RO110397B1 - Vaccin pentru prevenirea sau tratarea unor boli care rezulta din raspunsuri patogene, prin populatii de celule t specifice, procedeu de obtinere si metode de diagnostic si tratament cu acesta - Google Patents

Description

Invenția de față se referă la un vaccin pentru prevenirea sau tratarea unor boli care rezultă din răspunsuri patogene prin populații de celule T specifice, la un procedeu de obținere al acestuia, precum și la metode de diagnostic și tratament cu vaccinul, pentru modificarea răspunsurilor patologic imune.

Organismele superioare sunt caracterizate printr-un sistem imun care le protejează împotriva invaziei de microorganisme sau substanțe potențial vătămătoare. Când o substanță denumită antigen, întră în corp, și este recunoscută ca fiind străină, sistemul imun produce, atât un răspuns mediat de anticorpi, cât și un răspuns mediat de celule. Celulele sistemului imun denumite limfocite B sau celule B, produc anticorpi care recunosc în mod specific substanțele străine și le leagă. Alte limfocite denumite limfocite T, sau celule T, regularizează și efectuează răspunsul mediat de celule ducând eventual la eliminarea antigenului.

în răspunsul mediat de celule sunt antrenate variate celule T. Unele celule T induc coloni specifici de celule B pentru proliferarea și producerea de anticorpi specifici pentru antigen. Alte celule T recunosc și distrug celulele care prezintă antigeni străini pe suprafața lor. Anumite celule T regularizează răspunsul, fie prin stimularea, fie prin reprimarea altor celule.

Deși sistemul imun normal este regularizat în mod strâns, se întâlnesc și aberații în răspunsul imun. în unele exemple, sistemul imun funcționează în mod inadecvat și reacționează față de o componentă a gazdei, ca și cum ar fi, de fapt, străin. Un astfel de răspuns duce la o boală de autoimunitate, în care sistemul imun al gazdei atacă țesutul propriu al gazdei. Celulele T, ca regulatori primari ai sistemului imun efectuează în mod direct sau indirect asemenea patologii de autoimunitate.

Se consideră că numeroase boli rezultă din mecanismul autoimunitar. Printre aceste boli sunt importante artrita reumatoidă, lupus eritematos sistemic, scleroza multiplă, diabetul de tip I, myastenia gravis și pemphigus vulgaris. Bolile de autoimunitate afectează milioane de indivizi, pe scară mondială și costul acestor boli, exprimat sub formă de tratament propriu-zis și cheltuieli și pierderi de productivitate, este măsurat în milioane de dolari anual. în prezent nu se cunosc tratamente eficiente pentru astfel de patologii autoimune. în mod obișnuit se poate trata numai simptomele, pe când boala continuă să progreseze, rezultând adesea debilizări severe sau chiar mortale.

în alte exemple, limfocitele răspund în mod inadecvat și fără control. Astfel de replicări duc la forme canceroase cunoscute ca lymphomul. Când limfocitele neregularizate sunt de tipul celulelor T, tumoarea se numește lymphom de celule T. în mod similar cum alte boli maligne, lymphomul de celulă T este greu de tratat în mod eficient.

Astfel există o necesitate pentru a obține un mijloc eficient de vindecare sau de ameliorare a patologiilor mediate de celulele T. Un astfel de tratament ar trebui să regleze în primul rând răspunsul incorect al celulelor T, mai mult decât să reducă simptomele.

Sistemul imunitar este apărarea biologică primară a gazdei (însăși) împotriva unor agenți pernicioși potențiali. Acești agenți pernicioși pot fi patogeni, cum ar fi bacteriile sau virușii, precum și celule proprii modificate, incluzând celule infectate cu viruși, celule de tumori sau alte celule anormale ale gazdei. în mod colectiv, aceste obiective ale sistemului imunitar se denumesc antigeni. Recunoașterea antigenului de către sistemul imunitar mobilizează rapid mecanismele imunitare pentru a distruge acest antigen, apărând astfel inviolabilitatea mediului gazdei.

Manifestările principale ale răspunsului imunitar specific la antigen sunt imunitatea umorală (mediată de anticorpi) și imunitatea celulară (mediată de celule). Fiecare din aceste mecanisme imunologice sunt inițiate prin activitatea celulelor T ajutătoare CD4+. Aceste celule T CD4+, la rândul lor, stimulează celulele B primare pentru sinteza anticorpilor, prin legarea anticorpilor, prin proliferarea și secretarea anticorpilor. Acești anticorpi secretați se leagă de antigen și facilitează distrugerea lui prin alte mecanisme imunitare. în mod similar, celulele T CD4+ produc semnale de stimulare către celulele T citotoxice CD8+ care recunosc și distrug obiectivele celulare (de exemplu, celule infectate ale gazdei). Astfel, activitatea celulelor T CD4+ este evenimentul cel mai apropiat în stimularea unui răspuns imunitar. De aceea elaborarea activității specifice a celulelor T CD4+ specifice pentru mecanismul de supunere a antigenului este crucial în orice încercare de modificare selectivă a funcției imunologice.

Celulele T datorează specificitatea lor împotriva antigenului receptorului celulei T, TCR care este formulat pe suprafața celulei. TCR este o glicoproteină heterodimerică, compusă din două lanțuri de polipeptide, fiecare cu o greutate moleculară de aproximativ 45 kD. S-au identificat două forme de TCR. Una este compusă dintr-un lanț alfa și un lanț beta, pe când cea de-a doua constă dintr-un lanț gama și un lanț delta. Fiecare din aceste patru lanțuri de polipeptide TCR este codificată printr-o poziție genetică distinctă conținând segmente multiple discontinue de gene. Acestea includ segmente de gene de regiune variabilă V , segmente de gene de regiune de joncțiune J și segmente de gene de regiune constantă C . Lanțurile beta și delta conțin un element adițional denumit segmentul de genă de diversitate D . Dat fiind că segmentele și elementele D se găsesc numai în unele din locurile genetice TCR, și polipeptidele, denumite aici ca segmente D,vor fi în paranteze pentru a indica includerea acestor regiuni numai în lanțurile TCR adecvate. Astfel, V (D) J se referă, fie la secvențe VDJ de lanțuri care au o regiune D, sau se referă la secvențe VJ de lanțuri în care lipsesc regiunile D.

în timpul maturației limfocitelor, segmentele de gene individuale V, (D) și J se rearanjează pentru a forma o genă funcțională care determină secvența aminoacidului al TCR exprimată prin acea celulă, întrucât unitatea formată din genele V, (D) și J care poate fi rearanjată este formată din mai mulți membrii individuali ai acestor unități pot fi rearanjați în orice combinație virtuală, repertoriul complet de TCR este foarte divers și capabil de recunoaștere și legare specifică a unei mase vaste de parteneri legați la care poate fi expus un organism. Oricum, o anumită celulă T va avea numai o singură moleculă TCR și această moleculă TCR determină într-o mare măsură specificitatea acestei celule T pentru partenerul ei de legătură.

Modelele pe animale au contribuit în mare parte la înțelegerea mecanismului imunologic al bolii autoimune. Un astfel de model pe animal, encefalomielita alergică experimentală EAE este o boală autoimună a sistemului nervos central care poate fi indusă la șoareci și șobolani prin imunizare cu proteină pe bază de mielină MBP . Boala este caracterizată clinic prin paralizie și ușoară pierdere în greutate și histologic printr-o infiltrație perivasculară mononucleară a celulei parenchimului sistemului nervos central. Patogeneza bolii este mediată prin celulele T cu specificitate pentru MBP: S-au izolat de la animale suferind de EAE, cloni multiplii ai celulelor T specifice pentru MBP și aceștia au fost propagați în cultură continuă. După stimularea in vitro cu MBP, acești cloni de celule T au indus în mod rapid EAE, când au fost transferați în mod adoptiv în gazde sănătoase. Este important că aceste celule T care induc EAE sunt specifice, nu numai pentru același antigen (MBP), dar și în mod obișnuit pentru un singur epitop de pe acest antigen. Aceste observații au indicat că populații discrete de celule T autoagresive sunt responsabilepentrupatogenezaencefalomielitei alergice experimentale EAE .

Analiza receptorilor de celule T, TCRs,a celulelor T care induc EAE a arătat o heterogenitate restrânsă a structurii acestor receptori asociați cu boala. într-o analiză de 33 celule T reactive MBP, numai două segmente de gene de regiune V de lanț alfa și un singur segment de genă de regiune J de lanț alfa au fost utilizate. în această populație de celule T s-a observat o restricție similară a utilizării de gene TCR din lanțul beta. S-au găsit numai două segmente de regiune V de lanț beta și două segmente de gene de regiune J. Mai important aproximativ 80 % din clonii celulei T au avut secvențe de aminoacizi identice în lungul și în latul regiunii legăturii de lanța beta V-D-J. Aceste descoperiri confirmă noțiunea de structură TCR comună printre celulele T cu specificitățile similare de antigen și indică faptul că TCR este o țintă eficace pentru strategiile imunoterapeutice vizate la eliminarea patogenezei EAE.

S-au făcut diferite experiențe pentru a exploata specificitatea antigenului celulelor autoagresive T în strategiile de tratament ale invenției pentru EAE. De exemplu, s-a utilizat administrarea pasivă a anticorpilor monoclonali specifici pentru TCRs prezente în celulele T care induc EAE. în modelul pentru șoarece al EAE, infuzia unui anticorp monoclonal specific pentru V/J8, gena regiunii V a lanțului beta major utilizat prin celulele T specifice pentru MBP, a redus sensibilitatea șoarecilor la inducerea ulterioară a EAE [Acha-Orbea et al., Cell 54:263-273 (1988) și Urban et al., Cell 54:577-592 (1988)]. O protecție similară a fost demonstrată la EAE, la șobolani cu reactiv monoclonal de anticop cu un determinant idiotipic neidentificat al TCR pe celule T specifice pentru MBP (Bums et al., J. Exp. Med. 169:27-39 1989). Pe când terapia cu anticorpi pasivi pare să aibe un efect de oarecare ameliorare asupra sensibilității la EAE, această terapie este bogată în dificultăți potențiale. Protecția produsă este trecătoare, necesitând astfel o administrare repetată a anticorpului. Infuziile multiple ale anticorpului cresc șansele ca gazda să arate un răspuns imun la anticorpul administrat, mai ales dacă este stârnită într-un animal de origine străină. Apoi, un răspuns de anticorp la un clon de celulă T patogenică reprezintă numai un element în răspunsul imun complet și neglijează contribuțiile potențiale ale imunității celulare la soluționarea autoreactivității.

