CN114258402A - 抗cd123抗体、抗cd123嵌合抗原受体和抗cd123嵌合抗原受体t细胞 - Google Patents

抗cd123抗体、抗cd123嵌合抗原受体和抗cd123嵌合抗原受体t细胞 Download PDF

Info

Publication number
CN114258402A
CN114258402A CN202080058104.1A CN202080058104A CN114258402A CN 114258402 A CN114258402 A CN 114258402A CN 202080058104 A CN202080058104 A CN 202080058104A CN 114258402 A CN114258402 A CN 114258402A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
sequence seq
identity
complementarity determining
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080058104.1A
Other languages
English (en)
Inventor
F·加纳彻-奥投
C·费尔兰德
F·安格洛特-德雷特雷
M·德斯产普斯
E·波勒-理查德
O·阿多特维
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Besanson Regional University Hospital Center
Fa Guoxueyejigou
University Franche Comte
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Besanson Regional University Hospital Center
Fa Guoxueyejigou
University Franche Comte
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Besanson Regional University Hospital Center, Fa Guoxueyejigou, University Franche Comte, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Besanson Regional University Hospital Center
Publication of CN114258402A publication Critical patent/CN114258402A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及特异性结合人白细胞介素3(IL3)受体α链的单克隆抗CD123抗体或其片段。进一步地，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中CAR包含包括抗CD123结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域和至少包含刺激结构域的胞内信号传导结构域，由所述核酸分子编码的多肽以及包含这种抗体或抗体片段的分离的嵌合抗原受体(CAR)分子。本发明还涉及包含编码CAR的核酸分子的载体，以及包含所述载体的T细胞，并涉及表达CAR分子的T细胞用于治疗哺乳动物中增殖性疾病(例如癌症)的用途。

Description

抗CD123抗体、抗CD123嵌合抗原受体和抗CD123嵌合抗原受体 T细胞
本发明涉及单克隆抗体及其用途。更具体而言，本发明涉及特异性结合人白细胞介素3(IL3)受体α链的单克隆抗CD123抗体或其片段。
本发明还涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中所述CAR包含包括抗CD123结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域和至少包含刺激结构域的胞内信号传导结构域，由所述核酸分子编码的多肽以及包含这种抗体或抗体片段的分离的嵌合抗原受体(CAR)分子。
本发明还涉及包含编码CAR的核酸分子的载体，以及包含所述载体的T细胞。本发明还涉及表达CAR分子的T细胞用于治疗哺乳动物中增殖性疾病如癌症的用途。
抗击癌症是一项全球性的挑战。母细胞性浆细胞样树突细胞瘤(BPDCN)是一种罕见的侵袭性癌症。这是一种源于浆细胞样树突细胞(pDC)前体的克隆性疾病，其具有常见的皮肤病变且总是进展为侵袭性白血病扩散。这种类型癌症的中位总生存期(OS)为8至12个月。
BPDCN的预后和治疗都非常差。强化化疗是无效的，因为几乎所有接受这种治疗的患者在数周或数月后都会复发。
一种称为SL-401的融合蛋白为疗法提供了先导，该融合蛋白由与白喉毒素融合的人白细胞介素3(IL3)组成，参见Angelot-Delettre F,Roggy A,Frankel AE,Lamarthee B,Seilles E,Biichle S等人,In vivo and in vitro sensitivity of blasticplasmacytoid dendritic cell neoplasm to SL-401,an interleukin-3receptortargeted biologic agent,Haematologica,2015,100(2):223-30。
本发明改善了这种状况。
本申请人已经发现，一种称为CD123的蛋白质–它是白介素-3(IL3)受体的alpha(α)链–在所有BDPCN患者的癌细胞中过度表达，参见Garnache-Ottou F,Feuillard J,Ferrand C,Biichle S,Trimoreau F,Seilles E等人,Extended diagnostic criteriafor plasmacytoid dendritic cell leukaemia,British journal of haematology,2009,145(5):624-36。
因此，本发明的重点是使用CD123作为治疗靶标。
在这种情况下，并以开发针对CD123的生物疗法为目标，本申请人成功地产生、开发、筛选和选定了特异性结合人CD123的抗CD123单克隆抗体(MA)。这些抗体一般可用于疗法中，更具体地说，可用作对抗浆细胞样树突细胞瘤型白血病和表达CD123的其它病理的武器。
一种快速发展的抗癌技术使用工程化T细胞(或T淋巴细胞)。这些T细胞包含所谓的嵌合抗原受体，通常称为CAR，其特异性针对由癌细胞表达的靶抗原。
考虑到这一点，本申请人克服了许多障碍，利用新开发的抗CD123抗体对T细胞进行基因工程化改造以表达特异性靶向CD123的CAR，从而特异性和有效地对抗癌细胞。
这种新型治疗武器可以应用于BPDCN患者或BPDCN复发患者，以及已经经过强化化疗、SL-401、造血干细胞同种异体移植或其它治疗方法治疗的BPDCN患者。
为此目的，在第一方面，本发明的特征在于特异性结合抗原CD123的抗体，其具有不超过9.5x10-9M的KD值、不超过9.0x10-4s-1的抗体解离速率koff，和至少7x104Ms-1的抗体结合速率kon，并且其中所述抗体选自由AB1、AB2、AB3、AB4、AB5和AB6组成的组，其中
-AB1包括重链和轻链，并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:13具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:14具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)；
-AB2包括重链和轻链，并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:27具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:15具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)；
-AB3包括重链和轻链，并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:5具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:6具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)；
-AB4包括重链和轻链，并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:31具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:32具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)；
-AB5包括重链和轻链，并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:33具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:34具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:22具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:10具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)；以及
-AB6包括重链和轻链，并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:35具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:23具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)。
根据本发明的实施方案，AB1包括与氨基酸序列SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:86具有至少85％同一性的轻链，
并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:13具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，
并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
AB2包括与氨基酸序列SEQ ID NO:87具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:88具有至少85％同一性的轻链，
并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:27具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:15具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，
并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
AB3包括与氨基酸序列SEQ ID NO:89具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:90具有至少85％同一性的轻链，
并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，
并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
AB4包括与氨基酸序列SEQ ID NO:91具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:92具有至少85％同一性的轻链，
并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:31具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，
并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:32具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
AB5包括与氨基酸序列SEQ ID NO:93具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:94具有至少85％同一性的轻链，
并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:33具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，
并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:34具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:22具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；以及
AB6包括与氨基酸序列SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:96具有至少85％同一性的轻链，
并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:35具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:23具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，
并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)。
根据本发明的优选实施方案，AB1包括与氨基酸序列SEQ ID NO:85具有至少90％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:86具有至少90％同一性的轻链，
并且其中该重链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:13组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成的互补决定区3(CDR3)，
并且其中该轻链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成的互补决定区3(CDR3)；
AB2包括与氨基酸序列SEQ ID NO:87具有至少90％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:88具有至少90％同一性的轻链，
并且其中该重链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:15组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:3组成的互补决定区3(CDR3)，
并且其中该轻链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:28组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:16组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成的互补决定区3(CDR3)；
AB3包括与氨基酸序列SEQ ID NO:89具有至少90％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:90具有至少90％同一性的轻链，
并且其中该重链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:29组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:17组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:5组成的互补决定区3(CDR3)，
并且其中该轻链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:30组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:18组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成的互补决定区3(CDR3)；
AB4包括与氨基酸序列SEQ ID NO:91具有至少90％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:92具有至少90％同一性的轻链，
并且其中该重链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:31组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:19组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:7组成的互补决定区3(CDR3)，
并且其中该轻链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:32组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:20组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:8组成的互补决定区3(CDR3)；
AB5包括与氨基酸序列SEQ ID NO:93具有至少90％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:94具有至少90％同一性的轻链，
并且其中该重链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:33组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:21组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:9组成的互补决定区3(CDR3)，
并且其中该轻链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:34组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:22组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:10组成的互补决定区3(CDR3)；以及
AB6包括与氨基酸序列SEQ ID NO:95具有至少90％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:96具有至少90％同一性的轻链，
并且其中该重链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:35组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:23组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:11组成的互补决定区3(CDR3)，
并且其中该轻链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:36组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:24组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:12组成的互补决定区3(CDR3)。
根据本发明的另一实施方案，AB1的重链具有可变区，该可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:37组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:38组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ ID NO:39组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:40组成的第四框架区(FR4)，并且其中AB1的轻链具有可变区，该可变区包括由氨基酸序列SEQID NO:61组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:62组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ ID NO:63组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:64组成的第四框架区(FR4)；
AB2的重链具有可变区，该可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:41组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:42组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:43组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:44组成的第四框架区(FR4)，并且其中AB2的轻链具有可变区，该可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:65组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:66组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ ID NO:67组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:68组成的第四框架区(FR4)；
AB3的重链具有可变区，该可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:45组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:46组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:47组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:48组成的第四框架区(FR4)，并且其中AB3的轻链具有可变区，该可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:69组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:70组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ ID NO:71组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:72组成的第四框架区(FR4)；
AB4的重链具有可变区，该可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:49组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:50组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:51组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:52组成的第四框架区(FR4)，并且其中AB4的轻链具有可变区，该可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:73组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:74组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ ID NO:75组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:76组成的第四框架区(FR4)；
AB5的重链具有可变区，该可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:53组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:54组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:55组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:56组成的第四框架区(FR4)，并且其中AB5的轻链具有可变区，该可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:77组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成的第四框架区(FR4)；
AB6的重链具有可变区，该可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:57组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:58组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:59组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:60组成的第四框架区(FR4)，并且其中AB6的轻链具有可变区，该可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ ID NO:83组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:84组成的第四框架区(FR4)。
在另一方面，本发明的特征在于编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中该CAR包括包含抗CD123结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域和至少包含刺激结构域的胞内信号传导结构域，并且其中所述抗CD123结合结构域包括：
(i)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:13具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ IDNO:2具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(ii)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:27具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:15具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ IDNO:4具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(iii)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ IDNO:6具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(iv)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:31具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:32具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ IDNO:8具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(v)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:33具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:34具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:22具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ IDNO:10具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
或者
(vi)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:35具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:23具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ IDNO:12具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)。
根据实施方案，本发明分离的核酸分子的抗CD123结合结构域选自抗体、Fv、scFv、Fab或其它抗体片段组成的组，优选scFv。
在另一实施方案中，胞内信号传导结构域是CD3-zeta(CD3ζ)，任选地包含选自CD28、4.1BB、诱导型T细胞共刺激物(ICOS)、OX-40或其组合组成的组中的共刺激结构域。
本发明另一方面的特征在于由上述核酸分子编码的分离的多肽分子。
本发明再一方面的特征在于分离的嵌合抗原受体(CAR)分子，其包含包括抗CD123结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域和至少包含刺激结构域的胞内信号传导结构域，并且其中所述抗CD123结合结构域包括：
(i)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:13具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ IDNO:2具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(ii)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:27具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:15具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ IDNO:4具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(iii)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ IDNO:6具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(iv)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:31具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:32具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ IDNO:8具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(v)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:33具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:34具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:22具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ IDNO:10具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
或者
(vi)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:35具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:23具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)，以及与氨基酸序列SEQ IDNO:12具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)。
本发明另一方面的特征在于分离的嵌合抗原受体(CAR)分子，其中所述CAR如上所述。
本发明另一方面的特征在于包含本发明核酸分子的表达载体，其中该载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体组成的组。
本发明另一方面的特征在于包含本发明核酸分子或本发明载体的工程化免疫细胞。在本发明的一个实施方案中，细胞在其膜上表达如上所述的CAR。根据一个实施方案，该细胞用作药物，优选用于治疗哺乳动物，优选人类中的增殖性疾病，其中该增殖性疾病是与CD123过度表达相关的疾病，优选母细胞性浆细胞样树突细胞瘤(BPDCN)。
本发明再一方面的特征在于一种药物组合物，其包含如上所述的工程化免疫细胞和药用赋形剂。
本发明又一方面的特征在于一种工程化改造免疫细胞的方法，该方法包括用如上所述的表达载体来转导细胞。
本发明再一方面的特征在于编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中该核酸分子由与SEQ ID NO:97具有至少85％、优选90％、更优选95％和最优选100％同一性的序列组成。
在阅读以下描述后，本发明的其它特征和有益效果会脱颖而出和/或变得清晰，该以下描述包括以说明性和非限制性方式给出的具体示例，并且也从附图中可以看出，其中：
图1示出了本发明抗体的重链和轻链的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)的核苷酸序列和氨基酸序列；
图2示出了本发明抗体的重链的框架区1(FR1)、框架区2(FR2)、框架区3(FR3)和框架区4(FR4)的核苷酸序列和氨基酸序列；
图3示出了本发明抗体的轻链的框架区1(FR1)、框架区2(FR2)、框架区3(FR3)和框架区4(FR4)的核苷酸序列和氨基酸序列；
图4示出了本发明第一抗体的轻链的共有氨基酸序列和重链的共有氨基酸序列；
图5示出了本发明第二抗体的轻链的共有氨基酸序列和重链的共有氨基酸序列；
图6示出了本发明第三抗体的轻链的共有氨基酸序列和重链的共有氨基酸序列；
图7示出了本发明第四抗体的轻链的共有氨基酸序列和重链的共有氨基酸序列；
图8示出了本发明第五抗体的轻链的共有氨基酸序列和重链的共有氨基酸序列；
图9示出了本发明命名的第六抗体的轻链的共有氨基酸序列和重链的共有氨基酸序列；
