KR20110094272A - 류마티스 관절염 및 골다공증 치료용 ｉｌ-20 길항제의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IL-20의 길항제를 투여함으로써 류마티스 관절염 및 골다공증을 예방하거나 치료하기 위한 방법 및 조성물을 특징으로 한다. IL-20 길항제는 인간 IL-20과 결합하여 이의 수용체와 IL-20의 상호작용을 차단할 수 있는 mAB 7E와 같은 항-IL-20 항체일 수 있다.

Description

류마티스 관절염 및 골다공증 치료용 ＩＬ-20 길항제의 용도{USE OF IL-20 ANTAGONISTS FOR TREATING RHEUMATOID ARTHRITIS AND OSTEOPOROSIS}

관련 출원 참조

본원은 2008년 10월 7자로 출원된 미국 특허 출원 제 12/246,715호 및 2009년 8월 31일자로 출원된 미국 가출원 제 61/238,661호의 이익을 주장하며, 이들 각각은 본원에 전체가 참고로 인용된다.

본 발명은 류마티스 관절염 및 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료를 위한 IL-20 길항제의 용도에 관한 것이다.

골다공증은 연약하고 부서지기 쉬운 뼈를 초래하는 낮은 골량(bone mass) 및 골조직의 손실로 특징지어지지는 질병이다. 순 골손실(net bone loss)은 낮은 수준의 에스트로겐, 칼슘 및 비타민 D의 불충분한 흡수, 및 염증과 같은 다양한 인자에 의해 유도될 수 있다. 폐경후 골다공증에서는 골 흡수(bone resorption)가 주요 병리학적 요인이다. 골다공증은 골격 취약성을 야기하고 골절 위험성을 증가시키는 손상된 골 강도의 질병이다(Theill, LE 등, (2002) Annu Rev Immunol 20:795-823; Boyle, WJ 등, (2003) Nature 423; 337-342). 폐경기에서의 에스트로겐 결핍과 남성에의 안드로겐 결핍 둘 모두는 골 흡수가 골 형성을 초과하는 골 전환(bone turnover)에 있어 불균형적인 증가를 야기한다. 따라서 상대적으로 빠른 골 손실이 나타나고, 골 미세구조의 파괴가 동반된다(Simonet, WS 등, (1997) Cell 89:309-319; McClung, M, (2007) Arthritis Res Ther 9 Suppl 1:S3). 대부분의 경우에 낮은 골량은 파골세포(osteoclast) 수의 증가 또는 과도한 파골세포 활성에 의해 야기된다(Walsh, NC 등, (2005) Immunol Rev 208: 228-251]). 파골세포는 타타르산염 내성 산성 포스파타제(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP) 및 칼시토닌 수용체를 발현하는 다핵거대세포(multinucleated giant cell)이다. 파골세포 형성은 2개의 인자, 즉 대식세포 콜로니 자극인자(macrophage colony-stimulation factor, M-CSF) 및 NF-κB 리간드(RANKL)의 수용체 활성제(RANKL)를 필요로 한다(Takayanagi, H 등, (2005) Immunol Rev 208: 181-193; Ross, FP & Teitelbaum, SL, (2005) Immunol Rev 208: 88-105). 단핵 세포/대식세포 전구체의 생존 및 증식을 조절하는 M-CSF는 주로 간질 섬유아세포, 골아세포 및 활성화 T세포에 의해 생성된다. RANK는 RANKL에 대한 유일한 신호 수용체로서, 파골세포의 발생 및 활성화를 유도한다(Suda, T 등, (1999) Endocr Rev 20: 345-357). RANKL-RANK 신호 전달 경로의 생체내 유의성은 생쥐의 유전자 중 하나의 결핍으로 인해 심각한 골다공증(증가된 골량) 및 파골세포의 소실이 초래된다는 관측에 의해 증명되었다(Kong, YY 등, (1999) Nature 397: 315-323; Li, J 등, (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 1566-1571). TNF-α, IL-1β, IL-15, IL-17 및 IL-23과 같은 몇몇 전염증성 사이토카인은 파골세포 전구체의 다핵화 또는 파골세포 표현형에 대한 이들의 개입(commitment)을 유도하며, RANKL과 시너지적으로 작용할 수 있다(Feldmann, M 등, (2001) Curr Dir Autoimmun 3: 188-199; O'Gradaigh, D 등, (2004) Ann Rheum Dis 63: 354-359; Sato, K 등, (2006) J Exp Med 203:2673-2682; Ju, JH 등, (2008) J Immunol 181:1507-1518).

IL-10 패밀리(IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 및 IL-26 (Blumberg, H 등, (2001) Cell 104: 9-19; Pestka, S 등, (2004) Annu Rev Immunol 22: 929-979)의 한 멤버인 다면 발현성의 염증성 사이토카인 IL-20은 단핵 세포, 상피 세포 및 내피 세포에서 발현된다. IL-20은 IL-20R1/IL-20R2 또는 IL-22R1/IL-20R2의 이질성 이량체 수용체 복합체(heterodimer receptor complex)를 활성화함으로써 다양한 유형의 세포 상에서 작용한다(Dumoutier, L. 등, (2001) J Immunol 167: 3545-3549). 이는 건선(Blumberg, H 등, (2001) Cell 104: 9-19; Sa, SM 등, (2007) J Immunol 178: 2229-2240; Wei, CC 등, (2005) Clin Immunol 117: 65-72), 류마티스 관절염(Hsu, YH 등, (2006) Arthritis Rheum 54: 2722-2733), 아테롬성 동맥 경화증(Caligiuri, G 등, (2006) Arterioscler Thromb Vase Biol 26: 1929-1930; Chen, WY 등, (2006) Arterioscler Thromb Vase Biol 26: 2090-2095), 허혈성 뇌졸중(Chen, WY & Chang, MS, (2009) J Immunol 182: 5003-5012), 및 신부전증(Li, HH 등, (2008) Genes Immun 9: 395-404) 등과 같은 다양한 염증성 질병에 연관되어 있다(Wei, CC 등, (2006) J Biomed Sci 13: 601-612). IL-20은 저산소증, 및 IL-1β 및 LPS와 같은 염증성 자극에 의해 조절된다(Chen, WY & Chang, MS, (2009) J Immunol 182: 5003-5012; Otkjaer, K 등, (2007) J Invest Dermatol ]). 최근 IL-20은 조절된 신생 혈관형성 작용(angiogenesis)을 갖는 것으로 보고되었다(Heuze-Vourc'h, N 등, (2005) Biochem Biophys Res Commun 333: 470-475; Hsieh, MY 등, (2006) Genes Immun 7: 234-242; Tritsaris, K 등, (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104: 15364-15369). 실험적 류마티스 관절염에서 IL-20은 활막 섬유아세포를 유도하여 MCP-I, IL-6 및 IL-8를 분비하도록 하며, 이는 전염증성 사이토카인으로서 작용한다(Hsu, YH 등, (2006) Arthritis Rheum 54: 2722-2733).

IL-20은 류마티스 관절염과 연관되어 있는 것으로 나타나 있으며, IL-20 가용성 수용체는 콜라겐 유도 관절염의 중증도를 감소시키는 IL-20을 차단하는 것으로 나타나 있다(Hsu, YH 등, (2006) Arthritis Rheum 54: 2722-2733). 따라서 IL-20은 류마티스 관절염의 진행 도중에 존재하는 촉진 인자이다. 그러나 골 흡수에서 IL-20의 기능, 또는 RANKL-RANK 신호-매개 파골세포 형성(osteoclastogenesis)에서 IL-20의 기능에 대해 알려진 바가 없다.

발명의 요약

본 발명은 개인에 있어서 골다공증을 치료하거나, 발병을 지연하거나 또는 예방하기 위한 방법에 있어서, 유효량의 IL-20 길항제를 개인에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 개인에 있어서 류마티스 관절염을 치료하거나, 발병을 지연하거나 또는 예방하기 위한 방법에 있어서, 유효량의 TNF-α 길항제(예를 들어, 에타너셉트(etanercept) 폴리펩티드)와 함께 유효량의 IL-20 길항제를 개인에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본원에 개시된 임의의 IL-20 길항제는 골다공증 또는 류마티스 관절염의 치료, 발병의 지연 및 예방을 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시태양에서 IL-20 길항제는 mAb 7E 또는 이의 작용성 등가물과 같은 항-IL-20 항체이다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 유효량의 항-IL-20 항체 7E를 치료가 필요한 대상에 투여함으로써 류마티스 관절염 또는 골다공증을 치료하는 방법을 제공한다. 일 예로서, 항-IL-20 항체 7E는 mAb 7E의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체이며, 이는 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection) 기탁 번호 PTA-8687로 기탁된 하이브리도마(hybridoma) 세포주에 의해 생산된다. 이러한 항체의 예로는 mAb 7E 및 이의 작용성 단편(예를 들어, F(ab')2, Fab), 단일쇄 항체, 또는 키메릭 항체를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 예로서 항-IL-20 항체 7E는 mAb 7E의 인간화 항체(humanized antibody)이다.

상술한 방법에서, 대상에 유효량의 에타너셉트 폴리펩티드를 추가로 투여하는 것이 바람직하다. 일 예로서 에타너셉트 폴리펩티드는 인간 가용성 TNF 수용체(하기에 나타나 있는 서열번호: 5) 및 인간 IgG1의 Fc 성분(예를 들어, 에타너셉트)을 포함하는 융합 단백질이다.

또한 본 발명의 범주 내에는 골다공증의 치료 또는 골다공증 치료용 약물의 제조를 위한 항-IL-20 항체 7E의 용도가 포함된다. 또한 본 발명의 범주 내에는 류마티스 관절염 및 골다공증의 치료 또는 이들 치료용 약물의 제조를 위한 항-IL-20 항체 7E, 바람직하게는 에타너셉트 폴리펩티드를 갖는 항-IL-20 항체 7E의 용도가 포함된다.

본 발명의 하나 또는 그 이상의 실시태양의 세부사항이 하기 상세한 설명에 개시되어 있다. 본 발명의 기타 특징 및 이점은 하기 도면, 몇몇 실시태양의 상세한 설명, 및 첨부된 특허청구범위로부터 자명하게 될 것이다.

도 1은 건강한 래트, 및 PBS, mIgG, mAb 7E, 에타너셉트, 또는 mAb 7E와 에타너셉트 둘 모두로 처리된 콜라겐 유도 관절염 래트에서 심각한 뒷발 부종의 발병률을 보여주는 도표이다.
도 2는 건강한 래트, 및 mIgG, mAb 7E, 에타너셉트, 또는 mAb 7E와 에타너셉트 둘 모두로 처리된 콜라겐 유도 관절염 래트에서 TNF-α(패널 A), IL-1β(패널 B) 및 IL-20(패널 C)의 수준을 보여주는 다수의 도표이다.
도 3의 (a)는 IL-20의 혈청 수준이 OVX 그룹 생쥐에서 상향 조절되지만 mAb 7E로 처리된 이후에는 OVX 그룹 생쥐에서 하향 조절됨을 보여주는 도표이다. 모조 대조군과의 비교시 *P < 0.05. OVX-mIgG 그룹과의 비교시 #P < 0.05. 도 3의 (b)는 OVX 처리 2개월 후 생쥐의 오른쪽 경골의 마이크로 CT 분석 결과를 보여주는 대표적인 도면이다: 모조 대조군(건강), 무처리 난소 적출(OVX), 및 17β-에스트라디올, OVX + mIgG, OVX + 7E(3 mg/kg), 또는 OVX + 7E(6 mg/kg)로 처리된 난소 적출된 생쥐. 도 3의 (c)는 각 실험군의 무릎 관절에서의 골 무기질 밀도(bone mineral density)를 보여주는 도표이다. 수치는 평균 ± 표준 편차이다.
도 4의 (a)는 파골세포 분화를 위한 배양 시스템의 개략도이다. 도 4의 (b)는 종양 괴사 인자(TNF)-α, mIgG 또는 mAb 7E와 조합하여 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF) 및 가용성 NF-κB 리간드 수용체 활성제(sRANKL)의 처리를 위한 파골세포의 대표적인 타타르산염 내성 산성 포스파타제(TRAP) 염색을 보여준다. 도 4의 (c)는 웰(well) 당 TRAP+ 파골세포의 수를 보여주는 도표이다. 도 4의 (d)는 초기 mAb 7E 처리를 위한 파골세포 분화/배양 시스템의 개략도이다. 도 4의 (e)는 파골세포의 TRAP 염색을 보여준다. 도 4의 (f)는 웰 당 TRAP+ 파골세포의 수를 보여주는 도표이다. 3회의 독립적인 실험으로부터 얻은 대표적인 결과가 도시되어 있다.
도 5의 (a)는 MCSF 유무에 따른 골수 유래 조혈 줄기 세포(HSC)에서의 IL-20 발현을 보여주는 도표이다. 도 5의 (b)는 RANK 단백질 IL-20 처리 HSC의 표면 발현에 대한 유동 세포측정 분석을 보여준다. 이소타입은 음성 대조군인 이소타입 항체로 염색된 세포를 나타낸다. 도 5의 (c)는 HSC가 IL-20으로 처리된 이후에 HSC에서 RANK mRNA 발현이 상향 조절된다는 것을 보여주는 도표이다. 도 5의 (d)는 실시간 PCR로 측정했을 때 mAb 7E가 OC 전구체 세포에서 IL-20 유도 RANK mRNA 발현을 억제한다는 것을 보여주는 도표이다.
도 6의 (a)는 RT-PCR을 이용하여 MC3T3-E1 골아세포에서 IL-20 및 이의 수용체의 발현을 보여준다. 도 6의 (b)는 MC3T3-E1 세포에서 IL-20 및 이의 수용체의 세포 염색을 보여준다: 붉은색(IL-20 및 수용체, AEC), 청색(핵). 도 6의 (c)는 특정 항체, 예를 들어 포스포-JNK(JNK), 포스포-ERK(ERK), 포스포-AKT(AKT), 포스포-p38(p38), 포스포-STAT3(STAT3), 및 β-액틴(β-액틴)을 이용하여 표시된 시간 동안에 IL-20와 함께 배양된 세포의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 도 6의 (d)는 IL-20으로 처리된 MC3T3-E1 세포에서 IL-17 mRNA 발현에 대한 RT-PCR 분석을 보여준다. 도 6의 (e)는 IL-20으로 처리후 실시간 PCR로 측정된 MC3T3-E1 세포의 RANKL mRNA 발현량을 보여주는 도표이다. 도 6의 (f)는 IL-20으로 처리된 MC3T3-E1 세포 세포에서의 RANKL 단백질 발현량을 보여주는 도표이다.
도 7은 mAb 7E가 MC3T3-E1 골아세포에서 IL-20 유도 RANKL 발현을 억제한다는 것을 보여주는 도표이다. 3회의 독립적인 실험으로부터 얻은 대표적인 결과가 도시되어 있다.

본 발명은 IL-20이 파골세포 전구체 상에서 RANK 발현을 야기하고 골아세포 상에서 RANKL 발현을 야기하는 신규한 파골세포 형성 사이토카인(osteoclastogenic cytokine)이라는 발견에 기초한 것이다. IL-20의 길항제, 예를 들어 IL-20 특정 단일 클론성 항체인 mAb 7E는 IL-20 유도 RANK 및 RANKL을 발현하지 못하게 하였다. 이들 결과에 따르면, IL-20 길항제는 파골세포의 분화를 억제하고 생체내 골다공성 골 손실로부터 개인을 보호하기 위해 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 IL-20 특정 단일 클론성 항체는 단독 또는 에타너셉트(etanercept)와 조합하여 사용되는 경우 뒷발 두께 및 부종을 감소시킴으로써 관절염의 중증도를 유의하게 감소시켰고, 류마티스 관절염을 위한 동물 모델에서 연골 손상 및 골 손실을 예방하였다는 발견에 기초한 것이다.

본 발명은 유효량의 IL-20 길항제(예를 들어, 항-IL-20 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 투여함으로써 개인에 있어서 골다공증을 치료하거나, 발병을 지연하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제는 다른 골다공증 치료제와 함께 투여된다. 몇몇 실시태양에서, 골다공증은 폐경후 골다공증이다. 몇몇 실시태양에서, 골다공증은 호르몬 결핍과 관련이 있다. 예를 들어, 몇몇 경우에 골다공증은 호르몬 제거 치료와 관련이 있다. 호르몬 제거 치료의 예로는 유방암 치료 및 전립선암 치료를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 골다공증은 스테로이드 유도 또는 스테로이드 관련 골다공증이다. 몇몇 실시태양에서, 골다공증은 류마티스 관절염과 관련이 있다.

또한 본 발명은 유효량의 IL-20 길항제(예를 들어, 항-IL-20 항체 또는 이의 항원 결합 단편) 및 유효량의 TNF-α 길항제(예를 들어, 에타너셉트 폴리펩티드)를 투여함으로써 개인에 있어서 류마티스 관절염을 치료하거나, 발병을 지연하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.