S-a examinat rolul imunității celulare în reducerea activității celulelor T autoagresive în EAE și s-au propus terapii potențiale. întrun mod similar cu încercarea cu anticorp pasiv, s-au derivat celule T de regularizare ex vivo și s-au administrat din nou pentru imunoterapie. De exemplu, Sun și colaboratorii, Nature, 332:843-845 (1988), au izolat recent un clon de celulă T CD8+ din șobolani în convalescență în care s-a indus EAE prin transfer adoptiv al unei linii de celulă T CD4+ specifică pentru MBP. Acest clon de celulă T CD8+ a arătat o activitate citolitică in vitro pentru celula T CD4+ utilizată pentru a induce boala. Pe lângă aceasta, transferul adoptiv al acestui clon CTL a redus sensibilitatea șobolanilor receptivi la o provocare ulterioară cu MBP. Lider și colaboratorii, Science, 239:181-183 (1988), au izolat de asemenea, cloni de celulă T CD8+ cu activitate de reprimare pentru celule T care induc EAE. Acest clon CD8+ a fost izolat din șobolani vaccinați cu cloni de celulă T care induc boala atenuată și deși el nu a prezentat nici o activitate citolitică in vitro, el a putut să reprime proliferarea condusă de MBP a celulelor T care induc EAE. Deși aceste studii indică faptul că celulele T CD8+ ar putea reduce EAE, este greu să se confere un rol major pentru acesta CTLs CD8+ selectate în ceea ce privește rezistența pe termen lung a șobolanilor recuperați, întrucât Sedwick și colaboratorii, (Eur. J. Immunol., 18:495-502 1988) au arătat în mod clar că epuizarea celulelor CD8+ cu anticorpi monoclonali nu afectează procesul de boală sau recuperarea.

în experimentările lui Sun și colaboratorii, și Lider și colaboratorii, descrise mai sus, administrarea produsului derivat din celulele T de regularizare învinge obstacolul major al terapiei pasive al anticorpului; el permite un răspuns regulator in vivo cu o durată prelungită. Totuși el necesită o cultivare in vitro cu celule T care induc o boală atenuată pentru a produce cloni ale unor astfel de celule T regulatoare, un proces costisitor și laborios intensiv. Apoi într-o populație complexă cum sunt ființele umane, lipsa de identitate MHC printre indivizi face ca acestea să constituie o strategie terapeutică foarte individualizată. Clonii regulatori trebuie să fie derivați pentru fiecare pacient individual și apoi readministrați numai la acel pacient, pentru a evita grefa potențială împotriva reacțiilor gazdei.

Ca terapie pentru EAE s-a utilizat și o vaccinare directă cu cloni de celulă T care induce o boală atenuată. Celule T specifice pentru MBP, capabile să transmită boala, au fost atenuate prin iradiație gamma sau prin fixare chimică și utilizate pentru vaccinarea șobolanilor simpli. în unele cazuri, animalele vaccinate au arătat rezistență la încercări ulterioare de inducere EAE (Lider și colaboratorii, supra; vezi Cohen și Weiner, Immunol. Today 9:332-355 (1988) pentru analiză). Eficacitatea unei astfel de vaccinări, totuși, nu este constantă și gradul de protecție este foarte variabil. Celulele T conțin o multitudine de antigeni diferiți care induc un răspuns imun când toată celula T este administrată ca vaccin. Acest fenomen a fost demonstrat de Offner și colaboratorii, (J.Neuroimunol. 21:13-22 1989), care au arătat că imunizarea cu celule T totale măresc hipersensibilitatea de tip întârziat DTH, adică răspunsul respectiv, măsurat prin umflarea urechii, la celule T într-un mod crescând, pe măsură ce numărul de vaccinări crește. Totuși s-au constatat răspunsuri DTH pozitive, atât la animale protejate, cât și la animale neprotejate. Șobolanii au răspuns în mod similar,atât la vaccinarea cu celule T encefalitogenice, cât și cu celule T de control. Răspunsul similar al șobolanilor vaccinați, atât cu celule care induc boala, cât și cu celule de control, după ce au fost cuantificate prin hipersensibilitatea de tip întârziat (o măsurătoare a imunității mediate de celulă), indică faptul că numeroși antigeni de pe aceste celule T induc răspunsuri imune. Astfel, vaccinarea cu celule T care induc o boală atenuată suferă de o lipsă de specificitate pentru antigenul protector de pe suprafața acestei celule T, precum și de o inducere variabilă a imunității către acest antigen. Ca alternativă pentru tratamentul bolilor ființelor umane, vaccinarea cu celule T atenuate este dezavantajată de aceeași intensitate de muncă și de necesitatea terapiilor individualizate așa cum s-a arătat mai sus pentru infuzia celulelor CD8+.

Problema pe care o rezolvă invenția de față constă în găsirea unor vaccinuri și a unui mijloc de vaccinare a unui mamifer, astfel încât să prevină sau să frâneze bolile mediate în mod specific de celule T.

Invenția de față prevede un vaccin compus dintr-un receptor de celulă T TCR sau dintr-un fragment din acesta corespunzând la un TCR prezent pe suprafața celulelor T care mediază boala, unde fragmentul de vaccin poate fi o peptidă corespunzând secvențelor de TCR caracteristice ale celulelor T care mediează boala mențioantă.

Se prevăd, de asemenea, mijloace de determinare ale secvențelor adecvate de aminoacid pentru astfel de vaccinuri. Vaccinul este administrat unui mamifer într-un mod care induce un răspuns imun îndreptat împotriva TCR a celulelor T care mediază boala. Acest răapuns imun reduce sau anulează celulele T patogene, extirpând în acest fel patogeneza bolii.

Invenția mai prevede și o regiune variabilă specifică de lanț β a receptorului de celulă T, denumită V/Î17, care este fundamentală pentru tratarea artritei reumatoide RA, ca și mijloace de diagnosticare, prevenire și tratare a artritei reumatoide RA.

Conform unui alt aspect al invenției mai prevede și o regiune specifică a unui receptor de celulă T util pentru tratarea sclerozelor multiple MS ca și mijloace de diagnosticare, prevenire și tratarea sclerozelor multiple MS.

Invenția se referă la vaccinuri și metode pentru prevenirea sau ameliorarea bolilor mediate de celulele T, cum ar fi bolile de autoimunitate și lymphomul de celulă T. Vaccinarea prevede un tratament specific și susținut care anulează problemele asociate cu alte căi potențiale de terapie.

Concret, vaccinul, conform invenției, este constituit dintr-o cantitate eficientă imunogen a unui receptor de celulă T sau a unui fragment din acest corespunzător la un receptor de celulă T prezent pe suprafața celulelor care mediază boala respectivă și un mediu acceptabil farmaceutic.

Vaccinul pentru tratarea artritei reumatoide este constituit dintr-un receptor de celulă T ce prezintă secvența de aminoacizi MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDA MYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKG DIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTA FYLCASS, precum și modificări care nu afectează capacitatea receptorului să acționeze ca imunogen și fragmente reprezentative din punct de vedere imunogen ale acestuia.

Confonn unui aspect particular, vaccinul pentru tratarea artritei reumatoide, conține un fragment de celulă T ce cuprinde o secvență de regiune variabilă de lanț β a receptorului de celulă T și anume secvența SQIVNDFQK.

Vaccinul pentru tratarea sclerozei multiple este constituit dintr-un receptor de celulă T ce cuprinde secvența SGDQGGNE.

Pentru diagnosticarea, prevenirea și tratarea bolilor de autoimunitate, respectiv artrită reumatoidă și scleroza multiplă, invenția prezintă metode specifice.

Metoda de diagnosticare sau de prevenire a susceptibilității față de artrita reumatoidă, conform invenției, constă în detectarea într-o probă suspectă, de preferință, din țesutul sinovial, a celulelor T având regiu110397 ne variabilă de lanț -β MSNQVLCCVVLCFL GANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSC EQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQ IVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVT SAQKNPTAFYLCASS sau un fragment din aceasta, de preferință, cu un ligand detectabil cunoscut, capabil să se lege specific la regiunea variabilă de lanț - β, sau cu probe de nucleotide complementare la secvențe de nucleotide care codifică această regiune.

Metoda de profilaxie sau de tratament a artritei reumatoide constă în prevenirea atașării unui receptor de celulă T conținând regiunea MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQN LNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVN DFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQ KNPTAFYLCASS la partenerul său de legătură, HLA-DR, de preferință, prin legarea unui ligand la această regiune sau la partenerul ei de legătură.

Metoda de diagnosticare sau de prevenire a susceptibilității față de scleroza multiplă constă în detectarea într-o probă a celulelor T având secvența SGDQGGNE, de preferință, cu un ligand cunoscut capabil să se lege specific sau cu o probă de nucleotidă, care este complementară față de secvența de nucleotidă care codififcă secvența dată.

Metoda de profilaxie sau de tratament a sclerozei multiple constă în prevenirea atașării unui receptor de celulă T conținând secvența SGDQGGNE la partenerul său de legătură, de preferință, prin legarea unui ligand la secvența menționată sau la partenerul de legătură al receptorului menționat al celulei T, ca și în tratarea celulelor T conținând secvența SGDQGGNE cu un agent citotoxic sau citostatic, care leagă selectiv secvența menționată, și care de preferință poate fi un anticorp atașat la o substanță aleasă din grupul constând din substanțe radioactive, terapeutice sau chemostatice.

