JP5860699B2 - 骨粗鬆症の治療のためのil−20アンタゴニストの使用 - Google Patents
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Description
本願は、2008年10月7日出願の米国特許出願第12/246,715号および2009年8月31日出願の米国仮特許出願第61/238,661号の利益を主張する。各出願は、参考で全体を本明細書中に引用する。
本発明は、リウマチ性関節炎および骨粗鬆症の予防、当該疾患の発症の遅延または当該疾患の治療のためのIL−20アンタゴニストの使用に関する。
骨粗鬆症は、骨量の減少および骨組織の低下を特徴とする病気であり、これにより、骨が弱くなったり、脆くなったりする。正味の骨量の減少は、様々な要因、例えば、低レベルのエストロゲン、カルシウムやビタミンDの不適切な摂取、および炎症によって誘発されうる。骨吸収は、更年期後の骨粗鬆症の主要な病理学的因子である。骨粗鬆症は、骨格の脆弱性を引き起こし、骨折の危険性を増加する骨強度が損なわれた疾患である(Theill, LE, et al. (2002) Annu Rev Immunol 20:795-823; Boyle, WJ, et al. (2003) Nature 423;337-342)。更年期でのエストロゲン欠乏および男性でのアンドロゲン欠乏は双方とも、骨代謝回転の不安定な増加を引き起こし、この際、骨吸収が骨形成を上回る。比較的早い骨量の減少がおき、それに付随して骨微細構造の破壊が起こる(Simonet, WS, et al. (1997) Cell 89:309-319; McClung, M, (2007) Arthritis Res Ther 9 Suppl 1:S3)。ほとんどの場合、骨量の減少は、破骨細胞数の増加によってまたは過剰な破骨細胞活性によって起こる(Walsh, NC, et al. (2005) Immunol Rev 208:228-251)。破骨細胞は、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ(TRAP)およびカルシトニンレセプターを発現する多核巨細胞である。破骨細胞の形成は、2つの因子が必要である:マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)およびNF−κBリガンドのレセプター活性化因子(RANKL)(Takayanagi, H, et al. (2005) Immunol Rev 208:181-193; Ross, FP & Teitelbaum, SL, (2005) Immunol Rev 208:88-105)。M−CSFは、単球/マクロファージ前駆細胞の生存および増殖を媒介するが、初期には、間質線維芽細胞、骨芽細胞、及び活性化T細胞によって生産される。RANKは、RANKLの唯一のシグナル伝達レセプターであり、破骨細胞の発生及び活性化を誘導する(Suda, T, et al., (1999) Endocr Rev 20:345-357)。マウスでのいずれの遺伝子の欠損が重篤な骨粗鬆症(骨量の増加)および破骨細胞の消失を引き起こすという知見によって、RANKL−RANKシグナル伝達経路のインビボでの重要性が確認された(Kong, YY, et al, (1999) Nature 397:315-323; Li, J, et al, (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:1566-1571)。TNF−a、IL−Iβ、IL−15、IL−17、及びIL−23等の、様々な炎症性サイトカインが、破骨細胞前駆体の多核細胞化、または破骨細胞表現型へこれらのコミッタンスを誘導し、RANKLと相乗的に作用しうる(Feldmann, M, et al. (2001) Curr Dir Autoimmun 3:188-199; O' Gradaigh, D, et al. (2004) Ann Rheum Dis 63:354-359; Sato, K, et al, (2006) Exp Med 203:2673-2682; Ju, JH, et al, (2008) J Immunol 181:1507-1518)。
本発明は、有効量のIL−20アンタゴニストを個体に投与することを有する個体の骨粗鬆症の治療、骨粗鬆症の発症の遅延、または骨粗鬆症の予防方法を提供する。
本発明は、IL−20が破骨前駆細胞へのRANK発現及び骨芽細胞へのRANKL発現を引き起こす新規な破骨細胞形成サイトカインであるという知見に基づくものである。IL−20のアンタゴニスト;例えば、IL−20に特異的なモノクローナル抗体mAb 7Eは、IL−20で誘導されるRANK及びRANKL発現を消失させた。これらの結果は、IL−20アンタゴニストが、インビボで破骨細胞の分化を阻害し、骨粗鬆症による骨量の減少から個体を保護するのに使用されうることを示した。本発明はまた、IL−20に特異的なモノクローナル抗体が単独でまたはエタネルセプトと組み合わせると、後肢の腫脹(thickness and swelling)を減らすことによる関節炎の重篤度を有意に下げ、さらにリウマチ性関節炎の動物モデルにおいて軟骨損傷及び骨量の減少を防止したという知見に基づく。
