NO309164B1

NO309164B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av vaksine

Info

Publication number: NO309164B1
Application number: NO913722A
Authority: NO
Inventors: Mark D Howell; Steven W Brostoff; Dennis J Carlo
Original assignee: Immune Response Corp Inc
Priority date: 1989-03-21
Filing date: 1991-09-20
Publication date: 2000-12-18
Also published as: FI914432A0; BG95337A; DE69006018T2; DE69006018D1; NO913722L; EP0463101A1; ES2062519T5; NO20002425L; DK0463101T3; AU6893094A; AU7650096A; BG61164B1; AU648753B2; ES2062519T3; EP0463101B1; WO1990011294A1; AU6892994A; RO110397B1; JP3472297B2; AU6892894A

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine omfattende et peptid som har en aminosyresekvens med et ikke-konstant område fra en T-cellereseptor med begrenset heterogenitet som er til stede på T-celler som medierer en patologisk tilstand, hvori peptidet induserer en immunrespons mot T-cellene som forebygger eller reduserer alvorligheten av den patologiske tilstand.

Høyere organismer karakteriseres ved et immunsystem som beskytter dem mot invasjon av potensielt skadelige stoffer eller mikroorganismer. Når et stoff, kalt et antigen, kommer inn i kroppen og gjenkjennes som fremmed starter immunsystemet både en antistoff-mediert respons og en celle-mediert respons. Celler i immunsystemet kalt B-lymfo-cytter eller B-celler produserer antistoffer som spesifikt gjenkjenner og bindes til det fremmede stoff. Andre lymfocytter kalt T-lymfocytter eller T-celler både fremkaller og regulerer den cellemedierte respons som til slutt vil resultere i eliminas-jon av antigenet.

En rekke forskjellige T-celler er involvert i den celle-medierte respons. Noen induserer spesielle B-cellekloner til proliferasjon og produksjon av antistoffer spesifikke for antigenet. Andre gjenkjenner og ødelegger celler som presenterer fremmede antigener på overflaten. Visse T-celler regulerer responsen ved enten å stimulere eller å undertrykke andre celler.

Selv om det normale immunsystem er nøye regulert er avvik i immunresponsen ikke uvanlige. I visse tilfelle fun-gerer immunsystemet uhensiktsmessig og reagerer på vertsko-mponenter som om de var fremmede. En slik respons resulterer i en autoimmunsykdom hvor vertens immunsystem angriper vertens eget vev. T-celler er som primære regulatorer av immunsystemet direkte eller indirekte årsak til slike autoimmunsykdommer.

En rekke sykdommer antas å skyldes autoimmunmekanis-mer. Fremstående blant disse er reumatoid artritt, systemisk lupus erythematosus, multippel sklerose, type I diabetes, myasthenia gravis og pemphigus vulgaris. Autoimmunsykdommer påvirker millioner av mennesker over hele verden, og kostnad-ene av disse sykdommer anslås til milliarder av dollar pr. år når både behandlingskostnader og tapt produktivitet tas med. Pr. i dag finnes ingen effektiv behandling for slike autoimmunsykdommer. Vanligvis kan bare symptomene behandles mens sykdommen fortsetter å utvikle seg, ofte med alvorlig svek-kelse eller død som resultat.

I andre tilfeller deler lymfocytter seg uhensiktsmessig og uten kontroll. Slik celledeling resulterer i en krefttilstand kalt et lymfom. Dersom de uregulerte lymfocytter er av T-celletypen kalles svulstene T-cellelymfomer. I likhet med andre ondartede svulster er T-cellelymfomer vanskelige å behandle effektivt.

Der er følgelig et lenge følt behov for en effektiv måte å kurere eller bedre T-cellemedierte sykdommer. En slik behandling skulle ideelt kontrollere den uhensiktsmessige T-celleresponsen snarere enn bare å redusere symptomene. Foreliggende oppfinnelse tilfredsstiller dette behov og gir i tillegg andre fordeler.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine omfattende et peptid som har en aminosyresekvens med et ikke-konstant område fra en T-cellereseptor med begrenset heterogenitet som er til stede på T-celler som medierer en patologisk tilstand, hvori peptidet induserer en immunrespons mot T-cellene som forebygger eller reduserer alvorligheten av den patologiske tilstand,

og fremgangsmåten er særpreget ved at den har følgende trinn:

a. utvelgelse av T-celler som medierer nevnte patologiske tilstand, hvori T-cellene har begrenset T-cellereseptorheterogenitet; b. bestemmelse av aminosyresekvensen til T-cellereseptorene med begrenset heterogenitet fra nevnte T-celler; c. utvelgelse av en aminosyresekvens med et ikke-konstant område som er karakteristisk for nevnte T-cellereseptorer med begrenset heterogenitet som stimulerer en flerfasettert immunrespons mot nevnte T-celler; og d. fremstilling av et peptid som omfatter nevnte utvalgte aminosyresekvenser med ikke-konstant område, for med dette å fremstille vaksinen.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen gjelder fremgangsmåte for fremstilling av vaksiner for forebygging eller bedring av sykdomsforløpet for T-cellemedierte sykdommer som autoimmunsykdommer og T-cellelymfomer. Vaksinasjon sørger for en spesifikk og vedvarende behandling som unngår problemer forbundet med andre mulige behandlingsveier.

I det følgende benyttes begrepet "T-cellemediert sykdom" om enhver tilstand hvor en uhensiktsmessig T-cellerespons inngår i sykdommen. Begrepet er ment å inkludere både sykdommer som direkte forårsakes av T-celler og sykdommer som primært er karakterisert ved skade som resultat av antistoff-binding som f.eks. myasthenia gravis, og likeså sykdommer hvor en uhensiktsmessig T-cellerespons bidrar til produksjon av disse antistoffer. Begrepet er ment å omfatte både T-cellemedierte autoimmunsykdommer og uregulert klonal T-celle-replikasjon.

I det følgende er begrepet "i det vesentlige tilsvarende sekvensen" når en aminosyresekvens omtales, ment å omfatte den beskrevne sekvens eller andre sekvenser med addi-sjoner, delesjoner eller substitusjoner som ikke i det vesentlige påvirker sekvensens evne til å fremkalle en immunrespons mot den ønskede T-cellereseptor-sekvensen. En del av den beskrevne immuniserende sekvens kan således nyttes så lenge den er tilstrekkelig karakteristisk for den ønskede T-cellereseptor til å forårsake en effektiv immunrespons mot ønskede T-cellereseptorer, men ikke mot uønskede T-cellereseptorer. Slike variasjoner i sekvensen kan lett lages f.eks. ved å syntetisere en alternativ sekvens, og testes f.eks. ved immunisering av et pattedyr for å bestemme dets effektivitet.

I det følgende er begrepet "fragment" ment å omfatte slike fragmenter i forbindelse med eller kombinert med andre sekvenser eller deler, som f.eks. peptidet er koblet til andre aminosyresekvenser eller til en bærer. Begrepene "fragment" og "peptid" er følgelig ensbetydende, siden et peptid vil være det vanligste fragment av T-cellereseptoren. Hvert fragment i oppfinnelsen kan ha en endret sekvens som beskrevet ovenfor for begrepet "i det vesentlige tilsvarende sekvensen".

Omtale i det følgende av et "fragment eller del av T-cellereseptoren" betyr ikke at forbindelsen må være fremstilt fra intakte T-cellereseptorer. Slike "fragmenter eller deler" kan fremstilles på en rekke måter velkjent for fagfolk, som f.eks. ved manuell eller automatisk peptidsyntese eller ved kloning.

