundamental Inmunology Ch. 7 (Paul, W. , ed. , 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))). Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de enlace de anticuerpo. De esta manera, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de enlace. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos , los dos sitios de enlace son los mismos. Las cadenas todas exhiben la misma estructura general de regiones marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hiper variables, también denominadas regiones de determinación de complementariedad o CDRs . Las CDRs de las dos cadenas de cada par se alinean por las regiones marco permitiendo enlace a un epítopo específico. De N-terminal a C-terminal ambas cadenas ligeras y pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3 , CDR3 y FR . La asignación de amino ácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), or Chothia & Lesk J\ Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia y colaboradores. Nature 342 :878-883 (1989) . Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes y dos sitios de enlace diferentes. Anticuerpos biespeclficos pueden producirse por una variedad de métodos incluyendo fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab' . Ver por e emplo, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), ostelny y colaboradores. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992) . Producción de anticuerpos biespecífico puede ser un proceso relativamente intenso en mano de obra en comparación con producción de anticuerpos convencionales y rendimientos y grado de pureza en general son menores para anticuerpos biespecíficos . Anticuerpos biespecíficos no existen en la forma de fragmentos que tiene un sitio de enlace sencillo (por ejemplo Fab, Fab', y Fv) . Además de los aspectos estructurales generales de anticuerpos, la interacción más especifica entre el parátopo y el epitopo puede examinarse a través de enfogues estructurales. En una modalidad, la estructura de los CDRs forma un parátopo, a través del cual un anticuerpo es capaz de ligar a un epitopo. La estructura de este parátopo puede determinarse de una cantidad de formas . Enfoques de examen estructural tradicionales pueden emplearse, tales como RM o cristalografía de rayos-X. Estos enfoques pueden examinar la estructura del parátopo solo, o mientras que se liga al epitopo. En forma alterna, puede generarse modelos moleculares in silíco. Una estructura puede generarse a través de modelación de homología, ayudada con un paquete comercial, tal como el paquete de modelación InsightlI de (San Diego, CA) . Brevemente, se puede utilizar la secuencia del anticuerpo a examinarse para buscar contra una base de datos de proteínas de estructuras conocidas tales como Protein Data Bank. Después de que se identifican las proteínas homologas con estructuras conocidas, estas proteínas homologas se emplean como plantillas o patrones de modelación. Cada una de las plantillas posibles puede alinearse, produciendo de esta manera alineamientos de secuencia basados en estructura entre las plantillas. La secuencia del anticuerpo con la estructura desconocida luego puede alinearse con estas plantillas para generar un modelo molecular para el anticuerpo con la estructura desconocida. Como se apreciará por una persona con destreza en la técnica, hay-muchos métodos alternos para generar dichas estructuras in silico, todos los cuales pueden emplearse. Por ejemplo, un proceso similar al descrito por Hardman y colaboradores, en la patente de los E.U.A No. 5,958,708 que emplea QUANTA (Poligen Corp., Waltham, Mass.) y CHARM (Brooks, B. R. , Bruccoleri, R. E., Olafson, B. D., States, D. J. , Swaminathan, S. y Karplus, M., 1983, J. Comp. Chem, . 4:187) puede emplearse. No solo es importante la forma del parátopo para determinar si o que tan bien un parátopo posible ligará a un epxtopo, sino la propia interacción, entre el epítopo y el parátopo es una fuente de gran información en el diseño de anticuerpos variantes. Como se apreciará por la persona con destreza en la técnica, hay una variedad de formas en las que esta interacción puede estudiarse. Una forma es utilizar el modelo estructural generado, probablemente como se describió con anterioridad y luego utilizar un programa tal como InsightlI (Accelrys, San Diego, CA) , que tiene un módulo de exploración computacional de modos de enlace posibles, que entre otras cosas, es capaz de realizar una búsqueda Monte Cario en los espacios de conformación y de orientación entre el parátopo y su epítopo . El resultado es aquel que permita estimar donde y como el epítopo interactúa con el parátopo. En una modalidad, solo un fragmento o variante del epítopo se utiliza para ayudar en determinar las interacciones relevantes. En una modalidad, todo el epítopo se emplea en modelación de la interacción entre el parátopo y el epítopo. Como se apreciará por una persona con destreza en la técnica, estos dos enfoques diferenciales tienen diferentes ventajas y desventajas. Por ejemplo, utilizar solo un fragmento del epítopo permite un examen más detallado de las variaciones posibles de cada cadena lateral, sin consumir grandes cantidades de tiempo. Por otra parte, al utilizar solo un fragmento del epítopo, o simplemente el epítopo en lugar de toda la proteína, es posible que las características del fragmento epítopo puedan no ser las mismas que las características para todo el epítopo, de esta manera incrementando en forma posible el riesgo de desviarse durante el modelado computacional . En una modalidad, ambos enfoques se emplean en una medida limitada, a fin de verificar en forma cruzada los resultados. En una modalidad preferida, si se utiliza una variante de un epítopo, se optimizará de manera tal que la variante del epítopo comprende los residuos más importantes del epítopo. La identidad de los residuos más importantes puede determinarse en cualquier cantidad de formas, por ejemplo como se describe en los Ejemplos 4 y 14 de la presente especificación. A través del uso de estos estudios generados, es posible que se determine qué residuos son los más importantes en la interacción entre el epítopo y el parátopo. De esta manera, en una modalidad, se puede seleccionar fácilmente qué residuos cambiar a fin de alterar las características de enlace del anticuerpo. Por ejemplo, puede ser aparente de los modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles que las cadenas laterales de ciertos residuos en el parátopo puedan impedir estéricamente el enlace del epítopo, de esta manera alterando estos residuos a residuos con cadenas laterales más pequeñas puede ser benéfico. Se puede determinar esto en muchas formas. Por ejemplo, simplemente se puede ver a los dos modelos y estimar interacciones con base en grupos funcionales y proximidad. En forma alterna, se pueden realizar repetidos apareamientos de epítopo y parátopo, como se describe anteriormente a fin de obtener interacciones de energía más favorable. También se pueden determinar estas interacciones para una variedad de variantes del anticuerpo para determinar formas alternas en donde el anticuerpo puede ligar al epitopo. También se pueden combinar los diversos modelos para determinar como se deberá alterar la estructura y los anticuerpos para obtener un anticuerpo con las características particulares deseadas . Los modelos anteriormente determinados pueden probarse a través de diversas técnicas. Por ejemplo, la energía de interacción puede determinarse con los programas discutidos anteriormente a fin de determinar cual de las variaciones examinar adicionalmente . También, interacciones coulómbicas y de van der Waals se emplean para determinar las energías de interacción del epitopo y los parátopos variantes. También, mutagénesis dirigida por sitio se utiliza para ver si los cambios pronosticados en la estructura de anticuerpo de hecho resultan en los cambios deseados en las características de enlace. En forma alterna, pueden realizarse cambios al epitopo para verificar que los modelos son correctos o para determinar temas de enlace generales que pueden ocurrir entre el parátopo y el epitopo. Los métodos anteriores para modelar estructuras pueden emplearse para determinar que cambios en la estructura de proteínas resultaran en características deseadas particulares del anticuerpo.
Estos métodos pueden utilizarse para determinar que cambios en la estructura de proteínas no resultarán en las características deseadas. Como se apreciarán por una persona con destreza en la técnica, mientras que estos métodos proporcionan la guía necesaria para elaborar los anticuerpos y sus variantes de las presentes modalidades, aún puede ser conveniente al realizar prueba rutinaria de los modelos in silico, probablemente a través de estudios in vitro. Además, como será aparente para una persona con destreza en la técnica, cualquier modificación puede tener también efectos laterales adicionales en la actividad del anticuerpo. Por ejemplo, mientras que cualquier alteración pronosticada resulta en mayor enlace, pude inducir mayor enlace, también puede provocar otros cambios estructurales que puedan reducir o alterar la actividad del anticuerpo. La determinación de si o no este es el caso, y es rutina en la técnica y puede lograrse de muchas formas. Por ejemplo, la actividad puede aprobarse a través de una prueba ELISA, como en el Ejemplo 21. En forma alterna, las muestras pueden probarse a través del uso de un dispositivo de resonancia plasmón superficial . Enlace de Anticuerpos y Anticuerpos Variantes para Enlace Superior En una modalidad, los modelos anteriormente descritos se utilizan para incrementar la habilidad de enlace del anticuerpo a su epítopo. El anticuerpo puede ligar al epítopo más fácilmente y de esta manera tener una superior constante de asociación (ka) . En forma alterna, el anticuerpo puede disociarse del epítopo más lentamente y de esta manera tener una constante de disociación inferior (ka) , o la KD de la interacción epítopo-parátopo puede ser similar en valor, haciendo de esta manera la extensión del enlace entre el epítopo y parátopo, superior. En algunas modalidades, los anticuerpos ¦variantes se diseñan para ligar con las características opuestas. Esto es, los anticuerpos no ligan tan ajustados o probablemente tan rápidamente. En otras modalidades, los anticuerpos variantes no son diferentes en su KD de los anticuerpos tipo silvestre, pero los anticuerpos variantes son más específicos para un epítopo particular. Esto puede significar que los parátopos de los anticuerpos diseñados tienen un menor riesgo de ligar a otros epítopos . Los anticuerpos pueden tener otras características que se han alterado. Por ejemplo, una variante puede ser más inmune a enlace de anticuerpo no específico o puede permanecer solvatada en solución aún cuando el anticuerpo está presente en altas concentraciones. Dicha variante puede estar presente en los anticuerpos discutidos. Por ejemplo, mientras que superiores concentraciones de algunos anticuerpos variantes examinados a continuación resultaron en componentes de enlace más lentos en experimentos Biacore, por ejemplo mAb 13.1.2, ciertas variantes no exhiben este componente más lento, incluso a las mismas concentraciones L217N-2.1, por ejemplo. Las variantes pronosticadas por los modelos anteriormente determinados pueden crearse y luego probarse para determinar que actualmente ligan con las características deseadas . Mutantes con una energía de interacción total mayor con el epítopo pueden seleccionarse para mayores pruebas. La energía de interacción puede determinarse en una cantidad de formas, una de las cuales se describió anteriormente. Estas variantes pueden probarse en una cantidad de formas. Opciones ejemplares incluyen y no están limitadas a inExA (por ejemplo, Lackie, Patente de los E.U.A. otorgada No. 5,372,783, diciembre 13, 1994) (Sapidyne Instruments Inc., ID, Boise), resonancia de plasmón superficial (SPR) (por ejemplo, BIACORE™ Biacore, Inc., Pistcataway, N.J.) , fluorescencia de flujo detenido, espejo resonante y polarización de fluorescencia. Muchas de estas opciones son capaces no solo de registrar los datos sino también proporcionar fáciles medios para ajustar los datos a diversas curvas teóricas y de esta manera determinar ka, k¿, y KD, asi como otras propiedades. Es importante notar que el ajuste de estas curvas a los datos resultantes no carece de la posibilidad de cierta variación. Debido a esto, las relevantes constantes de asociación, disociación y equilibrio pueden buscarse, no solo a través de estos mecanismos de ajuste de curva, sino también en comparación directa entre sí, y a la luz del conocimiento de una persona con destreza en la técnica. Anticuerpos humanos y humanización de Anticuerpos Anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos que poseen regiones constantes y/o variables murina o de rata. La presencia de dichas proteínas derivadas de ratas o murinas puede llevar a la liberación rápida de los anticuerpos o puede llevar a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo por un paciente. A fin de evitar el empleo de anticuerpos derivados de rata o murinos, anticuerpos totalmente humanos pueden generarse a través de la introducción de la función de anticuerpo humano en un roedor, de manera tal que el roedor produce anticuerpos totalmente humanos . La capacidad por clonar y reconstruir sitios humanos de tamaño megabase en YACs e introducirlos en la linea germinal de ratón proporciona un enfoque poderoso para elucidar los componentes funcionales de sitios cartografiados crudamente o muy grandes así como generar modelos útiles de enfermedad humana. Además, el empleo de dicha tecnología para substitución de sitios o lugares de ratón con sus equivalentes humanos puede proporcionar profundas percepciones únicas en la expresión y regulación de productos de genes humanos durante desarrollo, su comunicación con otros sistemas y su participación en inducción y avance de enfermedad. Una aplicación práctica importante de dicha estrategia es la "humanización" del sistema inmune humoral de ratón. La introducción de sitios de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los que los genes Ig endógenos se han inactivado, ofrece la oportunidad por estudiar los mecanismos subyacentes a expresión programada y ensamblado de anticuerpos así como su papel en desarrollo de células B. Además, dicha estrategia puede proporcionar una fuente ideal para producción de anticuerpos monoclonales totalmente humanos (mAbs) -- un hito importante para satisfacer la promesa de terapia de anticuerpos para enfermedades de humanos. Anticuerpos totalmente humanos se espera que minimicen las respuestas inmunogénica y alérgica intrínsecas a mAbs de ratón o derivatizados de ratón y de esta manera incrementar la eficacia y seguridad de los anticuerpos administrados. El uso de anticuerpos totalmente humanos puede esperarse que proporcione una ventaja substancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación, autoinmunidad y cáncer, que requieren administraciones repetidas de anticuerpos . Un enfoque hacia esta meta era someter a ingeniería cepas de ratones deficientes en producción de anticuerpo de ratón con grandes fragmentos de sitios Ig humanos en anticipo a que esos ratones produjeran un gran repertorio de anticuerpos humanos en la ausencia de anticuerpo de ratón. Grandes fragmentos Ig de humanos preservarán la diversidad genética variable substancial así como la propia regulación de la producción y expresión de anticuerpos. Al explotar la maquinaria de ratón para diversificación y selección de anticuerpos y la carencia de tolerancia inmunológica para proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humano reproducidos en estas cepas de ratón deberá producir anticuerpos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés incluyendo antlgenos humanos. Utilizando la tecnología de hibridoma, mAbs de humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada pueden producirse y seleccionarse fácilmente . Esta estrategia general se demostró en conexión con nuestra generación de las primeras cepas de ratón XenoMouse, como se publicó en 1994. (Ver Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)). Las cepas XenoMouse fueron sometidas a ingeniería con cromosomas artificiales de levadura (YACs) que contienen fragmentos de configuración de línea germinal con tamaño de 245 kb y 190 kb- de sitios de cadena pesada humana y sitios de cadena ligera kappa, respectivamente que contienen secuencias de región constante y variable núcleo. Id. Ig humano que contiene YACs demostró ser compatible con el sistema de ratón tanto para re-arreglo como expresión de anticuerpos y fueron capaces de sustituir los genes Ig de ratón inactivados . Esto se demostró por su habilidad para inducir desarrollo de células B, para producir un repertorio humano tipo adulto de anticuerpos totalmente humanos y generar mAbs humanos específicos de antígeno. Estos resultados también sugieren que la introducción de grandes porciones de los sitios Ig de humano que contienen mayores números de genes V, adicionales elementos regulatorios y regiones constantes Ig humanas pueden recapitular substancialmente todo el repertorio que es característico de la respuesta humana humoral a la infección e inmunización. El trabajo de Green et al . recientemente se extendió a la introducción de más de aproximadamente 80 por ciento del repertorio de anticuerpos humanos a través de introducción de fragmentos YAC con configuración de linea germinal con tamaño de mega base, de los sitios de cadena pesada humana y sitios de cadena ligera kappa, respectivamente. Ver Méndez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) y la solicitud de patente de los E.U.A. No. de serie 08/759,620, presentada en diciembre 3, 1996. La producción de ratones XenoMouse se discute adicionalmente y delinea en las solicitudes de patentes de los E.U.A. No. de serie 07/466,008, presentada en enero 12, 1990, No. de serie 07/610,515, presentada en noviembre 8, 1990, No. de serie 07/919,297, presentada en julio 24, 1992, No. de serie 07/922,649, presentada en julio 30, 1992, presentada 08/031,801, presentada en marzo 15,1993, No. de serie 08/112,848, presentada en agosto 27, 1993, No. de serie 08/234,145, presentada en abril 28, 1994, No. de serie 08/376,279, presentada en enero 20, 1995, No. de serie 08/430, 938, abril 27, 1995, 08/464,584, presentada en junio 5, 1995, 08/464,582, presentada en junio 5, 1995, No. de serie 08/463,191, presentada en junio 5, 1995, No. de serie 08/462,837, presentada en junio 5, 1995, No. de serie 08/486,853, presentada en junio 5, 1995, No. de serie 08/486,857, presentada en junio 5, 1995, No. de serie 08/486,859, presentada en junio 5, 1995, No. de serie 08/462,513, presentada en junio 5, 1995, No. de serie 08/724,752, presentada en octubre 2, 1996, y No. de serie 08/759,620, presentada en diciembre 3, 1996 y patentes de los E.U.A. Nos. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, y 5,939,598 y las patentes japonesas Nos. 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, y 3 068 507 B2. Ver también Méndez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J". Exp. Med. 188:483-495 (1998). Ver también la patente europea No. EP 0 463 151 Bl, publicación otorgada en junio 12, 1996, la solicitud de patente internacional No. WO 94/02602, publicada en febrero 3, 1994, la solicitud de patente internacional No. WO 96/34096, publicada en octubre 31, 1996, WO 98/24893, publicada en junio 11, 1998, WO 00/76310, publicada en diciembre 21, 2000, WO 03/47336. En un enfoque alterno, otros incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque "minisitio" . En el enfoque minisitio un sitio Ig exógeno se imita a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del sitio Ig. De esta manera, uno o más genes de VH de uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante y una segunda región constante (de preferencia una región constante gamma) se forman en una construcción para insertar en un animal . Este enfoque se describe en la patente de los E.U.A. No. 5,545,807 otorgada a Surani et al . y en las patentes de los E.U.A. Nos. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, y 6,255,458 cada una otorgada a Lonberg y Kay, las patentes de los E.U.A. Nos. 5,591,669 y 6,023.010 otorgadas a Krimpenfort y Berns, en las patentes de los E.U.A. NOS. 5,612,205, 5,721,367, y 5,789,215 otorgadas a Berns et al., y la patente de los E.U.A. No. 5,643,763 otorgada a Choi y Dunn, y las solicitudes de patente de los E.U.A. de GenPharm No. de Serie 07/574,748, presentada en agosto 29, 1990, No. de serie 07/575,962, presentada en agosto 31, 1990, No. de serie 07/810,279, presentada en diciembre 17, 1991, No. de serie 07/853,408, presentada en marzo 18, 1992, No. de serie 07/904,068, presentada en junio 23, 1992, No. de serie 07/990,860, presentada en diciembre 16, 1992, 08/053,131, presentada en abril 26, 1993, No. de serie 08/096,762, presentada en julio 22, 1993, No. de serie 08/155,301, presentada en noviembre 18, 1993, No. de serie 08/161,739, presentada en diciembre 3, 1993, No. de serie 08/165,699, presentada en diciembre 10, 1993, No. de serie 08/209,741, presentada en marzo 9, 1994. Ver también la patente europea No. 0 546 073 Bl, las solicitudes de patentes internacionales Nos. O 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, O 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884 y la patente de los E.U.A. No. 5,981,175. Ver además Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), y Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996). irin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos de ratones en los que a través de fusión de microcélulas, grandes piezas de cromosomas, o cromosomas complejos se han introducido. Ver las solicitudes de patente europeas Nos. 773 288 y 843 961. Xenerex Biosciences está desarrollando una tecnología para la generación potencial de anticuerpos humanos. En esta tecnología, ratones SCID se reconstituyen con células linfáticas humanas, por ejemplo células B y/o células T. Los ratones luego se inmunizan con un antígeno y pueden generar una respuesta inmune contra el antígeno. Ver las patentes de los E.U.A. Nos. 5,476,996, 5,698,767, y 5,958,765. Respuestas anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) han llevado a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o de otra forma humanizados. Mientras que los anticuerpos quiméricos tienen una región constante humana y una región variable murina, se espera que ciertas respuestas anticuerpo anti-quiméricas humanas (HACA) se observarán, particularmente en utilizaciones crónicas o de múltiples dosis del anticuerpo. De esta manera, sería conveniente el proporcionar anticuerpo totalmente humanos contra EGFRvIII a fin de viciar consideraciones y/o efectos de respuesta ???? o HACA. Terapéuticas de Anticuerpo Como se discute aquí, la función del anticuerpo EGFRvIII parece importante cuando menos a una porción de su modo de operación. Por función, se entiende a manera de ejemplo, que la actividad del anticuerpo EGFRvIII en operación con EGFRvIII. De acuerdo con esto en ciertos aspectos, puede ser conveniente en conexión con la generación de anticuerpos, como candidatos terapéuticos contra EGFRvIII que los anticuerpos sean capaces de fijar complemento y reclutar linfocitos citotóxicos que participan de esta manera en CDC y ADCC. Hay una cantidad de isotipos de anticuerpos que son capaces de lo mismo, incluyendo sin limitación lo siguiente: IgM murino, IgG2a murino, IgG2b murino, IgG3 muri o, IgM humano, IgGl humano, IgG3 humano, y IgA humano. También puede ser conveniente en conexión con la generación de anticuerpos como candidatos terapéuticos contra EGFRvIII, que los anticuerpos sean capaces de activar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) , a través de acoplamiento de receptores Fe en células efectoras tales como células de exterminio (N ) . Hay una cantidad de isotipos de anticuerpos que son capaces de ADCC, incluyendo sin limitación los siguientes: IgG2a murino, IgG2b murino, IgG3 murino, IgGl humano, y IgG3 humano. Se apreciará que anticuerpos que se generan no requieren poseer inicialmente dicho isotipo sino más bien del anticuerpo como se genera puede poseer cualquier isotipo y el anticuerpo puede ser conmutado de isotipo posteriormente utilizando técnicas convencionales que son bien conocidas en la especialidad. Dichas técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 4, 816,397) y técnicas de fusión célula-célula (ver por ejemplo, las patentes de los E.U.A. Nos. 5, 916,771 y 6, 207,418), entre otras. En la técnica de fusión célula-célula, un mieloma u otra línea celular se prepara que posee una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y otro mieloma u otra línea celular se prepara que posea la cadena ligera. Dichas células posteriormente pueden fusionarse y una línea celular que expresa un anticuerpo intacto puede aislarse. A manera de ejemplo, ciertos anticuerpos anti-EGFRvIII aquí discutidos son anticuerpos IgGl anti-EGFRvIII humano. Si dicho anticuerpo posee el enlace deseado con la molécula EGFRvIII, puede ser fácilmente conmutado de isotipo para generar un IgM humano, IgG3 humano, o IgGA humano mientras que aún posee la misma región variable (que define la especificidad de anticuerpo y algo de su afinidad) . Estas moléculas, incluyendo IgGl, luego serían capaces de fijar complemento y participar en CDC, y si comprenden una región IgGl o IgG3 constante, dichas moléculas también serán capaces de participar en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) a través de reclutar linfocitos citotóxicos . De acuerdo con esto, conforme se generan candidatos de anticuerpo que satisfacen atributos "estructurales" deseados como se discutió anteriormente, en general puede proporcionarse con al menos ciertos de los atributos "funcionales" deseados a través de conmutación de isotipo. Diseño y Generación de Otros Terapéuticos Con base en la actividad de los anticuerpos que se producen y caracterizan aqui respecto a EGFRvIII, el diseño de otras modalidades terapéuticas más allá de porciones de anticuerpo se facilita. Dichas modalidades incluyen, sin limitación, terapéuticos de anticuerpo avanzados, tales como anticuerpos biespecíficos, inmunotoxinas , y terapéuticos radioetiquetados, generación de terapéuticos de péptido, terapias de genes, particularmente intra-anticuerpos , terapéuticos antisentido y moléculas pequeñas. En conexión con la generación de terapéuticos de anticuerpo avanzados, en donde la fijación de complemento y reclutamiento de linfocitos citotóxicos es un atributo conveniente, es posible mejorar el exterminio celular a través del uso de biespecificos , inmunotoxinas, o radioetiquetas , por ej emplo . Por ejemplo, en conexión con anticuerpos biespecificos, pueden generarse anticuerpos biespecxficos que comprenden (i) dos anticuerpos uno con una especificidad EGFRvIII y otro con una segunda molécula que se conjugan en conjunto, (ii) un solo anticuerpo que tiene una cadena específica a EGFRvIII y una segunda cadena específica a una segunda molécula o (iii) un anticuerpo de una sola cadena que tiene especificidad a EGFRvIII y la otra molécula. Estos anticuerpos biespecificos pueden generarse utilizando técnicas que son bien conocidas por ejemplo en conexión con (i) y (ii) ver por ejemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) y Wright y Harris, supra. y en conexión con (iii) ver por ejemplo, Traunecker et al. Int. J. Cáncer (Suppl.) 7:51-52 (1992) . En cada caso, la segunda especificidad puede hacerse a los receptores de activación de cadena Fe incluyendo sin limitación CD16 o CD64 (ver por ejemplo, Deo et al. 18:127 (1997)) CD3 (Micromet de BiTE technology) o CD89 (ver por ejemplo, Valerius et al. Blood 90:4485-4492 (1997)). Anticuerpos biespecificos preparados de acuerdo con lo anterior probablemente exterminarán células que expresan EGFRvIII, y particularmente aquellas células en donde los anticuerpos EGFRvIII de la invención son efectivos. En conexión con inmunotoxinas , pueden modificarse anticuerpos para actuar como inmunotoxinas utilizando técnicas que son bien conocidas en la especialidad. Ver por ejemplo Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Ver también la patente de los E.U.A. No. 5, 194,594. En conexión con la preparación de anticuerpos radioetiquetados , dichos anticuerpos modificados también pueden prepararse fácilmente utilizando técnicas que son bien conocidas en la especialidad. Ver por ejemplo Junghans et al. en Cáncer Chemotherapy y Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Ver también las patentes de los E.U.A. Nos. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471, y 5,697,902. Cada una de las inmunotoxinas y moléculas radioetiquetadas probablemente exterminará células que expresan EGF vIII, y particularmente aquellas células en donde los anticuerpos aquí descritos son efectivos . Los anticuerpos pueden diseñarse para ligar más rápidamente, o para disociar más lentamente del epítope, y de esta manera los propios anticuerpos pueden ser terapéuticos diseñados. Las características alteradas de los anticuerpos pueden utilizarse por ejemplo en la administración de un terapéutico para un paciente. Inmunoconjugados Terapéuticos Como se apreciará, anticuerpos conjugados a drogas, toxinas u otras moléculas (inmunoconjugados o inmunotoxinas) son altamente útiles en el exterminio dirigido de células que expresan una molécula que puede ligar específicamente por una molécula de enlace específica, tal como un anticuerpo. Como se discutió anteriormente, EGFRvIII no se conoce que sea expresada en ninguno de los tejidos normales. Además, EGFRvIII muestra expresión significante en numerosos tumores humanos. De acuerdo con esto, EGFRvIII es una molécula altamente atractiva para ser blanco con una inmunotoxina . Muchos reportes han aparecido en el blanco específico indentado de células de tumor con conjugados de droga-anticuerpo monoclonal (Sela et al. en Immunoconjugates 189-216 (C. Vogel, ed. 1987) ; Ghose et al, en Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg, ed. 1983); Diener et al, en Antibody Mediated Delivery Systems 1-23 (J. Rodwell, ed. 1988); Pietersz et al, en Antibody Mediated Delivery Systems 25-53 (J. Rodwell, ed. 1988) ; Bumol et al, en Antibody Mediated Delivery Systems 55-79 (J. Rodwell, ed. 1988) . Drogas citotóxicas tales como metotrexato, daunorubicina, doxorubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C, y clorambucil , se han conjugado con una variedad de anticuerpos monoclonales murino. En algunos casos, las moléculas de drogas se enlazaron a las moléculas de anticuerpo a través de una molécula portadora intermediaria tal como albúmina de suero (Garnett et al. Cáncer Res. 46:2407-2412 (1986); Ohkawa et al. Cáncer Immumol . Immunother. 23:81-86 (1986); Endo et al. C ncer Res. 47:1076-1080 (1980)), dextran (Hurwitz et al. Appl . Biochem. 2:25-35 (1980); Manabi et al. Biochem. Pharmacol . 34:289-291 (1985); Dillman et al. Cáncer Res. 46:4886-4891 (1986); Shoval et al. Proc . Nati. Acad. Sci. 85: 8276-8280 (1988))/ o ácido poliglutámico (Tsukada et al. J. Nati. Canc. Inst. 73:721-729 (1984); Kato et al. J. Med. Chem. 27:1602-1607 (1984); Tsukada et al. Br. J. Cáncer 52:111-116 (1985) ) . Un amplio conjunto de tecnologías de enlazador se ha empleado para la preparación de dichos inmunoconjugados y se han investigado tanto enlazadores escindibles como no escindibles . En la mayoría de los casos, el potencial citotóxico completo de las drogas solo puede observarse sin embargo si las moléculas de droga pueden librarse de los conjugados en forma no modificada en el sitio de diana u objetivo. Uno de los enlazadores escindibles que se ha empleado para la preparación de conjugados de anticuerpo-droga es un enlazador ácido lábil con base en ácido cis-aconítico que aprovecha el ambiente acídico de diferentes compartimentos intramoleculares tales como los endosomas que se encuentran durante endocitosis mediada por receptor y los lisosomas. Shen y Ryser introdujeron este método para la preparación de conjugados de daunorubicina con portador macromoleculares (Biochem. Biophys. Res. Commun. 102:1048-1054 (1981)). Yang y Reisfeld emplearon la misma técnica para conjugar daunorubicina a un anticuerpo anti-melanoma (J. Nati. Canc. Inst. 80:1154-1159 (1988)). Recientemente, Dillman et al . también emplearon un enlazador ácido lábil en forma similar para preparar conjugados de daunorubicina con un anticuerpo anti-célula T (Cáncer Res. 48:6097-6102 (1988) ) . Un enfoque alterno, explorado por Trouet et al . involucra enlazar daunorubicina a un anticuerpo mediante un brazo espaciador péptido (Proc. Nati. Acad. Sci. 79:626-629 (1982)). Esto se realizó bajo la premisa de que la droga libre pudo liberarse de dicho conjugado por la acción de peptidasas lisosomales. Pruebas de citotoxicidad in vitro, sin embargo han revelado que conjugados anticuerpo-droga raramente logran la misma potencia citotóxica que las drogas no conjugadas libres. Esto sugiere que mecanismos por los cuales las moléculas de droga se liberan de los anticuerpos son muy ineficientes . En el área de inmunotoxinas , conjugados formados mediante puentes disulfuro entre anticuerpos monoclonales y toxinas de proteína activa catalíticamente se mostró que son más citotóxicos que los conjugados que contienen otros enlazadores . Ver, Lambert et al. J. Biol . Chem. 260:12035-12041 (1985); Lambert et al. en Immunotoxins 175-209 (A. Frankel, ed. 1988); Ghetie et al. Cáncer Res. 48:2610-2617 (1988). Esto se atribuyó a la alta concentración intracelular de glutationa que contribuye a la escisión efectiva del enlace disulfuro entre una molécula de anticuerpo y una toxina. A pesar de esto, hay solo unos cuantos ejemplos reportados del uso de puentes disulfuro para la preparación de conjugados entre drogas y macromoléculas . Shen et al. describe la conversión de metotrexato en un derivado mercaptoetilamida seguido por conjugación con poli-D-lisina mediante un enlace disulfuro (J. Biol. Chem. 260:10905-10908 (1985)). Además, un reporte describe la preparación de un conjugado de la droga tóxica que contiene trisulfuro de calicheamicina con un anticuerpo (Menendez et al. Fourth International Conference on Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cáncer, San Diego, Abstract 81 (1989) ) . Otro reporte describe la preparación de un conjugado de la droga tóxica que contiene trisulfuro de calicheamicina con un anticuerpo (Hinman et al, 53 Cáncer Res. 3336-3342 (1993)). Una razón para la falta de conjugados de droga-anticuerpo enlazados con disulfuro es la no disponibilidad de drogas citotóxicas que contienen una porción que contiene átomo de azufre que pueda ser empleada fácilmente para ligar la droga a un anticuerpo mediante un puente disulfuro. Además, modificación química de drogas existentes es difícil sin disminuir su potencial citotóxico. Otra desventaja principal con los conjugados de droga-anticuerpo existentes es su incapacidad para suministrar una concentración suficiente de droga al sitio objetivo debido al número limitado de antígenos dirigidos y la citotoxicidad relativamente moderada de drogas cancerostáticas como metotrexato, daunorubicina y vincristina. A fin de lograr citotoxicidad significante, el enlace con una gran cantidad de moléculas de droga ya sea directamente al anticuerpo o a través de una molécula portadora polimérica, se vuelve necesario. Sin embargo, dichos anticuerpos fuertemente modificados a menudo exhiben enlace deteriorado al antígeno objetivo y rápida liberación in vivo de la corriente sanguínea. Los maytansinoides son drogas altamente citotóxicas. La Maytansina primero se aisló por Kupchan et al . del arbusto de Af ica Oriental Maitenus serrata y mostró que es 100 a 1000 veces más citotóxico que los agentes quimioterapeuticos de cáncer convencionales como metotrexato, daunorubicina, y vincristina (patente de los E.U.A. No. 3,896,111). Subsecuentemente, se descubrió que algunos microbios también producen maytansinoides, tales como maytansinol y C-3 esteres de maytansinol (patente de los E.U.A. No. 4, 151,042). Esteres C-3 sintéticos de maytansinol y análogos de maytansinol también se han reportado (Kupchan et al. J. Med. Chem. 21:31-37 (1978); Higashide et al. Nature 270:721-722 (1977); Kawai et al. Chem. Pharm. Bull. 32:3441-3451 (1984) ) . Ejemplos de análogos de maytansinol de los cuales los C-3 ésteres se han preparado incluyen maytansinol con modificaciones en el anillo aromático (por ejemplo decloro) o en C-9, C-14 (por ejemplo grupo metil hidroxilado) , C-15, C-18, C-20 y C-4,5. Los C-3 ésteres de origen natural y sintético pueden ser clasificados en dos grupos : (a) C-3 ésteres con ácidos carboxílicos simples (patente de los E.U.A. No. 4,248,870; 4,265,814; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,317,821; 4,322,348; y 4,331,598) , y (b) C-3 ésteres con derivados de M-metil-L-alanina (patente de los E.U.A. Nos. 4,137,230; 4,260,608; 5,208,020; y Chem. Pharm. Bull . 