本発明の実施は、特記しない限り、分子生物学(組換技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の公知技術を使用するであろうし、これらは当該分野に含まれる。このような技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al, eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (CA. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)等の、文献に十分に説明される。
「抗体」(複数形でも同じ意味に使用される)は、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する、少なくとも一の抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の、ターゲットに特異的に結合できる免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用される、当該ことばは、完全なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のみでなく、その断片(FAB、FAB’、F(AB’)2、Fv)、一本鎖(ScFv)、その変異体、dAb(抗体ドメイン; Ward、et. AL, 1989, Nature, 341:544-546を参照)、抗体タンパク質を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、二特異性抗体(diabody)、線状抗体(linear antibody)、一本鎖抗体、多特異的抗体(例えば、二重特異性抗体)及び所望の特異性を有する抗原認識部位を有する免疫グロブリン分子の他の修飾構造をも包含する。抗体はIgG、IgA、またはIgM(またはこれらのサブクラス)等の、いずれのクラスの抗体を包含し、また、抗体は特定のクラスである必要はない。重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列によっては、免疫グロブリンは別のクラスであってもよい。IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMの免疫グロブリンの5つの主要なクラスがあり、これらのうち幾つかはサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2にさらに分かれてもよい。様々なクラスの免疫グロブリンに相当する重鎖の定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び3次元構造は既知である。
本発明は、骨粗鬆症及びリウマチ性関節炎を治療する、発症を遅延させるおよび/または予防する必要のある個体(ヒトおよび非ヒト哺乳動物双方)における骨粗鬆症及びリウマチ性関節炎を治療する、発症を遅延させるおよび/または予防するのに有用である。
本発明の実施形態によっては、IL−20アンタゴニストは、抗IL−20抗体を含む。抗IL−20抗体は、当該分野において既知であり、例えば、米国特許第7,435,800号;第7,115,714号;第7,119,175号;第7,151,166号;及び第7,393,684号;及びPCT公開 WO 2007/081465号;WO 99/27103号;WO 2004/085475号;及びWO 2005052000号を参照。
抗IL−20抗体以外の他のIL−20アンタゴニストを使用してもよい。本発明の実施形態によっては、IL−20アンタゴニストは、機能的なIL−20の発現を遮断または低減できる少なくとも1のアンチセンス分子を有する。IL−20のヌクレオチド配列は知られており、公衆に利用可能なデータベースで容易に利用できる。例えば、Genbank 受託番号 NM 018724.3及びNP 061194.2を参照。他のポリヌクレオチドと交差反応せずに、IL−20 mRNAに特異的に結合するであろうアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を調製することは一般的である。ターゲッティングの具体的な部位としては、以下に制限されないが、開始コドン、5’調節領域、コーディング配列及び3’非翻訳領域が挙げられる。実施形態によっては、オリゴヌクレオチドは、約10〜100ヌクレオチド長、約15〜50ヌクレオチド長、約18〜25ヌクレオチド長、またはそれ以上である。オリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート結合および当該分野において既知である2’−O糖修飾等の骨格修飾を有していてもよい。