图10示出了基于评估正常造血细胞和BPDCN上CD123表达的流式细胞术图；
图11示出了基于评估BPDCN和其它非pDC急性白血病中CD123表达的表格和流式细胞术图；
图12示出了本发明嵌合抗原受体的设计示意图，以及与根据本发明产生包含本发明嵌合抗原受体的T细胞相关的western印迹图和流式细胞术图；
图13示出了根据本发明的嵌合抗原受体的核酸序列；
图14示出了与评估根据本发明的CART细胞与非转导T细胞相比的表型相关的流式细胞术图；
图15示出了将靶细胞与本发明的嵌合抗原受体和非转导细胞共培养的示意图，以及与本发明CAR对BPDCN细胞系和BPDCN患者源性异种移植细胞的特异性细胞毒性相关的流式细胞术图；
图16示出了与和CD123+靶细胞共培养中的本发明CD123R CAR T细胞的功能表征相关的流式细胞术图；
图17示出了异种移植模型的示意图、生物发光成像和与其相关的图，以及与本发明的T细胞对BPDCN细胞系(CAL-1)和患者源性异种移植细胞(PDX)的体内抗肿瘤活性相关的流式细胞术图；
图18示出了与本发明T细胞对BPDCN细胞系(CAL-1)的体内抗肿瘤活性相关的异种移植模型示意图、生物发光成像及其图；
图19示出了与不同细胞类型中CD123表达相关的荧光图、肿瘤和正常组织中CD123表达的免疫组织化学图像、与CD123表达相关的流式细胞术图、本发明自体T细胞的产生示意图，以及本发明T细胞对低水平表达CD123的细胞的与CD123相关的毒性的流式细胞术图；
图20示出了基于与评估自体T细胞对细胞系(CAL-1和DAUDI)的毒性相关的流式细胞术的图；
图21示出了与来自BPDCN患者的本发明CD123 T细胞诱导的对自体BPDCN母细胞的特异性细胞毒性相关的流式细胞术图。
本文的附图和说明书大体上都包含了确定性质的要素。因此，说明书和附图不仅用于更好地理解本发明，而且在适当的时候也有助于对其进行定义。
在本说明书中，术语“和/或”应该被解释为包括它所连接的一个或多个可能发生的情况。例如，措辞“可以使用标准重组和/或合成方法制备蛋白质或蛋白序列”表示可以使用标准重组和合成方法两者制备该蛋白质或蛋白序列，或者可以使用标准重组方法制备该蛋白质或蛋白序列，或者表示可以使用合成方法制备该蛋白质或蛋白序列。更一般地说，在短语例如“A和/或B”中使用的术语“和/或”，意在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样，在短语例如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”，意在包括以下具体表现中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
术语“包含”应被解释为包括所有具体提及的特征以及任选的、附加的、未指定的特征。更一般地说，术语“包括(comprise)”、“含有(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为意味着包括规定步骤或要素或者步骤组或要素组，但不排除任何其它步骤或要素或者步骤组或要素组。术语“由...组成”应被解释为除了具体提及的特征之外，不存在其它特征。此外，不定冠词“一个(a)”或“一种(an)”并不排除复数。
当在整个本说明书中提及“一个实施方案”、“实施方案”、“特定实施方案”、“某个实施方案”、“另外的实施方案”、“另一实施方案”或“再一实施方案”或者“一方面”、“方面”、“特定方面”、“某个方面”、“另外的方面”、“另一方面”或“再一方面”及其组合时，意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。冠词“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”在本文中用于指代该冠词语法客体的一个或多于一个(即至少一个)。
术语“基因”指的是编码特定氨基酸序列的DNA序列(核酸序列或核苷酸序列)。基因包含一种或多种蛋白质或酶的全部或部分，并且可以包括调节性DNA序列(例如启动子序列)，这些调节性DNA序列至少部分地决定在什么条件下表达该基因。有些基因不是结构基因，可以从DNA转录成RNA，但不翻译成氨基酸序列。其它基因可以作为结构基因的调节子或DNA转录的调节子而发挥作用。特别是，术语“基因”可意图用于编码蛋白质的基因组序列，即包含调节子、启动子、内含子和外显子序列的序列。
在两个或更多个核酸序列或氨基酸序列的上下文中，术语“同一性”或“同一性”百分比(％)指的是在比较或比对(如有必要，引入空位)最大一致性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或者具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，而不考虑任何保守性氨基酸取代作为序列同一性的一部分。可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量同一性百分比。本领域中已知的各种算法和软件可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对。序列比对算法的一个这样的非限制性示例是描述于下列中的算法，即Karlin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.87:2264-2268,1990，在下列中进行改进，即Karlin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.90:5873-5877,1993，并被并入NBLAST和XBLAST程序(Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1991)中。还可以使用空位BLAST(Gapped BLAST)，如下列中所描述，即Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人,Methods in Enzymology 266:460-480,1996)，ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或Megalign(DNASTAR)是可用于比对序列的其它可公开获取的软件程序。此外，Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(48):444-453,1970)可用于确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比(例如，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5)。备选地，核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用Myers和Miller的算法(CABIOS,4:11-17,1989)来确定。例如，可以使用ALIGN程序(2.0版)并使用带有残基表、空位长度罚分为12和空位罚分为4的PAM120来确定同一性百分比。本领域技术人员可以确定通过特定比对软件进行最大比对的合适参数。通常情况下，使用比对软件的默认参数。
“与参照序列至少85％同一性”的序列或“具有与参照序列至少85％同一性的某物”指的是在其整个长度上与参照序列的整个长度具有85％或更高序列同一性，特别是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在本说明书的上下文中，“同一性百分比”是使用成对比对来计算的(即在两个序列的整个长度上进行比较)。如上所述，用于比较两个或更多个序列同一性的方法在本领域中是众所周知的。例如，生物信息学工具或程序，如ebi.ac.uk网站上提供的EMBOSS Needle，可用于产生本发明的成对序列比对。通常，许多生物信息学工具和程序在考虑两个序列的整个长度时，会使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970J.Mol.Biol.48:443-453)来寻找它们的最佳比对(包括空位)。然而，其它算法也可以在各种生物信息学工具或程序中实施。
更一般地说，就本发明而言，“序列同一性”或“序列同源性”是通过在比较窗口中比较两个比对的序列来计算的。序列比对能够确定比较窗口中两个序列共有的位置(核苷酸或氨基酸)的数量。然后将共有位置的数量除以比较窗口中的位置总数，再乘以100，以获得同源性百分比。确定序列同一性百分比可以手动完成，或者通过使用众所周知的生物信息学计算机程序来完成。
根据本发明，两个多肽之间的同一性百分比可以使用EMBOSS Needle(全局比对)程序，使用“空位打开”参数等于10.0、“空位延长”参数等于0.5和Blosum62矩阵来计算。
具有与参照序列有“至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性”的氨基酸序列(或由其组成)的蛋白质或其部分可包含与参照序列相比的突变，例如缺失、插入和/或取代。
在取代的情况下，由与参照序列存在至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成的蛋白质可以对应于源自不同于参照序列的另一物种的同源序列(即“同源性”)。氨基酸的取代可能是保守的或非保守的。保守性取代是这样一种取代，即其中用一种氨基酸被取代为具有类似侧链的另一种氨基酸，即类似的结构和/或类似的化学性质。在这方面，保守性取代可能发生在下列之间：
-具有非极性侧链的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)、色氨酸(Trp)；
-具有不带电的极性侧链的氨基酸：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)；
-具有酸性侧链的氨基酸：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；
-具有碱性侧链的氨基酸：赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)；
-具有β-支化侧链的氨基酸：苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)；
-具有芳香族侧链的氨基酸：酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)。
非保守性取代可以在上述之间随机发生。根据蛋白质三维形状内各个氨基酸的位置，可以给出保守性或非保守性取代的其它定义。
除非另有说明，本发明使用的技术是本领域技术人员已知的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、基因和/或生物技术细胞工程、免疫学和细胞生物学的方法。必要时，出于说明的目的描述这些方法。大多数这些方法和其它技术在文献中都有描述。例如，参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,2001年)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989年)；Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982年)；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons,更新于2008年7月)；Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons,第4版,1999年；DNA Cloning:APractical Approach,第I&II卷(IRL Press,Oxford,1985年)；Techniques for theAnalysis of Complex Genomes,Anand,Academic Press,1992年；Transcription andTranslation,B.Names&S.Higgins,1984年；A Practical Guide to Molecular Cloning,Perbal,1984年；Antibodies,Harlow和Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,1998年；Current Protocols in Immunology,Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober,1991年；Annual Review ofImmunology。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明领域的本领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管可以使用与本文所述的那些类似或等同形式的任何方法或材料来实施或测试本发明，但是本文描述的是组合物、方法和材料的优选实施方案。
如本领域技术人员所理解的和本文所述的那样，“抗体”，也称为“免疫球蛋白”，包含两条重链和两条轻链。每条重链由可变区和第一、第二和第三恒定区组成，而每条轻链由可变区和恒定区组成。两条重链通过二硫键相互连接，其中每条重链通过二硫键与轻链连接。
在哺乳动物中，轻链有两种类型，lambda(I)和kappa(κ)。此外，有五种主要的重链类别(或同种型)，其被分类为a、d、e、y和m，它们决定了抗体分子的功能活性：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。
每条链都包含不同的序列结构域。轻链包括两个结构域或区域，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。更确切地说，完整的抗体形成一个“Y”形。Y的基部或茎部由两条重链的第二和第三恒定区(对于IgE和IgM，第四恒定区)组成，这两条重链通过二硫键结合在一起，有时称为链间二硫键，形成铰链。重链y和d具有由三个串联(内联)Ig结构域组成的恒定区，以及用于增加柔性的铰链区；重链m和e具有由四个免疫球蛋白结构域组成的恒定区。第二和第三恒定区分别称为“CH2结构域”和“CH3结构域”。Y的每个臂或分支包括与单个轻链的可变区和恒定区结合的单个重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。更一般地说，轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区结构域赋予了重要的生物学特性，如抗体链缔合、分泌、经胎盘移动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分，并由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体的联合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体的联合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基组成。有时候，来自非高变区或框架区(FR)的残基会影响整个结构域结构，从而影响联合位点。互补决定区或CDR指的是共同定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和性和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各有三个CDR，通常分别命名为CDR1、CDR2和CDR3，或者更确切地分别命名为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。在文献中，可以发现其它命名法。因此，位于抗体重链可变结构域中的CDR可称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，而位于抗体轻链可变结构域中的CDR可称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。具有不同特异性(即，对不同抗原有不同的联合位点)的抗体具有不同的CDR。因此，常规的抗体抗原结合位点包括六个CDR，其包括来自重链V区和轻链V区各自的CDR集。
如上所述，轻链和重链可变区包含被高变CDR区分隔的所谓“框架”区。CDR可以通过方法来定义或鉴定，例如通过根据下列的序列，即Kabat等人,Wu,TT和Kabat,E.A.,J ExpMed,132(2):211-50,1970；Borden,P.和Kabat E.A.,PNAS,84:2440-2443,1987；Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,美国卫生和公众服务部,1991-或者通过根据下列的结构，即Chothia等人-Choithia,C.和Lesk,A.M.,J Mol.Biol.,196(4):901-917,1987；Choithia,C.等人,Nature,342:877-883,1989。
不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种内如在人类中相对保守。更一般地说，“框架区”(FR)在单一物种的不同免疫球蛋白中相对保守。抗体的框架区在某种程度上是组成性轻链和重链的所有框架区的组合，用于在三维空间中(即当抗体折叠并具有活性时)定位和排列CDR。CDR主要负责结合抗原的表位。如上所述，每条链的CDR被称为CDR1、CDR2和CDR3。事实上，CDR是从N-末端开始按顺序编号的。免疫球蛋白的轻链和重链各有四个FR，分别命名为FR1、FR2、FR3和FR4，或者更确切地说，对于轻链分别为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L，并且对于重链分别为FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域因此可以被命名为(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)，并且重链可变结构域因此可以被命名为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。知道了CDR的氨基酸序列后，本领域技术人员可以容易地确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
本说明书中提及的“VH”或“VH”指的是免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、Fab或本文公开的其它抗体片段的可变区。提及的“VL”或“VL”指的是免疫球蛋白轻链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或本文公开的其它抗体片段的可变区。
如本文所用的，术语“抗体”或“免疫球蛋白”主要表示常规抗体，特别是单克隆抗体及其片段，以及单结构域抗体及其片段，特别是单结构域抗体的可变重链，并且进一步表示嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。抗体优选为人源抗体、鼠抗体或人源化抗体。
“单克隆抗体”或“mAb”是由B淋巴细胞的单个克隆或已经转染有单一抗体的重链和轻链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体是通过本领域众所周知的方法产生的，例如通过将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合来制备杂合抗体形成细胞，或通过重组技术，即通过蛋白质工程产生。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。更一般地说，单克隆抗体是针对特定抗原的单一氨基酸组成的分子，并且不应理解为需要通过本领域已知的方法以外的任何特定方法来产生抗体。
术语“嵌合抗体”指的是工程化抗体，从其最宽泛的意义上来讲，包含来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其它抗体的一个或多个区域。尤其是，嵌合抗体包含源自非人动物的抗体的VH结构域和VL结构域，以及与其缔合的另一种抗体特别是人抗体的CH结构域和CL结构域。作为非人动物，可以使用任何动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔子等。嵌合抗体还可以表示对至少两种不同抗原具有特异性的多特异性抗体。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”还包括最近描述和开发的“单结构域抗体”的含义。单结构域抗体是其互补决定区(CDR)是单结构域多肽的一部分的抗体。单结构域抗体的示例包括重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、源自常规四链抗体的单结构域抗体以及工程化的单结构域抗体。单结构域抗体可以源自任何物种，尤其是源自小鼠、人类或兔子。单结构域抗体可以是天然生成的单结构域抗体，称为缺乏轻链的重链抗体。特别是，骆驼科物种(如骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼和原驼)产生天然缺乏轻链的重链抗体。
这些缺乏轻链的单结构域抗体的可变重链在本领域中被称为“VHH”或“纳米抗体”。与常规的VH结构域类似，VHH包含四个框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。与常规抗体相比，纳米抗体的一个特殊优势是它们比IgG分子小约十倍。因此，适当折叠的功能性纳米抗体可以通过体外表达以高产率产生。此外，本领域描述的纳米抗体是非常稳定的，并且对蛋白酶的作用具有抗性。例如，纳米抗体的特性和产生已经在下列中进行了综述，即Harmsen和De Haard HJ,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2007年,11月,77(1):13-22。
在某些优选实施方案中，抗体是特异性结合肿瘤细胞上表面蛋白的人源化抗体(如人源化单克隆抗体)。“人源化”抗体是一种免疫球蛋白，其包括人类框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成)免疫球蛋白的一个或多个CDR。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分，可能除了CDR之外，都与天然人类免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。人源化或其它单克隆抗体可以具有额外的保守性氨基酸取代，这对于抗原结合或其它免疫球蛋白功能基本上没有影响。人源化抗体可以通过基因工程来构建(例如，参见第5,585,089号美国专利)。
更一般地说，术语“人源化抗体”指的是完全或部分非人来源的抗体，其已经被修饰以替换某些氨基酸，特别是在重链和轻链的框架区中，以避免或最小化在人类中的免疫应答。人源化抗体的恒定结构域在大多数情况下是人类的CH和CL结构域。本领域中已知有许多用于抗体序列人源化的方法；例如，参见Almagro&Fransson的综述，2008,FrontBiosci.13:1619-1633。一种常用的方法是所谓的CDR移植或抗体改型(antibodyreshaping)。该技术包括将供体抗体(通常为小鼠抗体)的CDR序列移植到具有不同特异性的人抗体的框架支架中。由于CDR移植可以降低移植了CDR的非人抗体的结合特异性和亲和性，从而降低其生物学活性，因此可以在移植了CDR的抗体的选定位置引入回复突变，以保持亲本抗体的结合特异性和亲和性。可以使用文献和抗体数据库中提供的信息来鉴定可能的回复突变的位置。作为回复突变候选的氨基酸残基通常是那些位于抗体分子表面的残基，而被掩埋或表面暴露程度较低的残基通常不会被改变。CDR移植和回复突变的备选人源化技术是表面重塑，其中保留非人来源的非表面暴露残基，而将表面残基改变为人类残基。另一种备选技术被称为所谓的引导选择，参见Jespers等人,Biotechnology 12,899,1994，并可用于从例如小鼠或大鼠抗体中衍生出保留亲本抗体的表位和结合特性的全人抗体。再一种人源化的方法是所谓的4D人源化。在专利申请WO2009032661A1(或US20110027266)中描述了4D人源化方案，并在下文中举例说明了应用4D人源化来对大鼠抗体可变轻链(VL)和重链(VH)结构域进行人源化。在一个示例中，利用PDB结构(参见Berman等人,NucleicAcids Research,28:235-242,2000)作为模板通常用MOE软件(v.201 1.10-ChemicalComputing Group,Quebec,Canada)完成大鼠抗体同源模型，随后使用MOE中实施的标准程序进行能量最小化。然后对大鼠抗体的最小化3D同源模型(用MOE软件完成)进行分子动力学(MD)模拟，并与例如由LGCR/SDI设计并在MOE中提供的7条代表性轻链(vκ1、vκ2、vκ3、vκ4、vλ1、vλ2、vλ3)和7条代表性重链(vhl a、vhl b、vh2、vh3、vh4、vh5、vh6)衍生的49个人类模型进行比较。例如，选择了具有最佳疏水性、静电分量和CDR之外序列同一性的链偶联模型(Vkx-Vhx)进行了4D人源化设计。对于大鼠抗体可变结构域和所选模型之间的成对关联，序列通常基于相应同源模型的α-碳的最佳3D叠加来进行对齐。然后考虑不想要的基序并对其进行突变。最后，将得到的人源化序列与例如IEDB数据库(http://www.immuneepitope.org；可在本地访问的2012/01/30版)进行序列相似性比对分析，以确保所有序列均不包含其中列出的任何已知B细胞或T细胞表位。
对于嵌合抗体，人源化通常涉及可变区序列的框架区的修饰。
作为CDR一部分的氨基酸残基通常不会随着人源化而改变，尽管在某些情况下，可能需要改变个别CDR氨基酸残基，例如去除糖基化位点、脱酰胺位点或不需要的半胱氨酸残基。N-连接糖基化通过将低聚糖链附接到三肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr中的天冬酰胺残基上而发生，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。去除N-糖基化位点可以通过将Asn或Ser/Thr残基突变为不同的残基来实现，特别是通过保守性取代的方式。天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺作用可能取决于一些因素例如pH值和表面暴露而发生。天冬酰胺残基特别容易发生脱酰胺作用，主要出现在序列Asn-Gly中，而在其它双肽序列如Asn-Ala中程度较轻。当CDR序列中存在此类脱酰胺位点，尤其是Asn-Gly时，因此可能需要去除该位点，通常是通过保守性取代来去除其中一个涉及的残基。在CDR序列中进行取代以去除其中一个涉及的残基也意在包括在本发明中。
术语抗体还包括其抗原结合片段。此类“片段”包含完整抗体的一部分，尤其是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的示例包括Fab'片段、F(ab)'2片段、Fv、单链Fv蛋白(“scFv”)和负责抗原结合的全长抗体的部分、双抗体、由抗体片段形成的双特异性和多特异性抗体。常规抗体的片段也可以是单结构域抗体，例如重链抗体或VHH。术语“Fab”表示分子量约为50,000且具有抗原结合活性的抗体片段，其中在通过以蛋白酶木瓜蛋白酶处理IgG获得的片段中，约一半的H链的N-末端侧和整个L链通过二硫键结合在一起。术语“F(ab')2”指的是在通过以蛋白酶胃蛋白酶处理IgG获得的片段中，分子量约为100,000并具有抗原结合活性的抗体片段，其比通过铰链区的二硫键结合的Fab稍大。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中，并呈任一方向(例如，VL-VH或VH-VL)。单链可以从针对所需靶标的特异性杂交瘤的V区基因中克隆出来。这种杂交瘤的产生已经成为常规程序。一种可用于克隆可变区重链(VH)和可变区轻链(VL)的技术已经描述于例如，Orlandi等人,PNAS,1989,86:3833-3837。通常，scFv多肽还包含位于VH和VL结构域之间的多肽接头，该接头使scFv能够形成用于抗原结合所需的结构。更具体地说，单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其通常由基因融合物表达，该基因融合物包括由肽编码接头连接的VH和VL编码基因。在一些实施方案中，人scFv片段包括保持适当构象的CDR，特别是通过使用基因重组技术。二价和多价抗体片段可以通过单价scFv的缔合自发形成，或者可以通过由肽接头偶联单价scFv而产生，如二价sc(Fv)2。“dsFv”是一种由二硫键稳定的VH::VL异二聚体。“(dsFv)2”表示由肽接头偶联的两个dsFv。术语“双特异性抗体”或“BsAb”通常表示一种抗体，它将两种抗体的抗原结合位点组合在单个分子内。因此，BsAb能够同时结合两种不同的抗原。基因工程已经越来越多地用于设计、修饰和产生具有一系列所需结合特性和效应功能的抗体或抗体衍生物，例如在EP2050764A1中所述。术语“多特异性抗体”表示一种抗体，它将两种或更多种抗体的抗原结合位点组合在单个分子内。术语“双抗体”指的是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含连接至同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
本发明提供了用设计为表达嵌合抗原受体(CAR)的载体进行遗传工程改造的免疫效应细胞，其将细胞毒性重定向至肿瘤细胞。CAR是将基于抗体的对靶抗原(例如肿瘤抗原)的特异性与T细胞受体激活性胞内结构域相组合以产生一种表现出特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。如本文所用的，术语“嵌合”描述了由来自不同来源的不同蛋白质或DNA的部分组成。CAR的主要特性是它们能够重定向免疫效应细胞特异性，从而触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用或产生能够以独立于主要组织相容性(MHC)的方式介导靶抗原表达细胞的细胞死亡的分子，其利用了单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共受体的细胞特异性靶向能力。
如本文所用的，术语“结合结构域”、“胞外结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”和“胞外抗原特异性结合结构域”可互换使用，并为CAR提供特异性结合感兴趣的靶抗原的能力。结合结构域可以包括具有特异性识别并结合生物分子(例如，细胞表面受体或肿瘤蛋白、脂质、多糖或其它细胞表面靶分子或其组分)的能力的任何蛋白质、多肽、寡肽或肽。结合结构域包括感兴趣的生物分子的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的结合伴侣。如本文所用的术语“特异性结合亲和力”或“特异性结合(specifically binds)”或“特异性结合的”或“特异性结合(specific binding)”或“特异性靶向”，描述了一种分子与另一种分子的结合，其结合亲和力大于背景结合。如果结合结构域(或包含结合结构域的CAR，或包含结合结构域的融合蛋白)以例如大于或等于约105M-1的亲和力或Ka(即，单位为1/M的特定结合相互作用的平衡缔合常数)与靶分子结合或缔合，则它“特异性结合”靶分子。根据本公开的结合结构域多肽和CAR蛋白的亲和力可以使用常规技术如竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)容易地确定。此外，可以确定、量化和定性与亲和力相关的结合质量，即所谓的KD值。KD与抗体亲和力和灵敏性相关。KD是抗体与其抗原之间的平衡解离常数，即koff/kon之比。KD与亲和力呈负相关。KD值与抗体浓度(特定实验所需的抗体量)有关，因此KD值越低(浓度越低)，抗体的亲和力越高。KD是抗体解离速率(koff)与该抗体的抗体结合速率(kon)的比值，其中koff提供抗体与其抗原解离有多快，而kon提供抗体与其抗原结合有多快。通过测量特定抗体/抗原相互作用的kon和koff速率，然后使用这些值的比值来计算KD值，从而确定本说明书的KD值。更一般地说，抗体的亲和力是单个分子与其配体结合的强度。它通常由平衡解离常数(KD)来测量和报告，该常数用于对双分子相互作用的强度进行评估和排序。抗体与其抗原的结合是一个可逆的过程，并且结合反应的速率与反应物的浓度成正比。在平衡状态下，[抗体]|[抗原]复合物形成的速率等于解离成其组分[抗体]+[抗原]的速率。反应速率常数的测量可用于定义平衡或亲和力常数(1/KD)。简而言之，KD值越小，抗体对其靶标的亲和力越大。
CAR的结合结构域通常后跟一个或多个“铰链区”。铰链区在定位抗原结合结构域时发挥作用，使其远离效应细胞表面，以实现细胞与细胞之间的适当接触、抗原结合和激活。CAR在结合结构域和跨膜结构域之间可以有一个或多个铰链区。如本领域中所述，铰链区可以来源于天然、合成、半合成或重组来源。
“跨膜结构域”是CAR的一部分，其将胞外结合部分和胞内信号传导结构域融合在一起。跨膜结构域将CAR锚定在免疫效应细胞的质膜上。如本领域中所述，跨膜区可以来源于天然、合成、半合成或重组来源。
在优选实施方案中，本发明的CAR包含胞内信号传导结构域。“胞内信号传导结构域”指的是CAR的一部分，其参与将CAR与靶抗原有效结合的信息转导到免疫效应细胞内部，以激发效应细胞功能，例如激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括向与CAR结合的靶细胞释放细胞毒性因子，或由与胞外CAR结构域结合的抗原引发的其它细胞反应。“效应功能”是指细胞的一种特化功能。T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或包括分泌细胞因子的活性。因此，在本说明书中，“胞内信号传导结构域”指的是蛋白质的一部分，其转导引起细胞执行特化功能的“效应功能”信号。如本领域中所述，可以使用完整的胞内信号传导结构域或胞内信号传导结构域的截短部分。如本领域技术人员将理解的那样，有效的截短部分必须以与完整结构域基本相同的方式转导效应功能信号。本文中，术语“胞内信号传导结构域”意在包括足以转导效应功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在本发明的优选实施方案中，CAR具有铰链区IgG1-CH2-CH3(IgG1的第一部分定位于膜内，并且IgG1的第二部分定位于细胞外)和作为跨膜结构域的CD28(CD28的第一部分定位于膜内，而CD28的第二部分胞内定位于细胞质内)。CD8α也可以用作跨膜结构域和铰链区。还可以使用来源自IgG4的序列。
如本领域所知，仅通过T细胞受体(TCR)产生的信号不足以完全激活T细胞，还需要次级或共刺激信号。因此，可以说T细胞的激活是由两类不同的胞内信号传导结构域介导的：通过TCR(例如TCR/CD3复合物)启动抗原依赖性主要激活的主要信号传导结构域和按照抗原非依赖性方式发挥作用以提供次级或任何共刺激信号的共刺激信号传导结构域。在优选实施方案中，本发明的CAR包含胞内信号传导结构域，该信号传导结构域包含一个或多个“共刺激信号传导结构域”。于是，在其它优选实施方案中，本发明的分离的核酸分子编码包含至少一个共刺激结构域的胞内信号传导结构域，从而使所得的胞内信号传导结构域因此包含至少一个共刺激结构域。
如本文所用的，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”指的是共刺激分子的胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体以外的细胞表面分子，它们提供在与抗原结合时有效进行T细胞激活/功能所需的第二信号。