12:3441 (1984)). Ésteres del grupo (b) se encontraron mucho más citotóxicos que ésteres del grupo (a) . La maytansina es un inhibidor mitótico. Tratamiento de células L1210 in vivo con maytansina se ha reportado que resulta en 67 por ciento de las células que se acumulan en mitosis. Células de control no tratadas se reportaron que demuestran un índice mitótico en el intervalo de entre 3.2 a 5.8 por ciento (Sieber et al. 43 Comparative Leukemia Research 1975, Bibl . Haemat . 495-500 (1976) ) . Experimentos con huevos de erizo de mar y huevos de almeja a sugerido que la maytansina inhibe mitosis al interferir con la formación de microtúbulos a través de la inhibición de la polimerización de la proteína en microtúbulo, tubulina (Remillard et al. Science 189:1002-1005 (1975) ) . In vitro, Suspensiones de células de leucemia murina, P388, L1210, y LY5178 se ha encontrado que se inhiben por maytansina a dosis de 10"3 a 10"1 .mu.g/.mu.l con la línea P388 que es la más sensible. La maytansina también se ha mostrado que es un inhibidor activo de crecimiento in vitro de células de carcinoma nasofaríngeo humano, y la línea de leucemia linfoblástica aguda humana CEM se reporta inhibida por concentraciones tan bajas como 10-7 mg/ml (Wolpert-DeFillippes et al. Biochem. Pharmacol . 24:1735-1738 (1975)). In vivo, también se ha mostrado que la maytansina se activa. El crecimiento de tumor en el sistema de leucemia linfocítica P388 se mostró inhibido sobre un intervalo de dosis de 50- a 100- veces que sugiere un alto índice terapéutico; también significante actividad inhibitoria puede demostrarse con el sistema de leucemia de ratón L1210, el sistema de carcinoma de pulmón Lewis de humano y el sistema de melanocarcinoma B-16 humano ( upchan, Ped. Proc . 33:2288-2295 (1974)). Métodos actuales de conjugación de maytansinoides con agentes que ligan células (tales como anticuerpos) involucran dos etapas de reacción. Un agente que liga célula por ejemplo a un anticuerpo primero se modifica con un reactivo de entrelazamiento tal como N-succinimidil piridilditiopropionato (SPDP) para introducir grupos ditiopiridilo en el anticuerpo (Carlsson et al. Biochem. J. 173:723-737 (1978); patente de los E.U.A. No. 5, 208,020). En una segunda etapa, un maytansinoide reactivo que tiene un grupo tiol, tal como DM1 (formalmente denominado N2' -deacetil-N2' - (3-mercapto-l-oxopropil) -maytansina, como el reactivo de partida, se agrega al anticuerpo modificado, resultando en el desplazamiento de los grupos tiopiridilo en los anticuerpos modificados, la producción de conjugados de anticuerpo/maytansinoide citotóxicos enlazados con disulfuro (patente de los E.U.A. No. 5,208,020). Un proceso de una etapa para conjugar maytansinoides se describe en la patente de los E.U.A. No. 6,441,163. Tecnología de inmunotoxina basada en maytansinoide está disponible de Immunogen Corporation (Cambridge, MA) . Otra tecnología de toxinas importantes se basa en las toxinas de auristatina. Las auristatinas se derivan de Dolastatina 10, que se obtiene del huevo de pulpo Dolabella del Océano índico, como una sustancia inhibitoria potente del crecimiento de células. Ver las patentes de los E.U.A. Nos. 4,816,444 y 4,978,744. Respecto a otras Dolastatinas, ver también las patentes de los E.U.A. Nos. 4,414,205 (Dolastatinas-1 , 2, y 3) , 5,076,973 (Dolastatina-3) , 4,486,414 (Dolastatinas-A y B) , ; 4,986,988 (Dolastatina-13 ) , 5,138,036 (Dolastatina-14), y 4,879,278 (Dolastatina-15) . Aisladas y sintetizadas por el Dr. Pettit y colegas en la University of Arizona, una variedad de derivados de auristatina se ha probado y mostrado que son altamente tóxicos para las células. Ver Pettit et al. Antineoplastic agents 337. Synthesis of dolastatin 10 structural modifications . Anticancer Drug Des. 10(7):529-44 (1995), Woyke et al. In vitro activities y postantifungal effects of the potent dolastatin 10 structural modification auristatin PHE. Antimicrobial Agents y Chemotherapy. 45:3580-3584 (2001), Pettit et al. Specific activities of dolastatin 10 y peptide derivatives against Cryptococcus neoformans . Antimicrobial Agents y Chemotherapy. 42:2961-2965 (1998), WoykeThree-dimensional visualization of microtubules during the Cryptococcus neoformans cell cycle y the effects of auristatin PHE on microtubule integrity y nuclear localization. Submitted, Antimicrobial Agents y Chemotherapy. Recientemente, derivados de auristatina adicionales se han desarrollado que parecen bastante efectivos cuando se suministran como cargas útiles en anticuerpos. Por ejemplo, monometil auristatina E (MMAE) se ha mostrado como una toxina potente para células de tumor cuando se conjuga con anticuerpos específicos de tumor. Doronina et al. Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cáncer therapy. Nature Biotechnology. (2003) (disponible en línea) , Francisco et al. cAClO-vcMMAE, an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjúgate with potent y selective antitumor activity. Blood. (2003) mayo 8 [Epub antes de impresión] . Epub 2003 abril 24 (disponible en línea) . Además de la toxicidad de la molécula de auristatina, la investigación ha mostrado que conjugados enlazados péptido son aceptables, y de esta manera más específicos y menos tóxicos a tejidos normales que otras tecnologías de enlazador en amortiguadores y plasma. Doronina et al. Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cáncer therapy. Nature Biotechnology. (2003) (disponible en línea), Francisco et al. cAClO-vcMMAE, an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjúgate with potent y selective antitumor activity. Blood. (2003) mayo 8 [Epub antes de impresión] . Epub 2003 abril 24 (disponible en línea) . Esos enlazadores se basan en un diseño de péptido ramificado e incluyen por ejemplo conjugados mAb-valina-citrulina-MMAE y mAb-fenilalanina-lisina- MAE . Doronina et al. Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cáncer therapy. Nature Biotechnology. (2003) (disponible en línea) , Francisco et al. cAClO-vcMMAE, an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjúgate with potent y selective antitumor activity. Blood. (2003) May 8 [Epub antes de impresión] . Epub 2003 Apr 24 (available online) . Estos diseños y técnicas de conjugación se describen por ejemplo por King et al. Monoclonal antibody conjugates of doxorubicin prepared with branched peptide linkers: inhibition of aggregation by methoxytriethyleneglycol chains. J Med Chem. 45 (19) :4336-43 (2002) y Dubowchik et al. Gathepsin B-sensitive dipeptide prodrugs . 2. Models of anticancer drugs paclitaxel (Taxol) , mitomycin C y doxorubicin. Bioorg Med Chem Lett . 8 (23) : 3347-52 (1998). Tecnología de inmunotoxina de Auristatina E basada en lo anterior está disponible de Seattle Genetics Corporation (Seattle, A) . Hay una gran cantidad de compuestos que afectan microtúbulos novedosos obtenidos de extractos de fuentes naturales, y análogos semisintéticos y sintéticos que parecen poseer potencial como toxinas para la generación de inmunocon ugado . (Ver el sitio de la red en newmedinc "punto" com) . Estas moléculas y ejemplos de productos de droga que los utilizan, incluyen lo siguiente: Aglutinantes de sitio de Colchicina (Curacin) , Combretastatína (AVE806, prodroga Combretastatina A-4 (CA4P) , Oxi-4503) , Criptoficina (LY355703) , Discodermolida, Dolastatina y Análogos (Auristatina PHE, Dolastatina 10, ILX-651, Simplostatina 1, TZT-1027) , Epotilonas (BMS-247550, BMS-310705, EPO906, KOS-862, ZK-EPO) , Eleuterobin, FR182877, Halocondrina B (E7389) , Halimida (NPI-2352 y NPI-2358) , Hemiasterlinas (HTI-286) , Laulimalida, Maytansinoides ("DM1") (Bivatuzumab mertansina, Cantuzumab mertansina, huN901-DMl/BB-10901TAP, MLN591DM1, My9-6-DMl, Trastuzumab-DMl) , PC-SPES, Pelorusida A, Resveratrol, S-allilmercaptocisteína (SAMC) , Espongistatinas, Vitilevuamida, Motor Molecular Quinecina (SB-715992) , Aglutinantes de Sitio Colchicina diseñados (A-289099, A-293620/A-318315, ABT-751/E7010 , D-24851/D-64131 , ZD6126) , Otros Venenos de Evónimo Novedosos (2-Metoxiestradiol (2-ME2) , Benzimidasol Carbamatos (serie ANG 600, Mebendazol), CP248/CP461, HM -214, R440, SDX-103, TS7/T607) . Además, toxinas derivadas marinas adicionales se realizan por Mayer, A.M.S. Marine P armacology in 1998: Antitumor and Cytotoxic Compounds . The Pharmacologist . 41 (4) : 159-164 (1999). Administración y Formulaciones Terapéuticas Una duración de acción prolongada permitirá programas de dosificación menos frecuentes y más convenientes para rutas parenterales alternas tales como inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular. Cuando se utiliza para administración in vivo, formulaciones de anticuerpos aquí descritas deberán ser estériles. Esto se logra fácilmente por ejemplo por situación a través de membranas de filtración estériles, antes de o después de liofilización y reconstitución. Anticuerpos ordinariamente se almacenarán en forma liofilizada o en solución. Composiciones de anticuerpos terapéuticas generalmente se colocan en un recipiente que tiene una compuerta de acceso estéril, por ejemplo una bolsa o ampolleta de solución intravenosa que tiene un adaptador que permite obtener la formulación, tal como un tapón perforable o una aguja de inyección hipodermica. La ruta de administración de anticuerpos es de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo inyección o infusión por rutas intravenosa, intraperitoneal , intracerebral , intramuscular, intraocular, intraarterial , intratecal, por inhalación o intralesión, o por sistemas de liberación sostenida como se anota a continuación. De preferencia se administran anticuerpos en forma continua por infusión o por inyección de bolo. Una cantidad excesiva de anticuerpo a emplearse terapéuticamente, dependerá por ejemplo de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración y la condición del paciente. De acuerdo con esto, se prefiere que el terapeuta titule la dosis y modifique la ruta de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Típicamente, el médico administrará anticuerpo hasta que se alcance una dosis que logre el efecto deseado. El avance de estas terapias se supervisa fácilmente por ensayos convencionales o por los ensayos aquí descritos . Anticuerpos como se describe aquí, pueden prepararse en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Composiciones terapéuticas pueden administrarse en forma intravenosa o a través de la nariz o pulmón, de preferencia como un líquido o polvo en aerosol (liofilizado) . Las composiciones también pueden administrarse en forma parenteral o subcutánea según se desee. Cuando se administran sistémicamente, las composiciones terapéuticas deberán ser estériles, libres de pirógenos y en una solución parenteralmente aceptable que tenga debida consideración de pH, isotonicidad y estabilidad. Estas condiciones se conocen por aquellos con destreza en la técnica. Brevemente, se preparan formulaciones de dosis de dosificación de los compuestos para almacenamiento o administración al mezclar el compuesto que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables. Estos materiales no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como TRIS HC1, fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico péptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) tales como poliarginina, proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulina,- polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidinona; aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcar alcoholes tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol . Composiciones estériles para inyección pueden formularse de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences (18ava ed. , Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990) . Por ejemplo, disolución o suspensión del compuesto activo en un vehículo tal como agua o aceite vegetal de origen natural como ajonjolí, cacahuate o aceite de semillas de algodón o un vehículo graso sintético como etil oleato o semejantes, pueden ser convenientes. Amortiguadores, conservadores, antioxidantes y semejantes pueden incorporarse de acuerdo con la práctica farmacéutica aceptada.
Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el polipéptido, estas matrices están en la forma de artículos conformados, películas o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli (2-hidroxietil-metacrilato) como se describe por Langer et al., J. Biomed Mater. Res., (1981) 15:167-277 and Langer, Chem. Tech., (1982) 12:98-105, o pol (vinilalcohol) ) , polilactidas (Patente de los E.U.A. Número 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etíl (Sidman et al., Biopolymers, (1983) 22:547-556), no-degradable etilen viníl acetato no degradable (Langer et al., supra) , copolímeros de ácido láctico-ácido glicolico degradable tales como the LUPRON Depot™ (microesferas inyectables compuestas por copolímeros de ácido láctico-ácido glicolico y leuprolida acetato) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico (EP 133,988). Mientras que polímeros tales como etilen vinil acetato y ácido láctico-ácido glicolico, permiten la liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos de tiempo más cortos . Cuando proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo por largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de exposición a la humedad a 37 grados C, resultando en pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad . Estrategias racionales pueden diseñarse para estabilización de proteina dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es formación de enlace S-S intermolecular a través de intercambio disulfuro, la estabilización puede lograrse al modificar residuos sulfhidrilo, liofilizar a partir de soluciones acidicas, controlar contenido de humedad utilizando aditivos apropiados y desarrollar composiciones de matriz de polímero especificas. Composiciones de liberación sostenida también incluyen preparaciones de cristales del anticuerpo suspendido en formulaciones convenientes capaces de mantener cristales en suspensión. Estas preparaciones cuando se inyectan subcutánea o intraperitonealmente pueden producir un efecto de liberación sostenida. Otras composiciones también incluyen anticuerpos atrapados liposomalmente . Liposomas que contienen dichos anticuerpos se preparan por métodos conocidos per se: Patente de los E.U.A. Número DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; 142,641; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008; Patentes de los E.U.A. Números 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Las dosis de la formulación de anticuerpo para un paciente determinado se determinará por el médico a cargo tomando en consideración diversos factores conocidos que modifican la acción de drogas incluyendo severidad y tipo de enfermedad, peso corporal, sexo, dietas, horas y ruta de administración, otros medicamentos y otros factores clínicos relevantes. Dosis terapéuticamente efectivas pueden determinarse ya sea por métodos in vi tro o in vivo. Una cantidad efectiva del anticuerpo a emplearse terapéuticamente dependerá por ejemplo de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración y la condición del paciente. De acuerdo con esto, se prefiere que el terapeuta titule la dosis y modifique la ruta de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.001 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Típicamente, el médico administrará el anticuerpo terapéutico hasta que se alcance una dosis que logre el efecto deseado. El avance de esta terapia se supervisa fácilmente por ensayos convencionales o como se describe aquí . Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con las composiciones y métodos presentes se hará con adecuados portadores excipientes y otros agentes que se incorporan en formulaciones para proporcionar mejorada transferencia, suministro, tolerancia y semejantes. Una multitud de formulaciones apropiadas puede encontrarse en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos : Remington's Pharmaceutical Sciences (18aa ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990) ) , particularmente capítulo 87 por Block, Lawrence . Estas formulaciones incluyen por ejemplo polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos (vesículas que contienen lípido) , catiónicas o aniónicas (tales como lipofectinam) conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite-en-agua, y aguas-en-aceite, emulsiones de carbowax (polietilen glicoles de diversos pesos moleculares) , geles semisólidos, y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, siempre que el ingrediente activo en la formulación no se inactive por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la ruta de administración. Ver también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul . Toxicol . Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals . " Int. J. Pharm. 203 (1-2 ): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci .89 (8) -.967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citas de ahí para información adicional relacionada a formulaciones, excipientes y portadores bien conocidos para los químicos farmacéuticos. Preparación de Anticuerpos Anticuerpos, como se describe aquí, se prepararon a través de la utilización de la tecnología XenoMouse® como se describe a continuación. Estos ratones, luego son capaces de producir moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina humana y son deficientes en la producción de moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina murina. Tecnologías utilizadas para lograr lo mismo se describen en las patentes, solicitudes y referencias aquí descritas. En particular, sin embargo una modalidad de producción transgénica de ratones y anticuerpos se describe en la solicitud de Patente de los E.U.A. Número de Serie 08/759,620, presentada en diciembre 3, 1996 y las solicitudes de Patente Internacionales Números WO 98/24893, publicada en junio 11, 1998 y WO 00/76310, publicada en diciembre 21, 2000, las descripciones de las cuales aquí se incorporan por referencia. Ver también Méndez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) . A través del uso de esta tecnología, anticuerpos monoclonales totalmente humanos para una variedad de antígenos pueden producirse. En una modalidad, líneas de ratones XenoMouse® se inmunizan con un . antígeno de interés (e.g. EGFRvIII) , células linfáticas se recuperan (tales como células B) de los ratones que expresan anticuerpos y estas células se fusionan con una linea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y estas líneas celulares de hibridomas se supervisan y se seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos al antígeno de interés . Aquí se proporcionan métodos para la producción de líneas celulares de hibridoma múltiples que producen anticuerpos específicos a EGFRvIII. Además, aquí se proporcionan caracterizaciones de los anticuerpos producidos por estas líneas celulares incluyendo secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de estos anticuerpos .
En forma alterna, en lugar de fusionarse a células de mieloma para generar hibridomas, el anticuerpo producido por las células recuperadas, aislado de líneas de ratones XenoMouse® inmunizadas, se supervisan más para reactividad contra el antigeno inicial, de preferencia proteína EGFRvIII. Esta supervisión incluye ELISA con proteína EGFRvIII, enlace in vitro a células NR6 M EGFRvIII de longitud integra de expresión estable e internalización de receptor de EGFRvIII por los anticuerpos en células NR6 M. Células B sencillas que secretan anticuerpos de interés son luego aisladas utilizando un ensayo de placa hemolítica específica de EGFRvIII (Babcook et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 193:7843-7848 (1996)). Células dirigidas a lisis de preferencia son células de glóbulos rojos de oveja (SRBCs) revestidas con el antígeno EGFRvIII. En la presencia de un cultivo de células B que secreta la inmunoglobulina de interés y complemento, la formación de una placa indica lisis mediada por EGFRvIII específicas de las células objetivo. La célula de plasma específica de antígeno sencilla en el centro de la placa puede aislarse y la información genética que codifica la especificidad de anticuerpos se aisla de la célula de plasma sencilla. Utilizando PCR transcriptasa inversa, el ADN que codifica la región variable del anticuerpo secretado, puede ser clonado. Este ADN clonado luego puede ser adicionalmente insertado en un vector de expresión conveniente, de preferencia un cásete vector tal como ADNpc, más preferible este vector ADNpc que contiene los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina. El vector generado luego puede ser transfectado en células huésped, de preferencia células CHO y cultivado en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Aquí, describimos el aislamiento de múltiples células de plasma sencillas que producen anticuerpos específicos para EGFRvIII. Además, el material genético que codifica la especificidad del anticuerpo anti-EGFRvIII se aisla, e introduce en un vector de expresión conveniente que luego se transfecta en células huésped. Células B de ratones Xeno ouse también pueden emplearse como una fuente de material genético de el cual se pueden generar bibliotecas de exhibición de anticuerpos . Estas bibliotecas pueden elaborarse en bacteriófago, levadura o in vitro mediante exhibición ribosoma utilizando destrezas ordinarias en la especialidad. Ratones XenoMouse hiperinmunizados pueden ser una fuente rica de la cual pueden aislarse anticuerpos de alta afinidad, reactivos a antígeno. De acuerdo con esto, ratones XenoMouse hiperinmunizados contra EGFRvIII pueden emplearse para generar bibliotecas de exhibición de anticuerpo de las cuales pueden aislarse anticuerpos de alta afinidad contra EGFRvIII. Estas bibliotecas pueden supervisarse contra el oligopéptido pep3 y supervisar los anticuerpos derivados resultantes contra células que expresan EGFRvIII para confirmar especificidad para el antígeno de exhibición nativo. Anticuerpo IgG completo luego puede expresarse utilizando tecnología de ADN recombinante . Ver O 99/53049. En general, anticuerpos producidos por las líneas celulares anteriormente mencionadas poseen cadenas pesadas IgGl o IgG2 totalmente humanas con cadenas ligeras capa humana. En una modalidad, los anticuerpos poseen altas afinidades, típicamente poseen Kd' s desde aproximadamente 10~9 hasta aproximadamente 10"13 M, cuando se mide ya sea por fase sólida y fase de solución. En otras modalidades, los anticuerpos poseen menores afinidades, de aproximadamente 10"6 hasta aproximadamente 1CT8 M. Como se aprecia por una persona con destreza en la técnica, anticuerpos de acuerdo con las presentes modalidades pueden expresarse en líneas celulares diferentes a lineas celulares de hibridoma.
Secuencias que codifican anticuerpos particulares pueden emplearse para transformación de una célula huésped de mamífero conveniente. La transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleotidos en una célula huésped, incluyendo por ejemplo empacar el polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducir una célula huésped con el virus (o vector) o por procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica por las patentes de los E.U.A. Números 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, y 4,959,455). El procedimiento de transformación empleado depende del huésped a transformar. Métodos para introducir polinucleotidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de el o los polinucleotidos en liposomas y microinyección directa del ADN en núcleos. Líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) , incluyendo pero no limitadas a células de ovario de hámster chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK) , células de riñón de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular humano (e.g., Hep G2), y una cantidad de otras líneas celulares. Líneas celulares de preferencia en particular se eligen a través de determinar que líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades de enlace EGFRvIII constitutivas. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos realizados y los resultados logrados, se proporcionan para propósitos ilustrativos solamente y no habrán de considerarse como limitantes de la presente invención. La estrategia para generar anticuerpos específicos EGFRvIII inicialmente involucra inmunización de ratones XenoMouse con combinaciones de antígenos (péptido, diversas proteínas solubles, células que expresan antígeno) seguido por aislamiento de células que producen anticuerpo, ya sea a través de fusiones para producir hibridomas o aislamiento de células B a través de la tecnología XenoMaxR/SLAMR. Células que producen anticuerpos se sometieron a una supervisión primaria para especificidad por ELISA y una supervisión secundaria para enlace de superficie celular por FMAT y/o FACS . Ensayos de internalización luego se condujeron para identificar anticuerpos que serán útiles para suministro de droga. Afinidades de los anticuerpos se midieron. Ciertos anticuerpos se seleccionaron para cartografía de epítopo. Además, ciertos anticuerpos se seleccionaron para pruebas in vit.ro e in vivo para analizar la eficacia de estos anticuerpos para tratamiento de cánceres. EJEMPLO 1 Preparación de Antígeno A. Preparación de Antígeno EGFRvIII PEP3-KLH En conexión con el Ejemplo 2, el péptido PEP3 EGFRvIII humano 14-mero (L E E K K G N Y V V T D H C (SEQ ID NO: 56)) se sintetizó a la medida por R&D. El péptido PEP3 luego se conjugó con hemocianina de erizo de mar (KLH) , como sigue: PEP3 EGFRvIII (200 mcg) (R&D) se mezcla con 50 mcg de hemocianina de erizo de mar (KLH; Pierce, Rockford, IL) a un volumen final de 165 mcl utilizando agua destilada. 250 mcl de amortiguador de conjugado (MES 0.1M, NaCl 0.9M, pH 4.7) se agregan y EGFRvIII PEP3 y KLH se entrelazaron por la adición de 25 mcl de 10 mg/ml de solución de material de hidrocloruro de l-etil-3- [3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC, Pierce, Rockford, IL) . El conjugado se incuba por 2 horas a temperatura ambiente y el EDC sin reaccionar se retira por centrifugación a través de un filtro de 1 kDa (filtro centrífugo; Millipore, Bedford, ??) utilizando PBS H 7.4. En conexión con el ejemplo 3, el péptido PEP3 EGFRvIII humano 14-mero (L E E K K G N Y VV T D H C (SEQ ID NO: 56)) se sintetiza a la medida. El péptido PEP3 luego se conjuga con KLH, conocidos: PEP3 EGFRvIII humano (200 mcg) se mezcla con 50 mcg de hemocianina de erizo de mar (KLH; Pierce, Rockford, IL) a un volumen final de 165 mcl utilizando agua destilada. 250 mcl de amortiguador de conjugado (MES 0.1M, NaCl 0.9M, pH 4.7) se agrega y EGFRvIII PEP3 y KLH se entrelazan por la adición de 25 mcl de 10 mg/ml de solución de material de hidrocloruro de l-etíl-3- [3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC, Pierce, Rockford, IL) . El conjugado se incuba por 2 horas a temperatura ambiente y el EDC sin reaccionar se retira por centrifugación a través de un filtro de 1 kDa (filtro centrífugo; Millipore, Bedford, MA) utilizando PBS pH 7.4. B. Transfectores B300.19/EGFRvIII A fin de preparar los transfectores B300.19/EGFRvIII , EGFR tipo silvestre se clona inicialmente de células A431 y gen EGFR se modifica para codificar EGFRvIII para eliminar los codones que codifican los residuos 6-273, con un codón que codifica un residuo glicina creado en la unión de la deleción. La deleción ocurre dentro de los codones que circundan la deleción GTT (Valina) y CGT (Arginina) , tal como el codón resultante después de la deleción es GGT (Glicina) . ( ikstrand et al. J Neurovirol . 4(2):148-58 (1998)) 1. Clonación de Construcción EGFR Tipo Silvestre: PolyA+mRNA se extrae de células A431 (ATCC) utilizando el equipo RNA (Invitrogen, Burlington, ON) . ADNc total se sintetiza a partir de polyA+ mRNA con cebadores pd 6 aleatorios y transcriptasa inversa M-MuLV (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.). Un producto 2.3kb PCR se amplifica a partir de ADNc ?431 con los siguientes cebadores : sentido 5 ' -GGATCTCGAGCCAGACCGGAACGACAGGCCACCTC-3 ' ; (SEQ ID NO: 62) antisentido 5 ' -CGGATCTCGAGCCGGAGCCCAGCACTTTGATCTT-3 ' (SEQ ID NO: 63) utilizando Pfu DNA polimerasa. El producto PCR se digiere con Xhol , purifica en gel y liga en plásmido pWBFNP (ver la Solicitud de Patente Internacional Número WO 99/45031) linearizado con Xhol para dar el plásmido Wt-EGFR/pWBFNP . 2. Generación de Construcción EGFRvIII: Productos PCR amplificados del plásmido plantilla Wt-EGFR/pWBFNP con pares de cebadores C13659/C29538 y C29539/C14288 (BioSource International), en donde C29538 y C29539 se fosforilaron con T4 Polinucleótido quinasa ( EB, New England Biolabs, Beverly, Mass.) : C13659: 5 ' -CGGATGAATTCCCAGACCGGACGACAGGCCACCTC- 3' (sentido) (SEQ ID NO: 64); C29538: 5 ' -CTTTCTTTTCCTCCAGAGCC-3 ' (antisentido) (SEQ ID NO: 65) ; C29539: 5 ' -GTAATTATGTGGTGACAGATC-3 ' (sentido) (SEQ ID NO: 66); C14288 : 5 ' -CGGATCTCGAGCTCAAGAGAGCTTGGTTGGGAGCT-3' (antisentido) (SEQ ID NO: 67). se ligaron para introducir una deleción en la secuencia que codifica los aminoácidos 6 a 273 del dominio extracelular EGFR y subclonaron en el vector de expresión pWBDHFR2 (ver la Solicitud de Patente Internacional Número WO 99/45031) . Un fragmento de 232 bp que representa el extremo 5' de la deleción se genera con el par cebador C13659/C29538 de la plantilla t-EGFR/pWBFNP amplificado con Pfu polimerasa (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.) El producto PCR se digiere con EcoRl (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.) y purifica en gel . Un fragmento de 1273 bp que representa el extremo 3' de la deleción se genera con el par cebador C29539/C14288 partir de Wt-EGFR/pWBFNP y la plantilla se amplifica con Pfu polimerasa. El producto PCR se digiere con Xhol (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.) y purifica en gel . Fragmentos se ligaron en EcoRl/Xhol digerir pWBDHFR2 con T4 DNA ligase (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.) para dar la construcción EGFRvIII/pWBDHFR. El dominio intracelular de EGFR se introduce en la construcción resultante como sigue: Un fragmento Dralll/Xhol 1566bp se aisla del pl smido Wt-EGFR/pWBFNP y liga en Dralll/Xhol digerido EGFRvIII/pWBDHFR para dar EGFRvIII-FL/pWBDHFR. 3. Transfeccion de Células B300.19 con EGFRvIII-FL/pWBDHFR: Células B300.19 (8xl06) se emplearon por transfeccion en 700 µ? de medio DMEM/HI . 20 µ? de EGFRvI11-FL/pWBDHFR y 2 µ<3 de CMV-Puro plasmid DNA se agregaron. Las células se sometieron a electroporación a 300 volts/960uF con Bio-Rad Gene Pulser. Después de electroporación, las células se enfriaron en hielo por 10 minutos y posteriormente, 10 mi de medio sin selección (DMEM/HI Glucosa, FBS al 10 por ciento, BME 50 µM, L-Glutamina 2mM, 100 unidades de Penicilina-G/ml, 100 unidades de MCG estreptomicina/ml) se agregó. Las células se incubaron por 48hrs a 37 grados C 7.5 por ciento de C02. Después de incubación, las células se dividieron en medio de selección (DMEM/HI Glucosa, FBS 10 por ciento, L-Glutamina 2 mM, BME 50 µ ?, 100 unidades de Penicilina-G/ml , 100 unidades de MCG estreptomicina/ml , 2ug/ml de puromicina) a 2xl04, 0.4xl04' y 0.08xl04 células/pozo en placa de 96 pozos y se seleccionaron en medio de selección por 14 días para generar ciónos estables. Ciónos resistentes puro se tiñeron con E752 mAb (un anticuerpo anti-EGFR, descrito en Yang et al., Crit Rev Oncol Hematol . , 38(l):17-23 (2001)) e IgG PE antihumano cabra se analizaron en FACS Vantage (Becton Dickinson) . C . Construcción de Expresión EGFRvIII-RbFc . A fin de generar la fusión Fe conejo EGFRvIII, proteina, primero se construye un vector que contiene ADN que codifica Fe de conejo. Este fue ligado con ADN que codifica EGFRvIII. Este enfoque se describe con más detalle a continuación: 1. Construcción de RbFc/pcDNA3.1 Higro: Cebadores 1322/867 (a continuación) se emplearon para amplificar un fragmento de 721bp que codifica el dominio bisagra-CH2-CH3 de IgG de conejo. #1322 (sentido): 5 ' -GGTGGCGGTACCTGGACAAGACCGTTGCG-3 ' (SEQ ID NO: 68) #867 (antisentido): 5'- ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGAGCGGGA-3 ' (SEQ ID NO : 69) El producto PCR resultante se digiere con pnl y Notl, purifica en gel y liga en pcDNA Kpnl/Notl 3.1(+)/Higro digerido con (Invitrogen, Burlington, ON) para dar el plásmido RbFc/pcDNA3.1 Higro. 2. Construcción de EGFRvIII-RbFc/pCEP : los cebadores 1290/1293 (a continuación) se emplearon para amplificar un producto de 1165bp de plantilla de plásmido EGFRvIII-FL/p BDHFR con Pfu polimerasa . #1290 (sentido) : 5' - CTACTAGCTAGCCACCATGCGACCCTCCGGGA-3 ' (SEQ ID NO: 70) #1293 (antisentido) : 5' -CGGGGTACCCGGCGATGGACGGGATC-3' (SEQ ID NO: 71) El producto PCR se digiere con Nhel y Kpnl, purifica en gel y liga en RbFc Nhel/Kpnl digerido con RbFc/pcDNA3.1 Hygro para dar el plásmido EGFRvIII-RbFc/pcDNA3. lHygro. Un fragmento 2170 bp se aisla de SnaBI/Xhol y subclona en pCEP4 digerido con EGFRvIII-RbFc/pcDNA3. lHygro y subclona en pCEP4 digerido con SnaBl/XhoI (Invitrogen, Burlington, ON) para dar el plásraido EGFRvIII-RbFc/pCEP4. 3. Generación de líneas celulares estables de 293F EGFRvIII-RbFc: El plásmido EGFRvIII-RbFc/pCEP4 se introduce en células 293F (Gibco, Grand Island, NY) por transfeccion con fosfato de calcio, como sigue: un día antes de transfeccion, lxlO6 células 293F se revisten en un plato petri de cultivo de tejido de 100 ram revestido con gelatina e incuban en C02 a 5 por ciento, 37 grados C. Las células se alimentan con 10 mi del medio no selectivo fresco (DMEM/F12, FBS al 10 por ciento, L-Glutamina 2mM, 100U/ml de Penicilina G, 100U/ml de estreptomicina MCG) 2-3 horas antes de transfeccion. Reactivos de transfeccion se prepararon en un tubo de microcentrífuga, como sigue: 10 µg de ADN (EGFRvIII-RbFc/pCEP4) se mezclan con 62 µ 1 de fosfato de calcio 2M y agua desionizada para constituir el volumen final 500 1. En otro tubo de pipeta, 500 µ 1 de 2XHBS se toman y emplean para transferir los reactivos de transfeccion. La solución en el tubo de pipeta se agrega a las células gota por gota, mientras que se mantiene adecuado pH al dejar las células en un incubador de C02 al 5 por ciento hasta que se realiza la transfeccion. 15 a 20 horas después de transfección, las células se lavaron con PBS y alimentan con 10 mi de medio no selectivo 293F fresco. Células de expresión se recolectan con tripsina 48-72 post-transfección y las células se revistieron a 0.08xl04 células/pozo en una placa de 96 pozos en medio selectivo 293F (DMEM/F12, FBS al 10 por ciento, L-Glutamina 2 mM, 100 U/ml Penicilina G, 100 U/ml Streptomicina MCG, 250 ug/ml de Higromicina) por 14 días. Ciónos resistentes a higromicina se supervisaron por ELISA utilizando anticuerpo anti-EGFR E763 (Patente de los E.U.A. No. 6,235,883) como el anticuerpo de captura a 1 /¿g/ml y detectar con igG HRPO anti-conejo cabra (CalTag) a dilución 1:100. D . Conjugación de EGFRvIII PEP3 con OVA mediante conjugación aleimida. El EGFRvIII peptide-OVA empleado para titulación de anticuerpos (Ejemplo 3) se produce como sigue : 207 µg de EGFRvIII PEP3 se reducen utilizando DTT previamente-pesado de (#20291). Una ampolleta de 7.7 mg de DTT previamente-pesado se disuelve utilizando 100 ?? de agua desionizada. EL material DTT se agrega a EGFRvIII PEP3. El volumen de la reacción se lleva a 600 µ?? utilizando PBS pH 7.4. La reacción se gira por 30 minutos a temperatura ambiente. Una columna G10 se preparó al pesar 5 gramos de perlas sephadex G10 y agregar 40mL de PBS, mezclar y dejar a temperatura ambiente por 10 minutos y luego centrifugar las perlas a 1000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante se retiró y se agregan 20 mi adicionales de PBS. Las perlas se centrifugaron a 1000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante se retira y suficiente PBS se agrega para constituir un fango al 50 por ciento de perlas sephadex 610. 5 mL de la mezcla de fango al 50 por ciento se agrega a una columna de centrifugado de 5 mL y la columna se coloca en un tubo de polipropileno de 14 mL. La columna se centrifugó a 1000 rpm por 3 minutos. Otros 3 mL de PBS se agregan y la columna se centrifuga de nuevo a 1000 rpm por 3 minutos . El tubo de polipropileno se reemplaza con un nuevo tubo y las columnas ahora estaban listas para uso. DTT se retira del péptido reducido. Después de 30 minutos de tiempo de reacción para reducir el péptido, 300 µ?? del péptido reducido se agregan por columnas. La columna se centrifugó a 1000 rpm por 3 minutos. 250 ÍL de PBS adicionales se agregan a cada columna y centrifugan de nuevo a 1000 rpm por 3 minutos. El péptido reducido se recolecta en el tubo de polipropileno de 14 mL.