일반적인 기법

달리 기술하지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업계에 기술범위 이내에 있는 분자 생물학(재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학과 같은 통상적인 기법을 이용할 것이다. 이 같은 기법은, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, 등, 1989) Cold Spring Harbor Press], [Oligonucleotide 합성 (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press], [Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press], [Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)], [Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press], [Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons], [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)], [Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and CC. Blackwell, eds.)], [Gene Transfer Vectors for 포유동물 ian Cells (J. M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)], [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel 등, eds., 1987)], [PCR : The Polymerase Chain Reaction (Mullis 등, eds., 1994)], [Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan 등, eds., 1991)], [Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)], [Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)], [Antibodies (P. Finch, 1997)], [Antibodies : a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)], [Monoclonal antibodies : a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)], [Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)], 및 [The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]와 같은 문헌에 상세하게 설명되어 있다.

정의

"항체"(복수의 형태로 교환 가능하게 사용됨)는 면역글로빈 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적 물질에 특이하게 결합할 수 있는 면역글로빈(immunoglobulin) 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 온전한 다클론성 또는 단일 클론성 항체뿐만 아니라, 이의 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄(ScFv) 및 이의 변이체, dAb(도메인 항체; 문헌[Ward, 등, 1989, Nature, 341:544-546)] 참조), 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메릭 항체(chimeric antibodies), 2가 항체 절편(diabodies), 선형 항체(linear antibodies), 단일 쇄 항체(single chain antibodies), 다중 특이성 항체(multispecific antibodies)(예를 들어, 이중 특이성 항체, bispecific antibodies), 및 목적하는 특이성을 갖는 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로빈 분자의 임의의 기타 변형된 구조를 포함한다. 항체는 IgG, IgA, 또는 IgM(또는 이들의 하위부류)와 같은 임의의 부류의 항체를 포함하며, 상기 항체는 임의의 특정 부류에 속할 필요는 없다. 항체의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열 서열에 따라 면역글로빈은 상이한 부류에 지정될 수 있다. 면역글로빈에는 5개의 주요 부류가 존재한다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. 이들 중 일부는 하위 부류(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로빈에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 α, δ, ε, γ 및 μ로 각각 지칭된다. 상이한 부류의 면역글로빈의 하위유니트 구조 및 3차원 구성은 널리 공지되어 있다.

"단일 클론성 항체"란 용어는 단일 클론성 항체가 항원의 선택적 결합과 관련이 있는 아미노산(자연 발생적 및 비-자연 발생적 아미노산)으로 이루어진 동종 항체의 개체군(homogeneous antibody population)을 지칭한다. 단일 클론성 항체의 개체군은 고도로 특이적이며, 단일 항원성 부위에 대향하고 있다. "단일 클론성 항체"란 용어는 온전한 단일 클론성 항체 및 전장 단일 클론성 항체뿐만 아니라, 이의 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄(ScFv) 및 이의 변이체, dAb(도메인 항체; 문헌[Ward, 등, 1989, Nature, 341:544-546)] 참조), 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 인간화 단일 클론성 항체, 키메릭 단일 클론성 항체, 및 목적하는 특이성 및 항원에 결합하는 능력을 갖는 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로빈 분자의 임의의 기타 변형된 구조를 포함한다. 이는, 항체 공급원에 대해, 또는 항체가 제조되는 방식(예를 들어, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질전환 동물 등에 의한 방식)에 대해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 상기 용어는 모든 면역글로빈뿐만 아니라 "항체"의 정의 하에서 상술한 단편 등을 포함한다. 단일 클론성 항체는 다양한 종, 예를 들어 생쥐 및 인간으로부터 유래될 수 있다.

인간화 항체는 비-인간 면역글로빈으로부터 유래한 최소 서열을 포함하는 비-인간(예를 들어, 쥣과 동물) 항체의 형태를 지칭하며, 상기 항체의 형태로는 특정 키메릭 면역글로빈, 면역글로빈 쇄, 또는 이의 단편(예를 들어, 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 기타 항원-결합 하위서열)이 있다. 대부분은, 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 부위(complementary determining region, CDR)로부터의 잔기들이 목적하는 특이성, 친화도 및 성능을 갖는 생쥐, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(기증자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 교체되어 있는 인간 면역글로빈(수용자 항체)이다. 몇몇의 경우, 인간 면역글로빈의 Fv 골격 영역(FR) 잔기들은 상응하는 비-인간 잔기에 의해 교체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 내입된 CDR 또는 골격 서열에서도 발견되지 않았지만, 항체 성능을 추가로 정련하고 최적화하기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 면역글로빈의 CDR 영역에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로빈 공통 서열의 FR 영역인, 적어도 하나 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인 모두를 실질적으로 포함할 것이다. 선택적으로 인간화 항체는 면역글로빈 불변 영역 또는 도메인(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로빈의 일부를 또한 포함할 것이다. 항체는 PCT 공개공보 제 WO 99/58572호에 개시된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 가질 수 있다. 다른 형태의 인간화 항체는 원형 항체에 대해 변경된 하나 또는 그 이상(1, 2, 3, 4, 5, 6개)의 CDR을 가지며, 상기 CDR은 또한 원형 항체의 하나 또는 그 이상의 CDR로부터 "유래한" 하나 또는 그 이상의 CDR로 지칭된다.

"키메릭" 항체는 제 1 종으로부터의 가변 영역 또는 가변 영역의 일부, 및 제 2 종으로부터의 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 이들 키메릭 항체에서 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 포유동물의 하나의 종으로부터 유래한 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 영역은 다른 종의 포유동물로부터 유래한 항체 내 서열과 상동성이 있다. 몇몇 실시태양에서, 아미노산 변형은 가변 영역 및/또는 불변 영역에서 이루질 수 있다.

표적 물질 또는 에피토프(epitope)에 "특이적으로 결합"하거나 "결합"하는 항체 또는 폴리펩티드(본원에서는 상호 교환 가능하게 사용됨)는 당업계에 널리 이해되고 있는 용어이며, 이 같은 특이적 결합을 결정하는 방법도 또한 당업계에 널리 공지되어 있다. 분자는 대안적인 표적 물질과 결합하는 것보다는 특정의 표적 물질과 보다 긴 시간 및/또는 보다 큰 친화도로, 더욱 빈번하면서도, 더욱 신속하게 반응하거나 결합하는 경우에 "특이적 결합"을 나타내는 것으로 언급된다.

항체 또는 폴리펩티드는 다른 물질들과 결합하는 것보다는 표적 물질과 보다 큰 친화도와 결합성(avidity)으로 더욱 신속하고 및/또는 더욱 긴 기간 동안 결합하는 경우에 상기 표적 물질에 "특이적으로 결합"한다. 예를 들어, IL-20 에피토프에 특이적이거나 우선적으로 결합하는 항체는, 기타 IL-20 에피토프 또는 비-IL-20 에피토프에 결합하는 것보다 이러한 IL-20 에피토프에 보다 큰 친화도와 접착력으로 보다 신속하고 및/또는 보다 긴 기간 동안 결합하는 항체이다. 또한 이러한 정의를 판독함으로써, 예를 들어 제 1 표적 물질에 특이적으로 결합하는 항체(또는 일부분(moiety))는 제 2 표적 물질에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 상기와 같이, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 (배타적인 결합을 포함할 수 있을지라도) 이러한 배타적인 결합을 필수적으로 요구하지는 않는다. 일반적으로, 필수적인 것은 아니지만, 결합에 대한 인용은 우선적 결합을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "IL-20"란 용어는 인터류킨-20(interleukin-20), 및 IL-20의 활성의 적어도 일부를 유지하는 이의 변이체를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, IL-20은 인간, 개, 고양이, 말 또는 소를 포함하는 모든 포유동물 종의 고유의 서열 IL-20을 포함한다.

"IL-20 수용체"는 IL-20에 의해 결합되거나 활성화되는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 지칭한다. 몇몇의 경우, IL-20은 IL-20R1 및 IL-20R2로 형성된 복합체에 결합한다. 다른 경우에 IL-20은 IL-20R2 및 IL-22R1로 형성된 복합체에 결합한다. 상기와 같이, IL-20 수용체는 인간, 개, 고양이, 말, 영장류, 또는 소를 포함하지만 이에 한정되지 않은 임의의 포유동물 종의 IL-20R1, IL-20R2 및 IL-22R1을 포함한다. 인간 IL-20 수용체의 예로는 ML-20R1(유전자은행(GenBank) 등록 번호 NM_014432.2), ML-20R2(유전자은행 등록 번호 NM_144717.2) 및 ML-22R1( NM_181309.1)을 들 수 있다. 인간 IL 수용체의 서열은, 예를 들어 미국 특허 제 6,610,286호; 7,122,632호; 7,393,684호; 및 7,537,761호; 및 미국 특허 공개공보 제 2006/0263850A1호; 2006/0263851A1호; 2008/0247945A1호 및 2009/0074661A1호에 개시되어 있다.

"IL-20 길항제"는 수용체 결합 및/또는 IL-20에 대한 세포성 반응의 유도와 같은 IL-20 신호 전달에 의해 매개되는 다운스트림 경로(downstream pathway)를 포함하는, IL-20 생물 활성을 (유의하게) 차단하거나, 억제하거나 또는 감소시키는 임의의 분자를 지칭한다. "길항제"란 용어는 어떠한 경우에도 특정의 생물 작용 기작을 포함하지 않으며, 직접적이든 간접적이든 IL-20과의 가능한 모든 약리학적, 생리학적 및 생화학적 상호작용을 명백히 포함하는 것으로 간주된다. 예시적인 IL-20 길항제로는 항-IL-20 항체 또는 이의 단편, IL-20을 향하고 있는 안티센스 분자(IL-20을 암호화하는 핵산을 향하고 있는 안티센스 분자를 포함함), IL-20 핵산을 향하고 있는 작은 간섭(small interfering) RNA(siRNA), IL-20 핵산을 향하고 있는 마이크로 RNA, 및 IL-20 억제 화합물을 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 목적을 위하여, "길항제"란 용어는 앞서 확인된 용어, 표제, 기능 상태 및 특징 모두를 포함하며, 이로 인해 IL-20 자체, IL-20 생물 활성(골다공증의 임의의 양상을 중재하는 능력을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 또는 생물 활성의 중요성이 실질적으로 무효화되거나, 임의의 유의한 정도로 감소되거나 중화되는 것으로 명백히 이해될 것이다. 몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제는 IL-20과 결합하고, IL-20 수용체 복합체의 형성을 방지한다. 기타 실시태양에서, IL-20 길항제는 IL-20 합성 및/또는 생산(방출)을 억제하거나 감소시킨다. IL-20 길항제 유형의 예가 본원에서 제공된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "항-IL-20 항체"는 IL-20에 결합하여, IL-20 생물 활성 및/또는 IL-20 신호 전달에 의해 매개되는 다운스트림 경로(들)를 억제할 수 있는 항체를 지칭한다.

"항-IL-20 항체 7E"란 용어는 단일 클론성 항체 mAb 7E 및 이의 작용성 변이체를 지칭한다. mAb 7E는 미국, 버지니아주, 머네서스, 유니버스티 불러버드 10801 (20110-2209) 소재의 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection, ATCC)에 기탁되어, 기탁 번호 PTA-8687로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된다. 이러한 하이브리도마 세포주는 본 출원에 대해 미국 특허가 허여되는 경우 취소 불가능하면서도 임의의 제한사항/조건없이 대중에 공개될 것이며, 특허 존속 기간을 위해 기탁일로부터 30년 이상 동안, 또는 가장 최근 일자로부터 5년 동안 ATCC에 유지될 것이다.

mAb 7E 의 "작용성 등가물"은 (1) 인간 IL-20에 특이적으로 반응하고, (2) mAb 7E의 중쇄 가변 영역(VH)(서열번호: 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 서열번호: 2로 후술됨)과 70%이상(예를 들어, 80%, 90% 또는 95%) 동일한 중쇄 가변 영역(VH), 및 mAb 7E의 경쇄 가변 영역(VL)(서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 서열번호: 4로 후술됨)과 70% 이상(예를 들어, 80%, 90% 또는 95%) 동일한 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체이다. 미국 특허 출원 제 11/763,812호를 참조한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 아미노산 서열의 "상동성(%)"은 문헌[Karlin and Altschul, Proc , Natl . Acad . Sci USA 5873-5877, 1993]에 개시된 바와 같이 변경된, 문헌[Karlin and Altschul, Proc , Natl . Acad . Sci USA 87: 2264-2268, 1990]에 개시된 알고리즘을 이용하여 결정된다.

이 같은 알고리즘은 문헌[Altschul 등, J. MoI . Biol . 215: 403-410, 1990]에 개시된 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 혼입된다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램(점수=50, 단어 길이=3)을 이용하여 수행하여, 참고용 폴리펩티드와 상동성이 있는 아미노산 서열을 수득한다. 비교를 위한 갭트 얼라인먼트(gapped alignment)를 수득하기 위해 갭트 BLAST를 문헌[Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997]에 개시된 바와 같이 이용한다. BLAST 및 갭트 BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 개별 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수가 이용된다. www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.

mAb 7E의 작용성 등가물은 효소 분해에 의해 생성된 이의 단편, 예를 들어 Fab 또는 F(ab')2일 수 있다. 또한 이는 mAb 7E의 VH 및 VL 영역을 포함하는 유전적으로 조작된 항체일 수도 있다. 이 같은 항체의 예로는, mAb 7E의 VH 및 VL이 링커(예를 들어, 펩티드 링커)를 통해 공유 결합적으로 융합되어 있는 단일 쇄 항체, 및 mAb 7E의 VH 및 VL이 인간 IgG의 중쇄 및 경쇄의 불변 영역과 각각 연결되어 있는 생쥐-인간 키메릭 항체를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

또한 작용성 등가물은 인간화 항체일 수 있다. "인간화 항체"란 용어는 VH 및 VL의 골격 영역(FR) 및 불변 영역이 임의의 경우에 인간 항체의 FR 및 불변 영역으로 교체되어 있는 비-인간 항체를 지칭한다. 추가로, mAb 7E 작용성 등가물은 VH 또는 VL의 FR에 돌연변이를 도입함으로써 생성될 수 있다. 항체의 상보성 결정 영역(CDR)은 이의 항원 특이성을 결정하는 것으로 널리 공지되어 있다. 따라서 FR에서의 돌연변이는 정상적으로는 항체 특이성에 영향을 주지 않을 수 있다. 항체의 CDR 및 FR은 이의 VH 및 VL의 아미노산 서열에 기초하여 결정될 수 있다. www.bioinf.org.uk/abs를 참조한다. 본원에 개시된 작용성 등가물의 결합 특이성은 당업계에 공지된 방법, 예들 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 조사될 수 있다.

단일 클론성 항체인 mAb 7E 및 이의 작용성 등가물은 통상적인 방법 통해, 예를 들어 상술한 하이브리도마 세포로부터 분비된 항체를 정제함으로써 제조되거나, 유전공학에 의해 제조될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이 "치료"란 용어는, 질병, 상기 질병의 증상 또는 질병에 걸리기 쉬운 성향을 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 교정, 개선 또는 향상하거나 영향을 미칠 목적으로 하나 또는 그 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 류마티스 관절염 또는 골다공증, 상기 질병의 증상, 또는 상기 질병에 걸리기 쉬운 성향을 갖는 대상에 적용하거나 투여하는 것을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이 "유효량"은 대상에 대한 치료 효과를 제공하기 위해 활성제 단독, 또는 하나 또는 그 이상의 기타 활성제와의 조합으로 요구되는 각각의 활성제의 양을 지칭한다. 유효량은, 당업계의 숙련자에 의해 인지되는 바와 같이, 투여 경로, 부형제 사용 및 기타 활성제의 동공 사용에 의존하여 변한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 질병(예를 들어, 골다공증 또는 류마티스 관절염)의 발병의 "지연하기"란 질병의 진행을 억제, 방해, 감속, 지체, 안정화 및/또는 연기한다는 것을 의미한다. 이러한 지연은 질병의 이력 및/또는 치료될 개인에 따른 시간 길이의 변경일 수 있다. 당업계의 숙련자에게 자명한 바와 같이, 충분하거나 유의한 지연은, 사실상 개인에 있어서 질병이 발생하지 않는다는 점에서 예방을 포함할 수 있다. 증상의 발생을 "지연"하는 방법으로는 상기 방법을 이용하지 않은 경우와 비교했을 때 주어진 시간의 틀 내에 증상이 발생할 가능성을 감소시키는 방법 및/또는 주어진 시간의 틀 내에 증상의 정도를 감소시키는 방법이 있다. 이 같은 비교는 전형적으로 통계학적으로 유의한 결과를 나타내기에 충분한 다수의 대상을 이용한 임상 연구에 기초한 것이다.