在本说明书中，术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且除非另有相反的规定，否则具有常规含义，即氨基酸序列。多肽不限于特定长度，并且可以包含全长蛋白序列或其片段。聚合物可以是线性或支化的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸分隔。此外，多肽可具有翻译后修饰，例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如与标记成分缀合，以及更普遍地，任何天然发生和/或非天然发生的修饰。鉴于本发明的多肽基于抗体的事实，在一些实施方案中，多肽可以作为单链或缔合的链出现。可以使用本领域内已知的任何技术来制备多肽，即重组和/或合成技术。更具体而言，本文所述的多肽包括本公开的CAR，或具有如本文所公开的CAR的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。
如本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等指的是从细胞环境中以及从与细胞其它组分的缔合中体外分离和/或纯化肽或多肽分子。同样地，“分离的细胞”指的是从体内组织或器官获得的细胞，基本上不含胞外基质。
术语“载体”在本文中用来指能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子。更一般地说，“载体”意指一种构建体，它能够向宿主细胞内递送并能够在宿主细胞内表达一个或多个感兴趣的基因或序列。待转运或转移的核酸以本领域已知的任何方式连接到载体核酸分子上，例如通过插入的方式。载体可以包括指导细胞内自主复制的序列，或者可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。本发明还提供了包含编码本发明CAR的核酸分子的载体。该载体可选自DNA、RNA、噬菌体载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。本发明的载体优选包含启动子，例如EF-1α启动子。如本文所用的术语“启动子”，指的是与RNA聚合酶结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。如本领域技术人员所知，RNA聚合酶启动了与启动子可操作地连接的多核苷酸的转录。在特定的实施方案中，可能需要从启动子表达包含CAR的多核苷酸，该启动子在T细胞中提供稳定和长期的CAR表达。在启动子控制下的CAR表达进一步确保了足够的表达水平，以引导T细胞对抗表达靶抗原的细胞。
逆转录病毒是基因递送的常用工具。在一些实施方案中，逆转录病毒用于将编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸递送至细胞，优选免疫细胞。如本文所用的，术语“逆转录病毒”指的是一种RNA病毒，它将其基因组RNA逆转录为线性双链DNA拷贝，并随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。一旦病毒被整合到宿主基因组中，它就被称为“原病毒”。原病毒作为RNA聚合酶的模板，并指导RNA分子的表达，这些RNA分子编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶。因此，用本发明的载体转导的T细胞可以产生稳定、长期和持续的CAR介导的T细胞应答。在特定的实施方案中，用编码根据本发明的CAR的慢病毒载体，即慢病毒，来转导T细胞。术语“慢病毒载体”指的是一种病毒载体或质粒，其包含结构和功能基因元件或其部分，包括主要来源于慢病毒的长末端重复序列(LTR)。术语“慢病毒”指的是一组(或一属)复杂的逆转录病毒。众所周知的慢病毒包括人类免疫缺陷病毒(HIV，例如1型或2型)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。术语“自灭活”(SIN)载体指的是复制缺陷型载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，其中3’LTR增强子-启动子区(称为U3区)经过修饰(例如通过缺失或取代)以防止第一轮病毒复制后的病毒转录。
当提及一种分子例如本发明的多肽或抗体或核苷酸序列时，术语“纯化的”和“分离的”指的是所指分子在不存在其它相同类型的生物大分子的情况下存在。更具体地说，如本文所用的术语“纯化的”特别意指存在至少85％、90％、95％或98％(按重量计)的相同类型的生物大分子。更具体地说，术语“分离的”编码特定多肽的核酸分子指的是基本上不含不编码主题多肽的其它核酸分子的核酸分子；然而，该分子可以包括一些额外的碱基或部分，它们不会对该组成的基本特性产生有害影响。
术语“抗原”、“靶标”或“靶抗原”指的是能够被抗体或抗体样结合蛋白结合的分子或分子的一部分。该术语还指能够在动物中用于产生能够结合该抗原表位的抗体的分子或分子的一部分。靶抗原可以有一个或多个表位。对于由抗体或抗体样结合蛋白识别的每个靶抗原，抗体样结合蛋白能够与识别该靶抗原的完整抗体竞争。
除非另有说明，术语“CD123”、“IL-3Ra”或“IL-3Rα”、“白细胞介素-3受体alpha”或“白细胞介素-3受体α”在本文中可互换使用，并指的是任何天然(人类)IL-3Ra或CD123。CD123蛋白是异二聚体细胞因子受体(即IL-3受体或IL-3R)的白细胞介素3特异性亚基。IL-3R由配体特异性α亚基和信号转导的共同β亚基(也称为CD131)组成，该β亚基由白细胞介素3(IL3)、集落刺激因子2(CSF2/GM-CSF)和白细胞介素5(IL5)的受体共有。CD123/IL-3Ra与IL3的结合取决于β亚基。Β亚基由配体结合激活，并且是IL3的生物活性所必需的。前述所有关于CD123的术语都可以指本文所指的蛋白质或核酸序列。术语“CD123/IL-3Ra”包括“全长”未加工的CD123/IL-3Ra，以及细胞内加工产生的任何形式的CD123/IL-3Ra。该术语还包括CD123/IL-3Ra蛋白或核酸的天然存在的变体，如剪接变体、等位基因变体和同等型。本文所述的CD123/IL-3Ra多肽和多核苷酸可以从多种来源分离出来，如从人类组织类型或其它来源，或通过重组或合成方法制备。CD123/IL-3Ra序列的示例包括但不限于NCBI检索号NP_002174&NM_002183(人类CD123变体1的蛋白质和核酸序列)和NP_001254642&NM_001267713(人类CD123变体2的蛋白质和核酸序列)。
术语“抗CD123抗体”、“抗IL-3Ra抗体”或“抗IL-3Rα抗体”、“特异性结合CD123的抗体”或“特异性结合IL-3Ra/IL-3Rα的抗体”指的是能够以足够的亲和力结合CD123的抗体，从而使得该抗体可用作靶向CD123的诊断剂和/或治疗剂。除非另有规定，否则抗CD123抗体与不相关的非CD123蛋白质的结合程度小于所测该抗体与CD123结合的约10％。更一般地说，术语“特异性结合”表示抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间的一些互补性。根据这一定义，当抗体通过其抗原结合结构域与表位结合比其与随机的、不相关的表位结合更容易时，就是说抗体与该表位“特异性结合”。术语“特异性”在本文中用于定性某种抗体与某种表位结合的相对亲和力。例如，可以认为抗体“A”对给定表位的特异性比抗体“B”高，或者可以说抗体“A”结合表位“C”的特异性比其对相关表位“D”的特异性更高。相应地，本发明的抗体或抗原结合片段特异性结合CD123抗原，因为它对CD123抗原(来自任何物种)的结合特异性高于对非CD123抗原的结合特异性。更具体而言，本发明的抗体或抗原结合片段特异性结合人CD123抗原，因为它对人CD123抗原的结合特异性高于对非人CD123抗原(例如小鼠或大鼠CD123)的结合特异性。有时候，术语“优先结合”表示抗体与表位的特异性结合比其与相关的、相似的、同源的或类似的表位结合更容易。因此，优先与给定表位结合的抗体更有可能与该表位结合，而不是与相关表位结合，即使这种抗体可能与相关表位发生交叉反应。例如，本发明的抗体或抗原结合片段可相对于小鼠CD123优先与人CD123抗原结合。
根据以上所述，可以轻松获取与本发明的抗体、CAR、载体或细胞相关的术语。事实上，本说明书的一般语境并不总是要求坚持与上文标注的措辞完全一致。可能会出现一些偏差。例如，当提及T细胞的CAR时，并不总是要求说明CAR包含针对特定抗原的部分，即“抗某物”。相应地，从更广泛的角度来看，本发明的包含特异性结合CD123的部分的CAR不仅可以称为抗CD123 CAR，也可以称为CD123 CAR。以同样的方式，用根据本发明的特异性结合CD123的CAR转导的T细胞可以被称为CD123 CAR T细胞。
如本文所用的“治疗/处理”，包括对疾病或病理状况的症状或病变产生的任何有益或期望的效应，并且可以包括正在接受治疗的疾病或病况(例如癌症)的一种或多种可测量标志物的任何减少。治疗可以包括症状减轻或关于疾病或病况症状的任何改善。治疗还可包括延迟疾病或病况的进展。因此，术语“治疗”不一定意指疾病或病况或其相关症状的完全根除或治愈。考虑到这一点，本发明的公开内容提供了BPDCN的治疗或预防，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的T细胞。
在此背景下，本文所述的T细胞可单独施用，或作为药物组合物(也称为药物制剂)施用。术语“药物组合物”或“药物制剂”指的是一种制剂，其存在形式允许活性成分的生物学活性是有效的，并且不含有对接受施用该组合物/制剂的受试者具有不可接受的毒性的附加成分。这种制剂可以是无菌的。药物组合物可以仅包含根据本发明的T细胞，或者与一种或多种药学上或生理上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可以包括缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂和稳定剂。术语“药学上可接受的”或“生理上可接受的”在本文中用来指在合理的医学判断范围内，适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，并与合理的收益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。本发明的组合物优选配制用于胃肠外施用。“胃肠外施用”可以指的是肠内和局部施用以外的施用模式。通常，胃肠外施用通过注射来完成，例如血管内、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、瘤内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内和胸骨内注射和/或输注。优选地，通过直接注射入肿瘤、淋巴结、系统循环或感染部位，向受试者施用本发明的经CAR修饰的T细胞或组合物。一般而言，本发明可用于治疗被确诊为患有过度表达CD123的疾病的受试者，尤其是患有BPDCN的患者。该治疗包括从受试者中取出免疫效应细胞，用包含编码本文涵盖的CAR的核酸的载体对所述免疫效应细胞进行遗传修饰，从而产生经修饰的免疫效应细胞的群体，并将该经修饰的免疫效应细胞的群体施用于同一受试者。在优选的实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。根据患者的身体状况(患者的状况、患者疾病的类型和严重程度)来确定施用的量、频次。适当的剂量也可以在动物模型和随后临床试验的帮助下确定。当提及剂量时，术语“有效量”是足以实现规定目的的量。活性成分如遗传修饰的T细胞的所谓“治疗有效量”可能取决于一些因素，例如疾病及其状态、患者的年龄、性别和体重，还取决于细胞在患者中引起所需应答的能力。治疗有效量也是病毒或经转导的治疗性细胞的任何毒性或有害效应被治疗性有益效应所抵消的量。一般来说，包含本文所述T细胞的药物组合物可以按照104至109个细胞/kg体重的剂量施用，优选105至106个细胞/kg体重，包括那些范围内的所有整数值。更一般地说，术语“治疗有效量”指的是有效治疗受试者中疾病或病症的抗体、活性成分或其它药物的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；缩小肿瘤尺寸；抑制(即在某种程度上减缓或阻止癌症)癌细胞浸润到周围器官内；抑制(即在某种程度上减缓或阻止癌症)肿瘤转移；在一定程度上抑制或阻止肿瘤生长；在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状；和/或产生良好应答，例如增加的无进展存活(PFS)、无病存活(DFS)或总体存活(OS)、完全应答(CR)、部分应答(PR)，或在某些情况下，病情稳定(SD)、延缓病情进展(PD)、进展前时间缩短(TTP)，或其任意组合。“预防有效量”指的是在必要的剂量和时间段内达到期望的预防效果的有效量。通常，预防有效量小于治疗有效量，因为预防剂量在疾病之前或疾病更早期用于受试者。
在特定的实施方案中，在对本文所述的免疫效应细胞进行体外操作或基因修饰之前，从受试者获得细胞源。在特定的实施方案中，在其膜上表达本发明CAR的免疫效应细胞包括T细胞。可以从多种来源获得T细胞，包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术，例如FicollTM分离，从在受试者中采集的单位血液中获得T细胞。在另一实施方案中，通过单采血液成分法从个体的循环血液中获得细胞。单采血液成分法的产物通常含有淋巴细胞，其包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分法收集的细胞以除去血浆级分，并将细胞置于合适的缓冲液或介质中用于后续处理。在其它实施方案中，通过裂解红细胞和消耗单核细胞，例如通过PercollTM梯度离心，从外周血单核细胞中分离出T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离出表达一种或多种标志物如CD3、CD4或CD8的特定T细胞亚群。例如，通过阴性选择来富集T细胞群可以用针对在阴性选择的细胞上不表达的表面标志物的抗体的组合来实现。
在更普遍的情况下，本说明书强调了一种细胞疗法，其中T细胞在离体下经过基因工程改造(或基因修饰)以表达CAR，并将该CAR T细胞输注给有此需要的患者，优选人类。注入的细胞能够杀伤患者中的肿瘤细胞。如上文所阐述的，并与抗体疗法不同，包含CAR的T细胞能够在体内复制，产生长期持续性，从而可以实现持久的肿瘤控制。此外，CAR允许效应T细胞向任何细胞表面分子(在被抗体来源的受体结合后)重定向并激活，并且不受MHC限制(MHC限制性抗原识别；MHC代表主要组织相容性复合物)。如上所述，本发明的基因工程化T细胞是从患者自身(自体)采集的T细胞开始构建的，但是它们也可以来源于其他同种异体供体，以在骨髓或外周造血干细胞同种异体移植环境中(供体淋巴细胞输注)提供同种异体基因工程化T细胞。这些表达根据本发明的CAR分子的T细胞可用于治疗哺乳动物中，优选人类中的增殖性疾病。
在本发明的一些实施方案中，多核苷酸或含有本发明多核苷酸的细胞使用自杀基因，包括使用诱导型自杀基因来降低基因修饰细胞的直接毒性(即，同种异体施用中的移植物抗宿主病，GvHD)和/或失控增殖的风险。在特定方面，自杀基因对含有该多核苷酸或细胞的宿主没有免疫原性。可以使用的自杀基因的特定示例是诱导型半胱天冬酶-9(iCASP9)、单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)、CD20、截短的EGFR、半胱天冬酶-8或胞嘧啶脱氨酶。可以使用特定的二聚化化学诱导物(CID)来激活半胱天冬酶-9。其它系统可以通过代谢前药(更昔洛韦)或通过结合抗体(利妥昔单抗、西妥昔单抗)来激活。
参考实验数据和具体示例进一步详细描述本发明。除非另有说明，所提供的示例仅用于说明的目的，并不旨在进行限制。虽然下面的详细描述集中在BPDCN上，但是本发明通常仍然可以为其中发生CD123过度表达的任何疾病提供改善和/或解决方案。
本发明的主要重点是为母细胞性浆细胞样树突细胞瘤(BPDCN)提供治疗手段。
BPDCN是一种起源于浆细胞样树突细胞(pDC)前体的克隆性疾病，其皮肤病变进展为侵袭性白血病扩散，参见Blastic Plasmacytoid Dendritic Cell Neoplasm:State ofthe Art and Prospects,Maria Rosaria Sapienza,Alessandro Pileri,EnricoDerenzini,Federica Melle等人,Cancer,2019。BPDCN的预后很差，并且在本领域中不存在有效治疗手段或其相关报道。大多数患者最初对强化化疗有应答，但随后复发。在最大的患者系列中，中位总存活期(OS)为8至12个月。该数据的唯一例外是关于接受同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)的患者；参见Roos-Weil D,Dietrich S,Boumendil A,Polge E,BronD,Carreras E等人,Stem cell transplantation can provide durable diseasecontrol in blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm:a retrospective studyfrom the European Group for Blood and Marrow Transplantation,Blood,2013,121(3):440-6；Pagano L,Valentini CG,Grammatico S,Pulsoni A,Blastic plasmacytoiddendritic cell neoplasm:diagnostic criteria and therapeutical approaches,British journal of haematology,2016,174(2):188-202；Kharfan-Dabaja MA,LazarusHM,Nishihori T,Mahfouz RA,Hamadani M.Diagnostic and therapeutic advances inblastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm:a focus on hematopoietic celltransplantation,Biology of blood and marrow transplantation:journal of theAmerican Society for Blood and Marrow Transplantation,2013；19(7):1006-12；甚至在接受靶向疗法的患者中也是如此(Pemmaraju N,Lane AA,Sweet KL,Stein AS,Vasu S,Blum W等人,Tagraxofusp in Blastic Plasmacytoid Dendritic-Cell Neoplasm,TheNew England journal of medicine,2019；380(17):1628-37)。然而，大多数老年患者并不符合这种方法的要求。对于这种可以被定性为化疗难治性白血病的白血病，需要改进治疗手段。本发明的申请人已经确定了新的治疗靶标。白细胞介素(IL)3受体α链(CD123)已被证明是一个有价值的靶标，因为它在生物体中仅由嗜碱性粒细胞和pDC高表达。本领域进一步公开了CD123还以低水平表达于正常造血的CD34+CD38+祖细胞、单核细胞和内皮细胞中，而在造血干细胞上则不表达；参见Taussig DC,Pearce DJ,Simpson C,Rohatiner AZ,ListerTA,Kelly G等人Hematopoietic stem cells express multiple myeloid markers:implications for the origin and targeted therapy of acute myeloid leukemia,Blood.2005；106(13):4086-92；参见Adhra Al-Mawali1,David Gillis和Ian Lewis,Immunoprofiling of leukemic stem cells CD34+/CD38-/CD123+delineate FLT3/ITD-positive clones,Journal of Hematology&Oncology,2016,9:61。
为了对抗BPDCN，本发明人总体上考虑了在诊断和化疗后复发两种情况下，抗原CD123均在BPDCN中均一地且高表达；参见Garnache-Ottou F,Feuillard J,Ferrand C,Biichle S,Trimoreau F,Seilles E等人,Extended diagnostic criteria forplasmacytoid dendritic cell leukaemia,British journal of haematology,2009；145(5):624-36。而且，本发明人还考虑了CD123是IL-3受体的一个组分，并且IL-3受体是pDC细胞存活所需的pDC谱系的关键驱动因子。Broughton SE,Dhagat U,Hercus TR,Nero TL,Grimbaldeston MA,Bonder CS等人,The GM-CSF/IL-3/IL-5cytokine receptor family:from ligand recognition to initiation of signaling.Immunologicalreviews.2012；250(1):277-302；Hara T,Miyajima A.,Function and signaltransduction mediated by the interleukin 3receptor system in hematopoiesis,Stem Cells,1996,14(6):605-18；和Testa U,Pelosi E,Frankel A.,CD 123is amembrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies,Biomarker research,2014,2(1):4。本发明人推测，靶向这种IL-3受体可能会诱导对BPDCN细胞有害的信号传导通路。
据报道，CD123参与了急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)中的母细胞引发(blast priming)；参见Ehninger A,Kramer M,Rollig C,Thiede C,BornhauserM,von Bonin M等人,Distribution and levels of cell surface expression of CD33and CD123 in acute myeloid leukemia,Blood cancer journal,2014,4:e218。此外，据报道CD123在CD34+“白血病启动细胞(LIC)”组分上表达，并与不良临床影响相关；参见Vergez F,Green AS,Tamburini J,Sarry JE,Gaillard B,Cornillet-Lefebvre P等人,High levels of CD34+CD38low/-CD123+blasts are predictive of an adverse outcomein acute myeloid leukemia:a Groupe Ouest-Est des Leucemies Aigues et Maladiesdu Sang(GOELAMS)study,Haematologica,2011,96(12):1792-8；和Reya T,Morrison SJ,Clarke MF,Weissman IL,Stem cells,cancer,and cancer stem cells,Nature,2001,414(6859):105-11。然而，在BPDCN中，尚不清楚患者中是否存在数量增加的未成熟LIC。本申请人还惊奇地观察到，在本发明人汇集的特定BPDCN病例中，低组分的母细胞比白血病大细胞(bulk cell)表达更高水平的CD123。本申请人随后进一步推测，如果它们是LIC，靶向CD123可能会清除这些细胞并减少BPDCN患者中的复发。然后，本申请人主动选择CD123作为BPDCN的靶向免疫疗法。
本申请人进一步证明了BPDCN细胞对SL-401的敏感性，SL-401是一种融合蛋白，其包含与IL-3偶联的白喉毒素，在体外和体内均靶向表达CD123的细胞；参见Angelot-Delettre F,Roggy A,Frankel AE,Lamarthee B,Seilles E,Biichle S等人,In vivo andin vitro sensitivity of blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm to SL-401,an interleukin-3receptor targeted biologic agent,Haematologica,2015；100(2):223-30。另外，有报道称BPDCN患者中出现了临床应答；参见Frankel AE,Woo JH,AhnC,Pemmaraju N,Medeiros BC,Carraway HE等人,Activity of SL-401,a targetedtherapy directed to interleukin-3receptor,in blastic plasmacytoid dendriticcell neoplasm patients,Blood,2014；124(3):385-92。
如本领域所知，采用嵌合抗原受体(CAR)的过继性T细胞疗法是治疗有复发风险的血液系统恶性肿瘤的一种有前景的方式；参见Grupp SA,Kalos M,Barrett D,Aplenc R,Porter DL,Rheingold SR等人,Chimeric antigen receptor-modified T cells foracute lymphoid leukemia,The New England journal of medicine,2013；368(16):1509-18；和and Kochenderfer JN,Dudley ME,Kassim SH,Somerville RP,Carpenter RO,Stetler-Stevenson M等人,Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphomaand indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous Tcells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor,Journal of clinicaloncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology,2015；33(6):540-9。
根据本发明的一个实施方案，已经对CAR基因工程改造以使其由与T细胞受体(TCR)的胞内信号传导链连接的单克隆抗体(MAb)重链和轻链的单链可变片段(ScFv)制成。优选地，CAR的胞内部分包括CD3ζ和共刺激结构域，如CD28和4-1BB，它们能够更好地进行激活和细胞信号传导。该CAR可以被定性为第三代CAR。关于CAR的更多信息：参见AndrewD.Fesnak,Carl H.June和Bruce L.Levine的综述，Engineered T cells:the promise andchallenges of cancer immunotherapy,Nature,第16卷,2016年9月。ScFV允许独立于主要组织相容性复合物(MHC)呈递而识别抗原。
关于CAR CD123在体外和几种鼠科动物患者源性异种移植模型(PDX)中根除急性髓系白血病的效率已经有了报道；参见Mardiros A,Dos Santos C,McDonald T,Brown CE,Wang X,Budde LE等人,T cells expressing CD123-specific chimeric antigenreceptors exhibit specific cytolytic effector functions and antitumor effectsagainst human acute myeloid leukemia,Blood,2013,122(18):3138-48；Gill S,TasianSK,Ruella M,Shestova O,Li Y,Porter DL等人,Preclinical targeting of humanacute myeloid leukemia and myeloablation using chimeric antigen receptor-modified T cells,Blood,2014,123(15):2343-54；Thokala R,Olivares S,Mi T,MaitiS,Deniger D,Huls H等人,Redirecting Specificity of T cells Using the SleepingBeauty System to Express Chimeric Antigen Receptors by Mix-and-Matching of VLand VH Domains Targeting CD123+Tumors,PloS one,2016,11(8):e0159477；CumminsKD,Gill S.Anti-CD123 chimeric antigen receptor T-cells(CART):an evolvingtreatment strategy for hematological malignancies,and a potential ace-in-the-hole against antigen-negative relapse,Leukemia&lymphoma,2018,59(7):1539-53；Tettamanti S,Marin V,Pizzitola I,Magnani CF,Giordano Attianese GM,Cribioli E等人,Targeting of acute myeloid leukaemia by cytokine-induced killer cellsredirected with a novel CD123-specific chimeric antigen receptor,Britishjournal of haematology,2013,161(3):389-401；和Tasian SK,Kenderian SS,Shen F,Ruella M,Shestova O,Kozlowski M等人,Optimized depletion of chimeric antigenreceptor T cells in murine xenograft models of human acute myeloid leukemia,Blood,2017；129(17):2395-407。另一组研究显示，CAR CD123可以对已建立的BPDCN细胞系(CAL-1)和小鼠模型中的CD123+原发性BPDCN样品具有活性。但这种CAR只在同种异体的情况下使用。它还是带有自杀系统的第二代；参见Cai T,Galetto R,Gouble A,Smith J,Cavazos A,Konoplev S等人,Pre-Clinical Studies of Anti-CD123 CAR-T Cells forthe Treatment of Blastic Plasmacytoid Dendritic Cell Neoplasm(BPDCN),Blood.2016,128(22):4039。然而，越来越多的临床试验表明，接受CAR疗法的患者会出现毒性。这是开发高效CAR的一个主要问题。本申请人开发了一种特定的CAR，克服了现有技术的问题。更具体而言，本申请人同时工程化设计了第三代逆转录病毒和慢病毒CAR。本发明的CAR克服了现有技术的问题，特别是与细胞毒性有关的问题。本发明的CAR在体外对BPDCN细胞(BPDCN细胞系、PDX细胞和原代BPDCN细胞)具有改进的功能活性，这与在体内若干小鼠BPDCN模型中一样。评估它们对CD123低阳性细胞的潜在细胞毒性，其结果具有出人意料的前景。
根据本发明，产生了针对人CD123的单克隆抗体(Mab)。本发明的单克隆抗体可以在同种异体和自体情况下使用。
抗CD123单克隆抗体的制备方法包括用重组CD123蛋白免疫小鼠。更具体地说，用重组CD123免疫五只小鼠，该重组CD123的产品编号为301-R3-025(可在R&D Systems,Minnesota,USA获得)。通过爪垫和/或腹膜内施用进行免疫。淋巴结和/或脾脏B细胞被用来产生分泌Mab的杂交瘤。使用CD123+和CD123-细胞系根据MAb的亲和力和特异性选择杂交瘤。
根据本发明，选定了6种特异性抗体，并且分别命名为18B4D5(本文也称为AB1，或有时缩写为B4D5)、17F7B2(本文也称为AB2)、11B6E6(本文也称为AB3)、14G12D7(本文也称为AB4)、11A12C6(本文也称为AB5)和15E11B7(本文也称为AB6)。根据SANGER方法进行了分子表征和DNA测序。
对VDJ和VJ基因重排进行了测序，并在利用VQUEST在线工具将共有核苷酸序列与
Figure BDA0003508166120000361
数据库进行比对后鉴定；参见Brochet X,Lefranc MP,Giudicelli V.IMGT/V-QUEST:the highly customized and integrated system for IG and TR standardizedV-J and V-D-J sequence analysis,Nucleic acids research,2008；36(网络刊):W503-8。图1至图9中列出了本发明的六种抗体的各自序列(核苷酸序列和氨基酸序列)。
图1示出了本发明抗体(分别为18B4D5、17F7B2、11B6E6、14G12D7、11A12C6和15E11B7)的重链和轻链的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)的核苷酸序列和氨基酸序列。
图2示出了本发明抗体(分别为18B4D5、17F7B2、11B6E6、14G12D7、11A12C6和15E11B7)的重链的框架区1(FR1)、框架区2(FR2)、框架区3(FR3)和框架区4(FR4)的核苷酸序列和氨基酸序列。
图3示出了本发明抗体(分别为18B4D5、17F7B2、11B6E6、14G12D7、11A12C6和15E11B7)的轻链的框架区1(FR1)、框架区2(FR2)、框架区3(FR3)和框架区4(FR4)的核苷酸序列和氨基酸序列。
图4示出了本发明第一抗体AB1(命名为18B4D5或B4D5)的轻链的共有氨基酸序列和重链的共有氨基酸序列。与CDR1、CDR2和CDR3相对应的氨基酸按阅读顺序从左到右分别突出显示。
图5示出了命名为17F7B2的本发明第二抗体AB2的轻链的共有氨基酸序列和重链的共有氨基酸序列。与CDR1、CDR2和CDR3相对应的氨基酸按阅读顺序从左到右分别突出显示。
图6示出了命名为11B6E6的本发明第三抗体AB3的轻链的共有氨基酸序列和重链的共有氨基酸序列。与CDR1、CDR2和CDR3相对应的氨基酸按阅读顺序从左到右分别突出显示。
图7示出了命名为14G12D7的本发明第四抗体AB4的轻链的共有氨基酸序列和重链的共有氨基酸序列。与CDR1、CDR2和CDR3相对应的氨基酸按阅读顺序从左到右分别突出显示。
图8示出了命名为11A12C6的本发明第五抗体AB5的轻链的共有氨基酸序列和重链的共有氨基酸序列。与CDR1、CDR2和CDR3相对应的氨基酸按阅读顺序从左到右分别突出显示。
图9示出了命名为15E11B7的本发明第六抗体AB6的轻链的共有氨基酸序列和重链的共有氨基酸序列。与CDR1、CDR2和CDR3相对应的氨基酸按阅读顺序从左到右分别突出显示。
表1中显示了重链VH和JH以及轻链VK和JK各自的序列同源性
Figure BDA0003508166120000371