El péptido reducido se conjuga a OVA activado con maleimida y recolecta en un tubo eppendorf . 2 mg de OVA activado con maleimida se disuelven (Pierce: 77126, Rockford IL) con amortiguador de conjugado de maleimida para producir 10 mg/mL de material. 414 µ de OVA activado con maleimida se agregan al péptido reducido en el tubo eppendorf. 500 µ?? del amortiguador de conjugado de maleimida se agregan a la reacción. Se deja que la reacción incube por 2 horas a temperatura ambiente y luego 2 mg de cisteína se agregan para neutralizar cualesquiera grupos maleimida activos que puedan haber estado presentes. Se dejó que la cisteína reaccionara por 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. El conjugado luego se lava con una columna centrífuga 10 , tres veces utilizando PBS IX pH 7.4. Esto retiró cualquier péptido libre que no conjugó con OVA y cisteína libre. El conjugado se retiró de la columna centrífuga utilizando puntas de carga de gel y transfirió a un tubo eppendorf. Finalmente el conjugado se lleva a la concentración deseada utilizando PBS IX pH 7.4. El conjugado producido tuvo una producción molar de 14.5 : 1 (péptido : OVA) . EJEMPLO 2 Producción de Anticuerpos Anti-EGFRvIII a Través de Generación de Hibridoma Ocho ratones XenoMouse que producen anticuerpos con una región constante gamma-1 (ratones XenoMouse Gl) se inmunizaron el día 0 y reforzaron los días 11, 21, 32, 44 y 54 para este protocolo y se realizaron fusiones el día 58. Todas las inmunizaciones se realizaron mediante administración subcutánea en la base de la cola más administración intraperitoneal para todas las inyecciones. La inmunización del día 0 se realizó con 1.5 x 107 de células transfectadas de B300.19/EGFRvIII (Ejemplo 1A) suspendidas en DPBS libres de pirógeno en mezcla 1:1 v/v con adyuvante completo de Freunds (CFA) (Sigma, St . Louis, O) . Refuerzos los días 11, 21, y 32 se realizaron con 1.5 x 107 de células transfectadas de B300.19/EGFRvIII en DPBS en mezcla 1:1 v/v con adyuvante incompleto de Freunds (IFA) (Sigma, St. Louis, MO) . Los refuerzos del día 44 se realizan con 5 µg de PEP3 (EGFRvIII péptido) - conjugado KLH (Ejemplo 1) en DPBS en mezcla 1:1 v/v con IFA y refuerzo final, el día 54 se realiza con 5 µ< de PEP3 (EGFRvIII péptido) -conjugado KLH en DPBS sin adyuvante. El día 58, los ratones se sacrificaron y luego se recuperaron los nodos linfáticos lumbares e inguinales. Los linfocitos se liberaron por separación mecánica de los nodos linfáticos utilizando un molino de tejido, luego agotaron de células T por selección negativa CD90. La fusión se realizó al mezclar células B enriquecidas lavadas y células P3X63Ag8.653 de mieloma no secretorio adquiridas de ATCC, cat . # CRL 1580 (Kearney et al, J. Immunol. 123:1548-1550 (1979)) a una proporción de 1:1. La mezcla celular se centrifugó suavemente a 800 g. Después de remoción completa del sobrenadante, las células se trataron con 2-4 mL de solución Pronase (CalBiochem, cat. # 53702; 0.5 mg/ml en PBS) por no más de 2 minutos. Luego 3-5 mi de FBS se agregan para detener la actividad enzim tica y la suspensión se ajustó a 40 mi volumen total utilizando solución de fusión electro celular, ECFS (Sacarosa 0.3M, Sigma, Cat# S7903, Acetato de Magnesio de O.lmM, Sigma, Cat# M2545, Acetato de Calcio 0.1 mM, Sigma, Cat# C4705 (St. Louis, MO) ) . El sobrenadante se retiró después de centrifugación y las células se lavaron por resuspensión en 40 mi de ECFS. Esta etapa de lavado se repitió y las células de nuevo se resuspendieron en ECFS a una concentración de 2xl06 células/ml. Fusión de electro-células se realizó utilizando un generador de fusión modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA. El tamaño de cámara de fusión empleado fue 2.0 mi, y utilizando los siguientes ajustes del instrumento: condición de alineamiento: voltaje 50 v, tiempo: 50 s, ruptura de membrana a: voltaje: 3000 v, tiempo: 30 , tiempo de retención post-fusión: 3 s. Después de fusión, las células se resuspendieron en DMEM (JRH Biosciences) , FCS al 15 por ciento (Hyclone) , que contiene HAT, y suplementaron con L-glutamina, pen/strep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todo de Sigma, St . Louis, MO) y IL-6 (Boehringer Mannheim) para cultivo a 37 grados C y C0210 por ciento en aire. Células se revistieron en placas de cultivo de tejido de 96 pozos a 4xl04 células por pozos. Los cultivos se mantuvieron en medio suplementado HA (hipoxantinae, aminopterina y timidina) por 2 semanas antes de transferencia a medio suplementado con HT (hipoxantina y timidina) . Se seleccionaron hibridomas por supervivencia en medio HAT y los sobrenadantes se supervisaron por reactividad de antígeno por ELISA. El formato ELISA involucra incubar sobrenadantes en placas revestidas con antígeno (placas revestidas con péptido EGFRvIII-OVA y placas revestidas péptido EGFr tipo silvestre-OVA como una contra pantalla y detectar enlace especifico de EGFRvIII utilizando IgG antihumano ratón etiquetado con peroxidato de rábano (HRP) (ver tabla 2.1.) .
TABLA 2.1 Placa.Pozo Hibridoma OD Placa de fusión muEGFr EGFr 13.2 DIO 13.1 034 2.653 0.051 13.3 C12 13.2 829 2.443 0.049 13.3 Fll 13.3 874 1.081 0.049 13.6 Bll 13.4 322 1.311 0.052 Ciónos Placa OD #1 OD #2 Placa de clonación muEGFr EGFr 13 0.5c/w D2 2.614 2.586 0.042 13 0.5c/w F5 2.248 1.272 0.041 Como se observará, cuando menos cuatro ibridomas específicos de antígeno se detectaron: 13.1, 13.2, 13.3, y 13.4. Estos hibridomas que fueron positivos en la especificidad EGFRvIII ensayo ELISA se confirmaron por FACS en 300.19 células transfectadas en forma estable que expresan EGFRvIII contra 300.19 células parenterales no transfectadas . La clonación se realizó en pozos positivos de antigenos selectos utilizando revestimiento de dilución limitado. Las placas se inspeccionaron visualmente por la presencia de crecimiento de colonia sencilla y sobrenadantes de pozos de colonia sencilla luego supervisaron por ELISAs específicos de antígeno y confirmación FACS como se describió anteriormente. Ciónos altamente reactivos se ensayaron para verificar la pureza de cadena kappa y gamma humana por ELISA multiplex utilizando un instrumento luminex. Con base en la especificidad de EGFRvIII en el ensayo ELISA y FACS, el clon 13.1.2 se seleccionó como el candidato más promisorio para mayor supervisión y análisis. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras el anticuerpo 13.1.2 se ilustran en la Figura 3L y SEQ ID NO: 137 y 139 para ácidos nucleicos de cadena pesada y ligera y 138 y 140 para secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera. Además, una comparación de las secuencias de cadena pesada y ligera 13.1.2 con la secuencia de linea germinal de la cual se derivaron como se ilustran las Figuras 4 y 5. EJEMPLO 3 Generación de Anticuerpos a Través del Uso de Tecnología Genomax Inmunización de animales XenoMouse Anticuerpos monoclonales humanos contra EGFRvIII se desarrollaron al inmunizar secuencialmente ratones XenoMouse que producen anticuerpos con una región constante gamma 1 (ratones XenoMouse Gl) , los ratones XenoMouse que producen anticuerpos con regiones constantes gamma-2 (ratones XenoMouse HMG2) y ratones XenoMouse que producen anticuerpos con una región constante gamma-4 (ratones XenoMouse G4) . Para generar mAbs a través de tecnología XenoMax, cohortes de ratones XenoMouse Gl y XMG2 se inmunizaron con EGFRvIII PEP3 (Ejemplo 1?) y células 300.19 que expresan EGFRvIII- (Ejemplo IB) o con dominio extracelular bacterialmente expresado de proteína EGFRvIII (EGFRvIII-ECD) (Dr. Bigner, Duke University) y células 300.19 que expresan EGFRvIII o con proteína de fusión Fe conejo EGFRvIII (EGFRvIII -RbFc) (Ejemplo 1C) y células 300.19 que expresan EGFRvIII o con EGFRvIII-RbFc solo mediante la planta de la pata (FP) , o por la base de la cola mediante inyección subcutánea e intraperitoneo (BIP) . Para inmunizaciones en la planta de la pata, la inmunización inicial fue con o sin 10 X 10e células 300.19 que expresan EGFRvIII-y con o sin 10 /ig de EGFRvIII PEP3 o EGFRvIII-ECD o EGFRvIII-RbFc en mezcla 1:1 v/v con Titermax gold (Sigma, Oakville, ON) por ratón. Los refuerzos subsecuentes se realizaron con la mitad de la cantidad de inmunógeno empleada en la inmunización inicial. Los primeros cuatro refuerzos se realizaron al tomar el inmunógeno en mezcla con Alumbre (Sigma, Oakville, ON) , adsorbido durante la noche por ratón como se ilustra en la tabla 3.1 siguiente esto fue seguido por una inyección con inmunógeno respectivo en Titermax gold, una inyección con Alumbre y luego un refuerzo final del inmunógeno en PBS como se muestra en la Tabla 3.1. En particular, se inmunizaron animales los días 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24. Los animales se sangraron el día 19 para obtener suero y determinar el título para selección de cosecha. Los animales se cosecharon el día 28. TABLA 3.1 Programa de inmunización en la planta de la pata Grupo # 1 2 3 4 # de animales 5 5 5 5 Cepa de ratón XMG XM3C-3 XMG2 XM3C-3 2 Refuerzo Adyuvante Immunógeno Immunógeno # 1° Titermax EGFRvIII- EGFRvIII-Grupo # 1 2 3 4 # de animales 5 5 5 5 Cepa de ratón XMG XM3C-3 XMG2 XM3C-3 2 Refuerzo Adyuvante Immunogeno Immunogeno # gold células células 300.19 300.19 + + EGFRvIII-ECD PEP3-KLH 2o Alumbrebr EGFRvIII- EGFRvIII- e células células 300.19 300.19 3o Alumbre PEP3- LH EGFRvIII-ECD 4o Alumbre EGFRvIII- EGFRvIII- células células 300.19 300.19 5o Alumbre PEP3-KLH EGFRvIII-ECD 6o Titermax EGFRvIII- EGFRvIII- gold células células 300.19 300.19 7o Alumbre PEP3-KLH EGFRvIII-ECD 8o PBS EGFRvIII- EGFRvIII- células células 300.19 300.19 + + EGFRvIII-ECD PEP3-KLH Grupo # 1 2 3 4 # de animales 5 5 5 5 Cepa de ratón XMG XM3C-3 XMG2 XM3C-3 2 Refuerzo Adyuvante Immunógeno Immunógeno # Cosecha Grupo # 5 6 7 8 # de animales 5 5 5 5 Cepa de ratón XM XM3C-3 XMG2 XM3C-3 G2 Refuerzo # Adyuvante Immunógeno Immunógeno 1° Titermax EGFRvIII- EGFRvIII-RbFc gold células 300.19 + EGFRvIII- RbFc 2o Alumbrebr EGFRvIII- EGFRvIII-RbFc e células 300.19 3o Alumbre EGFR III- EGFRvIII-RbFc ECD 4o Alumbre EGFR III- EGFRvIII-RbFc células 300.19 5o Alumbre EGFRvUI- EGFRvIII-RbFc ECD 6o Titermax EGFRvIII- EGFRvIII-RbFc gold células 300.19 7o Alumbre EGFRvIII- EGFRvIII-RbFc ECD 8o PBS EGFRvIII- EGFRvIlI-RbFc células 300.19 + EGFRvIII- RbFc Cosecha La inmunización BIP inicial con el inmunógeno respectivo, como se describe para la inmunización en la planta de la pata, se mezcló 1:1 v/v con adyuvante completo de Freund (CFA, Sigma, Oakville, ON) por ratón. Se realizaron subsecuentes refuerzos primero con el inmunógeno respectivamente, mezclado 1:1 v/v adyuvante incompleto de Freund (IFA, Sigma, Oakville, ON) por ratón, seguido por un refuerzo inicial en PBS por ratón. Los animales se inmunizaron los días 0, 14, 28, 42, 56, y el día 75 (refuerzo final) como se muestra en la Tabla 3.2 a continuación. Los animales se sangraron el día 63 para obtener suero y determinar el título para selección de cosecha. Los animales se cosecharon el día 78. TABLA 3.2 Programa de inmunización BIP Gru o 9 10 11 12 # de animales 5 5 5 5 Cepa de ratón XMG2 XM3C-3 XMG2 XM3C-3 Refue Adyuvante Immunógeno Immunógeno rzo # 1° CFA EGFRvIII- EGFRvIII-células 300.19 células 300.19 + EGFRvIII-ECD + PEP3- LH 2o IFA EGFR-vIXI- EGFRvIII-células 300.19 células 300.19 3o IFA PEP3-KLH EGFRvIII-ECD 4o IFA EGFRvIII- EGFRvIII-células 300.19 células 300.19 5o IFA PEP3 - LH EGFRvIII-ECD 6o PBS EGFRvIII- EGFRvIII-células 300.19 células 300.19 + EGFRvIII-ECD + PEP3-KLH Grupo 9 10 11 12 # de animales 5 5 5 5 Cepa de ratón XMG2 XM3C-3 XMG2 XM3C-3 Refue Adyuvante Immunógeno Immunógeno rzo # 7o 8o Grupo 13 14 15 16 # de animales 5 5 5 5 Cepa de ratón XMG2 XM3C-3 XMG2 XM3C-3 Refuerzo Adyuvante Immunógeno Immunógeno 5 # 1° CFA EGFRvIII- EGFRvIII-RbFc células 300.19 + EGFRvIII-RbFc 10 2o IFA EGFRvIII- EGFRvIII-RbFc células 300.19 3o IFA EGFRvIII-ECD EGFRvIII-RbFc 4o IFA EGFRvIII- EGFRvIII-RbFc 15 células 300.19 5o IFA EGFRvIII-ECD EGFRvIII-RbFc 6o PBS EGFRvIII- EGFRVIII-RbFC células 20 300.19 + EGFRvIII-RbFc 7o 8o 25 Selección de animales para cosecha por determinación de título Títulos de anticuerpo Anti-hEGFRvIII se determinaron por ELISA. EGFRvI11-RbFc y (2.5 ¿¿g/ml) o RbFc de control (2 ^g/ml) o péptido EGFRvIII-OVA (2 jitg/ml) (Ejemplo 1) o OVA de control (4 ^g/ml) se revistieron en placas de 96 pozos de poliestireno de enlace Costar Labcoat Universal (Corning, Acton, MA) durante la noche a cuatro grados . La solución que contiene antígeno no ligado se retira y las placas se trataron con luz UV (365nm) por 4 minutos (4000 microjoules) . Las placas se lavaron cinco veces con d¾0. Suero de animales XenoMouse® inmunizados con EGFRvIII o animales XenoMouse® naive, se titularon en leche/PBS 2 por ciento a 1:2 diluciones en duplicado de una dilución inicial 1:100. El último pozo se dejó en vacío. Las placas se lavaron cinco veces con d¾0. Anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano específico Fc-IgG antihumano cabra (HRP, Pierce, Rockford, IL) se agrega a una concentración final de 1 µg/mL por 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cinco veces con dH20. Las placas se revelaron con la adición de sustancia cromogénica TMB (Gaithersburg, MD) por 30 minutps y el ELISA se detuvo por la adición de ácido fosfórico 1 M. El título específico de animales XenoMouse® individuales se determinó a partir de la densidad óptica a 450 nm y se ilustra en las tablas 3.3 ? 3.4. El título representa la dilución recíproca del suero y por lo tanto entre mayor sea el número, mayor será la respuesta inmune humoral a hEGFRvIII. Para ratones inmunizados mediante la base de la cola por inyección subcutánea e intraperitoneo, el título se determina exactamente como con anterioridad excepto porque las placas se revistieron con EGFRvIII-RbFc (2.0 µ /p?1) o un RbFc de control (2.5 µg/ l) .
Tabla 3.3 Iinmunización Cepa y Grupo r.Ds de EGFRvIII-RbFc (sitio e sexo de # ratón @ 2.5ug/ml . inmunógeno) ratón FP 0748-1 330 EGFRvIII- 0748-2 237 células 0748-3 109 300.19 + 0748-4 714 1 EGFRvIII XMG2 0748-5 165 PEP3-KLH (ver programa de Inm. ) Nalve <100 2 FP XM3C-3 0741-1 388 Inmunización Cepa y Grupo I .Ds de EGFRVIII-RbFc (sitio e sexo de # ratón @ 2.5ug/ml . inmunógeno) ratón EGFRvIII- 0741-2 327 células 0741-3 385 300.19 + 0741-4 589 EGFRvIII 0741-5 273 PEP3-KLH (ver programa Inm. ) Nalve <100 FP 0749-1 552 EGFRvIII- 0749-2 477 células 0749-3 100 300.19 + 0749-4 100 3 XMG2 EGFRvIII-ECD 0749-5 1631 (ver programa de Inm. ) Naive 100 4 FP XM3C-3 0742-1 372 EGFRvIII- 0742-2 745 células 0742-3 484 300.19 + 0742-4 530 EGFRvIII-ECD 0742-5 270 Inmunización Cepa y Grupo I.Ds de EGFRvIII- bFc (sitio e sexo de # ratón @ 2.5ug/ml . inmunógeno) ratón (ver programa Inm. ) Naive 100 FP 0750-1 5399 EGFRvIII- 0750-2 3072 células 0750-3 >6400 300.19 + 0750-4 5845 5 XMG2 EGFRvIII- 0750-5 5770 RbFc (ver programa Inm. ) Naive 100 FP 0743-1 1220 EGFRvIII- 0743-2 1183 células 0743-3 645 300.19 + 0743-4 759 6 XM3C-3 EGFRvIII- 0743-5 1260 RbFc (ver programa Inm. ) Naive 100 7 FP XMG2 0745-1 1897 EGFRvIII- 0745-2 >6400 KbFc (ver 0745-3 1225 Iinmunización Cepa y Grupo I.Ds de EGFRvIII-RbFc (sitio e sexo de # ratón @ 2.5ug/inl . inmunógeno) ratón programa 0745-4 4047 Inm. ) 0745-5 852 Nalve 100 0744-1 362 FP 0744-2 807 EGFRvIII- 0744-3 479 8 RbFc (ver X 3C-3 0744-4 631 programa 0744-5 1112 Inm. ) Nai e 100 Cepa Péptido Immunización y I.Ds EGFRvIII - OVA Grupo (sitio e sexo de OVA revestido # inmunógeno) de ratón revestido a 4.0 /íg/ml ratón 2.0 ftg/ml 1 FP XMG2 0748-1 13549 <100 EGFRvIII- 0748-2 7635 <100 células 0748-3 9824 <100 300.19 + 0748-4 8014 <100 EGFRvIII 0748-5 9421 <100 Cepa Péptido Immunización y I.Ds EGFRvIII OVA Grupo (sitio e sexo de OVA revestido # inmunógeno) de ratón revestido a 4.0 ^g ml ratón 2.0 ftg/ml PEP3-KLH (ver programa de Inm. ) Halve n/a n/a FP 0741-1 347 <100 EGFRvIII - 0741-2 240 <100 células 0741-3 330 <100 300.19 + 0741-4 227 <100 XM3C- 2 EGFRvIII 0741-5 626 <100 3 PEP3-KLH (ver programa Inm. ) Nalve n/a n/a 3 FP XMG2 0749-1 <100 <100 EGFRvIII- 0749-2 <100 <100 células 0749-3 <100 <100 300.19 + 0749-4 <100 <100 EGFRvIII-ECD 0749-5 <100 <100 Cepa Péptido Iinmunización y I.DS EGFRvIII OVA Grupo (sitio e sexo de OVA reves ido # inmunógeno) de ratón revestido a 4.0 ^g ml ratón 2.0 fig/m.1 (ver programa de Inm. ) Nalve n/a n/a FP 0742-1 <100 <100 EGFRvIII- 0742-2 <100 <100 células 0742-3 <100 <100 300.19 + XM3C- 0742-4 <100 <100 4 EGFRvIII-ECD 3 0742-5 <100 <100 (ver programa Inm. ) Naive n/a n/a FP 0750-1 <100 <100 EGFRvIII- 0750-2 <100 <100 células 0750-3 <100 <100 300.19 + 0750-4 <100 <100 XMG2 EGFRvIII- 0750-5 <100 <100 RbFc (ver programa Inm. ) Nalve n/a n/a 6 FP XM3C- 0743-1 <100 <100 Cepa Péptido Iinmunización y I.DS EGFRvIII OVA Grupo (sitio e sexo de OVA revestido # inmunógeno) de ratón revestido a 4.0 ¿ig/ml ratón 2.0 /íg/ml EGFRvIII- 3 0743-2 <100 <100 cél las 0743-3 <100 <100 300.19 + 0743-4 <100 <100 EGFRvIII- 0743-5 <100 <100 RbFc (ver programa Inm. ) Waive n/a n/a 0745-1 <100 <100 FP 0745-2 <100 <100 EGFRvIII- 0745-3 <100 <100 7 RbFc (ver XMG2 0745-4 <100 <100 programa 0745-5 <100 <100 Inm. ) Nalve n/a n/a 0744-1 <100 <100 FP 0744-2 <100 <100 EGFRvIII- XM3C- 0744-3 <100 <100 8 RbFc (ver 3 0744-4 <100 <100 programa 0744-5 <100 <100 Inm. ) Malve n/a n/a Todos los animales XenoMouse del grupo 5 y los animales XenoMouse 0743-5 del grupo 6 de la tabla 3.3 se seleccionaron para cosechas XenoMax con base en la serología. Tabla 3.4 Cepa Immunización y I.DS EGFRvIII- Control Grupo (sitio e sexo de RbFc @ RbFc @ # Immunógeno) del ratón 2. Oug/ml . 2.5ug/ial. ratón BIP 0695-1 2921 EGFRvIII- 0695-2 2219 células 0695-3 4609 300.19 + 0695-4 >6400 9 EGFRvIII XMG2 0695-5 1580 PEP3 -KLH (ver programa Inm. ) Narve <100 10 BIP XM3C- O700-1 <100 EGFRvIII- 3 O700-2 <100 células O700-3 >6400 300.19 + O700-4 5342 EGFRvIII O700-5 >6400 Cepa Iim ización y I.DS ESFRvIII- Control Grupo (sitio e sexo de RbPc @ R Fc @ # Ixnmuxiógsno) del ratón 2. Oug/ml . 2.5ug/ml . ratón PEP3-KLH (ver programa Inm. ) Malve <100 BIP 0696-1 <100 EGFRvIII- 0696-2 <100 células 06S6-3 <100 300.19 + 0696-4 143 11 XMG2 EGFRvIII-ECD 0696-5 <100 (ver programa Inm. ) Nalve <100 BIP O702-1 358 EGFRvIII- O702-2 469 células O702-3 401 300.19 + XM3C- O702-4 >6400 12 EGFRvIII-ECD 3 O702-5 >6400 (ver programa Inm. ) Waxve <100 Cepa Iinmunización y I.DS EGFRvIII- Control Grupo (sitio e sexo de RbFc @ RbFc @ # Ixmnunógeno) del ratón 2. Oug/ml . 2.5ug/ml. ratón BIP 0694-1 >6400 >6400 EGFRvIII- 0694-2 >6400 >6400 células 0694-3 >6400 >6400 300.19 + 0694-4 >6400 >6400 13 XMG2 EGFRvIII- 0694-5 3710 >6400 RbFc (ver programa Inm. ) Kalve <100 >6400 BIP O703-1 2740 >6400 EGFRvIII- O703-2 408 >6400 células O703-3 1406 >6400 300.19 + XM3C- O703-4 1017 >6400 14 EGFRvIII- 3 O703-5 403 >6400 RbFc (ver programa Inm. ) Nai e <100 >6400 BIP X G2 0697-1 >6400 >6400 EGFRvIII- 0697-2 >6400 >6400 RbFc (ver 0697-3 6242 >6400 programa 0697-4 1766 >6400 Cepa Intmunizacion y I.Ds EGFRvIII- Control Grupo (sitio e sexo de RbFc @ R Fc @ # Immunógeno) del ratón 2. Oug/ml . 2.5ug/ml. ratón Inm. ) 0697-5 >6400 >6400 Nalve <100 >6400 O701-1 592 >6400 B1P O701-2 1118 >6400 EGFRvIII- XM3C- O701-3 >6400 >6400 16 bFc (ver 3 O701-4 <100 <100 programa O701-5 n/a n/a Inm. ) Ialve <100 >6400 Cepa Péptido Inmunización y I.Ds EGFRvIII OVA Grupo (sitio e sexo de OVA revestido a # Immunógeno) del ratón revestido a 4.0 µg/¦ml. ratón 2.0 ^g ml 9 BIP X G2 0695-1 >128000 472 EGFRvIII- 0695-2 30504 379 células 0695-3 >128000 608 300.19 + 0695-4 >128000 368 EGFRvIII 0695-5 19757 269 Cepa Péptido Intmunización y I.DS EGFRvIII OVA Grupo (sitio e sexo de OVA revestido a # Immunógeno) del ratón revestido a .0 fig/ml ratón 2.0 /tg/ml (ver programa Inm. ) Walve 242 BIP O702-1 EGFRvIII- O702-2 células O702-3 300.19 + XM3C- O702-4 12 EGFBvIII-ECD 3 O702-5 (ver programa Inm. ) Naive BIP 0694-1 250 243 EGFRvIII- 0694-2 296 309 cél las 0694-3 736 605 300.19 + 0694-4 739 1111 13 XMG2 EGFRvIII- 0694-5 517 465 RbFc (ver programa Inm. ) Naive 242 14 BIP XM3C- O703-1 Cepa Péptido Inmunización y I.Ds EGFRvIII OVA Grupo (sitio e sexo de OVA revestido a # Immunógeno) del ratón revestido a 4.0 ftg/ml ratón 2.0 ng/ml EGFRvIII- 3 O703-2 células O703-3 300.19 + O703-4 EGFRvIII- O703-5 RbFc (ver programa Inm. ) Nalve 0697-1 340 348 BIP 0697-2 642 1793 EGFRvIII- 0697-3 319 246 15 RbFc (ver XMG2 0697-4 133 <100 programa 0697-5 685 448 Inm. ) Nalve 243 242 O701-1 BIP 0701-2 EGFRvIII- XM3C- O701-3 16 RbFc (ver 3 0701-4 programa O701-5 Inm. ) Nazive Animales XenoMouse (0695-1, 0695-3 y 0695-4) se seleccionaron para cosechas con base en los datos de serologia de la Tabla 3.4. Selección de células B B-células de los animales anteriormente discutidos se cosecharon y cultivaron. Aquellos que secretan anticuerpos específicos de péptido EGFRvIII- se aislaron como se describe por Babcook et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996). Se empleó Elisa para identificar pozos específicos OVA-péptido-EGFRvIII primario. Aproximadamente 5 millones de células B se cultivaron de animales XenoMouse en 245 Placas de 96 Pozos a 500 o 150 o 50 células/Pozo, y se supervisaron en OVA-péptido-EGFRvIII para identificar los pozos específicos de antígeno. Aproximadamente 515 pozos mostraron ODs significativamente sobre el fondo, una muestra representativa de la cual se ilustra en la Tabla 3.5. TABLA 3.5 Total Positivos sobre OD de corte de: # de 1. 2. 2. 3. 3.