질병(예를 들어, 골다공증 또는 류마티스 관절염)의 "발생" 또는 "진행"은 질환의 초기 징후 및/또는 그 이후의 진행을 의미한다. 질병의 발생은 당업계에 널리 공지된 바와 같은 표준 임상 기법을 이용하여 검출되거나 평가될 수 있다. 그러나 발생은 또한 검출되지 않을 수 있는 진행도 또한 지칭한다. 본 발명의 목적을 위하여, 발생 및 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발생"은 발현, 재발 및 개시를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 골다공증의 "개시" 또는 "발현"은 초기 개시 및/또는 발현을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "약제"는 생물학적, 약학적 또는 화학적 화합물을 지칭한다. 비제한적인 예로는 단순 또는 복합 유기 또는 무기 분자, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 항체, 항체 유도체, 항체 단편, 비타민 유도체, 탄수화물, 톡신, 또는 화학 요법 화합물을 들 수 있다. 다양한 화합물, 예를 들어, 작은 분자 및 올리고머(예를 들어, 올리고펩티드 및 올리고뉴클레오티드), 및 합성 유기 화합물이 다양한 코어 구조에 기초하여 합성될 수 있다. 또한 다양한 천연 공급원은 식물 또는 동물 추출물 등과 같은 스크린닝용 화합물을 제공할 수 있다. 당업계 숙련자라면 본 발명에 따른 약제의 구조적 특성에 대해 어떠한 제한도 없다는 것을 용이하게 인지할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "병합투여(co-administration)" 또는 "함께 투여(administration in conjunction with)"는 동시 투여 및/또는 상이한 시간에 투여를 포함한다. 또한 병합투여는 복합제제(co-formulation)(예를 들어, IL-20 길항제 및 약제가 동일한 조성물에 존재함)으로서 투여 또는 별개의 조성물로서 투여를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 병합투여는 약제 및 IL-20 길항제가 개인에게 투여되되, 상기 투여가 동시 및/또는 개별적으로 일어날 수 있는 임의의 상황을 포함한다는 것을 의미한다. 본원에서 추가로 토의된 바와 같이, IL-20 길항제 및 약제는 상이한 투여 빈도 또는 투여 간격으로 투여될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 항-IL-20 항체는 매주 투여될 수 있는 반면, 약제는 보다 자주 투여될 수 있다. IL-20 길항제 및 약제는 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 이용하여 투여될 수 있는 것으로 이해된다.

"개인" 또는 "대상"은 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간이다. 포유동물로는 가축, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 생쥐 및 래트를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

본원에 개시된 모든 방법에 있어서, IL-20 길항제에 대한 인용은 하나 또는 그 이상의 이들 약제를 포함하는 조성물도 또한 포함한다. 이들 조성물은 당업계에 널리 공지된 완충제를 포함한, 약학적으로 허용 가능한 부형제(담체)와 같은 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 단독으로, 또는 기타 통상적인 치료 방법과 함께 사용될 수 있다.

본원 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 달리 언급하지 않는 한, "부정관사" 및 "정관사"와 같은 단수 형태는 복수 인용을 포함한다. 예를 들어, "항체"에 대한 인용은 몰량과 같이 하나 내지 다수의 항체에 대한 인용이며, 당업계의 숙련자에게 공지된 이의 등가물 등을 포함한다.

본원에 개시된 본 발명의 양태 및 변형예는, 양태 및 변형예들로 "이루어지고" 및/또는 "양태 및 변형예들로 본질적으로 이루어진다"는 것을 포함하는 것으로 이해된다.

IL -20 길항제

본 발명은 치료가 필요한 개인, 즉 인간 및 비-인간 포유동물 둘 모두에서 골다공증 및 류마티스 관절염을 치료, 발병의 지연 및/또는 예방에 유용하다. 본 발명의 방법은 IL-20 길항제를 이용하며, 상기 IL-20 길항제는 수용체 결합 및/또는 IL-20에 대한 세포성 반응의 유도와 같은 IL-20 신호 전달에 의해 매개되는 다운스트림 경로를 포함하는, IL-20 생물 활성을 (유의하게) 차단하거나, 억제하거나 또는 감소시키는 임의의 분자를 지칭한다. IL-20의 일 예는 인간 IL-20이다. 몇몇 실시태양에서, IL-20은 IL-20 고유의 변이체를 포함한다. 인간 IL-20의 아미노산 서열은 하기와 같다:

MKASSLAFSLLSAAFYLLWTPSTGLKTLNLGSCVIATNLQEIRNGFSEIRGSVQAKDGNIDIRILRRTESLQDTKPANRCCLLRHLLRLYLDRVFKNYQTPDHYTLRKISSLANSFLTIKKDLRLCHAHMTCHCGEEAMKKYSQILSHFEKLEPQAAVVKALGELDILLQWMEETE

(밑줄 친 부분은 신호 펩티드임).

예시적인 IL-20 길항제로는 항-IL-20 항체 또는 이의 단편, IL-20을 향하고 있는 안티센스 분자(IL-20을 암호화하는 핵산을 향하고 있는 안티센스 분자를 포함함), IL-20 핵산을 향하고 있는 작은 간섭 RNA(siRNA), IL-20 핵산을 향하고 있는 마이크로 RNA, 및 IL-20 수용체의 세포외 부분을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 목적을 위하여, "길항제"란 용어는 앞서 확인된 용어, 표제, 기능 상태 및 특징 모두를 포함하며, 이로 인해 IL-20 자체, IL-20 생물 활성(골다공증의 임의의 양상을 중재하는 능력을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 또는 생물 활성의 중요성이 실질적으로 무효화되거나, 임의의 유의한 정도로 감소되거나 중화되는 것으로 명백히 이해될 것이다. 몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제는 IL-20과 결합하고, IL-20이 하나 또는 그 이상의 이의 수용체와의 복합체를 형성하는 것을 막는다. 기타 실시태양에서, IL-20 길항제는 IL-20 합성 및/또는 생산(방출)을 억제하거나 감소시킨다. 따라서 몇몇 실시태양에서 IL-20 길항제는 IL-20과 결합한다(물리적으로 작용한다). 몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제는 IL-20에 결합하는 폴리펩티드이다. 몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제는 펩티드 또는 변형된 펩티드(예를 들어, Fc 도메인에 융합된 가용성 수용체인 IL-20R1, IL-20R2 및/또는 IL-22R1을 포함하는 IL-20 결합 펩티드)이다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,610,286호; 7,189,394호; 7,364,732호; 7,393,684호; 및 7,537,761호; 미국 특허 공개공보 제 2006/0263850A1호; 2006/0263851A1호; 2008/0171041A1호; 및 2008/0233115A1호를 참조한다. 기타 실시태양에서, IL-20 길항제는 항-IL-20 항체이다. 또 다른 실시태양에서, 항-IL-20 항체는 인간화되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 항-IL-20 항체는 항체 mAb 7E(본원에서 개시된 바와 같음) 또는 mAb 7E의 작용성 등가물이다. 기타 실시태양에서, 항-IL-20 항체는 항체 mAb 7E의 하나 또는 그 이상의 CDR(들)(예를 들어, mAb 7E로부터의 1, 2, 3, 4 또는 5 개 또는 몇몇 실시태양의 경우 6개 모두의 CDR)을 포함한다. 기타 실시태양에서, 항체는 인간 항체이다. 또 다른 실시태양에서, 항-IL-20 항체는 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호: 2) 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열번호: 4)을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 항체는 면역학적으로 불활성인 불변 영역, 예를 들어 보채 매개 용해를 개시하지 않거나 항체-독립성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않는 불변 영역과 같은 변형된 불변 영역을 포함한다. 기타 실시태양에서, 불변 영역은 문헌[Eur . J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624], PCT 국제출원 제 PCT/GB99/01441 및/또는 영국 특허 출원 제 9809951.8호에 개시된 바와 같이 변형된다. 기타 실시태양에서,IL-20 길항제는 IL-20 합성 및/또는 방출을 억제(감소)한다.

mAb 7E 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열번호: 1) 및 아미노산 서열 (서열번호: 2)

mAb 7E 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열번호: 3) 및 아미노산 서열 (서열번호: 4)

항- IL -20 항체

본 발명의 몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제는 항-IL-20 항체를 포함한다. 항-IL-20 항체는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 7,435,800호; 7,115,714호; 7,119,175호; 7,151,166호; 및 7,393,684호; PCT 공개공보 제 WO 2007/081465호; WO 99/27103호; WO 2004/085475호; 및 WO 2005/052000호를 참조한다.

기타 실시태양에서, 항-IL-20 항체는 항체 mAb 7E의 하나 또는 그 이상의 CDR(들)(예를 들어, mAb 7E로부터의 1, 2, 3, 4 또는 5개 또는 몇몇 실시태양의 경우 6개 모두의 CDR)을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 항-IL-20 항체는 ATCC 기탁 번호 PTA-8587을 갖는 세포주 또는 이의 자손에 의해 생성된 mAb 7E의 중쇄로부터의 3개의 CDR 및 경쇄로부터의 3개의 CDR을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 항-IL-20 항체는 서열번호: 2로 표시된 아미노산 서열로부터의 3개의 중쇄 CDR, 및 서열번호: 4로 표시된 아미노산 서열로부터의 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.

CDR 영역의 결정은 당업계의 기술분야에 널리 포함된다. CDR(들)은 Kabat, Chothia, 또는 Kabat와 Chothia의 조합일 수 있다. CDR을 결정하는 2개 이상의 기법이 존재한다: (1) 종간 서열 변이성(cross-species sequence variability)에 기초한 접근법(예를 들어, Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법(Chothia 등, (1989) Nature 342: 877; Al-lazikani 등 (1997) J. Molec. Biol . 273: 927-948). 본원에서 사용된 바와 같이, CDR은 이들 접근법 중 하나, 또는 이들 접근법의 조합에 의해 한정된 CDR를 지칭할 수 있다.

본 발명에서 유용한 항체는 단일 클론성 항체, 다클론성 항체, 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메릭 항체, 이중 특이성 항체, 헤테로접합 항체, 단일 쇄(ScFv), 이의 돌연변이체, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 및 목적하는 특이성을 갖는 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로빈 분자의 임의의 기타 변형된 구조를 포함할 수 있으며, 임의의 변형된 구조는 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유 결합적으로 변형된 항체를 포함한다. 항체는 쥐, 래트, 인간, 또는 임의의 기타 기원(키메릭 또는 인간화 항체를 포함함)일 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 항체는 IL-20, 및/또는 IL-20 신호 전달 기능에 의해 매개되는 다운스트림 경로를 억제하는 방식으로 IL-20과 반응한다. 일 실시태양에서, 항체는 인간 IL-20 상의 하나 또는 그 이상의 에피토프를 인식하는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메릭 항체이다. 몇몇 실시태양에서, 항-IL-20 항체는 항체 mAb 7E와 동일한 인간 IL-20 상의 에피토프에 결합한다. 기타 실시태양에서, 항체는 면역학적으로 불활성인 불변 영역, 예를 들어 보채 매개 용해를 개시하지 않거나 항체-독립성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않는 불변 영역과 같은 변형된 불변 영역을 포함한다. ADCC 활성은 미국 특허 제 5,500,362호에 개시된 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 기타 실시태양에서, 불변 영역은 문헌[Eur . J. Immunol . (1999) 29: 2613-2624], PCT 국제출원 제 PCT/GB 99/01441호 및 유럽 특허 출원 제 9809951.8호에 개시된 바와 같이 변형된다.

IL-20(예를 들어, 인간 IL-20)에 대한 항-IL-20 항체의 결합 친화도는 임의의 약 2pM에 대해 임의의 약 100nM, 약 50nM, 약 10nM, 약 1nM, 약 500pM, 약 100pM, 또는 약 50pM 미만일 수 있다. 결합 친화도는 KD 또는 분리 상수로 표시될 수 있으며, 결합 친화도의 증가는 KD의 감소에 상응한다. IL-20에 대한 항체의 결합 친화도를 결정하는 하나의 방법은 항체의 단일 작용성 Fab 단편의 결합 친화도를 결정하는 것이다. 단일 작용성 Fab 단편을 수득하기 위해, 항체(예를 들어, IgG)는 파파인(papain)으로 개열되거나, 재조합적으로 발현될 수 있다. 항체의 항-IL-20 Fab 단편의 친화도는 표면 플라즈몬 공명(BlAcore3000TM 표면 플라즈몬 공명(SPR) 시스템, 뉴저지주 피스카웨이(Piscaway) 소재의 BIAcore, INC)을 이용하여 결정될 수 있다. 운동 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)(일반적으로 25℃에서 측정됨)가 수득되며, 평행 해리 상수(KD) 값은 k_off/k_on으로서 산정된다.

몇몇 실시태양에서, 항체는 인간 IL-20과 결합하고, 다른 유동물 종으로부터의 IL-20과는 유의하게 결합하지 않는다. 몇몇 실시태양에서, 항체는 다른 유동물 종으로부터의 하나 또는 그 이상의 IL-20뿐만 아니라, 인간 IL-20과 결합한다. 또 다른 실시태양에서, 항체는 IL-20과 결합하지만, 기타 사이토카인(예를 들어, 관련 사이토카인인 IL-10, IL-17A, IL-19, IL-22, IL-24 및 IL-26)과는 유의하게 교차 반응하지 않는다. 항체와 결합된 에피토프(들)는 연속적 또는 불연속적일 수 있다. 일 실시태양에서, 항체는 본질적으로 항체 mAb 7E와 동일한 인간 IL-20 에피토프와 결합한다.

항-IL-20 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, IL-20을 억제할 수 있는 항체는 면역원으로써 IL-20 전장 또는 부분 서열을 이용하여 면역화에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로 숙주 동물의 면역화 경로 및 일정은 본원에서 추가로 개시된 바와 같이 항체 자극 및 생성을 위한 확립된 기법 및 통상의 기법과 일치한다. 생쥐, 인간화 항체 및 인간 항체의 생성을 위한 일반적인 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 본원에 개시되어 있다. 인간을 포함하는 임의의 포유동물 대상 또는 이로부터 유래한 항체 생성 세포는 인간을 포함하는 포유동물 세포주 및 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 기반으로서 작용하도록 조작될 수 있는 것으로 고려된다. 전형적으로, 숙주 동물은 본원에 개시된 것을 포함하는 면역원의 양으로 복막내, 근육내, 경구, 피하, 발바닥내, 및/또는 진피내로 접종된다.

하이브리도마는, 문헌[Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256: 495-497]에 개시된 일반적인 체세포 혼성화 기법(somatic cell hybridization technique), 또는 문헌[Buck, D. W. 등, In Vitro, 18: 377-381 (1982)]에 의해 변경된 바와 같은 체세포 혼성화 기법을 이용하여 림프구 및 불멸화된 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. 골수종 X63-Ag8.653, 및 미국 캘리포니아주 샌디애고 소재의 솔크 연구소(Salk Institute)의 세포 분배 센터(Cell Distribution Center)로부터의 골수종 세포주를 포함하지만 이에 한정되지 않는 이용 가능한 골수종 세포주는 혼성화에 이용될 수 있다. 일반적으로, 상기 기법은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 푸소젠(fusogen)을 이용하거나, 당업계의 숙련자에게 널리 공지된 전기 수단을 이용하여 골수종 세포와 림프계 세포를 융합하는 단계를 포함한다. 융합 이후에 세포는 융합 배지로부터 분리되어, 히포크산틴-아미놉테린-티미딘(HAT) 배지와 같은 선택적 성장 배지에서 성장하여, 혼성화되지 않은 모세포를 제거한다. 혈청이 보충되거나 보충되지 않은, 본원에 개시된 임의의 배지가 단일 클론성 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 세포 융합 기법의 다른 대안으로서, EBV-불멸화된 B 세포는 본 발명의 항-IL-20 단일 클론성 항체를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 하이브리도마는 필요한 경우에 팽창되거나 하위클로닝되며, 상층액은 통상적인 면역 검증 과정(예를 들어, 방사 면역검증법, 효소 면역검증법 또는 형광 면역검증법)을 이용하여 항-면역원 활성에 대해 시험한다.

항체의 공급원으로서 이용할 수 있는 하이브리도마는, IL-20에 대해 특이적인 단일 클론성 항체 또는 이의 일부분을 생산하는 모 하이브리도마의 모든 유도체 및 자손 세포를 포함한다.

이 같은 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 과정을 이용하여 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 성장할 수 있다. 단일 클론성 항체는, 필요한 경우에 황산암모늄 침전(ammonium sulfate precipitation), 겔 전기영동(gel electrophoresis), 투석(dialysis), 크로마토그래피(chromatography) 및 한외여과(ultrafiltration)와 같은 통상적인 면역글로빈 정제 과정을 통해 배양 배지 또는 체액으로부터 단리될 수 있다. 목적하지 않는 활성이 존재하는 경우, 이러한 활성은, 예를 들어 고체 상태에 부착된 면역원으로 제조된 흡착제 상으로 침전물을 흘러 보내고, 상기 면역원으로부터 목적하는 항체를 용출하거나 방출함으로써 제거될 수 있다.

이작용성 약제(bifunctional agent) 또는 유도제(derivatizing agent), 예를 들어 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)(리신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물(glutar aldehyde, succinic anhydride), SOCl₂ 또는 R1N=C=NR(여기서, R 및 R1은 서로 다른 알킬기임)를 이용하여, 인간 IL-20, 또는 면역화될 종에서 면역원성인 단백질에 접합된 표적 아미노산 서열을 포함하는 단편, 예를 들어 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민(serum albumin), 소 갑상선글로불린(bovine thyroglobulin), 또는 대두 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor)에 의한 숙주 동물의 면역화는 항체의 개체군(예를 들어, 단일 클론성 항체)을 수득할 수 있다.