Prezenta invenție se mai referă și la un porocedeu de obținere a vaccinului ce constă în izolarea clonilor de celulă T, care induc boala la indivizi afectați, determinarea secvențelor de aminoacizi ale receptorilor de celulă T de la clonii celulei T, alegerea segmentelor din acești receptori care sunt caracteristice pentru receptorii de celulă T care mediează boala, și selecția secvențelor de aminoacizi din secvenețele receptorilor de celulă T capabile să stabilească un răspuns imunogen la receptorul celulei T.

Avantajele oferite de invenție constau în aceea că se prevede o metodă eficientă de imunoterapie pentru patologii mediate de celule T, incluzând boli de autoimunitate, care evită multe din dificultățile asociate cu metodele propuse anterior pentru tratament. Prin vaccinare, preferabil față de administrarea pasivă a anticorpilor heterologi, este mobilizat sistemul propriu de imunitate al gazdei pentru a suprima celulele T autoagresive. Astfel suprimarea este persistentă și poate include oricare și toate mecanismele imunologice pentru efectuarea acestei suprimări. Acest răspuns multiplu este mai eficient decât suprimarea unidimensională realizată prin administrarea pasivă a anticorpilor monclonali sau a clonilor de celulă T de regularizare derivați din produs.

Vaccinurile din invenția de față cuprind receptorii de celulă T, TCRs, ale celulelor T care mediază bolile de autoimunitate. Vaccinurile pot fi TCRs întregi purificate în mod eficient de clonii de celulă T, lanțuri individuale de receptoare de celulă T (de exemplu, alfa, beta, etc.) sau porțiuni de astfel de lanțuri, fie singure, fie în combinație. Vaccinul poate fi omogen, de exemplu, o singură peptidă, sau poate fi compus din mai mult decât un tip de peptidă din care fiecare corespunzând la o porțiune diferită de receptor de celulă T, TCR. Apoi, aceste peptide pot fi de la TCRs distincte, în care ambele TCRs contribuie la boala mediată de celula T.

într-o realizare specifică, peptidă imunizantă poate avea secvența de aminoacid SGDQGGNE, când subiectul are scleroză multiplă. Oricare porțiune imunogenă a acestei peptide poate fi eficientă. Astfel, se pot face substituiri de aminoacid care nu distrug imunicitatea pepetidei. în mod suplimentar, această peptidă poate fî legată la un putător pentru a mări în continuare imunogenicitatea ei.

într-o altă realizare specifică, receptorii de celulă T sau fragmente din TCR care conțin V/317 pot fi utilizați pentru imunizarea unui individ care are artrită reumatoidă, prin tratarea sau prevenirea acestei boli. Răspunsul imun generat în individ poate neutraliza sau omorâ celulele T având V/317 și astfel să prevină sau să trateze efectele distrugătoare ale celulelor T care poartă V/317. Pe lângă aceasta, în măsura în care V/S17 este comun față de receptorii de celulă T sau celulele T patogenice care mediează bolile de autoimunitate în general, astfel de vaccinuri pot fi eficiente și în ameliorarea unor boli de autoimunitate de acest fel.

Așa cum se utilizează în prezenta descriere, expresia patologie mediată de celulă T se referă la oricare condiție în care o componentă a patologiei este constituită dintr-un răspuns inadecvat al unei celule T. Prin acest termen se intenționează includerea atât a bolilor mediate direct de celule T și acele boli, cum ar fi myastenia gravis, care sunt caracterizate în primul rând prin vătămarea organismului cauzată de legarea anticorpilor precum și acele boli în care la producerea acelor anticorpi contribuie un răspuns inadecvat al unei celule T. Prin această expresie se intenționează cuprinderea, atât a bolilor autoimune mediate de celule T, cât și a celor mediate de replicarea clonală neregularizată a celulelor T.

Așa cum se utilizează în prezenta descriere, secvența în mod efectiv când se referă la o secvență de aminoacid înseamnă secvența descrisă sau alte secvențe având orice adăugiri, ștergeri sau substituții care nu realizează în mod efectiv posibilitatea secvenței să obțină un răspuns imunitar împotriva secvenței receptorului dorit al celulei T. Astfel, o porțiune din secvența descrisă de imunizare poate fi utilizată atât timp cât este caracteristic în mod suficient pentru receptorul dorit al celulei T pentru a produce un răspuns imun eficient împotriva receptorilor doriți de celulă T, dar nu împotriva receptorilor nedoriți de celulă T. Astfel de variații în secvență pot fi realizate ușor, de exemplu, prin sintetizarea unei secvențe alternative și testarea acesteia, de exemplu, prin imunizarea unui mamifer, pentru determinarea eficienței ei.

Așa cum se utilizează în prezenta descirere prin termenul fragment trebuie să se înțeleagă că acoperă asemenea fragmente în legătură sau în combinație cu secvențe sau părți adiționale, ca, de exemplu, în care peptida este cuplată cu alte secvențe de aminoacizi sau cu un purtător. Termenii fragment și peptidă pot, de aceea să fie utilizați în mod interschimbabil, dat fiind că o peptidă va fi fragmentul cel mai obișnuit al receptorului de celulă T. Fiecare fragment al invenției poate avea o secvență modificată, așa cum s-a arătat mai sus pentru termenul secvența în mod efectiv.

Referirea în prezenta descriere la un fragment sau o porțiune din receptorul de celulă T nu înseamnă că compoziția trebuie să provină din receptori intacți de celulă T. Astfel de fragmente sau porțiuni pot fi produse prin diferite mijloace bine cunoscute de specialiști în materie, cum ar fi, de exemplu, sinteza unei peptide sau metodele de donare.

Așa cum se utilizează în prezenta descriere, când se face referirea la realația, dintre fregmentele de peptidă ale invenției și secvențele de receptoare de celule T TCRs corespunzând la înseamnă că fragmentul de peptidă are o secvență de aminoacid care este adică corespunzătoare față de secvența receptorului de celulă T, TCR pentru a stimula un răspuns eficient regularizam în individ. Totuși secvența nu trebuie să fie identică cu secvența receptorului de celulă T, TCR, așa cum se arată în exemplul 1.

Prin eficient din punct de vedere imunogen se înțelege o cantitate de receptor de celulă T sau un fragment al acestuia care este eficientă pentru obținerea unui răspuns imunitar, pentru a preveni sau a trata o boală mediată de o celulă T sau o replicare clonală neregularizată a unei celule T. în mod evident astfel de cantități vor varia funcție de specie și individ, depinzând de mulți factori. De exemplu, vor fi necesare doze mai mari pentru un răspuns imunitar eficient la o ființă umană în comparație cu un șoarece.

Așa cum se utilizează în prezenta descriere V/317 se referă la un lanț β specific variabil, respectiv la o regiune variabilă a unui lanț β specific al receptorului de celulă T, TCR. V/317 are secvența de aminoacid MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHD AMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQK GDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPT AFYLCASS (aminoacizii sunt reprezentați prin codurile convenționale cu o literă). Regiunile hipervariabile și de legătură sunt cele mai utile pentru vaccinuri. O regiune hipervariabilă a

V/317 foarte utilă este regiunea CDR2 care are secvenja de aminoacid SQIVNDFQK. în această definiție sunt incluse și modificările în această secvență care nu afectează posibilitatea receptorului de a acționa ca un imunogen pentru a stimula răspunsul imunitar dorit. Regiunea variabilă poate fi legată cu oricare segment D și J al TCR. în plus, în definiția lui V/317 sunt incluse și fragmentele reprezentative imunogenic ale V/817.

Așa cum se utilizează în descrierea de fată, partener de legătură înseamnă un compus care este reactiv cu un receptor de celulă T, TCR. în general, acest compus va fi un Antigen Major de Histocompatibilitate, MHC, dar poate fi oricare compus în măsura în care atunci când TCR este legat în curs normal, apare activarea sau proliferarea celulei T.

Așa cum se utilizează în descrierea de față, ligand înseamnă oricare moleculă care reacționează pentru a forma un complex cu o altă moleculă.

Așa cum se utilizează în descrierea de față legată în mod selectiv înseamnă că o moleculă se leagă de un tip de moleculă, dar nu se leagă în mod selectiv de alte tipuri de molecule. în legătură cu V/317 legătură selectivă indică legarea la V/817 conținute în receptori de celulă T, TCRs dar nu în mod efectiv la alte TCRs cărora le lipsește V/317.

Prin efectiv pur se înțelege că TCR este în mod efectiv liber de alte substanțe biochimice cu care el este în mod obișnuit asociat în natură. în mod alternativ, vaccinurile cuprind peptide de lungimi variabile corespunzând TCR-ului sau porțiunilor din acesta. Peptidele pot fi produse sintetic sau recombinat, prin mijloace bine cunoscute celor specializați în materie. De preferință, vaccinurile cu peptide corespunzând la regiuni ale TCR care disting acest TCR de alte TCRs nepatogenice. Astfel de regiuni specifice pot fi așezate în interiorul diferitelor regiuni ale lanțurilor de polipeptidă respectivă TCR, mai ales o secvență scurtă cuprinzând joncțiunea V (D)J, în acest fel restrângând răspunsul imun în mod exclusiv la acele celule T care poartă acest singur determinant.

Vaccinurile sunt administrate la o gazdă care prezintă, sau are riscul să prezinte un răspuns autoimunitar. O diagnoză clinică definită, a unei boli de autoimunitate specifică, justifică administrarea vaccinurilor TCR specifice relevante bolii. Aplicațiile profilactice sunt garantate în boli în care mecanismele autoimunitare preced manifestarea unei boli clinice evidente (de exemplu, diabetul de tipul I). Astfel, indivizii cu antecedente familiale de boală și prevăzuți, având riscul de îmbolnăvire prin indicatorii siguri de prognosticare pot fi tratați în mod profilactic pentru a opri mecanismele de autoimunitate înainte de manifestarea lor.