Figure BDA0003508166120000381
表1：可变链的序列同源性。
在链霉亲和素生物传感器上测试本发明的抗体对CD123的亲和力。在本文中，为了测定KD值，在固定化的本发明抗体上使用了七种不同浓度的CD123。根据FortéBio可获的Octet系统对结果进行了分析。
表2中显示了抗体亲和力的结果。
加载样品编号 浓度(nM) 应答 KD(M) k<sub>on</sub>(1/Ms) K<sub>dis</sub>(1/s) 全R^2
AB1(18B4D5) 50 0,6972 <1.0E-12 1,22E+05 <1.0E-07 0,9988
AB1(18B4D5) 25 0,4202 <1.0E-12 1,22E+05 <1.0E-07 0,9988
AB1(18B4D5) 12,5 0,2301 <1.0E-12 1,22E+05 <1.0E-07 0,9988
AB1(18B4D5) 6,25 0,12 <1.0E-12 1,22E+05 <1.0E-07 0,9988
AB5(11A12C6) 12,5 0,4158 <1.0E-12 3,26E+05 <1.0E-07 0,9885
AB5(11A12C6) 6,25 0,2815 <1.0E-12 3,26E+05 <1.0E-07 0,9885
AB5(11A12C6) 3,13 0,1349 <1.0E-12 3,26E+05 <1.0E-07 0,9885
AB3(11B6E6) 50 0,3164 9,368E-09 7,01E+04 6,57E-04 0,9973
AB3(11B6E6) 25 0,1794 9,368E-09 7,01E+04 6,57E-04 0,9973
AB3(11B6E6) 12,5 0,0895 9,368E-09 7,01E+04 6,57E-04 0,9973
AB3(11B6E6) 6,25 0,0349 9,368E-09 7,01E+04 6,57E-04 0,9973
AB4(14G12D7) 100 0,3965 8,843E-09 3,67E+04 3,25E-04 0,9986
AB4(14G12D7) 50 0,2206 8,843E-09 3,67E+04 3,25E-04 0,9986
AB4(14G12D7) 25 0,1342 8,843E-09 3,67E+04 3,25E-04 0,9986
AB2(17F7B2) 50 0,5066 2,552E-09 3,46E+05 8,82E-04 0,9747
AB2(17F7B2) 25 0,34 2,552E-09 3,46E+05 8,82E-04 0,9747
AB2(17F7B2) 12,5 0,2645 2,552E-09 3,46E+05 8,82E-04 0,9747
AB2(17F7B2) 6,25 0,1486 2,552E-09 3,46E+05 8,82E-04 0,9747
AB6(15E11B7) 25 0,3052 2,485E-09 3,32E+05 8,26E-04 0,9829
AB6(15E11B7) 12,5 0,1552 2,485E-09 3,32E+05 8,26E-04 0,9829
AB6(15E11B7) 6,25 0,0878 2,485E-09 3,32E+05 8,26E-04 0,9829
表2：抗体亲和力。
用于实施本发明的细胞，特别是用于本文实施例和结果目的的细胞，是从人类获取的。更准确地说，来自BPDCN患者(DC-2008-713和DC-2016-2791收集物)的原代细胞用于CD123表达评估、细胞毒性测定和NSG小鼠中的原代细胞扩增以产生PDX(原代衍生异种移植物)，参见Philippe L.等人,Bortezomib as a new therapeutic approach for blasticplasmacytoid dendritic cell neoplasm.Haematologica,2017。根据本申请人建立的诊断BPDCN的当前建议，已经对这些病例的特征进行了描述，参见Garnache-Ottou F,Feuillard J,Ferrand C,Biichle S,Trimoreau F,Seilles E等人,Extended diagnosticcriteria for plasmacytoid dendritic cell leukaemia,British journal ofhaematology,2009,145(5):624-36和Swerdlow,S.H.,Campo,E.,Harris,N.L.,Jaffe,E.S.,Pileri,S.A.,Stein,H.,Thiele,J.,Arber,D.A.,Hasserjian,R.P.,Le Beau,M.M.,Orazi,A.&Siebert,R.(2017)WHO classification of tumors of haematopoeitic andlymphoid tissues.于：WHO Classification of Tumors of Haematopoietic andLymphoid Tissues.(编者为Swerdlow,S.H.,Campo,E.,Harris,N.L.,Jaffe,E.S.,Pileri,S.A.,Stein,H.,Thiele,J.,Arber,D.A.,Hasserjian,R.P.,Le Beau,M.M.,Orazi,A.&Siebert,R.),第98-106页.IARC,Lyon,France。将PDX细胞P127B、P25B、CM60915、F13-CAL1和F13-LAN在适当的培养基中进行体外培养。两种CD123+BPDCN细胞系(GEN 2.2和CAL-1，Maeda博士，Nagasaki University,Japan)和CD123-细胞系(Daudi、Jurkat、HL-60、REH)。由慢病毒转导以表达CD123产生K562 CD123细胞系。为了研究CD123的表达，从健康供体和/或患者获得了来源于正常血液(n＝19)和骨髓(n＝4)、急性白血病(髓系AML，n＝3)和淋巴(B-ALL，n＝3；T-ALL，n＝3)的细胞。在本发明中，为了产生遗传修饰的T细胞，使用了外周血单核细胞(PBMC)。通过FicollTM梯度密度离心(使用市售的Ficoll-PaqueTM)从健康供体或脐带血样品中分离PBMC，这些样品在法国血液中心(EFS B/FC,
Figure BDA0003508166120000391
France)采集。
除非另有说明，本文的统计分析以均值表示。更具体而言，MFI和MFIR的结果以均值[最小-最大值]表示，所有其它结果以均值±标准差表示。所述实施方案中的所有统计分析均使用GraphPad Prism 7(GraphPad软件,San Diego,CA,USA)进行。两组之间的比较通过学生t检验进行评估。存活研究通过Kaplan-Meier曲线和对数秩(Mantel-Cox)检验进行评估。
利用流式细胞术，测试了在正常造血细胞和BPDCN细胞上的CD123表达谱。使用本发明的抗体B4D5(AB1)和商业化抗CD123抗体(6H6)，测定了正常细胞和BPDCN患者细胞中CD123的表达谱。更准确地说，将正常的血液和骨髓细胞，即正常pDC(以CD304为靶标)、单核细胞(CD14+)、淋巴细胞(CD45+高/SSC低)、粒细胞(CD45+、SSC高和FSC高)和CSH/祖细胞(CD34+)与BPDCN患者细胞(CD45+低、CD304+)进行比较。将CD123的平均荧光强度(MFI)除以同种型对照mAb的平均荧光强度，来计算平均荧光强度比(MFIR)。MFIR高于2时，认为细胞的CD123表达阳性；参见Garand R,Robillard N.,Immunophenotypic characterization of acuteleukemias and chronic lymphoproliferative disorders:practical recommendationsand classifications.Hematology and cell therapy,1996；38(6):471-86。CD123在正常pDC和BPDCN上最高(分别为130.6[118.4-146.8]，n＝5和136[102.1-158.1]，n＝5)。在单核细胞(20.7[4.5-51.1]，n＝7)和CD34+细胞(23.7[19.2-32.2]，n＝4)上检测到低表达，而淋巴细胞(1.4[1-2.4]，n＝7)和多核细胞(1.1[1.1-1.2]，n＝3)不表达CD123。
图10示出了基于评估正常造血细胞和BPDCN上CD123表达的流式细胞术图。特别是，示出了基于使用B4D5抗体与商业化抗体6H6相比，来评估正常造血细胞和BPDCN上CD123表达的流式细胞术图。同种型对照呈现为白色，而抗CD123 B4D5呈现为深色。如上所述，在外周血和骨髓中评估正常细胞，参见图10A，对于BPDCN细胞系(CAL-1和GEN 2.2)、PDX(P127B-M5)和BPDCN患者的原代细胞，参见图10B。此外，使用抗CD123 B4D5和6H6商业化抗体在淋巴细胞(n＝7和12)、单核细胞(n＝7和12)、粒细胞(n＝3和5)、正常pDC(n＝5和7)上通过MFIR(CD123的平均荧光强度与同种型对照mAb的平均荧光强度的比值)来评估CD123的表达。除了CD34群体，将来自血液和骨髓样品(n＝4和7)的数据合并，因为我们观察到CD123水平的表达没有差异，见图10C。
此外，用B4D5单克隆抗体对一些非pDC急性白血病进行了测试。本申请人证实，BPDCN表达的CD123水平高于测试的AML、B或T淋巴细胞急性白血病。
图11示出了基于评估BPDCN和其它非pDC急性白血病中CD123表达的表格和流式细胞术图。图11示出了使用6H6商业化抗体在淋巴细胞(n＝12)、单核细胞(n＝12)、粒细胞(n＝5)、正常pDC(n＝7)上，通过MFIR(CD123的平均荧光强度除以同种型对照mAb的平均荧光强度的比值)来评估CD123的表达，参见图11A。由于我们观察到CD123水平没有差异，所以将来自血液和骨髓样品的数据合并。在骨髓上评估CD34群体上的表达。图11还示出了使用呈深色的CD123 B4D5抗体和呈白色的同种型对照，对B-LAL、T-LAL和AML细胞系以及患者原代细胞上的CD123表达进行流式细胞术评估，参见图11B。非pDC急性白血病中的CD123表达水平低于BPDCN患者的，参见图11B。
图12示出了本发明嵌合抗原受体的设计示意图，以及与根据本发明产生包含本发明嵌合抗原受体的T细胞相关的western印迹图和流式细胞术图。
图12示出了根据本发明的CD123 CAR T细胞的设计和产生。使用本发明的抗体AB1，构建了抗CD123 CAR T细胞。本发明本实施方案的CAR基于B4D5(AB1)的scFv、T细胞激活的特定结构域(CD3ζ)和两个共激活结构域(CD28和4.1BB)。将编码CAR的序列、2A序列(编码2A自剪切肽)和筛选标志物ΔCD19(截短的CD19)克隆到pSFG逆转录病毒载体(SFG.CARCD123.IRES.ΔCD19载体)中。逆转录病毒上清液是由转染了SFG.CAR CD123.IRES.ΔCD19载体的PG13包装细胞系产生的。
根据本发明的另一实施方案，还产生了慢病毒构建体：相同的CAR序列受EF1α启动子控制，并且下游是T2A核糖体跳跃序列和截短型人CD19转导标志物。
图12A显示了逆转录病毒和慢病毒的实施方案。更准确地说，图12的A项示出了第三代逆转录病毒抗CD123 CAR载体(CD123R CAR)和第三代慢病毒抗CD123 CAR载体(CD123LCAR)的示意图。将源自本发明B4D5抗体的scFv CD123与T细胞信号传导结构域CD28、4.1BB和CD3ζ融合。还标明了筛选标志物(ΔCD19)。
本发明中遗传修饰的原代T细胞是通过病毒转导产生的。在转导之前，用CD3/CD28Dynabeads(Life Technologies,California,USA)激活PBMC两天。在用重组人纤维连接蛋白(retronectin)(在4℃的PBS中过夜，1.2μg/cm2，Takara,Japan)包被的6孔板中完成逆转录病毒转导。然后，用逆转录病毒颗粒对细胞进行离心转导(1.5h,2000g,10℃)。对于慢病毒转导，将细胞在800g、32℃下离心转导1小时，MOI等于10。通过进行流式细胞分析以鉴定CD3+细胞上ΔCD19细胞表面标志物表达，来确定转导效率。根据生产商的方案，用微珠(CD19微珠,Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)对逆转录转导的阳性细胞进行磁性标记，并将其装载到
Figure BDA0003508166120000411
柱上。对于通过逆转录病毒转导获得的T细胞，转导的T细胞将被命名为CD123R CAR，并且慢病毒转导获得的T细胞将被命名为CD123L CAR。从同一供体，收集未转导的T细胞(称为C0)并进行与上述类似的培养，但不进行病毒转导：这些细胞在所有实验中都用作对照。将CD123 CAR T细胞扩增21天并冷冻保存。
就本发明的所述实施方案而言，除非另有说明，细胞毒性可基于BPDCN患者衍生的转导T细胞进行评估。更具体而言，使用人CD3/CD28 Dynabeads和磁性选择从PBMC中激活来自BPDCN患者(DC 2016-2791)的T细胞。阴性级分含有BPDCN母细胞(血细胞分类计数为60％)，可用于评估CAR和B淋巴细胞的细胞毒性。此外，如前所述，用慢病毒构建体转导T细胞。10天后，转导效率和CAR表达通过所述的流式细胞术来测定。以E:T比＝5:1对BPCDN母细胞进行24小时的细胞毒性活性评估。
就本发明的所述实施方案而言，除非另有说明，免疫表型分型可按如下进行。在LSR Fortessa流式细胞仪或BD FACS CANTO II上检测抗体结合，并用Diva软件(BDBiosciences,New Jersey,USA)进行分析。将适当匹配的同种型对照纳入分析。简言之，通过CD3、CD4、CD8、CD19，对T细胞进行染色。CD3+/CD19+T细胞为CD123 CAR T细胞。使用B4D5(用于构建CAR的AB1)和商业化抗体(即，6H6)对BPDCN细胞、细胞系和PDX通过CD123染色进行表征，以获得更多结果。使用抗CD45(T细胞为CD45高/SSC低，并且粒细胞为CD45+/SSC高/FSC高)、CD304(正常pDC)、CD14(单核细胞)和CD34(CSH/祖细胞)来分析正常血液和骨髓样品。通过CD56、CD4、CD303、CD304、CD45，对来自患者的BPDCN样品进行染色。本发明的一些实施方案涉及BPDCN小鼠模型。相应地，在BPDCN小鼠模型中，每周使用BD TruCount管监测血细胞样品中的母细胞计数(抗人hCD45、hCD123)和T细胞(C0和CD123 CAR)(hCD3、hCD19)。在人源化小鼠中，通过流式细胞术(Attune NxT流式细胞仪,Life Technologies)分析外周血以定量人细胞：总的白细胞(hCD45+)、单核细胞(CD45/SSC+中、hCD33+)、B淋巴细胞(hCD19+)、T淋巴细胞(hCD3+)、pDC(hCD123+、hCD304+)和小鼠处死后骨髓中的CSH/祖细胞(CD34+)。用于表征细胞表面表型的单克隆抗体如表3所示。
Figure BDA0003508166120000421
Figure BDA0003508166120000431
Figure BDA0003508166120000441
表3：用于表征细胞表面表型的单克隆抗体。
本文描述的一些实施方案还涉及体外细胞毒性测定和功能分析。为此，按照生产商的方案，用细胞增殖染料eFluor 450(ThermoFischer,Ecublens,Switzerland)对C0或CD123 CAR T细胞(1·106个细胞/mL)进行标记。然后，将标记细胞以合适的效应器对靶标(E:T)比与靶细胞(CAL-1、GEN 2.2、DAUDI、HL-60、K562 CD123和PDX)在37℃一起培养24小时或15小时(PDX)。共培养后，用7-AAD(Beckman Coulter)、抗CD3、抗CD19(评估C0或CAR T细胞)和抗CD123来标记细胞，以评估靶细胞(7-AAD+CD123+细胞)的细胞死亡。按照生产商的方案，使用BD Cytofix/CytopermTM Plus固定/透化溶液试剂盒和BD GolgiPlugTM(BDBiosciences)进行CD107aPE脱颗粒测定(克隆号H4A3,BD Biosciences)和IFNγPE胞内产生(克隆号B27,BD Biosciences)，从而在体外测试CD123 CAR T细胞的功能特性。按照生产商的方案，通过CBA人Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒(BD Biosciences)分析共培养上清液。按照生产商的方案，利用MTT细胞增殖测试(Sigma-Aldrich,Missouri,USA)，评估了CAR对HMEC贴壁细胞系或原代单核细胞的细胞毒性。
本文描述的一些实施方案还涉及组织微阵列和免疫组织化学。B4D5(AB1)抗体的特异性通过组织微阵列进行分析，组织微阵列包括每种器官三名个体供体的90个组织芯(30种器官)(US Biomax,Rockville,United States)。使用UltraView通用DAB检测试剂盒(Ventana,USA)检测免疫染色，并用NDP.view 2.0软件分析图像。染色强度分级如下：阴性(0)、低度染色(1+)、中度染色(2+)或阳性染色(3+)、高度染色(4+)。高CD123(CAL-1)或阴性(Daudi)表达细胞系分别用作阳性或阴性对照。对于每个显示CD123染色的组织(结肠、胃、肌肉、食管、皮肤和甲状腺)，通过免疫组织化学(IHC)控制CD123在来自三名患者的石蜡包埋正常组织上的表达，并与来自两名BPDCN患者的皮肤进行比较。
此外，本文描述的一些实施方案涉及体内模型以评估CAR CD123的效率。为此，对NOD/SCID/IL2Rγc缺陷(NSG)小鼠(6-8周龄，The Jackson laboratory,Sacramento,CA,USA)进行照射(2.5Gy)，并静脉内接种适当数量的表达荧光素酶的CAL-1(1·106/小鼠)或PDX细胞(2·106/小鼠)。对BPDCN细胞的植入和定量已有描述；参见Philippe L,Ceroi A,Bole-Richard E,Jenvrin A,Biichle S,Perrin S等人,Bortezomib as a newtherapeutic approach for blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm,Haematologica,2017,102(11):1861-8。对于CAL-1模型，在第3天将T细胞(未转导的和转导的)注射入尾静脉。每周通过BLI测量来监测植入情况：小鼠在成像(IVIS Lumina系列III,Perkin Elmer,Massachusetts,USA)前10分钟内接受腹膜内3mg荧光素(VivoGlo荧光素,货号P1043,Promega,Wisconsin,USA)。在PDX模型中，当血液样品中检测到BPDCN母细胞时，小鼠接受T细胞。通过流式细胞术，利用抗hCD45、抗CD123和BD Trucount管，每10天监测母细胞计数。
本文描述的一些其它实施方案涉及评估CAR对CD123低细胞的毒性。为此，使用人源化的小鼠模型。更具体地说，采用人源化小鼠模型(雌性hCD34植入的小鼠NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull的免疫缺陷小鼠品系：hu-NOG)研究本发明的CAR对正常人类造血细胞(n＝3名供体)的体内毒性。在第-15天时，处死2只人源化小鼠；从脾脏中收获T细胞并进行转导以获得CD123 CAR T细胞或C0。在第0天时，对两只人源化小鼠(由同一供体产生)进行眼眶后注射20·106个C0或CD123 CAR。在第-5天和第15天，对血液中的白细胞总数、单核细胞、B和T淋巴细胞、pDC和嗜碱性粒细胞进行定量，并对处死后获得的骨髓中的HSC/祖细胞进行定量(仅在第15天时)。为了评价CAR T细胞对正常自体CD34细胞的体外细胞毒性，可以使用从处死的人源化小鼠的骨髓获得的磁性分选的CD34+细胞(CD34微珠,Miltenyi Biotec)和CD123 CAR。或者备选地，可以使用从与上述相同的人源化小鼠(n＝3)获得的T细胞产生的C0。共培养是在与描述的BPDCN细胞相同的条件下进行的，E:T比为5:1。比较了与CD123 CAR或C0共培养后活hCD34+的数量。使用从脐带血磁性分选的CD34细胞与从相同脐带血T淋巴细胞(n＝3)产生的CAR CD123或C0共培养，来完成相同的实验。
图12示出了转导效率，参见图12B。通过定量共表达CD3和CD19的T细胞来评估转导效率。使用逆转录病毒构建体观察到的可变转导水平平均为17.8％([3-57％],n＝43)。这可能表明转导能力是可变的，可以通过使用磁性选择来控制，以便有效地利用CAR T细胞(转导的T细胞的纯度为90％±9.5％,[60-98.5％],n＝43)。更准确地说，图12的B项示出了在本发明T细胞的磁性细胞分离之前和之后，与本发明的转导的T细胞相比(CD123 CAR T细胞或抗CD123 CAR T细胞)，未转导的T细胞(C0)的代表性表型CD3/CD19。慢病毒转导显示出良好的转导效率(91.2％±5.22,n＝6)，参见图12B。
出于本发明的目的，可以通过Western印迹来评估转导的细胞中CAR构建的表达。更具体而言，在补充有蛋白酶抑制剂混合物(不含EDTA的完整微型混合物；Roche,France)的RIPA缓冲液中，通过超声处理来裂解根据本发明的未转导的T细胞(C0)和CD123 CAR T细胞。用SDS-PAGE对等量的蛋白质进行分离，并将其电转移到PVDF膜上(Bio Rad,California,USA)。用结合人CD3ζ链的第一抗体(以1:1000稀释)对膜进行探测过夜(51-6527GR,BD Biosciences)。加入识别β-肌动蛋白的抗体(以1:106稀释)(克隆号AC15,货号A5441,Sigma-Aldrich,Missouri,USA)作为内部上样对照。为了进行免疫检测，加入第二抗体(以1:6000稀释)：绵羊抗小鼠IgG(货号515-035-062,Jackson,Pennsylvania,USA)。通过加入适当的检测试剂(ClarityTM Western ECL印迹底物,Bio-Rad,Cressier,Switzerland)，并通过使用照相机和Bio-1D软件(Wilber-Lourmat,Coll é gien,France)来检测化学发光。
图12还示出了western印迹，参见图12C。通过在3次实验中的免疫印迹验证了本发明CAR的表达(图2C)。在转导和未转导的T细胞裂解物中检测到与内源性CD3ζ链相对应的较低条带(16kDa)，而在CD123 CAR T细胞中55kDa处出现额外条带，与CD123 CAR构建体的理论大小相对应。该条带在未转导的T细胞中是不存在的。更准确地说，图12的C项示出了与C0中的无表达相比，来源自遗传修饰T细胞(CAR)的全细胞裂解物中CD123 CAR蛋白表达(55kDa，与内源性CD3ζ(16kDa)相比，CD3ζ与CAR构建体融合)的western印迹分析。
图12还示出了流式细胞分析，参见图12D和图12E。使用生物素缀合的CD123蛋白进行流式细胞分析，确认了CD123 CAR在T细胞上的表面表达。CD123蛋白的固定仅发生在转导的T细胞上(CD123R CAR为16％±11.5，n＝8，并且CD123L CAR为31.5％±12.2，n＝9)，而在未转导的T细胞上为0％。图12的D项示出了通过流式细胞术检测CAR在细胞表面的表达：用生物素缀合的CD123蛋白和链霉亲和素PE对CD123 CAR和C0进行染色。更准确地说，在图12的D项示出了表达的示例，并且在图12的E项中示出了报告的总共17次不同实验(CD123R CAR为n＝8，并且CD123L CAR为n＝9)的平均值。在未转导的细胞中未检测到表达。
更一般地说，出于本发明的目的，通过流式细胞术来完成对转导的细胞中CAR表面表达的评估。更准确地说，通过流式细胞术检查抗CD123 scFV在转导的T细胞的细胞表面上的表达。T细胞(100 000个细胞)在室温用0.25μg生物素化CD123蛋白染色1小时，然后用PE缀合的链霉亲和素(BD Biosciences)染色。然后评估与C0相比，CD123在CD3+CD19+CAR细胞上的固定。
图13示出了根据本发明的CAR的核酸序列。
CAR是用本发明的抗体AB1构建的。对应于信号肽、标签HA、重链、铰链1、轻链、铰链2、CD28、4.1BB和CD3z的核酸分别以不同的阴影按阅读顺序从左到右突出显示。
相应地，本发明的一个目的是编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中该核酸分子由与SEQ ID NO:97具有至少85％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性的序列组成。
本发明的另一目的是编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中该核酸由SEQ ID NO:97组成。
图14示出了与评估根据本发明的CAR T细胞与未转导T细胞相比的表型相关的流式细胞术图。
本实施方案的CAR CD123细胞产物包含CD4 T细胞(58％[22.6-84.8％],n＝23)和CD8 T细胞(39.6％[16.1-74.9％],n＝23)的混合物。未转导和转导的T细胞之间没有观察到CD4/CD8比值的差异。图14的A项示出了在基于10名不同供体的10次实验中，未转导的T细胞C0和遗传修饰的细胞(GMC)CD123R CAR T细胞中CD8群体(与CD4群体相对)的百分比。总的来说，在转导和未转导的细胞中，两个群体(CD4和CD8)的重新划分没有显著差异(ns,p＝0.57)，参见图14A。图14的B项示出了基于CD45RA和CD45RO以及CD95和CCR7的表达，对记忆T细胞表型的流式细胞术分析的代表性示例，参见图14B。图14的C项和D项分别示出了对于三名供体在CD123R CAR T细胞(GMC)与C0相比中，CD4和CD8的T亚群的重新划分。TEFF：效应T细胞；TEM：效应记忆性T细胞；TCM：中枢记忆性T细胞；TSCM：记忆性T细胞干细胞。
图15示出了将靶细胞与本发明的嵌合抗原受体和未转导细胞共培养的示意图，以及与本发明CAR对BPDCN细胞系和BPDCN患者源性异种移植细胞的特异性细胞毒性(另外针对CD123阴性细胞，显示靶向特异性)相关的流式细胞术图。
更一般地说，图15示出了本发明CAR对BPDCN细胞系和BPDCN患者来源性异种移植细胞的特异性细胞毒性。对于每张图，指示均值和SD。
图15的A项在左侧示出了将C0和CD123 CAR T细胞与BPDCN细胞共培养的一般原理图，随后在右侧示出了流式细胞术结果。为了评估CD123 CAR T细胞的细胞毒性(例如，诱导靶细胞凋亡的能力)，将靶细胞与效应T细胞(C0或CD123 CAR)以10:1(CD123R CAR)或5:1(CD123L CAR)的E:T比或单独1:0(对照)的E:T比共培养16小时(PDX)或24小时(CAL-1、GEN2.2、DAUDI、REH)，参见图15A。利用eDye细胞增殖靶向T细胞，和7-AAD染色可以检测BPDCN细胞死亡。活的靶细胞为7-AAD-CD123+(灰色)。通过比较CAR CD123培养或C0培养相对于单独培养中活的靶细胞(7AAD-/CD123+)的数量来计算消耗的百分比。由于用于CAR产生的T淋巴细胞与靶细胞是同种异体的，因此在C0培养条件下获得细胞毒性(与T细胞的同种异体性有关)。这与在CAR CD123培养中获得的细胞毒性进行了比较。C0或CD123 CAR条件下的特异性细胞毒性代表与单独靶标条件下的死亡百分比相比而言的靶细胞死亡％。
图15的B项示出了通过流式细胞术检测CD123在BPDCN细胞系(CAL-1和GEN 2.2)中的表达，图15的C项示出了以10:1的E:T比共培养(CAL-1,n＝22和GEN 2.2,n＝10)后，CD123R CAR T细胞对CAL-1和GEN 2.2的特异性细胞毒性，图15的D项示出了通过流式细胞术检测CD123在BPDCN PDX细胞中的表达，并且图15的E项示出了CD123 CAR T细胞对指示的CD123+PDX细胞(P127B-M5为n＝9，并且P25B-M1为n＝6)的细胞毒性。当与以下细胞系培养时，CD123R CAR T细胞表现出有力的抗原特异性细胞毒性：CAL-1细胞系(与CD123R CAR一起培养消耗为69.1％±27.4，而与C0一起培养消耗为22.2％±11.8，n＝22,p<0.0001)；GEN2.2细胞系(与CD123R CAR一起培养，为65.7％±26.4，而与C0一起培养，为25.3％±12.2，n＝10,p＝0.0004)，以及PDX细胞(与CD123R CAR一起培养，为68％±22.2，而与C0一起培养，为13％±29.5，n＝15)，参见图15B、图15C、图15D和图15E。
图15的F项在左侧示出了通过流式细胞术检测在DAUDI和REH细胞系中不存在CD123表达，并且在右侧示出了与C0和CD123 CAR共培养后，这些细胞系(DAUDI,n＝6和REH,n＝4)的存活力百分比。对CD123-细胞系DAUDI和REH没有细胞毒性，参见图15F。
图15的G项示出了在与C0或CD123R CAR T细胞共培养前，将CAL-1与B4D5抗体一起孵育1h的条件下的细胞死亡百分比图。
通过将CAL-1细胞与B4D5 CD123抗体(AB1)进行预孵育来确认CD123R CAR T细胞的特异性细胞毒性。预孵育诱导CD123R CAR T细胞的细胞毒性受到抑制，n＝5。抑制CARCD123的细胞毒性导致使用CD123R CAR的死亡水平类似于用C0观察到的细胞死亡(CD123CAR为27.2％±13.7，并且C0为17.2％±11，(ns,p＝0.2368,n＝5)，参见图15G)。事实上，CD123R CAR T细胞在体外显示出对CD123+白血病细胞的特异性细胞毒性。
图15的H项示出了CD123L CAR对CAL-1(E:T＝10:1,n＝3或E:T＝5:1,n＝5)、GEN2.2(E:T＝5:1,n＝3)和2种PDX(E:T＝5:1,P127B-M3,n＝3和F13-CAL-1-M2,n＝3)的特异性细胞毒性。
以E:T＝10:1和5:1的比值使用CD123L CAR来验证细胞毒性测定，参见图15H。对于CAL-1，当E:T比等于5:1时，观察到用CD123L CAR的消耗为94.6％±6.1，而用C0的消耗为16.6％±18.7(p<0.0001,n＝5)；对于GEN 2.2：CD123L CAR的消耗为96.7％±4.9，而C0的消耗为7％±11.9(p＝0.0032,n＝3)；对于PDX：CD123L CAR的消耗为87.5％±6.8，而C0的消耗为21.2％±22.7(p<0.0001,n＝6)，参见图15H。
图15的I项示出了与C0和CD123L CAR T细胞共培养后，CD123-细胞系(DAUDI,n＝3和HL-60,n＝4)的存活力百分比。同样，未观察到对CD123-细胞系HL-60和DAUDI的毒性(使用CD123L CAR，HL-60的存活力为73.8±7.3，而使用C0，存活力为72.5±15.5，n＝4；使用CD123L CAR，DAUDI的存活力为93±9.9，而使用C0，存活力为94.1±8.4，n＝3)，参见图3I。
图16示出了与本发明CD123R CAR T细胞在与CD123+靶细胞共培养中的功能表征相关的流式细胞术图。
图16的A项示出了以10:1的E:T比与CAL-1细胞系共培养6小时后，与未转导的细胞(C0)相比，通过CD123R CAR的CD107a表达检测的代表性脱颗粒测定。图16的B项示出了代表6次实验均值+/-SD的直方图，*p＝0.0253。为了确定CD123R CAR T细胞的效应功能，在共培养后测量了不同的参数。CD123R CAR T细胞脱颗粒是因为其表达一定量的CD107a(CD123RCAR为10.7％±7.6，而C0为2.4±1.3，p＝0.0253,n＝6)，参见图16A和图16B。
图16的C项示出了与CAL-1共培养24小时后，胞内细胞因子IFN-γ的染色。图16的D项示出了代表3次实验均值+/-SD的直方图，*p＝0.0314。CD123R CAR T细胞在胞内区室中分泌IFN-γ(对于CD123R CAR为11％±4.7，而对于C0为2％±0.7，p＝0.0314,n＝3)(图4C&D)，表明CD123R CAR T细胞活化，参见图16C和图16D。
图16的E项示出了共培养上清液中代表性细胞因子微珠阵列人Th1/Th2/Th17分析(自上而下：IL-2；IL-6；IL-4；IL-10；TNF；IFN-γ；IL-17a–数据以颜色显示，其中红色＝IL-2；橙色＝IL-6；黄色＝IL-4；绿色＝IL-10；蓝色＝TNF；深蓝色＝IFN-γ；紫色＝IL-17a)。在使用CD123-CAR共培养的上清液中发现更高水平的IFN-γ和IL10(CBA分析)(IL-10：CD123RCAR为91.4pg/mL±19.4，相对于C0为31.6±6.8，n＝5)，参见图16E。
图16的F项示出了代表与不同靶细胞共培养后，通过C0和CD123R CAR的INF-γ分泌的均值的直方图，n＝3。观察到IFN-γ分泌的显著增加(CD123 CAR为288pg/mL±70，相对于C0为147pg/mL±67，n＝5)。该分泌是特异性的，因为CD123R CAR T细胞在与CD123-DAUDI细胞系共培养时不分泌IFN-γ，参见图16F。
图16的G项示出了在与用B4D5抗体预孵育1小时的CAL-1共培养后，通过CD123RCAR的CBA分析来测量抑制IFN-γ分泌的条件下的IFN-γ分泌图，n＝5。当CAL-1细胞与本发明的CD123 B4D5抗体预孵育时，通过CD123R CAR T细胞的IFN-γ产生减少，达到使用C0观察到的细胞毒性水平，参见图16G。IL10也有所增加，但处于较低水平(CD123 CAR为91pg/mL±19，而C0为31±6，n＝5)，参见图16E。
图17示出了异种移植模型的示意图、生物发光成像和与其相关的图，以及与本发明的T细胞对BPDCN细胞系(CAL-1)和原代衍生异种移植细胞(PDX)的体内抗肿瘤活性相关的流式细胞术图。
更一般地说，图17示出了本发明的CD123L CAR T细胞对CAL-1和PDX(原代衍生异种移植物或患者来源性异种移植物)的体内抗肿瘤活性。
图17的A项示出了异种移植模型的一般示意图。该模型是基于6-8周龄的NSG小鼠，其在CAL-1荧光素酶细胞系(1·106)或PDX(2·106)静脉内注射前一天进行照射(2,5Gy)。在CAL-1模型中在第3天或当通过流式细胞术在血液样品中检测到hCD45+/CD123+BPDCN细胞时，将C0 T细胞或包含本发明CD123L CAR的T细胞注射到尾静脉中(5或10×106/小鼠)，参见图17A。
图17的B项示出了在CAR抗CD123或C0治疗之前和治疗33天期间，生物发光成像分析的图像。叉字形标记表示死亡小鼠。图17的C项示出了在C0(虚线)和CD123L CAR(实线)治疗的小鼠中检测到的生物发光定量(cts/s)图。与CD123L CAR相比，用C0治疗的小鼠中反映白血病浸润的发光更高。这证明了本发明的CD123L CAR控制和/或治疗BPDCN的能力。与C0治疗的小鼠相比，用一剂CD123L CAR治疗的小鼠的总存活显示出高存活(41相比于26，5只小鼠/组，p＝0.0017，对数秩检验)，参见图17B和图17C。
图17的D项示出了小鼠总存活分析图。显然，与C0处理的小鼠相比，使用本发明的CAR治疗的小鼠的存活显著提高(n＝5只小鼠/组)。本发明的CD123L CAR以剂量依赖性方式控制BPDCN。这一点得到了以下事实的支持，即剂量为10×106的CD123L CAR比剂量为5×106的CD123L CAR引起更好的小鼠存活。此外，它还得到了较低肿瘤负荷的支持(对于5×106个T细胞为41，而对于10×106个T细胞为55，5只小鼠/组，p＝0.0173，对数秩检验)，参见图17D。
利用CD123R CAR，即本发明的逆转录病毒形式，进一步验证了与图17相关的相同的前述实验。
