JP2022031906A - 治療用細胞の活性化及び排除のための二重コントロール - Google Patents
治療用細胞の活性化及び排除のための二重コントロール Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022031906A JP2022031906A JP2021200645A JP2021200645A JP2022031906A JP 2022031906 A JP2022031906 A JP 2022031906A JP 2021200645 A JP2021200645 A JP 2021200645A JP 2021200645 A JP2021200645 A JP 2021200645A JP 2022031906 A JP2022031906 A JP 2022031906A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- item
- cells
- cell
- chimeric
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title abstract description 29
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 title abstract description 11
- 230000008030 elimination Effects 0.000 title abstract description 9
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 title abstract description 9
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 title abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 626
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract description 280
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 242
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 abstract description 67
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 45
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 abstract description 38
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 abstract description 38
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 32
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 28
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 716
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 713
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 711
- 108010027179 Tacrolimus Binding Proteins Proteins 0.000 description 218
- 102000018679 Tacrolimus Binding Proteins Human genes 0.000 description 218
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 198
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 195
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 195
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 146
- 108010077432 Myeloid Differentiation Factor 88 Proteins 0.000 description 136
- 102000010168 Myeloid Differentiation Factor 88 Human genes 0.000 description 135
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 131
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 131
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 131
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 126
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 120
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 108
- 102000004039 Caspase-9 Human genes 0.000 description 107
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 103
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 103
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 103
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 97
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 92
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 82
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 82
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 65
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 65
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 57
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 57
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 51
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 46
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 46
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 45
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 45
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 38
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 36
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 32
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 23
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 22
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 22
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 21
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 20
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 20
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 20
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 19
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 18
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 17
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 17
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 17
- 102000002164 CARD domains Human genes 0.000 description 16
- 108050009503 CARD domains Proteins 0.000 description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 16
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 16
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 14
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 14
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 14
- -1 p-dimethoxyphenyl Chemical group 0.000 description 14
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 13
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 13
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 13
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 12
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 12
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 11
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 11
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 10
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 102000021350 Caspase recruitment domains Human genes 0.000 description 9
- 108091011189 Caspase recruitment domains Proteins 0.000 description 9
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 9
- 102100038713 Death domain-containing protein CRADD Human genes 0.000 description 9
- 101000957914 Homo sapiens Death domain-containing protein CRADD Proteins 0.000 description 9
- 101001136592 Homo sapiens Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 9
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 9
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 9
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 description 9
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 9
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 9
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 8
- 108010058905 CD44v6 antigen Proteins 0.000 description 8
- 102000047934 Caspase-3/7 Human genes 0.000 description 8
- 108700037887 Caspase-3/7 Proteins 0.000 description 8
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 8
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 8
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 8
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 8
- 101001103039 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Proteins 0.000 description 8
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 8
- 101001103036 Homo sapiens Nuclear receptor ROR-alpha Proteins 0.000 description 8
- 102100039615 Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Human genes 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 101100346932 Mus musculus Muc1 gene Proteins 0.000 description 8
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 8
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 8
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 8
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 7
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 7
- 208000032672 Histiocytosis haematophagic Diseases 0.000 description 7
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 7
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 7
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 7
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 6
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 6
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 6
- 208000015322 bone marrow disease Diseases 0.000 description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 6
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 5
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 description 5
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 description 5
- 102000004046 Caspase-2 Human genes 0.000 description 5
- 108090000552 Caspase-2 Proteins 0.000 description 5
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 5
- 206010053138 Congenital aplastic anaemia Diseases 0.000 description 5
- 208000036066 Hemophagocytic Lymphohistiocytosis Diseases 0.000 description 5
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 5
- 102100023085 Serine/threonine-protein kinase mTOR Human genes 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 5
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 5
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 5
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 208000014752 hemophagocytic syndrome Diseases 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 4
- 102000004018 Caspase 6 Human genes 0.000 description 4
- 108090000425 Caspase 6 Proteins 0.000 description 4
- 108090000567 Caspase 7 Proteins 0.000 description 4
- 102000004068 Caspase-10 Human genes 0.000 description 4
- 108090000572 Caspase-10 Proteins 0.000 description 4
- 102000004066 Caspase-12 Human genes 0.000 description 4
- 108090000570 Caspase-12 Proteins 0.000 description 4
- 102000004958 Caspase-14 Human genes 0.000 description 4
- 108090001132 Caspase-14 Proteins 0.000 description 4
- 102100025597 Caspase-4 Human genes 0.000 description 4
- 101710090338 Caspase-4 Proteins 0.000 description 4
- 102100038916 Caspase-5 Human genes 0.000 description 4
- 101710090333 Caspase-5 Proteins 0.000 description 4
- 102100038902 Caspase-7 Human genes 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 4
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 4
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 4
- 101000818543 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Proteins 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 101000933115 Mus musculus Caspase-4 Proteins 0.000 description 4
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 4
- 102100021125 Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Human genes 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 108010018550 caspase 13 Proteins 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 4
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- 102100033051 40S ribosomal protein S19 Human genes 0.000 description 3
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 3
- 102100034524 Apoptotic protease-activating factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100026596 Bcl-2-like protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 208000033932 Blackfan-Diamond anemia Diseases 0.000 description 3
- 201000007155 CD40 ligand deficiency Diseases 0.000 description 3
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 description 3
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 3
- 201000003874 Common Variable Immunodeficiency Diseases 0.000 description 3
- 102000036292 Death effector domains Human genes 0.000 description 3
- 108091010866 Death effector domains Proteins 0.000 description 3
- 201000004449 Diamond-Blackfan anemia Diseases 0.000 description 3
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 3
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 3
- 208000000259 GATA2 Deficiency Diseases 0.000 description 3
- 208000022140 GATA2 deficiency with susceptibility to MDS/AML Diseases 0.000 description 3
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 3
- 101000924629 Homo sapiens Apoptotic protease-activating factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 3
- 102000004551 Interleukin-10 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010017550 Interleukin-10 Receptors Proteins 0.000 description 3
- 208000001126 Keratosis Diseases 0.000 description 3
- 201000001779 Leukocyte adhesion deficiency Diseases 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 3
- 208000002678 Mucopolysaccharidoses Diseases 0.000 description 3
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 3
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 3
- 206010029379 Neutrophilia Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 208000026378 Polyglandular endocrine disease Diseases 0.000 description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 201000001322 T cell deficiency Diseases 0.000 description 3
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 3
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 3
- 102000055574 bcl-2 Homologous Antagonist-Killer Human genes 0.000 description 3
- 102000055102 bcl-2-Associated X Human genes 0.000 description 3
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 208000037902 enteropathy Diseases 0.000 description 3
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000014165 immunodeficiency 21 Diseases 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 201000001268 lymphoproliferative syndrome Diseases 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 206010028093 mucopolysaccharidosis Diseases 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004967 non-hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 3
- 208000002865 osteopetrosis Diseases 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 2
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 201000004939 Fanconi anemia Diseases 0.000 description 2
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 208000004987 Macrophage activation syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 201000011442 Metachromatic leukodystrophy Diseases 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 208000031951 Primary immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 206010045170 Tumour lysis syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003258 hemophagocytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 2
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 2
- 235000020938 metabolic status Nutrition 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 239000002062 molecular scaffold Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 2
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 208000010380 tumor lysis syndrome Diseases 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- 230000004222 uncontrolled growth Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- BCHIXGBGRHLSBE-UHFFFAOYSA-N (4-methyl-2-oxochromen-7-yl) dihydrogen phosphate Chemical compound C1=C(OP(O)(O)=O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C BCHIXGBGRHLSBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010089941 Apoptosomes Proteins 0.000 description 1
- 108010031480 Artificial Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 208000025324 B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010048396 Bone marrow transplant rejection Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008583 Chloroma Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000001493 Cyclophilins Human genes 0.000 description 1
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102100024350 Dedicator of cytokinesis protein 8 Human genes 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010000196 Factor XIIIa Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010067807 Gingival cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000983523 Homo sapiens Caspase-9 Proteins 0.000 description 1
- 101001052946 Homo sapiens Dedicator of cytokinesis protein 8 Proteins 0.000 description 1
- 101100446641 Homo sapiens FKBP1A gene Proteins 0.000 description 1
- 101000914053 Homo sapiens Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP2 Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 240000001812 Hyssopus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000010650 Hyssopus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000035809 Lymphohistiocytosis Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 101000914065 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) FK506-binding protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 description 1
- 206010033701 Papillary thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102100026408 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP2 Human genes 0.000 description 1
- 208000031839 Peripheral nerve sheath tumour malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010037868 Rash maculo-papular Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical class C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010062129 Tongue neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000013593 acute megakaryoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 201000002660 colon sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003499 exocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 206010016629 fibroma Diseases 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- 208000017750 granulocytic sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000055209 human FKBP1A Human genes 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 208000012965 maculopapular rash Diseases 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000009020 malignant peripheral nerve sheath tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 201000005987 myeloid sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 208000023833 nerve sheath neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000029974 neurofibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004798 organs belonging to the digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004786 perivascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 102200015453 rs121912293 Human genes 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 201000004477 skin sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002037 sum-frequency generation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 208000030045 thyroid gland papillary carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 201000006134 tongue cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464403—Receptors for growth factors
- A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/464412—CD19 or B4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464416—Receptors for cytokines
- A61K39/464419—Receptors for interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
- A61K39/464489—PRAME
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464493—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; Prostatic acid phosphatase [PAP]; Prostate-specific G-protein-coupled receptor [PSGR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
- C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
- C12Y304/22062—Caspase-9 (3.4.22.62)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y502/00—Cis-trans-isomerases (5.2)
- C12Y502/01—Cis-trans-Isomerases (5.2.1)
- C12Y502/01008—Peptidylprolyl isomerase (5.2.1.8), i.e. cyclophilin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
- A61K2239/23—On/off switch
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/54—Pancreas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【課題】治療用細胞の活性化及び排除のための二重コントロールの提供。【解決手段】本技術は一部、他の多量体リガンドとともに、別個のヘテロ二量体化剤リガンドを使用する分子スイッチを使用して、治療用細胞の活性または排除を調節するための方法に関する。本技術は、例えば、生着を促進するために使用される細胞を活性化または排除するため、疾患もしくは状態を処置するため、またはキメラ抗原レセプターもしくは組換えＴ細胞レセプターを発現する治療用細胞の活性を調節もしくはモジュレートするために、使用され得る。【選択図】なし
Description
関連出願
「治療細胞活性化まあは排除のための二重制御」との題名の、２０１５年１２月１４日に出願された、米国仮特許出願第６２／２６７，２７７号に対して優先権を主張し、その全体を参照し、参照により援用する。
「治療細胞活性化まあは排除のための二重制御」との題名の、２０１５年１２月１４日に出願された、米国仮特許出願第６２／２６７，２７７号に対して優先権を主張し、その全体を参照し、参照により援用する。
分野
本技術は一部、別個のヘテロ二量体化剤（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）リガンドを、他の多量体リガンドとともに使用する分子スイッチを使用して、治療用細胞の活性または排除を調節するための方法に関する。本技術は、例えば、生着を促進するために使用される細胞を活性化または排除するため、疾患もしくは状態を処置するため、またはキメラ抗原レセプターもしくは組換えＴ細胞レセプターを発現する治療用細胞の活性を調節もしくはモジュレートするために使用され得る。
本技術は一部、別個のヘテロ二量体化剤（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）リガンドを、他の多量体リガンドとともに使用する分子スイッチを使用して、治療用細胞の活性または排除を調節するための方法に関する。本技術は、例えば、生着を促進するために使用される細胞を活性化または排除するため、疾患もしくは状態を処置するため、またはキメラ抗原レセプターもしくは組換えＴ細胞レセプターを発現する治療用細胞の活性を調節もしくはモジュレートするために使用され得る。
背景
改変されたまたは改変されていない細胞（例えば、Ｔ細胞）が患者に投与される細胞治療の使用がますます増加しつつある。いくつかの例では、細胞は、異種遺伝子を発現するように遺伝子操作され、次いで、これらの改変細胞は患者へと投与される。異種遺伝子は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現させるために使用され得る。このキメラ抗原レセプターは、ＭＨＣ抗原提示の必要なくＴ細胞に抗原特異性を伝えるためにデザインされた人工レセプターである。それらは、Ｔ細胞を活性化し、特異免疫をもたらすように選択された、抗原特異的構成成分、膜貫通構成成分および細胞内構成成分を含む。ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、がん治療をはじめとした様々な治療において使用され得る。これら処置は、例えば、腫瘍を排除のために標的化するために、ならびにがんおよび血液障害を処置するために使用されるが、これら治療は、負の副作用を有し得る。
改変されたまたは改変されていない細胞（例えば、Ｔ細胞）が患者に投与される細胞治療の使用がますます増加しつつある。いくつかの例では、細胞は、異種遺伝子を発現するように遺伝子操作され、次いで、これらの改変細胞は患者へと投与される。異種遺伝子は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現させるために使用され得る。このキメラ抗原レセプターは、ＭＨＣ抗原提示の必要なくＴ細胞に抗原特異性を伝えるためにデザインされた人工レセプターである。それらは、Ｔ細胞を活性化し、特異免疫をもたらすように選択された、抗原特異的構成成分、膜貫通構成成分および細胞内構成成分を含む。ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、がん治療をはじめとした様々な治療において使用され得る。これら処置は、例えば、腫瘍を排除のために標的化するために、ならびにがんおよび血液障害を処置するために使用されるが、これら治療は、負の副作用を有し得る。
治療用細胞誘発性有害事象のいくつかの場合には、治療用細胞の迅速かつほぼ完全な排除の必要性がある。過度のオンターゲット効果（例えば、大きな腫瘍塊に対して指向されるもの）は、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）と関連するサイトカインストームをもたらし得る。結果として、それらが重大有害事象（ＳＡＥ）を引き起こす事象において移入されたＴ細胞または幹細胞を排除し得るか、または処置後にもはや用いられなくなり得る安定な、信頼性のある「自殺遺伝子」の開発は非常に重要である。なお場合によっては、治療の必要性は残り得、十分な治療レベルを維持しながら、負の効果を減少するための方法が存在し得る。
場合によっては、治療用細胞の活性を増加させる必要性がある。例えば、共刺激ポリペプチドは、Ｔ細胞の活性化、および標的抗原に対するＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性化を高めるために使用され得る。これは、養子免疫療法の効力を増大させる。
従って、治療の有益な効果のうちの一部またはすべてを保持しながら、細胞治療において使用されるドナー細胞の活性化を迅速に増強または細胞治療において使用されるドナー細胞の考えられる負の効果を迅速に除去するために、治療用細胞のコントロールされた活性化または排除の必要性がある。
要旨
小分子での二量体化の化学的誘導（ＣＩＤ）は、タンパク質機能のスイッチを生成して、細胞生理を変化させるために使用される有効な技術である。高い特異性の効率的二量体化剤は、リミズシド（ＡＰ１９０３）であり、これは、テールトゥーテール（ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ）に配置された２個の同一のタンパク質結合表面を有し、各々は、ＦＫＢＰ１２の変異体もしくはバリアント：ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）（ＦＫＢＰ１２ｖ３６、ＦＶ３６またはＦｖ）に対して高い親和性および特異性を有する。ホモ二量体化に通常は依拠する１個またはこれより多くの細胞シグナル伝達分子上への１個またはこれより多くのＦＶドメインの結合は、そのタンパク質をリミズシド調節へと変換し得る。リミズシドでのホモ二量体化は、誘導性カスパーゼ安全スイッチおよび細胞治療のための誘導性活性化スイッチの状況で使用され、この場合、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドを含む共刺激ポリペプチドが、免役活性を刺激するために使用される。
これらのスイッチはともに、同じリガンド誘導物質に依拠するので、同じ細胞内でこれらのスイッチを使用して両方の機能を調節することは困難である。いくつかの実施形態において、分子スイッチが提供され、これは、ヘテロ二量体化小分子、ラパマイシン、またはラパマイシンアナログ（「ラパログ」）に基づいて、別個の二量体化剤リガンドによって調節される。ラパマイシンは、ＦＫＢＰ１２およびそのバリアントに結合し、ＦＫＢＰ１２およびｍＴＯＲのＦＫＢＰ－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインを含むポリペプチドの両方に結合することによって、ＦＫＢＰ１２に融合されるシグナル伝達ドメインのヘテロ二量体化を誘導し得る。本出願のいくつかの実施形態において提供されるのは、治療適用のための薬剤として、ラパマイシン、ラパログおよびリミズシドの使用を大いに増加させる分子スイッチである。ある種の実施形態において、リミズシドの対立遺伝子特異性は、Ｆｖ－融合物の選択的二量体化を可能にするために使用される。他の実施形態において、ラパマイシンまたはラパログ誘導性アポトーシス促進ポリペプチド（例えば、カスパーゼ－９またはラパマイシンもしくはラパログ誘導性共刺激ポリペプチドなど（例えば、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ＭＣ）など））は、二重スイッチを生成するために、リミズシド誘導性アポトーシス促進ポリペプチド（例えば、カスパーゼ－９など）、またはリミズシド誘導性キメラ刺激ポリペプチド（例えば、ｉＭＣなど）と組み合わせて使用される。これらの二重スイッチは、２種の別個のリガンド誘導物質のうちのいずれかの投与によって選択的に細胞増殖およびアポトーシスの両方を調節するために使用され得る。
小分子での二量体化の化学的誘導（ＣＩＤ）は、タンパク質機能のスイッチを生成して、細胞生理を変化させるために使用される有効な技術である。高い特異性の効率的二量体化剤は、リミズシド（ＡＰ１９０３）であり、これは、テールトゥーテール（ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ）に配置された２個の同一のタンパク質結合表面を有し、各々は、ＦＫＢＰ１２の変異体もしくはバリアント：ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）（ＦＫＢＰ１２ｖ３６、ＦＶ３６またはＦｖ）に対して高い親和性および特異性を有する。ホモ二量体化に通常は依拠する１個またはこれより多くの細胞シグナル伝達分子上への１個またはこれより多くのＦＶドメインの結合は、そのタンパク質をリミズシド調節へと変換し得る。リミズシドでのホモ二量体化は、誘導性カスパーゼ安全スイッチおよび細胞治療のための誘導性活性化スイッチの状況で使用され、この場合、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドを含む共刺激ポリペプチドが、免役活性を刺激するために使用される。
これらのスイッチはともに、同じリガンド誘導物質に依拠するので、同じ細胞内でこれらのスイッチを使用して両方の機能を調節することは困難である。いくつかの実施形態において、分子スイッチが提供され、これは、ヘテロ二量体化小分子、ラパマイシン、またはラパマイシンアナログ（「ラパログ」）に基づいて、別個の二量体化剤リガンドによって調節される。ラパマイシンは、ＦＫＢＰ１２およびそのバリアントに結合し、ＦＫＢＰ１２およびｍＴＯＲのＦＫＢＰ－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインを含むポリペプチドの両方に結合することによって、ＦＫＢＰ１２に融合されるシグナル伝達ドメインのヘテロ二量体化を誘導し得る。本出願のいくつかの実施形態において提供されるのは、治療適用のための薬剤として、ラパマイシン、ラパログおよびリミズシドの使用を大いに増加させる分子スイッチである。ある種の実施形態において、リミズシドの対立遺伝子特異性は、Ｆｖ－融合物の選択的二量体化を可能にするために使用される。他の実施形態において、ラパマイシンまたはラパログ誘導性アポトーシス促進ポリペプチド（例えば、カスパーゼ－９またはラパマイシンもしくはラパログ誘導性共刺激ポリペプチドなど（例えば、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ＭＣ）など））は、二重スイッチを生成するために、リミズシド誘導性アポトーシス促進ポリペプチド（例えば、カスパーゼ－９など）、またはリミズシド誘導性キメラ刺激ポリペプチド（例えば、ｉＭＣなど）と組み合わせて使用される。これらの二重スイッチは、２種の別個のリガンド誘導物質のうちのいずれかの投与によって選択的に細胞増殖およびアポトーシスの両方を調節するために使用され得る。
他の実施形態において、分子スイッチが提供され、これは、アポトーシス促進ポリペプチド（例えば、カスパーゼ－９など）を、リミズシド、またはラパマイシンもしくはラパログのいずれかで活性化する選択肢を提供し、ここでキメラアポトーシス促進ポリペプチドは、リミズシド誘導性スイッチおよびラパマイシン誘導性もしくはラパログ誘導性スイッチの両方を含む。同じキメラアポトーシス促進ポリペプチドに両方の分子スイッチを含めることは、臨床実践場面において柔軟性を提供する。その場合、臨床医は、その特異的な薬理学的特性に基づいて、または他の考慮事項（例えば、入手可能性など）から、適切な薬物を投与するために選択し得る。これらのキメラアポトーシス促進ポリペプチドは、例えば、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）またはＦＲＢバリアント、およびＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６など）の両方を含み得る。ＦＲＢバリアントポリペプチドとは、ラパマイシンアナログ（ラパログ）、例えば、本出願で提供されるラパログに結合するＦＲＢポリペプチドを意味する。ＦＲＢバリアントポリペプチドは、１またはこれより多くのアミノ酸置換を含み、ラパログに結合し、ラパマイシンに結合してもよいし結合しなくてもよい。
二重スイッチ技術の一実施形態において、（Ｆｗｔ．ＦＲＢΔＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）ホモ二量体化剤（例えば、ＡＰ１９０３（リミズシド））は、改変された細胞の活性化を誘導し、ヘテロ二量体化剤（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）は、安全スイッチを活性化し、改変された細胞のアポトーシスを引き起こす。この実施形態において、例えば、ＦＫＢＰ１２およびＦＲＢの両方、またはＦＲＢバリアント領域（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）を含むキメラアポトーシス促進ポリペプチド（例えば、カスパーゼ－９など）は、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチド、ならびに少なくとも２コピーのＦＫＢＰ１２ｖ３６を含む誘導性キメラＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激ポリペプチド（ＭＣ．ＦｖＦｖ）とともに細胞において発現される。細胞とＦｖ領域に結合する二量体化剤とを接触させると、そのＭＣ．ＦｖＦｖは、二量体化または多量体化し、細胞を活性化させる。その細胞は、例えば、標的抗原に対して誘導される（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲζ）を発現するＴ細胞であり得る。安全スイッチとして、細胞は、ヘテロ二量体化剤（例えば、ｉＦｗｔＦＲＢＣ９ポリペプチド上のＦＲＢ領域に結合するラパマイシンまたはラパログ、ならびにｉＦｗｔＦＲＢＣ９ポリペプチド上のＦＫＢＰ１２領域など）と接触させられ得、カスパーゼ－９ポリペプチドの直接的二量体化を引き起こし、アポトーシスを誘導する（図４３（２）、図５７）。別の機構において、ヘテロ二量体化剤は、ｉＦｗｔＦＲＢＣ９ポリペプチド上のＦＲＢ領域に、およびＭＣ．ＦｖＦｖポリペプチド上のＦｖ領域に結合し、各ＭＣ．ＦｖＦｖポリペプチド上の２個のＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチドの足場に起因して、足場誘導性二量体化を引き起こし（図４３（１））、アポトーシスを誘導する。ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチドとは、１またはこれより多くのアミノ酸置換を含みかつリガンド（例えば、リミズシドなど）が前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも１００倍、５００倍、または１０００倍高い親和性でそのリガンドに結合するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを意味する。
二重スイッチ技術の別の実施形態において、（ＦＲＢＦｗｔＭＣ／ＦｖＣ９）ヘテロ二量体化剤（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）は、改変された細胞の活性化を誘導し、ホモ二量体化剤（例えば、ＡＰ１９０３）は、安全スイッチを活性化し、改変された細胞のアポトーシスを引き起こす。この実施形態において、例えば、Ｆｖ領域を含むキメラアポトーシス促進ポリペプチド（例えば、カスパーゼ－９など）（ｉＦｖＣ９）は、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチド、ならびにＦＫＢＰ１２およびＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域の両方を含む誘導性キメラＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激共刺激ポリペプチド（ｉＦＲＢＦｗｔＭＣ）（ＭＣ．ＦｖＦｖ）とともに細胞において発現される。細胞とＦＫＢＰ１２およびＦＲＢ領域をヘテロ二量体化するラパマイシンまたはラパログとを接触させると、ｉＦＲＢＦｗｔＭＣは、二量体化または多量体化し、細胞を活性化する。上記細胞は、例えば、標的抗原に対して誘導されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲζ）を発現するＴ細胞であり得る。安全スイッチとして、上記細胞は、ｉＦｖＣ９ポリペプチドに結合するホモ二量体化剤（例えば、ＡＰ１９０３など）と接触させられ得、カスパーゼ－９ポリペプチドの直接的二量体化を引き起こし、アポトーシスを誘導する（図５７（右側））。
本出願の二重スイッチ組成物および方法のさらに別の実施形態において、二重スイッチアポトーシスポリペプチド、上記二重スイッチアポトーシスポリペプチドを発現する改変された細胞、および上記二重スイッチアポトーシスポリペプチドをコードする核酸が提供される。これらの二重スイッチキメラアポトーシス促進ポリペプチドは、リガンド誘導物質の選択を可能にする。例えば、一実施形態において、ＦＲＢ．ＦＫＢＰＶ．ΔＣ９ポリペプチド、またはＦＫＢＰｖ．ＦＲＢΔＣ９ポリペプチドを発現する改変された細胞が提供される；アポトーシスは、上記改変された細胞とヘテロ二量体（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）、またはホモ二量体（リミズシド）のいずれかとを接触させることによって誘導され得る。
従って、いくつかの実施形態において、二重スイッチキメラアポトーシス促進ポリペプチド（例えば、ＦＲＢ．ＦＫＢＰＶ．ΔＣ９ポリペプチド、またはＦＫＢＰｖ．ＦＲＢΔＣ９ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む改変された細胞が提供され、ここで上記ＦＲＢポリペプチド領域は、ＦＲＢバリアントポリペプチド領域（例えば、ＦＲＢＬなど）であり得る。ＦＲＢが示される場合（例えば、本明細書での命名表など）、他のＦＲＢ誘導体が使用され得る（例えば、ＦＲＢＬなど）ことは理解される。同様に、ＦＲＢＬを含むポリペプチドが、本出願の組成物または方法の一例として提供される場合、適切なリガンド（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）とともに、ＲＢまたはＦＲＢＬ以外のＦＲＢバリアントもしくは誘導体が使用され得ることは、理解される。ＦＫＢＰ１２ｖ３６以外のＦＫＢＰ１２バリアントが、適切な場合にはＦＫＢＰ１２ｖ３６の代わりに使用され得ることもまた、理解される。上記改変された細胞は、異種タンパク質（例えば、キメラ抗原レセプターまたは組換えＴ細胞レセプターなど）をコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。上記改変された細胞は、共刺激ポリペプチド（例えば、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含むポリペプチド、または例えば、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域および細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むポリペプチドなど）をコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。また提供されるのは、いくつかの実施形態において、二重スイッチキメラアポトーシス促進ポリペプチド（例えば、ＦＲＢ．ＦＫＢＰＶ．ΔＣ９ポリペプチド、またはＦＫＢＰｖ．ＦＲＢΔＣ９ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含む核酸であり、ここで上記ＦＲＢポリペプチド領域は、ＦＲＢバリアントポリペプチド領域（例えば、ＦＲＢＬなど）であり得る。上記核酸は、異種タンパク質（例えば、キメラ抗原レセプターまたは組換えＴ細胞レセプターなど）をコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。上記核酸は、共刺激ポリペプチド（例えば、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含むポリペプチド、または例えば、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域および細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含むポリペプチドなど）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
本出願のいくつかの実施形態において、キメラポリペプチドが提供され、ここで第１のキメラポリペプチドは、第１のリガンドに結合する第１の多量体化領域を含み；上記第１の多量体化領域は、第１のリガンド結合ユニットおよび第２のリガンド結合ユニットを含み；上記第１のリガンドは、第１の部分および第２の部分を含む多量体リガンドであり；上記第１のリガンド結合ユニットは、上記第１のリガンドの第１の部分に結合し、上記第１のリガンドの第２の部分には有意に結合せず；そして上記第２のリガンド結合ユニットは、上記第１のリガンドの第２の部分に結合し、上記上記第１のリガンドの第１の部分には有意に結合しない。いくつかの実施形態において、第２のキメラポリペプチドがまた提供され、ここで上記第２のキメラポリペプチドは、第２のリガンドに結合する第２の多量体化領域を含み；上記第２の多量体化領域は、第３のリガンド結合ユニットを含み；上記第２のリガンドは、第３の部分を含む多量体リガンドであり；そして上記第３のリガンド結合ユニットは、上記第２のリガンドの第３の部分に結合し、上記第１のリガンドの第２の部分には有意に結合しない。第１のリガンド結合ユニットの例としては、ＦＫＢＰ１２多量体化領域、またはバリアント（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６）が挙げられるが、これらに限定されず、第２のリガンド結合ユニットの例は、例えば、ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント多量体化領域である。第３のリガンド結合ユニットの例としては、例えば、ＦＫＢＰ１２多量体化領域、またはバリアント（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６）が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、上記第１のリガンド結合ユニットは、ＦＫＢＰ１２であり、上記第３のリガンド結合ユニットは、ＦＫＢＰ１２ｖ３６である。ある種の実施形態において、上記第１のリガンドは、ラパマイシン、またはラパログであり、上記第２のリガンドは、リミズシド（ＡＰ１９０３）である。
多量体化領域（例えば、ＦＫＢＰ１２／ＦＲＢ、ＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２、およびＦＫＢＰ１２ｖ３６）は、アポトーシス促進ポリペプチドもしくは共刺激ポリペプチドに対してアミノ末端側に位置してもよいし、または他の例では、アポトーシス促進ポリペプチドもしくは共刺激ポリペプチドに対してカルボキシル末端側に位置してもよい。さらなるポリペプチド（例えば、リンカーポリペプチド、ステムポリペプチド、スペーサーポリペプチド、またはいくつかの例では、マーカーポリペプチドなど）は、上記キメラポリペプチドにおいて、多量体化領域とアポトーシス促進ポリペプチドまたは共刺激ポリペプチドとの間に位置してもよい。
従って、いくつかの実施形態において提供されるのは、キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチド、またはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域（ＦＫＢＰ１２ｖ）を含む第１のポリヌクレオチド；ならびにキメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラ共刺激ポリペプチドは、１またはこれより多くの（例えば、１、２、または３個の）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域およびｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；またはｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、第２のポリヌクレオチド、を含む改変された細胞である。いくつかの実施形態において、上記改変された細胞は、キメラ抗原レセプターまたは組換えＴ細胞レセプターをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む。
また提供されるのは、いくつかの実施形態において、キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域（ＦＫＢＰ１２ｖ）を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびに、キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラ共刺激ポリペプチドは、１またはこれより多くの（例えば、１、２、または３個の）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域およびｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；またはｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、第２のポリヌクレオチド、に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸である。いくつかの実施形態において、上記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、第３のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、ここで上記第３のポリヌクレオチドは、キメラ抗原レセプターまたは組換えＴ細胞レセプターをコードする。いくつかの実施形態において、上記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ－９ポリペプチドであり、ここで上記カスパーゼ－９ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠いている。いくつかの実施形態において、上記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。また提供されるのは、いくつかの実施形態において、キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；（ｉｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチド領域またはそのバリアント；および（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域（ＦＫＢＰ１２ｖ）を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびにキメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラ共刺激ポリペプチドは、１またはこれより多くの（例えば、１、２、または３個の）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域およびｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；またはｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、第２のポリヌクレオチドを含む核酸を含む、キットまたは組成物である。
いくつかの実施形態において、キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現するための方法が提供され、ここで上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域；ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域および本実施形態のＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含み；上記方法は、本実施形態の核酸と細胞とを、上記核酸が上記細胞に組み込まれる条件下で接触させることを含み、それによって、上記細胞は、上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを上記組み込まれた核酸から発現する。
いくつかの実施形態において、被験体において免疫応答を刺激するための方法が提供され、上記方法は、本実施形態の改変された細胞を上記被験体に移植すること、および、（ａ）の後に、有効量の、上記キメラ共刺激ポリペプチドのＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与して、細胞媒介性免疫応答を刺激することを包含する。いくつかの実施形態において、改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがある被験体にリガンドを投与するための方法が提供され、上記方法は、上記キメラ共刺激ポリペプチドのＦＫＢＰバリアント領域に結合するリガンドを上記ヒト被験体に投与することを含み、ここで上記改変された細胞は、本実施形態、本実施形態の（ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）改変された細胞を含む。標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法がまた提供され、上記方法は、ａ）有効量の改変された細胞を上記被験体に移植することであって；ここで上記改変された細胞は、本実施形態の改変された細胞を含み、ここで上記改変された細胞は、標的抗原に結合する抗原認識部分を含む、キメラ抗原レセプターまたは組換えＴ細胞レセプターを含む、こと、および、ｂ） ａ）の後に、有効量の、上記キメラ共刺激ポリペプチドのＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与して、上記被験体において標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させること、を包含する。また提供されるのは、被験体において腫瘍のサイズを減少させるための方法であり、上記方法は、ａ）本実施形態の改変された細胞を上記被験体に投与することであって、ここで上記細胞は、上記腫瘍上の抗原に結合する抗原認識部分を含む、キメラ抗原レセプターまたは組換えＴ細胞レセプターを含む、こと；およびｂ） ａ）の後に、有効量の、上記キメラ共刺激ポリペプチドのＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与して、上記被験体において腫瘍のサイズを減少させること、を包含する。被験体において移植された、改変された細胞の生存を調節するための方法も提供され、上記方法は、本実施形態の改変された細胞を上記被験体に移植すること；および上記被験体に、上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを、上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する上記改変された細胞うちの少なくとも３０％を殺滅するために有効な量で投与することを含む。
他の実施形態において、改変された細胞を提供し、上記改変された細胞は、キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；およびｉｉ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびにキメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域；およびＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、またはＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、上記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む。いくつかの実施形態において、上記細胞は、第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで上記第３のポリヌクレオチドは、キメラ抗原レセプターまたは組換えＴ細胞レセプターをコードする。
いくつかの実施形態において、核酸が提供され、ここで上記核酸は、キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；およびｉ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域を含む、第１のポリヌクレオチド；ならびにキメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで上記キメラ共刺激ポリペプチドは、ｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；ｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；およびｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、またはＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、第２のポリヌクレオチド、に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、上記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む。いくつかの実施形態において、上記プロモーターは、第３のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、ここで上記第３のポリヌクレオチドは、キメラ抗原レセプターまたは組換えＴ細胞レセプターをコードする。いくつかの実施形態において、上記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ－９ポリペプチドであり、ここで上記カスパーゼ－９ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠いている。いくつかの実施形態において、上記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。本実施形態のポリヌクレオチドを含む核酸を含むキットまたは組成物もまた、提供される。キメラアポトーシス促進ポリペプチドおよびキメラ共刺激ポリペプチドを発現するための方法もまた提供され、ここでａ）上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；およびｉｉ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域を含み；そしてｂ）上記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；およびＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、またはＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含み、上記方法は、キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸であって、ここで上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；ｂ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）ポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；およびｃ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域を含む核酸と細胞とを、上記核酸が上記細胞に組み込まれる条件下で接触させることを含み、それによって、上記細胞は、上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドおよび上記キメラ共刺激ポリペプチドを、上記組み込まれた核酸から発現する。
いくつかの実施形態において、被験体において免疫応答を刺激するための方法が提供され、上記方法は、ａ）本実施形態の改変された細胞を上記被験体に移植すること、およびｂ） （ａ）の後に、有効量の、上記キメラ刺激ポリペプチドのＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、細胞媒介性免疫応答を刺激することを含む。いくつかの実施形態において、改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがある被験体にリガンドを投与するための方法が提供され、上記方法は、ラパマイシンまたはラパログを上記被験体に投与することを含み、ここで上記改変された細胞は、本実施形態の改変された細胞を含む。いくつかの実施形態において、標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法が提供され、上記方法は、ａ）有効量の改変された細胞を上記被験体に移植することであって；ここで上記改変された細胞は、本実施形態の改変された細胞を含み、ここで上記改変された細胞は、上記標的抗原に結合する抗原認識部分を含む、キメラ抗原レセプターまたは組換えＴ細胞レセプターを含む、こと、およびｂ） ａ）の後に、有効量の、上記キメラ刺激ポリペプチドのＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、上記被験体において標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させることを含む。いくつかの実施形態において、被験体において腫瘍のサイズを減少させるための方法が提供され、上記方法は、ａ）本実施形態の改変された細胞を上記被験体に投与することであって、ここで上記細胞は、該腫瘍上の抗原に結合する抗原認識部分を含む、キメラ抗原レセプターまたは組換えＴ細胞レセプターを含む、こと；およびｂ） ａ）の後に、有効量の、上記キメラ刺激ポリペプチドのＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、上記被験体において腫瘍のサイズを減少させること、を包含する。いくつかの実施形態において、被験体において移植された、改変された細胞の生存を調節するための方法が提供され、上記方法は、ａ）本実施形態の改変された細胞を上記被験体に移植すること、および（ａ）の後に、上記被験体に、上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを、上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与すること、を包含する。
本出願のいくつかの実施形態において、上記キメラ共刺激ポリペプチドは、２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、およびＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む。いくつかの実施形態において、上記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域をさらに含む。本出願のいくつかの実施形態において、上記キメラ共刺激ポリペプチドは、２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域を含む。
本出願において提供されるのはまた、キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸であり、ここで上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；ｂ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）ポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；およびｃ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域を含む。いくつかの実施形態において、上記ＦＫＢＰ１２バリアントは、アミノ酸残基３６でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、上記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域である。いくつかの実施形態において、前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）（ＦＲＢＬ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択され。いくつかの実施形態において、本実施形態の核酸によってコードされるキメラアポトーシス促進ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、本実施形態の核酸でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞が提供される。いくつかの実施形態において、上記改変された細胞は、キメラ抗原レセプターまたは組換えＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、被験体において移植された、改変された細胞の生存を調節するための方法が提供され、上記方法は、ａ）本実施形態の改変された細胞を上記被験体に移植することであって、ここで上記改変された細胞は、キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含み、ここで上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；ｂ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）ポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；およびｃ）本実施形態のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域を含む、こと；ならびにｂ） （ａ）の後に、上記被験体に、ｉ）上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合する第１のリガンド；またはｉｉ）上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する第２のリガンドを投与することを包含し、ここで上記第１のリガンドまたは上記第２のリガンドは、上記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する上記改変された細胞のうちの少なくとも３０％を殺滅するために有効な量で投与される。
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して指向されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する自家Ｔ細胞は、９０％に近づく客観的奏効（ＯＲ）率を伴って、ある種のタイプの白血病（「液性腫瘍」）およびリンパ腫の処置に関する初期の臨床試験において形質転換効果を有していた。それらの臨床的有望性が大きいことおよび予測可能な付随する熱意にも関わらず、この成功は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に代表的なその観察される高レベルのオンターゲット、オフ腫瘍有害事象（ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ， ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ）によって抑えられる。リスクを最小にしながらこれらの画期的な処置の利益を維持するために、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性レベルをコントロールするために整調可能な安全スイッチが開発された。誘導性共刺激キメラポリペプチドは、細胞において共発現されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の持続的で調節されたコントロールを可能にする。リガンド誘導物質は、誘導性キメラシグナル伝達分子を多量体化することによってＣＡＲ発現細胞を活性化し、これは翻って、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路および他の細胞内シグナル伝達経路を誘導し、標的細胞、例えば、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫ－Ｔ）細胞の活性化をもたらす。リガンド誘導物質の非存在下では、Ｔ細胞は、静止状態であるか、または基底レベルの活性を有する。
第２のレベルのコントロールにおいて、「二量体」スイッチは、必要な場合、治療用細胞を被験体から排除することによって、重大な副作用を減少または排除しながら、継続した細胞治療を可能にし得る。この二量体スイッチは、第２のリガンド誘導物質に依存する。いくつかの例では、治療用細胞を迅速に排除する必要性がある場合、この第２のリガンド誘導物質の適切な用量は、治療用細胞のうちの９０％超または９５％超を患者から排除するために、投与される。この第２のレベルのコントロールは、「整調可能」であり得る。すなわち、治療用細胞の除去レベルは、治療用細胞の部分的除去を生じるようにコントロールされ得る。この第２のレベルのコントロールは、例えば、キメラアポトーシス促進ポリペプチドを含み得る。
いくつかの例では、キメラアポトーシスポリペプチドは、ラパマイシン、またはラパマイシンアナログ（ラパログ）の結合部位を含み；リガンド誘導物質による誘導の際に、治療用細胞を活性化する誘導性キメラポリペプチドは、治療用細胞にも存在する；いくつかの例では、この誘導性キメラポリペプチドは、治療用細胞に共刺激活性を提供する。このＣＡＲは、細胞において発現される別個のポリペプチド上に存在し得る。他の例では、このＣＡＲは、誘導性キメラポリペプチドと同じポリペプチドの一部として存在し得る。このコントロール可能な第１のレベルを使用して、継続した治療の必要性、または治療を刺激する必要性は、負の副作用を排除またはそのレベルを減少させる必要性とバランスがとられ得る。
いくつかの実施形態において、ラパマイシンアナログ、ラパログは、患者に投与され、次いで、それは、カスパーゼポリペプチドおよびキメラ抗原レセプターの両方に結合し、従って、カスパーゼポリペプチドをＣＡＲの場所へと動員し、カスパーゼポリペプチドを凝集させる。凝集の際に、カスパーゼポリペプチドは、アポトーシスを誘導する。患者に投与されるラパマイシンまたはラパマイシンアナログの量は、変動し得る；アポトーシスによるより低い細胞レベルの除去が、副作用を減少させ、ＣＡＲ治療を継続するために望ましい場合、より低いレベルのラパマイシンまたはラパマイシンまたはラパログが、患者に投与され得る。
上記第２の治療用細胞排除レベルでは、選択的アポトーシスは、リミズシド（ＡＰ１９０３）を投与することによって、二量体リガンド結合ポリペプチド（例えば、ＡＰ１９０３結合ポリペプチドＦＫＢＰ１２ｖ３６など）に融合されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドを発現する細胞において誘導され得る。いくつの例では、上記カスパーゼ－９ポリペプチドは、誘導性キメラポリペプチドの一部として、野生型カスパーゼ－９ポリペプチドより低い基底アポトーシス活性レベルを生じるアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態において、本出願のキメラポリペプチドをコードする核酸は、キメラ抗原レセプター、Ｔ細胞レセプター、またはＴ細胞レセプターベースのキメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む。また提供されるのは、本明細書で論じられる核酸でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞である。
本出願のいくつかの局面において、上記細胞は、ウイルスベクターで形質導入またはトランスフェクトされる。上記ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルスベクターが挙げられるが、これに限定されない）；ＳＦＧベクター；およびアデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターであり得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、上記細胞は、単離される。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ヒト被験体の中にある。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ヒト被験体において移植される。
いくつかの実施形態において、個別化された処置が提供され、ここで上記疾患または状態のステージまたはレベルは、上記多量体リガンドを投与する前に、上記多量体リガンドのさらなる用量を投与する前に、または上記多量体リガンド投与に関与する方法および投与量を決定するにあたって、決定される。これら方法は、本出願の疾患または状態のうちのいずれかに対する上記方法のうちのいずれかにおいて使用され得る。上記リガンドを投与する前に上記患者を評価するためのこれらの方法が、移植片対宿主病の状況において論じられる場合、これらの方法が、他の状態および疾患の処置にも同様に適用され得ることは、理解される。従って、例えば、本出願のいくつかの実施形態において、上記方法は、治療用細胞を患者に投与することを包含し、そしてトランスフェクトまたは形質導入された治療用細胞を上記患者から除去することを要する該患者における状態の有無を同定すること；および上記患者において同定された状態の有無に基づいて、上記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、上記患者に対する上記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または上記多量体リガンドのその後の投与量を調整することをさらに包含する。そして、例えば、本出願の他の実施形態において、上記方法は、上記患者における移植片対宿主病の症状の出現に基づいて、上記多量体リガンドのさらなる単一用量またはさらなる複数用量を上記患者に投与するかどうかを決定することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記患者において移植片対宿主病の有無またはステージを同定すること、および上記患者において同定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、上記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、上記患者に対する上記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または上記多量体リガンドのその後の投与量を調整することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記患者において移植片対宿主病の有無またはステージを同定すること、および上記患者において同定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、上記多量体化領域に結合する多量体リガンドが上記患者に投与されるべきか、または上記患者にその後投与される上記多量体リガンドの投与量が、または調整されるかを決定することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記患者において移植片対宿主病の有無またはステージを含む情報を受け取ること；および上記患者において同定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、上記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、上記患者への上記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または多量体リガンドのその後の投与量を調整することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記患者において移植片対宿主病の有無またはステージを同定すること、および上記被験体において同定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて上記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、上記患者に投与される上記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または上記多量体リガンドのその後の投与量を調整する意思決定者に、上記移植片対宿主病の有無またはステージを伝達することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記患者において移植片対宿主病の有無またはステージを同定すること、ならびに上記被験体において同定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、上記多量体結合領域に結合する多量体リガンドを投与するか、上記患者に投与される上記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または上記多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝達することをさらに包含する。
ドナーＴ細胞をヒト患者に投与するための方法もまた提供され、上記方法は、本出願の形質導入またはトランスフェクトされたＴ細胞をヒト患者に投与することを包含し、ここで上記細胞は、非同種枯渇（ｎｏｎ－ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｅｄ）ヒトドナーＴ細胞である。
いくつかの実施形態において、上記治療用細胞は、非悪性障害を有する被験体に投与され、またはここで上記被験体は、例えば、原発性免疫不全障害（例えば、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＫ８欠損症、ＩＬ－１０欠損症／ＩＬ－１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全などが挙げられるが、これらに限定されない）、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害（Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｆａｉｌｕｒｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（例えば、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症などが挙げられるが、これらに限定されない）、ヘモグロビン異常症（例えば、鎌状赤血球症、サラセミアなどが挙げられるが、これらに限定されない）、代謝障害（例えば、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスなどが挙げられるが、これらに限定されない）、または破骨細胞障害（例えば、大理石骨病が挙げられるが、これらに限定されない）などの非悪性障害と診断されている。
上記治療用細胞は、例えば、所望の治療結果のために患者に投与される任意の細胞であり得る。上記細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、末梢血細胞、造血前駆体細胞、骨髄細胞、または腫瘍細胞であり得る。上記改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドはまた、腫瘍細胞を直接殺滅するために使用され得る。１つの適用において、上記誘導性の改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、腫瘍へと注射され、１０～２４時間後に（タンパク質発現を可能にするために）、上記リガンド誘導物質（例えば、ＡＰ１９０３など）は、アポトーシスを引き起こすために投与され、腫瘍抗原の微小環境への放出を引き起こす。腫瘍微小環境をさらに改善してより免疫原性にするために、処置は、１種またはこれより多くのアジュバント（例えば、ＩＬ－１２、ＴＬＲ、ＩＤＯ阻害剤など）と組み合わされ得る。いくつかの実施形態において、上記細胞は、固形腫瘍を処置するために送達され得る（例えば、腫瘍床への上記細胞の送達など）。いくつかの実施形態において、上記キメラカスパーゼ－９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ワクチンの一部として、または腫瘍床への直接送達によって投与され得、上記腫瘍細胞におけるキメラカスパーゼ－９ポリペプチドの発現を生じ、続いて、上記リガンド誘導物質の投与後に腫瘍細胞のアポトーシスが生じる。従って、いくつかの実施形態において、核酸ワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン）もまた提供され、ここで上記ワクチンは、本出願の誘導性、または改変された誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。上記ワクチンは、被験体へと投与され得、それによって標的細胞をインビボで形質転換または形質導入し得る。上記リガンド誘導物質は、次いで、本出願の方法に従って投与され得る。
いくつかの実施形態において、上記改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドは、短縮型の改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、上記改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドは、カスパーゼ動員ドメインを欠いている。いくつかの実施形態において、上記カスパーゼ－９ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含むか、または配列番号８のヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントによってコードされる。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与することをさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、フレキシブルリンカードメインによって隔てられた、タンデムの重鎖可変領域と重鎖可変領域とからなる一本鎖抗体、およびこれらの変異した配列からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域である。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンドは、ＦＫ５０６二量体または二量体ＦＫ５０６様アナログリガンドである。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンドは、ＡＰ１９０３である。いくつかの実施形態において、治療用細胞の数は、上記多量体リガンドの投与後に約６０％～９９％、約７０％～９５％、８０％～９０％または約９０％もしくはこれ超低減する。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンドの投与後に、ドナーＴ細胞は、上記患者の中で生存し、拡大することができかつウイルスおよび真菌に反応性である。いくつかの実施形態において、上記多量体リガンドの投与後に、ドナーＴ細胞は、上記患者の中で生存し、拡大することができかつ上記患者において腫瘍細胞に反応性である。
いくつかの実施形態において、上記第２のレベルのコントロールにおいて使用される自殺遺伝子は、カスパーゼポリペプチド、例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４である。ある種の実施形態において、上記カスパーゼポリペプチドは、カスパーゼ－９ポリペプチドである。ある種の実施形態において、上記カスパーゼ－９ポリペプチドは、本明細書中の表５または表６の中に提供される触媒として活性な（触媒として死んでいない）カスパーゼバリアントポリペプチドのアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、上記カスパーゼ－９ポリペプチドは、本明細書中の表５または表６の中に提供される触媒として活性な（触媒として死んでいない）カスパーゼバリアントポリペプチドのアミノ酸配列からなる。他の実施形態において、上記リガンド誘導物質の非存在下でより低い基底活性を有するカスパーゼポリペプチドが、使用され得る。例えば、誘導性キメラカスパーゼポリペプチドの一部として含まれる場合、ある種の改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドは、キメラ構築物の中の野生型カスパーゼ－９と比較して、より低い基底活性を有し得る。例えば、上記改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドは、配列番号９と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、少なくとも１個のアミノ酸置換を含み得る。
ある特定の実施形態は、以下の説明、実施例、請求項および図面においてさらに記載される。
図面は、本技術の実施形態を図示するものであって、限定するものではない。図示を明確にするためおよび容易にするために、図面は、一定の割合で拡大縮小して作成されておらず、場合によっては、特定の実施形態の理解を容易にするために、様々な態様が、誇張または拡大されて示されていることがある。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチド、またはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域（ＦＫＢＰ１２ｖ）；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域ならびに
ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；または
ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
(項目２)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域およびＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、項目１に記載の改変された細胞。
(項目３)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、項目１に記載の改変された細胞。
(項目４)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、項目１～３のいずれかに記載の改変された細胞。
(項目５)
前記細胞は、異種タンパク質をコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む、項目１～５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目６に記載の改変された細胞。
(項目７)
前記異種タンパク質は、組換えＴ細胞レセプターである、項目７に記載の改変された細胞。
(項目８)
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチド、またはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域（ＦＫＢＰ１２ｖ）；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、ならびに
ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；または
ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
(項目９)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域、ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域、およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、項目８に記載の核酸。
(項目１０)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、項目８～９のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１１)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、項目８～９のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１２)
前記プロモーターは、第３のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、ここで該第３のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目８～１１のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１３)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目１２に記載の核酸。
(項目１４)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目１２に記載の核酸。
(項目１５)
前記核酸は、前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１のポリヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目８～１４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１６)
前記核酸は、前記第３のポリヌクレオチドと前記第１のポリヌクレオチドまたは前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第３のポリヌクレオチドの翻訳生成物を、該第１のポリヌクレオチドまたは該第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物から分断する、項目１５に記載の核酸。
(項目１７)
前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、項目１５または１６のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１８)
項目８～１７のいずれか１項に記載の核酸で形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞。
(項目１９)
前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域および前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記アポトーシス促進ポリペプチドに対してアミノ末端側にある、項目１～１８のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２０)
前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に対してアミノ末端側にある、項目１９に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２１)
前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に対してアミノ末端側にある、項目１９に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２２)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも１００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目１～２１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２３)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも５００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目１～２１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２４)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも１０００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目１～２１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２５)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチドは、アミノ酸残基３６でのアミノ酸置換を含む、項目１～２４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２６)
３６位での前記アミノ酸置換は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される、項目２５に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２７)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域である、項目１～２１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２８)
前記リガンドは、リミズシドである、項目２２～２４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２９)
前記リガンドは、ＡＰ２０１８７またはＡＰ１５１０である、項目２２４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３０)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｃ７ラパログに結合する、項目１～２９のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３１)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｔ２０９８位またはＷ２１０１位においてアミノ酸置換を含む、項目１～３０のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３２)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）（ＦＲＢＬ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、項目１～３１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３３)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＦＲＢＬである、項目１～３２のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３４)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、Ｓ－ｏ，ｐ－ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）－ラパマイシン、Ｒ－イソプロポキシラパマイシン、Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシンおよびＳ－ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択されるラパログに結合する、項目１～３３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３５)
前記細胞または前記核酸は、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、項目１～３４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３６)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、Ｓｙｋポリペプチド、ＺＡＰ７０ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目３３に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３７)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目３３に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３８)
前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、項目３５～３７１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３９)
前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、項目３５～３８のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４０)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目３５～３９のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４１)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目３５～３０のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４２)
前記細胞は、組換えＴ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該組換えＴ細胞レセプターは、ＰＲＡＭＥ、Ｂｏｂ－１、およびＮＹ－ＥＳＯ－１からなる群より選択される抗原性ポリペプチドに結合する、項目１～３４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目４３)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｃｌ－２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１－ＲＨＩＭからなる群より選択される、項目１～４２のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４４)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、項目１～４３のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４５)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ－９ポリペプチドである、項目４４に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４６)
前記カスパーゼ－９ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠く、項目４５に記載の核酸または細胞。
(項目４７)
前記カスパーゼポリペプチドは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む、項目４５または４６のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４８)
前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６の中の触媒として活性なカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、項目４４～４７のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４９)
前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、項目４８に記載の改変された細胞または核酸。
(項目５０)
前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４もしくは３０５のアミノ酸配列、またはこれらの機能的フラグメントを有する、項目１～４９のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目５１)
前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目１～４９のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目５２)
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目１～５１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。(項目５３)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチド、ＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域および２個のＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含む、
項目１に記載の改変された細胞。
(項目５４)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチド、ＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および２個のＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含む、
項目１に記載の改変された細胞。
(項目５５)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチド、ＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域および２個のＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含む、
項目１９に記載の核酸。
(項目５６)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチド、ＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および２個のＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含む、
項目１９に記載の核酸。
(項目５７)
前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目５８)
前記細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目５９)
前記細胞は、Ｔ細胞である、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６０)
前記細胞は、初代Ｔ細胞である、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６１)
前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６２)
前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６３)
前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６４)
前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６５)
前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６６)
前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６７)
前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６８)
前記細胞は、ヒト細胞である、項目１～８、１８、１９～３６または５７～６７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６９)
前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、項目１～８、１８、１９～３６または５７～６８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目７０)
前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、項目１～８、１８、１９～３６または５７～６９のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目７１)
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチド領域、またはそのバリアント；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域（ＦＫＢＰ１２ｖ）；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域ならびに
ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；または
ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む核酸を含む、キットまたは組成物。
(項目７２)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域、ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域、およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、項目７１に記載のキットまたは組成物。
(項目７３)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、項目７１～７２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目７４)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、項目７１～７２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目７５)
前記核酸は、項目８～１７、１９～２１２または５５～５６のいずれか１項に記載の核酸である、項目７１に記載のキットまたは組成物。
(項目７６)
第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該第３のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目７１～７５のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目７７)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目７２に記載のキットまたは組成物。
(項目７８)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目７２に記載のキットまたは組成物。
(項目７９)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドを含む、項目７１～７５のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目８０)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、および前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目７２～７８のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目８１)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目７２～７８のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目８２)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第２のポリヌクレオチドおよび前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目７２～７８のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目８３)
キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現するための方法であって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および
ｂ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域、
を含み、該方法は、
項目８～１７、１９～５２、または５５～５６のいずれか１項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させること、
を含み、それによって、該細胞が該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
(項目８４)
前記細胞は、キメラ共刺激ポリペプチドをさらに発現し、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域；ならびに
ｂ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、またはＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、項目８３に記載の方法。
(項目８５)
前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、項目８３または８４のいずれか１項に記載の方法。
(項目８６)
前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、項目８３または８４のいずれか１項に記載の方法。
(項目８７)
被験体において免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体へと移植すること、および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与して、細胞媒介性免疫応答を刺激すること、
を包含する方法。
(項目８８)
改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがある被験体にリガンドを投与するための方法であって、該方法は、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰバリアント領域に結合するリガンドを該ヒト被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を含む、方法。
(項目８９)
被験体において移植された、改変された細胞の活性を制御するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を移植すること；および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与して、該移植された、改変された細胞の活性を刺激すること、
を包含する方法。
(項目９０)
標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
ａ）有効量の改変された細胞を該被験体に投与することであって；ここで該改変された細胞は、項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと、および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与して、該被験体において標的抗原または標的細胞の数または濃度を低減すること、
を包含する方法。
(項目９１)
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目９０に記載の方法。
(項目９２)
標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
ａ）有効量の改変された細胞を該被験体に投与することであって、ここで該改変された細胞は、項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原を認識しかつ該標的抗原に結合する組換えＴ細胞レセプターを含む、こと、および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与して、該被験体において標的抗原または標的細胞の数または濃度を低減すること、
を包含する方法。
(項目９３)
被験体において腫瘍のサイズを減少させるための方法であって、該方法は、
ａ）項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与することであって、ここで該細胞は、該腫瘍上の抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと；および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与して、該被験体において該腫瘍のサイズを減少させること、
を包含する方法。
(項目９４)
第２のリガンドの投与前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、該リガンドの投与後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を決定することを包含する、項目９０～９３のいずれか１項に記載の方法。
(項目９５)
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、項目９４に記載の方法。
(項目９６)
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増加している、項目９４に記載の方法。
(項目９７)
前記被験体は、前記改変された細胞の投与前または前記改変された細胞の投与と同時に幹細胞移植を受けたことがある、項目８７～９６のいずれか１項に記載の方法。
(項目９８)
少なくとも１×１０６個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞は、前記被験体に投与される、項目８７～９７のいずれか１項に記載の方法。
(項目９９)
少なくとも１×１０７個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞は、前記被験体に投与される、項目８７～９７のいずれか１項に記載の方法。
(項目１００)
少なくとも１×１０８個の改変された細胞は、前記被験体に投与される、項目８７～９７のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０１)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６であり、該ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、ＡＰ１９０３である、項目８７～１００のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０２)
被験体において移植された、改変された細胞の生存を調節するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に移植すること；および
ｂ） ａ）の後に、該被験体に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する該改変された細胞のうちの少なくとも３０％を殺滅するために有効な量で投与すること、
を包含する方法。
(項目１０３)
ｂ）の後に、前記被験体に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも３０％を殺滅するために有効な量で投与すること、をさらに包含する、項目８７～１０２のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０４)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも４０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０３に記載の方法。
(項目１０５)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも５０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０６)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも６０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０７)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも７０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０８)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも８０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０９)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１０)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９５％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１１)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９９％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１２)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＦＲＢＬ領域を含む、項目１０２～１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１３)
前記リガンドの１より多くの用量は、前記被験体に投与される、項目８７～１０１のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１４)
前記ラパマイシンまたはラパログの１より多くの用量は、前記被験体に投与される、項目１０２～１１３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１５)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；ならびに
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へラパマイシンもしくはラパログを投与するか、該被験体へのラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持するか、または該被験体への該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目８７～１１３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１６)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を含む情報を受け取ること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へ前記ラパマイシンもしくはラパログを投与するか、該被験体へのラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持するか、または該被験体へのラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目８７～１１３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１７)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて該被験体にラパマイシンもしくは前記ラパログを投与するか、該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整する意思決定者に、該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージを伝達すること、
をさらに包含する、項目８７～１１３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１８)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体に前記ラパマイシンもしくは前記ラパログを投与するか、該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整する指示を伝達すること、
をさらに包含する、項目８７～１１３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１９)
前記被験体はがんを有する、項目８７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２０)
前記改変された細胞は、腫瘍床に送達される、項目８７～１１９のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２１)
前記がんは、前記被験体の血液または骨髄に存在する、項目１１９または１２０のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２２)
前記被験体は、血液または骨髄の疾患を有する、項目８７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２３)
前記被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、項目８７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２４)
前記患者は、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン異常症、代謝状態、および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、項目８７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２５)
前記患者は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ－１０欠損症／ＩＬ－１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、および大理石骨病からなる群より選択される疾患または状態と診断されている、項目８７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２６)
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；および
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域；および
ｉｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、またはＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
(項目１２７)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、項目１２６に記載の改変された細胞。
(項目１２８)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、項目１２６に記載の改変された細胞。
(項目１２９)
前記細胞は、第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該第３のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目１２６～１２８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１３０)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目１２９に記載の改変された細胞。
(項目１３１)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目１２９に記載の改変された細胞。
(項目１３２)
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；および
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；および
ｉｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、またはＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域おとびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド
に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸。
(項目１３３)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、項目１３２に記載の核酸。
(項目１３４)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、項目１３２に記載の核酸。
(項目１３５)
前記プロモーターは、第３のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、ここで該第３のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目１３２～１３４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１３６)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目１３５に記載の核酸。
(項目１３７)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目１３５に記載の核酸。
(項目１３８)
前記核酸は、前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１のポリヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目１３２～１３７のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１３９)
前記核酸は、前記第３のポリヌクレオチドと前記第１のポリヌクレオチドまたは前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第３のポリヌクレオチドの翻訳生成物を、該第１のポリヌクレオチドまたは該第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物から分断する、項目１３８に記載の核酸。
(項目１４０)
前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、項目１３８または１３９のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１４１)
項目１３２～１４０のいずれか１項に記載の核酸で形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞。
(項目１４２)
前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域および前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域は、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＭｙＤ８８ポリペプチドまたは短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドに対してアミノ末端側にある、項目１２６～１４１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４３)
前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に対してアミノ末端側にある、項目１４２に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４４)
前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域は、前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に対してアミノ末端側にある、項目１４２に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４５)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも１００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目１２６～１４４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４６)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも５００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目１２６～１４４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４７)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも１０００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目１２６～１４４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４８)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチドは、アミノ酸残基３６でのアミノ酸置換を含む、項目１２６～１４７のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４９)
３６位での前記アミノ酸置換は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される、項目１４８に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１５０)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域である、項目１２６～１４４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１５１)
前記リガンドは、リミズシドである、項目１４５～１４７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５２)
前記リガンドは、ＡＰ２０１８７である、項目１４５～１４７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５３)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｃ７ラパログに結合する、項目１２６～１５２ののいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５４)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｔ２０９８位またはＷ２１０１位においてアミノ酸置換を含む、項目１２６～１５３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５５)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）（ＦＲＢＬ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、項目１２６～１５４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５６)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＦＲＢＬである、項目１２６～１５５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５７)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、Ｓ－ｏ，ｐ－ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）－ラパマイシン、Ｒ－イソプロポキシラパマイシン、Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシンおよびＳ－ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択されるラパログに結合する、項目１２６～１５６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５８)
前記細胞または前記核酸は、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、項目１２６～１５７のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１５９)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、Ｓｙｋポリペプチド、ＺＡＰ７０ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、、項目１５８のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６０)
前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、項目１５８または１５９のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６１)
前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、項目１５８～１６０のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６２)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目１５８～１６１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６３)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目１５８～１６２のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６４)
前記細胞は、組換えＴ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該組換えＴ細胞レセプターは、ＰＲＡＭＥ、Ｂｏｂ－１、およびＮＹ－ＥＳＯ－１からなる群より選択される抗原性ポリペプチドに結合する、項目１２６～１５７のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６５)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｃｌ－２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１－ＲＨＩＭからなる群より選択される、項目１２６～１６４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６６)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、項目１２６～１６５のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６７)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ－９ポリペプチドである、項目１６６に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６８)
前記カスパーゼ－９ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠く、項目１６７に記載の核酸または細胞。
(項目１６９)
前記カスパーゼポリペプチドは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む、項目１６７または１６８のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１７０)
前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６の中の触媒として活性なカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、項目１６６～１６８のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１７１)
前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、項目１７０に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１７２)
前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４もしくは３０５のアミノ酸配列、またはこれらの機能的フラグメントを有する、項目１２６～１７１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１７３)
前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目１２６～１７１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１７４)
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目１２６～１７３のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１７５)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチドおよびＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、
項目１２６に記載の改変された細胞。
(項目１７６)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチドおよびＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、ＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、
項目１２６に記載の改変された細胞。
(項目１７７)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチドおよびＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、
項目１４２に記載の核酸。
(項目１７８)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチドおよびＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、ＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、
項目１４２に記載の核酸。
(項目１７９)
前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目１２６～１３１、１４１、または１４２～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。(項目１８０)
前記細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８１)
前記細胞は、Ｔ細胞である、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８２)
前記細胞は、初代Ｔ細胞である、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８３)
前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８４)
前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８５)
前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８６)
前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される．項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８７)
前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８８)
前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８９)
前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１９０)
前記細胞は、ヒト細胞である、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１９１)
前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、項目１２６～１３１、１４１～１７６または１７９～１９０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１９２)
前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、項目１２６～１３１、１４１～１７４または１７９～１９０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１９３)
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；および
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、
を含む第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ｉ）ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；および
ｉｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、またはＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む第２のポリヌクレオチド、
を含む核酸を含む、キットまたは組成物。
(項目１９４)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、項目１９３に記載のキットまたは組成物。
(項目１９５)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、項目１９３～１９４のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目１９６)
第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該第３のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目１９３～１９５のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目１９７)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目１９６に記載のキットまたは組成物。
(項目１９８)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目１９６に記載のキットまたは組成物。(項目１９９)
前記核酸は、項目１３２～１３９、１４２～１７４、または１７７～１７８のいずれか１項に記載の核酸である、項目１９３に記載のキットまたは組成物。
(項目２００)
第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該第３のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目１９３～１９９のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目２０１)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目２００に記載のキットまたは組成物。
(項目２０２)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目２００に記載のキットまたは組成物。(項目２０３)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドを含む、項目１９４～１９９のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目２０４)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、および前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目１９９～２０２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目２０５)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目２００～２０２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目２０６)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第２のポリヌクレオチドおよび前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目２００～２０２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目２０７)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、および前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目２００～２０２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目２０８)
キメラアポトーシス促進ポリペプチドおよびキメラ共刺激ポリペプチドを発現させるための方法であって、ここで
ａ）該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；および
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、
を含み；そして
ｂ）該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；および
ｉｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、またはＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含み、該方法は、項目１３２～１３９、１４２～１７４、または１７７～１７８のいずれか１項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させることを含み、それによって、該細胞は、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドおよび該キメラ共刺激ポリペプチドを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
(項目２０９)
前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、項目２０８に記載の方法。
(項目２１０)
前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、項目２０８に記載の方法。
(項目２１１)
被験体において免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に移植すること、および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、細胞媒介性免疫応答を刺激すること、
を包含する方法。
(項目２１２)
改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがある被験体にリガンドを投与するための方法であって、該方法は、ラパマイシンまたはラパログを該被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を含む、方法。
(項目２１３)
被験体において移植された、改変された細胞の活性を調節するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を移植すること；および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該移植された、改変された細胞の活性を刺激すること、
を包含する方法。
(項目２１４)
標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
ａ）有効量の改変された細胞を該被験体に移植することであって；ここで該改変された細胞は、項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと、および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該被験体における標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させること、
を包含する方法。
(項目２１５)
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目２１４に記載の方法。
(項目２１６)
標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
ａ）有効量の改変された細胞を該被験体に投与することであって、ここで該改変された細胞は、項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原を認識しかつ該標的抗原に結合する組換えＴ細胞レセプターを含む、こと、および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該被験体における標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させること、
を包含する方法。
(項目２１７)
被験体において腫瘍のサイズを減少するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与することであって、ここで該細胞は、該腫瘍上の抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと；および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該被験体において該腫瘍のサイズを減少させること、
を包含する方法。
(項目２１８)
第２のリガンドの投与前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、該リガンドの投与後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を決定することを包含する、項目２１４～２１７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２１９)
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、項目２１８に記載の方法。
(項目２２０)
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増加している、項目２１８に記載の方法。
(項目２２１)
前記被験体は、前記改変された細胞の投与前または前記改変された細胞の投与と同時に幹細胞移植を受けたことがある、項目２１１～２２０のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２２)
少なくとも１×１０６個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞は、前記被験体に投与される、項目２１１～２２１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２３)
少なくとも１×１０７個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞は、前記被験体に投与される、項目２１１～２２１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２４)
少なくとも１×１０８個の改変された細胞は、前記被験体に投与される、項目２１１～２２１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２５)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６であり、該ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、ＡＰ１９０３である、項目２１１～２２４のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２６)
被験体において移植された、改変された細胞の生存を調節するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与すること、および
ｂ） （ａ）の後に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する該改変された細胞のうちの９５％未満を殺滅するために有効な量で該被験体に投与すること、
を包含する方法。
(項目２２７)
（ｂ）の後に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの９５％未満を殺滅するために有効な量で前記被験体に投与することをさらに包含する、項目２１１～２２５のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２８)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの４０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２９)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの５０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３０)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの６０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。(項目２３１)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの７０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３２)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの９０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。(項目２３３)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３４)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９５％を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３５)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＦＲＢＬ領域を含む、項目２２６～２２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３６)
前記リガンドの１より多くの用量は、前記被験体に投与される、項目２２１～２２５のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３７)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドの１より多くの用量は、前記被験体に投与される、項目２２６～２３６のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３８)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へ前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体への該リガンドのその後の投与量を維持するか、あるいは該被験体への該リガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目２１１～２３６のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３９)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を含む情報を受け取ること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へ前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体への該リガンドのその後の投与量を維持するか、あるいは該被験体への該リガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目２１１～２３６のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４０)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて該被験体に前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を調整する意思決定者に、該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージを伝達すること、
をさらに包含する、項目２１１～２３６のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４１)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて該被験体に前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝達すること、
をさらに包含する、項目２１１～２３６のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４２)
前記被験体はがんを有する、項目２１１～２４１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４３)
前記改変された細胞は、腫瘍床に送達される、項目２１１～２４１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４４)
前記がんは、前記被験体の血液または骨髄に存在する、項目２４２または２４３のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４５)
前記被験体は、血液または骨髄の疾患を有する、項目２１１～２４１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４６)
前記被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、項目２１１～２４１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４７)