Vaccinurile TCR pot fi administrate în multe formulări posibile, în medii acceptabile din punct de vedere farmaceutic. în cazul unei peptide scurte, aceasta poate fi conjugată la un purtător, cum ar fi KLH, (Keyhole limped hemocyanin) pentru a mări imunicitatea ei. Vaccinul poate fi administrat în asociere cu un adjuvant, mulți din aceștia fiind cunoscuți specialiștilor în materie. După imunizarea inițială cu vaccinul, se poate prevedea un activant. Vaccinurile sunt administrate prin metode convențioanle, în doze care sunt suficiente pentru a provoca un răspuns imunologic, care poate fi determinat ușor de specialiști în materie.

Peptidele adecvate pentru a fi utilizate pentru imunizare pot fi determinate după cum urmează: Clonii de celule T care induc boala și care reacționează cu antigenii care constituie obiectivele, sunt izolați din indivizi afectați. Astfel de celule T se obțin, de preferință, din locul activității autoagresive active cum ar fi o leziune în cazul lui pemphigus vulgaris, sistemul nervos central CNS, în cazul sclerozei multiple, lichidul sau țesutul sinovial în cazul artritei reumatoide, sau, în altă variantă, din sângele indivizilor afectați. Genele TCR de la aceste celule T autoagresive sunt apoi desfășurate. Apoi se pot alege polipeptidele corespunzătoare la TCRs sau porțiuni din acestea, care sunt reprezentate selectiv printre celulele T care induc boala (față de celulele T hepatogene), pentru a obține vaccinuri și sunt preparate și utilizate așa cum se descrie mai sus.

în mod alternativ, vaccinurile pot cuprinde anticorpi antiidiotipici care sunt imagini interne ale peptidelor descrise mai sus.

Metodele de preparare, selectarea și administrarea unor astfel de vaccinuri cu antiidiotipici sunt bine cunoscute în specialitate.

Patologii ale celulelor T cu etiologie malignă

S-a examinat boala autoimunității pentru a ilustra utilitatea vaccinării TCR. Totuși, lymphomul celulei T este o altă patologie a celulei T care trebuie supusă acestui tip de tratament. Aplicarea acestei tehnologii în tratarea lymphomului T ar trebui să fie condusă într-un mod în principiu identic, într-o privință, totuși, această tehnologie este mai ușor de aplicat la o boală proliferabilă printr-o celulă T deoarece izolarea celulelor T patogene se realizează mai ușor. Odată ce clonii au fost izolați, tehnologia se aplică în modul descris aici. în mod specific, genele TCR ale lymphomului T sunt desfășurate, regiunile adecvate ale acestor TCRs sunt identificate și utilizate ca vaccinuri. Vaccinurile pot cuprinde peptide individuale sau multiple și pot fi administrate în formulări acceptabile farmacologic cu sau fără adjuvanți prin mijloace convenționale.

Scleroza Multiplă (MS)

Celulele T care provoacă scleroza multiplă (proteină pe bază de mielină) MS nu au fost identificate mai înainte, deși celulele T reactive MBP au fost propuse să joace un rol datorită similitudinii clinice și histologice între MS și EAE. La șobolani și șoareci, modelele de celule T encefalogene, reactive MBP și EAE arată o conservare remarcabilă a conservării secvenței de aminoacid VDJ din lanțul β, cu toate diferențele cunoscute în ceea ce privește restricția MHC și specificitatea antigenului de peptidă MBP. Invenția de față este fundamentată de observația că, o proteină pe bază de mielină umană, o linie de celulă T reactivă MBP, derivată dintr-un pacient MS, are un lanț beta TCR cu o secvență de aminoacid VDJ omoloagă cu cea a lanțurilor beta de la celulele T reactive MBP care mediază patogeneza la encefalomielită (EAE), un model de animal al MS. Această linie este specifică pentru un alt epitrop al MBP. Această descoperire demonstrează implicarea celulelor T reactive MBP în patogeneza lui MS și demonstrează că peptidele TCR similare cu cele descrise aici pentru prevenirea EAE pot fi adecvate pentru tratamentul MS.

Artrita reumatoidă

Artrita reumatoidă RA este o boală de autoimunitate mediată de celula T. Invenția descrie infiltrații oligoclonale de celule T, Νβ 17 în țesutul sinovial al pacienților cu artrită reumatoidă. Prezența acestor celule T în țesutul bolnav al tuturor pacienților examinați, oligoclonalitatea lor și activitatea citotoxică a unei astfel de celule pentru celulele aderente sinoviale, demonstrează rolul fundamental al celulelor purtătoare de V/317 în patogeneza artritei reumatoide RA.

Populațiile de celulă activată T în țesutul sinovial al pacienților cu RA a fost examinată prin analiza receptorului de celulă T, TCR mRNAs izolate din celulele T sinovale IL-2R+ pozitive ale receptorului IL-

2. TCR mRNAs au fost amplificate utilizând o înregistrare a reacției lanțului de polimerază PCR menită să amplifice genele de lanț beta TCR umane, conținând virtual orice element de genă V β . în această analiza s-a găsit că rearanjările oligoclonale V/317 au fost îmbogățite în populația IL-2R+, indicând că celulele T, V/317 sunt probabil implicate în patogeneza lui RA. S-a izolat un clon de celulă T care poartă V/317. CD4+ din unul din specimenele de țesut sinovial și că citotoxicitatea sau in vitro pentru celulele sinoviale aderente susține implicarea directă a celulelor V/317, T în RA.

Așa cum s-a menționat, invenția prevede descoperirea foarte importantă că o regiune variabilă specifică a lanțului beta al TCR, notată νβ17, este asociată în mod strâns cu artrita reumatoidă la subiecții umani. Această descoperire permite detectarea, prevenirea și tratamentul artritei reumatoide utilizând metodologia expusă în invenția de față. Se pot aplica metode terapeutice similare expuse mai sus pentru EAE, la artrita reumatoidă de către cei specializați în materie.

în mod specific, invenția prevede o metodă de diagnosticare sau prezicere a sensibilității la artrita reumatoidă într-un individ, cuprinzând detectarea celulelor T având regiuni variabile cu lanț beta, notate V /317 într-o probă de la un individ, prezența nivelurilor anormale de celule T conținând V β17 indicând artrită reumatoidă sau sensibilitatea față de artrita reumatoidă. Celula T conținând V/317 poate fi comparată calitativ sau cantitativ cu cea a unui individ normal. O astfel de diagnoză poate fi realizată prin detectarea unei porțiuni din V/S17 care nu apare la receptorii de celulă T cu regiune variabilă a lanțului beta care este asociat cu o artrită nereumatoidă. V/317 poate fi detectat de exemplu prin aducerea în contact a V/S17 cu un ligand detectabil capabil să se lege în mod specific la V/317. în specialitate se cunosc mulți liganzi astfel detectabili, de exemplu un anticorp legat de o enzimă. în altă variantă, se pot utiliza probe de nucleotide complementare la secvențe de acid nucleic care codifică Νβ 17, așa cum se arată în exemplul 7.

Invenția prevede, de asemenea, o metodă de prevenire sau de tratare a artritei reumatoide cuprinzând prevenirea atașării unui receptor de celulă T conținând V/317 la partenerul său de legătură. într-o formă de realizare atașarea este prevenită prin legarea unui ligand la V317. Atașarea poate fi prevenită prin metode cunoscute, de exemplu prin legarea unui anticorp la V/317 sau prin legarea porțiunii de legătură la blocul fizic de atașare.

Invenția prevede, de asemenea, o metodă de prevenire sau de tratare a artritei reumatoide la un individ, cuprinzând tratarea în individ a celulelor T conținând V/317, în mod citotoxic sau citostatic. într-o formă de realizare celule T conținând V/317 sunt tratate cu un agent citotoxic sau citostatic care leagă în mod selectiv V/317. Agentul poate fi un anticorp atașat la o substanță radioactivă sau chemoterapeutică. O astfel de atașare și agenții eficienți sunt bine cunoscuți în specialitate. Vezi, de exemplu, Harlow, E. și Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, care este inclus aici ca referință.

Invenția mai prevede descoperirea extrem de importantă, că o secvență specifică de receptor de celulă T, TCR, SGDQGGNE, este asociată strâns cu scleroza multiplă la subiecții umani. Această descoperire permite detectarea, prevenirea și tratamentul sclerozei multiple utilizând metodologia prezentată în invenția de față. Metodele terapeutice similare prezentate aici pentru EAE pot fi aplicate la scleroza multiplă de către cei specializați în materie.

în mod specific, invenția prevede o metodă de diagnosticare sau prezicere a sensibilității față de scleroza multiplă la un individ, cuprinzând detectarea celulelor T având în mod efectiv secvența SGDQGGNE într-o probă de individ, prezența secvenței indicând scleroza multiplă sau sensibilitatea față de scleroza multiplă. Secvența poate fi detectată, de exemplu, prin aducerea în contact cu un ligand detectabil, Mulți astfel de liganzi sunt cunoscuți în literatura de specialitate, de exemplu un anticorp legat cu o enzimă. în altă variantă, se pot utiliza probe de nucleotide, complementare față de acidul nucleic codificând secvența, pentru a detecta celulele T, așa cum se arată în exemplul 7.

Invenția prevede, de asemenea, o metodă pentru prevenirea sau de tratarea sclerozei multiple cuprinzând prevenirea atașării unui receptor de celulă T conținând în mod efectiv secvența SGDQGGNE la partenerul ei de legătură. în una din formele de realizare, atașarea este prevenită prin legarea unui ligand la secvență. într-o altă variantă de realizare, atașarea este prevenită prin legarea unui ligand la partenerul de legătură. Atașarea poate fi prevenită prin metode cunoscute, de exemplu prin legarea unui anticorp la secvența legăturii fizice de bloc.