Placas 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 5 0 5 0 5 Cansera 12 1152 634 81 56 49 45 38 32 29 26 25 18 11 4 1 0 SOO células/ Pozo Sigma 500 13 1248 773 195 139 117 99 80 73 5B 53 49 21 9 5 1 0 células/ Pozo Sigma 150 20 1920 1304 478 178 91 67 55 47 45 3S 33 19 9 5 2 0 células/ Pozo Total 45 4320 2711 754 373 257 211 173 152 132 115 107 58 29 14 4 0 244 de pozos positivos Elisa-OVA-péptido EGFRvIII- con OD > 0.5 se supervisaron de nuevo en OVA-péptido-EGFRvIII y en OVA para confirmar que fueron específicos de péptido EGFRvIII-. Un ejemplo representativo de estos resultados se ilustra en la Tabla 3.6. Tabla 3.6 OD-OVA- OD-OVA- péptido 11 OD- Placa Pozo péptido 21 EGFRvIII OVA EGFRvIII 0.135 121 G 1 0.7534 1.40S5 5 OD-OVA- OD-OVA- péptido 1 ¦ OD- Placa Pozo péptido 21 EGFRvIII OVA EGFRvIII 0.126 121 A 7 1.3472 2.1491 8 0.153 121 D 8 0.6743 0.4179 1 0.149 121 E 8 2.0415 2.6965 8 0.159 121 H 10 0.8611 0.4288 5 0.140 121 C 12 2.1455 2.6443 4 0.116 122 H 1 1.8890 2.5987 4 0.157 122 H 5 0.5943 0.8321 2 0.145 122 F 8 0.6834 0.7715 0 Ensayo y análisis de antígeno limitado El análisis de antígeno limitado es un método que asigna rango por afinidad a los anticuerpos específicos de antígeno presentes en sobrenadantes de cultivo de células B respecto a todos los otros anticuerpos específicos de antígeno. En la presencia de un muy bajo revestimiento de antígeno, solo los anticuerpos con más alta afinidad deberán ser capaces de ligar a cualquier nivel detectable al equilibrio (ver por ejemplo la solicitud de Patente Internacional No. WO 03/48730) OVA-péptido-EGFRvIII se reviste en placas a tres concentraciones; 7.5 ng/ml, 1.5 ng/ml y 0.03 ng/ml durante la noche a 4 grados C en Placas Elisa de 96 pozos. Cada placa se lavó 5 veces con dH20, antes que 50ul de leche al 1 por ciento en PBS con azida de sodio al 0.05 por ciento se agregará a la placa, seguido por 4 µ? del sobrenadante de células B agregada a cada Pozo. Después de 18 horas a temperatura ambiente en un agitador, las placas de nuevo se lavaron 5 veces con d¾0. A cada Pozo se agregan 50ul de HRP-Gt anti-Humano (Fe) a 1 µg/ml. Después de 1 hora a temperatura ambiente, las placas de nuevo se lavaron 5 veces con dH20 y 50 µ.1 de substrato TMB se agregaron a cada Pozo. La reacción se detuvo por la adición de 50 uL de ácido fosfórico 1M a cada pozo y las placas se leyeron a longitud de onda 450nm y los resultados se ilustran en la Tabla 3.7. Tabla 3.7 Los resultados generados del análisis de antígeno limitado se compararon con el OD total obtenido en el fallo de alto antígeno. Un rango relativo de afinidad se realiza al tomar la relación del OD obtenido en el ensayo de antígeno limitado Vs que el obtenido en el ensayo de alto antígeno. Anticuerpos con proporción superior tendrán la más alta afinidad. La Tabla 3.7 ilustra la muestra de sobrenadantes de cultivo de células B que se asignaron rango con base en un ensayo OD de antígeno limitado (para la concentración de revestimiento de antígeno más baja de 0.03 ng/ml) Vs el OD de ensayo de antígeno alto. Ensayo de enlace de célula nativa por FM¾T Sobrenadantes de pozo positivos Elisa OVA-péptido-EGFRvIII se analizaron por su capacidad para ligar a la forma nativa de EGFRvIII expresada en forma estable en células NR6 (células M NR6) (Ver, Batra et al. Epidermal growth factor ligand-independent, unregulated, cell-transforming potential de a naturally occurring human mutant EGFRvIII gene. Cell Growth Differ. 6(10):1251-9 (1995)). Células R 6 M se sembraron a 8000 células por pozo e incubaron durante la noche en placas FMA.T de 96 Pozos. Los medios luego se retiraron dejando 15 µ? en el Pozo. 15 µ? de sobrenadantes de cultivo de células-B se agregan y 15 µ? de IgG Fe Cy5 anti-humano a una concentración final de 1 /¿g/ml agregados a los pozos. Luego se deja sin incubar a 4 grados C por 2 horas. Las células se lavaron con 150 µ? de PBS, y fijaron antes de leer en FMA.T. Los resultados expresaron a una intensidad fluorescente total (Tabla 3.8). mAb 13.1.2 anti-EGFRvIII humano se empelan como un control positivo partiendo de una concentración final de 1 µg/ml y el control negativo fue PK 16.3.1 a la misma concentración. 134 de las 244 muestras probadas ligadas a células NR6M de las cuales 62 tuvieron una fluorescencia total mayor a 8000..6 de estos 134 fueron enlazadores fueron falsos positivos. El mismo tipo de ensayo de enlace nativo se realiza en células NR6 Wt (células NR6 que expresan receptor E6F) (ver Batra et al . Epidermal growth factor ligand-independent, unregulated, cell-transforming potential de a naturally occurring human mutant EGFRvIII gene. Cell Growth Differ. 6(10):1251-9 (1995)) para eliminar el enlace se debe ligar a receptor Wt (Tabla 3.8) . ABX-EGF se emplea como un control positivo y PK 16.3.1 a la misma concentración se emplea como un anticuerpo de control negativo. 3 de los 134 enlazadores NR6 M ligan fuertemente con células NR6 Wt . 190 de los 244 Pozos ligados a péptido EGFRvIII en Elisa también se ligan a la forma nativa en las células. Se dan ejemplos en la Tabla 3.8.
TABLA 3.8 En la Tabla 3.8, el sobrenadante del Pozo 187A4 se identifica como un enlazador Wt y 141C6 fue un falso positivo para enlace de células NR6 M. Los Pozos 129H6 y 183E11 son fuertes enlazadores péptido sin enlace nativo. Ensayo de Internalización Los 60 sobrenadantes de cultivo de células B de enlace nativo superiores se ensayaron adicionalmente por su habilidad para internalizar el receptor. Células NR6 M se sembraron a 8000 células/Pozo en placas FMAT de 96 Pozos e incubaron durante la noche. Se retira medio y 10-15 µ? de sobrenadante de cultivo de célula-B en un volumen total de 30 µ? medio, en duplicado se agrega. A continuación, 15 µ? de anticuerpo secundario (IgG Fab anti-humano 647 SS Alexa a 1.5 ^g/ml concentración final) se agrega y la mezcla se incuba en hielo durante una hora. Un sobrenadante de cultivo de células B irrelevante se emplea para ver el efecto del medio de cultivo. mAb 13.2.1 anti-EGFRvIII humano se emplea como un control positivo que empieza a 1 µg/tl (concentración final) y control negativo fue PK 16.3.1 (anticuerpo IgG2 anti-KLH humano) a la misma concentración. Después de incubación, las células se lavaron con PBS frió, 50 µ? de medio se agrega a todos los Pozos, uno de los duplicados se incuba a 37 grados C por 30 minutos mientras que el otro duplicado permanece en hielo. Después de las incubaciones el medio se retira, 100 µ? de glutationa 50 mM se agrega al conjunto incubado a 37 grados C y 100 µ? de medio frío agregado al otro conjunto, ambos luego se dejan en hielo por una hora. Las células luego se lavan con 100 µ? de PBS frío y luego fijan con paraformaldehído al 1 por ciento y leen en FMA.T. Los resultados se expresaron como por ciento internalizado, calculado como fluorescencia total en la presencia de glutationa/fluorescencia total en la ausencia de glutationa X 100. Información representativa se da en la Tabla 3.9. Tabla 3.9 Sin Con % internalizado, Pozo conteo conteo (glut+/glut~) no. glutationa glutationa X 100 FLlx FLlx 124 C9 1877 1394 74.3 por ciento 124 26465 9959 37.6 por ciento G12 125 Hl 14608 3686 25.2 por ciento 125 2342 1236 52.8 por ciento DIO 127 El 15059 1318 8.7 por ciento 127 B9 12444 7109 57.1 por ciento 127 6623 0 0.0 por ciento Ell Sin Con % internalizado, Pozo costeo conteo (glut+/glut-) no . glutationa glutationa X 100 FLlx FLlx 128 G9 10071 1851 18.4 por ciento 129 A7 27648 8708 31.5 por ciento 130 B4 4558 4354 95.5 por ciento 131 H5 9258 2656 28.7 por ciento 132 D8 35820 13293 37.1 por ciento 133 F9 9773 3621 37.0 por ciento 136 2392 0 0.0 por ciento FIO 137 G6 5104 1021 20.0 por ciento 137 3451 0 0.0 por ciento G10 Ensayos de Placa Hemolítica específico de EGFRvIII Una cantidad de reactivos especializados se requirieron para realizar este ensayo. Estos reactivos se prepararon como sigue . 1. Biotinilación de glóbulos rojos de oveja (SRBC) . SRBCs se almacenan en medio RPMI como un material al 25 por ciento. Un precipitado de células empacadas SRBC de 250 µ? se obtiene por alícuota de 1.0 mi de SRBC a un tubo eppendorf fresco. El SRBC se centrifugó con un pulso de giro a 8000 rpm (6800 rcf) en microcentrífuga, el sobrenadante se retira, el centrifugado se resuspende en 1.0 mi de PBS a pH 8.6, y se repite la centrifugación. El ciclo de lavado se repite 2 veces, luego el precipitado SRBC se transfiere a un tubo falcon de 15 mi y constituye a 5 mi con PBS pH 8.6. En un tubo falcon de 50 mi separado, 2.5 mg de sulfo-biotina HS se agregan a 45 mi de PBS pH 8.6. Una vez que la biotina se disuelve por completo, los 5 mi de SRBCs se agregan y el tubo se gira a RT por una hora. SRBCs se centrifuga a 3000rpm por 5 minutos y se retira el sobrenadante. Los SRBCs biotinilados se transfieren a un tubo eppendorf y lavan 3 veces como con anterioridad pero con PBS pH 7.4 y luego constituyen a 5 mi con medio de células inmunes (RPMI 1640) en un tubo falcon de 15 mi (material B-SRBC al 5 por ciento) . El material se almacena a 4 grados C hasta que se requiera. 2. Revestimiento de streptavidina (SA) de B-SRBC. 1 mi de material B-SRBC al 5 por ciento se transfiere en un tubo eppendorf fresco. Las células B-SRBC se lavan 3 veces como con anterioridad y resuspenden en 1.0 mi de PBS a pH 7.4 para dar una concentración final de 5 por ciento (v/v) . 10 µ? de una solución de material de 10 mg/ml de streptavidina (CalBiochem, San Diego, CA) se agregan y el tubo se mezcla y gira a RT por 20 minutos. Las etapas de lavado se repiten y el SA-SRBC se re-suspende en 1 mi de PBS pH 7.4 (5 por ciento (v/v) ) . 3. Revestimiento de EGFRvIII de SA-SRBC. Los SA- SRBCs se revisten con OVA-péptido-EGFRvIII-biotinilado a 10 /ig/ml, mezclan y giran a RT por 20 minutos. Los SRBC se lava dos veces con 1.0 mi de PBS a pH 7.4 como con anterioridad. Los SRBC revestidos con EGFRvIII se re-suspenden en RPMI (+10 por ciento FCS) a una concentración final de 5 por ciento (v/v) . 4. Determinación de la calidad de EGFRvIIIpéptido-SRBC por inmunofluorescencia (IF) . 10 ¿l de SA-SRBC al 5 por ciento y 10 µ.1 de SRBC revestido con péptido EGFRvIII al 5 por ciento cada uno se agregaron a un tubo eppendorf de 1.5 mi fresco separado que contiene 40 µ? de PBS. Un anticuerpo anti-EGFRvIII humano de control se agrega a cada muestra de SRBCs a 45 /¿g/ml. Los tubos se giraron a RT por 25 minutos, y las células luego se lavaron tres veces con 100 µ? de PBS. Las células se resuspendieron en 50 µ? de PBS e incubaron con 40 mcg/mL de anticuerpo IgG Fe anti humano Gt conjugado con Alexa488 (Molecular Probes, Eugene, OR) . Los tubos se giraron a RT por 25 minutos y luego lavaron con 100 µ? de PBS y las células resuspendieron en 10 µ? de PBS. 10 µ? de las células teñidas se aplicaron sobre un portaobjetos para microscopio de vidrio limpio cubierto con un cubreobjetos de vidrio, observaron bajo luz fluorescente y calificaron en una escala arbitraria de 0-4. 5. Preparación de células de plasma. Los contenidos de un solo Pozo de microcultivo previamente identificado por varios ensayos que contienen un clon de célula B que secreta la inmunoglobulina de interés, que cosecharon. Utilizando un pipetman de 100-1000 µ?, los contenidos del Pozo se recuperaron al agregar 37C RPMI (10 por ciento FCS) . Las células se resuspendieron al pipetear y luego transferir a un tubo eppendorf de 1.5 mi fresco (volumen final aproximado 500-700 µ?) . Las células se centrifugaron en una microcentrífuga a 2500 rpm (660 rcf) por 1 minuto a temperatura ambiente, y luego el tubo se giró 180 grados y centrifugó de nuevo por 1 minuto a 2500 rpm. El medio congelado se retira y las células inmunes se resuspenden en 100 µ? de RPMI (10 por ciento FCS) , luego centrifugan. Este lavado con RPMI (10 por ciento FCS) se repite y las células se resuspenden en 60 µ? de RPMI (10 por ciento FCS) y almacenan en hielo hasta que estén listas para uso. 6. Micromanipulación de células de plasma. Porta objetos de vidrio de 5.08 x 7.62 cm (2 3 inch) se prepararon con anticipación con bordes de silicona y dejaron curar durante la noche a RT. Antes de usar, los portaobjetos se trataron con 5ul aproximados de SigmaCoat (Sigma, Oakville, ON) , frotaron uniformemente sobre superficie de vidrio dejando secar y luego frotaron vigorosamente. A una muestra de 60 µ? de células se agregan 60 µ?, cada una de SRBC revestido con péptido EGPRvIII (material 5 por ciento v/v) , complemento de conejillo de indias 4x (Sigma, Oakville, ON) material de complemento preparado en RPMI (10 por ciento FCS) , y material de suero de mejora 4x (1:150 en RPMI con 10 por ciento FCS) . La mezcla se aplicó por puntos (10-15 µ?) sobre porta objetos preparado y los puntos se cubrieron con aceite de parafina sin diluir. Los portaobjetos se incubaron a 37 grados C por un mínimo de 45 minutos. Las células de plasma especificas de EGFRvIII se identificaron de placas y rescataron por micromanipulación (ver Tabla 3.10). Tabla 3.10 Número total de ID de Número de Célula Sencilla células Pozo sencillas recogidas 1 124 G EGFRvIII -SCX-105-116 (LL) 12 2 Número total de ID de Número de Célula Sencilla células Pozo sencillas recogidas 129 A 7 EGFRvIII -SCX-117-128 (DM) 12 174 F 1 EGFRvIII -SCX-129-137 (DM) 9 EGFRvIII -SCX-138-149 (LL) ; 182 A 5 20 162-169 (OP) 1 EGFRvIII -SCX-170-181 (DM) ; 125 D 20 0 194-201 (LL) EGFRvIII -SCX-182-193 (LL) ; 127 B 9 20 202-209 (OP) 190 D 7 EGFRvIII -SCX-210-229 (LL) 20 130 B 4 EGFRvIII -SCX-230-249 (LL) 20 138 D 2 EGFRvIII -SCX-250-269 (LL) 20 145 C 1 EGFRvIII -SCX-80-92 (DM) 13 1 172 B EGFRvIII -SCX-93-104 (LL) 12 2 187 A 4 EGFRvIII -SCX-270-281 (LL) 12 173 C 1 EGFRvIII -SCX-282-293 (BC) 12 127 E 1 EGFRvIII -SCX-294-305 (LL) 12 1 142 C EGFRvIII -SCX-306-317 (LL) 12 1 141 A 1 EGFRvIII -SCX-318-329 (BC) 12 Número total de ID de Número de Célula Sencilla células Pozo sencillas recogidas 0 132 D 8 EGFRvIII -SCX-330-341 (LL) 12 124 D 4 EGFRvIII -SCX-342-349 (BC) 8 PCR de una sola célula, clonación, expresión, purificación y caracterización de anticuerpos anti-EGFRvIII recombinantes . Los genes que codifican las regiones variables se rescataron por RT-PCR en las células de plasma micromanipuladas sencillas. ARNm se extrajo y se realizó PCR de trancriptasa inversa para generar ADNc. El ADNc que codifica las cadenas pesada y ligera variables se amplificaron específicamente utilizando reacción de cadena polimerasa. La región de cadena pesada variable humana se clonó en un vector de expresión IgGl . Ese vector se generó al clonar el dominio constante de IgGl humano en el sitio de clonación múltiple de pcDNA3. l+/Hygro (Invitrogen, Burlington, ON) . La región de cadena ligera variable humana se clonó en un vector de expresión IgK. Esos vectores se generaron por clonación del dominio constante de IgK humano en el sitio de clonación múltiple de pcDMA.3. l+/Meo (Invitrogen, Burlington, ON) . Los vectores de expresión de cadena ligera y cadena pesada luego se co-lipofectaron en un plato de 60 mm con células 293 de riñon embrional humano 70 por ciento de confluentes y las células transíectadas permitió que secretaran un anticuerpo recombinante con la especificidad idéntica que las células de plasma original por 24 a 72 horas. El sobrenadante (3 mL) se recolectó de las células HEK 293 y la secreción de un anticuerpo intacto se demostró con una ELISA emparedado para detectar específicamente igG humano (Tabla 3.11). Especificidad se estimó a través de enlace del anticuerpo recombinante a EGFRvIII utilizando ELISA (Tabla 3.11). Tabla 3.11 Título mAh Célula # Anticuerpo Enlace ID total antígeno SC- EGFRvIII - 129A7 >1 : 64 >1 : 64 XG1-123/124 SC- EGFRvIII - 138D2 >1 : 64 >1 : 64 XG1-250 SC- EGFRvIII - 174F1 >1:64 >1:64 XG1-131 182A5 SC- EGFRvIII - >1 : 64 1 : 64 Título mAb Célula # Anticuerpo Enlace ID total antígeno XG1-139 SC- EGFRvIII - 190D7 >1:64 >1:64 XG1-211 125D1 SC- EGFRvIII - >1 : 64 >1:64 0 XG2-170 SC- EGFRvIII - 182D5 >1 :64 >1 : 64 XG2-150 141A1 SC- EGFRvIII - 1:64 1:64 0 XG1-318 SC- EGFRvIII - 132D8 >1 : 64 >1:64 XG1-333 SC- EGFRvIII - 12 D4 >1 : 64 >1 : 64 XG1-342 Las pruebas de ELISA de secreción se realizaron como sigue. Para secreción Ab, 2 µg/mL de IgG H+L antihumano cabra y para enlace antígeno, 1.5 µg/ml de proteina de fusión Rab Ig Fe EGFRvIII se reviste en placas de 96 pozos de Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene y se mantiene durante la noche a cuatro grados. Las placas se lavaron cinco veces con d¾0. Anticuerpos recombinantes se titularon 1:2 para 7 pozos a partir del sobrenadante de minilipofección sin diluir. Las placas se lavaron cinco veces con d¾0. Un anticuerpo conjugado HRP específico de IgG Fe anti-huraano cabra se agrega a una configuración final de 1 µg/mL por 1 hora a RT para las placas de secreción y de placas de enlace detectadas con 1 µ /p?1 de Rb anti Hu Fe por 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cinco veces con d¾0. Las placas se revelaron con la adición de TMB por 30 minutos y la ELISA se detuvo por la adición de ácido fosfórico 1 M. Cada placa de ELISA se analizó para determinar la densidad óptica de cada pozo a 450 nm. Secuenciado y análisis de secuencia Los ADNcs de cadena pesada y cadena ligera clonados se secuenciaron en ambas direcciones y analizaron para determinar la derivación de secuencia de línea germinal de los anticuerpos e identificar cambios de la secuencia de línea germinal. Estas secuencias se proporcionan en las Figuras 3A-3K y (SEQ ID NO: 34-55) . Una comparación de cada una de las secuencias de cadena pesada y ligera y las secuencias de línea germinal de las cuales se derivan, se proporciona en las Figuras 4-7. Además, la secuencia del anticuerpo 13.1.2 derivado de hibridoma se compara con su secuencia de línea germinal en las Figuras 4 y 5. Como se apreciará de la presente discusión, cada uno del anticuerpo 131 y el anticuerpo 13.1.2 posee muy altas afinidades para EGFRvIII, se internalizan bien por células, y parecen altamente efectivos en exterminio celular cuando se conjugan con la toxina. De manera intrigante, cada uno de los anticuerpos a pesar de haber sido generado en diferentes inmunizaciones de ratones XenoMouse, y utilizando tecnologías diferentes, cada uno se deriva de genes de línea germinal muy similares . Con base en trabajo de cartografía de epítopo (aquí descrito) , cada uno de los anticuerpos sin embargo parece ligar a epítopos ligeramente diferentes en la molécula EGFRvIII y tienen residuos ligeramente diferentes en EGFRvIII que son esenciales para ligar. Estos resultados indican que la utilización de gen de línea germinal es de importancia para la generación de terapéuticos de anticuerpo que hacen diana en EGFRvIII y que pequeños cambios pueden modificar el enlace y efectos del anticuerpo en formas que permiten adicionar diseño de anticuerpo y otros terapéuticos con base en estos hallazgos estructurales. Enlace de mAbs Anti-EGFRvIII con EGFRvIII nativo expresado en células En este ejemplo, el enlace de anticuerpos anti-EGFRvIII a células NR6 M se midió. Específicamente, son sobrenadantes no cuantificados de anticuerpos recombinantes IgGl derivados de XenoMax se ensayaron por su habilidad para ligar a células NR6 M y NR6 WT . Las células se sembraron a 10000 / pozo e incubaron durante la noche a 37 grados C en placas de 96 pozos FMAT. Media se retira y 40 µ? de sobrenadante mini lipo (titulado descendente) se agregó. Las células se incuban en hielo por 1 hora. Los anticuerpos EGFRvIII 13.1.2 humanos y anticuerpos ABX EGF (E7.6.3, Patente de los E.U.A. Número 6,235,883) se agregaron como controles positivos. El anticuerpo PK 16.3.1 se emplea como un control negativo. Las células se lavaron con PBS frío, anticuerpos secundario se agregó (IgG Fe antihumano SS Alexa) a 1 µg/ml, 40 µ?/???? e incuban en hielo por 1 hora. Las células luego se lavan con PBS frió y fijan y leen por FMAT. Todos los anticuerpos se probaron por especificidad para enlace por el contrario supervisión contra células NR6 WT. Purificación de Anticuerpos Anti-EGFRvIII Recombinantes Para producción a mayor escala, vectores de expresión de cadena pesada y ligera (2.5 µ? de cada cadena /plato) se lipofectaron en 10 platos de 100 mm que fueron 70 por ciento confluentes con células HEK 293. Las células transíectadas se incubaron a 37 grados C por 4 días, el sobrenadante (6 mL) se cosechó y reemplazó con 6 mL de medio fresco. El día 7, el sobrenadante se retiró y recolectó con cosecha inicial (120 mL total de 10 platos) . Cada anticuerpo se purificó del sobrenadante utilizando cromatografía de afinidad de proteína-A Sepharose (Amershara Biosciences, Piscataway, NJ) (1 mL) . El anticuerpo se eluye de la columna de proteína-A con 500 mcL de Glicina 0.1 M pH 2.5. El eluato se dializa en PBS, pH 7.4 y filtra-esteriliza . El anticuerpo se analizó por SDS-PAGE no reductor para estimar pureza y rendimiento. La concentración también se midió por análisis UV a OD 250. Internalización de receptor EGFRvIII por mAbs anti-EGFRvIII recombinante Anticuerpos recombinantes IgGl derivados de XenoMax se expresaron, purificaron y cuantificaron como se describió previamente. Anticuerpos fueron adicionalmente ensayados por su habilidad para internalizar el receptor EGFRvIII en células NR6 M. 250,000 células NR6 M se incubaron con anticuerpo primario (SC95, SC131, SC133, SC139, SC150, SC170, SC211, SC230, SC250 y 13.1.2 humano como control) a 0.25 /¿g/ml, 7 minutos en hielo y placa con fondo v de 96 pozos en triplicado. Las células se lavaron con FCS al 10 por ciento frío en PBS y anticuerpo secundario (IgG Fab antihumano SS Alexa) a 3 µg/ml de Fab se agrega e incuba por 7 minutos en hielo. Las células se lavaron con FCS al 10 por ciento frío en PBS una vez y luego resuspendieron en medio frío. A continuación, dos juegos del triplicado se incubaron a 37 grados C y el conjunto restante se incubó a 4 grados C por 1 hora. Después de que las células incubaron a 4 grados C y un conjunto de las células se incubó a 37 grados C se trataron con glutationa (como se mencionó previamente) por 1 hora en hielo. Luego, las células se lavaron y resuspendieron en 100 µ? de FCS al 1 por ciento frío en PBS y analizaron por FACS. El por ciento de internalización se calcula a partir FACS [(promedio a 37 grados C con glutationa -promedio a 4 grados C con glutationa) / (promedio a 37 grados C sin glutationa - promedio a 4 grados C con glutationa) ] . NA significa que un análisis FACS se realizó pero los datos no se proporcionan en la Tabla 3.12. Tabla 3.12 Promedio Geométrico FACS Sin Con glutaglutaCon Por ciento de mAb tiona a tiona a glutationa internali¬ 37 37 a 4 grados zación grados grados C C C 13.1 82.5 por 22.12 19.19 5.38 .2 ciento 72.4 por sc95 22.56 17.75 5.13 ciento scl3 NA NA NA 72 por ciento 1 scl3 72.2 por 23.39 18.63 6.24 3 ciento scl3 80.8 por 22.64 19.23 4.88 9 ciento scl5 20.0 por 20.29 7.78 4.66 0 ciento SC17 20.1 por 19.97 7.75 4.67 0 ciento sc21 21.6 por 20.76 8.23 4.78 1 ciento SC23 18.8 por 20.68 7.97 5.02 0 ciento sc25 16.7 por 24.13 8.07 4.84 0 ciento 13.1.2 es un anticuerpo que se generó a través de generación de hibridoma (Ejemplo 2) que se dirige contra el epitopo EGFRvIII previamente que se utilizó como control positivo en este experimento. Estos resultados en la Tabla 3.12 demuestran la presencia de dos subconjuntos de anticuerpos, aquellos que se internalizan eficientemente (70-80 por ciento) y aquellos que no (22 por ciento o menos) . Ej emplo 4 Cartografía de Epítopo de Anticuerpos Anti-EGFRvIII Humanos A fin de determinar los epítopos a los cuales ciertos de los anticuerpos de la presente invención se ligan, los epítopos de anticuerpos monoclonales 6 humanos y 3 murinos (mabs) contra EGFRvIII se cartografiaron utilizando péptidos sintéticos derivados de las secuencias de péptidos EGFRvIII específicas. Los anticuerpos cartografiados fueron el anticuerpo 13.1.2 anti-EGFRvIII derivado de hibridoma humano, los anticuerpos 131, 139, 250, 095, y 211 anti-EGFRvIII derivados de XenoMax humano y los anticuerpos H10, Y10, y B9 anti-EGFRvIII murino (de Dr. D. Bigner, Duke University) . El enfoque que se empleó fue una colección ordenada SPOTs a la medida (Sigma Genosys) para estudiar la interacción molecular de los anticuerpos anti-EGFrVIII humanos con su epítopo péptido. Tecnología SPOTs se basa en la síntesis de fases sólidas de péptidos en un formato adecuado para el análisis sistemático de epítopos de anticuerpos. Síntesis de oligopéptidos ordenados a la medida esta comercialmente disponible de Sigma-Genosys . Una colección ordenada de péptidos de oligopéptidos de superposición derivados de la secuencia de aminoácidos de la variante EGFr VIII fue ordenada de Sigma-Genosys. Una serie de nueve péptidos 12-mero se sintetizaron como puntos en hojas de membrana de polipropileno. La colección ordenada de péptidos extiende residuos 1-20 de la secuencia de EGFrVIII que representa la deleción de los aminoácidos 6-273 en el dominio extracelular de tEGFr, y la generación de un residuo glicina (G) en el punto de unión. Cada péptido consecutivo se desplazó por 1 residuo del previo, dando una biblioteca superpuesta encajada de oligopéptidos en colección ordenada. La membrana que transporta los 9 péptidos se reaccionó con 9 diferentes anticuerpos anti-EGFrVIII (1 g/ml) . El enlace de los mAbs a los péptidos ligados a membrana se estimó por un ensayo inmunosorbente enlazado con enzima utilizando anticuerpo secundario conjugado con HRP seguido por quimioluminiscencia mejorada (ECL) . La colección ordenada utilizada se ilustra en la Tabla 4.1. Tabla 4.1 SECUENCIA DE COLECCIÓN ORDENADA DE SPOT: 1. ALEEKKGNYWT (SEQ ID NO : 72) 2. LEEKKGNYWTD (SEQ ID NO: 59) 3. EEKKG YWTDH (SEQ ID NO: 73) 4. EKKG YWTDHG (SEQ ID NO: 74) 5. KKG YWTDHGS (SEQ ID NO: 75) 6. KGNYWTDHGSC (SEQ ID NO: 76) 7. GNYWTDHGSCV (SEQ ID NO: 77) 8. NYWTDHGSCVR (SEQ ID NO: 78) 9. YWTDHGSCVRA (SEQ ID NO: 79) Además, epítopos funcionales se cartografiaron por exploración de Alanina combinatoria. En este proceso, una estrategia de exploración de Alanina combinatoria se utilizó para identificar aminoácidos en el péptido EGFrVIII necesarios para interacción con mAbs anti-EGFRvIII . Para lograr esto, un segundo conjunto de colecciones ordenadas SPOTs se ordenó para exploración de Alanina. Un panel de péptidos variantes con sustituciones alanina en cada uno de los 12 residuos se exploró como con anterioridad. La Spot #1, secuencia sin mutar, es un control positivo para enlace de anticuerpo. La colección ordenada utilizada se ilustra en la Tabla 4.2. Tabla 4.2 Colección Ordenada De Exploración De Alanina: 1. LEEKKGNYWTD (SEQ ID NO: -59) 2. AEEKKGNYWTD (SEQ ID NO : 80) 3. LAEKKGNYWTD (SEQ ID NO: 81) 4. LEAKKG YWTD (SEQ ID NO: 82) 5. LEEAKGNYWTD (SEQ ID MO: 83) 6. LEEKAG YWTD (SEQ ID NO: 84) 7. LEEKKANYWTD (SEQ ID NO: 85) 8. LEEKKGAYWTD (SEQ ID NO: 86) 9. LEEKKGNAWTD (SEQ ID NO: 87) 10. LEEKKG YAVTD (SEQ ID NO: 88) 11. LEEKKGNYVATD (SEQ ID MO: 89) 12. LEEKKGNYWAD (SEQ ID NO: 90) 13. LEEKKG YWTA (SEQ ID NO: 91) Epltopos de todos los 9 mAbs al EGFrVIII humano se cartografiaron e identificaron por el procedimiento SPOTs . Todos los 9 anticuerpos fueron reactivos con los péptidos. Los resultados obtenidos con 3 anticuerpos murinos y 6 anticuerpos humanos derivados de ratón XenoMouse se presentan en la Tabla 4.3. Residuos resaltados son aquellos que imitamos alanina y abrogaron enlace por anticuerpo de prueba. Estos por lo tanto son residuos relevantes para enlace con el anticuerpo.