Når i det følgende peptidfragmenter som omfattes av oppfinnelsen beskrives som "tilsvarende" TCR-sekvenser, menes at peptidfragmentet har en aminosyresekvens som er tilstrekkelig homolog til TCR-sekvensen til å stimulere en effektiv regulatorisk respons i individet. Sekvensen behøver imidlertid ikke være identisk med TCR-sekvensen, som vist i eksempel II og III.

Med "immunogenisk effektiv" menes en mengde av T-cellereseptoren eller et fragment av denne som effektivt fremkaller en immunrespons tilstrekkelig til å forebygge eller behandle en T-cellemediert sykdom eller en uregulert T-celleklonal replikasjon i individet. Den nødvendige mengde vil åpenbart variere mellom arter og individer avhengig av en rekke faktorer. En effektiv immunrespons i et menneske vil f.eks. kreve høyere doser enn en tilsvarende respons i en mus.

I det følgende refererer "V"Pl7" til en spesifikk variabel region i T-cellereseptorens p-kjede. Vf3l7 har aminosyresekvensen MSNQVLCCWLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQN

LNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTA

FYLCASS. De hypervariable regioner og "junction"-regionene er mest anvendelige for vaksiner. En hypervariabel region i vpi7 som er spesielt anvendelig er CDR2-regionen, som har aminosyresekvensen SQIVNDFQK. Endringer i denne sekvensen som ikke påvirker reseptorens evne til å virke som et immunogen og å stimulere den ønskede immunrespons, er også omfattet av definisjonen. Den variable region kan kobles med hvilket som helst D- eller J-segment i TCR. Videre er også immunogenisk representative fragmenter av vpi7 omfattet av definisjonen "vpi7".

I det følgende benyttes begrepet "bindingspartner" om stoffer som reagerer med en TCR. Vanligvis vil dette stoffet være et "Major Histocompatibility Antigen" (MHC), men det kan være hvilket som helst stoff så lenge binding til TCR i et normalt forløp forårsaker T-celleaktivering eller proliferasjon.

I det følgende benyttes begrepet "ligand" om alle molekyler som kan reagere og danne komplekser med andre molekyler .

At et molekyl "selektivt bindes til" et annet vil i det følgende bety at molekylet bindes til én type molekyler men ikke i vesentlig grad til andre typer molekyler. I forbindelse med vpi7 betyr "selektiv binding" at et stoff bindes til TCR som inneholder vpi7, men ikke i vesentlig grad til andre TCR som mangler vpi7.

For en vert (selv) er immunsystemet det primære bio-logiske forsvar mot mulige skadelige stoffer (ikke-selv). Disse skadelige stoffer kan være patogener som bakterier eller virus så vel som modifiserte selv-celler, deriblant virusinfiserte celler, tumorceller eller andre unormale celler fra verten. Samlet omtales disse mål for immunsystemet som antigener. Gjenkjennelse av et antigen av immunsystemet gir en rask mobilisering av immunmekanismer for ødeleggelse av antigenet, slik at vertsmiljøets ukrenkelighet gj enopprettes.

De vesentligste uttrykksformer for en antigenspesi-fikk immunrespons er humoral immunitet (antistoffmediert) og cellulær immunitet (cellemediert). Begge disse immunologiske mekanismer startes ved aktivering av hjelper (CD4+)-T-celler. Disse CD4+-T-celler vil så stimulere B-celler som er forbe-redt til antistoffsyntese ved binding av antigen til proliferasjon og sekresjon av antistoffer. Utskilt antistoff bindes til antigenet og letter dets ødeleggelse ved andre immunmekanismer. Tilsvarende vil CD4+-T-celler gi stimula-toriske signaler til cytotoksiske (CD8+)-T-celler som gjenkjenner og ødelegger cellulære mål (f.eks. virusinfiserte celler fra verten). Aktivering av CD4+-T-celler er således første trinn i stimuleringen av en immunrespons. Utredning av de mekanismer som ligger til grunn for en antigen-spesifikk aktivering av CD4+-T-celler er således avgjørende for ethvert forsøk på selektivt å modifisere immunologiske funksjoner.

T-cellenes antigen-spesifisitet skyldes T-cellereseptoren (TCR) som er uttrykt på celleoverflaten. TCR er et heterodimert glykoprotein sammensatt av to polypeptidkjeder, hver med en molekylvekt på tilnærmet 4 5 kD. To former av TCR har blitt identifisert. Én er sammensatt av en alfa-kjede og en beta-kjede mens den andre består av en gamma-kjede og en delta-kjede. Hver av de fire TCR-polypeptidkjedene kodes av et eget genetisk locus som består av en rekke diskontinuer-lige gensegmenter. Disse omfatter gensegmenter for variable (V)- regioner, gensegmenter for "junction" (J)-regioner og gensegmenter for konstante (C)-regioner. Beta- og delta-kjeder inneholder ytterligere et element kalt diversitets(D)-gensegmentet. (Siden D-segmenter og -elementer bare finnes i noen genetiske loci for TCR og noen TCR-polypeptider, vil videre omtale i det følgende av D-segmenter og -elementer være i parenteser for å indikere at disse regioner bare inngår i de behørige TCR-kjeder. V(D)J vil således omfatte både VDJ-sekvenser i kjeder med en D-region og VJ-sekvenser i kjeder uten D-regioner.)

Under modningen av lymfocytter rearrangeres enkelt-liggende V-, (D)- og J-gensegmenter slik at et funksjonelt gen som bestemmer aminosyresekvensen til TCR uttrykt av den gitte celle dannes. Siden forrådene av V-, (D)- og J-gener som kan rearrangeres består av flere medlemmer, og siden individuelle medlemmer av disse forråd kan rearrangeres i nær sagt enhver kombinasjon, er det fullstendige TCR-repertoar meget variabelt og i stand til spesifikt å gjenkjenne og binde det store utvalg av bindingspartnere som en organisme kan utsettes for. En gitt T-celle vil imidlertid bare ha én type TCR-molekyl, og dette TCR-molekyl vil i det vesentlige, om ikke fullstendig, bestemme T-cellens spesifisitet med hensyn til bindingspartner.

Dyremodeller har i stor grad bidratt til vår for-ståelse av de immunologiske mekanismer som inngår i autoimmunsykdommer. Én slik dyremodell gjelder eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE) som er en autoimmunsykdom i sentralnervesystemet som kan induseres i mus og rotter ved immunisering med "myelin basic protein" (MBP). Sykdommen er klinisk karakterisert ved paralyse og mild utmagring, og histologisk ved en perivaskulær infiltrasjon av sentralnerve-systemets parenkym med mononukleære celler. Sykdommens patogenese formidles av T-celler med spesifisitet for MBP. En rekke kloner av MBP-spesifikke T-celler har blitt isolert fra dyr som lider av EAE og videredyrket i kontinuerlig celle-kultur. Etter stimulering in vitro med MBP vil disse T-cellekloner raskt indusere EAE når de overføres til friske verter. Av stor viktighet er at disse EAE-induserende T-celler er spesifikke ikke bare for det samme antigen (MBP), men vanligvis også for én enkelt epitop på dette antigen. Disse obser-vasjoner indikerer at atskilte populasjoner av "selv"-angrip-ende T-celler er ansvarlige for patogenesen av EAE.