Invenția prevede, de asemenea, o metodă de prevenire sau de tratare a sclerozei multiple într-un individ, cuprinzând tratarea din punct de vedere citotoxic sau citostatic a celulelor T care conțin în mod efectiv secvența SGDQGGNE în individ. într-o formă de realizare, celulele T sunt tratate cu un agent citotoxic sau citostatic care leagă selectiv secvența. Agentul poate fi un anticorp atașat la o substanță radioactivă sau chemoterapeutică.

Se dau, în continuare, 7 exemple de realizare a invenției:

Exemplul 1. S-a realizat un model de șobolan de EAE (encefalomielită alergică experimentală) astfel:

Șobolani Lewis femele (Charles River Laboratories, Raleigh-Durham, NC) au fost imunizați în fiecare talpă a picioarelor din spate cu 50 μg de proteină pe bază de mielină de la cobai, emulsionată în adjuvant Freund complet CFA. Primele semne ale bolii au fost observate în mod caracteristic la 9-11 zile după imunizare. Severitatea bolii este notată într-o scară cu trei puncte după cum urmează:

= coada fără vlagă; 2 = slăbiciunea picioarelor din spate; 3 = paralizia picioarelor din spate. Urmând o desfășurare a bolii de aproximativ patru la șase zile, majoritatea șobolanilor și-au revenit în mod spontan și au 5 fost refractari la o inducere ulterioară cu EAE.

Selectarea și prepararea vaccinurilor

- s-a realizat astfel:

Vaccinările au fost conduse cu o peptidă de celulă C a cărei secvență a fost 10 dedusă dintr-o secvență DNA de la o genă beta de receptor de celulă T care predomină printre celulele T care induc EAE ale șoarecilor BIO. PL/L. Secvența ADN a fost cea raportată de Urban și colaboratorii, supra, care este inclusă 15 aici ca referință. S-a sintetizat o peptidă de nouă aminoacizi, având secvența joncțiunii VDJ a lanțului beta TCR a șoarecelui, prin metode cunoscute celor specializați în materie. Secvența acestei peptide este: SGDAGGGYE. 20 (Aminoacizii sunt reprezentați prin codurile convenționale cu o singură literă). Secvența echivalentă a șobolanului a fost raportată a fi: SSD-SSNTE (Burns și colaboratorii,

J.Exp.Med. 169:27-39 (1989)). Peptidă a fost 25 desărată pe Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), s-a efectuat cromatografia în coloană în acid acetic 0,1 M și solventul a fost apoi îndepărtat prin două cicluri de liofilizare. O porțiune din peptidă a 30 fost conjugată la Keyhole limped hemocyanin KLH, cu glutaraldehidă la un raport de 7,5 mg de peptidă pe mg de KLH. Produsul a fost dializat față de saramura tamponată cu fosfat PBS. 35

S-a trecut la vaccinarea împotriva

EAE

Vaccinurile utilizate în aceste studii au constat din peptidă VDJ și, de asemenea, din peptidă VDJ unită cu KLH. Acestea s-au dizolvat în PBG și s-au emulsionat cu volume egale, fie din (1) adjuvant Freund incomplet IFA, sau cu (2) adjuvant complet Freund CFA obținut prin suspendarea a 10 mg/ml de Mycrobacteriam tuberculosis omorât la cald, uscat H37a (Difco Laboratories, Detroit, MI) în IFA. Emulsiile au fost administrate la șobolani Lewis femele de 8-12 săptămâni întrun volum final de 100 μΐ pe animal (50 μΐ în fiecare din tălpile picioarelor din spate). La fiecare șobolan s-au administrat 5 gg de peptidă VDJ necombinată. Peptidă combinată KLH-VDJ a fost administrată la o doză echivalentă cu 10 gg de KLH pe șobolan. 29 zile mai târziu, fiecare șobolan a fost infectat cu 50 μ% de proteină pe bază de mielină de cobai în adjuvant Freund complet în tălpile labelor din față. Animalele au fost supravegheate zilnic începând cu ziua 9 asupra semnelor clinice ale EAE și au fost notate așa cum s-a descris mai sus. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 1. Așa cum se poate vedea, nu numai că a existat o incidență redusă a bolii la indivizii vaccinați, dar la cei care au contractat boala, severitatea bolii a fost redusă și/sau îmbolnăvirea a fost întârziată. Extinderea protecției a variat cu formularea vaccinului, acele vaccinuri care au inclus în ele CFA ca adjuvant au demonstrat cel mai mare grad de protecție.

Tabelul 1

Animal nr.	Vaccinare (adjuvant)	Zile după provocarea bolii
10	11	12	13	14	15	16	17	18
/	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
1	VDJ (IFA)	-	-	2	3	3	3	-	-	-
2	idem	-	-	1	3	3	3	2	-	-
3	idem	-	-	-	3	3	3	2	-	-
4	VDJ (CFA)	-	-	-	-	1	1	1	-	-
5	idem	-	-	-	-	-	-	-	-	-
6	idem	-	-	-	1	3	3	3	2	-

Tabelul 1 (continuare)

22

I	2	3	4	5	6	7	8	9	10	II
7	KLH-VDJ (CFA)	-	-	-	1	3	2	-	-	-
8	idem	-	-	-	-	1	1	1	1	-
9	idem	-	-	-	-	-	-	-	-	-
10	KLH-VDJ (IFA)	-	1	3	3	2	2	1	-	-
11	idem	-	-	3	3	3	3	3	2	-
12	idem	-	-	1	3	3	3	3	-	-
13	nici unul	1	3	3	3	3	3	-	-	-
14	idem	-	1	3	3	3	1	-	-	-
15	idem	1	3	3	3	1	-	-	-	-

Notația: - fără semne

1) coada fără vlagă

2) slăbirea picioarelor

3) paralizia picioarelor din spate

Exemplul 2. S-a efectuat vaccinarea 20 împotriva EAE cu peptide VDJ de la șobolani Lewis astfel:

Peptida VDJ utilizată în exemplele anterioare a fost sintetizată în conformitate cu secvența moleculelor lanțului beta TCR găsite 25 prin inducerea cu EAE a celulelor T la șoareci B10.PL. în plus, s-au sintetizat și s-au testat peptide care corespund cu secvențe găsite pe celule T encefalitogene la șobolani Lewis.

Aceste secvențe VDJ sunt omoloage cu cele ale șoarecilor B10.PL, dar nu identice. Peptidele de șobolan au fost sintetizate în conformitate cu secvențele ADN raportate de Burns, și colaboratorii, and Chluba, și colaboratorii, Eur. J. Immunol. 19:279-284 (1989). Secvențele acestor trei peptide notate IR 1, 2 și 3, sunt arătate mai jos, aliniate cu secvența pentru șoarece B10.PL utilizată în exemplul 1, VDJ.

VDJ	SGDAGGYE
IR 1	CASSD-SSNTEVFFGK
IR 2	CASSD-SGNTEVFFGK
IR 3	CASSD-SGN-VLYFGEGSR
IR 9b	ASSD-SSNTE

Prepararea, administrarea și evaluarea 35 acestor vaccinuri a fost condusă așa cum se descrie în exemplul 1, cu următoarele excepții: 50 gg din peptidele VDJ individuale au fost încorporate în formulările de vaccin conținând CFA; nu s-au efectuat nici vaccinări în IFA și 40 nici vaccinări cu peptide unificate cu KLH.

Animalele de control au fost netratate înainte de provocarea cu MBP ca în exemplul 1, sau au fost vaccinate cu emulsii de PBS și CFA pentru a evalua efectul de protecție al adjuvantului singur. Rezultatele sunt arătate în tabelul 2 de mai jos.

Tabelul 2

Animalul nr.	Vaccinare (adjuvant)	Zile după provocarea bolii
10	11	12	13	14	15	16	17	18
1	nici unul	-	1	2	3	3	2	-	-	-
2	idem	1	3	3	3	2	-	-	-	-
3	idem	1	2	3	3	3	1	-	-	-
4	PBS-CFA	1	2	3	3	3	-	-	-	-
5	idem	1	2	3	3	3	-	-	-	-
6	PBS-CFA	-	2	3	3	3	-	-	-	-
7	IR1 (50 Mg)	-	-	-	2	1	-	-	-	-
8	idem	-	-	-	-	1	3	-	-	-
9	idem	-	-	-	1	1	1	1	-	-
10	IR2 (50 μ§)	-	-	1	3	3	3	-	-	-
11	idem	-	-	-	-	2	2	3	3	-
12	idem	-	-	-	-	1	-	-	-	-
13	IR3 (50 Mg)	1	3	3	3	2	-	-	-	-
14	idem	-	-	2	3	3	-	-	-	-
15	idem	-	-	-	-	-	-	-	-	-
16	IR9b (50 Mg)	-	-	-	-	-	-	-	-
17	idem	-	-	-	-	-	-	-	-	-
18	idem	-	-	-	-	-	-	-	-	-
19	idem	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Notația: - fără semne

1) coada fără vlagă

2) slăbirea picioarelor din spate

3) paralizia picioarelor din spate.