相应地，图18示出了与本发明的T细胞对BPDCN细胞系(CAL-1)的体内抗肿瘤活性相关的异种移植模型、生物发光成像及其图。
更一般地说，图18示出了CD123R CAR T细胞对CAL-1的体内抗肿瘤活性。图18的A项示出了异种移植模型的一般示意图：在注射CAL-1荧光素酶(1×106/小鼠)前一天对NSG小鼠进行照射(2.5Gy)。在第3天时，尾静脉注射C0和GMC(10×106)，参见图18A。图18的B项示出了CAL-1荧光素酶移植之后，CD123R CAR T细胞或C0治疗前后的生物发光成像图片，参见图18B。图18的C项示出了小鼠总存活分析图。存活分析显示，与C0治疗的小鼠相比，CD123R CAR治疗的小鼠有显著的存活(n＝5只小鼠)。
因此，本发明的CAR有效地治疗BPDCN。
进一步检查了如图17所示本发明的CAR慢病毒形式。
更具体而言，该结果在PDX模型中得到证实，参见图17A。
图17的E项示出了在C0或CD123L CAR治疗期间进行的血液免疫染色的代表性示例。人类T细胞和原代BPDCN细胞可根据hCD45表达进行区分。C0(hCD45高/CD123-/CD3+CD19-)或CD123L CAR(hCD45高/CD123-/CD3+CD19+)为灰色(数据也以颜色显示：蓝色)；BPDCN细胞(hCD45低/CD123+)为黑色(数据也以颜色显示：粉色)。图17的F项示出了在用C0(深色线，或当数据以颜色显示时蓝线)或CD123 CAR(灰线或当数据以颜色显示时红线)治疗期间，注射了LAN PDX的小鼠血液中的平均BPDCN细胞计数图。图17的G项示出了显示PDX异种移植小鼠总存活的图。与C0治疗的小鼠相比，CD123L CAR治疗的小鼠有更高的存活(p＝0.01)。更具体而言，在PDX F13-LAN模型中，注射后78天，在所有小鼠血液样品中都检测到BPDCN细胞：一组接受5×106的CD123L CAR(BPDCN细胞平均数：24个母细胞/μL[1-56],n＝8)，而另一组接受5×106的C0(26个母细胞/μL[1-66],n＝8)。在25天期间，通过使用绝对计数(trucount)分析的血液分析来监测小鼠。在第7天时，对小鼠血液样品中的BPDCN细胞和T细胞进行定量，参见图17E和图17F。在随访期间，显示出用CD123L CAR治疗可以控制循环中的BPDCN细胞的数量，参见图17C，并延长小鼠的总存活(CD123L CAR治疗为31天，而C0治疗为20天，P＝0.0103)，参见图17G。总体而言，在使用BPDCN细胞系和PDX细胞的小鼠模型中获得的结果显示，根据本发明的CAR CD123L可以在体内控制BPDCN。
本发明的CAR逆转录病毒形式已经在类似于所示慢病毒形式的实验中得到证实。
图19示出了与不同细胞类型中CD123表达相关的荧光图、肿瘤和正常组织中CD123表达的免疫组织化学图像、与CD123表达相关的流式细胞术图、本发明自体T细胞的产生示意图，以及本发明T细胞对低水平表达CD123的细胞的与CD123相关的毒性的流式细胞术图。
更一般地说，图19示出了评估本发明的CD123L CAR T细胞对以低水平表达CD123的细胞的毒性。
上文表明，抗CD123抗体(本发明的B4D5和商业化抗体6H6)显示出CD123的紧密染色，参见图10C。相应地，利用6H6抗体来比较CD123在正常造血细胞和内皮细胞系(HMEC)上的表达，并与BPDCN进行比较。
图19的A项示出了CD123在不同细胞系中的表达图。使用6H6商业化抗体研究CD123的表达，以便将BPDCN(n＝60)与血液和骨髓样品中的淋巴细胞(n＝31)、单核细胞(n＝22)、正常pDC(n＝30)、正常骨髓中的CD34细胞(n＝16)和内皮HMEC细胞系(n＝4)进行比较。结果以MFI表示，参见图19A。与BPDCN细胞(MFI＝11677[2962-33439],n＝60)和正常pDC(MFI＝34352[17822-76610],n＝30)相比，在单核细胞(MFI＝1704[778-4578],n＝22)、内皮细胞系(MFI＝1252[602-2283],n＝4)和CD34+细胞(MFI＝874[326-1424],n＝16)上检测到低表达。本发明的CD123 CAR在体内对CD123低细胞的细胞毒性低于对CD123高BPDCN细胞的细胞毒性。
为了评估CD123在组织上的表达，使用本发明的AB1(或18B4D5抗体)进行组织微阵列。为此，使用美国食品和药物管理局标准的冷冻组织阵列，包括每种器官3名个体供体的90个组织芯(30种器官)(US Biomax,Rockville,MD,USA)。利用UltraView通用DAB检测试剂盒(Ventana,USA)来检测免疫染色。以NDP.view 2.0软件采集图像并进行分析。染色强度分级如下：阴性(0)、弱染色(1+)、中度(2+)、阳性(3+)、强(4+)。高CD123(Cal-1)或阴性(Daudi)表达细胞系分别用作阳性或阴性对照。
表4示出了组织微阵列的结果。
Figure BDA0003508166120000531
Figure BDA0003508166120000541
表4：组织微阵列结果。
结果显示，CD123在特定组织细胞上没有明显的表达，淋巴结、胃、结肠、肌肉、食管、皮肤和甲状腺中仅有一些内皮细胞表达CD123。
图19的B项示出了肿瘤组织(BPDCN)和正常组织上使用B4D5抗体的免疫组织化学图像。为了将这些组织中内皮细胞上CD123表达的水平与BPDCN上CD123表达的水平进行比较，对使用本发明AB1(18B4D5)抗体的3种正常组织进行了IHC。将表达与BPDCN患者皮肤病变上获得的表达水平进行比较(n＝2)。在2名患者的皮肤病变上获得了高水平的CD123表达，以及在所测组织的内皮细胞上的低表达，参见图19B。更具体而言，BPDCN患者1和患者2在BPDCN细胞的真皮内母细胞性浸润中显示出CD123的高表达。不同健康组织的CD123免疫染色显示出内皮细胞上低水平的CD123表达(箭头)。特定组织细胞为CD123阴性。在胃和甲状腺分泌物中发现低的非特异性标记。
两种方法都显示出单核细胞、CD34+细胞和内皮细胞上的低水平CD123，这表明本发明的CAR CD123的“瘤外中靶(on target off tumor)”的潜能较低。
图19的C项示出了CD123 K532的代表性表达。更具体而言，显示了CD123在单独培养或与C0或CD123 CAR以E:T比＝5:1一起培养24小时期间的活K562 CD123细胞系上的代表性表达。CD123-区域由天然K562系(其为CD123-)界定，CD123低区域对应于单核细胞和HMEC细胞上的最大表达。CD123阳性代表CAL-1表达水平，并且CD123高代表高于CAL-1的水平。这种模型化显示了靶细胞上CD123的表达水平与CD123L CAR的杀伤效率之间的关系，其使用的是表达不同CD123水平的K562细胞系(K562 CD123)。如所述，细胞系与C0或CD123 CAR共培养或单独培养。根据K562细胞的CD123表达水平，即CD123-、CD123低(对应于单核细胞和内皮HMEC细胞上CD123的最高表达)、CD123+/高(对应于CAL-1上CD123的表达水平和更高水平)，比较在整个群体中K562细胞的持续性百分比，参见图19C。
图19的D项示出了K562的每个亚组中的细胞百分比图。当细胞与CAR CD123一起培养时，K562 CD123低细胞的百分比没有降低，而K562 CD123阳性/高细胞则消失了；K562 CD123-细胞的百分比增加(因为CD123+减少)，n＝3。更具体而言，单独培养或与C0共培养时，与各表达水平相关的K562细胞分布是相同的，而当K562 CD123与CD123L CAR共培养时，阳性/高阳性CD123细胞的比例显著降低(n＝3,p＝0.0001)(因此，CD123-细胞的百分比增加)，参见图19D。而且，对于CD123低细胞，在与C0或CD123L CAR一起培养之间，持续的细胞的百分比相似，这表明CD123L CAR对CD123低细胞无显著毒性。这证明了本发明的CD123L CAR杀伤CD123高表达者细胞的能力，而对弱表达者细胞没有影响或影响甚微。
图19的E项示出了与抑制靶细胞增殖相关的图。评估了CD123L CAR T细胞对内皮细胞系HMEC和原代单核细胞的细胞毒性。使用增殖测试评估了共培养18小时后的增殖抑制(MTT细胞增殖测试)。提供了细胞生长抑制的百分比。CAL-1用作CD123+阳性对照，并且DAUDI用作CD123-阴性对照，参见图19E。
图19的F项示出了从人CD34+移植的人源化小鼠中实验性产生自体CD123L CAR T细胞的示意图。图19的G项示出了CD123L CAR对CD34细胞的毒性图。使用了两种来源的CD34细胞。CD123L CAR T细胞由人源化小鼠产生。此外，脐带血用于产生CD123L CAR T细胞，这些细胞与从相同脐带血中分选的CD34+细胞一起培养，**p＝0.0019。图19的H项示出了与自体CAR T细胞或C0共培养后，CD123在来自小鼠骨髓的CD34+细胞上的代表性表达。CD123LCAR诱导CD123低表达HMEC的低裂解水平，证明CD123L CAR对内皮细胞的潜在低毒性。由于CD123以低水平表达在CD34+细胞上，因此使用上述两种策略研究了CD123L CAR T细胞的体外细胞毒性。首先，将脐带血分选的T细胞转导以产生CD123L CAR或C0 T细胞，并与自体脐带血分选的CD34+细胞共培养；未观察到由于CD123L CAR而导致的CD34+细胞消耗(CD123LCAR的消耗为5.7％±5.1，并且C0的消耗为11.7％±10.2，n＝3,p＝0.41)，参见图19G。第二，从人源化小鼠中分选的人T细胞用于产生CD123L CAR或C0，其与自体CD34细胞共培养，参见图19F、图19G和图19H。与CD123L CAR T细胞或C0细胞共培养引起CD34+细胞的低消耗(CD123L CAR为12.7％±16.3，而C0为2.7％±3.1，(ns,p＝0.3542,n＝3))，参见图19G。重点关注CD34+/CD123+亚群(代表38％和16％的CD34+细胞，n＝2)，观察到只有CD34+/CD123+细胞被CD123L CAR杀伤(消耗为82.1％±0.6)，而CD34+/CD123-细胞保持存活(消耗为3.5％±4.9)，参见图19G和图19H。
此外，在上述人源化小鼠模型中，研究了CD123L CAR在体内对自体造血细胞的反应性。人CD123 CAR T细胞或C0是从人T细胞产生的。转导效率为55.4％±9.2(n＝3)，并且在小鼠回输之前，在体外验证了这种CD123L CAR T细胞的效率。
图20示出了基于流式细胞术的与评估来自人源化小鼠的CD123L CAR T细胞对CAL-1和HL-60的毒性相关的图。更具体而言，显示了从人源化小鼠获取的CD123L CAR T细胞对自体CAL-1和CD123阴性HL-60细胞的毒性。使用CAR CD123时CAL-1细胞的消耗为98.6％(±0.5％,n＝3)，而使用C0时仅为0.7％(±0.6,n＝3)，并且观察到C0和CD123L CAR对CD123-HL-60细胞系的消耗之间无差异。
图19的I项示出了CD123L CAR在人源化小鼠中的体内毒性的代表性示例图。对于每只小鼠，测量D-5和D15之间人造血群体(血液：B和T淋巴细胞、单核细胞、pDC)的倍数变化(FC)。两组小鼠(C0和CD123L CAR)之间的人免疫细胞群(T和B淋巴细胞、单核细胞、pDC、嗜碱性粒细胞)没有明显差异。以第-5天为参照，计算C0或CD123L CAR注射后第15天时不同免疫活性细胞亚群(总hCD45+细胞、B细胞、T细胞、单核细胞)的倍数变化。细胞计数是从通过眼眶后采集的外周血样品中进行的，显示了一个代表性示例，n＝3。
图19的J项示出了注射C0或CD123L CAR T细胞后15天，人源化小鼠骨髓中CD34+细胞的百分比图，n＝3名供体。简而言之，对注射CD123L CAR的小鼠和注射C0的小鼠的FC进行比较，参见图19I和图19J。
在三次实验中，未观察到两组小鼠(C0和CD123L CAR)之间的T、B淋巴细胞、单核细胞、pDC的数量的差异。仅在D15时分析骨髓CD34+细胞，并在注射C0与CD123 CARL的小鼠之间进行比较(n＝3)：没有观察到人CD45+细胞中CD34数量的百分比的显著减少，参见图19J。
这些数据证实了本发明的CD123L CAR对CD123低造血细胞的细胞毒性不存在或至少非常低。而且，数据还证实了对CD123+亚群的选择性细胞毒性。在体内，未观察到对循环中单核细胞、淋巴细胞和pDC以及骨髓CD34+细胞的显著影响。
图21示出了与来自BPDCN患者的CD123 CAR T细胞诱导的对自体BPDCN母细胞的特异性细胞毒性相关的流式细胞术图。结果显示，患者自体CD123L CAR T细胞在体外成功清除了原代BPDCN母细胞，而对正常血细胞(B淋巴细胞和T淋巴细胞)无细胞毒性。
图21的A项示出了来自流式细胞术表型测定的图，其中将未转导的T细胞(C0)的表型CD3/CD19与本发明的转导的CD123L CAR T细胞进行比较。对于一名BPDCN患者，使用自体T细胞生成有效的CD123 CAR T细胞和C0。9天后，达到了大于79.2％的转导效率，参见图21A。这一效率与在健康供体T细胞中所达到的效率相似，参见图12B。
图21的B项示出了使用生物素缀合的CD123蛋白和链霉亲和素PE的CD123 CAR细胞表面表达的流式细胞术图。这是使用生物素缀合的CD123蛋白的CD123 CAR细胞表面表达的控制，参见图21B。
图21的C项示出了CD3/CD28磁性选择/激活后的患者阴性级分的图。灰色数据(彩色数据中的粉色)代表母细胞(CD45低、CD3-、CD19-、CD303+、CD123高)，深灰色(彩色数据中的蓝色)代表T淋巴细胞(CD45高、CD3+、CD19-、CD303-、CD123-)，浅灰色(彩色数据中的橙色)代表B淋巴细胞(CD45高、CD3-、CD19+、CD303-、CD123-)。更具体而言，测试了自体CAR T细胞对患者BPDCN母细胞的功能活性。母细胞级分从T细胞选择的阴性级分组建。它由BPDCN母细胞(灰色/粉色群体：CD45低/CD3-/CD19-/CD303+/CD123高)、T细胞(蓝色/深灰色群体：CD45高/CD3+/CD19-/CD303-/CD123-)和B细胞(橙色/浅灰色群体：CD45高/CD3-/CD19+/CD303-/CD123-)组成，参见图21C。将CD123L CAR和C0与这种自体母细胞级分以5:1的E:T比共培养24小时。
图21的D项示出了流式细胞术图和细胞存活力图。它显示了CD123L CAR T细胞在E:T比为5:1时共培养24h后对自体BPDCN母细胞的特异性细胞毒性(橙色＝B细胞；粉色＝BPDCN母细胞；蓝色＝T细胞，灰色＝C0或CD123L CAR)。更具体而言，观察到95％的BPDCN母细胞(CD123+)清除，而对CD123细胞(T细胞和B细胞)没有细胞毒性。由于患者在血液中没有单核细胞，因此无法对自体单核细胞进行毒性评估。然而，综合来看，这些结果表明本发明的自体CD123L CAR T细胞在体外选择性地有效清除BPDCN母细胞。
如上所述，BPDCN是一种克隆性疾病，在大多数情况下会进展为侵袭性白血病，且预后非常差。需要改进治疗方法。尽管BPDCN细胞对化疗敏感，但患者仍会复发并对二线治疗产生抗性。本发明提供了针对CD123的靶向疗法，CD123是BPDCN患者中高表达的“关键抗原”。更具体而言，本发明提供了一种使用基于特定设计的嵌合抗原受体(CAR)的疗法的BPDCN治疗手段。本发明能够选择性地靶向并杀伤患者中的BPDCN细胞。而且，本发明提供了BPDCN的长期缓解。
相应地，本发明提供了具有特异性识别和/或特异性结合CD123的第三代CAR的基因工程化T细胞。本发明的CAR是使用逆转录病毒或慢病毒策略构建的。逆转录病毒或慢病毒策略都能介导抗肿瘤活性。表达本发明CD123CAR的T细胞可以特异性地裂解BPDCN细胞。更具体而言，表达本发明CD123 CAR的T细胞可以特异性裂解不同的BPDCN靶标，即BPDCN细胞系CAL-1和GEN2.2和/或BPDCN PDX和原代BPDCN患者细胞。当本发明的CAR与这些靶标一起培养时，细胞在体外激活效应功能，如IFN-γ释放和CD107a脱颗粒。本发明的CAR的功能性对靶细胞的CD123表达是特异性的。事实上，当用本发明的抗CD123抗体(如AB1)预孵育来阻断CD123的表达时，细胞毒性和细胞因子分泌都被逆转。此外，本发明的一个令人惊讶的效果是，当本发明的CAR与CD123-细胞系(Daudi、REH、HL-60)共培养时，不会出现细胞毒性(或基本上不会)和/或细胞因子分泌(或基本上不会)。在体内，表达本发明CAR的T细胞显示出针对BPDCN系的抗白血病活性。本发明的这种积极效果为受BPDCN影响的受试者(例如小鼠)提供了长期存活。
现有技术公开了靶向CD123的药剂，即抗体[参见Li F,Sutherland MK,Yu C,Walter RB,Westendorf L,Valliere-Douglass J等人,Characterization of SGN-CD123A,A Potent CD123-Directed Antibody-Drug Conjugate for Acute MyeloidLeukemia,Molecular cancer therapeutics,2018,17(2):554-64；Xie LH,Biondo M,Busfield SJ,Arruda A,Yang X,Vairo G等人,CD123 target validation andpreclinical evaluation of ADCC activity of anti-CD123 antibody CSL362 incombination with NKs from AML patients in remission,Blood cancer journal,2017,7(6):e567；和Kovtun Y,Jones GE,Adams S,Harvey L,Audette CA,Wilhelm A等人,A CD123-targeting antibody-drug conjugate,IMGN632,designed to eradicate AMLwhile sparing normal bone marrow cells,Blood advances,2018,2(8):848-58]、融合蛋白[Frankel AE,Woo JH,Ahn C,Pemmaraju N,Medeiros BC,Carraway HE等人,Activityof SL-401,a targeted therapy directed to interleukin-3receptor,in blasticplasmacytoid dendritic cell neoplasm patients,Blood,2014；124(3):385-92]、BiTes[Pizzitola I,Anjos-Afonso F,Rouault-Pierre K,Lassailly F,Tettamanti S,Spinelli O等人；Chimeric antigen receptors against CD33/CD123 antigensefficiently target primary acute myeloid leukemia cells in vivo,Leukemia,2014,28(8):1596-605；Chu SY,Pong E,Chen H,Phung S,Chan EW,Endo NA等人,Immunotherapy with Long-Lived Anti-CD123×Anti-CD3 Bispecific AntibodiesStimulates Potent T Cell-Mediated Killing of Human AML Cell Lines and ofCD123+Cells in Monkeys:A Potential Therapy for Acute Myelogenous Leukemia,Blood,2014,124(21):2316；和Ruella M,Barrett DM,Kenderian SS,Shestova O,HofmannTJ,Perazzelli J等人,Dual CD19 and CD123 targeting prevents antigen-lossrelapses after CD19-directed immunotherapies,The Journal of clinicalinvestigation,2016,126(10):3814-26]、DART[Al-Hussaini M,Rettig MP,Ritchey JK,Karpova D,Uy GL,Eissenberg LG等人,Targeting CD123 in acute myeloid leukemiausing a T-cell-directed dual-affinity retargeting platform,Blood,2016,127(1):122-31]、三重抗体(triplebodies)或甚至CAR T细胞[Gill S,Tasian SK,Ruella M,Shestova O,Li Y,Porter DL等人Preclinical targeting of human acute myeloidleukemia and myeloablation using chimeric antigen receptor-modified T cells,Blood,2014,123(15):2343-54；和Tettamanti S,Marin V,Pizzitola I,Magnani CF,Giordano Attianese GM,Cribioli E等人,Targeting of acute myeloid leukaemia bycytokine-induced killer cells redirected with a novel CD123-specific chimericantigen receptor,British journal of haematology,2013,161(3):389-401]。虽然其中一些研究表明抗CD123治疗剂在一定程度上对AML有效力，但对正常造血的各种负面影响仍有报道，参见Pemmaraju N,Lane AA,Sweet KL,Stein AS,Vasu S,Blum W等人,Tagraxofusp in Blastic Plasmacytoid Dendritic-Cell Neoplasm,The New Englandjournal of medicine,2019,380(17):1628-37。最近对32名BPDCN患者在一线治疗时使用SL-401(与白喉毒素缔合的IL3)进行的研究表明，72％的患者有完全临床应答，并且24个月时的存活率为52％(包括45％的患者接受同种异体移植)。在之前接受过治疗的15名患者中，应答率为67％，并且中位总生存期为8.5个月。然而，在该研究中，78％的患者出现了负面副作用(3级或更高)，导致3名患者死亡。因此，毒性是一个主要问题。通过解决这个问题，本发明极大地改善了这种情况。
将本发明的活性CAR在BPDCN患者(以及AML患者)的临床试验中进行测试。未报告重大毒性事件和/或负面作用。
组织微阵列(TMA)和免疫组织化学(IHC)证实，当本发明的抗体(例如18B4D5)用于产生CAR时，在CD123低细胞中没有出现细胞毒性或细胞毒性较低。而且，本发明的CARCD123L对HMEC内皮细胞系不产生或产生很弱的细胞毒性。
从注射了本发明自体CAR CD123的人源化小鼠收集的体内数据显示，经本发明CD123 CAR治疗的小鼠对血液亚群(总CD45+细胞、T和B细胞以及单核细胞)没有显著影响。现有技术报告了可能由CAR T细胞导致的问题。所谓的细胞因子释放综合征(CRS)很常见，研究表明单核细胞是CRS期间IL-1和IL-6的主要来源，参见Giavridis T,van der StegenSJC,Eyquem J,Hamieh M,Piersigilli A,Sadelain M.,CAR T cell-induced cytokinerelease syndrome is mediated by macrophages and abated by IL-1blockade,NatMed,2018,24(6):731-8；和Norelli M,Camisa B,Barbiera G,Falcone L,Purevdorj A,Genua M等人,Monocyte-derived IL-1and IL-6are differentially required forcytokine-release syndrome and neurotoxicity due to CAR T cells,Nat Med,2018,24(6):739-48。本发明提供的数据使发明人相信，本发明的CD123 CAR T细胞在体内引起的潜在低水平单核细胞消耗可参与限制CRS(因为单核细胞表达低水平的CD123)。
为了控制本发明的CAR和出于人类治疗的目的，本发明的T细胞的一个实施方案包括自杀基因，即系统iCASP9/rimiducid，参见Warda W,Larosa F,Neto Da Rocha M,TradR,Deconinck E,Fajloun Z等人CML Hematopoietic Stem Cells Expressing IL1RAP CanBe Targeted by Chimeric Antigen Receptor-Engineered T Cells,Cancer research,2019,79(3):663-75。
本发明还提供了抗CD123 CAR T细胞，其能够在体外和体内特异性靶向和杀伤BPDCN的CD123+母细胞，并具有在正常CD123低细胞上评估的安全性概况。慢病毒策略允许体外和体内良好和可重复的转基因表达以及良好的活性。在临床应用和/或临床开发中，优选本发明CAR的慢病毒形式，参见Zufferey R,Donello JE,Trono D,Hope TJ.,Woodchuckhepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression oftransgenes delivered by retroviral vectors.Journal of virology,1999,73(4):2886-92；Miyoshi H,Blomer U,Takahashi M,Gage FH,Verma IM.,Development of aself-inactivating lentivirus vector,Journal of virology,1998,72(10):8150-7；Zufferey R,Dull T,Mandel RJ,Bukovsky A,Quiroz D,Naldini L等人,Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo genedelivery.Journal of virology,1998,72(12):9873-80。
相应地，本发明的目的在所附权利要求中定义。本发明的另一个目的在所附权利要求中参照序列同源性而不是序列同一性来定义。
相应地，本发明的实施方案涉及一种抗体，该抗体选自AB1、AB2、AB3、AB4、AB5和AB6组成的组，其中
AB1包括重链和轻链，并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:13具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区3(CDR3)，并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:14具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区3(CDR3)；
AB2包括重链和轻链，并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:27具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:15具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区3(CDR3)，并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区3(CDR3)；
AB3包括重链和轻链，并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:5具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区3(CDR3)，并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:6具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区3(CDR3)；
AB4包括重链和轻链，并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:31具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区3(CDR3)，并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:32具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区3(CDR3)；
AB5包括重链和轻链，并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:33具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区3(CDR3)，并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:34具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:22具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:10具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区3(CDR3)；以及
AB6包括重链和轻链，并且其中该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:35具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:23具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区3(CDR3)，并且其中该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少90％同源性，优选100％同源性的互补决定区3(CDR3)。
本发明的另一个目的是编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，或分离的嵌合抗原受体(CAR)分子，其中该CAR包括包含抗CD123结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域和至少包含刺激结构域的胞内信号传导结构域，并且其中所述抗CD123结合结构域包括：
(i)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少90％同一性，优选100％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少90％同一性，优选100％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(ii)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少90％同一性，优选100％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少90％同一性，优选100％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(iii)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:5具有至少90％同一性，优选100％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:6具有至少90％同一性，优选100％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(iv)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少90％同一性，优选100％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％同一性，优选100％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(v)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少90％同一性，优选100％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:10具有至少90％同一性，优选100％同一性的互补决定区3(CDR3)；
或者
(vi)重链和轻链，该重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少90％同一性，优选100％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且该轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少90％同一性，优选100％同一性的互补决定区3(CDR3)。
本发明的另一个实施方案是上述CAR，但是参照序列同源性而不是序列同一性。
本发明的另一个目的是包含如上文定义的核酸分子的表达载体，以及包含如上文定义的核酸分子的工程化免疫细胞(如T细胞)。根据本发明，该细胞可用作药剂和/或用于治疗哺乳动物中，优选人类中的增殖性疾病，其中该增殖性疾病是与CD123过度表达相关的疾病，优选母细胞性浆细胞样树突细胞瘤(BPDCN)。此外，本发明还涉及包含如上文定义的工程化免疫细胞的药物组合物。再者，本发明涉及一种工程化改造免疫细胞的方法，该方法包括用如上文定义的表达载体来转染细胞。
本发明的另一个实施方案的特征在于包含如权利要求中描述的核酸分子的工程化免疫细胞，其中该细胞是T细胞或自然杀伤细胞。
本发明的其它定义可以包括特异性结合抗原CD123的抗体，其中所述抗体选自AB1、AB2、AB3、AB4、AB5和AB6组成的组，并且其中
AB1包括与氨基酸序列SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:86具有至少85％同一性的轻链；
AB2包括与氨基酸序列SEQ ID NO:87具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:88具有至少85％同一性的轻链；
AB3包括与氨基酸序列SEQ ID NO:89具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:90具有至少85％同一性的轻链；
AB4包括与氨基酸序列SEQ ID NO:91具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:92具有至少85％同一性的轻链；
AB5包括与氨基酸序列SEQ ID NO:93具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:94具有至少85％同一性的轻链；以及
AB6包括与氨基酸序列SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:96具有至少85％同一性的轻链；
并且其中所述抗体具有不超过9.5x10-9M的KD值、不超过9.0x10-4s-1的抗体解离速率koff，和至少7x104Ms-1的抗体结合速率kon。