필요한 경우, 해당되는 항-IL-20 항체(단일 클론성 또는 다클론성 항체)(예를 들어 하이브리도마에 의해 생성됨)는 시퀀싱(sequencing)될 수 있으며, 이어 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 또는 증식용 벡터에 클로닝될 수 있다. 해당되는 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포 내 벡터에 유지될 수 있으며, 이어 숙주 세포는 추후 사용을 위해 팽창되거나 동결될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화"하기 위해, 또는 항체의 친화도 또는 기타 특징을 향상시키기 위해 유전적 조작용으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역은, 항체가 인간에서 임상 실험 및 치료에 사용되는 경우 면역 반응을 피하기 위해 인간 불변 영역과 더욱 유사하도록 조작될 수 있다. IL-20에 대한 보다 큰 친화도, 및 IL-20 억제시 보다 높은 효율을 달성하기 위해 항체 서열을 유전적으로 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 변경이 항-IL-20 항체에 대해 이루어질 수 있으며, IL-20에 대한 결합 성능을 여전히 유지할 수 있다는 것이 당업계의 숙련자에게 자명할 것이다.

"인간화" 항체는 일반적으로 비-인간 종의 면역글로빈으로부터 실질적으로 유래한 항원 결합 부위 및 인간 면역글로빈의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자의 나머지 면역글로빈 구조를 갖는 분자를 지칭한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인 상에 융합된 완전한 가변 도메인, 또는 가변 도메인에서 적절한 골격 영역 상에 이식된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형이거나, 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있으며, 예를 들어 인간 면역글로빈과 더욱더 유사하도록 변형될 수 있다. 인간화 항체의 몇몇 형태는 CDR 서열(예를 들어, 생쥐 항체로부터의 6개의 CDR 모두를 포함하는 인간화 생쥐 항체) 모두를 보존하고 있다. 인간화 항체의 기타 형태는 원형 항체에 대해 변경된 하나 또는 그 이상(1, 2, 3, 4, 5 및 6개)의 CDR을 갖는다. 몇몇의 경우, 인간 면역글로빈의 골격 영역(FR) 잔기 또는 기타 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 기증자 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 인간화는 또한 친화도 증진(affinity maturation)을 포함할 수도 있다.

또 다른 대안으로서, 완전한 인간 항체는, 특정 인간 면역글로빈 단백질을 발현하기 위해 조작되었던 상업적으로 이용 가능한 생쥐를 이용하여 수득될 수 있다. 또한 보다 바람직하거나(예를 들어, 완전한 인간 항체) 보다 강력한 면역 반응을 야기하기 위해 디자인된 형질전환 동물은 인간화 항체 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예로는 Xenomouse^®((캘리포니아주 프리몬트 소재의 Amgen, Inc.) 및 HuMAb-Mouse^® 및 TC Mouse^TM(뉴저지주의 프린스톤 소재의 Medarex, Inc.)이 있다. 다른 대안으로서 항체는 파지 발현 기술(phage display technology)에 의해 재조합적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,565,332호; 5,580,717호; 5,733,743호; 및 6,265,150호, 및 문헌[Winter 등,(1994) Annu. Rev . Immunol . 12: 433-455]을 참조한다. 대안적으로, 파지 발현 기술(McCafferty 등, (1990) Nature 348: 552-553)은 면역화되지 않은 기증자의 면역글로빈 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생산하기 위해 이용될 수 있다.

단일 클론성 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정에 의해 (예를 들어, 단일 클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브(probe)를 이용함으로써) 용이하게 단리되어, 시퀀싱될 수 있다. 하이브리도마 세포는 이 같은 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 DNA가 단리되면, 상기 DNA는 하나 또는 그 이상의 발현 벡터 상에 배치될 수 있으며, 이어 상기 발현 벡터는 E. coli 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포, 또는 다르게는 면역글로빈 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 단일 클론성 항체의 합성을 구현한다. 예를 들어, PCT 공개공보 제 WO 87/04462호를 참조한다. 또한 DNA는, 예를 들어 상동성 쥐 서열(Morrison 등, (1984) Proc . Nat . Acad . Sci . 81: 6851) 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환하거나, 비-면역글로빈 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 모두 또는 일부를 면역글로빈 코딩 서열에 공유 결합함으로써 변형될 수 있다. 이 같은 방식으로, 본원에서 항-IL-20 단일 클론성 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메릭" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.

항-IL-20 항체는 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 특성 부여(characterizing)될 수 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 항체가 결합하는 에피토프를 식별(identification)하는 것, 즉 "에피토프 매핑(mapping)"이다. 항체-항원 복합체의 결정 구조의 해석, 경쟁반응 검증법(competition assay), 유전자 단편 발현 검증법, 및 합성 펩티드-계 검증법을 포함하여, 단백질 상의 에피토프의 위치를 매핑하고 특성 부여하기 위한 당업계에 공지된 많은 방법이 있으며, 이러한 방법은, 예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]의 11장에 개시된 바와 같다. 부가적인 예로서, 에피토프 매핑은 항-IL-20 항체가 결합하는 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 에피토프는, 예를 들어 단일 유형(single stretch)의 아미노산에 포함된 선형 에피토프이거나, 필수적으로 단일 유형(일차 구조의 선형 서열)으로 포함될 수 없는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 구조 에피토프일 수 있다. 다양한 길이(예를 들어, 적어도 4 내지 6개의 아미노산 길이)를 갖는 펩티드가 단리되고 합성(재조합적으로 합성)될 수 있으며, 항-IL-20 항체의 결합 검증을 위해 이용될 수 있다. 다른 예로, 항-IL-20 항체가 결합하는 에피토프는 IL-20 서열로부터 유래한 중첩 펩티드를 이용함으로써, 그리고 항-IL-20 항체에 의한 결합을 결정함으로써 조직적인 스크리닝(systematic screening)으로 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검증법에 따라 IL-20을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 무작위로 단편화되거나, 특정 유전적 구조에 의해 단편화되며, 시험될 항체와 IL-20의 발현된 단편의 반응이 결정된다. 예를 들어, 유전자 단편은 PCR에 의해 제조되고, 전사된 후, 방사성 아미노산의 존재하에 시험관 내에서 단백질로 번역될 수 있다. 이어, 방사능 표지된 IL-20 단편에 대한 항체의 결합은 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정된다. 또한 특정 에피토프는 파지 입자(파지 라이브러리(phage library))의 표면 상에 표시되는 무작위 펩티드 서열의 방대한 라이브러리를 이용함으로써 식별될 수 있다. 대안적으로, 중첩 펩티드 단편의 한정된 라이브러리는 단순 결합 검증법에서 시료 항체에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다.

부가적인 예로서, 항원 결합 도메인의 돌연변이 유발, 도메인 스와핑(domain swapping) 실험, 및 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발(alanine scanning mutagenesis)은 에피토프 결합에 요구되고, 충분하고, 및 또는 필요한 잔기를 식별하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 도메인 스와핑 실험은, IL-20 폴리펩티드의 다양한 단편이 밀접하게 관련이 있지만 항원적으로 상이한 단백질(예를 들어, 뉴트로핀(neurotrophin) 단백질 부류의 다른 멤버)로부터의 서열과 교체(스와핑)되었던 돌연변이 IL-20을 이용하여 수행될 수 있다. 돌연변이 IL-20에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정 IL-20 단편의 중요성을 평가할 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 본원에 개시된 항체는 mAb 7E에 의해 인식되는 IL-20 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 개시된 항체는 IL-20 폴리펩티드(예를 들어, 인간 IL-20)에 대한 mAb 7E의 결합을 경쟁하거나 유의하게 억제한다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 개시된 항체는, IL-20 폴리펩티드 결합하기 위한 항체 mAb 7E의 중쇄 가변 영역 및/또는 mAb 7E의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다.

항-IL-20 항체를 특성 부여하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 방법은, 항-IL-20 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해 동일한 항원에 결합하는 것으로 알려져 이는 기타 항체, 예를 들어 IL-20의 다양한 단편과의 경쟁반응 검증법을 이용하는 것이다. 경쟁반응 검증법은 당업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 경쟁반응 검증법은 2개의 항체가 동일하거나 입체적으로 중첩된 에피토프를 인지함으로써 동일한 에피토프와 결합하는지, 또는 하나의 항체가 항원에 대해 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이들 검증법은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로 인간 IL-20에 대한 mAb 7E의 결합은, 경쟁 항체의 양을 증가시키면서 배양하는 경우 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상 감소한다. 항체가 결합하는 매핑을 위해 사용될 수 있는 기타 방법은 문헌[Morris (1996) "Eoutioe Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology v. 66(뉴저지 토토와 소재의 Humana Press)]에 제공된다.

기타 IL -20 길항제

항-IL-20 항체 이외의 IL-20 길항제가 사용될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제는 작용성 IL-20의 발현을 차단하거나 감소시킬 수 있는 적어도 하나의 안티센스 분자를 포함한다. IL-20의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있으며, 공적으로 이용 가능한 데이터베이스로부터 용이하게 입수할 수 있다. 예를 들어, 유전자은행 등록 번호 NM 018724.3 및 NP 061194.2를 참조한다. 기타 폴리뉴클레오티드와 교차 반응없이 IL-20 mRNA와 특이적으로 결합할 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자를 제조하는 것이 일상적이다. 예시적인 표적 부위로는 개시 코돈, 5' 조절 영역, 코딩 서열 및 3' 비번역 영역을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 100개의 뉴클레오티드의 길이, 약 15 내지 50개의 뉴클레오티드의 길이, 18 내지 25개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 포스포로티오에이트 연결, 및 당업계에 널리 공지된 2'-O 당 변형과 같은 골격 변형을 포함할 수 있다.

대안적으로, 당업계에 널리 공지된, 유전자 넉다운(gene knockdown), 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(siRNA 또는 RNAi), 마이크로 RNA 또는 리소자임 및 방법을 이용하여 IL-20 발현 및/또는 방출을 감소시킬 수 있다.

기타 실시태양에서, IL-20 길항제는 적어도 하나의 IL-20 억제 화합물을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "IL-20 억제 화합물"은 직접적으로 또는 간접적으로 IL-20 생물 활성을 감소, 억제 또는 중화하거나 없애는 항-IL-20 항체 이외의 화합물을 지칭한다. IL-20 억제 화합물은 임의의 하나 또는 그 이상의 하기 특징을 나타내야 한다: (a) IL-20에 결합하여, IL-20 생물 활성, 및/또는 IL-20 신호 전달 기능에 의해 매개되는 다운스트림 경로를 억제; (b) 골다공증 또는 류마티스 관절염의 임의의 양상을 예방, 완화 또는 치료; (c) IL-20 수용체 활성화를 차단 또는 감소; (d) IL-20의 간극(clearance)을 증가; 및 (e) IL-20 합성, 생성 또는 방출을 억제(감소). 당업계의 숙련자라면 기타 작은 분자인 IL-20 억제 화합물을 제조할 수 있다.

몇몇 실시태양에서, IL-20 억제 화합물은 IL-20 수용체에 결합할 수 있지만, 신호 전이(signal transduction)를 유도할 수 없는 IL-20 돌연변이체이다. 몇몇 실시태양에서, IL-20 억제 화합물은 야생형 IL-20의 IL-20 수용체에 대한 결합을 차단하여, IL-20 신호 전이를 방지하는 IL-20 돌연변이체이다.

몇몇 실시태양에서, IL-20 억제 화합물은 작은 분자를 포함하며, 작은 분자는 임의의 약 100 내지 20,000 달톤, 약 500 내지 15,000 달톤, 또는 약 1000 내지 10,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 작은 분자의 라이브러리는 상업적으로 이용 가능하다. 작은 분자는 흡입, 또는 복막내, 정맥내, 근육내, 피하, 척수내, 뇌실내(intraventricularly), 경구, 장내, 비경구, 비강내 또는 진피내 투여를 비롯한, 당업계에 공지된 임의의 수단을 이용하여 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 IL-20-길항제가 작은 분자인 경우, 이는 환자의 체중(kg)에 대해 0.1 내지 300 mg의 양으로 1회 또는 3회 이상의 분량으로 나누어 투여될 것이다. 정상 체중을 갖는 성인 환자의 경우, 투여 당 1 mg 내지 5 g 범위의 투여량으로 투여될 수 있다.

몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제는 IL-20 수용체(예를 들어, IL-20R1, IL-20R2 또는 IL-22R1)의 세포외 부분(예를 들어, 세포외 도메인)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하되, 상기 폴리펩티드는 11-20에 특이적으로 결합하여, 하나 또는 그 이상의 IL-20 수용체와의 상호작용을 차단한다. 몇몇 실시태양에서, IL-20 수용체의 세포외 부분은 면역글로빈(Ig) 분자(예를 들어, 인간 면역글로빈)의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역 모두 또는 일부와 같은 불변 영역 폴리펩티드에 융합되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 중쇄의 불변 영역은 CH1 도메인, CH2 도메인, 및 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결시키는 힌지(hinge) 서열로 구성되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 경쇄의 불변 영역은 CL 도메인으로 구성되어있다. 몇몇 실시태양에서, 수용체의 세포외 부분은 항체의 Fc 도메인에 융합되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 폴리펩티드 길항제는 이량체(예를 들어, 단일성 이량체 또는 이질성 이량체)이다. 세포외 도메인 및 가용성 수용체의 예가 PCT 공개공보 제 WO 01/046232호에 개시되어 있다.

IL -20 길항제의 식별

항-IL-20 항체 및 기타 IL-20 길항제는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 식별될 수 있거나, 특성 부여될 수 있으며, 그로 인해 IL-20 생물 활성의 감소, 완화 또는 중화가 검출되고 및/또는 측정된다. 예를 들어, ELISA 타입 검증법은, IL-20 캐스케이드를 통해 활성화된 단백질의 인산화를 측정함으로써 IL-20 매개 키나제(kinase) 활성화를 정성적으로 또는 정량적으로 측정하기에 적합할 수 있다. 예로는 JNK, ERK, AKT, p38, STAT3 및 TRAF6이 있다.

IL-20 길항제는 IL-20와 함께 후보 약제를 배양하고 하나 또는 그 이상의 하기 특징을 모니터링함으로써 식별될 수도 있다: (a) IL-20에 결합하여, IL-20 생물 활성 및/또는 IL-20 신호 전달 기능에 의해 매개되는 다운스트림 경로를 억제; (b) 골다공증 또는 류마티스 관절염의 임의의 양상을 예방, 완화 또는 치료; (c) IL-20 수용체 활성화를 차단 또는 감소; (d) IL-20의 간극을 증가; 및 (e) IL-20 합성, 생성 또는 방출을 억제(감소). 몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제는 IL-20과 함께 후보 약제를 배양하고, IL-20의 결합 및, IL-20의 생물 활성의 부차적인 감소 또는 중화를 모니터링함으로써 식별될 수 있다. 결합 검증법은 정제된 IL-20 폴리펩티드(들)를 이용하거나, IL-20 폴리펩티드(들)를 자연적으로 발현하거나 이를 발현하도록 형질 감염된 세포를 이용하여 수행될 수 있다. 일 실시태양에서, 결합 검증법은 경쟁적 결합 검증법으로, 후보 항체가 IL-20 결합을 위해 공지된 IL-20 길항제와 경쟁하는 능력을 평가하였다. 상기 검증법은 ELISA 포맷(format)을 포함하는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 기타 실시태양에서, IL-20 길항제는 IL-20과 함께 후보 약제를 배양하고, IL-20R1/IL-20R2 복합체 형성 또는 IL-20R2/IL-22R1 복합체 형성의 부차적인 억제를 모니터링함으로써 식별된다. 초기 식별 이후, 후보 항-IL-20 길항제의 활성은 표적화된 생물 활성을 시험하도록 공지된 생물 검증법에 의해 추가로 확인되고 정련될 수 있다. 대안적으로, 생물 검증법은 후보 물질을 직접 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.

하기에 제공된 실시예는 후보 IL-20 길항제를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는 다수의 검증법을 제공한다. 생물 검증법으로는 HUVEC 세포의 증식에 대한 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 검증법; 예를 들어 TRAP 염색법에 의해 측정된 바와 같은 파골세포 분화에 대한 후보 약제의 분석; 후보 IL-20 길항제의 존재하에 세포에 대한 IL-20의 경쟁적 결합을 결정하기 위한 유동 세포분석법; 및 신장 상피 세포에서 IL-20 유도 세포 사멸(apoptosis)의 억제를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 부가적으로, RT-PCR 또는 실시간 PCR은 IL-20 발현을 직접 측정하거나, TNF-α, MCP-I, IL-1β, IL-6 및 VEGF와 같이 IL-20에 의해 상향 조절된 유전자의 발현을 측정하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물

본 발명의 방법에서 사용되는 조성물은 하나 또는 그 이상의 IL-20 길항제(예를 들어, 항-IL-20 항체)를 유효량으로 포함하며, 몇몇 실시태양에서는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 조성물은 본원에서 개시된 임의의 방법에서 사용을 목적으로 한다. IL-20 길항제의 예가 본원에 개시되어 있다. 조성물은 하나 또는 그 이상의 IL-20 길항제를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 조성물은 IL-20 길항제 부류의 하나 이상의 멤버(예를 들어, IL-20의 상이한 에피토프를 인식하는 항-IL-20 항체의 혼합물)뿐만 아니라, 다른 IL-20 길항제 부류의 멤버(예를 들어, 항-IL-20 항체 및 IL-20 억제 화합물)를 포함할 수 있다. 기타 예시적인 조성물은 동일한 에피토프(들)를 인식하는 하나 이상의 항-IL-20 항체, IL-20의 상이한 에피토프에 결합하는 상이한 종의 항-IL-20 항체, 또는 상이한 IL-20 억제 화합물을 포함한다.