Așa cum se arată în tabelul 2 boala la 40 animalele de control nevaccinate a fost observată începând cu ziua a 10-a. Boala a fost caracterizată prin paralizie și stare gravă, a persistat timp de 4 până la 6 zile și după aceea animalul și-a revenit în mod spontan. Șobolanii 45 vaccinați cu PBS-CFA au arătat o stare de boală practic care nu se poate distinge de cea a animalelor de control nevaccinate. Spre deosebire de acestea, s-au observat întârzieri ale îmbolnăvirilor la unele animale vaccinate cu IR 1, 2 sau 3 și alte animale au arătat, atât întârzieri ale îmbolnăvirii, cât și o severitate mai redusă a bolii și/sau o durată mai redusă a bolii. în general, totuși, vaccinările cu peptidele VDJ de șobolan (IR 1-3) au fost, ușor, mai puțin eficiente decât cele cu peptida de șoarece VDJ (exemplul 1). Totuși, vaccinărea cu IR 9b, a produs o protecție completă a tuturor celor patru animale la care a fost testată. Este important, că nu s-au găsit nici leziuni histologice caracteristice bolii la nici unul din cele patru animale vaccinate cu IR 9b, arătând că semnele subclinice ale bolii au fost, de asemenea, abrogate. 5

Exemplul 3. S-a efectuat vaccinarea cu peptide specifice regiunii V, astfel:

S-a testat ca vaccin împotriva EAE o peptidă specifică pentru familia de gen V/38. V08 este familia de gene din lanțul beta cel 10 mai obișnuit utilizat de celulele T encefalitogene atât la șobolani cât și la șoareci. S-a sintetizat o peptidă bazată pe secvența DNA unică găsită în gena V08 și care nu se găsește printre alte gene V0 de șobolan a căror secvențe au fost raportate de Morris, et al.,

Immunogenetics 27:174-179 (1988). Secvența acestei peptide V/38, notată IR7, este:

IR 7 DMGHGLRLIHYS YDVNSTEK

Eficacitatea acestei peptide V/38 a fost testată în modelul de șobolan Lewis al EAE așa cum s-a descris în exemplul 1. S-au testat 50 gg de peptidă în CFA. Vaccinările în IFA sau cu combinații peptidă-KLH nu au fost realizate. Rezultatele acestor studii sunt arătate în tabelul 3.

Tabelul 3

Animalul nr.	Vaccinarea (adjuvant)	Zile după provocarea bolii
10	11	12	13	14	15	16	17	18
1	IR 7 (50 gg)	-	-	1	2	3	3	3	-	-
2	idem	-	-	-	-	1	1	-	-	-
3	idem	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Notația: - țâră semne

1) coada fără vlagă

2) slăbirea picioarelor din spate

3) paralizia picioarelor din spate.

Rezultatele vaccinărilor conduse cu peptidă V/38 de șobolan sunt similare cu cele observate cu peptidele de șoarece și șobolan IR 1, 2 și 3. La un animal s-a observat o îmbolnăvire întârziată precum și o severitate micșorată a bolii și o durată micșorată a bolii, 35 un animal a fost complet protejat.

Exemplul 4. S-a efectuat vaccinarea cu peptide din regiunea J, astfel:

S-a sintetizat o peptidă care corespunde segmentului de genă alfa, J, TA 39, găsită, 40 atât printre receptorii de celule T encefalitogene de șobolan, cât și de șoarece. Secvența acestei peptide, notată IR 5, este:

IR 5 RFGAGTRLTVK

Eficacitatea peptidei JaTA 39 a fost testată la modelul de șobolan Lewis al EAE, așa cum s-a descris în exemplul 1. 50 Mg de peptidă au fost testate în CFA. Nu s-au realizat vaccinări în IFA sau cu combinații peptidă-KLH. Rezultatele acestor studii sunt arătate în tabelul 4.

Tabelul 4

Animal, nr.	Vaccinarea (adjuvant)	Zile după provocarea bolii
10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
1	IR 5 (50 gg)	-	-	-	-	-	2	1	1	1	1	-
2	idem	-
3	idem	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Notație: - fără semne

1) coada fără vlagă

2) slăbirea picioarelor din spate

3) paralizia picioarelor din spate.

Rezultatele vaccinărilor conduse cu peptidă de șobolan J alfa TA 39 sunt mai eficiente decât cele observate cu peptida de șoarece VDJ sau cu peptida V/S8. Două din trei animale au fost complet protejate și în al 5 treilea animal izbucnirea bolii a fost întârziată în mod pronunțat. S-a redus și severitatea bolii la acest animal deși boala a persistat într-un curs normal de 5 zile. Este important că cele două animale care au fost complet protejate nu 10 au arătat o evidență histologică a infiltrației celulei T cu CNS. Acest rezultat indică o vaccinare cu J alfa TA 39 induce în mod foarte eficient un răspuns de regularizare îndreptat către celulele T encefalitogene. Chiar 15 și semnele de boală subclinice au fost abrogate.

Exemplul 5. S-a efectuat vaccinarea cu amestecuri de peptide TCR astfel:

Vaccinările au fost conduse cu un amestec de peptide TCR. Acest amestec a conținut 50 pg din fiecare din peptidele IR 1, 2, 3 și 5 (cele trei peptide de șobolan VDJ și peptida de șobolan J alfa TA 39).

Eficacitatea acestui amestec de peptide a fost testat în modelul de șobolan Lewis, așa cum s-a descris în exemplul 1. Peptidele au fost testate în CFA. Nu s-au realizat vaccinări în IFA sau cu combinații peptidă-KLH. Rezultatele acestor studii sunt arătate în tabelul 5.

Tabelul 5

Animalul nr.	Vaccinarea (adjuvant)	Zile după provocarea bolii
10	11	12	13	14	15	16	17	18
4	IR 1,2,3,5 (50 μg fiecare)	-	-	-	-	-	-	-	-	-
5	idem	-	-	-	-	-	-	-	-	-
6	idem	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Notație: - fără semne

1) coada fără vlagă

2) slăbirea picioarelor din spate

3) paralizia picioarelor din spate.

Rezultatele vaccinărilor conduse cu peptidele de șobolan J alfa TA 39 și trei peptide VDJ sunt apropape tot atât de eficiente ca cele descrise pentru IR9b din tabelul 2. Toate cele trei animale au fost protejate în totalitate. în plus față de absența 35 oricăror semne clinice de EAE, două din aceste trei animale au fost complet libere de evidența histologică a infiltrației celulei T în CNS pe când al treilea animal a prezentat numai două focare mici de infiltrație 40 limfocitică la baza măduvei spinării.

Exemplul 6. Vaccinul împotriva sclerozei multiple (MS):

Celulele T umane reactive MBP

Liniile de celulă T reactivă la MBP au 45 fost stabilite de la celulele mononucleare ale sângelui periferic PBMC, a nouă pacienți bolnavi cronici progresiv de scleroză multiplă

MS, și de la doi pacienți de control sănătoși.

Celulele au fost menținute în cultură prin 50 stimulare regulată cu MBP purificat uman și

PBNC autolog iradiat timp de trei zile, urmată de patru zile în mediu conținând IL-2.

Amplificarea PCR a genelor de lanț beta TCR de la linii de celule T reactive MBP.

Celulele T au fost recoltate din culturile în fază logaritmică și s-a preparat RNA, amplificată cu amorsă de V016 și încadrat în CB timp de 55 cicluri așa cum se descrie în exemplul 1.

Secvențe de lanț beta TCR ale celulelor T umane reactive MBP

Genele de lanț beta TCR amplificate cu V/316 de la linii de celule MBP reactive umane au fost ordonate folosind amorsa secvenței C/3. Produsele de amplificare au fost purificate cu gel, denaturate cu bază și ordonate din amorsa secvenței Cff. S-au obținut secvențe DNA vizibile din 5 astfel de linii, indicând că, clonii de celulă T predominanți au fost selectați prin trecerea în timp prelungit in vitro. Una din aceste secvențe de la linia de celule Re (tabelul 6), a posedat secvența de aminoacid cu un lanț beta VDJ, care a reprezentat cinci din primele șase și șase din cele nouă reziduri totale cu secvența 5 de aminoacid VDJ cu lanț beta conservată printre celulele T encefalogene MBP reactive în modelul șoarece B10.PL al EAE. Această secvență nu a fost prezentă printre rearanjările TCR predominante găsite în liniile de celule T 10 reactive MBP ale celor patru linii de celule T umane reactive MBP.

Pentru a determina dacă secvențe similare au fost prezentate în repertoriul lanțului beta al liniilor de celulă T reactivă 15 MBP din alți pacienți, amplificarea PCR a fost condusă cu o amor să degenerată («-1024) de 21 nucleotide V/3Re, corespunzând la șapte aminoacizi cu această secvență (tabelul 6). RNAs au fost transcrise invers și amplificate 20 în reacții din treapta I cu 20 ciclii cu primeri V/316 mer și C/Sext. Una din alicotele de un μΐ a acestor reacții din treapta I a fost reamplificată pentru 35 ciclii cu primeri de

V3Re și C/3. Una din alicotele de un μΐ din aceste reacții a fost analizată prin hibridizare pe pată Southern cu o probă umană de C/3 marcată ³²p. Această analiză a arătat produsul amplificat cu 300 bp în linia de celule Re și una din liniile celorlalți pacienți MS, dar nu în celulele T reactive MBP de la subiecții de control sau în clonii și liniile de celulă T umană reactivă MBP. Prezența acestei secvențe în două din cele nouă linii de testare ale pacienților MS testate este obligatorie, întrucât această secvență este cunoscută că este conservată printre celulele T encefalogene în EAE, detectarea ei printre celulele T reactive MBP de la pacienții MS demonstrează un rol al celulelor T care poartă acest determinant în patogeneza MS.

Peptidele imunogene având secvența SGDQGGNE pot fi sintetizate așa cum se arată în exemplul 1, și pot fi utilizate pentru a imuniza subiecții umani, prin metodele demonstrate în exemplul 1. Astfel de imunizări pot duce la un răspuns imun eficient (tabelul 6).

Tabelul 6

A	Proba		νβ	D/3	1β
			V/34.2		ΊβΣϊ
	MS-Re	ctctgc	agcggagaccagggcgga	aatgagcagttcttc
			L C	S G D Q G	G - N E Q F F
	B10.PL		S G D A G	G G Y E
B
		A	A	A
		C C	C	CCA
	5’ GG	GA CA	GG GG	AA GA 3’
		G T	G	G T G
		T	T	T

Exemplul 7. S-a efectuat izolarea 35 infiltratelor oiigoclonale a 11 celule T, νβ17 activate în sinovium-ul pacienților cu artrită reumatoidă.