前記患者は、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン異常症、代謝状態、および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、項目２１１～２４１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４８)
前記患者は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ－１０欠損症／ＩＬ－１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、および大理石骨病からなる群より選択される疾患または状態と診断されている、項目２１１～２４１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４９)
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸であって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
ｂ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）ポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および
ｃ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、
を含む、核酸。
(項目２５０)
領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｃ）、（ｂ）、（ａ）である、項目２４９に記載の核酸。
(項目２５１)
領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）である、項目２４９に記載の核酸。
(項目２５２)
（ｂ）および（ｃ）は、前記アポトーシス促進ポリペプチドに対してアミノ末端側にある、項目２５０または２５１のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２５３)
（ｂ）および（ｃ）は、前記アポトーシス促進ポリペプチドに対してカルボキシル末端側にある、項目２５０または２５１のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２５４)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の間にリンカーポリペプチドをさらに含む、項目２５９～２５３のいずれか１項に記載の核酸。(項目２５５)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも１００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目２４９～２５４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２５６)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも５００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目２４９～２５４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２５７)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも１０００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目２４９～２５４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２５８)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントは、アミノ酸残基３６でのアミノ酸置換を含む、項目２４９～２５７のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２５９)
３６位での前記アミノ酸置換は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される、項目２５８に記載の核酸。
(項目２６０)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域である、項目２４９～２５９のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６１)
前記リガンドは、リミズシドである、項目２５５～２６０のいずれか１項に記載の核酸。(項目２６２)
前記リガンドは、ＡＰ２０１８７またはＮ１５１０である、項目２５５～２６０のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６３)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｃ７ラパログに結合する、項目２４９～２６２のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６４)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｔ２０９８位またはＷ２１０１位においてアミノ酸置換を含む、項目２４９～２６３のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６５)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）（ＦＲＢＬ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、項目２４９～２６４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６６)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＦＲＢＬである、項目２４９～２６５のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６７)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、Ｓ－ｏ，ｐ－ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）－ラパマイシン、Ｒ－イソプロポキシラパマイシン、Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシンおよびＳ－ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択されるラパログに結合する、項目２４９～２６６のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６８)
前記プロモーターは、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、ここで該第２のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目２４９～２６７のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６９)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目２６８に記載の核酸。
(項目２７０)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目２６８に記載の核酸。
(項目２７１)
前記核酸は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目２４９～２６８のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２７２)
前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、項目２７１に記載の核酸。
(項目２７３)
前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、項目２６９、または２７１～２７２のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２７４)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、Ｓｙｋポリペプチド、ＺＡＰ７０ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目２７３に記載の核酸。
(項目２７５)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目２７３に記載の核酸。
(項目２７６)
前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、項目２７３～２７５のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２７７)
前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、項目２７３～２７６のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２７８)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目２７３～２７７のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２７９)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目２７３～２７７のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８０)
前記組換えＴ細胞レセプターは、ＰＲＡＭＥ、Ｂｏｂ－１、およびＮＹ－ＥＳＯ－１からなる群より選択される抗原性ポリペプチドに結合する、項目２７０～２７２のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８１)
ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含むキメラ共刺激ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目２４９～２８０のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８２)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチドをさらに含む、項目２８１に記載の核酸。
(項目２８３)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、膜標的化領域をさらに含む、項目２８１～２８２のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８４)
前記膜標的化領域は、ミリストイル化領域を含む、項目２８３に記載の核酸。
(項目２８５)
前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４もしくは３０５のアミノ酸配列、またはこれらの機能的フラグメントを有する、項目２８２～２８４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８６)
前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目２８２～２８４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８７)
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目２８２～２８６のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８８)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｃｌ－２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１－ＲＨＩＭからなる群より選択される、項目２４９～２８７のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８９)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、項目２４９～２８８のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２９０)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ－９ポリペプチドである、項目２８９に記載の核酸。
(項目２９１)
前記カスパーゼ－９ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠く、項目２９０に記載の細胞の核酸。
(項目２９２)
前記カスパーゼポリペプチドは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む、項目２８９または２９０のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２９３)
前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６の中の触媒として活性なカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、項目２８９～２９０のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２９４)
前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、項目２９４に記載の核酸。
(項目２９５)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチド、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域；およびＦＲＢＬポリペプチド領域を含む、項目２４９～２９４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２９６)
項目２４９～２９５のいずれか１項に記載の核酸によってコードされる、キメラアポトーシス促進ポリペプチド。
(項目２９７)
項目２４９～２９５のいずれか１項に記載の核酸でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
(項目２９８)
前記改変された細胞は、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む、項目２９７に記載の改変された細胞。
(項目２９９)
前記改変された細胞は、組換えＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む、項目２９７に記載の改変された細胞。
(項目３００)
前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、項目２９８に記載の改変された細胞。
(項目３０１)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、Ｓｙｋポリペプチド、ＺＡＰ７０ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目３００に記載の改変された細胞。
(項目３０２)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目３００に記載の改変された細胞。
(項目３０３)
前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、項目３００～３０２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３０４)
前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、項目３００～３０３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３０５)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目３００～３０４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３０６)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目３００～３０４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３０７)
前記組換えＴ細胞レセプターは、ＰＲＡＭＥ、Ｂｏｂ－１、およびＮＹ－ＥＳＯ－１からなる群より選択される抗原性ポリペプチドに結合する、項目２９９に記載の改変された細胞。
(項目３０８)
前記改変された細胞は、ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域をコードするポリヌクレオチドを含む、項目２９７に記載の改変された細胞。
(項目３０９)
前記改変された細胞は、キメラ共刺激ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチドをコードする、項目３０８に記載の改変された細胞。
(項目３１０)
前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４もしくは３０５のアミノ酸配列、またはこれらの機能的フラグメントを有する、項目３０８～３０９のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１１)
前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目３０８～３１０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１２)
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目３０９～３１１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１３)
前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１４)
前記細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１５)
前記細胞は、Ｔ細胞である、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１６)
前記細胞は、初代Ｔ細胞である、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１７)
前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１８)
前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１９)
前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２０)
前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２１)
前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２２)
前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２３)
前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２４)
前記細胞は、ヒト細胞である、項目２９７～３２３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２５)
前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、項目２９７～３２４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２６)
前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、項目２９７～３２５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２７)
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むキットまたは組成物であって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
ｂ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）ポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および
ｃ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、
を含む、キットまたは組成物。
(項目３２８)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントは、アミノ酸残基３６でのアミノ酸置換を含む、項目３２７に記載のキットまたは組成物。
(項目３２９)
３６位での前記アミノ酸置換は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される、項目３２８に記載のキットまたは組成物。
(項目３３０)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域である、項目３２７～３２９のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３１)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リミズシドに結合する、項目３２７～３３０ののいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３２)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＡＰ２０１８７またはＡＰ１５１０に結合する、項目３２７～３３１のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３３)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｃ７ラパログに結合する、項目３２７～３３２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３４)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｔ２０９８位またはＷ２１０１位においてアミノ酸置換を含む、項目３２７～３３３のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３５)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）（ＦＲＢＬ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、項目３２７～３３４のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３６)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＦＲＢＬである、項目３２７～３３５のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３７)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、Ｓ－ｏ，ｐ－ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）－ラパマイシン、Ｒ－イソプロポキシラパマイシン、Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシンおよびＳ－ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択されるラパログに結合する、項目３２７～３３６のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３８)
前記核酸は、項目２４９～Ｎ４１のいずれか１項に記載の核酸である、項目３２７～３３７のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３９)
キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現するための方法であって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および
ｃ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、
を含み、該方法は、項目２４９～２９５のいずれか１項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させることを含み、それによって該細胞は、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドおよび前記キメラ共刺激ポリペプチドを、該組み込まれた核酸から発現する方法。
(項目３４０)
前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、項目３３９に記載の方法。
(項目３４１)
前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、項目３３９に記載の方法。
(項目３４２)
被験体において移植された、改変された細胞の生存を調節するための方法であって、該方法は、
ａ）項目２９７～３２６のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に移植すること；および
ｂ） （ａ）の後に、該被験体に、
ｉ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＲＢもしくはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合する第１のリガンド；または
ｉｉ）該キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する第２のリガンド、
を投与することを含み、
ここで該第１のリガンドまたは該第２のリガンドは、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する該改変された細胞のうちの少なくとも３０％を殺滅するために有効な量で投与される、方法。
(項目３４３)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも４０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３４４)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも５０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３４５)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも６０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３４６)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも７０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３４７)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも８０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３４８)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３４９)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９５％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３５０)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９９％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３５１)
第１のリガンドまたは第２のリガンドを、キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがある被験体に投与するための方法であって、ここで該改変された細胞は、項目２４９～Ｎ４５のいずれか１項に記載の核酸を含み、ここで該第１のリガンドまたは該第２のリガンドは、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する該改変された細胞のうちの少なくとも３０％を殺滅するために有効な量で投与される、方法。
(項目３５２)
前記第１のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合し、前記第２のリガンドは、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する、項目３５１に記載の方法。
(項目３５３)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも４０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３５４)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも５０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３５５)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも６０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３５６)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも７０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３５７)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも８０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３５８)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３５９)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９５％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６０)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９９％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６１)
前記リガンドの１より多くの用量は、前記被験体に投与される、項目３４２～３６０のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６２)
前記第１のリガンドは、ラパマイシンまたはラパログである、項目３４２～３６１のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６３)
前記第１のリガンドは、Ｓ－ｏ，ｐ－ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）－ラパマイシン、Ｒ－イソプロポキシラパマイシン、Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシンおよびＳ－ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択されるラパログである、項目３６２に記載の方法。
(項目３６４)
前記第２のリガンドは、リミズシド、ＡＰ２０１８７、またはＡＰ１５１０である、項目３４２～３６０のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６５)
前記第２のリガンドは、リミズシドである、項目３６４に記載の方法。
(項目３６６)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの１より多くの用量が投与される、項目３４２～３６５のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６７)
前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドの両方が投与される、項目３４２～３６６のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６８)
改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へ前記第１のリガンドもしくは前記第２のリガンドを投与するか、または該被験体への該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体への該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目３４２～３６７のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６９)
トランスフェクトまたは形質導入された治療用細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体に前記第１のリガンドもしくは前記第２のリガンドが該被験体に投与されるべきか、または該被験体にその後に投与される該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドの投与量がモジュレートされるかどうかを決定すること、
をさらに包含する、項目３４２～３６７のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７０)
トランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を含む情報を受け取ること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へ前記第１のリガンドもしくは前記第２のリガンドを投与するか、該被験体への該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体への該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目３４２～３６９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７１)
トランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて該被験体に前記第１のリガンドもしくは前記第２のリガンドを投与するか、該被験体に投与される該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を調整する意思決定者に、該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージを伝達すること、
をさらに包含する、項目３４２～３６９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７２)
トランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体に前記第１のリガンドもしくは前記第２のリガンドを投与するか、該被験体に投与される該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を調整する指示を伝達すること、
をさらに包含する、項目３４２～３９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７３)
同種反応性の改変された細胞は、前記被験体に存在し、同種反応性の改変された細胞の数は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与後に少なくとも９０％減少する、項目３４２～３６９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７４)
少なくとも１×１０６個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞が、前記被験体に投与される、項目３４２～３６９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７５)
少なくとも１×１０７個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞が、前記被験体に投与される、項目３４２～３７３のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７６)
少なくとも１×１０８個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞が、前記被験体に投与される、項目３４２～３７３のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７７)
前記被験体における移植片対宿主病の存在、非存在またはステージを同定すること、および
該被験体において同定された該移植片対宿主病の存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体へ前記第１のリガンドもしくは前記第２のリガンドを投与するか、該被験体への該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体への該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目３４２～３７３のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７８)
改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがある被験体にリガンドを投与するための方法であって、該方法は、該リガンドを該被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、項目２９７～３２６のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該リガンドは、ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する、方法。
(項目３７９)
ラパマイシンまたはラパログを、改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがある被験体に投与するための方法であって、該方法は、ラパマイシンまたはラパログを該被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、項目２９７～３２６のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該ラパマイシンまたはラパログは、ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合する、方法。
(項目３８０)
前記リガンドは、ラパマイシン、ＡＰ２０１８７、およびＡＰ１５１０からなる群より選択される、項目３７８に記載の方法。
(項目３８１)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも３０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３４２～１７９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３８２)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも４０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８３)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも５０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８４)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも６０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８５)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも７０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８６)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも８０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８７)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも９０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８８)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも９５％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８９)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の９０分間以内に殺滅される、項目３８１～３８８のいずれか１項に記載の方法。
(項目３９０)
ａ）前記第１のリガンドが、前記被験体に投与され、続いて、前記第２のリガンドが投与されるか、または
ｂ）前記第２のリガンドが、前記被験体に投与され、続いて、前記第１のリガンドが投与される、
項目３４２～３８９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３９１)
前記被験体はヒトである、項目３４２～３９０のいずれか１項に記載の方法。
(項目３９２)
前記被験体は、非ヒト霊長類、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、鳥類および魚類からなる群より選択される、項目３４２～３９１のいずれか１項に記載の方法。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチド、またはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域（ＦＫＢＰ１２ｖ）；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域ならびに
ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；または
ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
(項目２)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域およびＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、項目１に記載の改変された細胞。
(項目３)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、項目１に記載の改変された細胞。
(項目４)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域、および（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、項目１～３のいずれかに記載の改変された細胞。
(項目５)
前記細胞は、異種タンパク質をコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む、項目１～５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目６に記載の改変された細胞。
(項目７)
前記異種タンパク質は、組換えＴ細胞レセプターである、項目７に記載の改変された細胞。
(項目８)
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチド、またはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域（ＦＫＢＰ１２ｖ）；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、ならびに
ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；または
ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
(項目９)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域、ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域、およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、項目８に記載の核酸。
(項目１０)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、項目８～９のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１１)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、項目８～９のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１２)
前記プロモーターは、第３のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、ここで該第３のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目８～１１のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１３)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目１２に記載の核酸。
(項目１４)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目１２に記載の核酸。
(項目１５)
前記核酸は、前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１のポリヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目８～１４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１６)
前記核酸は、前記第３のポリヌクレオチドと前記第１のポリヌクレオチドまたは前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第３のポリヌクレオチドの翻訳生成物を、該第１のポリヌクレオチドまたは該第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物から分断する、項目１５に記載の核酸。
(項目１７)
前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、項目１５または１６のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１８)
項目８～１７のいずれか１項に記載の核酸で形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞。
(項目１９)
前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域および前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記アポトーシス促進ポリペプチドに対してアミノ末端側にある、項目１～１８のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２０)
前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に対してアミノ末端側にある、項目１９に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２１)
前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に対してアミノ末端側にある、項目１９に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２２)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも１００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目１～２１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２３)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも５００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目１～２１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２４)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも１０００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目１～２１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２５)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチドは、アミノ酸残基３６でのアミノ酸置換を含む、項目１～２４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２６)
３６位での前記アミノ酸置換は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される、項目２５に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２７)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域である、項目１～２１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２８)
前記リガンドは、リミズシドである、項目２２～２４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目２９)
前記リガンドは、ＡＰ２０１８７またはＡＰ１５１０である、項目２２４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３０)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｃ７ラパログに結合する、項目１～２９のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３１)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｔ２０９８位またはＷ２１０１位においてアミノ酸置換を含む、項目１～３０のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３２)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）（ＦＲＢＬ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、項目１～３１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３３)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＦＲＢＬである、項目１～３２のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３４)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、Ｓ－ｏ，ｐ－ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）－ラパマイシン、Ｒ－イソプロポキシラパマイシン、Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシンおよびＳ－ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択されるラパログに結合する、項目１～３３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３５)
前記細胞または前記核酸は、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、項目１～３４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３６)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、Ｓｙｋポリペプチド、ＺＡＰ７０ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目３３に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３７)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目３３に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３８)
前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、項目３５～３７１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目３９)
前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、項目３５～３８のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４０)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目３５～３９のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４１)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目３５～３０のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４２)
前記細胞は、組換えＴ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該組換えＴ細胞レセプターは、ＰＲＡＭＥ、Ｂｏｂ－１、およびＮＹ－ＥＳＯ－１からなる群より選択される抗原性ポリペプチドに結合する、項目１～３４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目４３)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｃｌ－２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１－ＲＨＩＭからなる群より選択される、項目１～４２のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４４)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、項目１～４３のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４５)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ－９ポリペプチドである、項目４４に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４６)
前記カスパーゼ－９ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠く、項目４５に記載の核酸または細胞。
(項目４７)
前記カスパーゼポリペプチドは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む、項目４５または４６のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４８)
前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６の中の触媒として活性なカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、項目４４～４７のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目４９)
前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、項目４８に記載の改変された細胞または核酸。
(項目５０)
前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４もしくは３０５のアミノ酸配列、またはこれらの機能的フラグメントを有する、項目１～４９のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目５１)
前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目１～４９のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目５２)
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目１～５１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。(項目５３)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチド、ＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域および２個のＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含む、
項目１に記載の改変された細胞。
(項目５４)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチド、ＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および２個のＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含む、
項目１に記載の改変された細胞。
(項目５５)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチド、ＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域および２個のＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含む、
項目１９に記載の核酸。
(項目５６)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチド、ＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、および２個のＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含む、
項目１９に記載の核酸。
(項目５７)
前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目５８)
前記細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目５９)
前記細胞は、Ｔ細胞である、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６０)
前記細胞は、初代Ｔ細胞である、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６１)
前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６２)
前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６３)
前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６４)
前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６５)
前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６６)
前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６７)
前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、項目１～８、１８、または１９～３６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６８)
前記細胞は、ヒト細胞である、項目１～８、１８、１９～３６または５７～６７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目６９)
前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、項目１～８、１８、１９～３６または５７～６８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目７０)
前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、項目１～８、１８、１９～３６または５７～６９のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目７１)
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチド領域、またはそのバリアント；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域（ＦＫＢＰ１２ｖ）；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域ならびに
ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；または
ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む核酸を含む、キットまたは組成物。
(項目７２)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域、ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域、およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、項目７１に記載のキットまたは組成物。
(項目７３)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、項目７１～７２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目７４)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、項目７１～７２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目７５)
前記核酸は、項目８～１７、１９～２１２または５５～５６のいずれか１項に記載の核酸である、項目７１に記載のキットまたは組成物。
(項目７６)
第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該第３のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目７１～７５のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目７７)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目７２に記載のキットまたは組成物。
(項目７８)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目７２に記載のキットまたは組成物。
(項目７９)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドを含む、項目７１～７５のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目８０)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、および前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目７２～７８のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目８１)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目７２～７８のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目８２)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第２のポリヌクレオチドおよび前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目７２～７８のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目８３)
キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現するための方法であって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および
ｂ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域、
を含み、該方法は、
項目８～１７、１９～５２、または５５～５６のいずれか１項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させること、
を含み、それによって、該細胞が該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
(項目８４)
前記細胞は、キメラ共刺激ポリペプチドをさらに発現し、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域；ならびに
ｂ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、またはＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、項目８３に記載の方法。
(項目８５)
前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、項目８３または８４のいずれか１項に記載の方法。
(項目８６)
前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、項目８３または８４のいずれか１項に記載の方法。
(項目８７)
被験体において免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体へと移植すること、および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与して、細胞媒介性免疫応答を刺激すること、
を包含する方法。
(項目８８)
改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがある被験体にリガンドを投与するための方法であって、該方法は、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰバリアント領域に結合するリガンドを該ヒト被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を含む、方法。
(項目８９)
被験体において移植された、改変された細胞の活性を制御するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を移植すること；および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与して、該移植された、改変された細胞の活性を刺激すること、
を包含する方法。
(項目９０)
標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
ａ）有効量の改変された細胞を該被験体に投与することであって；ここで該改変された細胞は、項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと、および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与して、該被験体において標的抗原または標的細胞の数または濃度を低減すること、
を包含する方法。
(項目９１)
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目９０に記載の方法。
(項目９２)
標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
ａ）有効量の改変された細胞を該被験体に投与することであって、ここで該改変された細胞は、項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原を認識しかつ該標的抗原に結合する組換えＴ細胞レセプターを含む、こと、および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与して、該被験体において標的抗原または標的細胞の数または濃度を低減すること、
を包含する方法。
(項目９３)
被験体において腫瘍のサイズを減少させるための方法であって、該方法は、
ａ）項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与することであって、ここで該細胞は、該腫瘍上の抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと；および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与して、該被験体において該腫瘍のサイズを減少させること、
を包含する方法。
(項目９４)
第２のリガンドの投与前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、該リガンドの投与後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を決定することを包含する、項目９０～９３のいずれか１項に記載の方法。
(項目９５)
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、項目９４に記載の方法。
(項目９６)
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増加している、項目９４に記載の方法。
(項目９７)
前記被験体は、前記改変された細胞の投与前または前記改変された細胞の投与と同時に幹細胞移植を受けたことがある、項目８７～９６のいずれか１項に記載の方法。
(項目９８)
少なくとも１×１０６個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞は、前記被験体に投与される、項目８７～９７のいずれか１項に記載の方法。
(項目９９)
少なくとも１×１０７個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞は、前記被験体に投与される、項目８７～９７のいずれか１項に記載の方法。
(項目１００)
少なくとも１×１０８個の改変された細胞は、前記被験体に投与される、項目８７～９７のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０１)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６であり、該ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、ＡＰ１９０３である、項目８７～１００のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０２)
被験体において移植された、改変された細胞の生存を調節するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１～８、１８、１９～３６、または５７～７０のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に移植すること；および
ｂ） ａ）の後に、該被験体に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する該改変された細胞のうちの少なくとも３０％を殺滅するために有効な量で投与すること、
を包含する方法。
(項目１０３)
ｂ）の後に、前記被験体に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも３０％を殺滅するために有効な量で投与すること、をさらに包含する、項目８７～１０２のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０４)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも４０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０３に記載の方法。
(項目１０５)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも５０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０６)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも６０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０７)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも７０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０８)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも８０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１０９)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１０)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９５％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１１)
前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９９％を殺滅するために有効な量で投与される、項目１０２または１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１２)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＦＲＢＬ領域を含む、項目１０２～１０３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１３)
前記リガンドの１より多くの用量は、前記被験体に投与される、項目８７～１０１のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１４)
前記ラパマイシンまたはラパログの１より多くの用量は、前記被験体に投与される、項目１０２～１１３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１５)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；ならびに
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へラパマイシンもしくはラパログを投与するか、該被験体へのラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持するか、または該被験体への該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目８７～１１３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１６)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を含む情報を受け取ること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へ前記ラパマイシンもしくはラパログを投与するか、該被験体へのラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持するか、または該被験体へのラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目８７～１１３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１７)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて該被験体にラパマイシンもしくは前記ラパログを投与するか、該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整する意思決定者に、該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージを伝達すること、
をさらに包含する、項目８７～１１３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１８)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体に前記ラパマイシンもしくは前記ラパログを投与するか、該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整する指示を伝達すること、
をさらに包含する、項目８７～１１３のいずれか１項に記載の方法。
(項目１１９)
前記被験体はがんを有する、項目８７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２０)
前記改変された細胞は、腫瘍床に送達される、項目８７～１１９のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２１)
前記がんは、前記被験体の血液または骨髄に存在する、項目１１９または１２０のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２２)
前記被験体は、血液または骨髄の疾患を有する、項目８７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２３)
前記被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、項目８７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２４)
前記患者は、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン異常症、代謝状態、および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、項目８７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２５)
前記患者は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ－１０欠損症／ＩＬ－１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、および大理石骨病からなる群より選択される疾患または状態と診断されている、項目８７～１１８のいずれか１項に記載の方法。
(項目１２６)
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；および
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域；および
ｉｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、またはＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
(項目１２７)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、項目１２６に記載の改変された細胞。
(項目１２８)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、項目１２６に記載の改変された細胞。
(項目１２９)
前記細胞は、第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該第３のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目１２６～１２８のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１３０)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目１２９に記載の改変された細胞。
(項目１３１)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目１２９に記載の改変された細胞。
(項目１３２)
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；および
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ｉ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；および
ｉｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、またはＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域おとびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド
に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸。
(項目１３３)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、項目１３２に記載の核酸。
(項目１３４)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、項目１３２に記載の核酸。
(項目１３５)
前記プロモーターは、第３のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、ここで該第３のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目１３２～１３４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１３６)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目１３５に記載の核酸。
(項目１３７)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目１３５に記載の核酸。
(項目１３８)
前記核酸は、前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１のポリヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目１３２～１３７のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１３９)
前記核酸は、前記第３のポリヌクレオチドと前記第１のポリヌクレオチドまたは前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第３のポリヌクレオチドの翻訳生成物を、該第１のポリヌクレオチドまたは該第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物から分断する、項目１３８に記載の核酸。
(項目１４０)
前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、項目１３８または１３９のいずれか１項に記載の核酸。
(項目１４１)
項目１３２～１４０のいずれか１項に記載の核酸で形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞。
(項目１４２)
前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域および前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域は、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＭｙＤ８８ポリペプチドまたは短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドに対してアミノ末端側にある、項目１２６～１４１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４３)
前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に対してアミノ末端側にある、項目１４２に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４４)
前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域は、前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に対してアミノ末端側にある、項目１４２に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４５)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも１００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目１２６～１４４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４６)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも５００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目１２６～１４４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４７)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも１０００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目１２６～１４４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４８)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチドは、アミノ酸残基３６でのアミノ酸置換を含む、項目１２６～１４７のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１４９)
３６位での前記アミノ酸置換は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される、項目１４８に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１５０)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域である、項目１２６～１４４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１５１)
前記リガンドは、リミズシドである、項目１４５～１４７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５２)
前記リガンドは、ＡＰ２０１８７である、項目１４５～１４７のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５３)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｃ７ラパログに結合する、項目１２６～１５２ののいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５４)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｔ２０９８位またはＷ２１０１位においてアミノ酸置換を含む、項目１２６～１５３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５５)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）（ＦＲＢＬ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、項目１２６～１５４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５６)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＦＲＢＬである、項目１２６～１５５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５７)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、Ｓ－ｏ，ｐ－ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）－ラパマイシン、Ｒ－イソプロポキシラパマイシン、Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシンおよびＳ－ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択されるラパログに結合する、項目１２６～１５６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１５８)
前記細胞または前記核酸は、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、項目１２６～１５７のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１５９)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、Ｓｙｋポリペプチド、ＺＡＰ７０ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、、項目１５８のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６０)
前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、項目１５８または１５９のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６１)
前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、項目１５８～１６０のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６２)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目１５８～１６１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６３)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目１５８～１６２のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６４)
前記細胞は、組換えＴ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該組換えＴ細胞レセプターは、ＰＲＡＭＥ、Ｂｏｂ－１、およびＮＹ－ＥＳＯ－１からなる群より選択される抗原性ポリペプチドに結合する、項目１２６～１５７のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６５)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｃｌ－２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１－ＲＨＩＭからなる群より選択される、項目１２６～１６４のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６６)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、項目１２６～１６５のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６７)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ－９ポリペプチドである、項目１６６に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１６８)
前記カスパーゼ－９ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠く、項目１６７に記載の核酸または細胞。
(項目１６９)
前記カスパーゼポリペプチドは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む、項目１６７または１６８のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１７０)
前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６の中の触媒として活性なカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、項目１６６～１６８のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１７１)
前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、項目１７０に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１７２)
前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４もしくは３０５のアミノ酸配列、またはこれらの機能的フラグメントを有する、項目１２６～１７１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１７３)
前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目１２６～１７１のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１７４)
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目１２６～１７３のいずれか１項に記載の改変された細胞または核酸。
(項目１７５)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチドおよびＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、
項目１２６に記載の改変された細胞。
(項目１７６)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチドおよびＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、ＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、
項目１２６に記載の改変された細胞。
(項目１７７)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチドおよびＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、
項目１４２に記載の核酸。
(項目１７８)
ａ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチドおよびＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域を含み；そして
ｂ）前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、ＦＲＢＬポリペプチド領域およびＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域を含む、
項目１４２に記載の核酸。
(項目１７９)
前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目１２６～１３１、１４１、または１４２～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。(項目１８０)
前記細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８１)
前記細胞は、Ｔ細胞である、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８２)
前記細胞は、初代Ｔ細胞である、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８３)
前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８４)
前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８５)
前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８６)
前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される．項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８７)
前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８８)
前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１８９)
前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１９０)
前記細胞は、ヒト細胞である、項目１２６～１３１または１４１～１７６のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１９１)
前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、項目１２６～１３１、１４１～１７６または１７９～１９０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１９２)
前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、項目１２６～１３１、１４１～１７４または１７９～１９０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目１９３)
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；および
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、
を含む第１のポリヌクレオチド；ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ｉ）ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；および
ｉｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、またはＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む第２のポリヌクレオチド、
を含む核酸を含む、キットまたは組成物。
(項目１９４)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、項目１９３に記載のキットまたは組成物。
(項目１９５)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域を含む、項目１９３～１９４のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目１９６)
第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該第３のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目１９３～１９５のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目１９７)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目１９６に記載のキットまたは組成物。
(項目１９８)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目１９６に記載のキットまたは組成物。(項目１９９)
前記核酸は、項目１３２～１３９、１４２～１７４、または１７７～１７８のいずれか１項に記載の核酸である、項目１９３に記載のキットまたは組成物。
(項目２００)
第３のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該第３のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目１９３～１９９のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目２０１)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目２００に記載のキットまたは組成物。
(項目２０２)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目２００に記載のキットまたは組成物。(項目２０３)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドを含む、項目１９４～１９９のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目２０４)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、および前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目１９９～２０２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目２０５)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目２００～２０２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目２０６)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第２のポリヌクレオチドおよび前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目２００～２０２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目２０７)
ウイルスを含み、ここで該ウイルスは、前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、および前記第３のポリヌクレオチドを含む、項目２００～２０２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目２０８)
キメラアポトーシス促進ポリペプチドおよびキメラ共刺激ポリペプチドを発現させるための方法であって、ここで
ａ）該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；および
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、
を含み；そして
ｂ）該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；
ｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；および
ｉｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、またはＭｙＤ８８ポリペプチド領域もしくはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含み、該方法は、項目１３２～１３９、１４２～１７４、または１７７～１７８のいずれか１項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させることを含み、それによって、該細胞は、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドおよび該キメラ共刺激ポリペプチドを該組み込まれた核酸から発現する、方法。
(項目２０９)
前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、項目２０８に記載の方法。
(項目２１０)
前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、項目２０８に記載の方法。
(項目２１１)
被験体において免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に移植すること、および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、細胞媒介性免疫応答を刺激すること、
を包含する方法。
(項目２１２)
改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがある被験体にリガンドを投与するための方法であって、該方法は、ラパマイシンまたはラパログを該被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を含む、方法。
(項目２１３)
被験体において移植された、改変された細胞の活性を調節するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を移植すること；および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該移植された、改変された細胞の活性を刺激すること、
を包含する方法。
(項目２１４)
標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
ａ）有効量の改変された細胞を該被験体に移植することであって；ここで該改変された細胞は、項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと、および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該被験体における標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させること、
を包含する方法。
(項目２１５)
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、項目２１４に記載の方法。
(項目２１６)
標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
ａ）有効量の改変された細胞を該被験体に投与することであって、ここで該改変された細胞は、項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原を認識しかつ該標的抗原に結合する組換えＴ細胞レセプターを含む、こと、および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該被験体における標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させること、
を包含する方法。
(項目２１７)
被験体において腫瘍のサイズを減少するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与することであって、ここで該細胞は、該腫瘍上の抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと；および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該被験体において該腫瘍のサイズを減少させること、
を包含する方法。
(項目２１８)
第２のリガンドの投与前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、該リガンドの投与後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を決定することを包含する、項目２１４～２１７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２１９)
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、項目２１８に記載の方法。
(項目２２０)
前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増加している、項目２１８に記載の方法。
(項目２２１)
前記被験体は、前記改変された細胞の投与前または前記改変された細胞の投与と同時に幹細胞移植を受けたことがある、項目２１１～２２０のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２２)
少なくとも１×１０６個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞は、前記被験体に投与される、項目２１１～２２１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２３)
少なくとも１×１０７個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞は、前記被験体に投与される、項目２１１～２２１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２４)
少なくとも１×１０８個の改変された細胞は、前記被験体に投与される、項目２１１～２２１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２５)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６であり、該ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、ＡＰ１９０３である、項目２１１～２２４のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２６)
被験体において移植された、改変された細胞の生存を調節するための方法であって、該方法は、
ａ）項目１２６～１３１、１４１～１７６、または１７９～１９２のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に投与すること、および
ｂ） （ａ）の後に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する該改変された細胞のうちの９５％未満を殺滅するために有効な量で該被験体に投与すること、
を包含する方法。
(項目２２７)
（ｂ）の後に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの９５％未満を殺滅するために有効な量で前記被験体に投与することをさらに包含する、項目２１１～２２５のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２８)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの４０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２２９)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの５０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３０)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの６０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。(項目２３１)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの７０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３２)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの９０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。(項目２３３)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３４)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９５％を殺滅するために有効な量で投与される、項目２２６または２２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３５)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＦＲＢＬ領域を含む、項目２２６～２２７のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３６)
前記リガンドの１より多くの用量は、前記被験体に投与される、項目２２１～２２５のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３７)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する前記リガンドの１より多くの用量は、前記被験体に投与される、項目２２６～２３６のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３８)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へ前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体への該リガンドのその後の投与量を維持するか、あるいは該被験体への該リガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目２１１～２３６のいずれか１項に記載の方法。
(項目２３９)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を含む情報を受け取ること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へ前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体への該リガンドのその後の投与量を維持するか、あるいは該被験体への該リガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目２１１～２３６のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４０)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて該被験体に前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を調整する意思決定者に、該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージを伝達すること、
をさらに包含する、項目２１１～２３６のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４１)
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて該被験体に前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝達すること、
をさらに包含する、項目２１１～２３６のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４２)
前記被験体はがんを有する、項目２１１～２４１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４３)
前記改変された細胞は、腫瘍床に送達される、項目２１１～２４１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４４)
前記がんは、前記被験体の血液または骨髄に存在する、項目２４２または２４３のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４５)
前記被験体は、血液または骨髄の疾患を有する、項目２１１～２４１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４６)
前記被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、項目２１１～２４１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４７)
前記患者は、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン異常症、代謝状態、および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、項目２１１～２４１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４８)
前記患者は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ－１０欠損症／ＩＬ－１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、および大理石骨病からなる群より選択される疾患または状態と診断されている、項目２１１～２４１のいずれか１項に記載の方法。
(項目２４９)
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸であって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
ｂ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）ポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および
ｃ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、
を含む、核酸。
(項目２５０)
領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｃ）、（ｂ）、（ａ）である、項目２４９に記載の核酸。
(項目２５１)
領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）である、項目２４９に記載の核酸。
(項目２５２)
（ｂ）および（ｃ）は、前記アポトーシス促進ポリペプチドに対してアミノ末端側にある、項目２５０または２５１のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２５３)
（ｂ）および（ｃ）は、前記アポトーシス促進ポリペプチドに対してカルボキシル末端側にある、項目２５０または２５１のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２５４)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の間にリンカーポリペプチドをさらに含む、項目２５９～２５３のいずれか１項に記載の核酸。(項目２５５)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも１００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目２４９～２５４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２５６)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも５００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目２４９～２５４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２５７)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リガンドが野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域に結合するより少なくとも１０００倍高い親和性で該リガンドに結合する、項目２４９～２５４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２５８)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントは、アミノ酸残基３６でのアミノ酸置換を含む、項目２４９～２５７のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２５９)
３６位での前記アミノ酸置換は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される、項目２５８に記載の核酸。
(項目２６０)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域である、項目２４９～２５９のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６１)
前記リガンドは、リミズシドである、項目２５５～２６０のいずれか１項に記載の核酸。(項目２６２)
前記リガンドは、ＡＰ２０１８７またはＮ１５１０である、項目２５５～２６０のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６３)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｃ７ラパログに結合する、項目２４９～２６２のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６４)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｔ２０９８位またはＷ２１０１位においてアミノ酸置換を含む、項目２４９～２６３のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６５)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）（ＦＲＢＬ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、項目２４９～２６４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６６)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＦＲＢＬである、項目２４９～２６５のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６７)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、Ｓ－ｏ，ｐ－ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）－ラパマイシン、Ｒ－イソプロポキシラパマイシン、Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシンおよびＳ－ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択されるラパログに結合する、項目２４９～２６６のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６８)
前記プロモーターは、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結され、ここで該第２のポリヌクレオチドは、異種タンパク質をコードする、項目２４９～２６７のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２６９)
前記異種タンパク質は、キメラ抗原レセプターである、項目２６８に記載の核酸。
(項目２７０)
前記異種タンパク質は、組換えＴＣＲである、項目２６８に記載の核酸。
(項目２７１)
前記核酸は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、項目２４９～２６８のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２７２)
前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、項目２７１に記載の核酸。
(項目２７３)
前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、項目２６９、または２７１～２７２のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２７４)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、Ｓｙｋポリペプチド、ＺＡＰ７０ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目２７３に記載の核酸。
(項目２７５)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目２７３に記載の核酸。
(項目２７６)
前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、項目２７３～２７５のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２７７)
前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、項目２７３～２７６のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２７８)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目２７３～２７７のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２７９)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目２７３～２７７のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８０)
前記組換えＴ細胞レセプターは、ＰＲＡＭＥ、Ｂｏｂ－１、およびＮＹ－ＥＳＯ－１からなる群より選択される抗原性ポリペプチドに結合する、項目２７０～２７２のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８１)
ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含むキメラ共刺激ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目２４９～２８０のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８２)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチドをさらに含む、項目２８１に記載の核酸。
(項目２８３)
前記キメラ共刺激ポリペプチドは、膜標的化領域をさらに含む、項目２８１～２８２のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８４)
前記膜標的化領域は、ミリストイル化領域を含む、項目２８３に記載の核酸。
(項目２８５)
前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４もしくは３０５のアミノ酸配列、またはこれらの機能的フラグメントを有する、項目２８２～２８４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８６)
前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目２８２～２８４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８７)
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目２８２～２８６のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８８)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｃｌ－２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１－ＲＨＩＭからなる群より選択される、項目２４９～２８７のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２８９)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、項目２４９～２８８のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２９０)
前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ－９ポリペプチドである、項目２８９に記載の核酸。
(項目２９１)
前記カスパーゼ－９ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠く、項目２９０に記載の細胞の核酸。
(項目２９２)
前記カスパーゼポリペプチドは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む、項目２８９または２９０のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２９３)
前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６の中の触媒として活性なカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、項目２８９～２９０のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２９４)
前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、項目２９４に記載の核酸。
(項目２９５)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠くカスパーゼ－９ポリペプチド、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域；およびＦＲＢＬポリペプチド領域を含む、項目２４９～２９４のいずれか１項に記載の核酸。
(項目２９６)
項目２４９～２９５のいずれか１項に記載の核酸によってコードされる、キメラアポトーシス促進ポリペプチド。
(項目２９７)
項目２４９～２９５のいずれか１項に記載の核酸でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
(項目２９８)
前記改変された細胞は、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む、項目２９７に記載の改変された細胞。
(項目２９９)
前記改変された細胞は、組換えＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む、項目２９７に記載の改変された細胞。
(項目３００)
前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、項目２９８に記載の改変された細胞。
(項目３０１)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、Ｓｙｋポリペプチド、ＺＡＰ７０ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目３００に記載の改変された細胞。
(項目３０２)
前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、項目３００に記載の改変された細胞。
(項目３０３)
前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、項目３００～３０２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３０４)
前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、項目３００～３０３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３０５)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目３００～３０４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３０６)
前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、項目３００～３０４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３０７)
前記組換えＴ細胞レセプターは、ＰＲＡＭＥ、Ｂｏｂ－１、およびＮＹ－ＥＳＯ－１からなる群より選択される抗原性ポリペプチドに結合する、項目２９９に記載の改変された細胞。
(項目３０８)
前記改変された細胞は、ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域をコードするポリヌクレオチドを含む、項目２９７に記載の改変された細胞。
(項目３０９)
前記改変された細胞は、キメラ共刺激ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、ＭｙＤ８８ポリペプチドまたはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、およびＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチドをコードする、項目３０８に記載の改変された細胞。
(項目３１０)
前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４もしくは３０５のアミノ酸配列、またはこれらの機能的フラグメントを有する、項目３０８～３０９のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１１)
前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目３０８～３１０のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１２)
前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目３０９～３１１のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１３)
前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１４)
前記細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１５)
前記細胞は、Ｔ細胞である、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１６)
前記細胞は、初代Ｔ細胞である、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１７)
前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１８)
前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３１９)
前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２０)
前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２１)
前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２２)
前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２３)
前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、項目２９７～３１２のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２４)
前記細胞は、ヒト細胞である、項目２９７～３２３のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２５)
前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、項目２９７～３２４のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２６)
前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、項目２９７～３２５のいずれか１項に記載の改変された細胞。
(項目３２７)
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むキットまたは組成物であって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
ｂ）ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）ポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および
ｃ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、
を含む、キットまたは組成物。
(項目３２８)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントは、アミノ酸残基３６でのアミノ酸置換を含む、項目３２７に記載のキットまたは組成物。
(項目３２９)
３６位での前記アミノ酸置換は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される、項目３２８に記載のキットまたは組成物。
(項目３３０)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド領域である、項目３２７～３２９のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３１)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、リミズシドに結合する、項目３２７～３３０ののいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３２)
前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域は、ＡＰ２０１８７またはＡＰ１５１０に結合する、項目３２７～３３１のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３３)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｃ７ラパログに結合する、項目３２７～３３２のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３４)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチドは、Ｔ２０９８位またはＷ２１０１位においてアミノ酸置換を含む、項目３２７～３３３のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３５)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）（ＦＲＢＬ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、項目３２７～３３４のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３６)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、ＦＲＢＬである、項目３２７～３３５のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３７)
前記ＦＲＢバリアントポリペプチド領域は、Ｓ－ｏ，ｐ－ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）－ラパマイシン、Ｒ－イソプロポキシラパマイシン、Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシンおよびＳ－ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択されるラパログに結合する、項目３２７～３３６のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３８)
前記核酸は、項目２４９～Ｎ４１のいずれか１項に記載の核酸である、項目３２７～３３７のいずれか１項に記載のキットまたは組成物。
(項目３３９)
キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現するための方法であって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域；および
ｃ）ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域、
を含み、該方法は、項目２４９～２９５のいずれか１項に記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させることを含み、それによって該細胞は、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドおよび前記キメラ共刺激ポリペプチドを、該組み込まれた核酸から発現する方法。
(項目３４０)
前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、項目３３９に記載の方法。
(項目３４１)
前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、項目３３９に記載の方法。
(項目３４２)
被験体において移植された、改変された細胞の生存を調節するための方法であって、該方法は、
ａ）項目２９７～３２６のいずれか１項に記載の改変された細胞を該被験体に移植すること；および
ｂ） （ａ）の後に、該被験体に、
ｉ）前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＲＢもしくはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合する第１のリガンド；または
ｉｉ）該キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する第２のリガンド、
を投与することを含み、
ここで該第１のリガンドまたは該第２のリガンドは、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する該改変された細胞のうちの少なくとも３０％を殺滅するために有効な量で投与される、方法。
(項目３４３)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも４０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３４４)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも５０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３４５)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも６０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３４６)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも７０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３４７)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも８０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３４８)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３４９)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９５％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３５０)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９９％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３４２に記載の方法。
(項目３５１)
第１のリガンドまたは第２のリガンドを、キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがある被験体に投与するための方法であって、ここで該改変された細胞は、項目２４９～Ｎ４５のいずれか１項に記載の核酸を含み、ここで該第１のリガンドまたは該第２のリガンドは、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する該改変された細胞のうちの少なくとも３０％を殺滅するために有効な量で投与される、方法。
(項目３５２)
前記第１のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合し、前記第２のリガンドは、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する、項目３５１に記載の方法。
(項目３５３)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも４０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３５４)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも５０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３５５)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも６０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３５６)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも７０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３５７)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも８０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３５８)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３５９)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９５％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６０)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９９％を殺滅するために有効な量で投与される、項目３５１～３５２のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６１)
前記リガンドの１より多くの用量は、前記被験体に投与される、項目３４２～３６０のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６２)
前記第１のリガンドは、ラパマイシンまたはラパログである、項目３４２～３６１のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６３)
前記第１のリガンドは、Ｓ－ｏ，ｐ－ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）－ラパマイシン、Ｒ－イソプロポキシラパマイシン、Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシンおよびＳ－ブタンスルホンアミドラプからなる群より選択されるラパログである、項目３６２に記載の方法。
(項目３６４)
前記第２のリガンドは、リミズシド、ＡＰ２０１８７、またはＡＰ１５１０である、項目３４２～３６０のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６５)
前記第２のリガンドは、リミズシドである、項目３６４に記載の方法。
(項目３６６)
前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの１より多くの用量が投与される、項目３４２～３６５のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６７)
前記第１のリガンドおよび前記第２のリガンドの両方が投与される、項目３４２～３６６のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６８)
改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へ前記第１のリガンドもしくは前記第２のリガンドを投与するか、または該被験体への該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体への該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目３４２～３６７のいずれか１項に記載の方法。
(項目３６９)
トランスフェクトまたは形質導入された治療用細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体に前記第１のリガンドもしくは前記第２のリガンドが該被験体に投与されるべきか、または該被験体にその後に投与される該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドの投与量がモジュレートされるかどうかを決定すること、
をさらに包含する、項目３４２～３６７のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７０)
トランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を含む情報を受け取ること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へ前記第１のリガンドもしくは前記第２のリガンドを投与するか、該被験体への該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体への該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目３４２～３６９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７１)
トランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて該被験体に前記第１のリガンドもしくは前記第２のリガンドを投与するか、該被験体に投与される該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を調整する意思決定者に、該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージを伝達すること、
をさらに包含する、項目３４２～３６９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７２)
トランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体に前記第１のリガンドもしくは前記第２のリガンドを投与するか、該被験体に投与される該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を調整する指示を伝達すること、
をさらに包含する、項目３４２～３９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７３)
同種反応性の改変された細胞は、前記被験体に存在し、同種反応性の改変された細胞の数は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与後に少なくとも９０％減少する、項目３４２～３６９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７４)
少なくとも１×１０６個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞が、前記被験体に投与される、項目３４２～３６９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７５)
少なくとも１×１０７個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞が、前記被験体に投与される、項目３４２～３７３のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７６)
少なくとも１×１０８個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞が、前記被験体に投与される、項目３４２～３７３のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７７)
前記被験体における移植片対宿主病の存在、非存在またはステージを同定すること、および
該被験体において同定された該移植片対宿主病の存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体へ前記第１のリガンドもしくは前記第２のリガンドを投与するか、該被験体への該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体への該第１のリガンドもしくは該第２のリガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、項目３４２～３７３のいずれか１項に記載の方法。
(項目３７８)
改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがある被験体にリガンドを投与するための方法であって、該方法は、該リガンドを該被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、項目２９７～３２６のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該リガンドは、ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合する、方法。
(項目３７９)
ラパマイシンまたはラパログを、改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがある被験体に投与するための方法であって、該方法は、ラパマイシンまたはラパログを該被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、項目２９７～３２６のいずれか１項に記載の改変された細胞を含み、ここで該ラパマイシンまたはラパログは、ＦＲＢポリペプチドまたはＦＲＢバリアントポリペプチド領域に結合する、方法。
(項目３８０)
前記リガンドは、ラパマイシン、ＡＰ２０１８７、およびＡＰ１５１０からなる群より選択される、項目３７８に記載の方法。
(項目３８１)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも３０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３４２～１７９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３８２)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも４０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８３)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも５０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８４)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも６０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８５)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも７０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８６)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも８０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８７)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも９０％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８８)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも９５％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の２４時間以内に殺滅される、項目３８１に記載の方法。
(項目３８９)
前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する細胞のうちの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％は、前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドの投与の９０分間以内に殺滅される、項目３８１～３８８のいずれか１項に記載の方法。
(項目３９０)
ａ）前記第１のリガンドが、前記被験体に投与され、続いて、前記第２のリガンドが投与されるか、または
ｂ）前記第２のリガンドが、前記被験体に投与され、続いて、前記第１のリガンドが投与される、
項目３４２～３８９のいずれか１項に記載の方法。
(項目３９１)
前記被験体はヒトである、項目３４２～３９０のいずれか１項に記載の方法。
(項目３９２)
前記被験体は、非ヒト霊長類、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、鳥類および魚類からなる群より選択される、項目３４２～３９１のいずれか１項に記載の方法。
（詳細な説明）
外部環境からの情報を細胞の内部へと移すための機構として、制御されるタンパク質－タンパク質相互作用は、大部分の（全てではないものの）シグナル伝達経路をコントロールするように進化した。シグナル伝達は、酵素プロセス（例えば、アミノ酸側鎖リン酸化、アセチル化、または固有の特異性を欠くタンパク質分解性切断）によって左右される。さらに、多くのタンパク質または因子は、十分な基質／生成物関係の自発的な生成を排除してシグナル伝達を活性化もしくは伝播する細胞濃度でまたは細胞下位置で、存在する。活性化されたシグナル伝達の重要な構成成分は、適切な上流シグナルを介して経路を効率的に伝達する（または弱める）シグナル伝達「ノード」または空間的シグナル伝達センターへのこれら構成成分の動員である。
外部環境からの情報を細胞の内部へと移すための機構として、制御されるタンパク質－タンパク質相互作用は、大部分の（全てではないものの）シグナル伝達経路をコントロールするように進化した。シグナル伝達は、酵素プロセス（例えば、アミノ酸側鎖リン酸化、アセチル化、または固有の特異性を欠くタンパク質分解性切断）によって左右される。さらに、多くのタンパク質または因子は、十分な基質／生成物関係の自発的な生成を排除してシグナル伝達を活性化もしくは伝播する細胞濃度でまたは細胞下位置で、存在する。活性化されたシグナル伝達の重要な構成成分は、適切な上流シグナルを介して経路を効率的に伝達する（または弱める）シグナル伝達「ノード」または空間的シグナル伝達センターへのこれら構成成分の動員である。
個々のタンパク質－タンパク質相互作用および従って、個々のシグナル伝達タンパク質を人工的に単離および操作するためのツールとして、化学的に誘導される二量体化（ＣＩＤ）技術を開発して、標的タンパク質に対するホモタイプまたはヘテロタイプの相互作用を課して、天然の生物学的制御を再現した。その最も単純な形態では、単一のタンパク質を、１またはこれより多くの構造的に同一なリガンド結合ドメインを含むように改変する。次いで、これは、コグネイトホモ二量体リガンドの存在下で、それぞれ、ホモ二量体化またはオリゴマー化の基本となる（Ｓｐｅｎｃｅｒ ＤＭら （９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６２， １０１９－２４）。この概念のわずかにより複雑なバージョンは、１またはこれより多くの別個のリガンド結合ドメインを２個の異なるタンパク質に配置して、小分子、両方の別個のドメインに同時に結合するヘテロ二量体リガンドを使用してこれらシグナル伝達分子のヘテロ二量体化を可能にすることを包含する（Ｈｏ ＳＮら （９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８２， ８２２－６）。この薬物媒介性二量体化は、それらの誘導性のまたは自発的なアセンブリおよび制御を可能にするために［十分なリガンド結合ドメインタグ化構成成分の非常に高い局所濃度を生じる。
２６２， １０１９－２４）。この概念のわずかにより複雑なバージョンは、１またはこれより多くの別個のリガンド結合ドメインを２個の異なるタンパク質に配置して、小分子、両方の別個のドメインに同時に結合するヘテロ二量体リガンドを使用してこれらシグナル伝達分子のヘテロ二量体化を可能にすることを包含する（Ｈｏ ＳＮら （９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８２， ８２２－６）。この薬物媒介性二量体化は、それらの誘導性のまたは自発的なアセンブリおよび制御を可能にするために［十分なリガンド結合ドメインタグ化構成成分の非常に高い局所濃度を生じる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、タンパク質の多量体化を誘導するための方法である。この場合、タンデムにある２個またはこれより多くのヘテロ二量体リガンド結合領域（または「ドメイン」）は、上記ヘテロ二量体リガンドのための第２の結合部位の１またはこれより多くのコピーに融合される、第２のシグナル伝達ドメイン含有タンパク質を二量体化またはオリゴマー化するために「分子足場」として使用する。この分子足場は、リガンド結合ドメインの単離された多量体として（図８）、細胞内に局在するもしくは局在しないかのいずれかで（図８Ｂ、８Ｃ）発現され得るか、または構造的、シグナル伝達、細胞マーキング、またはより複雑な組み合わせ機能を提供する別のタンパク質に結合され得る（図９）。「足場」とは、少なくとも２個、例えば、２個もしくはこれより多くのヘテロ二量体リガンド結合領域を含むポリペプチドを意味する；ある種の例では、上記リガンド結合領域は、タンデムにある、すなわち、各リガンド結合領域は、その次のリガンド結合領域の直ぐ近位に位置している。他の例では、各リガンド結合領域は、その次のリガンド結合領域に対して近位に位置し得、例えば、約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個またはこれより多くのアミノ酸によって隔てられ得るが、二量体化剤の存在下で、誘導性カスパーゼ分子の二量体化の足場機能を保持する。足場は、例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはこれより多くのリガンド結合領域を含み得、別のポリペプチド（例えば、マーカーポリペプチド、共刺激分子、キメラ抗原レセプター、Ｔ細胞レセプターなどのような）にも連結され得る。
いくつかの実施形態において、上記第１のポリペプチドは、上記第１の多量体化領域の少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のユニットから本質的になる。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、上記足場領域から本質的になる。いくつかの実施形態において、上記第１のポリペプチドは、膜会合領域または膜標的化領域から本質的になる。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、上記足場ユニットまたは足場が、単独で存在し得るか、または上記足場の末端、もしくは上記ユニットの間のいずれかに、リンカーポリペプチドを必要に応じて含み得、そして必要に応じて、小さなポリペプチド（例えば、図１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、および１０Ｅに示されるとおりのステムポリペプチドなど）を含み得ることを意味する。
一例において、プロテインキナーゼｍＴＯＲに由来する約８９ａａ ＦＫ５０６－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインのタンデム多量体（Ｃｈｅｎ Ｊら （９５） ＰＮＡＳ， ９２， ４９４７－５１）は、ラパマイシンまたはラパマイシンベースのアナログ（「ラパログ」）の存在下で、複数のＦＫＢＰｖ３６融合カスパーゼ－９（ｉＣ９／ｉカスパーゼ－９）を動員するために使用される（Ｌｉｂｅｒｌｅｓ ＳＤ （９７） ＰＮＡＳ ９４， ７８２５－３０； Ｒｉｖｅｒａ ＶＭ （９６） Ｎａｔ Ｍｅｄ ２， １０２８－１０３２， Ｓｔａｎｋｕｎａｓ Ｋ （０３） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １２， １６１５－２４； Ｂａｙｌｅ ＪＨ （０６） Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｌ， １３， ９９－１０７）（図１～３）。この動員は、自発的なカスパーゼ二量体化および活性化をもたらす。
第２の例において、上記タンデムＦＲＢドメインは、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に融合され、これは、ラパログ駆動ｉＣ９活性化を両方の融合タンパク質を発現する細胞に提供する（図１５、挿入図）。
第３の例では、２個のタンパク質の極性は逆転し、それにより、２もしくはこれより多くのＦＫＢＰ１２のコピーが使用され、ラパマイシンの存在下で、ＦＲＢ改変されたシグナル伝達分子を動員および二量体化する（図８Ｃ、９Ａ）。
いくつかの例では、キメラポリペプチドは、単一のリガンド結合領域を含んでいてもよいし、または１個より多くのリガンド結合領域を含む足場が存在してもよく、ここで上記キメラポリペプチドは、例えば、ＭｙＤ８８ポリペプチド、短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、細胞質ＣＤ４０ポリペプチド、キメラＭｙＤ８８／細胞質ＣＤ４０ポリペプチドまたはキメラ短縮型ＭｙＤ８８／細胞質ＣＤ４０ポリペプチドなどのポリペプチドを含む。
ＭｙＤ８８またはＭｙＤ８８ポリペプチドとは、ｎｃｂｉ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４６１５として引用される骨髄系分化一次応答遺伝子８８（ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅ ８８）のポリペプチド生成物（例えば、ヒトバージョンが挙げられるが、これに限定されない）を意味する。「短縮型」とは、そのタンパク質が全長ではなくかつ例えば、ドメインを欠き得ることを意味する。例えば、短縮型ＭｙＤ８８は、全長ではなく、例えば、ＴＩＲドメインを失っていてもよい。短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドのアミノ酸配列の一例は、配列番号３０５として示される。「短縮型ＭｙＤ８８」をコードする核酸配列とは、短縮型ＭｙＤ８８ペプチドをコードする核酸配列を意味し、この用語はまた、クローニングの人工産物として付加される任意のアミノ酸（リンカーによってコードされる任意のアミノ酸を含む）をコードする部分を含む核酸配列に言及し得る。方法または構築物が、短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドに言及する場合、その方法がまた使用され得るか、またはその構築物は、別のＭｙＤ８８ポリペプチド（例えば、全長ＭｙＤ８８ポリペプチド）をいうためにデザインされ得ることは、理解される。方法または構築物が、全長ＭｙＤ８８ポリペプチドに言及する場合、その方法がまた使用され得るか、またはその構築物は、短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドに言及するためにデザインされ得る。
本明細書中の方法において、ペプチドのＣＤ４０部分は、ＭｙＤ８８または短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド部分から上流または下流のいずれかに位置し得る。
第４の例では、不安定なＦＲＢバリアント（例えば、ＦＲＢＬ２０９８）は、ラパログ投与の前に上記シグナル伝達分子を不安定化するために使用される（Ｓｔａｎｋｕｎａｓ
Ｋ （０３） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １２， １６１５－２４； Ｓｔａｎｋｕｎａｓ Ｋ （０７） ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ８， １１６２－６９） （図９、１０）。ラパログ曝露の後に、上記不安定な融合分子は安定化され、先のように、しかしより低いバックグラウンドシグナル伝達を伴う凝集をもたらす。
Ｋ （０３） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １２， １６１５－２４； Ｓｔａｎｋｕｎａｓ Ｋ （０７） ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ８， １１６２－６９） （図９、１０）。ラパログ曝露の後に、上記不安定な融合分子は安定化され、先のように、しかしより低いバックグラウンドシグナル伝達を伴う凝集をもたらす。
シグナル伝達タンパク質を指向するためにリガンドを使用することは、多くのシグナル伝達経路を活性化または減弱するために一般に適用され得る。アポトーシスまたはプログラム細胞死を一次標的としての「開始カスパーゼ」、カスパーゼ－９でコントロールすることによって、このアプローチの有用性を示す例が、本明細書で提供される。広く利用可能なラパマイシンまたはより専有のラパログでのアポトーシス促進タンパク質の二量体化によるアポトーシスのコントロールは、実験者または臨床医が望ましくない効果を示す細胞ベースの移植物（ｉｍｐｌａｎｔ）の生存率を厳密にかつ迅速にコントロールすることを可能にするはずである。これらの効果の例としては、オフターゲット組織または移植物の過剰なコントロールされない成長もしくは転移に対する移植片対宿主（ＧｖＨ）免疫応答が挙げられるが、これらに限定されない。アポトーシスの迅速な誘導は、望ましくない細胞の機能を厳密に減弱し、過度の炎症なく、貪食細胞（例えば、マクロファージ）によって死細胞の天然のクリアランスを可能にする。
アポトーシスは厳密に制御され、天然には、足場（例えば、Ａｐａｆ－１、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ、またはＦＡＤＤ／Ｍｏｒｔ１）を使用して、カスパーゼをオリゴマー化および活性化し、これは上記細胞を最終的には殺滅し得る。Ａｐａｆ－１は、アポトーシスプロテアーゼカスパーゼ－９を潜在性複合体へとアセンブリし得、この複合体は、次いで、シトクロムＣを上記足場へと動員する際に、活性オリゴマーアポプトソームを形成する。この重要な事象は、上記カスパーゼの二量体化および活性化を引き起こす、上記足場ユニットのオリゴマー化である。類似のアダプター（例えば、ＣＲＡＤＤ）は、カスパーゼ－２をオリゴマー化し得、アポトーシスをもたらす。本明細書で提供される組成物および方法は、例えば、上記リガンド結合ドメインＦＲＢまたはＦＫＢＰの多量体バージョンを使用して、ラパマイシンでの動員の際に、ＦＲＢまたはＦＫＢＰ融合物として存在するカスパーゼユニットの自発的二量体化および活性化を可能にする足場として働く。
本明細書中の実施例で提供されるある種の方法を使用すると、カスパーゼ活性化は、ラパマイシンまたはラパログが、ＦＲＢまたはＦＫＢＰ融合カスパーゼを上記足場へと補充するために存在する場合にのみ起こる。これらの方法において、上記ＦＲＢまたはＦＫＢＰポリペプチドは、ＦＫＢＰ－カスパーゼまたはＦＲＢ－カスパーゼの二量体化（ＦＲＢ－カスパーゼ－９がＦＫＢＰ－カスパーゼ－９と二量体化される場合を除く）を駆動するために、単量体としてではなく多量体ユニットとして存在しなければならない。上記ＦＲＢまたはＦＫＢＰベースの足場は、他のタンパク質との融合物として標的化した細胞において発現され得、足場として働いて、アポトーシス促進分子をアセンブリおよび活性化するその能力を保持する。上記ＦＲＢまたはＦＫＢＰ足場は、可溶性実体としてサイトゾル内に局在し得るか、または標的化シグナルを通じて特異的細胞下の場所（例えば、原形質膜）に存在し得る。アポトーシスを活性化するために使用される構成成分および上記細胞を分解する下流の構成成分は、全ての細胞によって、および種をわたって共有される。カスパーゼ－９活性化に関しては、これらの方法は、細胞株において、正常な初代細胞（例えば、Ｔ細胞などが挙げられるが、これらに限定されない）において、または細胞移植物において、広く利用され得る。
アポトーシスを指向するためにＦＲＢ－カスパーゼとＦＫＢＰ－カスパーゼをラパマイシンで直接二量体化するある種の例では、ＦＫＢＰ融合カスパーゼが、ホモ二量体化剤分子（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（例えば、ＡＰ１５１０、ＡＰ２０１８７またはＡＰ１
９０３）によって二量体化され得る（図６（右パネル）、１０Ａ（模式図）（類似のアポトーシス促進スイッチ（ｐｒｏａｐｏｔｏｔｉｃ ｓｗｉｔｃｈ）は、キメラタンパク質内のカスパーゼド
メインのホモ二量体化をもたらすＦＫＢＰ－カスパーゼ－９とともに、ＦＲＢ－カスパーゼ－９融合タンパク質の共発現によって、ラパマイシンまたはラパログを使用してバイナリースイッチのヘテロ二量体化を介して指向され得る（図８Ａ（模式図）、１０Ｂ（模式図）、（１１））ことが示された。
９０３）によって二量体化され得る（図６（右パネル）、１０Ａ（模式図）（類似のアポトーシス促進スイッチ（ｐｒｏａｐｏｔｏｔｉｃ ｓｗｉｔｃｈ）は、キメラタンパク質内のカスパーゼド
メインのホモ二量体化をもたらすＦＫＢＰ－カスパーゼ－９とともに、ＦＲＢ－カスパーゼ－９融合タンパク質の共発現によって、ラパマイシンまたはラパログを使用してバイナリースイッチのヘテロ二量体化を介して指向され得る（図８Ａ（模式図）、１０Ｂ（模式図）、（１１））ことが示された。
本明細書中で使用されるとき、請求項および／または明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用されるときの単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つの」を意味し得るが、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」および「１つもしくは１つより多くの」の意味とも一致する。なおもさらに、用語「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、相互交換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドな（ｏｐｅｎ ｅｎｄｅｄ）用語であると認識している。
以下の表は、この例および以下の例において論じられるスイッチの命名法および頭字語のうちのいくつかの性質を概説する。