抗IL−20抗体及び他のIL−20アンタゴニストは、IL−20の生物学的活性の減少、改善、または中和を検出および/または測定する、当該分野において既知の方法を用いて同定できるまたはその特性が明らかにできる。例えば、ELISAタイプのアッセイが、IL−20カスケードを介して活性化されるタンパク質のリン酸化反応を測定することによるIL−20が仲介するキナーゼ活性化の定性的または定量的な測定に適している場合がある。例としては、JNK、ERK、AKT、p38、STAT3及びTRAF6がある。
本発明の方法に使用される組成物は、有効量の1以上のIL−20アンタゴニスト(抗IL−20抗体等)を含み、実施形態によっては、製薬上許容できる賦形剤をさらに含む。実施形態によっては、本組成物は、本明細書に記載される方法のいずれかに使用される。IL−20アンタゴニストの例は本明細書に記載される。本組成物は、1超のIL−20アンタゴニストを含んでもよい。例えば、組成物は、1超のあるクラスのIL−20アンタゴニストのもの(例えば、IL−20の異なるエピトープを認識する抗IL−20抗体の混合物)、さらには異なるクラスのIL−20アンタゴニスト(例えば、抗IL−20抗体及びIL−20阻害化合物)を含んでもよい。他の具体的な組成物としては、同じエピトープを認識する1超の抗IL−20抗体、IL−20の異なるエピトープに結合する抗IL−20抗体の異なる種、または異なるIL−20阻害化合物を含むものがある。
本発明は、個体の骨粗鬆症の治療、発症の遅延、または予防方法を提供する。上記したように、IL−20は、破骨細胞の発達及び活性化における上流のRANKL−RANKシグナル伝達化スケートに作用する破骨細胞形成サイトカインである。IL−20の過剰発現は、破骨細胞の分化を刺激することにより、骨粗鬆症に関連する骨損傷の修復能を減少させる可能性がある。
本発明はまた、本方法に使用されるキットをも提供する。本発明のキットは、IL−20アンタゴニスト(本明細書中に記載される抗体mAb 7Eまたはその誘導体等の、抗体など)を含む1以上の容器を有し、および実施形態によっては、本明細書中に記載される本発明の方法のいずれかに従って使用される指示書をさらに有する。実施形態によっては、IL−20アンタゴニストは、本明細書中に記載されるいずれかのIL−20アンタゴニストである。他の実施形態では、キットは、抗IL−20抗体以外のIL−20アンタゴニストを含む。実施形態によっては、キットは、抗IL−20抗体(本明細書中に記載される抗体mAb 7E等)を含む。他の実施形態では、キットは、抗体mAb 7Eの1以上のCDR(mAb 7Eの1、2、3、4、5、または実施形態によっては、6全てのCDR)を含む抗IL−20抗体を含む。実施形態によっては、含まれる指示書には、本明細書に記載されるいずれかの方法に従って骨粗鬆症またはリウマチ性関節炎を治療する、発症を遅延させるまたは予防するためのIL−20アンタゴニストの投与が記載されている。キットには、個体が骨粗鬆症またはリウマチ性関節炎を有しているか否かに基づいて治療に適する個体を選択することがさらに記載されてもよい。さらに他の実施形態では、指示書には、骨粗鬆症またはリウマチ性関節炎の危険性のある個体へのIL−20アンタゴニストの投与が記載される。
コラーゲン誘導関節炎(CIA)を有するラットは、ヒトリウマチ性関節炎を研究するためのよく開発された動物モデルである。このモデルを本研究に用いて、mAb 7Eによるこの疾患の治療の有効性を試験した。
CIAを実施例1に記載される方法に従ってラットで誘導した。このCIAラットをランダムに5グループ(各グループでn=9)に分け、CIA発症後週に3回、以下のように処置した:グループ1:PBS;グループ2:Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USAから得られた、マウスIgG;グループ3:エタネルセプト(6mg/kg、皮下);グループ4:mAb 7E(6mg/kg、皮下);およびグループ5:mAb 7E(3mg/kg、皮下)及びエタネルセプト(3mg/kg、皮下)。まず、各処置ラットの後脚の厚さを上記実施例1に記載の方法に従って試験した。mAb 7E及びエタネルセプトを合わせて処置したものは、mAb 7E及びエタネルセプトを個々に処置したものに比べて後脚の厚さの低減効果が有意に高かった。
14週齢のメスのBALB/Cマウス(Laboratory Animal Center, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan)を、到着したら環境が制御された実験室で飼育し、4日間慣れさせた。動物を、温度/湿度が制御された部屋(20〜25℃及び40〜45%)でポリカーボネート製のケージ(1ケージ当たり3匹)に割り当てた。明:暗サイクルを、12時間明所:12時間暗所とし、餌及び水を自由に摂取できるよう供給した。動物を、ペントバルビタール(50mg/kg体重;Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を用いた通常の麻酔下で背部の卵巣を摘出した(OVX)または偽で手術した(偽コントロール)。偽コントロールでは、左右の卵巣を暴露した後、除かずに皮膚を縫合して閉じた。