Preparări de celulă T din țesut sinovial

Probele de țesut sinovial au fost 40 obținute de la pacienți cu artrită reumatoidă verificați radiografie care au fost supuși unei terapii de înlocuire combinată. Celulele T activate au fost selectate utilizând mărgele magnetice și anticorpi reactivi cu IL2-R 45 (aIL2-R) uman după cum urmează: Țesutul sinovial a fost fermentat timp de 4 h la 31° C, în ser bovin fetal PBS, RPMi + 10 % conținând 4 mg/ml de colagenază (Worthington Biochemical, Freehold, NJ) și 0,15 mg/ML DNAse (Sigma, St. Louis, MO.). Extractele au fost trecute printr-o sită de 80 ochiuri și s-au colectat celule individuale prin centrifigare cu gradient de densitate Ficoll. Celulele au fost spălate la interfață și au fost incubate la 10⁶/ml timp de 30 min, la 0°C, cu 5 μg/ml de IgG de șoarece de control (Coultes Immunology, Hialeah, FL) în PBS conținând 2% FBS (PBS-FBS). Celulele au fost spălate de trei ori și incubate timp de 30 min, la 0C, cu mărgele magnetice unite cu IgG anti-șoarece (Advanced Magnetice, Cambridge, MA).

Mărgelele au fost separate magnetic și spălate de trei ori cu PBS-FBS. Această preselecție cu IgG, mlgG de șoarece și mărgele magnetice a fost utilizată pentru controlul adsorbției nespecifice a celulelor T. Celulele rămase în 5 suspensia inițială au fost apoi incubate 30 min, la O’C, cu 5 /zg/ml de IgG de șoarece reactiv cu IL2-R de celulă T umană (Coulter Immunology, Hialeah, FL). Celulele au fost spălate și selectate cu mărgele magnetice ca 10 mai sus. Mărgelele de la preadsorbția IgG și selecția anticorpilor IL2-R au fost imediat resuspendate în guanidină-fenol-cloroform acidulat și RNA preparat așa cum este descris în Chonezynski și Sacchi, Anal.Biochem. 15 162:156 (1987), care este inclus aici ca referință. întrucât RNAS a fost preparat fără cultură in vitro a celulelor și influențele însoțitoare care pot fi induse, se așteaptă ca acestea să reflecte exact distribuțiile celulelor 20 T în țesutul sinovial în timpul extirpării chirurgicale. Numai jumătate din picăturile mlgG și aIL2-R de la pacientul 1012 au fost prelucrate imediat pentru RNA. Ceea ce a rămas a fost cultivat timp de 5 zile în RPMI 25 1640, 5 % FBS, 20 % HL-1 (Ventrex Laboratories Inc., Portland, ME), 25 mM HEPES, glutamină, antibiotice și 20 % supernatant LAK (Allegretta et al, Science, 247:718 (1990)), care este inclus aici ca 30 referință, ca sursă, pentru IL-2. RNA a fost extras din culturi de picături aIL2-R (1012IL2.d5), dar nu din proba 1012 mlgG dat fiind că la sfârșitul culturii de 5 zile nu au fost prezente celule vii. 35

Un clon de celulă T a provenit dintr-o peletă Ficoll a pacientului 1008. Celulele din peletă au fost cultivate la 2 x 10⁶/ml în medii fără IL-2 timp de două săptămâni. Celulele neaderente din această cultură au fost clonate prin diluare limitativă pe monostraturi de celule sinoviale autologe. Un clon 1008.8 de celulă T, CD4+ a fost obținut și adaptat la cultură prin stimulare regulată cu monostraturi sinoviale autologe timp de 3 zile în medii fără IL-2 urmată de cultivarea timp de 4 zile într-un mediu cu supenatant LAK.

Distrugerea celulelor sinoviale aderente prin 1008.8

Distrugerea celulelor sinoviale aderente prin 1008.8 a fost demonstrată după cum urmează: Monostraturile de celule sinoviale, au fost marcate așa cum s-a descris în Stedman și Campell, J. Immunol.Meth. 119:291 (1989), care este inclus aici ca referință cu ³⁵S pentru utilizarea ca obiective în încercări CTL. Celulele au fost tipsinizate, spălate și plasate la 2000 celule pe cavitate sau la o placă de microtitru cu fund rotund cu 96 cavități. Celulele 1008.8 cultivate timp de 3 zile înainte de încercarea cu celulele sinoviale aderente și mediu conținând supernatant LAK, au fost adăugate la obiective la raporturile indicate de realizator: obiectiv. Culturile au fost incubate peste noapte, la 37 °C, centrifugate la 300 xg timp de 2 min și radioactivate în 50 μΐ de supernatant cuantificat. Distrugerea procentuală specifică a fost calculată față de obiectivele distruse în detergent prin formulele standardizate. Acest clon este citotoxic pentru obiectivele de celule sinoviale aderente în încercările CTL. (tabelul 7).

Tabelul 7

Raportul realizator: obiectiv	% de distrugere specifică
5:1	7
10:1	16
25:1	32

Amplificarea PCR a genelor de lanț 45 beta TCR

Genele de lanț beta TCR au fost amplificate cu câteva combinații din primerii arătați în tabelul 8. Primerul Vj816 este un primer V/3 degenerat (n=256) care este prevăzut să lege 85 % din genele umane ale lanțului beta TCR la toate 16 reziduurile și 95 % la 15 reziduuri. Acest primer a fost utilizat pentru a amplifica lanțurile beta TCR din mai mult decât 25 cloni diferiți de celulă T umană, linii sau preparate de țesut primar. S-a desfășurat un spectru de gene V/3 din aceste DNAs amplificate, argumentând împotriva unei tendințe semnificative a primerului pentru 5 anumite familii de Νβ. Astfel, amplificarea PCR cu primerul V/316 ușurează analiza populației de celule T pentru care cunoașterea unui precedent a utilizării genei V$ este inaccesibilă. 10

Genele de lanț beta a receptorului de celulă T au fost amplificate în reacții de amplificare în două stadii cu perechi încadrate ale primerilor arătați în tabelul 7. RNAs au fost transcrise invers timp de o oră, la 42’C, 15 cu 40 pmol de primer Cfi ext într-o reacție în 12 μΐ utilizând condițiile descrise de Hart et al., The Lancet, p.596 (1988), inclusă aici ca referință. Amestecurile de reacție au fost diluate cu un amestec etalon conținând 40 20 pmoli de primer V/316 mer, nucleotide și tampon de reacție ca mai sus dar fără MgCl₂ pentru a da o concentrație finală de Mg⁺² de

3,6 mM. Probele au fost denaturate timp de 15 min la 95 C, 1 unitate de polimerază DNA recombinată stabilă la căldură (Cetus Corporation, Emeryville, CA, Amplitag™) a fost adăugată și s-au condus 20 ciclii de PCR. Fiecare ciclu a constat dintr-o denaturare de 1 min, la 95’C, o treaptă de revenire de două minute și o extensie de două minute la 72’C. Primele două cicluri au fost normalizate la 37’C și 45’C, resp, iar partea rămasă la 50’C. Un microlitru alicot din amestecul de reacție din această treaptă I a fost adăugat la 100 μΐ de amestecuri de reacție de amplificare din stadiul II (Cetus, Gene-Amp Kit™) conținând 100 pmoli din primerul C0 int și 100 pmoli de V/38, V/317 sau primerii 5’C/î sau 700 pmoli din primerul Vj816. Amplificările din stadiul II au fost conduse ca mai sus cu utilizarea unei temperaturi de normalizare de 50’C și fără ridicarea la 37’C și 45’C (tabelul 8).

Tabelul 8

7	.— v —-	...........D -	------j------------------	... c-----------------------
			3’..............5’	3’ -	—- 5’ 3’	------5’
			C/3 seq		C/3int	C0ext
Vj316mer	Vj817	V/38	5’C0
5’-----3’	5’ — 3’	5’-----3’	5’ —- 3’

3’............................. 5’

V016mer

V017

V|38 5’ Cj8 C/3ext C/3int C/3seq

GAC CAAA

5’T TC TGGTA CA 3’

T T T T C G T

5’ T C A C A G A T A G T A A A T G A C T T T C AG 3’ 5’ T CTCC ACTCT G A AG ATCC 3’ 5’CAAGCTGTTCCCACCCGA3’ 5’CCAGAAGGTGGCCGAGAC3’

5’GCGGCTGCTCAGGCAGTA3’ 5’CGACCTCGGGTGGGAACA3’

Probe RNA din culturi 1012lL2.d5 și 45 1008.8 au fost amplificate cu primerii V/516 și CjSext în reacțiile din stadiul I și cu V/Î16 și C/3int primer în 35 cicluri din stadiul II. Produsele de reacție, purificate pe felii de gel de agaroză cu punct de topire scăzut cu bile 50 din sticlă Gene Clean (BiolOl, sau Diego, CA) au fost denaturate cu bază și desfășurate din primerul secvenței C/3 cu polimerază T7 (Secvenază, United States Bioche, Cleveland, OH). în proba 1012IL2, d5 a fost detectată în mod clar o secvență predominantă V0 corespunzând la un rearanjament individual V/317, tabelul 9. Alte rearanjamente mai puțin frecvente au fost detectate ca fiind sub formă de benzi slabe, neinterpretabile în gelurile de aranjare. Cultura acestor bile 1012. IL2 în mediu conținând IL2 fără adăugarea unor celule sau antigen suplimentar nu se așteaptă să inducă din nou activitatea celulelor T. Astfel, predominarea unui singur rearanjament V/317 în această probă, reflectă in vivo expansiunea clonală a celulelor V/317 + T la acest pacient. Determinarea secvenței DNA a

DNA lanțului beta TCR amplificat din clonul de celulă T citotoxică, 1008,8, a arătat, de asemenea, un rearanjament V017 (tabelul 9). Prezența rearanjamentelor V/S17 în aceste două 5 tipuri diferite de probe de celule T sinoviale, derivate din doi pacienți RA separați, implică celule T care poartă V/317 în patogeneza lui RA (tabelul 9).