本明細書中で使用される用語「同種異系」は、抗原的に異なるＨＬＡ遺伝子座またはＭＨＣ遺伝子座のことを指す。
したがって、同じ種から移植される細胞または組織は、抗原的に異なり得る。同系マウスは、１つ以上の遺伝子座が異なり得（コンジェニック）、同種異系マウスは、同じバックグラウンドを有し得る。
用語「抗原」は、本明細書で使用される場合、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生、または特異的な免疫学的に能力のある細胞の活性化のいずれか、または両方に関与し得る。
「抗原認識部分」は、抗原に結合する任意のポリペプチドまたはそのフラグメント、例えば、天然に由来するかまたは合成の抗体フラグメント可変ドメインなどであり得る。抗原認識部分の例としては、抗体に由来するポリペプチド、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；Ｔ細胞レセプターに由来するポリペプチド、例えば、ＴＣＲ可変ドメインなど；ならびに細胞外の同種タンパク質に結合する任意のリガンドまたはレセプターフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される用語「がん」は、そのユニークな特質である正常なコントロールの喪失が、制御されない成長、分化の欠如、局所的な組織浸潤および転移をもたらす、細胞の過剰増殖として定義される。例としては、メラノーマ、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺がん、肝細胞癌、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、歯肉がん、舌がん、神経芽細胞腫、頭部がん、頚部がん、乳がん、膵がん、前立腺がん、腎がん、骨がん、精巣がん、卵巣がん、中皮腫、子宮頸がん、消化器がん、リンパ腫、脳がん、結腸がん、肉腫または膀胱がんが挙げられるが、これらに限定されない。
ドナー：用語「ドナー」は、患者レシピエントではない哺乳動物（例えば、ヒト）を指す。上記ドナーは、例えば、上記レシピエントとＨＬＡ同一性を有し得るか、または上記レシピエントと部分的またはより大きなＨＬＡ不一致を有し得る。
ハプロタイプ一致：用語「ハプロタイプ一致」は、細胞を参照して使用される場合、本明細書での細胞タイプおよび／または細胞系統は、ハプロタイプを共有する細胞または１つの染色体上に密接に連鎖した遺伝子のセットにおいて実質的に同じ対立遺伝子を有する細胞を指す。ハプロタイプ一致ドナーは、上記レシピエントと完全なＨＬＡ同一性は有さず、部分的ＨＬＡ不一致が存在する。
血液疾患：本明細書中で使用される用語「血液疾患」、「血液疾患」および／または「血液の疾患」は、血液およびその成分（血液細胞、ヘモグロビン、血液タンパク質を含むが、これらに限定されない）の産生、凝固のメカニズム、血液の産生、血液タンパク質の産生などおよびそれらの組み合わせに影響する状態のことを指す。血液疾患の非限定的な例としては、貧血、白血病、リンパ腫、血液学的新生物、アルブミン血症（ａｌｂｕｍｉｎｅｍｉａｓ）、血友病などが挙げられる。
骨髄疾患：本明細書中で使用される用語「骨髄疾患」は、血液細胞および血小板の産生の減少をもたらす状態のことを指す。いくつかの骨髄疾患では、正常な骨髄の構造が、感染症（例えば、結核）または悪性疾患によって取って代わられ得、その後、血液細胞および血小板の産生の減少に至り得る。骨髄疾患の非限定的な例としては、白血病、細菌感染症（例えば、結核）、放射線宿酔または放射線中毒、汎血球減少症（ａｐｎｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、貧血、多発性骨髄腫などが挙げられる。
Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞（これがＣＤ３＋細胞を意味するものを包含する）：Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも称される）は、リンパ球と称される白血球の一群に属する。リンパ球は、一般に、細胞性免疫に関わる。「Ｔ細胞」における「Ｔ」とは、胸腺に由来する細胞またはその成熟が胸腺に影響される細胞のことを指す。Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプターとして知られる細胞表面タンパク質の存在によって、他のリンパ球のタイプ（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）と区別され得る。本明細書中で使用される用語「活性化Ｔ細胞」は、クラスＩＩ主要組織適合性（ＭＨＣ）マーカーにおいて提示された抗原決定基の認識によって免疫応答（例えば、活性化Ｔ細胞のクローン性増殖）をもたらすように刺激されたＴ細胞のことを指す。Ｔ細胞は、抗原決定基、サイトカインおよび／またはリンフォカインならびに分化クラスター細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８などおよびそれらの組み合わせ）の存在によって活性化される。差次的なタンパク質のクラスターを発現する細胞は、しばしば、Ｔ細胞表面上のそのタンパク質の発現について「陽性」であると言われる（例えば、ＣＤ３またはＣＤ４の発現について陽性の細胞は、ＣＤ３＋またはＣＤ４＋と称される）。ＣＤ３およびＣＤ４タンパク質は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達に直接的および／または間接的に関わり得る細胞表面レセプターまたはコレセプターである。
末梢血：本明細書中で使用される用語「末梢血」は、血液の循環プールから得られるかまたは調製され、リンパ系、脾臓、肝臓もしくは骨髄内に隔絶されない、血液の細胞成分（例えば、赤血球、白血球および血小板）のことを指す。
臍帯血：臍帯血は、末梢血、およびリンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔絶された血液とは異なる。交換可能に使用され得る用語「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｂｌｏｏｄ）」、「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｂｌｏｏｄ）」または「臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）」は、胎盤および出産後のつながったままの臍帯に残存する血液のことを指す。臍帯血は、造血細胞をはじめとした幹細胞を含むことが多い。
「細胞質ＣＤ４０」または「ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０」とは、ＣＤ４０細胞外ドメインを欠いているＣＤ４０ポリペプチドを意味する。いくつかの例では、この用語はまた、ＣＤ４０細胞外ドメインおよびＣＤ４０膜貫通ドメインのうちの一部または全ての両方を欠いているＣＤ４０ポリペプチドを指す。
例えば、細胞の場合におけるような「得られるかまたは調製される」は、細胞または細胞培養物が、その供給源から単離されること、精製されることまたは部分的に精製されることを意味し、ここで、その供給源は、例えば、臍帯血、骨髄または末梢血であり得る。これらの用語は、元の供給源または細胞培養物が培養され、細胞が複製される場合、および子孫細胞がその元の供給源に由来する場合にも適用され得る。
あるパーセントの細胞が殺傷される場合におけるような「殺滅する（ｋｉｌｌ）」または「殺滅する（ｋｉｌｌｉｎｇ）」は、アポトーシスを計測するための公知の任意の方法を使用して、および例えば、本明細書で論じられるアッセイ（例えば、本明細書で論じられるＳＥＡＰアッセイまたはＴ細胞アッセイなど）を使用して計測されるときの、アポトーシスによる細胞の死を意味する。この用語はまた、細胞除去を指し得る。
同種枯渇：用語「同種枯渇」とは、本明細書で使用される場合、同種反応性Ｔ細胞の選択的枯渇を指す。用語「同種反応性Ｔ細胞」とは、本明細書で使用される場合、外来細胞（例えば、移植された同種移植片におけるものなど）への曝露に対する反応において、免疫応答を生じるように活性化されたＴ細胞を指す。選択的枯渇は、一般に、免疫磁力を使用する除去、免疫毒素、フローソーティング、アポトーシスの誘導、光枯渇技術などまたはこれらの組み合わせのために、種々の細胞表面で発現されるマーカーまたはタンパク質（例えば、ときおり、分化クラスタータンパク質（ＣＤタンパク質）、ＣＤ１９など）を標的化することに関与する。本方法において、上記細胞は、同種枯渇の前または後に、キメラタンパク質コードベクターで形質導入またはトランスフェクトされ得る。また、上記細胞は、同種枯渇工程なしで、キメラタンパク質コードベクターで形質導入またはトランスフェクトされ得、非同種枯渇細胞は、患者に投与され得る。付加された「安全スイッチ」が原因で、例えば、非同種枯渇（または部分的にのみ同種枯渇された）Ｔ細胞を投与することは可能である。なぜなら有害事象、例えば、移植片対宿主病などは、上記多量体リガンドの投与の際に緩和され得るからである。
移植片対宿主病：用語「移植片対宿主病」または「ＧｖＨＤ」とは、同種骨髄移植としばしば関連し、そしてときおり、免疫不全患者への非照射血液の輸血と関連する合併症を指す。移植片対宿主病はときおり、移植された骨髄中の機能的免疫細胞が、レシピエントを「外来」として認識し、免疫応答を上昇させる場合に起こり得る。ＧｖＨＤは、急性形態および慢性形態へと分けられ得る。急性ＧＶＨＤ（ａＧＶＨＤ）はしばしば、移植または輸血後の最初の１００日以内に観察され、肝臓、皮膚、粘膜、免疫系（例えば、造血系、骨髄、胸腺など）、肺および消化管に影響を及ぼし得る。慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）はしばしば、移植または輸血後１００日またはそれより後に始まり、急性ＧｖＨＤと同じ器官を攻撃し得るが、結合組織および外分泌腺にも影響を及ぼし得る。皮膚の急性ＧｖＨＤは、びまん性斑丘疹状皮疹を、ときおり、レース模様で生じ得る。
ドナーＴ細胞：ここで使用される用語「ドナーＴ細胞」は、同種異系の幹細胞移植の後に抗ウイルス免疫および／または抗腫瘍免疫をもたらすためにレシピエントにしばしば投与されるＴ細胞のことを指す。ドナーＴ細胞は、骨髄移植片拒絶反応を阻害するためおよび同種異系生着（ａｌｌｏｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）の成功を増加させるために利用されることが多いが、しかしながら、同じドナーＴ細胞は、宿主抗原に対する同種異系攻撃反応（ａｌｌｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を引き起こし得、それはその後、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）をもたらし得る。ある特定の活性化ドナーＴ細胞は、他の活性化Ｔ細胞よりも高いまたは低いＧｖＨＤ反応を引き起こし得る。ドナーＴ細胞は、レシピエントの腫瘍細胞に対しても反応性であり得、有益な移植片対腫瘍効果を引き起こす。
間葉系ストローマ細胞：本明細書中で使用される用語「間葉系ストローマ細胞」または「骨髄由来間葉系ストローマ細胞」は、エキソビボ、インビトロおよびインビボにおいて脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞に分化し得、標準的な培養条件においてプラスチック培養皿に接着する単核骨髄細胞の一部としてさらに定義され得る、多分化能幹細胞のことを指し、造血系マーカーが陰性であり、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が陽性である。
胚性幹細胞：本明細書中で使用される用語「胚性幹細胞」は、５０～１５０個の細胞の初期胚である、胚盤胞の内部細胞塊に由来する、多能性幹細胞のことを指す。胚性幹細胞は、それ自体を無限に再生する能力、ならびに３つの一次胚葉である外胚葉、内胚葉および中胚葉のすべての誘導体に分化する能力を特徴とする。多能性細胞は、すべての細胞型を生み出せるが、多分化能細胞（例えば、成体幹細胞）は、限られた数の細胞型しか生み出せないという点で、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）は、多分化能（ｍｕｔｉｐｏｔｅｎｔ）と区別される。
誘導性多能性幹細胞：本明細書中で使用される用語「誘導性多能性幹細胞」または「人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞などの、すべての細胞型ではないが多くの細胞型に分化できる細胞を作製するように、遺伝的操作（例えば、後に多能性を活性化する遺伝子の発現）、生物学的操作（例えば、ウイルスまたはレトロウイルスによる処理）および／または化学的操作（例えば、小分子、ペプチドなど）によって「再プログラムされた」または誘導された、成体の細胞または分化細胞のことを指す。誘導性多能性幹細胞は、それらが、中間に分化したまたは最終分化した状況（例えば、皮膚細胞、骨細胞、線維芽細胞など）を達成し、次いで、脱分化するように誘導され、それにより、多分化能細胞または多能性細胞を作製する能力の一部または全部を回復するという点で胚性幹細胞と区別される。
ＣＤ３４＋細胞：本明細書中で使用される用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現している細胞のことを指す。本明細書中で使用される「ＣＤ３４」は、細胞間接着因子としてしばしば働き、リンパ節にＴ細胞が入ることに関与し、「分化クラスター」遺伝子ファミリーのメンバーである、細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）のことを指す。ＣＤ３４は、骨髄、細胞外マトリックスに、またはストローマ細胞に直接、幹細胞が付着することも媒介し得る。ＣＤ３４＋細胞は、臍帯および骨髄において造血細胞として、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆体細胞、リンパ管（胸膜のリンパ管を除く）ではなく血管の内皮細胞、マスト細胞、皮膚の真皮の間質におよび付属器周辺における樹状細胞の部分集団（ＸＩＩＩａ因子が陰性である）、ならびにある特定の軟部組織の腫瘍（例えば、胞状軟部肉腫、プレＢ急性リンパ芽球性白血病（Ｐｒｅ－Ｂ－ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ＡＭＬ－Ｍ７、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、巨細胞線維芽腫、顆粒球性肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、髄膜（ｍｅｎｇｉｎｇｅａｌ）血管周囲細胞腫、髄膜腫、神経線維腫、神経鞘腫および甲状腺乳頭癌）における細胞に見られることが多い。
遺伝子発現ベクター：本文書全体を通じて交換可能に使用され得る、本明細書中で使用される用語「遺伝子発現ベクター」、「核酸発現ベクター」または「発現ベクター」は、宿主細胞内で複製され得、単数または複数の遺伝子を宿主細胞に導入するために利用され得る、核酸分子（例えば、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、人工染色体、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ））のことを広く指す。発現ベクター上に導入された遺伝子は、内在性遺伝子（例えば、宿主細胞または宿主生物に通常見られる遺伝子）または異種遺伝子（例えば、ゲノムに通常見られない遺伝子または宿主細胞もしくは宿主生物の染色体外核酸上の遺伝子）であり得る。発現ベクターによって細胞に導入される遺伝子は、天然の遺伝子、または改変されたもしくは操作された遺伝子であり得る。遺伝子発現ベクターは、発現ベクター上に保有された単数または複数の遺伝子の効率的な転写を促進し得るかまたは増強し得る、エンハンサー配列、プロモーター領域および／またはターミネーター配列として時折、機能し得る、５’および３’非翻訳制御配列を含むようにも操作され得る。遺伝子発現ベクターは時折、特定の細胞型、細胞位置または組織タイプにおける複製および／または発現の機能性（例えば、転写および翻訳）について操作される。発現ベクターは時折、宿主細胞またはレシピエント細胞においてベクターを維持するための選択マーカーを含む。
発生的に制御されるプロモーター：本明細書中で使用される用語「発生的に制御されるプロモーター」は、発生のプログラムまたは経路によってコントロールされるか、開始されるか、または影響されるある特定の条件下で発現される遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーゼに対する最初の結合部位として作用するプロモーターのことを指す。発生的に制御されるプロモーターは、発生のプログラムまたは経路の一部である遺伝子の転写に影響し得る転写のアクチベーターまたはリプレッサーに結合するためのさらなる調節領域をプロモーター領域にまたはプロモーター領域付近に有することが多い。発生的に制御されるプロモーターは、時折、遺伝子産物が細胞の発生分化に影響する遺伝子の転写に関与する。
発生的に分化した細胞：本明細書中で使用される用語「発生的に分化した細胞」は、発生的に制御される特定の遺伝子の発現を伴うことが多く、特定の機能を果たすために、その細胞がそれほど特殊化されていない形態からより特殊化された形態に発展するプロセスを経た細胞のことを指す。発生的に分化した細胞の非限定的な例は、肝臓細胞、肺細胞、皮膚細胞、神経細胞、血液細胞などである。発生分化の変化は、通常、遺伝子発現の変化（例えば、遺伝子発現のパターンの変化）、遺伝子の再編成（例えば、サイレンシングされるかまたは発現される遺伝子をそれぞれ隠すかまたは曝すリモデリングまたはクロマチン）を含み、時々、ＤＮＡ配列の変化（例えば、免疫多様性の分化）を含む。発生中の細胞分化は、遺伝子制御ネットワークの結果として理解され得る。制御遺伝子およびそのシス制御のモジュールは、インプット（例えば、発生の経路またはプログラムの上流で発現されるタンパク質）を受け取り、そのネットワークの別の箇所でアウトプットをもたらす、遺伝子制御ネットワークにおける分岐点（ｎｏｄｅ）である（例えば、発現された遺伝子産物は、その発生の経路またはプログラムの下流の他の遺伝子に対して作用する）。
本明細書中で使用される用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能に使用され得る。これらの用語のすべてには、任意およびすべてのその後の世代のそれらの子孫も含まれる。故意または偶然の変異に起因して、すべての子孫が同一でない可能性があることが理解される。
本明細書で使用される場合、用語「ラパログ」とは、天然の抗生物質ラパマイシンのアナログを意味する。本実施形態におけるある種のラパログは、血清中の安定性、野生型ＦＲＢ（およびよって、免疫抑制特性の低減または排除をもたらす親タンパク質であるｍＴＯＲ）に対する不十分な親和性、および変異体ＦＲＢドメインに対する比較的高い親和性などの特性を有する。商業目的で、ある種の実施形態において、上記ラパログは、有用なメモリおよび生成特性を有する。ラパログの例としては、Ｓ－ｏ，ｐ－ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）－ラパマイシン：ＥＣ５０（ｗｔ ＦＲＢ（Ｋ２０９５ Ｔ２０９８ Ｗ２１０１） 約１０００ｎＭ）、ＥＣ５０（ＦＲＢ－ＫＬＷ 約５ｎＭ） Ｌｕｅｎｇｏ
ＪＩ （９５） Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｌ ２：４７１－８１； Ｌｕｅｎｇｏ ＪＩ
（９４） Ｊ． Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ５９：６５１２－６５１３；米国特許第６１８７７５７号；Ｒ－イソプロポキシラパマイシン：ＥＣ５０（ｗｔ ＦＲＢ（Ｋ２０９５ Ｔ２０９８ Ｗ２１０１） 約３００ｎＭ）、ＥＣ５０（ＦＲＢ－ＰＬＦ 約８．５ｎＭ）；Ｌｉｂｅｒｌｅｓ Ｓ （９７） ＰＮＡＳ ９４： ７８２５－３０；およびＳ－ブタンスルホンアミドラプ（Ｓ－Ｂｕｔａｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｏｒａｐ）（ＡＰ２３０５０）： ＥＣ５０（ｗｔ ＦＲＢ（Ｋ２０９５ Ｔ２０９８ Ｗ２１０１） 約２．７ｎＭ）， ＥＣ５０（ＦＲＢ－ＫＴＦ 約＞２００ｎＭ） Ｂａｙｌｅ （０６） Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏ． １３： ９９－１０７が挙げられるが、これらに限定されない。
ＪＩ （９５） Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｌ ２：４７１－８１； Ｌｕｅｎｇｏ ＪＩ
（９４） Ｊ． Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ５９：６５１２－６５１３；米国特許第６１８７７５７号；Ｒ－イソプロポキシラパマイシン：ＥＣ５０（ｗｔ ＦＲＢ（Ｋ２０９５ Ｔ２０９８ Ｗ２１０１） 約３００ｎＭ）、ＥＣ５０（ＦＲＢ－ＰＬＦ 約８．５ｎＭ）；Ｌｉｂｅｒｌｅｓ Ｓ （９７） ＰＮＡＳ ９４： ７８２５－３０；およびＳ－ブタンスルホンアミドラプ（Ｓ－Ｂｕｔａｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｏｒａｐ）（ＡＰ２３０５０）： ＥＣ５０（ｗｔ ＦＲＢ（Ｋ２０９５ Ｔ２０９８ Ｗ２１０１） 約２．７ｎＭ）， ＥＣ５０（ＦＲＢ－ＫＴＦ 約＞２００ｎＭ） Ｂａｙｌｅ （０６） Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏ． １３： ９９－１０７が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「ＦＲＢ」とは、ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン（ｍＴＯＲ内にコードされる残基２０１５～２１１４）およびそのアナログを指す。ある種の実施形態において、ＦＲＢバリアントが提供される。ＦＲＢアナログまたはバリアントバリアント（ｖａｒｉａｎｔ ｖａｒｉａｎｔ）の特性は、安定性（いくつかのバリアントは、他のものより不安定である）および種々のラパログに結合する能力である。ある種の実施形態において、そのＦＲＢアナログまたはバリアントは、Ｃ７ラパログ（例えば、本出願で提供されるもの、および本明細書に参考として援用される刊行物中で言及されるものなど）に結合する。ある種の実施形態において、そのＦＲＢアナログまたはバリアントは、Ｔ２０９８位においてアミノ酸置換を含む。ラパマイシンに結合体化した結晶構造に基づいて、最も分析された３個の重要なラパマイシン相互作用残基が存在する（Ｋ２０９５、Ｔ２０９８、およびＷ２１０１）。全３個の変異は、ラパマイシンまたはいくつかのラパログの存在下で安定化され得る不安定なタンパク質をもたらす。この特徴は、いくつかの適用において、シグナル：ノイズ比をさらに増大させるために使用され得る。変異体の例としては、Ｂａｙｌｅら （０６） Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏ １３： ９９－１０７； Ｓｔａｎｋｕｎａｓら （０７） Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ８：１１６２－１１６９； および Ｌｉｂｅｒｌｅｓ Ｓ （９７） ＰＮＡＳ ９４：７８２５－３０）において論じられる。本実施形態のＦＲＢバリアントポリペプチド領域の例としては、ＫＬＷ（Ｌ２０９８を有する）；ＫＴＦ（Ｆ２１０１を有する）；およびＫＬＦ（Ｌ２０９８、Ｆ２１０１）が挙げられるが、これらに限定されない。ＦＲＢバリアントＫＬＷは、ＦＲＢＬポリペプチド（例えば、配列番号３０３のアミノ酸からなる）に相当し、２０９８位においてＬ残基の置換を有する。配列番号３０３のＫＬＷバリアントと野生型ＦＲＢポリペプチド（例えば、配列番号３０４アミノ酸配列からなるポリペプチド）とを比較することによって、本明細書で列挙される他のＦＲＢバリアントの配列が決定され得る。
各リガンドは、２個またはこれより多くの部分（例えば、定義された部分、別個の部分）を含み得、およびときおり、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはこれより多くの部分を含む。上記第１のリガンドおよび第２のリガンドは各々独立して、２個の部分（すなわち、二量体）からなり得るか、３個の部分（すなわち、三量体）からなり得るか、または４個の部分（すなわち、四量体）からなり得る。上記第１のリガンドはときおり、第１の部分および第２の部分を含み、上記第２のリガンドはときおり、第３の部分および第４の部分を含む。上記第１の部分および上記第２の部分はしばしば、異なり（すなわち、異種（例えば、ヘテロ二量体））、上記第１の部分および上記第３の部分はときおり異なり、そしてときおり同じであり、上記第３の部分および上記第４の部分はしばしば同じである（すなわち、同種（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）（例えば、ホモ二量体））。異なる部分はときおり、異なる機能を有する（例えば、上記第１の多量体化領域に結合する、上記第２の多量体化領域に結合する、上記第１の多量体化領域に有意に結合しない、上記第２の多量体化領域に有意に結合しない（例えば、上記第１の部分は、上記第１の多量体化領域に結合するが、上記第２の多量体化領域に有意に結合しない））、そしてときおり、異なる化学構造を有する。異なる部分はときおり、異なる化学構造を有するが、同じ多量体化領域に結合し得る（例えば、上記第２の部分および上記第３の部分は、上記第２の多量体化領域に結合し得るが、異なる構造を有し得る）。上記第１の部分はときおり、上記第１の多量体化領域に結合し、ときおり上記第２の多量体化領域に有意に結合しない。各部分はときおり、「単量体」（例えば、上記第１の部分、第２の部分、第３の部分および第４の部分、それぞれを追跡する（ｔｒａｃｋ）第１の単量体、第２の単量体、第３の単量体および第４の単量体）といわれる。各部分はときおり、「側面」といわれる。リガンドの側面はときおり、互いに隣接し得、ときおり、リガンド上の反対側の位置に位置し得る。
「結合できる」とは、多量体化領域またはリガンド結合領域に結合する多量体リガンドまたはヘテロ二量体リガンドの例におけるように、上記リガンドが上記リガンド結合領域に結合し、例えば、上記リガンドの単数または複数の部分は、上記多量体化領域に結合すること、およびこの結合は、アッセイ方法（生物学的アッセイ、化学的アッセイ、または物理的検出手段（例えば、ｘ線結晶学など）が挙げられるが、これらに限定されない）によって検出され得ることが意味される。さらに、リガンドが「有意に結合しない」と考えられる場合は、上記リガンド結合領域へのリガンドの結合のわずかな検出があり得るが、この結合量または結合の安定性は、有意に検出可能ではないこと、および本実施形態の細胞において起こる場合、上記改変された細胞を活性化しないかまたはアポトーシスを引き起こさないことを意味する。ある種の例では、上記リガンドが上記リガンドの投与の際に「有意に結合」しない場合、アポトーシスを受ける細胞の量は、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満である。
「領域」または「ドメイン」は、それが本出願のキメラポリペプチドに関する場合、上記ポリペプチドの機能を維持するポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。すなわち、例えば、ＦＫＢＰ１２結合ドメイン、ＦＫＢＰ１２ドメイン、ＦＫＢＰ１２領域、ＦＫＢＰ１２多量体化領域などとは、キメラポリペプチドの二量体化または多量体化を引き起こすかまたはそれを可能にするための、ＣＩＤリガンド（例えば、リミズシドまたはラパマイシンなど）に結合するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを指す。アポトーシス促進ポリペプチド、例えば、本出願のカスパーゼ－９ポリペプチドまたは短縮型カスパーゼ－９ポリペプチドの「領域」または「ドメイン」は、上記キメラポリペプチド、またはキメラアポトーシス促進ポリペプチドの一部としてのカスパーゼ－９領域の二量体化または多量体化の際に、その二量体化または多量体化したキメラポリペプチドは、カスパーゼカスケードに関与し得、アポトーシスを可能にし得るかまたは引き起こし得ることを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「ｉカスパーゼ－９」分子、ポリペプチド、またはタンパク質は、誘導性カスパーゼ－９として定義される。用語「ｉカスパーゼ－９」は、ｉカスパーゼ－９核酸、ｉカスパーゼ－９ポリペプチドおよび／またはｉカスパーゼ－９発現ベクターを包含する。この用語はまた、天然のｉカスパーゼ－９ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列、またはＣＡＲＤドメインを欠いている短縮型配列のいずれかを包含する。
本明細書で使用される場合、用語「ｉカスパーゼ１分子」、「ｉカスパーゼ３分子」、または「ｉカスパーゼ８分子」は、それぞれ、誘導性カスパーゼ１、３、または８として定義される。用語ｉカスパーゼ１、ｉカスパーゼ３、またはｉカスパーゼ８は、それぞれ、ｉカスパーゼ１、３、もしくは８核酸、ｉカスパーゼ１、３、もしくは８ポリペプチドおよび／またはｉカスパーゼ１、３、もしくは８発現ベクターを包含する。この用語はまた、それぞれ、天然のカスパーゼｉカスパーゼ－１、－３、もしくは－８ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、またはＣＡＲＤドメインを欠いている短縮型配列のいずれかを包含する。本明細書で提供される実験詳細の状況において「野生型」カスパーゼ－９は、ＣＡＲＤドメインを欠いているカスパーゼ－９分子を意味する。
改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドは、改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドを含むキメラポリペプチドにおいて、基底活性またはＩＣ５０に影響を及ぼす少なくとも１個のアミノ酸置換を含む。基底活性およびＩＣ５０を試験するための方法は、本明細書で論じられる。非改変カスパーゼ－９ポリペプチドは、このタイプのアミノ酸置換を含まない。改変されたおよび非改変カスパーゼ－９ポリペプチドの両方は、例えば、ＣＡＲＤドメインを除去するために、切断され得る。
「機能保存的バリアント」は、タンパク質または酵素の全体的な立体構造および機能を変化させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、あるアミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有するアミノ酸で置き換えたものが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺伝的にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知である。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。
保存アミノ酸と示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間のタンパク質配列またはアミノ酸配列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って決定されるとき、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似性」は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。２つの配列間の類似性の程度は、配列同一性および／または保存のパーセントに基づき得る。本明細書中の「配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同一性（およびアミノ酸配列の場合、保存）レベルを達成するように２つ以上の配列を並べるプロセスを意味する。配列をアラインメントするためおよび類似性／同一性を評価するための数多くの方法（例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ法ならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡなど）が、当該分野で公知である。これらのプログラムのうちのいずれかを使用するとき、設定は、最も高い配列類似性をもたらすものとして選択され得る。
本明細書で言及されるアミノ酸残基番号は、非短縮型および非改変カスパーゼ－９ポリペプチド（例えば、配列番号９のもの）におけるアミノ酸位置を反映する。配列番号９は、短縮型カスパーゼ－９ポリペプチドのアミノ酸配列を提供し、これは、ＣＡＲＤドメインを含まない。従って、配列番号９は、全長カスパーゼ－９アミノ酸配列を参照して、アミノ酸残基番号１３５において始まり、アミノ酸残基番号４１６で終わる。当業者は、配列をカスパーゼ－９ポリペプチドの他の配列と整列させて、望ましい場合には、アミノ酸残基番号を、例えば、本明細書で論じられる配列アラインメント法を使用して相関させ得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用して調製されたＤＮＡのことを指すと意図されている。ゲノムＤＮＡ、またはゲノムＲＮＡ鋳型、プロセシングされていないＲＮＡ鋳型もしくは部分的にプロセシングされたＲＮＡ鋳型から重合されたＤＮＡに対立するものとしてｃＤＮＡを使用することの利点は、ｃＤＮＡが、主に、対応するタンパク質のコード配列を含む点である。完全または部分的なゲノム配列が使用されるときがあり、例えば、最適な発現のために非コード領域を必要とする場合、またはイントロンなどの非コード領域がアンチセンスストラテジーにおいて標的化される場合が存在する。
本明細書中で使用されるとき、用語「発現構築物」または「導入遺伝子」は、遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝的構築物として定義され、ここで、核酸コード配列の一部または全部が転写されることが可能であり、該構築物は、ベクターに挿入され得る。転写産物は、タンパク質に翻訳されるが、必ずしも翻訳されるわけではない。ある特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写とｍＲＮＡから遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態において、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写だけを含む。用語「治療的な構築物」は、発現構築物または導入遺伝子のことを指すためにも使用され得る。発現構築物または導入遺伝子は、例えば、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害（例えば、がん）を処置する治療として、使用され得、ゆえに、発現構築物または導入遺伝子は、治療的な構築物または予防的な構築物である。
本明細書中で使用されるとき、用語「発現ベクター」は、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターのことを指す。場合によっては、ＲＮＡ分子は、その後、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成では、これらの配列は、翻訳されない。発現ベクターは、種々の調節配列を含み得、それらの調節配列は、特定の宿主生物において、作動可能に連結されたコード配列を転写するためおよびおそらく翻訳するために必要な核酸配列のことを指す。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を支配する調節配列に加えて、同様に他の機能を果たす核酸配列を含み得、それらは、下で論じられる。
本明細書中で使用されるとき、用語「エキソビボ」は、身体の「外側」のことを指す。用語「エキソビボ」および「インビトロ」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。
本明細書で使用される場合、用語「機能的に等価な」とは、カスパーゼ－９または短縮型カスパーゼ－９に関する場合、例えば、カスパーゼ－９核酸フラグメント、バリアント、またはアナログを指し、カスパーゼ－９ポリペプチド、またはアポトーシス応答を刺激するカスパーゼ－９ポリペプチドをコードする核酸を指す。「機能的に等価な」とは、例えば、ＣＡＲＤドメインを欠くが、アポトーシス細胞応答を誘導できるカスパーゼ－９ポリペプチドを指す。用語「機能的に等価な」が、他の核酸またはポリペプチド（例えば、ＣＤ１９、５’ＬＴＲ、多量体リガンド結合領域、またはＣＤ３など）に適用される場合、それは、本明細書中の方法の参照ポリペプチドと同じまたは類似の活性を有するフラグメント、バリアントなどを指す。
本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子」は、機能的なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単位として定義される。理解されるように、この機能的な用語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および変異体を発現するかまたは発現するように適合された、より小さい操作された遺伝子セグメントが含まれる。
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的な過剰増殖性疾患としては、がんまたは自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または炎症性腸疾患が挙げられ得る。
用語「免疫原性組成物」または「免疫原」は、免疫応答を引き起こすことができる物質のことを指す。免疫原の例としては、例えば、抗原、自己免疫疾患の誘導において役割を果たす自己抗原、およびがん細胞上に発現された腫瘍関連抗原が挙げられる。
本明細書中で使用される用語「免疫無防備状態」は、免疫系が衰えているかまたは弱くなっている被験体として定義される。免疫無防備状態の状態は、免疫系の欠損もしくは機能不全または感染および／もしくは疾患への感受性を高める他の要因に起因し得る。そのような分類は、評価に対して概念的基礎を与えるが、免疫無防備状態の個体は、一方の群または他方の群に完全に当てはまらないことが多い。身体の防御機構における２つ以上の欠損が、影響され得る。例えば、ＨＩＶによって引き起こされる特定のＴリンパ球欠損を有する個体は、抗ウイルス治療のために使用される薬物によって引き起こされる好中球減少症も有し得るか、または皮膚および粘膜の完全性が破られたために免疫無防備状態であり得る。免疫無防備状態の状況は、留置中心ライン（ｉｎｄｗｅｌｌｉｎｇ ｃｅｎｔｒａｌ ｌｉｎｅｓ）もしくは静脈内薬物乱用に起因する他のタイプの機能障害に起因し得るか；または続発性悪性疾患、栄養失調によって引き起こされ得るか、または他の感染病原体（例えば、結核）もしくは性行為感染症、例えば、梅毒もしくは肝炎に感染していることに起因し得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「薬学的または薬理学的に許容され得る」は、動物またはヒトに投与されたとき、有害（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー反応または他の有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」は、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒質または作用物質が、本明細書中に提示されるベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中で使用される核酸およびポリヌクレオチドは、相互交換可能である。核酸は、モノマーの「ヌクレオチド」に加水分解され得るポリヌクレオチドである。モノマーのヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書中で使用されるとき、ポリヌクレオチドには、当該分野において利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されず、そのような手段としては、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびＰＣＲＴＭなどを使用する組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの変異を含み、当該分野で周知の方法によるヌクレオチドまたはヌクレオシドの変異を含むが、これらに限定されない。核酸は、１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、通常、規定の配列を有する、アミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドという用語は、「ペプチド」および「タンパク質」という用語と相互交換可能である。
本明細書中で使用されるとき、用語「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。
用語「トランスフェクション」および「形質導入」は、相互交換可能であり、外来性ＤＮＡ配列が真核生物宿主細胞に導入されるプロセスのことを指す。トランスフェクション（または形質導入）は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、スーパーフェクション（ｓｕｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ）などを含むいくつかの手段のうちのいずれか１つによって達成され得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「同系」とは、同一の遺伝子型、または組織移植が可能であるのに十分密接な関係がある遺伝子型、または免疫学的に適合性の遺伝子型を有する細胞、組織または動物のことを指す。例えば、同じ近交系の一卵性双生児または動物。同系および同遺伝子系は、交換可能に使用され得る。
用語「患者」または「被験体」は、相互交換可能であり、本明細書中で使用されるとき、生物または動物；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジまたは他の非ヒト哺乳動物を含む）；非哺乳動物（例えば、非哺乳動物の脊椎動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリまたはアヒル）または魚類、および非哺乳動物の無脊椎動物を含む）を含むが、これらに限定されない。
「Ｔ細胞活性化分子」とは、キメラ抗原レセプターを発現するＴ細胞へと組み込まれる場合、Ｔ細胞の活性化を高めるポリペプチドを意味する。例としては、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子（例えば、ＣＤ３ζポリペプチドなど）、およびＦｃレセプターガンマ（例えば、Ｆｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットなど）（Ｈａｙｎｅｓ， Ｎ．Ｍ．ら Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６：１８２－７（２００１））．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用されるとき、用語「転写支配下」または「作動可能に連結された」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現をコントロールする核酸に対して正しい位置および方向で存在することとして定義される。
本明細書中で使用されるとき、用語「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置される」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、予防法および／または治療のことを指す。
本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワクチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体、サイトカインおよび／または他の細胞応答の産生を含むがこれらに限定されない免疫応答を引き起こすことができる。
いくつかの実施形態において、核酸は、ウイルスベクター内に含まれている。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、エキソビボにおいてウイルスベクターと接触され、いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、インビボにおいてウイルスベクターと接触されることが理解される。
造血幹細胞および細胞治療
造血幹細胞としては、造血前駆体細胞、成熟した血球タイプへと分化し得る未成熟の多分化能細胞が挙げられる。これら幹細胞および前駆体細胞は、骨髄および臍帯血から、およびいくつかの場合では、末梢血から単離され得る。他の幹細胞および前駆体細胞としては、例えば、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞が挙げられる。
造血幹細胞としては、造血前駆体細胞、成熟した血球タイプへと分化し得る未成熟の多分化能細胞が挙げられる。これら幹細胞および前駆体細胞は、骨髄および臍帯血から、およびいくつかの場合では、末梢血から単離され得る。他の幹細胞および前駆体細胞としては、例えば、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞が挙げられる。
骨髄由来間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）は、標準的培養条件においてプラスチック培養ディッシュに接着し、造血系統マーカーに関して陰性であり、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に関して陽性であり、そして脂肪細胞、骨芽細胞、および軟骨芽細胞へとインビトロで分化し得る単核骨髄細胞の画分として定義されている。１つの生理学的役割が、造血の支持であると推定される一方で、ＭＳＣが活発な成長の領域（例えば、瘢痕性組織および新生物組織）に組み込まれ得、おそらく増殖し得る、およびそれらの天然の微小環境にホーミングし得、病的細胞の機能を置き換え得るといういくつかの報告もまた、確立された。それらの分化潜在能およびホーミング能力は、それらの天然の形態での再生医療への適用（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）のための、または特定の微小環境（例えば、病的な骨髄または転移性の沈着物）への活性な生物学的因子の送達のためのそれらの遺伝子改変を通じてかのいずれかで、ＭＳＣを細胞治療のための魅力的なビヒクルにする。さらに、ＭＳＣは、強力な本質的免疫抑制活性を有し、今日までに、移植片対宿主病および自己免疫障害の実験的処置においてそれらの最も頻繁な適用が見出されている（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ， Ｍ． Ｆ．ら （１９９９）． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４： １４３－１４７； Ｄｏｍｉｎｉｃｉ， Ｍ．ら （２００６）． Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ８： ３１５－３１７； Ｐｒｏｃｋｏｐ， Ｄ． Ｊ． （１９９７）． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６： ７１－７４； Ｌｅｅ， Ｒ． Ｈ．ら （２００６）． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３： １７４３８－１７４４３； Ｓｔｕｄｅｎｙ， Ｍ．ら， （２００２）． Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ ６２： ３６０３－３６０８； Ｓｔｕｄｅｎｙ， Ｍ．ら （２００４）．
Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９６： １５９３－１６０３； Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ｅ． Ｍ．ら （１９９９）． Ｎａｔ Ｍｅｄ ５： ３０９－３１３； Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ， Ｇ．ら， （２００７）． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５： ２７３９－２７４９； Ｐｈｉｎｎｅｙ， Ｄ． Ｇ．， および Ｐｒｏｃｋｏｐ， Ｄ． Ｊ． （２００７）． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５： ２８９６－２９０２； Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ｅ． Ｍ．ら （２００２）． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９： ８９３２－８９３７； Ｈａｌｌ， Ｂ．ら， （２００７）． Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ８６： ８－１６； Ｎａｕｔａ， Ａ．
Ｊ．， および Ｆｉｂｂｅ， Ｗ． Ｅ． （２００７）． Ｂｌｏｏｄ １１０： ３４９９－３５０６； Ｌｅ Ｂｌａｎｃ， Ｋ．ら （２００８）． Ｌａｎｃｅｔ ３７１： １５７９－１５８６； Ｔｙｎｄａｌｌ， Ａ．， および Ｕｃｃｅｌｌｉ， Ａ． （２００９）． Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）。
Ｒｅｓ ６２： ３６０３－３６０８； Ｓｔｕｄｅｎｙ， Ｍ．ら （２００４）．
Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９６： １５９３－１６０３； Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ｅ． Ｍ．ら （１９９９）． Ｎａｔ Ｍｅｄ ５： ３０９－３１３； Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ， Ｇ．ら， （２００７）． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５： ２７３９－２７４９； Ｐｈｉｎｎｅｙ， Ｄ． Ｇ．， および Ｐｒｏｃｋｏｐ， Ｄ． Ｊ． （２００７）． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５： ２８９６－２９０２； Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ｅ． Ｍ．ら （２００２）． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９９： ８９３２－８９３７； Ｈａｌｌ， Ｂ．ら， （２００７）． Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ８６： ８－１６； Ｎａｕｔａ， Ａ．
Ｊ．， および Ｆｉｂｂｅ， Ｗ． Ｅ． （２００７）． Ｂｌｏｏｄ １１０： ３４９９－３５０６； Ｌｅ Ｂｌａｎｃ， Ｋ．ら （２００８）． Ｌａｎｃｅｔ ３７１： １５７９－１５８６； Ｔｙｎｄａｌｌ， Ａ．， および Ｕｃｃｅｌｌｉ， Ａ． （２００９）． Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）。
ＭＳＣは、最小の報告された副作用を伴って、数百名の患者において注入された。しかし、追跡調査は限定的であって、長期間の副作用は未知であり、ＭＳＣのインビボ分化（例えば、軟骨もしくは骨への）を誘導する、またはＭＳＣの機能性を高めるためにＭＳＣを遺伝子改変することは今後の取り組みと関連するという帰結については、ほとんど未知である。いくつかの動物モデルは、安全性の懸念を引き起こした。例えば、培養物中の自発的な骨肉腫形成は、マウス由来ＭＳＣにおいて観察された。さらに、心筋梗塞のマウスモデルおよびラットモデルにおける、ＭＳＣの局所注射後の異所性骨化および石灰化病変が論じられており、それらの催不整脈潜在性はまた、新生仔ラットの心室の筋細胞との共培養実験において明らかであった。さらに、両側性のびまん性肺骨形成は、イヌにおける骨髄移植後に観察されており、それはおそらく移植されたストローマ構成成分に起因している（Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ｅ． Ｍ．ら， （２００７）． Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １３： ５３－５７； Ｔｏｌａｒ， Ｊ．ら （２００７）． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５： ３７１－３７９； Ｙｏｏｎ， Ｙ．－Ｓ．ら， （２００４）． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９： ３１５４－３１５７； Ｂｒｅｉｔｂａｃｈ， Ｍ．ら （２００７）． Ｂｌｏｏｄ １１０： １３６２－１３６９；Ｃｈａｎｇ， Ｍ． Ｇ．ら （２００６）． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ
１１３： １８３２－１８４１； Ｓａｌｅ， Ｇ． Ｅ．， および Ｓｔｏｒｂ，
Ｒ． （１９８３）． Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ １１： ９６１－９６６）。
１１３： １８３２－１８４１； Ｓａｌｅ， Ｇ． Ｅ．， および Ｓｔｏｒｂ，
Ｒ． （１９８３）． Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ １１： ９６１－９６６）。
細胞治療の別の例では、キメラ抗原レセプターをコードする核酸で形質導入されたＴ細胞は、がんを処置するために患者に投与されてきた（Ｚｈｏｎｇ， Ｘ．－Ｓ．， （２０１０） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８：４１３－４２０）。キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、ＭＨＣ抗原提示を必要とすることなしに、Ｔ細胞に抗原特異性を伝達するようにデザインされた人工レセプターである。それらは、抗原特異的構成成分、膜貫通構成成分、およびＴ細胞を活性化しかつ特異的免疫を提供するために選択される細胞内構成成分を含む。キメラ抗原レセプター発現Ｔ細胞は、種々の治療（がん治療を含む）において使用され得る。共刺激ポリペプチドは、標的抗原に対するＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性化を高めるために、従って、養子免疫療法の効能を増大するために使用され得る。
例えば、ヒト化モノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）に基づくキメラ抗原レセプターを発現するＴ細胞は、がん患者を処置するために使用されてきた。有害事象は考えられるが、少なくとも１つの報告された症例では、この治療は、患者にとって致命的結果になった（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ．ら， （２０１０） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８：８４３－８５１）。細胞を、本明細書で示されるとおりのキメラカスパーゼ－９ベースの安全スイッチで形質導入すると、有害事象が進行することを停止させ得る安全スイッチが提供される。従って、いくつかの実施形態において、その改変されたＴ細胞がまた誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドを発現する、核酸、細胞、および方法が提供される。例えば、キメラ抗原レセプター改変Ｔ細胞の数を減少する必要性がある場合、誘導性リガンドが上記患者に投与され得、それによって、その改変されたＴ細胞のアポトーシスを誘導し得る。
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）分子の効力を高めるためにＣＡＲ分子にさらなるシグナル伝達ドメインを組み込んだとき、ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞による免疫療法の抗腫瘍の効能は、着実に改善した。腫瘍細胞は、完全なＴ細胞活性化にとって必要な必須の共刺激分子を欠くことが多いので、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達分子だけを含む第１世代ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞は、養子移入後にインビボにおいて不良な存続および増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を明らかに示した（Ｔｉｌｌ ＢＧ，Ｊｅｎｓｅｎ ＭＣ，Ｗａｎｇ Ｊら：ＣＤ２０－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ ｂｏｔｈ ＣＤ２８ ａｎｄ ４－１ＢＢ ｄｏｍａｉｎｓ：ｐｉｌｏｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｂｌｏｏｄ １１９：３９４０－５０，２０１２；Ｐｕｌｅ ＭＡ，Ｓａｖｏｌｄｏ Ｂ，Ｍｙｅｒｓ ＧＤら：Ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １４：１２６４－７０，２００８；Ｋｅｒｓｈａｗ ＭＨ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ ＪＡ，Ｐａｒｋｅｒ ＬＬら：Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ
ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：６１０６－１５，２００６）。第２世代ＣＡＲ Ｔ細胞は、それらの細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および生存を改善するようにデザインされた。ＣＤ２８または４－１ＢＢ由来の細胞内の共刺激ドメインを組み込んでいる第２世代ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ Ｃ，Ｍｉｌｏｎｅ ＭＣ，Ｈａｓｓａｎ Ｒら：Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＤ１３７ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：３３６０－５，２００９；Ｓｏｎｇ ＤＧ，Ｙｅ Ｑ，Ｐｏｕｓｓｉｎ Ｍら：ＣＤ２７ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｂｌｏｏｄ １１９：６９６－７０６，２０１２）は、養子移入後に、改善された生存およびインビボでの増殖を示し、これらの共刺激分子を含む、抗ＣＤ１９ ＣＡＲによって改変されたＴ細胞を用いたより最近の臨床試験では、ＣＤ１９＋白血病の処置に対して顕著な効能が示された（Ｋａｌｏｓ Ｍ，Ｌｅｖｉｎｅ ＢＬ，Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬら：Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｈａｖｅ ｐｏｔｅｎｔ
ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｃａｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３：９５ｒａ７３，２０１１；Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬ，Ｌｅｖｉｎｅ ＢＬ，Ｋａｌｏｓ Ｍら：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５：７２５－３３，２０１１；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ＲＪ，Ｄａｖｉｌａ ＭＬ，Ｒｉｖｉｅｒｅ Ｉら：ＣＤ１９－ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５：１７７ｒａ３８，２０１３）。
ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：６１０６－１５，２００６）。第２世代ＣＡＲ Ｔ細胞は、それらの細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および生存を改善するようにデザインされた。ＣＤ２８または４－１ＢＢ由来の細胞内の共刺激ドメインを組み込んでいる第２世代ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ Ｃ，Ｍｉｌｏｎｅ ＭＣ，Ｈａｓｓａｎ Ｒら：Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＤ１３７ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：３３６０－５，２００９；Ｓｏｎｇ ＤＧ，Ｙｅ Ｑ，Ｐｏｕｓｓｉｎ Ｍら：ＣＤ２７ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｂｌｏｏｄ １１９：６９６－７０６，２０１２）は、養子移入後に、改善された生存およびインビボでの増殖を示し、これらの共刺激分子を含む、抗ＣＤ１９ ＣＡＲによって改変されたＴ細胞を用いたより最近の臨床試験では、ＣＤ１９＋白血病の処置に対して顕著な効能が示された（Ｋａｌｏｓ Ｍ，Ｌｅｖｉｎｅ ＢＬ，Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬら：Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｈａｖｅ ｐｏｔｅｎｔ
ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｃａｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３：９５ｒａ７３，２０１１；Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬ，Ｌｅｖｉｎｅ ＢＬ，Ｋａｌｏｓ Ｍら：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５：７２５－３３，２０１１；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ＲＪ，Ｄａｖｉｌａ ＭＬ，Ｒｉｖｉｅｒｅ Ｉら：ＣＤ１９－ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５：１７７ｒａ３８，２０１３）。
他の研究者らは、「第３世代」ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれる、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリータンパク質（例えば、ＯＸ４０および４－１ＢＢ）由来のさらなるシグナル伝達分子を探索した（Ｆｉｎｎｅｙ ＨＭ，Ａｋｂａｒ ＡＮ，Ｌａｗｓｏｎ ＡＤ：Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ
ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＣＤ２８，ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ，ＣＤ１３４，ａｎｄ ＣＤ１３７ ｉｎ ｓｅｒｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＴＣＲ ｚｅｔａ ｃｈａｉｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：１０４－１３，２００４；Ｇｕｅｄａｎ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｍａｄａｒ Ａら：ＩＣＯＳ－ｂａｓｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｐｒｏｇｒａｍ ｂｉｐｏｌａｒ ＴＨ１７／ＴＨ１ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，２０１４）が、活性化Ｔ細胞のＣＤ３ζ核因子（ＮＦＡＴ）経路と異なるＴ細胞シグナル伝達を誘導する他の分子が、Ｔ細胞の生存および増殖に必要な共刺激を提供する可能性があり、おそらく、従来の共刺激分子によって供給されない、価値のあるさらなる機能をＣＡＲ Ｔ細胞に与える。いくつかの第２および第３世代ＣＡＲ Ｔ細胞は、高度に活性化されたＴ細胞によって引き起こされるサイトカインストームおよび腫瘍崩壊症候群に起因する患者の死に関係していた。
ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＣＤ２８，ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ，ＣＤ１３４，ａｎｄ ＣＤ１３７ ｉｎ ｓｅｒｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＴＣＲ ｚｅｔａ ｃｈａｉｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：１０４－１３，２００４；Ｇｕｅｄａｎ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｍａｄａｒ Ａら：ＩＣＯＳ－ｂａｓｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｐｒｏｇｒａｍ ｂｉｐｏｌａｒ ＴＨ１７／ＴＨ１ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，２０１４）が、活性化Ｔ細胞のＣＤ３ζ核因子（ＮＦＡＴ）経路と異なるＴ細胞シグナル伝達を誘導する他の分子が、Ｔ細胞の生存および増殖に必要な共刺激を提供する可能性があり、おそらく、従来の共刺激分子によって供給されない、価値のあるさらなる機能をＣＡＲ Ｔ細胞に与える。いくつかの第２および第３世代ＣＡＲ Ｔ細胞は、高度に活性化されたＴ細胞によって引き起こされるサイトカインストームおよび腫瘍崩壊症候群に起因する患者の死に関係していた。
「キメラ抗原レセプター」または「ＣＡＲ」は、例えば、Ｔ細胞を活性化し、特異免疫をもたらすように選択された、膜貫通ポリペプチドおよび細胞内ドメインポリペプチドに連結された、標的抗原を認識するポリペプチド配列（抗原認識ドメイン）を含むキメラポリペプチドのことを意味する。その抗原認識ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）であり得るか、または例えば、他の分子（例えば、Ｔ細胞レセプターまたはパターン認識レセプターなど）に由来し得る。細胞内ドメインは、Ｔ細胞の活性化を引き起こす少なくとも１つのポリペプチド（例えば、例えば、ＣＤ３ゼータであるがこれに限定されない、および、例えば、共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４－１ＢＢであるがこれらに限定されない）を含む。用語「キメラ抗原レセプター」とは、抗体に由来するのではなくキメラＴ細胞レセプターに由来するキメラレセプターのことも指すことがある。これらのキメラＴ細胞レセプターは、標的抗原を認識するポリペプチド配列を含み得、ここで、その認識配列は、例えば、Ｔ細胞レセプターまたはｓｃＦｖに由来する認識配列であり得るがこれらに限定されない。細胞内ドメインポリペプチドは、Ｔ細胞を活性化するように作用するポリペプチドである。キメラＴ細胞レセプターは、例えば、Ｇｒｏｓｓ，Ｇ．，ａｎｄ Ｅｓｈａｒ，Ｚ．，ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：３３７０－３３７８（１９９２）およびＺｈａｎｇ，Ｙ．ら、ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ６：１－１３（２０１０）において論じられている。
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の１タイプにおいて、腫瘍特異的モノクローナル抗体の可変重（ＶＨ）鎖および軽（ＶＬ）鎖は、Ｔ細胞複合体に由来するＣＤ３ゼータ鎖（ζ）とインフレームで融合される。そのＶＨおよびＶＬは、通常、グリシン－セリンフレキシブルリンカーを使用して互いに接続され、次いで、スペーサー（ＣＨ２ＣＨ３）によって膜貫通ドメインに結合されることにより、腫瘍抗原と相互作用できるようにｓｃＦｖが細胞表面から離れて伸長する。形質導入の後、Ｔ細胞は、この時点で、その表面上にＣＡＲを発現し、腫瘍抗原と接触し、ライゲーションすると、ＣＤ３ゼータ鎖を介してシグナル伝達し、細胞傷害および細胞活性化を誘導する。
研究者らは、ＣＤ３ゼータを介したＴ細胞の活性化が、腫瘍特異的殺滅を誘導するのに十分であるが、Ｔ細胞の増殖および生存を誘導するには不十分であることを述べている。ゼータ鎖のみを発現している第１世代ＣＡＲによって改変されたＴ細胞を使用した初期の臨床試験は、遺伝子が改変されたＴ細胞が、インビボにおいて不良な生存および増殖を示すことを示した。
Ｂ７軸を介した共刺激が、完全なＴ細胞活性化にとって必要であるので、研究者らは、共刺激ポリペプチドＣＤ２８シグナル伝達ドメインをＣＡＲ構築物に付加した。この領域は、通常、膜貫通領域（ＣＤ３ゼータバージョンの代わりに）、ならびにＰＩ３ＫおよびＬｃｋに結合するためのＹＭＮＭモチーフを含む。ゼータだけを有するＣＡＲまたはゼータとＣＤ２８の両方を有するＣＡＲを発現しているＴ細胞の間のインビボでの比較から、活性化後のＩＬ－２産生の増加に部分的に起因して、ＣＤ２８がインビボにおいて増殖を促進することが実証された。ＣＤ２８を含んでいるものは、第２世代ＣＡＲと呼ばれる。最もよく使用される共刺激分子としては、ＣＤ２８および４－１ＢＢが挙げられ、これらは、腫瘍認識後に、ＮＦ－κＢの活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを惹起し得、Ｔ細胞の増殖と細胞生存の両方を促進する。
ＣＡＲのデザインにおいて共刺激ポリペプチド４－１ＢＢまたはＯＸ４０を使用することにより、Ｔ細胞の生存および効力がさらに改善された。４－１ＢＢは、特に、Ｔ細胞の増殖および生存を大幅に増強するとみられる。この第３世代のデザイン（３つのシグナル伝達ドメインを有する）は、ＰＳＭＡ ＣＡＲ（Ｚｈｏｎｇ ＸＳら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｆｅｂ；１８（２）：４１３－２０）およびＣＤ１９ ＣＡＲにおいて、最も著しくはＣＬＬの処置のために、使用されている（Ｍｉｌｏｎｅ，Ｍ．Ｃ．ら（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１４５３－１４６４；Ｋａｌｏｓ，Ｍ．ら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１１）３：９５ｒａ７３；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．ら（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５－５３３）。これらの細胞は、インビボにおいて１０００倍超増殖して、３人の患者において目覚ましい機能を示し、３人の患者すべてにおいて持続的な緩解をもたらした。
「由来する」が、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、分子の配列に由来し得ることを意味することは、理解される。細胞内ドメインは、Ｔ細胞の活性化を引き起こす少なくとも１種のポリペプチド（例えば、ＣＤ３ゼータなどが挙げられるが、これらに限定されない）および例えば、共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０および４－１ＢＢが挙げられるが、これらに限定されない）を含む。
Ｔ細胞レセプターは、Ｔ細胞の表面に存在する２種の異なるポリペプチドから構成される分子である。それらは、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合した抗原を認識する；上記抗原での認識の際に、上記Ｔ細胞は活性化される。「認識する」は、例えば、Ｔ細胞レセプターまたはそのフラグメント（単数または複数）、例えば、ＴＣＲαポリペプチドおよびＴＣＲβが一緒に、上記抗原と接触し、これを標的として同定することができることを意味する。ＴＣＲは、αおよびβポリペプチド、または鎖を含み得る。このαポリペプチドおよびβポリペプチドは、２つの細胞外ドメイン、可変ドメインおよび定常ドメインを含む。このαおよびβポリペプチドの可変ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する；ＣＤＲ３は、エピトープの認識を担う主要なＣＤＲであると考えられる。そのαポリペプチドは、ＶＪ組換えによって生成される、Ｖ領域およびＪ領域を含み、そのβポリペプチドは、ＶＤＪ組換えによって生成される、Ｖ領域、Ｄ領域、およびＪ領域を含む。ＶＪ領域およびＶＤＪ領域の交差は、ＣＤＲ３領域に相当する。ＴＣＲはしばしば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ （ＩＭＧＴ） ＴＣＲ命名を使用して命名される（ＩＭＧＴデータベース、ｗｗｗ．ＩＭＧＴ．ｏｒｇ； Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ， Ｖ．ら，ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ－ＤＢ、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターヌクレオチド配列のＩＭＧＴ（登録商標）包括的データベース、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３４， Ｄ７８１－Ｄ７８４ （２００６）． ＰＭＩＤ： １６３８１９７９；Ｔ細胞レセプター Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ， ＬｅＦｒａｎｃ ａｎｄ
ＬｅＦｒａｎｃ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ＩＳＢＮ ０－１２－４４１３５２－８）。
ＬｅＦｒａｎｃ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ＩＳＢＮ ０－１２－４４１３５２－８）。
キメラＴ細胞レセプターは、例えば、抗原性ポリペプチド（例えば、Ｂｏｂ－１、ＰＲＡＭＥ、およびＮＹ－ＥＳＯ－１）に結合し得る（米国特許出願第１４／９３０，５７２号（２０１５年１１月２日出願、標題「Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｂｏｂ１ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」、および米国仮特許出願第６２／１３０，８８４号（２０１５年３月１０日出願、標題「Ｔ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ－Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ
Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」）（これらの各々は、その全体において本明細書に参考として援用される）。
Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ－Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ
Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」）（これらの各々は、その全体において本明細書に参考として援用される）。
細胞治療の別の例では、Ｔ細胞は、非機能的ＴＧＦ－βレセプターを発現し、それらをＴＧＦ－βに対して耐性にするように改変される。これは、その改変されたＴ細胞がＴＧＦ－βによって引き起こされる細胞毒性を回避することを可能にし、上記細胞が細胞治療において使用されることを可能にする（Ｂｏｌｌａｒｄ， Ｃ．Ｊ．ら， （２００２）
Ｂｌｏｏｄ ９９：３１７９－３１８７； Ｂｏｌｌａｒｄ， Ｃ．Ｍ．ら， （２００４） Ｊ． Ｅｘｐｔｌ． Ｍｅｄ． ２００：１６２３－１６３３）。しかし、それはまた、Ｔ細胞リンパ腫または他の有害作用を生じ得る。なぜなら上記改変されたＴ細胞は、いまや正常な細胞コントロールの一部を欠いているからである；これら治療用Ｔ細胞は、それら自体が悪性になり得る。これら改変されたＴ細胞を、本明細書で示されるとおりのキメラカスパーゼ－９ベースの安全スイッチで形質導入すると、この結果を回避し得る安全スイッチが提供される。
Ｂｌｏｏｄ ９９：３１７９－３１８７； Ｂｏｌｌａｒｄ， Ｃ．Ｍ．ら， （２００４） Ｊ． Ｅｘｐｔｌ． Ｍｅｄ． ２００：１６２３－１６３３）。しかし、それはまた、Ｔ細胞リンパ腫または他の有害作用を生じ得る。なぜなら上記改変されたＴ細胞は、いまや正常な細胞コントロールの一部を欠いているからである；これら治療用Ｔ細胞は、それら自体が悪性になり得る。これら改変されたＴ細胞を、本明細書で示されるとおりのキメラカスパーゼ－９ベースの安全スイッチで形質導入すると、この結果を回避し得る安全スイッチが提供される。
他の例では、ナチュラルキラー細胞は、膜標的化ポリペプチドを発現するように改変される。キメラ抗原レセプターの代わりに、ある種の実施形態において、異種膜結合ポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄレセプターである。ＮＫＧ２Ｄレセプターは、腫瘍細胞上のストレスタンパク質（例えば、ＭＩＣＡ／Ｂ）に結合し得、それによってＮＫ細胞を活性化し得る。細胞外結合ドメインはまた、シグナル伝達ドメインに融合され得る（Ｂａｒｂｅｒ，
Ａ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；６７： ５００３－８； Ｂａｒｂｅｒ
Ａら， Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ． ２００８； ３６：１３１８－２８； Ｚｈａｎｇ
Ｔ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００７； ６７：１１０２９－３６．）、そしてこれは、翻って、ＦＲＢ連結（ｌｉｎｋｅｒｅｄ）ＣＡＲに類似のＦＲＢドメインに連結され得る。さらに、他の細胞表面レセプター（例えば、ＶＥＧＦ－Ｒ）は、多くの腫瘍内で、高レベルで見出される、低酸素症誘発性ＶＥＧＦの存在下で腫瘍依存性クラスター化を高めるために、ＦＲＢドメインのドッキング部位として使用され得る。
Ａ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；６７： ５００３－８； Ｂａｒｂｅｒ
Ａら， Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ． ２００８； ３６：１３１８－２８； Ｚｈａｎｇ
Ｔ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００７； ６７：１１０２９－３６．）、そしてこれは、翻って、ＦＲＢ連結（ｌｉｎｋｅｒｅｄ）ＣＡＲに類似のＦＲＢドメインに連結され得る。さらに、他の細胞表面レセプター（例えば、ＶＥＧＦ－Ｒ）は、多くの腫瘍内で、高レベルで見出される、低酸素症誘発性ＶＥＧＦの存在下で腫瘍依存性クラスター化を高めるために、ＦＲＢドメインのドッキング部位として使用され得る。
異種遺伝子（例えば、改変されたレセプター、またはキメラレセプター）を発現する、細胞治療において使用される細胞は、細胞が異種遺伝子で形質導入される前に、それの後に、またはそれと同時にキメラカスパーゼ－９ベースの安全スイッチをコードする核酸で形質導入され得る。
（ハプロタイプ一致幹細胞移植）
幹細胞移植は、造血幹細胞およびそれらの子孫が関わる広く種々の疾患を処置する有効な手段と判明した一方で、組織適合性ドナーの不足は、このアプローチの最も広い適用に対する主な障害であると判明した。血縁のない幹細胞ドナーおよび／または臍帯血バンクの大きな一団の導入は、その問題を緩和する一助となったが、多くの患者は、いずれの供給源とも適合しないままである。マッチしたドナーが見出され得る場合ですら、検索の開始と幹細胞の収集との間に経過した時間は、通常、最も必要な患者のうちの多くを運命付け得る遅れである３ヶ月を超える。従って、ＨＬＡハプロタイプ一致の家族ドナーを利用するにあたっては、かなりの重要性が存在している。かかるドナーは、親、同胞（ｓｉｂｌｉｎｇ）、もしくは第２度近親者であり得る。移植拒絶という問題は、幹細胞の適切な馴化および大きな用量の組み合わせによって克服され得る一方で、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は、ドナー移植片の広範なＴ細胞枯渇によって防止され得る。このような手順の即座の結果は、移植後免疫抑制の非存在下ですら、成人および小児の両方に関して生着率＞９０％および重症ＧｖＨＤ率＜１０％ゆえに満足させるものである。不運なことに、広範なＴ細胞枯渇およびドナーとレシピエントとの間のＨＬＡミスマッチと結びつけられた移植手順の十分な免疫抑制は、極めて高率の移植後感染性合併症をもたらし、疾患再発の高い発生率に寄与する。
幹細胞移植は、造血幹細胞およびそれらの子孫が関わる広く種々の疾患を処置する有効な手段と判明した一方で、組織適合性ドナーの不足は、このアプローチの最も広い適用に対する主な障害であると判明した。血縁のない幹細胞ドナーおよび／または臍帯血バンクの大きな一団の導入は、その問題を緩和する一助となったが、多くの患者は、いずれの供給源とも適合しないままである。マッチしたドナーが見出され得る場合ですら、検索の開始と幹細胞の収集との間に経過した時間は、通常、最も必要な患者のうちの多くを運命付け得る遅れである３ヶ月を超える。従って、ＨＬＡハプロタイプ一致の家族ドナーを利用するにあたっては、かなりの重要性が存在している。かかるドナーは、親、同胞（ｓｉｂｌｉｎｇ）、もしくは第２度近親者であり得る。移植拒絶という問題は、幹細胞の適切な馴化および大きな用量の組み合わせによって克服され得る一方で、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は、ドナー移植片の広範なＴ細胞枯渇によって防止され得る。このような手順の即座の結果は、移植後免疫抑制の非存在下ですら、成人および小児の両方に関して生着率＞９０％および重症ＧｖＨＤ率＜１０％ゆえに満足させるものである。不運なことに、広範なＴ細胞枯渇およびドナーとレシピエントとの間のＨＬＡミスマッチと結びつけられた移植手順の十分な免疫抑制は、極めて高率の移植後感染性合併症をもたらし、疾患再発の高い発生率に寄与する。
ドナーＴ細胞注入は、同種幹細胞移植後の抗ウイルス免疫および抗腫瘍免疫を付与するための有効なストラテジーである。しかし、ハプロタイプ一致移植後に患者にＴ細胞を単純に追加戻し（ａｄｄｂａｃｋ）しても、機能させられない；同種反応性Ｔ細胞の頻度は、例えば、ウイルス特異的Ｔリンパ球の頻度より数桁高い。同種反応性細胞を最初に枯渇させたドナーＴ細胞を投与することによって、免疫再形成を促進するための方法が開発されつつある。これを達成するための１つの方法は、ドナーＴ細胞をレシピエントのＥＢＶで形質転換したＢリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）で刺激することである。同種反応性Ｔ細胞は、ＣＤ２５発現をアップレギュレートし、ＣＤ２５ Ｍａｂ免疫毒素結合体、ＲＦＴ５－ＳＭＰＴ－ｄｇＡによって排除される。この化合物は、化学的に脱グリコシル化されたリシンＡ鎖（ｄｇＡ）へとヘテロ二官能性架橋剤［Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－ｄ－（２－ピリジルチオ）トルエン］を介して結合体化したマウスＩｇＧ１抗ＣＤ２５（ＩＬ－２レセプターα鎖）からなる。
ＬＣＬ刺激後のＣＤ２５免疫毒素での処置は、同種反応性細胞のうちの＞９０％を枯渇させる。フェーズＩ臨床研究において、ＣＤ２５免疫毒素を使用して同種反応性リンパ球を枯渇させ、同種枯渇させた後の免疫再形成ドナーＴ細胞を２用量レベルで、Ｔ細胞枯渇ハプロタイプ一致ＳＣＴのレシピエントへと注入した。８名の患者を、１０４細胞／ｋｇ／用量で処置し、８名の患者に、１０５ 細胞／ｋｇ／用量を与えた。１０５細胞／ｋｇ／用量を受ける患者は、１０４ 細胞／ｋｇ／用量を受ける患者と比較して、ＳＣＴ後の３ヶ月、４ヶ月、および５ヶ月で、有意に改善されたＴ細胞回復を示した（Ｐ＜０．０５）。促進されたＴ細胞回復は、エフェクター記憶（ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＣＲ－７（－））集団の拡大の結果として起こった（Ｐ＜０．０５）。このことは、防御Ｔ細胞応答が長く生存するようであることを示唆する。Ｔ細胞レセプターシグナルジョイント除去サークル（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌ ｊｏｉｎｔ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｃｉｒｃｌｅ）（ＴＲＥＣ）は、用量レベル２の患者においてＴ細胞の再構築において検出されなかった。このことは、それらがその注入された同種枯渇した細胞に由来するようであることを示す。４ヶ月でのＴ細胞のスペクトルタイピング（ｓｐｅｃｔｒａｔｙｐｉｎｇ）は、ポリクローナルＶβレパートリーを示した。四量体および酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを使用すると、用量レベル２では６名の評価可能な患者のうちの４名において、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）特異的応答が移植後２～４ヶ月程度の早さで観察されたが、このような応答は、用量レベル１の患者において６～１２ヶ月まで観察されなかった。有意な急性の移植片対宿主病（１６名のうちの２名）および慢性の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ；１５名のうちの２名）の発生率は、低かった。これらのデータは、同種枯渇したドナーＴ細胞が、ハプロタイプ一致ＳＣＴ後にＴ細胞回復を改善するために安全に使用され得ることを示す。注入される細胞の量を、その後、ＧｖＨＤの証拠なしに１０６ 細胞／ｋｇへと上昇させた。
このアプローチは、抗ウイルス免疫を再構築したが、再発は主要な問題のままであり、６名の患者は、高リスクの白血病再発のために移植し疾患で死亡した。従って、より高いＴ細胞用量は、抗腫瘍免疫を再構築するために、および待ち望まれた抗腫瘍効果を提供するために有用である。なぜなら腫瘍反応性前駆体のその推測される頻度は、ウイルス反応性前駆体の頻度より１～２対数低いからである。しかし、いくらかの患者では、細胞のこれら用量は、同種枯渇の後ですらＧｖＨＤを引き起こすために十分である（Ｈｕｒｌｅｙ
ＣＫら， Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２００３；９：６１０－６１５； Ｄｅｙ ＢＲら， Ｂｒ．Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． ２００６；１３５：４２３－４３７； Ａｖｅｒｓａ Ｆら， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９８；３３９：１１８６－１１９３； Ａｖｅｒｓａ Ｆら， Ｊ Ｃ ｌｉｎ．Ｏｎ ｃｏｌ． ２００５；２３：３４４７－３４５４；Ｌａｎｇ Ｐ， Ｍｏｌ．Ｄｉｓ． ２００４；３３：２８１－２８７； Ｋｏｌｂ ＨＪら， Ｂｌｏｏｄ ２００４；１０３：７６７－７７６； Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ Ｓら， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ ２００５；５６：２９－４４； Ｂｌｅａｋｌｅｙ Ｍら， Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ
２００４；４：３７１－３８０； Ａｎｄｒｅ－Ｓｃｈｍｕｔｚ Ｉら， Ｌａｎｃｅｔ ２００２；３６０：１３０－１３７； Ｓｏｌｏｍｏｎ ＳＲら， Ｂｌｏｏｄ ２００５；１０６：１１２３－１１２９； Ａｍｒｏｌｉａ ＰＪら， Ｂｌｏｏｄ ２００６；１０８：１７９７－１８０８； Ａｍｒｏｌｉａ ＰＪら， Ｂｌｏｏｄ ２００３； Ｇｈｅｔｉｅ Ｖら， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９１；１４２：２２３－２３０； Ｍｏｌｌｄｒｅｍ ＪＪら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９；５９：２６７５－２６８１； Ｒｅｚｖａｎｉ Ｋら， ＣＩｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５；１ １：８７９９－８８０７； Ｒｅｚｖａｎｉ Ｋら， Ｂｌｏｏｄ
２００３；１０２：２８９２－２９００）。
ＣＫら， Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２００３；９：６１０－６１５； Ｄｅｙ ＢＲら， Ｂｒ．Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． ２００６；１３５：４２３－４３７； Ａｖｅｒｓａ Ｆら， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９８；３３９：１１８６－１１９３； Ａｖｅｒｓａ Ｆら， Ｊ Ｃ ｌｉｎ．Ｏｎ ｃｏｌ． ２００５；２３：３４４７－３４５４；Ｌａｎｇ Ｐ， Ｍｏｌ．Ｄｉｓ． ２００４；３３：２８１－２８７； Ｋｏｌｂ ＨＪら， Ｂｌｏｏｄ ２００４；１０３：７６７－７７６； Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ Ｓら， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ ２００５；５６：２９－４４； Ｂｌｅａｋｌｅｙ Ｍら， Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ
２００４；４：３７１－３８０； Ａｎｄｒｅ－Ｓｃｈｍｕｔｚ Ｉら， Ｌａｎｃｅｔ ２００２；３６０：１３０－１３７； Ｓｏｌｏｍｏｎ ＳＲら， Ｂｌｏｏｄ ２００５；１０６：１１２３－１１２９； Ａｍｒｏｌｉａ ＰＪら， Ｂｌｏｏｄ ２００６；１０８：１７９７－１８０８； Ａｍｒｏｌｉａ ＰＪら， Ｂｌｏｏｄ ２００３； Ｇｈｅｔｉｅ Ｖら， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９１；１４２：２２３－２３０； Ｍｏｌｌｄｒｅｍ ＪＪら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９９；５９：２６７５－２６８１； Ｒｅｚｖａｎｉ Ｋら， ＣＩｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５；１ １：８７９９－８８０７； Ｒｅｚｖａｎｉ Ｋら， Ｂｌｏｏｄ
２００３；１０２：２８９２－２９００）。
（移植片対宿主病（ＧｖＨＤ））
移植片対宿主病は、ドナーの免疫担当細胞（例えば、Ｔ細胞）をレシピエントへと移植した後にときおり起こる状態である。上記移植した細胞は、そのレシピエントの細胞を外来物質として認識し、それらを攻撃および破壊する。この状態は、Ｔ細胞移植の、特に、ハプロタイプ一致幹細胞移植と関連する場合に、危険な効果であり得る。十分なＴ細胞が、有益な効果（例えば、免疫系の再形成および移植片の抗腫瘍効果など）を提供するために注入されるべきである。しかし、移植され得るＴ細胞の数は、移植が重症の移植片対宿主病を生じるという懸念によって制限され得る。
移植片対宿主病は、ドナーの免疫担当細胞（例えば、Ｔ細胞）をレシピエントへと移植した後にときおり起こる状態である。上記移植した細胞は、そのレシピエントの細胞を外来物質として認識し、それらを攻撃および破壊する。この状態は、Ｔ細胞移植の、特に、ハプロタイプ一致幹細胞移植と関連する場合に、危険な効果であり得る。十分なＴ細胞が、有益な効果（例えば、免疫系の再形成および移植片の抗腫瘍効果など）を提供するために注入されるべきである。しかし、移植され得るＴ細胞の数は、移植が重症の移植片対宿主病を生じるという懸念によって制限され得る。
移植片対宿主病は、以下の表に示されるように病期分類され得る：
急性ＧｖＨＤグレード判定は、コンセンサス会議基準によって行われ得る（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ Ｄら．， １９９４ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ａｃｕｔｅ ＧＶＨＤ Ｇｒａｄｉｎｇ． Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １９９５；１５：８２５－８２８）。
細胞治療および遺伝子操作された細胞移植の「安全スイッチ」としての誘導性カスパーゼ－９
移植片対宿主病の作用を低減するとは、例えば、患者がより低いレベルのステージに割り当てられ得るように、ＧｖＨＤの症状における減少、または例えば、移植片対宿主病の症状を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減少させることを意味する。移植片対宿主病の効果の減少はまた、ＧｖＨＤ反応に関与する活性化Ｔ細胞の減少（例えば、マーカータンパク質（例えば、ＣＤ１９）を発現し、そしてＣＤ３を発現する細胞（例えば、ＣＤ３＋ＣＤ１９＋細胞）の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％減少など）の検出によって測定され得る。
本明細書で提供されるのは、二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）を結合するために最適化されるＦＫＢＰバリアントと融合されるヒトアポトーシス促進分子に基づく代替の自殺遺伝子ストラテジーである。バリアントとしては、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有するＦＫＢＰ領域を含み得る（Ｃｌａｃｋｓｏｎ Ｔら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
Ｕ Ｓ Ａ． １９９８， ９５：１０４３７－１０４４２）。ＡＰ１９０３は、健常志願者において安全であると判明している合成分子である（Ｉｕｌｉｕｃｃｉ ＪＤら，
Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００１， ４１：８７０－８７９）。この小分子の投与は、アポトーシス促進標的分子の架橋および活性化を生じる。ヒトＴリンパ球におけるこの誘導性システムの適用を、Ｆａｓまたはアポトーシス促進分子としてのＦａｓ関連デスドメイン含有タンパク質（ＦＡＤＤ）のデスエフェクタードメイン（ＤＥＤ）を使用して探索した。これら誘導性死分子で形質導入されたＴ細胞の９０％までが、ＣＩＤの投与後にアポトーシスを受けた（Ｔｈｏｍｉｓ ＤＣら， Ｂｌｏｏｄ． ２００１， ９７：１２４９－１２５７； Ｓｐｅｎｃｅｒ ＤＭら， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ． １９９６， ６： ８３９－８４７； Ｆａｎ Ｌら， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
１９９９， １０： ２２７３－２２８５； Ｂｅｒｇｅｒ Ｃら， Ｂｌｏｏｄ． ２００４， １０３：１２６１－１２６９； Ｊｕｎｋｅｒ Ｋら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００３， １０：１１８９－ １９７）。この自殺遺伝子ストラテジーは、細胞治療のために使用される任意の適切な細胞（例えば、造血幹細胞、および他の前駆体細胞（例えば、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞が挙げられる）が挙げられる）において使用され得る。ＡＰ２０１８７およびＡＰ１９５０（ＡＰ１９０３の合成バージョン）はまた、リガンド誘導物質として使用され得る（Ａｍａｒａ ＪＦ （９７） ＰＮＡＳ ９４：１０６１８－２３； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ－Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）。
Ｕ Ｓ Ａ． １９９８， ９５：１０４３７－１０４４２）。ＡＰ１９０３は、健常志願者において安全であると判明している合成分子である（Ｉｕｌｉｕｃｃｉ ＪＤら，
Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００１， ４１：８７０－８７９）。この小分子の投与は、アポトーシス促進標的分子の架橋および活性化を生じる。ヒトＴリンパ球におけるこの誘導性システムの適用を、Ｆａｓまたはアポトーシス促進分子としてのＦａｓ関連デスドメイン含有タンパク質（ＦＡＤＤ）のデスエフェクタードメイン（ＤＥＤ）を使用して探索した。これら誘導性死分子で形質導入されたＴ細胞の９０％までが、ＣＩＤの投与後にアポトーシスを受けた（Ｔｈｏｍｉｓ ＤＣら， Ｂｌｏｏｄ． ２００１， ９７：１２４９－１２５７； Ｓｐｅｎｃｅｒ ＤＭら， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ． １９９６， ６： ８３９－８４７； Ｆａｎ Ｌら， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
１９９９， １０： ２２７３－２２８５； Ｂｅｒｇｅｒ Ｃら， Ｂｌｏｏｄ． ２００４， １０３：１２６１－１２６９； Ｊｕｎｋｅｒ Ｋら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００３， １０：１１８９－ １９７）。この自殺遺伝子ストラテジーは、細胞治療のために使用される任意の適切な細胞（例えば、造血幹細胞、および他の前駆体細胞（例えば、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞が挙げられる）が挙げられる）において使用され得る。ＡＰ２０１８７およびＡＰ１９５０（ＡＰ１９０３の合成バージョン）はまた、リガンド誘導物質として使用され得る（Ａｍａｒａ ＪＦ （９７） ＰＮＡＳ ９４：１０６１８－２３； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ－Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）。
従って、この安全スイッチ（カスパーゼ－９によって触媒される）は、トランスフェクトまたは形質導入された治療用細胞の除去を要する細胞治療患者における状態が存在する場合に使用され得る。上記細胞が除去される必要があり得る状態としては、例えば、ＧｖＨＤ、上記細胞が誤った組織または細胞タイプのより成熟した細胞へ不適切に分化すること、および他の毒性が挙げられる。不適切な分化の場合にカスパーゼ－９スイッチを活性化するために、組織特異的プロモーターを使用することは可能である。例えば、前駆体細胞が骨および脂肪細胞へと分化する、および脂肪細胞が望ましくない場合、上記前駆体細胞をトランスフェクトまたは形質導入するために使用されるベクターは、カスパーゼ－９ヌクレオチド配列に作動可能に連結された脂肪細胞特異的プロモーターを有し得る。このように、多量体リガンドの投与の際に、上記細胞が脂肪細胞へと分化するのであれば、その不適切に分化した脂肪細胞のアポトーシスが生じるはずである。
上記方法は、例えば、細胞治療によって緩和され得る任意の障害（がん、血液または骨髄におけるがん、他の血液または骨髄由来の疾患（例えば、鎌状赤血球貧血および異染性白質ジストロフィー（ｍｅｔａｃｈｒｏｍｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ））、および幹細胞移植によって緩和され得る任意の障害（例えば、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィー（ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｌ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）などの血液または骨髄障害）が挙げられる）のために使用され得る。
養子免疫療法の効力は、治療用Ｔ細胞を腫瘍細胞によって使用される免疫回避ストラテジーに耐性にすることによって高められ得る。インビトロ研究は、これがドミナントネガティブレセプターまたは免疫調節性サイトカインでの形質導入によって達成され得ることを示した（Ｂｏｌｌａｒｄ ＣＭら， Ｂｌｏｏｄ． ２００２， ９９：３１７９－３１８７： Ｗａｇｎｅｒ ＨＪら， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００４，
１１：８１－９１）。さらに、抗原特異的Ｔ細胞レセプターの移入は、Ｔ細胞治療をより広い範囲の腫瘍へと適用することを可能にする（Ｐｕｌｅ Ｍら， Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ． ２００３， ５：２１１－２２６； Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ＴＮ， Ｎａｔ
Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２， ２：５１２－５１９）。操作されたヒトＴ細胞の自殺システムを、臨床研究における該Ｔ細胞のその後の使用を可能にするために開発および試験した。カスパーゼ－９を改変したところ、ヒトＴリンパ球において、それらの機能的および表現型特性を損なうことなく、アップレギュレートされた抗アポトーシス分子を有するＴ細胞ですら、ＣＩＤへの感受性を示す一方で安定して発現されることが示された（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ， Ｋ．Ｃ．ら， ２００５， Ｂｌｏｏｄ １０５：４２４８－５４）。
１１：８１－９１）。さらに、抗原特異的Ｔ細胞レセプターの移入は、Ｔ細胞治療をより広い範囲の腫瘍へと適用することを可能にする（Ｐｕｌｅ Ｍら， Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ． ２００３， ５：２１１－２２６； Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ＴＮ， Ｎａｔ
Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２， ２：５１２－５１９）。操作されたヒトＴ細胞の自殺システムを、臨床研究における該Ｔ細胞のその後の使用を可能にするために開発および試験した。カスパーゼ－９を改変したところ、ヒトＴリンパ球において、それらの機能的および表現型特性を損なうことなく、アップレギュレートされた抗アポトーシス分子を有するＴ細胞ですら、ＣＩＤへの感受性を示す一方で安定して発現されることが示された（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ， Ｋ．Ｃ．ら， ２００５， Ｂｌｏｏｄ １０５：４２４８－５４）。
遺伝子治療のために使用される遺伝子改変された細胞において、その遺伝子は、その遺伝子を発現するために使用される細胞以外の供給源に由来する異種ポリヌクレオチド配列であり得る。上記遺伝子は、細菌、ウイルス、酵母、寄生生物、植物、またはさらには動物などの原核生物または真核生物供給源に由来する。この異種ＤＮＡはまた、１つより多くの供給源に由来する（すなわち、マルチ遺伝子構築物または融合タンパク質）。この異種ＤＮＡはまた、１つの供給源に由来する制御配列および異なる供給源に由来する遺伝子を含み得る。または、この異種ＤＮＡは、細胞内因性遺伝子の通常の発現を変更させるために使用される制御配列を含み得る。
（他のカスパーゼ分子）
最新技術のキメラポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｏｔｉｄｅ）によってコードされ得るカスパーゼ－９以外のカスパーゼポリペプチドとしては、例えば、カスパーゼ－１、カスパーゼ－３、およびカスパーゼ－８が挙げられる。これらカスパーゼポリペプチドの考察は、例えば、ＭａｃＣｏｒｋｌｅ， Ｒ．Ａ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． （１９９８） ９５：３６５５－３６６０； および Ｆａｎ， Ｌ．ら （１９９９） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２２７３－２２８５）に見出され得る。
最新技術のキメラポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｏｔｉｄｅ）によってコードされ得るカスパーゼ－９以外のカスパーゼポリペプチドとしては、例えば、カスパーゼ－１、カスパーゼ－３、およびカスパーゼ－８が挙げられる。これらカスパーゼポリペプチドの考察は、例えば、ＭａｃＣｏｒｋｌｅ， Ｒ．Ａ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． （１９９８） ９５：３６５５－３６６０； および Ｆａｎ， Ｌ．ら （１９９９） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２２７３－２２８５）に見出され得る。
（発現構築物の操作）
発現構築物は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ－９ポリペプチド、またはある種の実施形態では、多量体リガンド結合領域およびマーカーポリペプチドに連結されたカスパーゼ－９ポリペプチド（全て作用的に連結される）をコードする。一般に、用語「作動可能に連結される」とは、プロモーター配列が第２の配列に機能的に連結される（ここで例えば、上記プロモーター配列は、上記第２の配列に相当するＤＮＡの転写を開始および媒介する）ことを示すことを意味する。このカスパーゼ－９ポリペプチドは、全長であってもよいし、短縮型であってもよい。ある種の実施形態において、上記マーカーポリペプチドは、上記カスパーゼ－９ポリペプチドに連結される。例えば、上記マーカーポリペプチドは、ポリペプチド配列（例えば、切断可能な２Ａ様配列など）を介して上記カスパーゼ－９ポリペプチドに連結され得る。上記マーカーポリペプチドは、例えば、ＣＤ１９であり得るか、または例えば、異種タンパク質であり得、キメラカスパーゼポリペプチドの活性に影響を及ぼさないように選択され得る。
発現構築物は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ－９ポリペプチド、またはある種の実施形態では、多量体リガンド結合領域およびマーカーポリペプチドに連結されたカスパーゼ－９ポリペプチド（全て作用的に連結される）をコードする。一般に、用語「作動可能に連結される」とは、プロモーター配列が第２の配列に機能的に連結される（ここで例えば、上記プロモーター配列は、上記第２の配列に相当するＤＮＡの転写を開始および媒介する）ことを示すことを意味する。このカスパーゼ－９ポリペプチドは、全長であってもよいし、短縮型であってもよい。ある種の実施形態において、上記マーカーポリペプチドは、上記カスパーゼ－９ポリペプチドに連結される。例えば、上記マーカーポリペプチドは、ポリペプチド配列（例えば、切断可能な２Ａ様配列など）を介して上記カスパーゼ－９ポリペプチドに連結され得る。上記マーカーポリペプチドは、例えば、ＣＤ１９であり得るか、または例えば、異種タンパク質であり得、キメラカスパーゼポリペプチドの活性に影響を及ぼさないように選択され得る。
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、カスパーゼ－９ポリペプチドおよび異種タンパク質（これは、例えば、マーカーポリペプチドであり得、例えば、キメラ抗原レセプターであり得る）をコードし得る。上記異種ポリペプチド、例えば、上記キメラ抗原レセプターは、ポリペプチド配列（例えば、切断可能な２Ａ様配列など）を介して上記カスパーゼ－９ポリペプチドに連結され得る。
ある種の例では、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸は、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同じベクター（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターなど）の中に含まれる。この第２のポリペプチドは、例えば、カスパーゼポリペプチド（本明細書で論じられるとおり）またはマーカーポリペプチドであり得る。これらの例では、上記構築物は、切断可能な２Ａポリペプチドによって連結される上記２種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸に作動可能に連結された１個のプロモーターとともにデザインされ得る。この例では、上記第１のおよび第２のポリペプチドは、翻訳の間に分断され、キメラ抗原レセプターポリペプチド、および上記第２のポリペプチドを生じる。他の例では、上記２種のポリペプチドは、同じベクターから別個に発現され得、ここで上記ポリペプチドのうちの一方をコードするポリヌクレオチドを含む各核酸が、別個のプロモーターに作動可能に連結される。なお他の例では、１個のプロモーターは、上記２個の核酸に作動可能に連結され得、２個の別個のＲＮＡ転写物、従って２種のポリペプチドの生成を指向し得る。従って、本明細書で論じられる発現構築物は、少なくとも１個、または少なくとも２個のプロモーターを含み得る。
２Ａ様配列、または「切断可能な」２Ａ配列は、例えば、多くの異なるウイルス（例えば、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａが挙げられる）に由来する。これらの配列はときおり、「ペプチドスキッピング配列（ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」としても公知である。このタイプの配列は、分断されることが意図される２個のペプチドの間でシストロン内に配置される場合、リボソームは、ペプチド結合をスキップするようであり、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ配列の場合、Ｇｌｙアミノ酸とＰｒｏアミノ酸との間の結合は省かれる。これは、２種のポリペプチド、この場合には、上記カスパーゼ－９ポリペプチドおよび上記マーカーポリペプチドを残す。この配列が使用される場合、２Ａ配列の５’側にコードされるペプチドは、カルボキシ末端におけるさらなるアミノ酸（Ｇｌｙ残基が挙げられる）および２Ａ配列における任意の上流で終わり得る。２Ａ配列の３’側にコードされる上記ペプチドは、アミノ末端におけるさらなるアミノ酸（Ｐｒｏ残基が挙げられる）および２Ａ配列における任意の下流で終わり得る。「２Ａ」または「２Ａ様」配列は、ペプチド結合スキッピングを引き起こし得るペプチドの大きなファミリーの一部である。種々の２Ａ配列が特徴付けられており（例えば、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ）、本出願のポリペプチドにおいて使用され得る２Ａ様配列の例である。ある種の実施形態において、その２Ａリンカーは、配列番号３０６のアミノ酸配列を含む；ある種の実施形態において、その２Ａリンカーは、配列番号３０６のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、その２Ａリンカーは、配列番号３０７のアミノ酸配列を含む；いくつかの実施形態において、その２Ａリンカーは、配列番号３０７のアミノ酸配列からなる。ある種の実施形態において、その２Ａリンカーは、ポリペプチドのアミノ末端においてＧＳＧアミノ酸配列をさらに含み、他の実施形態において、その２Ａリンカーは、ポリペプチドのアミノ末端においてＧＳＧＰＲアミノ酸配列を含む。従って、「２Ａ」配列によって、その用語は、本明細書で列挙されるとおりの２Ａ配列に言及してもよいし、そのリンカーのアミノ末端においてＧＳＧまたはＧＳＧＰＲ配列をさらに含む、本明細書で列挙されるとおりの２Ａ配列に言及してもよい。
発現構築物は、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドベクター）へと挿入され得る。提供される方法のことは、任意の適切な方法を使用して行われ得る；これら方法としては、抗原提示細胞（本明細書で示される）へと核酸を形質導入、形質転換、またはさもなければ提供するための方法が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、短縮型カスパーゼ－９ポリペプチドは、ＤＮＡリンカーありもしくはなしで、配列番号８、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７のヌクレオチド配列、もしくはこれらの機能的に等価なフラグメントによってコードされるか、あるいは配列番号９、配列番号２４、配列番号２６、もしくは配列番号２８のアミノ酸配列またはこれらの機能的に等価なフラグメントを有する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ポリペプチドは、ＤＮＡリンカーありもしくはなしで、配列番号１４のヌクレオチド配列もしくはその機能的に等価なフラグメントによってコードされるか、または配列番号１５のアミノ酸配列もしくはその機能的に等価なフラグメントを有する。カスパーゼ－９ポリペプチドの機能的に等価なフラグメントは、配列番号９のポリペプチドと実質的に同じアポトーシスを誘導する能力を有し、配列番号９のポリペプチドの能力のうちの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を有する。ＣＤ１９ポリペプチドの機能的に等価なフラグメントは、標準的検出技術を使用して、配列番号１５のポリペプチドと比較される場合、形質導入またはトランスフェクトされた細胞を同定および選択するために使用されるべきマーカーとして作用する、検出されているマーカーポリペプチドのうちの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を有して、配列番号１５のポリペプチドと実質的に同じ能力を有する。
より詳細には、１個より多くのリガンド結合ドメインまたは多量体化領域は、発現構築物の中で使用され得る。なおさらには、上記発現構築物は、膜標的化配列を含む。適切な発現構築物は、上記のＦＫＢＰリガンド結合エレメントのいずれかの側に、共刺激ポリペプチドエレメントを含み得る。
ある種の例では、誘導性カスパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドと同じベクター（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターなど）の中に含まれる。これらの例では、上記構築物は、切断可能な２Ａポリペプチドによって連結される２種のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に作動可能に連結された１個のプロモーターでデザインされ得る。この例では、上記第１のおよび第２のポリペプチドは、発現後に切断され、キメラ抗原レセプターポリペプチドおよび誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドを生じる。他の例では、上記２種のポリペプチドは、同じベクターから別個に発現され得、ここで上記ポリペプチドのうちの一方をコードするヌクレオチド配列を含む各核酸が、別個のプロモーターに作動可能に連結される。なお他の例では、１個のプロモーターは、２個の核酸に作動可能に連結され得、２個の別個のＲＮＡ転写物、従って、２種のポリペプチドの生成を指向し得る。従って、本明細書で論じられる発現構築物は、少なくとも１個、または少なくとも２個のプロモーターを含み得る。
なお他の例では、２種のポリペプチドは、２個の別個のベクターを使用して、細胞において発現され得る。上記細胞は、上記ベクターで共トランスフェクトまたは共形質転換され得るか、または上記ベクターは、種々の時間で上記細胞へと導入され得る。
（リガンド結合領域）
発現構築物のリガンド結合（「二量体化」）ドメインまたは多量体化領域は、天然または非天然のリガンド、例えば、非天然の合成リガンドを使用して誘導を可能にし得る任意の好都合なドメインであり得る。多量体化領域は、構築物の性質およびリガンドの選択に応じて、細胞膜に対して内側または外側であり得る。上に示された細胞質領域と会合されるリガンド結合タンパク質を含むレセプターをはじめとした多種多様のリガンド結合タンパク質が公知である。本明細書中で使用されるとき、用語「リガンド結合ドメイン」は、用語「レセプター」と相互交換可能であり得る。リガンド（例えば、小さい有機リガンド）が公知であるかまたは容易に生成され得るリガンド結合タンパク質が、特に興味深い。これらのリガンド結合ドメインまたはレセプターには、ＦＫＢＰおよびシクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、上に示された他のレセプターなど、ならびに抗体から得ることができる「非天然の」レセプター、特に、重鎖または軽鎖サブユニット、その変異された配列、確率論的手順、コンビナトリアル合成などによって得られるランダムアミノ酸配列が含まれる。ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、ステロイドレセプターリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域およびテトラサイクリンレセプターリガンド結合領域からなる群より選択される。しばしば、リガンド結合領域は、ＦｖＦｖｌｓ配列を含む。時折、Ｆｖ’Ｆｖｌｓ配列は、さらなるＦｖ’配列をさらに含む。例としては、例えば、Ｋｏｐｙｔｅｋ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：３１３－３２１（２０００）およびＧｅｓｔｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍ．＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １０：６６７－６７５（２００７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ Ｔ（２００６）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ６７：４４０－２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，ｓ．ら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，２００７））において論じられているものが挙げられる。
発現構築物のリガンド結合（「二量体化」）ドメインまたは多量体化領域は、天然または非天然のリガンド、例えば、非天然の合成リガンドを使用して誘導を可能にし得る任意の好都合なドメインであり得る。多量体化領域は、構築物の性質およびリガンドの選択に応じて、細胞膜に対して内側または外側であり得る。上に示された細胞質領域と会合されるリガンド結合タンパク質を含むレセプターをはじめとした多種多様のリガンド結合タンパク質が公知である。本明細書中で使用されるとき、用語「リガンド結合ドメイン」は、用語「レセプター」と相互交換可能であり得る。リガンド（例えば、小さい有機リガンド）が公知であるかまたは容易に生成され得るリガンド結合タンパク質が、特に興味深い。これらのリガンド結合ドメインまたはレセプターには、ＦＫＢＰおよびシクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、上に示された他のレセプターなど、ならびに抗体から得ることができる「非天然の」レセプター、特に、重鎖または軽鎖サブユニット、その変異された配列、確率論的手順、コンビナトリアル合成などによって得られるランダムアミノ酸配列が含まれる。ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、ステロイドレセプターリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域およびテトラサイクリンレセプターリガンド結合領域からなる群より選択される。しばしば、リガンド結合領域は、ＦｖＦｖｌｓ配列を含む。時折、Ｆｖ’Ｆｖｌｓ配列は、さらなるＦｖ’配列をさらに含む。例としては、例えば、Ｋｏｐｙｔｅｋ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：３１３－３２１（２０００）およびＧｅｓｔｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍ．＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ １０：６６７－６７５（２００７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ Ｔ（２００６）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ６７：４４０－２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，ｓ．ら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，２００７））において論じられているものが挙げられる。
おおむね、リガンド結合ドメインまたはレセプタードメインは、天然のドメインまたはその切断された活性な一部として、少なくとも約５０アミノ酸、および約３５０アミノ酸未満、通常、２００アミノ酸未満であり得る。結合ドメインは、例えば、低分子（ウイルスベクターでの効率的なトランスフェクションを可能にする＜２５ｋＤａ）であり得、モノマーであり得、非免疫原性であり得、二量体化のために形成され得る、合成的に入手可能な細胞透過性の無毒性リガンドを有し得る。
レセプタードメインは、発現構築物のデザインおよび適切なリガンドの利用可能性に応じて、細胞内または細胞外であり得る。疎水性リガンドの場合、結合ドメインは、膜のいずれの側であってもよいが、親水性リガンド、特に、タンパク質リガンドの場合、リガンドを結合にとって利用可能な形態で内部移行させるための輸送系が存在しない場合、結合ドメインは、通常、細胞膜に対して外側であり得る。細胞内レセプターの場合、構築物は、レセプタードメイン配列の５’または３’においてシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインをコードし得るか、またはレセプタードメイン配列の５’に脂質付着シグナル配列を有し得る。レセプタードメインが、シグナルペプチドと膜貫通ドメインとの間に存在する場合、レセプタードメインは、細胞外であり得る。
レセプターをコードする発現構築物の一部は、種々の理由のために変異誘発に供され得る。変異誘発されたタンパク質は、より高い結合親和性を提供し得、天然に存在するレセプターと変異誘発されたレセプターとのリガンドによる区別を可能にし得、レセプター－リガンド対などをデザインする機会を提供し得る。レセプターの変更は、結合部位におけるコンビナトリアル法を使用したランダム変異誘発と知られているアミノ酸の変更を含み得、ここで、結合部位に関連するアミノ酸または立体構造変化に関連する他のアミノ酸に対するコドンが、特定のアミノ酸に対するコドン（複数可）を公知の変化によってまたはランダムに変更し、得られるタンパク質を適切な原核生物宿主において発現し、次いで、得られたタンパク質を結合についてスクリーニングすることによって、変異誘発に供され得る。
抗体および抗体サブユニット、例えば、重鎖もしくは軽鎖、特にフラグメント、より詳細には、可変領域の全部もしくは一部、または高親和性結合をもたらす重鎖と軽鎖との融合物が、結合ドメインとして使用され得る。企図される抗体には、免疫応答を引き起こさず、一般に末梢（すなわち、ＣＮＳ／脳領域の外側）では発現されない細胞外ドメインなどの異所的に発現されたヒト生成物であるものが含まれる。そのような例としては、低親和性神経成長因子レセプター（ＬＮＧＦＲ）および胚表面タンパク質（すなわち、癌胎児抗原）が挙げられるが、これらに限定されない。
なおもさらに、抗体は、生理的に許容され得るハプテン分子、および結合親和性についてスクリーニングされる個別の抗体サブユニットに対して調製され得る。そのサブユニットをコードするｃＤＮＡは、単離され、定常領域、可変領域の一部の欠失、可変領域の変異誘発などによって改変されることにより、リガンドに対して適切な親和性を有する結合タンパク質ドメインを得ることができる。このように、ほとんどの生理的に許容され得る任意のハプテン化合物が、リガンドとして使用され得るか、またはリガンドに対するエピトープを提供するために使用され得る。抗体単位の代わりに、結合ドメインが公知であって、結合のための有用なリガンドが存在する、天然のレセプターが使用され得る。
（オリゴマー化）
形質導入されるシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンド媒介性のオリゴマー化によって、すなわち、リガンドが結合した後のオリゴマー化の結果として、生じ得るが、他の結合事象、例えば、アロステリックな活性化が、シグナルを惹起するために使用され得る。キメラタンパク質の構築物は、様々なドメインの順序および個々のドメインの反復の数に関して、変動し得る。
形質導入されるシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンド媒介性のオリゴマー化によって、すなわち、リガンドが結合した後のオリゴマー化の結果として、生じ得るが、他の結合事象、例えば、アロステリックな活性化が、シグナルを惹起するために使用され得る。キメラタンパク質の構築物は、様々なドメインの順序および個々のドメインの反復の数に関して、変動し得る。
レセプターを多量体化する場合、キメラ表面膜タンパク質のリガンド結合ドメイン／レセプタードメインに対するリガンドは、通常、少なくとも２つの結合部位を有し、それらの結合部位の各々がリガンドレセプタードメインに結合することができるという意味において、多量体であり得る。「多量体リガンド結合領域」とは、多量体リガンドに結合するリガンド結合領域のことを意味する。用語「多量体リガンド」には、二量体のリガンドが含まれる。二量体のリガンドは、リガンドレセプタードメインに結合することができる２つの結合部位を有し得る。望ましくは、対象のリガンドは、二量体またはそれより高次のオリゴマー、通常、約四量体以下の、小さい合成有機分子であり得、個々の分子は、代表的には、少なくとも約１５０Ｄａおよび約５ｋＤａ未満、通常、約３ｋＤａ未満であり得る。合成リガンドとレセプターとの種々の対が、使用され得る。例えば、天然のレセプターを含む実施形態において、二量体のＦＫ５０６は、ＦＫＢＰ１２レセプターとともに使用され得、二量体化されたシクロスポリンＡは、シクロフィリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたエストロゲンは、エストロゲンレセプターとともに使用され得、二量体化された糖質コルチコイドは、糖質コルチコイドレセプターとともに使用され得、二量体化されたテトラサイクリンは、テトラサイクリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたビタミンＤは、ビタミンＤレセプターとともに使用され得るなど。あるいは、それより高次のリガンド、例えば、三量体が、使用され得る。非天然のレセプター、例えば、抗体サブユニット、改変された抗体サブユニット、フレキシブルリンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体、または改変されたレセプターならびにその変異された配列などを含む実施形態の場合、多種多様な化合物のうちのいずれかが使用され得る。これらのリガンド単位の有意な特色は、各結合部位が、高親和性でレセプターに結合することができる点、およびそれらのリガンド単位が、化学的に二量体化されることができる点である。また、リガンドが、機能的なレベルで血清に溶解することができ、なおもほとんどの用途のために原形質膜を横断して拡散することができるように、それらのリガンドの疎水性／親水性のバランスをとる方法も利用可能である。
ある特定の実施形態において、本方法は、条件的にコントロールされるタンパク質またはポリペプチドを生成するために、化学的に誘導される二量体化（ＣＩＤ）の手法を利用する。この手法は、誘導可能であることに加えて、不安定な二量体化剤の分解またはモノマーの競合的阻害剤の投与に起因して、可逆的である。
ＣＩＤシステムは、合成二価リガンドを使用して、リガンド結合ドメインに融合されたシグナル伝達分子を迅速に架橋する。このシステムは、細胞表面タンパク質（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３．２６２：ｐ．１０１９－１０２４；Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９９６，６：８３９－８４７；Ｂｌａｕ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７，９４：３０７６－３０８１）またはサイトゾルタンパク質（Ｌｕｏ，Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３８３：１８１－１８５；ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８，９５：３６５５－３６６０）のオリゴマー化および活性化、転写を調節するＤＮＡエレメントへの転写因子のリクルートメント（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３８２：８２２－８２６；Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９６，２：１０２８－１０３２）またはシグナル伝達を刺激する原形質膜へのシグナル伝達分子のリクルートメント（Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９２：９８０５－９８０９；Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９５：９８１０－９８１４）を引き起こすために使用されている。
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９８，９５：３６５５－３６６０）のオリゴマー化および活性化、転写を調節するＤＮＡエレメントへの転写因子のリクルートメント（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３８２：８２２－８２６；Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９６，２：１０２８－１０３２）またはシグナル伝達を刺激する原形質膜へのシグナル伝達分子のリクルートメント（Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９２：９８０５－９８０９；Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９５：９８１０－９８１４）を引き起こすために使用されている。
ＣＩＤシステムは、表面レセプターの凝集が、下流のシグナル伝達カスケードを効率的に活性化するという概念に基づく。最も単純な実施形態において、ＣＩＤシステムは、脂質透過性免疫抑制薬ＦＫ５０６の二量体アナログを使用し、その二量体アナログは、その正常な生物活性を失っているが、ＦＫ５０６結合タンパク質であるＦＫＢＰ１２に遺伝的に融合された分子を架橋する能力を獲得している。１つ以上のＦＫＢＰを、カスパーゼ－９に融合することによって、二量体化薬物に依存的であるがリガンドおよび外部ドメインに非依存的な様式でカスパーゼ－９活性を刺激することができる。これにより、時間的なコントロール、モノマー薬物アナログを使用して可逆性、および高い特異性を備えたシステムが提供される。第３世代のＡＰ２０１８７／ＡＰ１９０３ ＣＩＤの、それらの結合ドメインであるＦＫＢＰ１２に対する高親和性は、インビボにおいて、内在性のＦＫＢＰ１２による非特異的な副作用を誘導することなく、組換えレセプターの特異的な活性化を可能にする。二量体化薬物に結合する、アミノ酸の置換および欠失を有するＦＫＢＰ１２バリアント（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６）もまた使用され得る。ＦＫＢＰ１２バリアントとしては、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびアラニンからなる群より選択される３６位でアミノ酸置換を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、合成リガンドは、プロテアーゼ分解に対して抵抗性であり、それにより、インビボにおけるレセプターの活性化において、送達されるほとんどのタンパク質剤よりも効率的になる。
ＦＫＢＰ１２とは、野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチド、またはアミノ酸置換を含み得、ラパマイシンへのＦＫＢＰ１２結合活性を維持するそのアナログもしくは誘導体を意味する；ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはポリペプチド領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチドより少なくとも１／１００の低い親和性でリミズシドに結合する。いくつかの例では、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、リガンド（例えば、リミズシド）に、配列番号３０２のアミノ酸配列からなるＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチドより少なくとも１／１００の低い親和性で結合する。
ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチドとは、それは（ｉｆ）、リガンド（例えば、リミズシド）に、野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチド（例えば、配列番号３０１のアミノ酸配列からなる野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチドなど）より少なくとも１００倍高い親和性で結合するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを意味した。
使用されるリガンドは、リガンド結合ドメインの２つ以上に結合することができる。キメラタンパク質は、２つ以上のリガンド結合ドメインを含むとき、２つ以上のリガンドに結合することができる場合がある。そのリガンドは、代表的には、非タンパク質または化学物質である。例示的なリガンドとしては、ＦＫ５０６（例えば、ＦＫ１０１２）が挙げられるが、これに限定されない。
他のリガンド結合領域は、例えば、二量体の領域、またはゆらぎ置換によって改変されたリガンド結合領域、例えば、ＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）などであり得る：Ｆ３６がＶに置換されたヒト１２ｋＤａ ＦＫ５０６結合タンパク質、完全に成熟したコード配列（アミノ酸１～１０７）は、合成二量体化薬物ＡＰ１９０３に対する結合部位を提供する（Ｊｅｍａｌ，Ａ．ら、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．５８，７１－９６（２００８）；Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ，Ｗ．Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１，１５６６－７２（１９９３））。上記タンパク質の２つのタンデムなコピーは、より高次のオリゴマーが、ＡＰ１９０３による架橋の際に誘導されるようにその構築物においても使用され得る。
ＦＫＢＰ１２バリアントはまた、ＦＫＢＰ１２／ＦＲＢ多量体化領域において使用され得る。これらの融合物で使用されるバリアントは、いくつかの実施形態において、ラパマイシンまたはラパログに結合するが、例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６よりリミズシドに対して低い親和性で結合する。ＦＫＢＰ１２バリアントの例は、多くの種（例えば、酵母が挙げられる）からのものが挙げられる。一実施形態において、上記ＦＫＢＰ１２バリアントは、ＦＫＢＰ１２．６（ｃａｌｓｔａｂｌｉｎ）である。
他のヘテロ二量体は、本出願において企図されている。一実施形態において、カルシニューリンＡポリペプチドまたは領域は、ＦＲＢ多量体化領域の代わりに使用され得る。いくつかの実施形態において、第１の多量体化領域の第１のユニットは、カルシニューリン－Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第１の多量体化領域の第１のユニットは、カルシニューリン－Ａポリペプチド領域であり、第１の多量体化領域の第２のユニットは、ＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２バリアント多量体化領域である。いくつかの実施形態において、第１の多量体化領域の第１のユニットは、ＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２バリアント多量体化領域であり、第１の多量体化領域の第２のユニットは、カルシニューリン（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎｇ）－Ａポリペプチド領域である。これらの実施形態において、その第１のリガンドは、例えば、シクロスポリンを含む。
Ｆ３６Ｖ’－ＦＫＢＰ：Ｆ３６Ｖ’－ＦＫＢＰは、Ｆ３６Ｖ－ＦＫＢＰのコドンゆらぎバージョンである。それは、Ｆ３６Ｖ－ＦＫＰＢと同一のポリペプチド配列をコードするが、ヌクレオチドレベルでは６２％の相同性しか有しない。Ｆ３６Ｖ’－ＦＫＢＰは、レトロウイルスベクターにおける組換えを減少させるようにデザインされた（Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７，１７３１－５（１９９７））。Ｆ３６Ｖ’－ＦＫＢＰは、ＰＣＲアセンブリ手順によって構築された。その導入遺伝子は、１コピーのＦ３６Ｖ－ＦＫＢＰに直接連結された１コピーのＦ３６Ｖ’－ＦＫＢＰを含む。
Ｆ３６Ｖ’－ＦＫＢＰ：Ｆ３６Ｖ’－ＦＫＢＰは、Ｆ３６Ｖ－ＦＫＢＰのコドンゆらぎバージョンである。それは、Ｆ３６Ｖ－ＦＫＰＢと同一のポリペプチド配列をコードするが、ヌクレオチドレベルでは６２％の相同性しか有しない。Ｆ３６Ｖ’－ＦＫＢＰは、レトロウイルスベクターにおける組換えを減少させるようにデザインされた（Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７，１７３１－５（１９９７））。Ｆ３６Ｖ’－ＦＫＢＰは、ＰＣＲアセンブリ手順によって構築された。その導入遺伝子は、１コピーのＦ３６Ｖ－ＦＫＢＰに直接連結された１コピーのＦ３６Ｖ’－ＦＫＢＰを含む。
いくつかの実施形態において、リガンドは、小分子である。選択されたリガンド結合領域に対する適切なリガンドが、選択され得る。しばしば、リガンドは、二量体であり、時折、リガンドは、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ１９０３（ＣＡＳ索引名：２－ピペリジンカルボン酸、１－［（２Ｓ）－１－オキソ－２－（３，４，５－トリメトキシフェニル）ブチル］－、１，２－エタンジイルビス［イミノ（２－オキソ－２，１－エタンジイル）オキシ－３，１－フェニレン［（１Ｒ）－３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ－［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（Ｒ＊），２Ｒ＊］］］］］－（９ＣＩ） ＣＡＳ登録番号：１９５５１４－６３－７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０ 分子量：１４１１．６５）である。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７である。
ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７アナログ、例えば、ＡＰ１５１０などである。いくつかの実施形態において、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２に対して適切であり得、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２のゆらぎバージョンに対して適切であり得る。ある特定の実施形態において、１つのリガンド結合領域が、キメラタンパク質に含められる。他の実施形態において、２つ以上のリガンド結合領域が、含められる。例えば、リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２である場合、これらの領域の２つが含められる場合、一方は、例えば、ゆらぎバージョンであり得る。
企図される他の二量体化システムは、クーママイシン／ＤＮＡジャイレースＢシステムを含む。クーママイシン誘導性二量体化は、改変されたＲａｆタンパク質を活性化し、ＭＡＰキナーゼカスケードを刺激する。Ｆａｒｒａｒ， Ｍ． Ａ．，ら， （１９９６）
Ｎａｔｕｒｅ ３８３，１７８－１８１を参照のこと。他の実施形態において、ＧＲ Ｃｒａｂｔｒｅｅおよび共同研究者らによって開発されたアブシシン酸（ＡＢＡ）システム（Ｌｉａｎｇ ＦＳら， Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ． ２０１１ Ｍａｒ １５；４（１６４）：ｒｓ２）が使用され得るが、ＤＮＡジャイレースＢのように、これは、免疫原性である外来タンパク質に依拠する。
Ｎａｔｕｒｅ ３８３，１７８－１８１を参照のこと。他の実施形態において、ＧＲ Ｃｒａｂｔｒｅｅおよび共同研究者らによって開発されたアブシシン酸（ＡＢＡ）システム（Ｌｉａｎｇ ＦＳら， Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ． ２０１１ Ｍａｒ １５；４（１６４）：ｒｓ２）が使用され得るが、ＤＮＡジャイレースＢのように、これは、免疫原性である外来タンパク質に依拠する。
（膜標的化）
膜標的化配列または膜標的化領域は、細胞表面膜へのキメラタンパク質の輸送を提供し、ここで、同じ配列または他の配列が、細胞表面膜へのキメラタンパク質の結合をコードし得る。細胞膜と会合した分子は、膜会合を容易にするある特定の領域を含み、そのような領域は、キメラタンパク質分子に組み込まれることにより、膜標的化分子をもたらし得る。例えば、いくつかのタンパク質は、アシル化される配列をＮ末端またはＣ末端に含み、これらのアシル部分は、膜会合を容易にする。そのような配列は、アシルトランスフェラーゼによって認識され、特定の配列モチーフに一致することが多い。ある特定のアシル化モチーフは、単一のアシル部分（その後に、陰イオン性脂質頭部基との会合を改善するいくつかの正に帯電した残基（例えば、ヒトｃ－Ｓｒｃ：Ｍ－Ｇ－Ｓ－Ｎ－Ｋ－Ｓ－Ｋ－Ｐ－Ｋ－Ｄ－Ａ－Ｓ－Ｑ－Ｒ－Ｒ－Ｒ）が続くことが多い）によって修飾されることができ、他のものは、複数のアシル部分によって修飾されることができる。例えば、タンパク質チロシンキナーゼＳｒｃのＮ末端配列は、単一のミリストイル部分を含み得る。二重アシル化領域は、ある特定のタンパク質キナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーメンバーのサブセット（例えば、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ）およびＧタンパク質アルファサブユニット）のＮ末端領域内に配置されている。そのような二重アシル化領域は、そのようなタンパク質の最初の１８アミノ酸の中に配置されることが多く、それは、配列モチーフＭｅｔ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｃｙｓに一致し、ここで、Ｍｅｔは、切断され、Ｇｌｙは、Ｎ－アシル化され、Ｃｙｓ残基のうちの１つは、Ｓ－アシル化される。Ｇｌｙは、ミリストイル化されることが多く、Ｃｙｓは、パルミトイル化され得る。配列モチーフＣｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｘａａ（いわゆる「ＣＡＡＸボックス」）に一致するアシル化領域は、Ｇタンパク質ガンマサブユニットのＣ末端由来のＣ１５またはＣ１０イソプレニル部分によって修飾され得、他のタンパク質（例えば、ワールドワイドウェブアドレスｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ＤｉｓｐｌａｙＩｐｒｏＥｎｔｒｙ？ａｃ＝ＩＰＲ００１２３０）もまた使用され得る。これらのおよび他のアシル化モチーフとしては、例えば、Ｇａｕｔｈｉｅｒ－Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １５：２２０５－２２１７（２００４）；Ｇｌａｂａｔｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：６９７－７００（１９９４）およびＺｌａｋｉｎｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１０：６７３－６７９（１９９７）において論じられているものが挙げられ、そのモチーフは、膜局在化を誘導するためにキメラ分子に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、アシル化モチーフを含むタンパク質由来の天然の配列が、キメラタンパク質に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌｃｋ、ＦｙｎもしくはＹｅｓまたはＧタンパク質アルファサブユニットのＮ末端部分（例えば、そのようなタンパク質由来の最初の２５個のＮ末端アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸（例えば、随意の変異を有する、その天然の配列の約５～約２０アミノ酸、約１０～約１９アミノ酸または約１５～約１９アミノ酸））が、キメラタンパク質のＮ末端の中に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、ＣＡＡＸボックスモチーフ配列を含むＧタンパク質ガンマサブユニット由来の約２５アミノ酸以下のＣ末端配列（例えば、随意の変異を有する、天然の配列の約５～約２０アミノ酸、約１０～約１８アミノ酸または約１５～約１８アミノ酸）が、キメラタンパク質のＣ末端に連結され得る。
膜標的化配列または膜標的化領域は、細胞表面膜へのキメラタンパク質の輸送を提供し、ここで、同じ配列または他の配列が、細胞表面膜へのキメラタンパク質の結合をコードし得る。細胞膜と会合した分子は、膜会合を容易にするある特定の領域を含み、そのような領域は、キメラタンパク質分子に組み込まれることにより、膜標的化分子をもたらし得る。例えば、いくつかのタンパク質は、アシル化される配列をＮ末端またはＣ末端に含み、これらのアシル部分は、膜会合を容易にする。そのような配列は、アシルトランスフェラーゼによって認識され、特定の配列モチーフに一致することが多い。ある特定のアシル化モチーフは、単一のアシル部分（その後に、陰イオン性脂質頭部基との会合を改善するいくつかの正に帯電した残基（例えば、ヒトｃ－Ｓｒｃ：Ｍ－Ｇ－Ｓ－Ｎ－Ｋ－Ｓ－Ｋ－Ｐ－Ｋ－Ｄ－Ａ－Ｓ－Ｑ－Ｒ－Ｒ－Ｒ）が続くことが多い）によって修飾されることができ、他のものは、複数のアシル部分によって修飾されることができる。例えば、タンパク質チロシンキナーゼＳｒｃのＮ末端配列は、単一のミリストイル部分を含み得る。二重アシル化領域は、ある特定のタンパク質キナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリーメンバーのサブセット（例えば、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ）およびＧタンパク質アルファサブユニット）のＮ末端領域内に配置されている。そのような二重アシル化領域は、そのようなタンパク質の最初の１８アミノ酸の中に配置されることが多く、それは、配列モチーフＭｅｔ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｃｙｓに一致し、ここで、Ｍｅｔは、切断され、Ｇｌｙは、Ｎ－アシル化され、Ｃｙｓ残基のうちの１つは、Ｓ－アシル化される。Ｇｌｙは、ミリストイル化されることが多く、Ｃｙｓは、パルミトイル化され得る。配列モチーフＣｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｘａａ（いわゆる「ＣＡＡＸボックス」）に一致するアシル化領域は、Ｇタンパク質ガンマサブユニットのＣ末端由来のＣ１５またはＣ１０イソプレニル部分によって修飾され得、他のタンパク質（例えば、ワールドワイドウェブアドレスｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ＤｉｓｐｌａｙＩｐｒｏＥｎｔｒｙ？ａｃ＝ＩＰＲ００１２３０）もまた使用され得る。これらのおよび他のアシル化モチーフとしては、例えば、Ｇａｕｔｈｉｅｒ－Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ １５：２２０５－２２１７（２００４）；Ｇｌａｂａｔｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：６９７－７００（１９９４）およびＺｌａｋｉｎｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１０：６７３－６７９（１９９７）において論じられているものが挙げられ、そのモチーフは、膜局在化を誘導するためにキメラ分子に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、アシル化モチーフを含むタンパク質由来の天然の配列が、キメラタンパク質に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｌｃｋ、ＦｙｎもしくはＹｅｓまたはＧタンパク質アルファサブユニットのＮ末端部分（例えば、そのようなタンパク質由来の最初の２５個のＮ末端アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸（例えば、随意の変異を有する、その天然の配列の約５～約２０アミノ酸、約１０～約１９アミノ酸または約１５～約１９アミノ酸））が、キメラタンパク質のＮ末端の中に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、ＣＡＡＸボックスモチーフ配列を含むＧタンパク質ガンマサブユニット由来の約２５アミノ酸以下のＣ末端配列（例えば、随意の変異を有する、天然の配列の約５～約２０アミノ酸、約１０～約１８アミノ酸または約１５～約１８アミノ酸）が、キメラタンパク質のＣ末端に連結され得る。
いくつかの実施形態において、アシル部分は、＋１から＋６というｌｏｇ ｐ値を有し、時折、＋３から＋４．５というｌｏｇ ｐ値を有する。Ｌｏｇ ｐ値は、疎水性の尺度であり、オクタノール／水の分配研究に由来することが多く、ここで、より高い疎水性を有する分子は、より高い頻度でオクタノールに分配し、より高いｌｏｇ ｐ値を有すると特徴付けられる。Ｌｏｇ ｐ値は、いくつかの親油性分子に対して公表されており、ｌｏｇ ｐ値は、公知の分配プロセスを使用して計算され得る（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．７１，Ｉｓｓｕｅ ６，ｐａｇｅ ５９９、エントリー４４９３は、４．２というｌｏｇ ｐ値を有するラウリン酸を示している）。任意のアシル部分が、上で論じられたペプチド組成物に連結され得、公知の方法および本明細書中以後に論じられる方法を用いて抗菌活性について試験され得る。アシル部分は、時折、例えば、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、Ｃ２－Ｃ２０アルキニル、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１－Ｃ４ハロアルキル、Ｃ４－Ｃ１２シクロアルキルアルキル（ｃｙｃｌａｌｋｙｌａｌｋｙｌ）、アリール、置換アリールまたはアリール（Ｃ１－Ｃ４）アルキルである。任意のアシル含有部分は、時折、脂肪酸であり、脂肪酸部分の例は、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）、オクチル（Ｃ８）、ノニル（Ｃ９）、デシル（Ｃ１０）、ウンデシル（Ｃ１１）、ラウリル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）、アラキジル（Ｃ２０）、ベヘニル（Ｃ２２）およびリグノセリル部分（Ｃ２４）であり、各部分は、０、１、２、３、４、５、６、７または８つの不飽和（すなわち、二重結合）を含み得る。アシル部分は、時折、脂質分子（例えば、ホスファチジル脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴミエリン（ｓｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）、スフィンゴシン、セラミド、ガングリオシド、セレブロシド））またはそれらの改変バージョンである。ある特定の実施形態において、１、２、３、４もしくは５個またはそれより多くのアシル部分が、膜会合領域に連結される。
本明細書中のキメラタンパク質はまた、一回貫通型（ｓｉｎｇｌｅ－ｐａｓｓ）または複数回貫通型（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｓｓ）の膜貫通配列を含み得る（例えば、キメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端に）。一回貫通型膜貫通領域は、ある特定のＣＤ分子、チロシンキナーゼレセプター、セリン／トレオニンキナーゼレセプター、ＴＧＦベータ、ＢＭＰ、アクチビンおよびホスファターゼに見出される。一回貫通型膜貫通領域は、シグナルペプチド領域および約２０～約２５アミノ酸（それらの多くは、疎水性アミノ酸であり、アルファヘリックスを形成し得る）の膜貫通領域を含むことが多い。短いトラックの正に帯電したアミノ酸が、タンパク質を膜に繋ぎ止めるために膜貫通の範囲の後に続くことが多い。複数回貫通型タンパク質には、イオンポンプ、イオンチャネルおよびトランスポーターが含まれ、膜を複数回またぐ２つまたはそれを超えるらせんを含む。複数回貫通型タンパク質のすべてまたは実質的にすべてが、時折、キメラタンパク質に組み込まれる。一回貫通型および複数回貫通型膜貫通領域に対する配列は、公知であり、キメラタンパク質分子に組み込むために選択され得る。
宿主において機能性であり、キメラタンパク質の他のドメインのうちの１つと会合されていることもあるし会合されていないこともある、任意の膜標的化配列が、使用され得る。いくつかの実施形態において、そのような配列としては、ミリストイル化標的化配列、パルミトイル化標的化配列、プレニル化配列（すなわち、ファルネシル化、ゲラニル－ゲラニル化、ＣＡＡＸボックス）、タンパク質間相互作用モチーフ、またはレセプター由来の膜貫通配列（シグナルペプチドを利用する）が挙げられるが、これらに限定されない。例としては、例えば、ｔｅｎ Ｋｌｏｏｓｔｅｒ ＪＰら、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（２００７）９９，１－１２，Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：９３６－４０，１０９８（２００３）において論じられているものが挙げられる。
様々な膜におけるタンパク質の保持を高め得るさらなるタンパク質ドメインが存在する。例えば、約１２０アミノ酸のプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインが、代表的には細胞内のシグナル伝達に関与する２００個を超えるヒトタンパク質において見られる。ＰＨドメインは、膜内の様々なホスファチジルイノシトール（ＰＩ）脂質（例えば、ＰＩ（３，４，５）－Ｐ３、ＰＩ（３，４）－Ｐ２、ＰＩ（４，５）－Ｐ２）に結合し得るので、種々の膜コンパートメントまたは細胞内コンパートメントにタンパク質をリクルートする際に重要な役割を果たし得る。しばしば、ＰＩ脂質のリン酸化状態は、例えば、ＰＩ－３キナーゼまたはＰＴＥＮによって制御されるので、膜とＰＨドメインとの相互作用は、アシル脂質による相互作用ほど安定でない。
ＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
ＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
ＡＰ１９０３ ＡＰＩは、Ａｌｐｈｏｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．によって製造されており、ＡＰ１９０３ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、Ｆｏｒｍａｔｅｃｈ Ｉｎｃによって作製されている。それは、非イオン性可溶化剤Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５（２５０ｍｇ／ｍＬ，ＢＡＳＦ）の２５％溶液中のＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化されている。室温において、この製剤は、わずかに黄色の透明の溶液である。冷蔵されると、この製剤は、可逆的な相転移を起こし、乳白色の溶液になる。この相転移は、室温に再度温めると、元に戻る。１本分（ｔｈｅ ｆｉｌｌ）は、
３ｍＬのガラスバイアルにおける２．３３ｍＬである（バイアル１本あたり合計約１０ｍｇのＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
３ｍＬのガラスバイアルにおける２．３３ｍＬである（バイアル１本あたり合計約１０ｍｇのＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
ＡＰ１９０３は、患者に投与する前の夜に冷蔵庫から取り出され、およそ２１℃の温度で一晩保管され、その結果、その溶液は、希釈前に透明になる。その溶液は、注入開始の３０分以内にガラスボトルもしくはポリエチレンボトルまたは非ＤＥＨＰバッグにおいて調製され、投与するまでおよそ２１℃で保管される。
すべての試験薬が、２℃～８℃の温度で維持され、過剰な光および熱から保護され、アクセスが制限された鍵が掛かった区域で保管される。
ＡＰ１９０３を投与し、誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドを誘導する必要性を決定する際に、患者は、例えば、非ＤＥＨＰ、非エチレンオキシド滅菌注入セットを使用して２時間にわたるＩＶ注入を介して単一の固定された用量の注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を投与され得る。ＡＰ１９０３の用量は、全ての患者のために個々に計算され、体重が≧１０％変動しなければ、再計算されるべきではない。その計算された用量は、注入前に０．９％ノーマルセーライン１００ｍＬ中に希釈される。
ＡＰ１９０３の以前の第１相研究では、２４人の健常志願者を、２時間にわたって、ＩＶ注入される０．０１、０．０５、０．１、０．５および１．０ｍｇ／ｋｇという用量レベルにおいて、単一用量のＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎで処置した。ＡＰ１９０３血漿レベルは、用量に正比例し、平均Ｃｍａｘ値は、０．０１～１．０ｍｇ／ｋｇの用量の範囲にわたって、およそ１０～１２７５ｎｇ／ｍＬの範囲だった。最初の注入期間の後、血中濃度は、急速な分布相を示し、血漿レベルは、投与の０．５、２および１０時間後にそれぞれ最高濃度のおよそ１８、７および１％に減少した。ＡＰ１９０３ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、すべての用量レベルにおいて安全であり、耐容性がよいことが示され、好ましい薬物動態プロファイルを示した。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ ＪＤら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：８７０－９，２００１。
使用されるＡＰ１９０３ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎの固定された用量は、例えば、２時間にわたって静脈内に注入される０．４ｍｇ／ｋｇであり得る。細胞の有効なシグナル伝達にインビトロで必要とされるＡＰ１９０３の量は、１０～１００ｎＭ（１６００Ｄａ ＭＷ）である。これは、１６～１６０μｇ／Ｌまたは約０．０１６～１．６ｍｇ／ｋｇ（１．６～１６０μｇ／ｋｇ）に等しい。１ｍｇ／ｋｇまでの用量は、上記で論じられるＡＰ１９０３のフェーズ１研究において十分に許容された。従って、０．４ｍｇ／ｋｇは、治療用細胞と組み合わせた、このフェーズＩ研究のための安全かつ有効なＡＰ１９０３の用量であり得る。
（選択マーカー）
ある特定の実施形態において、発現構築物は、その発現構築物にマーカーを含めることによってその発現がインビトロまたはインビボにおいて識別される核酸構築物を含む。そのようなマーカーは、その発現構築物を含む細胞の容易な識別を可能にする識別可能な変化を細胞にもたらし得る。通常、薬物選択マーカーを含めることが、クローニングおよび形質転換体の選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルス－Ｉのチミジンキナーゼ（ｔｋ）などの酵素が使用される。免疫学的表面マーカーを含む細胞外の非シグナル伝達ドメインまたは様々なタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＬＮＧＦＲ）もまた使用され得、それにより、磁性抗体または蛍光抗体によって媒介される選別のための直接的方法が可能になる。使用される選択マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要であると考えられない。選択マーカーのさらなる例としては、例えば、レポーター（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ベータ－ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））が挙げられる。ある特定の実施形態において、マーカータンパク質、例えば、ＣＤ１９などは、例えば、免疫磁気選択などにおいて、移入するための細胞の選択のために使用される。本明細書中で論じられるように、ＣＤ１９マーカーは、抗ＣＤ１９抗体、すなわち、例えば、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＴＣＲまたは他の抗原認識部分と区別される。
ある特定の実施形態において、発現構築物は、その発現構築物にマーカーを含めることによってその発現がインビトロまたはインビボにおいて識別される核酸構築物を含む。そのようなマーカーは、その発現構築物を含む細胞の容易な識別を可能にする識別可能な変化を細胞にもたらし得る。通常、薬物選択マーカーを含めることが、クローニングおよび形質転換体の選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルス－Ｉのチミジンキナーゼ（ｔｋ）などの酵素が使用される。免疫学的表面マーカーを含む細胞外の非シグナル伝達ドメインまたは様々なタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＬＮＧＦＲ）もまた使用され得、それにより、磁性抗体または蛍光抗体によって媒介される選別のための直接的方法が可能になる。使用される選択マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要であると考えられない。選択マーカーのさらなる例としては、例えば、レポーター（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ベータ－ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））が挙げられる。ある特定の実施形態において、マーカータンパク質、例えば、ＣＤ１９などは、例えば、免疫磁気選択などにおいて、移入するための細胞の選択のために使用される。本明細書中で論じられるように、ＣＤ１９マーカーは、抗ＣＤ１９抗体、すなわち、例えば、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＴＣＲまたは他の抗原認識部分と区別される。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、細胞をソートする一助とするために、発現ベクターの中に含まれ得る。例えば、ＣＤ３４最小エピトープは、ベクターの中に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるキメラ抗原レセプターまたはキメラ刺激分子を発現させるために使用される発現ベクターは、１６アミノ酸のＣＤ３４最小エピトープをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。本明細書中の例において提供されるある特定の実施形態などのいくつかの実施形態において、ＣＤ３４最小エピトープは、ＣＤ８ストークのアミノ末端位置において組み込まれる。
（膜貫通領域）
本明細書中のキメラ抗原レセプターは、一回貫通型（ｓｉｎｇｌｅ－ｐａｓｓ）または複数回貫通型（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｓｓ）の膜貫通配列を含み得る（例えば、キメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端に）。一回貫通型膜貫通領域は、ある特定のＣＤ分子、チロシンキナーゼレセプター、セリン／トレオニンキナーゼレセプター、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、アクチビンおよびホスファターゼに見出される。一回貫通型膜貫通領域は、シグナルペプチド領域および約２０～約２５アミノ酸（それらの多くは、疎水性アミノ酸であり、アルファヘリックスを形成し得る）の膜貫通領域を含むことが多い。短いトラックの正に帯電したアミノ酸が、タンパク質を膜に繋ぎ止めるために膜貫通の範囲の後に続くことが多い。複数回貫通型タンパク質には、イオンポンプ、イオンチャネルおよびトランスポーターが含まれ、膜を複数回またぐ２つまたはそれを超えるらせんを含む。複数回貫通型タンパク質のすべてまたは実質的にすべてが、時折、キメラタンパク質に組み込まれる。一回貫通型および複数回貫通型膜貫通領域に対する配列は、公知であり、キメラタンパク質分子に組み込むために選択され得る。
本明細書中のキメラ抗原レセプターは、一回貫通型（ｓｉｎｇｌｅ－ｐａｓｓ）または複数回貫通型（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｓｓ）の膜貫通配列を含み得る（例えば、キメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端に）。一回貫通型膜貫通領域は、ある特定のＣＤ分子、チロシンキナーゼレセプター、セリン／トレオニンキナーゼレセプター、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、アクチビンおよびホスファターゼに見出される。一回貫通型膜貫通領域は、シグナルペプチド領域および約２０～約２５アミノ酸（それらの多くは、疎水性アミノ酸であり、アルファヘリックスを形成し得る）の膜貫通領域を含むことが多い。短いトラックの正に帯電したアミノ酸が、タンパク質を膜に繋ぎ止めるために膜貫通の範囲の後に続くことが多い。複数回貫通型タンパク質には、イオンポンプ、イオンチャネルおよびトランスポーターが含まれ、膜を複数回またぐ２つまたはそれを超えるらせんを含む。複数回貫通型タンパク質のすべてまたは実質的にすべてが、時折、キメラタンパク質に組み込まれる。一回貫通型および複数回貫通型膜貫通領域に対する配列は、公知であり、キメラタンパク質分子に組み込むために選択され得る。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合される。１つの実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つと天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。他の実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つと天然に会合しない膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、そのレセプター複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインにそのようなドメインが結合するのを回避するために膜貫通ドメインは、選択され得るか、またはアミノ酸置換によって改変され得る（例えば、代表的には、疎水性残基に変更される（ｃｈａｒｇｅｄ））。
膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞レセプターのアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ３－ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７またはＣＤ１５４に由来し得る。または、いくつかの例では、主に疎水性残基、例えば、ロイシンおよびバリンなどを含む膜貫通ドメインが、新規に合成され得る。ある特定の実施形態において、短いポリペプチドリンカーは、キメラ抗原レセプターの膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間に結合を形成し得る。それらのキメラ抗原レセプターは、ストーク、すなわち、細胞外領域のアミノ酸を細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にさらに含み得る。例えば、そのストークは、選択された膜貫通ドメインに天然に会合するアミノ酸の配列であり得る。いくつかの実施形態において、キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８膜貫通ドメインを含み、ある特定の実施形態において、キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびその膜貫通ドメインの細胞外部分におけるさらなるアミノ酸を含み、ある特定の実施形態において、キメラ抗原レセプターは、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ストークを含む。キメラ抗原レセプターは、膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間にアミノ酸の領域をさらに含み得、それらのアミノ酸は、その膜貫通ドメインが由来するポリペプチドと天然に会合するものである。
（調節領域）
（１．プロモーター）
目的のポリヌクレオチド配列の発現をコントロールするために使用される特定のプロモーターは、標的化された細胞においてそのポリヌクレオチドの発現を指示することができる限り、重要であると考えられない。したがって、ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌクレオチド配列コード領域は、例えば、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接しておよびそのプロモーターの支配下に配置され得る。一般的に言えば、そのようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターを含み得る。
（１．プロモーター）
目的のポリヌクレオチド配列の発現をコントロールするために使用される特定のプロモーターは、標的化された細胞においてそのポリヌクレオチドの発現を指示することができる限り、重要であると考えられない。したがって、ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌクレオチド配列コード領域は、例えば、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接しておよびそのプロモーターの支配下に配置され得る。一般的に言えば、そのようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターを含み得る。
様々な実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列、β－アクチン、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素が、目的のコード配列の高レベル発現を得るために使用され得る。発現レベルが所与の目的にとって十分であるならば、目的のコード配列の発現を達成すると当該分野で周知である他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用も同様に企図される。周知の特性を有するプロモーターを使用することによって、トランスフェクション後または形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベルおよびパターンが、最適化され得る。
特異的な生理学的シグナルまたは合成シグナルに応答して制御されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導性発現を可能にし得る。例えば、１つの導入遺伝子の発現、またはマルチシストロニックなベクターが使用されるときは複数の導入遺伝子の発現が、ベクターが生成される細胞にとって有毒である場合、それらの導入遺伝子のうちの１つ以上の発現を妨げるかまたは減少させることが望ましい。産生細胞株にとって有毒である導入遺伝子の例は、アポトーシス促進遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。いくつかの誘導性プロモーターシステムが、導入遺伝子産物が有毒である場合のウイルスベクターの作製に利用可能である（より誘導性のプロモーターを付加する）。
エクジソンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、１つのそのようなシステムである。このシステムは、哺乳動物細胞において目的の遺伝子の制御された発現を可能にするようにデザインされる。そのシステムは、導入遺伝子の基底レベルの発現ではなく２００倍超の誘導能を実質的に可能にする厳しく制御された発現機構からなる。そのシステムは、ショウジョウバエのヘテロ二量体エクジソンレセプターに基づき、エクジソンまたはムリステロンＡなどのアナログが、そのレセプターに結合すると、そのレセプターは、プロモーターを活性化して、下流の導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのｍＲＮＡ転写産物がもたらされる。このシステムでは、ヘテロ二量体レセプターの両方のモノマーが、１つのベクターから構成的に発現されるのに対し、目的の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上に存在する。ゆえに、このタイプのシステムを目的の遺伝子トランスファーベクターに遺伝子操作して導入することが、有用であり得る。次いで、産生細胞株において目的の遺伝子を含むプラスミドとレセプターモノマーを含むプラスミドとをコトランスフェクションすることにより、潜在的に有毒な導入遺伝子を発現させずに、遺伝子トランスファーベクターの作製が可能になり得る。適切な時点において、導入遺伝子の発現が、エクジソンまたはムリステロンＡによって活性化され得る。
有用であり得る別の誘導性システムは、もともとはＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄによって開発された（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１，１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６－１７６９，１９９５）、Ｔｅｔ－ＯｆｆＴＭまたはＴｅｔ－ＯｎＴＭシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。このシステムもまた、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（例えば、ドキシサイクリン）に応答して高レベルの遺伝子発現を制御することが可能である。Ｔｅｔ－ＯｎＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの存在下において遺伝子発現がオンになるのに対し、Ｔｅｔ－ＯｆｆＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの非存在下において遺伝子発現がオンになる。これらのシステムは、大腸菌のテトラサイクリン抵抗性オペロンに由来する２つの制御エレメント（テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリンオペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質）に基づく。目的の遺伝子は、プラスミドの中に存在するテトラサイクリン応答性エレメントを有するプロモーターの後ろでプラスミド中にクローニングされる。第２のプラスミドは、テトラサイクリンによってコントロールされるトランス活性化因子と呼ばれる制御エレメントを含み、その制御エレメントは、Ｔｅｔ－ＯｆｆＴＭシステムでは、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６ドメインおよび野生型テトラサイクリン（ｔｅｒｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）リプレッサーから構成される。したがって、ドキシサイクリンの非存在下において、転写は、恒常的にオンである。Ｔｅｔ－ＯｎＴＭシステムでは、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型でなく、ドキシサイクリンの存在下において転写を活性化する。遺伝子治療ベクターを作製する場合、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下において産生細胞が生育され得、潜在的に有毒な導入遺伝子の発現を妨げ得るように、Ｔｅｔ－ＯｆｆＴＭシステムが使用され得るが、そのベクターが患者に導入されると、遺伝子発現は恒常的にオンになり得る。
いくつかの状況において、遺伝子治療ベクターにおける導入遺伝子の発現を制御することが望ましい。例えば、様々な活性強度を有する種々のウイルスプロモーターが、所望の発現レベルに応じて使用される。哺乳動物細胞では、ＣＭＶ前初期プロモーターが、強力な転写活性化をもたらすために使用されることが多い。ＣＭＶプロモーターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら、１９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７－４８において概説されている。導入遺伝子の低い発現レベルが望まれるとき、それほど強力でないＣＭＶプロモーターの改変バージョンもまた、使用されている。造血細胞における導入遺伝子の発現が望まれるとき、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲなどのレトロウイルスプロモーターが使用されることが多い。所望の効果に応じて使用される他のウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２ ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域由来のもの）、ＡＡＶ ＬＴＲ、ＨＳＶ－ＴＫおよびトリ肉腫ウイルスが挙げられる。
他の例では、特定の分化した細胞において発生的に制御されかつ活性であるプロモーターが、選択され得る。従って、例えば、プロモーターは、多能性幹細胞において活性でなくてもよいが、例えば、多能性幹細胞がより成熟した細胞へと分化する場合、上記プロモーターは、次いで、活性化され得る。