본 발명에서 사용된 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover)를 냉동 건조된 제형 또는 수용액의 형태로 추가로 포함할 수 있다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 독성이 없으며, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 염화물; 벤잘코늄 염화물; 벤제토늄 염화물; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소시놀(resorcinol); 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로빈과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN^TM, PLURONICS^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 본원에서 추가로 개시되어 있다.

본원에서 개시되고 선택적으로는 에타너셉트 폴리펩티드와 결합된 항체가 류마티스 관절염 또는 골다공증을 치료하기 위해 사용되는 경우, 항체는 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합되어 약학 조성물을 형성할 수 있다. "허용 가능한"이란 용어는 담체가 조성물의 활성 성분과 상용성이어야 하며(바람직하게는 활성 성분을 안정화시킬 수 있어야 하며), 치료될 대상에 유해하지 않아야 한다는 것을 의미한다. 적합한 담체로는 미정질 셀룰로스, 만니톨, 글루코스, 탈지 분말, 폴리비닐피롤리돈, 및 전분 또는 이들의 조합을 포함한다.

의학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 통상적인 방법은, 치료될 질병의 유형 또는 질병 부위에 따라 항-IL-20-항체 함유 약학 조성물을 대상에 투여하기 위해 사용될 수 있다. 류마티스 관절염을 치료할 목적으로 항체 함유 조성물은 주사를 통해 활액 관절에 직접 전달될 수 있다. 또한 이러한 조성물은 기타 통상적인 경로, 예를 들어 피하 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 부가적으로는 조성물이, 1개월, 3개월 또는 6개월 데포 주사용 생분해 물질 및 방법의 이용과 같은 주사용 데포 투여 경로를 통해 대상에 투여될 수 있다.

주사용 조성물은 식물유, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 및 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)과 같은 다양한 담체를 포함할 수 있다. 정맥 주사액에 있어서, 수용성 항체는 낙하 방법에 의해 투여될 수 있으며, 따라서 항체 및 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 함유하는 약학 제형이 주입된다. 생리학적으로 허용 가능한 부형제는, 예를 들어 5% 덱스트로스, 0.9% 생리 식염수, 링거액 또는 기타 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 투여 제제, 예를 들어 항체의 적합한 가용성 염의 형태인 멸균 제형은 주사용수(Water-for-Injection), 0.9% 생리 식염수, 또는 5% 글루코스 용액과 같은 약학 부형제에 용해되어 투여될 수 있다.

본 명세서에서 제공된 방법을 실시하기 위해, 상술한 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여되거나, 흡입형 분부에 의해 투여될 수 있으며, 또한 국부, 직장,비강, 구강 또는 질내로 투여되거나, 주입된 용기를 통해 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "비경구"란 용어는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활액내, 흉골내, 척수내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기법을 포함한다.

멸균 주사용 조성물, 예를 들어 멸균 주사용 수용성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들어, Tween^® 80) 및 현탁제를 이용하여 당업계에 공지된 기법에 따라 제형화될 수 있다. 또한 멸균 주사용 조성물은 비독성이며 비경구 투여용으로 이용 가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 본원에서 이용될 수 있는 허용 가능한 부형제 및 용매 중에는 만니톨, 물, 링거액 및 염화나트륨 등장 용액이 있다. 부가적으로, 멸균된 고정유는 용매 또는 현탁 매질(예를 들어, 합성 모노- 또는 디-글리세라이드)로서 통상적으로 이용된다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산은 올리브유 또는 캐스터유와 같은 천연의 약학적으로 허용 가능한 오일인 주사용 물질의 제조, 특히 이들의 폴리옥시에틸화 형태인 주사용 물질의 제조에 유용하다. 또한 이들 오일 용액 또는 현탁액은 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제, 또는 카복실메틸 셀룰로스 또는 유사한 분산제를 포함할 수도 있다. Tween 또는 Span, 또는 약학적으로 허용 가능한 고체, 액체 또는 기타 투여 형태의 제조에 일반적으로 사용되는 기타 유사한 유화제 또는 생체 이용성 증강제(bioavailability enhancer)와 같이 일반적으로 사용되는 기타 계면활성제가 제제를 목적으로 사용될 수 있다.

경구 투여용 조성물은 임의의 경구 투여용으로 허용 가능한 투여 형태일 수 있으며, 이 같은 투여 형태는 캡슐, 정제, 유제 및 수용성 현탁액, 분산액 또는 용액을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 경구용 정제의 경우, 통상적으로 이용되는 담체로는 락토스 및 옥수수 전분을 들 수 있다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제도 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여용으로 유용한 희석제는 락토스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수용성 현탁액 또는 유제가 경구 투여되는 경우, 활성 성분은 유제 또는 현탁제와 결합된 오일 상(oily phase)에 현탁되거나 용해될 수 있다. 필요한 경우, 특정의 감미제, 향미제 또는 착색제가 첨가될 수 있다. 비강 투여용 에어로졸 또는 흡입 조성물은 약학 제형 분야에 널리 공지된 기법에 따라 제조될 수 있다. 옥사디아졸 화합물 함유 조성물은 직장 투여용 좌제의 형태로 투여될 수도 있다.

IL-20 길항제 및 이의 조성물도 또한 약제의 효능을 증가시키고 및/또는 보충하도록 작용하는 기타 약제와 함께 사용될 수 있다.

IL -20 길항제의 투여 및 치료에 대한 평가

본 발명은 개인에 있어서 골다공증을 치료하거나, 발병을 지연하거나 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 상술한 바와 같이, IL-20은 파골세포의 발생 및 활성화에서 RANKL-RANK 신호 전달 캐스케이드의 업스트림(upstream)에서 작용하는 파골세포 형성 사이토카인이다. IL-20의 과발현은 파골세포 분화를 자극할 수 있으며, 이로 인해 골다공증과 연관된 골 손실을 치료하는 능력을 감소시킬 수 있다.

골다공증을 발생시키는 위험성을 증가시키는 다수의 인자가 존재하다. 예를 들어, 골다공증은 폐경기 이후에 발생하는 낮은 에스트로겐 수준과 연관되어 있다. 또한 낮은 에스트로겐 수준은 수술에 의한 양쪽 난소의 조기 제거의 결과 일 수 있다. 부가적으로, 화학 요법은 난소에 대한 화학 요법의 독성 효과의 결과로서 조기 폐경을 초래할 수 있다. 실시예에 나타나 있는 바와 같이, IL-20 길항제는 난소 적출 생쥐에서 골다공성 효과를 완화시켰다. 따라서 본원에 개시된 IL-20 길항제는, 유효량의 IL-20 길항제를 투여함으로써 폐경기가 지난 개인에 있어서 골다공증을 치료하거나 발병을 지연하거나 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.

또한 골다공증은 호르몬 절제 치료로부터 유래할 수 있다. 전립선암 및 유방암 둘 모두에서 환자는 호르몬 제거 요법, 예를 들어 전립선암의 경우에 안드로겐 제거 요법 및 유방암의 경우에는 에스트로겐 제거 요법을 받는 것이 일반적이며, 이로 인해 골량의 감소 및 골절 위험성의 증가가 야기될 수 있다. 따라서 본원에 개시된 IL-20 길항제는, 유효량의 IL-20 길항제를 투여함으로써 호르몬 제거 요법을 받은 개인에 있어서 골다공증을 치료하거나, 발병을 지연하거나 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.

류마티스 관절염 및 만성 간 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않은 질병으로 인한 만성 염증은 골 손상을 초래할 수 있다. 실시예에서 나타나 있는 바와 같이, IL-20 길항제는 류마티스 관절염의 래트 모델에서 골 손상을 완화시켰다. 따라서 본원에 개시된 IL-20 길항제는 유효량의 IL-20 길항제를 투여함으로써 만성 염증 상태를 앓고 있는 개인에 있어서 골다공증을 치료하거나, 발병을 지연하거나 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.

IL-20 길항제는 임의의 적합한 경로를 통해 대상에 투여될 수 있다. 예를 들어, IL-20 길항제는 경구, 정맥내, 설하, 피하, 동맥내, 활액내, 소낭내(예를 들어, 방광을 통해), 근육내, 심장내, 흉부내, 복막내, 뇌실내, 설하 및 경피내 투여될 수 있으며, 흡입 및 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들은, 예를 들어 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭셔, 현탁액, 시럽, 웨이퍼(wafer), 사탕, 츄잉검 등의 형태로 경구 투여될 수 있으며, 이들은 당업계에 공지된 과정에 의해 제조된다. 본원에 개시된 실시예는 이용 가능한 기법을 한정하기 위함이 아니라 이를 예시하도록 의도된다는 것이 당업계의 숙련자에게 자명해야 한다.

따라서, 몇몇 실시태양에서는 항-IL-20 항체와 같은 IL-20 길항제가 정맥내 투여와 같은 공지된 방법에 따라 개인에 투여되며, 예를 들어 근육내, 복막내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 척수내, 경구, 흡입 또는 국부 경로를 통해 임의의 시간 동안 벌버스(bolus)로서 투여되거나 연속 주입에 의해 투여된다. 제트 네불라이저 및 초음파 네불라이저를 포함한, 액체 제형용으로 상업적으로 이용 가능한 네불라이저가 투여에 유용하다. 액체 제형은 직접 네불라이징(nebulizing)될 수 있으며, 냉동 건조 분말을 재구성한 이후에 네불라이징 수 있다. 대안적으로, IL-20 길항제는 플루오르탄소 제형 및 정량 흡입기(metered dose inhaler)를 이용하여 에어로졸화될 수 있거나, 냉동 건조 분말 및 분유로서 흡입될 수 있다.

일 실시태양에서, IL-20 길항제는 부위 특이적(site- specific) 또는 표적화 국부 전달(targeted local delivery) 기법을 통해 투여된다. 부위 특이적 또는 표적화 국부 전달 기법의 예로는 IL-20 길항제 또는 주입 카테터(catheter), 유치 카테터 또는 바늘 카테터와 같은 국부 전달 카테터의 다양한 이식용 데포 공급원, 합성 이식 조식, 외막 포장지(adventitial wrap), 션트(shunt) 및 스텐트(stent) 또는 기타 이식 장치, 부위 특이적 담체, 직접 주사 또는 직접 도포를 들 수 있다. 예를 들어, PCT 공개공보 제 WO 00/53211호 및 미국 특허 제 5,981,568호를 참조한다.

IL-20 길항제(예를 들어, 항-IL-20 항체)의 다양한 제형은 투여용으로 사용될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제는 그 자체로 투여될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제는 항-IL-20 항체를 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 제형을 포함하는 다양한 제형 내에 존재할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 당업계에 공지되어 있으며, 약리학적 유효 물질의 투여를 조장하는 비교적 불활성인 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 경도를 제공할 수 있으며, 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제로는 안정제, 습윤제, 유제, 삼투성을 변경하기 위한 염, 캡슐, 완충제 및 피부 투과 촉진제를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 비경구 및 경구 약물 전달을 위한 제형뿐만 아니라 부형제가 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 개시되어 있다.

몇몇 실시태양에서, 이들 약제는 주사(예를 들어, 복막내, 정맥내, 피하, 근육내 경로 등)에 의해 투여하기 위해 제형화된다. 따라서 이들 약제는 생리 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 같은 약학적으로 허용 가능한 비히클(vehicle)과 조합될 수 있다. 특정의 투여 계획, 예를 들어 투여량, 투여 시기 및 재현성은 특정 개인 및 개인의 의료 이력에 의존할 것이다.

항-IL-20 항체는, 주사(예를 들어, 복막내, 정맥내, 피하, 근육내 경로 등)에 의한 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법을 이용하여 투여될 수 있다. 또한 항-IL-20 항체는 본원에서 개시된 바와 같이 흡입을 통해 투여될 수도 있다. 일반적으로 항-IL-20 항체의 투여를 위해 후보 물질의 초기 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 전형적인 1일 투여량은 상술한 인자에 따라 임의의 약 0.1 μg/kg 내지 3 μg/kg, 3 μg/kg 내지 30 μg/kg, 30 μg/kg 내지 300 μg/kg, 300 μg/kg 내지 3 mg/kg, 3 mg/kg 내지 30 mg/kg, 30 mg/kg 내지 100 mg/kg, 및 그 이상의 범위일 수 있다. 상태에 따라 수일 또는 그 이상에 걸쳐 반복 투여하는 경우, 증상의 목적하는 억제가 나타나거나, 골다공증 또는 류마티스 관절염을 감소시키기에 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 치료를 유지한다. 예시적인 투여 계획은 항-IL-20 항체를 약 2 mg/kg의 초기 투여량으로 투여한 후, 매주 약 1 mg/kg의 투여량으로 유지하거나, 격주로 약 1 mg/kg의 투여량을 유지하는 것을 포함한다. 그러나 기타 투여 계획은 의료인이 달성하기를 원하는 약물 동력학적 부식 패턴에 따라 유용할 수 있다. 예를 들어, 주 1 내지 4회 투여가 고려된다. 몇몇 실시태양에서 약 3 μg/mg 내지 약 2 mg/kg(예를 들어, 약 3 μg/mg, 약 10 μg/mg, 약 30 μg/mg, 약 100 μg/mg, 약 300 μg/mg, 약 1 mg/kg 및 약 2 mg/kg) 범위의 투여가 이용될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 투여 빈도는 매주, 2주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주 또는 10주마다 1회이거나, 매달, 2달, 3달 또는 그 이상마다 1회이다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기법 및 검증법에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 계획(사용된 IL-20 길항제(들)를 포함함)은 시간이 지남에 따라 변할 수 있다.

일반적으로, IL-20 길항제가 항체가 아닌 경우, IL-20 길항제는 (몇몇 실시태양에서) 환자의 체중(kg)에 대해 약 0.1 내지 300 mg의 양으로 1회 또는 3회 이상의 분량으로 나누어 투여될 수 있으며, 본원에 개시된 바와 같이 투여될 수 있다. 몇몇 실시태양에서 정상 체중을 갖는 성인 환자의 경우에 약 0.3 내지 5.00 mg/kg 범위의 투여량으로 투여될 수 있다. 특정의 투여 계획, 예를 들어, 투여량, 투여 시기 및 재현성은 개별 약제의 특성(예를 들어, 약제의 반감기, 및 당업계에 널리 공지된 기타 고려 사항)뿐만 아니라, 특정 개인 및 개인의 의료 이력에 의존할 것이다.

본 발명의 목적을 위하여, IL-20 길항제의 적합한 투여량은, 사용된 IL-20 길항제(들)(또는 이의 조성물), 치료될 골다공증 또는 류마티스 관절염의 유형 및 중증도, 약제가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 이전의 요법, 환자의 임상 이력 및 약제에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 것이다. 전형적으로, 임상의는 목적하는 결과를 달성하기 위한 투여량에 도달할 때까지 항-IL-20 항체와 같은 IL-20 길항제를 투여할 것이다.

반감기와 같은 경험적 고려 사항이 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체와 같이 인간 면역계와 양립할 수 있는 항체를 이용하여 항체의 반감기를 연장하고, 숙주의 면역계에 의해 항체가 공격당하는 것을 방지할 수 있다. 투여 빈도는 치료 과정 동안에 결정되거나 조절될 수 있으며, 필수적인 것은 아니지만 일반적으로 골다공증의 치료 및/또는 억제 및/또는 완화 및/또는 지연에 기초한다. 대안적으로 항-IL-20 항체의 연속 서방형 제형이 적합할 수 있다. 지속적 방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 장치가 당업계에 공지되어 있다.

일 실시태양에서, IL-20 길항제의 투여량은 IL-20 길항제(예를 들어, 항체)를 1회 이상 투여받은 개인에 있어서 경험적으로 결정될 수 있다. 개인은 IL-20 길항제, 예를 들어, 항-IL-20 항체를 증가하는 양으로 투여받는다. IL-20 길항제의 효능을 평가하기 위해, 골다공증(예를 들어, 골 무기질 밀도) 또는 류마티스 관절염(예를 들어, 관절에서의 부종, 통증, 경직 및 조직 파괴)의 반응 지시약(indicator)을 뒤이어 투여받을 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 IL-20 길항제의 투여는, 예를 들어 수용자의 생리 조건, 투여 목적인 치료용인 지 예방용인 지의 여부, 숙련된 주치의에 공지된 기타 인자에 따라 연속적이거나 간헐적일 수 있다. IL-20 길항제(예를 들어, IL-20 길항제가 항-IL-20 항체인 경우)의 투여는 기설정된 기간 동안에는 본질적으로 연속적일 수 있거나, 예를 들어 골다공증 또는 류마티스 관절염의 발생 전, 발생 도중 또는 발생 이후에 일련의 일정 간격으로 투여될 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 항체와 같은 하나 이상의 IL-20 길항제가 존재할 수 있다. 길항제는 동일하거나 서로 상이할 수 있다. 적어도 한 개, 적어도 두 개, 적어도 세 개, 적어도 네 개, 적어도 다섯 개의 서로 다른 L-20 길항제가 존재할 수 있다. 일반적으로, 이들 IL-20 길항제는 서로에 대해 악영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는다. 또한 IL-20 길항제는 상기 약제의 효능을 증가시키고 및/또는 보충하도록 작용하는 기타 약제와 함께 사용될 수도 있다.

몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제는 다른 약제와 함께 투여된다. 몇몇 실시태양에서, 기타 약제는 류마티스 관절염의 치료 또는 완화용 약제이다. 항-류마티스 관절염 치료제의 예로는 TNF-α 길항제, 예를 들어 TNF가 TNF-수용체에 결합할 때 반영되는 바와 같이 TNF와 결합하여 TNF 활성을 억제하는 폴리펩티드를 들 수 있다. TNF-α 길항제의 예로는 에타너셉트(ENBREL^®), 및 인플릭시맙(infliximab)(REMICADE^®) 및 아달리뮤맙(adalimumab)(HUMIRA^®)과 같은 항-TNF-α 항체를 들 수 있다. 일 예로서 에타너셉트 폴리펩티드는 인간 가용성 TNF 수용체(후술된 서열번호: 5) 및 인간 IgG1의 Fc 성분(예를 들어, 에타너셉트)을 포함하는 융합 단백질이다. 몇몇 실시태양에서, 기타 약제는 골다공증의 치료 또는 완화용 약제이다. 항-골다공증 치료제의 예로는 알렌드로네이트(alendronate), 이반드론네이트(ibandronate), 리세드로네이트(risedronate), 졸레드로닌산(zoledronic acid), 칼시토닌, 에스트로겐, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제, 랄록시펜(raloxifene), 부갑상선 호르몬 및 테리파라티드(teriparatide)를 포함한다.

인간 가용성 TNF 수용체의 아미노산 서열 (서열번호: 5)

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본 발명의 몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제, 예를 들어 mAb 7E 또는 이의 유도체는 류마티스 관절염 또는 골다공증을 치료하기 위해 에타너셉트 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있다. "에타너셉트 폴리펩티드"란 용어는 종양 괴사 인자(TNF)의 가용성 수용체 및 면역글로빈의 Fc 성분을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 일 예로서 가용성 TNF 수용체는 후술된 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 인간 가용성 TNF 수용체 및 이의 작용성 등가물, 예를 들어 서열번호: 5와 85% 이상(예를 들어, 90%, 95% 또는 98%) 동일하고 인간 TNF에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 에타너셉트 폴리펩티드는 통상적인 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 IL-20 길항제(예를 들어, 항체)의 치료 제형은, 목적하는 순도를 갖는 항체를 선택적이면서 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제(Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing(2000))와 혼합함으로써 냉동 건조 제형 또는 수용액의 형태의 저장용으로 제조된다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에 대한 독성이 없으며, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 염; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 염화물; 헥사메토늄 염화물; 벤잘코늄 염화물, 벤제토늄 염화물; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤(예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤); 카테콜; 레소시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로빈과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN^TM, PLURONICS^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.

IL-20 길항제(예를 들어, 항체)를 포함하는 리포좀은 문헌[Epstein 등, Proc. Natl . Acad . Sci USA 82: 3688 (1985)], 문헌[Hwang 등, Proc . Natl Acad . Sci USA 77:4 030 (1980)], 및 미국 특허 제 4,485,045호 및 4,544,545호에 개시된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증가된 리포좀이 미국 특허 제 5,013,556호에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-파생 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용하여 역상 증착법으로 형성될 수 있다. 리포좀은 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득하기 위해 제한된 기공 크기를 갖는 필터를 통해 압출된다.

또한 활성 성분은, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소 구체, 미세유액(macroemulsion), 나노입자 및 나노캡슐) 또는 미세유액에서 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기법에 의해, 또는 계면 중합을 통해 제조된 미세캡슐, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐에 각각 넣을 수 있다. 이 같은 기법은 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 개시되어 있다

서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예로는 항체를 포함하는 소수성 고체 고분자의 반투성 매트릭스를 들 수 있으며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(polylactide)(미국 특허 제 3,773,919호), L-글루탐산과 7-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 난분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, LUPRON DEPOT^TM과 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 미소 구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 들 수 있다.

생체내 투여용으로 사용될 제형은 멸균되어야 한다. 이는, 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료용 항-IL-20 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접속 포트가 구비된 용기, 예를 들어 정맥 주사액 봉투, 또는 피하 주사용 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이얼에 넣는다.

본 발명에 따른 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여를 위해, 또는 흡입 또는 통기에 의한 투여를 위해 정제, 환제, 캡슐제, 분말제, 과립제, 용제 또는 현탁제, 또는 좌제와 같은 단위 투여 형태일 수 있다.

정제와 같은 고체 조성물을 제조하기 위해, 주요 활성 성분을 약학적 담체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 제2 인산칼슘 또는 검, 및 기타 약학적 희석제(예를 들어, 물)와 같은 통상적인 정제 성분(tableting ingredient)과 혼합하여 본 발명의 화합물 또는 이의 비-독성 약학적으로 허용 가능한 염의 균질 혼합물을 포함하는 고체 제형화전 조성물(preformulation composition)을 형성한다. 이들 제형화전 조성물이 균질한 것으로 인용되는 경우에 이는 상기 조성물이 정제, 환제 및 캡슐과 같은 동일한 효능을 갖는 단위 투여 형태로 용이하게 재-구분되도록 활성 성분을 조성물을 통해 균일하게 분산된다는 것을 의미한다. 이어, 이러한 고체 제형화전 조성물은 상술한 유형의 단위 투여 형태로 재-구분되며, 이때 상기 단위 투여 형태는 본 발명의 활성 성분을 0.1 내지 약 500 mg의 함량으로 포함한다. 신규한 조성물의 정제 또는 환제는 코팅되거나, 다르게는 혼합되어 활성의 연장이라는 이점을 부여하는 투여 형태를 제공한다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여 성분 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있으며, 여기서 외부 투여 성분은 내부 투여 성분 위에서 외피의 형태를 갖는다. 이 같은 2개의 성분은 위에서 분해되지 않고 내부 성분이 온전한 상태로 십이지장 내로 통과하도록, 즉 내부 성분의 방출이 지연되도록 작용하는 장용성 피막(enteric layer)에 의해 분리될 수 있다. 다양한 재료는 장용성 피막 또는 코팅용으로 사용될 수 있으며, 이때 상기 재료로는 다수의 고분자산, 및 셀락(shellac), 세틸 알코올 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 재료와 고분자산의 혼합물을 들 수 있다.

특히, 적합한 계면 활성제로는 폴리옥시에틸렌소르비탄(예를 들어, Tween^TM 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 기타 소르비탄(예를 들어, Span^TM 20, 40, 60, 80 또는 85)과 같은 비이온성 약제를 들 수 있다. 편의상, 계면 활성제를 갖는 조성물은 계면 활성제를 0.05 내지 5%의 함량으로 포함할 것이며, 0.1 내지 2.5%의 함량 범위일 수 있다. 필요한 경우, 기타 성분, 예를 들어 만니톨 또는 기타 약학적으로 허용 가능한 비히클을 첨가할 수 있는 것으로 인식될 것이다.

적합한 유제(emulsion)는 Intralipud^TM, Liposyn^TM, Infonutrol^TM, Lipofundin^TM 및 Lipiphysan^TM과 같이 상업적으로 이용 가능한 지방 유제를 이용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 프리믹스된 유제 조성물에 용해되거나, 대안적으로는 오일(예를 들어, 대두유, 홍화유, 면화씨 기름, 참기름, 옥수수 기름 또는 아몬드유), 및 인지질(예를 들어, 달걀 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과 혼합하는 경우에 형성되는 유제에 용해될 수 있다. 기타 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 유제의 탄력성(tonicity)을 조절하기 위해 첨가될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 적합한 유제는 통상적으로 최대 20%의 오일, 예를 들어 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다. 지방 유제는 0.1 내지 1.0 .im, 특히 0.1 내지 0.5 .im 범위의 지방 소적(fat droplet)을 포함할 수 있으며, 5.5 내지 8.0 범위의 pH 값을 가질 수 있다.

유제 조성물은 IL-20 길항제를 Intralipid^TM 또는 이의 성분(대두유, 달걀 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조된 것일 수 있다.

흡입 또는 통기용 조성물은 약학적으로 허용 가능한, 수용성 또는 유기 용매 중의 용액 또는 현탁액 또는 이들의 혼합물, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상술한 바와 같은 적합한 약학적으로 허용 가능한 부형제를 함유할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 조성물은 국부 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강 호흡기 경로로 투여된다. 바람직하게 멸균된 약학적으로 허용 가능한 용매 중의 조성물은 기체를 이용하여 네불라이징될 수 있다. 네불라이징된 용액은 네불라이징 장치로부터 직접 들이마실 수 있거나, 네불라이징 장치가 안면 보호구, 산소 텐트 또는 간헐성 양압 호흡기기에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 적절한 방식으로 제형을 절단하는 장치로부터 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구 또는 비강 투여될 수 있다.

치료 효능은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.

안티센스 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 또는 서브게놈성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물의 표적화된 전달이 또한 이용될 수 있다. 수용체 매개 DNA 전달 기법은, 예를 들어 문헌[Findeis 등, Trends Biotechnol . (1993) 11: 202], 문헌[Chiou 등, Gene Therapeutics: Methods and Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994)], 문헌[Wu 등, J. Biol . Chem . (1988) 263: 621], 문헌[Wu 등, J. Biol . Chem . (1994) 269: 542], 문헌[Zenke 등, Proc . Natl . Acad. Sci USA (1990) 87: 3655], 및 문헌[Wu 등, J. Biol . Chem . (1991) 266: 338]에 개시되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물은 유전자 치료 프로토콜에서 국부 투여를 위해 DNA의 함량이 약 100 ng 내지 약 200 mg 범위가 되도록 투여된다. 몇몇 실시태양에서 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 μg 내지 약 2 mg, 약 5 μg 내지 약 500 μg, 및 약 20 μg 내지 약 100 μg 범위 또는 그 이상의 범위의 DNA 농도가 유전자 치료 프로토콜 도중에 사용될 수도 있다. 본 발명의 치료용 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 이용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스성 또는 비-바이러스성 기원을 가질 수 있다(일반적으로, 문헌[Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1: 51], 문헌[Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5: 845], 문헌[Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1: 185], 및 문헌[Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6: 148] 참조). 이 같은 코딩 서열의 발현은 내생성 포유동물 프로모터 및/또는 인핸서(enhancer) 또는 이종성 프로모터 및/또는 인핸서를 이용하여 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성적이거나 조절될 수 있다.

목적하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 목적하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스계 벡터가 당업계에 널리 공지되어 있다. 예시적인 바이러스계 비히클로는 재조합 레트로바이러스(예를 들어 PCT 공개공보 제 WO 90/07936호; WO 94/03622호; WO 93/25698호; WO 93/25234호; WO 93/11230호; WO 93/10218호; WO 91/02805호; 미국 특허 제 5,219,740호 및 4,777,127호; 유럽 특허 제 2,200,651호; 및 0,345,242호 참조), 알파바이러스계 벡터(예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키 포리스트 바이러스(Semliki forest virus)(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버 바이러스(Ross River virus)(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, PCT 공개공보 제 WO 94/12649호, WO 93/03769호; WO 93/19191호; WO 94/28938호; WO 95/11984호; 및 WO 95/00655호 참조)를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 문헌[Curiel, Hum . Gene Ther . (1992) 3: 147]에 개시된 바와 같은 살상된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 이용될 수 있다.

비-바이러스성 전달 비히클 및 방법이 이용될 수도 있으며, 이 같은 전달 비히클 및 방법으로는 살상된 아데노바이러스 단독과 연결되거나 연결되지 않는 다양이온성 축합 DNA(예를 들어, 문헌[Curiel, Hum . Gene Ther . (1992) 3: 147] 참조); 리간드 결합 DNA(예를 들어, 문헌[Wu, J. Biol. Chem . (1989) 264: 16985] 참조); 진핵세포 전달 비히클 세포(예를 들어, 미국 특허 제 5,814,482호; PCT 공개공보 제 WO95/07994호; WO96/17072호; WO95/30763호; 및 WO97/42338호 참조); 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 순수 DNA(naked DNA)도 또한 이용될 수 있다. 예시적인 순수 DNA 도입 방법이 PCT 공개공보 제 WO 90/11092호 및 미국 특허 제 5,580,859호에 개시되어 있다. 유전자 전달 비히클로 작용할 수 있는 리포좀은 미국 특허 제 5,422,120호; PCT 공개공보 제 WO 95/13796호; WO 94/23697호; WO 91/14445호; 및 유럽 특허 제 0524968호에 개시되어 있다. 부가적인 접근법이 문헌[Philip, Mol . Cell Biol . (1994) 14:2411] 및 문헌[Woffendin, Proc . Natl . Acad . Sci (1994) 91: 1581]에 개시되어 있다.

발현 벡터를 이용하여 본원에 개시된 임의의 단백질계 IL-20 길항제(예를 들어, 항-IL-20 항체, 이뮤노아드헤신(immunoadhesin) 등)의 발현을 지시할 수 있다는 것이 또한 자명하다. 예를 들어, IL-20 및/또는 IL-20 생물 활성을 차단(부분적으로 차단 내지 완전히 차단)할 수 있는 기타 IL-20 수용체 단편이 당업계에 공지되어 있다.

키트

또한 본 발명은 임시 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 하나 또는 그 이상의 용기를 포함하며, 상기 용기는 IL-20 길항제(예를 들어, 본원에 개시된 항체 mAb 7E 또는 이의 유도체와 같은 항체)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서 본 발명의 키트는 본원에 개시된 본 발명의 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, IL-20 길항제는 본원에 개시된 임의의 IL-20 길항제이다. 기타 실시태양에서, 키트는 항-IL-20 항체 이외의 IL-20 길항제를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 키트는 항-IL-20 항체(예를 들어, 본원에 개시된 항체 mAb 7E)를 포함한다. 기타 실시태양에서, 키트는 항체 mAb 7E의 하나 또는 그 이상의 CDR(들)(예를 들어, mAb 7E로부터의 1, 2, 3, 4 또는 5 개 또는 몇몇 실시태양의 경우 6개 모두의 CDR)을 포함하는 항-IL-20 항체를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 내장된 지침서는 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 골다공증 또는 류마티스 관절염을 치료하거나, 발병을 지연하거나 도는 예방하기 위해 IL-20 길항제의 투여에 대한 상세내용을 포함한다. 키트는 개인이 골다공증 또는 류마티스 관절염을 앓고 있는 지에 대한 인식에 기초하여 치료에 적합한 개인을 선별하는 내용을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 지침서는 골다공증 또는 류마티스 관절염의 위험성이 있는 개인에 IL-20 길항제를 투여하는 내용을 포함한다.

IL-20 길항제의 사용과 관련한 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 계획 및 투여 경로와 같은 정보를 포함한다. 용기는 단위 투여량, 벌크 패키지(예를 들어, 분할 투여 패키지) 또는 하위 단위 투여량일 수 있다. 본 발명의 키트에 제공된 지침서는 전형적으로 라벨(label) 또는 패키지 삽입물(package insert)(예를 들어, 키트에 포함된 종이) 상에 쓰여진 지침서이지만, 기계 판독 가능한 지침서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 포함된 지침서)도 또한 이용 가능하다.

라벨 또는 패키지 삽입물에는 조성물이 골다공증을 치료, 발병의 지연 및/또는 예방하기 위해 사용된다고 표시되어 있다. 지침서는 본원에 개시된 임의의 방법을 실행하기 위해 제공될 수 있다.

본 발명의 키트는 적합한 포장용기 내에 있다. 적합한 포장용기로는 바이얼, 병, 단지, 연성 포장용기(예를 들어, 밀봉 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 봉지) 등을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 분사기(atomizer)) 또는 소형 펌프와 같은 주입 장치와 함께 사용하기 위한 포장 요기가 또한 고려되고 있다. 키트는 멸균 접속 포트(access port)를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥 주사액 봉투, 또는 피하 주사용 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이얼일 수 있다. 또한 용기는 멸균 접속 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥 주사액 봉투, 또는 피하 주사용 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이얼일 수 있다. 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 항-IL-20 항체와 같은 IL-20 길항제이다. 용기는 TNF-α 길항제 또는 골다공증을 치료하기 위한 다른 약제와 같은 제 2 약학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.

키트는 선택적으로 완충제와 같은 부가적인 성분 및 해설 정보를 제공할 수 있다. 정상적으로 키트는 용기, 및 상기 용기 상에 있거나 이와 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명은 상술한 키트의 내용물을 포함하는 제품을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 키트는 골다공증 또는 류마티스 관절염을 치료하기 위한 용도를 나타낸 정보와 함께 IL-20 길항제(예를 들어, 항-IL-20 항체)를 포함한다.

당업계의 숙련자라면, 추가의 상세한 설명 없이도 상기 설명에 기초하여 본 발명을 최대 범위로 이용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서 하기 특정의 실시예는 단지 예시적이지, 어쨌든 임의의 방식으로 나머지 개시 내용을 한정하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 인용된 모든 공개공보, 인용문헌, 특허 및 특허 출원서는 본원에서 전체가 참고로 인용된다.