Tabelul 9

Proba	V/3	D/3
1012	Y L C A S	K N P T V S	Y G Y T F
ziua 5	tatctctgtgccagt V/317	aaaaatcccacggtctcc	tatggctacaccttc Ιβ 1,2
1008,8	Y L C A S tatctctgtgccagt V/317	D N gacaac	E A F F G gaggctttctttgga Ιβ 1,1
1014	V L C A S	VRDRR	N Y G Y T
IL-2	tatctctgtgccagt V/317	gtgagggacaggaga	aactatggctacacc J/3 1,2
1015	Y L C A S S	S I D S	S Y E Q Y
IL-2	tatctctgtgccagtagt V/317	agtatagactcc	tcctacgagcagtac 2,7

Prezența rearanjărilor V/317 în probele RNA sinoviale rămase a fost evaluată prin amplificarea PCR cu primerul specific al V/S17 (tabelul 8), DNA TCR V017 a fost amplificat prin probele de magnet în granule derivate de la fiecare din cei șapte pacienți RA. Colorarea bromurii de etidiu a produselor reacției de electroforeză a arătat o amplificare mai mare de V017 în patru din probele aIL2-R decât în cele de control mlgG. Această îmbogățire nu a fost un produs al procedurii de izolare, întrucât amplificarea lui VJ38 TCRs nu a reușit să arate diferențe între probele de mlgG și IL2-R.

Rearanjamentele V/317 din două preparate din aIL2-RNA au fost amplificate cu perechea de primeri V/317 și C/3int și produsele de reacție au fost orânduite cu primerul C/3 seq. Probele 1014 și 1015 au conținut secvențe individuale tabelul 9) care au demonstrat, ca în proba 1012IL2.d5 expansiunea clonală a celulelor V/317 T in vivo. Dimpotrivă, orânduirea directă a rearanjamentelor amplificate cu primerul specific VJ37 nu a fost posibilă datorită eterogenității din produsul lanțului beta.

V017 are secvența de aminoacid MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAM YWYRQDPQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIA EGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYL CASS (aminoacizii sunt reprezentați prin codurile convenționale cu o literă).

Analiza HLA-DR lapacienții cu artrită reumatoidă

Analiza HLA-DR la pacienții cu artrită reumatoidă a fost realizată după cum urmează: ADN de la fiecare pacient a fost preparat prin fierberea a IO⁵ celule sinoviale în 200μ1 dH₂O. Zece μΐ au fost amplificați timp de 35 ciclii într-un amestec de reacție de 100 μΐ (Cetus, Gene Amp Kit^IN) conținând 100 pmoli din fiecare dintre polimerii DRB PCR (tabelul 10). O zecime din acest amestec de reacție a fost reamplificat în 10 μ.1 conținând numai primerul DRB2 și 17 pmoli de «32PdCTP ca unică sursă de dCTP timp de 10 ciclii. Reacțiile au fost străpunse cu

200 μϊ dCTP și împrăștiate 2 ciclii. Probele negative rezultate rămase au fost hibridizate la pete tăiate conținând 10 pmoli de oligomeri specifici de alele (fascicule pozitive) utilizând condițiile descrise mai înainte de Amor și 5 colaboratorii, J.Immunol. 138:1947 (1987), care este inclus aici ca referință. Crestăturile au fost spălate de două ori timp de 20 min cu clorură de tetrametilamoniu (Wood et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1585 (1985) care este inclus aici ca referință) la 65-68’C și expus la film cu raze X.

Fiecare din pacienții din acest studiu au posedat cel puțin o alelă de gene HLA-DR, DR4w4, DR1, DR4wl4 sau DR4wl5, care se cunosc că predispun la RA (tabelul 10).

Tabelul 10

A)
5’--------------------------	ASO	3’	— 3’ -------5’ DR/32
DR/32
5’----------------3’
3’-----------------------		-----------------------------------5’
	A
DR/31 5’GAGTCTGGAACAGC3’
	C
	A
DR/32 5’GTAGTTCTTCTGCA3’
	G
Gene HLA-DR ALELE - Oligonucleotide specifice
DR/31
DRl, DR4W14, DR4W15	5’ CTC CTG GAG	CAG AGG CGG GCC	GCG 3’
DR2	5’ T.....	G-C .....C	3’
DR3	5-	-A- — -G-	CG- 3’
DR4W4	5’	-A-	3’
DR4W13	5’	—	-A- 3’
DR5, DR6, DR4W10	5’ A- — -A	G-C GA-	3’
DR7	5’ A-	G-C .......G-	CA- 3'
DR8	5’ T.......A	G-C	CT- 3’
DR9	5’ T-	-G.....-	-A- 3’
DR/33 Gene
DR2	5’ A-	GC-	3’
DR3	5’	-A- — -G-	CAG 3’
DR7, DR9	5’	-G- .........	-A- 3’
B)
Pacient	HLA-DR
1008	l,4w4
1012	1,3
1013	1,7
1014	l,4w4
1015	4w4, 4w4
1016	N.D.
1017	1.7

în concluzie receptorii de celulă T conținând Vfil7 sau fragmente din aceștia care sunt imunogene sau pot fi făcute imunogene, pot fi utilizate pentru a imuniza subiecții umani prin metodele demonstrate în exemplul 7. Astfel de imunizări pot duce la un răspuns imun eficient.

Claims (14)

1. Revendicări

   1. Vaccin pentru prevenirea sau tratarea unor boli care rezultă din răspunsuri patogene prin populații de celule T specifice, caracterizat prin aceea că este constituit dintr-o cantitate eficientă imunogen a unui receptor de celulă T sau aunui fragment din acesta corespunzător la un receptor de celulă T prezent pe suprafața celulelor care mediază boala respectivă și un mediu acceptabil farmaceutic.
2. 2. Vaccin, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că pentru tratarea artritei reumatoide, receptorul de celulă T prezintă secvența de aminoacizi MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPK YLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIV NDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSA QKNPTAFYLCASS, precum și modificări care nu afectează capacitatea receptorului să acționeze ca imunogen și fragmente reprezentative din punct de vedere imunogen ale acestuia.
3. 3. Vaccin, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că fragmentul de celulă T cuprinde o secvență de regiune variabilă de lanț β a receptorului de celulă T și anume secvența SQIVNDFQK.
4. 4. Vaccin, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizat prin aceea că fragmentul de receptor de celulă T cuprinde o secvență de regiune joncțională.
5. 5. Vaccin, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că pentru tratarea sclerozei multiple, receptorul de celulă T cuprinde secvența SGDQGGNE.
6. 6. Vaccin , conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, cuprinde mai mult decât un tip de celulă T sau un fragment al acestuia.
7. 7. Vaccin, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, cuprinde mai mult decât un fragment corespunzător la diferitele secvențe ale aceluiași receptor de celulă T.
8. 8. Vaccin, conform revendicărilor 1 - 7, caracterizat prin aceea că într-o formulare cu un adjuvant, se utilizează în tratarea sau prevenirea unor boli de autoimunitate, mediate de replierea clonală neregulată a celulelor T, administrat odată sau de mai multe ori.
9. 9. Metodă de diagnosticare sau de prevenire a susceptibilității față de artrita reumatoidă, caracterizată prin aceea că, constă în detectarea într-o probă suspectă, de preferință , din țesutul sinovial, a celulelor T având regiune variabilă de lanț -β MS NQ VLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPK YFLRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWY RQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEG YSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCA SS, sau un fragment din aceasta, de preferință, cu un ligand detectabil cunoscut, capabil să se lege specific la regiunea variabilă de lanț - β, sau cu probe de nucleotide complementare la secvențe de nucleotide care codifică această regiune.
10. 10. Metodă de profilaxie sau de tratament a artritei reumatoide, caracterizată prin aceea că, constă în prevenirea atașării unui receptor de celulă T conținând regiunea MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPK YLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQI VNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTS AQKNPTAFYLCASS , la partenerul său de legătură, HLA-DR, de preferință, prin legarea unui ligand la această regiune sau la partenerul ei de legătură.
11. 11. Metodă de diagnosticare sau de prevenire a susceptibilității față de scleroza multiplă,caracterizată prin aceea că, constă în detectarea într-o probă a celulelor T având secvența SGDQGGNE, de preferință, cu un ligand cunoscut, capabil să se lege specific sau cu o probă de nucleotidă, care este complementară față de secvența de nucleotidă care codififcă secvența dată.
12. 12. Metodă de profilaxie sau de tratament a sclerozei multiple, caracterizată prin aceea că, constă în prevenirea atașării unui receptor de celulă T conținând secvența SGDQGGNE la partenerul său de legătură, de preferință, prin legarea unui ligand la secvența menționată sau la partenerul de legătură al receptorului menționat al celulei T.
13. 13. Metodă de profilaxie sau de tratament a sclerozei multiple, caracterizată prin aceea că, constă în tratarea celulelor T 5 conținând secvența SGDQGGNE cu un agent citotoxic sau citostatic, care leagă selectiv secvența menționată, și care, de preferință, poate fi un anticorp atașat la o substanță aleasă din grupul constând din substanțe radioactive, 10 terapeutice sau chemotactice.
14. 14. Procedeu de obținere a vaccinului prezentat în revendicările, 1-8, caracterizat prin aceea că, constă în izolarea clonilor de celulă T, care induc boala la indivizi afectați, determinarea secvențelor de aminoacizi ale receptorilor de celulă T de la clonii celulei T, alegerea segmentelor din acești receptori care sunt caracteristice pentru receptorii de celulă T care mediează boala, și selecția secvențelor de aminoacizi din secvențele receptorilor de celulă T capabile să stabilească un răspuns imunogen la receptorul celulei T.