同様に、組織特異的プロモーターは、標的化されていない組織に対する潜在的な毒性または望ましくない効果を減少させるように、特定の組織または細胞において転写をもたらすために使用される。これらのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターなどのより強力なプロモーターと比べて低い発現をもたらし得るが、より限定された発現および免疫原性ももたらし得る（Ｂｏｊａｋ，Ａ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１９７５－７９；Ｃａｚｅａｕｘ．，Ｎ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：３３２２－３１）。例えば、組織特異的プロモーター（例えば、ＰＳＡ関連プロモーター）または前立腺特異的腺性カリクレインまたは筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子が、適切な場合に使用され得る。
組織特異的プロモーターまたは分化特異的プロモーターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｂ２９（Ｂ細胞）；ＣＤ１４（単球性細胞）；ＣＤ４３（白血球および血小板）；ＣＤ４５（造血細胞）；ＣＤ６８（マクロファージ）；デスミン（筋肉）；エラスターゼ－１（膵腺房細胞）；エンドグリン（内皮細胞）；フィブロネクチン（分化中の細胞、治癒中の組織）；およびＦｌｔ－１（内皮細胞）；ＧＦＡＰ（アストロサイト）。
ある特定の適応症では、遺伝子治療ベクターを投与した後の特定の時点において転写を活性化することが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカインによって制御可能であるようなプロモーターを用いて行われる。使用され得るサイトカイン応答性プロモーターおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターとしては、ＫキニノーゲンおよびＴキニノーゲン（Ｋａｇｅｙａｍａら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，２３４５－２３５１）、ｃ－ｆｏｓ、ＴＮＦ－アルファ、Ｃ反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅら（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６（８），３１９５－３２０７）、ハプトグロビン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．，６，１９０５－１９１２）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰアルファ、ＩＬ－１、ＩＬ－６（Ｐｏｌｉ ａｎｄ Ｃｏｒｔｅｓｅ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２０２－８２０６）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６１８１－６１９１）、ＩＬ－８、アルファ－１酸性糖タンパク質（Ｐｒｏｗｓｅ ａｎｄ Ｂａｕｍａｎｎ，（１９８８）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，８，４２－５１）、アルファ－１抗トリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２３９４－２４０１，１９８８）、アンジオテンシノーゲン（Ｒｏｎら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８８７－２８９５）、フィブリノゲン、ｃ－ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ－アルファ、ＵＶ照射、レチノイン酸および過酸化水素によって誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸によって誘導される）、メタロチオネイン（重金属および糖質コルチコイド誘導性）、ストロメライシン（ホルボールエステル、インターロイキン－１およびＥＧＦによって誘導可能）、アルファ－２マクログロブリンおよびアルファ－１抗キモトリプシンが挙げられる。他のプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、エプスタイン・バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビンおよびクレアチンが挙げられる。
上記プロモーターのいずれか単独または別のプロモーターとの併用が、所望の作用に応じて有用であり得ることが想定される。プロモーターおよび他の制御エレメントは、それらが所望の細胞または組織において機能的であるように選択される。さらに、このプロモーターのリストは、網羅的または限定的であると解釈されるべきでなく；他のプロモーターが、本明細書中に開示されるプロモーターおよび方法とともに使用される。
（２．エンハンサー）
エンハンサーは、同じＤＮＡ分子上の離れた位置に配置されたプロモーターからの転写を増加させる遺伝的エレメントである。初期の例としては、コード配列に隣接し、かついくつかのイントロンの中に存在する、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターに関連するエンハンサーが挙げられる。多くのウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０およびレトロウイルスＬＴＲ）は、エンハンサーの活性と密接に関連し、単一エレメントのように扱われることが多い。エンハンサーは、ほぼプロモーターのように組織化される。すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、１つ以上の転写性タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの基本的な区別は、操作上のものである。エンハンサー領域は概して、少し離れて、しばしば向きに関係なく、転写を刺激する；これは、プロモーター領域またはその成分エレメントには必ずしも当てはまらない。他方で、プロモーターは、特定の部位において特定の向きでＲＮＡ合成の開始を指示する１つ以上のエレメントを有するのに対し、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複し、近接することから、しばしば非常によく似たモジュール構成を有するようである。エンハンサーのサブセットは、転写活性を増加させ得るだけでなく、ゲノムにインテグレートされたとき、隣接する配列から転写性エレメントを（インスレーターエレメントとともに）隔離するのを助け得る、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）である。
エンハンサーは、同じＤＮＡ分子上の離れた位置に配置されたプロモーターからの転写を増加させる遺伝的エレメントである。初期の例としては、コード配列に隣接し、かついくつかのイントロンの中に存在する、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターに関連するエンハンサーが挙げられる。多くのウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０およびレトロウイルスＬＴＲ）は、エンハンサーの活性と密接に関連し、単一エレメントのように扱われることが多い。エンハンサーは、ほぼプロモーターのように組織化される。すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、１つ以上の転写性タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの基本的な区別は、操作上のものである。エンハンサー領域は概して、少し離れて、しばしば向きに関係なく、転写を刺激する；これは、プロモーター領域またはその成分エレメントには必ずしも当てはまらない。他方で、プロモーターは、特定の部位において特定の向きでＲＮＡ合成の開始を指示する１つ以上のエレメントを有するのに対し、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複し、近接することから、しばしば非常によく似たモジュール構成を有するようである。エンハンサーのサブセットは、転写活性を増加させ得るだけでなく、ゲノムにインテグレートされたとき、隣接する配列から転写性エレメントを（インスレーターエレメントとともに）隔離するのを助け得る、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）である。
任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢのように）が、遺伝子の発現を駆動するために使用され得るが、多くは、特定の組織タイプまたは組織のサブセットに発現を限定し得る（例えば、Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：７７６－８８に概説されている）。例としては、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、筋肉クレアチンキナーゼ由来のエンハンサー、ならびにウイルスＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶ由来の配列が挙げられるが、これらに限定されない。適切なエンハンサーが、特定の用途に対して選択され得る。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝的発現構築物として提供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質内転写を支持し得る。
（３．ポリアデニル化シグナル）
ｃＤＮＡインサートが使用される場合、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含めることが通常望ましい。ポリアデニル化シグナルの性質は、本方法の実施の成功にとって重大であるとは考えられておらず、任意のそのような配列（例えば、ヒトまたはウシの成長ホルモンおよびＳＶ４０のポリアデニル化シグナルならびにＬＴＲポリアデニル化シグナル）が、使用される。１つの非限定的な例は、ｐＣＥＰ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。ターミネーターもまた、発現カセットのエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高めるため、およびそのカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするために役立ち得る。終止シグナル配列またはポリ（Ａ）シグナル配列は、例えば、ｍＲＮＡの３’末端における保存配列（ＡＡＵＡＡＡ）から約１１～３０ヌクレオチド下流に位置し得る（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ら、１９９３．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：７７７－８３；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６－８８）。
ｃＤＮＡインサートが使用される場合、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含めることが通常望ましい。ポリアデニル化シグナルの性質は、本方法の実施の成功にとって重大であるとは考えられておらず、任意のそのような配列（例えば、ヒトまたはウシの成長ホルモンおよびＳＶ４０のポリアデニル化シグナルならびにＬＴＲポリアデニル化シグナル）が、使用される。１つの非限定的な例は、ｐＣＥＰ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。ターミネーターもまた、発現カセットのエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高めるため、およびそのカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするために役立ち得る。終止シグナル配列またはポリ（Ａ）シグナル配列は、例えば、ｍＲＮＡの３’末端における保存配列（ＡＡＵＡＡＡ）から約１１～３０ヌクレオチド下流に位置し得る（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ら、１９９３．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：７７７－８３；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６－８８）。
（４．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位）
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされることがある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンをはじめとした外来性翻訳調節シグナルが、提供される必要があり得る。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠とインフレームで配置される。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって上昇し得る。
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされることがある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンをはじめとした外来性翻訳調節シグナルが、提供される必要があり得る。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠とインフレームで配置される。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって上昇し得る。
ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子すなわちポリシストロニックなメッセージを作製するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回することができ、内部部位において翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０－３２５，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメントが、論じられており（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、ならびに哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳも論じられている（Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０－９４，１９９１）。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結され得る。各々がＩＲＥＳによって分断されている複数のオープンリーディングフレームが、共に転写され得、ポリシストロニックなメッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子が、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現され得る（米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号（各々が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。
（配列の最適化）
タンパク質産生は、導入遺伝子におけるコドンを最適化することによっても増加され得る。タンパク質産生を増加させるために、種特異的コドンの変更が用いられ得る。また、コドンが最適化されることにより、最適化されたＲＮＡが生成され得、それにより、より効率的な翻訳がもたらされ得る。ＲＮＡに組み込まれるコドンを最適化することによって、不安定性を引き起こす二次構造をもたらすエレメント、例えばリボソーム結合を阻害し得るｍＲＮＡ二次構造、またはｍＲＮＡの核外輸送を阻害し得るクリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）配列などのエレメントが、除去され得る（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ
Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６－８８；Ｙａｎ，Ｊ．ら、２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：４１１－２１；Ｃｈｅｕｎｇ，Ｙ．Ｋ．ら、２００４．Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：６２９－３８；Ｎａｒｕｍ．，Ｄ．Ｌ．ら、２００１．６９：７２５０－５５；Ｙａｄａｖａ，Ａ．，ａｎｄ Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，Ｃ．Ｆ．，２００３．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：４９６２－６９；Ｓｍｉｔｈ．，Ｊ．Ｍ．ら、２００４．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２０：１３３５－４７；Ｚｈｏｕ，Ｗ．ら、２００２．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８８：１２７－５１；Ｗｕ，Ｘ．ら、２００４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１３：８９－９６；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら、２００６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４９：６９－７８；Ｄｅｍｌ，Ｌ．Ａ．ら、２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０９９－１１００１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．Ｍ．ら、１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４８９２－４９０３；Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｄ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１－４０；ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊ．ら、２０００．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８－２６３５）。例えば、ＦＢＰ１２、カスパーゼポリペプチド、およびＣＤ１９配列が、コドンの変更によって最適化され得る。
タンパク質産生は、導入遺伝子におけるコドンを最適化することによっても増加され得る。タンパク質産生を増加させるために、種特異的コドンの変更が用いられ得る。また、コドンが最適化されることにより、最適化されたＲＮＡが生成され得、それにより、より効率的な翻訳がもたらされ得る。ＲＮＡに組み込まれるコドンを最適化することによって、不安定性を引き起こす二次構造をもたらすエレメント、例えばリボソーム結合を阻害し得るｍＲＮＡ二次構造、またはｍＲＮＡの核外輸送を阻害し得るクリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）配列などのエレメントが、除去され得る（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ
Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６－８８；Ｙａｎ，Ｊ．ら、２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：４１１－２１；Ｃｈｅｕｎｇ，Ｙ．Ｋ．ら、２００４．Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：６２９－３８；Ｎａｒｕｍ．，Ｄ．Ｌ．ら、２００１．６９：７２５０－５５；Ｙａｄａｖａ，Ａ．，ａｎｄ Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，Ｃ．Ｆ．，２００３．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：４９６２－６９；Ｓｍｉｔｈ．，Ｊ．Ｍ．ら、２００４．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２０：１３３５－４７；Ｚｈｏｕ，Ｗ．ら、２００２．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８８：１２７－５１；Ｗｕ，Ｘ．ら、２００４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１３：８９－９６；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら、２００６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４９：６９－７８；Ｄｅｍｌ，Ｌ．Ａ．ら、２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０９９－１１００１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．Ｍ．ら、１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４８９２－４９０３；Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｄ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１－４０；ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊ．ら、２０００．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８－２６３５）。例えば、ＦＢＰ１２、カスパーゼポリペプチド、およびＣＤ１９配列が、コドンの変更によって最適化され得る。
（リーダー配列）
リーダー配列は、ｍＲＮＡの安定性を高めるためおよびより効率的な翻訳をもたらすために付加され得る。リーダー配列は、通常、ｍＲＮＡを小胞体に標的化することに関与する。例としては、自身の切断を遅延させる、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）に対するシグナル配列、およびＩｇＥ遺伝子リーダー配列が挙げられる（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６－８８；Ｌｉ，Ｖ．ら、２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７２：４１７－２８；Ｘｕ，Ｚ．Ｌ．ら、２００１．Ｇｅｎｅ ２７２：１４９－５６；Ｍａｌｉｎ，Ａ．Ｓ．ら、２０００．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．２：１６７７－８５；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、２００５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：１１２－１２５；Ｙａｎｇ．，Ｊ．Ｓ．ら、２００２．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：１３７９－８４；Ｋｕｍａｒ．，Ｓ．ら、２００６．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：３８３－９２；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１－４０）。ＩｇＥリーダーは、小胞体への挿入を高めるために使用され得る（Ｔｅｐｌｅｒ，Ｉら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５９１２）。
リーダー配列は、ｍＲＮＡの安定性を高めるためおよびより効率的な翻訳をもたらすために付加され得る。リーダー配列は、通常、ｍＲＮＡを小胞体に標的化することに関与する。例としては、自身の切断を遅延させる、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）に対するシグナル配列、およびＩｇＥ遺伝子リーダー配列が挙げられる（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６－８８；Ｌｉ，Ｖ．ら、２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７２：４１７－２８；Ｘｕ，Ｚ．Ｌ．ら、２００１．Ｇｅｎｅ ２７２：１４９－５６；Ｍａｌｉｎ，Ａ．Ｓ．ら、２０００．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．２：１６７７－８５；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、２００５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：１１２－１２５；Ｙａｎｇ．，Ｊ．Ｓ．ら、２００２．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：１３７９－８４；Ｋｕｍａｒ．，Ｓ．ら、２００６．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：３８３－９２；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５３１－４０）。ＩｇＥリーダーは、小胞体への挿入を高めるために使用され得る（Ｔｅｐｌｅｒ，Ｉら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５９１２）。
導入遺伝子の発現は、発現を最適化するための適切な方法を選択することによって、最適化され得るおよび／またはコントロールされ得る。これらの方法は、例えば、プロモーター、送達方法および遺伝子配列を最適化することを含む（例えば、Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．ら、２００８．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ ３ ｅ２５１７；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６－８８に提示されているような）。
（核酸）
本明細書中で使用される「核酸」は、一般に、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその誘導体もしくはアナログの分子（１本、２本またはそれより多くの鎖）のことを指す。核酸塩基には、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）に見られる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基が含まれる。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、その各々は、用語「核酸」の亜属として包含される。核酸は、少なくとも、多くとも、または約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０もしくは１０００ヌクレオチド長、またはこの中の導き出せる任意の範囲の長さであり得る。
本明細書中で使用される「核酸」は、一般に、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその誘導体もしくはアナログの分子（１本、２本またはそれより多くの鎖）のことを指す。核酸塩基には、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）に見られる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基が含まれる。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、その各々は、用語「核酸」の亜属として包含される。核酸は、少なくとも、多くとも、または約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０もしくは１０００ヌクレオチド長、またはこの中の導き出せる任意の範囲の長さであり得る。
本明細書中に提供される核酸は、別の核酸に対して同一または相補的である領域を有し得る。その相補的または同一である領域は、少なくとも５つ連続した残基であり得ることが企図されるが、その領域は、少なくとも、多くとも、または約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００個連続したヌクレオチドであることが特に企図される。
本明細書中で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、二本鎖分子もしくは三本鎖分子、または部分的な二本鎖もしくは三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味すると理解される。本明細書中で使用される用語「アニールする」は、「ハイブリダイズする」と同義である。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、用語「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリンジェンシー」および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件（複数可）」を包含する。
本明細書中で使用されるとき、「ストリンジェントな条件（複数可）」または「高ストリンジェンシー」は、相補的な配列（複数可）を含む１つ以上の核酸鎖の間のまたはその１つ以上の核酸鎖内のハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダム配列のハイブリダイゼーションを妨げる条件である。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖との間のミスマッチを、たとえあったにしてもほとんど許容しない。そのような条件は、公知であり、高選択性が要求される用途のために使用されることが多い。非限定的な用途としては、核酸（例えば、遺伝子またはその核酸セグメント）の単離、または少なくとも１つの特異的なｍＲＮＡ転写産物もしくはその核酸セグメントの検出などが挙げられる。
ストリンジェントな条件は、約４２℃～約７０℃の温度における約０．０２Ｍ～約０．５Ｍ ＮａＣｌによって提供されるような、低塩および／または高温の条件を含み得る。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定の核酸（複数可）の長さ、標的配列（複数可）の長さおよび核酸塩基含有量、核酸（複数可）の電荷組成、ならびにハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他の溶媒（複数可）の存在または濃度によって部分的に決定されることが理解される。
ハイブリダイゼーションのためのこれらの範囲、組成および条件は、単なる非限定的な例という目的で言及されていること、特定のハイブリダイゼーション反応に対する所望のストリンジェンシーは、１つ以上のポジティブコントロールまたはネガティブコントロールとの比較によって経験的に決定されることが多いことが理解される。想定される用途に応じて、標的配列に対する様々な程度の核酸選択性を達成するために、様々なハイブリダイゼーション条件が使用され得る。非限定的な例では、ストリンジェントな条件下において核酸にハイブリダイズしない関係する標的核酸の同定または単離は、低温および／または高イオン強度におけるハイブリダイゼーションによって達成され得る。そのような条件は、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリンジェンシーの非限定的な例としては、約２０℃～約５０℃の温度範囲における約０．１５Ｍ～約０．９Ｍ ＮａＣｌで行われるハイブリダイゼーションが挙げられる。低または高ストリンジェンシー条件は、特定の用途に適合させるためにさらに改変され得る。
（核酸修飾）
下記で論じられる修飾のいずれかが、核酸に適用され得る。修飾の例としては、ＲＮＡもしくはＤＮＡの骨格、糖または塩基、およびそれらの様々な組み合わせに対する変更が挙げられる。核酸における任意の好適な数の骨格結合、糖および／または塩基が、修飾され得る（例えば、独立して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、最大１００％）。修飾されていないヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－リボ－フラノースの１’炭素に結合された塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルのうちのいずれか１つである。
下記で論じられる修飾のいずれかが、核酸に適用され得る。修飾の例としては、ＲＮＡもしくはＤＮＡの骨格、糖または塩基、およびそれらの様々な組み合わせに対する変更が挙げられる。核酸における任意の好適な数の骨格結合、糖および／または塩基が、修飾され得る（例えば、独立して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、最大１００％）。修飾されていないヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－リボ－フラノースの１’炭素に結合された塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルのうちのいずれか１つである。
修飾塩基は、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基である。修飾塩基の非限定的な例としては、イノシン、プリン、ピリジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６－トリメトキシベンゼン、３－メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５－アルキルシチジン（例えば、５－メチルシチジン）、５－アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５－ハロウリジン（例えば、５－ブロモウリジン）または６－アザピリミジンまたは６－アルキルピリミジン（例えば、６－メチルウリジン）、プロピンなどが挙げられる。修飾塩基の他の非限定的な例としては、ニトロピロリル（例えば、３－ニトロピロリル）、ニトロインドリル（例えば、４－、５－、６－ニトロインドリル）、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２－アザ－イノシニル、７－デアザ－イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、ジフルオロトリル、４－フルオロ－６－メチルベンゾイミダゾール、４－メチルベンゾイミダゾール、３－メチルイソカルボスチリリル、５－メチルイソカルボスチリリル、３－メチル－７－プロピニルイソカルボスチリリル、７－アザインドリル、６－メチル－７－アザインドリル、イミジゾピリジニル、９－メチル－イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７－プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル－７－アザインドリル、２，４，５－トリメチルフェニル、４－メチルインドリル、４，６－ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルなどが挙げられる。
いくつかの実施形態において、例えば、核酸は、リン酸骨格修飾を有する修飾された核酸分子を含み得る。骨格修飾の非限定的な例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよび／またはアルキルシリル修飾が挙げられる。ある特定の場合において、ヌクレオシドに天然に存在するリボース糖部分は、ヘキソース糖、多環式ヘテロアルキル環またはシクロヘキセニル基で置き換えられる。ある特定の場合において、ヘキソース糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはそれらの誘導体である。ヘキソースは、Ｄ－ヘキソース、グルコースまたはマンノースであり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、環内に１つの酸素原子を含む二環式環であり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［３．２．１］オクタンまたはビシクロ［３．３．１］ノナンである。
ニトロピロリル核酸塩基およびニトロインドリル核酸塩基は、ユニバーサル塩基として公知の化合物のクラスのメンバーである。ユニバーサル塩基は、オリゴヌクレオチド二重鎖の融解挙動または活性に実質的に影響せずに４つの天然に存在する塩基のいずれかを置き換え得る化合物である。天然に存在する核酸塩基に関連する安定化する水素結合相互作用とは対照的に、３－ニトロピロリル核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド二重鎖は、スタッキング相互作用によって単独で安定化され得る。ニトロピロリル核酸塩基との有意な水素結合相互作用が無いことにより、特定の相補性塩基に対する特異性は不必要になる。さらに、４－、５－および６－ニトロインドリルは、４つの天然塩基に対して非常に低い特異性しか示さない。１－（２’－Ｏ－メチル－ベータ－Ｄ－リボフラノシル）－５－ニトロインドールを調製するための手順は、Ｇａｕｂｅｒｔ，Ｇ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００４，４５，５６２９に論じられている。他のユニバーサル塩基としては、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２－アザ－イノシニル、７－デアザ－イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。
ジフルオロトリルは、ユニバーサル塩基として機能する非天然の核酸塩基である。ジフルオロトリルは、天然の核酸塩基チミンの同配体である。しかしながら、チミンとは異なり、ジフルオロトリルは、天然塩基のいずれに対しても、顕著な選択性を示さない。ユニバーサル塩基として機能する他の芳香族化合物は、４－フルオロ－６－メチルベンゾイミダゾールおよび４－メチルベンゾイミダゾールである。さらに、比較的疎水性のイソカルボスチリリル誘導体である３－メチルイソカルボスチリリル、５－メチルイソカルボスチリリルおよび３－メチル－７－プロピニルイソカルボスチリリルは、天然塩基だけを含むオリゴヌクレオチド配列と比べてオリゴヌクレオチド二重鎖の不安定化をわずかにしか引き起こさないユニバーサル塩基である。他の非天然の核酸塩基としては、７－アザインドリル、６－メチル－７－アザインドリル、イミジゾピリジニル、９－メチル－イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７－プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル－７－アザインドリル、２，４，５－トリメチルフェニル、４－メチルインドリル、４，６－ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。ジフルオロトリル、４－フルオロ－６－メチルベンゾイミダゾール、４－メチルベンゾイミダゾールおよび上で言及された他の非天然塩基の合成手順を含むより詳細な考察については、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８－７２４２（１９９４）を参照のこと。
さらに、化学的置換基、例えば、架橋剤が、反応物に対して安定性または不可逆性をさらに付加するために使用され得る。架橋剤の非限定的な例としては、例えば、１，１－ビス（ジアゾアセチル）－２－フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４－アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル（ジスクシンイミジルエステル、例えば、３，３’－ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含む）、二官能性マレイミド（例えば、ビス－Ｎ－マレイミド－１，８－オクタン）およびメチル－３－［（ｐ－アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの作用物質が挙げられる。
ヌクレオチドアナログは、「ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）」核酸も含み得る。ある特定の組成物は、内因性の核酸を特定の構造に本質的に「繋ぎ止める」または「ロックする」ために使用され得る。配列を繋ぎ止めることは、核酸複合体の解離を防ぐために役立ち、ゆえに、複製を防ぎ得るだけでなく、内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ）配列の標識、修飾および／またはクローニングも可能にし得る。ロックされた構造は、遺伝子発現を制御し得る（すなわち、転写または複製を阻害し得るかまたは増強し得る）か、または内在性の核酸配列を標識するためもしくはその他の方法で修飾するために使用され得る安定した構造として使用され得るか、またはその内在性配列を単離するために、すなわちクローニングのために使用され得る。
核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡだけを含む分子に必ずしも限定されず、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。非ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのパーセントは、１％～１００％（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％）であり得る。
（核酸調製物）
いくつかの実施形態において、例えば、アッセイにおけるコントロールまたは標準物質として、または治療薬として使用するための核酸が、提供される。核酸は、当該分野で公知の任意の手法（例えば、化学合成、酵素的生成または生物学的生成など）によって作製され得る。核酸は、生物学的サンプルから回収され得るかまたは単離され得る。核酸は、組換えであり得るか、または天然であり得るかもしくは細胞にとって内因性であり得る（細胞のゲノムから産生され得る）。生物学的サンプルは、小さい核酸分子の回収率を高めるような方法で処理され得ることが企図される。一般に、方法は、グアニジニウムおよび界面活性剤を有する溶液で細胞を溶解することを含み得る。
いくつかの実施形態において、例えば、アッセイにおけるコントロールまたは標準物質として、または治療薬として使用するための核酸が、提供される。核酸は、当該分野で公知の任意の手法（例えば、化学合成、酵素的生成または生物学的生成など）によって作製され得る。核酸は、生物学的サンプルから回収され得るかまたは単離され得る。核酸は、組換えであり得るか、または天然であり得るかもしくは細胞にとって内因性であり得る（細胞のゲノムから産生され得る）。生物学的サンプルは、小さい核酸分子の回収率を高めるような方法で処理され得ることが企図される。一般に、方法は、グアニジニウムおよび界面活性剤を有する溶液で細胞を溶解することを含み得る。
核酸合成はまた、標準的な方法に従って行われ得る。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例としては、ホスホトリエステル、ホスファイトもしくはホスホルアミダイト化学を使用するインビトロ化学合成および固相法によってまたはデオキシヌクレオシドＨ－ホスホネート中間体を介して作製された核酸が挙げられる。様々な異なるオリゴヌクレオチド合成機構が、他の箇所に開示されている。
核酸は、公知の手法を用いて単離され得る。特定の実施形態において、小さい核酸分子を単離するためおよび／またはＲＮＡ分子を単離するための方法が、使用され得る。クロマトグラフィーは、タンパク質または他の核酸から核酸を分離するためまたは単離するために使用されるプロセスである。そのような方法は、ゲルマトリックスを用いる電気泳動、フィルターカラム、アルコール沈殿および／または他のクロマトグラフィーを含み得る。細胞からの核酸が、使用されるかまたは評価される場合、方法は、一般に、特定のＲＮＡ集団を単離するためのプロセスを実行する前に、細胞をカオトロピック（例えば、グアニジニウムイソチオシアネート）および／または界面活性剤（例えば、Ｎ－ラウロイルサルコシン）で溶解することを含む。
方法は、核酸を単離するための有機溶媒および／またはアルコールの使用を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞溶解産物に加えられるアルコールの量は、約５５％～６０％というアルコール濃度に達する。種々のアルコールを使用できるが、エタノールがうまく機能する。固体支持体は、任意の構造であってよく、それには、電気陰性基を有する無機物またはポリマー支持体を含み得る、ビーズ、フィルターおよびカラムが含まれる。ガラス繊維のフィルターまたはカラムは、そのような単離手順にとって有効である。
核酸単離プロセスは、時折、ａ）サンプル中の細胞を、グアニジニウムを含む溶解液で溶解すること（ここで、少なくとも約１Ｍグアニジニウムの濃度を有する溶解産物が生成される）；ｂ）その溶解産物から核酸分子を、フェノールを含む抽出液を用いて抽出すること；ｃ）その溶解産物にアルコール溶液を加えることにより、溶解産物／アルコール混合物を形成すること（ここで、その混合物中のアルコールの濃度は、約３５％～約７０％である）；ｄ）その溶解産物／アルコール混合物を固体支持体に適用すること；ｅ）イオン性溶液を用いてその固体支持体から核酸分子を溶出すること；およびｆ）その核酸分子を捕捉することを含み得る。サンプルは、乾燥され得、その後の操作にとって適切な液体および体積で再懸濁され得る。
本明細書で提供されるのは、本出願のポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物またはキットである。従って、組成物またはキットは、例えば、上記第１のおよび第２のキメラポリペプチドをコードする上記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの両方を含み得る。上記核酸は、１個より多くの核酸種を含み得、すなわち、例えば、上記第１の核酸種は、上記第１のポリヌクレオチドを含み、上記第２の核酸種は、上記第２のポリヌクレオチドを含む。他の例では、上記核酸は、上記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの両方を含み得る。上記キットは、さらに、上記第１のもしくは第２のリガンド、または両方を含み得る。キットは、いくつかの実施形態において、少なくとも２種のポリヌクレオチドを含む核酸組成物（例えば、ウイルス（例えば、レトロウイルス）など）を提供し得、ここでそのポリヌクレオチドは、例えば、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドおよびキメラ抗原レセプター；誘導性アポトーシス促進ポリペプチドおよび組換えＴＣＲ；誘導性アポトーシス促進ポリペプチドおよびキメラ共刺激ポリペプチド（例えば、誘導性キメラＭｙＤ８８ポリペプチド、誘導性キメラ短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、および任意選択で、ＣＤ４０ポリペプチドなど）を発現する。その核酸組成物は、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、誘導性キメラＭｙＤ８８ポリペプチドまたは誘導性キメラ短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド、および任意選択で、ＣＤ４０ポリペプチド、ならびにキメラ抗原レセプターまたは組換えＴ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドを含み得る。
従って、ある種の実施形態において、１）ｉＲＣ９またはｉＲｍＣ９ポリペプチドおよびｉＭ（ＭｙＤ８８ＦｖＦｖ）またはｉＭＣポリペプチド；２）ＲＣ９またはｉＲｍＣ９ポリペプチドおよびキメラ抗原レセプター；３）ｉＲＣ９またはｉＲｍＣ９ポリペプチドおよび組換えＴＣＲ；４）ｉＣ９ポリペプチドおよびｉＲＭＣまたはｉＲＭ（ｉＲＭｙＤ８８）ポリペプチド；５）ｉＣ９ポリペプチドおよびｉＲＭＣまたはｉＲＭ（ｉＲＭｙＤ８８）ポリペプチドおよびキメラ抗原レセプター；あるいは６）ｉＣ９ポリペプチドおよびｉＲＭＣまたはｉＲＭ（ｉＲＭｙＤ８８）ポリペプチドおよび組換えＴ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドを含む核酸組成物（例えば、ウイルス（例えば、レトロウイルス）など）を含むキットが提供される。
（遺伝子移入の方法）
細胞内での導入遺伝子発現の効果を媒介するために、発現構築物を細胞に移行させる必要があり得る。そのような移行は、ウイルスによる遺伝子移入方法またはウイルスによらない遺伝子移入方法を使用し得る。この項では、遺伝子移入の方法および組成物の考察が提供される。
細胞内での導入遺伝子発現の効果を媒介するために、発現構築物を細胞に移行させる必要があり得る。そのような移行は、ウイルスによる遺伝子移入方法またはウイルスによらない遺伝子移入方法を使用し得る。この項では、遺伝子移入の方法および組成物の考察が提供される。
発現ベクターを含む形質転換された細胞は、その細胞に発現ベクターを導入することによって作製される。本方法とともに使用するための細胞小器官、細胞、組織または生物の形質転換のためのポリヌクレオチド送達に適した方法は、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を細胞小器官、細胞、組織または生物に導入し得る実質的に任意の方法を含む。
宿主細胞は、ベクターに対するレシピエントとして使用され得るし、使用されてきた。宿主細胞は、所望の結果が、ベクターの複製であるかまたはベクターによってコードされるポリヌクレオチド配列の一部もしくは全部の発現であるかに応じて、原核生物または真核生物に由来し得る。数多くの細胞株および細胞培養物が、宿主細胞として使用するために利用可能であり、それらは、生存している培養物および遺伝物質に対する保管所としての機能を果たす組織であるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を通じて入手することができる。
適切な宿主は、決定され得る。一般に、これは、ベクターの骨格および所望の結果に基づく。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多くのベクターの複製のために、原核生物宿主細胞に導入され得る。ベクターの複製および／または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞としては、ＤＨ５アルファ、ＪＭ１０９およびＫＣ８、ならびにいくつかの商業的に入手可能な細菌宿主（例えば、ＳＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ＣｅｌｌｓおよびＳＯＬＯＰＡＣＫ Ｇｏｌｄ Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標），Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））が挙げられる。あるいは、大腸菌ＬＥ３９２などの細菌細胞が、ファージウイルスに対する宿主細胞として使用され得る。宿主細胞として使用され得る真核細胞としては、酵母、昆虫および哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの複製および／または発現のための哺乳動物真核生物宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＳａｏｓおよびＰＣ１２が挙げられるが、これらに限定されない。酵母株の例としては、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸ワクチンは、例えば、非ウイルスＤＮＡベクター、「裸の」ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにウイルスベクターを含み得る。細胞をこれらのワクチンで形質転換する方法およびこれらのワクチンに含まれる遺伝子の発現を最適化するための方法は公知であり、それらの方法も本明細書中で論じられる。
（核酸またはウイルスベクターを移入する方法の例）
細胞をトランスフェクトするためもしくは形質転換するため、または本方法のヌクレオチド配列もしくは組成物を投与するために、任意の適切な方法が使用され得る。ある特定の例が、本明細書中に提示され、それらの例としてはさらに、カチオン性ポリマー、脂質様分子およびある特定の市販品、例えば、ＩＮ－ＶＩＶＯ－ＪＥＴ ＰＥＩなどを使用した送達などの方法が挙げられる。
細胞をトランスフェクトするためもしくは形質転換するため、または本方法のヌクレオチド配列もしくは組成物を投与するために、任意の適切な方法が使用され得る。ある特定の例が、本明細書中に提示され、それらの例としてはさらに、カチオン性ポリマー、脂質様分子およびある特定の市販品、例えば、ＩＮ－ＶＩＶＯ－ＪＥＴ ＰＥＩなどを使用した送達などの方法が挙げられる。
（１．エキソビボ形質転換）
生物から取り出された血管細胞および血管組織をエキソビボの環境においてトランスフェクトするために、様々な方法が利用可能である。例えば、イヌ内皮細胞は、インビトロにおけるレトロウイルス遺伝子移入によって遺伝的に変更され、イヌに移植された（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４－１３４６，１９８９）。別の例では、ユカタンミニブタ内皮細胞を、インビトロにおいてレトロウイルスでトランスフェクトし、ダブルバルーンカテーテルを使用して動脈に移植した（Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９１０）：１３４２－１３４４，１９８９）。したがって、細胞または組織が、取り出され、本明細書中に提示されるポリヌクレオチドを使用してエキソビボにおいてトランスフェクトされ得ることが企図される。特定の態様において、移植された細胞または組織は、生物の中に配置され得る。
生物から取り出された血管細胞および血管組織をエキソビボの環境においてトランスフェクトするために、様々な方法が利用可能である。例えば、イヌ内皮細胞は、インビトロにおけるレトロウイルス遺伝子移入によって遺伝的に変更され、イヌに移植された（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４－１３４６，１９８９）。別の例では、ユカタンミニブタ内皮細胞を、インビトロにおいてレトロウイルスでトランスフェクトし、ダブルバルーンカテーテルを使用して動脈に移植した（Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９１０）：１３４２－１３４４，１９８９）。したがって、細胞または組織が、取り出され、本明細書中に提示されるポリヌクレオチドを使用してエキソビボにおいてトランスフェクトされ得ることが企図される。特定の態様において、移植された細胞または組織は、生物の中に配置され得る。
（２．注射）
ある特定の実施形態において、抗原提示細胞または核酸ベクターもしくはウイルスベクターは、１つ以上の注射（すなわち、針による注射）、例えば、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｔａｔｉｃ）、腫瘍内、腹腔内などを介して、細胞小器官、細胞、組織または生物に送達され得る。注射の方法としては、例えば、食塩水溶液を含む組成物の注射が挙げられる。さらなる実施形態は、直接マイクロインジェクションによるポリヌクレオチドの導入を含む。使用される発現ベクターの量は、抗原の性質、ならびに使用される細胞小器官、細胞、組織または生物に応じて変動し得る。
ある特定の実施形態において、抗原提示細胞または核酸ベクターもしくはウイルスベクターは、１つ以上の注射（すなわち、針による注射）、例えば、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｔａｔｉｃ）、腫瘍内、腹腔内などを介して、細胞小器官、細胞、組織または生物に送達され得る。注射の方法としては、例えば、食塩水溶液を含む組成物の注射が挙げられる。さらなる実施形態は、直接マイクロインジェクションによるポリヌクレオチドの導入を含む。使用される発現ベクターの量は、抗原の性質、ならびに使用される細胞小器官、細胞、組織または生物に応じて変動し得る。
皮内注射、結節内注射またはリンパ管内注射は、ＤＣ投与のより一般的に使用される方法の一部である。皮内注射は、血流への吸収が低速度であるがリンパ系への取り込みが迅速であることを特徴とする。真皮に多数のランゲルハンス樹状細胞が存在することにより、インタクトな抗原ならびにプロセシングされた抗原が流入領域リンパ節に輸送され得る。これを正しく行うためには、適切な部位の準備が必要である（すなわち、適切な針の留置を観察するために、毛を刈り込む）。結節内注射は、リンパ系組織への抗原の直接的な送達を可能にする。リンパ管内注射は、ＤＣの直接投与を可能にする。
（３．エレクトロポレーション）
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションを介して細胞小器官、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびＤＮＡの懸濁液を高圧放電に曝露することを含む。この方法のいくつかの変法では、ある特定の細胞壁分解酵素（例えば、ペクチン分解酵素）を使用して、標的レシピエント細胞を、未処理の細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換に対してより感受性にする（参照により本明細書中に援用される米国特許第５，３８４，２５３号）。
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションを介して細胞小器官、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびＤＮＡの懸濁液を高圧放電に曝露することを含む。この方法のいくつかの変法では、ある特定の細胞壁分解酵素（例えば、ペクチン分解酵素）を使用して、標的レシピエント細胞を、未処理の細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換に対してより感受性にする（参照により本明細書中に援用される米国特許第５，３８４，２５３号）。
エレクトロポレーションを使用した真核細胞のトランスフェクションは、かなり成功している。この様式で、マウスプレＢリンパ球がヒトカッパ免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされ（Ｐｏｔｔｅｒら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，７１６１－７１６５）、ラット肝細胞がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｔｕｒ－Ｋａｓｐａら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，７１６－７１８）。
インビボにおけるワクチン用エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ）、すなわちｅＶａｃは、単純な注射法を介して臨床で実行されている。ポリペプチドをコードするＤＮＡベクターが、患者の皮内に注射される。次いで、電極によって皮内の空間に電気的パルスが適用されることにより、そこに局在化している細胞、特に、常在の皮膚樹状細胞が、ＤＮＡベクターを取り込み、コードされるポリペプチドを発現するようになる。次いで、局所炎症によって活性化された、これらのポリペプチドを発現している細胞が、例えば、リンパ節に遊走し、抗原を提示し得る。核酸が、エレクトロポレーションによって細胞に送達され得る場合、その核酸は、例えば、限定されないが、核酸の注射または他の任意の投与手段の後で、エレクトロポレーションを使用して投与されるとき、電気穿孔的に（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ）投与される。
エレクトロポレーションの方法は、例えば、Ｓａｒｄｅｓａｉ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２３：４２１－９（２０１１）およびＦｅｒｒａｒｏ，Ｂ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ７：１２０－１２７（２０１１）（これらの全体が本明細書中で参照により援用される）に論じられている。
（４．リン酸カルシウム）
他の実施形態では、リン酸カルシウム沈殿を用いて、ポリヌクレオチドが細胞に導入される。この手法を用いて、ヒトＫＢ細胞が、アデノウイルス５ＤＮＡでトランスフェクトされた（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６－４６７）。また、この様式において、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ－１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５－２７５２，１９８７）、ラット肝細胞が、種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０：６８９－６９５，１９９０）。
他の実施形態では、リン酸カルシウム沈殿を用いて、ポリヌクレオチドが細胞に導入される。この手法を用いて、ヒトＫＢ細胞が、アデノウイルス５ＤＮＡでトランスフェクトされた（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６－４６７）。また、この様式において、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ－１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５－２７５２，１９８７）、ラット肝細胞が、種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０：６８９－６９５，１９９０）。
（５．ＤＥＡＥ－デキストラン）
別の実施形態では、ＤＥＡＥ－デキストランの後にポリエチレングリコールを使用して、ポリヌクレオチドが細胞に送達される。この様式において、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ，Ｔ．Ｖ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８５ Ｍａｙ；５（５）：１１８８－９０）。
別の実施形態では、ＤＥＡＥ－デキストランの後にポリエチレングリコールを使用して、ポリヌクレオチドが細胞に送達される。この様式において、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ，Ｔ．Ｖ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８５ Ｍａｙ；５（５）：１１８８－９０）。
（６．音波処理負荷（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ Ｌｏａｄｉｎｇ））
さらなる実施形態は、直接音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ ｓｏｎｉｃ ｌｏａｄｉｎｇ）によるポリヌクレオチドの導入を含む。ＬＴＫ線維芽細胞が、音波処理負荷によってチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，８４６３－８４６７）。
さらなる実施形態は、直接音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ ｓｏｎｉｃ ｌｏａｄｉｎｇ）によるポリヌクレオチドの導入を含む。ＬＴＫ線維芽細胞が、音波処理負荷によってチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，８４６３－８４６７）。
（７．リポソーム媒介性トランスフェクション）
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質複合体、例えば、リポソームなどの中に閉じ込められ得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒質を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、自発的に形成する。それらの脂質成分は、自己再配列を起こした後、閉鎖構造を形成し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｂａｃｈｈａｗａｔ，（１９９１）Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄｓ．ｐｐ．８７－１０４）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化されたポリヌクレオチドも企図される。
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質複合体、例えば、リポソームなどの中に閉じ込められ得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒質を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、自発的に形成する。それらの脂質成分は、自己再配列を起こした後、閉鎖構造を形成し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｂａｃｈｈａｗａｔ，（１９９１）Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｌｉｇａｎｄｓ．ｐｐ．８７－１０４）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化されたポリヌクレオチドも企図される。
（８．レセプター媒介性トランスフェクション）
なおもさらに、ポリヌクレオチドは、レセプター媒介性送達ビヒクルを介して標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞において生じているレセプター媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々なレセプターの細胞型特異的分布に照らして、この送達方法は、別の特異性の程度を付加する。
なおもさらに、ポリヌクレオチドは、レセプター媒介性送達ビヒクルを介して標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞において生じているレセプター媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々なレセプターの細胞型特異的分布に照らして、この送達方法は、別の特異性の程度を付加する。
ある特定のレセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、細胞レセプター特異的リガンドおよびポリヌクレオチド結合剤を含む。他のものは、送達されるべきポリヌクレオチドに作動可能に付着された細胞レセプター特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドは、レセプター媒介性遺伝子移入のために使用され（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，４４２９－４４３２；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（９）：３４１０－３４１４，１９９０；Ｐｅｒａｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４０８６－４０９０，１９９４；Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ ０２７３０８５）、これにより、この手法の実施可能性が確立される。別の哺乳動物細胞型における特異的送達も論じられている（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，１２：１５９－１６７，１９９３；参照により本明細書中に援用される）。ある特定の態様では、標的細胞の集団上に特異的に発現されるレセプターに対応するリガンドが、選択される。
他の実施形態において、細胞特異的ポリヌクレオチド標的化ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソームとともに特異的結合リガンドを含み得る。送達されるべきポリヌクレオチド（複数可）は、そのリポソーム内に収容され、特異的結合リガンドは、リポソーム膜に機能的に組み込まれる。このようにして、そのリポソームは、標的細胞のレセプター（複数可）に特異的に結合し、細胞にその内容物を送達し得る。そのようなシステムは、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）が、ＥＧＦレセプターのアップレギュレーションを示す細胞へのポリヌクレオチドのレセプター媒介性送達において使用されるシステムを使用して機能的であると示された。
なおもさらなる実施形態において、標的化された送達ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソーム自体であり得、そのリポソームは、例えば、細胞特異的結合を指示する１つ以上の脂質または糖タンパク質を含み得る。例えば、ガラクトース末端のアシアロガングリオシドであるラクトシル－セラミドが、リポソームに組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９，１５７－１７６）。組織特異的な形質転換構築物が、類似の様式で標的細胞に特異的に送達され得ることが企図される。
（微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ））
微粒子銃法は、ポリヌクレオチドを少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織または生物に導入するために使用され得る（米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５３８，８８０号；米国特許第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９；これらの各々は、参照により本明細書中に援用される）。この方法は、ＤＮＡでコーティングされた微小発射体が高速度に加速して、それらが細胞膜を貫通し、細胞を殺滅せずにそれらの細胞に入ることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０－７３）。当該分野で公知の多種多様の微粒子銃法が存在し、それらの多くは、本方法に適用可能である。
微粒子銃法は、ポリヌクレオチドを少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織または生物に導入するために使用され得る（米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５３８，８８０号；米国特許第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９；これらの各々は、参照により本明細書中に援用される）。この方法は、ＤＮＡでコーティングされた微小発射体が高速度に加速して、それらが細胞膜を貫通し、細胞を殺滅せずにそれらの細胞に入ることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０－７３）。当該分野で公知の多種多様の微粒子銃法が存在し、それらの多くは、本方法に適用可能である。
この微粒子銃では、１つ以上の粒子が、少なくとも１つのポリヌクレオチドでコーティングされ、推進力によって細胞に送達され得る。小粒子を加速するためのいくつかのデバイスが、開発された。１つのそのようなデバイスは、電流を発生させ、その後その電流が輸送力を提供する高圧放電に依存する（Ｙａｎｇら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，９５６８－９５７２）。使用される微小発射体は、生物学的に不活性な物質（例えば、タングステンまたは金の粒子またはビーズ）からなった。例示的な粒子としては、タングステン、白金、およびある特定の例では、金から構成された粒子（例えば、ナノ粒子を含む）が挙げられる。場合によっては、金属粒子上へのＤＮＡ沈殿が、微粒子銃を使用したレシピエント細胞へのＤＮＡ送達に必要としないことが企図される。しかしながら、粒子は、ＤＮＡでコーティングされるのではなく、ＤＮＡを含み得ることが企図される。ＤＮＡでコーティングされた粒子は、粒子銃を介したＤＮＡ送達のレベルを上昇させ得るが、本質的に必要ない。
（ウイルスベクター媒介性移入方法の例）
被験体内の単数または複数の細胞がヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子を発現し得るようにそのヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列を含む組成物をその細胞またはその被験体に投与するのに適した任意のウイルスベクターが、本方法において使用され得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、細胞への遺伝子移入を媒介するウイルス粒子に組み込まれる。代表的には、そのウイルスは、単純に、適切な宿主細胞に生理学的条件下で曝露されることにより、ウイルスの取り込みが可能になり得る。本方法は、下記で論じられるように、種々のウイルスベクターを使用して都合よく使用される。
被験体内の単数または複数の細胞がヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子を発現し得るようにそのヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列を含む組成物をその細胞またはその被験体に投与するのに適した任意のウイルスベクターが、本方法において使用され得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、細胞への遺伝子移入を媒介するウイルス粒子に組み込まれる。代表的には、そのウイルスは、単純に、適切な宿主細胞に生理学的条件下で曝露されることにより、ウイルスの取り込みが可能になり得る。本方法は、下記で論じられるように、種々のウイルスベクターを使用して都合よく使用される。
（１．アデノウイルス）
アデノウイルスは、その中程度のサイズのＤＮＡゲノム、操作の容易性、高力価、広範囲な標的細胞および高感染力を理由に、遺伝子トランスファーベクターとして使用するのに特に適している。およそ３６ｋｂのウイルスゲノムは、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシス作用性エレメントを含む１００～２００塩基対（ｂｐ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）が境を接している。異なる転写単位を含む、ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される。
アデノウイルスは、その中程度のサイズのＤＮＡゲノム、操作の容易性、高力価、広範囲な標的細胞および高感染力を理由に、遺伝子トランスファーベクターとして使用するのに特に適している。およそ３６ｋｂのウイルスゲノムは、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシス作用性エレメントを含む１００～２００塩基対（ｂｐ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）が境を接している。異なる転写単位を含む、ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される。
Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の制御に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現により、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、ＤＮＡの複製、後期遺伝子の発現および宿主細胞の切り離しに関与する（Ｒｅｎａｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ．，１９，１９７－２１８）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によってもたらされる単一の一次転写産物の有意なプロセシングの後にだけ、発現される。ＭＬＰ（１６．８マップ単位に位置する）は、感染の後期において特に有効であり、このプロモーターからもたらされたすべてのｍＲＮＡは、それらを翻訳にとって有用にする５’トリパータイトリーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ）（ＴＬ）配列を有する。
アデノウイルスが遺伝子治療に対して最適化されるために、大きなＤＮＡセグメントを含むことができるように運搬能を最大にする必要がある。ある特定のアデノウイルス産物に関連する毒性および免疫学的反応を減少させることも非常に望ましい。これらの２つの目標は、アデノウイルス遺伝子の除去が両方の目的にかなうという点で、ある程度重なり合っている。本方法の実施によって、治療的な構築物を比較的容易にマニピュレートする能力を保持しつつ、これらの両方の目標を達成することができる。
ウイルスＤＮＡの複製に必要とされるシスエレメントがすべて、直鎖状のウイルスゲノムのいずれかの末端の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（１００～２００ｂｐ）に局在化するので、ＤＮＡの大きな置き換えが可能である。ＩＴＲを含むプラスミドは、非欠陥アデノウイルスの存在下において複製し得る（Ｈａｙ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８４ Ｊｕｎ ５；１７５（４）：４９３－５１０）。ゆえに、これらのエレメントをアデノウイルスベクターに含めることにより、複製が可能になり得る。
さらに、ウイルス封入のためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左端の１９４～３８５ｂｐ（０．５～１．１マップ単位）に局在する（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５－２５５８）。このシグナルは、左端に近いが付着末端配列の外側の特異的配列が、頭部構造へのＤＮＡの挿入に必要とされるタンパク質への結合を媒介する、バクテリオファージラムダＤＮＡにおけるタンパク質認識部位を模倣している。ＡｄのＥ１置換ベクターは、ウイルスゲノムの左端の４５０ｂｐ（０～１．２５マップ単位）フラグメントが２９３細胞においてパッケージングを指示し得ることを実証した（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ，１０１：１９５－２０２，１９９１）。
以前に、アデノウイルスゲノムのある特定の領域が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、コードされている遺伝子が発現され得ることが示された。これらの細胞株は、その細胞株によってコードされる、アデノウイルス機能を欠いたアデノウイルスベクターの複製を支持することができる。「補助」ベクター、例えば、野生型ウイルスまたは条件欠陥性変異体による複製欠損性アデノウイルスベクターの補完の報告も存在する。
複製欠損性アデノウイルスベクターは、ヘルパーウイルスによってトランスで補完され得る。しかしながら、複製機能を提供するのに必要なヘルパーウイルスが存在するせいで、いずれの調製物も汚染され得るので、この知見だけでは、複製欠損性ベクターの単離が可能にならない。したがって、複製欠損性ベクターの複製および／またはパッケージングに特異性を付加し得るさらなるエレメントが必要だった。そのエレメントは、アデノウイルスのパッケージング機能に由来する。
アデノウイルスに対するパッケージングシグナルは、従来のアデノウイルスマップの左端に存在することが示されている（Ｔｉｂｂｅｔｔｓら（１９７７）Ｃｅｌｌ，１２，２４３－２４９）。後の研究から、ゲノムのＥ１Ａ（１９４～３５８ｂｐ）領域に欠失を有する変異体が、初期（Ｅ１Ａ）機能を補完した細胞株においてさえ不十分にしか成長しないことが示された（Ｈｅａｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６７，８０９－８２２）。代償的な（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ）アデノウイルスＤＮＡ（０～３５３ｂｐ）が、その変異体の右端に組み換えられたとき、そのウイルスは、正常にパッケージングされた。さらなる変異解析から、Ａｄ５ゲノムの左端に、短い反復性の位置依存性エレメントが同定された。その反復は、ゲノムのいずれかの末端に存在する場合、効率的なパッケージングには１コピーで十分であるが、Ａｄ５ ＤＮＡ分子の内側に向かって移動した場合は、そうではないことが見出された（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５－２５５８）。
パッケージングシグナルの変異バージョンを使用することによって、様々な効率でパッケージングされるヘルパーウイルスを作製することが可能である。代表的には、変異は、点変異または欠失である。パッケージングが低効率であるヘルパーウイルスをヘルパー細胞内で生育させるとき、そのウイルスは、野生型ウイルスと比べて低い速度であったとしてもパッケージングされ、それにより、ヘルパーの繁殖が可能となる。しかしながら、これらのヘルパーウイルスを、野生型パッケージングシグナルを含むウイルスとともに細胞内で生育させるとき、その野生型パッケージングシグナルは、変異バージョンよりも優先的に認識される。パッケージング因子の量が限られていることを考慮すると、野生型シグナルを含むウイルスは、ヘルパーと比べて選択的にパッケージングされる。優先性が十分大きい場合、均質に近い系統（ｓｔｏｃｋ）が達成され得る。
特定の組織または種に対するＡＤＶ構築物の向性を改善するために、レセプター結合ファイバー配列は、しばしばアデノウイルス分離株の間で置換され得る。例えば、アデノウイルス５において見出されたコクサッキー－アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）リガンドは、アデノウイルス３５由来のＣＤ４６結合ファイバー配列の代わりに用いられ、ヒト造血細胞に対する結合親和性が大幅に改善されたウイルスが作製され得る。得られた「シュードタイプ化された」ウイルスであるＡｄ５ｆ３５は、いくつかの臨床的に開発されたウイルス分離株の基礎となった。さらに、標的細胞に対してウイルスを再標的化することを可能にするファイバーを改変する様々な生化学的方法が存在する。方法は、二機能性抗体（一方の末端はＣＡＲリガンドに結合し、もう一方の末端は標的配列に結合する）の使用、およびカスタマイズされたアビジンベースのキメラリガンドとの会合を可能にするファイバーの代謝性のビオチン化を含む。あるいは、リガンド（例えば、抗ＣＤ２０５）をヘテロ二機能性リンカー（例えば、ＰＥＧ含有）によってアデノウイルス粒子に付着することができる。
（２．レトロウイルス）
レトロウイルスは、そのＲＮＡを逆転写のプロセスによって感染細胞において二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ，（１９９０）Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４３７－１５００）。次いで、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体内に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。その組み込みにより、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。ｐｓｉと呼ばれる、ｇａｇ遺伝子から上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。したがって、例えば、本技術は、例えば、細胞を形質導入するために使用されるポリヌクレオチドがその細胞のゲノムに組み込まれた細胞を含む。
レトロウイルスは、そのＲＮＡを逆転写のプロセスによって感染細胞において二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ，（１９９０）Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４３７－１５００）。次いで、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体内に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。その組み込みにより、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。ｐｓｉと呼ばれる、ｇａｇ遺伝子から上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。したがって、例えば、本技術は、例えば、細胞を形質導入するために使用されるポリヌクレオチドがその細胞のゲノムに組み込まれた細胞を含む。
レトロウイルスベクターを構築するために、プロモーターをコードする核酸を、ウイルスゲノム内のある特定のウイルス配列の位置に挿入することにより、複製欠損であるウイルスが作製される。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよびｐｓｉ成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ，３３，１５３－１５９）。レトロウイルスのＬＴＲ配列およびｐｓｉ配列とともにヒトｃＤＮＡを含む組換えプラスミドをこの細胞株に導入するとき（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、そのｐｓｉ配列は、その組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子内にパッケージングさせ、次いでそれを培養培地中に分泌させる（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．Ｒ．，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ ａｎｄ
Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．）．Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ；Ｔｅｍｉｎら（１９８６）Ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），および Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９－１８８；Ｍａｎｎら、１９８３）。組換えレトロウイルスを含む培地を捕集し、必要に応じて濃縮し、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染することができる。しかしながら、多くのタイプのレトロウイルスの組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら（１９７５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７，２４２－２４８）。
Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．）．Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ；Ｔｅｍｉｎら（１９８６）Ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），および Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９－１８８；Ｍａｎｎら、１９８３）。組換えレトロウイルスを含む培地を捕集し、必要に応じて濃縮し、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染することができる。しかしながら、多くのタイプのレトロウイルスの組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら（１９７５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７，２４２－２４８）。
レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするようにデザインされたアプローチは、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて最近開発された。アシアロ糖タンパク質レセプターを介した肝細胞などの細胞の特異的感染を可能にし得るこの修飾が望まれる場合がある。
組換えレトロウイルスの標的化に対する異なるアプローチがデザインされており、そのアプローチは、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特異的な細胞レセプターに対するビオチン化抗体を使用した。それらの抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９０７９－９０８３）。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、それらの表面抗原を有する種々のヒト細胞がインビトロにおいてエコトロピックウイルスに感染することが実証された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
（３．アデノ随伴ウイルス）
ＡＡＶは、約４７００塩基対の直鎖状の一本鎖ＤＮＡを使用する。末端逆位反復配列は、ゲノムに隣接している。２つの遺伝子が、ゲノム内に存在し、いくつかの異なる遺伝子産物を生じる。第１に、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ－１、ＶＰ－２およびＶＰ－３と命名された３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を生成する。第２に、ｒｅｐ遺伝子は、４つの非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする。これらのｒｅｐ遺伝子産物の１つ以上は、ＡＡＶ転写のトランス活性化に関与する。
ＡＡＶは、約４７００塩基対の直鎖状の一本鎖ＤＮＡを使用する。末端逆位反復配列は、ゲノムに隣接している。２つの遺伝子が、ゲノム内に存在し、いくつかの異なる遺伝子産物を生じる。第１に、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ－１、ＶＰ－２およびＶＰ－３と命名された３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を生成する。第２に、ｒｅｐ遺伝子は、４つの非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする。これらのｒｅｐ遺伝子産物の１つ以上は、ＡＡＶ転写のトランス活性化に関与する。
ＡＡＶにおける３つのプロモーターは、ゲノム内のそれらの位置によって、マップ単位で命名されている。これらは、左から右へ、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０である。転写によって、６つの転写産物が生じ、２つは、３つの各プロモーターにおいて開始され、各対の一方がスプライシングされる。マップ単位４２～４６に由来するスプライス部位は、各転写産物にとって同じである。４つの非構造タンパク質は、より長い転写産物に由来するとみられ、３つのビリオンタンパク質のすべてが、最も小さい転写産物から生じる。
ＡＡＶは、ヒトにおけるいかなる病的状態にも関連しない。興味深いことに、効率的な複製のために、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ならびに当然のことながらアデノウイルスなどのウイルスからの「補助」機能を必要とする。それらのヘルパーのうち最も特徴付けられたものは、アデノウイルスであり、このウイルスに対する多くの「初期」機能は、ＡＡＶの複製を支援すると示された。ＡＡＶ構造発現を抑制すると考えられているＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の低レベルの発現、およびヘルパーウイルス感染は、この阻止を取り消すと考えられている。
ＡＡＶベクターの末端反復配列は、ＡＡＶまたは改変されたＡＡＶゲノムを含むｐ２０１などのプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化によって（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：３０９６－３１０１（１９８７））またはＡＡＶの公開配列に基づく末端反復配列の化学的合成もしくは酵素的合成を含むがこれらに限定されない他の方法によって得ることができる。それは、例えば、機能、すなわち安定した部位特異的な組み込みを可能にするために必要とされるＡＡＶ ＩＴＲの最小の配列または一部を、欠失分析によって決定することができる。また、安定した部位特異的な組み込みを指示する末端反復配列の能力を維持しつつ、配列のどの軽微な改変が許容され得るかを決定することもできる。
ＡＡＶベースのベクターは、インビトロにおいて遺伝子送達するための安全で有効なビヒクルであることが証明されており、これらのベクターは、開発されており、エキソビボとインビボの両方における潜在的な遺伝子治療において広範囲に適用するために前臨床段階および臨床段階において試験されている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ，（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０；７９－９０；Ｃｈａｔｔｅｉｊｅｅら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０，７９－９０；Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，３２２７－３２３４；Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０－５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３－１０６１７，（１９９３）；Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９４），Ｂｌｏｏｄ，８４，１４９２－１５００；Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９４）Ｎａｔ’ｌ Ｇｅｎｅｔ．，８，１４８－１５３；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ．１９９６ Ｄｅｃ；６２（６）：１６６９－７６；Ｋｅｓｓｌｅｒら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１４０８２－１４０８７；Ｋｏｅｂｅｒｌら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１４２６－１４３１；Ｍｉｚｕｋａｍｉら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１７，１２４－１３０）。
肺におけるＡＡＶ媒介性の効率的な遺伝子移入および遺伝子発現は、嚢胞性線維症の処置のための臨床試験に至っている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ，１９９５；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３－１０６１７，（１９９３））。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のＡＡＶ媒介性の遺伝子送達による筋ジストロフィーの処置、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送達によるパーキンソン病の処置、肝臓への第ＩＸ因子遺伝子送達による血友病Ｂの処置、および潜在的に、心臓への血管内皮成長因子遺伝子による心筋梗塞の処置の見込みは、これらの器官におけるＡＡＶ媒介性の導入遺伝子発現が高度に効率的であると最近示されたので、有望であるとみられる（Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０－５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３；Ｋａｐｌｉｔｔら、１９９４；１９９６；Ｋｏｅｂｅｒｌら、１９９７；ＭｃＣｏｗｎら（１９９６）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，７１３，９９－１０７；Ｐｉｎｇら（１９９６）Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，３，２２５－２２８；Ｘｉａｏら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８０９８－８１０８）。
（４．他のウイルスベクター）
他のウイルスベクターも、本発明の方法および組成物において発現構築物として用いられる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ
ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，ｐｐ．４６７－４９２；Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ，（１９８６）Ｉｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｐｐ．１１７－１４８；Ｃｏｕｐａｒら、Ｇｅｎｅ，６８：１－１０，１９８８）カナリアポックスウイルスおよびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用される。これらのウイルスは、様々な哺乳動物細胞への遺伝子移入において使用するためのいくつかの特徴を提供する。
他のウイルスベクターも、本発明の方法および組成物において発現構築物として用いられる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ
ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，ｐｐ．４６７－４９２；Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ，（１９８６）Ｉｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｐｐ．１１７－１４８；Ｃｏｕｐａｒら、Ｇｅｎｅ，６８：１－１０，１９８８）カナリアポックスウイルスおよびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用される。これらのウイルスは、様々な哺乳動物細胞への遺伝子移入において使用するためのいくつかの特徴を提供する。
いったん、構築物が細胞内に送達されたら、導入遺伝子をコードする核酸は、種々の部位に位置づけられ、発現される。ある実施形態おいて、導入遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれる。この組み込みは、相同組換えを介して同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）位置および向きである（遺伝子置換）かまたはランダムで非特異的な位置に組み込まれる（遺伝子増強）。なおもさらなる実施形態において、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持される。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係のまたはそれと同期した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達され、その核酸が細胞のどこにとどまるかは、使用される発現構築物のタイプに依存する。
（疾患を処置するための方法）
本方法は、疾患を処置するかまたは予防する方法も包含し、ここで、例えば注入による細胞の投与が、有益であり得る。
本方法は、疾患を処置するかまたは予防する方法も包含し、ここで、例えば注入による細胞の投与が、有益であり得る。
細胞、例えば、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、または前駆体細胞など、例えば、造血幹細胞、間葉系ストローマ細胞、幹細胞、多能性幹細胞および胚性幹細胞などが、細胞治療のために使用され得る。それらの細胞は、ドナーに由来し得るか、または患者から得られた細胞であり得る。それらの細胞は、例えば、病的な細胞の機能を置き換えるための、例えば、再生において使用され得る。それらの細胞は、生物学的作用物質が、特定の微小環境、例えば、病的な骨髄または転移性の沈着物（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｅｐｏｓｉｔ）などに送達され得るように、異種遺伝子を発現するようにも改変され得る。間葉系ストローマ細胞は、例えば、免疫抑制活性を提供するためにも使用されており、移植片対宿主病および自己免疫障害の処置において使用され得る。本願において提供される細胞は、細胞治療後に治療用細胞の活性が増加されるか、または減少される必要がある状況において価値のあるものであり得る安全スイッチを含む。例えば、キメラ抗原レセプターを発現するＴ細胞が患者に提供される場合、場合によっては、またはオフターゲット毒性などの有害事象が存在し得る。リガンドの投与を終了すると、治療用Ｔ細胞は非活性化状態に戻り、無毒性の低い発現レベルで残存し得る。または、例えば、その治療用細胞は、腫瘍細胞または腫瘍サイズを減少させるように働き得、もはや必要とされなくなることがある。この状況では、リガンドの投与は、終了してもよく、治療用細胞は、もはや活性化されない。最初の治療後に腫瘍細胞が再発する（ｒｅｔｕｒｎ）かまたは腫瘍サイズが増加する場合、キメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞を活性化させ、患者を再処置するために、リガンドが再度投与され得る。
「治療用細胞」とは、細胞治療のために使用される細胞、すなわち、状態または疾患を処置するためまたは予防するために被験体に投与される細胞のことを意味する。上記細胞が負の効果を有するこのような場合、本方法は、選択的アポトーシスを介して上記治療用細胞を除去するために使用され得る。
他の例では、Ｔ細胞は、種々の疾患および状態を処置するために、ならびに幹細胞移植の一部として使用される。ハプロタイプ一致Ｔ細胞移植後に起こり得る有害事象は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。ＧｖＨＤが起こる可能性は、移植されるＴ細胞の数が増大するとともに増大する。これは、注入され得るＴ細胞の数を制限する。患者におけるＧｖＨＤの事象において、その注入されたＴ細胞を選択的に除去する能力を有することによって、より多数のＴ細胞が注入され得、その数を１０６より多い、１０７より多い、１０８より多い、または１０９より多い細胞へと、増大させ得る。投与され得る１ｋｇ 体重あたりのＴ細胞の数は、例えば、約１×１０４ Ｔ細胞／ｋｇ 体重～約９×１０７ Ｔ細胞／ｋｇ 体重、例えば、約１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、もしくは９×１０４；約１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、もしくは９×１０５；約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、もしくは９×１０６；または約１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、もしくは９×１０７ Ｔ細胞／ｋｇ 体重であり得る。他の例では、Ｔ細胞以外の治療用細胞が使用され得る。投与され得る１ｋｇ 体重あたりの治療用細胞の数は、例えば、約１×１０４ Ｔ細胞／ｋｇ 体重～約９×１０７ Ｔ細胞／ｋｇ 体重、例えば、約１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、もしくは９×１０４；約１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、もしくは９×１０５；約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、もしくは９×１０６；または約１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、もしくは９×１０７ 治療用細胞／ｋｇ 体重であり得る。
用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量として好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる希釈剤と共同して、所望の免疫原性効果をもたらすと計算された所定の量の薬学的組成物を含む。接種材料の単位用量についての規格（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、薬学的組成物のユニークな特色および
達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、その特色に依存する。
達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、その特色に依存する。
本明細書で示される多量体リガンドなどの薬学的組成物の有効量は、カスパーゼ－９ベクターを含む細胞を選択的に除去するというこの選択された結果を達成する量である。その結果、カスパーゼ－９発現細胞のうちの６０％超、７０％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、または９７％超が殺滅される。用語は、「十分な量」とも同義である。
任意の特定の用途に対する有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、被験体のサイズおよび／または疾患もしくは状態の重症度などの因子に応じて変動し得る。本明細書中に提示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を必要とせずに、経験的に決定され得る。
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき、薬学的組成物および／もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬などが標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセスを論ずるために本明細書中で使用されるか、または標的細胞、組織もしくは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを考察するために本明細書中で使用される。細胞の殺滅または静止を達成するために、薬学的組成物および／またはさらなる作用物質（複数可）が、細胞（複数可）を殺滅するのに有効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計量で１つ以上の細胞に送達される。
薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質（複数可）より先に行われ得る、他の作用物質（複数可）と並行して（ｃｏ－ｃｕｒｒｅｎｔ）であり得る、および／または他の作用物質（複数可）の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質（複数可）が別々に細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質（複数可）がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証され得る。例えば、そういった場合には、２、３、４つまたはそれより多くの様式を用いて、細胞、組織または生物を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）薬学的組成物と接触させ得ることが企図される。他の態様において、１つ以上の作用物質が、発現ベクターを投与する前および／または投与した後に、実質的に同時、約１分以内から、約２４時間、約７日間、約１～約８週間またはそれより長くまで、およびそれらの中の任意の導き出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と１つ以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。
（最適化されたおよび個別化された治療的処置）
二量体の投与後のアポトーシスの誘導は、移植片対宿主病のステージ、または患者の中に残っている望ましくない治療用細胞の数を決定することによって最適化され得る。
二量体の投与後のアポトーシスの誘導は、移植片対宿主病のステージ、または患者の中に残っている望ましくない治療用細胞の数を決定することによって最適化され得る。
例えば、患者がＧｖＨＤを有すること、およびそのＧｖＨＤのステージを決定することは、多量体リガンドを投与することによって、カスパーゼ－９関連アポトーシスを誘導することは必要であり得るという臨床医への指示を提供する。別の例では、患者が多量体リガンドでの処置後にＧｖＨＤのレベルの低下を有することの決定は、さらなる用量の多量体リガンドが必要とされないことを臨床医に示し得る。同様に、多量体リガンドでの処置後に、上記患者がＧｖＨＤ症状を示し続けるか、またはＧｖＨＤの再発に苦しむことの決定は、多量体リガンドの少なくともさらなる１用量を投与することが必要であり得ることを臨床医に示し得る。用語「投与量」は、投薬量および投与頻度（例えば、次の用量のタイミングなど）の両方を含むことを意味する。
他の実施形態において、改変された細胞またはインビボで改変された細胞の数を減少することが必要な事象において、誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドに加えて、キメラ抗原レセプターを発現する治療用細胞のような治療用細胞の投与後に、多量体リガンドは、上記患者に投与され得る。これら実施形態において、上記方法は、有害な症状または状態（例えば、移植片対宿主病、またはオフターゲット毒性）の有無を決定すること、および上記多量体リガンドのある用量を投与することを包含する。上記方法は、上記症状または状態をモニターすること、および上記症状もしくは状態が持続する事象において、さらなる用量の上記多量体リガンドを投与することをさらに包含し得る。このモニタリングおよび処置スケジュールは、キメラ抗原レセプターまたはキメラシグナル伝達分子を発現する治療用細胞が上記患者の中に残っている間は継続し得る。
その後の薬物の用量、例えば、例えば、その後の多量体リガンドの用量、および／またはその後の薬物投与量を調整するまたは維持する指示は、任意の好都合な様式で提供され得る。指示は、いくつかの実施形態において、表形式で（例えば、物理的媒体または電子媒体において）提供され得る。例えば、観察される移植片対宿主病の症状が、表として提供され得、臨床医は、疾患のステージのリストまたは表とその症状を比較し得る。次いで、その臨床医は、その表から、その後の薬物用量に対する指示を確認し得る。ある特定の実施形態において、指示は、それらの症状またはＧｖＨＤステージがコンピュータに提供された後（例えば、コンピュータ上のメモリに入れられた後）、コンピュータによって提示され得る（例えば、表示され得る）。例えば、この情報は、コンピュータに提供され得（例えば、ユーザーによってコンピュータメモリに入れられ得るか、またはコンピュータネットワーク内のリモートデバイスを介してコンピュータに送信され得）、コンピュータ内のソフトウェアが、その後の薬物用量を調整するかもしくは維持することについての指示を生成し得、および／またはその後の薬物用量の量を提供し得る。
その後の用量が、指示に基づいて決定されたら、臨床医は、決定されたその後の用量を投与し得るか、または別の人もしくは実体に対してその用量を調整する指示を提供し得る。本明細書中で使用される用語「臨床医」は、意思決定者のことを指し、ある特定の実施形態において、臨床医は、医療専門家である。意思決定者は、いくつかの実施形態において、コンピュータまたは表示されたコンピュータプログラムのアウトプットであり得、そのコンピュータによって表示される指示またはその後の薬物用量に基づいて、保健サービス提供者が行動し得る。意思決定者は、その後の用量を直接投与し得る（例えば、その後の用量を被験体に注入し得る）か、または遠隔的に投与し得る（例えば、ポンプパラメータが、意思決定者によって遠隔的に変更され得る）。
いくつかの例では、上記リガンドの１用量または複数用量は、ＧｖＨＤ、または他の症状（例えば、ＣＲＳ症状）の臨床的出現が明らかになる前に投与され得る。この例では、細胞治療は、負の症状の出現の前に終了される。例えば、遺伝的疾患の処置のための造血細胞移植などの他の実施形態において、上記治療は、移植片が生着に向かって進行した後であるが、しかし臨床的に観察可能なＧｖＨＤまたは他の負の症状が起こり得る前に、終了され得る。他の例では、上記リガンドは、オンターゲット／オフ腫瘍細胞（例えば、Ｂ細胞関連標的抗原を共発現する健康なＢ細胞など）を排除するための、改変された細胞を排除するために投与され得る。
本明細書で示されるとおりの方法は、限定なしに、活性化された細胞、核酸またはこれをコードする発現構築物の有効量の送達を含む。薬学的組成物の「有効量」は、一般に、検出可能にかつ反復して、述べられる所望の結果を達成するために、例えば、上記疾患またはその症候を回復するか、減少するか、最小にするか、またはその程度を制限するために、十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定義が、適用されることもある。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価するためおよび毒性をコントロールするためにバイオマーカーをモニターすることが存在してもよい。
（コントロールされた治療のための治療用細胞の二重コントロールおよびヘテロ二量体化剤のよるアポトーシスのコントロール）
本明細書で提供される核酸および細胞は、コントロールされた治療のための治療用細胞の二重コントロールを達成するために使用され得る。例えば、被験体は、標的化されたキメラ抗原レセプター治療を送達する必要性がある腫瘍などの状態と診断され得る。本明細書で論じられる方法は、ＣＡＲ発現治療用細胞の活性を誘導するために、および治療を完全に中止するか、または被験体における治療用細胞の数またはパーセントを減少させる必要性がある場合の、安全スイッチを提供するためにも、治療をコントロールする方法のいくつかの例を提供する。
本明細書で提供される核酸および細胞は、コントロールされた治療のための治療用細胞の二重コントロールを達成するために使用され得る。例えば、被験体は、標的化されたキメラ抗原レセプター治療を送達する必要性がある腫瘍などの状態と診断され得る。本明細書で論じられる方法は、ＣＡＲ発現治療用細胞の活性を誘導するために、および治療を完全に中止するか、または被験体における治療用細胞の数またはパーセントを減少させる必要性がある場合の、安全スイッチを提供するためにも、治療をコントロールする方法のいくつかの例を提供する。
ある種の例では、改変されたＴ細胞は、以下のポリペプチドを発現する被験体に投与される：１．２個もしくはこれより多くのＦＫＢＰ１２リガンド結合領域および単数もしくは複数の共刺激ポリペプチド（例えば、ＭｙＤ８８もしくは短縮型ＭｙＤ８８およびＣＤ４０など）を含むキメラポリペプチド（ｉＭｙＤ８８／ＣＤ４０、または「ｉＭＣ」）；２．１個もしくはこれより多くのＦＲＢリガンド結合領域およびカスパーゼ－９ポリペプチドを含むキメラアポトーシス促進ポリペプチド；３．標的抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターポリペプチド。この例では、上記標的抗原は、被験体において腫瘍細胞上に存在する腫瘍抗原である。投与後に、リガンドＡＰ１９０３は、上記被験体に投与され得、ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉＭＣ活性化を誘導する。上記治療はモニターされ、例えば、その腫瘍サイズまたは成長は、治療の過程の間に評価され得る。上記リガンドの１もしくはこれより多くの用量は、治療の過程の間に投与され得る。
ＡＰ１９０３の投与を中止することによって、治療がモジュレートされ得、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化レベルを低下させ得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞治療を中止するために、安全スイッチ－キメラカスパーゼ－９ポリペプチドは、ラパログを投与することによって活性化され得、ラパログはＦＲＢリガンド結合領域に結合する。ラパログの量および投与スケジュールは、必要とされるＣＡＲ－Ｔ細胞治療のレベルに基づいて決定され得る。安全スイッチとして、ラパログの用量は、投与された改変された細胞のうちの少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％を除去するために有効な量である。他の例では、上記用量は、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療のレベルを減少させる必要性があるが、上記治療を完全には中止しない場合、上記キメラカスパーゼポリペプチドを発現する細胞のうちの３０％まで、４０％まで、５０％まで、６０％まで、７０％まで、８０％まで、９０まで、９５％まで、または１００％までを除去するために有効な量である。これは、例えば、安全スイッチを誘導する前に、ラパマイシンまたはラパログを投与する前に被験体からサンプルを得、そしてラパマイシンまたはラパログを投与した後に、例えば投与後、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、または１日、２日、３日、４日、５日でサンプルを得、そして例えば、利用可能な任意の方法（例えば、マーカーの存在を検出することを含む）によって、上記２種のサンプルの間のキメラカスパーゼ発現細胞の数または濃度を比較することによって、測定され得る。上記細胞の％除去を決定するためのこの方法はまた、誘導するリガンドが、ＡＰ１９０３であるか、またはＦＫＢＰ１２もしくはＦＫＢＰ１２バリアント多量体化領域に結合する場合に使用され得る。
いくつかの例では、上記誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラポリペプチドはまた、キメラ抗原レセプターを含む。これら例では、上記２種のポリペプチドがその同じ分子の上に存在する場合、上記キメラポリペプチドは、１個またはこれより多くのリガンド結合領域を含み得る。
タンパク質二量体化の化学誘導（ＣＩＤ）は、細胞を自殺させるかまたは小分子ホモ二量体化リガンドであるリミズシド（ＡＰ１９０３）でアポトーシス誘導可能にするために、有効に適用されてきた。この技術は、細胞移植を補助する遺伝子治療として組み込まれる「安全スイッチ」の基礎をなす（１、２）。この技術の中心的教義は、シグナル伝達経路の一部としてタンパク質－タンパク質相互作用に依拠する通常の細胞制御経路が、小分子二量体化薬物が上記タンパク質－タンパク質オリゴマー化事象をコントロールするために使用される場合に、リガンド依存性の条件コントロールに適合され得るということである（３～５）。ホモ二量体化リガンド（例えば、リミズシド、ＡＰ１５１０またはＡＰ２０１８７）を使用するカスパーゼ－９およびＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２バリアントを含む融合タンパク質の誘導される二量体化（すなわち、「ｉカスパーゼ９／ｉＣａｓｐ９／ｉＣ９」）は、細胞死を迅速にもたらし得る。カスパーゼ－９は、アポトーシスプロセスの「ゲートキーパー」として作用する開始カスパーゼである（６）。通常は、アポトーシス細胞のミトコンドリアから放出されるアポトーシス促進分子（例えば、シトクロムｃ）は、Ａｐａｆ－１、カスパーゼ－９結合足場のコンホメーションを変化させ、そのオリゴマー化および「アポプトソーム」の形成をもたらす。この変化は、カスパーゼ－９二量体化およびその潜伏性形態を活性な分子へ切断することを促進し、これは翻って、「下流の」アポトーシスエフェクター、カスパーゼ－３を切断し、不可逆的な細胞死をもたらす。リミズシドは、２個のＦＫＢＰ１２－Ｖ３６部分と直接結合し、ＦＫＢＰ１２－Ｖ３６を含む融合タンパク質の二量体化を指向し得る（１、２）。リミズシドとのｉＣ９結合は、活性なアポプトソームのＡｐａｆ１変換の必要性を回避する。この例では、ヘテロ二量体化リガンドを結合するタンパク質部分へのカスパーゼ－９の融合は、その活性化およびリミズシド媒介性ｉＣ９活性化に類似の効力を伴って細胞死を指向するその能力に関してアッセイされる。
ＭｙＤ８８およびＣＤ４０を、ｉＭＣ活性化スイッチの基礎（ｂａｓｉｓ）として選択した
。ＭｙＤ８８は、樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）による病原体の検出または細胞傷害において中心的なシグナル伝達の役割を果たす。病原体由来または壊死細胞由来の「危険な分子」への曝露後に、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）といわれる「パターン認識レセプター」のサブクラスが活性化され、両方のタンパク質上の相同なＴＬＲ－ＩＬ１ＲＡ（ＴＩＲ）ドメインを介して、アダプター分子であるＭｙＤ８８の凝集および活性化をもたらす。ＭｙＤ８８は、翻って、タンパク質の残りを介して、下流のシグナル伝達を活性化する。これは、ＣＤ４０のような共刺激タンパク質、ならびに抗原プロセシングおよび抗原提示のために必要とされるＭＨＣおよびプロテアーゼのような他のタンパク質のアップレギュレーションをもたらす。ＭｙＤ８８およびＣＤ４０由来のシグナル伝達ドメインと２個のＦｖドメインとの融合は、ｉＭＣ（ＭＣ．ＦｖＦｖも）を提供し、これは、リミズシドへの曝露後にＤＣを強力に活性化した（７）。ｉＭＣは、同様にＴ細胞の強力な共刺激タンパク質であることが、後に見出された。
。ＭｙＤ８８は、樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）による病原体の検出または細胞傷害において中心的なシグナル伝達の役割を果たす。病原体由来または壊死細胞由来の「危険な分子」への曝露後に、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）といわれる「パターン認識レセプター」のサブクラスが活性化され、両方のタンパク質上の相同なＴＬＲ－ＩＬ１ＲＡ（ＴＩＲ）ドメインを介して、アダプター分子であるＭｙＤ８８の凝集および活性化をもたらす。ＭｙＤ８８は、翻って、タンパク質の残りを介して、下流のシグナル伝達を活性化する。これは、ＣＤ４０のような共刺激タンパク質、ならびに抗原プロセシングおよび抗原提示のために必要とされるＭＨＣおよびプロテアーゼのような他のタンパク質のアップレギュレーションをもたらす。ＭｙＤ８８およびＣＤ４０由来のシグナル伝達ドメインと２個のＦｖドメインとの融合は、ｉＭＣ（ＭＣ．ＦｖＦｖも）を提供し、これは、リミズシドへの曝露後にＤＣを強力に活性化した（７）。ｉＭＣは、同様にＴ細胞の強力な共刺激タンパク質であることが、後に見出された。
ラパマイシンは、高い親和性（＜１ｎＭ）でＦＫＢＰ１２に結合し、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインとの高親和性の阻害性相互作用を一緒に開始する天然生成物のマクロライドである（８）。ＦＲＢは、小さく（８９アミノ酸）、そのために、多くのタンパク質に付加されるときにタンパク質「タグ」または「ハンドル」として使用され得る（９－１１）。ＦＲＢ融合タンパク質とＦＫＢＰ１２融合タンパク質とが共発現すると、それらが接近することでラパマイシン誘導性になる（１２－１６）。この例および以下の例は、ＦＫＢＰおよびＦＲＢをタンデムで結合したカスパーゼ－９の発現がまた、アポトーシスに誘導し得、かつ経口で利用可能なリガンド（ラパマイシン）によって制御される細胞安全スイッチの基礎として働き得るかどうかを試験するためにデザインされた実験および結果を提供する。さらに、誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０ラパマイシン感受性共刺激ポリペプチドを、ＦＫＢＰおよびＦＲＢをタンデムでＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチドと融合することによって開発した。ＦＫＢＰおよびＦＲＢのこのタンデム融合物に関して、ラパマイシンの誘導体（ラパログ）がまた使用され得、これは、低い治療的用量でｍＴＯＲを阻害しない。例えば、ラパマイシンまたはこれらラパマイシンアナログは、ヘテロ二量体化剤を使用して選択されたＭＣ－ＦＫＢＰ融合した変異体ＦＲＢドメインと結合して、２個のＭＣ－ＦＫＢＰ－ＦＲＢポリペプチドをホモ二量体化し得る。
以下の参考文献は、この節で言及され、それらの全体が本明細書のよって参考として援用される。
二重スイッチキメラアポトーシス促進ポリペプチド
キメラポリペプチドＦＲＢ．ＦＫＢＰＶ．ΔＣ９（二重調節）、ＦＫＢＰｖ．ΔＣ９、および／またはＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９の活性を、ヘテロ二量体のラパマイシン、またはホモ二量体のリミズシドのいずれかに対する応答についてアッセイした。
キメラポリペプチドＦＲＢ．ＦＫＢＰＶ．ΔＣ９（二重調節）、ＦＫＢＰｖ．ΔＣ９、および／またはＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９の活性を、ヘテロ二量体のラパマイシン、またはホモ二量体のリミズシドのいずれかに対する応答についてアッセイした。
小分子での二量体化の化学的誘導（ＣＩＤ）は、タンパク質機能のスイッチを生成して、細胞生理を変化させるために使用される有効な技術である。リミズシドまたはＡＰ１９０３は、高い特異性の効率的二量体化剤であり、これは、テールトゥーテール（ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ）に配置された（ＦＫ５０６に基づく）２個の同一のタンパク質結合表面から構成され、各々は、ＦＫＢＰ１２の変異体、ＦＫＢＰ１２ｖ３６またはＦＫＢＰｖに対して高い親和性および特異性を有する。ＦＫＢＰ１２ｖ３６は、ＦＫＢＰ１２の改変されたバージョンであり、その中でフェニルアラニン３６は、より小さな疎水性残基であるバリンで置き換えられ、ＡＰ１９０３のＦＫＢＰ１２結合部位上でのかさ高い改変に適応する[1]。この変更は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６へのＡＰ１９０３の結合を増加させる（約
０．１ｎＭ）一方で、天然のＦＫＢＰ１２へのＡＰ１９０３の結合は、ＦＫ５０６と比較しておよそ１／１００に低下する[1, 2]。ホモ二量体化に通常は依拠する１またはこれより多くの細胞シグナル伝達分子上への１またはこれより多くのＦＶドメインの結合は、そのタンパク質をリミズシド誘導性シグナル伝達調節に変換し得る。リミズシドでのホモ二量体化は、細胞治療のための誘導性カスパーゼ－９（ｉカスパーゼ－９）「安全スイッチ」および誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ｉＭＣ）「活性化スイッチ」の両方の基礎である。
０．１ｎＭ）一方で、天然のＦＫＢＰ１２へのＡＰ１９０３の結合は、ＦＫ５０６と比較しておよそ１／１００に低下する[1, 2]。ホモ二量体化に通常は依拠する１またはこれより多くの細胞シグナル伝達分子上への１またはこれより多くのＦＶドメインの結合は、そのタンパク質をリミズシド誘導性シグナル伝達調節に変換し得る。リミズシドでのホモ二量体化は、細胞治療のための誘導性カスパーゼ－９（ｉカスパーゼ－９）「安全スイッチ」および誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ｉＭＣ）「活性化スイッチ」の両方の基礎である。
ラパマイシンは、ＦＫＢＰ１２に結合するが、リミズシドとは異なり、ラパマイシンはまた、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインに結合し、ＦＲＢを含む融合物で、ＦＫＢＰ１２に融合されるシグナル伝達ドメインのヘテロ二量体化を誘導し得る。ＦＫＢＰおよびＦＲＢとタンデムで（両方の配置において：ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９またはＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９）融合されたカスパーゼ－９の発現は、アポトーシスに誘導し得、かつ経口的に利用可能なリガンドであるラパマイシンによって制御される細胞安全スイッチの基礎として働き得る。重要なことには、リミズシドは、ＦＫＢＰ１２結合部位上にかさ高い改変を含むので、この二量体化剤は、野生型ＦＫＢＰ１２に結合できない。
ＦＲＢ．ＦＫＢＰＶ．ΔＣ９スイッチは、ＦＫＢＰドメインをＦＫＢＰＶへと変異させることによって、リミズシドまたはラパマイシンのいずれかでカスパーゼ－９を活性化する選択肢を提供する。活性化薬物の選択に関するこの柔軟性は、臨床医がその薬物を、その特異的な薬理学的特性に基づいて投与するために選択し得る臨床実践場面では、重要であり得る。さらに、このスイッチは、エフェクターが単一分子内に含まれるリミズシドとラパマイシンの薬物活性化動態間の直接比較を可能にする分子を提供する。
（患者に投与するための製剤および経路）
臨床適用が企図される場合、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、トランスフェクトまたは形質導入された細胞）を、意図される用途にとって適切な形態で調製する必要があり得る。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴い得る。
臨床適用が企図される場合、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、トランスフェクトまたは形質導入された細胞）を、意図される用途にとって適切な形態で調製する必要があり得る。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴い得る。
多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３（ＩＮＮリミズシド）などは、例えば、約０．１～１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．１～５ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．２～４ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３～３ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３～２ｍｇ／ｋｇ被験体体重または約０．３～１ｍｇ／ｋｇ被験体体重、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重の用量で送達され得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、１用量あたり０．４ｍｇ／ｋｇ、例えば、５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。リガンドを、例えば、バイアル１本あたり約０．２５ｍｌ～約１０ｍｌ、例えば、約０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０ｍｌ、例えば、約２ｍｌの体積で含むバイアルまたは他の容器が提供され得る。
送達ベクターを安定にするためおよび標的細胞による取り込みを可能にするために適切な塩および緩衝剤を使用することが一般に望ましい場合がある。緩衝剤は、組換え細胞が患者に導入されるときにも使用され得る。水性組成物は、薬学的に許容され得るキャリアまたは水性媒質に溶解されたまたは分散された、細胞に対して有効量のベクターを含む。そのような組成物は、接種材料とも称される。薬学的に許容され得るキャリアは、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、公知である。任意の従来の媒質または作用物質が、ベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。
活性な組成物は、従来の医薬品を含み得る。これらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の通常の経路を介し得る。これには、例えば、経口、経鼻、頬側、直腸、膣または局所的が含まれる。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射による投与であり得る。そのような組成物は、通常、本明細書中で論じられる薬学的に許容され得る組成物として投与され得る。
注射可能な使用に適した薬学的な形態としては、滅菌された水溶液または分散液、および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌された粉末が挙げられる。すべての場合において、その形態は、滅菌されており、容易に注射できる程度に流動性である。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合、必要とされる粒径を維持すること、および界面活性物質を使用することによって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。ある特定の例では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムが、含められ得る。注射可能な組成物の持続性の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において使用することによってもたらされ得る。
経口投与の場合、組成物は、賦形剤とともに組み込まれ得、摂取不可能なうがい薬および歯磨剤の形態で使用され得る。必要とされる量で活性成分をホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な溶媒に組み込んでいるうがい薬が、調製され得る。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む殺菌洗浄液に組み込まれ得る。活性成分は、例えば、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含む、歯磨剤にも分散され得る。活性成分は、例えば、水、結合剤、研磨剤、香味料、起泡剤および湿潤剤を含み得るペースト歯磨剤に治療有効量で加えられ得る。
組成物は、中性または塩の形態で製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩としては、例えば、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸など、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄など、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基からも得ることができる。
製剤化されると、溶液は、投与製剤（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に適合した様式で、および治療的に有効であるような量で、投与され得る。それらの製剤は、種々の剤形（例えば、注射可能な液剤、薬物放出カプセル剤など）で容易に投与される。例えば、水性液剤での非経口投与の場合、その液剤は、必要であれば適切に緩衝され得、最初に、液体希釈剤が、十分な食塩水またはグルコースで等張性にされ得る。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。この文脈では、滅菌された水性媒質が使用され得る。例えば、１投与量が、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、１０００ｍｌの皮下注入液に加えられ得るか、または提案される注入部位に注射され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１０３５－１０３８および１５７０－１５８０頁を参照のこと）。処置されている被験体の状態に応じて、投与量のいくつかのバリエーションが必然的に生じる。いずれにしても、投与に関与する者が、個々の被験体に対する適切な用量を決定し得る。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準が要求するような、無菌性、発熱性ならびに一般的な安全性および純度の基準を満たし得る。
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１０３５－１０３８および１５７０－１５８０頁を参照のこと）。処置されている被験体の状態に応じて、投与量のいくつかのバリエーションが必然的に生じる。いずれにしても、投与に関与する者が、個々の被験体に対する適切な用量を決定し得る。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準が要求するような、無菌性、発熱性ならびに一般的な安全性および純度の基準を満たし得る。
以下で示される実施例は、ある種の実施形態を例証し、本技術を限定しない。
ドナー細胞を選択的に除去するための機構を、細胞治療のための安全スイッチとして研究してきたが、合併症があった。今日までの安全スイッチ遺伝子でのいくつかの経験は、Ｔリンパ球におけるものであった。なぜならこれら細胞での免疫療法は、ウイルス感染症および悪性腫瘍の処置として有効であると判明したからである（Ｗａｌｔｅｒ， Ｅ．Ａ．ら， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． １９９５， ３３３：１０３８－４４； Ｒｏｏｎｅｙ， Ｃ．Ｍ．ら， Ｂｌｏｏｄ． １９９８， ９２：１５４９－５５； Ｄｕｄｌｅｙ， Ｍ．Ｅ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２， ２９８：８５０－５４；
Ｍａｒｊｉｔ， Ｗ．Ａ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ２００３， １００：２７４２－４７）。単純ヘルペスウイルスＩ由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）遺伝子を、造血幹細胞移植後の再発性悪性腫瘍およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）リンパ増殖を処置するために、ドナーＴ細胞注入におけるインビボ自殺スイッチとして使用されてきた（Ｂｏｎｉｎｉ Ｃら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９７， ２７６：１７１９－１７２４； Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎ Ｐら， Ｂｌｏｏｄ． ２００１， ９７：６３－７２）。しかし、移植片対宿主病を引き起こすＴ細胞の破壊は不完全であり、ＨＳＶ－ＴＫを活性化するためのプロドラッグとしてのガンシクロビル（またはアナログ）の使用は、サイトメガロウイルス感染症のための抗ウイルス薬としてのガンシクロビルの投与を排除する。この作用機構はまた、細胞分裂に依拠してＤＮＡ合成の干渉を要し、その結果、細胞殺滅は、数日間にわたって長引かされ得、不完全であり得、臨床上の利益に長い遅れを生じ得る（Ｃｉｃｅｒｉ， Ｆ．ら， Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ． ２００９， ２６２：１０１９－２４）。さらに、ＨＳＶ－ＴＫ誘導免疫応答は、免疫抑制されたヒト免疫不全ウイルスおよび骨髄移植患者においてすら、ＨＳＶ－ＴＫ形質導入細胞の排除を生じ、持続性、および従ってその注入されたＴ細胞の有効性を損なった。ＨＳＶ－ＴＫはまたウイルス由来であり、従って、潜在的に免疫原性である（Ｂｏｎｉｎｉ Ｃら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９７， ２７６：１７１９－１７２４； Ｒｉｄｄｅｌｌ ＳＲら， Ｎａｔ Ｍｅｄ． １９９６， ２：２１６－ ２３）。Ｅ ｃｏｌｉ由来シトシンデアミナーゼ遺伝子はまた、臨床上は使用されてきた（Ｆｒｅｙｔａｇ ＳＯら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００２， ６２：４９６８－４９７６）が、異種抗原としてそれは免疫原性であり得、従って、長期間の持続性を要するＴ細胞ベースの治療とは不適合であり得る。トランスジェニックヒトＣＤ２０は、モノクローナルキメラ抗ＣＤ２０抗体によって活性化され得、非免疫原性安全システムとして提唱されている（Ｉｎｔｒｏｎａ Ｍら， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０００， １１： ６１１－６２０）。
Ｍａｒｊｉｔ， Ｗ．Ａ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ２００３， １００：２７４２－４７）。単純ヘルペスウイルスＩ由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）遺伝子を、造血幹細胞移植後の再発性悪性腫瘍およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）リンパ増殖を処置するために、ドナーＴ細胞注入におけるインビボ自殺スイッチとして使用されてきた（Ｂｏｎｉｎｉ Ｃら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９７， ２７６：１７１９－１７２４； Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎ Ｐら， Ｂｌｏｏｄ． ２００１， ９７：６３－７２）。しかし、移植片対宿主病を引き起こすＴ細胞の破壊は不完全であり、ＨＳＶ－ＴＫを活性化するためのプロドラッグとしてのガンシクロビル（またはアナログ）の使用は、サイトメガロウイルス感染症のための抗ウイルス薬としてのガンシクロビルの投与を排除する。この作用機構はまた、細胞分裂に依拠してＤＮＡ合成の干渉を要し、その結果、細胞殺滅は、数日間にわたって長引かされ得、不完全であり得、臨床上の利益に長い遅れを生じ得る（Ｃｉｃｅｒｉ， Ｆ．ら， Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ． ２００９， ２６２：１０１９－２４）。さらに、ＨＳＶ－ＴＫ誘導免疫応答は、免疫抑制されたヒト免疫不全ウイルスおよび骨髄移植患者においてすら、ＨＳＶ－ＴＫ形質導入細胞の排除を生じ、持続性、および従ってその注入されたＴ細胞の有効性を損なった。ＨＳＶ－ＴＫはまたウイルス由来であり、従って、潜在的に免疫原性である（Ｂｏｎｉｎｉ Ｃら， Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９７， ２７６：１７１９－１７２４； Ｒｉｄｄｅｌｌ ＳＲら， Ｎａｔ Ｍｅｄ． １９９６， ２：２１６－ ２３）。Ｅ ｃｏｌｉ由来シトシンデアミナーゼ遺伝子はまた、臨床上は使用されてきた（Ｆｒｅｙｔａｇ ＳＯら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００２， ６２：４９６８－４９７６）が、異種抗原としてそれは免疫原性であり得、従って、長期間の持続性を要するＴ細胞ベースの治療とは不適合であり得る。トランスジェニックヒトＣＤ２０は、モノクローナルキメラ抗ＣＤ２０抗体によって活性化され得、非免疫原性安全システムとして提唱されている（Ｉｎｔｒｏｎａ Ｍら， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０００， １１： ６１１－６２０）。
以下の節は、カスパーゼ－９キメラタンパク質を使用して、細胞治療のために使用される細胞において安全スイッチを提供するための方法の例を提供する。
（実施例１：カスパーゼ－９自殺スイッチ発現ベクターの構築および評価）
（ベクター構築および発現の確認）
ヒトＴ細胞において安定してかつ効率的に発現され得る安全スイッチは、本明細書で示される。上記システムは、改変された遺伝子を発現する形質導入されたＴ細胞の選択的排除を引き起こすことができる小分子二量体化薬物と相互作用するように改変された潜在的に低い免疫原性を有するヒト遺伝子生成物を含む。さらに、上記誘導性カスパーゼ－９は、抗アポトーシス分子を過剰発現するＴ細胞において機能を維持する。
（ベクター構築および発現の確認）
ヒトＴ細胞において安定してかつ効率的に発現され得る安全スイッチは、本明細書で示される。上記システムは、改変された遺伝子を発現する形質導入されたＴ細胞の選択的排除を引き起こすことができる小分子二量体化薬物と相互作用するように改変された潜在的に低い免疫原性を有するヒト遺伝子生成物を含む。さらに、上記誘導性カスパーゼ－９は、抗アポトーシス分子を過剰発現するＴ細胞において機能を維持する。
ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６などの）に融合された改変されたヒトカスパーゼ－９活性を含む、治療剤としての使用に適した発現ベクターを構築した。このカスパーゼ－９／ＦＫ５０６ハイブリッド活性は、小分子医薬を使用して二量体化され得る。カスパーゼ－９活性の全長、短縮型、および改変されたバージョンを、リガンド結合ドメイン、または多量体化する（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｉｎｇ）領域に融合
し、蛍光マーカーＧＦＰの発現も可能にするレトロウイルスベクターＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＲＰへと挿入した。図１Ａは、アポトーシスの誘導のための自殺スイッチとして構築および評価される全長、短縮型および改変されたカスパーゼ－９発現ベクターを図示する。
し、蛍光マーカーＧＦＰの発現も可能にするレトロウイルスベクターＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＲＰへと挿入した。図１Ａは、アポトーシスの誘導のための自殺スイッチとして構築および評価される全長、短縮型および改変されたカスパーゼ－９発現ベクターを図示する。
全長誘導性カスパーゼ－９分子（Ｆ’－Ｆ－Ｃ－Ｃａｓｐ９）は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーで、カスパーゼ分子の小および大サブユニットへと連結される２個、３個、またはこれより多くのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ－例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６バリアント）を含む（図１Ａを参照のこと）。全長誘導性カスパーゼ－９（Ｆ’Ｆ－Ｃ－Ｃａｓｐ９．Ｉ．ＧＦＰ）は、全長カスパーゼ－９を有し、Ｆ３６Ｖ変異を含む２個の１２ｋＤａヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２； ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２ ８１８）に連結されたカスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ； ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ００１ ２２９）をも含む（図１Ａ）。ＦＫＢＰ（Ｆ’）のうちの１種もしくは複数種のアミノ酸配列は、レトロウイルスにおいて発現される場合、相同組換えを防止するために、コドンゆらぎにした（ｃｏｄｏｎ－ｗｏｂｂｌｅｄ）（例えば、各アミノ酸コドンの３番目のヌクレオチドを、本来コードされたアミノ酸を維持するサイレント変異によって変化させた）。Ｆ’Ｆ－Ｃ－Ｃａｓｐ９Ｃ３Ｓは、その活性部位を破壊する２８７位でのシステインからセリンへの変異を含む。構築物Ｆ’Ｆ－Ｃａｓｐ９、Ｆ－Ｃ－Ｃａｓｐ９、およびＦ’－Ｃａｓｐ９において、カスパーゼ活性化ドメイン（ＣＡＲＤ）、１個のＦＫＢＰ、またはその両方のいずれかを、それぞれ欠失させた。全ての構築物を、ＥｃｏＲＩ－ＸｈｏＩフラグメントとしてＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰへとクローニングした。
２９３Ｔ細胞を、これら構築物の各々でトランスフェクトし、形質導入の４８時間後、そのマーカー遺伝子ＧＦＰの発現を、フローサイトメトリーによって分析した。さらに、トランスフェクションの２４時間後、２９３Ｔ細胞を、１００ｎＭ ＣＩＤとともに一晩インキュベートし、その後、アポトーシスマーカーアネキシンＶで染色した。４回の別個の実験からの、二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）への曝露前および後の導入遺伝子発現レベル（平均ＧＦＰ）の平均および標準偏差ならびにアポトーシス細胞の数（ＧＦＰ～細胞内の％アネキシンＶ）を、図１Ａ中の表の第２列～第５列において示す。ＧＦＰ発現のレベルおよびアネキシンＶに関する染色に加えて、全長、短縮型および改変されたカスパーゼ－９の発現された遺伝子生成物をまた、カスパーゼ－９遺伝子が発現されて、その発現された生成物が予測されたサイズであったことを確認するためにウェスタンブロットによって分析した。ウェスタンブロットの結果を、図１Ｂに示す。
トランスフェクトした２９３Ｔ細胞における予測されるサイズの誘導性カスパーゼ－９構築物とマーカー遺伝子ＧＦＰとの共発現を、全長および短縮型両方のカスパーゼ分子に存在するアミノ酸残基２９９～３１８に特異的なカスパーゼ－９抗体、ならびにＧＦＰ特異的抗体を使用して、ウェスタンブロットによって実証した。ウェスタンブロットを、本明細書で示されるとおりに行った。
トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、溶解緩衝液（アプロチニン、ロイペプチン、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ， Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を０．５％で含む５０％ Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙ、１０％ ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、４％ β－メルカプトエタノール、１０％ グリセロール、１２％ 水、４％ ブロモフェノールブルー）中で再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。３０分間遠心分離した後、上清を採取した；Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）と１：２で混合し、煮沸し、１０％ ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルに負荷した。その膜を、ウサギ抗カスパーゼ－９（アミノ酸残基２９９～３１８）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ； Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ， Ｇｏｌｄｅｎ， ＣＯ； １：５００希釈）でおよびマウス抗ＧＦＰ ＩｇＧ（Ｃｏｖａｎｃｅ， Ｂｅｒｋｅｌｅｙ， ＣＡ； １：２５，０００希釈）でプローブした。次いで、ブロットを、適切なペルオキシダーゼ結合二次抗体に曝し、タンパク質発現を、増強化学発光（ＥＣＬ； Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）で検出した。次いで、上記膜を小片にし、ヤギポリクローナル抗アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； １：５００希釈）で再プローブして、負荷の品質をチェックした。
さらにより小さなサイズのバンド（図１Ｂに見られる）は、分解生成物を表すようである。Ｆ’Ｆ－Ｃ－Ｃａｓｐ９およびＦ’Ｆ－Ｃａｓｐ９構築物の分解生成物は、これらの構築物のより低い発現レベルに起因して、それらの基底活性の結果として検出されない可能性がある。各サンプルの等しいローディングを、ウェスタンブロットの各レーンの下に示されるアクチンの実質的に等しい量によって確認したところ、タンパク質の実質的に類似の量が各レーンにおいて負荷されたことが示された。
改変された細胞において発現され得るキメラポリペプチドの例は、本明細書で提供される。この例では、単一のポリペプチドが、核酸ベクターによってコードされる。誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドは、ペプチド結合のスキッピングに起因して、翻訳中にＣＡＲポリペプチドから分離される（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ， ＭＬ ２００１， Ｊ． Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ． ８２：１０１３－２５）。
Ｖｉｒｏｌ． ８２：１０１３－２５）。
（カスパーゼ－９自殺スイッチ発現構築物の評価）
（細胞株）
（細胞株）
Ｂ ９５－８ ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株（ＬＣＬ）、Ｊｕｒｋａｔ、およびＭＴ－２細胞（Ｄｒ Ｓ． Ｍａｒｒｉｏｔｔ（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ）による贈呈）を、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ；
Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）中で培養した。ポリクローナルＥＢＶ特異的Ｔ細胞株を、４５％ ＲＰＭＩ／４５％ Ｃｌｉｃｋｓ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｓａｎｔａ Ａｎａ， ＣＡ）／１０％ ＦＢＳ中で培養し、以前報告されたように生成した。簡潔には、末梢血単核細胞（２４ウェルプレートのウェルあたり２×１０６個）を、レスポンダー－対－刺激物質（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）（Ｒ／Ｓ）比４０：１において、４０００ラドで照射した自家ＬＣＬで刺激した。９～１２日後、生細胞を、Ｒ／Ｓ比４：１で、照射したＬＣＬで再刺激した。その後、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を、４０Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬ 組換えヒトインターロイキン－２（ｒｈＩＬ－２； Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ； Ｃｈｉｒｏｎ，
Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＣＡ）の存在下で、ＬＣＬで毎週再刺激することによって拡大した。
Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）中で培養した。ポリクローナルＥＢＶ特異的Ｔ細胞株を、４５％ ＲＰＭＩ／４５％ Ｃｌｉｃｋｓ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｓａｎｔａ Ａｎａ， ＣＡ）／１０％ ＦＢＳ中で培養し、以前報告されたように生成した。簡潔には、末梢血単核細胞（２４ウェルプレートのウェルあたり２×１０６個）を、レスポンダー－対－刺激物質（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）（Ｒ／Ｓ）比４０：１において、４０００ラドで照射した自家ＬＣＬで刺激した。９～１２日後、生細胞を、Ｒ／Ｓ比４：１で、照射したＬＣＬで再刺激した。その後、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を、４０Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬ 組換えヒトインターロイキン－２（ｒｈＩＬ－２； Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ； Ｃｈｉｒｏｎ，
Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＣＡ）の存在下で、ＬＣＬで毎週再刺激することによって拡大した。
（レトロウイルス形質導入）
レトロウイルスの一過性の生成のために、２９３Ｔ細胞を、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を使用して、ｇａｇ－ｐｏｌおよびＲＤ １１４エンベロープをコードするプラスミドとともにｉＣａｓｐ９／ｉＦａｓ構築物でトランスフェクトした。ウイルスを、トランスフェクションの４８～７２時間後に採取し、急速凍結し、使用するまで－８０℃で貯蔵した。安定なＦＬＹＲＤ
１８由来のレトロウイルスプロデューサー株を、ＶＳＶ－Ｇ偽型一過性レトロウイルス上清での多重形質導入によって生成した。最高の導入遺伝子発現を有するＦＬＹＲＤ１８細胞を、単一細胞ソートし、最高のウイルス力価を生じたクローンを拡大し、リンパ球を形質導入するためのウイルスを生成するために使用した。このクローンの導入遺伝子発現、機能、およびレトロウイルス力価を、８週間超にわたる連続培養の間に維持した。ヒトリンパ球の形質導入のために、非組織培養処理した２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を、組換えフィブロネクチンフラグメント（ＦＮ ＣＨ－２９６；レトロネクチン； Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ， Ｏｔｓｕ， Ｊａｐａｎ； ＰＢＳ中４μｇ／ｍＬ、４℃で一晩）でコーティングし、３７℃において３０分間にわたって、０．５ｍＬ レトロウイルス／ウェルで２回インキュベートした。その後、３×１０５～５×１０５ Ｔ細胞／ウェルを、１ｍＬ ウイルス／ウェルを使用して、１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２の存在下で４８～７２時間にわたって形質導入した。形質導入効率を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で、共発現されたマーカー遺伝子緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現の分析によって決定した。機能研究のために、形質導入したＣＴＬを、示されるようにＭｏＦｌｏサイトメーター（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ， Ｆｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ， ＣＯ）を使用して、選択しないか、または低い、中間、もしくは高いＧＦＰ発現を有する集団へと分離するかのいずれかであった。
レトロウイルスの一過性の生成のために、２９３Ｔ細胞を、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を使用して、ｇａｇ－ｐｏｌおよびＲＤ １１４エンベロープをコードするプラスミドとともにｉＣａｓｐ９／ｉＦａｓ構築物でトランスフェクトした。ウイルスを、トランスフェクションの４８～７２時間後に採取し、急速凍結し、使用するまで－８０℃で貯蔵した。安定なＦＬＹＲＤ
１８由来のレトロウイルスプロデューサー株を、ＶＳＶ－Ｇ偽型一過性レトロウイルス上清での多重形質導入によって生成した。最高の導入遺伝子発現を有するＦＬＹＲＤ１８細胞を、単一細胞ソートし、最高のウイルス力価を生じたクローンを拡大し、リンパ球を形質導入するためのウイルスを生成するために使用した。このクローンの導入遺伝子発現、機能、およびレトロウイルス力価を、８週間超にわたる連続培養の間に維持した。ヒトリンパ球の形質導入のために、非組織培養処理した２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を、組換えフィブロネクチンフラグメント（ＦＮ ＣＨ－２９６；レトロネクチン； Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ， Ｏｔｓｕ， Ｊａｐａｎ； ＰＢＳ中４μｇ／ｍＬ、４℃で一晩）でコーティングし、３７℃において３０分間にわたって、０．５ｍＬ レトロウイルス／ウェルで２回インキュベートした。その後、３×１０５～５×１０５ Ｔ細胞／ウェルを、１ｍＬ ウイルス／ウェルを使用して、１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２の存在下で４８～７２時間にわたって形質導入した。形質導入効率を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で、共発現されたマーカー遺伝子緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現の分析によって決定した。機能研究のために、形質導入したＣＴＬを、示されるようにＭｏＦｌｏサイトメーター（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ， Ｆｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ， ＣＯ）を使用して、選択しないか、または低い、中間、もしくは高いＧＦＰ発現を有する集団へと分離するかのいずれかであった。
（アポトーシスの誘導および分析）
示された濃度のＣＩＤ（ＡＰ２０１８７； ＡＲＩＡＤ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞または形質導入したＣＴＬへと添加した。接着細胞および非接着細胞を採取し、アネキシン結合緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）で洗浄した。細胞を、製造業者の指示（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従って、アネキシンＶおよび７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）で１５分間染色した。染色後１時間以内に、細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してフローサイトメトリーによって分析した。
示された濃度のＣＩＤ（ＡＰ２０１８７； ＡＲＩＡＤ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞または形質導入したＣＴＬへと添加した。接着細胞および非接着細胞を採取し、アネキシン結合緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）で洗浄した。細胞を、製造業者の指示（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従って、アネキシンＶおよび７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）で１５分間染色した。染色後１時間以内に、細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してフローサイトメトリーによって分析した。
（細胞傷害アッセイ）
各ＣＴＬ株の細胞傷害活性を、以前に示されたように、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいて評価した。標的細胞は、自家ＬＣＬ、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ－ミスマッチＬＣＬおよびリン補カイン活性化キラー細胞感受性Ｔ細胞リンパ腫株ＨＳＢ－２を含んだ。完全培地または１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）中でインキュベートした標的細胞を、それぞれ、自発的および最大５１Ｃｒ放出を決定するために使用した。三連のウェルの特異的溶解の平均パーセンテージを、１００×（実験放出－自発的放出）／（最大放出－自発的放出）として計算した。
各ＣＴＬ株の細胞傷害活性を、以前に示されたように、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいて評価した。標的細胞は、自家ＬＣＬ、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ－ミスマッチＬＣＬおよびリン補カイン活性化キラー細胞感受性Ｔ細胞リンパ腫株ＨＳＢ－２を含んだ。完全培地または１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）中でインキュベートした標的細胞を、それぞれ、自発的および最大５１Ｃｒ放出を決定するために使用した。三連のウェルの特異的溶解の平均パーセンテージを、１００×（実験放出－自発的放出）／（最大放出－自発的放出）として計算した。
（表現型決定）
細胞表面表現型を、以下のモノクローナル抗体を使用して調査した：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＣＤ５６ならびにＴＣＲ－α／β（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）。ΔＮＧＦＲ－ｉＦａｓを、抗ＮＧＦＲ抗体（Ｃｈｒｏｍａｐｒｏｂｅ， Ａｐｔｏｓ， ＣＡ）を使用して検出した。適切なマッチしたアイソタイプコントロール（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、各実験において使用した。細胞を、ＦＡＣＳｓｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
細胞表面表現型を、以下のモノクローナル抗体を使用して調査した：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＣＤ５６ならびにＴＣＲ－α／β（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）。ΔＮＧＦＲ－ｉＦａｓを、抗ＮＧＦＲ抗体（Ｃｈｒｏｍａｐｒｏｂｅ， Ａｐｔｏｓ， ＣＡ）を使用して検出した。適切なマッチしたアイソタイプコントロール（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、各実験において使用した。細胞を、ＦＡＣＳｓｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
（サイトカイン生成の分析）
ＣＴＬ培養上清中のインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、および腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）の濃度を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリックビーズアッセイ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して測定し、培養上清中のＩＬ－１２の濃度を、製造業者の指示に従って、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ； Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）によって測定した。
ＣＴＬ培養上清中のインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、および腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）の濃度を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリックビーズアッセイ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して測定し、培養上清中のＩＬ－１２の濃度を、製造業者の指示に従って、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ； Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）によって測定した。
（インビボ実験）
非肥満糖尿病重症複合免疫不全症（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス（６～８週齢）を、照射し（２５０ラド）、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に再懸濁された１０×１０６～１５×１０６ ＬＣＬを右側腹部の皮下に注射した。２週間後、直径約０．５ｃｍの腫瘍を有するマウスに、非形質導入ＥＢＶ ＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９．Ｉ．ＧＦＰｈｉｇｈ形質導入ＥＢＶ ＣＴＬの１：１混合物（合計１５×１０６個）を尾静脈へと注射した。ＣＴＬ注入の４～６時間前および３日後に、マウスに、組換えｈＩＬ－２（２０００Ｕ； Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ； Ｃｈｉｒｏｎ）を腹腔内注射した。４日目に、上記マウスを、２群に無作為に分離した：１群は、ＣＩＤ（５０μｇ ＡＰ２０１８７、腹腔内）を受け、１群は、キャリアのみ（１６．７％ プロパンジオール、２２．５％ ＰＥＧ４００、および１．２５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、腹腔内）を受けた。７日目に、全てのマウスを殺滅した。腫瘍をホモジナイズし、抗ヒトＣＤ３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。ＦＡＣＳ分析によって、ゲーティングしたＣＤ３＋集団内のＧＦＰ＋細胞の数を、評価した。非形質導入ＣＴＬのみ（合計１５×１０６個）を受けたマウスのコントロール群の腫瘍を、ＣＤ３＋／ＧＦＰ＋ 細胞の分析において陰性コントロールとして使用した。
非肥満糖尿病重症複合免疫不全症（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス（６～８週齢）を、照射し（２５０ラド）、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に再懸濁された１０×１０６～１５×１０６ ＬＣＬを右側腹部の皮下に注射した。２週間後、直径約０．５ｃｍの腫瘍を有するマウスに、非形質導入ＥＢＶ ＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９．Ｉ．ＧＦＰｈｉｇｈ形質導入ＥＢＶ ＣＴＬの１：１混合物（合計１５×１０６個）を尾静脈へと注射した。ＣＴＬ注入の４～６時間前および３日後に、マウスに、組換えｈＩＬ－２（２０００Ｕ； Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ； Ｃｈｉｒｏｎ）を腹腔内注射した。４日目に、上記マウスを、２群に無作為に分離した：１群は、ＣＩＤ（５０μｇ ＡＰ２０１８７、腹腔内）を受け、１群は、キャリアのみ（１６．７％ プロパンジオール、２２．５％ ＰＥＧ４００、および１．２５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、腹腔内）を受けた。７日目に、全てのマウスを殺滅した。腫瘍をホモジナイズし、抗ヒトＣＤ３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。ＦＡＣＳ分析によって、ゲーティングしたＣＤ３＋集団内のＧＦＰ＋細胞の数を、評価した。非形質導入ＣＴＬのみ（合計１５×１０６個）を受けたマウスのコントロール群の腫瘍を、ＣＤ３＋／ＧＦＰ＋ 細胞の分析において陰性コントロールとして使用した。
（誘導性カスパーゼ－９の発現および機能の最適化）
カスパーゼ３、７、および９を、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞および形質導入ヒトＴ細胞の両方において、誘導性安全スイッチ分子としてのそれらの適切性についてスクリーニングした。誘導性カスパーゼ－９（ｉＣａｓｐ９）のみが、選択したＣＩＤ（例えば、二量体化の化学的誘導物質）に対する感受性を付与するために十分なレベルで発現された。最初の検査では、全長ｉＣａｓｐ９が、おそらく形質導入された細胞が導入遺伝子の基底活性によって排除されていることに起因して、Ｔ細胞において安定して高レベルで維持できないことが示された。ＣＡＲＤドメインは、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１（Ａｐａｆ－１）とのシトクロムＣおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）駆動の相互作用によって、カスパーゼ－９分子の生理学的な二量体化に関与する。二量体化および自殺スイッチの活性化を誘導するためにＣＩＤを使用することが原因で、ＣＡＲＤドメインの機能は、この状況では不必要であり、ＣＡＲＤドメインの除去を、基底活性を減少するための方法として調査した。カスパーゼ－９の活性化のために、多量体化よりむしろ二量体化のみが必要とされることを考慮すると、単一のＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメインをまた、活性化をもたらすための方法として調査した。
カスパーゼ３、７、および９を、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞および形質導入ヒトＴ細胞の両方において、誘導性安全スイッチ分子としてのそれらの適切性についてスクリーニングした。誘導性カスパーゼ－９（ｉＣａｓｐ９）のみが、選択したＣＩＤ（例えば、二量体化の化学的誘導物質）に対する感受性を付与するために十分なレベルで発現された。最初の検査では、全長ｉＣａｓｐ９が、おそらく形質導入された細胞が導入遺伝子の基底活性によって排除されていることに起因して、Ｔ細胞において安定して高レベルで維持できないことが示された。ＣＡＲＤドメインは、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１（Ａｐａｆ－１）とのシトクロムＣおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）駆動の相互作用によって、カスパーゼ－９分子の生理学的な二量体化に関与する。二量体化および自殺スイッチの活性化を誘導するためにＣＩＤを使用することが原因で、ＣＡＲＤドメインの機能は、この状況では不必要であり、ＣＡＲＤドメインの除去を、基底活性を減少するための方法として調査した。カスパーゼ－９の活性化のために、多量体化よりむしろ二量体化のみが必要とされることを考慮すると、単一のＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメインをまた、活性化をもたらすための方法として調査した。
カスパーゼ－９の得られる短縮型および／または改変された形態（例えば、ＣＡＲＤドメイン、または２個のＦＫＢＰドメインのうちの一方、または両方が除去される）の活性を比較した。破壊された活性化部位を有する構築物Ｆ’Ｆ－Ｃ－Ｃａｓｐ９Ｃ－＞Ｓは、非機能的コントロールを提供した（図１Ａを参照のこと）。全ての構築物を、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）が導入遺伝子発現を誘導し、増強ＧＦＰが内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の使用によって同じｍＲＮＡから共発現されるレトロウイルスベクターＭＳＣＶ２６ へとクローニングした。トランスフェクトした２９３Ｔ細胞において、予測されたサイズでの全ての誘導性カスパーゼ－９構築物の発現、ならびにＧＦＰの共発現は、ウェスタンブロットによって示された（図１Ｂを参照のこと）。タンパク質発現（ＧＦＰの平均蛍光によって予測し、ウェスタンブロットで可視化される）は、非機能的構築物Ｆ’Ｆ－Ｃ－Ｃａｓｐ９Ｃ－＞Ｓにおいて最高であり、全長構築物Ｆ’Ｆ－Ｃ－Ｃａｓｐ９において大きく減少した。ＣＡＲＤ（Ｆ’Ｆ－Ｃａｓｐ９）、１個のＦＫＢＰ（Ｆ－Ｃ－Ｃａｓｐ９）、または両方（Ｆ－Ｃａｓｐ９）の除去は、誘導性カスパーゼ－９およびＧＦＰの両方の次第により高い発現を生じ、対応してＣＩＤに対する感受性を高めた（図１Ａを参照のこと）。これらの結果に基づいて、Ｆ－Ｃａｓｐ９構築物（以降、ｉＣａｓｐ９Ｍといわれる）を、ヒトＴリンパ球におけるさらなる研究のために使用した。
（ヒトＴリンパ球におけるｉＣａｓｐ９Ｍの安定な発現）
自殺遺伝子発現の長期の安定性は、最も重要である。なぜなら自殺遺伝子は、遺伝子操作された細胞が存続する限りにおいて、発現されなければならないからである。Ｔ細胞形質導入に関しては、高力価ＲＤ１１４偽型ウイルスを生成するＦＬＹＲＤ１８由来レトロウイルスプロデューサークローンを、Ｔ細胞の形質導入を促進するために生成した。ＥＢＶ特異的ＣＴＬ株（ＥＢＶ－ＣＴＬ）におけるｉＣａｓｐ９Ｍ発現を評価した。なぜならＥＢＶ特異的ＣＴＬ株は、十分に特徴付けられた機能および特異性を有し、ＥＢＶ関連悪性腫瘍の防止および処置のためのインビボ治療として既に使用されつつあるからである。７０％より高いＥＢＶ－ＣＴＬの一貫した形質導入効率（５名の異なるドナーにおいて平均７５．３％；範囲、７１．４％～８３．０％）を、レトロウイルスでの単一の形質導入後に得た。ＥＢＶ－ＣＴＬにおけるｉＣａｓｐ９Ｍの発現は、導入遺伝子機能の選択または喪失なしに、形質導入後の少なくとも４週間にわたって安定であった。
自殺遺伝子発現の長期の安定性は、最も重要である。なぜなら自殺遺伝子は、遺伝子操作された細胞が存続する限りにおいて、発現されなければならないからである。Ｔ細胞形質導入に関しては、高力価ＲＤ１１４偽型ウイルスを生成するＦＬＹＲＤ１８由来レトロウイルスプロデューサークローンを、Ｔ細胞の形質導入を促進するために生成した。ＥＢＶ特異的ＣＴＬ株（ＥＢＶ－ＣＴＬ）におけるｉＣａｓｐ９Ｍ発現を評価した。なぜならＥＢＶ特異的ＣＴＬ株は、十分に特徴付けられた機能および特異性を有し、ＥＢＶ関連悪性腫瘍の防止および処置のためのインビボ治療として既に使用されつつあるからである。７０％より高いＥＢＶ－ＣＴＬの一貫した形質導入効率（５名の異なるドナーにおいて平均７５．３％；範囲、７１．４％～８３．０％）を、レトロウイルスでの単一の形質導入後に得た。ＥＢＶ－ＣＴＬにおけるｉＣａｓｐ９Ｍの発現は、導入遺伝子機能の選択または喪失なしに、形質導入後の少なくとも４週間にわたって安定であった。
（ｉＣａｓｐ９Ｍは、形質導入したＴ細胞特性を変化させない）