Tabla 4.3 Los aminoácidos sombreados ilustrados en la Tabla 4.3 son los residuos más relevantes en el epítopo para el reconocimiento de anticuerpos. Las longitudes mínimas de epítopo de todos los diez mAbs se cartografiaron en forma precisa utilizando péptidos de secuencia superpuestas, y la tolerancia de mAb se liga con epítopos mutados se determinó por reemplazo sistemático de cada residuo en el epítopo con Alanina. En la Tabla 4.4, se resumen características adicionales de los anticuerpos. Específicamente, un subconjunto de los anticuerpos se probó por su enlace a lizados de líneas celulares de tumor en placas Western de electroforésis de gel de poliacrilamida ya sea bajo condiciones sin reducción o con reducción. Proteína recombinante purificada también se incluye. Anticuerpos que ligan en ambas condiciones de reducción y sin reducción sugieren que el epítopo es lineal . Identificaciones de muestra: EGFRvIII - la proteína de fusión Fe de conejo H1477 - línea celular de tumor humano H80 transfectada con construcción de expresión EGFRvIII. Estas células expresan tanto EGFR como EGFRvIII. EGFR - proteína EGFR de tipo silvestre purificada A431 - línea celular de tumor humano que expresa solo EGFR de tipo silvestre A549 - línea celular del tumor humano que expresa solo EGFR de tipo silvestre H80 - línea celular de tumor humano que expresa solo EGFR de tipo silvestre EGFR Biacore - mAbs se probaron en Biacore para ligar a EGFR purificado como una prueba altamente sensible por especificidad TABLA 4.4 Los resultados mostraron que la mayoría de estos mAbs tienen esencialmente la misma especificidad de enlace, se mostró que siete de los mAbs ligan específicamente a la variante EGFrVIII, mientras que 2 mAbs reaccionan en forma cruzada con EGFr de tipo silvestre (murino H10 y humano 211) en técnicas Western de proteína purificada y enlizado de células A431. Hay que notar sin embargo que mientras que el anticuerpo 211 liga tanto a EGFRvIII nativo como purificado reducido en técnicas Western, liga ligeramente más fuerte a la proteína no reducida. En pruebas contra un lizado de células A431, el anticuerpo 211 liga fuertemente a una banda del tamaño de EGFR tipo silvestre, en la muestra no reducida pero no hay señal en la muestra reducida. Esto sugiere que el enlace del anticuerpo 211 se debe a un epitopo conformacional presente en EGFR de tipo silvestre y representa en forma diferente en la variante EGFRvIII . Los epítopos de 5 de los mAbs están dentro de los residuos 2-12 que se extiende en el residuo glicina específico de variante EGFRvIII, mientras que el epitopo de 4 de los mAbs (incluyendo H10 y 211) se extienden los residuos 7-16 que son comunes a el EGFRvIII y EGFr de tipo silvestre. El anticuerpo 131 liga a A431 y las células A549 en FACS. Estas células son aparentemente negativas para expresión de EGFRvIII mientras que positivas para expresión de EGFR. El anticuerpo 131 no liga a EGFR no reducido o no reducido purificado o a lisados reducidos o no reducidos de células A43 y A549 en esterns sugiriendo que el anticuerpo 131 puede ligar a una variante de EGFR expresada en la superficie celular de algunas líneas de células de tumor humano. Esta variante sería sensible a desnaturalización. EJEMPLO 5 Caracterización de Especificidad de Anticuerpos Anti- EGFRvIII in Vitro La especificidad de los anticuerpos purificados se evaluó al realizar análisis FACS en células NR6 que se transíectaron ya sea con cualquiera de EGFR tipo silvestre o mutante. Las células se incubaron en hielo con 5 //g/ml del anticuerpo respectivo por 1 hora, lavaron en amortiguador FACs y subsecuentemente incubaron con IgG antihumano cabra conjugado con PE. EJEMPLO 6 Reactividad Cruzada con EGFR Amplificado Anticuerpos dirigidos a receptores EGF variantes se han mostrado que reaccionan en forma cruzada con subconjuntos de receptores de tipo silvestre en células en donde ha ocurrido amplificación genética (Johns et al., Int. J. Cáncer. 98: 398, 2002). Para determinar si los anticuerpos EGFRvIII humano identificados tenían propiedades similares, se probaron por su habilidad para reconocer receptores EGF de tipo silvestre en una variedad de células en cultivo. Se incubaron anticuerpos ¦ con las lineas celulares indicadas a 4 grados C. Después de lavar en amortiguador FACS, un anticuerpo secundario conjugado con fioeritrina se agregó y la incubación se continuó. Todas las lineas celulares analizadas se expresaron EGFR de tipo silvestre. Un subconjunto de EGFRs tipo silvestre se reconoce por el anticuerpo XG1-131 tanto en células A431 como SF-539 pero no en células A498 o SKRC-52. Otro anticuerpo EGFRvIII, 13.1.2, no reconoce ese subconjunto de EGFRs de tipo silvestre. Cuando se consideran juntos estos datos indican que solo un subconjunto de anticuerpos dirigido al EGFRvIII mutante son capaces de reconocer EGFRs de tipo silvestre en la superficie de la célula. La capacidad de ciertos anticuerpos dirigidos a EGFRvIII mutante para reconocer una subpoblación de receptores EGF de tipo silvestre no depende de la densidad EGFR total sino probablemente representa un epítope de conformación novedoso que es único para las células de tumor. La capacidad de anticuerpos dirigidos a EGFRvIII a reaccionar en forma cruzada con sus poblaciones de receptor de tipo silvestre puede determinarse tanto por el epítopo específico dentro de la unión del receptor mutante como la afinidad del anticuerpo para este epítopo único (ver los resultados de la sección de determinación de afinidad y cartografía de epítopo aquí) . EJEMPLO 7 Caracterización de Especificidad de Anticuerpos Anti- EGFRvIII in Vitro: Enlace de los Anticuerpos a Líneas Celulares La especificidad de los anticuerpos purificados se evalúa al realizar análisis FACS en un panel de lineas celulares. H80, una línea de glioblastoma humano y H1477 (H80-EGFRvIII) que expresa altos niveles de EGFRvIII, A431, una linea de carcinoma epidermóide humano, y A549, una línea celular de carcinoma de pulmón humano se emplearon como las líneas celulares. Todas las líneas celulares fueron del doctor Bigner excepto A431 y A549, que fueron de ATCC (Rockville, MD, E.U.A.). Las células se incubaron en hielo con 10 /íg/ml del anticuerpo respectivo para 30 minutos, lavaron en amortiguador FACS y subsecuentemente se incubaron con IgG antihumano cabra conjugado con PE de Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, E.U.A.). En las Figuras 9A-9L y 10A-10D, el histograma oscurecido indica células teñidas con un IgG irrelevante, el histograma resaltado o blanco, representa la tinción de los anticuerpos relevantes. Los anticuerpos 13.1.2, 131 y 139 anti-EGFRvIII ligan a la proteína EGFRvIII en las líneas celulares transfectadas . Una gráfica que resume algunos de los resultados se exhibe en las Figuras 9M-9P. Anticuerpos dirigidos a receptores EGF variantes se han mostrado que reaccionan en forma cruzada con subconjuntos de receptores EGF de tipo silvestre en células en donde la amplificación de genes ha ocurrido (Johns et al., Int. J. Cáncer. 98: 398, 2002). En este ejemplo, A431 y A549 teñidos por XG1-131 y XG1-139. La Figura 10B y la Figura 10C muestran que 131 y 139 tienen cierta reactividad cruzada con EGFR de tipo silvestre en lugar de solo reconocer un subconjunto de población en las lineas H80, A431 y ?549. Sin embargo, esta reactividad cruzada solo esta a 10 por ciento del nivel de ABX-EGF (E7.6.3) de extinción en estas lineas celulares. Los resultados se proporcionan en las Figuras 9A-9P y 10A-10D. Anticuerpos dirigidos a antígenos de superficie celular pueden emplearse como vehículos de suministro que transportan específicamente drogas o toxinas en células. Si el anticuerpo estimula la internalización del antígeno, la droga o toxina puede resultar en muerte de la célula, probablemente después de que la droga o toxina se escinde del anticuerpo. Dicho mecanismo puede ser utilizado para exterminar específicamente células de tumor en mamíferos y en pacientes. Una forma de seleccionar anticuerpos que pueden suministrar drogas a células es a través de ensayos de citotoxicidad secundaria. En estos ensayos, el anticuerpo primario liga a la superficie celular y un anticuerpo secundario que se conjuga con una droga o toxina se agrega. Si el anticuerpo primario estimula internalización de antígeno, el anticuerpo secundario se co-internalizará y división de la droga o toxina resulta en exterminio celular. EJEMPLO 8 Ensayos de Citotoxicidad Secundaria En los siguientes estudios, anticuerpos específicos de EGFRvIII, se emplearon para dirigir anticuerpos secundarios conjugados con toxina en linea celular de glioblastoma (H80) y línea celular de glioblastoma tranfectado con EGFRvIII (H1477) . IgG antihumano ratón (cat # 555784) de Pharmingen (BD Biosciences Pharmingen) se conjugaron con AEFP de toxinas (Seattle Genetics, Inc.) y maytansina (DM1, Immunogenlnc . ) para generar mah-AEFP (IgG-AEFP antihumano murino y mah-DMl (IgG-DMl antihumano murino) . Un IgG antihumano cabra conjugado con saporina, Hum-ZAP (TM, cat # IT-22-250, IgG-saporina antihumano cabra purificada por afinidad) es de Advanced Targeting Systems (San Diego, CA,U. S. A. ) . Células H80 y H1477 se revistieron en placas de 96 pozos con 1000 células en 100 /iL de medio de crecimiento por pozo. Después de 24 horas, anticuerpos primarios se mezclaron con anticuerpos secundarios conjugados a l: 3, diluyeron en serie a l: 5 sobre 6 pozos. 100 /L de mezclas de anticuerpo secundario de toxina y primario diluidas se agregaron en los pozos de células a concentraciones de partida finales de O.lllg/ml de anticuerpos primarios y 0. 3 //g/ml de anticuerpos secundarios. La placa se dejó que continuara para cultivar por tres días. El cuatro día, reactivos CellTiter-Glo (cat #G7571) de Promega (Madison, WI , U. S. A.) se agregaron y se leyó luminiscencia. Las Figuras HA- 111, 12A-12I, y 13A-13I demuestran los resultados de este experimento. Destrucción específica de antígeno mediada por Hum-ZAP en H1477 (círculo relleno) comparado con H80 (cuadrado relleno) en la mayoría de mAbs específicos de EGFRvIII se probaron. AbsXGl-131 y XG1-139 generaron destrucciones secundarias específicas de antígeno con mah-AEFP, en una menor proporción con mah-DM1. Entre los anticuerpos probados, XG1-131 realizó al menos un log mejor que 13.1.2, XG1-095,XG1-139, XG1-150, XG1-170, XG1-250 y XG1- 211. IgGl se empleó como un control negativo y células positivas de antígeno (H1477) se compararon con células negativas de antígeno (H80) . La cantidad de exterminio específico requerido puede variar dependiendo del uso particular. En una modalidad, cualquier reducción en células cancerosas posibles es suficiente. Por ejemplo, una reducción de 0-1, 1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, GO-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, o 100 por ciento de las células objetivo o diana será suficiente. En otra modalidad, la reducción deseada en el número de células diana también es una función de la letalidad no específica de la combinación de anticuerpo. Por ejemplo, combinaciones de anticuerpo/toxina que solo tienen un 10 por ciento de disminución en el número de células diana puede ser suficiente, si hay muy poca letalidad y blanco o diana no especifico por el anticuerpo. Por ejemplo, la combinación de toxina anticuerpo extermina menos de 10 por ciento de una población no objetivo o diana. De nuevo, la cantidad particular dependerá de la necesidad y situación particulares. Son particularmente útiles anticuerpos que son altamente selectivos para una célula objetivo y ligan bien con la célula objetivo, o proteínas asociadas con la célula. En una modalidad, el objetivo es la proteína EGFRvIII, o su fragmento. En una modalidad, anticuerpos que son humanos o humanizados, eficientes a internalizar, específicos a la proteína EGFRvIII o sus fragmentos, se asocian estrechamente con la proteína o fragmento EGFRvIII y se asocian con una toxina efectiva, se ilustran de estos ejemplos. EJEMPLO 9 Ensayos Clonogénicos de Citotoxicidad Secundaria Además de los ensayos de citotoxicidad secundaria, anticuerpos específicos de EGFRvIII se probaron en los ensayos clonogénicos . Anticuerpos EGFRvIII específicos dirigen anticuerpos secundarios conjugados con toxina en línea celular de glioblastoma transfectada con EGFRvIII (H1477) , las toxinas se liberan dentro de las células y eventualmente reducen la habilidad de las células para proliferar formando colonias. De esta manera, la aplicación de estas toxinas -anticuerpo EGFRvIII genera números reducidos de ciónos cuando las células se re-revisten después de tratamientos de anticuerpo a toxina primaria y secundaria. En este ejemplo, células H80 y H1477 se revistieron en placas de 6 pozos a 30,000 células por pozo e incubaron durante la noche. El anticuerpo primario y anticuerpo toxina secundario se mezclaron en una proporción 1:3. De esta manera, la mezcla A se agrega en los pozos adecuados a una concentración final de anticuerpo primario a 0.5 µg/ml y anticuerpo de toxina secundario a 1.5 µg/tal. Esto se incubó a 37 grados C durante la noche. Después de incubar, la mezcla de toxina se descarta adecuadamente y las células se desprenden de los pozos con solución de tripsina IX. Las células se contaron y revistieron a 200 células por pozo en nuevas placas de 6 pozos. Pozos triplicados se revistieron por cada grupo de tratamiento. Estas placas se incubaron en una incubadora a 37 grados C por 2-3 semanas, hasta que las colonias se formaron y pudieron identificarse a simple vista o bajo el microscopio. El medio se aspiró y azul de metileno 5M en metanol se agrega por una hora.
La placa se enjuaga en agua y las colonias se contaron. La Figura 14A y la Figura 14B muestran los resultados de este experimento. Como puede verse, se probó formación de colonias inhibida por anticuerpos toxina secundaria mab-AEFP con los tres anticuerpos EGFRvIII . EJEMPLO 10 Anticuerpo anti-EGFRvIII (13.1.2) conjugados directos en los ensayos de citotoxicidad. Mayor evidencia que un anticuerpo es capaz de suministrar una droga a células de tumor se proporciona por conjugación directa del anticuerpo con una droga citotóxica. En el siguiente ejemplo, anticuerpo 13.1.2 EGFRvIII se conjuga directamente con conjugados en E MMAE y AEFP con enlazadores péptido (ambos MMAE y AEFP están disponibles de Seattle Genetics y describen anteriormente) y maytansina (DM1) se conjuga con un enlazador tiol (DM1 está disponible de Immunogen y descrito anteriormente) . Al agregar el conjugado con células que expresan el antigeno EGFRvIII, H1477, se observa citotoxicidad específica. Células que no expresan el antígeno, H80, solo se exterminaron cuando se exponen a muy altas concentraciones del anticuerpo. Resultados de este experimento se ilustran en las FIGs. 15A-15C. Conjugado directo de los anticuerpos EGFRvIII con las drogas o toxinas es un método particularmente ventajoso para uso terapéutico. De esta manera, este experimento inicial mostró que dichos conjugados resultan en exterminio específico de las células que expresan EGFRvIII. EJEMPLO 11 Caracterización de anticuerpos anti-EGFRvIII in vivo. Un método opcional para determinar si un anticuerpo es capaz de suministrar una droga citotóxica a una célula es evaluar el efecto del anticuerpo conjugado en el crecimiento de tumores humanos in vivo. Este ejemplo presenta dicho método. Células de glioblastoma H1477 se cultivaron in vitro, cosecharon por tripsinación y subsecuentemente incrustaron en Matrigel como se describe a continuación. Cinco millones de células se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos hembra y se dejó que desarrollaran tumores hasta que alcanzaron un tamaño de aproximadamente 0.5 cm3. En este momento, los animales se distribuyeron aleatoriamente en grupos y fue iniciado el tratamiento con la concentración indicada del anticuerpo conjugado intravenosamente cada 4 días. Los resultados de la figura 16 demuestran que el anticuerpo 13.1.2 puede provocar regresión de tumores de glioblastoma cuando se conjugan con maytansina (dEGFR-DM1) o auristatina E (dEGFR-????) . Si el anticuerpo se administra con una cantidad equivalente de droga no conjugada (Grupo 2) no hay efecto en crecimiento de tumor demostrando que el blanco de la célula de tumor in vivo requiere el conjugado de anticuerpo con la toxina. El modelo de animal empleado anteriormente se desarrolló al inyectar xenoinjertos de célula H1477 en ratones desnudos. Diversas cantidades de las células se inyectaron con o sin Matrigel en ratones desnudos nu/nu de 8 semanas de edad, y se analizó el implante de tumor con los días. De este análisis, el número de células que permiten un tumor de tamaño apropiado se identifica como 5 millones de células en Matrigel por aproximadamente 22 días. El grupo G8 se incluye como un control para mostrar que el exterminio fue específico de anticuerpos . El grupo G7 se incluye como un control negativo. De esta manera, se desarrolla un protocolo para el estudio de toxina como sigue : Día 1: implante de tumor de 5 millones de células en MATRIGEL en ratones desnudos nu/nu de 8 semanas dé edad. Día 22: tratamientos de pro-droga anticuerpo cada 4 días, mediante I.V., como se muestra en la tabla 11.1. Tabla 11.1 Grupo Número Tratamiento de ratones Gl 8 13.1.2-DMI 250 ig cada 4 días, vía I.V.
Grupo Número Tratamiento de ratones G2 8 13.1.2 -DMI 75 /¿g cada 4 días, vía I.V.
G3 9 13.1.2 -???? 75 ^g cada 4 días, vía I.V.
G4 8 13.1.2-MMAE 250 µg cada 4 días, vía I.V.
G5 9 13.1.2-AEFP 75 ^g cada 4 días, vía I.V.
G6 8 13.1.2-AEFP 250 µg cada 4 días, vía I.V.
G7 8 PBS cada 4 días, vía I.V. G8 9 13.1.2- (sin conjugar) 250 µg + Maytansina 4 ¿ug Los resultados se ilustran en la Figura 16 con las flechas que indican la adición de droga. Los grupos Gl, G6 y G4 muestran exterminio efectivo. El grupo G3 mostró una cantidad menor de exterminio. Los grupos G8 y G7 no mostraron exterminio. Cierta toxicidad puede haberse observado en el grupo vc-AEFP de alta dosis. Estos animales recibieron dos tratamientos a 250 ^g y un tratamiento a 125 µg . EJEMPLO 12 Expresión de EGFRvIII en Tumores de Humano/Pacientes de Cáncer La expresión de EGFRvIII en tumores humanos se determina por función de secciones de tej ido congelado de una variedad de pacientes de cáncer con una combinación de dos anticuerpos monoclonales murinos (B9, IgGl y Y10, IgG2 (Dr. Bigner, Duke University) ) que se conoce y ligan específicamente con EGFRvIII. Las mismas secciones se tiñeron con anticuerpos de control apareados de isotipo. Un compendio de los resultados de extinción obtenidos de todas las muestras de pacientes se presenta en la Tabla 12.1. TABLA 12.1 EGFRvIII>+: incluye todos los tumores que expresan EGFRvIII EGFRvIII>++: incluyen solo aquellos tumores que expresan al menos 10 % o más de EGFRvIII La expresión se encontró primordialmente en la membrana celular y/o citoplasma. Números significantes de especímenes de cáncer de pecho (31 por ciento) , NSCL (47 por ciento) , y cabeza y cuello (42 por ciento) tiñeron en forma positiva para EGFRvIII . En ciertas instancias, a fin de obtener una tinsión IHC de alta calidad, el uso de los anticuerpos puede ser mejor que el uso de un anticuerpo. Especímenes del tejido congelado fueron superiores sobre tejidos fijos. Como apreciará una persona con destreza en la especialidad, puede ser ventajoso el probar pacientes antes de utilizar anticuerpos terapéuticos para asegurar que el tumor que se trata exprese EGFRvIII . EJEMPLO 13 Caracterización de Anticuerpos Anti-EGFRvIII In vivo El método del Ejemplo 11 se utilizará para tratar cáncer de pulmón y gliomas. Esto se examinará ampliamente al producir modelos de animales. Modelos de animales para glioblastoma y cáncer de pulmón se desarrollan como siguen: células de cáncer de pulmón que expresan wt-EGFR se transfectan con EGFRvIII. Las células se inyectan en los pulmones de ratones nu/nu y se deja que progresen los tumores a una etapa comparable a la anterior. Conjugados anti-EGFRvIII luego se inyectan intravenosamente como con anterioridad cada 1 a 10 días según se requiera. El tamaño y prevención o supresión de crecimiento continuo de estas células de cáncer luego se supervisará para determinar la efectividad de estos anticuerpos anti-EGFRvIII y combinaciones de anticuerpo-toxina. Como se aprecia por una persona con destreza en la técnica, esto puede hacerse para cualquiera de los anticuerpos aquí descritos. EJEMPLO 14 Caracterización Funcional de Epítopos por Análisis de Sustitución A fin de resolver adicionalmente la identidad de aquellos residuos de aminoácidos que son indispensables para ligar dentro del epítopo EGFRvIII, análisis de sustitución de los aminoácidos en los péptidos de epítopos realizaron. El punto de partida fue la secuencia que se deriva del Ejemplo 4, LEEKKG YWTD (SEQ ID NO 59) . En este ejemplo, cada aminoácido del epítopo cartografiado se sustituye uno-a-la-vez por todos los 20 L-aminoácidos, de esta manera todos los análogos de sustitución del sitio sencillo posibles se sintetizaron y supervisaron para proporcionar información detallada del modo de enlace de péptido. Patrones de sustitución discretos se identificaron para mAbs 131 y 13.1.2. Los resultados de las sustituciones se resumen en la Tabla 14.1.
Parece que para residuos mAb 13.1.2, 5 son importantes para enlace (negritas) , mientras que solo 4 residuos son esenciales para enlace de mAb 131. El resto de los residuos se reemplaza por diversos aminoácidos sin perilla de enlace significante. Aunque los epítopos de 131 y 13.1.2 son idénticos por secuencia y longitud, el patrón de enlace por cada uno aparece diferente. El enlace de mAb 131 es fuertemente dependiente de los residuos EKNY (SEQ ID NO: 60) . Por otra parte, los datos revelan que los residuos EEKGN (SEQ ID NO: 61) están involucrados en enlace de mAb 13.1.2. Ejemplo 15 Transposion de Secuencias de Cadena Mabs Cadenas pesadas y ligeras de mAbs 131 y 13.1.2 tuvieron transposiciones transitorias de secuencias y transfectaron transitoriamente en células 293T. Setenta y dos horas después los sobrenadantes se recolectaron y ensayaron por secreción y enlace a antígeno EGFrVIII por ELISA. Los resultados demuestran que anticuerpos derivados de la expresión de cadena pesada 131 con cadena de capa a 13.1.2 y viceversa se expresaron bien pero la actividad de enlace se redujo por 75 por ciento, probablemente debido al patrón de enlace diferente de estos dos mAbs al antígeno EGFrVIII (no se muestran datos) . Esto demuestra la diferencia entre los dos paratopos de los mAbs 131 y 13.1.2, de nuevo sugiriendo que las características estructurales del epítopo seleccionado entre los dos mAbs son diferentes . EJEMPLO 16 Modelado Molecular de 131 y su Parátopo Este ej emplo demuestra como pueden generarse estructuras tridimensionales por las proteínas de las modalidades. El modelo de estructura tridimensional de la región variable del anticuerpo 131 se genera a través de un enfoque de modelación de homología utilizando el paquete de modelación InsightlI de Accelrys (San Diego, CA) . El modelo se construyó a partir de las secuencias de región variables descritas a continuación, Tabla 16.1. La numeración de residuo empieza con los aminoácidos de cadena ligera y continua a los aminoácidos de cadena pesada. Tabla 16.1 Región variable de cadena ligera DTVMTQTPLSSHVTLGQPASISC (SEQ ID NO : 100) RSSQSLVHSDGNTYLS (CDR1) (SEQ ID NO: 101) WLQQRPGPPRLLIY (SEQ ID NO: 102) RISRRFS (CDR2) (SEQ ID NO: 103) GVPDRFSGSGAGTDFTLEISRVEAEDVGVYYC (SEQ ID NO: 104) MQSTHVPWT (CDR3) (SEQ ID NO: 105) FGQT VEIK (SEQ ID NO: 106) Región variable de cadena pesada QVQLVESGGGWQSGRSLRLSCAASGFTFR (SEQ ID NO: 107) NYG H (CDR1) (SEQ ID NO: 108) WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 109) VIWYDGSDKYYADSVRG (CDR2) (SEQ ID NO: 110) RFTISRDNSKNTLYLQ NSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 111) DGYDILTGNPRDFDY (CDR 3) (SEQ ID NO: 112) WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 113) Secuencias de anticuerpo 131 se emplearon para búsqueda contra el Protein Data Bank, para identificar anticuerpos homólogos y sus estructuras. Con base en la similaridad de secuencia de los anticuerpos homólogos al anticuerpo 131, se seleccionaron varias estructuras . Las estructuras selectas para las muestras de modelación de Protein Data Bank tuvieron las identificaciones de Protein Data Bank de 1HEZ, 2H1P, 1AQK, 1DQL, 1MF2 y 1FLR. Estas estructuras plantilla o patrón luego se alinearon por superposición y emplearon para generar alineamientos de secuencia basados en la estructura entre las plantillas. Las secuencias de la región variable del anticuerpo 131 luego se alinearon a las secuencias de plantilla. Los alineamientos de estructura y secuencia se emplearon para generar el modelo molecular para la región variable del anticuerpo 131. La secuencia para CDR1, cadena ligera fue: RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO 103) . La secuencia para CDR2 , cadena ligera fue: RISRRFS (SEQ ID NO 103) . La secuencia para CDR3 , cadena ligera fue: MQSTHVPWT (SEQ ID NO 105) . La secuencia para CDR1, cadena pesada fue: NYGMH (SEQ ID NO 108) . La secuencia para CDR2, cadena pesada fue: VI YDGSDKYYADSVRG (SEQ ID NO 110) . La secuencia para CDR3 , cadena pesada fue: DGYDILTGNPRDFDY (SEQ ID NO 112) . La superficie de interacción para el anticuerpo 131 se calcula a partir del modelo de estructura y se muestra en la Figura 17. Los diversos CDRs se identifican como sigue: Ll (CDR1 ligero) 10, Hl (GDR1 pesado) 20, L2 30, H2 40, L3 50 y H3 60. Una característica prominente en la superficie de interacción del anticuerpo 131 pronosticado es una cavidad profunda.
La cavidad está circundada primordialmente por CDR2 , CDR3 de cadena pesada y CDR3 de cadena ligera, con una pequeña porción contribuida por CDR1 de cadena ligera. La cavidad probablemente es la cavidad de enlace. Dentro de 5 angstroms de la cavidad de enlace están los residuos 31, 37, 95-101, 143-147, 159, 162-166, 169-171, 211-219, 221 y 223. Estos residuos probablemente comprenden el parátopo y hacen contactos clave en el enlace del epltopo EGFRvIII . También es probable que los residuos proporcionen características estructurales importantes al sitio de enlace en general . EJEMPLO 17 Mutagénesis Dirigida por Sitio que Confirma el Modelo Para el Anticuerpo 131 Este ejemplo demuestra un método por el cual pueden probarse modelos que sugieren residuos que son importantes para enlace. El ejemplo también resulta en diversas variantes de anticuerpo. Variantes de anticuerpo del clon 131 se generaron por mutaciones de residuo sencillo introducidas a la cadena pesada y ligera de mAb 131. Estas variantes luego se analizaron para determinar como las cadenas laterales alteradas de la mutación punto contribuyeron' al enlace de antígeno. Se realizaron cambios en las cadenas pesada y ligera de mAb 131. En la cadena pesada L216 se cambia por mutagénesis dirigida de sitio a R. En la cadena ligera, V99 se cambia a F. Ambas mutaciones afectan la expresión y secreción de anticuerpos variantes comparado con la secuencia de tipo silvestre. Ambas mutaciones resultaron en pérdida de enlace de la variante mAb al antígeno EGFRvIII. Esto demuestra que L216 y V99 probablemente tienen contacto significante con el antígeno EGFRvIII ya que las sustituciones de estos residuos a R y F respectivamente resultaron en actividad reducida. Por supuesto, siempre es una opinión que estas sustituciones rompan la estructura general del anticuerpo . EJEMPLO 18 Modelado Molecular de 13.1.2 y su Parátopo El modelo de estructura tridimensional de la región variable del anticuerpo 13.1.2 se generó a través del enfoque de modelación de homología con el paquete de modulación InsightlI de Accelrys (San Diego, CA) . El modelo se construyó a partir de las secuencias de región variable, mostradas a continuación en la Tabla 18.1, utilizando la estructura de cristal de rayos-x publicada como plantillas. Tabla 18.1 Región variable de cadena ligera (1-113) DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISC (SEQ ID NO: 114) RSSQSLVHSDGNTYLS (CDR1) (SEQ ID NO: 101) WLHQRPGQPPRLLIY (SEQ ID NO: 115) KIS RFS (CDR2) (SEQ ID NO: 116) .