Analyse av TCR-ene fra EAE-induserende T-celler har avslørt begrenset heterogenitet i strukturen til disse syk-domsassosierte reseptorer. I én analyse av 3 3 MBP-reaktive T-celler var bare to alfa-kjede V-region-gensegmenter og én enkelt alfa-kjede J-region-gensegmenter benyttet. Tilsvarende begrensninger ble også observert når det gjaldt benyttelse a\ gensegmenter for TCR beta-kjede i denne T-cellepopulasjon, idet bare to beta-kjede V-regionsegmenter og to J-region-gensegmenter ble funnet. Av større viktighet er at tilnærmet 80 % av T-celleklonene hadde identisk aminosyresekvens over området for V-D-J-sammenkobling i beta-kjeden. Disse funn bekrefter antagelsen om en felles TCR-struktur blant T-celle] med tilsvarende antigenspesifisitet, og indikerer at TCR er et egnet mål for immunoterapeutiske strategier rettet mot eliminering av patogenesen av EAE.

En rekke forsøk har blitt gjort på å utnytte "selv"-angripende T-cellers antigene spesifisitet i formulering av strategier for behandling av EAE. Et eksempel er passiv til-førsel av monoklonale antistoffer spesifikke for TCR-molekyler til stede på EAE-induserende T-celler. I muse-modellen for EAE reduserte infusjon av et monoklonalt antistoff spesifikt for Vp8, det mest benyttede beta-kjede V-regiongenet i MTP-spesifikke T-celler, musenes sårbarhet overfor påfølgende EAE-induksjon (Acha-Orbea et al., Cell 54:263-273 (1988) og Urban et al., Cell 54:577-592 (1988)). Tilsvarende beskyttelse har blitt vist i rotte-EAE med et monoklonalt antistoff som reagerer med en ikke-identifisert idiotypisk determinant på TCR fra MBP-spesifikke T-celler (Burns et al., J. Exp. Med. 169:27-39 (1989)). Selv om passiv antistoffterapi synes å ha en viss formildende virkning på EAE-sårbarhet er behandlingsformen utsatt for en rekke mulige problemer. Den oppnådde beskyttelse er forbigående slik at gjentatt tilførsel av antistoffet er nødvendig. Gjentatt infusjon av antistoff øker faren for at verten vil iverksette en immunrespons mot det tilførte antistoff, spesielt hvis det er fremstilt i et xenogent dyr. Videre representerer anti-stoffrespons mot en patogen T-celleklon bare ett element i den fullstendige immunrespons og neglisjerer mulige bidrag fra den cellulære immunitet med hensyn til å fjerne auto-rerktiviteten.

Den cellulære immunitets rolle for reduksjon av "selv"-angripende T-cellers aktivitet i EAE har blitt under-søkt, og mulige terapier foreslått. Som for fremgangsmåten med passive antistoffer har regulatoriske T-celler blitt derivert ex vivo og tilbakeført i immunoterapeutisk øyemed. Sun et al., Nature, 332:843-845 (1988) har således nylig isolert en CD8+-T-celleklon fra konvaleserende rotter i hvilke EAE hadde blitt indusert ved tilførsel av en MBP-spesifikk CD4+-T-cellelinje. Denne CD8+-T-celleklon viste cytolytisk aktivitet in vitro overfor CD4+-T-cellen som var benyttet til induksjon av sykdommen. Tilførsel av denne CTL-klon reduserte videre sårbarheten av mottakerrotter for påfølgende tilførsel av MBP. Lider et al., Science, 239:181-183 (1988) har også isolert en CD8+-T-celleklon med dempende aktivitet overfor EAE-induserende T-celler. Denne CD8+-klon ble isolert fra rotter vaksinert med svekkede sykdomsinduserende T-cellekloner og kunne, selv om det ikke viste cytolytisk aktivitet in vitro, undertrykke MBP-indusert proliferasjon av EAE-induserende T-celler. Selv om disse undersøkelser indikerer at CD8+-T-celler kan nedregulere EAE er det vanskelig å forutsette en viktig rolle for disse utvalgte CD8+-CTL i de restituerte rotters langtidsresi-stens, siden Sedgwick et al. (Eur. J. Immunol., 18:495-502

(1988)) klart har vist at uttelling av CD8+-celler med monoklonale antistoffer ikke påvirker sykdomsforløpet eller restitusj onen.

I forsøkene til Sun et al. og Lider et al. beskrevet ovenfor overvinner tilførsel av eksisterende regulatoriske T-celler den viktigste ulempe ved passiv antistoffterapi, idet en regulatorisk respons in vivo av forlenget varighet til-lates. Utvikling av slike regulatoriske T-cellekloner krever imidlertid in vi tro-dyrking av svekkede sykdomsinduserende T-celler, en kostbar og arbeidskrevende prosess. Videre vil MHC ikke-identitet blant individer i en så utavlet populasjon som mennesket utgjør gjøre dette til en meget individualisert terapeutisk strategi. Regulatoriske kloner må utledes for hver enkelt pasient og så tilbakeføres kun til denne pasient for å unngå mulige transplantat-mot-vert-reaksjoner.

Direkte vaksinasjon med svekkede sykdomsinduserende T-cellekloner har også blitt benyttet som en terapi for EAE. MBP-spesifikke T-celler i stand til å overføre sykdommen har blitt svekket ved gamma-bestråling eller kjemisk fiksering og nyttet til vaksinasjon av tidligere ikke-eksponerte rotter. I noen tilfelle viste vaksinerte dyr motstandskraft mot påføl-gende forsøk på induksjon av EAE (Lider et al., supra: se Cohen og Weiner, Immunol. Today 9:332-335 (1988) for over-sikt. Virkningen av slik vaksinasjon er imidlertid uforutsig-bar og beskyttelsesgraden svært variabel. T-celler inneholder et stort antall forskjellige antigener som induserer immunrespons når hele T-celler benyttes som vaksine. Dette fenomen

har blitt demonstrert av Offner et al. (J. Neuroimmunol.,

21:13-22 (1989)), som viste at immunisering med hele T-celler økte den forsinkede hypersensitivitet ("delayed type hyper-sensitivity") (DTH)-responsen, målt ved oppsvulming av øret, mot T-cellene trinnvis ettersom antall vaksinasjoner økte. Positive DTH-responser ble imidlertid observert både i beskyttede og ikke-beskyttede dyr. Rottene reagerte på lignende måte på vaksinasjon både med encefalitt-induserende T-celler og kontroll-T-celler. Tilsvarende induserte vaksinasjon med PPD-spesifikke T-celler fra en PPD-spesifikk T-cellelinje DTH mot cellene i vaksinen så vel som mot en encefalittinduser-ende klon, selv om ingen beskyttelse ble observert. Likheten i respons av vaksinerte rotter mot både sykdomsinduserende celler og kontrollceller, målt ved forsinket hypersensitivitet (et mål på celle-mediert immunitet) indikerer at en rekke antigener på disse T-celler induserer immunresponser. Vaksinasjon med svekkede, sykdomsfremkallende T-celler lider således både av mangel på spesifisitet for det beskyttende antigen på overflaten av T-cellen så vel som av variabel induksjon av immunitet mot antigenet. Vaksinasjon med svekkede T-celler er som kandidat for behandling av sykdommer hos mennesket hjemsøkt av å være like arbeidskrevende og med et like stort behov for individuell behandling som beskrevet ovenfor for infusjon av CD8+-celler.