ｉＣａｓｐ９Ｍの発現がＴ細胞特性を変化させないことを確実にするために、非形質導入または非機能的ｉＣａｓｐ９Ｃ－＞Ｓ形質導入ＥＢＶ－ＣＴＬの表現型、抗原特異性、増殖潜在性、および機能を、ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入ＥＢＶ－ＣＴＬのものと比較した。４名の別個のドナーにおいて、形質導入したおよび非形質導入ＣＴＬは、等数のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ５６＋、およびＴＣＲα／β＋ 細胞からなった。同様に、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－２を含むサイトカインの生成は、ｉＣａｓｐ９Ｍ発現によって変化しなかった。ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入ＥＢＶ－ＣＴＬは、非形質導入ＣＴＬおよびコントロールの形質導入したＣＴＬに匹敵する自家ＬＣＬを特異的に溶解した。ｉＣａｓｐ９Ｍの発現は、指数関数的に増殖するＣＴＬの成長特性に影響を及ぼさず、重要なことには、抗原に対する独立性および増殖のためのＩＬ－２を保った。形質導入後２１日目に、自家ＬＣＬおよびＩＬ－２での通常の毎週の抗原性の刺激は、継続したかまたは中止した。抗原刺激の中止は、Ｔ細胞の一様の下降を生じた。
ｉＣａｓｐ９Ｍの発現がＴ細胞特性を変化させないことを確実にするために、非形質導入または非機能的ｉＣａｓｐ９Ｃ－＞Ｓ形質導入ＥＢＶ－ＣＴＬの表現型、抗原特異性、増殖潜在性、および機能を、ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入ＥＢＶ－ＣＴＬのものと比較した。４名の別個のドナーにおいて、形質導入したおよび非形質導入ＣＴＬは、等数のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ５６＋、およびＴＣＲα／β＋ 細胞からなった。同様に、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－２を含むサイトカインの生成は、ｉＣａｓｐ９Ｍ発現によって変化しなかった。ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入ＥＢＶ－ＣＴＬは、非形質導入ＣＴＬおよびコントロールの形質導入したＣＴＬに匹敵する自家ＬＣＬを特異的に溶解した。ｉＣａｓｐ９Ｍの発現は、指数関数的に増殖するＣＴＬの成長特性に影響を及ぼさず、重要なことには、抗原に対する独立性および増殖のためのＩＬ－２を保った。形質導入後２１日目に、自家ＬＣＬおよびＩＬ－２での通常の毎週の抗原性の刺激は、継続したかまたは中止した。抗原刺激の中止は、Ｔ細胞の一様の下降を生じた。
（インビトロでの高い導入遺伝子発現のために選択されたＴリンパ球のうちの９９％超の排除）
ＣＴＬにおいて誘導性ｉＣａｓｐ９Ｍ能力（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ）を、ＣＩＤの投与後のＧＦＰ発現細胞の喪失をモニターすることによって試験した；ＧＦＰ＋ 細胞の９１．３％（範囲、５名の異なるドナーにおいて８９．５％～９２．６％）を、単一の１０ｎＭ用量のＣＩＤ後に排除した。ＣＩＤへの曝露時間に拘わらず、同様の結果を得た（範囲、１時間継続）。全ての実験において、ＣＩＤ処置を生き残ったＣＴＬは、ＣＩＤ後のＧＦＰの平均蛍光強度において７０％（範囲、５５％～８２％）減少とともに、低い導入遺伝子発現を有した。生存しているＧＦＰ＋Ｔ細胞のさらなる排除は、抗原刺激、続いて第２の１０ｎＭ 用量のＣＩＤによって得られなかった。従って、上記非応答ＣＴＬは、ＣＩＤによる機能的活性化に関して、不十分なｉＣａｓｐ９Ｍを発現する可能性が最も高かった。低レベルの発現とＣＩＤに対するＣＴＬ非応答との間の相関関係を調査するために、ＣＴＬを、連結したマーカー遺伝子ＧＦＰの低、中、および高発現に関してソートし、同じドナーに由来する非形質導入ＣＴＬと１：１で混合して、ＣＩＤ誘導アポトーシスに応答する形質導入したＴ細胞の数の正確な定量を可能にした。
ＣＴＬにおいて誘導性ｉＣａｓｐ９Ｍ能力（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ）を、ＣＩＤの投与後のＧＦＰ発現細胞の喪失をモニターすることによって試験した；ＧＦＰ＋ 細胞の９１．３％（範囲、５名の異なるドナーにおいて８９．５％～９２．６％）を、単一の１０ｎＭ用量のＣＩＤ後に排除した。ＣＩＤへの曝露時間に拘わらず、同様の結果を得た（範囲、１時間継続）。全ての実験において、ＣＩＤ処置を生き残ったＣＴＬは、ＣＩＤ後のＧＦＰの平均蛍光強度において７０％（範囲、５５％～８２％）減少とともに、低い導入遺伝子発現を有した。生存しているＧＦＰ＋Ｔ細胞のさらなる排除は、抗原刺激、続いて第２の１０ｎＭ 用量のＣＩＤによって得られなかった。従って、上記非応答ＣＴＬは、ＣＩＤによる機能的活性化に関して、不十分なｉＣａｓｐ９Ｍを発現する可能性が最も高かった。低レベルの発現とＣＩＤに対するＣＴＬ非応答との間の相関関係を調査するために、ＣＴＬを、連結したマーカー遺伝子ＧＦＰの低、中、および高発現に関してソートし、同じドナーに由来する非形質導入ＣＴＬと１：１で混合して、ＣＩＤ誘導アポトーシスに応答する形質導入したＴ細胞の数の正確な定量を可能にした。
排除された形質導入したＴ細胞の数は、ＧＦＰ導入遺伝子発現のレベルとともに増大した（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃを参照のこと）。導入遺伝子発現とｉＣａｓｐ９Ｍの機能との間の相関関係を決定するために、ｉＣａｓｐ９Ｍ ＩＲＥＳ．ＧＦＰ形質導入ＥＢＶ－ＣＴＬを、低ＧＦＰ発現（平均２１）、中ＧＦＰ発現（平均８０）および高ＧＦＰ発現（平均１８９）について選択した。選択したＴ細胞を１０ｎＭ ＣＩＤとともに一晩インキュベートし、その後、アネキシンＶおよび７－ＡＡＤで染色した。アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－およびアネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋ Ｔ－のパーセンテージが示される。選択されたＴ細胞を、非形質導入Ｔ細胞と１：１で混合し、抗原刺激後に１０ｎＭ ＣＩＤとともにインキュベートした。７日目の残余ＧＦＰ陽性Ｔ細胞のパーセンテージが示される。
ＧＦＰｈｉｇｈ選択細胞に関しては、１０ｎＭ ＣＩＤは、形質導入した細胞のうちの９９．１％（範囲、９８．７％～９９．４％）の枯渇をもたらした。抗原刺激の日に、Ｆ－Ｃａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ形質導入ＣＴＬを、処理しなかったか、または１０ｎＭ ＣＩＤで処理したかのいずれかであった。７日後に、ＣＩＤへの応答を、ＧＦＰに関するフローサイトメトリーによって測定した。形質導入したＴ細胞のパーセンテージを５０％に調整して、ＣＩＤ処理後の残余ＧＦＰ＋ 細胞の正確な測定を可能にした。選択していないＣＴＬ（上の行）およびＧＦＰｈｉｇｈ選択ＣＴＬ（下の行）におけるＣＩＤへの応答を比較した。残余ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示す。
ＧＦＰｈｉｇｈ選択細胞におけるアポトーシスの迅速な誘導は、ＣＩＤ投与の１４日以内に、細胞収縮およびフラグメント化などのアポトーシス特性によって示される。１０ｎＭ ＣＩＤとの一晩のインキュベーション後に、Ｆ－Ｃａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰｈｉｇｈ形質導入Ｔ細胞を、顕微的評価によって、細胞収縮およびフラグメント化などのアポトーシス特性を有した。高い発現について選択されたＴ細胞のうち、６４％（範囲、５９％～６９％）はアポトーシス（アネキシン－Ｖ＋＋／７－ＡＡＤ－）表現型を有し、３０％（範囲、２６％～３２％）は、壊死（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）表現型を有した。アポトーシスのマーカーで染色すると、Ｔ細胞のうちの６４％がアポトーシス表現型（アネキシンＶ＋、７－ＡＡＤ－、右下象限）を有し、３２％が壊死表現型（アネキシンＶ＋、７－ＡＡＤ＋、右上象限）を有することが示された。３回の別個の実験の代表例を示す。
対照的に、アポトーシスの誘導は、中間または低いＧＦＰ発現に関して選択したＴ細胞では有意に低かった（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃを参照のこと）。従って、臨床適用のために、高コピー数、高レベルの発現、または抗コピー数および高レベルの発現の両方の選択を可能にする選択マーカーを有する発現構築物のバージョンは、望ましいものであり得る。ＣＩＤ誘導アポトーシスを、汎カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ－ｆｍｋ（ＣＩＤを添加する前に１時間にわたって１００μＭ）によって阻害した。ＣＩＤの力価は、１ｎＭ ＣＩＤが最大欠失効果を得るために十分であることが示された。示される量のＣＩＤ（ＡＰ２０１８７）を使用する用量応答曲線は、ＣＩＤに対するＦ－Ｃａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰｈｉｇｈの感受性を示す。ＧＦＰ＋細胞の生存を、示される量のＣＩＤの投与後７日目に測定する。各点の平均および標準偏差を与える。別の二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）であるＡＰ１９０３を使用しても同様の結果を得た。上記誘導物質は、健常志願者に投与される場合、有害作用を実質的に有しないことが臨床的に示された。その用量応答は、形質導入後少なくとも４週間にわたって変化しないままであった。
（ｉＣａｓｐ９Ｍは抗アポトーシス分子を発現する悪性細胞において機能する）
カスパーゼ－９を、以前に示されたｉＦａｓおよびｉＦＡＤＤよりむしろ臨床使用のために誘導性アポトーシス促進分子として選択した。なぜならカスパーゼ－９は、アポトーシスシグナル伝達において比較的遅く作用し、従って、アポトーシス阻害剤による阻害に余り感受性でないと予測されるからである。従って、自殺機能は、抗アポトーシス分子を発現する悪性の形質転換されたＴ細胞株においてのみならず、記憶細胞の長期保存を確実にするために、上記プロセスの一部として上昇した抗アポトーシス分子を発現する通常のＴ細胞の亜集団においても保存されるべきである。この仮説をさらに調査するために、ｉＣａｓｐ９ＭおよびｉＦａｓの機能を、ＥＢＶ－ＣＴＬにおいてまず比較した。任意の潜在的ベクターベースの差異を排除するために、誘導性Ｆａｓはまた、ｉＣａｓｐ９のように、ＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰベクターにおいて発現された。これらの実験のために、ΔＮＧＦＲ．ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ形質導入ＣＴＬの両方を、ＧＦＰｈｉｇｈ発現についてソートし、非形質導入ＣＴＬと１：１比で混合して、等しい割合でかつ類似のレベルでｉＦａｓまたはｉＣａｓｐ９Ｍのいずれかを発現する細胞集団を得た。上記ＥＢＶ－ＣＴＬを、高いＧＦＰ発現についてソートし、示されるとおりに非形質導入ＣＴＬと１：１で混合した。ΔＮＧＦＲ＋／ＧＦＰ＋およびＧＦＰ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
カスパーゼ－９を、以前に示されたｉＦａｓおよびｉＦＡＤＤよりむしろ臨床使用のために誘導性アポトーシス促進分子として選択した。なぜならカスパーゼ－９は、アポトーシスシグナル伝達において比較的遅く作用し、従って、アポトーシス阻害剤による阻害に余り感受性でないと予測されるからである。従って、自殺機能は、抗アポトーシス分子を発現する悪性の形質転換されたＴ細胞株においてのみならず、記憶細胞の長期保存を確実にするために、上記プロセスの一部として上昇した抗アポトーシス分子を発現する通常のＴ細胞の亜集団においても保存されるべきである。この仮説をさらに調査するために、ｉＣａｓｐ９ＭおよびｉＦａｓの機能を、ＥＢＶ－ＣＴＬにおいてまず比較した。任意の潜在的ベクターベースの差異を排除するために、誘導性Ｆａｓはまた、ｉＣａｓｐ９のように、ＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰベクターにおいて発現された。これらの実験のために、ΔＮＧＦＲ．ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ形質導入ＣＴＬの両方を、ＧＦＰｈｉｇｈ発現についてソートし、非形質導入ＣＴＬと１：１比で混合して、等しい割合でかつ類似のレベルでｉＦａｓまたはｉＣａｓｐ９Ｍのいずれかを発現する細胞集団を得た。上記ＥＢＶ－ＣＴＬを、高いＧＦＰ発現についてソートし、示されるとおりに非形質導入ＣＴＬと１：１で混合した。ΔＮＧＦＲ＋／ＧＦＰ＋およびＧＦＰ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
１０ｎＭ ＣＩＤの投与後のＧＦＰ＋細胞の排除は、ｉＦａｓ形質導入ＣＴＬにおいてよりｉＣａｓｐ９Ｍにおいて、より迅速かつより効率的であった（ＣＩＤ後の７日目において、ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入細胞の９９．２％±０．１４％をｉＦａｓ形質導入細胞の８９．３％±４．９％と比較した；Ｐ＜０．０５）。ＬＣＬ刺激の日に、１０ｎＭ ＣＩＤを投与し、示される時点でＧＦＰを測定して、ＣＩＤへの応答を決定した。黒菱形は、ΔＮＧＦＲ－ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰについてのデータを示し；黒四角は、ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰについてのデータを示す。３回の実験の平均および標準偏差を示す。
ｃ－ＦＬＩＰおよびｂｃｌ－ｘＬ発現に起因する、ｉＣａｓｐ９ＭおよびｉＦａｓの機能もまた２種の悪性Ｔ細胞株：Ｊｕｒｋａｔ（アポトーシス感受性Ｔ細胞白血病株）およびＭＴ－２（アポトーシス耐性Ｔ細胞株）において比較した。Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＭＴ－２細胞を、類似の効率（Ｊｕｒｋａｔでは９２％ 対 ８４％、ＭＴ－２では７６％
対 ７０％）で、ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍで形質転換し、１０ｎＭ ＣＩＤの存在下で８時間培養した。アネキシンＶ染色は、ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍが等数のＪｕｒｋａｔ細胞においてアポトーシスを誘導した（それぞれ、５６．４％±１５．６％および５７．２％±１８．９％）が、ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化のみがＭＴ－２細胞のアポトーシスを生じた（ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍに関して、それぞれ１９．３％±８．４％および５７．９％±１１．９％）ことを示した（図５Ｃ参照）。
対 ７０％）で、ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍで形質転換し、１０ｎＭ ＣＩＤの存在下で８時間培養した。アネキシンＶ染色は、ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍが等数のＪｕｒｋａｔ細胞においてアポトーシスを誘導した（それぞれ、５６．４％±１５．６％および５７．２％±１８．９％）が、ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化のみがＭＴ－２細胞のアポトーシスを生じた（ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍに関して、それぞれ１９．３％±８．４％および５７．９％±１１．９％）ことを示した（図５Ｃ参照）。
ヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ（左）およびＭＴ－２（右）を、ΔＮＧＦＲ－ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰまたはｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰで形質導入した。Ｔ細胞の等しいパーセンテージを、自殺遺伝子の各々で形質導入した：Ｊｕｒｋａｔでは、ΔＮＧＦＲ－ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰに関して９２％ 対 ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰに関して８４％、およびＭＴ－２では、ΔＮＧＦＲ－ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰに関しては７６％ 対 ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰに関しては７０％。Ｔ細胞は、非処理であったかまたは１０ｎＭ ＣＩＤとともにインキュベートしたかのいずれかであった。ＣＩＤへの曝露の８時間後、アポトーシスを、アネキシンＶおよび７－ＡＡＤに関して染色することによって測定した。３回の実験の代表例を示す。ＰＥは、フィコエリトリンを示す。これら結果は、アポトーシス阻害分子を過剰発現するＴ細胞において、ｉＦａｓの機能がブロックされ得る一方で、ｉＣａｓｐ９Ｍがアポトーシスをなお効率的に誘導し得ることを示す。
（免疫調節性導入遺伝子を発現するＴ細胞のｉＣａｓｐ９Ｍ媒介性排除）
ｉＣａｓｐ９Ｍが活性な導入遺伝子生成物を発現するように遺伝子改変された細胞を効率的に破壊し得るかどうかを決定するために、ＩＬ－１２を安定して発現するＥＢＶ－ＣＴＬを排除するｉＣａｓｐ９Ｍの能力を測定した。ＩＬ－１２が、非形質導入ＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ形質導入ＣＴＬの上清中で検出不能であった一方で、ｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＩＬ－１２形質導入細胞の上清は、３２４ｐｇ／ｍＬ～７６２ｐｇ／ｍＬ ＩＬ－１２を含んだ。しかし、１０ｎＭ ＣＩＤの投与後に、上記上清中のＩＬ－１２は、検出不能なレベルに低下した（＜７．８ｐｇ／ｍＬ）。従って、高い導入遺伝子発現細胞に関する事前のソートなしですら、ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化は、ＩＬ－１２の生物学的に関連するレベルを生成する全てのＴ細胞を完全に排除するために十分である。ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ構築物中のマーカー遺伝子ＧＦＰを、ヒトＩＬ－１２のｐ４０およびｐ３５サブユニットをコードするｆｌｅｘｉ ＩＬ－１２によって置き換えた。ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ形質導入ＥＢＶ－ＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＩＬ－１２形質導入ＥＢＶ－ＣＴＬを、ＬＣＬで刺激し、次いで、未処置のままにするかまたは１０ｎＭ ＣＩＤに曝露した。第２の抗原性刺激の３日後に、培養上清中のＩＬ－１２のレベルは、ＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡによって測定した（このアッセイの検出限界は、７．８ｐｇ／ｍＬである）。三連のウェルの平均および標準偏差を、示す。２名の異なるドナーのＣＴＬでの２回の実験のうちの１回の結果を示す。
ｉＣａｓｐ９Ｍが活性な導入遺伝子生成物を発現するように遺伝子改変された細胞を効率的に破壊し得るかどうかを決定するために、ＩＬ－１２を安定して発現するＥＢＶ－ＣＴＬを排除するｉＣａｓｐ９Ｍの能力を測定した。ＩＬ－１２が、非形質導入ＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ形質導入ＣＴＬの上清中で検出不能であった一方で、ｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＩＬ－１２形質導入細胞の上清は、３２４ｐｇ／ｍＬ～７６２ｐｇ／ｍＬ ＩＬ－１２を含んだ。しかし、１０ｎＭ ＣＩＤの投与後に、上記上清中のＩＬ－１２は、検出不能なレベルに低下した（＜７．８ｐｇ／ｍＬ）。従って、高い導入遺伝子発現細胞に関する事前のソートなしですら、ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化は、ＩＬ－１２の生物学的に関連するレベルを生成する全てのＴ細胞を完全に排除するために十分である。ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ構築物中のマーカー遺伝子ＧＦＰを、ヒトＩＬ－１２のｐ４０およびｐ３５サブユニットをコードするｆｌｅｘｉ ＩＬ－１２によって置き換えた。ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ形質導入ＥＢＶ－ＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＩＬ－１２形質導入ＥＢＶ－ＣＴＬを、ＬＣＬで刺激し、次いで、未処置のままにするかまたは１０ｎＭ ＣＩＤに曝露した。第２の抗原性刺激の３日後に、培養上清中のＩＬ－１２のレベルは、ＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡによって測定した（このアッセイの検出限界は、７．８ｐｇ／ｍＬである）。三連のウェルの平均および標準偏差を、示す。２名の異なるドナーのＣＴＬでの２回の実験のうちの１回の結果を示す。
（インビボでの高い導入遺伝子発現について選択したＴ細胞のうちの９９％超の排除）
ｉＣａｓｐ９Ｍの機能をまた、インビボで形質導入されたＥＢＶ－ＣＴＬにおいて評価した。ＳＣＩＤマウス－ヒト異種移植モデルを、養子免疫療法のために使用した。自家ＬＣＬ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスへの、非形質導入ＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰｈｉｇｈ形質導入ＣＴＬの１：１混合物の静脈内注入後に、マウスを、単一用量のＣＩＤまたはキャリアのみのいずれかで処置した。ＣＩＤ／キャリア投与の３日後に、腫瘍を、ヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋ 細胞について分析した。ヒト抗ＣＤ３抗体を使用する上記注入生成物のうちの非形質導入構成成分の検出から、ＣＩＤを受けたマウスにおける尾静脈注入の成功を確認した。ＣＩＤで処置したマウスにおいて、キャリアのみで処置した注入したマウスと比較して、ヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋ Ｔ細胞の数が９９％超減少した。これは、インビボおよびインビトロで、ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入Ｔ細胞の等しく高い感受性を示す。
ｉＣａｓｐ９Ｍの機能をまた、インビボで形質導入されたＥＢＶ－ＣＴＬにおいて評価した。ＳＣＩＤマウス－ヒト異種移植モデルを、養子免疫療法のために使用した。自家ＬＣＬ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスへの、非形質導入ＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰｈｉｇｈ形質導入ＣＴＬの１：１混合物の静脈内注入後に、マウスを、単一用量のＣＩＤまたはキャリアのみのいずれかで処置した。ＣＩＤ／キャリア投与の３日後に、腫瘍を、ヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋ 細胞について分析した。ヒト抗ＣＤ３抗体を使用する上記注入生成物のうちの非形質導入構成成分の検出から、ＣＩＤを受けたマウスにおける尾静脈注入の成功を確認した。ＣＩＤで処置したマウスにおいて、キャリアのみで処置した注入したマウスと比較して、ヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋ Ｔ細胞の数が９９％超減少した。これは、インビボおよびインビトロで、ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入Ｔ細胞の等しく高い感受性を示す。
インビボでのｉＣａｓｐ９Ｍの機能をアッセイした。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを照射し、１０×１０６～１５×１０６ ＬＣＬを皮下注射した。１４日後、直径０．５ｃｍの腫瘍を有するマウスに、合計１５×１０６ ＥＢＶ－ＣＴＬを与えた（これら細胞のうちの５０％は非形質導入であり、５０％はｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰで形質導入され、高ＧＦＰ発現に関してソートした）。ＣＴＬ投与後の３日目に、マウスに、ＣＩＤ（５０μｇ
ＡＰ２０１８７；（黒菱形、ｎ＝６）またはキャリアのみ（黒四角、ｎ＝５）のいずれかを与え、６日目に、腫瘍中のヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋Ｔ細胞の存在を分析した。非形質導入ＣＴＬ（１５×１０６ ＣＴＬ；ｎ＝４）のみを与えたマウスのコントロール群の腫瘍から単離したヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、腫瘍内のＣＤ３＋／ＧＦＰ＋ Ｔ細胞の分析のための陰性コントロールとして使用した。
ＡＰ２０１８７；（黒菱形、ｎ＝６）またはキャリアのみ（黒四角、ｎ＝５）のいずれかを与え、６日目に、腫瘍中のヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋Ｔ細胞の存在を分析した。非形質導入ＣＴＬ（１５×１０６ ＣＴＬ；ｎ＝４）のみを与えたマウスのコントロール群の腫瘍から単離したヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、腫瘍内のＣＤ３＋／ＧＦＰ＋ Ｔ細胞の分析のための陰性コントロールとして使用した。
（考察）
いくつかの実施形態において、遺伝子改変されたＴ細胞をインビボで排除するために適した自殺遺伝子を発現する発現ベクターが、本明細書で示される。本明細書で示される自殺遺伝子発現ベクターは、細胞死、低い基底活性、高比活性、および内因性抗アポトーシス分子に対する最小の感受性を惹起するために十分高いレベルでの発現である、改変している遺伝子を有する全ての細胞において安定した共発現を含む、ある種非限定的な有利な特性を有する。本明細書で示されるのは、ある種の実施形態において、誘導性カスパーゼ－９、ｉＣａｓｐ９Ｍ（これは低い基底活性を有する）であり、ヒトＴ細胞において４週間超にわたって安定な発現を可能にする。小分子の二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）の単一の１０ｎＭ 用量は、インビトロおよびインビボの両方で、高い導入遺伝子発現について選択されたｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入細胞のうちの９９％超を殺滅するために十分である。さらに、Ｔｈ１サイトカインＩＬ－１２と共発現される場合、ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化は、高い導入遺伝子発現に関する選択なしですら、全ての検出可能なＩＬ－１２生成細胞を排除した。カスパーゼ－９は、大部分の抗アポトーシス分子の下流で作用し、従って、ＣＩＤへの高感受性は、ｂｃｌ－２ファミリーの抗アポトーシス分子の増大したレベルの存在に拘わらず保存される。従って、ｉＣａｓｐ９Ｍはまた、アポトーシスに比較的耐性である形質転換されたＴ細胞および記憶Ｔ細胞すらも破壊を誘導するために有用であると判明し得る。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変されたＴ細胞をインビボで排除するために適した自殺遺伝子を発現する発現ベクターが、本明細書で示される。本明細書で示される自殺遺伝子発現ベクターは、細胞死、低い基底活性、高比活性、および内因性抗アポトーシス分子に対する最小の感受性を惹起するために十分高いレベルでの発現である、改変している遺伝子を有する全ての細胞において安定した共発現を含む、ある種非限定的な有利な特性を有する。本明細書で示されるのは、ある種の実施形態において、誘導性カスパーゼ－９、ｉＣａｓｐ９Ｍ（これは低い基底活性を有する）であり、ヒトＴ細胞において４週間超にわたって安定な発現を可能にする。小分子の二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）の単一の１０ｎＭ 用量は、インビトロおよびインビボの両方で、高い導入遺伝子発現について選択されたｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入細胞のうちの９９％超を殺滅するために十分である。さらに、Ｔｈ１サイトカインＩＬ－１２と共発現される場合、ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化は、高い導入遺伝子発現に関する選択なしですら、全ての検出可能なＩＬ－１２生成細胞を排除した。カスパーゼ－９は、大部分の抗アポトーシス分子の下流で作用し、従って、ＣＩＤへの高感受性は、ｂｃｌ－２ファミリーの抗アポトーシス分子の増大したレベルの存在に拘わらず保存される。従って、ｉＣａｓｐ９Ｍはまた、アポトーシスに比較的耐性である形質転換されたＴ細胞および記憶Ｔ細胞すらも破壊を誘導するために有用であると判明し得る。
他のカスパーゼ分子とは異なり、タンパク質分解は、カスパーゼ－９の活性化に十分でないようである。結晶学データおよび機能データは、不活性カスパーゼ－９単量体の二量体化は、コンホメーション変化誘導活性化をもたらすことを示す。プロカスパーゼ－９の濃度は、生理学的状況において、二量体化のために必要とされる閾値を十分下回る約２０ｎＭの範囲にある。
理論によって限定されることなく、二量体化へのエネルギー的障壁は、シトクロムＣおよびＡＴＰによって駆動される、Ａｐａｆ－１のＣＡＲＤドメインとカスパーゼ－９との間の同種親和性相互作用（ｈｏｍｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）によって克服され得ると考えられる。２個のＦＫＢＰに結合されるカスパーゼ－９の過剰発現は、自発的二量体化が起こることを可能にし得、最初の全長カスパーゼ－９構築物の観察された毒性を説明し得る。毒性の減少および遺伝子発現の増大が１個のＦＫＢＰの除去後に観察された、それは、自発的二量体化と関連する毒性の減少に起因する可能性が最も高い。多量体化はしばしば、表面死レセプターの活性化に関与する一方で、カスパーゼ－９の二量体化は、活性化を媒介するために十分であるはずである。本明細書で示されるデータは、単一のＦＫＢＰを有するｉＣａｓｐ９構築物が、２個のＦＫＢＰを有するものと同程度に効率的に機能することを示す。ＣＡＲＤドメインの除去によるＣＩＤへの増大した感受性は、ＣＩＤ結合の際に、二量体化のエネルギー的閾値の減少を表し得る。
ウイルス由来または細菌由来の致死遺伝子（例えば、ＨＳＶ－ＴＫおよびシトシンデアミナーゼ）の持続性および機能は、ウイルス由来または細菌由来の致死遺伝子を発現する細胞に対する望ましくない免疫応答によって損なわれ得る。ｉＣａｓｐ９Ｍの構成成分を形成するＦＫＢＰおよびアポトーシス促進分子は、ヒト由来分子であり、従って、免疫応答を誘導する可能性は低い。ＦＫＢＰとカスパーゼ－９との間のリンカーおよびＦＫＢＰドメイン中の単一の点変異は、新規アミノ酸配列をもたらすが、その配列は、ｉＦａｓ形質導入Ｔ細胞のマカクレシピエントによって免疫学的に認識されなかった。さらに、ｉＣａｓｐ９Ｍの構成成分はヒト由来分子であるので、接合部配列に特異的な記憶Ｔ細胞は、ウイルス由来タンパク質（例えば、ＨＳＶ－ＴＫ）とは異なり、レシピエントに存在するべきではなく、それによって、ｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入Ｔ細胞の免疫応答媒介性排除のリスクを減少させる。
誘導性ＦａｓまたはＦａｓ関連死ドメインタンパク質（ＦＡＤＤ）の死エフェクタードメイン（ＤＥＤ）を使用する以前の研究は、形質導入された細胞のうちのおよそ１０％が、破壊性遺伝子の活性化に非応答性であることを示した。ここで示される実験において観察されるように、ＣＩＤへの非応答性の考えられる説明は、導入遺伝子の低い発現である。ＣＩＤ投与後に生き残った、本発明者らの研究におけるｉＣａｓｐ９Ｍ形質導入Ｔ細胞および他者による研究におけるｉＦａｓ形質導入Ｔ細胞は、低レベルの導入遺伝子発現を有した。認められるレトロウイルス「位置効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔ）」を克服する試みにおいて、導入遺伝子の均質な発現の増大したレベルは、レトロウイルス組み込み体とニワトリβ－グロビンクロマチンインスレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）とを隣接させることによって達成された。このクロマチンインスレーターの付加は、形質導入された２９３Ｔ細胞における発現の均質さを劇的に増大させたが、形質導入された初代Ｔ細胞において有意な効果を有しなかった。高発現レベルを有するＴ細胞の選択は、二量体化剤への応答の変動性を最小限にした。高ＧＦＰ発現に関してソートされた形質導入されたＴ細胞のうちの９９％超は、単一の１０ｎＭ ＣＩＤ用量後に排除された。この実証は、高レベルの自殺遺伝子を発現する細胞が選択マーカーを使用して単離され得るという仮説を裏付ける。
非常に少数の耐性残余細胞は、毒性の再起を引き起こし得る。２ ｌｏｇまでの欠失効率は、この可能性を有意に減少させる。臨床使用のために、非免疫原性選択マーカー（例えば、短縮型ヒトＮＧＦＲ、ＣＤ２０、またはＣＤ３４（例えば、ＧＦＰの代わりに））との共発現は、高い導入遺伝子発現Ｔ細胞の選択を可能にする。自殺スイッチ（例えば、ｉＣＡＳＰ９Ｍ）および適切な選択マーカー（例えば、短縮型ヒトＮＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３４などおよびこれらの組み合わせ）の共発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断配列（例えば、２Ａ）を含む融合タンパク質の翻訳後修飾のいずれかを使用して得られ得る。対照的に、唯一の安全性の懸念が導入遺伝子媒介性毒性（例えば、人工Ｔ細胞レセプター、サイトカインなどまたはこれらの組み合わせ）である状況では、この選択工程は不必要であり得る。なぜならｉＣａｓｐ９Ｍと導入遺伝子発現との間の厳密な連鎖は、治療用導入遺伝子の生物学的に関連するレベルを発現する実質的に全ての細胞の排除を可能にするからである。これは、ｉＣａｓｐ９ＭとＩＬ－１２とを共発現することによって示された。ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化は、任意の測定可能なＩＬ－１２生成を実質的に排除した。導入遺伝子発現の成功および「自殺スイッチ」のその後の活性化は、導入遺伝子の機能および活性に依存し得る。
ＣＩＤへの非応答性の別の考えられる説明は、高レベルのアポトーシス阻害剤がＣＩＤ媒介性アポトーシスを減弱し得ることである。アポトーシス阻害剤の例としては、ｃ－ＦＬＩＰ、ｂｃｌ－２ファミリーメンバーおよびアポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）が挙げられ、これらは、通常、アポトーシスと生存との間のバランスを制御する。例えば、ｃ－ＦＬＩＰおよびｂｃｌ－２のアップレギュレーションは、記憶プールを確立するように運命付けられたＴ細胞の亜集団を、コグネイト標的または抗原提示細胞に応じて活性化誘導細胞死に対して耐性にする。いくつかのＴリンパ系腫瘍では、アポトーシスと生存との間の生理学的バランスは、細胞生存の利益となるように破壊される。自殺遺伝子は、記憶細胞および悪性に形質転換された細胞を含む実質的に全ての形質導入されたＴ細胞を欠失させるはずである。従って、その選択された誘導性自殺遺伝子は、抗アポトーシス分子の増大したレベルの存在下でその活性の実質的に全てではないにしても有意な部分を保持するはずである。
アポトーシスシグナル伝達経路におけるｉＦａｓ（またはｉＦＡＤＤ）の頂端位置は、このｉＦａｓ（またはｉＦＡＤＤ）をアポトーシスの阻害剤に対して特に脆弱なままにさせ得、従って、これら分子をアポトーシス安全スイッチの重要な構成成分であることに、あまりよく適さないものにし得る。カスパーゼ３または７は、終末エフェクター（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）分子として十分に適しているようである；しかし、初代ヒトＴ細胞において機能レベルで発現され得ない。従って、カスパーゼ－９はアポトーシス経路において十分遅く機能し、ｃ－ＦＬＩＰおよび抗アポトーシスｂｃｌ－２ファミリーメンバーの阻害効果を回避するので、カスパーゼ－９を自殺遺伝子として選択した。そしてカスパーゼ－９をまた、機能レベルで安定して発現できた。アポトーシスのＸ連鎖阻害剤（ＸＩＡＰ）は、理論では、自発的カスパーゼ－９活性化を減少できたが、ＦＫＢＰＶ３６に対するＡＰ２０１８７（またはＡＰ１９０３）の高親和性は、この非共有結合的に会合したＸＩＡＰを置き換え得る。ｉＦａｓとは対照的に、ｉＣａｓｐ９Ｍは、ｂｃｌ－ｘＬを含む抗アポトーシス分子を過剰発現する形質転換されたＴ細胞株において機能的なままであった。
ヒトＴ細胞によってオンコレトロウイルスベクターからの発現に対して特異的にデザインされた誘導性安全スイッチが、本明細書で示される。ｉＣａｓｐ９Ｍは、最適な欠失効果に関する必要用量において安全であると判明した小さな、二量体化の化学的誘導物質であるＡＰ１９０３（またはアナログ）によって活性化され得、ガンシクロビルまたはリツキシマブとは異なり、インビボで他の生物学的効果を有しない。従って、養子移入のためのＴ細胞におけるこの自殺遺伝子の発現は、安全性を増大させ得、また、臨床適用の範囲を拡げ得る。
（実施例２）
（半合致（Ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ）幹細胞移植後の同種枯渇Ｔ細胞（Ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ）の安全性を改善するためのｉＣａｓｐ９自殺遺伝子の使用）
この例では、発現構築物を使用して、半合致幹細胞移植後に同種枯渇Ｔ細胞の安全性を改善するための発現構築物および該発現構築物を使用する方法が示される。ｉＣａｓｐ９および選択マーカー（短縮型ＣＤ１９）をコードするレトロウイルスベクターを、ドナーＴ細胞のための安全スイッチとして生成した。（抗ＣＤ２５免疫毒素を使用する）同種枯渇の後ですら、ドナーＴ細胞は、効率的に形質導入でき、増殖でき、およびその後にＣＤ１９免疫磁性選択によって＞９０％純度へと富化できた。その操作された細胞は、抗ウイルス特異性および機能性を保持し、調節性の表現型および機能を有するサブセットを含んだ。ｉＣａｓｐ９を小分子二量体化剤（ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）で活性化すると、
＞９０％アポトーシスが迅速に生じた。導入遺伝子発現は、静止しているＴ細胞においてダウンレギュレートされたが、ｉＣａｓｐ９は、活性化（同種反応性）Ｔ細胞において迅速に発現がアップレギュレートされたので、効率的な自殺遺伝子を保持した。
（半合致（Ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ）幹細胞移植後の同種枯渇Ｔ細胞（Ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ）の安全性を改善するためのｉＣａｓｐ９自殺遺伝子の使用）
この例では、発現構築物を使用して、半合致幹細胞移植後に同種枯渇Ｔ細胞の安全性を改善するための発現構築物および該発現構築物を使用する方法が示される。ｉＣａｓｐ９および選択マーカー（短縮型ＣＤ１９）をコードするレトロウイルスベクターを、ドナーＴ細胞のための安全スイッチとして生成した。（抗ＣＤ２５免疫毒素を使用する）同種枯渇の後ですら、ドナーＴ細胞は、効率的に形質導入でき、増殖でき、およびその後にＣＤ１９免疫磁性選択によって＞９０％純度へと富化できた。その操作された細胞は、抗ウイルス特異性および機能性を保持し、調節性の表現型および機能を有するサブセットを含んだ。ｉＣａｓｐ９を小分子二量体化剤（ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）で活性化すると、
＞９０％アポトーシスが迅速に生じた。導入遺伝子発現は、静止しているＴ細胞においてダウンレギュレートされたが、ｉＣａｓｐ９は、活性化（同種反応性）Ｔ細胞において迅速に発現がアップレギュレートされたので、効率的な自殺遺伝子を保持した。
（材料および方法）
（同種枯渇Ｔ細胞の生成）
同種枯渇細胞を、以前に示されたように、健常志願者から生成した。簡潔には、健常ドナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、無血清培地（ＡＩＭ Ｖ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中で４０：１のレスポンダー 対 刺激物質比で、照射レシピエントエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）とともに共培養した。７２時間後、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞は、ＲＦＴ５－ＳＭＰＴ－ｄｇＡ免疫毒素中での一晩のインキュベーションによる共培養物から枯渇された。同種枯渇を、残っているＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が＜１％であり、３Ｈ－チミジン取り込みによる残りの増殖が＜１０％であった場合に適切であるとみなした。
（同種枯渇Ｔ細胞の生成）
同種枯渇細胞を、以前に示されたように、健常志願者から生成した。簡潔には、健常ドナーに由来する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、無血清培地（ＡＩＭ Ｖ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中で４０：１のレスポンダー 対 刺激物質比で、照射レシピエントエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）とともに共培養した。７２時間後、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞は、ＲＦＴ５－ＳＭＰＴ－ｄｇＡ免疫毒素中での一晩のインキュベーションによる共培養物から枯渇された。同種枯渇を、残っているＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が＜１％であり、３Ｈ－チミジン取り込みによる残りの増殖が＜１０％であった場合に適切であるとみなした。
（プラスミドおよびレトロウイルス）
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９は、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒトＣＤ１９へと連結された誘導性カスパーゼ－９（ｉＣａｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーを介してヒトカスパーゼ－９（ＣＡＳＰ９； ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１２２９）へと接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２； ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２ ８１８）からなる。このＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３へのＦＫＢＰ１２の結合親和性を増大させる。カスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）を、ヒトカスパーゼ－９配列から欠失させた。なぜならその生理学的機能は、ＦＫＢＰ１２によって置き換えられており、その除去は、導入遺伝子の発現および機能を増大させるからである。この２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸のペプチドをコードし、このペプチドは、グリシンと末端プロリン残基との間で＞９９％切断を媒介し、ｉＣａｓｐ９のＣ末端において１９個の余分なアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端において１個の余分なプロリン残基を生じる。ＣＤ１９は、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で短縮された全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７７０）からなり、これは、細胞質内ドメインを２４２から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化の潜在的部位である全ての保存されたチロシン残基を除去する。
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９は、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒトＣＤ１９へと連結された誘導性カスパーゼ－９（ｉＣａｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーを介してヒトカスパーゼ－９（ＣＡＳＰ９； ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１２２９）へと接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２； ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２ ８１８）からなる。このＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３へのＦＫＢＰ１２の結合親和性を増大させる。カスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）を、ヒトカスパーゼ－９配列から欠失させた。なぜならその生理学的機能は、ＦＫＢＰ１２によって置き換えられており、その除去は、導入遺伝子の発現および機能を増大させるからである。この２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸のペプチドをコードし、このペプチドは、グリシンと末端プロリン残基との間で＞９９％切断を媒介し、ｉＣａｓｐ９のＣ末端において１９個の余分なアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端において１個の余分なプロリン残基を生じる。ＣＤ１９は、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で短縮された全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７７０）からなり、これは、細胞質内ドメインを２４２から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化の潜在的部位である全ての保存されたチロシン残基を除去する。
テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ－Ｖ）偽型レトロウイルスを生成する安定なＰＧ１３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ製品＃ＳＤ３４４４； ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）をＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９で一過性にトランスフェクトすることによって作製した。これは、Ｅｃｏ偽型レトロウイルスを生成した。ＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏ偽型もしくはレトロウイルスで３回形質導入して、１細胞あたり複数のＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９プロウイルス組み込み体を含むプロデューサー株を生成した。単一細胞クローニングを行い、最高力価を生じたＰＧ１３クローンを増殖させ、ベクター生成のために使用した。
（レトロウイルス形質導入）
Ｔ細胞活性化および増殖のための培養培地は、４５％ ＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）、４５％ クリック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｓａｎｔａ Ａｎａ， ＣＡ）および１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ； Ｈｙｃｌｏｎｅ）からなった。同種枯渇細胞を、固定化抗ＣＤ３（ＯＫＴ３； Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ， ＮＪ）によって４８時間にわたって活性化し、その後、レトロウイルスベクター選択的同種枯渇での形質導入を、ドナーＰＢＭＣとレシピエントＥＢＶ－ＬＣＬとを共培養することによって行って、同種反応性細胞を活性化した：活性化した細胞は、ＣＤ２５を発現し、その後、抗ＣＤ２５免疫毒素によって排除した。この同種枯渇細胞を、ＯＫＴ３によって活性化し、レトロウイルスベクターで４８時間後に形質導入した。免疫磁性選択を、形質導入の４日目に行った；陽性画分を、さらに４日間増殖させ、凍結保存した。
Ｔ細胞活性化および増殖のための培養培地は、４５％ ＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）、４５％ クリック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｓａｎｔａ Ａｎａ， ＣＡ）および１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ； Ｈｙｃｌｏｎｅ）からなった。同種枯渇細胞を、固定化抗ＣＤ３（ＯＫＴ３； Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ， ＮＪ）によって４８時間にわたって活性化し、その後、レトロウイルスベクター選択的同種枯渇での形質導入を、ドナーＰＢＭＣとレシピエントＥＢＶ－ＬＣＬとを共培養することによって行って、同種反応性細胞を活性化した：活性化した細胞は、ＣＤ２５を発現し、その後、抗ＣＤ２５免疫毒素によって排除した。この同種枯渇細胞を、ＯＫＴ３によって活性化し、レトロウイルスベクターで４８時間後に形質導入した。免疫磁性選択を、形質導入の４日目に行った；陽性画分を、さらに４日間増殖させ、凍結保存した。
小規模実験では、非組織培養処理２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を、ＯＫＴ３ １ｇ／ｍｌで２～４時間、３７℃においてコーティングした。同種枯渇細胞を、１×１０６ 細胞／ウェルで添加した。２４時間において、１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ； Ｃｈｉｒｏｎ， Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＣＡ）を添加した。レトロウイルス形質導入を、活性化の４８時間後に行った。非組織培養処理２４ウェルプレートを、３．５ｇ／ｃｍ２ 組換えフィブロネクチンフラグメント（ＣＨ－２９６； Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ； Ｔａｋａｒａ Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）でコーティングし、そのウェルに、０．５ｍｌ／ウェルのレトロウイルスベクター含有上清を、３０分間、３７℃において２回負荷した。その後、ＯＫＴ３活性化細胞を、３：１の比の新鮮なレトロウイルスベクター含有上清およびＴ細胞培養培地（１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２を補充）中に、５×１０５ 細胞／ウェル蒔いた。細胞を２～３日後に採取し、５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２の存在下で増殖させた。
（遺伝子改変同種枯渇細胞のスケールアップ生成）
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップは、非組織培養処理Ｔ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）を使用し、これを、一晩４℃において、１０ｍｌのＯＫＴ３ １μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチン ７μｇ／ｍｌでコーティングした。増大した細胞接着のためのコロナ放電処理したフッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ－００７２ＡＣ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）も使用した。同種枯渇細胞を、１×１０６ 細胞／ｍｌで、ＯＫＴ３でコーティングしたフラスコの中に播種した。１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２を翌日添加した。レトロウイルス形質導入のために、レトロネクチンでコーティングしたフラスコまたはバッグに、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清を２～３時間にわたって１回負荷した。ＯＫＴ３活性化Ｔ細胞を、３：１の比の新鮮なレトロウイルスベクター含有培地およびＴ細胞培養培地（１００ Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２を補充）の中で、１×１０６ 細胞／ｍｌで播種した。翌朝に細胞を採取し、約５×１０５ 細胞／ｍｌ～８×１０５ 細胞／ｍｌの播種密度で、組織培養処理Ｔ７５またはＴ１７５フラスコ中の、ＩＬ－２ 約５０～１００Ｕ／ｍｌを補充した培養培地中で増殖させた。
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップは、非組織培養処理Ｔ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）を使用し、これを、一晩４℃において、１０ｍｌのＯＫＴ３ １μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチン ７μｇ／ｍｌでコーティングした。増大した細胞接着のためのコロナ放電処理したフッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ－００７２ＡＣ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）も使用した。同種枯渇細胞を、１×１０６ 細胞／ｍｌで、ＯＫＴ３でコーティングしたフラスコの中に播種した。１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２を翌日添加した。レトロウイルス形質導入のために、レトロネクチンでコーティングしたフラスコまたはバッグに、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清を２～３時間にわたって１回負荷した。ＯＫＴ３活性化Ｔ細胞を、３：１の比の新鮮なレトロウイルスベクター含有培地およびＴ細胞培養培地（１００ Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２を補充）の中で、１×１０６ 細胞／ｍｌで播種した。翌朝に細胞を採取し、約５×１０５ 細胞／ｍｌ～８×１０５ 細胞／ｍｌの播種密度で、組織培養処理Ｔ７５またはＴ１７５フラスコ中の、ＩＬ－２ 約５０～１００Ｕ／ｍｌを補充した培養培地中で増殖させた。
（ＣＤ１９免疫磁性選択）
ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）で標識し、小規模実験ではＭＳもしくはＬＳカラム上で、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動化選択デバイスで選択した。ＣＤ１９選択細胞を、さらに４日間増殖させ、形質導入後の８日目に凍結保存した。それらの細胞を、「遺伝子改変同種枯渇細胞」と呼んだ。
ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）で標識し、小規模実験ではＭＳもしくはＬＳカラム上で、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動化選択デバイスで選択した。ＣＤ１９選択細胞を、さらに４日間増殖させ、形質導入後の８日目に凍結保存した。それらの細胞を、「遺伝子改変同種枯渇細胞」と呼んだ。
（免疫表現型決定およびペンタマー分析）
フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して行った：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９－ＰＥ（Ｃｌｏｎｅ ４Ｇ７； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、最適な染色を与えることが見出されたので、その後の全ての実験において使用した。非形質導入コントロールを使用して、ＣＤ１９に関する陰性ゲートを設定した。ＨＬＡ－ペンタマー、ＨＬＡ－Ｂ８－ＲＡＫＦＫＱＬＬ（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ， Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ， ＶＡ）を使用して、ＥＢＶ溶解抗原（ＢＺＬＦ１）のエピトープを認識するＴ細胞を検出した。ＨＬＡ－Ａ２－ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペンタマーを使用して、ＣＭＶ－ｐｐ６５抗原のエピトープを認識するＴ細胞を検出した。
フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して行った：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９－ＰＥ（Ｃｌｏｎｅ ４Ｇ７； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、最適な染色を与えることが見出されたので、その後の全ての実験において使用した。非形質導入コントロールを使用して、ＣＤ１９に関する陰性ゲートを設定した。ＨＬＡ－ペンタマー、ＨＬＡ－Ｂ８－ＲＡＫＦＫＱＬＬ（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ， Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ， ＶＡ）を使用して、ＥＢＶ溶解抗原（ＢＺＬＦ１）のエピトープを認識するＴ細胞を検出した。ＨＬＡ－Ａ２－ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペンタマーを使用して、ＣＭＶ－ｐｐ６５抗原のエピトープを認識するＴ細胞を検出した。
（抗ウイルス応答に関するインターフェロン－ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）
ＥＢＶ、ＣＭＶおよびアデノウイルス抗原への応答の評価に関するインターフェロン－ＥＬＩＳｐｏｔを、公知の方法を使用して行った。形質導入後８日間の低温貯蔵した遺伝子改変された同種枯渇させた細胞を解凍し、レスポンダー細胞として使用する前に、ＩＬ－２なしの完全培地中で一晩静置した。同じドナーに由来する低温貯蔵したＰＢＭＣを、比較物質（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）として使用した。レスポンダー細胞を、１ウェルあたり２×１０５、１×１０５、５×１０４および２．５×１０４ 細胞の連続希釈物として二連または三連でプレーティングした。刺激物質細胞を、１×１０５／ウェルでプレーティングした。ＥＢＶへの応答に関しては、４０Ｇｙで照射したドナー由来ＥＢＶ－ＬＣＬを、刺激物質として使用した。アデノウイルスへの応答に関しては、Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスに感染させたドナー由来活性化単球を使用した。
ＥＢＶ、ＣＭＶおよびアデノウイルス抗原への応答の評価に関するインターフェロン－ＥＬＩＳｐｏｔを、公知の方法を使用して行った。形質導入後８日間の低温貯蔵した遺伝子改変された同種枯渇させた細胞を解凍し、レスポンダー細胞として使用する前に、ＩＬ－２なしの完全培地中で一晩静置した。同じドナーに由来する低温貯蔵したＰＢＭＣを、比較物質（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）として使用した。レスポンダー細胞を、１ウェルあたり２×１０５、１×１０５、５×１０４および２．５×１０４ 細胞の連続希釈物として二連または三連でプレーティングした。刺激物質細胞を、１×１０５／ウェルでプレーティングした。ＥＢＶへの応答に関しては、４０Ｇｙで照射したドナー由来ＥＢＶ－ＬＣＬを、刺激物質として使用した。アデノウイルスへの応答に関しては、Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスに感染させたドナー由来活性化単球を使用した。
簡潔には、ドナーＰＢＭＣを、２４ウェルプレートにおいて一晩、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５（Ｃａｍｂｒｅｘ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）中にプレーティングし、翌朝採取し、Ａｄ５ｆ３５を多重感染度（ＭＯＩ）２００で２時間感染させ、洗浄し、３０Ｇｙで照射し、刺激物質として使用した。抗ＣＭＶ応答に関しては、ＭＯＩ ５０００でＣＭＶ ｐｐ６５導入遺伝子をコードするＡｄ５ｆ３５アデノウイルス（Ａｄ５ｆ３５－ｐｐ６５）を使用する類似のプロセスを使用した。特異的スポット形成単位（ＳＦＵ）を、試験ウェルのレスポンダーのみおよび刺激物質のみのウェルからＳＦＵを差し引くことによって計算した。ＣＭＶへの応答は、Ａｄ５ｆ３５－ｐｐ６５ウェルとＡｄ５ｆ３５ウェルとの間でのＳＦＵの差異であった。
（ＥＢＶ特異的細胞傷害）
遺伝子改変された同種枯渇した細胞を、レスポンダー：刺激物質比 ４０：１において、４０Ｇｙ照射ドナー由来ＥＢＶ－ＬＣＬで刺激した。９日後、その培養物を、レスポンダー：刺激物質比 ４：１において再刺激した。再刺激を、示されるとおり毎週行った。２ラウンドまたは３ラウンドの刺激後に、細胞傷害を、標的細胞としてドナーＥＢＶ－ＬＣＬを、および自家コントロールとしてドナーＯＫＴ３芽細胞（ｂｌａｓｔ）を使用して、４時間５１Ｃｒ－放出アッセイにおいて測定した。ＮＫ活性を、３０倍過剰の非放射能のＫ５６２細胞を添加することによって阻害した。
遺伝子改変された同種枯渇した細胞を、レスポンダー：刺激物質比 ４０：１において、４０Ｇｙ照射ドナー由来ＥＢＶ－ＬＣＬで刺激した。９日後、その培養物を、レスポンダー：刺激物質比 ４：１において再刺激した。再刺激を、示されるとおり毎週行った。２ラウンドまたは３ラウンドの刺激後に、細胞傷害を、標的細胞としてドナーＥＢＶ－ＬＣＬを、および自家コントロールとしてドナーＯＫＴ３芽細胞（ｂｌａｓｔ）を使用して、４時間５１Ｃｒ－放出アッセイにおいて測定した。ＮＫ活性を、３０倍過剰の非放射能のＫ５６２細胞を添加することによって阻害した。
（二量体化の化学的誘導物質、ＡＰ２０１８７でのアポトーシスの誘導）
自殺遺伝子機能性を、小分子合成ホモ二量体化剤、ＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ； Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）をＣＤ１９免疫磁性選択の翌日に１０ｎＭ 終濃度で添加することによって評価した。細胞を、２４時間においてアネキシンＶおよび７－アミノアクチノマイシン（７－ＡＡＤ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。アネキシンＶおよび７－ＡＡＤの両方に関して陰性の細胞を、生存しているとみなし、アネキシンＶ陽性の細胞をアポトーシスとみなし、アネキシンＶおよび７－ＡＡＤの両方が陽性の細胞を壊死とみなした。二量体化によって誘導される殺滅率を、以下のとおり、基底生存率に関して較正した：殺滅率＝１００％－（ＡＰ２０１８７処理細胞の％生存率÷非処理細胞の％生存率）。
自殺遺伝子機能性を、小分子合成ホモ二量体化剤、ＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ； Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）をＣＤ１９免疫磁性選択の翌日に１０ｎＭ 終濃度で添加することによって評価した。細胞を、２４時間においてアネキシンＶおよび７－アミノアクチノマイシン（７－ＡＡＤ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。アネキシンＶおよび７－ＡＡＤの両方に関して陰性の細胞を、生存しているとみなし、アネキシンＶ陽性の細胞をアポトーシスとみなし、アネキシンＶおよび７－ＡＡＤの両方が陽性の細胞を壊死とみなした。二量体化によって誘導される殺滅率を、以下のとおり、基底生存率に関して較正した：殺滅率＝１００％－（ＡＰ２０１８７処理細胞の％生存率÷非処理細胞の％生存率）。
（長期培養および再活性化後の導入遺伝子発現の評価）
細胞を、形質導入の２２日後まで、５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２を含むＴ細胞培地中で維持した。細胞の一部を、１ｇ／ｍｌ ＯＫＴ３および１μｇ／ｍｌ 抗ＣＤ２８（Ｃｌｏｎｅ ＣＤ２８．２， ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）で４８～７２時間コーティングした２４ウェルプレート上で再活性化した。再活性化細胞および非再活性化細胞の両方でのＣＤ１９発現および自殺遺伝子機能を、形質導入後の２４日目または２５日目に測定した。
細胞を、形質導入の２２日後まで、５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２を含むＴ細胞培地中で維持した。細胞の一部を、１ｇ／ｍｌ ＯＫＴ３および１μｇ／ｍｌ 抗ＣＤ２８（Ｃｌｏｎｅ ＣＤ２８．２， ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）で４８～７２時間コーティングした２４ウェルプレート上で再活性化した。再活性化細胞および非再活性化細胞の両方でのＣＤ１９発現および自殺遺伝子機能を、形質導入後の２４日目または２５日目に測定した。
いくつかの実験では、細胞をまた、形質導入後３週間培養し、１：１のレスポンダー：刺激物質比において、３０Ｇ照射同種異系ＰＢＭＣで刺激した。共培養の４日後、細胞の一部を、１０ｎＭ ＡＰ２０１８７で処理した。殺滅を、２４時間においてアネキシンＶ／７－ＡＡＤ染色によって測定し、バイスタンダーウイルス特異的Ｔ細胞に対する二量体化剤の効果を、ＡＰ２０１８７処理細胞および未処理細胞に対するペンタマー分析によって評価した。
（制御Ｔ細胞）
ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３の発現を、フローサイトメトリーを使用して、遺伝子改変された同種枯渇された細胞において分析した。ヒトＦｏｘｐ３染色に関して、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）染色セットを、適切なラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールとともに使用した。これら細胞を、表面ＣＤ２５－ＦＩＴＣおよびＣＤ４－ＰＥで共染色した。機能分析を、同種枯渇および遺伝子改変後に選択されたＣＤ４＋２５＋細胞と、カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識自家ＰＢＭＣとを共培養することによって行った。ＣＤ４＋２５＋選択を、抗ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）を使用してＣＤ８＋細胞をまず枯渇させ、続いて、抗ＣＤ２５マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）を使用して陽性選択を行った。ＣＦＳＥ標識を、１．５μＭ ＣＦＳＥを含むリン酸緩衝食塩水中２×１０７／ｍｌの自家ＰＢＭＣを１０分間インキュベートすることによって行った。上記反応を、等容積のＦＢＳを添加し、１０分間、３７℃でインキュベートすることによって停止した。細胞を、使用前に２回洗浄した。ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、ＯＫＴ３ ５００ｎｇ／ｍｌおよび４０Ｇ照射同種ＰＢＭＣフィーダーで、ＰＢＭＣ：同種フィーダー比 ５：１において刺激した。次いで、細胞を、等数の自家ＣＤ４＋２５＋遺伝子改変された同種枯渇された細胞ありまたはなしで培養した。培養の５日後に、細胞分裂を、フローサイトメトリーによって分析した；ＣＤ１９を使用して、非ＣＦＳＥ標識のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ 遺伝子改変されたＴ細胞をゲートアウトした。
ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３の発現を、フローサイトメトリーを使用して、遺伝子改変された同種枯渇された細胞において分析した。ヒトＦｏｘｐ３染色に関して、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）染色セットを、適切なラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールとともに使用した。これら細胞を、表面ＣＤ２５－ＦＩＴＣおよびＣＤ４－ＰＥで共染色した。機能分析を、同種枯渇および遺伝子改変後に選択されたＣＤ４＋２５＋細胞と、カルボキシフルオレセインジアセテートＮ－スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識自家ＰＢＭＣとを共培養することによって行った。ＣＤ４＋２５＋選択を、抗ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）を使用してＣＤ８＋細胞をまず枯渇させ、続いて、抗ＣＤ２５マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）を使用して陽性選択を行った。ＣＦＳＥ標識を、１．５μＭ ＣＦＳＥを含むリン酸緩衝食塩水中２×１０７／ｍｌの自家ＰＢＭＣを１０分間インキュベートすることによって行った。上記反応を、等容積のＦＢＳを添加し、１０分間、３７℃でインキュベートすることによって停止した。細胞を、使用前に２回洗浄した。ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを、ＯＫＴ３ ５００ｎｇ／ｍｌおよび４０Ｇ照射同種ＰＢＭＣフィーダーで、ＰＢＭＣ：同種フィーダー比 ５：１において刺激した。次いで、細胞を、等数の自家ＣＤ４＋２５＋遺伝子改変された同種枯渇された細胞ありまたはなしで培養した。培養の５日後に、細胞分裂を、フローサイトメトリーによって分析した；ＣＤ１９を使用して、非ＣＦＳＥ標識のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ 遺伝子改変されたＴ細胞をゲートアウトした。
（統計分析）
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の統計的有意差を決定した。全てのデータを、平均±１標準偏差として表す。
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の統計的有意差を決定した。全てのデータを、平均±１標準偏差として表す。
（結果）
選択的に同種枯渇したＴ細胞を、ｉＣａｓｐ９で効率的に形質導入し、拡大し得る。
選択的同種枯渇を、臨床プロトコル手順に従って行った。簡潔には、３／６～５／６のＨＬＡミスマッチＰＢＭＣおよびリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）を共培養した。ＲＦＴ５－ＳＭＰＴ－ｄｇＡ免疫毒素を、７２時間の共培養後に適用し、＜１０％ 残余増殖（平均４．５±２．８％；範囲０．７４～９．１％；１０回の実験）を有し、＜１％ 残余ＣＤ３＋ＣＤ２５＋細胞（平均０．２３±０．２０％；範囲０．０６～０．７３％；１０回の実験）を含む同種枯渇細胞を確実に生成した。それによって、選択的同種枯渇のための放出基準を満たしかつその後の操作のための出発材料として働いた。
選択的に同種枯渇したＴ細胞を、ｉＣａｓｐ９で効率的に形質導入し、拡大し得る。
選択的同種枯渇を、臨床プロトコル手順に従って行った。簡潔には、３／６～５／６のＨＬＡミスマッチＰＢＭＣおよびリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）を共培養した。ＲＦＴ５－ＳＭＰＴ－ｄｇＡ免疫毒素を、７２時間の共培養後に適用し、＜１０％ 残余増殖（平均４．５±２．８％；範囲０．７４～９．１％；１０回の実験）を有し、＜１％ 残余ＣＤ３＋ＣＤ２５＋細胞（平均０．２３±０．２０％；範囲０．０６～０．７３％；１０回の実験）を含む同種枯渇細胞を確実に生成した。それによって、選択的同種枯渇のための放出基準を満たしかつその後の操作のための出発材料として働いた。
固定化ＯＫＴ３上で４８時間にわたって活性化した同種枯渇された細胞は、ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９をコードするＧａｌ－Ｖ偽型レトロウイルスベクターで効率的に形質導入できた。形質導入の２～４日後にＣＤ１９発現に関してＦＡＣＳ分析によって評価した形質導入効率は、約５３％±８％であり、小規模（２４ウェルプレート）および大規模（Ｔ７５フラスコ）での形質導入についての結果（それぞれ、６回および４回の実験において約５５±８％ 対 約５０％±１０％）と匹敵していた。細胞数は、ＯＫＴ３活性化後の最初の２日間において縮小し、その結果、同種枯渇された細胞のうちのわずか約６１％±１２％（約４５％～８０％の範囲）が、形質導入の日に回収された。その後、上記細胞は、その後の８日間にわたって約９４±４６倍の範囲（約４０～約１５３の範囲）の平均拡大で有意な拡大を示し、正味５８±３３倍の拡大を生じた。細胞拡大は、小規模および大規模実験の両方において、５回の小規模実験において正味の拡大約４５±２９倍（約２５～約９０の範囲）および３回の大規模実験において約７９±３４倍（約５０～約１１６の範囲）と類似していた。
（ΔＣＤ１９は、免疫磁性カラム上で、形質導入された細胞の効率的かつ選択的富化を可能にする）
自殺遺伝子活性化の効率は、ときおり、自殺遺伝子自体の機能性に依存し、ときおり、遺伝子改変された細胞を富化するために使用される選択システムに依存する。選択マーカーとしてのＣＤ１９の使用を、ＣＤ１９選択が十分な純度および収量で遺伝子改変された細胞の選択を可能にするかどうか、および選択がその後の細胞成長に対して任意の有害作用を有するかどうかを決定するために調査した。小規模選択を、製造業者の指示に従って行った；しかし、大規模選択は、１０リットルのＣＤ１９マイクロビーズを１．３×１０７ 細胞につき使用する場合に最適であることが判明した。ＦＡＣＳ分析を、免疫磁性選択の２４時間後に行って、抗ＣＤ１９マイクロビーズからの干渉を最小にした。免疫磁性選択後の細胞の純度は、一貫して９０％より高かった：ＣＤ１９＋ 細胞の平均パーセンテージは、小規模選択で約９８．３％±０．５％（ｎ＝５）の範囲にあり、大規模ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択で約９７．４％±０．９％（ｎ＝３）の範囲にあった。
自殺遺伝子活性化の効率は、ときおり、自殺遺伝子自体の機能性に依存し、ときおり、遺伝子改変された細胞を富化するために使用される選択システムに依存する。選択マーカーとしてのＣＤ１９の使用を、ＣＤ１９選択が十分な純度および収量で遺伝子改変された細胞の選択を可能にするかどうか、および選択がその後の細胞成長に対して任意の有害作用を有するかどうかを決定するために調査した。小規模選択を、製造業者の指示に従って行った；しかし、大規模選択は、１０リットルのＣＤ１９マイクロビーズを１．３×１０７ 細胞につき使用する場合に最適であることが判明した。ＦＡＣＳ分析を、免疫磁性選択の２４時間後に行って、抗ＣＤ１９マイクロビーズからの干渉を最小にした。免疫磁性選択後の細胞の純度は、一貫して９０％より高かった：ＣＤ１９＋ 細胞の平均パーセンテージは、小規模選択で約９８．３％±０．５％（ｎ＝５）の範囲にあり、大規模ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択で約９７．４％±０．９％（ｎ＝３）の範囲にあった。
小規模および大規模での選択の絶対収量は、形質導入効率の較正後に；それぞれ、約３１％±１１％および約２８％±６％であった。形質導入された細胞の平均回収率は、小規模選択で約５４％±１４％および大規模選択で約７２％±１８％であった。選択プロセスは、その後の細胞拡大に対して何ら識別可能な有害作用を有しなかった。４回の実験においで、ＣＤ１９免疫磁性選択後３日間にわたる平均細胞拡大は、ＣＤ１９陽性画分に関して約３．５倍 対 選択されていない形質導入された細胞に関して約４．１倍（ｐ＝０．３４）および非形質導入細胞に関して約３．７倍（ｐ＝０．７５）であった。
（遺伝子改変された同種枯渇された細胞の免疫表現型）
最終細胞生成物（形質導入の８日後に低温貯蔵された、遺伝子改変された同種枯渇された細胞）を、免疫表現型決定したところ、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の両方を含むことが見出され、以下の表で示されるとおり、６２％±１１％ ＣＤ８＋ 対 ２３％±８％
ＣＤ４＋でＣＤ８細胞が優勢であった。ＮＳ＝有意でない、ＳＤ＝標準偏差。
最終細胞生成物（形質導入の８日後に低温貯蔵された、遺伝子改変された同種枯渇された細胞）を、免疫表現型決定したところ、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の両方を含むことが見出され、以下の表で示されるとおり、６２％±１１％ ＣＤ８＋ 対 ２３％±８％
ＣＤ４＋でＣＤ８細胞が優勢であった。ＮＳ＝有意でない、ＳＤ＝標準偏差。
細胞の大部分は、ＣＤ４５ＲＯ＋であり、エフェクター記憶Ｔ細胞の表面免疫表現型を有した。記憶マーカー（ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＤ２８を含む）の発現は、不均一であった。細胞のうちのおよそ２４％は、ＣＤ６２Ｌ（中枢記憶細胞上で主に発現されるリンパ節ホーミング分子）を発現した。
（遺伝子改変された同種枯渇された細胞は、抗ウイルスレパートリーおよび機能を保持した）
最終生成物の細胞が抗ウイルス免疫を媒介する能力を、インターフェロン－ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞傷害アッセイ、およびペンタマー分析によって評価した。低温貯蔵された遺伝子改変された同種枯渇された細胞を、全ての分析において使用した。なぜならそれらは、臨床試験における使用のために現在評価されている生成物の代表であったからである。ドナー細胞によって提示されるアデノウイルス抗原、ＣＭＶ抗原またはＥＢＶ抗原に応答したインターフェロン－γ分泌は保存されたが、非操作ＰＢＭＣに対して遺伝子改変された同種枯渇された細胞において抗ＥＢＶ応答は低下する傾向にあった。ウイルス抗原に対する応答は、４対の非操作ＰＢＭＣおよび遺伝子改変された同種枯渇された細胞（ＧＭＡＣ）においてＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。アデノウイルス抗原およびＣＭＶ抗原は、それぞれ、Ａｄ５ｆ３５ヌルベクターおよびＡｄ５ｆ３５－ｐｐ６５ベクターでの感染を通じて、ドナー由来活性化単球によって提示された。ＥＢＶ抗原は、ドナーＥＢＶ－ＬＣＬによって提示された。スポット形成単位（ＳＦＵ）の数字を、刺激物質のみのウェルおよびレスポンダーのみのウェルに対して較正した。４名のドナーのうちの３名のみが、ＣＭＶ応答について評価可能であり、１名のセロネガティブドナーを除外した。
最終生成物の細胞が抗ウイルス免疫を媒介する能力を、インターフェロン－ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞傷害アッセイ、およびペンタマー分析によって評価した。低温貯蔵された遺伝子改変された同種枯渇された細胞を、全ての分析において使用した。なぜならそれらは、臨床試験における使用のために現在評価されている生成物の代表であったからである。ドナー細胞によって提示されるアデノウイルス抗原、ＣＭＶ抗原またはＥＢＶ抗原に応答したインターフェロン－γ分泌は保存されたが、非操作ＰＢＭＣに対して遺伝子改変された同種枯渇された細胞において抗ＥＢＶ応答は低下する傾向にあった。ウイルス抗原に対する応答は、４対の非操作ＰＢＭＣおよび遺伝子改変された同種枯渇された細胞（ＧＭＡＣ）においてＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。アデノウイルス抗原およびＣＭＶ抗原は、それぞれ、Ａｄ５ｆ３５ヌルベクターおよびＡｄ５ｆ３５－ｐｐ６５ベクターでの感染を通じて、ドナー由来活性化単球によって提示された。ＥＢＶ抗原は、ドナーＥＢＶ－ＬＣＬによって提示された。スポット形成単位（ＳＦＵ）の数字を、刺激物質のみのウェルおよびレスポンダーのみのウェルに対して較正した。４名のドナーのうちの３名のみが、ＣＭＶ応答について評価可能であり、１名のセロネガティブドナーを除外した。
細胞傷害を、ドナー由来ＥＢＶ－ＬＣＬを標的として使用して評価した。ドナー由来ＥＢＶ－ＬＣＬで２ラウンドまたは３ラウンドの刺激を受けた、遺伝子改変された同種枯渇された細胞は、ウイルス感染した自家標的細胞を効率的に溶解できた。遺伝子改変された同種枯渇された細胞を、ドナーＥＢＶ－ＬＣＬで２サイクルまたは３サイクルにわたって刺激した。５１Ｃｒ放出アッセイを、ドナー由来ＥＢＶ－ＬＣＬおよびドナーＯＫＴ３芽細胞を標的として使用して行った。ＮＫ活性を、３０倍過剰の非放射能Ｋ５６２でブロックした。左パネルは、全体的にまたは部分的にミスマッチのドナー－レシピエント対を使用する５回の独立した実験からの結果を示す。右のパネルは、血縁のないＨＬＡハプロタイプ一致ドナー－レシピエント対を使用する３回の実験からの結果を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
ＥＢＶ－ＬＣＬを、選択的同種枯渇の間の抗原提示細胞として使用した。従って、ドナーおよびレシピエントがハプロタイプ一致である場合に、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞が有意に枯渇され得ることは可能であった。この仮説を調査するために、血縁のないＨＬＡハプロタイプ一致のドナー－レシピエント対を使用する３回の実験が含められ、その結果は、ドナー由来ＥＢＶ－ＬＣＬに対する細胞傷害性が保持されることを示した。その結果は、ＨＬＡ－Ｂ８陰性ハプロタイプ一致レシピエントに対する同種枯渇後の２名の有益なドナーにおいて、ＨＬＡ－Ｂ８－ＲＡＫＦＫＱＬＬ（ＥＢＶ溶解抗原（ＢＺＬＦ１）エピトープ）を認識するＴ細胞に関するペンタマー分析によって実証された。非操作ＰＢＭＣを、比較物質として使用した。このＲＡＫ－ペンタマー陽性集団は、遺伝子改変された同種枯渇された細胞において保持され、ドナー由来ＥＢＶ－ＬＣＬでの数ラウンドのインビトロ刺激後に拡大できた。まとめると、これら結果は、遺伝子改変された同種枯渇された細胞が有意な抗ウイルス機能性を保持したことを示す。
（遺伝子改変された同種枯渇された細胞集団における制御Ｔ細胞）
フローサイトメトリーおよび機能分析を使用して、制御性Ｔ細胞が、本発明者らの同種枯渇された、遺伝子改変されたＴ細胞生成物において保持されるかどうかを決定した。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋２５＋集団を見出した。免疫磁性分離後に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋富化された画分は、ＣＦＳＥ標識自家ＰＢＭＣとともにＯＫＴ３および同種フィーダーの存在下で共培養した場合に、サプレッサー機能を示した。ドナー由来ＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、ＯＫＴ３および同種フィーダーで刺激した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、遺伝子改変された細胞集団から免疫磁性選択し、１：１比で試験ウェルに添加した。フローサイトメトリーを５日後に行った。遺伝子改変されたＴ細胞を、ＣＤ１９発現によってゲートアウトした。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋遺伝子改変された細胞の添加（下のパネル）は、細胞増殖を有意に減少させた。従って、同種枯渇されたＴ細胞は、ＣＤ２５枯渇免疫毒素への曝露後にすら、制御性の表現型を再獲得し得る。
フローサイトメトリーおよび機能分析を使用して、制御性Ｔ細胞が、本発明者らの同種枯渇された、遺伝子改変されたＴ細胞生成物において保持されるかどうかを決定した。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋２５＋集団を見出した。免疫磁性分離後に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋富化された画分は、ＣＦＳＥ標識自家ＰＢＭＣとともにＯＫＴ３および同種フィーダーの存在下で共培養した場合に、サプレッサー機能を示した。ドナー由来ＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、ＯＫＴ３および同種フィーダーで刺激した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、遺伝子改変された細胞集団から免疫磁性選択し、１：１比で試験ウェルに添加した。フローサイトメトリーを５日後に行った。遺伝子改変されたＴ細胞を、ＣＤ１９発現によってゲートアウトした。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋遺伝子改変された細胞の添加（下のパネル）は、細胞増殖を有意に減少させた。従って、同種枯渇されたＴ細胞は、ＣＤ２５枯渇免疫毒素への曝露後にすら、制御性の表現型を再獲得し得る。
（遺伝子改変された同種枯渇された細胞は、二量体化の化学的誘導物質の添加によって効率的にかつ迅速に排除された）
免疫磁性選択の翌日に、１０ｎＭの二量体化の化学的誘導物質であるＡＰ２０１８７を添加して、アポトーシスを誘導した。アポトーシスは、２４時間以内に出現した。２４時間においてアネキシンＶおよび７－ＡＡＤ染色によるＦＡＣＳ分析は、ＡＰ２０１８７処理細胞のうちの約５．５％±２．５％のみが生存可能なままであるのに対して、非処理細胞のうちの約８１．０％±９．０％が生存可能であることを示した（以下を参照のこと：ベースラインの生存率に対する較正後の殺滅効率は、約９２．９％±３．８％であった。大規模ＣＤ１９選択は、小規模選択と類似の効率で殺滅された細胞を生じた：大規模および小規模において、ＡＰ２０１８７ありおよびなしの平均生存率、ならびにパーセンテージ殺滅は、それぞれ、約３．９％、約８４．０％、約９５．４％（ｎ＝３）ならびに約６．６％、約７９．３％、約９１．４％（ｎ＝５）であった。ＡＰ２０１８７は、非形質導入細胞に対して非毒性であった：ＡＰ２０１８７ありおよびなしでの生存率は、それぞれ、約８６％±９％および８７％±８％（ｎ＝６）であった。
免疫磁性選択の翌日に、１０ｎＭの二量体化の化学的誘導物質であるＡＰ２０１８７を添加して、アポトーシスを誘導した。アポトーシスは、２４時間以内に出現した。２４時間においてアネキシンＶおよび７－ＡＡＤ染色によるＦＡＣＳ分析は、ＡＰ２０１８７処理細胞のうちの約５．５％±２．５％のみが生存可能なままであるのに対して、非処理細胞のうちの約８１．０％±９．０％が生存可能であることを示した（以下を参照のこと：ベースラインの生存率に対する較正後の殺滅効率は、約９２．９％±３．８％であった。大規模ＣＤ１９選択は、小規模選択と類似の効率で殺滅された細胞を生じた：大規模および小規模において、ＡＰ２０１８７ありおよびなしの平均生存率、ならびにパーセンテージ殺滅は、それぞれ、約３．９％、約８４．０％、約９５．４％（ｎ＝３）ならびに約６．６％、約７９．３％、約９１．４％（ｎ＝５）であった。ＡＰ２０１８７は、非形質導入細胞に対して非毒性であった：ＡＰ２０１８７ありおよびなしでの生存率は、それぞれ、約８６％±９％および８７％±８％（ｎ＝６）であった。
（導入遺伝子発現および機能は、長期の培養とともに減少したが、細胞再活性化の際に回復した）
導入遺伝子発現および機能の安定性を評価するために、細胞を、形質導入後２４日まで、Ｔ細胞培養培地および低用量ＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ）中で維持した。次いで、細胞の一部を、ＯＫＴ３／抗ＣＤ２８で再活性化した。ＣＤ１９発現を、４８～７２時間後にフローサイトメトリーによって分析し、自殺遺伝子機能を、１０ｎＭ ＡＰ２０１８７での処理によって評価した。４８～７２時間の活性化ありまたはなし（５回の実験）で、形質導入後５日目（すなわち、ＣＤ１９選択の１日後）および形質導入後２４日目の細胞を得る。２回の実験では、ＣＤ２５選択を、ＯＫＴ３／ａＣＤ２８活性化後に行って、活性化した細胞をさらに富化した。エラーバーは、標準偏差を表す。＊は、形質導入後５日目の細胞と比較した場合に、ｐ＜０．０５を示す。２４日目までに、表面ＣＤ１９発現は、７９３±１２８から４７８±１０７への平均蛍光強度（ＭＦＩ）の並行した低下（ｐ＜０．０５）とともに、約９８％±１％から約８８％±４％へと低下した（ｐ＜０．０５）（図１３Ｂを参照のこと）。同様に、自殺遺伝子機能は有意に減少した：残余生存率は、ＡＰ２０１８７での処理後に１９．６±５．６％であった；ベースラインの生存率５４．８±２０．９％に対する較正後に、これは、わずか６３．１±６．２％という殺滅効率に等しかった。
導入遺伝子発現および機能の安定性を評価するために、細胞を、形質導入後２４日まで、Ｔ細胞培養培地および低用量ＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ）中で維持した。次いで、細胞の一部を、ＯＫＴ３／抗ＣＤ２８で再活性化した。ＣＤ１９発現を、４８～７２時間後にフローサイトメトリーによって分析し、自殺遺伝子機能を、１０ｎＭ ＡＰ２０１８７での処理によって評価した。４８～７２時間の活性化ありまたはなし（５回の実験）で、形質導入後５日目（すなわち、ＣＤ１９選択の１日後）および形質導入後２４日目の細胞を得る。２回の実験では、ＣＤ２５選択を、ＯＫＴ３／ａＣＤ２８活性化後に行って、活性化した細胞をさらに富化した。エラーバーは、標準偏差を表す。＊は、形質導入後５日目の細胞と比較した場合に、ｐ＜０．０５を示す。２４日目までに、表面ＣＤ１９発現は、７９３±１２８から４７８±１０７への平均蛍光強度（ＭＦＩ）の並行した低下（ｐ＜０．０５）とともに、約９８％±１％から約８８％±４％へと低下した（ｐ＜０．０５）（図１３Ｂを参照のこと）。同様に、自殺遺伝子機能は有意に減少した：残余生存率は、ＡＰ２０１８７での処理後に１９．６±５．６％であった；ベースラインの生存率５４．８±２０．９％に対する較正後に、これは、わずか６３．１±６．２％という殺滅効率に等しかった。
導入遺伝子発現における経時的減少がＴ細胞静止後の低下した転写にまたは形質導入した細胞の排除に起因したかどうかを決定するために、細胞の一部を、ＯＫＴ３および抗ＣＤ２８抗体での形質導入後２２日目に再活性化した。４８～７２時間で（形質導入後２４日目または２５日目）において、ＯＫＴ３／ａＣＤ２８再活性化した細胞は、非再活性化細胞より有意に高い導入遺伝子発現を有した。ＣＤ１９発現は、約８８％±４％から約９３％±４％へと増大し（ｐ＜０．０１）、ＣＤ１９ ＭＦＩは、４７８±１０７から６４３±１７４へと増大した（ｐ＜０．０１）。さらに、自殺遺伝子機能はまた、約６３．１％±６．２％殺滅効率から約８４．６％±８．０％（ｐ＜０．０１）殺滅効率へと有意に増大した。さらに、殺滅効率は、細胞が活性化マーカーＣＤ２５に関して免疫磁性的にソートされた場合に完全に回復した：ＣＤ２５陽性細胞の殺滅効率は、約９３．２％±１．２％，であった。これは、形質導入後５日目の殺滅効率（９３．１±３．５％）と同じであった。ＣＤ２５陰性画分の殺滅は、７８．６±９．１％であった。
注意すべき観察は、二量体化剤が、非特異的マイトジェン刺激によるよりむしろ、同種ＰＢＭＣで再活性化された遺伝子改変された細胞を枯渇させるために使用された場合、多くのウイルス特異的Ｔ細胞が残された（ｓｐａｒｅ）ことであった。同種細胞での４日間の再活性化後に、図１４Ａおよび１４Ｂに示されるように、ＡＰ２０１８７での処理は、ＥＢＶおよびＣＭＶに由来するペプチドに対して特異的なＨＬＡペンタマーと反応性のＴ細胞の割合によって測定される場合、ウイルス反応性亜集団を残す（およびそれによって富化する）。遺伝子改変された同種枯渇された細胞を、形質導入後３週間にわたって培養物中で維持して、導入遺伝子ダウンモジュレーションを可能にした。細胞を、同種ＰＢＭＣで４日間刺激し、その後、一部を１０ｎＭ ＡＰ２０１８７で処理した。ＥＢＶ特異的Ｔ細胞およびＣＭＶ特異的Ｔ細胞の頻度は、同種刺激前に、同種刺激後に、および二量体化剤での同種刺激細胞の処理後に、ペンタマー分析によって定量した。ウイルス特異的Ｔ細胞のパーセンテージは、同種刺激後に減少した。二量体化剤での処理後に、ウイルス特異的Ｔ細胞は、部分的におよび優先的に保持された。
（考察）
同種Ｔ細胞を２種の別個の安全機構、選択的同種枯渇および自殺遺伝子改変で操作するという実施可能性は、本明細書で示されてきた。組み合わせると、これら改変は、ハプロタイプ一致移植後ですら、抗ウイルス活性および抗腫瘍活性を有する実質的な数のＴ細胞の追加戻しを高め得るおよび／または可能にし得る。本明細書で示されるデータは、自殺遺伝子ｉＣａｓｐ９が効率的に機能すること（二量体化剤での処置後に＞９０％ アポトーシス）および同種反応性Ｔ細胞がそれらの標的と遭遇した場合に起こるように、経時的に起こる導入遺伝子発現のダウンモジュレーションがＴ細胞活性化の際に迅速に逆にされたことを示す。本明細書で示されるデータはまた、ＣＤ１９が、形質導入された細胞の＞９０％ 純度への効率的かつ選択的富化を可能にした適切な選択マーカーであることを示す。さらに、本明細書で示されるデータは、これら操作が、抗ウイルス活性の保持を伴うその操作されたＴ細胞の免疫学的能力に対する認識できる効果、およびＴｒｅｇ活性を有するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋集団の再生を有しなかったことを示す。
同種Ｔ細胞を２種の別個の安全機構、選択的同種枯渇および自殺遺伝子改変で操作するという実施可能性は、本明細書で示されてきた。組み合わせると、これら改変は、ハプロタイプ一致移植後ですら、抗ウイルス活性および抗腫瘍活性を有する実質的な数のＴ細胞の追加戻しを高め得るおよび／または可能にし得る。本明細書で示されるデータは、自殺遺伝子ｉＣａｓｐ９が効率的に機能すること（二量体化剤での処置後に＞９０％ アポトーシス）および同種反応性Ｔ細胞がそれらの標的と遭遇した場合に起こるように、経時的に起こる導入遺伝子発現のダウンモジュレーションがＴ細胞活性化の際に迅速に逆にされたことを示す。本明細書で示されるデータはまた、ＣＤ１９が、形質導入された細胞の＞９０％ 純度への効率的かつ選択的富化を可能にした適切な選択マーカーであることを示す。さらに、本明細書で示されるデータは、これら操作が、抗ウイルス活性の保持を伴うその操作されたＴ細胞の免疫学的能力に対する認識できる効果、およびＴｒｅｇ活性を有するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋集団の再生を有しなかったことを示す。
自殺遺伝子の全体的な機能性が、自殺遺伝子自体および形質導入された細胞を選択するために使用されるマーカーの両方に依存するならば、臨床的使用への変換は、両方の構成成分の最適化、および２種の遺伝子の発現を結びつけるために使用される方法の最適化を必要とする。この２種の最も広く（現在では臨床診療において）使用される選択マーカーは、各々欠点を有する。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）は、潜在的に免疫原性の外来タンパク質をコードし、選択培地中での７日間の培養を要し、これは、系の複雑さを増大させるのみならず、ウイルス特異的Ｔ細胞に対して潜在的に損傷をも与える。広く使用される表面選択マーカーＬＮＧＦＲは、その明らかな臨床的安全性にもかかわらず、マウスモデルでは、その腫瘍形成潜在能および白血病との潜在的な相関性に関して近年懸念が高まっている。さらに、ＬＮＧＦＲ選択は、広く利用可能ではない。なぜならそれは、遺伝子治療においてほぼ独占的に使用されるからである。多くの代替の選択マーカーが示唆されている。ＣＤ３４は、インビトロで十分に研究されているが、希な造血前駆体の選択のために主に構成された系を最適化するために必要とされる工程、およびより重大なことには、変化したインビボでのＴ細胞ホーミングの潜在性は、ＣＤ３４を、自殺スイッチ発現構築物に関する選択マーカーとしての使用に対して最適以下にする。ＣＤ１９は、代替の選択マーカーとして選択された。なぜなら臨床グレードのＣＤ１９選択は、幹細胞自己移植のＢ細胞枯渇のための方法として容易に利用可能であるからである。本明細書で示される結果は、ＣＤ１９富化が高純度かつ高収量で行われ得、さらに、選択プロセスがその後の細胞成長および機能性に対して認識できる効果を有しないことを示した。
ＣＤ１９選択ｉＣａｓｐ９細胞における自殺遺伝子活性化の有効性は、ＨＳＶｔｋ遺伝子を発現するように形質導入したｎｅｏ選択細胞またはＬＮＧＦＲ選択細胞の活性化に対して非常に都合良く比較した。ＨＳＶｔｋ構築物のより前の世代は、３Ｈ－チミジン取り込みの８０～９０％抑制を提供し、長期のインビトロ培養の際に殺滅効率において同様の減少を示したが、それでもなお臨床的に有効であった。急性および慢性両方のＧＶＨＤの完全な消散は、循環する遺伝子改変された細胞におけるインビボでの減少が僅か８０％であると報告された。これらデータは、インビトロで見られる導入遺伝子ダウンモジュレーションが問題となりそうにないという仮説を支持する。なぜならＧＶＨＤの原因である活性化Ｔ細胞が、自殺遺伝子発現をアップレギュレートし、従って、インビボで選択的に排除されるからである。この効果が、インビボでのウイルス特異的Ｔ細胞および白血病特異的Ｔ細胞の保持を可能にするために十分であるかどうかは、臨床状況で試験される。自殺遺伝子改変前にインビトロ選択的同種枯渇を組み合わせることによって、自殺遺伝子機構を活性化する必要性は、有意に減少し得、それによって、追加戻しＴ細胞ベースの治療の利益を最大化し得る。
インビトロで見られるｉＣａｓｐ９媒介性自殺の高効率は、インビボでも繰り返された。ＳＣＩＤマウス－ヒト異種移植モデルにおいて、ｉＣａｓｐ９改変Ｔ細胞のうちの９９％超が、二量体化剤の単一用量後に排除された。ＡＰ１９０３（これは、ＡＰ２０１８７に極めて近い機能的かつ化学的等価性を有し、臨床適用における使用が現在提唱されている）は、健常ヒト志願者に対して安全性が試験され、安全であると示された。約１０ｎｇ／ｍｌ～約１２７５ｎｇ／ｍｌ ＡＰ１９０３（約７ｎＭ～約８９２ｎＭの間で等価）との間の最大血漿レベルは、２時間の静脈内注入として投与される、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇ用量範囲にわたって達した。実質的に有意な有害作用はなかった。迅速な血漿再分布を可能にした後、インビトロで使用される二量体化剤の濃度は、インビボで容易に達成可能なままである。
自殺遺伝子改変Ｔ細胞の免疫学的能力を維持するために最適な培養条件を、安全スイッチ、選択マーカーおよび細胞タイプの各組み合わせに関して決定して定義しなければならない。なぜなら表現型、レパートリーおよび機能性は、全て、ポリクローナルＴ細胞活性化のために使用される刺激、形質導入細胞の選択のための方法、および培養の継続時間によって影響を及ぼされ得るからである。ＣＤ２８共刺激の付加およびＣＤ４：ＣＤ８比に関して非操作ＰＢＭＣにより密接に似ている遺伝子改変された細胞を生成するための細胞サイズの常磁性ビーズの使用、ならびにリンパ節ホーミング分子ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７を含む記憶サブセットマーカーの発現は、遺伝子改変されたＴ細胞のインビボ機能性を改善し得る。ＣＤ２８共刺激はまた、レトロウイルス形質導入および拡大の効率を増大し得る。しかし、興味深いことには、ＣＤ２８共刺激の付加は、同種枯渇された細胞の形質導入に何ら影響を有しないことが見出され、示された細胞拡大の程度は、他の研究において抗ＣＤ３単独アームと比較した場合に、より高かった。さらに、ｉＣａｓｐ９改変同種枯渇された細胞は、有意な抗ウイルス機能性を保持し、およそ１／４は、ＣＤ６２Ｌ発現を保持した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の再生もまた、見られた。Ｔ細胞活性化および形質導入のための出発材料として使用される同種枯渇された細胞は、共刺激としての抗ＣＤ２８抗体の添加にあまり感受性を有しない可能性がある。ＣＤ２５枯渇されたＰＢＭＣ／ＥＢＶ－ＬＣＬ共培養物は、非操作ＰＢＭＣより有意に高いレベルでＣＤ８６を既に発現しかつ共刺激を提供し得るＴ細胞およびＢ細胞を含んだ。抗ＣＤ３でのポリクローナルＴ細胞活性化の前にＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を枯渇させると、最終Ｔ細胞生成物の免疫学的能力を高めることが報告された。機能的能力に対するインビトロ培養および拡大の効果を最小にするために、本明細書で示されるいくつかの実験では、比較的短時間の培養期間を使用した。それによって細胞は、４日目に行われるＣＤ１９選択を伴う形質導入後合計８日間にわたって拡大された。
最後に、スケールアップした生成が示され、その結果、十分な細胞生成物が、１０７ 細胞／ｋｇまでの用量で成人患者を処置するために生成され得る：同種枯渇された細胞は、４×１０７細胞／フラスコで活性化および形質転換され得、ＣＤ１９選択された最終細胞生成物の最小で８倍の回復が、元のフラスコ１個あたり少なくとも３×１０８ 同種枯渇された遺伝子改変された細胞を生成するために、形質導入後８日目に得られ得る。増大した培養容積は、さらなるフラスコまたはバッグに容易に収容され得る。
本明細書で示される同種枯渇およびｉＣａｓｐ９改変は、特にハプロタイプ一致幹細胞同種移植後に、Ｔ細胞を添加し戻す安全性を有意に改善し得る。これは、翻って、抗白血病効果を生じるというより高い見込みとともに、より大きな用量漸増を可能にするはずである。
（実施例３）
（ＣＡＳＰＡＬＬＯ － ハプロタイプ一致幹細胞移植後の誘導性カスパーゼ－９自殺遺伝子で形質導入した同種枯渇Ｔ細胞のフェーズＩ臨床試験）
この例は、図２において例示した代替の自殺遺伝子ストラテジーを使用するフェーズ１臨床試験の結果を示す。簡潔には、ドナー末梢血単核球を、レシピエントの照射ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞とともに（４０：１）７２時間共培養し、ＣＤ２５免疫毒素で同種枯渇させ、次いで、ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子および選択マーカー（ΔＣＤ１９）を有するレトロウイルス上清で形質導入した；ΔＣＤ１９は、免疫磁性選択を介して＞９０％純度への富化を可能にした。
（ＣＡＳＰＡＬＬＯ － ハプロタイプ一致幹細胞移植後の誘導性カスパーゼ－９自殺遺伝子で形質導入した同種枯渇Ｔ細胞のフェーズＩ臨床試験）
この例は、図２において例示した代替の自殺遺伝子ストラテジーを使用するフェーズ１臨床試験の結果を示す。簡潔には、ドナー末梢血単核球を、レシピエントの照射ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞とともに（４０：１）７２時間共培養し、ＣＤ２５免疫毒素で同種枯渇させ、次いで、ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子および選択マーカー（ΔＣＤ１９）を有するレトロウイルス上清で形質導入した；ΔＣＤ１９は、免疫磁性選択を介して＞９０％純度への富化を可能にした。
細胞治療製品の生成のためのプロトコルの一例を、本明細書で提供する。
（原材料）
末梢血の２４０ｍｌまで（２回の収集にて）を、確立されたプロトコルに従って移植ドナーから得た。場合によっては、ドナーおよびレシピエントのサイズに依存して、白血球除去を行って、十分なＴ細胞を単離した。１０ｃｃ～３０ｃｃの血液をまた、レシピエントから採血し、それを使用して刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｃｅｌｌ）として使用されるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞株を生成した。場合によっては、医療履歴および／またはＢ細胞数が低いという表示に依存して、ＬＣＬを、適切な第１度近親者（例えば、親、きょうだい、もしくは子孫）の末梢血単核球を使用して生成した。
末梢血の２４０ｍｌまで（２回の収集にて）を、確立されたプロトコルに従って移植ドナーから得た。場合によっては、ドナーおよびレシピエントのサイズに依存して、白血球除去を行って、十分なＴ細胞を単離した。１０ｃｃ～３０ｃｃの血液をまた、レシピエントから採血し、それを使用して刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｃｅｌｌ）として使用されるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞株を生成した。場合によっては、医療履歴および／またはＢ細胞数が低いという表示に依存して、ＬＣＬを、適切な第１度近親者（例えば、親、きょうだい、もしくは子孫）の末梢血単核球を使用して生成した。
（同種枯渇細胞の生成）
同種枯渇細胞を、本明細書で示されるように移植ドナーから生成した。健常ドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、無血清培地（ＡＩＭ Ｖ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中４０：１のレスポンダー対刺激物質比において、照射したレシピエントのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）とともに共培養した。７２時間後、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞を、ＲＦＴ５－ＳＭＰＴ－ｄｇＡ免疫毒素中での一晩のインキュベーションによって、共培養物から枯渇させた。同種枯渇を、その残りのＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が＜１％であり、３Ｈ－チミジン取り込みによる残りの増殖が＜１０％であった場合に、適切であるとみなす。
同種枯渇細胞を、本明細書で示されるように移植ドナーから生成した。健常ドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、無血清培地（ＡＩＭ Ｖ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中４０：１のレスポンダー対刺激物質比において、照射したレシピエントのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）とともに共培養した。７２時間後、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞を、ＲＦＴ５－ＳＭＰＴ－ｄｇＡ免疫毒素中での一晩のインキュベーションによって、共培養物から枯渇させた。同種枯渇を、その残りのＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が＜１％であり、３Ｈ－チミジン取り込みによる残りの増殖が＜１０％であった場合に、適切であるとみなす。
（レトロウイルス生成）
レトロウイルスプロデューサー株クローンを、ｉＣａｓｐ９－ＣＤ１９構築物のために生成した。このプロデューサーのマスター細胞バンクもまた、生成した。このマスター細胞バンクの試験を行って、複製能のあるレトロウイルスの生成およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなどによる感染を除外した。このプロデューサー株を、コンフルエントになるまで成長させ、上清を採取し、濾過し、アリコートに分け、急速凍結し、－８０℃で貯蔵した。さらなる試験を、レトロウイルス上清の全てのバッチに対して行って、プロトコルに従って、複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ）を除外し、分析証明書を発行した。
レトロウイルスプロデューサー株クローンを、ｉＣａｓｐ９－ＣＤ１９構築物のために生成した。このプロデューサーのマスター細胞バンクもまた、生成した。このマスター細胞バンクの試験を行って、複製能のあるレトロウイルスの生成およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなどによる感染を除外した。このプロデューサー株を、コンフルエントになるまで成長させ、上清を採取し、濾過し、アリコートに分け、急速凍結し、－８０℃で貯蔵した。さらなる試験を、レトロウイルス上清の全てのバッチに対して行って、プロトコルに従って、複製能のあるレトロウイルス（ＲＣＲ）を除外し、分析証明書を発行した。
（同種枯渇細胞の形質導入）
同種枯渇Ｔリンパ球を、フィブロネクチンを使用して形質導入した。プレートまたはバッグを、組換えフィブロネクチンフラグメントＣＨ－２９６（ＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎＴＭ， Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ， Ｏｔｓｕ， Ｊａｐａｎ）でコーティングした。ウイルスを、コーティングしたプレートまたはバッグ中でプロデューサー上清をインキュベートすることによってレトロネクチンに結合させた。次いで、細胞を、ウイルスコーティングしたプレートまたはバッグに移した。形質導入後、同種枯渇Ｔ細胞を、プロトコルに従って、これらにＩＬ－２を１週間に２回供給して増殖させて十分な細胞数に到達させた。
同種枯渇Ｔリンパ球を、フィブロネクチンを使用して形質導入した。プレートまたはバッグを、組換えフィブロネクチンフラグメントＣＨ－２９６（ＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎＴＭ， Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ， Ｏｔｓｕ， Ｊａｐａｎ）でコーティングした。ウイルスを、コーティングしたプレートまたはバッグ中でプロデューサー上清をインキュベートすることによってレトロネクチンに結合させた。次いで、細胞を、ウイルスコーティングしたプレートまたはバッグに移した。形質導入後、同種枯渇Ｔ細胞を、プロトコルに従って、これらにＩＬ－２を１週間に２回供給して増殖させて十分な細胞数に到達させた。
（ＣＤ１９免疫磁性選択）
ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）で標識し、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動化選択デバイスで選択する。臨床での注入に必要とされる細胞数に依存して、細胞を、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択後に凍結保存するか、またはＩＬ－２でさらに増殖させて形質導入後の６日目または８日目に凍結保存するかのいずれかを行った。
ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体に結合体化した常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）で標識し、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動化選択デバイスで選択する。臨床での注入に必要とされる細胞数に依存して、細胞を、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択後に凍結保存するか、またはＩＬ－２でさらに増殖させて形質導入後の６日目または８日目に凍結保存するかのいずれかを行った。
（凍結）
細胞のアリコートを、ＦＤＡによる最終リリース試験のために必要とされるとおりの形質導入効率、同一性、表現型および微生物学的培養を試験するために取り出した。この細胞を、プロトコルに従って投与する前に、凍結保存した。
細胞のアリコートを、ＦＤＡによる最終リリース試験のために必要とされるとおりの形質導入効率、同一性、表現型および微生物学的培養を試験するために取り出した。この細胞を、プロトコルに従って投与する前に、凍結保存した。
（研究薬）
（ＲＦＴ５－ＳＭＰＴ－ｄｇＡ）
ＲＦＴ５－ＳＭＰＴ－ｄｇＡは、ヘテロ－－二官能性架橋剤［Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル－アルファ－メチル－ｄ－（２－ピリジルチオ）トルエン］（ＳＭＰＴ）を介して化学的に脱グリコシル化したリシンＡ鎖（ｄｇＡ）に結合体化したマウスＩｇＧ１ 抗ＣＤ２５（ＩＬ－２レセプターアルファ鎖）である。ＲＦＴ５－ＳＭＰＴ－ｄｇＡを、０．５ｍｇ／ｍｌの滅菌溶液として製剤化する。
（ＲＦＴ５－ＳＭＰＴ－ｄｇＡ）
ＲＦＴ５－ＳＭＰＴ－ｄｇＡは、ヘテロ－－二官能性架橋剤［Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル－アルファ－メチル－ｄ－（２－ピリジルチオ）トルエン］（ＳＭＰＴ）を介して化学的に脱グリコシル化したリシンＡ鎖（ｄｇＡ）に結合体化したマウスＩｇＧ１ 抗ＣＤ２５（ＩＬ－２レセプターアルファ鎖）である。ＲＦＴ５－ＳＭＰＴ－ｄｇＡを、０．５ｍｇ／ｍｌの滅菌溶液として製剤化する。
（合成ホモ二量体化剤ＡＰ１９０３）
作用機構：ＡＰ１９０３誘導性細胞死は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）由来の薬物結合ドメインに融合されたヒト（カスパーゼ－９プロテイン）レセプター（これは、アポトーシス細胞死をシグナル伝達する）の細胞内部分を含むキメラタンパク質を発現させることによって達成される。このキメラタンパク質は、ＦＫＢＰドメインを架橋し、カスパーゼシグナル伝達およびアポトーシスを開始するＡＰ１９０３の投与まで細胞内で静止状態のままである。
作用機構：ＡＰ１９０３誘導性細胞死は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）由来の薬物結合ドメインに融合されたヒト（カスパーゼ－９プロテイン）レセプター（これは、アポトーシス細胞死をシグナル伝達する）の細胞内部分を含むキメラタンパク質を発現させることによって達成される。このキメラタンパク質は、ＦＫＢＰドメインを架橋し、カスパーゼシグナル伝達およびアポトーシスを開始するＡＰ１９０３の投与まで細胞内で静止状態のままである。
毒物学：ＡＰ１９０３は、ＦＤＡによって臨床試験用の新医薬品（ＩＮＤ）として評価されており、フェーズＩ臨床安全性研究を成功裡に終えた。ＡＰＩ９０３を０．０１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇ 用量範囲にわたって投与した場合に、有意な有害作用は注記されなかった。
薬理学／薬物動態：患者に、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を、２時間注入として（０．０１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇ用量範囲にわたって１０ｎｇ／ｍＬ～１２７５ｎｇ／ｍＬの血漿濃度を示し、血漿レベルは、投与後０．５時間および２時間で最大から１８％および７％へと低下するという、公開されたＰｋデータに基づいて）与えた。
ヒトにおける副作用プロファイル：志願者でのフェーズ１研究の間には、重篤な有害事象は起こらなかった。有害事象の発生率は、各処置後に非常に低く、全ての有害事象は、重症度が軽度であった。唯一の有害事象は、おそらくＡＰ１９０３に関連していると考えられた。これは、１．０ｍｇ／ｋｇ ＡＰ１９０３投与量で１名の志願者について「顔面紅潮」として示された血管拡張というエピソードであった。この事象は、注入の開始後３分で起こり、３２分の継続後に消散した（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）。この研究の間に報告された全ての他の有害事象は、研究者によって研究薬には関連しないかまたは関連性がありそうもない（ｉｍｐｒｏｂａｂｌｅ）と考えられた。これらの事象は、胸痛、インフルエンザ症候群、口臭、頭痛、注射部位疼痛、血管拡張、咳の増加、鼻炎、発疹、歯肉出血、および斑状出血を含んだ。
グレード１ ＧＶＨＤを発症している患者を、２時間注入として、０．４ｍｇ／ｋｇ ＡＰ１９０３で処置した。患者グレード１ ＧＶＨＤへのＡＰ１９０３の投与プロトコルを、以下のとおり確立した。同種枯渇Ｔ細胞の注入後にＧｖＨＤを発症している患者を生検して診断を確定し、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を２時間の注入として与える。グレードＩ ＧＶＨＤを有する患者は、他の治療を最初に何も受けなかったが、彼らがＧｖＨＤの進行を示した場合、従来のＧｖＨＤ治療を、施設のガイドラインに従って投与した。グレード２～４ ＧＶＨＤを発症している患者に、施設のガイドラインに従って、ＡＰ１９０３二量体化薬物に加えて、標準的な全身免疫抑制治療を施した。
調製および注入の指示：注射用ＡＰ１９０３を、３ｍｌ バイアル中、５ｍｇ／ｍｌの濃度で２．３３ｍｌの濃縮溶液（すなわち、１１．６６ｍｇ／バイアル）として得る。ＡＰ１９０３はまた、例えば、８ｍｇ／バイアル８ｍｇ／ｍｌで提供され得る。投与前に、その計算した用量を、注入用０．９％ 生理食塩水中で１００ｍＬへと希釈した。１００ｍｌ容積中の注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を、非ＤＥＨＰ、非エチレンオキシド滅菌注入セットおよび注入ポンプを使用して、２時間かけてＩＶ注入を介して投与した。
図２４に示されるｉＣａｓｐ９自殺遺伝子発現構築物（例えば、ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＡＣＤ１９）は、切断可能な２Ａ様配列を介して短縮型ヒトＣＤ１９（ＡＣＤ１９）へと連結した誘導性カスパーゼ－９（ｉＣａｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカーを介してヒトカスパーゼ－９（ＣＡＳＰ９； ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１２２９）へと接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２； ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨ００２ ８１８）を含む。このＦ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３に対するＦＫＢＰ１２の結合親和性を増大させ得る。カスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）は、ヒトカスパーゼ－９配列から欠失されており、その生理学的機能は、ＦＫＢＰ１２によって置き換えられている。ＣＡＲＤをＦＫＢＰ１２で置き換えると、導入遺伝子発現および機能が増大する。上記２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の１８アミノ酸のペプチドをコードし、それはグリシンと末端プロリン残基との間で＞９９％切断を媒介し、ｉＣａｓｐ９のＣ末端において１７個の余分なアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端において１個の余分なプロリン残基を生じる。ΔＣＤ１９は、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で短縮された全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１７７０）からなり、これは、細胞質内ドメインを２４２から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化の潜在的部位である全ての保存されたチロシン残基を除去する。
（インビボ研究）
３名の患者に、ハプロ－ＣＤ３４＋幹細胞移植（ＳＣＴ）後に、約１×１０６ 細胞／ｋｇ～約３×１０６ 細胞／ｋｇの間の用量レベルでｉＣａｓｐ９＋ Ｔ細胞を与えた。
３名の患者に、ハプロ－ＣＤ３４＋幹細胞移植（ＳＣＴ）後に、約１×１０６ 細胞／ｋｇ～約３×１０６ 細胞／ｋｇの間の用量レベルでｉＣａｓｐ９＋ Ｔ細胞を与えた。
表２：患者の特性および臨床転帰
注入したＴ細胞を、図２７、２８および２９において図示したように、注入後７日目の早さで、フローサイトメトリー（ＣＤ３＋ ΔＣＤ１９＋）またはｑＰＣＲによってインビボで検出し、最大倍数増殖は１７０±５（注入後２９±９日目）であった。２名の患者は、グレードＩ／ＩＩ ａＧＶＨＤを発症し（図３１～３２を参照のこと）、ＡＰ１９０３投与は、注入の３０分以内に、ＣＤ３＋ ΔＣＤ１９＋細胞の＞９０％除去（図３０、３３および３４を参照のこと）（２４時間以内にさらなる対数減少を伴う）、および２４時間以内の皮膚および肝臓のａＧｖＨＤの消散を引き起こし、ｉＣａｓｐ９導入遺伝子がインビボで機能することを示した。患者２に関しては、処置後２４時間以内での皮膚発疹の消失が観察された。
エキソビボ実験は、このデータを確認した。さらに、残っている同種枯渇Ｔ細胞は、増殖でき、ウイルス（ＣＭＶ）および真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に対して反応性であった（ＩＦＮ－γ生成）。これらのインビボ研究は、二量体化薬物の単一用量が、ＧｖＨＤを引き起こすＴ細胞の部分集団を減少または排除し得るが、ウイルス特異的ＣＴＬ（これは、次いで、再増殖し得る）を残し得ることを見出した。
（免疫再形成）
患者細胞および試薬の利用可能性に依存して、免疫再形成研究（免疫表現型決定、Ｔ細胞およびＢ細胞機能）は、移植後一連の間隔で得られ得る。ｉカスパーゼ形質導入同種枯渇Ｔ細胞から生じる免疫再形成を測定するいくつかのパラメータを分析する。この分析は、全リンパ球カウント、Ｔ細胞およびＣＤ１９ Ｂ細胞の数の反復測定、ならびにＴ細胞サブセット（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、アルファ／ベータおよびガンマ／デルタＴ細胞レセプター）のＦＡＣＳ分析を含む。患者Ｔ細胞の利用可能性に依存して、調節性Ｔ細胞マーカー（例えば、ＣＤ４１，ＣＤ２５１およびＦｏｘＰ３）もまた分析する。可能な場合には、注入の４時間後、１ヶ月の間週に１回、月に１回×９ヶ月間、および次に１年でおよび２年で、およそ１０～６０ｍｌの患者血液を採取する。採取される血液量は、レシピエントのサイズに依存し、いずれの１回の採血時にも（臨床上のケアおよび研究評価のために血液採取は可能である）合計で１～２ｃｃ／ｋｇを超えない。
患者細胞および試薬の利用可能性に依存して、免疫再形成研究（免疫表現型決定、Ｔ細胞およびＢ細胞機能）は、移植後一連の間隔で得られ得る。ｉカスパーゼ形質導入同種枯渇Ｔ細胞から生じる免疫再形成を測定するいくつかのパラメータを分析する。この分析は、全リンパ球カウント、Ｔ細胞およびＣＤ１９ Ｂ細胞の数の反復測定、ならびにＴ細胞サブセット（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、アルファ／ベータおよびガンマ／デルタＴ細胞レセプター）のＦＡＣＳ分析を含む。患者Ｔ細胞の利用可能性に依存して、調節性Ｔ細胞マーカー（例えば、ＣＤ４１，ＣＤ２５１およびＦｏｘＰ３）もまた分析する。可能な場合には、注入の４時間後、１ヶ月の間週に１回、月に１回×９ヶ月間、および次に１年でおよび２年で、およそ１０～６０ｍｌの患者血液を採取する。採取される血液量は、レシピエントのサイズに依存し、いずれの１回の採血時にも（臨床上のケアおよび研究評価のために血液採取は可能である）合計で１～２ｃｃ／ｋｇを超えない。
（形質導入された同種枯渇されたＴ細胞の持続性および安全性）
以下の分析もまた末梢血サンプルに対して行って、研究予定表に示された時点で形質導入されたＴ細胞の機能、持続性および安全性をモニターした：
・トランスジェニック細胞の存在を検出するためのフローサイトメトリーによる表現型決定。
・ＰＣＲによるＲＣＲ試験。
・レトロウイルス組み込み体を検出するための定量的リアルタイムＰＣＲ。
ＰＣＲによるＲＣＲ試験は、研究前、３ヶ月、６ヶ月、および１２ヶ月で行われ、その後、合計１５年間にわたって毎年行われる。組織、細胞および血清サンプルを、ＦＤＡによって要求されるように、ＲＣＲの将来的な研究における使用のために保管する。
以下の分析もまた末梢血サンプルに対して行って、研究予定表に示された時点で形質導入されたＴ細胞の機能、持続性および安全性をモニターした：
・トランスジェニック細胞の存在を検出するためのフローサイトメトリーによる表現型決定。
・ＰＣＲによるＲＣＲ試験。
・レトロウイルス組み込み体を検出するための定量的リアルタイムＰＣＲ。
ＰＣＲによるＲＣＲ試験は、研究前、３ヶ月、６ヶ月、および１２ヶ月で行われ、その後、合計１５年間にわたって毎年行われる。組織、細胞および血清サンプルを、ＦＤＡによって要求されるように、ＲＣＲの将来的な研究における使用のために保管する。
（統計分析および停止規則）
ＭＴＤを、適格な症例のうちの多くても２５％においてグレードＩＩＩ／ＩＶの急性ＧＶＨＤを引き起こす用量であると定義する。その決定は、サイズ２のコホートを有するロジスティックモデルを使用する改変連続再評価法（ＣＲＭ）に基づく。３つの用量群（すなわち、１×１０６、３×１０６、１×１０７）が評価され、毒性の事前確率が、それぞれ、１０％、１５％、および３０％と予測されている。提唱されるＣＲＭデザインは、各コホートにおいて１名より多くの被験体を集め、用量漸増を１用量レベル以下にまで制限し、非形質導入細胞に関して安全であると示された最低用量レベルで患者登録を開始することによって、元のＣＲＭに対する改変を使用する。最低用量コホートでの毒性転帰は、用量－毒性曲線を更新するために使用される。次の患者コホートを、２５％という目標確率に最も近い毒性の関連する確率（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）を有する用量レベルへと割り当てる。このプロセスは、少なくとも１０名の患者がこの用量漸増研究へと集められるまで継続する。患者の利用可能性に依存して、１８名以下の患者がフェーズＩ治験へと登録され得るか、または６名の患者が最新ＭＴＤにおいて処理されるまで登録され得る。最終ＭＴＤは、これら終結点において目標毒性率に最も近い確率を有する用量である。
シミュレーションを行って、その提唱されるデザインの操作特性を決定し、これと、標準的な３＋３用量漸増デザインとを比較した。提唱されるデザインは、ＭＴＤとして適切な用量レベルを宣言するより高い確率に基づいてＭＴＤのよりよい推定値（ｅｓｔｉｍａｔｅ）を提供し、より低いかつおそらく無効な用量レベルで集められたより少数の患者を提供し、治験に必要とされる患者平均総数がより低く維持された。低い用量－毒性曲線（ｓｈａｌｌｏｗ ｄｏｓｅ－ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｃｕｒｖｅ）は、本明細書で提唱される用量の範囲にわたって予測され、従って、促進される用量漸増は、患者の安全を含むことなく行われ得る。行われるシミュレーションは、改変ＣＲＭデザインが、標準的デザインと比較した場合に、総毒性のより大きな平均数を招かないことを示す（総毒性は、それぞれ、１．９および２．１に等しい）。
同種枯渇されたＴ細胞の最初の注入後の４５日以内に起こるグレードＩＩＩ／ＩＶ ＧＶＨＤは、その後のコホートに関して推奨される用量を決定するために、ＣＲＭ計算へと考慮される。患者の毒性転帰のリアルタイムモニタリングを、用量－毒性曲線の推定を実行し、予め指定された用量レベルのうちの１つを使用して次の患者コホートのための用量レベルを決定するために研究の間に行う。
処置を制限する毒性としては以下が挙げられる：
注入に関連するグレード４の反応、
ＴＣ－Ｔの注入後３０日以内に起こる移植不全（少なくとも１４日間にわたって持続する成長因子治療に不応性の、異なる日での３回連続測定に関して＜５００ｍｍ３へのＡＮＣのその後の減少として定義される）、
注入後３０日以内に起こるグレード４非造血および非感染性の有害事象、
ＴＣ－Ｔの注入後４５日までのグレード３～４の急性ＧＶＨＤ、
注入後３０日以内に起こる処置関連死。
処置を制限する毒性としては以下が挙げられる：
注入に関連するグレード４の反応、
ＴＣ－Ｔの注入後３０日以内に起こる移植不全（少なくとも１４日間にわたって持続する成長因子治療に不応性の、異なる日での３回連続測定に関して＜５００ｍｍ３へのＡＮＣのその後の減少として定義される）、
注入後３０日以内に起こるグレード４非造血および非感染性の有害事象、
ＴＣ－Ｔの注入後４５日までのグレード３～４の急性ＧＶＨＤ、
注入後３０日以内に起こる処置関連死。
ＧＶＨＤ率を、安全性および毒性の他の尺度とともに、記述統計を使用してまとめる。同様に、記述統計を、グレード１より大きいＧＶＨＤに起因してＡＰ１９０３を受ける患者における臨床的応答および生物学的応答をまとめるために計算する。
ｉカスパーゼ形質導入同種枯渇Ｔ細胞から生じる免疫再形成を測定するいくつかのパラメーターを、分析する。これらは、全リンパ球数、ＴおよびＣＤ１９ Ｂ細胞数の反復測定、ならびにＴ細胞サブセット（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、α／βおよびγ／δＴ細胞レセプター）のＦＡＣＳ分析を含む。十分なＴ細胞が分析用に残っている場合、Ｔ制御性細胞マーカー（例えば、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＦｏｘＰ３）もまた分析する。各被験体を、上記で示されるように注入前および注入後の複数の時点で測定する。
患者群全体における、および用量群による、ならびに測定時間によるこれらパラメーターの記述要約を示す。患者内の経時的な測定を表す成長曲線を作成して、免疫再形成の一般的パターンを可視化する。ｉＣａｓｐ９陽性細胞の割合もまた、各時点でまとめる。注入前と比較して経時的なこれらエンドポイントでの変化のペアワイズ比較を、対応のあるｔ検定またはウィルコクソンの符合順位検定を使用して行う。
ランダム係数モデルを使用する各反復測定した免疫再形成パラメーターの縦断的分析を行う。縦断的分析は、患者１名あたりの免疫再形成のモデルパターンの構築を可能にしながら、患者内の種々の切片および傾きを可能にする。上記患者が受ける異なる用量レベルを説明するためにモデルにおいて独立変数としての用量レベルもまた、使用する。免疫機能において経時的に有意な改善があるかどうかの検定、および傾きの推定値およびその標準誤差に基づくこれら改善の大きさの推定は、本明細書で示されるモデルを使用して可能である。ＣＴＬの異なる用量レベルにわたる免疫再形成の率における差異の任意の指標の評価はまた、行われる。同一性リンクを有する正規分布は、これらモデルにおいて利用され、ＳＡＳ ＭＩＸＥＤ手順を使用して実装される。免疫再形成パラメーターの正規性の仮定を評価し、正規性を達成するために必要であれば、変換（例えば、対数、平方根）を行い得る。
上記に示されるものに類似のストラテジーを使用して、Ｔ細胞生存、拡大および持続性の速度論を評価することができる。絶対Ｔ細胞数とマーカー遺伝子陽性細胞数との比を決定し、縦断的に経時的にモデル化する。その傾きの正の推定値は、免疫回復のためのＴ細胞の寄与が増大していることを示す。ｉＣａｓｐ９ Ｔ細胞のウイルス特異的免疫を、縦断的モデルを使用してエキソビボ刺激ウイルス特異的ＣＴＬに基づいて、ＩＦＮγを放出するＴ細胞数の分析によって評価する。ＥＢＶ、ＣＭＶおよびアデノウイルスの免疫評価の分析のために別個のモデルを作成する。
最後に、患者コホート全体において、全体的および疾患なしの生存を、カプラン・マイヤーの積・極限法（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔ－ｌｉｍｉｔ ｍｅｔｈｏｄ）を使用してまとめる。移植後１００日間および１年間で生存しかつ疾患のない患者の割合を、カプラン・マイヤー曲線から概算し得る。
結論として、ハプロＣＤ３４＋ ＳＣＴ後のｉＣａｓｐ９＋ 同種枯渇Ｔ細胞の追加戻しは、機能的ドナーリンパ球のインビボでの有意な拡大およびａＧｖＨＤの消散とともに同種反応性Ｔ細胞の迅速なクリアランスを可能にする。
（実施例４：インビボでのＴ細胞同種枯渇）
実施例１～３において提供されるプロトコルはまた、インビボでのＴ細胞同種枯渇を提供するために改変され得る。このアプローチを急性（ａｃｔｕｔｅ）ＧｖＨＤなしの免疫再形成から利益を受け得る被験体のより大きな群へと拡げるために、Ｔ細胞枯渇のインビボ方法を提供することによってこのプロトコルを単純化し得る。処置前の同種枯渇方法では、本明細書で論じられるように、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞株を、レシピエントからまず調製する。次いで、これは、同種抗原提示細胞として作用する。この手順は８週間かかり得、広範囲に前処置した悪性腫瘍を有する被験体では、特に、彼らの最初の治療の構成成分としてリツジシマブを彼らが受けた場合には、失敗する可能性がある。その後、ドナーＴ細胞を、レシピエントＥＢＶ－ＬＣＬと共培養し、その同種反応性Ｔ細胞（これは活性化抗原ＣＤ２５を発現する）を、その後、ＣＤ２５－リシン結合体化モノクローナル抗体で処理する。この手順は、各被験体に関する実験室作業にさらに多くの日数がかかり得る。
実施例１～３において提供されるプロトコルはまた、インビボでのＴ細胞同種枯渇を提供するために改変され得る。このアプローチを急性（ａｃｔｕｔｅ）ＧｖＨＤなしの免疫再形成から利益を受け得る被験体のより大きな群へと拡げるために、Ｔ細胞枯渇のインビボ方法を提供することによってこのプロトコルを単純化し得る。処置前の同種枯渇方法では、本明細書で論じられるように、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞株を、レシピエントからまず調製する。次いで、これは、同種抗原提示細胞として作用する。この手順は８週間かかり得、広範囲に前処置した悪性腫瘍を有する被験体では、特に、彼らの最初の治療の構成成分としてリツジシマブを彼らが受けた場合には、失敗する可能性がある。その後、ドナーＴ細胞を、レシピエントＥＢＶ－ＬＣＬと共培養し、その同種反応性Ｔ細胞（これは活性化抗原ＣＤ２５を発現する）を、その後、ＣＤ２５－リシン結合体化モノクローナル抗体で処理する。この手順は、各被験体に関する実験室作業にさらに多くの日数がかかり得る。
上記プロセスは、同種枯渇のインビボ方法を使用し、二量体化薬物による同種反応性Ｔ細胞の観察された迅速なインビボ枯渇を利用し、非刺激であるが、ウイルス／真菌反応性Ｔ細胞を残しておくことによって、単純化され得る。
グレードＩまたはこれより高い急性ＧｖＨＤの発生がある場合、単一用量の二量体化薬物が投与される（例えば、２時間の静脈内注入として０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３という用量で）。急性ＧｖＨＤが持続する場合、さらに３用量までの二量体化薬物が４８時間の間隔で投与され得る。グレードＩＩまたはこれより高い急性ＧｖＨＤを有する被験体では、これらのさらなる用量の二量体化薬物がステロイドと組み合わされ得る。二量体化剤に対してグレードＩＩＩまたはＩＶの反応に起因して二量体化剤のさらなる用量を受けることができない持続性のＧＶＨＤを有する患者に関しては、この患者は、０または１用量いずれかの二量体化剤の後に、ステロイドのみで処置され得る。
（治療用Ｔ細胞の生成）
２４０ｍｌ（２回の収集で）までの末梢血を、獲得した同意に従って移植ドナーから得る。必要であれば、白血球除去療法（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）を使用して、十分なＴ細胞を得る；（幹細胞動員前または最後のＧ－ＣＳＦ投与の７日後のいずれかに）。１０～３０ｍｌの余分の血液をまた集めて、肝炎およびＨＩＶなどの感染性疾患について試験し得る。
２４０ｍｌ（２回の収集で）までの末梢血を、獲得した同意に従って移植ドナーから得る。必要であれば、白血球除去療法（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）を使用して、十分なＴ細胞を得る；（幹細胞動員前または最後のＧ－ＣＳＦ投与の７日後のいずれかに）。１０～３０ｍｌの余分の血液をまた集めて、肝炎およびＨＩＶなどの感染性疾患について試験し得る。
末梢血単核細胞を、抗ヒトＣＤ３抗体（例えば、ＯｒｔｈｏｔｅｃｈまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ製）を使用して０日目に活性化し、２日目に組換えヒトインターロイキン－２（ｒｈＩＬ－２）の存在下で拡大する。ＣＤ３抗体活性化Ｔ細胞を、組換えフィブロネクチンフラグメントＣＨ－２９６（ＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎＴＭ， Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ， Ｏｔｓｕ， Ｊａｐａｎ）でコーティングしたフラスコまたはプレートでｉカスパーゼ－９レトロウイルスベクターによって形質導入する。ウイルスを、レトロネクチンコーティングしたプレートまたはフラスコ中でプロデューサー上清をインキュベートすることによって、レトロネクチンへと結合させる。次いで、細胞を、ウイルスコーティングした組織培養デバイスへと移す。形質導入後、Ｔ細胞を、プロトコルに従って、これらにｒｈＩＬ－２を１週間に２回供給することによって拡大して十分数の細胞に到達させる。
注入されたＴ細胞の大部分が自殺遺伝子を有することを確実にするために、選択マーカー、短縮型ヒトＣＤ１９（ΔＣＤ１９）および市販の選択デバイスを使用して、その形質導入された細胞を＞９０％純度になるように選択し得る。ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を、形質導入の４日後に行い得る。細胞を、モノクローナルマウス抗－ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）に結合体化した常磁性マイクロビーズで標識し、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ Ｐｌｕｓ自動化選択デバイスで選択する。臨床的注入に必要とされる細胞数に依存して、細胞は、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択後に低温貯蔵されるかまたはＩＬ－２でさらに拡大されて十分な細胞が拡大されたらすぐに低温貯蔵される（生成物開始から１４日目まで）かのいずれかであり得る。
細胞のアリコートを、ＦＤＡによる最終リリース試験のために必要とされる場合、形質導入効率、同一性、表現型、自律的成長および微生物学的検査の試験のために取り出し得る。上記細胞を、投与前に低温貯蔵する。
（Ｔ細胞の投与）
形質導入されたＴ細胞を、幹細胞移植後から、例えば、３０日～１２０日の間に患者に投与する。上記低温貯蔵したＴ細胞を解凍し、ノーマルセーラインを用いカテーテルラインを通して注入する。小児に関しては、体重によっては前投薬の薬が投与される。細胞の用量は、例えば、約１×１０４ 細胞／ｋｇ～１×１０８ 細胞／ｋｇ、例えば、約１×１０５ 細胞／ｋｇ～１×１０７ 細胞／ｋｇ、約１×１０６ 細胞／ｋｇ～５×１０６
細胞／ｋｇ、約１×１０４ 細胞／ｋｇ～５×１０６ 細胞／ｋｇ、例えば、約１×１０４、約１×１０５、約２×１０５、約３×１０５、約５×１０５、６×１０５、約７×１０５、約８×１０５、約９×１０５、約１×１０６、約２×１０６、約３×１０６、約４×１０６、または約５×１０６ 細胞／ｋｇの範囲に及び得る。
形質導入されたＴ細胞を、幹細胞移植後から、例えば、３０日～１２０日の間に患者に投与する。上記低温貯蔵したＴ細胞を解凍し、ノーマルセーラインを用いカテーテルラインを通して注入する。小児に関しては、体重によっては前投薬の薬が投与される。細胞の用量は、例えば、約１×１０４ 細胞／ｋｇ～１×１０８ 細胞／ｋｇ、例えば、約１×１０５ 細胞／ｋｇ～１×１０７ 細胞／ｋｇ、約１×１０６ 細胞／ｋｇ～５×１０６
細胞／ｋｇ、約１×１０４ 細胞／ｋｇ～５×１０６ 細胞／ｋｇ、例えば、約１×１０４、約１×１０５、約２×１０５、約３×１０５、約５×１０５、６×１０５、約７×１０５、約８×１０５、約９×１０５、約１×１０６、約２×１０６、約３×１０６、約４×１０６、または約５×１０６ 細胞／ｋｇの範囲に及び得る。
（ＧｖＨＤの処置）
グレード≧１の急性ＧＶＨＤを発生させる患者を、２時間の注入として０．４ｍｇ／ｋｇ ＡＰ１９０３で処置する。注入用ＡＰ１９０３は、例えば、３ｍｌバイアル中２．３３ｍｌの濃縮溶液として、５ｍｇ／ｍｌの濃度（すなわち、１１．６６ｍｇ／バイアル）で提供され得る。ＡＰ１９０３はまた、異なるサイズのバイアルで提供され得、例えば、５ｍｇ／ｍｌで８ｍｌが提供され得る。投与前に、計算された用量を、注入用の０．９％
ノーマルセーラインで１００ｍＬへと希釈する。１００ｍｌ体積での注入用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を、非ＤＥＨＰ、非エチレンオキシド滅菌注入セットおよび注入ポンプを使用して、２時間にわたるＩＶ注入を介して投与し得る。
グレード≧１の急性ＧＶＨＤを発生させる患者を、２時間の注入として０．４ｍｇ／ｋｇ ＡＰ１９０３で処置する。注入用ＡＰ１９０３は、例えば、３ｍｌバイアル中２．３３ｍｌの濃縮溶液として、５ｍｇ／ｍｌの濃度（すなわち、１１．６６ｍｇ／バイアル）で提供され得る。ＡＰ１９０３はまた、異なるサイズのバイアルで提供され得、例えば、５ｍｇ／ｍｌで８ｍｌが提供され得る。投与前に、計算された用量を、注入用の０．９％
ノーマルセーラインで１００ｍＬへと希釈する。１００ｍｌ体積での注入用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を、非ＤＥＨＰ、非エチレンオキシド滅菌注入セットおよび注入ポンプを使用して、２時間にわたるＩＶ注入を介して投与し得る。
他の方法は、例えば、本明細書中の実施例１～３において提供されるとおりの臨床的治療および評価に従い得る。
（実施例５：ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子を使用して、間葉系ストローマ細胞治療の安全性を改善する）
間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）は、数百名の患者に注入され、今日まで報告された有害副作用は最小限である。ＭＳＣは、疾患の処置において使用されてきたために、追跡調査が限定されたものであり比較的短期間であることに起因して、長期間の副作用は知られていない。なぜならＭＳＣは、疾患の処置において使用されてきたからである。いくつかの動物モデルは、副作用が潜在的に存在し、従って、使用されるＭＳＣの成長および生存にわたってコントロールを可能にするシステムが治療上望ましいことを示した。本明細書で示される誘導性カスパーゼ－９自殺スイッチ発現ベクター構築物を、インビボおよびインビトロでＭＳＣを排除するための方法として調査した。
間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）は、数百名の患者に注入され、今日まで報告された有害副作用は最小限である。ＭＳＣは、疾患の処置において使用されてきたために、追跡調査が限定されたものであり比較的短期間であることに起因して、長期間の副作用は知られていない。なぜならＭＳＣは、疾患の処置において使用されてきたからである。いくつかの動物モデルは、副作用が潜在的に存在し、従って、使用されるＭＳＣの成長および生存にわたってコントロールを可能にするシステムが治療上望ましいことを示した。本明細書で示される誘導性カスパーゼ－９自殺スイッチ発現ベクター構築物を、インビボおよびインビトロでＭＳＣを排除するための方法として調査した。
（材料および方法）
（ＭＳＣ単離）
ＭＳＣを、健常ドナーから単離した。簡潔には、注入後廃棄される健常ドナー骨髄収集バッグおよびフィルターを、ＲＰＭＩ １６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）で洗浄し、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ アラニル－グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ユニット／ｍＬ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）が入った組織培養フラスコにプレーティングした。４８時間後、その上清を廃棄し、その細胞を、完全培養培地（ＣＣＭ）：１６．５％ ＦＢＳ、２ｍＭ アラニル－グルタミン、１００ユニット／ｍＬ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを有するα－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。細胞を、８０％ コンフルエント未満になるように成長させ、適切であれば低密度で再プレーティングした。
（ＭＳＣ単離）
ＭＳＣを、健常ドナーから単離した。簡潔には、注入後廃棄される健常ドナー骨髄収集バッグおよびフィルターを、ＲＰＭＩ １６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）で洗浄し、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ アラニル－グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ユニット／ｍＬ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）が入った組織培養フラスコにプレーティングした。４８時間後、その上清を廃棄し、その細胞を、完全培養培地（ＣＣＭ）：１６．５％ ＦＢＳ、２ｍＭ アラニル－グルタミン、１００ユニット／ｍＬ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを有するα－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。細胞を、８０％ コンフルエント未満になるように成長させ、適切であれば低密度で再プレーティングした。
（免疫表現型決定）
フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合体化ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１３３モノクローナル抗体を使用して、ＭＳＣを染色した。全ての抗体は、示されたものを除いてＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ－Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）製であった。適切なアイソタイプ適合抗体で標識したコントロールサンプルを、各実験に含めた。細胞を、４種の蛍光シグナルについて設定されたフィルタを備えた蛍光活性化セルソーティングＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。
フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合体化ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１３３モノクローナル抗体を使用して、ＭＳＣを染色した。全ての抗体は、示されたものを除いてＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ－Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）製であった。適切なアイソタイプ適合抗体で標識したコントロールサンプルを、各実験に含めた。細胞を、４種の蛍光シグナルについて設定されたフィルタを備えた蛍光活性化セルソーティングＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。
（インビトロでの分化研究）
脂肪細胞分化。 ＭＳＣ（７．５×１０４ 細胞）を、ＮＨ ＡｄｉｐｏＤｉｆｆ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）が入った、６ウェルプレートのウェルにプレーティングした。培地を、２１日間にわたって３日毎に交換した。細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％ ホルムアルデヒドで固定した後にＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ溶液（３：２比のイソプロパノールと水とで０．５％ ｗ／ｖ Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏを希釈することによって得た）で染色した。
脂肪細胞分化。 ＭＳＣ（７．５×１０４ 細胞）を、ＮＨ ＡｄｉｐｏＤｉｆｆ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）が入った、６ウェルプレートのウェルにプレーティングした。培地を、２１日間にわたって３日毎に交換した。細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％ ホルムアルデヒドで固定した後にＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ溶液（３：２比のイソプロパノールと水とで０．５％ ｗ／ｖ Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏを希釈することによって得た）で染色した。
骨形成分化。 ＭＳＣ（４．５×１０４ 細胞）を、ＮＨ ＯｓｔｅｏＤｉｆｆ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が入った、６ウェルプレートにプレーティングした。培地を、１０日間にわたって３日毎に交換した。細胞を、冷メタノールでの固定後に、製造業者の指示に従って、Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を使用してアルカリホスファターゼ活性に関して染色した。
軟骨芽細胞分化。 ２．５×１０５～５×１０５ 細胞を含むＭＳＣペレットを、１５ｍＬまたは１．５ｍＬ ポリプロピレンコニカルチューブの中で遠心分離することによって得、ＮＨ ＣｈｏｎｄｒｏＤｉｆｆ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で培養した。培地を、合計２４日間にわたって３日毎に交換した。細胞ペレットを、ＰＢＳ中の４％ ホルマリン中で固定し、慣用的パラフィン切片化のために処理した。切片をアルシアンブルーで、またはペプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｆｒｅｍｏｎｔ， ＣＡ）での抗原回復後にＩＩ型コラーゲンに関する間接免疫蛍光（マウス抗ＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体ＭＡＢ８８８７， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）を使用して染色した。
（ｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９レトロウイルス生成およびＭＳＣの形質導入）
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９（ｉＣａｓｐ－ΔＣＤ１９）レトロウイルスは、切断可能な２Ａ様配列を介して、短縮型ヒトＣＤ１９（ΔＣＤ１９）に連結されたｉＣａｓｐ９からなる。上記のように、ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカーを介してヒトカスパーゼ－９（その動員ドメイン（ＣＡＲＤ）は欠失されており、その機能は、ＦＫＢＰ１２によって置き換わっている）に接続されたＦ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）（その変異は、合成ホモ二量体化剤（ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３）に対するそのタンパク質の結合親和性を増大させる）である。
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９（ｉＣａｓｐ－ΔＣＤ１９）レトロウイルスは、切断可能な２Ａ様配列を介して、短縮型ヒトＣＤ１９（ΔＣＤ１９）に連結されたｉＣａｓｐ９からなる。上記のように、ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカーを介してヒトカスパーゼ－９（その動員ドメイン（ＣＡＲＤ）は欠失されており、その機能は、ＦＫＢＰ１２によって置き換わっている）に接続されたＦ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）（その変異は、合成ホモ二量体化剤（ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３）に対するそのタンパク質の結合親和性を増大させる）である。
２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸ペプチドをコードし、グリシンと末端プロリン残基との間で９９％超の切断を媒介して、翻訳の際のｉＣａｓｐ９とΔＣＤ１９との間の分離を確実にする。ΔＣＤ１９は、アミノ酸３３３で短縮され、リン酸化のための潜在的部位である全ての保存された細胞質内チロシン残基を除去したヒトＣＤ１９からなる。テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ－Ｖ）偽型レトロウイルスを生成する安定なＰＧ１３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ製品 ＃ＳＤ３４４４； ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）をＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９で一過性にトランスフェクトすることによって作製し、これによってＥｃｏ偽型レトロウイルスを得た。このＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏ偽型レトロウイルスで３回形質導入して、１細胞あたり複数のＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９プロウイルス組み込み体を含むプロデューサー株を生成した。単一細胞クローニングを行い、最高力価を生成するＰＧ１３クローンを拡大し、ベクター生成のために使用した。レトロウイルス上清を、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ アラニル－グルタミン、１００ユニット／ｍＬ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを有するＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、プロデューサー細胞株の培養を介して得た。レトロウイルスを含む上清を、最初の培養の４８時間後および７２時間後に集めた。形質導入のために、およそ２×１０４ ＭＳＣ／ｃｍ２を、６ウェルプレート、Ｔ７５またはＴ１７５フラスコの中のＣＭ中にプレーティングした。２４時間後、培地を、ポリブレン（最終濃度５μｇ／ｍＬ）と一緒に１０倍希釈したウイルス上清に置き換え、その細胞を、３７℃で５％ ＣＯ２中で４８時間にわたってインキュベートし、その後、細胞を完全培地中で維持した。
（細胞富化）
インビトロ実験のための誘導性ｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９陽性ＭＳＣ選択のために、レトロウイルスで形質導入したＭＳＣを、製造業者の指示に従って、抗ＣＤ１９（クローン４Ｇ７）で結合体化した磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ１９陽性細胞について富化した。細胞サンプルを、ＰＥ結合体化またはＡＰＣ結合体化ＣＤ１９（クローンＳＪ２５Ｃ１）抗体で染色して、細胞画分の純度を評価した。
インビトロ実験のための誘導性ｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９陽性ＭＳＣ選択のために、レトロウイルスで形質導入したＭＳＣを、製造業者の指示に従って、抗ＣＤ１９（クローン４Ｇ７）で結合体化した磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ１９陽性細胞について富化した。細胞サンプルを、ＰＥ結合体化またはＡＰＣ結合体化ＣＤ１９（クローンＳＪ２５Ｃ１）抗体で染色して、細胞画分の純度を評価した。
（インビトロでのアポトーシス研究）
未分化ＭＳＣ。 二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）（ＡＰ２０１８７； ＡＲＩＡＤ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を、完全培地中のｉＣａｓｐ９形質導入ＭＳＣ培養物へと５０ｎＭで添加した。アポトーシスを、細胞採取ならびにアネキシンＶ結合緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）中でのアネキシンＶ－ＰＥおよび７－ＡＡＤでの染色後に、ＦＡＣＳ分析によって２４時間後に評価した。コントロールｉＣａｓｐ９形質導入ＭＳＣを、ＣＩＤへの曝露なしで、培養物中で維持した。
未分化ＭＳＣ。 二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）（ＡＰ２０１８７； ＡＲＩＡＤ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を、完全培地中のｉＣａｓｐ９形質導入ＭＳＣ培養物へと５０ｎＭで添加した。アポトーシスを、細胞採取ならびにアネキシンＶ結合緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）中でのアネキシンＶ－ＰＥおよび７－ＡＡＤでの染色後に、ＦＡＣＳ分析によって２４時間後に評価した。コントロールｉＣａｓｐ９形質導入ＭＳＣを、ＣＩＤへの曝露なしで、培養物中で維持した。
分化ＭＳＣ。 形質導入したＭＳＣを、上記で示されるように分化させた。分化期間の最後に、ＣＩＤを、５０ｎＭで分化培地へと添加した。細胞を、上記で示されるように、研究されている組織に対して適切に染色し、対比染色（メチレンアズールまたはメチレンブルー）を使用して、核および細胞質形態を評価した。並行して、組織を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのために、製造業者の指示に従って処理した（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ， Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。各時点について、４つの無作為の視野を、最終倍率４０×で撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアバージョン１．４３ｏ（ＮＩＨ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）で画像を分析した。細胞密度を、表面積の単位（ｍｍ２）あたりの核の数（ＤＡＰＩ陽性）として計算した。アポトーシス細胞のパーセンテージを、陽性ＴＵＮＥＬシグナル（ＦＩＴＣ陽性）を有する核の数 対 核の総数の比として決定した。コントロールを、ＣＩＤなしの培養物中で維持した。
（マウスモデルでのインビボ殺滅研究）
全てのマウス実験を、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ動物飼養ガイドラインに従って行った。改変ＭＳＣのインビボでの持続性を評価するために、ＳＣＩＤマウスモデルを、インビボ画像化システムとともに使用した。ＭＳＣを、高感度緑色蛍光タンパク質－ホタルルシフェラーゼ（ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）遺伝子のみをまたはｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９遺伝子と一緒にコードするレトロウイルスで形質導入した。細胞を、ＭｏＦｌｏフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ）を使用する蛍光活性化セルソーティングによって、ｅＧＦＰ陽性に関してソートした。二重形質導入細胞もまた、ＰＥ結合体化抗ＣＤ１９で染色し、ＰＥ陽性に関してソートした。ＳＣＩＤマウス（８～１０週齢）に、反対側の側腹部にｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９ありおよびなしで、５×１０５ ＭＳＣを皮下注射した。マウスに、１週間後に開始して、２４時間間隔を空けて、５０μｇのＣＩＤの２回の腹腔内注射を与えた。ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃを発現するＭＳＣのインビボ画像化のために、マウスに、Ｄ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、Ｘｅｎｏｇｅｎ－ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して分析した。各時点での総ルミネッセンス（沈着した総標識ＭＳＣに比例した測定値）を、ＭＳＣ移植部位にわたる関心領域（ＲＯＩ）を自動的に定義することによって計算した。これらＲＯＩは、バックグラウンドを少なくとも５％上回るルミネッセンスシグナルを有する全ての領域を含んだ。総光子数を各ＲＯＩに関して積分し、平均値を計算した。結果を、時間ゼロが１００％シグナルに相当するように正規化した。
全てのマウス実験を、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ動物飼養ガイドラインに従って行った。改変ＭＳＣのインビボでの持続性を評価するために、ＳＣＩＤマウスモデルを、インビボ画像化システムとともに使用した。ＭＳＣを、高感度緑色蛍光タンパク質－ホタルルシフェラーゼ（ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）遺伝子のみをまたはｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９遺伝子と一緒にコードするレトロウイルスで形質導入した。細胞を、ＭｏＦｌｏフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ）を使用する蛍光活性化セルソーティングによって、ｅＧＦＰ陽性に関してソートした。二重形質導入細胞もまた、ＰＥ結合体化抗ＣＤ１９で染色し、ＰＥ陽性に関してソートした。ＳＣＩＤマウス（８～１０週齢）に、反対側の側腹部にｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９ありおよびなしで、５×１０５ ＭＳＣを皮下注射した。マウスに、１週間後に開始して、２４時間間隔を空けて、５０μｇのＣＩＤの２回の腹腔内注射を与えた。ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃを発現するＭＳＣのインビボ画像化のために、マウスに、Ｄ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、Ｘｅｎｏｇｅｎ－ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して分析した。各時点での総ルミネッセンス（沈着した総標識ＭＳＣに比例した測定値）を、ＭＳＣ移植部位にわたる関心領域（ＲＯＩ）を自動的に定義することによって計算した。これらＲＯＩは、バックグラウンドを少なくとも５％上回るルミネッセンスシグナルを有する全ての領域を含んだ。総光子数を各ＲＯＩに関して積分し、平均値を計算した。結果を、時間ゼロが１００％シグナルに相当するように正規化した。
第２の実験セットにおいて、２．５×１０６ ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ標識ＭＳＣおよび２．５×１０６ ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ標識ｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９形質導入ＭＳＣの混合物を、右側腹部に皮下注射し、そのマウスに、７日後に開始して２４時間空けて５０μｇのＣＩＤの２回の腹腔内注射を与えた。ＣＩＤ注射後のいくつかの時点で、ＭＳＣの皮下ペレットを、組織ルミネッセンスを使用して採取し、全ヒト標本を同定し、収集し、マウス組織の夾雑を最小にした。次いで、ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡｍｐ（登録商標） ＤＮＡ Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を使用して単離した。１００ｎｇのＤＮＡのアリコートを、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）において使用して、特異的プライマーおよびプローブ（ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ構築物に関して：順方向プライマー ５’－ＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣ－３’、逆方向、５’－ＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴ－３’、プローブ ５’ ＦＡＭ，６－カルボキシフルオレセイン－ＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣ－３’ ＭＧＢＮＦＱ、副溝結合非蛍光クエンチャー；ｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９：順方向 ５’－ＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴ－３’、逆方向 ５’－ＣＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴ－３’、プローブ５’ ＦＡＭ－ＣＧＧＡＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＴ－３’ ＭＧＢＮＦＱ）を使用して、各導入遺伝子のコピー数を決定した。各導入遺伝子の単一コピーを含む既知数のプラスミドを使用して、標準曲線を確立した。単一ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ形質導入ＭＳＣまたは二重ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ形質導入ＭＳＣおよびｉＣａｓｐ９形質導入ＭＳＣの「純粋」集団から単離されたおよそ１００ｎｇのＤＮＡは、それぞれ、類似した数のｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ遺伝子コピー（およそ３．０×１０４）、ならびにゼロおよび１．７×１０３のｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９遺伝子コピーを有すると決定された。
非形質導入ヒト細胞およびマウス組織は、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ中でいずれの遺伝子のコピーもゼロであった。ｅＧＦＰ遺伝子のコピー数は、ＭＳＣのいずれの集団（ｉＣａｓｐ９陰性または陽性）から単離された同一量のＤＮＡに対しても同じであるので。細胞の任意の混合物から単離されたＤＮＡ中のこの遺伝子のコピー数は、ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ陽性細胞の総数（ｉＣａｓｐ９陽性＋陰性ＭＳＣ）に比例する。さらに、ｉＣａｓｐ９陰性組織は、ｉＣａｓｐ９コピー数に寄与しないので、任意のＤＮＡサンプル中のｉＣａｓｐ９遺伝子のコピー数は、ｉＣａｓｐ９陽性細胞の総数に比例する。従って、任意のＤＮＡサンプルに関して、ＧがＧＦＰ陽性およびｉＣａｓｐ９陰性細胞の総数であり、ＣがＧＦＰ陽性およびｉＣａｓｐ９陽性細胞の総数である場合、ＮｅＧＦＰ＝ｇ・（Ｃ＋Ｇ）およびＮｉＣａｓｐ９＝ｋ・Ｃである（ここでＮは、遺伝子コピー数を表し、ｇおよびｋは、それぞれ、ｅＧＦＰ遺伝子およびｉＣａｓｐ９遺伝子についてのコピー数および細胞数に関する定数である）。従って、ＮｉＣａｓｐ９／ＮｅＧＦＰ＝（ｋ／ｇ）・［Ｃ／（Ｃ＋Ｇ）］、すなわち、ｉＣａｓｐ９コピー数とｅＧＦＰコピー数との間の比は、全てのｅＧＦＰ陽性細胞の中での二重形質導入（ｉＣａｓｐ９陽性）細胞の画分に比例する。ＮｉＣａｓｐ９およびＮｅＧＦＰの絶対値は、各ＭＳＣ外植片中のマウス細胞による汚染の増大とともに減少するが、各時点に関して、含まれるマウス組織の量に拘わらずその比は一定である。なぜならヒト細胞の両方のタイプが物理的に混合されるからである。（インビトロ培養によって示されるように）両方の集団における自発的アポトーシスの類似の比を想定すると、任意の時点におけるＮｉＣａｓｐ９／ＮｅＧＦＰと時間ゼロでのそれとの間の商は、ＣＩＤへの曝露後に生存しているｉＣａｓｐ９陽性細胞のパーセンテージを表す。全てのコピー数決定を、三連で行った。
（統計分析）
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の統計的有意差を決定した。全ての数値データを、平均±１標準偏差として表す。
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の統計的有意差を決定した。全ての数値データを、平均±１標準偏差として表す。
（結果）
（ＭＳＣは、ｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９で容易に形質導入され、それらの基本表現型を維持する）
３名の健常ドナー由来のＭＳＣのフローサイトメトリー分析は、それらが一様に、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に関して陽性であり、造血マーカーＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１３３およびＣＤ３４に関して陰性であることを示した。骨髄から単離された単核性接着画分は均質に（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓｌｙ）、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に関して陽性であり、造血マーカーに関して陰性であった。単離されたＭＳＣの、脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞への分化潜在能を特異的アッセイにおいて確認したところ、これら細胞が真正のＭＳＣであることが示された。
（ＭＳＣは、ｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９で容易に形質導入され、それらの基本表現型を維持する）
３名の健常ドナー由来のＭＳＣのフローサイトメトリー分析は、それらが一様に、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に関して陽性であり、造血マーカーＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１３３およびＣＤ３４に関して陰性であることを示した。骨髄から単離された単核性接着画分は均質に（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓｌｙ）、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に関して陽性であり、造血マーカーに関して陰性であった。単離されたＭＳＣの、脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞への分化潜在能を特異的アッセイにおいて確認したところ、これら細胞が真正のＭＳＣであることが示された。
早期継代のＭＳＣを、カスパーゼ－９の誘導性形態をコードするｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９レトロウイルスベクターで形質導入した。最適なシグナル伝達条件（ｓｉｎｇｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で、この細胞のうちの４７±６％がＣＤ１９（その短縮型形態は、ｉＣａｓｐ９とともにシスで転写される）を発現し、成功裡の形質導入のための代用物として働き、形質導入された細胞の選択を可能にする。ＣＤ１９に関して陽性の細胞のパーセンテージは、培養物中で２週間より長く安定であり、ＭＳＣに対してその構築物の有害な作用も成長に有利な効果も示唆しなかった。ＣＤ１９陽性細胞（ｉＣａｓｐ９での成功裡の形質導入の代用物）のパーセンテージは、２週間より長く一定なままである。その構築物の安定性にさらに対処するために、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によって精製したｉＣａｓｐ９陽性細胞の集団を、培養物中で維持した：ＣＤ１９陽性細胞のパーセンテージの有意差は、６週間を超えても観察されなかった（ベースラインで９６．５±１．１％ 対 ４３日後に９７．４±０．８％、Ｐ＝０．４６）。ｉＣａｓｐ９－ＣＤ１９陽性細胞の表現型は、非形質導入細胞の表現型と他の点では実質的に同一であった（実質的に全ての細胞がＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に関して陽性、造血マーカーに関して陰性）。これは、ＭＳＣの遺伝子操作がそれらの基本特性を改変しないことを確認した。
（ｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９形質導入ＭＳＣは、インビトロでのＣＩＤへの曝露後に選択的アポトーシスを受ける）
アポトーシス促進遺伝子生成物ｉＣａｓｐ９は、小さな二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）、ＡＰ２０１８７（ｉＣａｓｐ９生成物に存在するＦＫ５０６－結合ドメインに結合するタクロリムスのアナログ）によって活性化され得る。非形質導入ＭＳＣは、ベースラインにおいてｉＣａｓｐ９陽性細胞が有する（１５±６％、Ｐ＝０．４７）ように、およそ１８％（±７％）という培養物中での自発的アポトーシス率を有する。ｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９での形質導入後のＭＳＣ培養物へのＣＩＤ（５０ｎＭ）の添加は、２４時間以内にｉＣａｓｐ９陽性細胞の９０％超（９３±１％、Ｐ＜０．０００１）のアポトーシス死を生じる一方で、ｉＣａｓｐ９陰性細胞は、非形質導入コントロールに類似のアポトーシス指数を保持する（２０±７％、ＣＩＤありまたはなしでの非形質導入コントロールに対してそれぞれＰ＝０．９９およびＰ＝０．６９）（図１７Ａおよび７０Ｂを参照のこと）。ｉＣａｓｐ９でのＭＳＣの形質導入後、その二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）を、５０ｎＭで完全培地中の培養物に添加した。アポトーシスを、細胞採取ならびにアネキシンＶ－ＰＥおよび７－ＡＡＤでの染色後に、ＦＡＣＳ分析によって２４時間後に評価した。同じ化合物に曝露された非形質導入コントロールＭＳＣ（コントロール／ＣＩＤ、１５％）およびＣＩＤに曝露されなかったｉＣａｓｐ９－ＣＤ１９陽性細胞（ｉＣａｓｐ陽性／ＣＩＤなし、１３％）に匹敵し、非形質導入ＭＳＣのベースラインアポトーシス率（コントロール／ＣＩＤなし、１６％）に類似した割合である、陰性集団（ｉＣａｓｐ陰性／ＣＩＤ）のわずか１９％に対して、ｉＣａｓｐ９－ＣＤ１９陽性細胞（ｉＣａｓｐ陽性／ＣＩＤ）のうちの９３％がアネキシン陽性になった。ｉＣａｐ９－ＣＤ１９陽性細胞の磁性免疫選択は、高純度に到達させ得る。その選択された細胞のうちの９５％超が、ＣＩＤへの曝露後にアポトーシス性になる。
アポトーシス促進遺伝子生成物ｉＣａｓｐ９は、小さな二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）、ＡＰ２０１８７（ｉＣａｓｐ９生成物に存在するＦＫ５０６－結合ドメインに結合するタクロリムスのアナログ）によって活性化され得る。非形質導入ＭＳＣは、ベースラインにおいてｉＣａｓｐ９陽性細胞が有する（１５±６％、Ｐ＝０．４７）ように、およそ１８％（±７％）という培養物中での自発的アポトーシス率を有する。ｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９での形質導入後のＭＳＣ培養物へのＣＩＤ（５０ｎＭ）の添加は、２４時間以内にｉＣａｓｐ９陽性細胞の９０％超（９３±１％、Ｐ＜０．０００１）のアポトーシス死を生じる一方で、ｉＣａｓｐ９陰性細胞は、非形質導入コントロールに類似のアポトーシス指数を保持する（２０±７％、ＣＩＤありまたはなしでの非形質導入コントロールに対してそれぞれＰ＝０．９９およびＰ＝０．６９）（図１７Ａおよび７０Ｂを参照のこと）。ｉＣａｓｐ９でのＭＳＣの形質導入後、その二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）を、５０ｎＭで完全培地中の培養物に添加した。アポトーシスを、細胞採取ならびにアネキシンＶ－ＰＥおよび７－ＡＡＤでの染色後に、ＦＡＣＳ分析によって２４時間後に評価した。同じ化合物に曝露された非形質導入コントロールＭＳＣ（コントロール／ＣＩＤ、１５％）およびＣＩＤに曝露されなかったｉＣａｓｐ９－ＣＤ１９陽性細胞（ｉＣａｓｐ陽性／ＣＩＤなし、１３％）に匹敵し、非形質導入ＭＳＣのベースラインアポトーシス率（コントロール／ＣＩＤなし、１６％）に類似した割合である、陰性集団（ｉＣａｓｐ陰性／ＣＩＤ）のわずか１９％に対して、ｉＣａｓｐ９－ＣＤ１９陽性細胞（ｉＣａｓｐ陽性／ＣＩＤ）のうちの９３％がアネキシン陽性になった。ｉＣａｐ９－ＣＤ１９陽性細胞の磁性免疫選択は、高純度に到達させ得る。その選択された細胞のうちの９５％超が、ＣＩＤへの曝露後にアポトーシス性になる。
ＣＩＤへの単一曝露後の後の時点での高度に精製されたｉＣａｓｐ９陽性集団の分析は、ｉＣａｓｐ９陰性細胞の小さな画分が拡大し、ｉＣａｓｐ９陽性細胞の集団が残存するが、ｉＣａｓｐ９陽性細胞の集団はＣＩＤへの再曝露によって殺滅され得ることを示す。従って、ＣＩＤによるさらなる殺滅に耐性のｉＣａｓｐ９陽性集団は検出されなかった。ｉＣａｓｐ９－ＣＤ１９陰性ＭＳＣの集団は、ＣＩＤ導入後２４時間程度の速さで出現する。ｉＣａｓｐ９－ＣＤ１９陰性ＭＳＣの集団が予測される。なぜなら１００％純度を有する集団の達成は非現実的であり、かつそのＭＳＣは、それらのインビトロでの迅速な拡大に有利な条件において培養されている最中であるからである。ｉＣａｓｐ９－ＣＤ１９陽性集団の画分は、殺滅が１００％効率ではないという事実によって推測されるように、持続する（例えば、９９％純粋集団の９９％殺滅を仮定すると、得られる集団は、４９．７％ ｉＣａｓｐ９陽性細胞および５０．３％ ｉＣａｓｐ９陰性細胞を有する）。しかし、生存している細胞は、ＣＩＤへの再曝露によって後の時点で殺滅され得る。
（ｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９形質導入ＭＳＣは、非改変ＭＳＣの分化潜在能を維持し、それらの子孫は、ＣＩＤへの曝露によって殺滅される）