GVPDRFSGSGAGTAFTLKISRVEAEDVGVYYC (SEQ ID NO: 117) MQATQLPRT (CDR3 ) (SEQ ID NO: 118) FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 119) Región variable de cadena pesada (114-234) QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO: 120) SYGMH (CDR1) (SEQ ID NO: 121) WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 122) VIWYDGSNKYYVDSVKG (CDR2) (SEQ ID NO: 123) RFTISRDNSK TLYLQM SLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 124) DGWQQLAPFDY (CDR3 ) (SEQ ID NO: 125) WGQGTLVTVSSA (SEQ ID NO: 126) La secuencia para CDR1, cadena ligera fue: RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO: 101) . La secuencia para CDR2, cadena ligera fue: KISNRFS (SEQ ID NO: 116) . La secuencia para CDR3 , cadena ligera fue: MQATQLPRT (SEQ ID NO: 118) . La secuencia para CDR1, cadena pesada fue: SYGMH (SEQ ID NO': 121) . La secuencia para CDR2, cadena pesada fue: VIWYDGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 123). La secuencia para CDR3, cadena pesada fue: DGWQQLAPFDY (SEQ ID NO: 125) . Secuencias 13.1.2 de anticuerpo se utilizaron para buscar el Protein Data Bank para identificar anticuerpos homólogos. Las estructuras con las identificaciones de Protein Data Bank de 1HEZ, 2H1P, 8FAB y 1AQ se seleccionaron como plantillas de modelación, con base en su similaridad de secuencia del anticuerpo 13.1.2. Las estructuras de plantilla se eliminaron por superposición y emplearon para generar alineamientos de secuencia basados en la estructura entre las plantillas. Las secuencias de las regiones variables del anticuerpo 13.1.2 luego se alinearon a las secuencias plantilla. Los alineamientos de estructura y secuencia se emplearon para generar el modelo molecular para la región variable 13.1.2 anticuerpo. La superficie de interacción se calcula para el modelo y se ilustra en la Figura 18. Una característica principal del modelo 13.1.2 es una ranura larga y estrecha en la superficie de la región CDR. La ranura es resaltada por CDR2 de cadena pesada 140, CDR3 160, y CDR1 de cadena ligera 110, CDR2 130 y CDR3 150. Un extremo de la ranura toca el resto de CDR3 de cadena ligera 150, y el otro extremo abre al área más amplia de CDR3 de cadena pesada 160 cerca de la interfase de cadena ligera-cadena pesada. La ranura probablemente es la cavidad de enlace para el antígeno. Dentro de 5 Angstroms de la ranura de enlace están los residuos 31, 33, 35-39, 51, 54-56, 58-61, 94-101, 144-148, 160, 163-166, 172, y 211-221. Estos residuos probablemente comprenden el parátopo para el enlace del epítopo EGFRvIII. También es probable que los residuos proporcionen características estructurales importantes al sitio de enlace en general. EJEMPLO 19 Modelos de Exploración Computacional de Modos de Enlace Posibles de un Péptido a un Anticuerpo Los estudios de cartografía de epítopo en el Ejemplo 14 revelaron que los aminoácidos relevantes requeridos para enlazar el epítopo con el parátopo del residuo mAb 13.2.1 en el péptido de seis residuos EEKKGN (SEQ ID NO: 127) . Por lo tanto, modelos de exploración molecular de modos de enlace posibles de este péptido de seis residuos complejado con la región CDR del modelo de estructura 13.1.2 fueron generados. Primero, se produjo un modelo del péptido EEKKGN (SEQ ID NO: 127) . Esto se realizó, similármente como se describió con anterioridad, excepto esta vez utilizando la estructura del cristal de rayos-x de 1181, como se identifica en el Protein Data Bank, como plantilla. A continuación, estructura de péptido se colocó manualmente en la ranura larga para formar un complejo de conjunto o de conjunto inicial. Una búsqueda Monte Cario en los espacios de conformación y orientación se realizó automáticamente con el módulo de exploración molecular de modos de enlace posibles en InsightII. La conformación de peptido se permitió que sea flexible al dar a cada uno de los ángulos Phi, Psi y Chi libertar rotacional completa. Durante el proceso de exploración molecular de modos de enlace posibles, los residuos dentro de 5 Angstroms de la ranura de enlace se permitió que se movieran mientras que los otros residuos del anticuerpo estaban fijos. Las configuraciones plausibles que se encuentran por la búsqueda de Monte Cario se sometieron a fijado simulado y minimización de energía para alcanzar los modelos de estructura compleja final . Para cada modelo obtenido de exploración molecular de modos de enlace posibles, la energía de interacción entre el anticuerpo y el peptido se calculó con el modelo Discover_3 del paquete InsightII. Las energías de interacción para todos los modelos de exploración molecular de modos de enlace posibles se estimaron y el modelo con la interacción anticuerpo-péptido total más fuerte se examinó y se ilustra en la Figura 19A y 19B. En este modelo de exploración molecular de modos de enlace posibles, hay seis uniones de hidrógeno entre el péptido EEKKGN (SEQ ID NO: 127) y el anticuerpo 13.1.2, como se ilustra en la Figura 19B. El número de residuos péptido se etiqueta desde el extremo N al extremo C como 1 a 6. Seis uniones de hidrógeno se indican por líneas punteadas verdes. Los seis pares de aminoácidos que forman enlaces de hidrógeno son: E2...Y172, K3...H31, K4...H31, ?6.. 33, N6...Y37, y N6...K55. En este modelo de exploración molecular de modos de enlace posibles, el péptido se liga a la ranura en una conformación de hebra beta extendida. Residuos en el péptido dan frente en forma alterna al solvente y la superficie de anticuerpo. Los residuos que dan frente a la ranura de enlace con los contactos más significantes al anticuerpo son E2 , K4 y N6. Esto indica que estos tres residuos pueden ser importantes a enlace de péptido, consistente con los resultados de cartografía de epítopos . Las energías de interacción para cada uno de los seis residuos péptido con el parátopo 13.1.2 se calculan con el módulo Discover_3 y los resultados se ilustran en la Tabla 19.1. La Tabla 19.1 muestra las energías de interacción para cada uno de los seis residuos péptido con el parátopo 13.1.2. Todas las energías están en las unidades de kcal/mol . Los residuos con las energías de interacción más fuertes están en el orden de N6, K4 y E2, confirmando que estos residuos son contribuyentes clave en el lado de antígeno en la interacción anticuerpo-antígeno, de nuevo consistente con datos experimentales. Estos datos proporcionan fuerte evidencia para soportar el modelo de exploración molecular de modos de enlace posibles. En esta modalidad, el parátopo se define como los residuos dentro de 5 Angstroms del péptido con exploración computacional de modos de enlace posibles . Los 20 residuos que comprenden el parátopo asi definido son los residuos 31-33, 35, 37, 55, 96-101, 148, 163, 165, 170, 172, 178 y 217-218. Para evaluar en una base de residuos individual, la contribución de cada uno de estos residuos del anticuerpo en la interacción anticuerpo-antigeno, la energía de interacción entre los residuos parátopo y el péptido EEKKGN (SEQ ID NO: 127), se calcula para cada uno de los 20 residuos anteriores. Los resultados se citan en la Tabla 19.2. La Tabla 19.2 muestra las energías de interacción para cada uno de los 20 residuos parátopo con el péptido EEKKGN (SEQ ID NO: 127). Todas las energías están en unidades de kcal/mol. Los residuos con las energías de interacción más fuertes con el péptido son Lys55 y His31, seguidos por Tyrl72, Ala96, Asp33, Tyr37, Leu99, Thr97, Gln98, Lysl78 y Asnl70. Tabla 19.1 Residuo Coulómbico VdW Total Péptido El -2.013 -3.738 -5.751 E2 -10.661 -0.617 -11.278 Residuo Coulómbico VdW Total Péptido K3 -9.816 -0.493 -10.309 K4 -11.123 -0.968 -12.091 G5 -1.241 -1.468 -2.709 N6 -16.504 -0.181 -16.685 Tabla 19.2 Residuo 13.1.2 Coulómbico VdW Total His31 -12.835 3.033 -9.801 Ser32 2.857 -1.062 1.794 Asp33 -4.181 -0.698 -4.879 Asn35 0.253 -1.009 -0.756 Tyr37 -2.058 -2.463 -4.521 Lys55 -14.363 1.568 -12.794 Ala96 -6.077 0.896 -5.182 Thr97 -2.739 -1.431 -4.171 Gln98 -2.542 -1.548 -4.09 Leu99 -1.507 -2.779 - .286 ProlOO 0.439 -0.379 0.061 ArglOl 3.992 -0.549 3.443 HÍS148 0.101 -0.083 0.018 Vall63 -0.104 -0.237 -0.342 Trpl65 1.358 -1.122 0.236 Asnl70 -2.102 -0.487 -2.589 Tyrl72 -8.7 0.896 -7.804 Lysl78 -3.614 -0.03 -3.644 Leu217 0.761 -1.426 -0.664 Ala218 -0.071 -0.281 -0.352 Ejemplo 20 Diseño Racional para Anticuerpos Mejorados por Afinidad Este ejemplo demuestra como el modelo de exploración molecular de modos de enlace posibles puede emplearse como la base del diseño racional para anticuerpos mejorados de afinidad por mutagénesis dirigida por sitio. Cada uno de los residuos de parátopo 13.1.2 se muta a todos los 19 otros aminoácidos in sílico, resultando en un total de 19x20 o 380 mutantes virtuales. La mutación se realizó por reemplazo de residuo seguido por 50 etapas de minimizacion de energía para tomar en cuenta cualesquiera cambios de conformación local que puedan inducirse por el cambio de cadena lateral . La energía de interacción entre todo el péptido y todo el parátopo se calcula para cada mutante. Mutantes con una energía de interacción total más fuerte que el tipo silvestre 13.1.2 pueden tener potencialmente una afinidad superior para el péptido EEKKGN (SEQ ID NO: 127), y probablemente incluso toda la proteína EGFRvIII.
Estos mutantes primordialmente tienen interacciones culómbicas más fuertes que el tipo silvestre 13.1.2, pero algunos de ellos tienen interacciones de van der Waals (VdW) más débiles que el anticuerpo de tipo silvestre. Considerando que en el anticuerpo 13.1.2 tipo silvestre, la energía de interacción VdW es -9.689 kcal/mol, mutantes con energía de interacción VdW más débil que -8.5 kcal/mol se separaron por filtración. El resto de los mutantes que tienen energía de interacción total más fuerte que 13.1.2 tipo silvestres se citan en la Tabla 20.1. Los datos de tipo silvestre se citan al fondo para comparación. Todas las energías se dan en unidades de kcal/mol . Tabla 20.1 Mutante Coulómbico VdW Total Tyrl72Arg -93.004 -8.702 -101.706 Leu99Glu -79.897 -8.506 -88.403 ArglOlGlu -77.984 -8.833 -86.817 Leu217Glu -75.124 -8.998 -84.123 Leu99Asn -73.337 -9.894 -83.231 Leu99His -73.631 -9.008 -82.639 ArglOlAsp -71.983 -9.877 -81.861 Leu217Gln -70.263 -9.795 -80.058 Leu99Thr -69.882 -10.153 -80.035 Gln98Glu -70.651 -9.257 -79.908 Mutante Coulómbico VdW Total Leu217Asn -70.989 -8.769 -79.758 ArglOlGln -69.432 -10.164 -79.596 Leu217 sp -69.934 -9.643 -79.578 Asn35Gly -69.016 -10.191 -79.207 Tyrl72Hls -69.312 -9.509 -78.820 Vall63Asn -68.841 -9.944 -78.784 Tyrl72Asn -68.896 -9.871 -78.767 Ala218Lys -70.024 -8.570 -78.594 Asn35Arg -68.989 -9.604 -78.593 Trpl65Lys -69.578 -8.766 -78.344 Trpl65Arg -68.814 -9.216 -78.030 Leu99Tyr -67.052 -10.464 -7 .517 Tyrl72Thr -68.146 -9.225 -77.371 Ala96T r -67.534 -9.623 -77.158 Ala96Ser -67.222 -9.822 -77.045 ProlOOTrp -67.399 -9.496 -76.894 Leu217Ser -66.676 -10.133 -76.810 Ser32Ile -66.700 -10.077 -76.777 Tyrl72Ser -67.588 -9.146 -76.734 His31Glu -67.070 -9.461 -76.531 Leu217Tyr -65.605 -10.726 -76.331 Vall63His -67.236 -9.064 -76.300 Hisl48Ser -66.780 -9.495 -76.274 Mutante Coulómbico VdW Total Hisl48Val -66.634 -9.629 -76.263 Hisl48Ala -66.770 -9.473 -76.243 Hisl48Gly -66.762 -9.456 -76.217 HiSl48Thr -66.700 -9.508 -76.209 Leu99Ser -66.126 -10.006 -76.132 ProlOOAsp -66.153 -9.787 -75.940 Trpl65Glu -66.665 -9.267 -75.932 Hisl48Asn -66.010 -9.889 -75.899 ProlOOGln -65.873 -9.871 -75.745 Leu217 hr -66.045 -9.672 -75.717 Ser32Val -65.845 -9.854 -75.699 Ser32Pro -65.807 -9.813 -75.620 ProlOOGly -65.841 -9.774 -75.615 ProlOOAla -65.889 -9.712 -75.601 Ser32Ala -65.497 -10.089 -75.586 Ser32Thr -65.723 -9.861 -75.584 Ala218T r -66.054 -9.505 -75.560 ProlOOSer -65.831 -9.699 -75.530 Vall63Gly -65.993 -9.536 -75.529 Gln98Thr -66.162 -9.277 -75.438 ProlOOMet -65.811 -9.602 -75.412 Ser32Met -66.252 -9.153 -75.406 Ser32Gly -65.509 -9.891 -75.399 Mut nte Coulómbico VdW Total ProlOOAsn -65.729 -9.655 -75.384 Tyr37Phe -66.253 -9.020 -75.272 Val163Ala -65.713 -9.543 -75.255 Leu217Ile -65.479 -9.759 -75.238 Wild type 13.1.2 -65.517 -9.689 -75.205 Los mutantes citados en la Tabla 20.1 pueden ser candidatos para ingeniería de anticuerpos mejorados de afinidad. Para los superiores 14 candidatos en la lista contribuciones por residuo en el lado de antígeno y en el lado de anticuerpo se analizaron adicionalmente para examinar el impacto de las modificaciones propuestas. Los 10 mutantes selectos para mutagénesis dirigida en sitio in vitro fueron Tyrl72Arg, ArglOlGlu, Leu99Asn, Leu99His, ArglOlAsp, Leu217Gln, Leu99Thr, Leu217Asn, ArglOlGln y Asn35Gly. Los resultados pueden verse en el Ejemplo 21. Ejemplo 21 Mutagénesis Dirigida de Sitio Que Confirma el Modelo para 13.1.2 Este ejemplo demuestra un método por el cual los modelos anteriores, que sugieren residuos importantes para enlace, pueden probarse. El ejemplo también resulta en diversas variantes de anticuerpos. Variantes de anticuerpo de 13.1.2 se generaron por mutaciones de residuo sencillo introducidas en las cadenas pesada y ligera del mAb 13.1.2. Las variantes se analizaron para determinar la contribución que las diversas cadenas laterales tienen en enlace de antigeno. Una lista de las mutaciones introducidas por mutagenesis dirigida por sitio se resume en la Tabla 21.1.
Cada una de las 10 mutaciones en la Tabla 21.1 se introduce en la cadena pesada o ligera del mAb 13.1.2. Cada cadena mutada luego se transfecta con la cadena de tipo silvestre complementaria en células 293. Sobrenadantes luego se probaron para excreción y secreción de los anticuerpos IgG humanos y para enlace del antígeno EGFrVIII. Los resultados, como se determina por un ELISA, se resumen en la Tabla 21.2. Tabla 21.2 Energía de Mutación enlace Expresión Enlace 1 ArglOlAsp -81.861 Sí No 2 ArglOlGln -79.596 Sí No 3 ArglOlGlu -86.817 Sí No 4 Asn35Gly -79.207 Sí Sí 5 Leu217 sn -79.758 Sí Sí 6 Leu217Gln -80.058 Sí Sí 7 Leu99Asn -83.231 Sí Sí 8 Leu99His -82. S39 Si Sí 9 Leu99Thr -80.035 Sí Sí 10 Tyrl72Arg -101.706 Sí Sí 11 WT -75.205 Sí Sí Ejemplo 22 Preparación de Construcción Variante EGFRvIIl/pFLAG Este ejemplo demuestra como una variante a EGFRvIII puede producirse. Un fragmento de 1092bp que codifica el dominio extracelular de EGFRvIII se genera con pares cebadores 9712 y 9713 (Qiagen, Valencia, CA) : Cebador # 9712: 5 ' -ataaaagcttctggaggaaaagaaaggtaatta-3 ' (sentido) (SEQ ID NO 128) Cebador # 9713: 5 ' -TTATTGGTACCTCAGGCGATGGACGGGATCTTA- 3' (antisentido) (SEQ ID NO 129) de la plantilla de plásmido EGFRvIII-rbIgG/pCEP4 (como se describió anteriormente) amplificado utilizando la encima Pfu DNA polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA) . El cebador # 9712 introduce un sitio HindIII y el cebador # 9713 introduce un sitio Kpnl . El producto PCR fue purificado en columna (Equipo de purificación en columnas Qiagen, Valencia, CA) digerido con HindIII y Kpnl (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.) y purificado en gel (Equipo de purificación del gel Qiagen, Valencia, CA) . Los fragmentos se ligaron con T4 DNA Ligase (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.) en pFLAG-CMV-1 (Sigma, St . Louis, MO) linearizado con HindIII y Kpnl (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass . ) . El vector resultante se designó EGFRvIIl/pFLAG-CMV-1 # 1. Ejemplo 23 Preparación de Proteína Recombinante EGFRvIII/pFLAG Este ejemplo demuestra como una proteina EGFRvIII variante puede producirse. Primero, 500 ¿g de EGFRvIIl/pFLAG-CMV-l# 1 plásmido DNA se resuspenden en 25 mi de Opti-MEMI (Invitrogen, Burlington, ON) y combinan con 500 µ? de 293fectin (Invitrogen, Burlington, ON) se suspendieron 25 mi de Opti-MEMI. La mezcla se incubó por 20 minutos a temperatura ambiente o mezcló con células 293T (IxlO9) preparado en 1L 293 FreeStyle media (Invitrogen, Burlington, ON) , suplementado con FBS al 2 por ciento y 50 /g/ml de G418 (Invitrogen, Burlington, ON) . Se desarrollan células por 7 días a 37 grados C en C02 al 8 por ciento con agitación a 125 rpm. Purificación de proteína de fusión EGFRvI11-FLAG se lleva a cabo con el equipo de cromatografía de afinidad "Anti-FLAG M2 Affinity Chromatography kit" (Sigma, St . Louis, MO) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Proteína de fusión monomérica se produce como sigue. Primero, proteína purificada (1508 g) , se reduce con DTT en una concentración final de 10 mM por 30 minutos a 55 grados C. Luego IAA (ácido yodo acético) (Sigma, St . Louis, MO) se agrega a 22 mM e incuban 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad luego dializan contra PBS a 4 grados C en casetes de diálisis de 7k MWCO (Pierce, Rockford, 111.) . Ejemplos 24-30 Estudios de Enlace de Variante de Anticuerpo Los siguientes ejemplos involucran experimentos Biacore (resonancia plasmón de superficie) y experimentos KinExA. Estos ejemplos demuestran como se pueden probar los diversos anticuerpos y sus variantes producidas por los ejemplos anteriores para determinar si tiene las características de enlace deseadas. Todas las variantes examinadas fueron variantes en el fondo 13.1.2. I strumentación Todos los experimentos de resonancia plasmón en superficie se realizaron utilizando biosensores ópticos Biacore 2000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) . Todos los ensayos de exclusión cinética se realizaron utilizando un instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID). Reactivos Pep-3, N¾-LEEKKGNYWTDHG-OH (MW = 1590 Da) (SEQ ID NO: 130) , se sintetizó a la medida y adquirió de Anatech, Inc. (San José, CA) . Todos los mAbs se prepararon en las inatalaciones . El antígeno EGFRvIIIpflag (ácido yodoacético reaccionado para bloquear agregación a través de grupos sulfhidrilo libres), MW 39,907, se preparó dentro de las instalaciones . La fracción V de albúmina de suero bovino (BSA) (#BP1605-100) se adquiere de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) . Todos los otros reactivos generales se adquirieron de Sigma-Aldrich, Inc (St. Louis, MO) . Todas las muestras de antígeno y mAb para análisis Biacore y KinExA se prepararon en amortiguador HBS-P desgasificado-vacío (HEPES 0.01 M, NaCl 0.15 M, surfactante P-20 0.005 por ciento, Biacore Inc., Uppsala, Suecia) que contienen 100 yUg/mL de BSA. Reactivos de acoplamiento amina Biacore, l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) , N-hidroxisuccinimida (NHS) , y etanolamina se adquirieron de Biacore, Inc. Regeneración de superficie Biacore fue con pulso de 12 segundos de NaOH 26 mM para el experimento pep-3/mAb 131. Todos los otros mAbs se disociaron a línea base dentro de 20 minutos. Chips biosensores CM5 grado de investigación se adquirieron de Biacore, Inc. El anticuerpo de detección KinExA fue IgG antihumano cabra etiquetado Cy5, específico Fcy (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, #109-175-008) y fue diluido 1000 -veces en amortiguador HEPES (HEPES 0.01 M, NaCl 0.15 , pH 7.2) de un 0.5 mg/mL del material (PBS 1 X, H 7.4) . Las partículas de fase sólida empleadas para los experimentos KinExA fueron perlas de flujo rápido sefaróse 4 activadas con HS (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia, #17-0906-01) . Antes de reaccionar las perlas de sepharose con antxgeno, una alícuota de material de perlas de 1.5 mL en un tubo de microcentrífuga se centrifugó y lavó al menos 6 veces en H20 desionizada fría. Después de enjuagar las perlas una vez con amortiguador carbonato de sodio (0.05 M, pH 9.3), antxgeno (-40 µg) en amortiguador de carbonato de sodio se agrega a las perlas de sepharose. El tubo de sefarose/antígeno se balanceó durante la noche a 4 grados C. Después de balancear, sepharose se centrifugó y enjuagó dos veces con amortiguador Tris 1 M pH 8.3. Las perlas revestidas con antígeno luego se balancearon por 1 hora a temperatura ambiente en amortiguador Tris 1 M con BSA al 2 por ciento. Medidas Biacore Acoplamiento carbohidrato y EDC/NHS estándar se emplea para inmovilizar en forma covalente mAbs con un chip sensor CM5. Para minimizar transporte de masa y atestar mAbs se inmovilizaron a niveles que dieron una respuesta de enlace antxgeno máxima (Rmax) no mayor a 50 - 100 RU. Una celda de flujo de referencia en cada chip se activa y bloquea sin inmovilización mAb para servir como un control . Todos los experimentos cinéticos Biacore se realizaron a 23 grados C. Por cada experimento, una serie de seis a ocho concentraciones de antígeno (partiendo de pep-3 1.01 µ?) se preparan utilizando diluciones dobles. Muestras de antígeno se inyectaron aleatoriamente sobre la superficie de de biosensor en triplicado a 100 //L/min. Varias muestras de amortiguador se inyectaron intermitentemente en el curso de un experimento para doble referencia. Cada concentración pep-3 y muestra se inyectaron por 90 segundos. La disociación fue seguida por 13 a 180 minutos. Datos de disociación para enlace pep-3 a mAb 131 se adquirieron al alternar tres inyecciones adicionales de pep-3 251 nM con tres inyecciones de muestra adicionales y siguiendo la fase de disociación por 3 a 4 horas . Todas las gráficas que proporcionan un registro completo del avance de asociación y disociación entre dos reactivos (sensorgrams) Biacore se procesaron utilizando el soporte o programa Scrubber (Versión l.lf, BioLogic Software, Australia) . Todas las gráficas que proporcionan un registro completo del avance de asociación y disociación entre dos reactivos primero se ajustaron a cero en el eje y, luego alinearon x al inicio de la inyección. Cambios de índice de refracción a granel se retiraron al sustraer las respuestas de celda de flujo de referencia. La respuesta promedio de todas las inyecciones de muestra se sustrae de todas las gráficas que proporcionan un registro completo del avance de asociación y disociación entre analito y muestra para retirar artefactos sistémicos entre las celdas de flujo de referencia y experimental. El programa para análisis de datos de biosensor CLAMP (Versión 3.40, BioLogic Software, Australia) se emplea para determinar ka y kd de los juegos de datos procesados. Datos de todas las celdas de flujo se ajustaron globalmente a un modelo de enlace biomolecular 1 : 1 que incluye un término de transporte de masa. Para varios de los mAbs, las inyecciones correspondientes a la primera o segunda concentración de la serie pep-3 se excluyeron en el ajuste cinético no lineal en donde fue evidente que todas las gráficas que proporcionan un registro completo del avance de asociación y disociación entre dos reactivos no se describieron bien por un modelo de interacción 1:1. La D se calculó del cociente ka/ka. Medidas de Equilibrio KinExA Todos los experimentos inExA se realizaron a temperatura ambiente (-23 grados C) . Para todos los experimentos en equilibrio, el antigeno se diluyó en serie en soluciones que tienen una concentración de sitio de enlace mAb constante. Para los primeros 10 puntos de titulación, las dilusiones fueron dobles y las diluciones seriales llava y 12ava fueron 10 veces. El gasto de flujo de muestra para todos los experimentos fue 0.25 mL/min y el gasto de flujo de anticuerpo etiquetado fue 0.5 mL/min. Muestras de antígeno/anticuerpo luego se permitió que alcanzaran el equilibrio, lo que tardó aproximadamente -48-72 horas. Para el experimento pep-3/mAb 131 KinExA de la concentración de partida de pep-3 en la titulación controlada por KD fue 352 r±M y la constante [sitio de enlace mAb] = 219 pM; para la titulación controlada por mAb el inicio [pep-3] = 251 nM y el [sitio de enlace mAb] = 11 nM. Durante el experimento controlado KD con pep-3/mAb 131, 1.25 mL de cada muestra se retiran a través de la celda de flujo. Un volumen de muestra de 250 µ? se analiza para el experimento controlado con anticuerpo. Dos o tres duplicados de cada muestra se midieron para todos los experimentos en equilibrio. Los datos de titulación de equilibrio se ajustaron en un análisis de curva dual a un modelo de enlace 1:1 utilizando el programa KinExA (Versión 2.4, Sapidyne Instruments). El complejo EGFRvIIIpflag/mAb 131 se descubrió con KinExA bajo condiciones controladas KD solamente. El inicio [EGFRvIIIpflag] fue 198 nM y [en sitio de enlace mAb] fue 150 pM. Un volumen de muestra de 1 mL se extrae a través de la celda de flujo. Medidas duplicadas se recolectaron para todas las muestras. Los datos de titulación en equilibrio se ajustaron en un análisis de curva dual a un modelo de enlace 1:1 utilizando el programa KinExA (Versión 2.4, Sapidyne Instruments) . Ver ejemplo 28 siguiente para resultados y constante de equilibrio pronosticada. Para las titulaciones KinExA del complejo EGFRvIIIpflag/mAb 13.1.2 la concentración de partida de EGFRvIII fue 5.26 j M (controlada mAb), 230.1 nM (controlada KD) y [sitio de enlace mAb] = 9.59 nM (controlada mAb) , 498 pM (controlada KD) . Durante el experimento controlado por KD, 1.30 mL de cada muestra se toman a través de la celda de flujo. Un volumen de muestra de 250 zL se analiza para el experimento controlado de anticuerpo. Dos o tres duplicados de cada muestra se midieron para todos los experimentos en equilibrio. Los datos de titulación en equilibrio se ajustan en un análisis de curva dual a un modelo de enlace 1:1 utilizando el programa KinExA (Versión 2.4, Sapidyne Instruments) . Ejemplo 24 Determinación Jn vitro de Constantes de Enlace para Anticuerpos Las cinéticas de enlace de mAb 131 tipo silvestre se observan al utilizar un instrumento de Resonancia Plasmón Superficial (SPR) de Biacore. La KD fue muy baja, 380 pM, debido a la muy lenta kd y una rápida ka. Estimados para los otros parámetros cinéticos, derivados de ajuste de curva, fueron ka=2.246*106 y kd=8.502*10"4. En una modalidad, se ilustran anticuerpos mejorados o variantes con cinéticas mejoradas. Por cinéticas mejoradas, se entiende que uno de los elementos cinéticos de enlace de anticuerpo a un epitopo es superior al mismo elemento en anticuerpos previamente conocidos para el mismo epitopo. Por ejemplo, un anticuerpo que liga a pep-3 con una KD mayor (en habilidad de enlace) que 1.3*10"9 M, sería un anticuerpo mejorado. Como tal, se contemplan anticuerpos con una KD menor a 500 nM, 500-300 nM, 300-100 nM, 100-1 nM, 1.3 nM, 1.3 nM a 1000 pM, 1000 pM A 900 pM, 900-500 pM, 500-400 pM, 400-300 pM, 300-100 pM, 100-50 pM, 50-1 pM, o más pequeña KD. Ejemplo 25 DETERMINACIÓN IN VITRO DE CONSTANTES DE ENLACE PARA ANTICUERPOS Similar al Ejemplo 24, las cinéticas de enlace de mAbl3.1.2 a Pep-3 (EGFRvIII epltopo) fueron examinadas. La estimada D fue 67nM, pero varió ligeramente entre experimentos. Estimados para los otros parámetros cinéticos, derivados de ajuste de curva, fueron ka=2.835*105 y ka=0.01922. Ejemplo 26 DETERMINACIÓN IN VITRO DE CONSTANTES DE ENLACE PARA ANTICUERPOS Similar al Ejemplo 24, se examinaron las cinéticas de enlace de mAb 095 a Pep-3 (EGFRvIII epltopo) . La estimada KD fue 66nM. Estimados para los parámetros cinéticos, derivados de ajuste de curva fueron ka=1.491*105 y kd=9.927*10"3. EJEMPLO 27 DETERMINACIÓN IN VITRO DE CONSTANTES DE ENLACE PARA ANTICUERPOS Similar al Ejemplo 24, se examinaron las cinéticas de enlace de mAb 139 a Pep-3 (EGFRvIII epítopo) . La estimada KD fue 290nM. Para los parámetros cinéticos derivados de ajuste de curva fueron estimadas ka=10328 y kd=2.981*10~3. EJEMPLO 28 DETERMINACIÓN IN VITRO DE CONSTANTES DE ENLACE PARA ANTICUERPOS Para analizar en forma más completa las características de enlace de los anticuerpos, se realizaron experimentos KinExA para determinar las características de enlace de mAb 131. La KD determinada a partir del análisis de curva dual fue 1.74*10"10. En un experimento KinExA, la KD para EGFRvIIIpflag a mAb 131 fue 6.266*1 '?? . EJEMPLO 29 DETERMINACIÓN IN VITRO DE CONSTANTES DE ENLACE PARA ANTICUERPOS VARIANTES A fin de analizar más completamente las características de enlace de los anticuerpos 13.1.2, se realizó un experimento KinExA para determinar las características de enlace de mAb 13.1.2. La KD determinada de un análisis de curva dual fue 7.538*10"10. Adicionalmente, el antígeno en este ejemplo fue la variante EGFRvIIIpflag y se reacciono con ácido yodoacético (???) . EJEMPLO 30 COMPARACIÓN DE RESULTADOS BIACORE Y RESULTADOS QUINEXA Los resultados de los ejemplos previos y las pruebas KinExA se presentan en la Tabla 30.1 siguiente. Números en paréntesis en la Tabla 30.1 son intervalos de confianza 95 por ciento. ND," significa no determinado y denota enlace a EGFRvIIIpflag (ácido yodoacético reaccionado) , en lugar de pep-3.