在一个实施方案中，CD123结合结构域是包括轻链可变区和重链可变区的scFv，该轻链可变区包含具有对SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:34或SEQ ID NO:36的轻链可变区的氨基酸序列有至少1个、2个或3个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列，并且该重链可变区包含具有对SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35的重链可变区的氨基酸序列有至少1个、2个或3个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列。
在另一实施方案中，CD123结合结构域是一种scFv，其包括(i)轻链可变区，该轻链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQID NO:34或SEQ ID NO:36具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性的互补决定区3(CDR3)，和(ii)重链可变区，该重链可变区包含与氨基酸序列SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性的互补决定区1(CDR1)，与氨基酸序列SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21或SEQID NO:23具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性的互补决定区2(CDR2)，和与氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性或具有100％同一性的互补决定区3(CDR3)。
在一个实施方案中，抗CD123结合结构域通过铰链区与跨膜结构域相连。优选地，编码的CAR包含CD28的跨膜结构域。
在一个实施方案中，铰链区包含IgG1的铰链序列或与其具有95-99％同一性的序列。在进一步的实施方案中，铰链区包含IgG4的铰链序列或与其具有95-99％同一性的序列。在进一步的实施方案中，铰链区还可包含IgG1或IgG4的CH2-CH3区或CD8α，或与其具有95-99％同一性的序列。
在优选的实施方案中，功能性胞内信号传导结构域的至少一个共刺激结构域从一种或多种蛋白质中获得，该蛋白质选自4.1BB和/或从CD3ζ获得的共刺激结构域。
序列表
<110> UNIVERSITÉ BOURGOGNE FRANCHE-COMTÉ
<120> 新的单克隆抗CD123抗体
<130> UNIVERSITÉ BOURGOGNE FRANCHE-COMTÉ | CAS 1 FR [122119]
<160> 175
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR3 "18B4D5
<400> 1
Ala Arg Gly Leu Asp Tyr
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR3 "18B4D5
<400> 2
His Gln Leu His Arg Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR3 "17F7B2
<400> 3
Thr Lys Gly Tyr Arg Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR3 "17F7B2
<400> 4
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Phe Thr
1 5
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR3 "11B6E6
<400> 5
Val Arg Ala His Gly Tyr Tyr Phe Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR3 "11B6E6
<400> 6
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Phe Thr
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR3 "14G12D7
<400> 7
Thr Arg Gly Val Asp Tyr
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR3 "14G12D7
<400> 8
Leu Gln Phe Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR3 "11A12C6
<400> 9
Val Arg Gly Asp Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR3 "11A12C6
<400> 10
Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Phe Thr
1 5
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR3 "15E11B7
<400> 11
Gly Gly Gly Val Arg Gly Ala Trp Phe Ala Phe
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR3 "15E11B7
<400> 12
Gln His Ser Ala Asp Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR2 "18B4D5
<400> 13
Ile Ser Phe Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR2 "18B4D5
<400> 14
Ser Thr Ser
1
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR2 "17F7B2
<400> 15
Phe Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr
1 5
<210> 16
<211> 3
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR2 "17F7B2
<400> 16
Lys Val Ser
1
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR2 "11B6E6
<400> 17
Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 18
<211> 3
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR2 "11B6E6
<400> 18
Trp Ala Ser
1
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR2 "14G12D7
<400> 19
Ile Ile Tyr Ser Gly Thr Thr
1 5
<210> 20
<211> 3
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR2 "14G12D7
<400> 20
Ser Thr Ser
1
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR2 "11A12C6
<400> 21
Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 22
<211> 3
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR2 "11A12C6
<400> 22
Trp Ala Ser
1
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR2 "15E11B7
<400> 23
Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr
1 5
<210> 24
<211> 3
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR2 "15E11B7
<400> 24
Leu Ala Ser
1
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR1 "18B4D5
<400> 25
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Thr
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR1 "18B4D5
<400> 26
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR1 "17F7B2
<400> 27
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR1 "17F7B2
<400> 28
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr
1 5 10
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR1 "11B6E6
<400> 29
Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp
1 5
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR1 "11B6E6
<400> 30
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Thr Arg Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR1 "14G12D7
<400> 31
Gly Tyr Ser Val Thr Ser Asp Tyr Ala
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR1 "14G12D7
<400> 32
Ser Ser Val Arg Ser Ser Tyr
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR1 "11A12C6
<400> 33
Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp
1 5
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR1 "11A12C6
<400> 34
Gln Ser Leu Phe Ser Ser Ser Ala Arg Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR1 "15E11B7
<400> 35
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Phe
1 5
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR1 "15E11B7
<400> 36
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 25
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR1 "18B4D5
<400> 37
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr
20 25
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR2 "18B4D5
<400> 38
Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 39
<211> 38
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR3 "18B4D5
<400> 39
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 40
<211> 42
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR4 "18B4D5
<400> 40
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala
1 5 10 15
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser
20 25 30
Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Ser
35 40
<210> 41
<211> 25
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR1 "17F7B2
<400> 41
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR2 "17F7B2
<400> 42
Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala
<210> 43
<211> 38
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR3 "17F7B2
<400> 43
Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 44
<211> 21
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR4 "17F7B2
<400> 44
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro
1 5 10 15
Pro Ser Val Tyr Ser
20
<210> 45
<211> 25
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR1 "11B6E6
<400> 45
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR2 "11B6E6
<400> 46
Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
1 5 10 15
Val
<210> 47
<211> 38
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR3 "11B6E6
<400> 47
Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Phe Ser Leu Gln Thr Asp Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 48
<211> 42
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR4 "11B6E6
<400> 48
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala
1 5 10 15
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser
20 25 30
Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Ser
35 40
<210> 49
<211> 25
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR1 "14G12D7
<400> 49
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr
20 25
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR2 "14G12D7
<400> 50
Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 51
<211> 38
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR3 "14G12D7
<400> 51
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 52
<211> 21
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR4 "14G12D7
<400> 52
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro
1 5 10 15
Pro Ser Val Tyr Ser
20
<210> 53
<211> 25
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR1 "11A12C6
<400> 53
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR2 "11A12C6
<400> 54
Ile Asn Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
1 5 10 15
Val
<210> 55
<211> 38
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR3 "11A12C6
<400> 55
Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 56
<211> 21
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR4 "11A12C6
<400> 56
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro
1 5 10 15
Pro Ser Val Tyr Ser
20
<210> 57
<211> 25
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR1 "15E11B7
<400> 57
Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Asp
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR2 "15E11B7
<400> 58
Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 59
<211> 38
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR3 "15E11B7
<400> 59
Phe Asn Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala His Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 60
<211> 42
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR4 "15E11B7
<400> 60
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Glu Ala Lys Thr Thr Ala
1 5 10 15
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser
20 25 30
Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Ser
35 40
<210> 61
<211> 26
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR1 "18B4D5
<400> 61
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR2 "18B4D5
<400> 62
Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 63
<211> 36
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR3 "18B4D5
<400> 63
Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 64
<211> 20
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR4 "18B4D5
<400> 64
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
1 5 10 15
Thr Val Ser Thr
20
<210> 65
<211> 26
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR1 "17F7B2
<400> 65
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR2 "17F7B2
<400> 66
Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 67
<211> 36
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR3 "17F7B2
<400> 67
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
20 25 30
Val Tyr Phe Cys
35
<210> 68
<211> 20
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR4 "17F7B2
<400> 68
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
1 5 10 15
Thr Val Ser Thr
20
<210> 69
<211> 26
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR1 "11B6E6
<400> 69
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser
20 25
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR2 "11B6E6
<400> 70
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 71
<211> 36
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR3 "11B6E6
<400> 71
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 72
<211> 20
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR4 "11B6E6
<400> 72
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
1 5 10 15
Thr Val Ser Thr
20
<210> 73
<211> 26
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR1 "14G12D7
<400> 73
Glu Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR2 "14G12D7
<400> 74
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 75
<211> 36
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR3 "14G12D7
<400> 75
Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 76
<211> 20
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR4 "14G12D7
<400> 76
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
1 5 10 15
Thr Val Ser Thr
20
<210> 77
<211> 26
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR1 "11A12C6
<400> 77
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser
20 25
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR2 "11A12C6
<400> 78
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 79
<211> 36
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR3 "11A12C6
<400> 79
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 80
<211> 20
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR4 "11A12C6
<400> 80
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
1 5 10 15
Thr Val Ser Thr
20
<210> 81
<211> 26
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR1 "15E11B7
<400> 81
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 82
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR2 "15E11B7
<400> 82
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 83
<211> 36
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR3 "15E11B7
<400> 83
Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 84
<211> 20
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR4 "15E11B7
<400> 84
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
1 5 10 15
Thr Val Ser Thr
20
<210> 85
<211> 144
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> 共有HC "18B4D5
<400> 85
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Phe Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys
115 120 125
Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Ser
130 135 140
<210> 86
<211> 118
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> 共有LC "18B4D5
<400> 86
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Leu His Arg Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Thr
115
<210> 87
<211> 128
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> 共有HC "17F7B2
<400> 87
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Phe Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Lys Gly Tyr Arg Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Ser
115 120 125
<210> 88
<211> 122
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> 共有LC "17F7B2
<400> 88
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Thr
115 120
<210> 89
<211> 149
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> 共有HC "11B6E6
<400> 89
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Phe Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Ala His Gly Tyr Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Ser
145
<210> 90
<211> 122
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> 共有LC "11B6E6
<400> 90
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Thr
115 120
<210> 91
<211> 123
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> 共有HC "14G12D7
<400> 91
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Val Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ile Tyr Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Ser
115 120
<210> 92
<211> 118
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> 共有LC "14G12D7
<400> 92
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Thr
115
<210> 93
<211> 128
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> 共有HC "11A12C6
<400> 93
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Gly Asp Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Ser
115 120 125
<210> 94
<211> 121
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> 共有LC "11A12C6
<400> 94
Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu
1 5 10 15
Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Ala Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gly Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser
85 90 95
Tyr Ser Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Thr
115 120
<210> 95
<211> 149
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> 共有HC "15E11B7
<400> 95
Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Asp
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Phe Asn Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala His
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Gly Gly Val Arg Gly Ala Trp Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Glu Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Ser
145
<210> 96
<211> 121
<212> PRT
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> 共有LC "15E11B7
<400> 96
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Ala
85 90 95
Asp Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Thr
115 120
<210> 97
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人
<220>
<223> CAR-18B4D5 核酸序列
<400> 97
atgaaactgc ccgtgagact gctggtgctg atgttttgga ttcccgcttc ctcgagcgac 60
ccatacgatg ttccagatta cgccatcctg tctgatgtgc agcttcagga gtcgggacct 120