マウスをOVXまたはコントロール外科手術してから1週間回復させた後、6グループにランダムに分けた:グループ1:偽コントロール(n=5);グループ2:さらに処置を行わないOVXマウス(n=5);グループ3:17β−エストラジオール(Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, 10μg/kg/日、n=6)で処置したOVXマウス;グループ4:mIgG(Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA, 3mg/kg/3日、n=7)で処置したOVXマウス;グループ5:mAb 7E(3mg/kg/3日、n=5)で処置したOVXマウス;およびグループ6:mAb 7E(6mg/kg/3日、n=5)で処置したOVXマウス。ポジティブコントロールとして使用した17β−エストラジオール処置の投与量は、OVXマウスを処置するのに有効であることが知られている従来のプロトコルに基づくものである。Cano et al, Osteoporos Int. 2008 Jun;19(6):793-800を参照。
骨形成は、骨芽細胞と破骨細胞とのクロストークによって密に調節される。不安定な破骨細胞形成により、骨粗鬆症及びリウマチ性関節炎で骨量の減少が引き起こされる(Takayanagi, H, et al. (2005) Immunol Rev 208:181-193; Ross, FP and Teitelbaum, SL (2005) Immunol Rev 208:88-105)。ゆえに、我々は、mAb 7Eが破骨細胞の分化を阻害することによってOVXマウスの骨量の減少を保護するか否かを決定したかった。
IL−20抗体 mAb 7Eは、骨髄由来のHSC由来の破骨細胞の分化を遮断した(図4)。HSCがIL−20を培養培地に分泌する可能性を試験するために、48時間M−CSFと予め培養、処置した骨髄由来のHSCにおけるIL−20の発現を調べた。リアルタイムPCR(RT−PCR)から、IL−20 mRNAはコントロールに比べてM−CSFで処置したHSCでより高いことが示され(図5a)、これは、IL−20がM−CSF刺激に応答して内因的に分泌された証拠である。RT−PCRでは、蛍光検出システム(DNA Engine Opticon 2; Bio-Rad)を用いたSYBR Green I(Bio-Rad)化学。蛍光−及び時間−に依存したシグナル生成を製造社のソフトウェアを用いて評価した。
RANKL−RANKシグナルは破骨細胞の分化で重要である(Wada, T et al. (2006) Trends Mol Med 12:17-25)。RANKは、破骨細胞の表面で発現する。IL−20がRANKL−RANKシグナル伝達を向上することによって破骨細胞の分化を増加させるかどうかを調べるために、RANK発現を骨髄細胞のM−CSFで誘導されるOC前駆細胞で分析した。細胞をスクラッピングによって集め、0.5mg/ml 抗マウスRANK抗体(eBioscience)またはアイソタイプコントロール抗体と30分間インキュベートし、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)と共役した二次抗体とインキュベートした後、フローサイトメーター(flow cytometer)(FACSCalibur; BD Biosciences)を用いて分析した。この際、2000個の事象を各サンプルで得た。
骨芽細胞におけるRANKL発現の増加はまた、破骨細胞形成のカギとなる因子である(Jordan, WJ et al. (2005) Eur J Immunol 35:1576-1582)。RT−PCR分析(図6a)及び細胞化学染色(図6b)を用いて、骨芽細胞におけるIL−20の機能を明らかにした。双方のインビトロアッセイにより、IL−20及びその3つのレセプターサブユニットがMC3T3−E1骨芽細胞中で発現することが示された。幾つかのシグナル伝達タンパク質のリン酸化パターンを評価するために、MC3T3−E1細胞を、所定の時間、マウスのIL−20(200ng/ml)(R&DSystems, Minneapolis, MN, USA)で刺激した。ウエスタンブロッティングを、製造社の指示を用いてリン酸化ERK、AKT、STAT3、p38、及びJNK(Cell Signaling Technology)に特異的な抗体を用いて行った。図4cに示されるように、JNK、ERK、AKT、及びp38はIL−20で処理されたMC3T3−E1骨芽細胞でリン酸化されたことから、IL−20が骨芽細胞中で内因的に発現し、オートクリンで上記細胞中のシグナル伝達を引き起こすというより明らかな証拠が得られた。Th17がRAの誘導及び進行で重要であることが近年報告された。Thl7がRAの発症にかかわりがあることはIL−17で刺激される破骨細胞形成によるものである(Kotake, S, et al. (1999) . Clin. Invest. 103:1345-1352)。IL−17の転写物は、IL−20で処理したMC3T3−E1骨芽細胞でより高かった(図6d)。IL−20が骨芽細胞でRANKL発現を誘導することにより破骨細胞形成に寄与するか否かを決定するために、MC3T3−E1細胞をIL−20と共に培養し、リアルタイムPCR及びフローサイトメトリーを用いてRANKL発現を分析した。RANKL発現は、未処置コントロールでよりも、IL−20で処置した細胞で時間に依存してより高く、処置してから6時間でピークになった(図6e)。RANKLタンパク質の表面発現もまた、IL−20で処置したMC3T3−E1細胞でより高かった(図6f)。IL−20は、Thl7細胞に作用し、RANKLの放出を誘導した。さらに、IL−20及びIL−17は、よりRANKL発現を相乗的に誘導し、さらに、破骨細胞の分化を向上し、骨侵食を引き起こす。