Como es evidente por las constantes de velocidad, mAb 131 parece tener una constante de asociación mayor y la constante de disociación más baja, dando de esta manera mAb 131 la más baja KD. TABLA 30.1 EJEMPLO 31 DETERMINACIÓN IN VITRO DE CONSTANTES DE ENLACE PARA ANTICUERPOS VARIANTES L99t-5.3 Las cinéticas de enlace de mAb L99T-5.3 a Pep-3 (EGFRvIII epitopo) se examinaron. La primera etapa fue inmovilizar 5,600 unidades de resonancia (RU) a 8,000 RU de mAb L99T-5.3 a dos celdas de flujo (Fe) de un chip sensor CM5 y 5,600 unidades de resonancia (RU) a 8,000 RU de mAb 13.1.2 a un Fe, utilizando química de acoplamiento EDC/ HS estándar. Esta densidad superficial produjo una señal de enlace con pep-3 inferior a 100 RU. Dos chips sensores CM5 se emplearon en total para inmovilizar ambos mAbs. Con los datos previamente recolectados, esto produce un total de 5 experimentos independientes para ambos anticuerpos que permiten que los intervalos de confianza de 95% sean calculados. Biosensores ópticos Biacore 2000 se emplearon para todos los estudios. A continuación, pep-3 se hizo circular a través de las superficies de biosensor inmovilizadas con mAb. La concentración de partida de pep-3 fue 1.25 /iM, seguido con ocho diluciones en serie dobles en inyecciones triplicadas aleatorias. Inyecciones de muestra se corrieron cada sexta muestra a través de las series de inyecciones para propósitos de doble referencia . Finalmente, los datos de biosensor se procesan con Scrubber y los datos se ajustan a curvas utilizando Clamp con un modelo de interacción 1:1 con un término incluido para transporte de masa. Las inyecciones de alta concentración, 1.25 µ?, se excluyeron para el ajuste de cinética debido a que fue aparente que los datos no fueron consistentes con un modelo de interacción 1:1. Más probablemente, esta desviación se provoca por interacciones no específicas que ocurren a altas concentraciones de pep-3. Todos los datos cinéticos ajustan satisfactoriamente a un modelo de interacción 1.-1. La KD estimada varió de 54-70 nM. Estimados para los otros parámetros cinéticos, que también variaron ligeramente entre corridas, fueron ka=2.238*105 y kd=0.01217. Ejemplos 32-38 Ejemplos 32-38 examinan adicionalmente las cinéticas de enlace de los mAbs variantes a través del uso de un dispositivo Biacore . La primera etapa de estos ejemplos involucra la inmovilización de 5,600 unidades de resonancia (RU) a 8, 000 RU de cada mAb probado a una celda de flujo (Fe) de un chip sensor CM5 utiizando química de acoplamiento EDC/NHS estándar. Esta densidad superficial produce una señal de enlace con pep-3 menor a 100 RU. Estos chips sensores CM5 se emplearon en total para inmovilizar todos los mAbs mutantes con un mAb único inmovilizado a cada celda de flujo. MAb 13.1.2 se incluye en la celda de flujo para dos de los tres chips sensores CM5. Biosensores ópticos Biacore 2000 se emplearon para todos los estudios . A continuación, pep-3 se pasa a través de superficies de biosensor inmovilizadas con mAb. La concentración de inicio de pep-3 fue 4.98 µ?, seguida por ocho a once diluciones en serie dobles en inyecciones duplicadas o triplicadas al azar. Inyecciones de muestra se corrieron cada sexta muestra a través de la serie de injección para propósitos de doble referencia. Finalmente, los datos de biosensor se procesaron con Scrubber y ajustaron utilizando Clamp con un modelo de interacción 1:1 con un término incluido para transporte de masa. Algunas inyecciones de alta concentración (4.98 - 1.25 µ?) , dependiendo del mAb y su afinidad, se excluyeron de los ajustes de cinética cuando fue aparente que los datos no fueron consistentes con un modelo de interacción 1:1. Más probablemente, esta deviación se provoca por interacciones no especificas que ocurren a altas concentraciones de pep-3. Todos los datos cinéticos ajustan un modelo de interacción 1:1. Ejemplo 32 DETERMINACIÓN IN VITRO DE CONSTANTES DE ENLACE PARA ANTICUERPOS VARIANTES L217q-10.1 Las cinéticas de enlace de mAb L217Q-10.1 a Pep-3 (EGFRvIII epítopo) se examinaron. La estimada KD fue 92 nM. Estimados para los otros parámetros cinéticos derivados de ajuste de curva fueron ka=2.04*105 y kd=0.01885. Ejemplo 33 DETERMINACIÓN IN VITRO DE CONSTANTES DE ENLACE PARA ANTICUERPOS VARIANTES L217n-2.1 Similar al Ejemplo 32, se examinaron las cinéticas de enlace mAb L217N-2.1 a Pep-3 (EGFRvIII epitopo) . La estimada KD fue 185 nM. Estimados para los otros parámetros cinéticos, derivados de ajuste de curva fueron ka=2.198*105 y kd=0.04069. Ejemplo 34 DETERMINACIÓN IN VITRO DE CONSTANTES DE ENLACE PARA ANTICUERPOS VARIANTES N35g-3.1 Similar al Ejemplo 32, se examinaron las cinéticas de enlace de mAb N35G-3.1 a Pep-3 (EGFRvIII epitopo) . La estimada D fue 204 nM. Estimados para los otros parámetros cinéticos, derivados de ajuste de curva fueron ka=1.497*105 y kd=0.03057. Ejemplo 35 DETERMINACIÓN IN VITRO DE CONSTANTES DE ENLACE PARA ANTICUERPOS VARIANTES Similar al Ejemplo 32, se examinaron las cinéticas de enlace de mAb L99H-9.2 a Pep-3 (EGFRvIII epitopo) . La estimada KD fue 395 nM. Estimados para los otros parámetros cinéticos, derivados de ajuste de curva fueron ka=83390 y kd=0.03293. Ejemplo 36 DETERMINACIÓN IN VITRO DE CONSTANTES DE ENLACE PARA ANTICUERPOS VARIANTES Similar al Ejemplo 32, se examinaron las cinéticas de enlace de mAb Y172R-1.2 a Pep-3 (EGFRvIII epítopo) . La estimada KD fue 927 nM. Estimados para los otros parámetros cinéticos, derivados de ajuste de curva fueron ka=82237 y kd=0.07622. Ej emplo 37 DETERMINACIÓN IN VITRO DE CONSTANTES DE ENLACE PARA- ANTICUERPOS VARIANTES Similar al Ejemplo -32, se examinaron las cinéticas de enlace de mAb L99N-4.1 a Pep-3 (EGFRvIII epítopo). La estimada KD fue 1.4 µ?. La MAb L99N-4.1 se ajustó utilizando un modelo de enlace de estado estable (equilibrio) a fin de determinar la KD debido a que las cinéticas fueron muy rápidas para ajustarse. Ejemplo 38 COMPARACIÓN DE 13.1.2 CON VARIANTES DISEÑADAS Como puede verse en la Tabla 38.1 un mAb con características de enlace mejoradas se ha desarrollado. Los intervalos de confianza de 95% se ilustran en paréntesis. L99T-5.3 exhibe una ka mejorada, una ka disminuida y de esta manera una KD más lenta en total. Mientras que estadísticamente, de existir, parece haber poca diferencia significante en las constantes de disociación en equilibrio y las constantes de velocidad cinética de enlace Pep-3 a mAbs 13.1.2 y L99T-5.3 (al intervalo de confianza de 95%) , aún parece haber un sesgo intuitivo para un incremento marginal en afinidad para enlace Pep-3 a L99T-5.3. Aún más, cuando se utiliza el mismo chip biosensor, L99T-5.3 parece siempre tener una superior afinidad que 13.1.2. TABLA 38.1 Modelos de Exploración Computacional de Modos de Bnalce Posibles Adicionales y Métodos para Seleccionar Modelos y Pronosticar Afinidad de Enlace En otras modalidades, los Ejemplos anteriormente descritos pueden realizarse con péptidos de diversa longitud en vez de solo péptidos que son de 6 amino ácidos de longitud, siempre que los residuos de enlace clave se incluyan en el péptido. Por ejemplo, en lugar del péptido de seis amino ácidos, EE KGN (SEQ ID NO: 127) , puede utilizarse un péptido de siete amino ácidos, EEKKGNY (SEQ ID NO : 131) . Un péptido de cualquier tamaño para el epítopo puede utilizarse. En otras modalidades, el péptido se elige de los siguientes péptidos: LEEKKGNYWTDHC (SEQ ID NO: 56), LEEKKGNYWTD (SEQ ID NO: 59), LEEKKGNYWT (SEQ ID NO:132), y EEKKGNYWT (SEQ ID NO: 57) . Puede utilizarse un péptido de cualquier tamaño entre los fragmentos cortos aquí descritos al péptido de longitud íntegra o sus variantes. Como se aprecia por una persona con destreza en la especialidad, la presencia de amino ácidos adicionales puede alterar la forma en la cual el péptido enlaza al anticuerpo. No solo la presencia del amino ácido adicional permite enlaces alternos y adicionales transformados entre el péptido y el anticuerpo, sino que el amino ácido adicional puede cambiar la estructura del péptido y la estructura del anticuerpo al enlazar el péptido con el anticuerpo. De esta manera, en una modalidad, diversas longitudes del péptido epítopo, por ejemplo EEKKGN (SEQ ID NO: 127) y EEKKGNY (SEQ ID NO: 131) , pueden examinarse para propiedades de enlace y optimización de enlace. No solo los fragmentos más largos del péptido proporcionan una ilustración precisa de la interacción péptido-anticuerpo para segmentos más largos del péptido, sino que un examen de los cambios en la fuerza de enlace y los residuos involucrados en el enlace, permitirán información adicional referente a péptidos más largos extrapolados a partir de los datos. Además, y probablemente complementario a la prueba de fragmentos de péptido más largos, pueden realizarse etapas de filtración adicionales en los diversos modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles, a fin de seleccionar un modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles refinado. Una etapa de filtrado adicional puede permitir filtrar a través de numerosos modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles, para encontrar aquellos que son consistentes con datos experimentales disponibles. En una modalidad, el filtro se basa en datos de cartografía de epítopo de resolución fina, por ejemplo el perfil de enlace de residuo individual caracterizado experimentalmente, que puede correlacionarse con el perfil de energía de enlace calculado para cada amino ácido en el péptido. El perfil de energía de enlace de un péptido de siete amino ácidos, por ejemplo puede utilizarse para seleccionar modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles que contienen perfiles de energía de enlace similares . Un perfil de energía de enlace es una asignación de la ¦ energía de enlace de cada amino ácido en un péptido al amino ácido particular, para crear un perfil del péptido en términos de cada energía de enlace de amino ácido en ese modelo. Por ejemplo, en un modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles, dado un péptido que comprende los amino ácidos A y B, en donde A tiene una energía de enlace de -5 y B tiene una energía de enlace de -20, se tendría un perfil de Al (a -5) y B2 (a -20) . Este perfil puede utilizarse como un filtro para seleccionar otros modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles. Por ejemplo, el uso de este perfil de energía de enlace como un filtro o "plantilla" , resultará en otros modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles seleccionados, si el péptido en el modelo candidato tuviera un valor relativamente bajo atribuido a la posición A, y un valor relativamente alto (más grande negativo, valor absoluto superior) atribuido a la posición B. En una modalidad alterna, la plantilla requiere limitaciones adicionales,- por e emplo, que el valor en la posición B es cuatro veces mayor que el valor en la posición A. Se puede comparar la plantilla de perfil de energía de enlace con los perfiles del péptido en los otros modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles, en una variedad de formas. Si la plantilla de perfil de energía de enlace es similar al perfil de energía de enlace deseado, entonces el filtro puede utilizarse para seleccionar modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles favorables, para adicional examen. Si la plantilla de perfil de energía de enlace es diferente al perfil de energía de enlace deseado, entonces el filtro puede utilizarse para eliminar modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles, desfavorables. En una modalidad, el proceso de filtrado incluye una plantilla tanto con energías de enlace favorables como desfavorables y el filtro se utiliza tanto para seleccionar como excluir modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles. Como se aprecia por una persona con destreza en la técnica, hay muchos perfiles de energía de enlace diferentes posibles y de esta manera muchas plantillas de perfil de energía de enlace diferentes que pueden utilizarse dependiendo de la situación. En una modalidad, se puede definir una plantilla de perfil de energía de enlace como una plantilla que tiene una serie de energías de enlace relativamente altas, en posiciones particulares en el péptido. En una modalidad preferida, la plantilla de perfil de energía de enlace y el perfil de energía de enlace seleccionado por la plantilla, tendrán energía de enlace relativamente alta en la posición 2 , 4 o 6 del péptido, EEKKG Y (SEQ ID NO: 131) . En otra modalidad, la plantilla de perfil de energía de enlace tendrá una energía de enlace relativamente alta en las posiciones 2 , 4 y 6 del péptido EEKKGNY (SEQ ID NO: 131) . En otra modalidad, la plantilla de perfil de energía de enlace tendrá una energía de enlace relativamente baja atribuida a la posición 3 del péptido EEKKGNY (SEQ ID NO: 131) . En la discusión anterior, las posiciones se asignan como sigue: El, E2, K3, K4 G5, N6, Y7. En una modalidad, el proceso de filtrado primero involucra una comparación de las energías de enlace en K3 y K4. Modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles que resultan en una energía de enlace relativamente superior para K4 en comparación con K3 se eligen, mientras que modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles que resultan en una energía de enlace inferior para K4 en comparación con K3, se separan por filtración. De esta manera, por "relativamente alta" se entiende que la energía de enlace para K4 es mayor (valor más negativo, valor absoluto mayor) que K3. A continuación, los modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles de nuevo se filtran a través de la plantilla de perfil de energía de enlace, esta vez, aquellos modelos de enlace con energías relativamente superiores en las posiciones 2, 4 y 6 se eligen mientras que los otros modelos pueden retirarse. De esta manera, por "relativamente alta" se entiende que la energía de enlace en las posiciones 2, 4 y 6 es superior (valor más negativo, valor absoluto más grande) que la energía de enlace más bajo en el péptido. De esta manera, en esta modalidad, la plantilla de perfil de energía de enlace puede resumirse como sigue: El puede ser cualquier valor, E2 deberá ser mayor que el valor más bajo, 3 deberá ser menor que K4, K4 deberá ser mayor que el valor más bajo, G5 puede ser cualquier valor, N6 deberá ser mayor que el valor más bajo, Y7 puede ser cualquier valor. De esta manera, El, G5 e ?7 pueden ser cualquier valor, siempre que al menos uno (o K3) sea menor que al menos uno de E2 , K4 y N6. En otra modalidad, "relativamente alta" puede ajustarse a un valor estándar como se determina a través del modelado o experimentación. En una modalidad, que los modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles que pasan el primer filtro es más importante que el modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles que pase la segunda etapa de filtrado. Como se aprecia por una persona con destreza en la especialidad, no se requiere realizar estas dos etapas secuencialmente y pueden realizarse simultáneamente. Adicionalmente, estas plantillas de perfil para filtrar por resultados variarán dependiendo del péptido, el anticuerpo y las condiciones de enlace. Una persona con destreza en la técnica, dada la presente descripción, especialmente con referencia al Ejemplo 14, puede determinar la plantilla de perfil de energía de enlace apropiada. Por ejemplo, como se muestra en la Tabla 14.1, hay varios residuos importantes posibles para enlace péptido tanto en el anticuerpo 131 como en el 13.1.2. En el mAb 131, las posiciones E2 , K4, N6 y Y7 son importantes para el péptido particular probado. En el mAb 13.1.2, las posiciones El, E2 , K4 , G5 y N6 son importantes para el péptido particular probado. Aquellos residuos que son importantes pueden ser residuos involucrados en la creación de una plantilla de perfil de energía de enlace. Como es claro de la siguiente discusión, la plantilla de perfil de energía de enlace en el Ejemplo 39 parece ser diferente de la sugerida por un análisis del Ejemplo 14. El Ejemplo 39 es una versión menos rigurosa de la plantilla que permite que pasen más modelos a través de la etapa de supervisión o clasificación. Si se quisiera reducir el número de modelos que pasan la etapa de supervisión, se puede agregar adicionalmente requerimientos referentes a El y G5. El siguiente Ejemplo demuestra tanto el uso de un péptido más largo, como puede alterar los resultados anteriormente mostrados, que significan dichos cambios así como demostrado el uso de uno de los filtros anteriores para seleccionar modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles particulares. Ejemplo 39 MODELO DE EXPLORACIÓN COMPUTACIONAL DE MODOS DE ENLACE POSIBLES DE EPÍTOPO-ANTICUERPO PARA UN PÉPTIDO DE SIETE AMINO ÁCIDOS Este Ejemplo demuestra la generación de un conjunto de modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles para un péptido de siete residuos complejado a la región CDR del modelo de estructura 13.1.2. Adicionalmente, este Ejemplo demuestra métodos para seleccionar un modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles, sobre otro modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles. Primero, un modelo estructural para el péptido de siete residuos EEKKGNY (SEQ ID NO: 131) se construye en una conformación extendida y de energía minimizada con el módulo Discover_3 en el paquete de modelado InsightII. A continuación, la estructura de péptido se coloco manualmente en el sitio de combinación para formar un conjunto inicial. Una búsqueda Monte Cario en los espacios de translación y rotación se realiza automáticamente con restricciones de energía relajada en el módulo de exploración computacional de modos de enlace posibles, en InsightII. Durante el proceso de exploración computacional de modos de enlace posibles, los residuos dentro de 5 Angstroms de la ranura de enlace se permite que se muevan mientras que otros residuos de anticuerpo se fijaron. El péptido se restringe dentro de 5 Angstroms de la posición de partida. Las configuraciones plausibles encontradas por la búsqueda Monte Cario se siguieron por simulado fijado y minimización de energía para llegar a los modelos de estructura compleja finales. Un total de 63 modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles se obtuvieron. Para cada modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles, la energía de interacción entre el anticuerpo y el residuo individual en el péptido se calcula con Discover_3. El perfil de la contribución de residuo individual en enlace epítopo-anticuerpo, se inspecciona para seleccionar los modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles que son consistentes con los datos de cartografía de epítope con resolución fina, es decir "la plantilla de perfil de energía de enlace" . 19 de los 63 modelos de exploración computacional de modos de enlace posibles pasaron esta verificación. Un perfil de energía de enlace de residuo individual típico se ilustra en la Tabla 39.1. Consistente con los datos de cartografía de epítopo, en el Ejemplo 14, la energía de enlace para K4 es prominente, y aquellos para N6 y E2 son más grandes. Esta plantilla de perfil de energía de enlace impone énfasis particular en el hecho de que K4 es mayor que K3. Este perfil de energía de enlace también impone un énfasis en el requerimiento de que E2, K4 y N6 son relativamente grandes. En otras palabras, las energías de enlace de E2 , K4 y N6 no fueron las más bajas energías de enlace (menos negativo o valor absoluto más pequeño) en el péptido. TABLA 39.1. Perfil de energía de enlace para residuo individual en el péptido de siete residuos al anticuerpo 13.1.2 es consistente con los datos de cartografía de epítope en el en el ejemplo 14.
El E2 K3 K4 G5 N6 Y7 TOTAL -10.97 -19.34 -13.46 -24.26 -10.1 -18.19 -15.15 -111.45 Para los 19 modelos que pasan el filtro con base en el perfil de energía de enlace, se realizaron simulaciones energéticas de enlace epítopo-anticuerpo en cada uno de los siete mutantes con datos de afinidad (Tyrl72Arg, Ejemplo 36; Leu217Asn, Ejemplo 33; Leu217Gln, Ejemplo 32; Asn35Gly, Ejemplo 34; Leu99Asn, Ejemplo 37; Leu99His, Ejemplo 35; y Leu99Thr, Ejemplo 31) . Ya que la extensión de interacción electroestática en este complejo tuvo que aproximarse, una cantidad de diferentes constantes dieléctricas se utilizaron en una serie de cálculos. La mutación se realizó con reemplazo de residuo seguido por 30-100 etapas de minimización de energía para tomar en cuenta cualesquiera cambios de conformación locales que se inducen por el cambio en cadena lateral . Por cada modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles, la energía de interacción entre el péptido de siete residuos y todo el anticuerpo se calcula para cada mutante por parámetros selectos. Para cada conjunto de 8 energías de enlace (7 mutantes más el tipo silvestre) , se realizó un proceso de ajuste lineal en cada conjunto de los datos de enlace, en comparación con el logaritmo de Kd. Un coeficiente de correlación se calcula para cada ajuste lineal. La mejor correlación se obtiene para un modelo, el modelo con los datos descritos en la Tabla 39.1, con una constante dieléctrica l*r y 50 etapas de minimización de energía. Las energías de enlace de epítopo-anticuerpo para este modelo, se ilustran en la Tabla 39.2. El coeficiente de correlación fue 0.80 con todos los datos. Ya que la KD para Leu99Asn no se midió con alto grado de precisión, ver el Ejemplo 37 anterior, se realizó un ajuste lineal separado excluyendo los datos para Leu99Asn. Se obtuvo un coeficiente de correlación excelente de 0.91, como se ilustra en la Figura 20. El modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles refinado de esta manera está bien representado por el modelo selecto anterior. El modelo con péptido con llenado de espacio se ilustra en la Figura 21, y los enlaces de hidrógeno se ilustran en la Figura 22. L3 150 es la sección inferior y H3 160 es la sección superior en la Figura 22. H2 140 está a la derecha del área de enlace de péptido. El propio péptido se coloca en el sitio de enlace con El ubicado en la parte superior de la página con un tono claro, bajando a K3 , K4, G5, N6 y Y7, oscurecidos progresivamente. Los residuos de anticuerpo involucrados en enlace de hidrógeno se ilustran en la Figura 22. El modelo producido de este Ejemplo demuestra que hay siete enlaces de hidrógeno: K4...Q95, K4...Q95, N6...Q98, G5...H31, Y7..JÍ31 y Y7...W165.
Tabla 39.2. Simulación de energéticos de enlace epítopo-anticuerpo, en comparación con el logaritmo de Kd. imitante Colúmbico vdw total Ln( d) 172Arg -19. .103 -27. 962 -47. .065 -13 .891 217Asn -19. .003 -28. 715 -47. .718 -15 .503 217Gln -18. , 977 -28 .73 -47. .707 -16 .201 35Gly -19. .095 -28. 431 -47. .526 -15 .405 99Asn -18. .719 -28. 778 -47. .497 (-13.-479) 99His -18. .837 -28. 719 -47. .556 -14 .744 99 hr -19. .155 -28. 704 -47. .859 -16 .475 T -18. .981 -28. 728 -47. .708 -16 .269 Como puede verse del modelo seleccionado del Ejemplo 39, que se representa en la Figura 15, el modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles, revela algunos resultados inesperados. Un resultado interesante es que mientras los residuos E2, K4 y N6 son residuos importantes en el enlace del péptido como un todo, no todos estos amino ácidos se modelan como se involucra en formar enlaces H con el anticuerpo. Parece ser que K4 se involucra en la formación de dos enlaces H, ambos con Q95, que es consistente con importancia K4 en el perfil de energía e enlace y la plantilla de perfil . Parece ser que N6 se modela para unir a Q98 ; sin embargo, en este modelo particular, E2 no parece formar enlaces H en el modelo. Una tendencia interesante que es consistente es que cada uno de los residuos clave de la plantilla de perfil de energía enlace (por ejemplo, E2 , K4 y N6) están primordialmente enterrados y de esta manera en contacto cercano con la ranura de enlace de anticuerpo. De esta manera, esta selección de modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles, puede tomar en cuenta el hecho de que estos residuos clave son importantes debido a su cercana interacción con el anticuerpo. Adicionalmente, es posible que El esté involucrado en un enlace de hidrógeno con W214. El Ejemplo 39 también demuestra que el método anteriormente descrito resulta en una fuerte correlación entre la energía de enlace y KD, sugiriendo que modelos creados por este método también permiten la optimización o al menos una predicción de la KD del complejo anticuerpo-péptido . Como puede verse de una comparación del Ejemplo 39 y el Ejemplo 19, hay algunos residuos que son importantes entre los dos modelos, algunos residuos que aparecen solo en el modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles de siete amino ácidos, así como algunos residuos que no aparecen tan importantes en el modelo de exploración computacional de modos de enlace posibles de siete amino ácidos. Por ejemplo, el epítopo de siete peptidos parece crear enlaces de H entre K4...Q95, K4...Q95, N6...Q98, G5...H31, Y7...H31 y Y7...W165. Por otra parte, el epitopo de seis péptidos parece crear enlaces H entre E2...Y172, K3...H31, K4...H31, N6...D33, N6...Y37 y N6...K55. Como puede verse de los datos anteriores, ambos modelos de seis y siete amino ácidos péptidos enfatizan la importancia de H31, ya que ambos modelos involucran H31 que forman dos enlaces de hidrógeno con el péptido. Mientras que en otras tendencias posibles entre los dos conjuntos de datos, parece que muchas de las interacciones de enlace han cambiado del modelo de seis amino ácidos al modelo de siete amino ácidos. Sin embargo, estos ejemplos demuestran que variaciones debidas a tamaño de epítopo puede detectarse con estos modelos y de esta manera el ajuste en escala de péptidos epítopo más cortos a más largos, no deberá ser problemático a la luz de la presente descripción. La presencia de amino ácidos que demuestran consistentemente su importancia en diversos modelos de enlace nos permite sesgar la importancia de las diversas interacciones de conformidad, de manera tal que los modelos de péptido más cortos pueden ser más representativos de interacciones de péptido más largas.
Como se aprecia por una persona con destreza en la técnica, cualquiera de la discusión o ejemplos anteriores referentes al péptido de seis amino ácidos, EE KGN (SEQ ID NO: 127) , también puede aplicarse hacia el péptido de siete amino ácidos, EEK GNY (SEQ ID NO: 131), o cualquier péptido más largo. Por ejemplo, el Ejemplo 20 puede repetirse con la información del Ejemplo 39 para diseño racional de anticuerpos mejorados en afinidad por mutagénesis dirigida por sitio. Además, el Ejemplo 21 puede repetirse, utilizando los resultados del Ejemplo 39, siguiendo un intento de diseño racional para anticuerpos de mejorada afinidad, por mutagénesis dirigida por sitio para probar cualesquiera nuevos anticuerpos derivados del Ejemplo 20. En una modalidad, los resultados del Ejemplo 39 se utilizan para redefinir el área de interacción entre el anticuerpo y el péptido. Por ejemplo, el parátopo para EEKKGNY (SEQ ID NO: 131) , puede definirse que incluye los otros residuos en el anticuerpo que se pronostica interactúan con el péptido, por ejemplo residuo 95. En forma alterna, como en el Ejemplo 19, el parátopo puede definirse como todos los residuos dentro de 5 Angstroms del péptido con exploración computacional de modos de enalce posibles . Maduración de Afinidad in Silíco en Diferentes Proteínas Maduración de afinidad de anticuerpo se ha realizado exitosamente in vi tro en una cantidad de diferentes estudios. Típicamente, bibliotecas mutantes aleatorias requieren ser construidas por métodos de biología molecular y ensayos de selección/supervisión requeridos para desarrollarse a fin de enriquecer los ciónos con buena capacidad de enlace . Variantes selectas luego requieren ser purificadas para determinar afinidades. Este proceso requiere una serie de experimentos prolongados y laboriosos . El siguiente Ejemplo demuestra que es posible pronosticar en forma precisa maduración de afinidad a través de selección in silico utilizando una estructura de complejo anticuerpo-antígeno sola . Ejemplo 40 Maduración De Afinidad In Silico A Través De Simulaciones Energéticas De Enlace Anticuerpo-Antígeno Este Ejemplo demuestra que simulaciones energéticas de enlace anticuerpo-antígeno in silico pueden utilizarse para maduración de afinidad. En particular, este ejemplo demuestra que la cinética de enlace de una Fab-12 (forma IgG conocida como rhuMAb VEGF) a VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) puede pronosticarse a través del proceso anteriormente descrito in silico.
La estructura cristalina del complejo VEGF-Pab utilizado fue ubicada en la base de datos PDB con el número de acceso 1BJ1, a una resolución de 2.4 angstroms . Datos de afinidad experimentales publicados para una serie de mutantes de un anti-VEGF Fab, se utilizaron para probar el concepto. Las coordenadas 3-D de la estructura VEGF-Fab se utilizaron para llevar a cabo mutación in silico para los siguientes mutantes: H97Y, SlOOaT, T28D, 28D31H, 28D31H97Y100aT, N31H, Y53W, 71I73K, 71V73V. Los datos de afinidad se obtuvieron del documento de Chen, Y y colaboradores, (J Mol Biol . , 293 (4) : 865-81 (1999)). Las simulaciones energéticas se llevaron a cabo entre los diversos mutantes VEGF-Fab, como se describe en el Ejemplo 39. Los resultados se citan en la Tabla 40.1. Los resultados de este Ejemplo demuestran que una correlación significante entre la energía de enlace y rango de afinidad, se obtiene a través de este proceso. El ajuste lineal de la energía de enlace contra el logaritmo de la afinidad relativa, se ilustra en la Figura 17. El coeficiente de correlación de -0.91 indica que la simulación in silico captura en forma precisa la interacción detallada a nivel atómico. Tabla 40.1. Simulación de energía de enlace anticuerpo-antígeno comparada con datos de afinidad.
Número deAfinidad Ln (AfinidadEnergía de Número Kabat Secuencia Relativa Relativa) Enlace H97Y 101Y 14 2.639 -59.065 SlOOaT 105T 1.9 0.642 -57.465 T28D 28D 1.4 0.336 -57.647 28D31H 28D31H 3.1 1.131 -57.699 28D31H97Y100aT 28D31H101Y105T 20 2.995 -59.518 N31H 31H 3.6 1.281 -57.724 Y53W 54 1.3 0.262 -57.504 71I73K 72I74K 0.9 -0.105 -57.158 71V73V 72V74V 0.3 -1.204 -57.314 WT T 1 0.000 -57.404 Como es claro de los anteriores Ejemplos, la simulación puede extrapolarse para identificar mutantes de superior afinidad sin el uso de experimentación in vitro. Adicionalmente, es claro que este enfoque es útil para diferentes anticuerpos y para diferentes péptidos . Esta metodología puede aplicarse en general para realizar maduración de afinidad in silico, utilizando solo una estructura compleja anticuerpo-antígeno de alta resolución. En una modalidad, este uso de maduración de afinidad in silico ahorrará tremendas cantidades de tiempo y recursos. Ejemplo 41 Determinación de clases canónicas de anticuerpos Chothia, y colaboradores han descrito estructura de anticuerpo en términos de "clases canónicas" para las regiones hipervariables de cada cadena inmunoglobulina (J. Mol. Biol. 1987 Aug 20 ; 196 (4) : 901-17) . Las estructuras atómicas de los fragmentos Fab y VL de una variedad de inmunoglobulinas se analizaron para determinar la relación entre subsecuencias de amino ácido y las estructuras tridimensionales de sus sitios de enlace antígeno. Chothia, y colaboradores encontraron que hubo relativamente pocos residuos que, a través de su empaque, enlaces de hidrógeno o la capacidad para adquirir conformaciones phi, psi u omega no usuales, fueron primordialmente responsables por las conformaciones de cadena principales de las regiones hipervariables . Estos residuos se encuentra que ocurren en sitios dentro de las regiones hipervariables y en el marco de hoja beta conservado. Al examinar secuencias de inmunoglobulinas que tienen estructuras desconocidas, Chothia y colaboradores muestran que muchas inmunoglobulinas tienen regiones hipervariables que son similares en tamaño a una de las estructuras conocidas y adicionalmente contienen residuos idénticos en los sitios responsables para la conformación observada. t Su descubrimiento implica que estas regiones hipervariables tienen conformaciones cercanas a aquellas en las estructuras conocidas. Para cinco de las regiones hipervariables, el repertorio de conformaciones parece estar limitado a un número relativamente pequeño de clases estructurales discretas . Estas conformaciones de cadena principal de origen común de las regiones hipervariables se denominaron "estructuras canónicas". Adicional trabaj o de Chothia y colaboradores . (Nature . 1989 Dec 21-28 ; 342 (6252) : 877-83) y otros (Martin, y colaboradores. J Mol Biol . 1996 Nov 15 ; 263 (5) : 800-15) confirma que hay un repertorio pequeño de conformaciones de cadena principal para al menos cinco de las seis regiones hipervariables de anticuerpos . Algunos de los anticuerpos anteriormente descrito se analizaron para determinar las clase canónica para cada una de las regiones de determinación de complementariedad de anticuerpo (CDRs) . Como se conoce, las clases canónicas solo se han asignado para CDR1 y CDR2 de la cadena pesada de anticuerpo, junto con CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de anticuerpo. La siguiente tabla (41.1) resume los resultados del análisis. Los datos de clase canónica están en la forma de *HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3, en donde "HCDR" se refiere a la cadena pesada CDR y "LCDR" se refiere a la cadena ligera CDR. De esta manera, por ejemplo, una clase canónica de 1-3-2-1-5 se refiere a un anticuerpo que tiene un HCDR1 que cae en la clase canónica 1, un HCDR2 que cae en la clase canónica 3 , un LCDR1 que cae en la clase canónica 2, un LCDR2 que cae en la clase canónica 1 , y un LCDR3 que cae en la clase canónica 5. Tabla 41.1 H1-H2-L1- mAb L2-L3 139 1-3-2-1-1 250 1-3-2-1-1 123 1-3-4-1-1 131 1-3-4-1-1 13_1_2 1-3-4-1-1 211 1-3-4-1-1 318 1-3-4-1-1 333 1-3-4-1-1 342 1-3-4-1-1 95 3-1-4-1-1 150 3-Y-4-1-1 170 3-Y-4-1-1 Cada CDR (excepto por H3) fue asignado a una estructura canónica si satisface el requerimiento de longitud y corresponde a los residuos clave definidos en la clase canónica. Los amino ácidos definidos para cada anticuerpo pueden encontrarse, por ejemplo, en los artículos por Chothia, y colaboradores, referidos anteriormente . EQUIVALENTES [0412] La siguiente descripción y Ejemplos detallan ciertas modalidades de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Se apreciará sin embargo que no importa que tan detallado pueda aparecer en texto lo anterior, la invención pueda practicarse en muchas formas y la invención deberá considerarse de acuerdo con las reivindicaciones anexas y cualesquiera de sus equivalentes.