ggcctggtga aaccttctca gtctctgtcc ctcacctgca ctgtcactgg ctactcaatc 180
accagtgatt atacctggaa ctggattcgg cagtttccag gaaacaaact ggagtggatg 240
ggctacataa gcttcagtgg tagcactagc tacaacccat ctctcaaaag tcgactctct 300
atcacccgag acacatccaa gaaccagttc ttcctgcagt tgaattctgt gactactgag 360
gacacagcca catattactg tgcaagaggg ctcgactact ggggccaagg caccactctc 420
acagtctcct caggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcgataatg 480
tccagaggac aaattgttct cacccagtct ccagcaatca tgtctgcatc tcttggggaa 540
cgggtcacca tgacctgcac tgccagctca agtataagtt ccagttactt gtactggtac 600
cagcagaagc caggctcctc ccccaaactc tggatttata gcacatccaa cctggcttct 660
ggagtcccag ctcgcttcag tggcagtggg tctgggacct cttactctct cacaatcagc 720
agcatggagg ctgaagatgc tgccacttat tactgccacc agttgcatcg ttccccgtgg 780
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaagagccca aatcttgtga caaaactcac 840
acatgcccac cgtgccctga tcccaaattt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 900
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 960
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1020
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc caaacggggc 1080
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1140
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1200
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1260
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag gcgtggccgg 1320
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1380
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1440
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1500
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1533
<210> 98
<211> 75
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR1 "18B4D5" DNA
<400> 98
gaggtcaagc tgcaggagtc aggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60
acctgcactg tcact 75
<210> 99
<211> 75
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR1 "17F7B2" DNA
<400> 99
gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60
tcctgcaagg cttct 75
<210> 100
<211> 75
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR1 "11B6E6" DNA
<400> 100
caggtcaagc tggaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatt 60
acctgcactg tctct 75
<210> 101
<211> 75
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR1 "14G12D7" DNA
<400> 101
gaggttcagc tgcaggagtc tggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60
acctgcactg tcact 75
<210> 102
<211> 75
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR1 "11A12C6" DNA
<400> 102
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatt 60
acctgcactg tctct 75
<210> 103
<211> 75
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR1 "15E11B7" DNA
<400> 103
gaggttcagc tggagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggattc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttct 75
<210> 104
<211> 51
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR2 "18B4D5" DNA
<400> 104
tggaactgga tccggcagtt tccaggaaac aaactggagt ggatgggcta c 51
<210> 105
<211> 51
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR2 "17F7B2" DNA
<400> 105
atgcactggg taaaacagag gcctgggcag ggtctagaat ggattggtgc t 51
<210> 106
<211> 51
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR2 "11B6E6" DNA
<400> 106
ataagctgga ttcgccagcc accaggaaag ggtctggagt ggcttggagt a 51
<210> 107
<211> 51
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR1 "14G12D7" DNA
<400> 107
tggaactgga tccggcagtt tcccggaaac aaactggagt ggatgggcta c 51
<210> 108
<211> 51
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR2 "11A12C6" DNA
<400> 108
ataaactgga ttcgccagac accaggaaag ggtctggagt ggcttggagt a 51
<210> 109
<211> 51
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR2 "15E11B7" DNA
<400> 109
atgaactggg tgaaacagag ccatggaaag agccttgagt ggattggacg t 51
<210> 110
<211> 114
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR3 "18B4D5" DNA
<400> 110
agctacaacc catctctcaa aagtcgactc tctatcactc gagacacatc caagaaccag 60
ttcttcctgc agttgaattc tgtgactact gaggacacag ccacatatta ctgt 114
<210> 111
<211> 114
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR3 "17F7B2" DNA
<400> 111
acctacaacc agaagttcaa gggcaaggcc aaactgactg ccgtcacatc cgccagtact 60
gcctacatgg agctcagcag cctgacaaat gaggactctg cggtctatta ctgt 114
<210> 112
<211> 114
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR3 "11B6E6" DNA
<400> 112
aattataatt cagctttcat gtccagactg agcatcagca aggacaactc caagagccaa 60
gttttcttaa aaatgttcag tctgcaaact gatgacacag ccatatatta ctgt 114
<210> 113
<211> 114
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR3 "14G12D7" DNA
<400> 113
agctacaacc catctctcaa aagtcgaatc tctatcactc gagacacatc caagaaccag 60
ttcttcctgc agttgaattc tgtgactact gaggacacag ccacatatta ctgt 114
<210> 114
<211> 114
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR3 "11A12C6" DNA
<400> 114
aattataatt cagctttcat gtccagactg agcatcagca gggacaactc caagagccag 60
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatatatta ctgt 114
<210> 115
<211> 114
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR3 "15E11B7" DNA
<400> 115
ttcaacaacc agaagttcaa ggacaaggcc acattgactg tagacaaatc ctcgagcaca 60
gcccacatgg agctcctgag cctgacatct gaggactctg cagtctatta ttgt 114
<210> 116
<211> 120
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR4 "18B4D5" DNA
<400> 116
tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagccaaaa caacagcccc atcggtctat 60
ccactggccc ctgtgtgtgg agatacaact ggctcctcgg tgactctagg atgcctggtc 120
<210> 117
<211> 64
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR4 "17F7B2" DNA
<400> 117
tggggccaag ggactctggt cactgtctct gcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat 60
tcca 64
<210> 118
<211> 126
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR4 "11B6E6" DNA
<400> 118
tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcagccaaaa caacagcccc atcggtctat 60
ccactggccc ctgtgtgtgg agatacaact ggctcctcgg tgactctagg atgcctggtc 120
aagtcc 126
<210> 119
<211> 64
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR4 "14G12D7" DNA
<400> 119
tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat 60
tcca 64
<210> 120
<211> 64
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR4 "11A12C6" DNA
<400> 120
tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat 60
tcca 64
<210> 121
<211> 127
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR4 "15E11B7" DNA
<400> 121
tggggccaag ggactctggt cactgtctct gaagccaaaa caacagcccc atcggtctat 60
ccactggccc ctgtgtgtgg agatacaact ggctcctcgg tgactctagg atgcctggtc 120
aagtcca 127
<210> 122
<211> 78
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR1 "18B4D5" DNA
<400> 122
gatattgtga tgacacagtc tccagcaatc atgtctgcat ctcttgggga acgggtcacc 60
atgacctgca ctgccagc 78
<210> 123
<211> 78
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR1 "17F7B2" DNA
<400> 123
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagt 78
<210> 124
<211> 78
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR1 "11B6E6" DNA
<400> 124
gatattgtgc tgacacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60
atgaggtgca aatccagt 78
<210> 125
<211> 78
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR1 "14G12D7" DNA
<400> 125
gaaattgtga tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga aaaggtcacc 60
atgacctgca gggccagc 78
<210> 126
<211> 78
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR1 "11A12C6" DNA
<400> 126
gatattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca aatccagt 78
<210> 127
<211> 78
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR1 "15E11B7" DNA
<400> 127
gatattgtgc tgacacagtc tacaacttcc ttagctgtgt ctctgggcca gagggccacc 60
atctcatgca gggccagc 78
<210> 128
<211> 51
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-FR2 "18B4D5" DNA
<400> 128
ttgtactggt accagcagaa gccaggatcc tcccccaaac tctggattta t 51
<210> 129
<211> 51
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR2 "17F7B2" DNA
<400> 129
ttacattggt acctgcagaa gccaggccag tctccaaagc tcctgatcta c 51
<210> 130
<211> 51
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR2 "11B6E6" DNA
<400> 130
ttggcttggt accagcagaa accagggcag tctcctaaac tgctgatcta c 51
<210> 131
<211> 51
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<400> 131
ttgcactggt accagcagaa gtcaggtgcc tcccccaaac tctggattta t 51
<210> 132
<211> 51
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR2 "11A12C6" DNA
<400> 132
ttggcttggt accagcagag accagggcag tctcctaaac tgctgatcta c 51
<210> 133
<211> 51
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR2 "15E11B7" DNA
<400> 133
atgcactggt accaacagaa accaggacag ccacccaaac tcctcatcta t 51
<210> 134
<211> 108
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR3 "18B4D5" DNA
<400> 134
aacctggctt ctggagtccc agctcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct 60
ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat gctgccactt attactgc 108
<210> 135
<211> 108
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR3 "17F7B2" DNA
<400> 135
aaccgatttt ctggggtccc agacaggttc agtggcagtg gatctgggac agatttcaca 60
ctcaagatca gcagagtgga ggctgaggat ctgggagttt atttctgc 108
<210> 136
<211> 108
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR3 "11B6E6" DNA
<400> 136
actagggaat ctggggtccc tgatcgcttc acaggcagtg gatctgggac agatttcact 60
ctcaccatca gcagtgtgca ggctgaagac ctggcagttt attactgc 108
<210> 137
<211> 108
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR3 "14G12D7" DNA
<400> 137
aacttggctt ctggagtccc tgctcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct 60
ctcacaatca gcagtgtgga ggctgaagat gctgccactt attactgc 108
<210> 138
<211> 108
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR3 "11A12C6" DNA
<400> 138
accagggaat ctggggtccc tgatcgcttc acaggcagtg gatctgggac agatttcact 60
ctcaccatcg gcagtgtgca ggctgaagac ctggcagttt attactgc 108
<210> 139
<211> 108
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR3 "15E11B7" DNA
<400> 139
aacctcgaat ctggggtccc tgccaggttc agtggcagtg ggtctgggac agacttcacc 60
ctcaacatcc atcctgtgga ggaggaggat gctgcaacct attactgt 108
<210> 140
<211> 60
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR4 "18B4D5" DNA
<400> 140
ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccacc 60
<210> 141
<211> 60
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR4 "17F7B2" DNA
<400> 141
ttcggctcgg ggacaaagtt ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccacc 60
<210> 142
<211> 61
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR4 "11B6E6" DNA
<400> 142
ttcggctcgg ggacaaagtt ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccacc 60
a 61
<210> 143
<211> 60
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR4 "14G12D7" DNA
<400> 143
ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccacc 60
<210> 144
<211> 60
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR4 "11A12C6" DNA
<400> 144
ttcggctcgg ggacaaagtt ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccacc 60
<210> 145
<211> 60
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-FR4 "15E11B7" DNA
<400> 145
ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccacc 60
<210> 146
<211> 18
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR3 "18B4D5" DNA
<400> 146
gcaagagggc tcgactac 18
<210> 147
<211> 33
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR3 "17F7B2" DNA
<400> 147
acaaagggct ataggtacga ctggtttgct tat 33
<210> 148
<211> 36
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR3 "11B6E6" DNA
<400> 148
gtgagagctc acggctatta ctttgctatg gactac 36
<210> 149
<211> 18
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR3 "14G12D7" DNA
<400> 149
acaagggggg ttgactac 18
<210> 150
<211> 36
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR3 "11A12C6" DNA
<400> 150
gtaagaggtg atggttacta ctggtacttc gatgtc 36
<210> 151
<211> 33
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR3 "15E11B7" DNA
<400> 151
ggaggggggg tacgaggggc ctggtttgct ttc 33
<210> 152
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR2 "18B4D5" DNA
<400> 152
ataagcttca gtggtagcac t 21
<210> 153
<211> 24
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR2 "17F7B2" DNA
<400> 153
ttttatcctg gaaaaagtga tact 24
<210> 154
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR2 "11B6E6" DNA
<400> 154
atatggactg gtggaggcac a 21
<210> 155
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR2 "14G12D7" DNA
<400> 155
ataatctaca gtggtaccac t 21
<210> 156
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR2 "11A12C6" DNA
<400> 156
atatggactg gtggaggcac a 21
<210> 157
<211> 24
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR2 "15E11B7" DNA
<400> 157
attaatcctt acaatgatta tact 24
<210> 158
<211> 27
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR1 "18B4D5" DNA
<400> 158
ggctactcaa tcaccagtga ttatacc 27
<210> 159
<211> 24
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR1 "17F7B2" DNA
<400> 159
ggctacagct ttaccagcta ctgg 24
<210> 160
<211> 24
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR1 "11B6E6" DNA
<400> 160
gggttctcat taaccagcta tgat 24
<210> 161
<211> 27
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR1 "14G12D7" DNA
<400> 161
ggctactcag tcaccagtga ttatgcc 27
<210> 162
<211> 24
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR1 "11A12C6" DNA
<400> 162
gggttctcat taaccagcta tgat 24
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> HC-CDR1 "15E11B7" DNA
<400> 163
ggttactcat ttactggcta cttt 24
<210> 164
<211> 27
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR3 "18B4D5" DNA
<400> 164
caccagttgc atcgttcccc gtggacg 27
<210> 165
<211> 27
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR3 "17F7B2" DNA
<400> 165
tctcaaaata cacatgttcc attcacg 27
<210> 166
<211> 24
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR3 "11B6E6" DNA
<400> 166
aagcaatctt ataatctatt cacg 24
<210> 167
<211> 27
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR3 "14G12D7" DNA
<400> 167
ctgcagttca gtggttaccc gttcacg 27
<210> 168
<211> 24
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR3 "11A12C6" DNA
<400> 168
aagcaatctt atagtctatt cacg 24
<210> 169
<211> 27
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR3 "15E11B7" DNA
<400> 169
cagcacagtg cggatcttcc ttacacg 27
<210> 170
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR1 "18B4D5" DNA
<400> 170
tcaagtataa gttccagtta c 21
<210> 171
<211> 33
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR1 "17F7B2" DNA
<400> 171
cagagccttg tacacagtaa tggaatcacc tat 33
<210> 172
<211> 37
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR1 "11B6E6" DNA
<400> 172
cagagtctgc tcaacagtag cacccgaaag aactact 37
<210> 173
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR1 "14G12D7" DNA
<400> 173
tcaagtgtac gttccagtta c 21
<210> 174
<211> 36
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR1 "11A12C6" DNA
<400> 174
cagagtctgt tcagcagtag tgcccgaaag aactac 36
<210> 175
<211> 30
<212> DNA
<213> 鼠 <小鼠，属>
<220>
<223> LC-CDR1 "15E11B7" DNA
<400> 175
aaaagtgtca gtacatctgg ctataattat 30

Claims (15)

1.特异性结合抗原CD123的抗体，其中所述抗体选自由AB1、AB2、AB3、AB4、AB5和AB6组成的组，所述抗体具有不超过9.5x10-9M的KD值、不超过9.0x10-4s-1的抗体解离速率koff，和至少7x104Ms-1的抗体结合速率kon，并且其中
AB1包含重链和轻链，并且其中所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:13具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且其中所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:14具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)；
AB2包含重链和轻链，并且其中所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:27具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:15具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且其中所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)；
AB3包含重链和轻链，并且其中所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:5具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且其中所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:6具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)；
AB4包含重链和轻链，并且其中所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:31具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且其中所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:32具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)；