Foreliggende oppfinnelse skaffer til veie en effektiv fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine for immunoterapi av T-cellemedierte sykdommer, inklusive autoimmune sykdommer, som unngår mange av de problemer forbundet med tidligere foreslåtte behand-lingsmetoder. Det å vaksinere, snarere enn passivt å tilføre heterologe antistoffer, mobiliserer vertens eget immunsystem for under-trykking av "selv"-angripende T-celler. Under-trykkelsen er således vedvarende, og alle immunologiske mekanismer kan delta i undertrykkelsen. En slik mangesidig respons er mer effektiv enn en éndimensjonal undertrykkelse oppnådd ved passiv tilførsel av monoklonale antistoffer eller eksisterende regulatoriske T-cellekloner.

Når det gjelder autoimmune sykdommer omfatter vaksinene i foreliggende oppfinnelse TCR fra T-celler som forårsaker autoimmune sykdommer. Vaksinene kan være hele TCR-molekyler i det vesentlige renset fra T-cellekloner, enkelte T-cellereseptor-kjeder (f.eks. alfa, beta osv.) eller deler av slike kjeder, enten alene eller i kombinasjon. Vaksinen kan være homogen, f.eks. ett enkelt peptid, eller sammensatt av mer enn én type peptid, hvert tilsvarende en forskjellig del av TCR. Videre kan disse peptider være fra forskjellige TCR-molekyler hvor begge TCR-utgavene bidrar til den T-celle-medierte sykdom.

I én spesiell utførelse når det gjelder multippel sklerose kan det immuniserende peptid ha aminosyresekvensen SGDQGGNE. Enhver immunogen del av dette peptid kan være effektiv. Aminosyreutbytninger kan således foretas uten at peptidets immunogenisitet ødelegges. Videre kan peptidet bindes til en bærer for å øke dets immunogenisitet.

I ytterligere en spesiell utførelse kan T-cellereseptorer eller fragmenter av TCR som inneholder V(3l7 benyttes til immunisering av individer med reumatoid artritt for behandling eller forebyggelse av sykdommen. Immunresponsen som fremkalles i individet kan nøytralisere eller drepe T-celler med V(3l7 og således forebygge eller behandle de skadelige virkninger av vpi7-bærende T-celler. Videre kan slike vaksiner, i den grad vpi7 er felles for T-reseptorer på patogene T-celler som forårsaker autoimmune sykdommer i sin alminnelighet, være effektive i å lette forløpet av slike andre autoimmune sykdommer.

Med "i det vesentlige ren" menes at TCR i det vesentlige er fri for andre biokjemiske stoffer med hvilke det vanligvis er assosiert i naturen. Alternativt omfatter vaksinene peptider med varierende lengder som tilsvarer TCR eller deler av denne. Peptidene kan fremstilles syntetisk eller ved rekombinante metoder velkjent av fagfolk. For-trinnsvis tilsvarer peptidvaksinene deler av TCR som skiller en gitt TCR fra andre ikke-patogene TCR-molekyler. Slike spesifikke regioner kan ligge innenfor de forskjellige regioner i de respektive TCR-polypeptidkjeder, særlig i en kort sekvens som omfatter V(D)J-koblingen, slik at den immune respons begrenses til å omfatte T-celler som bærer denne enkelte determinant.

Vaksinene tilføres verter som viser eller står i fare for å vise en autoimmun respons. Endelig klinisk diagnose av en gitt autoimmun sykdom berettiger tilførsel av de relevante sykdomsspesifikke TCR-vaksiner. Forebyggende tilførsel er berettiget i sykdommer hvor de autoimmune mekanismer går forut for den åpenbare kliniske sykdom (f.eks. type I diabetes). Således kan individer hvor sykdommen forekommer i familien gis en forebyggende behandling når pålitelige prognostiske indikatorer tilsier det, slik at autoimmune mekanismer kan avskjæres før de begynner.

TCR-vaksiner kan tilføres i en rekke forskjellige formuleringer i farmakologisk tilfredsstillende medier. For korte peptiders vedkommende kan peptidet konjugeres til en bærer som KLH for å øke dets immunogenisitet. Vaksinen kan tilføres sammen med en adjuvans, hvorav en rekke er kjent for fagfolk. Etter forutgående immunisering med vaksinen kan en "booster" tilføres. Vaksinene tilføres ved konvensjonelle metoder og i doser som er tilstrekkelige til å forårsake en immunologisk respons, lette å avgjøre for fagfolk.

Peptider som passer for bruk i immunisering kan be-stemmes som følger. Sykdomsfremkallende T-cellekloner som reagerer med målantigenene isoleres fra påvirkede individer. Slike T-celler oppnås lettest fra steder hvor den aktive "selv"-angripende aktivitet er stor, som lesjonen i tilfellet pemphigus vulgaris, sentralnervesystemet (CNS) i tilfellet multippel sklerose eller leddvæske eller -vev i tilfellet reumatoid artritt, eller alternativt fra blod fra påvirkede individer. TCR-genene fra disse "selv"-angripende T-celler sekvenseres så. Polypeptider som tilsvarer disse TCR eller deler av disse som er selektivt til stede i sykdomsinduserende T-celler (sammenlignet med ikke-patogene T-celler) kan så velges som vaksiner og fremstilles og benyttes som beskrevet over.

Alternativt kan vaksinene omfatte anti-idiotypiske antistoffer som er indre "bilder" av peptidene beskrevet over. Fremgangsmåter for fremstilling, utvelgelse og tilførsel av slike anti-idiotypiske vaksiner er velkjent for fagfolk, se f.eks. Eichmann et al., CRC Critical Reviews in Immunology 7:193-227 (1987).

T- cellesvkdommer med ondartet årsak

Ovenfor har autoimmune sykdommer blitt benyttet for å illustrere anvendelsen av TCR-vaksinasjon. T-cellelymfomer er en annen T-cellesykdom som kan være mottakelig for denne type behandling. Bruk av disse teknikker i behandling av T-lymfomer vil utføres på praktisk talt identisk måte. I ett henseende vil imidlertid denne teknologi lettere kunne nyttes på proliferative sykdommer hos T-celler, siden isolering av de patogene T-celler lettere kan oppnås. Når klonene først er isolert kan teknikkene benyttes som beskrevet her. T-lym-fomenes TCR-gener sekvenseres, passende områder i disse TCR identifiseres og benyttes som vaksiner. Vaksinene kan omfatte enkelte eller flere peptider og kan tilføres i farmakologisk tilfredsstillende formuleringer med eller uten adjuvanser på konvensjonelt vis.

Multippel sklerose

T-celler som forårsaker multippel sklerose (MS) har ikke tidligere blitt identifisert, selv om MBP-reaktive T-celler har blitt foreslått å spille en rolle på grunn av de kliniske og histologiske likheter mellom MS og EAE. MBP-reaktive, encefalogene T-celler viser en slående bevaring av aminosyresekvensen i P-kjedens VDJ-region i EAE-modeller i rotte og mus, tross i kjente forskjeller i MHC-restriksjon og MBP-peptidets antigene spesifisitet. Foreliggende oppfinnelse er basert på observasjonen at en human "myelin basic protein"

(MBP) reaktiv T-cellelinje skaffet til veie fra en MS-pasient har en TCR p-kjede med en VDJ aminosyresekvens homolog til

den i P-kjeder fra MBP-reaktive T-celler som forårsaker sykdom i eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE), en dyremodell for MS. Denne cellelinje er spesifikk for en annen epitop i MBP. Dette funn viser at MBP-reaktive T-celler er involvert i patogenesen av MS og viser at TCR-peptider som

ligner på de her beskrevet for forebyggelse av EAE kan være anvendelige for behandling av MS.

Reumatoid artritt

Reumatoid artritt (RA) er en T-cellemediert autoimmun sykdom. Foreliggende oppfinnelse beskriver oligoklonale infiltrater av aktiverte vpi7 T-celler i leddvæske fra pasienter med reumatoid artritt. Forekomsten av disse T-celler i skadet vev fra alle undersøkte pasienter, deres oligoklonalitet og den cytotoksiske aktivitet av en slik T-celle mot synoviale adherente celler viser en sentral rolle for vpi7-bærende T-celler i sykdomsforløpet av RA.

Aktiverte T-cellepopulasjoner i synovialt vev fra RA-pasienter har blitt undersøkt ved analyse av T-cellereseptor (TCR) mRNA isolert fra IL-2-reseptor-positive (IL-2R+) synoviale T-celler. TCR-mRNA ble amplifisert ved bruk av en polymerasekjedereaksjon (PCR)-protokoll formulert for amplifisering av humane TCR p-kjedegener inneholdende nær sagt hvilket som helst vp-genelement. I denne analyse ble oligoklonale vpi7-rearrangementer funnet å være anriket i IL2-R+-populasjonen; dette tyder på at vpi7 T-celler sann-synligvis er innblandet i patogenesen av RA. Cytotoksisiteten in vitro mot synoviale adherente celler av en CD4+, vpi7-bærende T-celleklon isolert fra en synovial vevsprøve under-støtter antagelsen om en direkte deltakelse av vpi7 T-celler i RA.

Som allerede nevnt er den svært viktige oppdagelse gjort at en spesifikk variabel region i P-kjeden i TCR kalt vpi7 er nært forbundet med reumatoid artritt hos mennesker. Denne oppdagelse tillater deteksjon, forebyggelse og behandling av reumatoid artritt ved benyttelse av de metoder som er beskrevet her. Terapeutiske tilnærminger som tilsvarer de som er beskrevet ovenfor for EAE kan benyttes mot reumatoid artritt av fagfolk.

Det er også oppdaget at en spesifikk TCR-sekvens, SGDQGGNE, er nøye forbundet med multippel sklerose hos mennesker. Denne oppdagelse tillater deteksjon, forebyggelse og behandling av multippel sklerose ved bruk av de metoder som er beskrevet her. Terapeutiske tilnærminger som tilsvarer de som her er beskrevet for EAE kan benyttes mot multippel sklerose av fagfolk.

De følgende eksempler er ment å illustrere men ikke å begrense oppfinnelsen.

Eksempel I

En rottemodell for EAE

Lewis rottehunner (Charles River Laboratories, Raleigh-Durham, NC) ble immunisert i fotsålen på hver bakfot med 50 (ig "myelin basic protein" fra marsvin emulgert i kom-plett Freund's adjuvans". De første sykdomstegn ble typisk observert 9-11 dager etter immunisering. Sykdommens strenghet bedømmes på en 3-punkts skala som følger: 1 = slapp hale; 2 = svakhet i bakben; 3 = paralyse i bakben. Etter et sykdomsfor-løp på tilnærmet 4-6 dager kom de fleste rottene seg spontant og var motstandsdyktige mot påfølgende induksjon av EAE.

Eksempel II

Seleksjon og fremstilling av vaksiner

Vaksinasjoner ble utført med et peptid fra T-cellereseptor hvis sekvens var utledet fra DNA-sekvensen til et gen for betakjeden i T-cellereseptoren som dominerte blant EAE-induserende T-celler i BIO.PL/L-mus. DNA-sekvensen var den beskrevet av Urban et al., supra, som inkorporeres heri ved referanse. Et peptid på 9 aminosyrer med sekvensen i VDJ-koblingen fra TCR-beta-kjeden i disse mus ble syntetisert ved metoder kjent av fagfolk. Sekvensen av dette peptid er: SGDAGGGYE. (Aminosyrer representeres ved den vanlige benyttede én-bokstavkoden.) Den tilsvarende sekvens i rotter ble vist å være: SSD-SSNTE (Burns et al., J. Exp. Med. 169:27-39 (1989)). Peptidet ble avsaltet ved Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) søylekromatografi i 0,1 M eddiksyre, hvoretter løsemidlet ble fjernet ved to omganger med frysetørking. En del av peptidet ble koblet til hemocyanin fra albuskjell ("keyhole limpet hemocyanin", KLH) med glutaraldehyd, med et forhold på 7,5 mg peptid pr. mg

KLH. Det resulterende konjugat ble dialysert mot fosfatbufret saltvann

(PBS).

Eksempel III

Vaksinasjon mot EAE

Vaksiner benyttet i disse undersøkelser bestod av fritt VDJ-peptid og av VDJ-peptid koblet til KLH. Disse ble løst i PBS og emulgert med like volumer av enten (1) "incom-plete Freund's adjuvans" (IFA) eller (2) "complete Freund's adjuvans" (CFA) fremstilt ved å suspendere 10 mg/ml varme-drept, tørket MycoJbacterium tuberculosis H37ra (Difco Laboratories, Detroit, MI) i IFA. Emulsjoner ble tilført 8-12 uker gamle Lewis rottehunner i et endelig volum på 100 ul pr. dyr (50 ul i fotsålen på hvert bakben). 5 ug ikke-konjugert VDJ-peptid ble tilført hver rotte. KLH-VDJ-konjugat ble tilført i en mengde som tilsvarer 10 ug KLH pr. rotte. Etter 2 9 dager ble hver rotte utsatt for 50 jag "myelin basic protein" fra marsvin i "complete Freund's adjuvans" i fotsålene på forbena. Etter 9 dager ble dyrene undersøkt daglig med hensyn til kliniske tegn på EAE, og ble bedømt som beskrevet over. Resultatene er vist i tabell I. Av disse fremgår ikke bare at vaksinerte individer viste redusert forekomst av sykdommen, men også at sykdommens strenghet ble redusert og/eller dens start forsinket i de dyr som ble syke. Graden av beskyttelse varierte med vaksinens sammensetning ved at de som omfattet CFA som adjuvans viste den største grad av beskyttelse.

Eksempel IV

Vaksinasjon mot EAE med VDJ- peptider fra Lewis- rotter

VDJ-peptidet benyttet i de foregående eksempler ble syntetisert i samsvar med sekvensen av TCR P~kjedemolekyler funnet i EAE-induserende T-celler i BlO.PL-mus. I tillegg ble peptider som tilsvarer sekvenser funnet i encefalitt-induserende T-celler i Lewis-rotter syntetisert og testet. Disse VDJ-sekvenser er homologe med de i BlO.PL-mus, men ikke iden-tiske med dem. Rottepeptidene ble syntetisert i samsvar med DNA-sekvensene beskrevet av Burns et al. og Chluba et al., Eur. J. Immunol. 19:279-284 (1989)). Sekvensene til disse tre peptider kalt IRI, 2 og 3 er vist under, opplinjet med sekvensen fra BlO.PL-mus benyttet i eksempel I-III (VDJ).

Fremstilling, tilførsel og evaluering av disse vaksiner ble utført som beskrevet i eksempel I-III med føl-gende unntak: 50 ug av de enkelte VDJ-peptider ble inkorporert i vaksine-formuleringer med CFA; vaksinasjon i IFA og vaksinasjon med peptider konjugert med KLH ble ikke utført. Kontrolldyr var ubehandlet forut for behandling med MBP som i eksempel III, eller de ble vaksinert med emulsjoner av PBS og CFA for å vurdere den beskyttende effekt av adjuvansen alene. Resultatene er vist i tabell II under.

Bedømmelse: - ingen tegn

1) slapp hale

2) svakhet i bakben

3) paralyse i bakben

Som vist i tabell II kunne sykdom i ikke-vaksinerte kontrolldyr observeres så tidlig som dag 10. Sykdommen som var karakterisert ved alvorlig paralyse og vektreduksjon varte i 4-6 dager og gikk så spontant over. Rotter vaksinert med PBS-CFA viste sykdomsforløp som praktisk talt ikke var til å skille fra de i ikke-vaksinerte kontroller. I mot-setning til dette ble en forsinkelse av sykdomsstart observert i noen dyr vaksinert med IRI, 2 eller 3, andre viste både forsinket sykdomsstart og redusert strenghet og/eller varighet av sykdommen. Totalt vurdert var imidlertid vaksinasjoner med VDJ-peptider fra rotte (IR1-3) noe mindre effektive enn vaksinasjoner med VDJ-peptid fra mus (eksempel III). Vaksinasjon med IR9b gav imidlertid fullstendig beskyttelse i alle fire dyr som ble behandlet. Det er av viktighet at ingen histologiske lesjoner karakteristiske for sykdommen ble påvist i noen av de fire dyr vaksinert med IR9b, dette antyder at også subkliniske sykdomstegn ble forhindret.

Eksempel V

Vaksinasjon med V- regionspesifikke peptider

Et peptid spesifikt for vp8-genfamilien ble utprøvd som vaksine mot EAE. vps er den vanligst forekommende p-kjede-genfamilien benyttet av encefalitt-induserende T-celler i både rotte og mus. Et peptid ble syntetisert basert på en unik DNA-sekvens funnet i vp8-genet og som ikke er påvist i noen andre Vp-gener fra rotte hvis sekvenser ble beskrevet av Morris et al., Immunogenetics 27:174-179 (1988). Sekvensen av dette vp8-peptid kalt IR7 er:

Effektiviteten av dette Vp8-peptid ble utprøvd i Lewis-rottemodellen for EAE (eksempel I) som beskrevet i eksempel II og III. 50 ug peptid ble utprøvd i CFA. Vaksinasjon i IFA eller med peptid-KLH-konjugater ble ikke utført. Resultatene av disse undersøkelser er vist i tabell III.

Bedømmelse: - ingen tegn

1) slapp hale

2) svakhet i bakben

3) paralyse i bakben

Resultatene av vaksinasjoner utført med V08-peptidet fra rotte tilsvarer de observert med IRI, 2 og 3-peptider fra mus og rotte. Forsinket sykdomsstart så vel som redusert strenghet og varighet av sykdommen ble observert i ett dyr. Ett dyr var fullstendig beskyttet.

Eksempel VI

Vaksinasjon med J- regionpeptider

Et peptid som tilsvarer Ja-gensegmentet TA3 9, påvist i encefalitt-induserende T-cellereseptorer både hos rotte og mus, ble syntetisert. Sekvensen av dette peptid kalt IR5 er:

Effektiviteten av JaTa39-peptidet ble utprøvd i Lewis-rottemodellen for EAE (eksempel I) som beskrevet i eksempel II og III. 50 ug peptid ble utprøvd i CFA. Vaksinasjoner i IFA eller med peptid-KLH-konjugater ble ikke utført. Resultatene av disse undersøkelser er vist i tabell IV.

Bedømmelse: - ingen tegn

1) slapp hale

2) svakhet i bakben

3) paralyse i bakben

Resultatene viser at vaksinasjoner utført med JaTA39-peptidet fra rotte er mer effektive enn de utført med VDJ-peptidet eller VØS-peptidet fra mus. To av tre dyr var fullstendig beskyttet, i det tredje var sykdomsstart tydelig forsinket. Sykdommens strenghet var også redusert i dette dyr selv om sykdommen varte i de normale 5 dager. Det er viktig at de to fullstendig beskyttede dyr ikke viste noen histologiske tegn på infiltrasjon av T-celler i CNS. Dette resultat antyder at vaksinasjon med JaTA3 9 gir en svært effektiv regulatorisk respons rettet mot encefalittinduser-ende T-celler. Selv subkliniske sykdomstegn ble forhindret.

Eksempel VII

Vaksinasjon med blandinger av TCR- peptider

Vaksinasjoner ble utført med en blanding av TCR-peptider. Denne blanding inneholdt 50 ug av hvert av peptidene IRI, 2, 3 og 5 (de tre VDJ-peptider fra rotte og JaTA39-peptidet fra rotte).

Effektiviteten av denne peptidblanding ble utprøvd i Lewis-rottemodellen (eksempel I) som beskrevet i eksempel II og III. Peptidene ble utprøvd i CFA. Vaksinasjoner i IFA eller med peptid-KLH-konjugater ble ikke utført. Resultatene av disse undersøkelser er vist i tabell V.

Bedømmelse: - ingen tegn 1) slapp hale 2) svakhet i bakben 3) paralyse i bakben

Resultatene viser at vaksinasjoner utført med JaTA-39-peptid og tre VDJ-peptider fra rotte er nesten like effektive som de beskrevet for IR9b i tabell II. Alle tre dyr var fullstendig beskyttet. I tillegg til manglende kliniske tegn på EAE var to av disse tre dyr fullstendig fri for histologiske tegn på infiltrasjon av T-celler i CNS, mens det tredje viste bare to små foci med lymfocytisk infiltrasjon i roten av ryggmargen.

Eksempel VIII

Vaksine mot multippel sklerose

Humane MBP- reaktive T- celler

MBP-reaktive T-cellelinjer ble etablert fra mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) fra ni kroniske progressive MS-pasienter og to friske kontrollindivider. Cellene ble holdt i kultur ved regelmessig stimulering med renset humant MBP og bestrålte autologe PBMC i 3 dager, fulgt av 4 dager i medium inneholdende IL-2.

PCR- amplifisering av gener for TCR B- kjede fra MBP- reaktive T- cellelinj er

T-celler ble høstet fra kulturer i logfase, og RNA fremstilt og amplifisert med Vpl6mer-primeren og sett av CØ-primere i 55 sykler som beskrevet i eksempel IX.

TCR B- kjedesekvenser fra humane MBP- reaktive T- celler

vpi6mer-amplifiserte TCR p-kjedegener fra humane MBP-reaktive T-cellelinjer ble sekvensert ved hjelp av Cpseq-primeren. Amplifikasjonsprodukter ble renset på gel, denaturert med alkali og sekvensert fra cpseq-primeren. Lesbar DNA-sekvens ble oppnådd fra fem av disse cellelinjer, noe som antyder at dominerende T-cellekloner hadde blitt selektert ved in vitro-passering over lengre tid. Én av disse sekvenser, fra Re-cellelinjen (tabell VI) hadde en p-kjede VDJ-aminosyresekvens hvor fem av de seks første og seks av totalt ni rester var felles med p-kjede VDJ-aminosyresekvensen bevart blant MBP-reaktive, encefalitt-induserende T-celler i B10.PL-musemodellen for EAE. Denne sekvens var ikke til stede blant

de dominerende TCR-rearrangementer funnet i de gjenværende fire humane MBP-reaktive T-cellelinjer.

For å fastslå hvorvidt lignende sekvenser var til stede i P~kjederepertoaret i MBP-reaktive T-cellelinjer fra andre MS-pasienter ble TCR-amplifisering utført med en degenerert (n = 1024) 21 nukleotider lang primer (vpRe) som tilsvarer 7 aminosyrer fra denne sekvens (tabell VI). RNA ble revers-transskribert og amplifisert i 20 sykler med trinn I-reaksjoner med vpi6mer- og Cpext-primerne. 1 ul uttak av disse trinn I-reaksjoner ble reamplifisert i 35 sykler med vpRe- og cpint-primerne. 1 ul av disse reaksjoner ble ana-lysert ved Southern-blot hybridisering med en <32>P-merket human cp-probe. Denne analyse viste et 3 00 basepars amplifisert produkt i Re-cellelinjen og i cellelinjen fra en av de andre MS-pasientene, men ikke i MBP-reaktive T-celler fra kontrollindivider eller i ikke-MBP-reaktive humane T-cellelinjer og -kloner. Nærvær av denne sekvens i to av de ni MS-pasient-linjer som ble testet er overbevisende. Siden man vet at denne sekvens er konservert blant encefalitt-induserende T-celler i EAE, viser dens tilstedeværelse i MBP-reaktive T-celler fra MS-pasienter en rolle for T-celler med denne determinant i patogenesen av MS.

Immunogene peptider med sekvensen SGDQGGNE kan syntetiseres som vist i eksempel II og nyttes til immunisering av mennesker ved metoder beskrevet i eksempel III. Slike immuniseringer kan resultere i effektive immunresponser .

Eksempel IX

Isolering av oligoklonale infiltrater av aktiverte vpi7 T-celler fra leddvæske fra pasienter med reumatoid artritt

T- cellepreparater fra leddvæske

Synoviale vevsprøver ble skaffet til veie fra radio-grafisk bekreftede pasienter med reumatoid artritt som under-gikk ledd-erstatningsterapi. Aktiverte T-celler ble selektert ved hjelp av magnetiske kuler og antistoffer som reagerer med human IL2-R (aIL2-R) som følger. Synovialt vev ble oppsluttet i 4 timer ved 37 °C i RPMI + 10 % føtalt bovint serum (FBS) med 4 mg/ml kollagenase (Worthington Biochemical, Freehold, NJ) og 0,15 mg/ml DNAse (Sigma, St. Louis, MO.). De oppslut-tede prøver ble passert gjennom et 80-mesh nett og enkelt-celler oppsamlet ved Ficoll tetthetsgradient-sentrifugering. Celler i interfasen ble vasket og inkubert (IO<6> celler/ml) i 3 0 min ved 0 °C med 5 ug/ml kontrollmus IgG (Coulter Immunology, Hialeah, FL) i PBS med 2 % FBS (PBS-FBS). Cellene ble vasket tre ganger og inkubert i 3 0 min ved 0 °C med magnetiske kuler konjugert til anti-mus IgG fra geit (Advanced Magnetics, Cambridge, MA). Kulene ble magnetisk separert og vasket tre ganger med PBS-FBS. Denne forseleksjon med muse-IgG (mlgG) og magnetiske kuler ble benyttet for å kontrollere ikke-spesifikk absorpsjon av T-celler. Celler som forble i den opprinnelige suspensjon ble inkubert videre i 30 min ved 0 °C med 5 ug/ml monoklonalt muse-IgG som reagerer med humant T-celle IL2-R (Coulter Immunology, Hialeah, FL). Celler ble vasket og selektert med magnetiske kuler som over. Kuler fra preadsorpsjon med IgG og seleksjon med IL2-R-antistoff ble umiddelbart resuspendert i surgjort-guanidin-fenol-kloroform og RNA preparert som beskrevet i Chonezynski og Sacchi, Anal. Biochem. 162:156 (1987), som inkorporeres heri ved referanse. Siden RNA ble preparert uten in vitro-dyrking av cellene og den mulige skjevhet som kan følge av dette, antas de å nøyaktig reflektere T-celledistribusjonen i synovialt vev tiden for kirurgisk fjerning. Bare halvparten av mlgG- og aIL2-R-kulene fra pasient 1012 ble prosessert umiddelbart for RNA. Resten ble dyrket i 5 dager i RPMI 164 0, 5 % FBS, 20 % HL-1 (Ventrex Laboratories Inc., Portland, ME), 25 mM HEPES, glutamin, antibiotika og 20 % LAK-supernatant (Allegretta et al., Science, 247:718 (1990)), som inkorporeres heri ved referanse, som kilde for IL-2. RNA ble ekstrahert fra kulturene fra aIL2-R-kulene (1012IL2.d5), men ikke fra 1012mIgG-prøven da ingen levedyktige celler var til stede etter 5 dagers dyrking.

En T-celleklon ble utvunnet fra Ficoll-bunnfallet fra pasient 1008. Cellene i bunnfallet ble dyrket (2 x IO<6 >celler/ml) i medium uten IL-2 i 2 uker. Ikke-adherente celler fra denne kultur ble klonet ved begrensende fortynning på overflatekulturer av autologe synovial-celler. En CD4+-T-celleklon 1008.8 ble oppnådd og tilpasset dyrkning ved regelmessig stimulering med autologe synoviale overflatekulturer i 3 dager i medium uten IL-2 fulgt av 4 dagers dyrkning i medium med LAK-supernatant.

Lysering av synoviale adherente celler med 1008. 8

Lysering av synoviale adherente celler med 1008.8 ble vist som følger. Overflatekulturer av synoviale celler ble merket med <35>S som beskrevet i Stedman og Campbell, J. Immunol. Meth. 119:291 (1989), som inkorporeres heri ved referanse, for bruk som mål i CTL-prøver. Cellene ble tryp-sinert, vasket og utsådd med 2000 celler pr. brønn i en 96-brønners mikrotiterplate med runde bunner. Etter dyrking i 3 dager med synoviale adherente celler og medium med LAK-supernatant forut for prøven ble 1008.8-celler tilsatt målcellene ved de angitte forhold mellom effektorceller og målceller. Kulturene ble inkubert over natten ved 3 7 °C, sentrifugert ved 3 00 x g i 2 min og radioaktiviteten i 50 ul supernatant bestemt. Spesifikk lysering i prosent relativt til målceller lysert med detergent ble bestemt i henhold til standard-formler. Denne klon er cytotoksisk for synoviale adherente cellemål i CTL-prøver (tabell VII).

PCR- amplifisering av TCR P- kjedegener

TCR P-kjedegener ble amplifisert med en rekke kombi-nasjoner av primerne vist i tabell VIII. vpi6mer-primeren er en degenerert vp-primer (n = 256) som er beregnet å bindes til 85 % av humane TCR P-kjedegener ved alle 16 rester og 95 % ved 15 rester. Denne primeren har blitt benyttet til amplifisering av TCR p-kjeder fra mer enn 25 forskjellige humane T-cellekloner, -linjer eller primære vevspreparater. Et spektrum av vp-gener har blitt sekvensert fra disse amplifiserte DNA, noe som taler mot at primeren foretrekker visse vp-familier. PCR-amplifisering med vpi6mer-primeren kan således lette analyse av T-cellepopulasjoner for hvilke a priori-kjennskap til vp-genbruken ikke er tilgjengelig.

T-cellereseptor p-kjedegener ble amplifisert i to-trinns amplifiseringsreaksjoner med sett av to og to primere som vist i tabell VIII. RNA ble revers-transskribert i 1 time ved 42 °C med 40 pmol cpext-primer i 12 ul reaksjoner med betingelser som beskrevet av Hart et al., The Lancet, s. 596

(1988), som inkorporeres heri ved referanse. Reaksjonene ble fortynnet med en blanding bestående av 4 0 pmol vpi6mer-primer, nukleotider og reaksjonsbuffer som over, men uten MgCl2, for å gi en endelig Mg<2+->konsentrasjon på 3,6 mM. Prøvene ble denaturert i 15 min ved 95 °C, 1 enhet varmestabil rekombinant DNA-polymerase (Cetus Corporation, Emeryville, CA, "Amplitaq") tilsatt og 20 sykler PCR utført. Hver syklus bestod av en 1 minutters denaturering ved 95 °C, et 2 minutters annealingtrinn, og en 2 minutters forlengelse ved 72 °C. For de første to sykler ble annealingen utført ved henholds-vis 3 7 °C og 4 5 °C, for de gjenværende sykler ved 50 °C. 1 ul uttak av disse trinn I-reaksjoner ble tilsatt 100 ul trinn II-amplifiseringsreaksjoner (Cetus,>"Gene-Amp Kit") med 100 pmol cpint-primer og 100 pmol av VP8-, vpi7 eller 5'cp-primere eller 700 pmol ved vpi6mer-primer. Trinn II-amplifiseringene ble utført som over med en annealing-temperatur på 50 °C, uten variasjonene i annealing-temperatur som beskrevet over.

RNA-prøver fra 1012IL2.d5- og 1008.8-kulturer ble amplifisert med V|3l6mer- og cpext-primere i trinn I-reaksjoner og med vpi6mer- og Cpint-primere i 3 5 syklers trinn II-reaksjoner. Reaksjonsproduktene ble renset fra lavt-smeltende agarosegelskiver med "Gene Clean" glasskuler (BiolOl, San Diego, CA), alkalidenaturert og sekvensert fra en cpseq-primer med T7 polymerase (Sequenase, United States Biochem, Cleveland, OH). En dominerende vp-sekvens som tilsvarer ett enkelt Vpl7-rearrangement (tabell IX) kunne tydelig leses i 1012.IL2-d5-prøven. Andre mindre hyppige rearrangementer kunne påvises som svake ikke lesbare bak-grunnsbånd i sekvenseringsgelene. Dyrking av disse 1012.IL2-kuler i IL2-holdig medium uten tilsatte hjelperceller eller antigen ventes ikke å indusere de novo-aktivering av T-celler. Følgelig reflekterer dominansen av ett enkelt V6l7-rearrangement i denne prøve klonal ekspansjon in vivo av vpi7+-T-celler i denne pasient. DNA-sekvensbestemmelse for TCR p-kjede-DNA amplifisert fra den cytotoksiske T-celleklon 1008.8 viste også et vpi7-rearrangement (tabell IX). Forekomsten av vpi7-rearrangementer i disse to forskjellige typer av synoviale T-celleprøver fra to uavhengige RA-pasienter imp-liserer vpi7-bærende T-celler i patogenesen av RA.

Forekomsten av Vpl7-rearrangementer i de gjenværende synoviale RNA-prøver ble anslått ved PCR-amplifisering med den V017-spesifikke primer (tabell VIII). vpi7 TCR-DNA ble amplifisert fra prøver på magnetiske kuler utledet fra hver av de 7 RA-pasientene. Farging av reaksjonsprodukter etter elektroforese med etidiumbromid viste større grad av V017-amplifisering i fire av aIL2-R-prøvene enn i de tilsvarende mlgG-kontroller. Denne anrikning var ikke et resultat av isoleringsmetoden, da amplifisering av vps TCR ikke viste forskjeller mellom mlgG- og IL2-R-prøver.

vpi7-rearrangementer fra to av aIL2-R-RNA-prøvene ble amplifisert med Vpl7- og cpint-primerparet og

reaksjonsproduktene sekvensert med cpseq-primeren. Prøve 1014 og 1015 inneholdt enkeltsekvenser (tabell IX) som i likhet med 1012IL2.d5-prøven viser klonal ekspansjon av VB17-T-celler in vivo. Direkte sekvensering av rearrangementene amplifisert med den Vp8-spesifikke primer var derimot ikke mulig på grunn av vesentlig heterogenitet i P-kjedeproduktet.

HLA- DR- analyse i pasienter med reumatoid artritt

HLA-DR-analyse i pasienter med reumatoid artritt ble utført som følger. DNA fra hver pasient ble fremstilt ved å koke IO<5> synoviale celler i 200 ul dH20. 10 (al ble amplifisert i 35 sykler i en 100 (il reaksjon (Cetus, "Gene Amp Kit") med 100 pmol av hver av DRP-PCR-primerne (tabell X) . 1/10 (al av disse reaksjoner ble reamplifisert i 10 (il inneholdende bare DRp2-primeren og 17 pmol a32P-dCTP som eneste dCTP-kilde i

10 sykler. Reaksjoner ble tilsatt 200 uM dCTP og inkubert videre i 2 sykler. De resulterende negativ trådprober ble hybridisert til slot-blots med 10 pmol HLA-DR-allelspesi-fikke oligoer (positive tråder) under betingelser som tidligere beskrevet av Amor et al., J. Immunol. 138:1947

(1987), som inkorporeres heri ved referanse. Slot-blotene ble vasket to ganger i 20 min med tetrametylammoniumklorid (Wood et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:1585 (1985)), som inkorporeres heri ved referanse, ved 65-68 °C og fremkalt med røntgenfilmer.

Hver av pasientene i denne undersøkelse hadde minst ett allel av HLA-DR-genene DR4w4, DR1, DR4wl4 eller DR4wl5 som man vet gir tilbøyelighet til RA (tabell X).

T-cellereseptorer inneholdende vpi7 eller fragmenter av denne som er immunogene eller kan gjøres immunogene kan nyttes til immunisering av mennesker ved metodene beskrevet i eksempel VII. Slik immunisering kan resultere i en effektiv immunrespons.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine omfattende et peptid som har en aminosyresekvens med et ikke-konstant område fra en T-cellereseptor med begrenset heterogenitet som er til stede på T-celler som medierer en patologisk tilstand, hvori peptidet induserer en immunrespons mot T-cellene som forebygger eller reduserer alvorligheten av den patologiske tilstand, karakterisert ved at den har følgende trinn:

a. utvelgelse av T-celler som medierer nevnte patologiske tilstand, hvori T-cellene har begrenset T-cellereseptorheterogenitet; b. bestemmelse av aminosyresekvensen til T-cellereseptorene med begrenset heterogenitet fra nevnte T-celler ,- c. utvelgelse av en aminosyresekvens med et ikke-konstant område som er karakteristisk for nevnte T-cellereseptorer med begrenset heterogenitet som stimulerer en flerfasettert immunrespons mot nevnte T-celler; og d. fremstilling av et peptid som omfatter nevnte utvalgte aminosyresekvenser med ikke-konstant område, for med dette å fremstille vaksinen.