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que liga específicamente al péptido que comprende la secuencia L E E K K G N Y V V T D H C (SEQ ID NO: 56) y que inhibe el enlace de factor de crecimiento epidérmico (EGF) al receptor de factor de crecimiento epidérmico vIII (EGFRvIII) , en donde el anticuerpo se asocia con una toxina seleccionada del grupo que consiste de toxina Auristatina E (AEFP) , monometil Auristatina E (????) , Auristatina E, Maytansinoide (DM-1) y proteína zeta-asociada (ZAP) .
  2. 2. El anticuerpo monoclonal humano aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque liga específicamente a un epítopo de EGFRvIII, en donde el epítopo comprende la secuencia LEEKKGNYVVTDHC (SEQ ID NO: 56) .
  3. 3. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo reconoce específicamente un residuo glicina en la posición 6 de un epítopo que comprende LEEKKGNYVVTDHC (SEQ ID NO : 56) .
  4. 4. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo además comprende el péptido que tiene la secuencia EEKKGNYWT (SEQ ID NO: 57) .
  5. 5. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se asocia con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  6. 6. El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal totalmente humano.
  7. 7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo tiene una KD inferior a 1.3*1CT9 M.
  8. 8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo tiene una KD inferior a 500 pM.
  9. 9. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es capaz de ser internalizado.
  10. 10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en asociación con un diluyente del portador farmacéuticamente aceptable.
  11. 11. Un método para exterminar una célula diana in vitro, caracterizado porque comprende: contactar la célula diana con un anticuerpo asociado con una toxina, en donde el anticuerpo liga a un péptido que tiene una secuencia LEEKKGNY (SEQ ID NO: 133) y el péptido se expresa por la célula diana, y en donde la toxina es una toxina Auristatina E (AEFP) , monometil Auristatina E ( ???) , Auristatina E, Maytansinoide (DM-1) o proteína zeta-asociada (???) .
  12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo asociado con la toxina es cuando menos diez veces más tóxico a la célula objetivo que a células que no expresan el péptido.
  13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo se asocia con la toxina mediante un enlazador péptido.
  14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo se asocia con la toxina mediante un segundo anticuerpo.
  15. 15. Uso del anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 10, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de células de cáncer que expresan Factor de Crecimiento Epidérmico vIII (EGF vIII) .
  16. 16. Uso de la reivindicación 15, caracterizado porque las células de cáncer son células epiteliales.
  17. 17. Uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque las células de cáncer se eligen del grupo que consiste de células de cáncer de pulmón, de colon, gástricas, renal, próstata, de pecho, glioblastoma o de ovarios.
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Families Citing this family (152)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1392359B2 (en) 2001-05-11 2013-03-13 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Specific binding proteins and uses thereof
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
DK1399484T3 (da) * 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
US20050271663A1 (en) * 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
US7658924B2 (en) * 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
CN1678634A (zh) * 2002-06-28 2005-10-05 多曼蒂斯有限公司 免疫球蛋白单个变体抗原结合区及其特异性构建体
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
US9321832B2 (en) * 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
JP2006523090A (ja) * 2002-12-27 2006-10-12 ドマンティス リミテッド リガンドに、そしてリガンド受容体に特異的な二重特異性単一ドメイン抗体
SI1897548T2 (sl) * 2003-02-28 2024-09-30 The Johns Hopkins University Regulacija celic T
KR101531400B1 (ko) 2003-06-27 2015-06-26 암젠 프레몬트 인코포레이티드 상피 성장 인자 수용체의 결실 돌연변이체 지향 항체 및 그용도
CA2589374C (en) * 2004-11-30 2016-05-03 Curagen Corporation Antibodies directed to gpnmb and uses thereof
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
EP1739179A1 (en) * 2005-06-30 2007-01-03 Octapharma AG Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines
NZ609752A (en) 2005-08-24 2014-08-29 Immunogen Inc Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
DK1951759T3 (da) 2005-11-12 2010-05-10 Lilly Co Eli Anti-EGFR-antistoffer
WO2007063308A2 (en) * 2005-12-01 2007-06-07 Domantis Limited Noncompetitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1
DOP2006000277A (es) * 2005-12-12 2007-08-31 Bayer Pharmaceuticals Corp Anticuerpos anti mn y métodos para su utilización
AR059900A1 (es) * 2006-03-17 2008-05-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-tat226 e inmunoconjugados
WO2007123661A2 (en) * 2006-03-31 2007-11-01 Massachusetts Institute Of Technology Treatment of tumors expressing mutant egf receptors
EP2010568A1 (en) * 2006-04-14 2009-01-07 Ablynx N.V. Dp-78-like nanobodies
CN104013956B (zh) 2007-01-25 2018-12-18 达娜-法勃肿瘤研究所公司 抗egfr抗体在治疗egfr突变体介导的疾病中的用途
US9340601B2 (en) * 2007-03-01 2016-05-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Splice variants of the EGF receptor
WO2008115404A1 (en) * 2007-03-15 2008-09-25 Ludwing Institute For Cancer Research Treatment method using egfr antibodies and src inhibitors and related formulations
KR20100040840A (ko) * 2007-06-06 2010-04-21 도만티스 리미티드 폴리펩티드，항체 가변 도메인 및 길항제
US20090011060A1 (en) * 2007-07-06 2009-01-08 Peter Koepke Campsiandra angustifolia extract and methods of extracting and using such extract
US20100120134A1 (en) * 2007-07-19 2010-05-13 Texas Clean Fuels, Inc. Micro-organism production apparatus and system
US20090023199A1 (en) * 2007-07-19 2009-01-22 New England Clean Fuels, Inc. Micro-organism production system and method
WO2009012488A1 (en) * 2007-07-19 2009-01-22 Duke University Assay for human anti-egrf variant iii antibodies
ES2609915T3 (es) 2007-08-14 2017-04-25 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Anticuerpo monoclonal 175 direccionado al receptor de EGF y derivados y usos del mismo
US7879369B2 (en) 2007-09-18 2011-02-01 Selvamedica, Llc Combretum laurifolium Mart. extract and methods of extracting and using such extract
SG187477A1 (en) * 2007-09-26 2013-02-28 U3 Pharma Gmbh Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor antigen binding proteins
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
WO2009149094A2 (en) * 2008-06-02 2009-12-10 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Cytotoxic t cell defined egfr peptide and an optimized derivative peptide
PT2437790T (pt) 2009-06-03 2019-06-04 Immunogen Inc Métodos de conjugação
EP2481754B1 (en) * 2009-09-22 2014-06-18 Shanghai Yijie Biotechnology Co., Ltd Specific binding proteins and uses thereof
US20110076232A1 (en) * 2009-09-29 2011-03-31 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
TWI483736B (zh) * 2009-10-23 2015-05-11 Millennium Pharm Inc 抗－ｇｃｃ抗體分子及其相關之組合物及方法
JP5956342B2 (ja) * 2009-11-03 2016-07-27 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ 形質導入Ｔ細胞選択のためのトランケート上皮増殖因子レセプタ（ＥＧＦＲｔ）
US20130034573A1 (en) * 2009-12-22 2013-02-07 Celldex Therapeutics, Inc. Vaccine compositions
WO2011156617A2 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-egfr antibodies
EP2632490A4 (en) 2010-10-29 2014-10-22 Immunogen Inc NOVEL MOLECULES BINDING TO THE EGF RECEPTOR AND IMMUNOCONJUGATES THEREOF
EA201390575A1 (ru) 2010-10-29 2014-01-30 Иммьюноджен, Инк. Неантагонистические egfr-связывающие молекулы и их иммуноконъюгаты
US9249217B2 (en) * 2010-12-03 2016-02-02 Secretary, DHHS Bispecific EGFRvIII x CD3 antibody engaging molecules
SG192047A1 (en) * 2011-01-24 2013-08-30 Univ Singapore Pathogenic mycobacteria-derived mannose-capped lipoarabinomannan antigen binding proteins
CA3115406A1 (en) 2011-01-24 2012-08-02 National Research Council Of Canada Antibodies selective for cells presenting egfr at high density
SG193996A1 (en) 2011-03-29 2013-11-29 Immunogen Inc Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
JP2014510757A (ja) * 2011-03-29 2014-05-01 イムノゲン インコーポレーティッド 均質性が改善された複合体を製造する工程
RS58367B1 (sr) 2011-03-29 2019-03-29 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
PT2694549T (pt) * 2011-04-08 2018-11-22 Us Health Recetores de antigénio quimérico variante iii de recetor de fator de crescimento antiepidérmico e utilização do mesmo para o tratamento de cancro
CA2833477A1 (en) 2011-04-21 2012-10-26 Seattle Genetics, Inc. Novel binder-drug conjugates (adcs) and their use
DK2760471T3 (en) 2011-09-30 2017-05-08 Dana Farber Cancer Inst Inc THERAPEUTIC PEPTIDES
EA201490974A1 (ru) * 2011-11-16 2014-09-30 Эмджен Инк. СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАССТРОЙСТВ, СВЯЗАННЫХ С ДЕЛЕЦИОННЫМ МУТАНТОМ vIII ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА
RU2014121820A (ru) 2011-11-21 2015-12-27 Иммьюноджен, Инк. Способ лечения опухолей, устойчивых к анти-egfr терапиям, с помощью конъюгата антитела egfr с цитотоксическим средством
SG11201404313YA (en) 2012-01-25 2014-10-30 Dnatrix Inc Biomarkers and combination therapies using oncolytic virus and immunomodulation
BR112014019049A2 (pt) * 2012-02-02 2017-07-04 Univ Texas adenovirus imunogênico
DK2832363T3 (en) * 2012-03-27 2019-01-07 Green Cross Corp Epitopes of epidermal growth factor receptor surface antigen and use thereof
CN103382223B (zh) 2012-04-01 2015-06-10 上海益杰生物技术有限公司 针对表皮生长因子受体隐蔽表位和t细胞抗原的多功能抗体多肽
US9676858B2 (en) 2012-06-07 2017-06-13 Duke University Human bispecific EGFRvIII antibody and CD3 engaging molecules
JP2015527564A (ja) * 2012-06-07 2015-09-17 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 自己免疫抗体
WO2014022835A2 (en) * 2012-08-02 2014-02-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University PEPTIDE VACCINES BASED ON THE EGFRvIII SEQUENCE FOR THE TREATMENT OF TUMORS
IN2015DN03202A (es) 2012-10-04 2015-10-02 Immunogen Inc
RS53818B1 (en) 2012-10-12 2015-06-30 Spirogen Sàrl PIROLOBENZODIAZEPINI I NJIHOVI conjugated
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
US20160075788A1 (en) * 2013-02-15 2016-03-17 Exosome Diagnostics, Inc. A Novel EGFR Variant
US9394368B2 (en) 2013-02-20 2016-07-19 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-EGFRvIII chimeric antigen receptor
BR112015023333A8 (pt) 2013-03-13 2018-04-17 Medimmune Ltd pirrolbenzodiazepinas e conjugados dos mesmos
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
US20160319034A1 (en) * 2013-03-14 2016-11-03 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Met-binding agents and uses thereof
MY183572A (en) 2013-03-15 2021-02-26 Regeneron Pharma Biologically active molecules, conjugates thereof, and therapeutic uses
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
ES2837628T3 (es) 2013-03-15 2021-07-01 Celgene Corp Linfocitos T modificados
NZ629816A (en) 2013-03-15 2017-07-28 Dana Farber Cancer Inst Inc Therapeutic peptides
BR112015025347A2 (pt) 2013-04-09 2017-07-18 Boston Biomedical Inc 2-acetil-nafto [2-3-b] furan-4,9-diona para uso no tratamento do câncer
JP6462673B2 (ja) 2013-07-05 2019-01-30 フォーメーション バイオロジックス インコーポレイテッド Ｅｇｆｒ抗体コンジュゲート
AU2014287244B2 (en) 2013-07-09 2017-06-15 Duke University Certain improved human bispecific EGFRvIII antibody engaging molecules
RU2696892C2 (ru) * 2013-08-07 2019-08-07 Аффимед Гмбх САЙТЫ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНО СВЯЗЫВАЮЩИЕ EGFRvIII
WO2015031396A1 (en) 2013-08-26 2015-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising macrolide diastereomers, methods of their synthesis and therapeutic uses
AU2014318017B2 (en) 2013-09-05 2020-02-06 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
EP3043810B1 (en) 2013-09-09 2019-10-23 CanImGuide Therapeutics AB Immune system modulators
CA2931322A1 (en) 2013-11-22 2015-05-28 Dnatrix, Inc. Adenovirus expressing immune cell stimulatory receptor agonist(s)
CN106029694A (zh) 2013-12-06 2016-10-12 达纳-法伯癌症研究院公司 治疗性肽
DK3086814T3 (da) 2013-12-23 2020-09-14 Bayer Pharma AG Binder-konjugater (adcs) med ksp-inhibitorer
SG11201606979TA (en) 2014-03-11 2016-09-29 Regeneron Pharma Anti-egfrviii antibodies and uses thereof
CA3124243A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Vaccine compositions and methods for restoring nkg2d pathway function against cancers
PE20161211A1 (es) * 2014-03-21 2016-11-27 Abbvie Inc Anticuerpos y conjugados de anticuerpo y farmaco anti-egfr
EP3467501B1 (en) 2014-05-16 2020-11-04 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
JP6800021B2 (ja) 2014-06-02 2020-12-16 レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド 抗体−薬物コンジュゲート、それらの製造、及びそれらの治療用途
WO2016014565A2 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
US10568947B2 (en) 2014-07-21 2020-02-25 Novartis Ag Treatment of cancer using a CLL-1 chimeric antigen receptor
CN106687141A (zh) 2014-09-10 2017-05-17 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其缀合物
WO2016062851A1 (en) 2014-10-23 2016-04-28 Innate Pharma Treatment of cancers using anti-nkg2a agents
MA40934A (fr) 2014-11-19 2017-09-27 Immunogen Inc Procédé de préparation de conjugués agent de liaison cellulaire-agent cytotoxique
PT3239177T (pt) * 2014-11-25 2021-05-14 Pharmabcine Inc Novo anticorpo egfrviii e composição compreendendo o mesmo
DK3265117T3 (da) 2015-03-06 2021-02-08 Canimguide Therapeutics Ab Immunsystemmodulatorer og præparater
US20180086832A1 (en) * 2015-03-23 2018-03-29 The Johns Hopkins University Hla-restricted epitopes encoded by somatically mutated genes
CA2988126A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Boston Biomedical, Inc. Compositions comprising a cancer stemness inhibitor and an immunotherapeutic agent for use in treating cancer
PE20180610A1 (es) 2015-06-22 2018-04-09 Bayer Pharma AG CONJUGADOS DE LIGADOR-PRINCIPIO ACTIVO (ADCs) Y CONJUGADOS DE LIGADOR-PROFARMACO (APDCs) CON GRUPOS ENZIMATICAMENTE ESCINDIBLES
BR112017027811A2 (pt) 2015-06-23 2018-08-28 Bayer Pharma AG conjugados específicos de inibidores de ksp
CN106349389B (zh) * 2015-07-21 2019-11-15 科济生物医药（上海）有限公司 肿瘤特异性抗egfr抗体及其应用
CN105132357B (zh) * 2015-07-29 2019-12-06 苏州诺普再生医学有限公司 一种用于表皮细胞培养的无血清培养体系
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
DK3405490T3 (da) * 2016-01-21 2022-01-10 Pfizer Mono- og bispecifikke antistoffer mod epidermal vækstfaktorreceptor variant iii og cd3 og anvendelser deraf
SG11201806322QA (en) 2016-01-25 2018-08-30 Regeneron Pharma Maytansinoid derivatives, conjugates thereof, and methods of use
EA039859B1 (ru) * 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
KR20180105233A (ko) 2016-02-05 2018-09-27 이뮤노젠 아이엔씨 세포 결합제-세포독성제 접합체를 제조하기 위한 효율적인 방법
AU2017219386B2 (en) * 2016-02-15 2019-08-22 Samsung Life Public Welfare Foundation Antibody against EGFRvIII and use thereof
WO2017142294A1 (ko) * 2016-02-15 2017-08-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 EGFRvIII에 대한 항체 및 이의 용도
JP7251981B2 (ja) 2016-03-24 2023-04-04 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 酵素開裂基を有する細胞毒性活性剤のプロドラッグ
SI3626273T1 (sl) * 2016-05-17 2021-04-30 Abbvie Biotherapeutics Inc. Konjugati protitelesa proti CMET in zdravila ter postopki za njihovo uporabo
JP7022707B2 (ja) 2016-06-15 2022-02-18 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤および抗ｃｄ１２３抗体を含む特異的抗体－薬物－コンジュゲート（ａｄｃ）
JP2019534882A (ja) 2016-10-11 2019-12-05 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ 免疫介在性療法薬を有する抗体−薬物コンジュゲート
JP7100028B2 (ja) 2016-10-20 2022-07-12 セルジーン コーポレイション セレブロン系のヘテロ二量体化可能なキメラ抗原受容体
US11299469B2 (en) 2016-11-29 2022-04-12 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Naphthofuran derivatives, preparation, and methods of use thereof
KR20190099250A (ko) 2016-12-21 2019-08-26 바이엘 악티엔게젤샤프트 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 세포독성 활성제의 전구약물
WO2018114578A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
CA3047522A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody drug conjugates (adcs) having ksp inhibitors
SG11201908328XA (en) 2017-03-14 2019-10-30 Amgen Inc Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
JP2020517259A (ja) 2017-04-19 2020-06-18 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 操作された抗原受容体を発現する免疫細胞
AU2018269370A1 (en) 2017-05-16 2019-12-05 The Johns Hopkins University Manabodies and methods of using
WO2018213424A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Boston Biomedical, Inc. Methods for treating cancer
US20190049448A1 (en) * 2017-08-11 2019-02-14 Wipro Limited Method and device for identifying cancer
WO2019035630A2 (ko) * 2017-08-14 2019-02-21 사회복지법인 삼성생명공익재단 인간 상피 성장 인자 수용체 변이체 ⅲ에 결합하는 항체 및 그의 항체 단편
WO2019035649A1 (ko) * 2017-08-14 2019-02-21 주식회사 레고켐 바이오사이언스 EGFRvIII에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체
CN107367611B (zh) * 2017-09-05 2019-11-12 贵州医科大学 表皮生长因子受体ⅲ型突变体的elisa检测试剂盒
EA202092286A1 (ru) 2018-03-26 2021-03-18 Эмджен Инк. Общие афукозилированные гликоформы антител, полученные в культуре клеток
KR20210016562A (ko) 2018-05-23 2021-02-16 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 분자 애쥬번트
JP7438988B2 (ja) 2018-06-13 2024-02-27 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａキメラ抗原受容体及びその使用
KR101953299B1 (ko) * 2018-08-02 2019-02-28 의료법인 성광의료재단 EGFRvIII에 대한 항체 및 이의 이용
AU2019397152A1 (en) * 2018-12-14 2021-06-24 2Seventy Bio, Inc. Dimerizing agent regulated immunoreceptor complexes
AU2019414793A1 (en) 2018-12-26 2021-06-24 Innate Pharma Compounds and methods for treatment of head and neck cancer
AU2020249296A1 (en) * 2019-03-27 2021-11-11 National Research Council Of Canada Anti-EGFRvIII antibodies and antigen-binding fragments thereof
BR112022005583A2 (pt) 2019-09-26 2022-09-20 Amgen Inc Métodos para a produção de composições de anticorpos
US20220411516A1 (en) * 2019-11-07 2022-12-29 Amgen Inc. Dosage regimen for anti-egfrviii agents
CN110922484B (zh) * 2020-02-18 2020-05-08 南京诺艾新生物技术有限公司 抗EGFRvIII抗体及其在疾病诊断或治疗中的应用
CN111548417B (zh) * 2020-04-03 2022-05-03 首都医科大学附属北京胸科医院 EGFRvIII和EGFR的双特异性人源抗体及其应用
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
MX2023004364A (es) 2020-10-15 2023-05-03 Amgen Inc Glucanos no emparejados relativos en metodos de produccion de anticuerpos.
US20230372528A1 (en) 2020-10-16 2023-11-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycoconjugates
CA3205463A1 (en) * 2020-12-18 2022-06-23 Bioardis, Llc Cea6 binding molecules and uses thereof
US20240084029A1 (en) * 2021-01-20 2024-03-14 Oncoresponse, Inc. Use of immunomodulatory antibodies to treat fibrotic diseases
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
WO2022261021A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
KR20240024061A (ko) 2021-06-22 2024-02-23 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-EGFRvIII 항체 약물 접합체 및 이의 용도
CA3233279A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2024081686A2 (en) * 2022-10-11 2024-04-18 Ibio, Inc. Epidermal growth factor receptor variant iii antibodies
WO2024220916A1 (en) 2023-04-20 2024-10-24 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content

Family Cites Families (166)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US634219A (en) * 1899-05-18 1899-10-03 Henry H Sessions Draw-bar-attaching means.
US1234567A (en) * 1915-09-14 1917-07-24 Edward J Quigley Soft collar.
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4229389A (en) 1979-03-16 1980-10-21 Thompson Marine Corporation Gas diffuser, aerator, or sparger apparatus
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
ATE12348T1 (de) 1980-11-10 1985-04-15 Gersonde Klaus Prof Dr Verfahren zur herstellung von lipid-vesikeln durch ultraschallbehandlung, anwendung des verfahrens und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens.
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4414205A (en) 1981-08-28 1983-11-08 University Patents, Inc. Cell growth inhibitory substances
JPS58118008A (ja) 1982-01-06 1983-07-13 Nec Corp デ−タ処理装置
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
JPS58166633A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
JPS58166634A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
DE3218121A1 (de) 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
EP0102324A3 (de) 1982-07-29 1984-11-07 Ciba-Geigy Ag Lipide und Tenside in wässriger Phase
US4486414A (en) 1983-03-21 1984-12-04 Arizona Board Of Reagents Dolastatins A and B cell growth inhibitory substances
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
JPS607934A (ja) 1983-06-29 1985-01-16 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd リポソ−ムの製造方法
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0142641B1 (de) 1983-09-26 1991-01-16 Udo Dr. Ehrenfeld Mittel und Erzeugnis für die Diagnose und Therapie von Tumoren sowie zur Behandlung von Schwächen der zelligen und humoralen Immunabwehr
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
JPS62170639A (ja) 1986-01-22 1987-07-27 株式会社システムメンテナンス 防蟻板の取付け工法
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US5055291A (en) 1986-11-04 1991-10-08 Baylor College Of Medicine Compositions for preventing secondary cataracts
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US4816444A (en) 1987-07-10 1989-03-28 Arizona Board Of Regents, Arizona State University Cell growth inhibitory substance
US4981979A (en) 1987-09-10 1991-01-01 Neorx Corporation Immunoconjugates joined by thioether bonds having reduced toxicity and improved selectivity
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5076973A (en) 1988-10-24 1991-12-31 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 3
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
US5576288A (en) * 1989-04-27 1996-11-19 The Salk Institute For Biological Studies Fibroblast growth factor conjugates
US4879278A (en) 1989-05-16 1989-11-07 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptide dolastatin 15
US4986988A (en) 1989-05-18 1991-01-22 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear depsipeptides dolastatin 13 and dehydrodolastatin 13
US5102990A (en) 1989-08-09 1992-04-07 Rhomed Incorporated Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium
ATE135373T1 (de) 1989-09-08 1996-03-15 Univ Johns Hopkins Modifikationen der struktur des egf-rezeptor-gens in menschlichen glioma
US5981725A (en) 1989-09-08 1999-11-09 The Johns Hopkins Univiersity Structural alterations of the EGF receptor gene in human tumors
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5138036A (en) 1989-11-13 1992-08-11 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Isolation and structural elucidation of the cytostatic cyclodepsipeptide dolastatin 14
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5612205A (en) 1990-08-29 1997-03-18 Genpharm International, Incorporated Homologous recombination in mammalian cells
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2089661C (en) 1990-08-29 2007-04-03 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5194594A (en) 1990-09-07 1993-03-16 Techniclone, Inc. Modified antibodies
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH067934A (ja) 1992-01-16 1994-01-18 Nippon Steel Corp 二重管の管端シール溶接方法
AU4541093A (en) 1992-06-18 1994-01-24 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US5372783A (en) 1992-08-03 1994-12-13 Sapidyne, Inc. Assay system
US5958708A (en) 1992-09-25 1999-09-28 Novartis Corporation Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5401020A (en) 1993-07-22 1995-03-28 Dutton; Craig E. Device for simulating breaking football tackles
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE29507422U1 (de) * 1994-05-10 1995-06-29 Philips Electronics N.V., Eindhoven Gesockelte Hochdruckentladungslampe
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
EP0796277B1 (en) * 1994-11-28 2004-03-24 Thomas Jefferson University Fusion junction type iii mutant egf receptor peptide tumour vaccine
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ATE208403T1 (de) * 1995-05-26 2001-11-15 Merck Patent Gmbh Antiidiotypische antikörper die eine immunantwort gegen den rezeptor für epidermalen wachstumsfaktor induzieren
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
ATE352613T1 (de) 1995-08-29 2007-02-15 Kirin Brewery Chimäres tier und methode zu dessen herstellung
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP0941334B1 (en) 1996-11-06 2004-06-02 THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Protease-activatable pseudomonas exotoxin a-like proproteins
PT1500329E (pt) 1996-12-03 2012-06-18 Amgen Fremont Inc Anticorpos humanos que se ligam especificamente ao tnf alfa humano
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6244868B1 (en) * 1997-12-10 2001-06-12 Douglas Alan Schappert Integrated guided-tissue-regeneration barrier for root-form dental implants
AU2978899A (en) 1998-03-03 1999-09-20 Abgenix, Inc. Cd147 binding molecules as therapeutics
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
US6914128B1 (en) * 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
US6163963A (en) * 1999-04-14 2000-12-26 Huang; Yin Han Utility knife
DE60011612T2 (de) 1999-04-28 2005-07-07 Board of Regents, The University of Texas System, Austin Zusammensetzungen und Verfahren zur Krebsbehandlung durch die selektive Hemmung von VEGF
US6492497B1 (en) 1999-04-30 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for TGFbeta1
DE60040981D1 (de) 1999-05-14 2009-01-15 Genentech Inc BEHANDLUNG MIT ANTI-ErbB2 ANTIKÖRPERN
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
BRPI0012196B8 (pt) * 1999-06-25 2021-05-25 Genentech Inc artigo industrializado
WO2001024763A2 (en) 1999-10-01 2001-04-12 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US6455598B1 (en) * 1999-10-22 2002-09-24 Aster Roof Cover, Inc. Roof sealant composition and method of applying
WO2001062801A2 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Washington University Humanized antibodies that sequester amyloid beta peptide
HUP0204142A3 (en) 2000-02-25 2004-12-28 Univ Durham Anti-egfrviii scfv-antibodies with improved cytotoxicity and yield, immunotoxins based thereon, and methods of use thereof
US6946546B2 (en) 2000-03-06 2005-09-20 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibodies against eotaxin
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
EP1272647B1 (en) * 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US20030059427A1 (en) 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
AU2001268427B2 (en) 2000-06-16 2007-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7220840B2 (en) 2000-06-16 2007-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator protein
AUPQ841800A0 (en) 2000-06-28 2000-07-20 Biomolecular Research Institute Limited Truncated egf receptor
JP4340062B2 (ja) 2000-10-12 2009-10-07 ジェネンテック・インコーポレーテッド 粘度の減少した濃縮タンパク質製剤
WO2002086085A2 (en) 2001-04-24 2002-10-31 Bayer Corporation Human timp-1 antibodies
IL149701A0 (en) 2001-05-23 2002-11-10 Pfizer Prod Inc Use of anti-ctla-4 antibodies
US6441163B1 (en) * 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
DE60233509D1 (de) 2001-06-20 2009-10-08 Fibron Ltd Fgfr3 blockierende antikörper, verfahren zum screening darauf und verwendungen davon
US7084257B2 (en) * 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
US20050123536A1 (en) 2001-11-20 2005-06-09 Che-Leung Law Treatment of immunological disorders using anti-dc30 antibodies
EP1461442B1 (en) 2001-11-30 2017-09-06 Amgen Fremont Inc. Transgenic animals bearing human ig lambda light chain genes
EP1554576B9 (en) 2001-12-03 2008-08-20 Amgen Fremont Inc. Identification of high affinity molecules by limited dilution screening
DE60226641D1 (de) 2001-12-03 2008-06-26 Amgen Fremont Inc Antikörperkategorisierung auf der grundlage von bindungseigenschaften
KR100708398B1 (ko) 2002-03-22 2007-04-18 (주) 에이프로젠 인간화 항체 및 이의 제조방법
KR200289359Y1 (ko) 2002-05-31 2002-09-16 파츠닉(주) 편향요크의 마그네트링 지지구조
KR200290873Y1 (ko) 2002-05-31 2002-10-04 최대용 다기능 액정 텔레비전
US6875433B2 (en) 2002-08-23 2005-04-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Monoclonal antibodies and complementarity-determining regions binding to Ebola glycoprotein
MEP32508A (en) 2002-09-06 2010-10-10 Amgen Inc Therapeutic human anti-il-1r1 monoclonal antibody
JP2006501856A (ja) 2002-10-09 2006-01-19 インテグリジェン， インコーポレイテッド 組換え触媒ポリペプチドおよびその使用
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
US20040147428A1 (en) 2002-11-15 2004-07-29 Pluenneke John D. Methods of treatment using an inhibitor of epidermal growth factor receptor
AU2003298816C1 (en) 2002-12-02 2010-12-16 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to Tumor Necrosis Factor and uses thereof
AU2004224390A1 (en) 2003-03-19 2004-10-07 Abgenix, Inc. Antibodies against T cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (TIM-1) antigen and uses thereof
JP4999158B2 (ja) 2003-05-21 2012-08-15 メダレツクス・インコーポレーテツド 炭疽菌（ｂａｃｈｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原に対するヒトモノクローナル抗体
KR101531400B1 (ko) 2003-06-27 2015-06-26 암젠 프레몬트 인코포레이티드 상피 성장 인자 수용체의 결실 돌연변이체 지향 항체 및 그용도
KR200338557Y1 (ko) 2003-10-17 2004-01-16 강윤성 과일포장용 팔각상자
US7268986B2 (en) * 2004-03-31 2007-09-11 Hitachi Global Storage Technologies Netherlands B.V. Double tunnel junction using self-pinned center ferromagnet
EP2361933A3 (en) 2005-01-26 2012-05-02 Amgen Fremont Inc. Antibodies against interleukin-1 beta
EP1957115B8 (en) 2005-11-10 2014-03-05 Celldex Therapeutics, Inc. Method of treating ovarian and renal cancer using antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen
US7566605B2 (en) 2006-03-31 2009-07-28 Intel Corporation Epitaxial silicon germanium for reduced contact resistance in field-effect transistors
US7605251B2 (en) 2006-05-11 2009-10-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the PCSK9 gene
JP4616237B2 (ja) 2006-11-07 2011-01-19 日本電信電話株式会社 シリコン化合物薄膜の形成方法
AR064826A1 (es) 2007-01-09 2009-04-29 Wyeth Corp Formulaciones de anticuerpos anti-il-13 y usos de los mismos. dispositivos, parche y jeringa
CA2713251A1 (en) 2008-02-07 2009-08-13 Trustees Of Tufts College 3-dimensional silk hydroxyapatite compositions
AU2009294414A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Medimmune Llc Antibodies directed to CD105 and uses thereof
DE102011052852A1 (de) 2011-08-19 2013-02-21 Gustav Klauke Gmbh Pressvorrichtung
EA201490974A1 (ru) 2011-11-16 2014-09-30 Эмджен Инк. СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАССТРОЙСТВ, СВЯЗАННЫХ С ДЕЛЕЦИОННЫМ МУТАНТОМ vIII ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置
US11284893B2 (en) 2019-04-02 2022-03-29 Covidien Lp Stapling device with articulating tool assembly

Also Published As

Publication number Publication date
AU2010202054A1 (en) 2010-06-10
KR20120130014A (ko) 2012-11-28
KR20120060788A (ko) 2012-06-12
JP2011088901A (ja) 2011-05-06
JP6328928B2 (ja) 2018-05-23
CA2530172A1 (en) 2005-02-10
MXPA05014152A (es) 2006-05-25
CA2530285A1 (en) 2005-02-03
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