실시예

실시예 1. 단일 클론성 항체 7E( mAb 7E)로 류마티스 관절염의 치료

콜라겐 유도 관절염(collagen-induced arthritis, CIA)을 앓고 래트는 인간 류마티스 관절염을 연구하기 위한 개발된 동물 모델이다. 이러한 모델은 이러한 질병을 치료하기 위한 mAb 7E의 효능을 검사하기 위해 본 연구에 이용될 수 있다.

CIA는 8주령의 수컷 스프라그 다울리(Sprague-Dawley) 래트에서 하기와 같이 유도되었다. 래트는 200 μl의 유제를 진피내 주사(등 부분)함으로써 최초로 면역화되었으며, 이때 상기 유제는 프로인트(Freund) 완전 보조제, 4 mg/ml의 가열 살균된 Mycobacterium tuberculosis(워싱턴주 레드몬드의 콘드렉스 소재의 Arthrogen-CIA), 및 2형 소 콜라겐(CII; 2 mg/ml로 0.05M 아세트산에 용해됨)을 1:1:1의 부피비로 함유한다. 8일 후, 래트의 면역 반응을 증강시키기 위해 이의 꼬리 끝부분에 앞서 상술한 100 μl의 유제로 피하 주사하였다. 최초 면역화 이후 11일 내지 13일 사이에 이들 래트에서 CIA를 관측하였다.

하기 4개의 그룹의 래트(n=5)를 본 연구에 적용하였다: 그룹 1: 건강한 래트; 그룹 2: 상술한 바와 같이 CIA 발병 1주 후에 PBS가 투여(피하 투여)된 CIA 래트; 그룹 3: CIA 발병 1주 후에 mAb 7E(3 mg/kg)가 투여(피하 투여)된 CIA 래트; 및 그룹 4: CIA 발병 1주 후 에타너셉트(Enebrel^®; 미국 와이어스(Wyeth), 3 mg/kg, 피하 투여). 각각의 처리군 래트의 뒷발 두께는 캘리퍼스를 이용하여 측정되었다. 본 연구에서 수득된 모든 가공되지 않는 결과는 통계 소프트웨어인 Prism 4.0(미국 캘리포니아주의 샌디애고 소재의 GraphPad Software)을 이용하여 통계 분석에 적용되었다. Kruskal-Wallis 시험은 뒷발의 두께를 비교하기 위해 사용되었다. P-값: < 0.05는 유의한 것으로 간주되었다. 유의한 차이는 스투던트 t-검증(Student's t-test) 또는 일원분산 분석(ANOVA)을 이용하여 평가되었다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정되었다.

하기 표 1에 나타낸 바와 같이, mAb 7E는 CIA 래트(p< 0.05)의 뒷발 두께를 유의하게 감소시켰으며, 이의 효능은 상업적으로 이용 가능한 항-류마티스 관절염 약물(Mihara 등, Br J Pharmacol ., 2008, 154: 153-164)인 에타너셉트의 효능에 근접하였다. 이러한 결과는 에타너셉트와 같이 mAb 7E도 또한 류마티스 관절염의 치료에 유효하다는 것을 보여준다.

대조군 및 처리군 래트의 뒷발 두께

그룹	뒷발 두께의 중앙값	25 내지 75 백분위수
1(건강한 대조군)	0.53 cm	0.52 내지 0.54 cm
2 (PBS 처리군)	1.05 cm	1.02 내지 1.13 cm
3 (mAb 7E 처리군)	0.84 cm	0.72 내지 0.93 cm
4 (에타너셉트 처리군)	0.86 cm	0.78 내지 0.91 cm

이어, 윤활 조직에서 염증성 매개물질의 수준을 감소시키는데 있어 mAb 7E의 효과를 하기와 같이 검토하였다. 처리군 CIA 래트의 무릎 관절을 둘러싸고 있는 윤활 조직을 단리하여 PBS 용액에 현탁하였다. 이어 조직을 균질화하고, 4℃에서 10분 동안 3000rpm으로 원심분리하였으며, 이렇게 얻어진 상층액을 8O℃에 저장하여, 분석을 준비하였다. TNF-α 및 IL-1β(TNF-α 및 IL-1β 키트; 미네소타주 미니애폴리스 소재의 R&D Systems)의 수준 및 IL-20(IL-20 키트; 이스라엘 레호보트(Rehovot) 소재의 PeproTech Asia/CytoLab)의 수준을 제조사의 지침서에 따라 샌드위치 ELISA 검증법을 이용하여 평가하였다. 이들 염증성 매개 물질 모두의 수준이 CIA 래트에서 평가된다는 것이 당업계에 공지되어 있다.

이렇게 얻어진 결과에 따르면, mAb 7E 및 에타너셉트는 mIgG과 비교시 TNF-α, IL-1β 및 IL-20의 수준을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다. 보다 구체적으로는, mIgG 처리 CIA 래트의 경우 윤활 조직 중의 TNF-α, IL-lβ 및 IL-20의 수준은 건강한 대조군 래트의 윤활 조직에 있는 것보다 훨씬 높은 반면, mAb 7E 또는 에타너셉트로 처리된 CIA 래트에서는 유의하게 감소되었다.

실시예 2. mAb 7E 및 에타너셉트로 류마티스 관절염의 치료

실시예 1에서 개시된 방법을 따라 래트에서 CIA를 유도하였다. CIA 래트를 5개의 그룹(각 그룹 당 n=9)으로 무작위 지정하였으며, CIA 발병 이후 주 3회 치료하였다: 그룹 1: PBS; 그룹 2: 미국 캘리포니아주의 테메큘라(Temecula) 소재의 Chemicon International, Inc.로부터 수득한 생쥐 IgG; 그룹 3: 에타너셉트(6 mg/kg, 피하 투여); 그룹 4: mAb 7E(6 mg/kg, 피하 투여); 및 그룹 5: mAb 7E(3 mg/kg, 피하 투여) 및 에타너셉트(3 mg/kg, 피하 투여). 먼저, 각각의 처리군 래트의 뒷발 두께를 실시예 1에서 상술한 방법에 따라 검토하였다. mAb 7E 및 에타너셉트의 복합 처리의 경우 mAb 7E와 에타너셉트의 개별적인 처리에 비해 뒷발 두께를 감소시키는 성능이 유의하게 높은 것으로 나타났다.

이어, 문헌[Hsu 등, Arthritis Rheum . 2006, 54: 2722-2733]에 개시된 방법에 따라 래트의 각 뒷발에서의 CIA 중증도를 모니터링하고, 등급화하였다. 일반적으로 래트가 3 이상의 중증도 등급을 갖는 경우, 그 래트는 뒷발에 심각한 부종을 앓는 것으로 간주된다. 상이한 그룹으로부터 얻어진 중증도 등급을 비교하기 위해 Kruskal-Wallis 시험을 적용하여, 상기 결과가 통계학적으로 유의한지를 평가하였다. 하기 표 2에 나타나 있는 바와 같이, mAb 7E 및 에타너셉트 둘 모두로 처리된 래트의 중증도 등급의 중앙값은 mAb 7E 또는 에타너셉트 단독으로 처리된 래트의 중증도 등급의 중앙값보다 훨씬 높았다. 이들 결과는 통계학적으로 유의하였다(P < 0.05).

건강한 래트 및 다양한 약제로 처리된 래트의 중증도 등급

그룹	중증도 등급의 중간값	25 내지 75 백분위수
건강한 대조군	0.2	0.0 내지 0.4
그룹 1(PBS)	4.2	3.9 내지 4.5
그룹 2(mIgG)	4.0	3.5 내지 4.2
그룹 3(mAb 7E)	2.0	0.5 내지 3.1
그룹 4(에타너셉트)	2.1	0.7 내지 3.6
그룹 5)(mAb 7E + 에타너셉트)	0.9	0.0 내지 2.2

이어, 심각한 뒷발 부종의 존재를 각각의 처리군 CIA 래트에서 검토하였으며, 그 결과는 도 1에 나타나 있다. 예상외로, mAb 7E 및 에타너셉트로 각각 처리된 CIA 래트에서 심각한 부종의 발병률이 100%에서 22%로, 그리고 100%에서 33%로 각각 감소한 반면, mAb 7E 및 에타너셉트 둘 모두로 처리된 CIA 래트에서의 심각한 부종의 발병률이 100%에서 6%까지 감소하였다. 피셔의 정확 검증(Fisher's exact test)을 이용하여 분석하였을 때 통계학적으로 유의한 이들 결과에 따르면, mAb 7E와 에타너셉트의 복합 처리는 mAb 7E 또는 에타너셉트의 개별 처리에 비해 훨씬 더 효율적인 것으로 나타났다.

부가적으로, 방사선 영상(radio imaging)을 이용하여 소 콜라겐에 의한 초기 면역화 25일 이후에 처리군 CIA 래트에서의 골 손상의 중증도를 검토하였다. 심각한 골 손상이 PBS 및 mIgG로 처리된 CIA 래트(예를 들어, 그룹 1 및 그룹 2의 래트)의 뒷발 관절에서 관측되었다. 놀랍게도, 국부적인 복사뼈 손상의 중증도는 mAb 7E, 에타너셉트, 또는 이들의 조합으로 처리된 CIA 래트(그룹 3 내지 5의 래트)에서 비교적 온건하였다. 그룹 1 및 그룹 2의 래트와 그룹 3 내지 그룹 5의 래트 사이의 차이는 통계학적으로 유의하였다(P < 0.01 내지 0.05). 이들 결과에 따르면, mAb 7E는 에타너셉트만큼 효과적으로 CIA 래트에서 골 손상을 완화시키고, mAb 7E와 에타너셉트의 복합 처리는 상응하는 개별 처리보다 훨씬 더 효과적이란 것이 추가로 확인되었다.

추가로, 고해상의 저선량 X선 스캐너가 구비된 1076 마이크로 CT-40 시스템을 이용하는 미세콤퓨터 단층촬영 분석(microcomputed tomographic analysis)을 수행하여, CIA 래트에서 골 파괴를 보호하는데 있어서 mAb 7E 단독의 효능 및 mAb 7E와 에타너셉트 조합의 효능을 평가하였다. 스캐너의 X선관을 48kV의 양성자 에너지, 200uA의 전류, 및 0.5㎜ 두께의 필터를 통한 1180/1000초의 노출 시간의 조건으로 작동시켰다. 이미지의 픽셀 크기는 17.20um이고, 스캐닝 시간은 약 15분이었다, 스캐닝된 이미지의 표준화 재구성 이후, 각 경골 샘플용 데이터 설정을 소프트웨어(CTAn; Skyscan)로 다시 샘플링하여, 각 샘플을 배향시켰다. 모든 분석 전반에 걸쳐 문턱값과 같은 일정한 조건이 적용되었다. 3차원 골 특성 매개변수인 골 무기질 밀도를 50개의 연속하는 조각으로 나눠 분석하였다. 그 결과는 mIgG 대조군에 대응하는 값에 대한 비율(%)로서 산정되었다.

PBS 및 mIgG로 처리된 CIA 래트로부터 수득된 경골은 건강한 대조군에서 발견되는 온전한 관절에 비해 두드러진 골 손상을 나타냈다. mAb 7E로 처리된 CIA 래트는 mIgG로 처리된 래트에 비해 완화된 골 손실을 나타냈다. mAb 7E 및 에타너셉트 둘 모두로 처리된 래트에서, 골 손실은 mAb 또는 에타너셉트 단독으로 처리된 래트에 비해 심지어 덜 심각하였다.

질병 중증도를 평가하기 위한 양적 매개변수인 골 무기질 밀도는 상술한 바와 같이 각 처리군 CIA 래트에서 측정되었다. CIA 래트에서 mAb 7E의 처리는 mIgG-처리 CIA 래트에 비해 골 손실을 유의하게 억제하였다(P < 0.05). mAb 7E 및 에타너셉트 둘 모두로 처리된 CIA 래트에서 보호 효과는 상당히 증가하였다(P < 0.01). 마이크로 CT 결과는 래트의 발목 관절로부터 얻은 방사선 데이터를 지지하였다. 이들 결과는, mAb 7E가 관절염의 중증도를 감소시켰을 뿐만 아니라, 골 손실을 억제하였다는 증거를 제공하였다.

최종적으로, TNF-α, IL-1β 및 IL-20의 발현 수준은 mAb 7E 및 에타너셉트 둘 모두로 처리된 CIA 래트에서 검토되었으며, 이렇게 얻어진 결과는 이들 사이토카인이 유의하게 감소되었다는 것을 보여주었다. 도 2를 참조한다. mAb 7E 또는 에타너셉트 처리, 및 mAb 7E와 에타너셉트의 동시 처리 이후에 IL-6의 발현이 또한 감소하였다.

요약하면, 상술한 결과에 따르면, 관절염의 중증도를 감소시키면서 동시에 골 손실을 억제하는데 있어서 mAb 7E가 효과적이라는 것이 증명되었다. 또한 이들 결과는 mAb 7E 및 에타너셉트의 복합 효과가 mAb 7E 또는 에타너셉트의 개별 효과보다 유의하게 높다는 것을 보여준다.

실시예 3. mAb 7E로 골다공증의 치료

14주령 암컷 BALB/C 생쥐(대만 타이난 소재의 대만 성공 대학교(National Cheng Kung University)의 실험실 동물 센터)를 도착시에 환경적으로 제어된 실험실에 수용하고, 4일 동안 적응시켰다. 온도/습도가 제어된 장소(20 내지 25℃ 및 40 내지 45%)에 있는 폴리카보네이트 우리(우리 당 3마리)에 동물을 분배하였다. 명암 주기는 12시간 명주기와 12시간 암주기이며, 사료와 물은 접근이 자유롭도록 공급하였다. 동물은 펜토바르비탈(pentobarbital, 체중(kg) 당 50 mg; 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich)을 이용함으로써 전신 마취하에 등부 난소 적출(OVX)되거나, 거짓으로 수술을 하였다(모조 대조군). 모조 대조군에서, 양측성 난소(bilateral ovary)를 노출시킨 후, 비제거용 피부 봉합법으로 봉합하였다. 생쥐는 OVX 또는 대조군 수술 1 주후에 회복되었으며, 이어 5개의 그룹으로 무작위로 지정되었다: 그룹 1: 모조 대조군(n=5); 그룹 2: 추가의 처리가 없는 OVX 생쥐(n=5); 그룹 3: 17β-에스트라디올(미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich; 10 μg/kg/1일)로 처리된 OVX 생쥐(n=6); 그룹 4: mIgG(미국 캘리포니아주의 테메큘라(Temecula) 소재의 Chemicon International, Inc.; 3 mg/kg/3일)로 처리된 OVX 생쥐(n=7); 그룹 5: mAb 7E(3 mg/kg/3일)로 처리된 OVX 생쥐(n=5); 및 그룹 6: mAb 7E(6 mg/kg/3일)로 처리된 OVX 생쥐(n=5). 양성 대조군로서 이용된 17β-에스트라디올 처리량은 OVX 생쥐를 치료하는데 있어 유효한 것을 공지된 이전 프로토콜에 기초하고 있다. 문헌[Cano 등, Osteoporos Int . 2008 Jun; 19(6): 793-800]을 참조한다.

2개월 후에 모든 그룹의 생쥐를 희생시켰다. 각 생쥐의 경골을 무균하에서 수집하고, 부착 연조직을 제거하기 위해 세척한 후, 3.7% 포르말린이 채워진 관에 넣었다. 이어, 이를 실시예 2에서 상술한 방법에 따라 미세콤퓨터 단층촬영 및 골 무기질 밀도 분석에 적용하였다.

IL-20의 혈청 수준은 OVX 그룹 생쥐에서 상향 조절되었지만, mAb 7E로 처리된 OVX-생쥐에서 하향 조절되었다(도 3의 (a)). 생쥐 경골의 골 무기질 밀도에 대한 마이크로 CT 스캐닝 결과에 따르면, 그룹 2 및 그룹 3(mIgG로 미처리 또는 처리)에서 골 손상 수준은 그룹 4 내지 그룹 6(3 mg/kg의 mAb 7E, 6 mg/kg의 mAb 7E 및 17β-에스트라디올로 처리)에서의 골 손상 수준보다 훨씬 높은 것으로 나타났으며, 이는 17β-에스트라디올과 같이 mAb 7E도 또한 OVX 생쥐에서 골 손실을 감소시켰다(도 3의 (b))는 것을 나타낸다. 추가로 mAb 7E-처리 및 17β-에스트라디올-처리 OVX 생쥐에서의 골 무기질 밀도는 모조 대조군 및 mIgG-처리 생쥐에서의 골 무기질 밀도보다 훨씬 높았다(도 3의 (b)). 골 밀도에서의 통계학적으로 유의(P < 0.05, mIgG 대조군 대비)한 용량 반응 증가는 이들 생쥐에서 관측되었다(도 3의 (c)). 종합해보면, 이들 결과에 따르면, mAb 7E가 골 손실을 감소시킴으로써 골다공증을 치료하는데 효과적인 것으로 증명되었다.