上記したように、RANKL発現は、未処置MC3T3−E1細胞でよりも、IL−20で処置した細胞でより高かった(図6e及び6f)。IL−20抗体 mAb 7EがIL−20で誘導されるRANKL発現を阻害することを確認するために、細胞をIL−20及びmAb 7Eで同時に処置した。リアルタイムPCRから、同時処置した細胞ではRANKL転写物は検出されないことが示された(図7)。これらの結果から、IL−20が骨芽細胞でのRANKL発現に対して上流のアクチベーター(upstream activator)であり、mAb 7EがIL−20で誘導されるRANKL発現を阻害することが示された。これらの結果から、IL−20が、インビトロで、骨芽細胞でのRANKLの上流のインデューサー(upstream inducer)であり、破骨細胞形成を促進するという強固な証拠が得られた。
本明細書に開示されるすべての態様は、いずれの組み合わせで併合されてもよい。本明細書に開示される各態様は、同じ、等価の、または同様の目的を果たす別の態様に置換されてもよい。ゆえに、特記されない限り、開示される各態様は、一連の等価のまたは同様の態様の一例にすぎない。
Claims (21)
- IL−20に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、骨粗鬆症の治療、骨粗鬆症の発症の遅延、または骨粗鬆症の予防のための薬剤。
- 前記抗体またはその抗原結合断片は、ヒトIL−20(配列番号:6)に特異的に結合する、請求項1に記載の薬剤。
- 前記抗体は、(a)mAb 7E、または(b)mAb 7Eのものと少なくとも70%一致する重鎖可変領域(VH)及びmAb 7Eのものと少なくとも70%一致する軽鎖可変領域(LH)を含む、請求項2に記載の薬剤。
- 前記抗体またはその抗原結合断片は、mAb 7Eの軽鎖由来の3つの相補性決定領域および重鎖由来の3つの相補性決定領域を有する、請求項2または3に記載の薬剤。
- 前記抗体は、ヒト化抗体である、請求項2〜4のいずれか1項に記載の薬剤。
- 前記抗体は、キメラ抗体である、請求項2〜4のいずれか1項に記載の薬剤。
- 前記キメラ抗体は、mAb 7E由来の重鎖および軽鎖の可変領域配列を有する、請求項6に記載の薬剤。
- 前記抗体は、ヒト抗体由来の重鎖の定常領域配列および軽鎖の定常領域配列を有する、請求項6または7に記載の薬剤。
- 前記抗体は、mAb 7E由来の重鎖可変領域配列およびmAb 7E由来の軽鎖可変領域配列を有する、請求項2〜8のいずれか1項に記載の薬剤。
- 前記抗原結合断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFvからなる群より選択され;また、前記抗原結合断片は、mAb 7Eの結合特異性を保持する、請求項4〜9のいずれか1項に記載の薬剤。
- 前記骨粗鬆症は、炎症性疾患に関連する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の薬剤。
- 前記炎症性疾患は、リウマチ性関節炎である、請求項11に記載の薬剤。
- 前記骨粗鬆症は、エストロゲン欠乏に関連する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の薬剤。
- 前記エストロゲン欠乏は、更年期障害に関連する、請求項13に記載の薬剤。
- 前記骨粗鬆症は、アンドロゲン欠乏に関連する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の薬剤。
- 前記IL−20に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、他の治療剤と組み合わせて投与される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の薬剤。
- 前記治療剤は、TNFaアンタゴニストである、請求項16に記載の薬剤。
- 前記TNFアンタゴニストは、エタネルセプトポリペプチド、インフリキシマブおよびアダリムマブからなる群より選択される、請求項17に記載の薬剤。
- 前記エタネルセプトポリペプチドは、ヒト可溶性TNFレセプターおよびヒト免疫グロブリンG1のFc成分を含む融合タンパク質である、請求項18に記載の薬剤。
- 抗IL−20抗体を含む、骨粗鬆症の治療、骨粗鬆症の発症の遅延、または骨粗鬆症の予防のためのキット。
- 骨粗鬆症の治療、骨粗鬆症の発症の遅延、または骨粗鬆症の予防のために前記抗IL−20抗体を使用するための指示書をさらに有する、請求項20に記載のキット。
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