上記ＣＩＤが、ｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣの分化した子孫を選択的に殺滅し得るかどうかを決定するために、ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を使用して、改変された集団の純度を増大させた（１ラウンドの選択後に＞９０％）。このようにして選択されたｉＣａｓｐ９陽性細胞は、インビボで、研究した全ての結合組織系統へと分化できた（図１９Ａ～１９Ｑを参照のこと）。ヒトＭＳＣをＣＤ１９（従って、ｉＣａｓｐ９）発現に関して免疫磁性選択したところ、純度は９１％より高かった。特異的分化培地中での培養後に、ｉＣａｓｐ９陽性細胞は、脂肪細胞系統（Ａ、オイルレッドおよびメチレンアズール）、骨芽細胞系統（Ｂ、アルカリホスファターゼ－ＢＣＩＰ／ＮＢＴおよびメチレンブルー）および軟骨芽細胞系統（Ｃ、アルシアンブルーおよびヌクレアレッド）を生じることができた。これらの分化した組織は、５０ｎＭ ＣＩＤへの曝露によってアポトーシスへと駆動される（Ｄ～Ｎ）。未処理ｉＣａｓｐ９形質導入コントロールに見られるものとは対照的に、多くのアポトーシス小体（矢印）、細胞質膜ブレブ形成（挿入図）および細胞構造の喪失（ＤおよびＥ）；軟骨細胞小結節（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｉｃ ｎｏｄｕｌｅ）（Ｆ～Ｈ）、および脂肪生成培養物（Ｉ～Ｋ）および骨形成培養物（Ｌ～Ｎ）における広範囲のＴＵＮＥＬ陽性に注意のこと（脂肪生成条件が示される、Ｏ～Ｑ）（Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｏ、ＤＡＰＩ； Ｇ、Ｊ、Ｍ、Ｐ，ＴＵＮＥＬ－ＦＩＴＣ； Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、重ね合わせ）。
上記ＣＩＤが、ｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣの分化した子孫を選択的に殺滅し得るかどうかを決定するために、ＣＤ１９に関する免疫磁性選択を使用して、改変された集団の純度を増大させた（１ラウンドの選択後に＞９０％）。このようにして選択されたｉＣａｓｐ９陽性細胞は、インビボで、研究した全ての結合組織系統へと分化できた（図１９Ａ～１９Ｑを参照のこと）。ヒトＭＳＣをＣＤ１９（従って、ｉＣａｓｐ９）発現に関して免疫磁性選択したところ、純度は９１％より高かった。特異的分化培地中での培養後に、ｉＣａｓｐ９陽性細胞は、脂肪細胞系統（Ａ、オイルレッドおよびメチレンアズール）、骨芽細胞系統（Ｂ、アルカリホスファターゼ－ＢＣＩＰ／ＮＢＴおよびメチレンブルー）および軟骨芽細胞系統（Ｃ、アルシアンブルーおよびヌクレアレッド）を生じることができた。これらの分化した組織は、５０ｎＭ ＣＩＤへの曝露によってアポトーシスへと駆動される（Ｄ～Ｎ）。未処理ｉＣａｓｐ９形質導入コントロールに見られるものとは対照的に、多くのアポトーシス小体（矢印）、細胞質膜ブレブ形成（挿入図）および細胞構造の喪失（ＤおよびＥ）；軟骨細胞小結節（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｉｃ ｎｏｄｕｌｅ）（Ｆ～Ｈ）、および脂肪生成培養物（Ｉ～Ｋ）および骨形成培養物（Ｌ～Ｎ）における広範囲のＴＵＮＥＬ陽性に注意のこと（脂肪生成条件が示される、Ｏ～Ｑ）（Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｏ、ＤＡＰＩ； Ｇ、Ｊ、Ｍ、Ｐ，ＴＵＮＥＬ－ＦＩＴＣ； Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、重ね合わせ）。
５０ｎＭのＣＩＤへの曝露の２４時間後、アポトーシスの顕微鏡での証拠を、脂肪生成培養物および骨形成培養物全体にわたる膜ブレブ形成、細胞収縮および剥離、ならびにアポトーシス小体の存在とともに観察した。ＴＵＮＥＬアッセイは、脂肪生成培養物および骨形成培養物ならびに軟骨小結節において広範囲に陽性を示し（図１９Ａ～１９Ｑを参照のこと）、これは経時的に増大した。脂肪細胞分化培地中での培養後に、ｉＣａｓｐ９陽性細胞は、脂肪細胞を生じた。５０ｎＭ ＣＩＤへの曝露後に、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の増大しつつある割合によって証明されるように、進行性のアポトーシスが観察された。２４時間後、細胞密度の有意な減少が存在した（５８４ 細胞／ｍｍ２から＜１４ 細胞／ｍｍ２へ）。ほぼ全てのアポトーシス細胞が、スライドから剥がれてしまい、アポトーシス細胞の割合のさらに信頼に足る計算が妨げられた。従って、ｉＣａｓｐ９は、ＭＳＣ分化後にすら機能的なままであった。その活性化は、分化した子孫の死滅を生じる。
（ｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９形質導入ＭＳＣは、ＣＩＤへのインビボでの曝露後に選択的アポトーシスを受ける）
静脈内注射したＭＳＣは、短いインビボ生存時間を既に有するようであるが、局所注射した細胞は、より長く生存し得、相当してより多くの顕著な有害作用を生じ得る。このような状況でのｉＣａｓｐ９自殺システムのインビボ機能性を評価するために、ＳＣＩＤマウスに、ＭＳＣを皮下注射した。ＭＳＣを、ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ遺伝子（先に示された）およびｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９遺伝子で二重形質導入した。ＭＳＣをまた、ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃで単一に形質導入した。このｅＧＦＰ陽性（および適用可能である場合には、ＣＤ１９陽性）画分を、純度＞９５％で蛍光活性化セルソーティングによって単離した。各動物に、ｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣおよびコントロールＭＳＣ（ともにｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ陽性）を反対側の側腹部に皮下注射した。ＭＳＣの局在を、Ｘｅｎｏｇｅｎ－ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して評価した。別の実験セットでは、単一形質導入および二重形質導入されたＭＳＣの１：１混合物を、右側腹部に皮下注射し、上記のようにマウスにＣＩＤを与えた。ＭＳＣの皮下ペレットを、種々の時点で採取し、ゲノムＤＮＡを単離し、ｑＰＣＲを使用して、上記ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ遺伝子およびｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９遺伝子のコピー数を決定した。これら条件下では、ｉＣａｓｐ９ 対
ｅＧＦＰの遺伝子コピー数の比は、全ヒト細胞の間でのｉＣａｓｐ９陽性細胞の画分に比例する（詳細については上記の方法を参照のこと）。その比を、時間ゼロがｉＣａｓｐ９陽性細胞の１００％に相当するように正規化した。ＭＳＣの皮下接種後（ＣＩＤ注射前）の一連の動物実験は、両方の細胞集団において自発的アポトーシスの証拠を示す（ベースラインの約２０％への全体的なルミネッセンスシグナルにおける低下によって示されるとおり）。これは以前から、異種モデル（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｍｏｄｅｌ）におけるＭＳＣの全身送
達および局所送達後に観察された。
静脈内注射したＭＳＣは、短いインビボ生存時間を既に有するようであるが、局所注射した細胞は、より長く生存し得、相当してより多くの顕著な有害作用を生じ得る。このような状況でのｉＣａｓｐ９自殺システムのインビボ機能性を評価するために、ＳＣＩＤマウスに、ＭＳＣを皮下注射した。ＭＳＣを、ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ遺伝子（先に示された）およびｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９遺伝子で二重形質導入した。ＭＳＣをまた、ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃで単一に形質導入した。このｅＧＦＰ陽性（および適用可能である場合には、ＣＤ１９陽性）画分を、純度＞９５％で蛍光活性化セルソーティングによって単離した。各動物に、ｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣおよびコントロールＭＳＣ（ともにｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ陽性）を反対側の側腹部に皮下注射した。ＭＳＣの局在を、Ｘｅｎｏｇｅｎ－ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して評価した。別の実験セットでは、単一形質導入および二重形質導入されたＭＳＣの１：１混合物を、右側腹部に皮下注射し、上記のようにマウスにＣＩＤを与えた。ＭＳＣの皮下ペレットを、種々の時点で採取し、ゲノムＤＮＡを単離し、ｑＰＣＲを使用して、上記ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ遺伝子およびｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９遺伝子のコピー数を決定した。これら条件下では、ｉＣａｓｐ９ 対
ｅＧＦＰの遺伝子コピー数の比は、全ヒト細胞の間でのｉＣａｓｐ９陽性細胞の画分に比例する（詳細については上記の方法を参照のこと）。その比を、時間ゼロがｉＣａｓｐ９陽性細胞の１００％に相当するように正規化した。ＭＳＣの皮下接種後（ＣＩＤ注射前）の一連の動物実験は、両方の細胞集団において自発的アポトーシスの証拠を示す（ベースラインの約２０％への全体的なルミネッセンスシグナルにおける低下によって示されるとおり）。これは以前から、異種モデル（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｍｏｄｅｌ）におけるＭＳＣの全身送
達および局所送達後に観察された。
ルミネッセンスデータは、ＣＩＤの投与前ですら、 ＭＳＣの局所送達後最初の９６時間にわたってヒトＭＳＣの実質的喪失を示し、１週間後には、およそ２０％ 細胞のみが生存していた。しかし、その時点から進むと、二量体化薬物ありとなしとのｉｃａｓｐ９陽性ＭＳＣの生存の間には、有意差があった。ＭＳＣ移植の７日後に、動物に、２４時間空けて、５０μｇのＣＩＤの２回の注射を与えた。ｉＣａｓｐ９で形質導入したＭＳＣを、それらのルミネッセンスシグナルの消失によって示されるように、上記薬物によって迅速に殺滅した。ｉＣａｓｐ９に関して陰性の細胞は、上記薬物によって影響を受けなかった。上記薬物を注射しなかった動物は、ＭＳＣ移植後１ヶ月まで両方の集団においてシグナルの持続を示した。細胞殺滅をさらに定量するために、ｑＰＣＲアッセイを開発して、ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ遺伝子およびｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９遺伝子のコピー数を測定した。マウスに、二重形質導入ＭＳＣおよび単一形質導入ＭＳＣの１：１混合物を皮下注射し、ＭＳＣ移植の１週間後に上記のようにＣＩＤを投与した。ＭＳＣ外植片を、いくつかの時点で集め、ゲノムＤＮＡをそのサンプルから単離し、実質的に同一量のＤＮＡに対してｑＰＣＲアッセイを行った。これらの条件下で（方法を参照のこと）、任意の時点で、ｉＣａｓｐ９－ΔＣＤ１９ 対 ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃのコピー数の比は、生存能力のあるｉＣａｓｐ９陽性細胞の画分に比例する。ｉＣａｓｐ９陽性細胞の連続的な殺滅が観察され（＞９９％）、その結果、生存しているｉＣａｓｐ９陽性細胞の割合は、１週間後に、元の集団の０．７％へと減少した。従って、ｉＣａｓｐ９で形質導入されたＭＳＣは、ＣＩＤへの曝露後にインビボで選択的に殺滅され得るが、さもなければ持続する。
（考察）
誘導性自殺タンパク質を使用して安全機構を発現するようにヒトＭＳＣを操作する実施可能性は、本明細書で示される。本明細書で示される日付（ｄａｔｅ）は、ＭＳＣが、選択可能な表面マーカーＣＤ１９にカップルした自殺遺伝子ｉＣａｓｐ９で容易に形質導入され得ることを示す。共形質導入された遺伝子の発現は、ＭＳＣおよびそれらの分化した子孫の両方において安定であり、それらの表現型も分化潜在能も明らかには変化させない。これらの形質導入された細胞は、ｉＣａｓｐ９に結合する、適切な二量体化の小分子化学的誘導物質に曝される場合に、インビトロおよびインビボで殺滅され得る。
誘導性自殺タンパク質を使用して安全機構を発現するようにヒトＭＳＣを操作する実施可能性は、本明細書で示される。本明細書で示される日付（ｄａｔｅ）は、ＭＳＣが、選択可能な表面マーカーＣＤ１９にカップルした自殺遺伝子ｉＣａｓｐ９で容易に形質導入され得ることを示す。共形質導入された遺伝子の発現は、ＭＳＣおよびそれらの分化した子孫の両方において安定であり、それらの表現型も分化潜在能も明らかには変化させない。これらの形質導入された細胞は、ｉＣａｓｐ９に結合する、適切な二量体化の小分子化学的誘導物質に曝される場合に、インビトロおよびインビボで殺滅され得る。
細胞ベースの治療が成功するためには、移植された細胞は、それらの採取とそれらの最終的なインビボ臨床適用の間の期間を生き延びなければならない。さらに、安全な細胞ベースの治療はまた、成功裡に移植された細胞の望ましくない成長および活性をコントロールする能力を含むべきである。ＭＳＣは、顕著な副作用なしに多くの患者に投与されてきたが、近年の報告によれば、移植されたＭＳＣがそれらの機能性を高めるように、ならびに骨および軟骨を含む系統へと分化するように遺伝的にかつ後成的に改変される潜在性は、さらに調査および利用されるにつれて、さらなる保護（例えば、本明細書で示される安全スイッチ）が、細胞ベースの治療にわたるさらなるコントロール方法を提供し得ることが示される。生物学的に活性なタンパク質を放出するように遺伝子改変されたＭＳＣを受ける被験体は、自殺遺伝子によって提供される付加された安全性から特に利益を受け得る。
本明細書で示される自殺システムは、他の公知の自殺システムを超えるいくつかの潜在的利点を提供する。ヌクレオシドアナログが関わるストラテジー（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）とガンシクロビル（ＧＣＶ）とを、および細菌もしくは酵母シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）と５－フルオロ－シトシン（５－ＦＣ）とを組み合わせるもの）は、細胞周期依存性であり、再生医療へのＭＳＣの適用の間に形成され得る有糸分裂後組織において有効でである見込みはない。さらに、増殖しつつある組織においてすら、有糸分裂画分は、全ての細胞を含む訳ではなく、移植片の有意な部分は、生存しかつ機能不全のままであり得る。ある場合には、自殺に必要とされるプロドラッグそれ自体が治療用途を有し得、従って、これらは、非標的器官によるそれらの代謝の結果として（例えば、多くのシトクロムＰ４５０基質）、または標的細胞による活性化後の隣接する組織への拡散に起因して（例えば、ＣＢ１９５４、細菌ニトロレダクターゼの基質）のいずれかで、排除される（例えば、ＧＣＶ）か、または毒性であり得る（例えば、５－ＦＣ）。
対照的に、本明細書で示される二量体化の小分子化学的誘導物質は、ｉＣａｓｐ９を活性化するために必要とされるものより１０倍高い用量ですら、毒性の証拠を示さなかった。さらに、非ヒト酵素システム（例えば、ＨＳＶ－ｔｋおよびＤＣ）は、形質導入された細胞に対して破壊的な免疫応答という高いリスクを有する。ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子および選択マーカーＣＤ１９は両方ともヒト起源のものであり、従って、望ましくない免疫応答を導入する可能性はより低いはずである。選択マーカーの発現を、非ヒト起源の２Ａ様切断可能ペプチドによって自殺遺伝子へ連結すること（ｌｉｎｋａｇｅ）は問題を提起し得るが、この２Ａ様リンカーは、２０アミノ酸長であり、非ヒトタンパク質より免疫原性が低いようである。最後に、ｉＣａｓｐ９陽性細胞における自殺遺伝子活性化の有効性を、有利なことには、他の自殺システムを発現する細胞の殺滅と比較すると、ｉＣａｓｐ９改変Ｔ細胞のうちの９０％またはこれより多くが、臨床上おそらく有効であるレベルである、単一用量の二量体化剤の後に排除される。
本明細書で示されるｉＣａｓｐ９システムはまた、他の細胞ベースのおよび／または自殺スイッチベースの治療で見られるさらなる制限を回避し得る。形質導入された構築物のサイレンシングに起因する発現の喪失は、哺乳動物細胞のレトロウイルス形質導入後に頻繁に観察される。本明細書で示される発現構築物は、このような効果の証拠を示さなかった。培養物中で１ヶ月後ですら、発現または誘導死の減少は明らかではなかった。
他の細胞ベースのおよび／または自殺スイッチベースの治療においてときおり観察される別の潜在的問題は、制御されない抗アポトーシス遺伝子を有する細胞における耐性の発生である。この効果は、プログラム細胞死経路の異なるエレメント（例えば、Ｆａｓ）が関わる他の自殺システムにおいて観察されてきた。ｉＣａｓｐ９は、この制限を有する可能性がより低いことから、本明細書で示される発現構築物のための自殺遺伝子として選択された。アポトーシスカスケードの他のメンバーと比較すると、カスパーゼ－９の活性化は、アポトーシス経路において後期で起こり、従って、多くの（全てではないにしても）抗アポトーシス制御因子（例えば、ｃ－ＦＬＩＰおよびｂｃｌ－２ファミリーメンバー）の影響を回避するはずである。
本明細書で示されるシステムに特異的な潜在的制限は、ｉＣａｓｐ９の自発的二量体化であり得る。これは翻って、望ましくない細胞死および不十分な持続性を引き起こし得る。この効果は、Ｆａｓを利用するある種の他の誘導性システムにおいて観察されてきた。形質導入された細胞における低い自発的死の率およびトランスジェニック細胞のインビボでの長期の持続性という観察は、この可能性が、ｉＣａｓｐ９ベースの発現構築物を使用する場合に重大な考慮事項ではないことを示す。
ＭＳＣのレトロウイルス形質導入に由来する組み込み事象は、特に、レトロウイルスベクターの複数の挿入がある場合に、有害な変異誘発を潜在的に駆動し得、望ましくないコピー数効果および／または他の望ましくない効果を引き起こす。これら望ましくない効果は、レトロウイルス形質導入自殺システムの利益を相殺し得る。これら効果はしばしば、Ｔリンパ球を形質導入するために、安定なプロデューサー細胞株および類似の培養条件から得られる臨床グレードのレトロウイルス上清を使用して最小化され得る。本明細書で形質導入されかつ評価されたＴ細胞は、約１～３の範囲の組み込み体を含む（その上清は、約１×１０６ ウイルス粒子／ｍＬの範囲で含む）。レトロウイルスベクターの代わりにレンチウイルスベクターを使用すると、特に、高い自己再生および分化潜在能を有する細胞では、遺伝毒性のリスクがさらに減少し得る。
少ない割合のｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣが、ＣＩＤへの単一の曝露後に持続する一方で、これらの生き残っている細胞は、その後、ＣＩＤへの再曝露後に殺滅され得る。インビボでは、２用量で＞９９％が枯渇されるが、ＣＩＤの反復用量は、臨床状況では最大の枯渇のために必要とされるようである。誘導性自殺スイッチシステムを使用する場合に特別な安全性を提供するためのさらなる非限定的方法としては、投与される細胞集団の純度をさらに増大させるためのさらなるラウンドのセルソーティングおよび殺滅の効率を高めるための１より多くの自殺遺伝子システムの使用が挙げられる。
上記ＣＤ１９分子（これは、Ｂリンパ球によって生理学的に発現される）を、他の利用可能な選択系（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）および短縮型低親和性神経成長因子レセプター（ΔＬＮＧＦＲ））を超えるその潜在的利点から、形質導入細胞の選択マーカーとして選択した。「ｎｅｏ」は、潜在的に免疫原性の外来タンパク質をコードし、選択培地中での７日間の培養を要し、システムの複雑さを増大させ、その選択された細胞に潜在的に損傷を与える。ΔＬＮＧＦＲ発現は、他の表面マーカーに類似の単離ストラテジーを可能にするはずであるが、これらは、臨床用途に広く利用可能ではなく、ΔＬＮＧＦＲの腫瘍形成潜在能に関するなかなか消えない懸念が残る。対照的に、臨床グレードのデバイスを使用してＣＤ１９発現によってｉＣａｓｐ９陽性細胞を磁性選択することは、容易に利用可能であり、その後の細胞成長または分化に対して顕著な影響を示していない。
カスパーゼ－９安全スイッチを含む間葉系ストローマ細胞の調製および投与のために使用される手順は、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の調製のためにも使用され得る。従って、本実施例において概説される手順に関しては、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞のいずれかが、この実施例で提供される間葉系ストローマ細胞の代わりに使用され得る。これら細胞では、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、例えば、ＣＭＶプロモーターまたはロニン（ｒｏｎｉｎ）プロモーターとともに使用され得る。
（実施例６）
（より低い基底活性およびリガンドＩＣ５０の最小の損失を有する改変カスパーゼ－９ポリペプチド）
基底シグナル伝達（アゴニストまたは活性化剤の非存在下でのシグナル伝達）は、多くの生体分子で一般的である。例えば、複数のサブファミリーに由来する６０を超える野生型Ｇプロテイン共役レセプター（ＧＰＣＲ）［１］、キナーゼ（例えば、ＥＲＫおよびａｂｌ）［２］、表面免疫グロブリン［３］、およびプロテアーゼにおいて観察されている。基底シグナル伝達は、胚性幹細胞多能性の維持、Ｂ細胞発生および分化［４～６］、Ｔ細胞分化［２， ７］、胸腺細胞発生［８］、エンドサイトーシスおよび薬物耐容性［９］、自己免疫［１０］から、植物生長および発生［１１］まで、非常に種々の生物学的事象に寄与すると仮定されている。その生物学的重要性は常に完全に理解されているわけでも明らかでもないが、欠陥のある基底シグナル伝達は、重大な帰結をもたらし得る。欠陥のある基底Ｇｓプロテインシグナル伝達は、網膜色素変性、色盲、腎性尿崩症、家族性ＡＣＴＨ抵抗性（ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＣＴＨ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、および家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症［１２， １３］）などの疾患をもたらした。
（より低い基底活性およびリガンドＩＣ５０の最小の損失を有する改変カスパーゼ－９ポリペプチド）
基底シグナル伝達（アゴニストまたは活性化剤の非存在下でのシグナル伝達）は、多くの生体分子で一般的である。例えば、複数のサブファミリーに由来する６０を超える野生型Ｇプロテイン共役レセプター（ＧＰＣＲ）［１］、キナーゼ（例えば、ＥＲＫおよびａｂｌ）［２］、表面免疫グロブリン［３］、およびプロテアーゼにおいて観察されている。基底シグナル伝達は、胚性幹細胞多能性の維持、Ｂ細胞発生および分化［４～６］、Ｔ細胞分化［２， ７］、胸腺細胞発生［８］、エンドサイトーシスおよび薬物耐容性［９］、自己免疫［１０］から、植物生長および発生［１１］まで、非常に種々の生物学的事象に寄与すると仮定されている。その生物学的重要性は常に完全に理解されているわけでも明らかでもないが、欠陥のある基底シグナル伝達は、重大な帰結をもたらし得る。欠陥のある基底Ｇｓプロテインシグナル伝達は、網膜色素変性、色盲、腎性尿崩症、家族性ＡＣＴＨ抵抗性（ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＣＴＨ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、および家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症［１２， １３］）などの疾患をもたらした。
野生型イニシエーターカスパーゼ－９のホモ二量体化がエネルギー的にたとえ不利であり、野生型イニシエーターカスパーゼ－９を溶液中で大部分をモノマーにしても［１４～１６］、プロセシングされていないカスパーゼ－９の低レベルの生来の基底活性［１５，１７］は、Ａｐａｆ－１ベースの「アポプトソーム」（その天然のアロステリック調節因子［６］）の存在下で増強される。さらに、超生理学的発現レベルおよび／または共局在は、近位にあることで駆動される二量体化（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ－ｄｒｉｖｅｎ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）をもたらし得、さらには、基底活性化を増強し得る。
キメラ非改変カスパーゼ－９ポリペプチドでは、本質的なカスパーゼ－９基底活性は、カスパーゼ動員プロドメイン（Ｃａｓｐａｓｅ－Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｐｒｏ－Ｄｏｍａｉｎ）（ＣＡＲＤ）［１８］を除去し、これをコグネイト高親和性ＡＰ１９０３－結合ドメイン、ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖで置き換えることによって有意に減少した。細胞治療のためのアポトーシス促進性「安全スイッチ」としてのその有用性は、複数の研究において十分に示されてきた［１８～２０］。上記安全スイッチの高い特異的かつ低い基底活性は、これを細胞治療において強力なツールにした一方で、Ｇプロテイン共役レセプターとは対照的に、基底シグナル伝達を排除するための「逆作動薬」は現在存在しない［２１］。これは、製造には、およびいくつかの適用においては望ましいことであり得る。マスター細胞バンクを準備することは、キメラポリペプチドの低レベル基底活性の高い増幅に起因して、困難であることは判明している。さらに、いくつかの細胞は、カスパーゼ－９の低レベル基底活性に対して他のものより感受性が高く、形質導入された細胞の意図しないアポトーシスをもたらす［１８］。
キメラカスパーゼ－９ポリペプチドの基底活性を改変するために、「妥当なデザイン」ベースの方法を、ランダムに生成される変異体に対する選択圧として複数サイクルのスクリーニングを使用する「定向進化」［２２］よりむしろ、ホモ二量体化、ＸＩＡＰ媒介性阻害、またはリン酸化（以下の表）において決定的な役割を果たすことが公知の残基に基づいて７５ｉ Ｃａｓｐ９変異体を操作するために使用した。カスパーゼ－９の二量体化駆動活性化は、イニシエーターカスパーゼ活性化の優性モデルを熟考した［１５、２３、２４］。自発的二量体化を減少させるために、部位特異的変異誘発を、ホモ二量体化、および従って、基底カスパーゼ－９シグナル伝達にとって決定的な残基で行った。β６鎖（カスパーゼ－９の重要な二量体化界面）における５個の重要な残基（Ｇ４０２－Ｃ－Ｆ－Ｎ－Ｆ４０６）の、構成的二量体エフェクターカスパーゼ－３のそれ（Ｃ２６４－Ｉ－Ｖ－Ｓ－Ｍ２６８）での置き換えは、カスパーゼ－９を、有意な構造的再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）なしに、Ａｐａｆ－１活性化に非応答性の構成的二量体タンパク質に変換した［２５］。自発的ホモ二量体化を改変するために、上記５個の残基の体系的変異誘発を、アミノ酸化学に基づいて、ならびに溶液中で主に単量体として存在するイニシエーターカスパーゼ－２、－８、－９、および－１０の相当する残基に対して行った［１４、１５］。分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）ベースの代用物殺滅アッセイ（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）（表、下記）によって２８種のｉＣａｓｐ９変異体を作製および試験した後、Ｎ４０５Ｑ変異が、ＡＰ１９０３に対するより高いＩＣ５０を適度な（＜１０倍）コストで、基底シグナル伝達を下げることが判明した。
タンパク質分解（代表的には、カスパーゼ活性化のために必要とされる）は、カスパーゼ－９活性化のために絶対的に必要とされるわけではない［２６］ので、熱力学的な「ハードル」を、自己タンパク質分解を阻害するために増大させた。さらに、ＸＩＡＰ媒介性カスパーゼ－９結合は、単量体状態においてカスパーゼ－９を捕捉して、その触媒活性および基底活性を減弱する［１４］ので、ＸＩＡＰとの相互作用にとって重要なテトラペプチド（Ａ３１６－Ｔ－Ｐ－Ｆ３１９、Ｄ３３０－Ａ－Ｉ－Ｓ－Ｓ３３４）を変異誘発することによって、ＸＩＡＰとカスパーゼ－９との間の相互作用を強化しようと試みた。これらｉＣａｓｐ－９変異体のうちの１７種から、Ｄ３３０Ａ変異が、最小（＜５倍）のＡＰ１９０３ ＩＣ５０コストで基底シグナル伝達を低下させると決定した。
第３のアプローチは、カスパーゼ－９が、ＰＫＣ－ζによるＳ１４４［２７］、プロテインキナーゼＡによるＳ１８３［２８］、Ａｋｔ１によるＳ１９６［２９］のリン酸化の際にキナーゼによって阻害される、およびｃ－ａｂｌによるＹ１５３のリン酸化の際に活性化される［３０］という以前に報告された知見に基づいた。これらの「ブレーキ」は、ＩＣ５０を改善し得るか、またはリン酸化摸倣（「ホスホ摸倣（ｐｈｏｓｐｈｏｍｉｍｅｔｉｃ）」）残基での置換は、これらの「ブレーキ」を増やして、基底活性を低下させ得る。しかし、これら残基に基づく１５個の単一残基変異体のうちのいずれも、ＡＰ１９０３に対するＩＣ５０を成功裡に低下させなかった。
例えば、実施例１～５においておよび本出願全体を通じて論じられる方法などの方法は、適切な改変とともに、必要であれば、改変されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドに、および種々の治療用細胞に対して適用され得る。
（実施例７：材料および方法）
カスパーゼ－９のＰＣＲ部位特異的変異誘発：
カスパーゼ－９の基底シグナル伝達を改変するために、ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発［３１］を、変異含有オリゴおよびＫａｐａ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）で行った。１８サイクルの増幅後、親プラスミドを、ＰＣＲ生成物を無傷なままにするメチル化依存性ＤｐｎＩ制限酵素で除去した。得られた反応物のうちの２μｌを、ＸＬ１－ｂｌｕｅまたはＤＨ５αを化学的に形質転換するために使用した。陽性変異体を、配列決定（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ）を介してその後に同定した。
カスパーゼ－９のＰＣＲ部位特異的変異誘発：
カスパーゼ－９の基底シグナル伝達を改変するために、ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発［３１］を、変異含有オリゴおよびＫａｐａ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）で行った。１８サイクルの増幅後、親プラスミドを、ＰＣＲ生成物を無傷なままにするメチル化依存性ＤｐｎＩ制限酵素で除去した。得られた反応物のうちの２μｌを、ＸＬ１－ｂｌｕｅまたはＤＨ５αを化学的に形質転換するために使用した。陽性変異体を、配列決定（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ）を介してその後に同定した。
細胞株維持およびトランスフェクション：
早期継代ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）を、加湿した３７℃、５％ ＣＯ２／９５％ 空気雰囲気中でのトランスフェクションまで、１０％ ＦＢＳ、１００ Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および１００ Ｕ／ｍＬ ストレプトマイシンを補充したＩＭＤＭ、ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中で維持した。対数増殖期にある細胞を、１５ｍＬコニカルチューブ中で１００万個の細胞あたり、ｉＣａｓｐ９変異体をコードする発現プラスミドの８００ｎｇ～２μｇおよびＳＲαプロモーター駆動性ＳＥＡＰをコードする発現プラスミド５００ｎｇで一過性にトランスフェクトした。触媒として不活性なカスパーゼ－９（Ｃ２８５Ａ）（ＦＫＢＰドメインなし）または「空の」発現プラスミド（「ｐＳＨ１ヌル）を使用して、トランスフェクション間の全プラスミドレベルを一定に維持した。３μｌ／μｇのプラスミドＤＮＡの比のＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ（登録商標） Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、抗生物質の非存在下でＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション混合物のうちの１００μｌまたは２ｍＬを、それぞれ、９６ウェルプレートまたは６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＳＥＡＰアッセイのために、トランスフェクション後の最短３時間のインキュベーション後に、ＡＰ１９０３の対数希釈物を添加した。ウェスタンブロットのために、細胞を、採取する前にＡＰ１９０３（１０ｎＭ）とともに２０分間インキュベートした。
早期継代ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）を、加湿した３７℃、５％ ＣＯ２／９５％ 空気雰囲気中でのトランスフェクションまで、１０％ ＦＢＳ、１００ Ｕ／ｍＬ ペニシリン、および１００ Ｕ／ｍＬ ストレプトマイシンを補充したＩＭＤＭ、ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中で維持した。対数増殖期にある細胞を、１５ｍＬコニカルチューブ中で１００万個の細胞あたり、ｉＣａｓｐ９変異体をコードする発現プラスミドの８００ｎｇ～２μｇおよびＳＲαプロモーター駆動性ＳＥＡＰをコードする発現プラスミド５００ｎｇで一過性にトランスフェクトした。触媒として不活性なカスパーゼ－９（Ｃ２８５Ａ）（ＦＫＢＰドメインなし）または「空の」発現プラスミド（「ｐＳＨ１ヌル）を使用して、トランスフェクション間の全プラスミドレベルを一定に維持した。３μｌ／μｇのプラスミドＤＮＡの比のＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ（登録商標） Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、抗生物質の非存在下でＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション混合物のうちの１００μｌまたは２ｍＬを、それぞれ、９６ウェルプレートまたは６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＳＥＡＰアッセイのために、トランスフェクション後の最短３時間のインキュベーション後に、ＡＰ１９０３の対数希釈物を添加した。ウェスタンブロットのために、細胞を、採取する前にＡＰ１９０３（１０ｎＭ）とともに２０分間インキュベートした。
分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ：
ＡＰ１９０３処理の２４～４８時間後に、約１００μｌの上清を９６ウェルプレートに採取し、ＳＥＡＰ活性についてアッセイした［１９、３２］。簡潔には、熱に感受性の内因性（および血清由来）アルカリホスファターゼによって引き起こされるバックグラウンドを減少させるために、４５分間の６５℃熱変性の後に、５μｌの上清を９５μｌのＰＢＳに添加し、２Ｍ ジエタノールアミン中に再懸濁した１μｌの１００ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルホスフェート（４－ＭＵＰ； Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含む１００μｌの基質緩衝液に添加した。ＳＥＡＰによる４－ＭＵＰの加水分解は、励起／発光（３５５／４６０ｎｍ）を有する蛍光基質を生成し、この蛍光基質は容易に測定され得る。黒色不透明９６ウェルプレートの中でアッセイを行って、ウェル間の蛍光漏出を最小にした。基底シグナル伝達およびＡＰ１９０３誘導活性の両方を試験するために、１０６ 早期継代ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞を、種々の量の野生型カスパーゼおよびＳＲαプロモーターを使用してＳＥＡＰ（細胞生存性のマーカー）を駆動する５００ｎｇの発現プラスミドで共トランスフェクトした。製造業者の示唆に従って、抗生物質なしの１ｍＬのＩＭＤＭ＋１０％ ＦＢＳを、各混合物に添加した。上記混合物のうちの１０００μｌを、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。１００μｌのＡＰ１９０３を、トランスフェクションの少なくとも３時間後に添加した。少なくとも２４時間にわたるＡＰ１９０３の添加後に、１００μｌの上清を、９６ウェルプレートに移し、６８℃で３０分間熱変性させて、内因性アルカリホスファターゼを不活化した。このアッセイのために、４－メチルウンベリフェリルホスフェート基質を、ＳＥＡＰによって４－メチルウンベリフェロン（３６４ｎｍで励起され得、４４８ｎｍの発光フィルタで検出され得る代謝産物）へと加水分解した。ＳＥＡＰは、細胞生存性のマーカーとして使用されるので、還元型ＳＥＡＰ読み取りは、増大したｉカスパーゼ－９活性と一致する。従って、ＡＰ１９０３の非存在下でのより高いＳＥＡＰ読み取りは、より低い基底活性を示す。望ましいカスパーゼ変異体は、低下した基底シグナル伝達とともにＡＰ１９０３に対する増大した感受性（すなわち、より低いＩＣ５０）を有する。この研究の目的は、ＩＣ５０を有意に損なうことなく基底シグナル伝達を低下させることである。
ＡＰ１９０３処理の２４～４８時間後に、約１００μｌの上清を９６ウェルプレートに採取し、ＳＥＡＰ活性についてアッセイした［１９、３２］。簡潔には、熱に感受性の内因性（および血清由来）アルカリホスファターゼによって引き起こされるバックグラウンドを減少させるために、４５分間の６５℃熱変性の後に、５μｌの上清を９５μｌのＰＢＳに添加し、２Ｍ ジエタノールアミン中に再懸濁した１μｌの１００ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルホスフェート（４－ＭＵＰ； Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含む１００μｌの基質緩衝液に添加した。ＳＥＡＰによる４－ＭＵＰの加水分解は、励起／発光（３５５／４６０ｎｍ）を有する蛍光基質を生成し、この蛍光基質は容易に測定され得る。黒色不透明９６ウェルプレートの中でアッセイを行って、ウェル間の蛍光漏出を最小にした。基底シグナル伝達およびＡＰ１９０３誘導活性の両方を試験するために、１０６ 早期継代ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞を、種々の量の野生型カスパーゼおよびＳＲαプロモーターを使用してＳＥＡＰ（細胞生存性のマーカー）を駆動する５００ｎｇの発現プラスミドで共トランスフェクトした。製造業者の示唆に従って、抗生物質なしの１ｍＬのＩＭＤＭ＋１０％ ＦＢＳを、各混合物に添加した。上記混合物のうちの１０００μｌを、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。１００μｌのＡＰ１９０３を、トランスフェクションの少なくとも３時間後に添加した。少なくとも２４時間にわたるＡＰ１９０３の添加後に、１００μｌの上清を、９６ウェルプレートに移し、６８℃で３０分間熱変性させて、内因性アルカリホスファターゼを不活化した。このアッセイのために、４－メチルウンベリフェリルホスフェート基質を、ＳＥＡＰによって４－メチルウンベリフェロン（３６４ｎｍで励起され得、４４８ｎｍの発光フィルタで検出され得る代謝産物）へと加水分解した。ＳＥＡＰは、細胞生存性のマーカーとして使用されるので、還元型ＳＥＡＰ読み取りは、増大したｉカスパーゼ－９活性と一致する。従って、ＡＰ１９０３の非存在下でのより高いＳＥＡＰ読み取りは、より低い基底活性を示す。望ましいカスパーゼ変異体は、低下した基底シグナル伝達とともにＡＰ１９０３に対する増大した感受性（すなわち、より低いＩＣ５０）を有する。この研究の目的は、ＩＣ５０を有意に損なうことなく基底シグナル伝達を低下させることである。
ウェスタンブロット分析：
２μｇのプラスミドで４８～７２時間にわたって一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞を、３７℃でＡＰ１９０３で７．５～２０分間処理し（示されるとおり）、その後、ＨａｌｔＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌを含む５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ ８．０／１４０ｍＭ ＮａＣｌ／１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド／１％ デオキシコール酸ナトリウム／０．１％ ＳＤＳ）中で溶解した。この溶解物を集め、氷上で３０分間溶解した。細胞デブリをペレット化した後、重層する上清に由来するタンパク質濃度を、製造業者によって推奨されるように、ＢＣＡＴＭ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用いて、９６ウェルプレート中で測定した。３０μｇのタンパク質を、２．５％ ２－メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）中で５分間、９５℃で煮沸し、その後、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ １０％ Ｔｒｉｓ／グリシンタンパク質ゲルによって分離した。膜を、１／１０００ ウサギ抗ヒトカスパーゼ－９ポリクローナル抗体、続いて、１／１０，０００ ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でプローブした。タンパク質バンドを、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏケミルミネッセント基質を使用して検出した。等しいサンプル負荷を確実にするために、ブロットを、Ｒｅｓｔｏｒｅ ＰＬＵＳ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで６５℃で１時間にわたってストリッピングし、その後、１／１０，０００ ウサギ抗アクチンポリクローナル抗体で標識した。別段述べられなければ、全ての試薬を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
２μｇのプラスミドで４８～７２時間にわたって一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞を、３７℃でＡＰ１９０３で７．５～２０分間処理し（示されるとおり）、その後、ＨａｌｔＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌを含む５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ ８．０／１４０ｍＭ ＮａＣｌ／１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド／１％ デオキシコール酸ナトリウム／０．１％ ＳＤＳ）中で溶解した。この溶解物を集め、氷上で３０分間溶解した。細胞デブリをペレット化した後、重層する上清に由来するタンパク質濃度を、製造業者によって推奨されるように、ＢＣＡＴＭ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用いて、９６ウェルプレート中で測定した。３０μｇのタンパク質を、２．５％ ２－メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）中で５分間、９５℃で煮沸し、その後、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ １０％ Ｔｒｉｓ／グリシンタンパク質ゲルによって分離した。膜を、１／１０００ ウサギ抗ヒトカスパーゼ－９ポリクローナル抗体、続いて、１／１０，０００ ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でプローブした。タンパク質バンドを、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏケミルミネッセント基質を使用して検出した。等しいサンプル負荷を確実にするために、ブロットを、Ｒｅｓｔｏｒｅ ＰＬＵＳ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで６５℃で１時間にわたってストリッピングし、その後、１／１０，０００ ウサギ抗アクチンポリクローナル抗体で標識した。別段述べられなければ、全ての試薬を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
実施例１～５においておよび本明細書全体を通じて論じられる方法および構築物は、改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドをアッセイおよび使用するためにも使用され得る。
（実施例８：改変されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドの評価および活性）
基底活性およびＡＰ１９０３誘導活性の比較：
改変されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドの基底活性およびＡＰ１９０３誘導活性の両方を試験するために、ＳＥＡＰおよび種々の量のｉＣａｓｐ９変異体で共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞のＳＥＡＰ活性を試験した。ｉＣａｓｐ９ Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｑは、１μｇ ｉＣａｓｐ９／１００万個細胞（相対的ＳＥＡＰ活性単位 １４８９２８、１７９０８１、２０５７７２ 対 １１４５１８）または２μｇ ｉＣａｓｐ９／１００万個細胞（１３６８６３、１７５５２９、１７４３６６ 対 ９８８８９）のいずれかでトランスフェクトした細胞に関して、非改変ｉＣａｓｐ９より有意に低い基底活性を示した。２μｇ／１００万個細胞でトランスフェクトした場合に、全３種の改変されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドの基底シグナル伝達は、有意に高かった（ｐ値＜０．０５）。ｉＣａｓｐ９ Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｑはまた、ＡＰ１９０３に関する増大した推定ＩＣ５０を示したが、それらは全て、ＷＴに関して１ｐＭと比較して６ｐＭよりさらに低く（ＳＥＡＰアッセイに基づいて）、それらを潜在的に有用なアポトーシススイッチにする。
基底活性およびＡＰ１９０３誘導活性の比較：
改変されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドの基底活性およびＡＰ１９０３誘導活性の両方を試験するために、ＳＥＡＰおよび種々の量のｉＣａｓｐ９変異体で共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞のＳＥＡＰ活性を試験した。ｉＣａｓｐ９ Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｑは、１μｇ ｉＣａｓｐ９／１００万個細胞（相対的ＳＥＡＰ活性単位 １４８９２８、１７９０８１、２０５７７２ 対 １１４５１８）または２μｇ ｉＣａｓｐ９／１００万個細胞（１３６８６３、１７５５２９、１７４３６６ 対 ９８８８９）のいずれかでトランスフェクトした細胞に関して、非改変ｉＣａｓｐ９より有意に低い基底活性を示した。２μｇ／１００万個細胞でトランスフェクトした場合に、全３種の改変されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドの基底シグナル伝達は、有意に高かった（ｐ値＜０．０５）。ｉＣａｓｐ９ Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｑはまた、ＡＰ１９０３に関する増大した推定ＩＣ５０を示したが、それらは全て、ＷＴに関して１ｐＭと比較して６ｐＭよりさらに低く（ＳＥＡＰアッセイに基づいて）、それらを潜在的に有用なアポトーシススイッチにする。
タンパク質発現レベルおよびタンパク質分解の評価：
改変されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドの基底活性における観察された減少が、低下したタンパク質安定性またはトランスフェクション効率の変動に起因するという可能性を排除するために、およびｉＣａｓｐ９の自己タンパク質分解を試験するために、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞におけるカスパーゼ－９バリアントのタンパク質発現レベルをアッセイした。非改変キメラカスパーゼ－９ポリペプチド、ｉＣａｓｐ９ Ｄ３３０Ａ、およびｉＣａｓｐ９ Ｄ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｑのタンパク質レベルは全て、この研究で使用されるトランスフェクション条件下で類似のタンパク質レベルを示した。対照的に、ｉＣａｓｐ９ Ｎ４０５Ｑバンドは、特に２μｇの発現プラスミドを使用した場合に、他のものより濃いようであった。自己タンパク質分解は、上記使用したトランスフェクション条件では、おそらく生細胞のみが集められたことが原因で容易に検出可能でなかった。抗アクチンタンパク質再ブロッティングは、匹敵する溶解物量が、各レーンへと負荷されることを確認した。これらの結果は、ＳＥＡＰアッセイによって観察される、ｉＣａｓｐ９ Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｑ変異体における観察されたより低い基底シグナル伝達を支持する。
改変されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドの基底活性における観察された減少が、低下したタンパク質安定性またはトランスフェクション効率の変動に起因するという可能性を排除するために、およびｉＣａｓｐ９の自己タンパク質分解を試験するために、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞におけるカスパーゼ－９バリアントのタンパク質発現レベルをアッセイした。非改変キメラカスパーゼ－９ポリペプチド、ｉＣａｓｐ９ Ｄ３３０Ａ、およびｉＣａｓｐ９ Ｄ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｑのタンパク質レベルは全て、この研究で使用されるトランスフェクション条件下で類似のタンパク質レベルを示した。対照的に、ｉＣａｓｐ９ Ｎ４０５Ｑバンドは、特に２μｇの発現プラスミドを使用した場合に、他のものより濃いようであった。自己タンパク質分解は、上記使用したトランスフェクション条件では、おそらく生細胞のみが集められたことが原因で容易に検出可能でなかった。抗アクチンタンパク質再ブロッティングは、匹敵する溶解物量が、各レーンへと負荷されることを確認した。これらの結果は、ＳＥＡＰアッセイによって観察される、ｉＣａｓｐ９ Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５Ｑ、およびＤ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｑ変異体における観察されたより低い基底シグナル伝達を支持する。
考察：
ＳＥＡＰスクリーニングアッセイに基づいて、これら３種の改変されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドは、ｉＣａｓｐ９ ＷＴトランスフェクト体と比較して、より高いＡＰ１９０３非依存性ＳＥＡＰ活性、従って、より低い基底シグナル伝達を示した。しかし、二重変異（Ｄ３３０－Ｎ４０５Ｑ）は、単一アミノ酸変異体に対して、基底活性もＩＣ５０（０．０５ｎＭ）もいずれもさらに低下させなかった。観察された差異は、タンパク質不安定性にもトランスフェクションの間に使用されるプラスミドの異なる量（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｍｏｕｎｔ）にも起因しないようであった。
ＳＥＡＰスクリーニングアッセイに基づいて、これら３種の改変されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドは、ｉＣａｓｐ９ ＷＴトランスフェクト体と比較して、より高いＡＰ１９０３非依存性ＳＥＡＰ活性、従って、より低い基底シグナル伝達を示した。しかし、二重変異（Ｄ３３０－Ｎ４０５Ｑ）は、単一アミノ酸変異体に対して、基底活性もＩＣ５０（０．０５ｎＭ）もいずれもさらに低下させなかった。観察された差異は、タンパク質不安定性にもトランスフェクションの間に使用されるプラスミドの異なる量（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｍｏｕｎｔ）にも起因しないようであった。
（実施例９：改変されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドの評価および活性）
誘導性カスパーゼ－９は、ＡＰ１９０３依存性様式において、迅速な細胞周期非依存性の細胞自律性の殺滅を提供する。この誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドの特性の改善は、さらにより広い適用性を可能にする。タンパク質のリガンド非依存性細胞傷害を減少させ、低い発現レベルでその殺滅を増大させることは、望ましい。リガンド非依存性細胞傷害は、比較的低い発現レベルでは懸念ではないが、発現のレベルが、ベクター生成の間などの、初代標的細胞におけるよりも１桁以上高いレベルに達し得る場合には、実質的な影響を有し得る。また、細胞は、ＸＩＡＰおよびＢｃｌ－２のような、細胞が発現するアポトーシスインヒビターのレベルに起因して、低いカスパーゼ発現レベルに差次的に感受性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）であり得る。従って、より低い基底活性およびＡＰ１９
０３リガンドに対しておそらくより高い感受性を有するようにカスパーゼポリペプチドを再操作するために、４つの変異誘発ストラテジーを考案した。
誘導性カスパーゼ－９は、ＡＰ１９０３依存性様式において、迅速な細胞周期非依存性の細胞自律性の殺滅を提供する。この誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドの特性の改善は、さらにより広い適用性を可能にする。タンパク質のリガンド非依存性細胞傷害を減少させ、低い発現レベルでその殺滅を増大させることは、望ましい。リガンド非依存性細胞傷害は、比較的低い発現レベルでは懸念ではないが、発現のレベルが、ベクター生成の間などの、初代標的細胞におけるよりも１桁以上高いレベルに達し得る場合には、実質的な影響を有し得る。また、細胞は、ＸＩＡＰおよびＢｃｌ－２のような、細胞が発現するアポトーシスインヒビターのレベルに起因して、低いカスパーゼ発現レベルに差次的に感受性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）であり得る。従って、より低い基底活性およびＡＰ１９
０３リガンドに対しておそらくより高い感受性を有するようにカスパーゼポリペプチドを再操作するために、４つの変異誘発ストラテジーを考案した。
二量体化ドメイン： カスパーゼ－９は、生理学的レベルでは溶液中で単量体であるが、アポトーシス促進Ａｐａｆ駆動性「アポプトソーム」において起こるような高い発現レベルでは、カスパーゼ－９は、二量体化し得、Ｄ３１５での自己タンパク質分解および触媒活性の大きな増大をもたらす。Ｃ２８５は活性部位の一部であるので、変異Ｃ２８５Ａは、触媒としては不活性であり、陰性コントロール構築物として使用される。二量体化は、特に５個の残基、すなわち、Ｇ４０２、Ｃ４０３、Ｆ４０４、Ｎ４０５、およびＦ４０６の非常に密な相互作用を要する。各残基に関して、アミノ酸の異なるクラス（例えば、疎水性、極性など）を表す種々のアミノ酸置換を構築した。興味深いことに、Ｇ４０２での全ての変異体（すなわち、Ｇ４０２Ａ、Ｇ４０２Ｉ、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ）およびＣ４０３Ｐは、触媒として不活性なカスパーゼポリペプチドをもたらした。さらなるＣ４０３変異（すなわち、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、およびＣ４０３Ｔ）は、野生型カスパーゼに類似であったので、さらに追求しなかった。Ｆ４０４での変異は全て、基底活性を減少させたが、それはまた、約１ ｌｏｇから測定不能までの、ＩＣ５０に対する感受性の低下を反映した。効力の順序では、それらは、以下のとおりである：Ｆ４０４Ｙ＞Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ＞＞Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４Ｓ。Ｎ４０５での変異は、それぞれ、Ｎ４０５Ａの場合のように何ら効果を有さないか、Ｎ４０５Ｔにおけるように増大した基底活性を有するか、またはＮ４０５ＱおよびＮ４０５Ｆの場合のようにＩＣ５０に対して小さな（約５倍）またはより大きな有害作用に付随して低下した基底活性を有するかのいずれかであった。最後に、Ｆ４０４のように、Ｆ４０６での変異は全て基底活性を低下させ、それは、約１ ｌｏｇから測定不能までの、ＩＣ５０に対する感受性の低下を反映した。効力の順序では、それらは以下のとおりである：Ｆ４０６Ａ Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ＞Ｆ４０６Ｔ＞＞Ｆ４０６Ｌ。
溶液中で単量体（例えば、カスパーゼ－２、－８、－１０）または二量体（例えば、カスパーゼ－３）であることが公知の他のカスパーゼに由来する類似の５残基を置換することを除いて、二量体化ドメイン内で複合変異（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有するいくつかのポリペプチドを構築し、試験した。ＡＡＡＡＡアラニン置換とともに、カスパーゼ－２、－３、および－８から５残基の変化を含むカスパーゼ－９ポリペプチドは全て、触媒として不活性であった一方で、カスパーゼ－１０由来の等価な残基（ＩＳＡＱＴ）は、ＩＣ５０がより高いことを除いて低下した基底活性をもたらした。
全体としては、一貫してより低い基底活性の組み合わせに基づいて、ＩＣ５０に関してごく軽度の影響と組み合わせて、Ｎ４０５Ｑをさらなる実験のために選択した。効力を改善するために、Ｎ４０５Ｑ置換を有する改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドのコドン最適化したバージョン（Ｎ４０５Ｑｃｏと称する）を試験した。このポリペプチドは、野生型Ｎ４０５Ｑ置換されたカスパーゼ－９ポリペプチドよりＡＰ１９０３に対して感受性が僅かに高いようであった。
切断部位変異体： アポプトソーム内でのまたはＡＰ１９０３強制ホモ二量体化を介するカスパーゼ－９の凝集後に、Ｄ３１５での自己タンパク質分解が起こる。これは、Ａ３１６において、少なくとも一過性に、新たなアミノ末端を作り出す。興味深いことに、新たに現れたテトラペプチドである３１６ＡＴＰＦ３１９は、カスパーゼ－９阻害剤、ＸＩＡＰ（これは、二量体化について、カスパーゼ－９自体と、その二量体化モチーフＧＣＦＮＦ（上記で論じられる）において競合する）に結合する。従って、Ｄ３１５切断の最初の結果は、ＸＩＡＰ結合であり、さらなるカスパーゼ－９活性化を減弱する。しかし、第２のカスパーゼ切断部位は、Ｄ３３０に存在し、この部位は、下流のエフェクターカスパーゼであるカスパーゼ－３の標的である。アポトーシス促進圧（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）が増えるにつれて、Ｄ３３０はますます切断され、残基３１６～３３０内のＸＩＡＰ結合小ペプチドを放出し、従って、この軽減するカスパーゼ－９阻害剤（ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ Ｃａｓｐａｓｅ－９ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を取り除く。Ｄ３３０Ａ変異体を構築した。この変異体は、基底活性を低下させたが、Ｎ４０５Ｑほど低くはなかった。高コピー数でのＳＥＡＰアッセイによって、ＩＣ５０において僅かな増大が明らかになったが、初代Ｔ細胞での低コピー数では、実際には、標的細胞の改善された殺滅とともに、ＩＣ５０のわずかな増大があった。自己タンパク質分解部位Ｄ３１５での変異はまた、基底活性を低下させたが、これは、ＩＣ５０において大きな増大をもたらした。なぜならおそらくＤ３３０切断は、次にカスパーゼ活性化のために必要であったからである。Ｄ３１５ＡおよびＤ３３０Ａでの二重変異は、正確にはプロセシングされ得ない不活性な「ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）」カスパーゼ－９をもたらした。
他のＤ３３０変異体を作った（Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、およびＤ３３０Ｖを含む）。Ｄ３２７での変異はまた、コンセンサスカスパーゼ－３切断部位がＤｘｘＤであるので、Ｄ３３０での切断を妨げたが、いくつかのＤ３２７変異（すなわち、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、およびＤ３２７Ｒ）は、Ｆ３２６Ｋ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｋ、Ｌ３２９Ｇ、およびＡ３３１Ｋとともに（Ｄ３３０変異とは異なって）、基底活性を低下させなかったのでさらに追求しなかった。
ＸＩＡＰ結合変異体： 上記で論じられるように、Ｄ３１５での自己タンパク質分解は、ＸＩＡＰ結合テトラペプチドである３１６ＡＴＰＦ３１９を明らかにし、これは、ＸＩＡＰをカスパーゼ－９複合体へと「誘い出す」。ＡＴＰＦを、ミトコンドリア由来抗ＸＩＡＰインヒビターであるＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯからの類似のＸＩＡＰ結合テトラペプチドＡＶＰＩで置換すると、ＸＩＡＰへとより密に結合し得、基底活性を低下させ得る。しかし、この４残基置換は、効果を有しなかった。ＡＴＰＦモチーフ内での他の置換は、効果なし（すなわち、Ｔ３１７Ｃ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ）から、ＩＣ５０において非常に軽度（すなわち、Ｔ３１７Ｓ）、軽度（すなわち、Ｔ３１７Ａ）、大きい（すなわち、Ａ３１６Ｇ、Ｆ３１９Ｗ）増大までのいずれかの、低い基底活性までの範囲に及んだ。全体としては、ＸＩＡＰ結合テトラペプチドを変化させるという効果は、軽度であった；にもかかわらず、Ｔ３１７Ｓを二重変異において試験するために選択した（下記で論じられる）。なぜならＩＣ５０に対する効果は、この群の中で最も軽度であったからである。
リン酸化変異体： 少数のカスパーゼ－９残基が、リン酸化の阻害性（例えば、Ｓ１４４、Ｓ１８３、Ｓ１９５、Ｓ１９６、Ｓ３０７、Ｔ３１７）または活性化（すなわち、Ｙ１５３）のいずれかの標的であると報告された。従って、酸性残基（例えば、Ａｓｐ）での置換によってリン酸化を摸倣する（「ホスホ摸倣物」）かまたはリン酸化を排除するかのいずれかの変異を試験した。一般に、大部分の変異は、ホスホ摸倣物が試行されたか否かに拘わらず、基底活性を低下させた。低い基底活性を有する変異体の中で、Ｓ１４４での変異（すなわち、Ｓ１４４ＡおよびＳ１４４Ｄ）およびＳ１４９６Ｄは、ＩＣ５０に対して識別できる効果を有さず、変異体Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、およびＳ１９６Ａは、ＩＣ５０を軽度に増大させ、変異体Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ａ、およびＳ３０７Ａは、ＩＣ５０に対して大きな有害作用を有した。低い基底活性および最小の（あるとすれば）ＩＣ５０に対する効果の組み合わせに起因して、Ｓ１４４Ａを、二重変異のために選択した（以下で論じられる）。
二重変異体： Ｄ３３０Ａバリアントの僅かに改善した効力と、基底活性をさらに低下させ得る考えられる残基とを組み合わせるために、多くのＤ３３０Ａ二重変異体を構築および試験した。代表的には、それらは、ＩＣ５０においてごく僅かな増大はあったが低い基底活性を維持した（Ｎ４０５Ｑ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、およびＳ１９６Ａにおける第２の変異を含む）。二重変異体Ｄ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｔは、より高い基底活性を有し、Ｄ３３０Ａと、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、およびＴ３１７Ｅとでの二重変異体は、触媒として不活性であった。効力を改善するかまたはＩＣ５０を減少させることが意図された低い基底活性を有する一連の二重変異体Ｎ４０５Ｑを、試験した。これらの全ては、ｉＣ９－１．０に対して低い基底活性および僅かに増大したＩＣ５０の観点から、Ｎ４０５Ｑに類似であるようであり、Ｎ４０５Ｑと、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ｄ、およびＴ３１７Ｓとを含んだ。
ＳＥＡＰアッセイを行って、二量体化ドメイン変異体のうちのいくつかの基底活性およびＣＩＤ感受性を研究した。Ｎ４０５Ｑは、ＡＰ１９０３独立性シグナル伝達の上方のシフトによって決定されるように、ＷＴカスパーゼ－９より低い基底活性を有する試験した変異体の中で最もＡＰ１９０３感受性であった。Ｆ４０６Ｔは、この群からの最も低いＣＩＤ感受性であった。
変異体カスパーゼポリペプチドＤ３３０ＡおよびＮ４０５Ｑの二量体非依存性ＳＥＡＰ活性を、二重変異体Ｄ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｑとともにアッセイした。複数のトランスフェクションの結果（Ｎ＝７～１３）は、Ｎ４０５ＱがＤ３３０Ａより低い基底活性を有し、この二重変異体は中間であることを見出した。
変異体カスパーゼポリペプチドＤ３３０ＡおよびＮ４０５Ｑの平均（＋標準偏差、ｎ＝５）ＩＣ５０を、二重変異体Ｄ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｑとともに得ると、一過性のトランスフェクション活性において、Ｄ３３０Ａは、Ｎ４０５Ｑ変異体よりＡＰ１９０３に対して幾分感受性が高いが、ＷＴ カスパーゼ－９より約２倍感受性が低いことが示される。
ＳＥＡＰアッセイを、野生型（ＷＴ）カスパーゼ－９、Ｎ４０５Ｑ、不活性Ｃ２８５Ａ、およびＸＩＡＰ結合ドメイン内のいくつかのＴ３１７変異体を使用して行った。その結果は、Ｔ３１７ＳおよびＴ３１７Ａが、ＡＰｆ１９０３に対してＩＣ５０の大きなシフトなしに、基底活性を減少し得ることを示す。従って、Ｔ３１７Ｓを、Ｎ４０５Ｑとの二重変異体を作製するために選択した。
上記のＳＥＡＰアッセイからのＩＣ５０は、Ｔ３１７ＡおよびＴ３１７Ｓが、より低い基底活性を有するにも拘わらず、野生型カスパーゼ－９ポリペプチドに類似のＩＣ５０を有することを示した。
いくつかのＤ３３０変異体に由来する二量体非依存性ＳＥＡＰ活性は、試験したことクラスの全てのメンバー（Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｖ、Ｄ３３０Ｇ、およびＤ３３０Ｓを含む）が、野生型カスパーゼ－９より低い基底活性を有することを示した。Ｄ３３０Ａバリアントの基底およびＡＰ１９０３誘導活性化をアッセイした。１００万個のＨＥＫ２９３細胞あたり１または２μｇの変異体カスパーゼポリペプチドおよび０．５μｇのｐＳＨ１－ｋＳＥＡＰで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３／１６細胞のＳＥＡＰアッセイを、トランスフェクションの７２時間後に行った。２μｇの各発現プラスミド（ＷＴを含む）に基づいて正規化したデータを、１μｇベースのトランスフェクションからの正規化したデータと混合した。ｉＣａｓｐ９－Ｄ３３０Ａ、－Ｄ３３０Ｅ、および－Ｄ３３０Ｓは、野生型カスパーゼ－９より統計的に低い基底シグナル伝達を示した。
ウェスタンブロットの結果は、Ｄ３３０変異が、Ｄ３３０での切断をブロックし、僅かに大きく（より遅く移動する）小さなバンド（＜２０ｋＤａマーカー）をもたらすことを示した。他のブロットは、Ｄ３２７変異がまた、切断をブロックすることを示す。
示されたカスパーゼ－９ポリペプチドをコードするレトロウイルスで５回形質導入されたＰＧ１３の複数のクローンの平均蛍光強度を、測定した。基底活性が低いほど、代表的には、遺伝子連結されたレポーターＣＤ１９とともに、カスパーゼ－９遺伝子のより高い発現レベルへと変換される。その結果は、平均して、Ｎ４０５Ｑ変異体を発現するクローンが、より高いレベルのＣＤ１９を発現し、Ｄ３３０変異体またはＷＴカスパーゼ－９を超えて、Ｎ４０５Ｑのより低い基底活性を反映することを示す。ＶＳＶ－Ｇエンベロープベースのレトロウイルス上清で交差形質導入した（ｃｒｏｓｓ－ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）ＰＧ１３パッケージング細胞から得られるウイルス力価に対する種々のカスパーゼ変異の効果をアッセイした。レトロウイルスマスター細胞株生成に対するｉＣ９－由来基底シグナル伝達の効果を試験するために、レトロウイルスパッケージング細胞株ＰＧ１３を、４μｇ／ｍｌ トランスフェクション増強因子ポリブレンの存在下で、ＶＳＶ－Ｇベースのレトロウイルス上清で５回交差形質導入した。ｉＣ９－形質導入ＰＧ１３細胞をその後、形質導入の指標としてＰＥ結合体化抗ヒトＣＤ１９抗体で染色した。ｉＣ９－Ｄ３３０Ａ、－Ｄ３３０Ｅ、および－Ｎ４０５Ｑ形質導入ＰＧ１３細胞は、増強されたＣＤ１９平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。これは、より高いレトロウイルスコピー数を示し、より低い基底活性を意味した。ＰＧ１３形質導入体のウイルス力価をより直接的に試験するために、ＨＴ１０８０細胞を、ウイルス上清および８μｇ／ｍｌ ポリブレンで処理した。ＰＧ１３細胞において、ＷＴ ｉＣａｓｐ９に対してｉＣａｓｐ９－Ｄ３３０Ａ、－Ｎ４０５Ｑ、および－Ｄ３３０Ｅ形質導入体の増強されたＣＤ１９ ＭＦＩは、ＨＴ１０８０細胞において観察されるように、より高いウイルス力価と正に相関する。最初に低いウイルス力価（およそ１Ｅ５形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌ）に起因して、ウイルス力価における差異は、ウイルス収量を増大させるためのＨＡＴ処理の非存在下で観察されなかった。ＨＡＴ培地処理の際に、ｉＣ９－Ｄ３３０Ａ、－Ｎ４０５Ｑ、または－Ｄ３３０Ｅで形質導入したＰＧ１３細胞は、より高いウイルス力価を示した。ウイルス力価（形質導入単位）を、以下の式で計算する：ウイルス力価＝（形質導入の日の細胞数）＊（％ ＣＤ１９＋）／上清の容積（ｍｌ）。より低い基底活性を有するｉＣ９－変異体の効果をさらに調査するために、ｉＣ９－形質導入ＰＧ１３細胞の個々のクローン（コロニー）を、選択および拡大した。他のコホートより高いＣＤ１９ ＭＦＩを有するｉＣ９－Ｎ４０５Ｑクローンを、観察した。
初代Ｔ細胞において主に単一コピーでの種々のカスパーゼポリペプチドの効果を、アッセイした。これは、これら自殺遺伝子が治療上どのように使用されるかをより正確に反映し得る。驚くべきことに、そのデータは、Ｄ３３０Ａ変異体が、低力価でＡＰ１９０３に対して実際にはより感受性が高く、２４時間アッセイで試験した場合にＷＴカスパーゼ－９と少なくとも同程度に殺滅することを示す。このＮ４０５Ｑ変異体は、ＡＰ１９０３に対して感受性がより低く、２４時間以内にそれほど効率的に標的細胞を殺滅できない。
別個の健常ドナーに由来する６種の非独立性のＴ細胞サンプルを形質導入した結果は、Ｄ３３０Ａ変異体（ｍｕｔ）が、野生型カスパーゼ－９ポリペプチドよりＡＰ１９０３に対して感受性がより高いことを示した。
図５７は、図５６に示される６名の健常ドナーからの平均ＩＣ５０、範囲および標準偏差を示す。このデータは、改善が統計的に有意であることを示す。ｉＣａｓｐ９－Ｄ３３０Ａ変異体は、形質導入されたＴ細胞において改善されたＡＰ１９０３依存性細胞傷害を示した。健常ドナー（ｎ＝６）由来の初代Ｔ細胞を、変異または野生型ｉＣａｓｐ９またはｉＣａｓｐ９－Ｄ３３０Ａ、およびΔＣＤ１９細胞表面マーカーをコードするレトロウイルスで形質導入した。形質導入後、ｉＣａｓｐ９形質導入Ｔ細胞を、ＣＤ１９マイクロビーズおよび磁性カラムを使用して精製した。次いで、Ｔ細胞をＡＰ１９０３（０～１００ｎＭ）に曝し、ＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞に関して、フローサイトメトリーによって２４時間後に測定した。ｉＣａｓｐ９－Ｄ３３０ＡのＩＣ５０は、野生型ｉＣａｓｐ９より有意に低かった（ｐ＝０．００２）。
いくつかのＤ３３０変異体の結果は、試験した全６種のＤ３３０変異体（Ｄ３３０Ａ、Ｅ、Ｎ、Ｖ、Ｇ、およびＳ）が、野生型カスパーゼ－９ポリペプチドよりＡＰ１９０３に対して感受性が高いことを明らかにした。
Ｎ４０５Ｑ変異体は、他の二量体化ドメイン変異体（Ｎ４０４ＹおよびＮ４０６Ｙを含む）とともに、１０日以内に野生型カスパーゼ－９ポリペプチドまたはＤ３３０Ａとは区別できない、標的Ｔ細胞を殺滅し得る。０日目にＡＰ１９０３を受けた細胞に、４日目に第２の用量のＡＰ１９０３を与えた。このデータは、制御される効力スイッチの一部としてＮ４０５Ｑのように、低下した感受性カスパーゼ－９変異体の使用を支持する。
Ｎ４０５Ｑカスパーゼポリペプチドのコドン最適化（「Ｎ４０５Ｑｃｏ」といわれる）の結果は、コドン最適化が、おそらく発現においてのみ増大をもたらし、誘導性カスパーゼ機能に対して非常に僅かな効果を有することを明らかにした。これは、元のカスパーゼ－９遺伝子における共通コドンの使用を反映するようである。
カスパーゼ－９ポリペプチドは、インビボで用量応答曲線を有し、これは、カスパーゼ－９ポリペプチドを発現するＴ細胞の種々の画分を排除するために使用され得る。このデータはまた、０．５ｍｇ／ｋｇ ＡＰ１９０３の用量が、大部分の改変されたＴ細胞をインビボで排除するために十分であることを示す。
Ｄ３３０Ｅ ｉＣａｓｐ９で形質導入したＴ細胞のインビボでのＡＰ１９０３用量依存性排除をアッセイした。Ｔ細胞を、ＳＦＧ－ｉＣａｓｐ９－Ｄ３３０Ｅ－２Ａ－ΔＣＤ１９レトロウイルスで形質導入し、免疫不全マウス（ＮＳＧ）へとｉ．ｖ．注射した。２４時間後に、マウスに、ＡＰ１９０３ （０～５ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．注射した。さらに２４時間後、マウスを屠殺し、脾臓由来のリンパ球（Ａ）を単離し、ヒトＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞の頻度に関してフローサイトメトリーによって分析した。これは、ｉＣａｓｐ９－Ｄ３３０Ｅが、ＡＰ１９０３に応答して野生型ｉＣａｓｐ９と類似のインビボ細胞傷害プロフィールを示すことを示す
結論： 論じられるように、これまでのところ７８個の変異体のこの分析から、単一の変異体の変異（ｓｉｎｇｌｅ ｍｕｔａｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）のうち、Ｄ３３０変異は、幾分改善された効力と僅かに減少した基底活性とを合わせもつ。Ｎ４０５Ｑ変異体は魅力的でもある。なぜならそれらは、非常に低い基底活性と、ＩＣ５０において４～５倍の増大を反映するごく僅かに減少した効力とを有するからである。初代Ｔ細胞での実験は、Ｎ４０５Ｑ変異体が、標的細胞を効率的に、しかしＤ３３０変異体より幾分遅い動力学で殺滅し得るということを示した。これは、Ｎ４０５Ｑ変異体を、ＡＰ１９０３の最初の投与後に部分的に殺滅し、ＡＰ１９０３の２回目の投与で完全な殺滅まで達成され得る段階的自殺スイッチとして潜在的に非常に有用にする。
以下の表は、本明細書で論じられる方法に従って調製およびアッセイされた種々の改変されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドに関する基底活性およびＩＣ５０のまとめを提供する。この結果は、一度試験したサブセット（すなわち、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ｅ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ａ３３１Ｋ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、および以下の二重変異体：Ｄ３３０ＡとＳ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、またはＳ１８３Ａ；およびＮ４０５ＱとＳ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ｄ、またはＴ３１７Ｓ）を除いて、最低２回の独立したＳＥＡＰアッセイに基づく。４回の多面的アプローチを採用して、試験される改変されたキメラカスパーゼ－９ポリペプチドを生成した。「機能しない（ｄｅａｄ）」改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドは、もはやＡＰ１９０３に応答しなかった。二重変異体は、ハイフンによって示される。例えば、Ｄ３３０Ａ－Ｎ４０５Ｑは、３３０位での置換および４０５位での置換を有する改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドを示す。
実施例６～９において引用された参考文献
キメラカスパーゼポリペプチドは、アミノ酸置換（より低い基底活性を有するカスパーゼポリペプチドを生じるアミノ酸置換を含む）を含み得る。これらは、例えば、ｉＣａｓｐ９ Ｄ３３０Ａ、ｉＣａｓｐ９ Ｎ４０５Ｑ、およびｉＣａｓｐ９ Ｄ３３０Ａ Ｎ４０５Ｑを含み得、ＳＥＡＰレポーターベースの代用物殺滅アッセイにおいてそれらのＡＰ１９０３ ＩＣ５０に対して最小の有害な作用とともに、それぞれ、低いから検出不能までの基底活性を示した。
（実施例１０：特定の核酸配列およびアミノ酸配列の例）
以下は、キメラタンパク質およびＣＤ１９マーカーの発現のために使用され得る構築物の例を提供するヌクレオチド配列である。この図は、ＳＦＧ．ｉＣ９．２Ａ．２ＣＤ１９．ｇｃｓ構築物を示す。
表６：カスパーゼ９バリアントのさらなる例
以下は、キメラタンパク質およびＣＤ１９マーカーの発現のために使用され得る構築物の例を提供するヌクレオチド配列である。この図は、ＳＦＧ．ｉＣ９．２Ａ．２ＣＤ１９．ｇｃｓ構築物を示す。
ポリペプチドをコードするプラスミド挿入物の部分的配列は、２Ａリンカーによって隔てられた、誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドおよびＣＤ１９に結合するキメラ抗原レセプターをコードする（ここでこの２つのカスパーゼ－９ポリペプチドおよびキメラ抗原レセプターは翻訳の間に分断される）。本明細書で提供されるキメラ抗原レセプターの例は、共刺激ポリペプチド（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢおよびＯＸ４０などが挙げられるが、これらに限定されない）を含めることによってさらに改変され得る。本明細書で提供される誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドは、誘導性改変されたカスパーゼ－９ポリペプチド（例えば、本明細書で提供されるものなど）によって置換され得る。
（ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターおよびキメラ刺激分子の発現）
以下の実施例は、本願において提供されるように、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターおよびキメラ刺激分子に関する組成物および方法を論じる。カスパーゼ－９ベースの安全スイッチ、およびＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターまたはキメラ刺激分子を発現する細胞におけるその使用に関する組成物および方法もまた、含まれる。
以下の実施例は、本願において提供されるように、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターおよびキメラ刺激分子に関する組成物および方法を論じる。カスパーゼ－９ベースの安全スイッチ、およびＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターまたはキメラ刺激分子を発現する細胞におけるその使用に関する組成物および方法もまた、含まれる。
（実施例１１：ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターのデザインおよび活性）
（ＭＣ－ＣＡＲ構築物のデザイン）
誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０実験からの活性化データに基づいて、従来の内部ドメイン（例えば、ＣＤ２８および４－１ＢＢ）の代わりに、ＣＡＲ分子におけるＭＣシグナル伝達の潜在性を試験した。ＭＣ（ＡＰ１９０３結合ＦＫＢＰｖ３６領域なし）を、ＰＳＣＡ．ζの中にサブクローニングして、ＣＤ２８内部ドメインの位置を模倣した。レトロウイルスを、３つの構築物の各々に関して生成し、ヒトＴ細胞を形質導入し、その後、形質導入効率を測定して、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζが発現され得ることを実証した。これらＣＡＲ構築物の各々を有するＴ細胞が、ＰＳＣＡ＋腫瘍細胞を認識するそれらの能力を保持することを確認するために、６時間の細胞傷害アッセイを行った。これは、Ｃａｐａｎ－１標的細胞の溶解を示した。従って、ＣＡＲ分子の細胞質領域へのＭＣの付加は、ＣＡＲ発現または標的細胞上の抗原の認識に影響を及ぼさない。
（ＭＣ－ＣＡＲ構築物のデザイン）
誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０実験からの活性化データに基づいて、従来の内部ドメイン（例えば、ＣＤ２８および４－１ＢＢ）の代わりに、ＣＡＲ分子におけるＭＣシグナル伝達の潜在性を試験した。ＭＣ（ＡＰ１９０３結合ＦＫＢＰｖ３６領域なし）を、ＰＳＣＡ．ζの中にサブクローニングして、ＣＤ２８内部ドメインの位置を模倣した。レトロウイルスを、３つの構築物の各々に関して生成し、ヒトＴ細胞を形質導入し、その後、形質導入効率を測定して、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζが発現され得ることを実証した。これらＣＡＲ構築物の各々を有するＴ細胞が、ＰＳＣＡ＋腫瘍細胞を認識するそれらの能力を保持することを確認するために、６時間の細胞傷害アッセイを行った。これは、Ｃａｐａｎ－１標的細胞の溶解を示した。従って、ＣＡＲ分子の細胞質領域へのＭＣの付加は、ＣＡＲ発現または標的細胞上の抗原の認識に影響を及ぼさない。
ＭＣ共刺激は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞におけるＴ細胞殺滅、増殖および生存を増強する。短期間細胞傷害アッセイにおいて実証されるように、上記３種のＣＡＲデザインの各々は、Ｃａｐａｎ－１腫瘍細胞を認識および溶解する能力を示した。エフェクターＴ細胞における細胞溶解エフェクター機能は、腫瘍認識後に予め形成されたグランザイムおよびパーフォリンの放出によって媒介され、ＣＤ３ζを介する活性化は、共刺激の必要性なしにこのプロセスを誘導するために十分である。第１世代ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３ζ細胞質領域のみで構築されたＣＡＲ）は、腫瘍細胞を溶解し得る；しかし、生存および増殖は、共刺激の欠如に起因して損なわれる。よって、ＣＤ２８もしくは４－１ＢＢ共刺激ドメイン構築物の付加は、ＣＡＲ Ｔ細胞の生存および増殖の能力を有意に改善した。
ＭＣが生存および増殖に影響を及ぼす共刺激シグナルを同様に提供し得るかどうかを試験するために、共培養アッセイを、高い腫瘍：Ｔ細胞比（１：１、１：５、１：１０ Ｔ細胞 対 腫瘍細胞）の下で、ＰＳＣＡ＋ Ｃａｐａｎ－１腫瘍細胞で行った。Ｔ細胞および腫瘍細胞の数が等しかった（１：１）場合、非形質導入コントロールＴ細胞と比べて全３種の構築物からＣａｐａｎ－１－ＧＦＰ細胞の効率的な殺滅が存在した。しかし、ＣＡＲ Ｔ細胞を、多数の腫瘍細胞（１：１０）でチャレンジした場合、ＣＡＲ分子がＭＣもしくはＣＤ２８のいずれかを含んだ場合のみ、Ｃａｐａｎ－１－ＧＦＰ腫瘍細胞の有意な減少が存在した。
これら２種のＣＡＲによる共刺激の機構をさらに試験するために、細胞の生存率および増殖をアッセイした。ＭＣもしくはＣＤ２８を含むＰＳＣＡ ＣＡＲは、非形質導入Ｔ細胞およびＣＤ３ζのみＣＡＲと比べて改善された生存率を示し、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζおよびＰＳＣＡ．２８．ζによるＴ細胞増殖は、有意に増強された。他の群は、共刺激シグナル伝達領域を含むＣＡＲがＴ細胞の重要な生存および成長分子であるＩＬ－２（４）を生成することを示したので、ＥＬＩＳＡを、Ｃａｐａｎ－１腫瘍細胞でチャレンジしたＣＡＲ Ｔ細胞に由来する上清に対して行った。ＰＳＣＡ．２８．ζは、高レベルのＩＬ－２を生成したが、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζシグナル伝達はまた、有意なレベルのＩＬ－２（これは、これらアッセイにおいて観察されたＴ細胞生存および増殖に寄与するようである）を生成した。さらに、ＣＡＲ改変Ｔ細胞によるＩＬ－６生成を試験した。なぜならＩＬ－６は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞の効力および有効性において重要なサイトカインとして関与している（１５）からである。ＩＬ－２とは対照的に、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζは、初代Ｔ細胞におけるｉＭＣ活性化がＩＬ－６を誘導するという観察と一致して、ＰＳＣＡ．２８．ζと比べてより高レベルのＩＬ－６を生成した。まとめると、これらデータは、ＭＣを介する共刺激が、ＣＤ２８のものに類似の効果を生じ、それによって、腫瘍細胞認識後に、ＣＡＲ改変Ｔ細胞がＩＬ－２およびＩＬ－６を生成する（これは、Ｔ細胞生存を増強する）ことを示唆する。
ＣＡＲ改変Ｔ細胞を使用する免疫療法は、種々の悪性腫瘍の処置に関して大いに有望である。ＣＡＲは、最初に単一のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を用いてデザインされた（１６～１９）一方で、ＣＡＲ免疫療法の実施可能性を評価する臨床試験は、限られた臨床上の利益を示した（１，２，２０，２１）。これは、腫瘍認識後にＴ細胞の不完全な活性化（これは、インビボで制限された持続性および増殖をもたらす）に主に起因した（２２）。この欠陥に対処するために、ＣＡＲを、別の刺激ドメイン（しばしば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよびＤＡＰ１０を含むＴ細胞共刺激分子の細胞質部分に由来した）（４，２３～３０）を含むように操作した。これは、ＣＡＲ Ｔ細胞が、標的抗原の結合の際に適切な共刺激を受けることを可能にする。実際に、難治性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置ための、ＣＤ２８または４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲで行った臨床試験は、養子移入の後に、印象的なＴ細胞持続性、増殖および一連の腫瘍殺滅を実証した（６～８）。
ＣＤ２８共刺激は、ＣＤ１９＋リンパ腫の処置に関して明確な臨床上の利点を提供する。Ｓａｖｏｌｄｏおよび共同研究者らは、第１世代ＣＡＲ（ＣＤ１９．ζ）および第２世代ＣＡＲ（ＣＤ１９．２８．ζ）を比較するＣＡＲ－Ｔ細胞臨床試験を行ったところ、養子移入後にＣＤ２８がＴ細胞持続性および増殖を増強することを見出した（３１）。第２世代ＣＡＲの主な機能のうちの１つは、ＣＤ３ζによるＮＦＡＴ転写因子の活性化（シグナル１）、およびＣＤ２８または４－１ＢＢによるＮＦ－κＢの活性化（シグナル２）を介してＴ細胞の生存および成長を支持するＩＬ－２を生成する能力である（３２）。これは、ＮＦ－κＢを同様に活性化した他の分子が、ＣＡＲ分子内のＣＤ３ζ鎖と対になり得ることを示唆した。本発明者らのアプローチは、樹状細胞（ＤＣ）ワクチンのアジュバントとして本来は開発されたＴ細胞共刺激分子を使用した（１２，３３）。ＤＣの完全な活性化またはライセンス供与のために、ＴＬＲシグナル伝達は、ＴＮＦファミリーメンバー、ＣＤ４０（これは、抗原でプライミングされたＣＤ４＋ Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌと相互作用する）のアップレギュレーションに通常は関与する。ｉＭＣは、ＤＣにおいてＮＦ－κＢの強力なアクチベーターであったので、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０を組み込んだＣＡＲでのＴ細胞の形質導入は、Ｔ細胞への必要とされた共刺激（シグナル２）を提供し得、それらの生存および増殖を増強し得る。
一連の実験を行って、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０または両方の成分が、ｉＭＣ分子を使用する最適なＴ細胞刺激に必要とされるかどうかを試験した。顕著なことには、ＭｙＤ８８もＣＤ４０も、サイトカイン生成（ＩＬ－２およびＩＬ－６）によって測定される場合にはＴ細胞活性化を十分に誘導できないが、単一の融合タンパク質として組み合わされた場合には、強力なＴ細胞活性化を誘導し得ることが見出された。ＭＣを組み込むＰＳＣＡ ＣＡＲを構築し、その後、第１世代（ＰＳＣＡ．ζ）ＣＡＲおよび第２世代（ＰＳＣＡ．２８．ζ）ＣＡＲに対してその機能を比較した。ここでＭＣは、ＣＡＲ Ｔ細胞の生存および増殖を、ＣＤ２８内部ドメインと匹敵するレベルへと増強することが見出された。このことは、共刺激が十分であったことを示唆した。ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、ＰＳＣＡ．２８．ζより低レベルのＩＬ－２を生成した一方で、分泌レベルは、非形質導入Ｔ細胞およびＰＳＣＡ．ζ ＣＡＲで形質導入したＴ細胞より有意に高かった。他方で、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、ＰＳＣＡ．２８．ζ形質導入Ｔ細胞より有意に高いレベルのＩＬ－６（Ｔ細胞活性化と関連する重要なサイトカイン）を分泌した。このことは、ＭＣが、インビボで改善された腫瘍細胞殺滅へと翻訳され得るＣＡＲ機能に特有の特性を付与することを示した。これら実験は、ＭＣが、細胞外ＣＡＲドメインによる抗原認識後にＮＦ－κＢ（シグナル２）を活性化し得ることを示す。
ＭＣ－ＣＡＲのデザインおよび機能検証。ＣＤ３ζのみ、またはＣＤ２８とともにもしくはＭＣ内部ドメインとともに組み込む３種のＰＳＣＡ ＣＡＲ構築物をデザインした。形質導入効率（パーセンテージ）を、抗ＣＡＲ－ＡＰＣ（ＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３ドメインを認識する）によって測定した。Ｃ）ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζ ＣＡＲでのＴ細胞の高い形質導入効率を実証するフローサイトメトリー分析。Ｄ）１：１ Ｔ細胞 対 腫瘍細胞の比での６時間のＬＤＨ放出アッセイにおける、ＣＡＲ改変Ｔ細胞によるＰＳＣＡ＋ Ｃａｐａｎ－１腫瘍細胞の特異的溶解の分析。
ＭＣ－ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、長期間共培養アッセイにおいてＣａｐａｎ－１腫瘍細胞を殺滅する。１：１比において培養して７日後の、Ｃａｐａｎ－１－ＧＦＰ腫瘍細胞とともに培養したＣＡＲ改変Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。１：１および１：１０のＴ細胞 対 腫瘍細胞比での共培養アッセイにおけるフローサイトメトリーによる生存性ＧＦＰ＋細胞の定量。
ＭＣおよびＣＤ２８共刺激は、Ｔ細胞生存、増殖およびサイトカイン生成を高める。１：１０のＴ細胞 対 腫瘍細胞共培養アッセイから単離されたＴ細胞を、細胞生存率および細胞数に関してアッセイして、腫瘍細胞曝露に応じた生存および増殖を評価した。共培養アッセイからの上清を、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２およびＩＬ－６生成に関してその後測定した。
誘導性共刺激分子のデザインおよびＴ細胞活性化に対する効果。ＦＫＢＰｖ３６ ＡＰ１９０３－結合ドメイン（Ｆｖ’．Ｆｖ）のみ、またはＭｙＤ８８、ＣＤ４０もしくはＭｙＤ８８／ＣＤ４０融合タンパク質とともに組み込む４種のベクターを、デザインした。ＣＤ３＋ＣＤ１９＋フローサイトメトリー分析を使用する初代活性化Ｔ細胞の形質導入効率。１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありおよびなしでの活性化後の改変されたＴ細胞のＩＦＮ－γ生成の分析。１０ｎＭ ＡＰ１９０３ありおよびなしでの活性化後の改変されたＴ細胞のＩＬ－６生成の分析。
生存および成長の利点とは別に、ＭＣ誘導共刺激はまた、ＣＡＲ改変Ｔ細胞にさらなる機能を提供し得る。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖおよび共同研究者らは近年、ＭｙＤ８８シグナル伝達が、Ｔｈ１およびＴｈ１７の両方の応答にとって必須であり、それがＩＬ－１を介して作用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）駆動阻害に対して不応性にすることを実証した（３４）。ｉＭＣでの実験は、ＩＬ－１αおよびβが、ＡＰ１９０３活性化後に分泌されることを示す。さらに、Ｍａｒｔｉｎらは、Ｒａｓ、ＰＩ３ＫおよびプロテインキナーゼＣを介するＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞を溶解する細胞傷害性メディエーターであるグランザイムおよびパーフォリンのＮＦ－κＢ依存性誘導を生じることを実証した（３５）。従って、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０共活性化は、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＴｒｅｇ細胞の免疫抑制効果（固形腫瘍および他のタイプのがんの処置において決定的に重要であり得る機能）に抵抗性にし得る。
まとめると、ＭＣは、ＣＡＲ分子へと組み込まれ得、レトロウイルスで形質導入された初代Ｔ細胞は、明確な毒性またはＣＡＲ安定性の問題なしに、ＰＳＣＡ．ＭＣ．ζを発現し得る。さらに、ＭＣは、類似の共刺激をＣＤ２８の共刺激に提供するようである。ここで形質導入されたＴ細胞は、第１世代ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞と比べて改善された生存率、増殖および腫瘍殺滅を示す。
（実施例１２：参考文献）
以下の参考文献は、例えば、実施例１１におけるものを含め、引用されるか、または関連し得るさらなる情報を提供する。
以下の参考文献は、例えば、実施例１１におけるものを含め、引用されるか、または関連し得るさらなる情報を提供する。
（実施例１３：ＭＣ共刺激は、ＣＤ１９ ＣＡＲの機能および増殖を増強する）
ＣＤ１９抗原を認識する抗原認識部分を使用する、本明細書で論じられるものに類似の実験が提供される。本明細書で提供されるベクターは、ＣＤ１９＋腫瘍細胞を標的化するＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ＣＡＲ構築物（これは、誘導性カスパーゼ－９安全スイッチも組み込む）を構築するために改変され得ることは、理解される。
ＣＤ１９抗原を認識する抗原認識部分を使用する、本明細書で論じられるものに類似の実験が提供される。本明細書で提供されるベクターは、ＣＤ１９＋腫瘍細胞を標的化するＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ＣＡＲ構築物（これは、誘導性カスパーゼ－９安全スイッチも組み込む）を構築するために改変され得ることは、理解される。
ＭＣ共刺激が、他の抗原を標的化するＣＡＲにおいて機能するかどうかを試験するために、Ｔ細胞を、ＣＤ１９．ζまたはＣＤ１９．ＭＣ．ζのいずれかで改変した。改変された細胞のＣＤ１９＋ バーキットリンパ腫細胞株（ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ）に対する細胞傷害、活性化および生存をアッセイした。共培養アッセイにおいて、いずれかのＣＡＲで形質導入したＴ細胞は、１：１程度の低さのエフェクター 対 標的比でＣＤ１９＋
Ｒａｊｉ細胞の殺滅を示した。しかし、共培養アッセイからのサイトカイン生成の分析は、ＣＤ１９．ＭＣ．ζ形質導入Ｔ細胞が、ＣＤ１９．ζと比べてより高レベルのＩＬ－２およびＩＬ－６を生成することを示した。これは、ｉＭＣおよびＭＣシグナル伝達ドメインを含むＰＳＣＡ ＣＡＲで観察された共刺激効果と一致する。さらに、ＣＤ１９．ＭＣ．ζで形質導入したＴ細胞は、Ｒａｊｉ腫瘍細胞による活性化後に増強された増殖を示した。これらデータは、ＣＡＲ分子におけるＭＣシグナル伝達が、腫瘍細胞上で発現される標的抗原へのライゲーション後に、Ｔ細胞活性化、生存および増殖を改善することを実証する先の実験を裏付ける。
ｐＢＰ０５２６－ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９ｗｔ．２Ａ．ＣＤ１９ｓｃＦｖ．ＣＤ３４ｅ．ＣＤ８ｓｔｍ．ＭＣ．ゼータ
Ｒａｊｉ細胞の殺滅を示した。しかし、共培養アッセイからのサイトカイン生成の分析は、ＣＤ１９．ＭＣ．ζ形質導入Ｔ細胞が、ＣＤ１９．ζと比べてより高レベルのＩＬ－２およびＩＬ－６を生成することを示した。これは、ｉＭＣおよびＭＣシグナル伝達ドメインを含むＰＳＣＡ ＣＡＲで観察された共刺激効果と一致する。さらに、ＣＤ１９．ＭＣ．ζで形質導入したＴ細胞は、Ｒａｊｉ腫瘍細胞による活性化後に増強された増殖を示した。これらデータは、ＣＡＲ分子におけるＭＣシグナル伝達が、腫瘍細胞上で発現される標的抗原へのライゲーション後に、Ｔ細胞活性化、生存および増殖を改善することを実証する先の実験を裏付ける。
ｐＢＰ０５２６－ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９ｗｔ．２Ａ．ＣＤ１９ｓｃＦｖ．ＣＤ３４ｅ．ＣＤ８ｓｔｍ．ＭＣ．ゼータ
（実施例１４：ＭｙＤ８８／ＣＤ４０キメラ抗原レセプターおよび誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドを共発現するＴ細胞のサイトカイン生成）
種々のキメラ抗原レセプター構築物を作製して、抗原への曝露後の形質導入Ｔ細胞のサイトカイン生成を比較した。上記キメラ抗原レセプター構築物は全て、ＣＤ１９に結合される抗原認識領域を有した。本明細書で提供されるベクターが、誘導性カスパーゼ－９安全スイッチをも組み込むＣＡＲ構築物を構築するために改変され得ることは、理解される。このＣＡＲ構築物がＦＲＢドメインをさらに含み得ることは、さらに理解される。
（実施例１５：Ｈｅｒ２＋腫瘍細胞を標的化するためのＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ＣＡＲ構築物の例）
本明細書で提供されるベクターがＨｅｒ２＋腫瘍細胞を標的とするＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ＣＡＲ構築物（これは、誘導性カスパーゼ－９安全スイッチをも組み込む）を構築するために改変され得ることは、理解される。上記ＣＡＲ構築物がＦＲＢドメインをさらに含み得ることは、さらに理解される。
ＳＦＧ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ．ＣＤ３４ｅ．ＣＤ８ｓｔｍ．ＭＣ．ゼータ配列
種々のキメラ抗原レセプター構築物を作製して、抗原への曝露後の形質導入Ｔ細胞のサイトカイン生成を比較した。上記キメラ抗原レセプター構築物は全て、ＣＤ１９に結合される抗原認識領域を有した。本明細書で提供されるベクターが、誘導性カスパーゼ－９安全スイッチをも組み込むＣＡＲ構築物を構築するために改変され得ることは、理解される。このＣＡＲ構築物がＦＲＢドメインをさらに含み得ることは、さらに理解される。
（実施例１５：Ｈｅｒ２＋腫瘍細胞を標的化するためのＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ＣＡＲ構築物の例）
本明細書で提供されるベクターがＨｅｒ２＋腫瘍細胞を標的とするＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ＣＡＲ構築物（これは、誘導性カスパーゼ－９安全スイッチをも組み込む）を構築するために改変され得ることは、理解される。上記ＣＡＲ構築物がＦＲＢドメインをさらに含み得ることは、さらに理解される。
ＳＦＧ－Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ．ＣＤ３４ｅ．ＣＤ８ｓｔｍ．ＭＣ．ゼータ配列
（実施例１７：改善された治療用細胞二量体スイッチの開発）
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して指向されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する自家Ｔ細胞を使用する治療は、客観的奏効（ＯＲ）率が９０％に達するある種のタイプの白血病（「液性腫瘍」）およびリンパ腫の処置に対して形質転換効果を有する。それらが臨床上大いに有望であることおよびそれに伴う強い関心が予測できるにも関わらず、この成功は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に典型的な、観察される高レベルのオンターゲット、オフ腫瘍有害事象によって抑えられる。これらの革命的な処置のリスクを最小にしながら、その利益を維持するために、キメラカスパーゼポリペプチドベースの自殺遺伝子システムは開発された（これは、リガンド結合ドメイン（ＦＫＢＰ１２ｖ３６と称される）に融合された、改変されたカスパーゼ－９タンパク質の合成リガンド媒介性二量体化に基づく）。小分子二量体化剤に結合するＦＫＢＰ１２ｖ３６であるリミズシド（ＡＰ１９０３）の存在下で、カスパーゼ－９は活性化され、標的細胞の迅速なアポトーシスがもたらされる。低減したレベルのリミズシドの添加は、抑えられた殺滅率をもたらし得、Ｔ細胞排除の量が、キメラカスパーゼ改変Ｔ細胞のほぼなしからほぼ完全な排除まで制御されることを可能にし得る。この「二量体」スイッチの利用性を最大にするために、用量応答曲線の傾きは、可能な限りゆるやかであるべきである；さもなければ、正確な用量の投与は、困難である。最新の、第１世代の、臨床的ｉカスパーゼ－９構築物を用いると、約１．５～２ ｌｏｇを網羅する用量応答曲線が観察された。
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して指向されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する自家Ｔ細胞を使用する治療は、客観的奏効（ＯＲ）率が９０％に達するある種のタイプの白血病（「液性腫瘍」）およびリンパ腫の処置に対して形質転換効果を有する。それらが臨床上大いに有望であることおよびそれに伴う強い関心が予測できるにも関わらず、この成功は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に典型的な、観察される高レベルのオンターゲット、オフ腫瘍有害事象によって抑えられる。これらの革命的な処置のリスクを最小にしながら、その利益を維持するために、キメラカスパーゼポリペプチドベースの自殺遺伝子システムは開発された（これは、リガンド結合ドメイン（ＦＫＢＰ１２ｖ３６と称される）に融合された、改変されたカスパーゼ－９タンパク質の合成リガンド媒介性二量体化に基づく）。小分子二量体化剤に結合するＦＫＢＰ１２ｖ３６であるリミズシド（ＡＰ１９０３）の存在下で、カスパーゼ－９は活性化され、標的細胞の迅速なアポトーシスがもたらされる。低減したレベルのリミズシドの添加は、抑えられた殺滅率をもたらし得、Ｔ細胞排除の量が、キメラカスパーゼ改変Ｔ細胞のほぼなしからほぼ完全な排除まで制御されることを可能にし得る。この「二量体」スイッチの利用性を最大にするために、用量応答曲線の傾きは、可能な限りゆるやかであるべきである；さもなければ、正確な用量の投与は、困難である。最新の、第１世代の、臨床的ｉカスパーゼ－９構築物を用いると、約１．５～２ ｌｏｇを網羅する用量応答曲線が観察された。
治療用細胞二量体機能に対して改善するために、第２のレベルのコントロールは、カスパーゼ－９凝集物に添加され得、ラパマイシン駆動性の低い凝集レベルを、リミズシド駆動性の高い二量体化レベルから分離する。第１のコントロールレベルにおいて、キメラカスパーゼポリペプチドは、ラパマイシン／シロリムス（または非免疫抑制アナログ）によって、そのカルボキシ末端に８９－アミノ酸ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン（ｍＴＯＲ内にコードされる）の１またはこれより多くのコピーを含むように改変されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）へと動員される（図３、左パネル）。ｉカスパーゼ－９のリミズシド駆動性ホモ二量体化に対して、リミズシド結合したＦＫＢＰ１２ｖ３６（約０．１ｎＭ）に対して、ＦＲＢに対するラパマイシン結合したＦＫＢＰ１２ｖ３６の相対的親和性（Ｋｄ 約４ｎＭ）および架橋されたタンパク質の「千鳥状（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）」の幾何的配置の両方に起因して、カスパーゼ－９オリゴマー化のレベルは減少されると推定される。「微調整（ｆｉｎｅ－ｔｕｎｉｎｇ）のさらなるレベルが、各ＣＡＲに融合されるＦＲＢドメインの数を変化させることによってＣＡＲドッキング部位において提供され得る。それに対して、標的依存の特異性は、通常の標的駆動性ＣＡＲクラスター化によって提供され、これは翻って、ラパマイシンの存在下でキメラカスパーゼポリペプチドクラスター化に変換されるべきである。最大の細胞排除レベルが必要とされる場合、リミズシドはまた、最新のプロトコル（すなわち、現在は、０．４ ｍｇ／ｋｇの２時間の注入で）の下で投与され得る（図３、右パネル）。
方法：
ラパログ制御されるキメラカスパーゼポリペプチドのベクター： Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ研究室は、ｍＴＯＲ／ＦＲＡＰから最小ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン（残基２０２５～２１１４）を最初に同定し、それをラパマイシン解離定数（Ｋｄ）
約４ｎＭを有すると決定した（Ｃｈｅｎ Ｊら （９５） ＰＮＡＳ ９２， ４９４７－５１）。その後の研究から、非免疫抑制性「隆起した（ｂｕｍｐｅｄ）」ラパマイシンアナログ（「ラパログ」）に対して比較的高い親和性で結合するＦＲＢの直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）変異体（例えば、ＦＲＢｌ（Ｌ２０９８）が同定された（Ｌｉｂｅｒｌｅｓ ＳＤ （９７） ＰＮＡＳ ９４， ７８２５－３０； Ｂａｙｌｅ ＪＨ （０６） Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｌ １３， ９９－１０７）。ｉＣ９を動員し得る改変されたＭＣ－ＣＡＲを開発するために、カルボキシ末端ＣＤ３ζドメイン（ｐＢＰ０５２６由来）および（ｐＢＰ０５４５、図７）を、１または２個のタンデムＦＲＢＬドメインに、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０、およびＣＤ３ζドメインを含む市販の合成ＳａｌＩ－ＭｌｕＩフラグメントを使用して融合して、それぞれ、ベクターｐＢＰ０６１２およびｐＢＰ０６１１を産生する（図４および５、ならび表７および８）。このアプローチはまた、標準の「非ＭｙＤ８８／ＣＤ４０」構築物（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０、および／または４－１ＢＢ、ならびにＣＤ３ζを含む構築物）を含むいかなるＣＡＲ構築物にも適用可能であるはずである。
ラパログ制御されるキメラカスパーゼポリペプチドのベクター： Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ研究室は、ｍＴＯＲ／ＦＲＡＰから最小ＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン（残基２０２５～２１１４）を最初に同定し、それをラパマイシン解離定数（Ｋｄ）
約４ｎＭを有すると決定した（Ｃｈｅｎ Ｊら （９５） ＰＮＡＳ ９２， ４９４７－５１）。その後の研究から、非免疫抑制性「隆起した（ｂｕｍｐｅｄ）」ラパマイシンアナログ（「ラパログ」）に対して比較的高い親和性で結合するＦＲＢの直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）変異体（例えば、ＦＲＢｌ（Ｌ２０９８）が同定された（Ｌｉｂｅｒｌｅｓ ＳＤ （９７） ＰＮＡＳ ９４， ７８２５－３０； Ｂａｙｌｅ ＪＨ （０６） Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｌ １３， ９９－１０７）。ｉＣ９を動員し得る改変されたＭＣ－ＣＡＲを開発するために、カルボキシ末端ＣＤ３ζドメイン（ｐＢＰ０５２６由来）および（ｐＢＰ０５４５、図７）を、１または２個のタンデムＦＲＢＬドメインに、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０、およびＣＤ３ζドメインを含む市販の合成ＳａｌＩ－ＭｌｕＩフラグメントを使用して融合して、それぞれ、ベクターｐＢＰ０６１２およびｐＢＰ０６１１を産生する（図４および５、ならび表７および８）。このアプローチはまた、標準の「非ＭｙＤ８８／ＣＤ４０」構築物（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０、および／または４－１ＢＢ、ならびにＣＤ３ζを含む構築物）を含むいかなるＣＡＲ構築物にも適用可能であるはずである。
結果：
原理証明として、２個のタンデムＦＲＢｌドメインを、第１世代Ｈｅｒ２－ＣＡＲまたは誘導性ｉカスパーゼ－９を共発現する第１世代ＣＤ１９－ＣＡＲのいずれかに融合した。２９３細胞を、構成的レポータープラスミド、ＳＲα－ＳＥＡＰで、Ｈｅｒ２－ＣＡＲ－ＦＲＢｌ２、ｉカスパーゼ－９、Ｈｅｒ２－ＣＡＲ－ＦＲＢｌ２＋ｉＣａｓｐ９、ｉＣ９－ＣＡＲ（１９）．ＦＲＢｌ２（ＣＤ１９－ＣＡＲ－ＦＲＢｌ２およびｉカスパーゼ９の両方を共発現する）をコードする正規化したレベルの発現プラスミド、またはコントロールベクターとともに一過性にトランスフェクトした。２４時間後に、細胞を洗浄し、ラパマイシンまたはリミズシドの半対数希釈物とともに二連のウェルへと分けた。薬物とともに一晩インキュベーションした後、ＳＥＡＰ活性を決定した。興味深いことに、ラパマイシン添加は、約５０％減少までのＳＥＡＰ活性の広い減少をもたらした（図６）。この用量依存性減少は、ＦＲＢタグ化ＣＡＲおよびＦＫＢＰタグ化カスパーゼ－９の両方の存在を必要とした。対照的に、ＡＰ１９０３は、遙かに低い薬物レベルで、ＳＥＡＰ活性を正常レベルの約２０％（以前の経験に匹敵）へと減少させた。細胞生存性をラパマイシンで減少させ、必要であればインビボでより効率的な殺滅のためにリミズシドへと切り替えることは可能であるようである。さらに、オンターゲットまたはオフターゲット媒介性ＣＡＲクラスター化は、主にｓｃＦｖ結合の部位において殺滅の感受性を増大させるはずである。
ヘテロスイッチのさらなる入れ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）：
原理証明として、２個のタンデムＦＲＢｌドメインを、第１世代Ｈｅｒ２－ＣＡＲまたは誘導性ｉカスパーゼ－９を共発現する第１世代ＣＤ１９－ＣＡＲのいずれかに融合した。２９３細胞を、構成的レポータープラスミド、ＳＲα－ＳＥＡＰで、Ｈｅｒ２－ＣＡＲ－ＦＲＢｌ２、ｉカスパーゼ－９、Ｈｅｒ２－ＣＡＲ－ＦＲＢｌ２＋ｉＣａｓｐ９、ｉＣ９－ＣＡＲ（１９）．ＦＲＢｌ２（ＣＤ１９－ＣＡＲ－ＦＲＢｌ２およびｉカスパーゼ９の両方を共発現する）をコードする正規化したレベルの発現プラスミド、またはコントロールベクターとともに一過性にトランスフェクトした。２４時間後に、細胞を洗浄し、ラパマイシンまたはリミズシドの半対数希釈物とともに二連のウェルへと分けた。薬物とともに一晩インキュベーションした後、ＳＥＡＰ活性を決定した。興味深いことに、ラパマイシン添加は、約５０％減少までのＳＥＡＰ活性の広い減少をもたらした（図６）。この用量依存性減少は、ＦＲＢタグ化ＣＡＲおよびＦＫＢＰタグ化カスパーゼ－９の両方の存在を必要とした。対照的に、ＡＰ１９０３は、遙かに低い薬物レベルで、ＳＥＡＰ活性を正常レベルの約２０％（以前の経験に匹敵）へと減少させた。細胞生存性をラパマイシンで減少させ、必要であればインビボでより効率的な殺滅のためにリミズシドへと切り替えることは可能であるようである。さらに、オンターゲットまたはオフターゲット媒介性ＣＡＲクラスター化は、主にｓｃＦｖ結合の部位において殺滅の感受性を増大させるはずである。
ヘテロスイッチのさらなる入れ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）：
誘導性カスパーゼ－９は、誘導性シグナル伝達分子の大きなコホートの中で試験した最速かつ最もＣＩＤ感受性自殺遺伝子であることが解ったが、アポトーシス（または細胞死の手段として炎症および壊死を引き起こす、関連するネクロトーシス）をもたらす多くの他のタンパク質またはタンパク質ドメインは、このアプローチを使用してホモ二量体またはヘテロ二量体ベースの殺滅に適合され得る。
ラパマイシン（またはラパログ）媒介性膜動員によって活性化され得るタンパク質の部分的リストとしては、以下が挙げられる：
・他のカスパーゼ（すなわち、カスパーゼ１～１４、これは、哺乳動物において同定されている）
・天然のカスパーゼ二量体化剤として機能する他のカスパーゼ関連アダプター分子（例えば、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ（ＣＡＲＤ）、およびＡＳＣ（ＣＡＲＤ）（括弧の中は二量体化ドメイン）。
ラパマイシン（またはラパログ）媒介性膜動員によって活性化され得るタンパク質の部分的リストとしては、以下が挙げられる：
・他のカスパーゼ（すなわち、カスパーゼ１～１４、これは、哺乳動物において同定されている）
・天然のカスパーゼ二量体化剤として機能する他のカスパーゼ関連アダプター分子（例えば、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ（ＣＡＲＤ）、およびＡＳＣ（ＣＡＲＤ）（括弧の中は二量体化ドメイン）。
・アポトーシス促進性Ｂｃｌ－２ファミリーメンバー（例えば、ＢａｘおよびＢａｋ、これは、ミトコンドリア脱分極（またはＢｃｌ－ｘＬまたはＢｃｌ－２などの抗アポトー阻止促進ファミリーメンバーの誤った局在化）を引き起こし得る）。
・ＭＬＫＬ媒介性膜溶解に起因して、炎症促進性細胞死（壊死と称される）の関連形態を引き起こし得るＲＩＰＫ３またはＲＩＰＫ１－ＲＨＩＭドメイン。
その標的依存性凝集レベルに起因して、ＣＡＲレセプターは、アポトーシス促進分子のラパマイシン媒介性動員のための理想的なドッキング部位を提供するはずである。にもかかわらず、共発現された誘導性キメラカスパーゼ様分子の存在下でラパログ媒介性細胞死を潜在的に提供し得るＦＲＢドメインを含む多価のドッキング部位の多くの例が存在する。
表７：ｉＣａｓｐ９－２Ａ－ΔＣＤ１９－Ｑ－ＣＤ２８ｓｔｍ－ＭＣｚ－ＦＲＢｌ２
表７：ｉＣａｓｐ９－２Ａ－ΔＣＤ１９－Ｑ－ＣＤ２８ｓｔｍ－ＭＣｚ－ＦＲＢｌ２
表８
表９ ｐＢＰ０５４５．ｐＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ＭＣ－ゼータ
本明細書で論じられる方法（ベクターを構築するための方法、活性または機能に関するアッセイ、患者への投与、細胞をトランスフェクトまたは形質転換する、アッセイならびに患者をモニターするための方法が挙げられるが、これらに限定されない）はまた、以下の特許および特許出願において見出され得、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
米国特許出願第１４／２１０，０３４号（標題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＯＮＴＲＯＬＬＩＮＧ Ｔ ＣＥＬＬ ＰＲＯＬＩＦＥＲＡＴＩＯＮ、２０１４年３月１３日出願）；米国特許出願第１３／１１２，７３９号（２０１１年５月２０日出願、米国特許第９，０８９，５２０号として２０１５年７月２８日発行、および標題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ
ＩＮＤＵＣＩＮＧ ＳＥＬＥＣＴＩＶＥ ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ）；米国特許出願第１４／６２２，０１８号（２０１４年２月１３日出願、標題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＡＣＴＩＶＡＴＩＮＧ Ｔ ＣＥＬＬＳ ＵＳＩＮＧ ＡＮ ＩＮＤＵＣＩＢＬＥ ＣＨＩＭＥＲＩＣ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥ）；米国特許出願第１３／１１２，７３９号（２０１１年５月２０日出願、標題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＮＤＵＣＩＮＧ ＳＥＬＥＣＴＩＶＥ ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ）；米国特許出願第１３／７９２，１３５号（２０１３年３月１０日出願、標題ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＣＡＳＰＡＳＥ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ
ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ）；米国特許出願第１４／２９６，４０４号（２０１４年６月４日出願、標題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＮＤＵＣＩＮＧ ＰＡＲＴＩＡＬ ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ ＵＳＩＮＧ ＣＡＳＰＡＳＥ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ）；米国仮特許出願第６２／０４４，８８５号（２０１４年９月２日出願）、および米国特許出願第１４／８４２，７１０号（２０１５年９月１日出願、各々は標題ＣＯＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮ
ＯＦ ＣＨＩＭＥＲＩＣ ＡＮＴＩＧＥＮ ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ ＢＹ ＭｙＤ８８ ＡＮＤ ＣＤ４０ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ）；米国特許出願第１４／６４０，５５４号（２０１５年３月６日出願、標題ＣＡＳＰＡＳＥ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ）；米国特許第７，４０４，９５０号（Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｄ．らへ２００８年６月２９日発行）、Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｄ．らによる米国特許出願第１２／４４５，９３９号（２０１０年１０月２６日出願）；Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｄ．らによる米国特許出願第１２／５６３，９９１号（２００９年９月２１日出願）；Ｓｌａｗｉｎ， Ｋ．らによる米国特許出願第１３／０８７，３２９号（２０１１年４月１４日出願）；Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｄ．らによる米国特許出願第１３／７６３，５９１号（２０１３年２月８日出願）；ならびに国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２００４（２０１４年３月７日出願、２０１４年１０月９日にＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２００４として公開、標題ＭＯＤＩＦＩＥＤ
ＣＡＳＰＡＳＥ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ）。
ＩＮＤＵＣＩＮＧ ＳＥＬＥＣＴＩＶＥ ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ）；米国特許出願第１４／６２２，０１８号（２０１４年２月１３日出願、標題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＡＣＴＩＶＡＴＩＮＧ Ｔ ＣＥＬＬＳ ＵＳＩＮＧ ＡＮ ＩＮＤＵＣＩＢＬＥ ＣＨＩＭＥＲＩＣ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥ）；米国特許出願第１３／１１２，７３９号（２０１１年５月２０日出願、標題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＮＤＵＣＩＮＧ ＳＥＬＥＣＴＩＶＥ ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ）；米国特許出願第１３／７９２，１３５号（２０１３年３月１０日出願、標題ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＣＡＳＰＡＳＥ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ
ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ）；米国特許出願第１４／２９６，４０４号（２０１４年６月４日出願、標題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＮＤＵＣＩＮＧ ＰＡＲＴＩＡＬ ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ ＵＳＩＮＧ ＣＡＳＰＡＳＥ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ）；米国仮特許出願第６２／０４４，８８５号（２０１４年９月２日出願）、および米国特許出願第１４／８４２，７１０号（２０１５年９月１日出願、各々は標題ＣＯＳＴＩＭＵＬＡＴＩＯＮ
ＯＦ ＣＨＩＭＥＲＩＣ ＡＮＴＩＧＥＮ ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ ＢＹ ＭｙＤ８８ ＡＮＤ ＣＤ４０ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ）；米国特許出願第１４／６４０，５５４号（２０１５年３月６日出願、標題ＣＡＳＰＡＳＥ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ）；米国特許第７，４０４，９５０号（Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｄ．らへ２００８年６月２９日発行）、Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｄ．らによる米国特許出願第１２／４４５，９３９号（２０１０年１０月２６日出願）；Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｄ．らによる米国特許出願第１２／５６３，９９１号（２００９年９月２１日出願）；Ｓｌａｗｉｎ， Ｋ．らによる米国特許出願第１３／０８７，３２９号（２０１１年４月１４日出願）；Ｓｐｅｎｃｅｒ， Ｄ．らによる米国特許出願第１３／７６３，５９１号（２０１３年２月８日出願）；ならびに国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２００４（２０１４年３月７日出願、２０１４年１０月９日にＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２２００４として公開、標題ＭＯＤＩＦＩＥＤ
ＣＡＳＰＡＳＥ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ）。
（実施例１８：ＦＲＢベースの足場アセンブリおよびｉカスパーゼ－９の活性化）
ｉカスパーゼ－９がＦＲＢＬのタンデム多量体によって凝集され得るかどうかを決定するために、ＦＲＢＬの１～４個のタンデムコピーを、発現ベクターｐＳＨ１へとサブクローニングし、ＳＲαプロモーターから導入遺伝子発現を駆動した。構築物のサブセットはまた、ＦＲＢ－足場の膜局在化のためにｖ－Ｓｒｃ由来のミリストイル化標的化ドメインを含んだ（図１２Ａ）。２９３細胞を、ＳＲα－ＳＥＡＰレポータープラスミドで、ＦＫＢＰ１２－Δカスパーゼ－９（ｉカスパーゼ－９／ｉＣ９）とともに、ＦＲＢＬの０個、１個、または４個のタンデムコピーを含むいくつかのＦＲＢベースの非ミリストイル化足場タンパク質のうちの１つを加えて、トランスフェクトした。ラパマイシンまたはアナログ、Ｃ７－イソプロポキシ－ラパマイシン（Ｌｕｅｎｇｏらの方法（Ｌｕｅｎｇｏ ＪＩ
（９５） Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｌ ２， ４７１－８１． Ｌｕｅｎｇｏ ＪＩ （９４） Ｊ． Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ５９： ６５１２－１３）によって創製された）のうちのいずれかを添加すると、４×ＦＲＢ構築物が存在する場合に、ＩＣ５０ 約３ｎＭ（図１２Ｂ）で推測される（図８Ｂ、１０Ｄ、１０Ｅ）ように、細胞死と一致してレポーター活性の減少がもたらされた。ラパマイシンの添加は、１（または０）個のＦＲＢドメインのみが存在する（これは、ｉＣａｓｐ９のオリゴマー化を排除する（図１０Ｃ））場合にはレポーター活性に対して効果を有しなかった。ＦＲＢ－足場がミリストイル化されて（図１２Ｃ）、その足場を原形質膜へ局在化させる場合に、同等の効果が得られた。従って、カスパーゼ－９ポリペプチドは、ＦＲＢベースの足場に対してオリゴマー化される場合に、ラパマイシンまたはアナログで活性化され得る。
（９５） Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｌ ２， ４７１－８１． Ｌｕｅｎｇｏ ＪＩ （９４） Ｊ． Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ５９： ６５１２－１３）によって創製された）のうちのいずれかを添加すると、４×ＦＲＢ構築物が存在する場合に、ＩＣ５０ 約３ｎＭ（図１２Ｂ）で推測される（図８Ｂ、１０Ｄ、１０Ｅ）ように、細胞死と一致してレポーター活性の減少がもたらされた。ラパマイシンの添加は、１（または０）個のＦＲＢドメインのみが存在する（これは、ｉＣａｓｐ９のオリゴマー化を排除する（図１０Ｃ））場合にはレポーター活性に対して効果を有しなかった。ＦＲＢ－足場がミリストイル化されて（図１２Ｃ）、その足場を原形質膜へ局在化させる場合に、同等の効果が得られた。従って、カスパーゼ－９ポリペプチドは、ＦＲＢベースの足場に対してオリゴマー化される場合に、ラパマイシンまたはアナログで活性化され得る。
（実施例１９：ＦＫＢＰ１２ベースの足場はアセンブルし、ＦＲＢ－Δカスパーゼ－９を活性化する）
ヘテロ二量体化およびカスパーゼ－９アセンブリの極性が逆にされ得るかどうかを決定するために、ＦＫＢＰ１２の１～４個の（ｏｎｅ ｔｏ ｆｏｕｒ １ ｔｏ ４）タンデムコピーを、上記のように、発現ベクターｐＳＨ１へとサブクローニングした（図１３Ａ）。上記のように、２９３細胞を、ＳＲα－ＳＥＡＰレポータープラスミドで、ＦＲＢＬ－Δカスパーゼ－９とともに、ＦＫＢＰ１２の１または４個のタンデムコピーを含む非ミリストイル化足場タンパク質を加えてトランスフェクトした。ラパマイシンまたはアナログのＣ７－イソプロポキシ－ラパマイシンのいずれかを添加すると、４×ＦＲＢＬ構築物が存在する場合に、ＩＣ５０ 約３ｎＭでの細胞死と一致して、レポーター活性の減少がもたらされた（図１３Ｂ）。ラパマイシンの添加は、わずか１（または０）個のＦＫＢＰドメインが存在する場合には、図１２の結果に類似して、レポーター活性に対して影響を有しなかった。従って、カスパーゼ－９は、ＦＲＢまたはＦＫＢＰ１２ベースの足場上でオリゴマー化される場合に、ラパマイシンまたはアナログで活性化され得る。
（実施例２０：初代Ｔ細胞におけるＦＲＢベースの足場アセンブリおよびｉカスパーゼ－９の活性化）
ｉカスパーゼ－９が初代非形質転換Ｔ細胞においてＦＲＢＬのタンデム多量体によって凝集され得るかどうかを決定するために、ＦＲＢＬの０～３個のタンデムコピーを、表面マーカーとして働くＣＤ１９の非シグナル伝達短縮型バージョンとともにカスパーゼ－９（ｉＣ９）をコードするレトロウイルス発現ベクターｐＢＰ０２２０－－ｐＳＦＧ－ｉＣ９．Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９へとサブクローニングした。得られた一体化したプラスミドベクター（ｐＢＰ０７５６－ｉＣ９．Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９．Ｐ２Ａ－ＦＲＢＬ、ｐＢＰ０７５５－ｉＣ９．Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９．Ｐ２Ａ－ＦＲＢＬ２、およびｐＢＰ０７５７－ｉＣ９．Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９．Ｐ２Ａ－ＦＲＢＬ３と称する）を、その後使用して、それぞれ、１個、２個または３個のタンデムＦＲＢＬドメインの足場をコードする感染性γ－レトロウイルス（γ－ＲＶ）を作製した。
３名の異なるドナーに由来するＴ細胞を、上記ベクターで形質導入し、種々のラパマイシン希釈物とともにプレーティングした。２４時間および４８時間後、細胞アリコートを採取し、抗ＣＤ１９ ＡＰＣで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。細胞を、ＦＳＣ 対 ＳＳＣによって生きているリンパ球に対して最初にゲーティングし、次いで、ＣＤ１９ヒストグラムとしてプロットし、ＣＤ１９＋ゲート内で高、中および低発現に関してサブゲーティングした。線グラフを作製して、高レベルのＣＤ１９を発現する総細胞集団の相対的パーセンテージを表し、薬物なしの「０」コントロールに対して正規化した（図１４）。形質転換した上皮細胞において行った代用物ＳＥＡＰレポーターアッセイと同様に、ラパマイシン濃度が増大するにつれて、ＣＤ１９ｈｉ細胞のパーセンテージは、カスパーゼ－９およびＦＲＢＬ２またはＦＲＢＬ３を発現する細胞において減少したが、カスパーゼ－９を０個または１個のＦＲＢＬドメインとともに発現する細胞において減少しなかった。これは、ラパマイシンがＦＲＢベースの足場とｉカスパーゼ９との間のヘテロ二量体化を誘導し、カスパーゼ－９二量体化および細胞死をもたらすことを示していた。同様の結果は、ラパマイシンがＣ７－イソプロポキシラパマイシンで置き換えられた場合に見られた。
（実施例２１：シグナル伝達分子に結合されたＦＲＢベースの足場は、ｉカスパーゼ－９を二量体化および活性化し得る）
ＦＲＢの多量体が、別のシグナル伝達ドメインに結合される場合にラパログ媒介性カスパーゼ－９二量体化を可能にするために、動員足場としてなお作用するかどうかを決定するために、１個または２個のＦＲＢＬドメインを、強力なキメラ刺激分子、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０に融合して、それぞれ、ｉＭＣ．ＦＲＢＬ（ｐＢＰ０６５５）およびｉＭＣ．ＦＲＢＬ２（ｐＢＰ０４９８）を得た（図９Ｂ）。最初の試験として、２９３細胞を、レポータープラスミドＳＲα－ＳＥＡＰ、カスパーゼ－９、第１世代抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ（ｐＢＰ０４８８）および（ｐＢＰ０６５５またはｐＢＰ０４９８）で一過性にトランスフェクトした（図１５）。コントロールトランスフェクションは、カスパーゼ－９（ｐＢＰ００４４）のみまたはｅＧＦＰ発現ベクター（ｐＢＰ００４７）を含んだ。リミズシドの存在下では、カスパーゼ－９含有細胞（しかし、コントロールｅＧＦＰ－細胞ではなく）は、カスパーゼ－９ホモ二量体化によって通常のように殺滅され、これは、ＳＥＡＰ活性の減少を反映していた（図１５、左）；しかし、ラパマイシンは、ｉＭＣ．ＦＲＢＬ２およびカスパーゼ－９を発現する細胞においてのみＳＥＡＰ減少を引き起こしたが、ｉＭＣ．ＦＲＢＬおよびカスパーゼ－９を発現する細胞、またはコントロール細胞ではそうではなかった。従って、カスパーゼ－９のヘテロ二量体化剤媒介性活性化は、別個のタンパク質（例えば、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０）に融合されたＦＲＢＬの多量体を含む細胞において可能である。
カスパーゼ－９のラパログ媒介性足場ベースの活性化に関する第２の試験では、２９３細胞を、ＳＲα－ＳＥＡＰレポータープラスミドで、第１世代抗ＣＤ１９ ＣＡＲとともに共発現されるミリストイル化または非ミリストイル化誘導性ｉＭＣを加えて、ＦＲＢＬ２融合カスパーゼ－９（プラスミド ｐＢＰ０４６７）を加えて、一過性にトランスフェクトした（図１６）。２４時間後、細胞を、リミズシド、ラパマイシン、またはＣ７－イソプロポキシ（ＩｓｏＰ）－ラパマイシンの対数希釈物で処理した。ＦＫＢＰ１２連結カスパーゼ－９（ｉＣ９）とは異なり、ＦＲＢＬ２－カスパーゼ－９は、リミズシドによって活性化されない；しかし、それは、タンデムＦＫＢＰが存在する場合には、ラパマイシンまたはＣ７－イソプロポキシ－ラパマイシンによって活性化される。従って、ラパマイシンおよびアナログは、ＦＲＢまたはＦＫＢＰ１２ドメインから構成される分子足場を介してカスパーゼ－９を活性化し得る。
（実施例２２：ｉＭＣ「スイッチ」ＦＫＢＰｘ２．ＭｙＤ８８．ＣＤ４０は、ラパマイシンの存在下でＦＲＢＬ２．カスパーゼ９のための足場を作って、細胞死を誘導する）
ＦＲＢＬ２－カスパーゼ－９を活性化するためのＦＫＢＰ１２ベースの足場としてのｉＭＣの使用を、初代Ｔ細胞において試験した（図１７）。初代Ｔ細胞（２名のドナー）を、ＳＦＧ－Δｍｙｒ．ｉＭＣ．２Ａ－ＣＤ１９（ｐＢＰ０６０６）およびＳＦＧ－ＦＲＢＬ２．カスパーゼ９．２Ａ－Ｑ．８ｓｔｍ．ζ（ｐＢＰ０６６８）由来のγ－ＲＶで形質導入した。形質導入したＴ細胞を、次いで、ラパマイシンの５倍希釈物とともにプレーティングした。２４時間後、細胞を採取し、ｉＭＣ（抗ＣＤ１９－ＡＰＣを介する）、カスパーゼ－９（抗ＣＤ３４－ＰＥを介する）の発現、およびＴ細胞の同一性（抗ＣＤ３－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５を介する）に関してフローサイトメトリーによって分析した。細胞を最初に、ＦＳＣ 対 ＳＳＣによってリンパ球形態に関してゲーティングし、続いて、ＣＤ３発現（リンパ球のうちの約９９％）によってゲーティングした。
二重形質導入された細胞に焦点を当てるために、ＣＤ３＋リンパ球を、ＣＤ１９＋（ΔＭｙｒ．ｉＭＣ．２Ａ－ＣＤ１９）およびＣＤ３４＋（ＦＲＢｌ２．カスパーゼ９．２Ａ－Ｑ．８ｓｔｍ．ζ）発現に対してゲーティングした。ゲーティングした集団を正規化するために、ＣＤ３４＋ＣＤ１９＋細胞のパーセンテージを、内部コントロールとして各サンプル内の％ＣＤ１９＋ＣＤ３４－細胞で除算した。次いで、それらの値を、各形質導入について薬物なしのウェル（１００％に設定した）に対して正規化した。その結果は、比較的低いレベルの（２ｎＭ）ラパマイシンの存在下で、二重形質導入細胞の迅速かつ効率的な排除を示す（図１７Ａ、Ｃ）。ＣＤ３４＋ＣＤ１９＋ゲート内での高、中、および低発現細胞にも類似の分析が適用された（図１７Ｂ）。ラパマイシン濃度が増大するにつれて、ＣＤ３４＋ＣＤ１９＋細胞のパーセンテージは減少し、これは細胞の排除を示す。最終的に、単一のドナーに由来するＴ細胞を、ΔＭｙｒ．ｉＭＣ．２Ａ－ＣＤ１９（ｐＢＰ０６０６）およびＦＲＢＬ２．カスパーゼ９．２Ａ－Ｑ．８ｓｔｍ．ζ（ｐＢＰ０６６８）で形質導入し、ＩＬ－２含有培地中、種々の濃度のラパマイシンとともに、２４時間または４８時間にわたってプレーティングした。２４時間または４８時間後、細胞を採取し、上記のようにフローサイトメトリーによって分析した。興味深いことに、両方の導入遺伝子の高レベルを発現する細胞の排除は、２４時間でほぼ完全であったが、両方の導入遺伝子の低レベルを発現する細胞ですら、４８時間までにラパマイシンによって殺滅される。これは、初代Ｔ細胞におけるプロセスの効率を示す（図１７Ｄ）。
（実施例２３：実施例１７～２１で論じられるプラスミドおよび配列の例）
ｐＢＰ００４４：ｐＳＨ１－ｉカスパーゼ９ｗｔ
（実施例２３：実施例１７～２１で論じられるプラスミドおよび配列の例）
ｐＢＰ００４４：ｐＳＨ１－ｉカスパーゼ９ｗｔ
ｐＢＰ０４６３－－ｐＳＨ１－Ｆｐｋ－Ｆｐｋ’．ＬＳ．Ｆｐｋ’’．Ｆｐｋ’’’．ＬＳ．ＨＡ
ｐＢＰ０７２５－－ｐＳＨ１－ＦＲＢｌ．ＦＲＢｌ’．ＬＳ．ＦＲＢｌ’’．ＦＲＢｌ’’’
ｐＢＰ０４６５－－ｐＳＨ１－Ｍ－ＦＲＢｌ．ＦＲＢｌ’．ＬＳ．ＨＡ
ｐＢＰ０７２２－－ｐＳＨ１－Ｆｐｋ－Ｆｐｋ’．ＬＳ．Ｆｐｋ’’．Ｆｐｋ’’’．ＬＳ．ＨＡ
ｐＢＰ０２２０－－ｐＳＦＧ－ｉＣ９．Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９
ｐＢＰ０７５６－－ｐＳＦＧ－ｉＣ９．Ｔ２Ａ－ｄＣＤ１９．Ｐ２Ａ－ＦＲＢｌ
ｐＢＰ０７５５－－ｐＳＦＧ－ｉＣ９．Ｔ２Ａ－ｄＣＤ１９．Ｐ２Ａ－ＦＲＢｌ２
ｐＢＰ０７５７－－ｐＳＦＧ－ｉＣ９．Ｔ２Ａ－ｄＣＤ１９．Ｐ２Ａ－ＦＲＢｌ３
ｐＢＰ０６５５－－ｐＳＦＧ－ΔＭｙｒ．ＦＲＢｌ．ＭＣ．２Ａ－ΔＣＤ１９
ｐＢＰ０４９８－－ｐＳＦＧ－ΔＭｙｒ．ｉＭＣ．ＦＲＢｌ２．Ｐ２Ａ－ΔＣＤ１９
ｐＢＰ０４８８－－ｐＳＦＧ－ａＨＥＲ２．Ｑ．８ｓｔｍ．ＣＤ３ゼータ．Ｆｐｋ２
ｐＢＰ０４６７－－ｐＳＨ１－ＦＲＢｌ’．ＦＲＢｌ．ＬＳ．Δカスパーゼ９
ｐＢＰ０６０６－－ｐＳＦＧ－ｋ－ΔＭｙｒ．ｉＭＣ．２Ａ－ΔＣＤ１９
ｐＢＰ０６０７－－ｐＳＦＧ－ｋ－ｉＭＣ．２Ａ－ΔＣＤ１９
ｐＢＰ０６６８－－ｐＳＦＧ－ＦＲＢｌｘ２．カスパーゼ９．２Ａ－Ｑ．８ｓｔｍ．ＣＤ３ゼータ
ｐＢＰ０６０８－－ｐＳＦＧ－ΔＭｙｒ．ｉＭＣ．２Ａ－ΔＣＤ１９．Ｑ．８ｓｔｍ．ＣＤ３ゼータ
ｐＢＰ０６０９： ｐＳＦＧ－ｉＭＣ．２Ａ－ΔＣＤ１９．Ｑ．８ｓｔｍ．ＣＤ３ゼータ
実施例２４：ヘテロ二量体化リガンドによって誘導される誘導性細胞死スイッチ
（方法）
（細胞のトランスフェクション）
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（５×１０５）を、１０ｍＬ ＤＭＥＭ４５００（グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ ウシ胎仔血清を補充）の入った、１００ｍｍ組織培養ディッシュに播種した。１６～３０時間のインキュベーション後、細胞を、Ｎｏｖａｇｅｎ’ｓ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）プロトコルを使用してトランスフェクトした。簡潔には、各トランスフェクションのために、０．５ｍＬ ＯｐｔｉＭＥＭを、１．５ｍＬの微量遠心チューブの中にピペットで入れ、１５μｌ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ試薬を添加し、５秒間ボルテックスした。サンプルを５分間静置して、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ懸濁物を沈殿させた。ＤＮＡ（合計５μｇ）を各チューブに添加し、ピペットで４回上下させることによって混合した。サンプルをＧｅｎｅＪｕｉｃｅ－ＤＮＡ複合体形成のために５分間静置させ、懸濁物を１ディッシュの２９３Ｔ細胞に滴下した。代表的なトランスフェクションは、１μｇ ＳＲα－ＳＥＡＰ（ｐＢＰ００４６）（３）、２μｇ ＦＲＢ－カスパーゼ－９（ｐＢＰ０４６３）および２μｇ ＦＫＢＰｖ１２－カスパーゼ－９（ｐＢＰ００４４）（７）を含む。
（細胞のトランスフェクション）
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（５×１０５）を、１０ｍＬ ＤＭＥＭ４５００（グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ ウシ胎仔血清を補充）の入った、１００ｍｍ組織培養ディッシュに播種した。１６～３０時間のインキュベーション後、細胞を、Ｎｏｖａｇｅｎ’ｓ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）プロトコルを使用してトランスフェクトした。簡潔には、各トランスフェクションのために、０．５ｍＬ ＯｐｔｉＭＥＭを、１．５ｍＬの微量遠心チューブの中にピペットで入れ、１５μｌ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ試薬を添加し、５秒間ボルテックスした。サンプルを５分間静置して、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ懸濁物を沈殿させた。ＤＮＡ（合計５μｇ）を各チューブに添加し、ピペットで４回上下させることによって混合した。サンプルをＧｅｎｅＪｕｉｃｅ－ＤＮＡ複合体形成のために５分間静置させ、懸濁物を１ディッシュの２９３Ｔ細胞に滴下した。代表的なトランスフェクションは、１μｇ ＳＲα－ＳＥＡＰ（ｐＢＰ００４６）（３）、２μｇ ＦＲＢ－カスパーゼ－９（ｐＢＰ０４６３）および２μｇ ＦＫＢＰｖ１２－カスパーゼ－９（ｐＢＰ００４４）（７）を含む。
二量体化薬物での細胞の刺激
トランスフェクションの２４時間後に（４．１）、２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートに分割し、二量体化薬物の希釈物とともにインキュベートした。簡潔には、１００μＬ
培地を、９６ウェル平底プレートの各ウェルに添加した。薬物を、プレートに入れるべき勾配中の一番上の濃度の４倍の濃度となるようチューブ中で希釈した。１００μＬの二量体化リガンド（リミズシド、ラパマイシン、イソプロポキシルラパマイシン）を、プレートの最も右側にある３個のウェルの各々に添加した（アッセイは、それによって３連で行われる）。次いで、各薬物含有ウェルからの１００μＬを、隣接するウェルへと移し、そのサイクルを１０回反復して、連続２倍段階勾配（ｓｅｒｉａｌ ｔｗｏ－ｆｏｌｄ ｓｔｅｐ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を生成した。最後のウェルは非処理にした。そして、それらは基底レポーター活性のコントロールとして働く。次いで、トランスフェクトした２９３細胞をトリプシン処理し、完全培地で洗浄し、培地中に懸濁し、薬物を含む（または薬物なし）各ウェルへと１００μＬアリコートした。細胞を２４時間インキュベートした。
トランスフェクションの２４時間後に（４．１）、２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートに分割し、二量体化薬物の希釈物とともにインキュベートした。簡潔には、１００μＬ
培地を、９６ウェル平底プレートの各ウェルに添加した。薬物を、プレートに入れるべき勾配中の一番上の濃度の４倍の濃度となるようチューブ中で希釈した。１００μＬの二量体化リガンド（リミズシド、ラパマイシン、イソプロポキシルラパマイシン）を、プレートの最も右側にある３個のウェルの各々に添加した（アッセイは、それによって３連で行われる）。次いで、各薬物含有ウェルからの１００μＬを、隣接するウェルへと移し、そのサイクルを１０回反復して、連続２倍段階勾配（ｓｅｒｉａｌ ｔｗｏ－ｆｏｌｄ ｓｔｅｐ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を生成した。最後のウェルは非処理にした。そして、それらは基底レポーター活性のコントロールとして働く。次いで、トランスフェクトした２９３細胞をトリプシン処理し、完全培地で洗浄し、培地中に懸濁し、薬物を含む（または薬物なし）各ウェルへと１００μＬアリコートした。細胞を２４時間インキュベートした。
レポーター活性のアッセイ
ＳＲαプロモーターは、ＳＶ４０初期領域（これは、Ｔ抗原転写を駆動する）およびヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ－１）の長末端反復（ＬＴＲ）の一部（ＲおよびＵ５）を含むハイブリッド転写エレメントである。このプロモーターは、高い構成的なレベルの分泌型アルカリホスファターゼ（ＳｅＡＰ）レポーター遺伝子を駆動する。二量体化によるカスパーゼ－９の活性化は、細胞死を迅速にもたらし、細胞が死んでいる割合は、薬物の量の増加と共に増加する。細胞が死ぬ場合、レポーターの転写および翻訳は停止するが、既に分泌されたレポータータンパク質は培地の中に残る。構成的ＳｅＡＰ活性の喪失は、それによって、細胞死の薬物依存性活性化の有効な代用である。
ＳＲαプロモーターは、ＳＶ４０初期領域（これは、Ｔ抗原転写を駆動する）およびヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ－１）の長末端反復（ＬＴＲ）の一部（ＲおよびＵ５）を含むハイブリッド転写エレメントである。このプロモーターは、高い構成的なレベルの分泌型アルカリホスファターゼ（ＳｅＡＰ）レポーター遺伝子を駆動する。二量体化によるカスパーゼ－９の活性化は、細胞死を迅速にもたらし、細胞が死んでいる割合は、薬物の量の増加と共に増加する。細胞が死ぬ場合、レポーターの転写および翻訳は停止するが、既に分泌されたレポータータンパク質は培地の中に残る。構成的ＳｅＡＰ活性の喪失は、それによって、細胞死の薬物依存性活性化の有効な代用である。
薬物刺激の２４時間後に、９６ウェルプレートを包んで蒸発を防止し、６５℃で２時間インキュベートして、内因性および血清ホスファターゼを不活化するが、その一方で、熱安定性ＳｅＡＰレポーターは残る(１，４，１２)。各ウェルからの１００μｌ サンプルを、側面が黒い９６ウェルアッセイプレートの個々のウェルへとロードした。サンプルを、４～１６時間にわたって０．５Ｍ ジエタノールアミン（ｐＨ１０．０）中の０．５ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルホスフェート（４－ＭＵＰ）とともにインキュベートした。ホスファターゼ活性を、３５５ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの発光を有する蛍光によって測定した。データを、表作成のためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートに移し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでグラフ化した。
イソプロピルオキシラパマイシンの生成
Ｌｕｅｎｇｏらの方法（（Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ ５９：６５１２， （１９９４））、（１６、１７））を使用した。簡潔には、２０ｍｇのラパマイシンを、３ｍＬ イソプロパノール中に溶解し、２２．１ｍｇのｐ－トルエンスルホン酸を添加し、室温で４～１２時間撹拌しながらインキュベートした。終了時に、５ｍＬ 酢酸エチルを添加し、生成物を、飽和炭酸水素ナトリウムで５回、ブライン（飽和塩化ナトリウム）で３回抽出した。その有機相を乾燥させ、酢酸エチル：ヘキサン（３：１）中に再溶解した。立体異性体および微量の生成物を、３～４ ＫＰａ圧下で、３：１ 酢酸エチル：ヘキサンを用いる１０～１５ｍＬ シリカゲルカラムでのＦＬＡＳＨクロマトグラフィーによって分離し、画分を乾燥させた。画分を、２３７ｎＭ、２６７ｎＭ、２７８ｎＭおよび２９０ｎＭでの分光測光法によってアッセイし、ＦＲＢ対立遺伝子特異的転写スイッチにおける結合特異性に関して試験した。
Ｌｕｅｎｇｏらの方法（（Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ ５９：６５１２， （１９９４））、（１６、１７））を使用した。簡潔には、２０ｍｇのラパマイシンを、３ｍＬ イソプロパノール中に溶解し、２２．１ｍｇのｐ－トルエンスルホン酸を添加し、室温で４～１２時間撹拌しながらインキュベートした。終了時に、５ｍＬ 酢酸エチルを添加し、生成物を、飽和炭酸水素ナトリウムで５回、ブライン（飽和塩化ナトリウム）で３回抽出した。その有機相を乾燥させ、酢酸エチル：ヘキサン（３：１）中に再溶解した。立体異性体および微量の生成物を、３～４ ＫＰａ圧下で、３：１ 酢酸エチル：ヘキサンを用いる１０～１５ｍＬ シリカゲルカラムでのＦＬＡＳＨクロマトグラフィーによって分離し、画分を乾燥させた。画分を、２３７ｎＭ、２６７ｎＭ、２７８ｎＭおよび２９０ｎＭでの分光測光法によってアッセイし、ＦＲＢ対立遺伝子特異的転写スイッチにおける結合特異性に関して試験した。
（ラパマイシンでのＦＲＢ－カスパーゼとＦＫＢＰ－カスパーゼとの直接二量体化は、アポトーシスを誘導する）
ＦＫＢＰ融合カスパーゼの二量体化は、ホモ二量体化剤分子（例えば、ＡＰ１５１０、ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３）によって二量体化され得る。類似のアポトーシス促進スイッチは、カスパーゼドメインのホモ二量体化をもたらすＦＫＢＰ－カスパーゼ－９とともにＦＲＢ－カスパーゼ－９融合タンパク質を共発現することによって、ラパマイシンを使用するバイナリースイッチのヘテロ二量体化を介して指向され得る。図３７では、構成的に活性なＳｅＡＰレポータープラスミドを、２９３Ｔ細胞へと、カスパーゼ構築物とともに共トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は、豊富にＳｅＡＰを生成した。これは、薬物なしで容易に測定され、実験において１００％ 正規化標準として働いた。２種の融合タンパク質とリミズシドとのインキュベーションは、ＦＫＢＰ１２－カスパーゼ９のみの用量依存性ホモ二量体化を生じ、二量体化およびアポトーシスの活性化をもたらす一方で、ＦＲＢ－カスパーゼ９は、リミズシド駆動性複合体から排除されたままである（左）。対照的に、ラパマイシンとのインキュベーションは、ＦＲＢおよびＦＫＢＰを直接会合し、連結されたカスパーゼ－９部分は、会合および活性化する。細胞死を、細胞が死滅するときのＳｅＡＰレポーター生成の喪失によって間接的に測定した。この実験は、ラパマイシンでのヘテロ二量体化が、用量依存性細胞死を生じることを示し、ナノモル濃度の薬物感受性を有する新規安全スイッチを明らかにした。
図３７ － タグ化カスパーゼ９のホモ二量体化またはヘテロ二量体化による薬物誘導プログラム細胞死。２９３Ｔ細胞を、ＳＲα－ＳｅＡＰ（ｐＢＰ００４６）、ｐＳＨ１－ＦＫＢＰｖ１２－カスパーゼ９（ｐＢＰ００４４）およびｐＳＨ１－ＦＲＢＬ－カスパーゼ９（ｐＢＰ０４６３）でトランスフェクトした。２４時間インキュベーションの後、細胞を分け、漸増濃度のラパマイシン（青）、リミズシド（赤）またはエタノール（ストックラパマイシンを含有する溶媒）とともにインキュベートした。レポーター活性の喪失は、細胞生存性の喪失の代用である。レポーター活性は、薬物を含まない８個のコントロールウェルの平均のパーセンテージとして表される。薬物ありのアッセイを、三連で行った。
（細胞死は、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログによって指向され得る）
ラパマイシンは、有効なヘテロ二量体化剤であるが、ＦＫＢＰ１２とプロテインキナーゼｍＴＯＲとのドッキングを引き起こす結果として、ラパマイシンはまた、シグナル伝達の強力な阻害剤であり、減少したタンパク質翻訳および減少した細胞成長を生じる。Ｃ３またはＣ７環位置でのラパマイシンの誘導体は、ｍＴＯＲに対して減少した親和性を有するが、ＦＲＢドメインの「ヘリックス４」における変異体に対して高い親和性を保持する。プラスミドｐＢＰ０４６３は、ＦＲＢドメイン中の２０９８位（ｍＴＯＲ番号付けを使用）において野生型のスレオニンの代わりにロイシンを使用する変異を含み、Ｃ７における誘導体に適合する。ＦＲＢＬ－カスパーゼ９、ＦＫＢＰＶ１２－カスパーゼ９および構成的ＳｅＡＰレポーターでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のインキュベーションから、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログ（ラパログ） Ｃ７－イソプロピルオキシラパマイシン（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｏｘｌｒａｐａｍｃｉｎ）での用量依存性の高効力細胞死スイッチを生じた（図３８）。
図３８－ラパログ誘導細胞死スイッチ。２９３Ｔ細胞を、ＳＲα－ＳｅＡＰ（ｐＢＰ００４６）、ｐＳＨ１－ＦＫＢＰｖ１２－カスパーゼ９（ｐＢＰ００４４）およびｐＳＨ１－ＦＲＢＬ－カスパーゼ９（ｐＢＰ０４６３）でトランスフェクトした。２４時間インキュベーション後、細胞を分け、漸増濃度のラパマイシン（青）、Ｃ７－イソプロピルオキシラパマイシン（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｏｘｌｒａｐａｍｃｉｎ）（緑）またはエタノール（薬物ストックを含む溶媒）とともにインキュベートした。レポーター活性の喪失は、細胞生存性の喪失の代用である。レポーター活性は、薬物を含まない８個のウェルの平均のパーセンテージとして表される。薬物含有アッセイを、三連で行った。
（ラパマイシン誘導細胞死は、ＦＲＢ－カスパーゼ－９の存在を要する）
ラパマイシン誘導細胞死が、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ１２と別個に連結されたカスパーゼ－９分子の二量体化から生じることを示すために、２つのコントロール実験を行った。
ラパマイシン誘導細胞死が、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ１２と別個に連結されたカスパーゼ－９分子の二量体化から生じることを示すために、２つのコントロール実験を行った。
（図３９および４０）。ｉＣ９（ＦＫＢＰｖ１２－カスパーゼ－９）を、エピトープタグのみを発現するコントロールベクター（図３９）またはカスパーゼ融合物を有さないが、代わりに短い無関係のタグを有するＦＲＢを含むベクター（図４０）で共トランスフェクトした。各場合において、リミズシドとのインキュベーションは、カスパーゼ－９のホモ二量体化および誘導を効率的に可能にしたが、ラパマイシンとのインキュベーションは、細胞死を促進しなかった。これらの知見は、ラパマイシン／ラパログ媒介性細胞死の機構が、カスパーゼ－９へのｍＴＯＲの動員ではなく、または内因性ｍＴＯＲ阻害が関わる間接的機構に起因して、二量体化Ｃ９分子の活性化であるという結論を支持する。
図３９－ＦＲＢ－カスパーゼ－９は、ラパマイシン誘導細胞死スイッチのために必要とされる。２９３Ｔ細胞を、ＳＲα－ＳｅＡＰ（ｐＢＰ００４６）、ｐＳ－ＮＬＳ－ＥおよびｐＳＨ１－ＦＫＢＰｖ１２－カスパーゼ９（ｐＢＰ００４４）でトランスフェクトした。
図４０－ＦＲＢとのカスパーゼ－９融合物は、ラパマイシン誘導細胞死スイッチのために必要とされる。２９３Ｔ細胞を、ＳＲα－ＳｅＡＰ（ｐＢＰ００４６）、ｐＳＨ１－ＦＲＢＬ－ＶＰ１６（ｐＢＰ０７３１）（４）およびｐＳＨ１－ＦＫＢＰｖ１２－カスパーゼ９（ｐＢＰ００４４）でトランスフェクトした。２４時間インキュベーション後、細胞を分け、漸増濃度のラパマイシン（青）、Ｃ７－イソプロピルオキシラパマイシン（赤）、リミズシド（緑）またはエタノール（薬物ストックをふくむ溶媒）とともにインキュベートした。レポーター活性の喪失は、細胞生存性の喪失の代用である。レポーター活性は、薬物を含まない８個のウェルの平均のパーセンテージとして表される。薬物含有ウェルを、三連のウェルでアッセイした。
以下の参考文献は、本実施例において言及され、それらの全体において本明細書に参考として援用される：
ｐＢＰ０４６３－－ｐＳＨ１－ＦＲＢＬ．ｄカスパーゼ９．Ｔ２Ａ （図４１から）
ｐＢＰ００４４－－ｐＳＨ１－ＦＫＢＰＶ３６．ｄカスパーゼ９．Ｔ２Ａ （図４２から）
実施例２５：改変された細胞の二重調節
タンパク質二量体化の化学的誘導（ＣＩＤ）は、小分子ホモ二量体化リガンドであるリミズシド（ＡＰ１９０３）によって細胞自殺またはアポトーシスを誘導可能にするよう効果的に適用されている。この技術は、細胞移植における遺伝子治療補助剤として組み込まれた「安全スイッチ」の基礎をなす（１， ２）。この技術を使用して、シグナル伝達経路の一部としてタンパク質間相互作用に依拠する通常の細胞制御経路は、小分子二量体化薬物がタンパク質間オリゴマー化事象を調節するために使用される場合、リガンド依存的条件調節に適合され得る（３－５）。ホモ二量体化リガンド（例えば、リミズシド（ＡＰ１９０３）、ＡＰ１５１０またはＡＰ２０１８７）を使用してカスパーゼ－９およびＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２バリアントを含む融合タンパク質（すなわち、“ｉカスパーゼ９／ｉＣａｓｐ９／ｉＣ９）の誘導された二量体化は、細胞死を迅速にもたらし得る（Ａｍａｒａ ＪＦ （９７） ＰＮＡＳ ９４：１０６１８－２３）。カスパーゼ－９は、アポトーシスプロセスの「ゲートキーパー」として作用する開始カスパーゼである（６）。アポトーシス細胞のミトコンドリアから放出されるアポトーシス促進分子（例えば、シトクロムｃ）は、カスパーゼ－９結合足場であるＡｐａｆ－１のコンホメーションを変化させ、そのオリゴマー化および「アポプトソーム」の形成をもたらす。この変化は、カスパーゼ－９二量体化およびその潜在的形態の活性な分子への切断を促進し、この分子は次には、「下流の」アポトーシスエフェクターであるカスパーゼ－３を切断し、不可逆的な細胞死をもたらす。リミズシドは、２個のＦＫＢＰ１２－Ｖ３６部分と直接結合し、ＦＫＢＰ１２－Ｖ３６を含む融合タンパク質の二量体化に誘導し得る（１， ２）。リミズシドとのｉＣ９結合は、活性なアポプトソームへのＡｐａｆ１変換の必要性を回避する。この実施例では、ヘテロ二量体化リガンドを結合するタンパク質部分へのカスパーゼ－９の融合を、リミズシド媒介性ｉＣ９活性化と類似の有効性でその活性化および細胞死に誘導する、その能力についてアッセイした。
タンパク質二量体化の化学的誘導（ＣＩＤ）は、小分子ホモ二量体化リガンドであるリミズシド（ＡＰ１９０３）によって細胞自殺またはアポトーシスを誘導可能にするよう効果的に適用されている。この技術は、細胞移植における遺伝子治療補助剤として組み込まれた「安全スイッチ」の基礎をなす（１， ２）。この技術を使用して、シグナル伝達経路の一部としてタンパク質間相互作用に依拠する通常の細胞制御経路は、小分子二量体化薬物がタンパク質間オリゴマー化事象を調節するために使用される場合、リガンド依存的条件調節に適合され得る（３－５）。ホモ二量体化リガンド（例えば、リミズシド（ＡＰ１９０３）、ＡＰ１５１０またはＡＰ２０１８７）を使用してカスパーゼ－９およびＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２バリアントを含む融合タンパク質（すなわち、“ｉカスパーゼ９／ｉＣａｓｐ９／ｉＣ９）の誘導された二量体化は、細胞死を迅速にもたらし得る（Ａｍａｒａ ＪＦ （９７） ＰＮＡＳ ９４：１０６１８－２３）。カスパーゼ－９は、アポトーシスプロセスの「ゲートキーパー」として作用する開始カスパーゼである（６）。アポトーシス細胞のミトコンドリアから放出されるアポトーシス促進分子（例えば、シトクロムｃ）は、カスパーゼ－９結合足場であるＡｐａｆ－１のコンホメーションを変化させ、そのオリゴマー化および「アポプトソーム」の形成をもたらす。この変化は、カスパーゼ－９二量体化およびその潜在的形態の活性な分子への切断を促進し、この分子は次には、「下流の」アポトーシスエフェクターであるカスパーゼ－３を切断し、不可逆的な細胞死をもたらす。リミズシドは、２個のＦＫＢＰ１２－Ｖ３６部分と直接結合し、ＦＫＢＰ１２－Ｖ３６を含む融合タンパク質の二量体化に誘導し得る（１， ２）。リミズシドとのｉＣ９結合は、活性なアポプトソームへのＡｐａｆ１変換の必要性を回避する。この実施例では、ヘテロ二量体化リガンドを結合するタンパク質部分へのカスパーゼ－９の融合を、リミズシド媒介性ｉＣ９活性化と類似の有効性でその活性化および細胞死に誘導する、その能力についてアッセイした。
ＭｙＤ８８およびＣＤ４０を、ｉＭＣ活性化スイッチの基礎として選択した。ＭｙＤ８８は、病原体の検出または樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）による細胞傷害において中心的なシグナル伝達の役割を果たす。病原体に由来するまたは壊死細胞に由来する「危険な」分子」への曝露後に、「パターン認識レセプター」のサブクラス（Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）といわれる）が活性化され、両方のタンパク質上の相同なＴＬＲ－ＩＬ１ＲＡ（ＴＩＲ）ドメインを介して、アダプター分子ＭｙＤ８８の凝集および活性化をもたらす。ＭｙＤ８８は、次には、タンパク質の残りを介して下流のシグナル伝達を活性化する。これは、抗原プロセシングおよび提示に必要とされる、ＣＤ４０などの共刺激タンパク質ならびにＭＨＣおよびプロテアーゼなどの他のタンパク質のアップレギュレーションをもたらす。ＭｙＤ８８およびＣＤ４０に由来するシグナル伝達ドメインと２個のＦｖドメインとの融合は、ｉＭＣ（また、ＭＣＦｖｖＭＣ．ＦｖＦｖ）を提供し、これは、リミズシドへの曝露後にＤＣを強力に活性化した（７）。ｉＭＣは、Ｔ細胞の強力な共刺激タンパク質でもあることが後に見出された。
ラパマイシンは、高い親和性（＜１ｎＭ）でＦＫＢＰ１２に結合し、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインとの高親和性の阻害性相互作用を一緒に開始する天然生成物のマクロライドである（８）。ＦＲＢは、小さく（８９アミノ酸）、そのために、多くのタンパク質に付加されるときにタンパク質「タグ」または「ハンドル」として使用され得る（９－１１）。ＦＲＢ融合タンパク質と第２のＦＫＢＰ１２融合タンパク質とが共発現すると、それらが接近することでラパマイシン誘導性になる（１２－１６）。この例および以下の例は、ＦＲＢ結合カスパーゼ－９（ｉＲＣ９）とＦＫＢＰ結合カスパーゼ－９（ｉＣ９）との共発現がまた、アポトーシスに誘導し得、かつ経口で利用可能なリガンド（ラパマイシン、またはｍＴＯＲを低い治療的用量で阻害しないが、代わりに選択されたカスパーゼ－９が融合した変異体ＦＲＢドメインと結合するラパマイシンの誘導体（ラパログ））によって制御される細胞安全スイッチの基礎として働き得るかどうかを試験するためにデザインされた実験および結果を提供する。
これらの例でも提供されるのは、二重スイッチ技術の別の実施形態（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣＦｖＦｖ）であり、ここでホモ二量体化剤（例えば、ＡＰ１９０３（リミズシド））は、改変された細胞の活性化を誘導し、ヘテロ二量体化剤（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）は、安全スイッチを活性化し、改変された細胞のアポトーシスを引き起こす。この実施形態において、ＦＫＢＰ１２およびＦＲＢの両方、またはＦＲＢバリアント領域（ＦｗｔＦＲＢＣ９）を含むキメラアポトーシス促進ポリペプチド（例えば、カスパーゼ－９など）は、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチドおよび少なくとも２コピーのＦＫＢＰ１２ｖ３６を含む誘導性キメラＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激ポリペプチド（ＭＣ．ＦｖＦｖ）とともに細胞中で発現される。その細胞とＦｖ領域に結合する二量体化剤とを接触させると、そのＭＣ．ＦｖＦｖは二量体化または多量体化し、その細胞を活性化する。その細胞は、例えば、標的抗原に対して誘導されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲζ）を発現するＴ細胞であり得る。安全スイッチとして、その細胞は、ＦｗｔＦＲＢ．Ｃ９ポリペプチド上のＦＲＢ領域およびＦｗｔＦＲＢ．Ｃ９ポリペプチド上のＦＫＢＰ１２領域に結合するヘテロ二量体化剤（例えば、ラパマイシン、またはラパログなど）と接触させられ得、カスパーゼ－９ポリペプチドの直接的二量体化を引き起こし、アポトーシスを誘導する（図４３（２）、図５７）。別の機構において、そのヘテロ二量体化剤は、ＦｗｔＦＲＢＣ９ポリペプチド上のＦＲＢ領域、およびＭＣ．ＦｖＦｖポリペプチド上のＦｖ領域に結合し、各ＭＣ．ＦｖＦｖポリペプチド上の２個のＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチドの足場に起因して、足場誘導性二量体化を引き起こし（図４３（１））、そしてアポトーシスを誘導する。ＭＣ．ＦｖＦｖおよびＦｗｔＦＲＢＣ９の両方を含む核酸構築物は、これらの例の目的のためにＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖと称されている。
二重スイッチ技術の別の実施形態（ＦＲＢＦｗｔＭＣ／ＦｖＣ９）において、ヘテロ二量体化剤（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）は、改変された細胞の活性化を誘導し、ホモ二量体化剤（例えば、ＡＰ１９０３）は、安全スイッチを活性化し、改変された細胞のアポトーシスを引き起こす。この実施形態において、例えば、Ｆｖ領域を含むキメラアポトーシス促進ポリペプチド（例えば、カスパーゼ－９など）（ｉＦｖＣ９）は、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０ポリペプチド、ならびにＦＫＢＰ１２およびＦＲＢの両方またはＦＲＢバリアント領域（ＦｗｔＦＲＢＭＣ）を含む誘導性キメラＭｙＤ８８／ＣＤ４０共刺激ポリペプチド（ＭＣ．ＦｖＦｖ）とともに、細胞中で発現された。その細胞とＦＫＢＰ１２およびＦＲＢ領域をヘテロ二量体化するラパマイシンまたはラパログとを接触させると、ＦｗｔＦＲＢＭＣは、二量体化または多量体化し、その細胞を活性化させる。その細胞は、例えば、標的抗原に対して誘導されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲζ）を発現するＴ細胞であり得る。安全スイッチとして、その細胞は、ｉＦｖＣ９ポリペプチドに結合するホモ二量体化剤（例えば、ＡＰ１９０３など）と接触させられ得、カスパーゼ－９ポリペプチドの直接的二量体化を引き起こし、アポトーシスを誘導する（図５７（右側））。ｉＦｖＣ９およびＦｗｔＦＲＢＭＣの両方を含む核酸構築物は、これらの例の目的のためにＦｗｔＦＲＢＭＣ／ＦｖＣ９と称されている。ｘｘｘ
材料および方法
材料および方法
レトロウイルスの生成および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の形質導入
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（１．５×１０５）を、１０ｍＬ ＤＭＥＭ４５００）（グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ ウシ胎仔血清を補充）の入った、１００ｍｍ組織培養ディッシュに播種した。１６～３０時間のインキュベーション後、細胞を、Ｎｏｖａｇｅｎ’ｓ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）プロトコルを使用してトランスフェクトした。簡潔には、各トランスフェクションに関して、０．５ｍＬ ＯｐｔｉＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１．５ｍＬ微量遠心チューブの中へとピペットで入れ、３０μｌ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ試薬を添加し、続いて５秒間ボルテックスした。サンプルを５分間静置して、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ懸濁物を沈殿させた。ＤＮＡ（合計１５μｇ）を各チューブに添加し、ピペットで４回上下させることによって混合した。サンプルを、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ－ＤＮＡ複合体形成のために５分間静置させ、懸濁物を、２９３Ｔ細胞の１つのディッシュに滴下した。代表的なトランスフェクションは、複製不能性レトロウイルスを生成するために、これらプラスミドを含んだ：３．７５μｇの、ｇａｇ－ｐｏｌを含むプラスミド（ｐＥＱ－ＰＡＭ３（－Ｅ））、２．５μｇの、ウイルスエンベロープ（例えば、ＲＤ１１４）を含むプラスミド、目的の遺伝子を含むレトロウイルス＝３＝３．７５μｇ。
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（１．５×１０５）を、１０ｍＬ ＤＭＥＭ４５００）（グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ ウシ胎仔血清を補充）の入った、１００ｍｍ組織培養ディッシュに播種した。１６～３０時間のインキュベーション後、細胞を、Ｎｏｖａｇｅｎ’ｓ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）プロトコルを使用してトランスフェクトした。簡潔には、各トランスフェクションに関して、０．５ｍＬ ＯｐｔｉＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１．５ｍＬ微量遠心チューブの中へとピペットで入れ、３０μｌ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ試薬を添加し、続いて５秒間ボルテックスした。サンプルを５分間静置して、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ懸濁物を沈殿させた。ＤＮＡ（合計１５μｇ）を各チューブに添加し、ピペットで４回上下させることによって混合した。サンプルを、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ－ＤＮＡ複合体形成のために５分間静置させ、懸濁物を、２９３Ｔ細胞の１つのディッシュに滴下した。代表的なトランスフェクションは、複製不能性レトロウイルスを生成するために、これらプラスミドを含んだ：３．７５μｇの、ｇａｇ－ｐｏｌを含むプラスミド（ｐＥＱ－ＰＡＭ３（－Ｅ））、２．５μｇの、ウイルスエンベロープ（例えば、ＲＤ１１４）を含むプラスミド、目的の遺伝子を含むレトロウイルス＝３＝３．７５μｇ。
ＰＢＭＣを、組織培養プレートのウェルに予めコーティングされた抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激した。プレーティングして２４時間後、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２を上記培養物に添加した。２日目または３日目に、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に由来するレトロウイルスを含む上清を、０．４５μｍで濾過し、レトロネクチン（１ｃｍ２表面あたり、１ｍｌのＰＢＳ中１０μｌ／ウェル）で予め被覆した非ＴＣ処理プレート上で遠心分離する。プレートを、２０００ｇで２時間、室温で遠心分離した。ＣＤ３／ＣＤ２８芽細胞を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２を補充した完全培地中で２．５×１０５ 細胞／ｍｌで再懸濁し、１０００×ｇで１０分間、室温で、プレート上で遠心分離した。３～４日間のインキュベーション後、細胞を計数し、形質導入効率を、フローサイトメトリーによって、適切なマーカー抗体（代表的には、ＣＤ３４またはＣＤ１９）を使用して測定した。細胞を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２を補充した完全培地中で維持し、細胞に、２～３日ごとに新鮮培地およびＩＬ－２を再供給し、細胞を必要に応じて分けて、拡大した。
培養細胞におけるＴ細胞カスパーゼアッセイ
適切なレトロウイルスでの形質導入の後、５０，０００個のＴを、ＩＬ－２なしのＣＴＬ培地中、自殺薬物（リミズシドまたはラパマイシン）の存在下または非存在下で、９６ウェルプレートの１ウェルあたりに播種した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ機器を使用するアポトーシスの検出を可能にするために、２μＭのＩｎｃｕＣｙｔｅＴＭ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ試薬（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ４４４０）を各ウェルに添加して、総容積２００μｌにした。そのプレートを、５分間、４００×ｇで遠心分離し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｍｏｄｅｌ ４４５９）の中に入れ、緑色蛍光を２～３時間ごとに合計４８時間にわたって１０×対物レンズでモニターした。画像分析を、「ＴＣｅｌｌｓ＿ｃａｓｐｒｅａｇｅｎｔ＿ｐｈａｓｅ＿ｇｒｅｅｎ＿１０ｘ＿ＭＬＤ」処理定義を使用して行った。「Ｔｏｔａｌ Ｇｒｅｅｎ
Ｏｂｊｅｃｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」測定法を使用して、カスパーゼ活性化を定量した。各条件を二連で行い、各ウェルを４個の異なる位置で画像化した。
適切なレトロウイルスでの形質導入の後、５０，０００個のＴを、ＩＬ－２なしのＣＴＬ培地中、自殺薬物（リミズシドまたはラパマイシン）の存在下または非存在下で、９６ウェルプレートの１ウェルあたりに播種した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ機器を使用するアポトーシスの検出を可能にするために、２μＭのＩｎｃｕＣｙｔｅＴＭ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ試薬（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ４４４０）を各ウェルに添加して、総容積２００μｌにした。そのプレートを、５分間、４００×ｇで遠心分離し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｍｏｄｅｌ ４４５９）の中に入れ、緑色蛍光を２～３時間ごとに合計４８時間にわたって１０×対物レンズでモニターした。画像分析を、「ＴＣｅｌｌｓ＿ｃａｓｐｒｅａｇｅｎｔ＿ｐｈａｓｅ＿ｇｒｅｅｎ＿１０ｘ＿ＭＬＤ」処理定義を使用して行った。「Ｔｏｔａｌ Ｇｒｅｅｎ
Ｏｂｊｅｃｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」測定法を使用して、カスパーゼ活性化を定量した。各条件を二連で行い、各ウェルを４個の異なる位置で画像化した。
Ｔ細胞抗腫瘍アッセイ
ＨＰＡＣ ＰＳＣＡ＋腫瘍細胞を、ＮｕｃＬｉｇｈｔＴＭ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ４６２５）を使用して、核局在化ＲＦＰタンパク質で安定して標識した。共培養を設定するために、４０００ ＨＰＡＣ－ＲＦＰ細胞を、１００μｌのＩＬ－２なしのＣＴＬ培地中、少なくとも４時間にわたって９６ウェルプレートの各ウェルに播種して、腫瘍細胞を接着させた。適切なレトロウイルスで形質導入し、培養物中で少なくとも７日間静置させた後、Ｔを、種々のＥ：Ｔ比に従って、ＨＰＡＣ－ＲＦＰ含有９６ウェルプレートへと播種した。リミズシドもまた上記培養物に添加して、３００μｌ総容積／ウェルにした。各プレートを二連で、一方のプレートをＩｎｃｕＣｙｔｅでモニターするため、一方のプレートを２日目にＥＬＩＳＡアッセイ用に上清収集するために設定した。プレートを５分間、４００×ｇで遠心分離し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｍｏｄｅｌ ４４５９）の中に入れて、赤色蛍光（およびＴ細胞がＧＦＰ－Ｆｆｌｕｃで標識される場合には緑色蛍光）を２～３時間ごとに合計７日間にわっって１０×対物レンズでモニターした。画像分析を、「ＨＰＡＣ－ＲＦＰ＿ＴｃｅｌｌｓＧＦＰ＿１０ｘ＿ＭＬＤ」処理定義を使用して行った。７日目に、ＨＰＡＣ－ＲＦＰ細胞を、「Ｒｅｄ Ｏｂｊｅｃｔ Ｃｏｕｎｔ（１／ウェル）」測定法を使用して分析した。また、７日目に、０ｎＭまたは１０ｎＭの自殺薬物を共培養物の各ウェルに添加し、ＩｎｃｕＣｙｔｅの中に戻して、Ｔ細胞排除をモニターした。８日目に、Ｔ細胞－ＧＦＰ細胞を、「Ｔｏｔａｌ Ｇｒｅｅｎ Ｏｂｊｅｃｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」測定法を使用して分析した。各条件を、少なくとも２連で行い、各ウェルを４個の異なる位置で画像化した。
ＨＰＡＣ ＰＳＣＡ＋腫瘍細胞を、ＮｕｃＬｉｇｈｔＴＭ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ４６２５）を使用して、核局在化ＲＦＰタンパク質で安定して標識した。共培養を設定するために、４０００ ＨＰＡＣ－ＲＦＰ細胞を、１００μｌのＩＬ－２なしのＣＴＬ培地中、少なくとも４時間にわたって９６ウェルプレートの各ウェルに播種して、腫瘍細胞を接着させた。適切なレトロウイルスで形質導入し、培養物中で少なくとも７日間静置させた後、Ｔを、種々のＥ：Ｔ比に従って、ＨＰＡＣ－ＲＦＰ含有９６ウェルプレートへと播種した。リミズシドもまた上記培養物に添加して、３００μｌ総容積／ウェルにした。各プレートを二連で、一方のプレートをＩｎｃｕＣｙｔｅでモニターするため、一方のプレートを２日目にＥＬＩＳＡアッセイ用に上清収集するために設定した。プレートを５分間、４００×ｇで遠心分離し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｍｏｄｅｌ ４４５９）の中に入れて、赤色蛍光（およびＴ細胞がＧＦＰ－Ｆｆｌｕｃで標識される場合には緑色蛍光）を２～３時間ごとに合計７日間にわっって１０×対物レンズでモニターした。画像分析を、「ＨＰＡＣ－ＲＦＰ＿ＴｃｅｌｌｓＧＦＰ＿１０ｘ＿ＭＬＤ」処理定義を使用して行った。７日目に、ＨＰＡＣ－ＲＦＰ細胞を、「Ｒｅｄ Ｏｂｊｅｃｔ Ｃｏｕｎｔ（１／ウェル）」測定法を使用して分析した。また、７日目に、０ｎＭまたは１０ｎＭの自殺薬物を共培養物の各ウェルに添加し、ＩｎｃｕＣｙｔｅの中に戻して、Ｔ細胞排除をモニターした。８日目に、Ｔ細胞－ＧＦＰ細胞を、「Ｔｏｔａｌ Ｇｒｅｅｎ Ｏｂｊｅｃｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」測定法を使用して分析した。各条件を、少なくとも２連で行い、各ウェルを４個の異なる位置で画像化した。
Ｒａｊｉ細胞抗腫瘍活性を測定するために、細胞集団を、ｉｎｃｕｃｙｔｅよりむしろフローサイトメトリーによって決定した。なぜならこの細胞はプレートに接着しないからである。緑色蛍光タンパク質の安定な発現によって標識したＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ）（Ｒａｊｉ－ＧＦＰ）は、その細胞表面上にＣＤ１９を発現しかつ抗ＣＤ１９ ＣＡＲにとっての標的である、バーキットリンパ腫細胞株であった。５００００ Ｒａｊｉ－ＧＦＰ細胞を、１００００ ＣＡＲ－Ｔ細胞を有する２４ウェルプレートに播種した（１：５ Ｅ：Ｔ比）。培地上清を、活性化されたＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカイン放出を決定するために、４８時間で採取した。腫瘍殺滅の程度を、７日および１４日で、ＧＦＰ標識腫瘍細胞およびＣＤ３標識Ｔ細胞の割合によってフローサイトメトリー（Ｇａｌｅｏｓ， Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって決定した。
ＩＶＩＳ画像化
標識されたＴ細胞を有するＮＳＧマウスをイソフルランで麻酔し、１００μｌ Ｄ－ルシフェリン（ＰＢＳ中１５ｍｇ／ｍｌ ストック溶液）を下腹部の腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって注射した。１０分後、その動物を、麻酔チャンバからＩＶＩＳプラットフォームへと移した。ＩＶＩＳイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）で背側および腹側から画像を得、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でＢＬＩを定量および記録した。
標識されたＴ細胞を有するＮＳＧマウスをイソフルランで麻酔し、１００μｌ Ｄ－ルシフェリン（ＰＢＳ中１５ｍｇ／ｍｌ ストック溶液）を下腹部の腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によって注射した。１０分後、その動物を、麻酔チャンバからＩＶＩＳプラットフォームへと移した。ＩＶＩＳイメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）で背側および腹側から画像を得、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でＢＬＩを定量および記録した。
ウェスタンブロット
適切なレトロウイルスでの形質導入後、６，０００，０００ Ｔ細胞を、３ｍｌ ＣＴＬ培地中、６ウェルプレートの１ウェルあたりに播種した。２４時間後、細胞を収集し、冷ＰＢＳ中で洗浄し、プレートの中で（ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｄ）１×Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ， ８７７８６）を含むＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ， ８９９０１）中、氷上で３０分間溶解した。その溶解物を、１６，０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、その上清を新しいエッペンドルフチューブに移す。タンパク質アッセイを、製造業者の推奨に従って、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ， ２３２２７）を使用して行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のサンプルを調製するために、５０μｇの溶解物を４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６１０７４７）と混合し、９５℃で１０分間加熱した。その間に、１０％ ＳＤＳゲルを、Ｂｉｏ Ｒａｄキャスティング装置および３０％ アクリルアミド／ビス溶液（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６０１５８）を使用して調製した。上記サンプルを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６１０３７４）とともに負荷し、１×Ｔｒｉｓ／グリシン泳動緩衝液（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６１０７７１）中、１４０Ｖで９０分間泳動した（ｒａｎ）。タンパク質分離後、そのゲルを、ｉＢｌｏｔ ２デバイス（Ｔｈｅｒｍｏ， ＩＢ２１００１）においてプログラム０を使用してＰＶＤＦ膜に転写した（合計７分）。その膜を、ｉＢｉｎｄ Ｆｌｅｘ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ，
ＳＬＦ２０００）を使用して、製造業者の推奨に従って一次抗体および二次抗体でプローブした。抗ＭｙＤ８８抗体（Ｓｉｇｍａ， ＳＡＢ１４０６１５４）を、１：２００希釈で使用し、二次ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， Ａ１６０７２）を、１：５００希釈で使用した。カスパーゼ－９抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， ＰＡ１－１２５０６）を、１：２００希釈で使用し、二次ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， Ａ１６１０４）を、１：５００希釈で使用した。β－アクチン抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， ＰＡ１－１６８８９）を、１：１０００希釈で使用し、二次ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， Ａ１６１０４）を、１：１０００希釈で使用した。その膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ， ３４０９６）で発色させ、ＧｅｌＬｏｇｉｃ ６０００ ＰｒｏカメラおよびＣａｒｅＳｔｒｅａｍ ＭＩソフトウェア（ｖ．５．３．１．１６３６９）を使用して画像化した。
適切なレトロウイルスでの形質導入後、６，０００，０００ Ｔ細胞を、３ｍｌ ＣＴＬ培地中、６ウェルプレートの１ウェルあたりに播種した。２４時間後、細胞を収集し、冷ＰＢＳ中で洗浄し、プレートの中で（ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｄ）１×Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ， ８７７８６）を含むＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ， ８９９０１）中、氷上で３０分間溶解した。その溶解物を、１６，０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、その上清を新しいエッペンドルフチューブに移す。タンパク質アッセイを、製造業者の推奨に従って、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ， ２３２２７）を使用して行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のサンプルを調製するために、５０μｇの溶解物を４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６１０７４７）と混合し、９５℃で１０分間加熱した。その間に、１０％ ＳＤＳゲルを、Ｂｉｏ Ｒａｄキャスティング装置および３０％ アクリルアミド／ビス溶液（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６０１５８）を使用して調製した。上記サンプルを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６１０３７４）とともに負荷し、１×Ｔｒｉｓ／グリシン泳動緩衝液（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６１０７７１）中、１４０Ｖで９０分間泳動した（ｒａｎ）。タンパク質分離後、そのゲルを、ｉＢｌｏｔ ２デバイス（Ｔｈｅｒｍｏ， ＩＢ２１００１）においてプログラム０を使用してＰＶＤＦ膜に転写した（合計７分）。その膜を、ｉＢｉｎｄ Ｆｌｅｘ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ，
ＳＬＦ２０００）を使用して、製造業者の推奨に従って一次抗体および二次抗体でプローブした。抗ＭｙＤ８８抗体（Ｓｉｇｍａ， ＳＡＢ１４０６１５４）を、１：２００希釈で使用し、二次ＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， Ａ１６０７２）を、１：５００希釈で使用した。カスパーゼ－９抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， ＰＡ１－１２５０６）を、１：２００希釈で使用し、二次ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， Ａ１６１０４）を、１：５００希釈で使用した。β－アクチン抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， ＰＡ１－１６８８９）を、１：１０００希釈で使用し、二次ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， Ａ１６１０４）を、１：１０００希釈で使用した。その膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ， ３４０９６）で発色させ、ＧｅｌＬｏｇｉｃ ６０００ ＰｒｏカメラおよびＣａｒｅＳｔｒｅａｍ ＭＩソフトウェア（ｖ．５．３．１．１６３６９）を使用して画像化した。
レポーターアッセイのための細胞のトランスフェクション
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（１．５×１０５）を、１０ｍＬ ＤＭＥＭ４５００（グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ ウシ胎仔血清を補充）が入った、１００ｍｍ組織培養ディッシュに播種した。１６～３０時間インキュベーション後、細胞を、Ｎｏｖａｇｅｎ’ｓ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）プロトコルを使用してトランスフェクトした。簡潔には、各トランスフェクションについて、０．５ｍＬ ＯｐｔｉＭＥＭを、１．５ｍＬ微量遠心チューブにピペットで入れ、１５μｌ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ試薬を添加し、続いて５秒間ボルテックスした。サンプルを５分間静置して、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ懸濁物を沈殿させた。ＤＮＡ（合計５μｇ）を各チューブに添加し、ピペットで４回上下させることによって混合した。サンプルを、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ－ＤＮＡ複合体形成のために５分間静置させ、その懸濁液を、２９３Ｔ細胞の１つのディッシュに滴下した。代表的なトランスフェクションは、１μｇ ＮＦｋＢ－ＳＥＡＰ（５）、４μｇ ｉＭＣ－ＣＡＲζ（ｐＢＰ０７７４）または４μｇ ＭＣ－Ｒａｐ－ＣＡＲ（ｐＢＰ１４４０）（１）を含む。
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（１．５×１０５）を、１０ｍＬ ＤＭＥＭ４５００（グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ ウシ胎仔血清を補充）が入った、１００ｍｍ組織培養ディッシュに播種した。１６～３０時間インキュベーション後、細胞を、Ｎｏｖａｇｅｎ’ｓ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）プロトコルを使用してトランスフェクトした。簡潔には、各トランスフェクションについて、０．５ｍＬ ＯｐｔｉＭＥＭを、１．５ｍＬ微量遠心チューブにピペットで入れ、１５μｌ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ試薬を添加し、続いて５秒間ボルテックスした。サンプルを５分間静置して、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ懸濁物を沈殿させた。ＤＮＡ（合計５μｇ）を各チューブに添加し、ピペットで４回上下させることによって混合した。サンプルを、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ－ＤＮＡ複合体形成のために５分間静置させ、その懸濁液を、２９３Ｔ細胞の１つのディッシュに滴下した。代表的なトランスフェクションは、１μｇ ＮＦｋＢ－ＳＥＡＰ（５）、４μｇ ｉＭＣ－ＣＡＲζ（ｐＢＰ０７７４）または４μｇ ＭＣ－Ｒａｐ－ＣＡＲ（ｐＢＰ１４４０）（１）を含む。
二量体化薬物での細胞の刺激
トランスフェクションの２４時間後（４．１）、２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートへと分け、二量体化薬物の希釈物と共にインキュベートした。簡潔には、１００μｌ 培地を、９６ウェル平底プレートの各ウェルに添加した。薬物を、プレート上に置かれるべき濃度勾配の最高濃度の４倍の濃度へとチューブ中で希釈した。１００μｌの二量体化リガンド（リミズシド、ラパマイシン、イソプロポキシルラパマイシン）を、プレートの最も右側にある３個のウェルの各々に添加した（アッセイは、それによって三連で行われる）。次いで、各薬物含有ウェルからの１００μｌを、隣のウェルへと移し、そのサイクルを１０回反復して、連続２倍段階勾配を生成した。最後のウェルは未処理にし、基底レポーター活性のコントロールとして働かせた。次いで、トランスフェクトした２９３細胞を、トリプシン処理し、完全培地で洗浄し、培地中に懸濁し、薬物を含む（または薬物なし）各ウェルへと１００μｌをアリコートした。細胞を２４時間インキュベートした。
トランスフェクションの２４時間後（４．１）、２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートへと分け、二量体化薬物の希釈物と共にインキュベートした。簡潔には、１００μｌ 培地を、９６ウェル平底プレートの各ウェルに添加した。薬物を、プレート上に置かれるべき濃度勾配の最高濃度の４倍の濃度へとチューブ中で希釈した。１００μｌの二量体化リガンド（リミズシド、ラパマイシン、イソプロポキシルラパマイシン）を、プレートの最も右側にある３個のウェルの各々に添加した（アッセイは、それによって三連で行われる）。次いで、各薬物含有ウェルからの１００μｌを、隣のウェルへと移し、そのサイクルを１０回反復して、連続２倍段階勾配を生成した。最後のウェルは未処理にし、基底レポーター活性のコントロールとして働かせた。次いで、トランスフェクトした２９３細胞を、トリプシン処理し、完全培地で洗浄し、培地中に懸濁し、薬物を含む（または薬物なし）各ウェルへと１００μｌをアリコートした。細胞を２４時間インキュベートした。
レポーター活性のアッセイ
ＳＲαプロモーターは、ＳＶ４０初期領域（これは、Ｔ抗原転写を駆動する）およびヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ－１）の長末端反復（ＬＴＲ）の一部（ＲおよびＵ５）を含むハイブリッド転写エレメントである。このプロモーターは、高い構成的なレベルの分泌型アルカリホスファターゼ（ＳｅＡＰ）レポーター遺伝子を駆動する。二量体化によるカスパーゼ－９の活性化は、細胞死を迅速にもたらし、細胞が死んでいるの割合は、薬物の量の増大と共に増大する。細胞が死ぬ場合、レポーターの転写および翻訳は停止するが、既に分泌されたレポータータンパク質は培地の中に残る。構成的ＳｅＡＰ活性の喪失は、それによって、細胞死の薬物依存性活性化の有効な代用である。
ＳＲαプロモーターは、ＳＶ４０初期領域（これは、Ｔ抗原転写を駆動する）およびヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ－１）の長末端反復（ＬＴＲ）の一部（ＲおよびＵ５）を含むハイブリッド転写エレメントである。このプロモーターは、高い構成的なレベルの分泌型アルカリホスファターゼ（ＳｅＡＰ）レポーター遺伝子を駆動する。二量体化によるカスパーゼ－９の活性化は、細胞死を迅速にもたらし、細胞が死んでいるの割合は、薬物の量の増大と共に増大する。細胞が死ぬ場合、レポーターの転写および翻訳は停止するが、既に分泌されたレポータータンパク質は培地の中に残る。構成的ＳｅＡＰ活性の喪失は、それによって、細胞死の薬物依存性活性化の有効な代用である。
薬物刺激の２４時間後に、９６ウェルプレートを包んで蒸発を妨げ、６５℃で２時間インキュベートして、内因性および血清ホスファターゼを不活化するが、その一方で、熱安定性ＳｅＡＰレポーターは残った（３、１２、１４）。各ウェルからの１００μｌ サンプルを、側面が黒い９６ウェルアッセイプレートの個々のウェルへと負荷した。サンプルを、４～１６時間にわたって０．５Ｍ ジエタノールアミン（ｐＨ１０．０）中の０．５ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルホスフェート（４－ＭＵＰ）とともにインキュベートした。ホスファターゼ活性を、３５５ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの発光を有する蛍光によって測定した。データを、表作成のためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートに移し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでグラフ化した。
イソプロピルオキシラパマイシンの生成
Ｌｕｅｎｇｏらの方法（（Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ ５９：６５１２，（１９９４）），（１７， １８））を使用した。簡潔には、２０ｍｇのラパマイシンを、３ｍＬ イソプロパノール中に溶解し、２２．１ｍｇのｐ－トルエンスルホン酸を添加し、室温で４～１２時間撹拌しながらインキュベートした。終了時に、５ｍＬ 酢酸エチルを添加し、生成物を、飽和炭酸水素ナトリウムで５回、ブライン（飽和塩化ナトリウム）で３回抽出した。その有機相を乾燥させ、酢酸エチル：ヘキサン（３：１）中に再溶解した。立体異性体および微量の生成物を、３～４ ＫＰａ圧下で、３：１ 酢酸エチル：ヘキサンを用いる１０～１５ｍＬ シリカゲルカラムでのＦＬＡＳＨクロマトグラフィーによって分離し、画分を乾燥させた。画分を、２３７ｎＭ、２６７ｎＭ、２７８ｎＭおよび２９０ｎＭでの分光測光法によってアッセイし、ＦＲＢ対立遺伝子特異的転写スイッチにおける結合特異性に関して試験した。
Ｌｕｅｎｇｏらの方法（（Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ ５９：６５１２，（１９９４）），（１７， １８））を使用した。簡潔には、２０ｍｇのラパマイシンを、３ｍＬ イソプロパノール中に溶解し、２２．１ｍｇのｐ－トルエンスルホン酸を添加し、室温で４～１２時間撹拌しながらインキュベートした。終了時に、５ｍＬ 酢酸エチルを添加し、生成物を、飽和炭酸水素ナトリウムで５回、ブライン（飽和塩化ナトリウム）で３回抽出した。その有機相を乾燥させ、酢酸エチル：ヘキサン（３：１）中に再溶解した。立体異性体および微量の生成物を、３～４ ＫＰａ圧下で、３：１ 酢酸エチル：ヘキサンを用いる１０～１５ｍＬ シリカゲルカラムでのＦＬＡＳＨクロマトグラフィーによって分離し、画分を乾燥させた。画分を、２３７ｎＭ、２６７ｎＭ、２７８ｎＭおよび２９０ｎＭでの分光測光法によってアッセイし、ＦＲＢ対立遺伝子特異的転写スイッチにおける結合特異性に関して試験した。
活性化スイッチ技術の構成成分の発現
レトロウイルス構築物を、ＦＲＢありおよびなしのＦＫＢＰ１２と誘導性標的タンパク質との間の融合タンパク質を発現するために作製した。その構築物は、腫瘍特異的免疫に誘導する遺伝子治療ストラテジーの一部として、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を共発現する。誘導性（ＭＣ．ＦｖＦｖ）または構成的（ＭＣ）共刺激分子はまた、カスパーゼ－９安全スイッチとともに存在した。各構成成分を、ピコルナウイルスに由来する２Ａ共翻訳切断部位で分断した。これらの分子がどのようにして標的Ｔ細胞において一緒に機能するかをよりよく理解するために、Ｔ細胞における定常状態のタンパク質レベルを決定することは、重要であった。「ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ」（ｐＢＰ０６０８；ＭＣ．ＦｖＦｖ＋ＣＡＲζ）、「ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ」（ｐＢＰ０８４４； ｉＦｖＣａｓｐ９＋ＣＡＲζ＋構成的に活性な「ＭＣ」）、および（ｐＢＰ１３００；ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ＋ＣＡＲζ＋ｉＭＣ）ベクターの全ての構成成分の相対的タンパク質発現レベルを決定するために、ＭｙＤ８８、カスパーゼ－９およびα－アクチンに対して特異的な抗体を使用して、４名の異なるドナーに由来する形質導入Ｔ細胞でウェスタンブロット分析を行った（図４４Ａ）。その結果は、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ Ｔ細胞は、ＭＣ．ＦｖＦｖ構成成分を、ＭＣ（融合されたＦＫＢＰ１２なし）を発現するｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ Ｔ細胞に類似のレベルで発現することを明らかにした。しかし、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ Ｔ細胞におけるＭＣ．ＦｖＦｖ発現のレベルは、他の２種のＣＡＲ改変Ｔ細胞より有意に低かった。同様に、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ構築物中のｉＦｖＣ９構成成分は、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ構築物中のｉＦｗｔＦＲＢＣ９構成成分（ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９）と比較して遙かに高いレベルで発現された。これは、より大きなマルチシストロン性挿入物がタンパク質発現を制限しているか、またはＭＣに由来する高い基底シグナル伝達活性が、高レベルのこれらキメラタンパク質を発現する細胞を排除していることを示唆する。これらの可能性の間を区別するために、インビトロでの長期培養にわたるＴ細胞におけるＣＡＲ発現の安定性および基底毒性を、評価した。ＣＡＲ発現を、第１世代ＣＡＲ－ζの細胞外部分へと組み込まれたヒトＣＤ３４に由来するエピトープに特異的な抗体（ＱＢｅｎｄ－１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））を使用するフローサイトメトリーによって分析し、Ｔ細胞生存率を、アクリジンオレンジで染色した細胞およびヨウ化プロピジウム細胞とともに、Ｎｅｘｅｌｏｎ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを使用して評価した。フローサイトメトリー（Ｇａｌｌｅｏｓ， Ｂｅｃｋｍａｎ）による発現分析は、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞がｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣおよびＴ細胞と比較して遙かに高いＣＡＲレベルを発現することを示した（図４４Ｂ）。しかし、培養で成長させた細胞の生存率において、全３種のＣＡＲ Ｔ細胞タイプで改変された細胞の間での差異は比較的なかった（図４４Ｃ）。従って、キメラタンパク質発現における差異は、使用されるウイルスベクターの限定的なパッケージング能力に基づいている可能性がある。
レトロウイルス構築物を、ＦＲＢありおよびなしのＦＫＢＰ１２と誘導性標的タンパク質との間の融合タンパク質を発現するために作製した。その構築物は、腫瘍特異的免疫に誘導する遺伝子治療ストラテジーの一部として、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を共発現する。誘導性（ＭＣ．ＦｖＦｖ）または構成的（ＭＣ）共刺激分子はまた、カスパーゼ－９安全スイッチとともに存在した。各構成成分を、ピコルナウイルスに由来する２Ａ共翻訳切断部位で分断した。これらの分子がどのようにして標的Ｔ細胞において一緒に機能するかをよりよく理解するために、Ｔ細胞における定常状態のタンパク質レベルを決定することは、重要であった。「ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ」（ｐＢＰ０６０８；ＭＣ．ＦｖＦｖ＋ＣＡＲζ）、「ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ」（ｐＢＰ０８４４； ｉＦｖＣａｓｐ９＋ＣＡＲζ＋構成的に活性な「ＭＣ」）、および（ｐＢＰ１３００；ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ＋ＣＡＲζ＋ｉＭＣ）ベクターの全ての構成成分の相対的タンパク質発現レベルを決定するために、ＭｙＤ８８、カスパーゼ－９およびα－アクチンに対して特異的な抗体を使用して、４名の異なるドナーに由来する形質導入Ｔ細胞でウェスタンブロット分析を行った（図４４Ａ）。その結果は、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ Ｔ細胞は、ＭＣ．ＦｖＦｖ構成成分を、ＭＣ（融合されたＦＫＢＰ１２なし）を発現するｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ Ｔ細胞に類似のレベルで発現することを明らかにした。しかし、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ Ｔ細胞におけるＭＣ．ＦｖＦｖ発現のレベルは、他の２種のＣＡＲ改変Ｔ細胞より有意に低かった。同様に、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ構築物中のｉＦｖＣ９構成成分は、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ構築物中のｉＦｗｔＦＲＢＣ９構成成分（ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９）と比較して遙かに高いレベルで発現された。これは、より大きなマルチシストロン性挿入物がタンパク質発現を制限しているか、またはＭＣに由来する高い基底シグナル伝達活性が、高レベルのこれらキメラタンパク質を発現する細胞を排除していることを示唆する。これらの可能性の間を区別するために、インビトロでの長期培養にわたるＴ細胞におけるＣＡＲ発現の安定性および基底毒性を、評価した。ＣＡＲ発現を、第１世代ＣＡＲ－ζの細胞外部分へと組み込まれたヒトＣＤ３４に由来するエピトープに特異的な抗体（ＱＢｅｎｄ－１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））を使用するフローサイトメトリーによって分析し、Ｔ細胞生存率を、アクリジンオレンジで染色した細胞およびヨウ化プロピジウム細胞とともに、Ｎｅｘｅｌｏｎ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを使用して評価した。フローサイトメトリー（Ｇａｌｌｅｏｓ， Ｂｅｃｋｍａｎ）による発現分析は、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞がｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣおよびＴ細胞と比較して遙かに高いＣＡＲレベルを発現することを示した（図４４Ｂ）。しかし、培養で成長させた細胞の生存率において、全３種のＣＡＲ Ｔ細胞タイプで改変された細胞の間での差異は比較的なかった（図４４Ｃ）。従って、キメラタンパク質発現における差異は、使用されるウイルスベクターの限定的なパッケージング能力に基づいている可能性がある。
ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ構築物でのアポトーシスの誘導
ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ構築物が、細胞あたりのタンパク質発現が幾分低いにもかかわらず機能的であるかどうかを決定するために、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ構築物デザインに組み込まれたオンスイッチおよびオフスイッチの機能性を、標的腫瘍細胞の非存在下で試験した。そのオフスイッチ（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）は、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９のラパマイシン誘導性二量体化によって活性化され、これを、４名の異なるドナーに由来するＴ細胞（これを、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ、およびＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖベクターで形質導入された）を、「カスパーゼ３／７緑色」試薬を使用するカスパーゼベースの殺滅アッセイに供することによって試験した（図４５Ａ）。このアッセイにおいて、カスパーゼ３または７に感受性のペプチドを、潜在的な蛍光ＤＮＡ挿入色素と連結した。アポトーシスの間のカスパーゼ３／７の活性化は、その色素を放出し、ＤＮＡ結合および緑色細胞蛍光を可能にする。細胞を含む９６ウェルマイクロプレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ機械の中に置いて、活性化カスパーゼの活性を４８時間モニターした（切断されたカスパーゼ３／７試薬＝緑色蛍光）。ＩｎｃｕＣｙｔｅは、長期間にわたって蛍光標識ありまたはなしで、プレート上で培養された生細胞を観察、定量、および記録し得る自動化顕微鏡である。薬物の非存在下で、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ Ｔ細胞は、最高レベルの基底毒性を示し、それぞれ、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞およびｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ－Ｔ細胞が続いた。リミズシドは、全てのリガンド濃度（０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ）において、ラパマイシンが誘導するｉＦｗｔＦＲＢＣ９と類似の効率で、ｉＣ９（ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣにおいて）の活性化を誘導した。しかし、ｉＣ９活性化の動態は、ｉＦｗｔＦＲＢＣ９活性化のものより僅かに早いようである。自殺薬物処理の４８時間後に、細胞を、以下のマーカーに関してフローサイトメトリーによって分析した：ＣＤ３４（操作されたＣＡＲ Ｔ細胞）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、アネキシンＶ、および切断されたカスパーゼ３／７（緑色蛍光）（図４５Ｂ）。薬物処理の４８時間後に、（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）改変Ｔ細胞（６０％）において、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ－Ｔ細胞（２０％）におけるより死（ＰＩ＋／ＡｎｎＶ＋）細胞の遙かに高いパーセンテージが観察された。これは、ＩｎｃｕＣｙｔｅベースのカスパーゼアッセイを使用して、（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）改変Ｔ細胞における後の時点で独立して観察された高いカスパーゼ活性化レベルと一致した。オンスイッチ（これは、ＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰＶ（ＭＣＦｖＦｖ）のリミズシド誘導性二量体化によって活性化される）を試験するために、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞および（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）Ｔ細胞を、種々のリミズシド濃度で処理し、ＩＬ－２およびＩＬ－６サイトカイン放出を、ＥＬＩＳＡによって分析した（図４５Ｃ）。ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞は、リミズシド濃度が増加するにつれて誘導性のＩＬ－２およびＩＬ－６生成を示した一方で、（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）Ｔ細胞によるサイトカイン生成は、相対的により弱かった。ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ（ＭＣとともに）による基底のリガンド非依存性のＩＬ－６生成は、リミズシド刺激性ｉＭＣ＋ＣＡＲζ Ｔ細胞のものに類似のレベルで存在した。ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ
ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ構築物が、細胞あたりのタンパク質発現が幾分低いにもかかわらず機能的であるかどうかを決定するために、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ構築物デザインに組み込まれたオンスイッチおよびオフスイッチの機能性を、標的腫瘍細胞の非存在下で試験した。そのオフスイッチ（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）は、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９のラパマイシン誘導性二量体化によって活性化され、これを、４名の異なるドナーに由来するＴ細胞（これを、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ、およびＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖベクターで形質導入された）を、「カスパーゼ３／７緑色」試薬を使用するカスパーゼベースの殺滅アッセイに供することによって試験した（図４５Ａ）。このアッセイにおいて、カスパーゼ３または７に感受性のペプチドを、潜在的な蛍光ＤＮＡ挿入色素と連結した。アポトーシスの間のカスパーゼ３／７の活性化は、その色素を放出し、ＤＮＡ結合および緑色細胞蛍光を可能にする。細胞を含む９６ウェルマイクロプレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ機械の中に置いて、活性化カスパーゼの活性を４８時間モニターした（切断されたカスパーゼ３／７試薬＝緑色蛍光）。ＩｎｃｕＣｙｔｅは、長期間にわたって蛍光標識ありまたはなしで、プレート上で培養された生細胞を観察、定量、および記録し得る自動化顕微鏡である。薬物の非存在下で、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ Ｔ細胞は、最高レベルの基底毒性を示し、それぞれ、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞およびｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ－Ｔ細胞が続いた。リミズシドは、全てのリガンド濃度（０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ）において、ラパマイシンが誘導するｉＦｗｔＦＲＢＣ９と類似の効率で、ｉＣ９（ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣにおいて）の活性化を誘導した。しかし、ｉＣ９活性化の動態は、ｉＦｗｔＦＲＢＣ９活性化のものより僅かに早いようである。自殺薬物処理の４８時間後に、細胞を、以下のマーカーに関してフローサイトメトリーによって分析した：ＣＤ３４（操作されたＣＡＲ Ｔ細胞）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、アネキシンＶ、および切断されたカスパーゼ３／７（緑色蛍光）（図４５Ｂ）。薬物処理の４８時間後に、（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）改変Ｔ細胞（６０％）において、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ－Ｔ細胞（２０％）におけるより死（ＰＩ＋／ＡｎｎＶ＋）細胞の遙かに高いパーセンテージが観察された。これは、ＩｎｃｕＣｙｔｅベースのカスパーゼアッセイを使用して、（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）改変Ｔ細胞における後の時点で独立して観察された高いカスパーゼ活性化レベルと一致した。オンスイッチ（これは、ＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰＶ（ＭＣＦｖＦｖ）のリミズシド誘導性二量体化によって活性化される）を試験するために、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞および（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）Ｔ細胞を、種々のリミズシド濃度で処理し、ＩＬ－２およびＩＬ－６サイトカイン放出を、ＥＬＩＳＡによって分析した（図４５Ｃ）。ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞は、リミズシド濃度が増加するにつれて誘導性のＩＬ－２およびＩＬ－６生成を示した一方で、（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）Ｔ細胞によるサイトカイン生成は、相対的により弱かった。ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ（ＭＣとともに）による基底のリガンド非依存性のＩＬ－６生成は、リミズシド刺激性ｉＭＣ＋ＣＡＲζ Ｔ細胞のものに類似のレベルで存在した。ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ
高い基底カスパーゼ活性は、ウイルスまたはＴ細胞生成の間の製造的困難を示し得る。従って、カスパーゼ－９インヒビターであるＱ－ＬＥＨＤ－ＯＰｈが基底カスパーゼ活性を打ち消す能力をアッセイした。活性化ｉＣ９およびｉＲＣ９（ＦｗｔＦＲＢＣ９）は、Ｑ－ＬＥＨＤ－ＯＰｈ（これは、１００μＭ程度の高さのレベルでＴ細胞に対して毒性でないようであった）で効率的に阻害され得る（図４６）。さらに、４μＭ程度の低さのＱ－ＬＥＨＤ－ＯＰｈは、ｉＣ９およびｉＲＣ９（ＦｗｔＦＲＢＣ９）によるカスパーゼ－９活性化を、２０ｎＭのそれぞれの活性化リガンドとともにインキュベートした場合に効率的に阻害できた（図４６Ｃ）。
高い基底カスパーゼ活性を弱める別のアプローチは、ｉＲＣ９（ＦｗｔＦＲＢＣ９）構築物におけるタンパク質発現を不安定化するＦＲＢ－Ｔ２０９８Ｌ（「ＦＲＢＬ」）変異体を利用することである（１５， １６）。さらに、カスパーゼ－９変異体（Ｎ４０５Ｑ、ΔＣａｓｐ９Ｑ）はまた、ｉＣ９における基底カスパーゼ活性を低下させる。ＩｎｃｕＣｙｔｅおよびカスパーゼ３／７緑色試薬を使用して調査した場合、ＦＲＢＬおよびΔｃａｓｐ９Ｑ変異体ｉＲＣ９（ＦｗｔＦＲＢＣ９）の両方が、野生型ｉＲＣ９（ＦｗｔＦＲＢＣ９）と比較して、より低い基底カスパーゼ活性を示した（図４７Ａ）。しかし、ＦＲＢを野生型（スレオニン２０９８）からＦＲＢＬ変異体（ロイシン２０９８）へと変化させると、ｉＲＣ９（ＦｗｔＦＲＢＣ９）による最大殺滅効率がおよそ５０％低下した。同様に、Δカスパーゼ－９をｗｔからＮ４０５Ｑ変異体へと変化させると、ｉＲＣ９（ＦｗｔＦＲＢＣ９）活性がＦＲＢＬ変異よりさらに低いレベルへと低下した。
二量体化剤媒介性結合または足場への間接的リクルートメントによるアポトーシス誘導の効率
この実施例において、ＦＲＢ領域（ｉＦＲＢＣ９）を含む誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドを、ＭＣ．ＦｖＦｖも発現する改変された細胞において試験した。ここでは、ｉＲＣ９において、ＦＲＢ．ΔＣ９のラパマイシン誘導性二量体化は、同じ構築物内で共発現されるＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰＶ（ｉＭＣ）におけるタンデムＦＫＢＰ１２タンパク質によって提供されるＦＫＢＰベースの足場にのみ依拠する（模式図に関しては図４８Ａを参照のこと）。このストラテジーにおいて、ＦＫＢＰの足場（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６の足場）への複数のｉＦＲＢＣ９分子のリクルートメントは、それらの間接的な自発的会合および活性化を促進する。ｉＣ９（ｐＢＰ０８４４）、ｉＲＣ９（ｐＢＰ１１１６）、およびｉＲＣ９（ｐＢＰ１３００）の間でカスパーゼ活性化の程度を直接的に比較するために、活性化Ｔ細胞を、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ －Ｔ、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ、ｉＦＲＢＣ９およびＭＣ．ＦｖＦｖ、または（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）をコードするレトロウイルスで形質導入し、薬物なし、２０ｎＭ ラパマイシンまたは２０ｎＭ リミズシドで処理し、カスパーゼ３／７緑色試薬の存在下で培養した（図４８Ｂ～Ｄ）。構築物のうちの全てにおいて概して低い基底カスパーゼ活性が存在したが、（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）で形質導入した細胞は、他のＣＡＲ Ｔ細胞と比較して最高の基底カスパーゼ活性を示した（図４８Ｂ）。２０ｎＭ ラパマイシンで誘導した場合、（ｉＦＲＢＣ９およびＭＣ．ＦｖＦｖ）は、中程度のカスパーゼ活性化を示した一方で、Ｔ細胞（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）においてカスパーゼ活性のロバストな誘導が存在した（図４８Ｃ）。アポトーシスのこの誘導は、２０ｎＭ リミズシドで処理したｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣを発現するＴ細胞で類似であった（図４８Ｄ）。このアッセイにおいて、２０ｎＭ リミズシドは、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．Δｃａｓｐ９（ｉＲＣ９）の二量体化を誘導できなかった。これは、ＦＫＢＰＶ３６と比較して、ｉＲＣ９（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）に存在する野生型ＦＫＢＰに対するリミズシドの親和性が１／１０００に低下したことが原因である。
この実施例において、ＦＲＢ領域（ｉＦＲＢＣ９）を含む誘導性カスパーゼ－９ポリペプチドを、ＭＣ．ＦｖＦｖも発現する改変された細胞において試験した。ここでは、ｉＲＣ９において、ＦＲＢ．ΔＣ９のラパマイシン誘導性二量体化は、同じ構築物内で共発現されるＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰＶ（ｉＭＣ）におけるタンデムＦＫＢＰ１２タンパク質によって提供されるＦＫＢＰベースの足場にのみ依拠する（模式図に関しては図４８Ａを参照のこと）。このストラテジーにおいて、ＦＫＢＰの足場（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６の足場）への複数のｉＦＲＢＣ９分子のリクルートメントは、それらの間接的な自発的会合および活性化を促進する。ｉＣ９（ｐＢＰ０８４４）、ｉＲＣ９（ｐＢＰ１１１６）、およびｉＲＣ９（ｐＢＰ１３００）の間でカスパーゼ活性化の程度を直接的に比較するために、活性化Ｔ細胞を、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ －Ｔ、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ、ｉＦＲＢＣ９およびＭＣ．ＦｖＦｖ、または（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）をコードするレトロウイルスで形質導入し、薬物なし、２０ｎＭ ラパマイシンまたは２０ｎＭ リミズシドで処理し、カスパーゼ３／７緑色試薬の存在下で培養した（図４８Ｂ～Ｄ）。構築物のうちの全てにおいて概して低い基底カスパーゼ活性が存在したが、（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）で形質導入した細胞は、他のＣＡＲ Ｔ細胞と比較して最高の基底カスパーゼ活性を示した（図４８Ｂ）。２０ｎＭ ラパマイシンで誘導した場合、（ｉＦＲＢＣ９およびＭＣ．ＦｖＦｖ）は、中程度のカスパーゼ活性化を示した一方で、Ｔ細胞（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）においてカスパーゼ活性のロバストな誘導が存在した（図４８Ｃ）。アポトーシスのこの誘導は、２０ｎＭ リミズシドで処理したｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣを発現するＴ細胞で類似であった（図４８Ｄ）。このアッセイにおいて、２０ｎＭ リミズシドは、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．Δｃａｓｐ９（ｉＲＣ９）の二量体化を誘導できなかった。これは、ＦＫＢＰＶ３６と比較して、ｉＲＣ９（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）に存在する野生型ＦＫＢＰに対するリミズシドの親和性が１／１０００に低下したことが原因である。
全動物モデルアッセイ
ｉＲＣ９（ＦｗｔＦＲＢＣ９）の機能性をインビボで示すために、ＮＯＤ－Ｓｃｉｄ－ＩＬ－２Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－／－マウス（ＮＳＧ， Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に、マウス１匹あたり１×１０７個のｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ、ｉＦＲＢＣ９およびＭＣ．ＦｖＦｖまたはＧＦＰ－ＦＦｌｕｃと共形質導入した（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）Ｔ細胞をｉ．ｖ．注射した。ＣＡＲ Ｔ細胞のバイオルミネッセンスイメージング（ＢＬＩ）を、薬物処置の１８時間前（－１８時間）、薬物処置直前（０時間）および薬物処置後４．５時間、１８時間、２７時間、および４５時間で評価した（図４９ＡおよびＢ）。ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ Ｔ細胞注射を受けたマウスの部分セットに、５ｍｇ／ｋｇ リミズシドでｉ．ｐ．処置した一方で、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ、（ｉＦＲＢＣ９およびＭＣ．ＦｖＦｖ）および－２．０ Ｔ細胞を受けたマウスの部分セットに、１０ｍｇ／ｋｇ ラパマイシンでｉ．ｐ．処置した。全ての他のマウスは、ｉ．ｐ．のビヒクルのみを受けた。薬物処置後４５時間で、マウスを安楽死させ、血液および脾臓を、ヒト（ｈ）ＣＤ３またはＣＤ３４、およびマウス（ｍ）ＣＤ４５に対する抗体を用いるフローサイトメトリー分析のために集めた。ｉＣ９と同様に、ｉＲＣ９（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）は、ＢＬＩならびに血液および脾臓組織の分析によって評価される場合、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ Ｔ細胞を迅速かつ効率的に排除した（図４９ＣおよびＤ）。（ｉＦＲＢＣ９およびＭＣ．ＦｖＦｖ） Ｔ細胞アポトーシスの誘導は中程度であり、動態は、図４８に示されるインビトロ細胞死データと一致して、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣおよびＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖと比較して遅れた。
ｉＲＣ９（ＦｗｔＦＲＢＣ９）の機能性をインビボで示すために、ＮＯＤ－Ｓｃｉｄ－ＩＬ－２Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－／－マウス（ＮＳＧ， Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に、マウス１匹あたり１×１０７個のｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ、ｉＦＲＢＣ９およびＭＣ．ＦｖＦｖまたはＧＦＰ－ＦＦｌｕｃと共形質導入した（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）Ｔ細胞をｉ．ｖ．注射した。ＣＡＲ Ｔ細胞のバイオルミネッセンスイメージング（ＢＬＩ）を、薬物処置の１８時間前（－１８時間）、薬物処置直前（０時間）および薬物処置後４．５時間、１８時間、２７時間、および４５時間で評価した（図４９ＡおよびＢ）。ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ Ｔ細胞注射を受けたマウスの部分セットに、５ｍｇ／ｋｇ リミズシドでｉ．ｐ．処置した一方で、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ、（ｉＦＲＢＣ９およびＭＣ．ＦｖＦｖ）および－２．０ Ｔ細胞を受けたマウスの部分セットに、１０ｍｇ／ｋｇ ラパマイシンでｉ．ｐ．処置した。全ての他のマウスは、ｉ．ｐ．のビヒクルのみを受けた。薬物処置後４５時間で、マウスを安楽死させ、血液および脾臓を、ヒト（ｈ）ＣＤ３またはＣＤ３４、およびマウス（ｍ）ＣＤ４５に対する抗体を用いるフローサイトメトリー分析のために集めた。ｉＣ９と同様に、ｉＲＣ９（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）は、ＢＬＩならびに血液および脾臓組織の分析によって評価される場合、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ Ｔ細胞を迅速かつ効率的に排除した（図４９ＣおよびＤ）。（ｉＦＲＢＣ９およびＭＣ．ＦｖＦｖ） Ｔ細胞アポトーシスの誘導は中程度であり、動態は、図４８に示されるインビトロ細胞死データと一致して、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣおよびＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖと比較して遅れた。
ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖは、二重共刺激オンスイッチおよびアポトーシスオフスイッチを含む
標的腫瘍細胞の存在下でＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ構築物におけるオンスイッチおよびオフスイッチの両方の機能性を試験するために、Ｔ細胞を、ＧＦＰ－ＦＦｌｕｃで標識し（インビボで細胞マーカーとしてホタルルシフェラーゼと融合した緑色蛍光タンパク質を発現する）、ＰＳＣＡ－ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ（ｐＢＰ０１８９）、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ（ｐＢＰ０８７３）、またはＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ（ｐＢＰ１３０８）をコードするベクターで共形質導入した（図５０）。形質導入の１０日後、Ｔ細胞を、９６ウェルプレートに、１：２および１：５のエフェクター 対 腫瘍標的（Ｅ：Ｔ）比で、０ｎＭ、２ｎＭ、または１０ｎＭ リミズシドの存在下で、ＲＦＰで構成的に標識したＨＰＡＣ膵臓癌細胞とともに播種し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ機械の中に置いて、ＨＰＡＣ－ＲＦＰおよびＴ細胞－ＧＦＰ成長の動態をモニターした。播種の２日後に、培養上清を、ＩＬ－２、ＩＬ－６、およびＩＦＮ－γ生成に関してＥＬＩＳＡによって分析した。全体として、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞は、全リミズシド濃度および両方のＥ：Ｔ比において、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ Ｔ細胞と比較しておよそ３倍高いレベルのＩＬ－２、ＩＬ－６、およびＩＦＮ－γを生成した（図５０ＡおよびＢ）。さらに、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ構築物におけるＭＣ共刺激構成成分の基底活性は、リミズシド刺激したｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞において測定されるものに類似のレベルで、ＩＬ－６およびＩＦＮ－γサイトカイン生成を誘導した。図５０ＣおよびＤに認められるように、１：２および１：５の比で、それぞれ、５％未満および１０％未満のＨＰＡＣ－ＲＦＰ細胞が残存した。（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ） Ｔ細胞は、両方の比でリミズシド依存性腫瘍細胞殺滅を示した一方で、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞は、これらの比においてリミズシド非依存性のようであり、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ Ｔ細胞と類似の標的殺滅効率である。Ｔ細胞拡大に関して分析した場合、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ．０ Ｔ細胞は、リミズシド濃度が増加するとともに増殖および拡大した一方で、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞は、１０ｎＭ リミズシド刺激後に同程度まで拡大できなかった。共培養の７日目に１０ｎＭ ラパマイシンを投与すると、２４時間以内に（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ） Ｔ細胞のうちの６０％超の排除が生じた一方で、１０ｎＭ リミズシドは、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ Ｔ細胞のうちのおよそ５０％の減少を引き起こした。これは、安全スイッチが、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖにおいても機能することを示唆する。
標的腫瘍細胞の存在下でＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ構築物におけるオンスイッチおよびオフスイッチの両方の機能性を試験するために、Ｔ細胞を、ＧＦＰ－ＦＦｌｕｃで標識し（インビボで細胞マーカーとしてホタルルシフェラーゼと融合した緑色蛍光タンパク質を発現する）、ＰＳＣＡ－ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ（ｐＢＰ０１８９）、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ（ｐＢＰ０８７３）、またはＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ（ｐＢＰ１３０８）をコードするベクターで共形質導入した（図５０）。形質導入の１０日後、Ｔ細胞を、９６ウェルプレートに、１：２および１：５のエフェクター 対 腫瘍標的（Ｅ：Ｔ）比で、０ｎＭ、２ｎＭ、または１０ｎＭ リミズシドの存在下で、ＲＦＰで構成的に標識したＨＰＡＣ膵臓癌細胞とともに播種し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ機械の中に置いて、ＨＰＡＣ－ＲＦＰおよびＴ細胞－ＧＦＰ成長の動態をモニターした。播種の２日後に、培養上清を、ＩＬ－２、ＩＬ－６、およびＩＦＮ－γ生成に関してＥＬＩＳＡによって分析した。全体として、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞は、全リミズシド濃度および両方のＥ：Ｔ比において、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ Ｔ細胞と比較しておよそ３倍高いレベルのＩＬ－２、ＩＬ－６、およびＩＦＮ－γを生成した（図５０ＡおよびＢ）。さらに、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ構築物におけるＭＣ共刺激構成成分の基底活性は、リミズシド刺激したｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞において測定されるものに類似のレベルで、ＩＬ－６およびＩＦＮ－γサイトカイン生成を誘導した。図５０ＣおよびＤに認められるように、１：２および１：５の比で、それぞれ、５％未満および１０％未満のＨＰＡＣ－ＲＦＰ細胞が残存した。（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ） Ｔ細胞は、両方の比でリミズシド依存性腫瘍細胞殺滅を示した一方で、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞は、これらの比においてリミズシド非依存性のようであり、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ Ｔ細胞と類似の標的殺滅効率である。Ｔ細胞拡大に関して分析した場合、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ．０ Ｔ細胞は、リミズシド濃度が増加するとともに増殖および拡大した一方で、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞は、１０ｎＭ リミズシド刺激後に同程度まで拡大できなかった。共培養の７日目に１０ｎＭ ラパマイシンを投与すると、２４時間以内に（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ） Ｔ細胞のうちの６０％超の排除が生じた一方で、１０ｎＭ リミズシドは、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ Ｔ細胞のうちのおよそ５０％の減少を引き起こした。これは、安全スイッチが、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖにおいても機能することを示唆する。
ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖにおけるカスパーゼ－９活性化
ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ改変Ｔ細胞内のｉＲＣ９（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）の活性化は、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９ホモ二量体化、およびＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰＶにおけるＦＫＢＰへのＦＫＢＰ．ＦＲＢ．Ｃ９におけるＦＲＢのリクルートメントによって駆動される足場媒介性リクルートメントの両方によって媒介できた。ｉＲＣ９（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）が足場媒介性リクルートメントによって活性化されるその能力を妨げるために、ＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰＶ（ｐＢＰ１３０８， 「ｉＭＣ」）、ＭＣ．ＦＫＢＰＶ（ｐＢＰ１３１９， １個のＦＫＢＰＶ）、ＭＣ（ｐＢＰ１３２０， ＦＫＢＰなし）、およびＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰ（ｐＢＰ１３２１， １個のＦＫＢＰＶおよび１個の非ＡＰ１９０３結合野生型ＦＫＢＰ）を含むＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ関連ファミリーベクターを生成した（構築物の模式図に関しては、図５１Ａを参照のこと）。ＰＳＣＡ－ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣベクター（ｐＢＰ０８７３）は、オフスイッチに関する陽性コントロールとして働き、ＣＤ１９－ｉＭＣ＋ＣＡＲζ －Ｔベクター（ＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰＶを有するｐＢＰ０６０８およびＭＣ．ＦＫＢＰＶを有するｐＢＰ１４３９）は、オンスイッチに関する陽性コントロールとして働いた。抗ＭｙＤ８８抗体を使用するＣＡＲ－Ｔ細胞のタンパク質発現を決定した。１コピーのＦＫＢＰＶをｉＭＣから除去すると、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖプラットフォーム（ｐＢＰ１３１９に対してｐＢＰ１３０８を比較のこと）およびｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔプラットフォーム（ｐＢＰ１４３９に対してｐＢＰ０６０８を比較のこと）において増加したＭＣ融合タンパク質発現が生じた（図５１Ｂ）。しかし、ＭＣ発現は、ＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰを含む構築物において減少した（ｐＢＰ１３２１に対してｐＢＰ１３１９を比較のこと）。これは、さらなるＦＫＢＰドメインがＭＣ融合タンパク質を不安定化したことを示唆した。最も興味深いことには、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣプラットフォーム構築物（すなわち、ｉＣ９を含むｐＢＰ０８７３およびｉＲＣ９を含むｐＢＰ１３２０（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９））の発現パターンは、抗ＭｙＤ８８抗体でプローブした場合に、さらなるゆっくりと移動するバンドを明らかにする。推定２７ｋＤａ ＭＣ融合タンパク質バンドに加えて、３本のさらなるバンドが９０ｋＤａ、８０ｋＤａおよび５０ｋＤａで検出された。ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣベクターにおける高い基底ＭＣシグナル伝達に基づいて、このデータは、２番目の「２Ａ」部位において不完全なタンパク質分断が存在し、以下の候補タンパク質生成物：αＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．２Ａ－ＭＣおよびＣＤ８ｓｔｍ．ζ．２Ａ－ＭＣ（後者は、ｓｃＦｖドメインを失っている）を生じるという仮説を裏付け得る。カスパーゼ－９融合タンパク質発現に関して、ＭＣ融合タンパク質の異なるバリエーションの間でキメラカスパーゼタンパク質レベルの顕著な差異は存在しなかった（ｐＢＰ１３０８、ｐＢＰ１３１９、ｐＢＰ１３２０、およびｐＢＰ１３２１を比較のこと）。
ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ改変Ｔ細胞内のｉＲＣ９（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）の活性化は、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９ホモ二量体化、およびＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰＶにおけるＦＫＢＰへのＦＫＢＰ．ＦＲＢ．Ｃ９におけるＦＲＢのリクルートメントによって駆動される足場媒介性リクルートメントの両方によって媒介できた。ｉＲＣ９（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）が足場媒介性リクルートメントによって活性化されるその能力を妨げるために、ＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰＶ（ｐＢＰ１３０８， 「ｉＭＣ」）、ＭＣ．ＦＫＢＰＶ（ｐＢＰ１３１９， １個のＦＫＢＰＶ）、ＭＣ（ｐＢＰ１３２０， ＦＫＢＰなし）、およびＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰ（ｐＢＰ１３２１， １個のＦＫＢＰＶおよび１個の非ＡＰ１９０３結合野生型ＦＫＢＰ）を含むＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ関連ファミリーベクターを生成した（構築物の模式図に関しては、図５１Ａを参照のこと）。ＰＳＣＡ－ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣベクター（ｐＢＰ０８７３）は、オフスイッチに関する陽性コントロールとして働き、ＣＤ１９－ｉＭＣ＋ＣＡＲζ －Ｔベクター（ＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰＶを有するｐＢＰ０６０８およびＭＣ．ＦＫＢＰＶを有するｐＢＰ１４３９）は、オンスイッチに関する陽性コントロールとして働いた。抗ＭｙＤ８８抗体を使用するＣＡＲ－Ｔ細胞のタンパク質発現を決定した。１コピーのＦＫＢＰＶをｉＭＣから除去すると、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖプラットフォーム（ｐＢＰ１３１９に対してｐＢＰ１３０８を比較のこと）およびｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔプラットフォーム（ｐＢＰ１４３９に対してｐＢＰ０６０８を比較のこと）において増加したＭＣ融合タンパク質発現が生じた（図５１Ｂ）。しかし、ＭＣ発現は、ＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰを含む構築物において減少した（ｐＢＰ１３２１に対してｐＢＰ１３１９を比較のこと）。これは、さらなるＦＫＢＰドメインがＭＣ融合タンパク質を不安定化したことを示唆した。最も興味深いことには、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣプラットフォーム構築物（すなわち、ｉＣ９を含むｐＢＰ０８７３およびｉＲＣ９を含むｐＢＰ１３２０（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９））の発現パターンは、抗ＭｙＤ８８抗体でプローブした場合に、さらなるゆっくりと移動するバンドを明らかにする。推定２７ｋＤａ ＭＣ融合タンパク質バンドに加えて、３本のさらなるバンドが９０ｋＤａ、８０ｋＤａおよび５０ｋＤａで検出された。ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣベクターにおける高い基底ＭＣシグナル伝達に基づいて、このデータは、２番目の「２Ａ」部位において不完全なタンパク質分断が存在し、以下の候補タンパク質生成物：αＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．２Ａ－ＭＣおよびＣＤ８ｓｔｍ．ζ．２Ａ－ＭＣ（後者は、ｓｃＦｖドメインを失っている）を生じるという仮説を裏付け得る。カスパーゼ－９融合タンパク質発現に関して、ＭＣ融合タンパク質の異なるバリエーションの間でキメラカスパーゼタンパク質レベルの顕著な差異は存在しなかった（ｐＢＰ１３０８、ｐＢＰ１３１９、ｐＢＰ１３２０、およびｐＢＰ１３２１を比較のこと）。
オフスイッチを試験するために、上記のベクターで形質導入したＴ細胞を、０ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ ラパマイシンの処理を伴うカスパーゼ活性化アッセイに供した。ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣベクター（ｐＢＰ０８７３）で形質導入したＴ細胞を、リミズシドで処理した。ラパマイシン（またはリミズシド）曝露の２４時間後のカスパーゼ活性化を決定し、線グラフによって示した（図５１Ｃ）。１コピーのＦＫＢＰＶをｉＭＣから除去すると、実際に、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖプラットフォーム（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）において改善されたカスパーゼ活性化を生じた（ｐＢＰ１３１９に対してｐＢＰ１３０８を比較のこと）。ＦＫＢＰＶの両方のコピーを除去した場合、カスパーゼ活性は、動態に関してｉＣ９のものに似ていたが、遙かにより高い振幅であった（ｐＢＰ１３２０に対してｐＢＰ０８７３を比較のこと）。ＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰを含む構築物において、カスパーゼ活性は、元の「ｉＭＣ」であるＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰＶをコードする構築物におけるものに匹敵するレベルへと戻った（ｐＢＰ１３２１に対してｐＢＰ１３０８を比較のこと）。
ｉＲＣ９（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）におけるＦＲＢおよびＦＫＢＰのトポロジー
シグナル伝達エレメントおよび結合ドメインの順序および間隔は、おそらく結果に影響を及ぼし得るので、ｉＦｗｔＦＲＢＣ９分子の場合のリガンド結合ドメインの順序を試験した。上記で論じたｉＲＣ９（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）は、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９（ｐＢＰ１３０８およびｐＢＰ１３１１）においての、アミノ末端のＦＫＢＰ、続いて、ＦＲＢドメインを含んだ。反対の配置の有効性を調査するために、ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９／（ｐＢＰ１３１０）を構築した（図５１Ａ）。カスパーゼ活性化アッセイから、ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９がラパマイシン開始のアポトーシスに関して、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９より僅かにより感受性であることが明らかになった（図５１Ｄ）。このあまり大きくない差異は、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９と比較して、より高いＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９タンパク質レベルと一致する（図５１Ｂ）。さらに、これら２つのプラスミドは、薄い（ｄｉｌｕｔｉｖｅ）ｉＭＣ会合足場を含まないので、これらのデータはまた、ｉＲＣ９が、カスパーゼシグナル伝達を強力に活性化するために足場を必要としないという証拠を提供する。オンスイッチに関して、全てのＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ構築物（ｐＢＰ１３０８、ｐＢＰ１３１９、およびｐＢＰ１３２１）は、リミズシドで刺激した場合にすら腫瘍の非存在下では低いＩＬ－２およびＩＬ－６サイトカイン生成を示す一方で、リミズシド－誘導性ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ構築物（ｐＢＰ０６０８およびｐＢＰ１４３９）は、予測されるように、リガンド依存性活性化を示す（図５１Ｅ）。さらに、ＭＣを含む両方のｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ構築物（ｐＢＰ０８７３およびｐＢＰ１３２０）が、高い基底ＩＬ－６生成を誘導する。
シグナル伝達エレメントおよび結合ドメインの順序および間隔は、おそらく結果に影響を及ぼし得るので、ｉＦｗｔＦＲＢＣ９分子の場合のリガンド結合ドメインの順序を試験した。上記で論じたｉＲＣ９（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）は、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９（ｐＢＰ１３０８およびｐＢＰ１３１１）においての、アミノ末端のＦＫＢＰ、続いて、ＦＲＢドメインを含んだ。反対の配置の有効性を調査するために、ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９／（ｐＢＰ１３１０）を構築した（図５１Ａ）。カスパーゼ活性化アッセイから、ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９がラパマイシン開始のアポトーシスに関して、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９より僅かにより感受性であることが明らかになった（図５１Ｄ）。このあまり大きくない差異は、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９と比較して、より高いＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９タンパク質レベルと一致する（図５１Ｂ）。さらに、これら２つのプラスミドは、薄い（ｄｉｌｕｔｉｖｅ）ｉＭＣ会合足場を含まないので、これらのデータはまた、ｉＲＣ９が、カスパーゼシグナル伝達を強力に活性化するために足場を必要としないという証拠を提供する。オンスイッチに関して、全てのＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ構築物（ｐＢＰ１３０８、ｐＢＰ１３１９、およびｐＢＰ１３２１）は、リミズシドで刺激した場合にすら腫瘍の非存在下では低いＩＬ－２およびＩＬ－６サイトカイン生成を示す一方で、リミズシド－誘導性ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ構築物（ｐＢＰ０６０８およびｐＢＰ１４３９）は、予測されるように、リガンド依存性活性化を示す（図５１Ｅ）。さらに、ＭＣを含む両方のｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ構築物（ｐＢＰ０８７３およびｐＢＰ１３２０）が、高い基底ＩＬ－６生成を誘導する。
ｉＲＣ９は、野生型ＦＫＢＰドメインを含むので、二量体化およびｉＲＣ９活性化を引き起こし得るリミズシドの濃度をアッセイして、Ｔ細胞刺激薬物としてリミズシドを使用するための安全性の治療ウインドウを測定した。このアッセイにおいて、２９３細胞を、ｉＣ９および２種の類似のｉＲＣ９バリアント（ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９およびＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９）（図５２）を発現するベクターで一過性にトランスフェクトし、ラパマイシンまたはリミズシドいずれかの半対数希釈物で処理した。細胞を、カスパーゼ３／７緑色試薬の存在下でＩｎｃｕＣｙｔｅによってモニターされるカスパーゼ活性化アッセイ（図５２Ａ）または構成的ＳＲαレポーターを使用する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ（図５２Ｂ）のいずれかに供した。図５２Ｂの左側のグラフに関して、グラフの線は、ｘ軸の１０３点で示される場合、上から下に、陰性コントロール、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．Ｃ９、ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．Ｃ９、ｉＣ９である。図５２Ｂの右側のグラフに関しては、グラフの線は、ｘ軸の１０３点において、上から下に、陰性コントロール、ｉＣ９、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．Ｃ９、およびＦＲＢ．ＦＫＢＰ．Ｃ９である。
機能的には、ｉＲＣ９およびｉＣ９は、それらそれぞれの自殺薬物によって活性化される場合、類似の動態および閾値でカスパーゼ切断を誘導するようであった。ｉＲＣ９は、１００ｐＭ程度の少なさのラパマイシンの存在下ですら高度に活性であり、さらにより低い薬物レベルでは、低下した動態にも拘わらず、いくらか有効性があった。ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９に対してＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９を比較する場合、ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９は、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９より低いラパマイシン濃度で活性であり、図５１Ｄで得られるデータと一致した。さらに、ｉＲＣ９は、１００ｎＭ未満のリミズシドに非感受性であったが、これは、リミズシドを使用して、Ｔ細胞活性化を誘導する大きな安全性のウインドウ（一般に１～１０ｎＭにおいて）を提供する。この実験はまた、（ｉＦｗｔＦＲＢＣ９）がＭＣ．ＦｖＦｖによって提供される足場誘導性二量体化とは無関係であるアポトーシスの強力な活性化因子であることを示す。
ＭＣ－Ｒａｐ：ラパマイシンアナログによって誘導される誘導性共刺激ポリペプチド
ＦＫＢＰおよびＦＲＢのタンデム融合物を利用して、ラパマイシンまたはラパログでのホモ二量体化を促進するという多用途性を示すために、ＭＣ－Ｒａｐ（ｉＦＲＢＦｗｔＭＣ）構築物を作製した。これは、野生型ＦＫＢＰおよびＦＲＢＬとのＭｙＤ８８／ＣＤ４０融合物を有した。ＭＣ－Ｒａｐを、２Ａ配列によって分断される２個のシストロンを有するＣＤ１９に対して誘導されるＣＡＲと一緒に発現した（図５３）。この構築物を用いて、ラパログを、ＭＣ－Ｒａｐ上に存在する野生型ＦＫＢＰに結合し、かつ第２のＭＣ－Ｒａｐ上に存在するＦＲＢとの二量体化を一緒に促進するように選択した。ＭＣ－Ｒａｐのこの技法での二量体化が、ＭＣの活性化および共刺激機能に誘導し得るかどうかを決定するために、ＭＣ－Ｒａｐを含むレトロウイルス構築物１４４０を、同じＣＡＲを含むが、リミズシド感受性Ｆｖの２個のタンデムコピーを含む２種のｉＭＣ＋ＣＡＲζ構築物または非誘導性ＭＣのみの構築物（１１５１）と比較した。Ｔ細胞へと形質導入した場合、ＭＣ機能に依拠するＩＬ－６の発現は、ＭＣ活性単独で中程度のレベルにおいて観察され、ラパログであるＣ７－イソブチルオキシラパマイシンまたはリミズシドのいずれでも誘導されなかった（図５４）。ＭＣのカルボキシ末端に融合されたＦｖ．Ｆｖを有するＢＰ０７７４またはアミノ末端のＦｖ融合物を有するＢＰ１４３３のいずれかを含むｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞からのＩＬ－６誘導は、の存在下で高レベルのＩＬ－６を分泌したが、イソブチルオキシラパマイシンではそうではなかった（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＩＬ－６ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｂｕｔ ｎｏｔ
ｗｉｔｈ ｉｓｏｂｕｔｙｌｏｘｙｒａｐａｍｙｃｉｎ）。図５４中の用語「繋がれた（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）」とは、ＭｙＤ８８－ＣＤ４０ポリペプチドに繋がれたＦＲＢおよびＦＫＢＰポリペプチドに言及する。対照的に、ＭＣとともに、ＦＲＢＬとのタンデムで野生型ＦＫＢＰのカルボキシ末端融合物を発現するＢＰ１４４０は、リミズシドに応答しなかったが、ＭＣの活性化によってＩＬ－６分泌を強く誘導する。ウェスタンブロットにおいてＭｙＤ８８に対する抗体でプローブした場合、ＭＣ．ＦＫＷＴ．ＦＲＢＬの発現レベルは、１４３３（カルボキシ末端融合物でもあるが、複数のＦｖ（Ｆｖｓ）を有する）およびＭＣ単独によって発現されるものに類似していた（図５５）。ｉＭＣ＋ＣＡＲζおよびＭＣ－Ｒａｐ－ＣＡＲ構築物の用量応答性は、感受性レポーターアッセイにおいて決定した。ここでＭＣを介するシグナル伝達は、転写因子ＮＦ－ΚＢを活性化する（図５６）。ＢＰ７７４は、ナノモル未満の濃度のリミズシドによって強く誘導されたが、ラパマイシンまたはイソブチルオキシラパマイシンによっては誘導されなかった。対照的に、ナノモル未満の濃度のラパマイシンまたはイソブチルオキシラパマイシンは、ＢＰ１４４０においてＭＣ－Ｒａｐを誘導するには十分であったが、リミズシドは、５０ｎＭですら、Ｆｖに対するその薬物の特異性が原因でＭＣ機能に対して不活性のままであった。
ＦＫＢＰおよびＦＲＢのタンデム融合物を利用して、ラパマイシンまたはラパログでのホモ二量体化を促進するという多用途性を示すために、ＭＣ－Ｒａｐ（ｉＦＲＢＦｗｔＭＣ）構築物を作製した。これは、野生型ＦＫＢＰおよびＦＲＢＬとのＭｙＤ８８／ＣＤ４０融合物を有した。ＭＣ－Ｒａｐを、２Ａ配列によって分断される２個のシストロンを有するＣＤ１９に対して誘導されるＣＡＲと一緒に発現した（図５３）。この構築物を用いて、ラパログを、ＭＣ－Ｒａｐ上に存在する野生型ＦＫＢＰに結合し、かつ第２のＭＣ－Ｒａｐ上に存在するＦＲＢとの二量体化を一緒に促進するように選択した。ＭＣ－Ｒａｐのこの技法での二量体化が、ＭＣの活性化および共刺激機能に誘導し得るかどうかを決定するために、ＭＣ－Ｒａｐを含むレトロウイルス構築物１４４０を、同じＣＡＲを含むが、リミズシド感受性Ｆｖの２個のタンデムコピーを含む２種のｉＭＣ＋ＣＡＲζ構築物または非誘導性ＭＣのみの構築物（１１５１）と比較した。Ｔ細胞へと形質導入した場合、ＭＣ機能に依拠するＩＬ－６の発現は、ＭＣ活性単独で中程度のレベルにおいて観察され、ラパログであるＣ７－イソブチルオキシラパマイシンまたはリミズシドのいずれでも誘導されなかった（図５４）。ＭＣのカルボキシ末端に融合されたＦｖ．Ｆｖを有するＢＰ０７７４またはアミノ末端のＦｖ融合物を有するＢＰ１４３３のいずれかを含むｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞からのＩＬ－６誘導は、の存在下で高レベルのＩＬ－６を分泌したが、イソブチルオキシラパマイシンではそうではなかった（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＩＬ－６ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｂｕｔ ｎｏｔ
ｗｉｔｈ ｉｓｏｂｕｔｙｌｏｘｙｒａｐａｍｙｃｉｎ）。図５４中の用語「繋がれた（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）」とは、ＭｙＤ８８－ＣＤ４０ポリペプチドに繋がれたＦＲＢおよびＦＫＢＰポリペプチドに言及する。対照的に、ＭＣとともに、ＦＲＢＬとのタンデムで野生型ＦＫＢＰのカルボキシ末端融合物を発現するＢＰ１４４０は、リミズシドに応答しなかったが、ＭＣの活性化によってＩＬ－６分泌を強く誘導する。ウェスタンブロットにおいてＭｙＤ８８に対する抗体でプローブした場合、ＭＣ．ＦＫＷＴ．ＦＲＢＬの発現レベルは、１４３３（カルボキシ末端融合物でもあるが、複数のＦｖ（Ｆｖｓ）を有する）およびＭＣ単独によって発現されるものに類似していた（図５５）。ｉＭＣ＋ＣＡＲζおよびＭＣ－Ｒａｐ－ＣＡＲ構築物の用量応答性は、感受性レポーターアッセイにおいて決定した。ここでＭＣを介するシグナル伝達は、転写因子ＮＦ－ΚＢを活性化する（図５６）。ＢＰ７７４は、ナノモル未満の濃度のリミズシドによって強く誘導されたが、ラパマイシンまたはイソブチルオキシラパマイシンによっては誘導されなかった。対照的に、ナノモル未満の濃度のラパマイシンまたはイソブチルオキシラパマイシンは、ＢＰ１４４０においてＭＣ－Ｒａｐを誘導するには十分であったが、リミズシドは、５０ｎＭですら、Ｆｖに対するその薬物の特異性が原因でＭＣ機能に対して不活性のままであった。
（ＦＲＢＦｗｔＭＣ／ＦｖＣ９）：ラパログでの共刺激およびリミズシドでのアポトーシスを活性化する二重スイッチ
ラパログで（しかしリミズシドでではない）の活性化に対するＭＣ－Ｒａｐの特異性は、第２の二重スイッチ（ＦＲＢＦｗｔＭＣ／ＦｖＣ９）としてのその使用を可能にした（図５７）。このストラテジーにおいて、ＭＣ－Ｒａｐを、第１世代のＣＡＲおよびｉＣ９と共発現させた。リミズシドを使用して、カスパーゼ－９を安全スイッチとして活性化した一方で、ｍＴＯＲにおける野生型ＦＲＢ（これはＴ細胞機能を阻害する）よりも１／２０の低い濃度でＦＲＢＬと結合するラパログであるイソブチルオキシラパマイシンは、ＭＣ－Ｒａｐを特異的に活性化し得る。このスキームは、ラパマイシン（またはラパログ）でアポトーシスを活性化しかつｉＭＣおよびリミズシドで共刺激を活性化する（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）の逆であった。その２つのストラテジーの薬物特異性は、培養物での細胞殺滅アッセイにおいて示された（図５８）。ＣＤ１９ＣＡＲとｉＣ９とをコードするｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ構築物ＢＰ０８４４および構成的またはＦＲＢＦｗｔＭＣ／ＦｖＣ９を発現するＢＰ１１６０またはＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖを発現するＢＰ１３００を、ＣＤ１９を発現するＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞株と共培養した。腫瘍殺滅は、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣまたはＦＲＢＦｗｔＭＣ／ＦｖＣ９形式の両方で、リミズシドでの安全スイッチの活性化によって除去された。対照的に、ラパマイシンまたはイソブチルオキシラパマイシンは、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖにおいてｉＲＣ９を活性化し、腫瘍への免疫応答を特異的に除去した。
ラパログで（しかしリミズシドでではない）の活性化に対するＭＣ－Ｒａｐの特異性は、第２の二重スイッチ（ＦＲＢＦｗｔＭＣ／ＦｖＣ９）としてのその使用を可能にした（図５７）。このストラテジーにおいて、ＭＣ－Ｒａｐを、第１世代のＣＡＲおよびｉＣ９と共発現させた。リミズシドを使用して、カスパーゼ－９を安全スイッチとして活性化した一方で、ｍＴＯＲにおける野生型ＦＲＢ（これはＴ細胞機能を阻害する）よりも１／２０の低い濃度でＦＲＢＬと結合するラパログであるイソブチルオキシラパマイシンは、ＭＣ－Ｒａｐを特異的に活性化し得る。このスキームは、ラパマイシン（またはラパログ）でアポトーシスを活性化しかつｉＭＣおよびリミズシドで共刺激を活性化する（ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖ）の逆であった。その２つのストラテジーの薬物特異性は、培養物での細胞殺滅アッセイにおいて示された（図５８）。ＣＤ１９ＣＡＲとｉＣ９とをコードするｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣ構築物ＢＰ０８４４および構成的またはＦＲＢＦｗｔＭＣ／ＦｖＣ９を発現するＢＰ１１６０またはＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖを発現するＢＰ１３００を、ＣＤ１９を発現するＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞株と共培養した。腫瘍殺滅は、ｉ９＋ＣＡＲζ＋ＭＣまたはＦＲＢＦｗｔＭＣ／ＦｖＣ９形式の両方で、リミズシドでの安全スイッチの活性化によって除去された。対照的に、ラパマイシンまたはイソブチルオキシラパマイシンは、ＦｗｔＦＲＢＣ９／ＭＣ．ＦｖＦｖにおいてｉＲＣ９を活性化し、腫瘍への免疫応答を特異的に除去した。
参考文献
以下の参考文献は、本実施例において言及され、本明細書によって、それらの全体が本出願中の本明細書において参考として援用される。
本実施例の付録：
付録１：ｐＢＰ１３００－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＣＤ１９．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．Ｐ２Ａ－ｉＭＣ
以下の参考文献は、本実施例において言及され、本明細書によって、それらの全体が本出願中の本明細書において参考として援用される。
付録１：ｐＢＰ１３００－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＣＤ１９．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．Ｐ２Ａ－ｉＭＣ
付録２：ｐＢＰ１３０８－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．Ｐ２Ａ－ｉＭＣ
付録３：ｐＢＰ１３１０－－ｐＳＦＧ．ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９
付録４：ｐＢＰ１３１１－－ｐＳＦＧ．ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９
付録５：ｐＢＰ１３１６－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰ．ＦＲＢＬ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．Ｐ２Ａ－ｉＭＣ
付録６：ｐＢＰ１３１７－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９Ｑ．Ｔ２Ａ－αＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．Ｐ２Ａ－ｉＭＣ
付録７：ｐＢＰ１３１９－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．Ｐ２Ａ－ＭＣ．ＦＫＢＰＶ
付録８：ｐＢＰ１３２０－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．Ｐ２Ａ－ＭＣ
付録９：ｐＢＰ１３２１－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．Ｐ２Ａ－ＭＣ．ＦＫＢＰＶ．ＦＫＢＰ
付録１０：ｐＢＰ１１５１－－ｐＳＦＧ－－ＭＣ－Ｔ２Ａ－αＣＤ１９．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録１１：ｐＢＰ１１５２－－ｐＳＦＧ－－ＭＣ－Ｔ２Ａ－αＣＤ１９．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録１２：ｐＢＰ１４１４－－ｐＳＦＧ－αＣＤ１９．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ－Ｐ２Ａ－ＭＣ
付録１３：ｐＢＰ１４１４－－ｐＳＦＧ－αＣＤ１９．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ－Ｐ２Ａ－ＭＣ
付録１４：ｐＢＰ１４３３－－ｐＳＦＧ－Ｆｖ－Ｆｖ－ＭＣ－Ｔ２Ａ－αＣＤ１９．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録１５：ｐＢＰ１４３９－－ｐＳＦＧ－－ＭＣ．ＦＫＢＰｖ－Ｔ２Ａ－αＣＤ１９．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録１６：ｐＢＰ１４４０－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰｖ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＣＤ１９．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．Ｔ２Ａ．Ｐ２Ａ－ＭＣ．ＦＫＢＰｗｔ．ＦＲＢＬ
付録１７：ｐＢＰ１４６０－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰｖ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＣＤ１９．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．Ｔ２Ａ．Ｐ２Ａ－ＭＣ．ＦＫＢＰｗｔ．ＦＲＢＬ
実施例２６：標的化された治療用細胞の活性化および排除を調節する二重スイッチ
本実施例は、標的化された治療用細胞の活性化および排除を調節することに関する方法を提供する。免疫細胞または治療用細胞は、免疫療法のために使用され得、ここでその治療用細胞は、例えば、固形腫瘍または白血病細胞に標的化される。ある種の方法が、キメラ抗原レセプターを発現するＴ細胞の使用に関連するデータを提供する場合、これらの方法が、他の治療用細胞および異種ポリペプチド（例えば、組換えＴ細胞レセプターなど）の使用のために改変され得ることは、理解される。従って、例えば、本実施例で提供されるベクターおよび細胞が、特定の抗原、または細胞に対して誘導される抗原認識部分を有するＣＡＲの使用を含み得る場合、これらベクターおよび細胞は、例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを組換えＴＣＲをコードするポリヌクレオチドで置換することによって、特定の抗原または細胞に対して誘導される組換えＴＣＲの使用を含むように改変され得る。
本実施例は、標的化された治療用細胞の活性化および排除を調節することに関する方法を提供する。免疫細胞または治療用細胞は、免疫療法のために使用され得、ここでその治療用細胞は、例えば、固形腫瘍または白血病細胞に標的化される。ある種の方法が、キメラ抗原レセプターを発現するＴ細胞の使用に関連するデータを提供する場合、これらの方法が、他の治療用細胞および異種ポリペプチド（例えば、組換えＴ細胞レセプターなど）の使用のために改変され得ることは、理解される。従って、例えば、本実施例で提供されるベクターおよび細胞が、特定の抗原、または細胞に対して誘導される抗原認識部分を有するＣＡＲの使用を含み得る場合、これらベクターおよび細胞は、例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを組換えＴＣＲをコードするポリヌクレオチドで置換することによって、特定の抗原または細胞に対して誘導される組換えＴＣＲの使用を含むように改変され得る。
図６８は、第１世代のＣＡＲおよびラパマイシン／ラパログいずれか、またはＴ細胞におけるリミズシド－誘導性キメラ短縮型ＭｙＤ８８／ＣＤ４０ポリペプチド（ＭＣ）を共発現するＴ細胞の共刺激能力を比較するアッセイの結果を提供する。これらのアッセイのために、ラパログ－誘導性ＭＣ（ＭＣ－ＲａｐまたはｉＲＭＣ）は、野生型ＦＫＢＰ１２ポリペプチド（Ｆｗｔ）およびＦＲＢＬポリペプチド（ＦＬ）を含んだ；リミズシド－誘導性ＭＣ（ｉＭＣ＋ＣＡＲζ、またはｉＭＣ）は、２個のＦＫＢＰ１２ｖ３６ポリペプチド（Ｆｖ）を含んだ（図６８Ｂ）。上記アッセイは、腫瘍細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞殺滅に対するＭＣＲａｐおよびｉＭＣ指向性共刺激を比較した。主としてＴ細胞を含むヒトＰＢＭＣを活性化し、ラパログ応答性共刺激ドメイン（ＭｙＤ８８－ＣＤ４０－ＦＫＢＰ－ＦＲＢＬ、ＭＣ－Ｒａｐと称される）の下流の第１世代ＣＡＲを指向するＰＳＣＡをコードするレトロウイルスベクターｐＢＰ１４５５で、共刺激がｉＭＣ（ＭｙＤ８８－ＣＤ４０－ＦＫＢＰｖ３６－ＦＫＢＰｖ３６）によって付与されたレトロウイルスｐＢＰ０１８９で、またはＣＡＲをコードするが、共刺激分子をコードしないコントロールレトロウイルス構築物で形質導入した。ＩＬ－２での静止の７日後に、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１：３０のエフェクター 対 標的比において、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）で標識したＰＳＣＡ発現ＨＰＡＣ腫瘍細胞とともに共培養した。その標識した細胞の１週間にわたる成長を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅチャンバにおける顕微鏡で評価した。２ｎＭ Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシン（ＩｂｕＲａｐ）の存在下では、ＭＣ－ｒａｐ含有細胞は、リミズシドで刺激したｉＭＣ含有ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞と同程度に効果的に腫瘍細胞を調節できた。
図６９は、第１世代のＣＡＲ、ＭＣＲａｐポリペプチド、およびリミズシド－誘導性キメラカスパーゼ－９ポリペプチド（ｉＣ９）を同じベクターから共発現するＴ細胞の共刺激能力を比較するアッセイの結果を提供する。ここでそのＭＣＲａｐポリペプチドを発現するポリヌクレオチドの配置は、様々である。このアッセイにおいて提供される結果は、その３個の遺伝子が一体化したベクター内の（ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅ ｕｎｉｆｉｅｄ ｖｅｃｔｏｒ）ＭＣＲａｐの配置が、共刺激活性の程度に影響を及ぼすことを示す。図６９は、種々のレトロウイルスベクターの概略図を提供する。ｐＢＰ１４６６は、ＭＣ－Ｒａｐ（ＭＣ－ＦＫＢＰ－ＦＲＢＬ）を、ＣＡＲおよびｉＣ９安全スイッチに対して３’側に配置する。ｐＢＰ１４９１は、ＭＣ－Ｒａｐを、ｉＣ９とＣＡＲとの間に配置する。ｐＢＰ１４９４は、ＭＣ－Ｒａｐを、ｉＣ９およびＣＡＲに対して５’側に配置する。各場合のＣＡＲは、ＰＳＣＡ抗原を標的化するＳｃＦＶを含んだ。２Ａ共翻訳切断配列は、ＭＣ－Ｒａｐを、ＣＡＲからおよびｉＣ９アポトーシススイッチから分断する。図６９Ｂは、共刺激シグナル伝達のレポーターアッセイを提供する。２９３細胞を、１μｇ ＮＦ－κＢ－ＳｅＡＰレポーターおよび３μｇの示されたＤＮＡ構築物でトランスフェクトした。２４時間後に、培養物を、９６ウェルプレートのうちの１２ウェルへと分割し、四連でモック刺激したか、または２ｎＭ リミズシドまたは２ｎＭ Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシンで処理した。各トランスフェクションは、刺激なしで最小限の基底活性を示した一方で、レトロウイルス構築物の５’末端に位置したＭＣ－Ｒａｐを有する構築物１４９４は、ＩｂｕＲａｐで刺激した場合に増強された活性を示した。図６９Ｃは、ＣＡＲ－Ｔサイトカイン分泌アッセイの結果を提供する。主としてＴ細胞を含むヒトＰＢＭＣを活性化し、（Ａ）で示されるレトロウイルスベクターで形質導入した。ＩＬ－２での静止の７日後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１：５のエフェクター 対 標的比において、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）で標識したＰＳＣＡ発現ＨＰＡＣ腫瘍細胞とともに共培養した。共培養を確立した２４時間後に、培地を除去し、インターフェロン－γレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。このサイトカインの分泌は、ＣＡＲのＴＣＲζ構成成分からのシグナル１によって、および誘導されたＭＣ活性を介する共刺激から、の両方で影響を受ける。この共刺激は、レトロウイルス構築物の５’末端に位置したＭＣ－Ｒａｐを有する構築物１４９４中のＩｂｕＲａｐで最もロバストである。図６９Ｄは、ＣＡＲ－Ｔ殺滅アッセイの結果を提供する。示されたトポロジー的な配向でポリペプチドを含む、改変された、形質導入またはトランスフェクトされたＴ細胞を、１：２０のＥ：Ｔ比でＨＰＡＣ－ＲＦＰ腫瘍標的とともに培養し、１週間にわたるその標識した細胞の成長を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅチャンバにおいて顕微鏡で測定した。２ｎＭ Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシン（ＩｂｕＲａｐ）の存在下では、５’末端に位置したＭＣ－Ｒａｐを有する構築物１４９４は、薬物依存性腫瘍調節において最も有効であった（示さず）。各場合において、リミズシドインキュベーションによる安全スイッチｉＣ９の活性化は、ＣＡＲ－Ｔアポトーシスおよび腫瘍調節の喪失を引き起こした。
図７０は、第１世代のＣＡＲ、ＭＣＲａｐポリペプチド、およびリミズシド－誘導性キメラカスパーゼ－９ポリペプチド（ｉＣ９）を同じベクターから共発現するＴ細胞の共刺激能力を比較するアッセイの結果を提供する。ここでそのＭＣＲａｐポリペプチドを発現するポリヌクレオチドの配向および配置（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）は、様々である。ＦＲＢおよびＦＫＢＰの配向および配置を改変して、そのベクターを発現するＴ細胞におけるＭＣ共刺激活性を比較した。図７０Ａは、レトロウイルスベクターの概略図を提供する。ＢＰ１４９３およびＢＰ１４９４は、ＦＫＢＰおよびＦＲＢＬを、ＭＣに対して３’側にかつその配向において配置する。ｐＢＰ１７９６は、ＦＲＢに対するＦＫＢＰのその同じ配向を維持するが、その構築物の５’末端にこれらの薬物結合構成成分を配置し、それによりアミノ末端融合物を作製する。構築物ＢＰ１７５７およびＢＰ１７５９は、ＦＲＢＬをアミノ末端に配置して、ＦＲＢおよびＦＫＢＰの配向を逆にする。ＣＡＲのＳｃＦＶユニットによって標的化される抗原が示される。図７０Ｂは、共刺激シグナル伝達のアッセイのレポーターアッセイ（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙｓ ａｓｓａｙ ｏｆ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の結果を提供する。２９３細胞を、１μｇ ＮＦ－κＢ－ＳｅＡＰレポーターおよび３μｇの示されたＤＮＡ構築物でトランスフェクトした。２４時間後に、培養物を、９６ウェルプレートへと分割し、Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシンの希釈シリーズを四連で添加した。各トランスフェクションは、刺激なしで最小限の基底活性を示した一方で、構築物１７５７は、ラパログで増強された刺激を示した。図７０Ｃおよび７０Ｄは、ＰＳＣＡ－ＣＡＲ－Ｔ殺滅アッセイの結果を提供する。ＦＲＢＬ、ＦＫＢＰおよびＭＣの示されたトポロジー的配向を有するＴ細胞を、１：２０（Ｃ）または１：３０（Ｄ）のＥ：Ｔ比でＨＰＡＣ－ＲＦＰ腫瘍標的とともに培養し、１週間にわたるその標識された細胞の成長を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅチャンバにおいて顕微鏡で測定した。２ｎＭ Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシン（ＩｂｕＲａｐ）の存在下では、５’末端に配置されたＭＣ－Ｒａｐを有する構築物１７５７は、薬物の添加なしで、腫瘍調節において最も有効であった。薬物での増大した効力は、１：３０という高いＥ：Ｔにおいて示された。ここで１７５７のみが、十分に増殖して腫瘍調節を維持できた。図７０Ｅ、７０Ｆ、および７０Ｇは、ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔ殺滅アッセイの結果を提供する。ＦＲＢＬ、ＦＫＢＰおよびＭＣの示されたトポロジー的配向を有するＴ細胞を、１：１５のＥ：Ｔ比でＨＰＡＣ－ＲＦＰ腫瘍標的（図７０Ｅ）、ＳＫＯＶ３卵巣がん細胞（Ｅ：Ｔ＝１：１０）（図７０Ｆ）またはＳＫＢＲ３－ＧＦＰ乳がん細胞（Ｅ：Ｔ＝１：１）（図７０Ｇ）とともに培養し、１週間にわたる標識した細胞の成長を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅチャンバにおいて顕微鏡で測定した。２ｎＭ Ｃ７－イソブチルオキシラパマイシン（ＩｂｕＲａｐ）の存在下では、５’末端に配置されたＭＣ－Ｒａｐを有する構築物１７５９は、薬物の添加なしで腫瘍調節において最も有効であった。薬物での増大した効力は、１：３０という高いＥ：Ｔにおいて示され、ここで１７５７のみが、十分に増殖して腫瘍調節を維持できた。これらのデータから、最大の薬物依存性ＭＣ－Ｒａｐ効力は、ＦＲＢ、次にＦＫＢＰをＭＣに対してアミノ末端側に配置することによってもたらされると結論づけられる。
図７１は、第１世代のＣＡＲ、ＭＣＲａｐポリペプチド、およびｉＣ９ポリペプチドを共発現するＴ細胞のアポトーシス活性をアッセイするアッセイ結果を提供する。このアッセイは、これら細胞において、誘導性アポトーシスが、リミズシドでのｉＣ９の二量体化によって誘導されるのみであることを示す結果を提供する。主としてＴ細胞を含むＰＢＭＣを活性化し、示されたレトロウイルス構築物およびＭＣ－ＲａｐとＣＡＲのみを有し、ｉＣ９を有しない調節構築物ＢＰ１４８８で形質導入した。細胞を、カスパーゼ３／７活性インジケーター試薬（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに、Ｉｎｃｕｃｙｔｅインキュベーター／顕微鏡の中で漸増量のリミズシド（図７１Ａ）またはＣ７－イソブチルオキシラパマイシン（図７１Ｂ）とともにインキュベートした。非常に低濃度のリミズシド（＜１００ｐＭ）では、ＦＫＢＰｖ３６－カスパーゼ９（ｉＣ９）構成成分は、各構築物から活性化されるが、ｉＣ９を含まないＭＣ－Ｒａｐ ＣＡＲ－Ｔ細胞（１４８８）からは活性化されないことが観察された。ＭＣ－ｒａｐを活性化するために使用されるレベル（通常は、１ｎＭが使用される）よりも１００倍を上回る高濃度のＩｂｕＲａｐですらアポトーシスを活性化するために不十分であり、このことは、理論的には可能である共発現されたＭＣ－ＦＫＢＰ－ＦＲＢＬとＦＫＢＰ－カスパーゼとの間の複雑なラパマイシン指向性ヘテロ二量体化事象は、このアッセイにおいて明らかではないことを示している。
図７２は、単一のレトロウイルスベクターの形態で、または２個のレトロウイルスベクターで、二重スイッチｉＭＣ＋ｉＲＣ９の模式図を提供する。図７２Ａは、ｉＭＣ活性化スイッチ（ＦｖＦｖ）（ベクターの３’末端に存在する）およびベクター中、５’末端に存在するｉＲＣ９（ＦＲＢおよびＦＫＢＰｗｔ）の両方を組み合わせる（ａｍａｌｇａｍａｔｅ）一体化ベクターデザインの模式図を提供する。形質導入したＴ細胞を、ＣＤ３４に由来するＱ－ｂｅｎｄ １０（Ｑ）エピトープでマークする。ＣｏｍｂｉＣＡＲプラットフォーム（図７２Ｂ）は、その同じタンパク質構成成分を含むが、ｉＭＣの発現レベルを、それによって、その構築物の効力を増大させるために２個のレトロウイルスから発現される。ｉＲＣ９は、細胞外ドメインのみを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含まないＣＤ１９の短縮型形態の発現によってマークされる。そのｉＭＣ＋ＣＡＲζ構成成分は、共刺激のためのｉＭＣ、およびＳｃＦＶの直後にＱエピトープマーカーを含むＣＡＲシストロンを組み込む。
図７３Ａは、ｉＲＣ９ポリペプチドを発現する細胞においてアポトーシス活性のアッセイの結果を提供する。ここでＦＲＢおよびＦＫＢＰｗｔの配向および配置は様々である。図７３Ａは、薬物結合部分なしのカスパーゼ９構成成分のみを含む陰性コントロールであるｉＲＣ９レトロウイルス構築物ＢＰ１５０１の概略図を提供する。ＢＰ０２２０は、ＦＫＢＰｖが、ｉＣ９を生成するカスパーゼ９に結合されているｉＣ９構築物である。この構築物は、リミズシドに応答性であるが、ラパマイシンには応答性でない。構築物ＢＰ１３１０およびＢＰ１３１１は、示された配向において、野生型ＦＫＢＰ（これに対して、リミズシドは、不十分な親和性を有する）およびＦＲＢを有する。図７３Ｂは、図７３Ａの種々のレトロウイルス構築物で形質導入されたＴ細胞のアッセイの結果を提供する。主としてＴ細胞を含むＰＢＭＣを活性化し、その示されたレトロウイルス構築物で形質導入し、細胞を、カスパーゼ３／７活性インジケーター試薬（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに、Ｉｎｃｕｃｙｔｅインキュベーター／顕微鏡の中で、２４時間、漸増量のラパマイシンとともにインキュベートした。細胞の蛍光変換は、アポトーシスを経時的にマークするカスパーゼ３／７試薬の切断を示す。図７３Ｃは、ラパマイシン濃度の関数として、図７３Ｂのアッセイからの薬物処理の開始と比較した最大のアポトーシス活性のグラフ表示である。ｉＲＣ９は、ＦＲＢが、ＦＫＢＰ１２およびカスパーゼ－９に対してアミノ末端側に配置される場合に、最も効果的である。図７３Ｄは、Ｔ細胞におけるカスパーゼ－９導入遺伝子発現のウェスタンブロットを提供する。示されたレトロウイルスベクターで形質導入された２名のドナーに由来する細胞を、溶解し、タンパク質を抽出し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、カスパーゼ－９発現をウェスタンブロットによって可視化した。ＢＰ１３１０のより高いラパマイシン誘導性アポトーシス活性と一致して、発現は、ＢＰ１３１１のものより僅かに高かった。
図７４は、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞（ｉＭＣおよびＣＡＲを発現する細胞）とＣｏｍｂｉＣＡＲ－Ｔ細胞（ｉＭＣ、ＣＡＲ、およびｉＲＣ９を発現する細胞）との活性化プロフィールを比較するアッセイの結果を提供する。ＢＰ１３１１に由来するキメラカスパーゼポリペプチドの包含が、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞の有効性を損なうかどうかを決定するために、ヒトＰＢＭＣを活性化し、示されるレトロウイルスベクターで形質導入した。ＩＬ－２での静止の７日後に、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１：１０のエフェクター 対 標的比において、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）で標識したＰＳＣＡ発現ＨＰＡＣ腫瘍細胞とともに共培養した。共培養を確立した４８時間後に、培地を除去し、インターロイキン－６（ＩＬ－６、図７４Ａ）、ＩＬ－２（図７４Ｂ）、およびインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ、図７４Ｃ）レベルを、ＥＬＩＳＡによって決定した。サイトカイン分泌は、用量依存性様式でリミズシド処理によって増加し、ｉＭＣ＋ＣＡＲζとＣｏｍｂｉＣＡＲ形式の間で密接に類似していた。興味深いことに、ＣｏｍｂｉＣＡＲは、ＩＦＮ分泌を刺激するには幾分有効性が低かった。図７４Ｄは、ＣＡＲ－Ｔ殺滅アッセイの結果を提供する。示されたトポロジー的配向を有する示された形式にあるＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＨＰＡＣ－ＲＦＰ腫瘍標的とともに１：１０のＥ：Ｔ比で培養した。１週間にわたる標識した細胞の成長を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅチャンバにおいて顕微鏡で測定した。ＣＡＲ－Ｔ包含のこのレベルでは、殺滅は、薬物に依存しなかったが、基底活性のｉＭＣによって増強された（各ＣＡＲ形式と、ｉＭＣを欠くＢＰ１３７３とを比較のこと）。図７４Ｅは、各ＣＡＲ形式でのｉＭＣおよびキメラカスパーゼポリペプチドの発現のウェスタンブロットを提供する。示されるレトロウイルスベクターで形質導入したＴ細胞を溶解し、タンパク質を抽出し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、示されたタンパク質の発現を、ウェスタンブロットによってプローブした。ビンキュリン発現は、ゲルの中の各レーンの充填量が等しいことを表す。ｉＭＣの発現は、ｉＭＣ＋ＣＡＲζとＣｏｍｂｉＣＡＲ形式との間で類似であった。
図７５は、一体化した単一ベクター形式および二重ベクター形式内でのラパマイシン誘導性カスパーゼ－９（ｉＲＣ９）のアッセイの結果を提供する。２名の別個のドナー（８７７および９０４）に由来するＴ細胞を、（抗ＣＤ３／ＣＤ２８）活性化し、形質導入しなかった（ＮＴ）か、またはＣＤ３４エピトープマークしたｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ（ｉＭＣ－２Ａ－ＣＡＲ－ゼータ）、（ｉＭＣ－２Ａ－ｉＲＣ９－２Ａ－ＣＡＲ－ゼータ）、もしくはＣｏｍｂｉＣＡＲ（ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－ＴおよびｉＲＣ９をコードするウイルスでの共形質導入）をコードするレトロウイルスで形質導入した。５×１０７個のｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞（１４６３）およびＴ細胞（１３５８）の集団を、ＣＤ３４マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）での精製によって形質導入された細胞に関して富化した一方で、ＣｏｍｂｉＣＡＲ細胞を、キメラカスパーゼ構築物に由来するマーカーを同定するＣＤ１９マイクロビーズで選択した。この富化手順、または高度に形質導入された細胞の「ソーティング」は、９５％より高いマーカー陽性を生じた。図７５Ａにおいて、細胞を、カスパーゼ３／７活性インジケーター（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに、ＩｎｃｕＣｙｔｅプレートインキュベーター／顕微鏡中で、０ｎＭ、１ｎＭ、または１０ｎＭ ラパマイシンとともにインキュベートした。アポトーシスの（カスパーゼ－３／７活性化を介する）読み取りを４時間毎に自動的に行い、ソートされていない細胞（上側のパネル）およびソートした細胞（下側パネル）に関して示した。図７５Ｂは、ソートされていない細胞（左側パネル）およびソートした細胞（右側パネル）に関する１２時間の時点での両方のドナーのデータ（および平均値）のグラフ表示を提供する。図７５Ｃに関して、同様に形質導入したＴ細胞を、０ｎＭ、１ｎＭ、または１０ｎＭ ラパマイシンの存在下で２４時間インキュベートし、細胞死に関して、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。１名のドナーに由来するソートしていない細胞の代表的グラフを示す。図７５Ｄは、図７５Ｃにおけるように、２４時間にわたって処理されたソートされていない細胞（左側パネル）およびソートした細胞（右側パネル）からの両方のドナーの結果のグラフ表示を提供する。
図７６は、急性骨髄性白血病腫瘍に対して誘導される抗ＣＤ１２３ ＣＡＲとともに、Ｔ細胞において共発現されるｉＭＣの異なる形態の有効性を評価するインビボ実験の結果を提供する。ｉＭＣを、ｉＲＣ９安全スイッチを発現しないｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞の形態で、および二重スイッチＣｏｍｂｉＣＡＲプラットフォームの形態（ここでその細胞はまたｉＲＣ９を発現する）で評価した。図７６Ａは、バイオルミネッセンスイメージング（ＢＬＩ）によって決定された腫瘍を有する動物の顕微鏡写真を提供する。１．０×１０６個のＧＦＰ－ルシフェラーゼ発現ＴＨＰ－１腫瘍細胞を、年齢を合わせたＮＳＧマウスへとｉ．ｖ．注射した。７日後（０日目）に、２．５×１０６個の非形質導入（ＮＴ）、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ形質導入、またはＣｏｍｂｉＣＡＲ形質導入（すなわち、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－ＴおよびｉＲＣ９ベクターで二重形質導入し、それぞれ、ＣＤ３４またはＣＤ１９に由来するエピトープによってマークした）Ｔ細胞を、腫瘍を有する動物へと注射した。群（ｎ＝５）に、１日目および１５日目に、リミズシド（１ｍｇ／ｋｇ）を注射した。動物を、Ｔ細胞注射の日（０日目）に開始して、毎週イメージングした。形質導入したＣｏｍｂｉＣＡＲ細胞をＣＤ１９で選択し、ＣＤ３４を介するＣＡＲ発現に関して正規化した。図７６Ｂは、ＢＬＩ（放射輝度）を介して表した、１群あたりの平均腫瘍成長を示すデータ（左側パネル）を提供するか、またはＴ細胞注射後の％体重変化（右側パネル）を示す。図７６Ｃは、終了時（２８日目）の脾臓中のヒトＴ細胞数を示すデータを提供する。左側パネルは、リミズシド（ＡＰ）注射の前または後のヒト（マウス（ｍ）ＣＤ４５－ＣＤ３＋） Ｔ細胞の総数を示す。中央パネルは、検出可能なＣＡＲ発現（ＣＤ３４エピトープを介する）を有するヒトＴ細胞の％を示す。右側パネルは、検出可能なｉＲＣ９（ＣＤ１９エピトープを介する）を有するヒトＴ細胞の％を示す。＊＝スチューデントのＴ検定によってｐ＜０．０５。図７６Ｄは、脾臓（上側）または骨髄（下側）に由来するＤＮＡからｑＰＣＲによって決定されたベクターコピー数（ＶＣＮ）を示すデータを提供する。ｉＭＣ（左側パネル）またはｉカスパーゼ－９（右側パネル）に対して特異的なプライマーを選択した。＊＝スチューデントのＴ検定によってｐ＜０．０５。
図７７は、ＭＯＬＭ１３腫瘍に対して誘導される抗ＣＤ３３ ＣＡＲとともに、Ｔ細胞中で共発現されるｉＭＣの異なる形態の有効性を評価するインビボ実験の結果を提供する。そのｉＭＣを、ｉＲＣ９安全スイッチを発現しないｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞の形態で、および二重スイッチＣｏｍｂｉＣＡＲプラットフォームの形態で（ここでその細胞は、ｉＲＣ９も発現する）評価した。図７７Ａは、ＢＬＩイメージングによって決定された腫瘍を有する動物の顕微鏡写真を提供する。ＰＢＭＣを活性化し、抗ＣＤ３３ ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔベクター（ｐＢＰ１２９３）およびｉＲＣ９ベクター（ｐＢ１３８５）から得られるレトロウイルスで共形質導入した。ＮＳＧマウスに、１×１０６個のＭＯＬＭ１３－ＧＦＰ．Ｆｌｕｃ細胞を６日間、ｉ．ｖ．で移植し、続いて、５×１０６ ｉＲＣ９またはＣＤ３３－ＣｏｍｂｉＣＡＲ発現Ｔ細胞のｉ．ｖ．注入を行った。リミズシドまたはプラセボを、Ｔ細胞注入後、毎週、１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．で与えた。図７７Ａにおいて、ＧＦＰ．Ｆｌｕｃ成長を、ＩＶＩＳバイオルミネッセンス（ＢＬＩ）を使用して測定し、平均放射輝度を計算した（図７７Ｂ）。図７７Ｃは、図７７Ａのインビボアッセイからのカプラン・マイアー分析の結果を提供する。図７７Ｄは、Ｔ細胞注射後３２日目の終了時でのリミズシド処置ＣＤ３３ ＣｏｍｂｉＣＡＲ群の代表的ＦＡＣＳ分析の結果を提供する。
図７８は、全動物モデルにおけるリミズシド誘導性ｉＣ９およびラパマイシン－誘導性（ｉＲＣ９）アポトーシススイッチの特異性および有効性を比較するアッセイの結果を提供する。ＢＰ２２０（ｉＣ９を含む）またはＢＰ１３１０（ｉＲＣ９を含む）およびＧＦＰ－ルシフェラーゼベクターで形質導入した１．０×１０７個のＴ細胞を、８週齢の雌性免疫不全マウス（ＮＯＤ．ＣｇＰｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ；ＮＳＧ）へと静脈内移植した。マウスを、Ｔ細胞注射の約４時間後に（薬物投与後の－１４時間）ＩＶＩＳイメージングに供した。翌日に、マウスを、薬物注射の直前（０時間）にイメージングし、次いで、ビヒクル、ソルトールおよびＰＢＳに希釈したリミズシドまたは１０％ＰＥＧ、１７％ Ｔｗｅｅｎ－８０に希釈したラパマイシンをＩＰ注射した。マウスを、薬物注射の５～６時間後、および２４時間後に再びイメージングした。マウスを屠殺し、脾臓を、ＦＡＣＳ分析のために除去した。図７８Ａは、ＢＬＩアッセイの結果を提供する。マウスを、ＩＶＩＳによってホタルルシフェラーゼ由来バイオルミネッセンスに関してイメージングした。マウスを、薬物またはビヒクルの投与に関して、示された時点でイメージングした。リミズシドは、ＦＫＢＰ１２のＦ３６Ｖ変異体に対して特異的でありかつｉＣ９は、野生型ＦＫＢＰ１２を利用するので、Ｔ細胞アポトーシスによる放射輝度の喪失は、ｉＣ９を有する動物のリミズシド処置で観察されるに過ぎず、ｉＣ９を有しない動物では観察されない。図７８Ｂは、図７８Ａからの計算された平均放射輝度のグラフ表示を提供する。図７８Ｃは、図７８Ａのインビボアッセイの独立した定量的分析の結果を示すデータを提供する。マウス脾臓中のヒトＴ細胞を単離し、塩化アンモニウム（ａｍｍｏｎｉａ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）／カリウム（ＡＣＫ）ベースの溶解緩衝液で赤血球を溶解し、続いて、７０μｍナイロンフィルタを通過させる機械的解離によって単一細胞懸濁物を作製した。細胞を、その後、以下の抗体で染色した：抗ｈＣＤ３－ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５、抗ｈＣＤ１９－ＡＰＣ、および抗ｍＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ５１０。ヒトＴ細胞カウントを、脾臓調製物中に存在するマウスＣＤ４５発現細胞の数に対して正規化した。
図７９は、全動物モデルにおけるラパマイシン誘導性ｉＣ９アポトーシススイッチの用量応答性アッセイの結果を提供する。ＢＰ１３８５（ｉＲＣ９を含む）により、およびＧＦＰ－ルシフェラーゼベクターにより形質導入した１．０×１０７個のＴ細胞を、８週齢の雌性免疫不全マウス（ＮＯＤ．ＣｇＰｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ；ＮＳＧ）へと静脈内移植した。マウスを、Ｔ細胞注射の約４時間後（薬物投与後－２４時間）に、ＩＶＩＳイメージングに供した。翌日、マウスを、薬物注射の直前（０時間）にイメージングし、次いで、１０ｍｇ／ｋｇ 体重から対数段階希釈（ｓｔｅｐ－ｌｏｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）において、ビヒクル、ソルトールおよびＰＢＳに希釈したリミズシドまたは５％ＰＥＧ、２．５％ Ｔｗｅｅｎ－８０に希釈したラパマイシンをＩＰ注射した。マウスを、薬物注射の５～６時間後、および２４時間後に再びイメージングした。マウスを屠殺し、脾臓を、ＦＡＣＳ分析のために除去した。図７９Ａは、ＢＬ１イメージングの写真表示を提供する。図７９Ｂは、図７９Ａからの計算された平均放射輝度のグラフ表示を提供する。図７９Ｃは、終了時（２４時間）の脾臓中のヒトＴ細胞の数のグラフを提供する。左側パネルは、アポトーシススイッチの存在を示すＣＤ１９でマークされているヒト（マウス（ｍ）ＣＤ４５－ＣＤ３＋）の総数を示す。中央パネルは、脾臓中に残存しているヒトＴ細胞におけるＣＤ１９マーカーに関する平均蛍光強度を示す。右側パネルは、（ＣＤ１９エピトープを介して）検出可能なｉＣ９を有するヒトＴ細胞の総数を示す。＊＝スチューデントのＴ検定によってｐ＜０．０５。図７９Ｄは、脾臓に由来するＤＮＡからｑＰＣＲによって決定されたベクターコピー数（ＶＣＮ）のグラフを提供する。ｉＭＣ（左側パネル、この実験での陰性コントロール）またはｉカスパーゼ－９およびＧＦＰ－ｌｕｃ（中央および右側パネル）に特異的なプライマーを選択した。
実施例２７：タンパク質二量体化の２種の独立した非毒性の化学誘導物質でＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性および安全性を調節する二重スイッチプラットフォーム
本実施例は、ｉＲＭＣポリペプチド、第１世代のＣＡＲおよびｉＣ９安全スイッチを発現するための単一のレトロウイルスベクターの使用を論じる。この実施例のために、ラパログであるＣ７－イソブチルオキシラパマイシン（Ｉｂｕ－Ｒａｐ）を使用して、ＭＣ活性を誘導した。野生型ＦＲＢおよびラパマイシンが、本実施例においても使用され得ることは、理解される。また、この実施例のために、ｉＲＭＣは、改変されたＦＲＢポリペプチド（ＦＲＢＫＬＷまたは「ＫＬＷ」といわれる）を含んだ。本技術の他の例では、ｉＲＣ９およびｉＲＭＣポリペプチドは、本明細書で提供される野生型ＦＲＢよりむしろ、改変されたＦＲＢポリペプチドを含み得る。また、野生型または改変されたＦＲＢポリペプチドに結合する種々のラパログは、ｉＲＣ９またはｉＲＭＣを活性化するために使用され得る。
本実施例は、ｉＲＭＣポリペプチド、第１世代のＣＡＲおよびｉＣ９安全スイッチを発現するための単一のレトロウイルスベクターの使用を論じる。この実施例のために、ラパログであるＣ７－イソブチルオキシラパマイシン（Ｉｂｕ－Ｒａｐ）を使用して、ＭＣ活性を誘導した。野生型ＦＲＢおよびラパマイシンが、本実施例においても使用され得ることは、理解される。また、この実施例のために、ｉＲＭＣは、改変されたＦＲＢポリペプチド（ＦＲＢＫＬＷまたは「ＫＬＷ」といわれる）を含んだ。本技術の他の例では、ｉＲＣ９およびｉＲＭＣポリペプチドは、本明細書で提供される野生型ＦＲＢよりむしろ、改変されたＦＲＢポリペプチドを含み得る。また、野生型または改変されたＦＲＢポリペプチドに結合する種々のラパログは、ｉＲＣ９またはｉＲＭＣを活性化するために使用され得る。
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）Ｔ細胞ストラテジーは、複数の播種性のがんに対する有効度を示したが、固形腫瘍は難題のままである。有効性を改善するために、プラットフォームを開発して、腫瘍抗原特異的な第１世代のＣＡＲを、ラパマイシンの非免疫抑制アナログであるＣ７－イソブチルオキシラパマイシン（ＩＢｕＲａｐ）によって制御されるサイトゾル共刺激構成成分であるｉＲＭＣから分断した。オフ腫瘍細胞傷害性または過剰なサイトカイン放出のリスクを軽減するために、ｉＲＭＣを、カスパーゼ－９ベースのスイッチであるｉＣ９と組み合わせ、リミズシド制御性ホモ二量体化および活性化による迅速なＴ細胞アポトーシスに誘導した。
非免疫抑制性ラパマイシンアナログ（ラパログ）を生成するために、酸感受性Ｃ７－メトキシ基を、イソブチルオキシ部分で置き換えた。この「出っ張り（ｂｕｍｐ）」の付加された大部分は、親和性およびｍＴＯＲ／ＴＯＲＣ１の阻害を低下させたが、ｍＴＯＲに由来する変異体ＦＫＢＰ－ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン（ＫＬＷと称される）のナノモル濃度未満の親和性を保持した。ＫＬＷを、タンデムで野生型ＦＫＢＰ１２ならびに共刺激シグナル伝達ドメインＭｙＤ８８およびＣＤ４０と融合させて、ｉＲＭＣを作製した。ＮＦ－κＢ活性を、ロバストかつ濃度依存性の様式（ＥＣ５０＜１ｎＭ）においてｉＢｕＲａｐで刺激した。レトロウイルス（ｉＲＭＣ－２Ａ－ｉＣ９－２Ａ－ＣＡＲ）形式に組み込んで、ＣＡＲ特異的腫瘍細胞とともにインキュベートした場合、ＩＢｕＲＡＰ添加は、Ｔ細胞増殖、サイトカイン生成および用量依存性腫瘍細胞殺滅を刺激した。７日間の共培養において、ラパログ／ｉＲＭＣ刺激性ＨＥＲ２特異的ｉＲＭＣ－２Ａ－ｉＣ９－２Ａ－ＣＡＲ Ｔ細胞は、優先的に増殖し、ＳＫＢＲ３乳癌細胞（Ｅ：Ｔ、１：１）、ＳＫＯＶ３卵巣癌（Ｅ：Ｔ、１：５）、またはＨＰＡＣ膵臓癌細胞（Ｅ：Ｔ、１：１５）のうちの＞９０％の排除をもたらした。リミズシドを、ｉＲＭＣ－２Ａ－ｉＣ９－２Ａ－ＣＡＲ－Ｔ培養物中に含めた場合、Ｔ細胞アポトーシスを迅速に誘導した（蛍光カスパーゼ－３基質の顕微鏡観察に関してはＴ１／２＝６時間）。ｉＲＭＣおよびｉＣ９の両方が、ＦＫＢＰ１２ドメインを組み込んでいるという事実にも拘わらず、リミズシドはＦＫＢＰ１２のＦ３６Ｖバリアントに対して高度に特異的であるので、共刺激スイッチおよび安全スイッチは、直交制御された（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）。
実施例２８：固形腫瘍を標的とする二重スイッチ
本実施例は、２種のレトロウイルスベクターの使用を論じる。ここで第１のベクターは、ｉＭＣおよび第１世代のＣＡＲを発現し、第２のベクターは、ｉＲＣ９安全スイッチを発現する。
本実施例は、２種のレトロウイルスベクターの使用を論じる。ここで第１のベクターは、ｉＭＣおよび第１世代のＣＡＲを発現し、第２のベクターは、ｉＲＣ９安全スイッチを発現する。
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）Ｔ免疫療法が、白血病およびリンパ腫に対して顕著な有効性を示した一方で、安全性を損なうことなく改善されたＣＡＲ－Ｔの有効性および持続性が固形腫瘍を克服するために必要とされる。２種の独立して制御される分子スイッチを開発した。その分子スイッチは、それらのコグネイトリガンドへの曝露の際に、細胞応答の特異的かつ迅速な誘導を誘発し得る。細胞活性化は、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０（ｉＭＣ）の下流のシグナル伝達カスケードを誘発するホモ二量体化剤であるリミズシドによって調節される。ラパマイシン調節性のアポトーシス促進スイッチは共発現される。このスイッチは、カスパーゼ－９の二量体化を誘導して、過剰なＣＡＲ－Ｔ機能（ｉＲＣ９）に由来する起こり得る毒性を軽減する。第１世代のＣＡＲと組み合わされる場合、これらの分子スイッチは、操作されたＴ細胞の特異的かつ効率的な制御を可能にする。
Ｔ細胞を活性化し、「ｉＭＣ＋ＣＡＲζ」、ＳＦＧ－ｉＭＣ－２Ａ－ＣＡＲ．ζベクター、およびｉＣ９－Ｘベクター、ＳＦＧ－ＦＲＢ．ＦＫＢＰ１２．Ｃ９－２Ａ－ΔＣＤ１９で共形質導入して、ＣｏｍｂｉＣＡＲを作製した。その観察された迅速な動態およびラパマイシン依存性細胞死の約９５％効率を、カスパーゼ－３活性化およびアネキシンＶ変換によって決定した。ｉＣ９－Ｘ機能性のインビボ評価を、ＮＳＧマウスにおいてＥＧＦＰルシフェラーゼ（ＥＧＦＰｌｕｃ）標識Ｔ細胞で行ったところ、ラパマイシン処置が、臨床的に検証されたリミズシド制御性ｉＣ９に類似して、２４時間以内にｉＲＭＣ含有Ｔ細胞のうちの９０％において細胞死を引き起こしたことを示した。
ｉＭＣ共刺激を、サイトカイン生成、Ｔ細胞成長および腫瘍細胞殺滅によって、７日間の腫瘍細胞共培養においてさらに評価した。ｉＣ９－Ｘの付加は、リミズシド処理したｉＭＣ含有ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍有効性（このＴ細胞は、１：２０のエフェクター 対 標的比での共培養アッセイにおいてＯＥ－１９食道腫瘍細胞を排除した（３．９±４．３％ ＯＥ１９－ＧＦＰ．Ｆｆｌｕｃ細胞は、ｉＭＣ＋ＣＡＲζ改変培養物中で、ＣｏｍｂｉＣＡＲに関して１．１±０．１％が残存した））またはＴ細胞拡大（ｉＭＣ＋ＣＡＲζに関して５３．４±９．４％ ＣＡＲ＋ 対 ＣｏｍｂｉＣＡＲに関して４４．６±１３．２％）に有害に影響を及ぼさかった。ＣｏｍｂｉＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ有効性を、毎週、ＥＧＦＰｌｕｃマークした腫瘍負荷量を移植したＮＳＧマウスにおいて、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼマーカーを介するＴ細胞持続性に関して評価した。複数の腫瘍モデルの代表である、ＯＥ９腫瘍を有するマウスモデルにおいてチャレンジした場合、抗ＨＥＲ２二重スイッチＴ細胞は、リミズシド依存性様式で腫瘍成長を調節した。
別個のリガンド依存性活性化およびアポトーシスならびに第１世代のＣＡＲを含む二重スイッチプラットフォームは、リミズシドの全身性投与を介して共刺激を提供した場合に、Ｔ細胞増殖および腫瘍排除を効率的に調節した。ｉＣ９－Ｘの配置（ｄｅｐｌｏｙｍｅｎｔ）は、ＣｏｍｂｉＣＡＲ－Ｔ細胞の迅速かつ効率的な排除を生じ、腫瘍抗原特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性および安全性を管理するためのユーザー主導型のシステムを提供する。
実施例２９：組換えＴＣＲ発現細胞を活性化する二重スイッチ
実施例２９：組換えＴＣＲ発現細胞を活性化する二重スイッチ
本実施例は、２種のレトロウイルスベクターの使用を論じる。ここで第１のベクターは、ｉＭＣおよびＰＲＡＭＥに対して誘導される組換えＴＣＲを発現し、第２のベクターは、ｉＲＣ９安全スイッチを発現する。
抗原特異的Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）のα鎖およびβ鎖を発現するように操作されたＴ細胞は、がん免疫療法の処置として有望であることを示した；しかし、恒久性のある応答は、遺伝子改変されたＴ細胞の不十分な持続性によって制限されてきた。さらに、患者の死亡を含む重症の毒性が、多数のＴＣＲ改変Ｔ細胞の注入の際に起こった。生命を脅かす毒性に対する保護手段を提供すると同時にＴ細胞持続性を増強するために、ラパマイシン（Ｒａｐ）誘導性カスパーゼ－９（ｉＲＣ９）と一緒にリミズシド（Ｒｉｍ）調節性活性化スイッチ、誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ｉＭＣ）を使用する二重スイッチαβ ＴＣＲプラットフォームを開発した。
ＨＬＡ－Ａ２拘束ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞クローンに由来するαβ ＴＣＲ配列を合成し、ｉＭＣ（ＭｙＤ８８に由来するシグナル伝達ドメインおよびタンデムのＲｉｍ結合変異体ＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメインに融合されたＣＤ４０を含む）とともにインフレームで配置して、ｉＭＣ－ＰＲＡＭＥ ＴＣＲを生成した。カスパーゼ－９を、ＦＲＢおよび野生型ＦＫＢＰドメインに融合し、選択マーカー、短縮型ＣＤ１９（ΔＣＤ１９）とインフレームでクローニングして、ｉＲＣ９－ΔＣＤ１９レトロウイルスを生成した。全てのモジュールを、２Ａポリペプチド配列によって分断した。活性化ヒトＴ細胞を、ｉＭＣ－ＰＲＡＭＥ ＴＣＲおよびｉＲＣ９－ΔＣＤ１９ウイルスで二重形質導入し、その後、磁性カラムを使用して、ＣＤ１９発現に関して富化した。ｉＭＣおよびｉＲＣ９を、それぞれ、形質導入したＴ細胞を１０ｎＭ ＲｉｍまたはＲａｐに曝すことによって活性化した。ＴＣＲ改変Ｔ細胞の増殖、サイトカイン生成および細胞傷害性を、誘導性リガンドの存在下または非存在下で、Ｕ２６６（骨髄腫）およびＴＨＰ－１（ＡＭＬ）細胞での共培養アッセイにおいて評価した。
ｉＭＣ－ＰＲＡＭＥ ＴＣＲおよびｉＲＣ９－ΔＣＤ１９で形質導入したＴ細胞は、ＣＤ１９選択後に、ＴＣＲおよびΔＣＤ１９に関して、効率的かつ安定な発現を示した（８２±９％ ＣＤ３＋Ｖβ１＋、９６±２％ ＣＤ３＋ＣＤ１９＋）。共培養アッセイにおいて、二重スイッチＰＲＡＭＥ ＴＣＲは、ｉＭＣ活性化ありまたはなしで、無関係のＴＣＲ（ＣＭＶｐｐ６５）と比較して、ＨＬＡ－Ａ２＋ＰＲＡＭＥ＋ ＴＨＰ－１腫瘍細胞およびＵ２６６腫瘍細胞の特異的溶解を示した。しかし、Ｒｉｍ曝露は、ＩＬ－２の４２倍の誘導を誘導し（９±０．３ 対 ３８５±１８０ｐｇ／ｍｌ ＩＬ－２）、そしてＴＣＲ改変Ｔ細胞の１３倍の拡大を生じた。ｉＲＣ９の発現は、ＴＣＲ機能に干渉せず、ＴＣＲとｉＭＣ活性化との間の相乗効果にも干渉しなかった。さらに、Ｒａｐへの曝露は、二重スイッチＴＣＲ改変Ｔ細胞の迅速なアポトーシスを引き起こした（Ｒａｐでの７２±５％ アネキシン－Ｖ＋ 対 薬物なしでの１４±４％）。これは、自殺スイッチがまた機能していることを示す。
ｉＭＣは、リミズシドを利用して、ＴＣＲ操作されたＴ細胞に共刺激を提供する。さらに、ｉＲＣ９は、重症の毒性の場合に、Ｔ細胞を排除し得るラパマイシン誘導性自殺スイッチを提供する。このｉＭＣ増強ｉＲＣ９組み込みＴＣＲは、新規な二重スイッチＴＣＲ操作されたＴ細胞療法の原型であり、これは、養子Ｔ細胞療法の有効性、持続性および安全性を増大し得る。
以下の付録は、本明細書で提供される実施例で言及される配列およびプラスミドを提供する：
付録１８：ｐＢＰ１２９３－－ｐＳＦＧ－ｉＭＣ．Ｔ２Ａ－αｈＣＤ３３（Ｍｙ９．６）．ζ
付録１８：ｐＢＰ１２９３－－ｐＳＦＧ－ｉＭＣ．Ｔ２Ａ－αｈＣＤ３３（Ｍｙ９．６）．ζ
付録１９：ｐＢＰ１２９６－－ｐＳＦＧ－ｉＭＣ．Ｔ２Ａ－αｈＣＤ１２３（３２７１６）．ζ
付録２０：ｐＢＰ１３２７－－ｐＳＦＧ－ＦＲＢ．ＦＫＢＰＶ．ΔＣ９．２Ａ－ΔＣＤ１９
付録２１：ｐＢＰ１３２８－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰＶ．ＦＲＢ．ΔＣ９．２Ａ－ΔＣＤ１９
付録２２： ｐＢＰ１３５１－－ｐＳＦＧ－ＳＰ１６３．ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αｈＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．２Ａ－ｉＭＣ
付録２３：ｐＢＰ１３７３－－ｐＳＦＧ－ｓｐ－ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αｈＰＳＣＡｓｃＦｖ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録２４：ｐＢＰ１３８５－－ｐＳＦＧ－ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－ΔＣＤ１９
付録２５：ｐＢＰ１４５５－－ｐＳＦＧ－ ＭＣ．ＦＫＢＰｗｔ．ＦＲＢＬ．Ｔ２Ａ－αＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録２６：ｐＢＰ１４６６－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰｖ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－ＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ．Ｐ２Ａ－ＭＣ．ＦＫＢＰｗｔ．ＦＲＢＬ
付録２７：ｐＢＰ１４７４－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰｖ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＨＥＲ２．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録２８：ｐＢＰ１４７５－－ｐＳＦＧ－ＦＫＢＰｖ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録２９：ｐＢＰ１４８８－－ｐＳＦＧ－ＦＲＢＬ．ＦＫＢＰｗｔ．ＭＣ－Ｔ２Ａ－αＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録３０：ｐＢＰ１４９１－－ｐＳＦＧ－ － ＦＫＢＰｖ．ΔＣ９．Ｐ２Ａ．ＭＣ．ＦＫＢＰｗｔ．ＦＲＢＬ．Ｔ２Ａ－αＨＥＲ２．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録３１：ｐＢＰ１４９３－－ｐＳＦＧ－ ＭＣ．ＦＫＢＰｗｔ．ＦＲＢＬ－Ｐ２Ａ．ＦＫＢＰｖ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＨＥＲ２．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録３２：ｐＢＰ１４９４－－ｐＳＦＧ－ ＭＣ．ＦＫＢＰｗｔ．ＦＲＢＬ－Ｐ２Ａ．ＦＫＢＰｖ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－ＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録３３：ｐＢＰ１７５７－－ｐＳＦＧ－ ＦＲＢＬ．ＦＫＢＰｗｔ．ＭＣ－Ｐ２Ａ．ＦＫＢＰｖ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録３４：ｐＢＰ１７５９－－ｐＳＦＧ－－ＦＲＢＬ．ＦＫＢＰｗｔ．ＭＣ－Ｐ２Ａ．ＦＫＢＰｖ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＨＥＲ２．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
付録３５：ｐＢＰ１７９６－－ｐＳＦＧ－－ＦＫＢＰｗｔ．ＦＲＢＬ－ＭＣ． Ｐ２Ａ．ＦＫＢＰｖ．ΔＣ９．Ｔ２Ａ－αＰＳＣＡ．Ｑ．ＣＤ８ｓｔｍ．ζ
実施例３０：アポトーシスの二重調節
本実施例は、二重分子スイッチを含み、アポトーシスを活性化するためのリガンドの選択を提供するキメラアポトーシス促進ポリペプチドの例を提供する。キメラ二重調節されたカスパーゼ－９ポリペプチドを調製し、アポトーシス活性に関してアッセイした。
本実施例は、二重分子スイッチを含み、アポトーシスを活性化するためのリガンドの選択を提供するキメラアポトーシス促進ポリペプチドの例を提供する。キメラ二重調節されたカスパーゼ－９ポリペプチドを調製し、アポトーシス活性に関してアッセイした。
この例において、インビトロデータが提供され、これは、２９３細胞および初代ヒトＴ細胞においてリミズシドおよびラパマイシン処理に応じた種々のカスパーゼ－９分子スイッチのアポトーシス誘導を比較する。ＮＳＧマウスへと導入された場合にこれら３種のカスパーゼ－９スイッチを発現するＴ細胞は、それらそれぞれの活性化リガンドへの曝露の２４時間以内に効率的に排除される。最終的に、ＦＲＢ．ＦＫＢＰＶ．ΔＣ９スイッチのインビボでの用量滴定は、リミズシドおよびラパマイシンの両方が、１ｍｇ／ｋｇ程度の低さの薬物濃度でＴ細胞の効率的除去を刺激することを示した。
方法
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒを通じて得たバフィーコートから単離した。バフィーコートを感染性ウイルス病原体に関して陰性であることを試験した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒを通じて得たバフィーコートから単離した。バフィーコートを感染性ウイルス病原体に関して陰性であることを試験した。
Ｔ細胞の活性化および形質導入
２９３Ｔの一過性トランスフェクションによるレトロウイルスの生成、およびＴ細胞の活性化を、本質的に本明細書で論じられるように行った。Ｔ細胞を、ｐＢＰ１５０１、ｐＢＰ０２２０、ｐＢＰ１３１０、ｐＢＰ１３１１、ｐＢＰ１３２７、ｐＢＰ１３２８ベクターで形質導入した。
２９３Ｔの一過性トランスフェクションによるレトロウイルスの生成、およびＴ細胞の活性化を、本質的に本明細書で論じられるように行った。Ｔ細胞を、ｐＢＰ１５０１、ｐＢＰ０２２０、ｐＢＰ１３１０、ｐＢＰ１３１１、ｐＢＰ１３２７、ｐＢＰ１３２８ベクターで形質導入した。
表現型決定およびインビボ細胞計数
形質導入効率を、抗ＣＤ３－ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５抗体および抗ＣＤ１９－ＡＰＣ抗体を使用してフローサイトメトリーによって決定した。マウスを屠殺した後に、脾臓中の合計の形質導入されたＴ細胞の数を、合計の脾細胞数をカウントし、フローサイトメトリーによって観察されるＣＤ３＋ＣＤ３４＋ Ｔ細胞のパーセンテージをかけ算することによって計算した。マウスにおけるＴ細胞の表現型を試験するために、脾臓を単離し、塩化アンモニウム／カリウム（ＡＣＫ）ベースの溶解緩衝液で赤血球を溶解し、続いて、７０μｍ ナイロンフィルタを通過させる機械的解離によって、単一細胞懸濁物を作製した。その後、細胞を以下の抗体で染色した：抗ｈＣＤ３－ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５、抗ｈＣＤ１９－ＡＰＣ、および抗ｍＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ５１０。
形質導入効率を、抗ＣＤ３－ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５抗体および抗ＣＤ１９－ＡＰＣ抗体を使用してフローサイトメトリーによって決定した。マウスを屠殺した後に、脾臓中の合計の形質導入されたＴ細胞の数を、合計の脾細胞数をカウントし、フローサイトメトリーによって観察されるＣＤ３＋ＣＤ３４＋ Ｔ細胞のパーセンテージをかけ算することによって計算した。マウスにおけるＴ細胞の表現型を試験するために、脾臓を単離し、塩化アンモニウム／カリウム（ＡＣＫ）ベースの溶解緩衝液で赤血球を溶解し、続いて、７０μｍ ナイロンフィルタを通過させる機械的解離によって、単一細胞懸濁物を作製した。その後、細胞を以下の抗体で染色した：抗ｈＣＤ３－ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５、抗ｈＣＤ１９－ＡＰＣ、および抗ｍＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ５１０。
２９３細胞におけるＳＲα ＳＥＡＰアッセイ
０日目に、５×１０５個の２９３細胞を、２ｍｌ ＤＭＥＭ培地（１０％ ＦＢＳ＋１％ ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を含む、６ウェルプレートに播種した。１日目に、細胞を、各１μｇのｐＢＰ１５０１、ｐＢＰ０２２０、ｐＢＰ１３１０、ｐＢＰ１３１１、ｐＢＰ１３２７、ｐＢＰ１３２８ベクター、およびＳＲα－ＳＥＡＰレポータープラスミド（ｐＢＰ００４６）で共トランスフェクトした。２日目に、細胞を集め、２倍濃度の半対数薬物希釈物を含む９６ウェルプレートに播種し、トランスフェクション効率に関してＦＡＣＳによっても分析した。３日目に、その薬物処置した細胞を、６８℃において１時間にわたって熱不活性化し、上清を、２Ｍ ジエタノールアミンに希釈した１ｍＭ ＭＵＰ基質（２倍濃度）を含む黒色９６ウェルプレートに添加した。そのプレートを、３７℃において３０分間インキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
０日目に、５×１０５個の２９３細胞を、２ｍｌ ＤＭＥＭ培地（１０％ ＦＢＳ＋１％ ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を含む、６ウェルプレートに播種した。１日目に、細胞を、各１μｇのｐＢＰ１５０１、ｐＢＰ０２２０、ｐＢＰ１３１０、ｐＢＰ１３１１、ｐＢＰ１３２７、ｐＢＰ１３２８ベクター、およびＳＲα－ＳＥＡＰレポータープラスミド（ｐＢＰ００４６）で共トランスフェクトした。２日目に、細胞を集め、２倍濃度の半対数薬物希釈物を含む９６ウェルプレートに播種し、トランスフェクション効率に関してＦＡＣＳによっても分析した。３日目に、その薬物処置した細胞を、６８℃において１時間にわたって熱不活性化し、上清を、２Ｍ ジエタノールアミンに希釈した１ｍＭ ＭＵＰ基質（２倍濃度）を含む黒色９６ウェルプレートに添加した。そのプレートを、３７℃において３０分間インキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
ウェスタンブロット分析
適切なレトロウイルスでの形質導入後、３ｍｌ ＣＴＬ培地を含む、６ウェルプレートへと１ウェルあたり６×１０６個のＴ細胞を播種した。２４時間後、細胞を集め、冷ＰＢＳ中で洗浄し、氷上で３０分間、プレート中の（ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｄ）、１×Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ， ８７７８６）を含むＲＩＰＡ溶解および抽出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ， ８９９０１）に溶解した。その溶解物を、１６，０００×ｇにおいて２０分間、４℃で遠心分離し、その上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。タンパク質アッセイを、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ， ２３２２７）を使用して製造業者の推奨に従って行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥのサンプルを調製するために、５０μｇの溶解物を、４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６１０７４７）と混合し、９５℃において１０分間加熱した。その間に、１０％ ＳＤＳゲルを、Ｂｉｏ Ｒａｄキャスティング装置および３０％ アクリルアミド／ビス溶液（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６０１５８）を使用して調製した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６１０３７４）とともに、それらのサンプルを、等しいレベルの総タンパク質でロードし、１×トリス／グリシン泳動緩衝液（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６１０７７１）中で、１４０Ｖにおいて９０分間泳動した。タンパク質分離後、ゲルを、ｉＢｌｏｔ ２デバイス（Ｔｈｅｒｍｏ，
ＩＢ２１００１）においてＰｒｏｇｒａｍ ０（合計７分間）を使用してＰＶＤＦ膜上に転写した。その後、膜を、ｉＢｉｎｄ Ｆｌｅｘ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ， ＳＬＦ２０００）を使用して製造業者の推奨に従って、一次抗体および二次抗体でプローブした。抗カスパーゼ－９抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， ＰＡ１－１２５０６）を、１：２００希釈で使用し、二次ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， Ａ１６１０４）を、１：５００希釈で使用した。β－アクチン抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， ＰＡ１－１６８８９）を、１：１０００希釈で使用し、二次ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， Ａ１６１０４）を、１：１０００希釈で使用した。その膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ， ３４０９６）を使用して発色させ、ＧｅｌＬｏｇｉｃ ６０００ ＰｒｏカメラおよびＣａｒｅＳｔｒｅａｍ ＭＩソフトウェア（ｖ．５．３．１．１６３６９）を使用してイメージングした。
適切なレトロウイルスでの形質導入後、３ｍｌ ＣＴＬ培地を含む、６ウェルプレートへと１ウェルあたり６×１０６個のＴ細胞を播種した。２４時間後、細胞を集め、冷ＰＢＳ中で洗浄し、氷上で３０分間、プレート中の（ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｄ）、１×Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ， ８７７８６）を含むＲＩＰＡ溶解および抽出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ， ８９９０１）に溶解した。その溶解物を、１６，０００×ｇにおいて２０分間、４℃で遠心分離し、その上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。タンパク質アッセイを、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ， ２３２２７）を使用して製造業者の推奨に従って行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥのサンプルを調製するために、５０μｇの溶解物を、４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６１０７４７）と混合し、９５℃において１０分間加熱した。その間に、１０％ ＳＤＳゲルを、Ｂｉｏ Ｒａｄキャスティング装置および３０％ アクリルアミド／ビス溶液（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６０１５８）を使用して調製した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６１０３７４）とともに、それらのサンプルを、等しいレベルの総タンパク質でロードし、１×トリス／グリシン泳動緩衝液（Ｂｉｏ Ｒａｄ， １６１０７７１）中で、１４０Ｖにおいて９０分間泳動した。タンパク質分離後、ゲルを、ｉＢｌｏｔ ２デバイス（Ｔｈｅｒｍｏ，
ＩＢ２１００１）においてＰｒｏｇｒａｍ ０（合計７分間）を使用してＰＶＤＦ膜上に転写した。その後、膜を、ｉＢｉｎｄ Ｆｌｅｘ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ， ＳＬＦ２０００）を使用して製造業者の推奨に従って、一次抗体および二次抗体でプローブした。抗カスパーゼ－９抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， ＰＡ１－１２５０６）を、１：２００希釈で使用し、二次ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， Ａ１６１０４）を、１：５００希釈で使用した。β－アクチン抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， ＰＡ１－１６８８９）を、１：１０００希釈で使用し、二次ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ， Ａ１６１０４）を、１：１０００希釈で使用した。その膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ， ３４０９６）を使用して発色させ、ＧｅｌＬｏｇｉｃ ６０００ ＰｒｏカメラおよびＣａｒｅＳｔｒｅａｍ ＭＩソフトウェア（ｖ．５．３．１．１６３６９）を使用してイメージングした。
ＩｎｃｕＣｙｔｅを使用するインビトロＴ細胞カスパーゼ活性化アッセイ
適切なレトロウイルスでの形質導入後、薬物（リミズシドまたはラパマイシン）の存在下または非存在下の、ＩＬ－２が存在するＣＴＬ培地を含む、９６ウェルプレートへと１ウェルあたり５×１０４個のＴ細胞を播種した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ機器を使用してアポトーシスの検出を可能にするために、２μＭのＩｎｃｕＣｙｔｅＴＭ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ試薬（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，
４４４０）を各ウェルに添加して、総容積２００μｌにした。そのプレートを５分間、４００×ｇで遠心分離し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｍｏｄｅｌ ４４５９）の中に置いて、１０倍の対物レンズで合計４８時間、２～３時間ごとに緑色蛍光をモニターした。「Ｔｃｅｌｌｓ＿ｃａｓｐｒｅａｇｅｎｔ＿ｐｈａｓｅ＿ｇｒｅｅｎ＿１０ｘ＿ＭＬＤ」処理定義を使用して画像分析を行った。「Ｔｏｔａｌ Ｇｒｅｅｎ Ｏｂｊｅｃｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」メトリックおよび「Ｐｈａｓｅ
Ｏｂｊｅｃｔ Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ （パーセント）」を使用して、カスパーゼ活性化を定量した。各条件を二連で行い、各ウェルを４つの異なる位置でイメージングした。
適切なレトロウイルスでの形質導入後、薬物（リミズシドまたはラパマイシン）の存在下または非存在下の、ＩＬ－２が存在するＣＴＬ培地を含む、９６ウェルプレートへと１ウェルあたり５×１０４個のＴ細胞を播種した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ機器を使用してアポトーシスの検出を可能にするために、２μＭのＩｎｃｕＣｙｔｅＴＭ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ試薬（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，
４４４０）を各ウェルに添加して、総容積２００μｌにした。そのプレートを５分間、４００×ｇで遠心分離し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｍｏｄｅｌ ４４５９）の中に置いて、１０倍の対物レンズで合計４８時間、２～３時間ごとに緑色蛍光をモニターした。「Ｔｃｅｌｌｓ＿ｃａｓｐｒｅａｇｅｎｔ＿ｐｈａｓｅ＿ｇｒｅｅｎ＿１０ｘ＿ＭＬＤ」処理定義を使用して画像分析を行った。「Ｔｏｔａｌ Ｇｒｅｅｎ Ｏｂｊｅｃｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」メトリックおよび「Ｐｈａｓｅ
Ｏｂｊｅｃｔ Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ （パーセント）」を使用して、カスパーゼ活性化を定量した。各条件を二連で行い、各ウェルを４つの異なる位置でイメージングした。
動物モデル
８週齢の雌性免疫不全マウス（ＮＯＤ．ＣｇＰｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ； ＮＳＧ）に、１００μｌ ＰＢＳ中の１×１０６個のＴ細胞をＩＶ注射した。マウスを、Ｔ細胞注射の約４時間後（薬物投与後－１４時間）にＩＶＩＳイメージングに供した。翌日、マウスを薬物注射直前（０時間）にイメージングし、次いで、ビヒクル、ソルトールおよびＰＢＳに希釈したリミズシド、または「ＰＴ」に希釈したラパマイシンをＩＰ注射した。マウスを、薬物注射の５～６時間後、および２４時間後に再びイメージングした。マウスを屠殺し、ＦＡＣＳ分析のために脾臓を取り出した。
インビボバイオルミネッセンスイメージング
マウスを、薬物またはビヒクルの投与に関して示された時点で、ホタルルシフェラーゼ由来バイオルミネッセンスについてイメージングした。
マウスを、薬物またはビヒクルの投与に関して示された時点で、ホタルルシフェラーゼ由来バイオルミネッセンスについてイメージングした。
結果
キメラカスパーゼ－９ポリペプチドにおけるＦＲＢおよびＦＫＢＰのトポロジー
シグナル伝達エレメントおよび結合ドメインの順序および間隔は、結果に影響を及ぼし得るので、リガンド結合ドメインと誘導性キメラカスパーゼ－９ポリペプチドとの順序を試験した（ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９（ｐＢＰ１３１０）およびＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９（ｐＢＰ１３１１））（図１０６Ａ）。カスパーゼ３／７緑色試薬を利用するカスパーゼ活性化アッセイ（ここでカスパーゼ活性は、緑色発蛍光団を放出するペプチド試薬の切断によって捕捉され、それによる緑色蛍光発光は、アポトーシスを受けている細胞をマークする）は、ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９がＴ細胞におけるラパマイシン媒介性のアポトーシスの開始に対してＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９より僅かに感受性であることを明らかにした（図１０６Ｂ）。このあまり大きくない差異は、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９のタンパク質レベルと比較して、より高いＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９タンパク質レベルに起因し得る（図１０６Ｃ）。
キメラカスパーゼ－９ポリペプチドにおけるＦＲＢおよびＦＫＢＰのトポロジー
シグナル伝達エレメントおよび結合ドメインの順序および間隔は、結果に影響を及ぼし得るので、リガンド結合ドメインと誘導性キメラカスパーゼ－９ポリペプチドとの順序を試験した（ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９（ｐＢＰ１３１０）およびＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９（ｐＢＰ１３１１））（図１０６Ａ）。カスパーゼ３／７緑色試薬を利用するカスパーゼ活性化アッセイ（ここでカスパーゼ活性は、緑色発蛍光団を放出するペプチド試薬の切断によって捕捉され、それによる緑色蛍光発光は、アポトーシスを受けている細胞をマークする）は、ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９がＴ細胞におけるラパマイシン媒介性のアポトーシスの開始に対してＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９より僅かに感受性であることを明らかにした（図１０６Ｂ）。このあまり大きくない差異は、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９のタンパク質レベルと比較して、より高いＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９タンパク質レベルに起因し得る（図１０６Ｃ）。
キメラｉＲＣ９カスパーゼポリペプチドは野生型ＦＫＢＰドメインを含むので、二量体化およびカスパーゼ活性化を引き起こし得るリミズシドの濃度を決定する必要があった。このアッセイでは、２９３細胞を、ＦＫＢＰｖ３６カスパーゼ－９（ｉＣ９）および２個の類似のラパマイシン誘導性バリアント（ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９およびＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９）を発現するベクターで一過性にトランスフェクトし（図１０７）、ラパマイシンまたはリミズシドいずれかの半対数希釈物で処理した。カスパーゼ３／７緑色試薬の存在下でのカスパーゼ活性化アッセイを受け、かつＩｎｃｕＣｙｔｅによってモニターされるか、または代わりにラパマイシン媒介性細胞死によってモニターされるかのいずれかである細胞を、構成的ＳＲα－ＳＥＡＰレポーターを使用する分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイによって間接的に測定した。機能的には、ラパマイシン誘導性およびリミズシド誘導性のキメラカスパーゼ－９ポリペプチドは、それらそれぞれの自殺薬物によって活性化される場合に、類似の動態および閾値でカスパーゼ切断を誘導するようである（図１０７Ａ）。対照的に、ＳＥＡＰアッセイから得られるデータは、ｉＣ９キメラカスパーゼポリペプチドにおけるリミズシド誘導性スイッチが、低ラパマイシン濃度でのラパマイシン誘導性カスパーゼ－９スイッチ（ｉＲＣ９）と比較して、低リミズシド濃度での活性化により感受性であることを示す（図１０７Ｂ）。ラパマイシン誘導性キメラカスパーゼ－９ポリペプチド、ｉＲＣ９は、１００ｐＭ程度の低さのラパマイシンの存在下ですら高度に活性であり、よりゆっくりとした動態にも拘わらず、さらに低い薬物レベルでもいくらかの有効性があった。この２種のｉＲＣ９ポリペプチド、ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９ 対 ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９を比較する場合、ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９は、図１０６Ｂで得られるデータと一致して、ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９より低いラパマイシン濃度で活性である。最後に、ｉＲＣ９キメラカスパーゼ－９ポリペプチドは、１００ｎＭを下回るリミズシドに非感受性であり、このことは、このラパマイシン誘導性オフスイッチと別のリミズシド媒介性スイッチ（例えば、ｉＭＣ）とを組み合わせることを実行可能にする。
キメラｉＲｍＣ９発現Ｔ細胞は、リミズシドおよびラパマイシンの両方によってインビトロで活性化され得る
ｉＲｍＣ９（ＦＲＢ．ＦＶ．ΔＣ９（ｐＢＰ１３２７）およびＦＶ．ＦＲＢ．ΔＣ９（ｐＢＰ１３２８））を、ｉＲＣ９内のＦＫＢＰドメインをＦ３６Ｖへと変異させることによって生成して、リミズシド結合に適合させた。ＳＲα－ＳＥＡＰアッセイを行って、３種のオフスイッチ：ｉＣ９（ｐＢＰ２２０）、ｉＲＣ９（ｐＢＰ１３１０および１３１１）、ならびにｉＲｍＣ９（ｐＢＰ１３２７およびｐＢＰ１３２８）の薬物特異性を評価した。プラスミドｐＢＰ１５０１は、ΔＣ９ドメインのみを含み、薬物誘導の陰性コントロールとして働く（図１０６Ａ）。リミズシドは、ｉＣ９スイッチおよびｉＲｍＣ９スイッチの両方を活性化し得るが、ｉＲＣ９スイッチを活性化するには＞１００ｎＭ リガンドを要する（図１０８Ａ）。逆に、ラパマイシンは、ｉＲＣ９スイッチおよびｉＲｍＣ９スイッチの両方を活性化し得るが、１０００ｎＭ 濃度ですらｉＣ９の二量体化を誘導できない。
活性化Ｔ細胞におけるこれらスイッチの機能性を決定するために、レトロウイルス上清を生成し、３名の別個のドナーからの活性化されたＰＢＭＣに形質導入した。異なるカスパーゼ－９スイッチを発現するＴ細胞を、カスパーゼ３／７緑色試薬の存在下で、漸増用量のリミズシドおよびラパマイシンで殺滅アッセイに供し、ＩｎｃｕＣｙｔｅによってモニターした（図１０８Ｂ）。ＳＲα－ＳＥＡＰアッセイによって観察される場合、リミズシドは、ｉＣ９およびｉＲｍＣ９を活性化し得るが、野生型ＦＫＢＰ１２を含むｉＲＣ９を活性化できない一方で、ラパマイシンは、ｉＲＣ９およびｉＲｍＣ９を活性化し得るが、ｉＣ９を活性化できない。陰性コントロールΔＣ９単独（ｐＢＰ１５０１）は、リミズシドまたはラパマイシンのいずれの存在下でも活性でなかった。注意すべきことは、リミズシドは、ＦＲＢ．ＦＶ．ΔＣ９（ｐＢＰ１３２７）を、ＦＶドメインがカスパーゼ－９に対して近位にあることにおそらく起因して、ＦＶ．ＦＲＢ．ΔＣ９（ｐＢＰ１３２８）より高い効率で活性化することである。誘導性カスパーゼのタンパク質レベルを、ウェスタンブロットによって決定した。ｉＣ９は、ｉＲＣ９およびｉＲｍＣ９の両方と比較して、より高いレベルで発現される（図１０８Ｃ）。これらのデータに基づいて、以下のプラスミドを選択して、さらなるインビボ試験に進んだ：ｉＣ９（ｐＢＰ０２２０）、ｉＲＣ９（ｐＢＰ１３１０）、およびｉＲｍＣ９（ｐＢＰ１３２７）。
ｉＲｍＣ９ Ｔ細胞は、リミズシドおよびラパマイシンの両方によってインビボで活性化され得る
ドナー６７６に由来するＰＢＭＣを活性化し、複数のオフスイッチおよび複数のＧＦＰ－Ｆｌｕｃレトロウイルスの１つで共形質導入した。形質導入の１１日後、細胞を、ＧＦＰおよび抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９抗体で形質導入効率に関して分析した（図１０９Ａ）。この分析は、ｉＣ９ Ｔ細胞が４１％ ＧＦＰ＋／ＣＤ１９＋であり、ｉＲＣ９ Ｔ細胞が６５％ ＧＦＰ＋／ＣＤ１９＋であり、ｉＲｍＣ９ Ｔ細胞が５１％ ＧＦＰ＋／ＣＤ１９＋であることを示した。その異なるＴ細胞集団に関するＣＤ１９＋ ＭＦＩは、以下であった：ｉＣ９＝１５．０７、ｉＲＣ９＝１４．３８、およびｉＲｍＣ９＝１３．３９。その細胞を集め、カウントし、洗浄し、各々、マウスに尾静脈注射するために１００μｌ
ＰＢＳ中１×１０６個の細胞で再懸濁した（表１０）（時間＝－１８時間）。翌日に、５ｍｇ／ｋｇ リミズシド（ソルトールおよびＰＢＳに溶解）または１０ｍｇ／ｋｇ ラパマイシン（界面活性剤ベースの賦形剤「ＰＴ」、１０％ ＰＥＧ－４００＋１７％ Ｔｗｅｅｎ－８０に溶解）を、各それぞれの群へと腹腔内注射した（時間＝０時間）。ＩＶＩＳイメージングを、－１４時間、０時間、５時間、２４時間および２９時間で行った。マウスを屠殺し、ｈＣＤ３、ｈＣＤ１９およびｍＣＤ４５抗体によるＦＡＣＳ分析のために脾臓を集めた。リミズシド投与は、ＩＣ９およびｉＲｍＣ９ Ｔ細胞の有意な除去を誘導した一方で、ラパマイシンは、ｉＲＣ９およびｉＲｍＣ９ Ｔ細胞の除去を誘導した（図１０９ＢおよびＣ）。リミズシドで処置したｉＣ９群で検出された比較的高レベルのＢＬＩシグナルは、形質導入されたＴ細胞において高い単一のＧＦＰ＋集団（４１％）の原因であり得る（図１０９Ａ）。興味深いことに、ラパマイシンで処置したｉＣ９発現Ｔ細胞群において、ＩＶＩＳイメージングは、それぞれの薬物なしの群と比較して、より高いシグナルを示す。これは、ＰＴから構成されるラパマイシンビヒクルが、検出されるバイオルミネッセンスをブーストし得ることを示唆する。脾細胞の分析から、ｉＣ９ Ｔ細胞の約２０％が、薬物なしで処置した群またはラパマイシンで処置した群におけるものと比較して、リミズシド処置後に残存することが明らかにされた（図１０９Ｄ）。同様に、２４時間で、ｉＲＣ９ Ｔ細胞のおよそ２５％が、薬物なしで処置した群およびリミズシドで処置した群におけるものと比較して、ラパマイシン処置後に残存した。ｉＲｍＣ９群において、ｉＲｍＣ９ Ｔ細胞のうちの約５０％および約４０％が、それぞれ、リミズシドまたはラパマイシン投与後に残存した。観察された残存しているｉＲｍＣ９ Ｔ細胞のより高いパーセンテージは、薬物なし群を正規化する人工物に起因し得る。脾細胞のＣＤ１９＋ ＭＦＩをブロットするグラフ（図１０９Ｄ、右側のグラフ）において、ｉＲｍＣ９
Ｔ細胞は、他の群と比較して注射前に見られるようにより低いＣＤ１９＋ ＭＦＩを有し、薬物処置後に脾臓に残存したＴ細胞は、ｉＣ９およびｉＲＣ９処置群に類似のＣＤ１９＋ ＭＦＩを有した。
ＰＢＳ中１×１０６個の細胞で再懸濁した（表１０）（時間＝－１８時間）。翌日に、５ｍｇ／ｋｇ リミズシド（ソルトールおよびＰＢＳに溶解）または１０ｍｇ／ｋｇ ラパマイシン（界面活性剤ベースの賦形剤「ＰＴ」、１０％ ＰＥＧ－４００＋１７％ Ｔｗｅｅｎ－８０に溶解）を、各それぞれの群へと腹腔内注射した（時間＝０時間）。ＩＶＩＳイメージングを、－１４時間、０時間、５時間、２４時間および２９時間で行った。マウスを屠殺し、ｈＣＤ３、ｈＣＤ１９およびｍＣＤ４５抗体によるＦＡＣＳ分析のために脾臓を集めた。リミズシド投与は、ＩＣ９およびｉＲｍＣ９ Ｔ細胞の有意な除去を誘導した一方で、ラパマイシンは、ｉＲＣ９およびｉＲｍＣ９ Ｔ細胞の除去を誘導した（図１０９ＢおよびＣ）。リミズシドで処置したｉＣ９群で検出された比較的高レベルのＢＬＩシグナルは、形質導入されたＴ細胞において高い単一のＧＦＰ＋集団（４１％）の原因であり得る（図１０９Ａ）。興味深いことに、ラパマイシンで処置したｉＣ９発現Ｔ細胞群において、ＩＶＩＳイメージングは、それぞれの薬物なしの群と比較して、より高いシグナルを示す。これは、ＰＴから構成されるラパマイシンビヒクルが、検出されるバイオルミネッセンスをブーストし得ることを示唆する。脾細胞の分析から、ｉＣ９ Ｔ細胞の約２０％が、薬物なしで処置した群またはラパマイシンで処置した群におけるものと比較して、リミズシド処置後に残存することが明らかにされた（図１０９Ｄ）。同様に、２４時間で、ｉＲＣ９ Ｔ細胞のおよそ２５％が、薬物なしで処置した群およびリミズシドで処置した群におけるものと比較して、ラパマイシン処置後に残存した。ｉＲｍＣ９群において、ｉＲｍＣ９ Ｔ細胞のうちの約５０％および約４０％が、それぞれ、リミズシドまたはラパマイシン投与後に残存した。観察された残存しているｉＲｍＣ９ Ｔ細胞のより高いパーセンテージは、薬物なし群を正規化する人工物に起因し得る。脾細胞のＣＤ１９＋ ＭＦＩをブロットするグラフ（図１０９Ｄ、右側のグラフ）において、ｉＲｍＣ９
Ｔ細胞は、他の群と比較して注射前に見られるようにより低いＣＤ１９＋ ＭＦＩを有し、薬物処置後に脾臓に残存したＴ細胞は、ｉＣ９およびｉＲＣ９処置群に類似のＣＤ１９＋ ＭＦＩを有した。
ｉＲｍＣ９ Ｔ細胞を有するマウスにおけるリミズシドおよびラパマイシンの薬物滴定
ｉＲｍＣ９構築物は、同じ分子において、リミズシド誘導性 対 ラパマイシン誘導性の殺滅動態の直接的比較を可能にし得る理想的スイッチを代表する。この実験において、ｉＲｍＣ９ Ｔ細胞は、ドナー５８４から、ｐＢＰ１３２７およびＧＦＰ－Ｆｌｕｃレトロウイルスで共形質導入によって生成した。形質導入の１０日後、ＦＡＣＳ分析は、その細胞のうちの７３％がＧＦＰ＋／ＣＤ１９＋であり、ＣＤ１９＋ ＭＦＩは、１５．２３であることを示した（図１１０Ａ）。マウス１匹あたりに１０００万個のｉＲｍＣ９ Ｔ細胞を、ＩＶ注射した（表１０）（時間＝－１４時間）。翌日に、リミズシド（ソルトールおよびＰＢＳに溶解）またはラパマイシン（ＰＴに溶解）を、各それぞれの群へと腹腔内注射した（時間＝０時間）。ビヒクル群は、ＰＢＳ、ＰＢＳ中の２５％ ソルトールまたはＰＴ中の５％ ＤＭＡのいずれかを受けた。ＩＶＩＳイメージングを、－１０時間、０時間、６時間、および２４時間で行った。マウスを屠殺し、ｈＣＤ３、ｈＣＤ１９およびｍＣＤ４５抗体でのＦＡＣＳ分析のために脾臓を集めた。リミズシド用量滴定のためのＩＶＩＳイメージングは、ｉＲｍＣ９ Ｔ細胞の用量依存性除去を示す（図１１０ＢおよびＣ）。対照的に、ラパマイシン投与群におけるＩＶＩＳイメージングは、ビヒクル処置群において最も顕著に検出されたＩＶＩＳシグナルの予測外の増加を示すが、ＰＢＳ処置群では観察されない（図１１０Ｂ）。この観察は、以前の実験において観察されたものに類似であり（図１０９Ｂ）、ＰＴの構成成分に起因し得る。しかし、脾細胞分析は、リミズシドまたはラパマイシンによるｉＲｍＣ９改変Ｔ細胞の欠失に関して類似の用量応答を示した（図１１０Ｄ）。
図１０６． ｉＲＣ９におけるＦＲＢおよびＦＫＢＰのトポロジー。（図１０６Ａ）ドナー９２０に由来するＰＢＭＣを活性化し、ｐＢＰ１３１０およびｐＢＰ１３１１ベクターで形質導入した。（図１０６Ｂ）形質導入の５日後に、Ｔ細胞を、０ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、および２０ｎＭ ラパマイシンを有する９６ウェルプレートに播種した。さらに、２μＭ カスパーゼ３／７緑色試薬を添加して、カスパーゼ切断をＩｎｃｕＣｙｔｅによってモニターした。線グラフは、ＦＲＢ．ＦＫＢＰ．ΔＣ９ 対 ＦＫＢＰ．ＦＲＢ．ΔＣ９の、ラパマイシン処理後２４時間にわたるカスパーゼ活性化を示す。（図１０６Ｃ）ｉＲＣ９ Ｔ細胞のタンパク質発現を、ｈカスパーゼ－９およびβ－アクチンに対する抗体を使用してウェスタンブロットによって分析した。
図１０７． 高い（＞１００ｎＭ）リミズシド濃度は、ｉＲＣ９を活性化するために必要とされる。２９３細胞を、６ウェルプレートにおいて３００，０００個の細胞／ウェルで播種し、２日間成長させた。４８時間後に、細胞を、１μｇの実験用プラスミドでトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に採取し、それらの最初の容積の２．５倍に希釈した。（図１０７Ａ）Ｉｎｃｕｃｙｔｅ／ｃａｓｐ３／７アッセイのために、５０μｌの細胞を、リミズシドまたはラパマイシン薬物のいずれかおよびカスパーゼ３／７緑色試薬（２．５μＭ 最終濃度）を含むウェルあたりに蒔いた。（図１０７Ｂ）ＳＥＡＰアッセイのために、１００μｌの細胞を、（半対数）リミズシド（またはラパマイシン）薬物希釈物を有する９６ウェルプレートに入れ、薬物曝露の約１８時間後に、プレートを、基質（４－ＭＵＰ）添加の前に熱不活性化した。
図１０８． ｉＲｍＣ９ Ｔ細胞は、リミズシドおよびラパマイシンの両方によってインビトロで活性化され得る。（図１０８Ａ）ＳＲα ＳＥＡＰアッセイを、２９３細胞をｐＢＰ１５０１、２２０、１３１０、１３１１、１３２７、１３２８ベクターおよびＳＲα－ＳＥＡＰレポータープラスミドで共トランスフェクトすることによって行った。（図１０８Ｂ）Ｉｎｃｕｃｙｔｅ／ｃａｓｐ３／７アッセイのために、２μＭ カスパーゼ３／７緑色試薬存在下の、漸増のリミズシドおよびラパマイシン濃度を有する９６ウェルプレートに、Ｔ細胞を播種して、カスパーゼ切断をＩｎｃｕＣｙｔｅによってモニターした。（図１０８Ｃ）ｉＲＣ９ Ｔ細胞のタンパク質発現を、ｈカスパーゼ－９およびβ－アクチンに対する抗体を使用してウェスタンブロットによって分析した。
図１０９． ｉＲｍＣ９ Ｔ細胞は、リミズシドおよびラパマイシンの両方によってインビボで活性化され得る。ドナー６７６に由来するＰＢＭＣを活性化し、ｐＢＰ０２２０、１３１０、１３２７ベクターをコードするレトロウイルスおよびＧＦＰ－Ｆｌｕｃプラスミドで共形質導入した。（図１０９Ａ）形質導入の１１日後に、その細胞を、マウスへの注射の前にＣＤ１９およびＧＦＰ形質導入効率に関して分析した。（図１０９ＢおよびＣ）ＮＳＧマウスに、マウス１匹あたりに、ＧＦＰ－Ｆｌｕｃで共形質導入した１０７個のＴ細胞（１０７ Ｔ ｃｅｌｌｓ）をｉ．ｖ．注射し、自殺薬物を翌日にｉ．ｐ．注射した。薬物投与後－１４時間、０時間、５時間、２４時間、および２９時間に、細胞のバイオルミネッセンスを評価した。（図１０９Ｄ）薬物処置の２９時間後に、マウスを安楽死させ、ｈＣＤ３、ｈＣＤ３４、およびｍＣＤ４５に対する抗体を用いるフローサイトメトリー分析のために脾臓を集めた。
図１１０． ｉＲｍＣ９ Ｔ細胞を有するマウスにおけるリミズシドおよびラパマイシンの薬物滴定。ドナー５８４に由来するＰＢＭＣを活性化し、ｐＢＰ１３２７ベクターをコードするレトロウイルスおよびＧＦＰ－Ｆｌｕｃプラスミドで共形質導入した。（図１１０Ａ）形質導入の１０日後、その細胞を、マウスへの注射の前に、ＣＤ１９およびＧＦＰ形質導入効率に関して分析した。（図１１０ＢおよびＣ）ＮＳＧマウスに、１匹のマウスあたりＧＦＰ－Ｆｌｕｃで共形質導入した１×１０７個のＴ細胞をｉ．ｖ．注射し、自殺薬物を、翌日にｉ．ｐ．注射した。薬物投与後の－１０時間、０時間、６時間、および２４時間に、細胞のバイオルミネッセンスを評価した。（図１１０Ｄ）薬物処置の２４時間後に、マウスを安楽死させ、ｈＣＤ３、ｈＣＤ３４、およびｍＣＤ４５に対する抗体を用いるフローサイトメトリー分析のために脾臓を集めた。
まとめ
３種の異なるカスパーゼ－９が可能にした安全スイッチ間での二量体化剤リガンド投与後のアポトーシス誘導の動態および効率を、比較した。一般に、アポトーシス誘導の能力は、それらそれぞれの薬物で誘発した場合にはｉＣ９、ｉＲＣ９、およびｉＲｍＣ９のオフスイッチ間で類似であるが、動態および用量応答に関して幾分微細な差異がある。従って、これら３種の安全スイッチのデザインは、オフ機構に重大な必要性がある現在のおよび将来の臨床適用のために使用され得る分子のツールボックスを拡大する。
ラパマイシンおよびリミズシドは、異なる薬力学的特性を有すると推測されるので、この技術の１つの潜在的適用は、組織選択性を提供し得るリガンドの選択にあり得る。例えば、血液脳関門の不透過性に起因して、リミズシドが脳から排除すべきである場合、ｉＲｍＣ９スイッチは、ラパマイシンによって活性化され得る。あるいは、Ｔ細胞数の滴定が必要とされる場合、一方の薬物の用量応答曲線が他方の薬物のそれに優ることは、その展開を決定する重要な決定因子であり得る。さらに、経口送達が必要とされる場合、ラパマイシンまたはアナログは、論理的選択であり得る。
実施例３１：誘導性ＭｙＤ８８－ＣＤ４０共刺激は、ＣＤ１２３特異的キメラ抗原レセプターＴ細胞によるリガンド依存性腫瘍根絶を提供する
ＣＤ１２３特異的キメラ抗原レセプター発現Ｔ細胞の共刺激の状況において２種の分子スイッチのうちの一方であるｉＭＣの使用例を提供する。Ｂ細胞白血病およびリンパ腫の処置に関するＣＤ１９特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）指向性Ｔ細胞での有望な臨床結果は、ＣＡＲが他の血液悪性腫瘍（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））において有効であり得ることを示唆する。
ＣＤ１２３特異的キメラ抗原レセプター発現Ｔ細胞の共刺激の状況において２種の分子スイッチのうちの一方であるｉＭＣの使用例を提供する。Ｂ細胞白血病およびリンパ腫の処置に関するＣＤ１９特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）指向性Ｔ細胞での有望な臨床結果は、ＣＡＲが他の血液悪性腫瘍（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））において有効であり得ることを示唆する。
ＣＤ１２３／ＩＬ－３Ｒαは、ＡＭＬ芽球および白血病性幹細胞（ＡＭＬ－ＬＳＣ）の両方でのその高発現に起因して、魅力的なＣＡＲ－Ｔ細胞標的である。しかし、その抗原はまた、正常な幹細胞前駆体において低レベルで発現され、主要な毒性の懸念を提示しているが、ＣＤ１２３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞は長期間の持続性を示すべきである。
ｉＭＣ－ＣＡＲ共刺激プラットフォームであるｉＭＣは、増殖欠損性の第１世代ＣＤ１２３特異的ＣＡＲと一緒にリガンド（リミズシド（Ｒｉｍ））依存性共刺激スイッチ（誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ｉＭＣ））を使用して、ＣＤ１２３＋腫瘍細胞の医師によ
り管理された根絶を提供し、長期間のＣＡＲ－Ｔ細胞生着を制御する。
り管理された根絶を提供し、長期間のＣＡＲ－Ｔ細胞生着を制御する。
レトロウイルスおよび形質導入： Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／２８抗体で活性化し、その後、タンデムＲｉｍ結合ドメイン（ＦＫＢＰ１２ｖ３６）をコードするバイシストロン性レトロウイルスで形質導入し、ＭｙＤ８８およびＣＤ４０細胞質シグナル伝達分子、ならびに第１世代のＣＡＲ標的化ＣＤ１２３（ＳＦＧ－ｉＭＣ－ＣＤ１２３．ζ）とインフレームでクローニングした（図１１１）。
共培養アッセイ： ＣＤ１２３標的化ＣＡＲに対するｉＭＣ共刺激の効果を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージングシステムを使用して、Ｒｉｍありおよびなしで、ＣＤ１２３＋、ＥＧＦＰルシフェラーゼ（ＥＧＦＰｌｕｃ）改変白血病細胞株（ＫＧ１、ＴＨＰ－１およびＭＯＬＭ－１３）との共培養アッセイにおいて評価した。ＩＬ－２生成を、ＥＬＩＳＡによって共培養上清から試験した。
動物実験： ｉＭＣ－ＣＤ１２３．ζ改変Ｔ細胞のインビボ有効性を、免疫不全ＮＳＧ腫瘍異種移植片モデルを使用して評価した。１００万個のＥＧＦＰｌｕｃ発現ＣＤ１２３＋ ＴＨＰ－１腫瘍細胞を、動物にｉ．ｖ．注射し、続いて、７日目に、種々の非形質導入Ｔ細胞またはｉＭＣ－ＣＤ１２３．ζ改変Ｔ細胞の単回ｉ．ｖ．注射を行った。ＣＡＲ－Ｔ細胞を受けた群は、その後、Ｔ細胞注射後の０日目および１５日目に、Ｒｉｍ（１ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルのみのｉ．ｐ．注射を受けた。動物を、ＩＶＩＳバイオルミネッセンスイメージング（ＢＬＩ）を使用して毎週ベースで、ＴＨＰ－１－ＥＧＦＰｌｕｃ腫瘍負荷および体重変化に関して評価し、Ｔ細胞注射後３０日目にフローサイトメトリーおよびｑＰＣＲによってＴ細胞持続性に関して評価した。
図１１２： ２名のドナーに由来するＰＢＭＣを活性化し、ＣＤ１２３ ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔベクターをコードするレトロウイルスで形質導入した。形質導入の６日後に、９６ウェルプレートに、０ｎＭ、０．１ｎＭ、または１ｎＭ リミズシドの存在下、Ｔ細胞を、ＴＨＰ１－ＧＦＰ．Ｆｌｕｃ細胞またはＨＰＡＣ－ＲＦＰ細胞とともに、１：１０のＥ：Ｔ比で播種し、ＩｎｃｕＣｙｔｅの中に置いて、ＴＨＰ１－ＧＦＰ．ＦｌｕｃまたはＨＰＡＣ－ＲＦＰ成長の動態をモニターした。（ＡおよびＢ）播種の２日後に、二連のプレートからの培養上清を、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－６およびＩＬ－２生成に関して分析した。（Ｃ）ＴＨＰ１－ＧＦＰ．Ｆｌｕｃの全緑色蛍光強度および（Ｄ）ウェルあたりのＨＰＡＣ－ＲＦＰ細胞数を、７日目にＩｎｃｕＣｙｔｅ用のベーシックアナライザーソフトウェアを使用して分析した。
図１１３． ４名のドナーに由来するＰＢＭＣを活性化し、ＣＤ１２３ ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－ＴベクターおよびＲＦＰベクターをコードするレトロウイルスで共形質導入した。形質導入の１０日後に、９６ウェルプレートに、０ｎＭまたは１ｎＭ リミズシドの存在下、Ｔ細胞を、ＴＨＰ１－ＧＦＰ．Ｆｌｕｃ細胞とともに１：１のＥ：Ｔ比で播種し、ＩｎｃｕＣｙｔｅの中に置いて、ＴＨＰ１－ＧＦＰ．ＦｌｕｃおよびＴ細胞－ＲＦＰ成長の動態をモニターした。（Ａ）播種の２日後に、二連のプレートからの培養上清を、ＥＬＩＳＡによってＩＬ－２生成に関して分析した。７日目に、細胞を、（Ｂ）ＴＨＰ１－ＧＦＰ．Ｆｌｕｃの数に関して分析し、（Ｃ）フローサイトメトリーによって共培養物中に残存したＴ細胞－ＲＦＰに関して分析した。（Ｄ）ＴＨＰ１－ＧＦＰ．Ｆｌｕｃ緑色蛍光の時間経過モニターおよび（Ｅ）Ｔ細胞－ＲＦＰ赤色蛍光を、合計７日間にわたってＩｎｃｕＣｙｔｅを使用して分析した。
図１１４． （Ａ）ＰＢＭＣを活性化し、ＣＤ１２３ ｉＭＣ－ＣＡＲζベクターを含むレトロウイルスで形質導入した。形質導入の１２日後に、ＣＡＲ発現を、マウスへの注射の前に、抗Ｑ－ｂｅｎｄ１０ 抗体を使用して決定した。（Ｂ）ＮＳＧマウスに、７日間にわたって１×１０６個のＴＨＰ１－ＧＦＰ．Ｆｌｕｃ細胞をｉ．ｖ．で移植し、続いて、２．５×１０６個の非形質導入（ＮＴ）細胞またはＣＤ１２３ ｉＭＣ－ＣＡＲζ細胞のｉ．ｖ．での注入を行った。リミズシドまたはプラセボを、Ｔ細胞注入後の０日目および１５日目に、１ｍｇ／ｋｇにおいてｉ．ｐ．で与えた。（Ｃ）ＴＨＰ１－ＧＦＰ．Ｆｌｕｃ成長を、ＩＶＩＳバイオルミネッセンスを使用して測定した。（Ｄ、Ｅ）３０日目に、マウスを屠殺し、フローサイトメトリーおよびベクターコピー数アッセイによってＣＡＲ－Ｔ細胞の存在に関して脾臓を分析した。
図１１５： （Ａ）ＮＳＧマウスに、１×１０６個のＴＨＰ１－ＧＦＰ．Ｆｌｕｃ細胞をｉ．ｖ．で７日間にわたって移植し、続いて、１０ｅ６ ＮＴ Ｔ細胞または種々の用量のＣＤ１２３ ｉＭＣ＋ＣＡＲζ－Ｔ細胞でのｉ．ｖ．処置を行った。Ｔ細胞注入後の０日目および１５日目に、リミズシドまたはプラセボ、１ｍｇ／ｋｇをｉ．ｐ．で与えた。（Ｂ）２９日目にマウスを屠殺し、ベクターコピー数アッセイによってＣＡＲ－Ｔ細胞の存在に関して脾臓を分析した。
リガンド依存性活性化スイッチおよび増殖欠損の第１世代のＣＡＲを含むｉＭＣ－ＣＡＲζプラットフォームは、全身性のリミズシド投与によって共刺激が提供される場合に、ＣＤ１２３＋白血病細胞を効率的に根絶した。ｉＭＣ共刺激の欠乏は、ＣＡＲ－Ｔレベルの低下を生じ、ＣＤ１２３特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性および安全性を管理するためのユーザー主導型システムを提供する。
実施例３２：誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０は、腫瘍特異的ＴＣＲ改変Ｔ細胞の増殖および生存を増強し、骨髄腫における抗腫瘍有効性を改善する。
腫瘍特異的組換えＴＣＲ発現Ｔ細胞の状況での２種の分子スイッチのうちの一方であるｉＭＣの使用例を提供する。
腫瘍特異的組換えＴＣＲ発現Ｔ細胞の状況での２種の分子スイッチのうちの一方であるｉＭＣの使用例を提供する。
腫瘍抗原特異的ＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞を使用するがん免疫療法は、クリニックにおいて有望であると示された；しかし、恒久性の応答は、インビボでの不十分なＴ細胞拡大および持続性によって制限されてきた。さらに、腫瘍細胞上でのＭＨＣクラスＩのダウンレギュレーションは、Ｔ細胞認識を減少させ、治療的有効性の低下をもたらす。
誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０（ｉＭＣ）は、ＤＣ活性化１ならびにＴ細胞増殖および生存を増強するリミズシド（ＡＰ１９０３）依存性共刺激分子である。ＰＲＡＭＥ（ＰＲｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ＭＥｌａｎｏｍａ）は、多くのがん（黒色腫、肉腫、ＡＭＬ、ＣＭＬ、神経芽腫、乳がん、肺がん、頭頚部がんが挙げられる）において過剰発現されるが、正常組織では過剰発現されないがん精巣（ＣＴ）抗原である。Ｂｏｂ１（ＯＣＡ－Ｂ、ＯＢＦ１またはＰＯＵ２ＡＦ１としても公知）は、ＣＤ１９＋ Ｂ細胞、ＡＬＬ、ＣＬＬ、ＭＣＬおよび多発性骨髄腫（ＭＭ）において高度に発現されるＢ細胞特異的転写コアクチベーターである。
図１１６は、強力なＴ細胞治療をよりよく制御するために、誘導性共刺激ポリペプチド（ｉＭＣ）を使用して調節される「オンデマンド共刺激（Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｄｅｍａｎｄ）」システムの模式図である。Ｔ細胞活性化および増殖は、ＴＣＲ依存性およびｉＭＣ依存性である。最大の腫瘍指向性細胞傷害性、ならびにインビボでのＴ細胞持続性は、腫瘍特異的ＴＣＲおよびリミズシド活性化ｉＭＣからの相乗作用的シグナルを要する。
図１１７：（Ａ～Ｃ）ＰＲＡＭＥ ＴＣＲを発現するレトロウイルスベクター（Ａｍｉｒら）またはＰＲＡＭＥ ＴＣＲ、ｉＭＣポリペプチド、および表面マーカーをコードするベクター、（Ｄ）ＳＬＬ－ペプチドをパルスしたＴ２細胞のＰＲＡＭＥ ＴＣＲ認識は、最大ＩＬ－２分泌に関してリミズシド依存性ｉＭＣシグナルと相乗効果を示す。
図１１８：（Ａ）トランスウェルアッセイ設定。（Ｂ）一番上のウェル中の形質導入されたＴ細胞によって分泌されるサイトカインは、抗原非依存性であるが、ｉＭＣ依存性およびリミズシド依存性の様式で、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ神経芽腫細胞の表面上のＨＬＡクラスＩをアップレギュレートする。
図１１９（Ａ）ＨＬＡ－Ａ２＋ＰＲＡＭＥ＋ Ｕ２ＯＳ骨肉腫に対するｉＭＣ－ＰＲＡＭＥ ＴＣＲ媒介性細胞傷害性は、リミズシド非依存性である、（Ｂ）ＰＲＡＭＥ ＴＣＲからのシグナルは、リミズシド駆動性ｉＭＣ共刺激と相乗効果を示し、最大ＩＬ－２分泌を生じる。Ｇｏ１５６ ＴＣＲは、陰性コントロールＴＣＲである。
図１２０：（Ａ）ＨＬＡ－Ｂ７＋Ｂｏｂ－１＋ Ｕ２６６多発性骨髄腫に対するｉＭＣ－Ｂｏｂ－１ ＴＣＲ媒介性細胞傷害性は、リミズシド非依存性である。（Ｂ）Ｂｏｂ－１ ＴＣＲからのシグナルは、リミズシド駆動性ｉＭＣ共刺激と相乗効果を示し、最大ＩＬ－２分泌を生じる。Ｇｏ１５６ ＴＣＲは、陰性コントロールＴＣＲである。
図１２１：（Ａ）ＮＳＧマウスに、１×１０６個のルシフェラーゼ発現Ｕ２６６骨髄腫細胞を移植し、１×１０７個の非形質導入Ｔ細胞、ＰＲＡＭＥ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞またはｉＭＣ－ＰＲＡＭＥ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞で１３日目に処置した。１４日目に開始して、ｉＭＣ－ＰＲＡＭＥ形質導入Ｔ細胞を受けたマウスのうちの５匹に、３８日目まで毎週、５ｍｇ／ｋｇ リミズシドをｉ．ｐ．で与えた。（Ｂ）腫瘍成長を、バイオルミネッセンスイメージングによって測定した。（Ｃ，Ｄ）マウスを９４日目に屠殺し、その脾臓を、ヒトＴ細胞の持続性に関して分析した。ｉＭＣ共刺激は、Ｖβ１＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数を有意に増加させた（Ｃ）が、Ｖβ１＋ＣＤ４＋ Ｔ細胞の数を増加させなかった（Ｄ）。
リミズシド駆動性ｉＭＣ活性化は、形質導入されたＴ細胞において強力な共刺激シグナルを提供し、外因性ＰＲＡＭＥ特異的またはＢｏｂ１特異的ＴＣＲからのシグナルと相乗効果を示し、増強されたＴ細胞増殖／生存ならびに改善された抗腫瘍有効性をインビトロおよびインビボの両方でもたらす。
ｉＭＣ活性化は、腫瘍標的上のＨＬＡクラスＩレベルをアップレギュレートし、これは、操作されたＴ細胞および内因性Ｔ細胞の両方を介して改善された細胞傷害性をもたらすはずである。
参考文献
Ｎａｒａｙａｎａｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ｓｗｉｔｃｈ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ
ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． （２０１１） １２１：１５２４．
Ｎａｒａｙａｎａｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ＭｙＤ８８／ＣＤ４０ ｓｗｉｔｃｈ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ
ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． （２０１１） １２１：１５２４．
Ａｍｉｒ ＡＬ ｅｔ ａｌ．， ＰＲＡＭＥ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｌｌｏ－ＨＬＡ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ
ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔ細胞 ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ （２０１１） １７：５６１５．
ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔ細胞 ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ （２０１１） １７：５６１５．
実施例３３：代表的実施形態
以降で提供されるのは、本技術のある種の実施形態の例である。
実施形態Ａ１．第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸であって、ここで：
該第１のキメラポリペプチドは、第１のリガンドに結合する第１の多量体化領域を含み；
該第１の多量体化領域は、第１のリガンド結合ユニットおよび第２のリガンド結合ユニットを含み；
該第１のリガンドは、第１の部分および第２の部分を含む多量体リガンドであり；
該第１のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第１の部分に結合し、該第１のリガンドの該第２の部分には有意に結合せず；そして
該第２のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第２の部分に結合し、該第１のリガンドの該第１の部分には有意に結合しない、
核酸。
以降で提供されるのは、本技術のある種の実施形態の例である。
実施形態Ａ１．第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸であって、ここで：
該第１のキメラポリペプチドは、第１のリガンドに結合する第１の多量体化領域を含み；
該第１の多量体化領域は、第１のリガンド結合ユニットおよび第２のリガンド結合ユニットを含み；
該第１のリガンドは、第１の部分および第２の部分を含む多量体リガンドであり；
該第１のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第１の部分に結合し、該第１のリガンドの該第２の部分には有意に結合せず；そして
該第２のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第２の部分に結合し、該第１のリガンドの該第１の部分には有意に結合しない、
核酸。
実施形態Ａ２．前記第１のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域を含む、実施形態Ａ１に記載の核酸。
実施形態Ａ２．１．前記第１の多量体化領域は、前記アポトーシス促進ポリペプチド領域に対してアミノ末端側にある、実施形態Ａ２に記載の核酸。
実施形態Ａ２．２．前記第１の多量体化領域は、前記アポトーシス促進ポリペプチド領域に対してカルボキシル末端側にある、実施形態Ａ２に記載の核酸。
実施形態Ａ３．前記第１のキメラポリペプチドは、
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
ｂ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、実施形態Ａ１に記載の核酸。
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
ｂ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、実施形態Ａ１に記載の核酸。
実施形態Ａ４．第２のキメラポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１～Ａ３のいずれか１つに記載の核酸であって、ここで：
前記プロモーターは、該第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結され；
該第２のキメラポリペプチドは、第２のリガンドに結合する第２の多量体化領域を含み；
該第２の多量体化領域は、第３のリガンド結合ユニットを含み；
該第２のリガンドは、第３の部分を含む多量体リガンドであり；そして
該第３のリガンド結合ユニットは、該第２のリガンドの該第３の部分に結合し、前記第１のリガンドの前記第２の部分に有意に結合しない、核酸。
前記プロモーターは、該第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結され；
該第２のキメラポリペプチドは、第２のリガンドに結合する第２の多量体化領域を含み；
該第２の多量体化領域は、第３のリガンド結合ユニットを含み；
該第２のリガンドは、第３の部分を含む多量体リガンドであり；そして
該第３のリガンド結合ユニットは、該第２のリガンドの該第３の部分に結合し、前記第１のリガンドの前記第２の部分に有意に結合しない、核酸。
実施形態Ａ５．前記第１のリガンドの前記第１の部分および前記第２のリガンドの前記第３の部分は、同じである、実施形態Ａ４に記載の核酸。
実施形態Ａ６．前記第１のリガンドの前記第１の部分および前記第２のリガンドの前記第３の部分は異なる、実施形態Ａ４に記載の核酸。
実施形態Ａ７．前記第１の多量体化領域の前記第１のリガンド結合ユニットおよび前記第２の多量体化領域の前記第３のリガンド結合ユニットは、同じである、実施形態Ａ４に記載の核酸。
実施形態Ａ８．前記第１の多量体化領域の前記第１のリガンド結合ユニットおよび前記第２の多量体化領域の前記第３のリガンド結合ユニットは異なる、実施形態Ａ４に記載の核酸。
実施形態Ａ９．前記第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域を含み、前記第１のキメラポリペプチドは、該アポトーシス促進ポリペプチド領域を含まない、実施形態Ａ４～Ａ８のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ａ１０．前記第２のキメラポリペプチドは、
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
ｂ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含み、
ここで該第２のキメラポリペプチドの前記第２の多量体化領域は、少なくとも２個の第３の結合ユニットを含む、実施形態Ａ９に記載の核酸。
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
ｂ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含み、
ここで該第２のキメラポリペプチドの前記第２の多量体化領域は、少なくとも２個の第３の結合ユニットを含む、実施形態Ａ９に記載の核酸。
実施形態Ａ１１．前記第２のキメラポリペプチドは、ＭＣポリペプチドを含み、ここで該ＭＣポリペプチドは、
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
ｂ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含み、前記第１のキメラポリペプチドは、該ＭＣポリペプチドを含まない、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の核酸。
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
ｂ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含み、前記第１のキメラポリペプチドは、該ＭＣポリペプチドを含まない、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ａ１２．前記第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域を含む、実施形態Ａ１１に記載の核酸。
実施形態Ａ１３．前記第１のリガンド結合ユニットは、ＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２バリアントである、実施形態Ａ１～Ａ１２のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ａ１４．前記第１のリガンド結合ユニットは、ＦＫＢＰ１２である、実施形態Ａ１３に記載の核酸。
Ａ１５．前記第２のリガンド結合ユニットは、ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントである、実施形態Ａ１～Ａ１４のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ａ１６．前記第２のリガンド結合ユニットは、ＦＲＢＬである、実施形態Ａ１５に記載の核酸。
実施形態Ａ１７．前記第３のリガンド結合ユニットは、ＦＫＢＰｖ３６である、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ａ１８．前記第１のリガンド結合ユニットは、ＦＫＢＰｖ３６ではない、実施形態Ａ１７に記載の核酸。
実施形態Ａ１９．前記第１のリガンドは、ラパマイシンまたはラパログである、実施形態Ａ１～Ａ１８のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ａ２０．前記第２のリガンドは、ＡＰ１９０３である、実施形態Ａ１～Ａ１９のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ａ２１．前記第３のリガンド結合ユニットは、前記第１のリガンド結合ユニットが前記第２のリガンドの前記第３の部分に結合するより１００倍高い親和性で該第２のリガンドの該第３の部分に結合する、実施形態Ａ１～Ａ２０のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ａ２２．前記第３のリガンド結合ユニットは、前記第１のリガンド結合ユニットが前記第２のリガンドの前記第３の部分に結合するより５００倍高い親和性で該第２のリガンドの該第３の部分に結合する、実施形態Ａ１～Ａ２０のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ａ２３．前記第３のリガンド結合ユニットは、前記第１のリガンド結合ユニットが前記第２のリガンドの前記第３の部分に結合するより１０００倍高い親和性で該第２のリガンドの該第３の部分に、結合する、実施形態Ａ１～Ａ２０のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ａ２４．キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ａ１～Ａ２３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ａ２５．前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態Ａ２４に記載の核酸。
実施形態Ａ２６．キメラＴ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ａ１～Ａ２３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態Ａ２７．実施形態Ａ１～Ａ２６のいずれか１つに記載の核酸を含む、改変された細胞。
実施形態Ａ２８．第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む改変された細胞であって、ここで：
該第１のキメラポリペプチドは、第１のリガンドに結合する第１の多量体化領域を含み；
該第１の多量体化領域は、第１のリガンド結合ユニットおよび第２のリガンド結合ユニットを含み；
該第１のリガンドは、第１の部分および第２の部分を含む多量体リガンドであり；
該第１のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第１の部分に結合し、該第１のリガンドの該第２の部分に有意に結合せず；
該第２のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第２の部分に結合し、該第１のリガンドの該第１の部分に有意に結合しない、
改変された細胞。
該第１のキメラポリペプチドは、第１のリガンドに結合する第１の多量体化領域を含み；
該第１の多量体化領域は、第１のリガンド結合ユニットおよび第２のリガンド結合ユニットを含み；
該第１のリガンドは、第１の部分および第２の部分を含む多量体リガンドであり；
該第１のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第１の部分に結合し、該第１のリガンドの該第２の部分に有意に結合せず；
該第２のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第２の部分に結合し、該第１のリガンドの該第１の部分に有意に結合しない、
改変された細胞。
実施形態Ａ２９．前記第１のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域を含む、実施形態Ａ２８に記載の改変された細胞。
実施形態Ａ３０．前記第１のキメラポリペプチドは、
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
ｂ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、実施形態Ａ２８に記載の改変された細胞。
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
ｂ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、実施形態Ａ２８に記載の改変された細胞。
実施形態Ａ３１．第２のキメラポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含み、ここで：
該第２のキメラポリペプチドは、第２のリガンドに結合する第２の多量体化領域を含み；
該第２の多量体化領域は、第３のリガンド結合ユニットを含み；
該第２のリガンドは、第３の部分を含む多量体リガンドであり；そして
該第３のリガンド結合ユニットは、該第２のリガンドの該第３の部分に結合し、前記第１のリガンドの前記第２の部分に有意に結合しない、
実施形態Ａ２８～Ａ３０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
該第２のキメラポリペプチドは、第２のリガンドに結合する第２の多量体化領域を含み；
該第２の多量体化領域は、第３のリガンド結合ユニットを含み；
該第２のリガンドは、第３の部分を含む多量体リガンドであり；そして
該第３のリガンド結合ユニットは、該第２のリガンドの該第３の部分に結合し、前記第１のリガンドの前記第２の部分に有意に結合しない、
実施形態Ａ２８～Ａ３０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ３２．前記第１のリガンドの前記第１の部分および前記第２のリガンドの前記第３の部分は、同じである、実施形態Ａ３１に記載の改変された細胞。
実施形態Ａ３３．前記第１のリガンドの前記第１の部分および前記第２のリガンドの前記第３の部分は、異なる、実施形態Ａ３１に記載の改変された細胞。
実施形態Ａ３４．前記第１の多量体化領域の前記第１のリガンド結合ユニットおよび前記第２の多量体化領域の前記第３のリガンド結合ユニットは、同じである、実施形態Ａ３１に記載の改変された細胞。
実施形態Ａ３５．前記第１の多量体化領域の前記第１のリガンド結合ユニットおよび前記第２の多量体化領域の前記第３のリガンド結合ユニットは、異なる、実施形態Ａ３１に記載の改変された細胞。
実施形態Ａ３６．前記第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域を含み、前記第１のキメラポリペプチドは、該アポトーシス促進ポリペプチド領域を含まない、実施形態Ａ３１～Ａ３５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ３７．前記第２のキメラポリペプチドは、
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
ｂ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含み、
ここで該第２のキメラポリペプチドの前記第２の多量体化領域は、少なくとも２個の第３の結合ユニットを含む、
実施形態Ａ３６に記載の改変された細胞。
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
ｂ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含み、
ここで該第２のキメラポリペプチドの前記第２の多量体化領域は、少なくとも２個の第３の結合ユニットを含む、
実施形態Ａ３６に記載の改変された細胞。
実施形態Ａ３８．前記第２のキメラポリペプチドは、ＭＣポリペプチドを含み、ここで該ＭＣポリペプチドは、
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
ｂ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含み、前記第１のキメラポリペプチドは、該ＭＣポリペプチドを含まない、実施形態Ａ２８～Ａ３５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
ｂ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含み、前記第１のキメラポリペプチドは、該ＭＣポリペプチドを含まない、実施形態Ａ２８～Ａ３５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ３９．前記第２のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド領域を含む、実施形態Ａ３８に記載の改変された細胞。
実施形態Ａ４０．前記第１のリガンド結合ユニットは、ＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２バリアントである、実施形態Ａ２８～Ａ３９のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ４１．前記第１のリガンド結合ユニットは、ＦＫＢＰ１２である、実施形態Ａ４０に記載の改変された細胞。
実施形態Ａ４２．前記第２のリガンド結合ユニットは、ＦＲＢまたはＦＲＢバリアントである、実施形態Ａ２８～Ａ４１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ４３．前記第２のリガンド結合ユニットは、ＦＲＢＬである、実施形態Ａ４２に記載の改変された細胞。
実施形態Ａ４４．前記第３のリガンド結合ユニットは、ＦＫＢＰｖ３６である、実施形態Ａ２８～Ａ４３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ４５．前記第１のリガンド結合ユニットは、ＦＫＢＰｖ３６ではない、実施形態Ａ４４に記載の改変された細胞。
実施形態Ａ４６．前記第１のリガンドは、ラパマイシンまたはラパログである、実施形態Ａ２８～Ａ４５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ４７．前記第２のリガンドは、ＡＰ１９０３である、実施形態Ａ２８～Ａ４６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ４８．前記第３のリガンド結合ユニットは、前記第１のリガンド結合ユニットが前記第２のリガンドの前記第３の部分に結合するより１００倍高い親和性で該第２のリガンドの該第３の部分に結合する、実施形態Ａ２８～Ａ４７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ４９．前記第３のリガンド結合ユニットは、前記第１のリガンド結合ユニットが前記第２のリガンドの前記第３の部分に結合するより５００倍高い親和性で該第２のリガンドの該第３の部分に結合する、実施形態Ａ２８～Ａ４７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ５０．前記第３のリガンド結合ユニットは、前記第１のリガンド結合ユニットが前記第２のリガンドの前記第３の部分に結合するより１０００倍高い親和性で該第２のリガンドの該第３の部分に結合する、実施形態Ａ２８～Ａ４７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ５１．キメラ抗原レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ａ２８～Ａ５０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ５２．前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態Ａ５１に記載の改変された細胞。
実施形態Ａ５３．キメラＴ細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ａ２８～Ａ５０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ５４．
ａ）第１のキメラポリペプチドであって、ここで：
該第１のキメラポリペプチドは、第１のリガンドに結合する第１の多量体化領域を含み；該第１の多量体化領域は、第１のリガンド結合ユニットおよび第２のリガンド結合ユニットを含み；
該第１のリガンドは、第１の部分および第２の部分を含む多量体リガンドであり；
該第１のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第１の部分に結合し、該第１のリガンドの該第２の部分に有意に結合せず；そして
該第２のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第２の部分に結合し、該第１のリガンドの該第１の部分に有意に結合しない、
第１のキメラポリペプチド；および
ｂ）第２のキメラポリペプチドであって、ここで：
該第２のキメラポリペプチドは、第２のリガンドに結合する第２の多量体化領域を含み；該第２の多量体化領域は、第３のリガンド結合ユニットを含み；
該第２のリガンドは、第３の部分を含む多量体リガンドであり；そして
該第３のリガンド結合ユニットは、該第２のリガンドの該第３の部分に結合し、該第１のリガンドの該第２の部分に有意に結合しない、
第２のキメラポリペプチド、
を含む、改変された細胞。
ａ）第１のキメラポリペプチドであって、ここで：
該第１のキメラポリペプチドは、第１のリガンドに結合する第１の多量体化領域を含み；該第１の多量体化領域は、第１のリガンド結合ユニットおよび第２のリガンド結合ユニットを含み；
該第１のリガンドは、第１の部分および第２の部分を含む多量体リガンドであり；
該第１のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第１の部分に結合し、該第１のリガンドの該第２の部分に有意に結合せず；そして
該第２のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第２の部分に結合し、該第１のリガンドの該第１の部分に有意に結合しない、
第１のキメラポリペプチド；および
ｂ）第２のキメラポリペプチドであって、ここで：
該第２のキメラポリペプチドは、第２のリガンドに結合する第２の多量体化領域を含み；該第２の多量体化領域は、第３のリガンド結合ユニットを含み；
該第２のリガンドは、第３の部分を含む多量体リガンドであり；そして
該第３のリガンド結合ユニットは、該第２のリガンドの該第３の部分に結合し、該第１のリガンドの該第２の部分に有意に結合しない、
第２のキメラポリペプチド、
を含む、改変された細胞。
実施形態Ａ５５．前記第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のキメラポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ５４に記載の改変された細胞。
実施形態Ａ５６．前記第１のリガンドまたは前記第２のリガンドを含む、実施形態Ａ２８～Ａ５５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態Ａ５７．第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む核酸を含む、キットまたは組成物であって、ここで
ａ）該第１のポリヌクレオチドは、第１のキメラポリペプチドをコードし、ここで：
該第１のキメラポリペプチドは、第１のリガンドに結合する第１の多量体化領域を含み；該第１の多量体化領域は、第１のリガンド結合ユニットおよび第２のリガンド結合ユニットを含み；
該第１のリガンドは、第１の部分および第２の部分を含む多量体リガンドであり；
該第１のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第１の部分に結合し、該第１のリガンドの該第２の部分に有意に結合せず；そして
該第２のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第２の部分に結合し、該第１のリガンドの該第１の部分に有意に結合せず；そして
ｂ）該第２のポリヌクレオチドは、第２のキメラポリペプチドをコードし、ここで：
該第２のキメラポリペプチドは、ここで該第２のキメラポリペプチドは、第２のリガンドに結合する第２の多量体化領域を含み；
該第２の多量体化領域は、第３のリガンド結合ユニットを含み；
該第２のリガンドは、第３の部分を含む多量体リガンドであり；そして
該第３のリガンド結合ユニットは、該第２のリガンドの該第３の部分に結合し、該第１のリガンドの該第２の部分に有意に結合しない、
キットまたは組成物。
ａ）該第１のポリヌクレオチドは、第１のキメラポリペプチドをコードし、ここで：
該第１のキメラポリペプチドは、第１のリガンドに結合する第１の多量体化領域を含み；該第１の多量体化領域は、第１のリガンド結合ユニットおよび第２のリガンド結合ユニットを含み；
該第１のリガンドは、第１の部分および第２の部分を含む多量体リガンドであり；
該第１のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第１の部分に結合し、該第１のリガンドの該第２の部分に有意に結合せず；そして
該第２のリガンド結合ユニットは、該第１のリガンドの該第２の部分に結合し、該第１のリガンドの該第１の部分に有意に結合せず；そして
ｂ）該第２のポリヌクレオチドは、第２のキメラポリペプチドをコードし、ここで：
該第２のキメラポリペプチドは、ここで該第２のキメラポリペプチドは、第２のリガンドに結合する第２の多量体化領域を含み；
該第２の多量体化領域は、第３のリガンド結合ユニットを含み；
該第２のリガンドは、第３の部分を含む多量体リガンドであり；そして
該第３のリガンド結合ユニットは、該第２のリガンドの該第３の部分に結合し、該第１のリガンドの該第２の部分に有意に結合しない、
キットまたは組成物。
実施形態１．キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸であって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域、
を含む、核酸。
ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域、
を含む、核酸。
実施形態２．領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｃ）、（ｂ）、（ａ）である、実施形態１に記載の核酸。
実施形態３．領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）である、実施形態１に記載の核酸。
実施形態３．１．（ｂ）および（ｃ）は、前記アポトーシス促進ポリペプチドに対してアミノ末端側にある、実施形態２または３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態３．２．（ｂ）および（ｃ）は、前記アポトーシス促進ポリペプチドに対してカルボキシル末端側にある、実施形態２または３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態４．前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の間にリンカーポリペプチドをさらに含む、実施形態１～３．２のいずれか１項に記載の核酸。
実施形態５．マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態６．実施形態１～５のいずれか１つに記載の核酸によってコードされる、ポリペプチド。
実施形態７．実施形態１～５のいずれか１つに記載の核酸でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
実施形態８．
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
実施形態８．５．
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
実施形態９．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するより少なくとも１００倍高い親和性で該リガンドに結合する、実施形態８または８．５のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態９．１．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するより少なくとも５００倍高い親和性で該リガンドに結合する、実施形態８に記載の核酸。
実施形態９．２．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するより少なくとも１０００倍高い親和性で該リガンドに結合する、実施形態８に記載の核酸。
実施形態１０．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態８に記載の核酸。
実施形態１１．
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２ ｖ３６領域；
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレチド
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２ ｖ３６領域；
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレチド
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
実施形態１２．領域（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の順序は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉｉｉ）、（ｉｉ）、（ｉ）である、実施形態８～１１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１３．領域（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の順序は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉ）である、実施形態８～１１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１４．前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の間にリンカーポリペプチドをさらに含む実施形態８～１３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１５．前記核酸は、前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１のポリヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、実施形態８～１４のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１６．前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、実施形態１５に記載の核酸。
実施形態１７．前記プロモーターは、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結される、実施形態８～１６のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１７．１．マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態８～１７のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１８．前記プロモーターは、発生的に制御される、実施形態１～５または８～１７．１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態１９．前記プロモーターは、組織特異的である、実施形態１～５または８～１７．１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２０．前記プロモーターは、活性化Ｔ細胞において活性化される、実施形態１～５または８～１９のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２１．キメラ抗原レセプターをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態８～２０のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２２．前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態２１に記載の核酸。
実施形態２３．キメラＴ細胞レセプターをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態８～２０のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２４．前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチドおよび、および前記第３のポリヌクレオチドの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１のポリヌクレオチド、該第２のポリヌクレオチド、および該第３のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、実施形態２１～２３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２５．前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、および前記第３のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、実施形態２４に記載の核酸。
実施形態２６．実施形態８～２５のいずれか１つに記載の核酸で形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞。
実施形態２７．
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
実施形態２７．５．
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
実施形態２８．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するより少なくとも１／１００の低い親和性で該リガンドに結合する、実施形態２７および２７．５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２９．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するより少なくとも１／５００の低い親和性で該リガンドに結合する、実施形態２７に記載の改変された細胞。
実施形態３０．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するより少なくとも１／１０００の低い親和性で該リガンドに結合する、実施形態２７に記載の改変された細胞。
実施形態３１．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態２７～３０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態３１．１．前記リガンドは、ＡＰ１９０３である、実施形態３１に記載の改変された細胞。
実施形態３２．改変された細胞であって、
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２ ｖ３６領域；
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
ａ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２ ｖ３６領域；
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
実施形態３３．領域（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の順序は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉｉｉ）、（ｉｉ）、（ｉ）である、実施形態２７～３２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態３４．領域（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の順序は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉ）である、実施形態２７～３２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態３５．前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の間にリンカーポリペプチドをさらに含む、実施形態２７～３４のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態３６．前記細胞は、キメラ抗原レセプターをさらに含む、実施形態２６～３５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態３７．前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態３６に記載の改変された細胞。
実施形態３８．前記細胞は、キメラＴ細胞レセプターをさらに含む、実施形態２６～３５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態３９．前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、実施形態７または実施形態Ａ２７～Ａ５６に記載の改変された細胞。
実施形態４０．前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態７または実施形態Ａ２７～Ａ５６に記載の改変された細胞。
実施形態４１．前記細胞は、初代Ｔ細胞である、実施形態７または実施形態Ａ２７～Ａ５６に記載の改変された細胞。
実施形態４２．前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、実施形態７または実施形態Ａ２７～Ａ５６に記載の改変された細胞。
実施形態４３．前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、実施形態７または実施形態Ａ２７～Ａ５６に記載の改変された細胞。
実施形態４４．前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、実施形態７または実施形態Ａ２７～Ａ５６に記載の改変された細胞。
実施形態４５．前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、実施形態７または３９～４４または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態４６．前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、実施形態７または３９～４４または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態４７．前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、実施形態７または３９～４４または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態４８．前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、実施形態７または３９～４４または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
４９．前記細胞は、ヒト細胞である、実施形態７または３９～４８または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態５０．前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、実施形態７または３９～４９または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態５１．前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態７または３９～５０または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態５２．前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、実施形態２６～３８または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態５３．前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態２６～３８または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態５４．前記細胞は、初代Ｔ細胞である、実施形態２６～３８または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態５５．前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、実施形態２６～３８または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態５６．前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、実施形態２６～３８または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態５７．前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、実施形態２６～３８または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態５８．前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、実施形態２６～３８または５２～５７または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態５９．前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、実施形態２６～３８または５２～５７または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態６０．前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、実施形態２６～３８または５２～５７または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態６１．前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、実施形態２６～３８または５２～５７または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態６２．前記細胞は、ヒト細胞である、実施形態２６～３８または５２～６１または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態６３．前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、実施形態２６～３８または５２～６２または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態６４．前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態２６～３８または５２～６３または実施形態Ａ２７～Ａ５６のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態６４．１．
ａ）第１のキメラアポトーシス促進ポリペプチドであって、該キメラポトーシス促進ポリペプチドは（ａ ｆｉｒｓｔ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏ－ａｐｏｐ ｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のキメラポトーシス促進ポリペプチド
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、キメラ共刺激ポリペプチド、
を含む、改変された細胞。
ａ）第１のキメラアポトーシス促進ポリペプチドであって、該キメラポトーシス促進ポリペプチドは（ａ ｆｉｒｓｔ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏ－ａｐｏｐ ｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のキメラポトーシス促進ポリペプチド
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、キメラ共刺激ポリペプチド、
を含む、改変された細胞。
実施形態６４．２．
ａ）第１のキメラアポトーシス促進ポリペプチドであって、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは（ａ ｆｉｒｓｔ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏ－ａｐｏｐ ｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のキメラアポトーシス促進ポリペプチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、
を含む、キメラ共刺激ポリペプチド、
を含む、改変された細胞。
ａ）第１のキメラアポトーシス促進ポリペプチドであって、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは（ａ ｆｉｒｓｔ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏ－ａｐｏｐ ｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のキメラアポトーシス促進ポリペプチド、ならびに
ｂ）キメラ共刺激ポリペプチドであって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域、
を含む、キメラ共刺激ポリペプチド、
を含む、改変された細胞。
実施形態６４．２．前記第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、請求項６４．１または６４．２に記載の改変された細胞。
実施形態６４．３．第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む核酸を含む、キットまたは組成物であって、ここで
ａ）該第１のポリヌクレオチドは、キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードし、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含み、そして
ｂ）該第２のポリヌクレオチドは、キメラ共刺激ポリペプチドをコードし、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、キットまたは組成物。
ａ）該第１のポリヌクレオチドは、キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードし、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
（ｉ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
（ｉｉ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
（ｉｉｉ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含み、そして
ｂ）該第２のポリヌクレオチドは、キメラ共刺激ポリペプチドをコードし、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
（ｉ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；
（ｉｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域、
を含む、キットまたは組成物。
実施形態６５．前記マーカーポリペプチドは、ΔＣＤ１９ポリペプチドである、実施形態５、７、または１７．１～６４、または実施形態Ａ１～Ａ５６のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態６６．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態１～９、１２～３１．１、または３３～６５のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態６７．ＦＫＢＰバリアント領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態６６に記載の核酸または細胞。
実施形態６８．前記ＦＲＢバリアント領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、実施形態１～６７のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態６９．前記ＦＲＢバリアント領域は、ＦＲＢＬである、実施形態１～６７のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態７０．前記ＦＲＢバリアント領域は、Ｓ－ｏ，ｐ－ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）－ラパマイシン、Ｒ－イソプロポキシラパマイシン、およびＳ－ブタンスルホンアミドラプ（Ｓ－Ｂｕｔａｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｏｒａｐ）からなる群より選択されるラパログに結合する、実施形態１～６９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態７１．前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｃｌ－２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１－ＲＨＩＭからなる群より選択される、実施形態１～７０のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態７２．前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、実施形態１～７１のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態７３．前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ－９ポリペプチドである、実施形態８４に記載の核酸または細胞。
実施形態７４．前記カスパーゼ－９ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠く、実施形態７３に記載の核酸または細胞（ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｏｆ ｃｅｌｌ）。
実施形態７５．前記カスパーゼポリペプチドは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む、実施形態７３または７４のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態７６．前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６の中の触媒として活性なカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、実施形態７３または７４のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態７７．前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、実施形態７６に記載の核酸または細胞。
実施形態７８．前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４のアミノ酸配列、またはこれらの機能的フラグメントを有する、実施形態８～３８または５２～７７のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態７９．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態８～３８または５２～７７のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態８０．前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態８～３８または５２～７７のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態８１．前記Ｔ細胞レセプターは、ＰＲＡＭＥ、Ｂｏｂ－１、およびＮＹ－ＥＳＯ－１からなる群より選択される抗原性ポリペプチドに結合する、実施形態２３、２６、３８または５２～６４のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態８２．前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、実施形態２２、２６、３７、５２～８０のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態８３．前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、実施形態２２、２６、３７、５２～８０、または８２のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態８４．前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、実施形態２２、２６、３７、５２～８０、または８２～８３のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態８５．前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態２２、２６、３７、５２～８０、または８２～８４のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態８６．前記核酸は、ウイルスベクター内に含まれる、実施形態１～５、８～２５、または６５～８５のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態８７．前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルスベクター、ＳＦＧベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群より選択される、実施形態８６に記載の核酸。
実施形態８８．前記核酸は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、もしくはバイオリスティックのために調製されるかまたはエレクトロポレーション、ソノポレーション、もしくはバイオリスティックのためにデザインされたベクターの中に存在するか、あるいは化学的脂質、ポリマー、無機ナノ粒子、もしくはポリプレックスに結合されるかまたは化学的脂質、ポリマー、無機ナノ粒子、もしくはポリプレックスの中に組み込まれる、実施形態１～５、８～２５、または６５～８７のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態８９．前記核酸は、プラスミド内に含まれる、実施形態１～５、８～２５、または６５～８５のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態９０．実施例２３または２５の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態１～８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態９１．ＦＫＢＰｖ３６、ＦｐＫ’、ＦｐＫ、Ｆｖ、Ｆｖ’、ＦＫＢＰｐＫ’、ＦＫＢＰｐＫ’’、およびＦＫＢＰｐＫ’’’からなる群より選択される実施例２３または２５の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態１～８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態９２．ＦＲＰ５－ＶＬ、ＦＲＰ５－ＶＨ、ＦＭＣ６３－ＶＬ、およびＦＭＣ６３－ＶＨからなる群より選択される実施例２３または２５の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態１～８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態９３．ＦＲＰ５－ＶＬおよびＦＲＰ５－ＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態１～８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態９４．ＦＭＣ６３－ＶＬおよびＦＭＣ６３－ＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態１～８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態９５．ＭｙＤ８８ＬおよびＭｙＤ８８からなる群より選択される実施例２３または２５の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態１～８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態９６．実施例２３または２５の表の中に提供されるΔカスパーゼ－９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態１～８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態９７．実施例２３または２５の表の中に提供されるΔＣＤ１８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態１～８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態９８．実施例２３または２５の表の中に提供されるｈＣＤ４０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態１～８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態９９．実施例２３または２５の表の中に提供されるＣＤ３ゼータポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態１～８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態１００．留保。
実施形態１０１．被験体において免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態Ａ２７～Ａ５６、２６～３８、または５２～８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を、該被験体に移植すること、および
ｂ）（ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与して、細胞媒介性免疫応答を刺激すること、
を包含する方法。
ａ）実施形態Ａ２７～Ａ５６、２６～３８、または５２～８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を、該被験体に移植すること、および
ｂ）（ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与して、細胞媒介性免疫応答を刺激すること、
を包含する方法。
実施形態１０２．改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがあるヒト被験体にリガンドを投与するための方法であって、該方法は、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰバリアント領域に結合するリガンドを該ヒト被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、実施形態Ａ２７～Ａ５６、２６～３８、または５２～８５のいずれか１項に記載の改変された細胞を含む、方法。
実施形態１０３．被験体において移植された、改変された細胞の活性を調節するための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態Ａ２７～Ａ５６、２６～３８、または５２～８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を移植すること；および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与して、該移植された、改変された細胞の活性を刺激すること、
を包含する方法。
ａ）実施形態Ａ２７～Ａ５６、２６～３８、または５２～８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を移植すること；および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与して、該移植された、改変された細胞の活性を刺激すること、
を包含する方法。
実施形態１０４．標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
（ａ）有効量の改変された細胞を該被験体に移植することであって；ここで該改変された細胞は、実施形態Ａ２７～Ａ５６、２６～３８、または５２～８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと、および
（ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与して、該被験体における標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させること、
を包含する方法。
（ａ）有効量の改変された細胞を該被験体に移植することであって；ここで該改変された細胞は、実施形態Ａ２７～Ａ５６、２６～３８、または５２～８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと、および
（ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与して、該被験体における標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させること、
を包含する方法。
実施形態１０５．前記標的抗原は、腫瘍抗原である、実施形態１０４に記載の方法。
実施形態１０６．標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
（ａ）該被験体に有効量の改変された細胞を投与することであって、ここで該改変された細胞は、実施形態Ａ２７～Ａ５６、２６～３８、または５２～８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原を認識し該標的抗原に結合するキメラＴ細胞レセプターを含む、こと、および
（ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与して、該被験体において標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させること、
を包含する方法。
（ａ）該被験体に有効量の改変された細胞を投与することであって、ここで該改変された細胞は、実施形態Ａ２７～Ａ５６、２６～３８、または５２～８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原を認識し該標的抗原に結合するキメラＴ細胞レセプターを含む、こと、および
（ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与して、該被験体において標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させること、
を包含する方法。
実施形態１０７．被験体において腫瘍のサイズを減少させるための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態Ａ２７～Ａ５６、２６～３８、または５２～８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に投与することであって、ここで該細胞は、該腫瘍上の抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと；および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与して、該被験体において腫瘍のサイズを減少させること、
を包含する方法。
ａ）実施形態Ａ２７～Ａ５６、２６～３８、または５２～８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に投与することであって、ここで該細胞は、該腫瘍上の抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと；および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ共刺激ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与して、該被験体において腫瘍のサイズを減少させること、
を包含する方法。
実施形態１０８．第２のリガンドの投与前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、該リガンドの投与後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を決定することを包含する、実施形態１０４～１０７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０９．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、実施形態１０８に記載の方法。
実施形態１１０．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増加している、実施形態１０８に記載の方法。
実施形態１１１．前記被験体は、前記改変された細胞の投与前または前記改変された細胞の投与と同時に幹細胞移植を受けたことがある、実施形態１０１～１１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１２．少なくとも１×１０６個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞は、前記被験体に投与される、実施形態１０１～１１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１３．少なくとも１×１０７個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞は、前記被験体に投与される、実施形態１０１～１１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１４．少なくとも１×１０８個の改変された細胞は、前記被験体に投与される、実施形態１０１～１１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１４．１．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６であり、該ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンドは、ＡＰ１９０３である、実施形態１０１～１１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１５．被験体において移植された、改変された細胞の生存を調節するための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態Ａ２７～Ａ５６、２６～３８、５２～６４または６５～８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に移植すること、および
ｂ） （ａ）の後に、該被験体に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの３０％未満を殺滅するために有効な量で投与すること、
を包含する方法。
ａ）実施形態Ａ２７～Ａ５６、２６～３８、５２～６４または６５～８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に移植すること、および
ｂ） （ａ）の後に、該被験体に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの３０％未満を殺滅するために有効な量で投与すること、
を包含する方法。
実施形態１１６．（ｂ）の後に、前記被験体に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの３０％未満を殺滅するために有効な量で投与することをさらに包含する、実施形態１０１～１１４．１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１６．１．前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも３０％を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態１１６に記載の方法。
実施形態１１７．前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの４０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態１１５または１１６いずれか１つに記載の方法。
実施形態１１８．前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの５０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態１１５または１１６いずれか１つに記載の方法。
実施形態１１９．前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの６０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態１１５または１１６いずれか１つに記載の方法。
実施形態１２０．前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの７０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態１１５または１１６いずれか１つに記載の方法。
実施形態１２１．前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの９０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態１１５または１１６いずれか１つに記載の方法。
実施形態１２２．前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態１１５または１１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２３．前記ラパマイシンまたはラパログは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９５％を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態１１５または１１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２４．前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、ＦＲＢＬ領域を含む、実施形態１１５～１１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２５．前記リガンドの１より多くの用量は、前記被験体に投与される、実施形態１０１～１１４．１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２６．前記ラパマイシンまたはラパログの１より多くの用量は、前記被験体に投与される、実施形態１１５～１２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２７．
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へラパマイシンもしくはラパログを投与すること、該被験体へのラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持すること、または該被験体への該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、実施形態１０１～１２５のいずれか１つに記載の方法。
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へラパマイシンもしくはラパログを投与すること、該被験体へのラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持すること、または該被験体への該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、実施形態１０１～１２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２８．
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を含む情報を受け取ること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へラパマイシンもしくはラパログを投与すること、該被験体へのラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持すること、または該被験体への該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、実施形態１０１～１２５のいずれか１つに記載の方法。
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を含む情報を受け取ること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へラパマイシンもしくはラパログを投与すること、該被験体へのラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持すること、または該被験体への該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、実施形態１０１～１２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２９．
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体にラパマイシンもしくは該ラパログを投与するか、該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整する意思決定者に、該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージを伝達すること、
をさらに包含する、実施形態１０１～１２５のいずれか１つに記載の方法。
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体にラパマイシンもしくは該ラパログを投与するか、該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整する意思決定者に、該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージを伝達すること、
をさらに包含する、実施形態１０１～１２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３０．
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体に該ラパマイシンもしくは該ラパログを投与するか、該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整する指示を伝達すること、
をさらに包含する、実施形態１０１～１２５のいずれか１つに記載の方法。
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体に該ラパマイシンもしくは該ラパログを投与するか、該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該ラパマイシンもしくは該ラパログのその後の投与量を調整する指示を伝達すること、
をさらに包含する、実施形態１０１～１２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３１．前記被験体は、がんを有する、実施形態１０１～１３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３２．前記改変された細胞は、腫瘍床に送達される、実施形態１０１～１３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３３．前記がんは、前記被験体の血液または骨髄に存在する、実施形態１３１または１３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３４．前記被験体は、血液または骨髄の疾患を有する、実施形態１０１～１３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３５．前記被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態１０１～１３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３６．前記患者は、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン異常症、代謝状態、および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態１０１～１３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３７．前記患者は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ－１０欠損症／ＩＬ－１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、および大理石骨病からなる群より選択される疾患または状態と診断されている、実施形態１０１～１３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３８．キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現するための方法であって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域、
を含み、該方法は、
実施形態１～６のいずれか１つに記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させことを含み、それによって、該細胞が前記第１のおよび前記第２のキメラポリペプチドを、該組み込まれた核酸から発現する方法。
ａ）アポトーシス促進ポリペプチド領域；
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域、
を含み、該方法は、
実施形態１～６のいずれか１つに記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させことを含み、それによって、該細胞が前記第１のおよび前記第２のキメラポリペプチドを、該組み込まれた核酸から発現する方法。
実施形態１３９．前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、実施形態１３８に記載の方法。
実施形態１４０．前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、実施形態１３８に記載の方法。
実施形態１４１～２００． 留保。
実施形態２０１．キメラ共刺激ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸であって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域、
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域、
を含む、核酸。
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域、
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域、
を含む、核酸。
実施形態２０２．領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序は、前記キメラ共刺激ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｃ）、（ｂ）、（ａ）である、実施形態２０１に記載の核酸。
実施形態２０３．領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序は、前記キメラ共刺激ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）である、実施形態２０１に記載の核酸。
実施形態２０４．前記キメラ共刺激ポリペプチドの領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の間にリンカーポリペプチドをさらに含む、実施形態２０１～２０３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２０５．マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態２０１～２０４のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２０６． 実施形態２０１～２０５のいずれか１つに記載の核酸によってコードされる、ポリペプチド
実施形態２０７．実施形態２０１～２０５のいずれか１つに記載の核酸でトランスフェクトまたは形質導入された、改変された細胞。
実施形態２０８．
キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
ｂ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
ｂ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
実施形態２０８．１．
キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、共刺激ポリペプチド領域；
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
ｂ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域を含む、共刺激ポリペプチド領域；
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；および
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
ｂ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
実施形態２０９．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するより少なくとも１／１００の低い親和性で該リガンドに結合する、実施形態２０８に記載の核酸。
実施形態２０９．１．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するより少なくとも１／５００の低い親和性で該リガンドに結合する、実施形態２０８に記載の核酸。
実施形態２０９．２．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するより少なくとも１／１０００の低い親和性で該リガンドに結合する、実施形態２０８に記載の核酸。
実施形態２１０．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態２０８に記載の核酸。
実施形態２１１．
キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域、
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２ｖ３６領域；および
ｂ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域、
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２ｖ３６領域；および
ｂ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
に作動可能に連結されたプロモーターを含む、核酸。
実施形態２１２．領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序は、前記キメラ共刺激ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｃ）、（ｂ）、（ａ）である、実施形態２０８～２１１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２１３．領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序は、前記キメラ共刺激ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）である、実施形態２０８～２１１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２１４．前記キメラ共刺激ポリペプチドの領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の間にリンカーポリペプチドをさらに含む、実施形態２０８～２１３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２１５．前記核酸は、前記第１のおよび前記第２のポリヌクレオチドの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１のポリヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、実施形態２０８～２１４のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２１６．前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、実施形態２１５に記載の核酸。
実施形態２１７．前記プロモーターは、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結される、実施形態２０８～２１６のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２１７．１．マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態２０８～２１７のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２１８．前記プロモーターは、発生的に制御される、実施形態２０１～２０５または２０８～２１７．１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２１９．前記プロモーターは、組織特異的である、実施形態２０１～２０５または２０８～２１７．１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２２０．前記プロモーターは、活性化Ｔ細胞において活性化される、実施形態２０１～２０５または２０８～２１９のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２２１．キメラ抗原レセプターをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態２０８～２２０のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２２２．前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態２１に記載の核酸。
実施形態２２３．キメラＴ細胞レセプターをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態２０８～２２０のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２２４．前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、および前記第３のポリヌクレオチドの間にリンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで該リンカーポリペプチドは、翻訳中または翻訳後に、該第１のポリヌクレオチドおよび該第２のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する、実施形態２２１～２２３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２２５．前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、および前記第３のポリヌクレオチドの翻訳生成物を分断する前記リンカーポリペプチドは、２Ａポリペプチドである、実施形態２２４に記載の核酸。
実施形態２２６．実施形態２０８～２２５のいずれか１つに記載の核酸で形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞。
実施形態２２７．
キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；
ｂ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；
ｂ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
実施形態２２８．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するより少なくとも１／１００の低い親和性で該リガンドに結合する、実施形態２２７に記載の改変された細胞。
実施形態２２９．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するより少なくとも１／５００の低い親和性で該リガンドに結合する、実施形態２２７に記載の改変された細胞。
実施形態２３０．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、リガンドが前記ＦＫＢＰ１２領域に結合するより少なくとも１／１０００の低い親和性で該リガンドに結合する、実施形態２２７に記載の改変された細胞。
実施形態２３１．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態２２７～２３０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２３１．１．前記リガンドは、ＡＰ１９０３である、実施形態２３１に記載の改変された細胞。
実施形態２３２．
キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２ ｖ３６領域；
ｂ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２ ｖ３６領域；
ｂ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
実施形態２３３．領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序は、前記キメラ共刺激ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｃ）、（ｂ）、（ａ）である、実施形態２２７～２３２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２３４．領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序は、前記キメラ共刺激ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって、（ｂ）、（ｃ）、（ａ）である、実施形態２２７～２３２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２３５．前記キメラ共刺激ポリペプチドの領域（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の間にリンカーポリペプチドをさらに含む、実施形態２２７～２３５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２３６．前記細胞は、キメラ抗原レセプターをさらに含む、実施形態２２６～２３４のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２３７．前記キメラ抗原レセプターは、（ｉ）膜貫通領域、（ｉｉ）Ｔ細胞活性化分子、および（ｉｉｉ）抗原認識部分を含む、実施形態２３６に記載の改変された細胞。
実施形態２３８．前記細胞は、キメラＴ細胞レセプターをさらに含む、実施形態２２６～２３５のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２３９．前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、実施形態２０７に記載の改変された細胞。
実施形態２４０．前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態２０７に記載の改変された細胞。
実施形態２４１．前記細胞は、初代Ｔ細胞である、実施形態２０７に記載の改変された細胞。
実施形態２４２．前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、実施形態２０７に記載の改変された細胞。
実施形態２４３．前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、実施形態２０７に記載の改変された細胞。
実施形態２４４．前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、実施形態２０７に記載の改変された細胞。
実施形態２４５．前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、実施形態２０７または２３９～２４４のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２４６．前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、実施形態２０７または２３９～２４４のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２４７．前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、実施形態２０７または２３９～２４４のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２４８．前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、実施形態２０７または２３９～２４４のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２４９．前記細胞は、ヒト細胞である、実施形態２０７または２３９～２４８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２５０．前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、実施形態２０７または２３９～２４９のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２５１．前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態２０７または２３９～２５０のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２５２．前記細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である、実施形態２２６～２３８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２５３．前記細胞は、Ｔ細胞である、実施形態２２６～２３８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２５４．前記細胞は、初代Ｔ細胞である、実施形態２２６～２３８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２５５．前記細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である、実施形態２２６～２３８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２５６．前記細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、非リンパ球性造血細胞、非造血細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノーマ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはＴ細胞からなる群より選択される、実施形態２２６～２３８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２５７．前記Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である、実施形態２２６～２３８のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２５８．前記細胞は、骨髄から得られるかまたは骨髄から調製される、実施形態２２６～２３８または２５２～２５７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２５９．前記細胞は、臍帯血から得られるかまたは臍帯血から調製される、実施形態２２６～２３８または２５２～２５７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２６０．前記細胞は、末梢血から得られるかまたは末梢血から調製される、実施形態２２６～２３８または２５２～２５７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２６１．前記細胞は、末梢血単核細胞から得られるかまたは末梢血単核細胞から調製される、実施形態２２６～２３８または２５２～２５７のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２６２．前記細胞は、ヒト細胞である、実施形態２２６～２３８または２５２～２６１のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２６３．前記改変された細胞は、インビボで形質導入またはトランスフェクトされる、実施形態２２６～２３８または２５２～２６２のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２６４．前記細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、バイオリスティック（例えば、Ａｕ粒子での遺伝子銃）、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群より選択される方法を使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトまたは形質導入される、実施形態２２６～２３８または２５２～２６３のいずれか１つに記載の改変された細胞。
実施形態２６４．１．
ａ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域
ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
ａ）キメラ共刺激ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドであって、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域
ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ）キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、第２のポリヌクレオチド、
を含む、改変された細胞。
実施形態２６４．２．前記第１のキメラポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態２６４．１に記載の改変された細胞。
実施形態２６４．３．第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む核酸を含む、キットまたは組成物であって、ここで
該第１のポリヌクレオチドは、キメラ共刺激ポリペプチドをコードし、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含み、そして
該第２のポリヌクレオチドは、キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードし、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
ｂ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、
キットまたは組成物。
該第１のポリヌクレオチドは、キメラ共刺激ポリペプチドをコードし、該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域；
を含み、そして
該第２のポリヌクレオチドは、キメラアポトーシス促進ポリペプチドをコードし、ここで該キメラアポトーシス促進ポリペプチドは、
ａ）２個のＦＫＢＰ１２バリアント領域；および
ｂ）アポトーシス促進ポリペプチド領域、
を含む、
キットまたは組成物。
実施形態２６５．前記マーカーポリペプチドは、ΔＣＤ１９ポリペプチドである、実施形態２０５、２０７、または２１７．１～２６４のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２６６．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択される３６位でのアミノ酸置換を有する、実施形態１０２～１０９、２１２～２３１．１、または２３３～２６５のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２６７．ＦＫＢＰバリアント領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６領域である、実施形態２６６に記載の核酸または細胞。
実施形態２６８．前記ＦＲＢバリアント領域は、ＫＬＷ（Ｔ２０９８Ｌ）、ＫＴＦ（Ｗ２１０１Ｆ）、およびＫＬＦ（Ｔ２０９８Ｌ、Ｗ２１０１Ｆ）からなる群より選択される、実施形態２０１～２６７のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２６９．前記ＦＲＢバリアント領域は、ＦＲＢＬである、実施形態２０１～２６７のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２７０．前記ＦＲＢバリアント領域は、Ｓ－ｏ，ｐ－ジメトキシフェニル（ＤＭＯＰ）－ラパマイシン、Ｒ－イソプロポキシラパマイシン、およびＳ－ブタンスルホンアミドラプ（Ｓ－Ｂｕｔａｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｏｒａｐ）からなる群より選択されるラパログに結合する、実施形態２０１～２６９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２７１．前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、またはカスパーゼ１４、ＦＡＤＤ（ＤＥＤ）、ＡＰＡＦ１（ＣＡＲＤ）、ＣＲＡＤＤ／ＲＡＩＤＤ ＣＡＲＤ）、ＡＳＣ（ＣＡＲＤ）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｃｌ－２、ＲＩＰＫ３、およびＲＩＰＫ１－ＲＨＩＭからなる群より選択される、２０１～２７０のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２７２．前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼポリペプチドである、実施形態２０８～２７１のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２７３．前記アポトーシス促進ポリペプチドは、カスパーゼ－９ポリペプチドである、実施形態２８４に記載の核酸または細胞。
実施形態２７４．前記カスパーゼ－９ポリペプチドは、ＣＡＲＤドメインを欠く、実施形態２７３に記載の核酸または細胞（ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｏｆ ｃｅｌｌ）。
実施形態２７５．前記カスパーゼポリペプチドが、配列番号３００のアミノ酸配列を含む、実施形態２７３または２７４のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２７６．前記カスパーゼポリペプチドは、表５または表６の中の触媒として活性なカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、実施形態２７３または２７４のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２７７．前記カスパーゼポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、およびＮ４０５Ｑからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼ－９ポリペプチドである、実施形態２７６に記載の核酸または細胞。
実施形態２７８．前記短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２１４のアミノ酸配列、またはこれらの機能的フラグメントを有する、実施形態２０１～２７７のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２７９．前記ＭｙＤ８８ポリペプチドは、配列番号２８２のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態２０１～２７７のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２８０．前記細胞質ＣＤ４０ポリペプチドは、配列番号２１６のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、実施形態２０１～２７７のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２８１．前記Ｔ細胞レセプターは、ＰＲＡＭＥ、Ｂｏｂ－１、およびＮＰ－ＥＳＯ－１からなる群より選択される抗原性ポリペプチドに結合する、実施形態２２３、２２６、３８、または２５２～２８０のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２８２．前記抗原認識部分は、腫瘍細胞上の抗原、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ＣＤ１９、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、Ｍｕｃ１、ＲＯＲ１、メソテリン、ＧＤ２、ＣＤ１２３、Ｍｕｃ１６、ＣＤ３３、ＣＤ３８、およびＣＤ４４ｖ６からなる群より選択される抗原に結合する、実施形態２２２、２２６、２３７、または２５２～２８０のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２８３．前記Ｔ細胞活性化分子は、ＩＴＡＭを含みシグナル１を与える分子、ＣＤ３ζポリペプチド、およびＦｃイプシロンレセプターガンマ（ＦｃεＲ１γ）サブユニットポリペプチドからなる群より選択される、実施形態２２２、２２６、２３７、２５２～２８０、または２８２のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２８４．前記抗原認識部分は、一本鎖可変フラグメントである、実施形態２２２、２２６、２３７、２５２～２８０、または２８２～２８３のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２８５．前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である、実施形態２２２、２２６、２３７、２５２～２８０、または２８２～２８４のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２８６．前記核酸は、ウイルスベクター内に含まれる、実施形態２０１～２０５、２０８～２２５、または２６５～２８５のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２８７．前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルスベクター、ＳＦＧベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群より選択される、実施形態２８６に記載の核酸。
実施形態２８８．前記核酸は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、もしくはバイオリスティックのために調製されるかまたはエレクトロポレーション、ソノポレーション、もしくはバイオリスティックのためにデザインされたベクターの中に存在するか、あるいは化学的脂質、ポリマー、無機ナノ粒子、もしくはポリプレックスに結合されるかまたは化学的脂質、ポリマー、無機ナノ粒子、もしくはポリプレックスの中に組み込まれる、実施形態２０１～２０５、２０８～２２５、または２６５～２８７のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２８９．前記核酸は、プラスミド内に含まれる、実施形態２０１～２０５、２０８～２２５、または２６５～２８５のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態２９０．実施例２３または２５の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態２０１～２８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２９１．ＦＫＢＰｖ３６、ＦｐＫ’、ＦｐＫ、Ｆｖ、Ｆｖ’、ＦＫＢＰｐＫ’、ＦＫＢＰｐＫ’’、およびＦＫＢＰｐＫ’’’からなる群より選択される実施例２３または２５の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態２０１～２８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２９２．ＦＲＰ５－ＶＬ、ＦＲＰ５－ＶＨ、ＦＭＣ６３－ＶＬ、およびＦＭＣ６３－ＶＨからなる群より選択される実施例２３または２５の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態２０１～２８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２９３．ＦＲＰ５－ＶＬおよびＦＲＰ５－ＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態２０１～２８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２９４．ＦＭＣ６３－ＶＬおよびＦＭＣ６３－ＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態２０１～２８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２９５．ＭｙＤ８８ＬおよびＭｙＤ８８からなる群より選択される実施例２３または２５の表の中に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態２０１～２８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２９６．実施例２３または２５の表の中に提供されるΔカスパーゼ－９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態２０１～２８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２９７．実施例２３または２５の表の中に提供されるΔＣＤ１８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態２０１～２８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２９８．実施例２３または２５の表の中に提供されるｈＣＤ４０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態２０１～２８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態２９９．実施例２３または２５の表の中に提供されるＣＤ３ゼータポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態２０１～２８９のいずれか１つに記載の核酸または細胞。
実施形態３００．留保。
実施形態３０１．被験体において免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態２２６～２３８、２５２～２６４、または２６５～２８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を、該被験体に移植すること、および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、細胞媒介性免疫応答を刺激すること、
を包含する方法。
ａ）実施形態２２６～２３８、２５２～２６４、または２６５～２８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を、該被験体に移植すること、および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、細胞媒介性免疫応答を刺激すること、
を包含する方法。
実施形態３０２．改変された細胞を使用する細胞治療を受けたことがあるヒト被験体にリガンドを投与するための方法であって、該方法は、ラパマイシンまたはラパログを、該ヒト被験体に投与することを包含し、ここで該改変された細胞は、実施形態２２６～２３８、２５２～２６４、または２６５～２８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を含む、方法。
実施形態３０３．被験体において移植された、改変された細胞の活性を調節するための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態２２６～２３８または２５２～２８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を移植すること；および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該移植された、改変された細胞の活性を刺激すること、
を包含する方法。
ａ）実施形態２２６～２３８または２５２～２８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を移植すること；および
ｂ） （ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該移植された、改変された細胞の活性を刺激すること、
を包含する方法。
実施形態３０４．標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
（ａ）有効量の改変された細胞を該被験体に移植することであって；ここで該改変された細胞は、実施形態２２６～２３８または２５２～２８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと、および
（ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該被験体において標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させること、
を包含する方法。
（ａ）有効量の改変された細胞を該被験体に移植することであって；ここで該改変された細胞は、実施形態２２６～２３８または２５２～２８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと、および
（ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該被験体において標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させること、
を包含する方法。
実施形態３０５．前記標的抗原は、腫瘍抗原である、実施形態３０４に記載の方法。
実施形態３０６．標的細胞によって発現される標的抗原の上昇した発現と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、
（ａ）該被験体に、有効量の改変された細胞を投与することであって、ここで該改変された細胞は、実施形態２２６～２３８または２５２～２８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原を認識しかつ該標的抗原に結合するキメラＴ細胞レセプターを含む、こと、および
（ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該被験体において標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させること、
を包含する方法。
（ａ）該被験体に、有効量の改変された細胞を投与することであって、ここで該改変された細胞は、実施形態２２６～２３８または２５２～２８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を含み、ここで該改変された細胞は、該標的抗原を認識しかつ該標的抗原に結合するキメラＴ細胞レセプターを含む、こと、および
（ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該被験体において標的抗原または標的細胞の数または濃度を減少させること、
を包含する方法。
実施形態３０７．被験体において腫瘍のサイズを減少させるための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態２２６～２３８または２５２～２８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に投与することであって、ここで該細胞は、該腫瘍上の抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと；および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該被験体において腫瘍のサイズを減少させること、
を包含する方法。
ａ）実施形態２２６～２３８または２５２～２８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に投与することであって、ここで該細胞は、該腫瘍上の抗原に結合する抗原認識部分を含むキメラ抗原レセプターを含む、こと；および
ｂ） ａ）の後に、有効量の、前記キメラ刺激ポリペプチドの前記ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域に結合するラパマイシンまたはラパログを投与して、該被験体において腫瘍のサイズを減少させること、
を包含する方法。
実施形態３０８．第２のリガンドを投与する前に前記被験体から得られる第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、該リガンドの投与後に該被験体から得られる第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度を測定すること、および該第１のサンプル中の標的細胞の数または濃度と比較して、該第２のサンプル中の標的細胞の数または濃度の増加または減少を決定することを包含する、実施形態３０４～３０７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３０９．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して減少している、実施形態３０８に記載の方法。
実施形態３１０．前記第２のサンプル中の標的細胞の濃度は、前記第１のサンプル中の標的細胞の濃度と比較して増加している、実施形態３０８に記載の方法。
実施形態３１１．前記被験体は、前記改変された細胞の投与前または前記改変された細胞の投与と同時に幹細胞移植を受けたことがある、実施形態３０１～３１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１２． 少なくとも１×１０６個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞は、前記被験体に投与される、実施形態３０１～３１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１３．少なくとも１×１０７個の形質導入またはトランスフェクトされた、改変された細胞は、前記被験体に投与される、実施形態３０１～３１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１４．少なくとも１×１０８個の改変された細胞は、前記被験体に投与される、実施形態３０１～３１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１４．１．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域は、ＦＫＢＰ１２ｖ３６であり、該ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンドは、ＡＰ１９０３である、実施形態３０１～３１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１５．被験体において移植された、改変された細胞の生存を調節するための方法であって、該方法は、
ａ）実施形態２２６～２３８または２５２～２８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に移植すること、および
ｂ） （ａ）の後に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する該改変された細胞のうちの３０％未満を殺滅するために有効な量で投与すること、
を包含する方法。
ａ）実施形態２２６～２３８または２５２～２８５のいずれか１つに記載の改変された細胞を該被験体に移植すること、および
ｂ） （ａ）の後に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する該改変された細胞のうちの３０％未満を殺滅するために有効な量で投与すること、
を包含する方法。
実施形態３１６．（ｂ）の後に、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドの前記ＦＫＢＰ１２バリアントポリペプチド領域に結合するリガンドを、該キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの３０％未満を殺滅するために有効な量で前記被験体に投与することをさらに包含する、実施形態３０１～３１４．１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１７．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンド（ｔｈｅ ａ ｌｉｇａｎｄ）は、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの４０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態３１５または３１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１８．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの５０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態３１５または３１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１９．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの６０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態３１５または３１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２０．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの７０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態３１５または３１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２１．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの９０％未満を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態３１５または３１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２２．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９０％を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態３１５または３１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２３．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンドは、前記キメラアポトーシス促進ポリペプチドを発現する前記改変された細胞のうちの少なくとも９５％を殺滅するために有効な量で投与される、実施形態３１５または３１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２４．前記キメラ共刺激ポリペプチドは、ＦＲＢＬ領域を含む、実施形態３１５～３１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２５．前記リガンドの１より多くの用量が、前記被験体に投与される、実施形態３０１～３１４．１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２６．前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンド（ｔｈｅ ａ ｌｉｇａｎｄ）の１より多くの用量は、前記被験体に投与される、実施形態３１５～３２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２７．
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へ前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体への該リガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体への該リガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、実施形態３０１～３２５のいずれか１つに記載の方法。
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、該被験体へ前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体への該リガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体への該リガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、実施形態３０１～３２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２８．
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を含む情報を受け取ること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、
該被験体へ前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンド（ｔｈｅ ａ ｌｉｇａｎｄ）を投与するか、該被験体への該リガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体への該リガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、実施形態３０１～３２５のいずれか１つに記載の方法。
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を含む情報を受け取ること；および
該被験体において同定された該状態の該存在または非存在に基づいて、
該被験体へ前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンド（ｔｈｅ ａ ｌｉｇａｎｄ）を投与するか、該被験体への該リガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体への該リガンドのその後の投与量を調整すること、
をさらに包含する、実施形態３０１～３２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２９．
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体に前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を調整する意思決定者に、該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージを伝達すること、
をさらに包含する、実施形態３０１～３２５のいずれか１つに記載の方法。
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体に前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合するリガンドを投与するか、該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を調整する意思決定者に、該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージを伝達すること、
をさらに包含する、実施形態３０１～３２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３０．
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体に前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンド（ｔｈｅ ａ ｌｉｇａｎｄ）を投与するか、該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝達すること、をさらに包含する、実施形態３０１～３２５のいずれか１つに記載の方法。
前記改変された細胞を前記被験体から除去することを要する該被験体における状態の存在または非存在を同定すること；および
該被験体において同定された該状態の該存在、非存在またはステージに基づいて、該被験体に前記ＦＫＢＰ１２バリアント領域に結合する前記リガンド（ｔｈｅ ａ ｌｉｇａｎｄ）を投与するか、該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を維持するか、または該被験体に投与される該リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝達すること、をさらに包含する、実施形態３０１～３２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３１．前記被験体は、がんを有する、実施形態３０１～３３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３２．前記改変された細胞は、腫瘍床に送達される、実施形態３０１～３３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３３．前記がんは、前記被験体の血液または骨髄に存在する、実施形態３３１または３３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３４．前記被験体は、血液または骨髄の疾患を有する、実施形態３０１～３３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３５．前記被験体は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態３０１～３３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３６．前記患者は、原発性免疫不全状態、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）または他の血球貪食状態、遺伝性骨髄不全状態、ヘモグロビン異常症、代謝状態、および破骨細胞状態からなる群より選択される状態と診断されている、実施形態３０１～３３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３７．前記患者は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸症、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＡ８欠損症、ＩＬ－１０欠損症／ＩＬ－１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコーニ貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、および大理石骨病からなる群より選択される疾患または状態と診断されている、実施形態３０１～３３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３８．キメラ共刺激ポリペプチドを発現するための方法であって、ここで該キメラ共刺激ポリペプチドは、
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域、
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域、
を含み、該方法は、
実施形態３０１～３０６のいずれか１つに記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させること、
を包含し、それによって該細胞が第１の該キメラポリペプチドおよび第２の該キメラポリペプチドを該組み込まれた核酸から発現する方法。
ａ）共刺激ポリペプチド領域であって、
（ｉ）ＭｙＤ８８ポリペプチド領域またはＴＩＲドメインを欠く短縮型ＭｙＤ８８ポリペプチド領域；および
（ｉｉ）ＣＤ４０細胞外ドメインを欠くＣＤ４０細胞質ポリペプチド領域；
を含む、共刺激ポリペプチド領域、
ｂ）ＦＲＢまたはＦＲＢバリアント領域；ならびに
ｃ）ＦＫＢＰ１２ポリペプチド領域、
を含み、該方法は、
実施形態３０１～３０６のいずれか１つに記載の核酸と細胞とを、該核酸が該細胞に組み込まれる条件下で接触させること、
を包含し、それによって該細胞が第１の該キメラポリペプチドおよび第２の該キメラポリペプチドを該組み込まれた核酸から発現する方法。
実施形態３３９．前記核酸は、前記細胞とエキソビボで接触させられる、実施形態３３８に記載の方法。
実施形態３４０．前記核酸は、前記細胞とインビボで接触させられる、実施形態３３８に記載の方法。
本明細書中で参照された特許、特許出願、刊行物および文書の各々の全体が、参照により本明細書によって援用される。上記特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、前述のいずれもが、関連する従来技術であることを自認するものでもないし、これらの刊行物または文書の内容または日付に関して何ら自認するものでもない。
本技術の基本的な態様から逸脱することなく、前述のものに対して改変が行われ得る。本技術は、１つ以上の特定の実施形態に照らして実質的に詳細に説明されてきたが、当業者は、本願において具体的に開示された実施形態に対して変更が行われ得るが、これらの改変および改善が本技術の範囲内および精神内であることを認識する。
本明細書中に例証的に記載された技術は、本明細書中に具体的に開示されていない任意のエレメント（複数可）の非存在下において、適切に実施され得る。したがって、例えば、本明細書中の各場合において、用語「～を含む」、「～から本質的になる」および「～からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。使用されてきた用語および表現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用は、示されたおよび記載された特徴またはそれらの一部のいかなる等価物も排除せず、特許請求される本技術の範囲内で様々な改変が可能である。エレメントのうちの１つまたはエレメントのうちの２つ以上が記載されていることが文脈から明らかでない限り、用語「ａ」または「ａｎ」は、それが修飾するエレメントのうちの１つまたは複数のことを指し得る（例えば、「試薬（ａ ｒｅａｇｅｎｔ）」は、１つ以上の試薬を意味し得る）。本明細書中で使用される用語「約」は、基となるパラメータの１０％以内の値（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）のことを指し、一続きの値の始めに用語「約」を使用することにより、それらの値の各々が修飾される（すなわち、「約１、２および３」は、約１、約２および約３のことを指す）。例えば、「約１００グラム」という重量は、９０グラム～１１０グラムの重量を含み得る。さらに、値のリストが、本明細書中に記載されるとき（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、そのリストには、それらのすべての中間値および分数値（例えば、５４％、８５．４％）が含まれる。したがって、本技術は、代表的な実施形態および随意の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書中に開示された概念の改変およびバリエーションが、当業者によって用いられることがあり、そのような改変およびバリエーションは、本技術の範囲内であるとみなされると理解されるべきである。
本技術のある種の実施形態は、以下の特許請求の範囲に示される。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562267277P | 2015-12-14 | 2015-12-14 | |
| US62/267,277 | 2015-12-14 | ||
| JP2018530845A JP2019506143A (ja) | 2015-12-14 | 2016-12-13 | 治療用細胞の活性化及び排除のための二重コントロール |
| PCT/US2016/066371 WO2017106185A2 (en) | 2015-12-14 | 2016-12-13 | Dual controls for therapeutic cell activation or elimination |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018530845A Division JP2019506143A (ja) | 2015-12-14 | 2016-12-13 | 治療用細胞の活性化及び排除のための二重コントロール |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022031906A true JP2022031906A (ja) | 2022-02-22 |
Family
ID=57799788
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018530845A Withdrawn JP2019506143A (ja) | 2015-12-14 | 2016-12-13 | 治療用細胞の活性化及び排除のための二重コントロール |
| JP2021200645A Pending JP2022031906A (ja) | 2015-12-14 | 2021-12-10 | 治療用細胞の活性化及び排除のための二重コントロール |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018530845A Withdrawn JP2019506143A (ja) | 2015-12-14 | 2016-12-13 | 治療用細胞の活性化及び排除のための二重コントロール |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20170166877A1 (ja) |
| EP (1) | EP3390434A2 (ja) |
| JP (2) | JP2019506143A (ja) |
| KR (1) | KR20180087423A (ja) |
| CN (2) | CN117402829A (ja) |
| AU (1) | AU2016370470B2 (ja) |
| CA (1) | CA3007473A1 (ja) |
| SG (1) | SG11201804694SA (ja) |
| WO (1) | WO2017106185A2 (ja) |
Families Citing this family (55)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9745548B2 (en) | 2012-03-15 | 2017-08-29 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustic perfusion devices |
| US9752113B2 (en) | 2012-03-15 | 2017-09-05 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustic perfusion devices |
| US10704021B2 (en) | 2012-03-15 | 2020-07-07 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustic perfusion devices |
| US10322949B2 (en) | 2012-03-15 | 2019-06-18 | Flodesign Sonics, Inc. | Transducer and reflector configurations for an acoustophoretic device |
| US10967298B2 (en) | 2012-03-15 | 2021-04-06 | Flodesign Sonics, Inc. | Driver and control for variable impedence load |
| US9950282B2 (en) | 2012-03-15 | 2018-04-24 | Flodesign Sonics, Inc. | Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation |
| US10689609B2 (en) | 2012-03-15 | 2020-06-23 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustic bioreactor processes |
| US9458450B2 (en) | 2012-03-15 | 2016-10-04 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves |
| US10737953B2 (en) | 2012-04-20 | 2020-08-11 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustophoretic method for use in bioreactors |
| US9745569B2 (en) | 2013-09-13 | 2017-08-29 | Flodesign Sonics, Inc. | System for generating high concentration factors for low cell density suspensions |
| EP3092049A1 (en) | 2014-01-08 | 2016-11-16 | Flodesign Sonics Inc. | Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber |
| US9744483B2 (en) | 2014-07-02 | 2017-08-29 | Flodesign Sonics, Inc. | Large scale acoustic separation device |
| US10888608B2 (en) | 2014-09-02 | 2021-01-12 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Costimulation of chimeric antigen receptors by MyD88 and CD40 polypeptides |
| CA2978171A1 (en) * | 2015-03-10 | 2016-09-15 | J.H. Frederik Falkenburg | T-cell receptors directed against the preferentially expressed antigen of melanoma and uses thereof |
| US11377651B2 (en) | 2016-10-19 | 2022-07-05 | Flodesign Sonics, Inc. | Cell therapy processes utilizing acoustophoresis |
| US11021699B2 (en) | 2015-04-29 | 2021-06-01 | FioDesign Sonics, Inc. | Separation using angled acoustic waves |
| US11708572B2 (en) | 2015-04-29 | 2023-07-25 | Flodesign Sonics, Inc. | Acoustic cell separation techniques and processes |
| US11474085B2 (en) | 2015-07-28 | 2022-10-18 | Flodesign Sonics, Inc. | Expanded bed affinity selection |
| US11459540B2 (en) | 2015-07-28 | 2022-10-04 | Flodesign Sonics, Inc. | Expanded bed affinity selection |
| RU2729116C2 (ru) | 2015-12-16 | 2020-08-04 | Гритстоун Онколоджи, Инк. | Идентификация, производство и применение неоантигенов |
| US11111505B2 (en) | 2016-03-19 | 2021-09-07 | Exuma Biotech, Corp. | Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof |
| US11325948B2 (en) | 2016-03-19 | 2022-05-10 | Exuma Biotech Corp. | Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL |
| US11085035B2 (en) | 2016-05-03 | 2021-08-10 | Flodesign Sonics, Inc. | Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis |
| US11214789B2 (en) | 2016-05-03 | 2022-01-04 | Flodesign Sonics, Inc. | Concentration and washing of particles with acoustics |
| JP2020513248A (ja) | 2016-10-19 | 2020-05-14 | フロデザイン ソニックス， インク．Ｆｌｏｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｎｉｃｓ， Ｉｎｃ． | 音響による親和性細胞抽出 |
| CN110191955B (zh) | 2016-12-13 | 2024-05-31 | 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） | 在体外和体内对工程化的细胞中表达的化学物质诱导的信号传导复合物进行外源性药物激活的方法 |
| WO2018148224A1 (en) | 2017-02-07 | 2018-08-16 | Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) | Phospholipid ether (ple) car t cell tumor targeting (ctct) agents |
| EP3589295A4 (en) | 2017-02-28 | 2020-11-04 | Endocyte, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS OF T CAR LYMPHOCYTE THERAPY |
| EP3621988A1 (en) | 2017-05-09 | 2020-03-18 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Methods to augment or alter signal transduction |
| CA3072329A1 (en) | 2017-08-07 | 2019-02-14 | The Regents Of The University Of California | Platform for generating safe cell therapeutics |
| CN111479921A (zh) * | 2017-09-18 | 2020-07-31 | 埃克苏马生物技术公司 | 用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物 |
| AU2018348165A1 (en) | 2017-10-10 | 2020-05-21 | Gritstone Bio, Inc. | Neoantigen identification using hotspots |
| US11885815B2 (en) | 2017-11-22 | 2024-01-30 | Gritstone Bio, Inc. | Reducing junction epitope presentation for neoantigens |
| JP2021505139A (ja) | 2017-12-08 | 2021-02-18 | ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | Ｃａｒ−ｔ細胞の効力を増強及び維持するための方法 |
| KR20220066413A (ko) | 2017-12-14 | 2022-05-24 | 프로디자인 소닉스, 인크. | 음향 트랜스듀서 구동기 및 제어기 |
| US20200308144A1 (en) | 2017-12-20 | 2020-10-01 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Multimeric piperidine derivatives |
| MX2020005701A (es) | 2017-12-22 | 2020-10-28 | Fate Therapeutics Inc | Células efectoras inmunitarias potenciadas y usos de las mismas. |
| JP2021512147A (ja) | 2018-01-22 | 2021-05-13 | エンドサイト・インコーポレイテッドＥｎｄｏｃｙｔｅ， Ｉｎｃ． | Ｃａｒ ｔ細胞の使用方法 |
| MX2020009896A (es) | 2018-03-29 | 2020-10-12 | Fate Therapeutics Inc | Celulas efectoras inmunitarias modificadas y usos de las mismas. |
| AU2019260687B2 (en) | 2018-04-27 | 2022-09-22 | Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) | Rapamycin resistant cells |
| US11495866B2 (en) | 2018-07-26 | 2022-11-08 | Lg Energy Solution, Ltd. | Separator and electrochemical device comprising same |
| CA3122421A1 (en) * | 2018-12-13 | 2020-06-18 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Psca car-t cells |
| EP3920888A4 (en) * | 2019-02-04 | 2023-11-01 | Oisin Biotechnologies, Inc. | FUSOGENIC LIPID NANOPARTICLES FOR TARGET CELL-SPECIFIC PRODUCTION OF RAPAMYCIN-INDUCIBLE THERAPEUTIC PROTEINS |
| US20220204575A1 (en) * | 2019-04-23 | 2022-06-30 | The Regents Of The University Of California | Modulating survival of therapeutic cells and methods, cells and nucleic acids related thereto |
| CN110079504A (zh) * | 2019-05-06 | 2019-08-02 | 山东大学第二医院 | 一种含有不稳定结构域的car-t细胞及其制备方法和调节car-t细胞功能方法 |
| AU2020327994A1 (en) * | 2019-08-12 | 2022-02-17 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Improved formulations for immune cells |
| CN110592014A (zh) * | 2019-08-14 | 2019-12-20 | 广东美赛尔细胞生物科技有限公司 | 一种在nk细胞治疗中免辐照体外体内持续去除饲养细胞的方法 |
| CN112430578A (zh) * | 2019-08-26 | 2021-03-02 | 深圳宾德生物技术有限公司 | 携带安全开关并靶向Her2的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用 |
| WO2021041958A1 (en) * | 2019-08-30 | 2021-03-04 | Shattuck Labs. Inc. | Chimeric proteins in autoimmunity |
| WO2021155369A1 (en) * | 2020-01-31 | 2021-08-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Systems and methods to identify genetic silencers and applications thereof |
| EP4150059A4 (en) * | 2020-05-13 | 2024-06-26 | Rapa Therapeutics, LLC | ANTIGEN-PRESENTING T CELLS, MANUFACTURED SENSITIZED T CELLS, AND METHODS OF TREATMENT USING THEM |
| WO2021257574A1 (en) * | 2020-06-15 | 2021-12-23 | Kiromic Biopharma Inc. | Tri-switch technology for multi-dimensional control of cell therapy |
| CN112575035B (zh) * | 2020-12-09 | 2022-11-29 | 贵州医科大学 | 一种诱导细胞凋亡的载体系统 |
| WO2023224927A2 (en) * | 2022-05-16 | 2023-11-23 | The Children's Medical Center Corporation | Compositions and methods for treating a cardiac disease |
| WO2024130179A1 (en) | 2022-12-16 | 2024-06-20 | Repertoire Immune Medicines, Inc. | T cell receptors binding hpv-16 epitopes |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002508971A (ja) * | 1998-01-15 | 2002-03-26 | アリアド・ジーン・セラピューティクス・インコーポレーテッド | 多量体キメラ蛋白質を使用する生物学的イベントの調節 |
| WO2014151960A2 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Methods for controlling t cell proliferation |
| WO2015017214A1 (en) * | 2013-07-29 | 2015-02-05 | Bluebird Bio, Inc. | Multipartite signaling proteins and uses thereof |
| WO2015123527A1 (en) * | 2014-02-14 | 2015-08-20 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Methods for activating t cells using an inducible chimeric polypeptide |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6187757B1 (en) * | 1995-06-07 | 2001-02-13 | Ariad Pharmaceuticals, Inc. | Regulation of biological events using novel compounds |
-
2016
- 2016-12-13 CN CN202310839876.4A patent/CN117402829A/zh active Pending
- 2016-12-13 EP EP16826509.8A patent/EP3390434A2/en active Pending
- 2016-12-13 AU AU2016370470A patent/AU2016370470B2/en active Active
- 2016-12-13 CN CN201680081930.1A patent/CN108779163A/zh active Pending
- 2016-12-13 CA CA3007473A patent/CA3007473A1/en active Pending
- 2016-12-13 US US15/377,776 patent/US20170166877A1/en not_active Abandoned
- 2016-12-13 WO PCT/US2016/066371 patent/WO2017106185A2/en active Application Filing
- 2016-12-13 KR KR1020187020145A patent/KR20180087423A/ko unknown
- 2016-12-13 SG SG11201804694SA patent/SG11201804694SA/en unknown
- 2016-12-13 JP JP2018530845A patent/JP2019506143A/ja not_active Withdrawn
-
2021
- 2021-03-31 US US17/219,116 patent/US20230065562A1/en not_active Abandoned
- 2021-12-10 JP JP2021200645A patent/JP2022031906A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002508971A (ja) * | 1998-01-15 | 2002-03-26 | アリアド・ジーン・セラピューティクス・インコーポレーテッド | 多量体キメラ蛋白質を使用する生物学的イベントの調節 |
| WO2014151960A2 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Methods for controlling t cell proliferation |
| WO2015017214A1 (en) * | 2013-07-29 | 2015-02-05 | Bluebird Bio, Inc. | Multipartite signaling proteins and uses thereof |
| WO2015123527A1 (en) * | 2014-02-14 | 2015-08-20 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Methods for activating t cells using an inducible chimeric polypeptide |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, vol. VOL:121, NR:4, JPN5018009062, 2011, pages 1524 - 1534, ISSN: 0005102227 * |
| NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, 2011, VOL.365, PP.1673-1683, JPN6020050074, ISSN: 0005102228 * |
| PLOS ONE, 2013, VOL.8, NO.12, E82742, PP.1-10, JPN6020050076, ISSN: 0005102229 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3007473A1 (en) | 2017-06-22 |
| AU2016370470B2 (en) | 2022-05-12 |
| WO2017106185A3 (en) | 2017-07-27 |
| WO2017106185A8 (en) | 2018-06-21 |
| AU2016370470A1 (en) | 2018-06-14 |
| AU2016370470A8 (en) | 2018-12-13 |
| CN117402829A (zh) | 2024-01-16 |
| JP2019506143A (ja) | 2019-03-07 |
| KR20180087423A (ko) | 2018-08-01 |
| WO2017106185A2 (en) | 2017-06-22 |
| US20170166877A1 (en) | 2017-06-15 |
| US20230065562A1 (en) | 2023-03-02 |
| SG11201804694SA (en) | 2018-07-30 |
| EP3390434A2 (en) | 2018-10-24 |
| CN108779163A (zh) | 2018-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2022031906A (ja) | 治療用細胞の活性化及び排除のための二重コントロール | |
| JP6720176B2 (ja) | 治療用細胞のコントロールされた活性化または排除のための方法 | |
| JP6821568B2 (ja) | 治療用細胞のコントロールされた排除方法 | |
| JP6818720B2 (ja) | カスパーゼポリペプチドを使用して部分的なアポトーシスを誘導するための方法 | |
| JP6537984B2 (ja) | 改変されたカスパーゼポリペプチドおよびその使用 | |
| JP6541639B2 (ja) | Ｔ細胞増殖をコントロールするための方法 | |
| US20150328292A1 (en) | Caspase polypeptides having modified activity and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211210 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221109 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230110 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230502 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230707 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230914 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20240228 |