실시예 4. IL -20 항체 mAb 7E로 파골세포 분화의 억제

골 형성은 골아세포와 파골세포 사이의 크로스토크(crosstalk)에 의해 엄격하게 조절된다. 불안정한 파골세포 형성은 골다공증 및 류마티스 관절염에서 골 손실을 야기한다(Takayanagi, H, 등, (2005) Immunol Rev 208: 181-193; Ross, FP and Teitelbaum, SL (2005) Immunol Rev 208: 88-105). 따라서 본 발명자들은 mAb 7E가 파골세포의 분화를 억제함으로써 OVX 생쥐에서 골 손실에 대해 보호하는지를 결정하기를 원했다.

골수 세포(BMC)는 생쥐의 경골로부터 준비하였으며, 12시간 동안 배양하였다(37℃/5% CO₂). 이후, 비-부착 세포를 수집하고, 24-웰 플레이트에 접종하고(웰 당 2 x 10⁶), 30 ng/ml의 재조합 쥐 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF)(PreproTech)가 보충된 동일한 배지에서 배양하였다. 8시간 후, M-CSF 유래 BMC를 실험이 끝날 때까지 쥐 M-CSF(40 ng/ml) 및 sRANKL(100 ng/ml)(PreproTech)과 함께 배양하였다. mAb 7E의 효과를 시험하기 위해, MCSF 유래 BMC를 실험이 끝날 때까지 M-CSF 및 sRANKL를 함유한 a-MEM에서 IL-20(200 ng/ml), mAb 7E(2 μg/ml) 또는 mIgG(2 μg/ml)로 처리하였다.

mAb 7E에 의한 초기 처리를 위해 BMC를 12시간 동안 배양하였다. 비-부착 세포를 24-웰 플레이트에 접종하고(웰 당 2 x 10⁶), mAb 7E(2 μg/ml) 또는 대조군 mIgG( μg/ml)를 함유하는 a-MEM에서 배양한 후, M-CSF(40 ng/ml)를 첨가하였다. 40시간 후, mAb 7E 처리를 종료하고, 세포를 무혈청 배양 배지로 세척한 후, 실험이 끝날 때까지 a-MEM(40 ng/ml) 및 sRANKL(100 ng/ml)에서 배양하였다. 파골세포의 수를 산정하기 위해 세포를 아세톤에서 고정시키고, 산 포스파타아제 키트(acid phosphatase kit, Sigma-Aldrich)를 이용하여 TRAP에 대해 염색하였다.

파골세포 전구체 세포를 골수 유래 조혈 줄기 세포(HSC)로부터 준비하고, OC 분화를 유도하기 위해 배양물에 M-CSF 및 가용성 RANKL(sRANKL) 둘 모두를 첨가하였다. 2개의 배양 프로토콜을 이용하여 파골세포 형성의 초기 및 후기 단계에서 OC 분화에 대한 IL-20 항체 mAb 7E의 효과를 분석하였다(도 4). 48시간 후, M-CSF 유래 골수 대식세포를 실험이 끝날 때까지 쥐 M-CSF(40 ng/ml) 및 sRANKL(100 ng/ml)과 함께 배양하였다. TRAP 염색법을 이용하여 분화된 파골세포의 수를 정량화하였다. mAb 7E(2 μg/ml)의 존재하에서는 TRAP+ 파골세포의 수가 이소타입 대조군보다 유의성(P < 0.01)있게 낮았다(도 4의 (b) 및 (c)). 어떠한 OC도 mAb 7E의 존재하에 검출되지 않았다. mAb 7E가 초기 및 후기 단계에서 OC 분화에 영향을 미치는 바를 규명하기 위해 골수 세포를 1시간 동안 mAb 7E 또는 mIgG로 전-처리한 후, M-CSF를 48시간 동안 다시 첨가하였다. 세포를 수집하고, M-CSF 및 sRANKL를 함유하는 배지에 mAb 7E 항체의 부재하에 추가의 3일 동안 배양하였다(도 4의 (d)). mAb 7E에 의한 초기 배양은 파골세포 분화를 효과적으로 억제하였다(P < 0.01, mIgG 대조군 대비)(도 4의 (e) 및 (f)). 따라서 IL-20 항체는 파골세포 분화 초기 및 후기 두 단계 모두를 차단하였다.

또한, IL-20은 류마티스 관절염의 CIA 래트 모델로부터의 활막 섬유아세포에서 TNF-α 및 RANKL 발현을 유도하였지만, 건강한 래트의 활막 섬유아세포에서는 유도하지 않았다.

실시예 5. HSC 내 IL -20을 상향 조절한 M- CSF

IL-20 항체 mAb 7E는 골수 유래 HSC로부터의 파골세포의 분화를 차단하였다(도 4). HSC가 배양 배지 내로 IL-20을 분비할 이 같은 가능성을 시험하기 위해, 배양되어 48시간 동안 M-CSF로 처리된 골수 유래 HSC에서의 IL-20 발현을 검토하였다. 실시간 PCR(RT-PCR)에 따르면, IL-20 mRNA는 대조군에서보다 M-CSF로 처리된 HSC에서 높은 것으로 나타났으며(도 5의 (a)), 이는 M-CSF 자극에 대한 반응으로 IL-20이 내생적으로 분비되었다는 것을 증명하는 것이다. RT-PCR에 있어서, SYBR Green I(Bio-Rad) 화학 기법은 형광 검출 시스템(DNA Engine Opticon 2; Bio-Rad)을 이용하였다. 제조사의 소프트웨어를 이용하여 형광 및 시간 의존성 신호 발생을 평가하였다.

또한 IL-20 수용체가 M-CSF 유래 OC 전구체 세포에서 발현되었다. 이들 결과는 IL-20이 자가분비(autocrine) 방식으로 HSC 유래 파골세포 전구체 세포 상에서 작용한다는 것을 암시한다.

실시예 6. 골수 세포로부터의 M- CSF 유래 OC 전구체 내의 IL -20 유도 RANK 발현

RANKL-RANK 신호는 파골세포 분화에 중요하다(Wada, T 등, (2006) Trends MoI Med 12: 17-25). RANK는 파골세포의 표면상에서 발현된다. IL-20이 RANKL-RANK 신호 전달을 증가시킴으로써 파골세포 분화를 증가시켰는지를 조사하기 위해 골수 세포로부터의 M-CSF-유래 파골세포 전구체에서 RANK 발현을 분석하였다. 스크래핑(scraping)에 의해 세포를 수확하고, 0.5 mg/ml의 항-쥐 RANK 항체(eBioscience) 또는 이소타입 대조군 항체와 함께 30분 동안 배양하고, 플루오로이소티오시아네이트(FITC) 접합 2차 항체와 함께 배양한 후, 유동 세포분석기(flow cytometer, FACSCalibur; BD Biosciences)를 이용하여 분석하였으며, 이때 각 샘플에 대한 이벤트(event)가 20,000회 요구된다. 유동 세포분석에 따르면, IL-20로 처리된 M-CSF 유래 OC 전구체에서 RANK 단백질(도 5의 (b)) 및 RANK mRNA(도 5의 (c))의 표면 발현이 샹향 조절되는 것으로 나타났다.

파골세포 분화에 대한 mAb 7E의 억제 효과와 일관되게, mAb 7E 처리는 RANK 전사체의 발현(도 5의 (d)) 및 RANK 단백질의 표면 발현 둘 모두를 억제하였다. 표시된 농도의 IL-20, mIgG, mAb 7E 또는 IL-20과 mAb 7E 둘 모두와 함께 M-CSF 유래 BMC를 M-CSF(50 ng/ml) 및 sRANKL(100 ng/ml)를 함유하는 a-MEM에서 24시간 동안 배양하였다. RANK 생산을 평가하기 위해 세포를 IL-20(200 ng/ml)로 자극하고, 트립신 처리한 후, 상술한 유동 세포 분석을 위해 RANK(eBioscience)에 대한 PE 접합 항체로 염색하였다. 이들 결과에 따르면, IL-20이 이들 RANK 발현을 증가시킴으로써 파골세포 형성 사이토카인으로서 파골세포 전구체로서 작용한다는 증거가 있다.

실시예 7. 골아세포를 표적화하고 RANKL 발현을 상향 조절한 IL -20

또한 골아세포에서 증가된 RANKL 발현은 파골세포 형성이 있어서 중요한 인자이다(Jordan, WJ 등, (2005) Eur J Immunol 35: 1576-1582'). RT-PCR 분석(도 6의 (a)) 및 세포 화학적 염색법(도 6의 (b))을 이용하여 골아세포에서의 IL-20의 기능을 규명하였다. 상기 시험관 내 검증법 둘 모두에 따르면, IL-20 및 이의 3개의 수용체 하위유니트가 MC3T3-E1 골아세포에서 발현되는 것으로 나타났다. 몇몇 신호 전이 단백질의 인산화 패턴을 평가하기 위해, 쥐 IL-20(200 ng/ml)(미국 미네소타주 미니애폴리스 소재의 R&D Systems)으로 MC3T3-E1 세포를 표시된 시간 동안 자극하였다. 제조사의 지침서를 이용함으로써 인산화된 ERK, AKT, STAT3, p38 및 JNK에 대해 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅을 수행되었다(세포 신호 전달 기술). 도 4의 (c)에 도시된 바와 같이, JNK, ERK, AKT 및 p38은 IL-20 처리 MC3T3-E1 골아세포에서 인산화되었으며, 그 결과 IL-20이 골아세포에서 내생적으로 발현되어 자가분비 방식으로 골아세포로의 신호 전이를 개시한다는 추가의 증거를 제공하게 되었다. Th17은 RA의 유도 및 진행에 중요한 것으로 현재 보고되어 있다. RA 발병(pathogenesis)에서의 Thl7의 관련성은 IL-17 자극 파골세포 형성에 기인한 것이었다(Kotake, S 등, (1999) J. Clin . Invest . 103: 1345-1352). IL-17의 전사체는 IL-20 처리 MC3T3-E1 골아세포에서 보다 높았다(도 6의 (d)). IL-20이 골아세포에서 RANKL 발현을 유도함으로써 파골세포 형성에 기여하는 바를 결정하기 위해, MC3T3-E1 세포를 IL-20으로 처리하고, 실시간 PCR 및 유동 세포분석법을 이용하여 RANKL 발현을 분석하였다. RANKL 발현은 IL-20 처리 세포에서 미처리 대조군에서 보다 더 시간 의존적으로 높았으며, 처리 6시간 후에 최대에 도달했다(도 6의 (e)). 또한 RANKL 단백질의 표면 발현은 IL-20 처리 MC3T3-E1 세포에서 높았다(도 6의 (f)). IL-20은 Thl7 상에서 작용하였으며, RANKL의 방출을 유도하였다. 추가로 IL-20 및 IL-17은 추가의 RANKL 발현을 협주적으로 유도하였으며, 이어 이는 파골세포 분화를 증가시켜 골의 침식을 초래하였다.

실시예 8. 골아세포에서 IL -20 유도 RANKL 발현을 억제한 IL -20 항체

상기에서 토의된 바와 같이, RANKL 발현은 미처리 MC3T3-E1 세포에서보다는 IL-20 처리 MC3T3-E1 세포에서 높았다(도 6의 (e) 및 (f)). IL-20 항체 mAb 7E가 IL-20 유도 RANKL 발현을 억제한다는 것을 확인하기 위해, 세포를 IL-20 및 mAb 7E로 공-처리(co-treating)하였다. 실시간 PCR에 따르면, 공-처리된 세포에서는 어떠한 RANKL 전사체도 검출되지 않는 것으로 나타났다(도 7). 이들 결과는 골아세포에서 IL-20이 RANKL 발현을 위한 업스트립 활성제이고, mAb 7E가 IL-20 유도 RANKL 발현을 억제한다는 것을 나타낸다. 상기 결과에 따르면, IL-20이 골아세포에서 RANKL의 시험관 내 업스트림 유도 인자이고, 이것이 파골세포 형성을 조장한다는 강력한 증거를 제공하였다.

기타 실시태양

본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 결합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일한 목적, 등가의 목적 또는 유사한 목적을 수행하는 대안적인 특징으로 변경될 수 있다. 따라서 본원에서 달리 언급하지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 단지 일련의 포괄적인 등가 또는 유사한 특징의 일 예이다.

상술한 본 발명은 명확한 이해를 목적으로 예시 및 예로서 상세하게 개시될지라도 상세한 설명 및 예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.

Claims (35)

1. 개인에 있어서 골다공증을 치료하거나, 발병을 지연하거나 또는 예방하기 위한 방법에 있어서,
   상기 개인에게 유효량의 IL-20 길항제(antagonist)를 투여하는 단계를 포함하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-20 길항제는 IL-20 또는 이의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IL-20(서열번호: 6)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection) 기탁 번호 PTA-8587을 갖는 하이브리도마(hybridoma)에 의해 발현되는 항체의 경쇄로부터의 3개의 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR) 및 중쇄로부터의 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 항체는 인간화 항체(humanized antibody)인 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
6. 제 4 항에 있어서, 상기 항체는 키메릭 항체(chimeric antibody)인 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 키메릭 항체는 ATCC 기탁 번호 PTA-8587을 갖는 세포주에 의해 생산되는 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
8. 제 6 또는 7 항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체(human antibody)로부터의 중쇄 불변 영역 서열 및 경쇄 불변 영역 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
9. 제 3 항에 있어서, 상기 항체는 ATCC 기탁 번호 PTA-8587을 갖는 세포주에 의해 생산되는 항체로부터의 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
10. 제 3 항에 있어서, 상기 항체는 ATCC 기탁 번호 PTA-8587을 갖는 세포주에 의해 생산되는 항체로부터의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
11. 제 4 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 항원 결합 단편은 ATCC 기탁 번호 PTA-8587을 갖는 세포주에 의해 생산되는 항체의 결합 특이성을 보유하는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
12. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-20 길항제는 IL-20R1, IL-20R2 또는 IL-22R1의 세포외 도메인(extracellular domain)을 포함하는 폴리펩티드이고, 상기 폴리펩티드는 상기 IL-20와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
13. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-20 길항제는 상기 IL-20의 발현을 특이적으로 억제하는 siRNA, 안티센스 RNA(antisense RNA) 또는 마이크로 RNA(microRNA)인 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
14. 제 1 항에 있어서, 상기 골다공증은 염증성 질병과 연관되어 있는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 염증성 질병은 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
16. 제 1 항에 있어서, 상기 골다공증은 에스트로겐 결핍과 연관이 있는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 에스트로겐 결핍은 폐경기와 연관이 있는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
18. 제 1 항에 있어서, 상기 골다공증은 안드로겐 결핍과 연관이 있는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
19. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-20 길항제는 다른 치료제와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
20. 제 19 항에 있어서, 상기 치료제는 TNF-α 길항제인 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
21. 제 20 항에 있어서, 상기 TNF 길항제는 에타너셉트(etanercept) 폴리펩티드, 인플릭시맙(infliximab) 및 아달리뮤맙(adalimumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
22. 제 21 항에 있어서, 상기 에타너셉트 폴리펩티드는 인간 가용성 TNF 수용체 및 인간 면역글로빈 G1의 Fc 성분을 포함하는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료 방법.
23. 골다공증을 치료하거나, 발병을 지연하거나 또는 예방하기 위한 키트에 있어서,
    IL-20 길항제를 포함하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료용 키트.
24. 제 23 항에 있어서, IL-20 길항제를 사용하여 골다공증을 치료하거나, 발병을 지연하거나 또는 예방하기 위한 지침서를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증의 예방, 발병의 지연 또는 치료용 키트.
25. 류마티스 관절염을 치료하기 위한 방법에 있어서,
    치료가 필요한 대상에게 유효량의 IL-20 길항제 및 유효량의 TNF-α 길항제를 투여하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염의 치료 방법.
26. 제 25 항에 있어서, 상기 IL-20 길항제는 항-IL-20 항체인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 치료 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 상기 항-IL-20 항체는 미국 미생물 보존센터 기탁 번호PTA-8587로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 mAb 7E인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 치료 방법.
28. 제 25 항에 있어서, 상기 항-IL-20 항체는 미국 미생물 보존센터 기탁 번호PTA-8587로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 mAb 7E의 작용성 등가물(functional equivalent)인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 치료 방법.
29. 제 28 항에 있어서, 상기 항-IL-20 항체는 미국 미생물 보존센터 기탁 번호PTA-8587로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 mAb 7E의 VH 및 VL 영역을 포함하는 항체인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 치료 방법.
30. 제 28 항에 있어서, 상기 항-IL-20 항체는 단일 쇄 항체 또는 키메릭 항체인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 치료 방법.
31. 제 28 항에 있어서, 상기 항-IL-20 항체는 mAb 7E의 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 치료 방법.
32. 제 25 항에 있어서, 상기 TNF-α 길항제는 에타너셉트 폴리펩티드, 인플릭시맙 및 아달리뮤맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 치료 방법.
33. 제 32 항에 있어서, 상기 에타너셉트 폴리펩티드는 인간 가용성 TNF 수용체 및 인간 면역글로빈 G1의 Fc 성분을 포함하는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 치료 방법.
34. 제 33 항에 있어서, 상기 IL-20 길항제는 미국 미생물 보존센터 기탁 번호PTA-8587로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 mAb 7E의 VH 및 VL 영역을 포함하는 항체, 또는 이의 작용성 등가물인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 치료 방법.
35. 제 34 항에 있어서, 상기 항-IL-20 항체는 mAb 7E의 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 치료 방법.

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