AB5包含重链和轻链，并且其中所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:33具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且其中所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:34具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:22具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:10具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)；以及
AB6包含重链和轻链，并且其中所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:35具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:23具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且其中所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少85％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少85％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少85％同一性的互补决定区3(CDR3)。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中
AB1包含与氨基酸序列SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQID NO:86具有至少85％同一性的轻链，
并且其中所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:13具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，
并且其中所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
AB2包含与氨基酸序列SEQ ID NO:87具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQID NO:88具有至少85％同一性的轻链，
并且其中所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:27具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:15具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，
并且其中所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
AB3包含与氨基酸序列SEQ ID NO:89具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQID NO:90具有至少85％同一性的轻链，
并且其中所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，
并且其中所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
AB4包含与氨基酸序列SEQ ID NO:91具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQID NO:92具有至少85％同一性的轻链，
并且其中所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:31具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，
并且其中所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:32具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
AB5包含与氨基酸序列SEQ ID NO:93具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQID NO:94具有至少85％同一性的轻链，
并且其中所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:33具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，
并且其中所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:34具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:22具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；以及
AB6包含与氨基酸序列SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的重链和与氨基酸序列SEQID NO:96具有至少85％同一性的轻链，
并且其中所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:35具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:23具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，
并且其中所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)。
3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中AB1包含与氨基酸序列SEQ ID NO:85具有至少90％同一性的重链和与氨基酸序列SEQ ID NO:86具有至少90％同一性的轻链，
并且其中所述重链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:25组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:13组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成的互补决定区3(CDR3)，
并且其中所述轻链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:26组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成的互补决定区3(CDR3)；
AB2包含与氨基酸序列SEQ ID NO:87具有至少90％同一性的重链和与氨基酸序列SEQID NO:88具有至少90％同一性的轻链，
并且其中所述重链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:27组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:15组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:3组成的互补决定区3(CDR3)，
并且其中所述轻链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:28组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:16组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成的互补决定区3(CDR3)；
AB3包含与氨基酸序列SEQ ID NO:89具有至少90％同一性的重链和与氨基酸序列SEQID NO:90具有至少90％同一性的轻链，
并且其中所述重链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:29组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:17组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:5组成的互补决定区3(CDR3)，
并且其中所述轻链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:30组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:18组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成的互补决定区3(CDR3)；
AB4包含与氨基酸序列SEQ ID NO:91具有至少90％同一性的重链和与氨基酸序列SEQID NO:92具有至少90％同一性的轻链，
并且其中所述重链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:31组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:19组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:7组成的互补决定区3(CDR3)，
并且其中所述轻链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:32组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:20组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:8组成的互补决定区3(CDR3)；
AB5包含与氨基酸序列SEQ ID NO:93具有至少90％同一性的重链和与氨基酸序列SEQID NO:94具有至少90％同一性的轻链，
并且其中所述重链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:33组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:21组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:9组成的互补决定区3(CDR3)，
并且其中所述轻链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:34组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:22组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:10组成的互补决定区3(CDR3)；以及
AB6包含与氨基酸序列SEQ ID NO:95具有至少90％同一性的重链和与氨基酸序列SEQID NO:96具有至少90％同一性的轻链，
并且其中所述重链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:35组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:23组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:11组成的互补决定区3(CDR3)，
并且其中所述轻链包含由氨基酸序列SEQ ID NO:36组成的互补决定区1(CDR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:24组成的互补决定区2(CDR2)和由氨基酸序列SEQ ID NO:12组成的互补决定区3(CDR3)。
4.根据前述权利要求之一所述的抗体，
其中AB1的重链具有可变区，所述可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:37组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:38组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:39组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:40组成的第四框架区(FR4)，并且其中AB1的轻链具有可变区，所述可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:61组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:62组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:63组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:64组成的第四框架区(FR4)；
其中AB2的重链具有可变区，所述可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:41组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:42组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:43组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:44组成的第四框架区(FR4)，并且其中AB2的轻链具有可变区，所述可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:65组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:66组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:67组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:68组成的第四框架区(FR4)；
其中AB3的重链具有可变区，所述可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:45组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:46组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:47组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:48组成的第四框架区(FR4)，并且其中AB3的轻链具有可变区，所述可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:69组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:70组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:71组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:72组成的第四框架区(FR4)；
其中AB4的重链具有可变区，所述可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:49组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:50组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:51组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:52组成的第四框架区(FR4)，并且其中AB4的轻链具有可变区，所述可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:73组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:74组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:75组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:76组成的第四框架区(FR4)；
其中AB5的重链具有可变区，所述可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:53组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:54组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:55组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:56组成的第四框架区(FR4)，并且其中AB5的轻链具有可变区，所述可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:77组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:79组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成的第四框架区(FR4)；
其中AB6的重链具有可变区，所述可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:57组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:58组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:59组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:60组成的第四框架区(FR4)，并且其中AB6的轻链具有可变区，所述可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成的第一框架区(FR1)、由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成的第二框架区(FR2)、由氨基酸序列SEQ IDNO:83组成的第三框架区(FR3)和由氨基酸序列SEQ ID NO:84组成的第四框架区(FR4)。
5.一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中所述CAR包括包含抗CD123结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域和至少包含刺激结构域的胞内信号传导结构域，并且其中所述抗CD123结合结构域包含：
(i)重链和轻链，所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:13具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(ii)重链和轻链，所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:27具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:15具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(iii)重链和轻链，所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ IDNO:6具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(iv)重链和轻链，所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:31具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:32具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(v)重链和轻链，所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:33具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:34具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:22具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
或者
(vi)重链和轻链，所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:35具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:23具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)。
6.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中所述抗CD123结合结构域选自由抗体、Fv、scFv、Fab或其它抗体片段组成的组，优选scFv。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述胞内信号传导结构域是CD3-zeta(CD3ζ)，任选地包含选自由CD28、4.1BB、诱导型T细胞共刺激物(ICOS)、OX-40或其组合组成的组中的共刺激结构域。
8.一种分离的多肽分子，其由权利要求5至7中任一项所述的核酸分子编码。
9.一种分离的嵌合抗原受体(CAR)分子，其包含包括抗CD123结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域和至少包含刺激结构域的胞内信号传导结构域，并且其中所述抗CD123结合结构域包含：
(i)重链和轻链，所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:25具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:13具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:26具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(ii)重链和轻链，所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:27具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:15具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:28具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(iii)重链和轻链，所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:29具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:17具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:18具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ IDNO:6具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(iv)重链和轻链，所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:31具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:19具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:32具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:20具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
(v)重链和轻链，所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:33具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:21具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:34具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:22具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)；
或者
(vi)重链和轻链，所述重链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:35具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:23具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)，并且所述轻链包含与氨基酸序列SEQ ID NO:36具有至少90％同一性的互补决定区1(CDR1)、与氨基酸序列SEQ ID NO:24具有至少90％同一性的互补决定区2(CDR2)和与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少90％同一性的互补决定区3(CDR3)。
10.一种分离的嵌合抗原受体(CAR)分子，其中所述CAR如权利要求6或7中任一项所定义。
11.一种表达载体，其包含如权利要求5至7中任一项所定义的核酸分子，其中所述载体选自由DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体组成的组。
12.一种工程化的免疫细胞，其包含权利要求5至7中任一项所述的核酸分子或权利要求11所述的载体。
13.根据权利要求12所述的细胞，其用作药物。
14.根据权利要求12或13所述的细胞，其用于治疗哺乳动物优选人类中的增殖性疾病，其中所述增殖性疾病是与CD123过度表达相关的疾病，优选为母细胞性浆细胞样树突细胞瘤(BPDCN)。
15.一种药物组合物，其包含根据权利要求12至14中任一项所述的工程化的免疫细胞和药用赋形剂。
CN202080058104.1A 2019-06-21 2020-06-22 抗cd123抗体、抗cd123嵌合抗原受体和抗cd123嵌合抗原受体t细胞 Pending CN114258402A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19305816.1 2019-06-21
EP19305816.1A EP3753954A1 (en) 2019-06-21 2019-06-21 Anti-cd123 antibodies, anti-cd123 chimeric antigen receptors and anti-cd123 chimeric antigen receptors t cells
PCT/EP2020/067303 WO2020254682A1 (en) 2019-06-21 2020-06-22 Anti-cd123 antibodies, anti-cd123 chimeric antigen receptors and anti-cd123 chimeric antigen receptors t cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114258402A true CN114258402A (zh) 2022-03-29

Family

ID=67253836

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080058104.1A Pending CN114258402A (zh) 2019-06-21 2020-06-22 抗cd123抗体、抗cd123嵌合抗原受体和抗cd123嵌合抗原受体t细胞

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220348668A1 (zh)
EP (1) EP3753954A1 (zh)
JP (1) JP2022538092A (zh)
CN (1) CN114258402A (zh)
AU (1) AU2020294953A1 (zh)
CA (1) CA3144117A1 (zh)
IL (1) IL289158A (zh)
WO (1) WO2020254682A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114907485B (zh) * 2021-02-08 2024-04-26 浙江大学 一种以内源性蛋白质分子替代单结构域抗体的嵌合抗原受体

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108409840A (zh) * 2017-05-18 2018-08-17 重庆精准生物技术有限公司 抗cd123单链抗体及其组合的嵌合抗原受体和应用
WO2019018538A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. RECOMBINANT ANTIBODIES BINDING TO CD123
WO2019072824A1 (en) * 2017-10-09 2019-04-18 Cellectis IMPROVED ANTI-CD123 CAR IN UNIVERSAL MODIFIED IMMUNE T LYMPHOCYTES

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
PT2195023T (pt) 2007-08-29 2018-06-08 Sanofi Sa Anticorpos anti-cxcr5 humanizados, seus derivados e suas utilizações
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108409840A (zh) * 2017-05-18 2018-08-17 重庆精准生物技术有限公司 抗cd123单链抗体及其组合的嵌合抗原受体和应用
WO2019018538A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. RECOMBINANT ANTIBODIES BINDING TO CD123
WO2019072824A1 (en) * 2017-10-09 2019-04-18 Cellectis IMPROVED ANTI-CD123 CAR IN UNIVERSAL MODIFIED IMMUNE T LYMPHOCYTES

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TIANYU CAI ET AL: "Pre-Clinical Studies of Anti-CD123 CAR-T Cells for the Treatment of Blastic Plasmacytoid Dendritic Cell Neoplasm (BPDCN)", BLOOD, vol. 128, no. 22 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020254682A1 (en) 2020-12-24
AU2020294953A1 (en) 2022-02-03
IL289158A (en) 2022-02-01
US20220348668A1 (en) 2022-11-03
EP3753954A1 (en) 2020-12-23
JP2022538092A (ja) 2022-08-31
CA3144117A1 (en) 2020-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7287963B2 (ja) 抗ｔｉｇｉｔ抗体並びに治療剤及び診断剤としてのその使用
JP6968872B2 (ja) 抗Ｔｉｍ−３抗体
CN107973854B (zh) Pdl1单克隆抗体及其应用
JP7361610B2 (ja) 抗ｐｄ－ｌ１抗体及びその使用
US20210188969A1 (en) Antibodies that bind interleukin-2 and uses thereof
CN110856446A (zh) 抗pd-l1抗体及其用途
WO2023125888A1 (zh) 一种gprc5d抗体及其应用
KR20200021069A (ko) Cd38 조정 항체
CN113980138A (zh) EphA2嵌合抗原受体以及其用途
CN113501879B (zh) 一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法
CN114258402A (zh) 抗cd123抗体、抗cd123嵌合抗原受体和抗cd123嵌合抗原受体t细胞
EP4378954A1 (en) Anti-pvrig/anti-tigit bispecific antibody and application
US20230312709A1 (en) Antibody targeting CD47 and application thereof
US20220324997A1 (en) Ssea-4 binding members
CA3174202A1 (en) Combination therapy involving anti-cd39 antibodies and adoptive cell therapy
CN114075283A (zh) 结合人cd38的抗体、其制备方法和用途
EP4353746A1 (en) Anti-pd-1 humanized antibody or antigen-binding fragment thereof and application thereof
WO2023182530A1 (ja) 抗ｃｄ３９抗体
McComb et al. Discovery and preclinical development of a therapeutically active nanobody-based chimeric antigen receptor targeting human CD22
CN116077645A (zh) 抗-pd-1抗体及其在制备治疗非小细胞肺癌患者的药物中的用途
JP2024521928A (ja) Ｂ７ｈ３モノクローナル抗体群及びその医薬用途
CN116396388A (zh) 一种抗b7-h3抗体及其应用
CN117025541A (zh) 一种靶向b7-h3并共表达细胞因子和趋化因子的car-t细胞及其用途
CN112079926A (zh) 抗人ctla4单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination