CN105175544A - 一种抗pd-1人源化单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗PD-1人源化单克隆抗体及其应用，属于分子免疫学技术领域。本发明所提供的抗PD-1人源化单克隆抗体，包含轻链和重链。其中，轻链的氨基酸序列如SEQ？IDNO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.4或SEQ？ID？NO.6所示。同时，本发明还提供了编码轻链和重链的核苷酸序列。本发明所提供的抗PD-1人源化单克隆抗体与人PD-1蛋白具有极高亲和力，并能阻断PD-1/PD-L1结合，促进T细胞增殖和IFN-γ分泌。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗PD-1人源化单克隆抗体及其应用，属于分子免疫学技术领域。
背景技术
PD-1，又称为程序性死亡受体1，为CD28超家族成员,其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来，由日本京都大学本庶佑教授于1992年发现。PD-1蛋白在活化的T细胞，B细胞等都有表达。
PD-1的受体PD-L1，又叫细胞程式死亡-配体1或表面抗原分化簇274(clusterofdifferentiation274，CD274)或B7同源体(B7homolog1，B7-H1)，是人类体内的一种蛋白质，由CD274基因编码。PD-L1是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白，据信其在某些特殊情形(例如怀孕、组织移植、自体免疫疾病，以及诸如肝炎等某些疾病)下，免疫系统的抑制有关。
正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性CD8+T细胞的增生。细胞程序化死亡受体-1(PD-1)与细胞程式死亡-配体1(PD-L1)结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+T细胞的增生，而且PD-1还可以借由调节Bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性T细胞的聚积。
PD-1在免疫调节中起到关键作用，它可以负调节T细胞的活化过程，PD-1介导的负调节作用可减少促感染过程引起的组织损伤等，但是阻断或抑制PD-1的负调节作用可导致自身免疫性疾病。通过阻断PD-1与PD-L1结合，可以有效阻止T淋巴细胞抑制信号，激活杀伤性T细胞或者效应T细胞。使用单克隆抗体阻断PD-1功能，可以介导T细胞活化，进而利用激活的T细胞和相应的细胞因子杀伤肿瘤细胞，从而成为癌症免疫疗法的重要治疗手段。
PD-1单克隆抗体药物具有广泛的应用前景和惊人的肿瘤治疗效果，可用于多个类型肿瘤的治疗，主要包括：非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、肝癌、血液癌症、三阴性乳腺癌、胃癌、胰腺癌等。因此，开发与PD-1具有高亲和力的抗体药物，用于癌症的免疫治疗，使其具有更好的治疗效果，更低的毒副作用，具有非常重要的意义。然而，目前现有的PD-1抗体药物的亲和力较低，尚缺少一种具有高亲和力的PD-1抗体。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种抗PD-1人源化单克隆抗体，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种抗PD-1人源化单克隆抗体，包含轻链和重链。其中，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示。
优选地，所述抗PD-1人源化单克隆抗体是抗PD-1人源化单克隆抗体AbB7，包含轻链和重链，其中，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
优选地，所述抗PD-1人源化单克隆抗体是抗PD-1人源化单克隆抗体AbB8，包含轻链和重链，其中，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。
本发明的另一目的在于提供了一种编码所述单克隆抗体的基因。其中，编码轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码重链的核苷酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.5所示。
优选地，所述核苷酸序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.3分别编码抗PD-1人源化单克隆抗体AbB7的轻链和重链。
优选地，所述核苷酸序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.5分别编码抗PD-1人源化单克隆抗体AbB8的轻链和重链。
所述任一抗体可以在制备预防、诊断、治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
所述任一抗体可以再在制备预防、诊断、治疗或辅助治疗肿瘤的药物原料中的应用。具体地，在制备PD-1通路阻断剂中应用。
更具体地，本发明所述的单克隆抗体或者单克隆抗体偶联物在制备如下药物中的用途：高亲和力结合PD-1的药物、阻断PD-1与PDL1结合的药物、激活T淋巴细胞的药物、提高T淋巴细胞中IL-2、IFN-γ表达的药物。
更具体地，所述肿瘤选自肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肾瘤、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、大肠癌、鼻咽癌、脑肿瘤、宫颈癌、血癌、骨癌、淋巴癌、胰脏癌等。
本发明获得的有益效果如下：
本发明针对研制的PD-1人源化抗体，利用噬菌体展示技术进行抗体亲和力成熟筛选，获得了具有极高亲和力的克隆，可以更有效的发挥PD-1功能的作用。
本发明新发现了一种能阻断PD-1功能的人源化抗体AbB7和AbB8及其编码基因，人源化抗体AbB7和AbB8均能够与PD-1抗原特异性结合，SPR方法测定人源化抗体AbB7亲和力为0.044nM，人源化抗体AbB8亲和力为0.076nM，其亲和力比美国百时美施贵宝公司开发的PD-1抗体Nivolumab提高了5倍以上。本发明的人源化抗体AbB7和AbB8作为PD-1/PDL-1通路的阻断剂，可以激活T淋巴细胞，从而成为肿瘤免疫治疗新药物中关键的组分。
附图说明
图1为人PD-1抗原SDS-PAGE电泳检测结果；
(其中，1，PD-1-Fc抗原融合蛋白；2，PD-1-Fc肠激酶酶切产物；3，PD-1胞外区抗原)。
图2为人源化抗体AbB7和AbB8SDS-PAGE电泳检测结果。
图3为SPR方法测定人源化抗体AbB7和AbB8亲和力的结果；
(其中，A为AbB7的测定结果；B为AbB8的测定结果)。
图4为人源化抗体AbB7和AbB8细胞EC50测定结果；
(其中，A为AbB7的测定结果；B为AbB8的测定结果)。
图5为人源化抗体AbB7和AbB8诱导T细胞IL2分泌结果。
图6为人源化抗体AbB7和AbB8诱导T细胞IFN-γ分泌。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
实施例1PD-1抗原的制备
从南京金斯瑞公司合成人的PD-1的cDNA，GeneID为5133，cDNAID为NM_005018.2。在合成的胞外区PD-1基因后加上人源IgG1Fc标签，并在两端引入XbaI，BamHI两个限制性酶切位点连接到pTT5表达质粒，经测序验证正确。测序完的质粒转染Trans10(购自北京全式金生物技术有限公司)，挑取单克隆，接种到1升LB液体培养基，至OD600为1时，离心收集菌体，用质粒大提试剂盒(购自Qiagen公司)提取质粒。
将测序鉴定正确的表达载体转染293F细胞(购自Invitrogen公司)，37度，5％CO2，130rpm/min培养7天后，离心收集上清。将上清于4000rpm离心10min，再用0.45μm滤膜过滤；滤液加入400mMNaCl；调整PH至8.0。样品经0.2μm滤膜再次过滤后，上样至已用PBS(137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,2mMKH2PO4，pH7.4)平衡好的5mlHiTrapProteinA柱；待样品上完后用PBS冲洗，流速5ml/min，紫外监测为水平。BufferB(1MGlycine，pH3.5)洗脱，流速1ml/min，收集流出峰用Tris中和至pH7.5。用超滤浓缩管浓缩洗脱峰换液至PBS中，由此得到PD-1-Fc抗原融合蛋白。将PD-1-Fc根据说明书用肠激酶(购自上海近岸蛋白科技有限公司)进行酶切，置于37度12小时，酶切后产物过ProteinA柱用于吸附切除的Fc标签，收集流出液，即为PD-1胞外区抗原。PD-1-Fc抗原融合蛋白和PD-1胞外区抗原SDS-PAGE电泳检测结果见图1。
实施例2PD-1抗体AbB7/AbB8的表达与纯化
人工合成抗体AbB7的轻链的cDNA(其序列如SEQIDNO.1所示)，人工合成抗体AbB7重链的cDNA(其序列如SEQIDNO.3所示)，人工合成抗体AbB8重链的cDNA(其序列如SEQIDNO.5所示)，将合成的cDNA分别克隆到pTT5质粒中，并通过测序确定质粒构建正确。
将测序鉴定正确的AbB7/AbB8重链表达载体和轻链表达载体(1:1)共转染到293F细胞中，37度，5％CO2，130rpm/min培养7天后，离心收集上清。将上清4000rpm离心10min，并用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；滤液加入400mMNaCl；调整PH至8.0。样品经0.2μm滤膜再次过滤后，上样至已用PBS(137mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,2mMKH2PO4，pH7.4)平衡好的5mlHiTrapProteinA柱；待样品上完后用PBS冲洗，流速5ml/min，紫外监测为水平。BufferB(1MGlycine，pH3.5)洗脱，流速1ml/min，收集流出峰用Tris中和至pH7.5。用超滤浓缩管浓缩洗脱峰，用脱盐柱换液至PBS中，由此得到抗体AbB7/AbB8蛋白。抗体AbB7/AbB8的SDS-PAGE电泳检测结果见图2。
实施例3SPR方法测定PD-1人源化抗体AbB7/AbB8的亲和力Kd
通过Biacore3000仪器(购自GE公司)分析抗PD-1抗体AbB7和/AbB8的表征亲和力及结合动力学。利用生物素标记试剂盒(Pierce公司)将重组人PD1胞外区蛋白与生物素共价偶联，然后流过亲和素标记的SA芯片(购自GE公司)，使反应值RU达到450左右。通过将抗体以0.0133、0.0266、0.0532、0.1064、0.2128μM的浓度和50μl/min的流速在PBS缓冲液中流动而测量结合。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学10分钟。使用BIAevaluation软件将结合和解离曲线拟合至1∶1朗格缪尔(Langmuir)结合模型。为了使亲合力在评估结合常数时的作用最小化，仅使用对应于结合和解离期的起始数据段来进行拟合，其中一次实验结果见图3。重复两次实验测定的KD、kon和koff值显示于表1。
表1SPR测定AbB7和AbB8亲和力
实施例4抗体AbB7/AbB8半最大效应浓度的测定
构建PD-1慢病毒载体(购自lifetechnology公司)，将慢病毒载体与3种包装质粒(购自lifetechnology公司)，共同转染293T细胞，48小时及72小时后，收集上清即可获得人PD-1的慢病毒。
以表达人PD-1蛋白的慢病毒感染293F细胞，使用抗性筛选一个星期，得到稳定表达PD-1的293F细胞系。用带FITC标记的PD-1阳性抗体(购自Abcom)，验证筛选获得表达人PD-1的293F细胞。
分别取100万293F细胞，加入25nmol、5nmol、1nmol三种不同浓度AbB7和AbB8抗体，以及Isotype对照抗体，4度孵育1小时，加入抗人IgG1抗体，继续孵育1小时，用PBS洗三次，通过FACS流式检测。通过测定MFI(平均荧光强度)，即可测定抗体AbB7/AbB8半最大效应浓度(EC50)，如图4所示。AbB7的EC50数值为1.5nm，AbB8的EC50数值为1.2nm。
实施例5人源化抗体AbB7和AbB8体外诱导T细胞分泌IL2
采用Ficoll离心法(购自GE公司)和CD4+T细胞富集柱(购自R&DSystems公司)，制备新鲜的的PBMC，纯化人T细胞。将细胞铺板至96孔平底板中，培养过夜后，加入25nmol、5nmol、1nmol三种不同浓度AbB7和AbB8抗体及80ng/ml的破伤风毒素(TT)，加入25nmol、5nmol、1nmol三种浓度的同种型对照抗体作为阴性对照，培养3天后收集上清液，用Luminex仪(购自LifeTechnology公司)和细胞因子IL2检测试剂盒(购自BDBiosciences公司)检测上清IL2的分泌水平。结果(见图5)显示人源化抗体AbB7和AbB8均可有效刺激T细胞的功能，分泌IL2，且与抗体浓度有关，而同型对照抗体不能促进T细胞增殖和IL2分泌。
实施例6人源化抗体AbB7和AbB8体外诱导T细胞分泌IFN-γ
用Ficoll离心法(购自GE公司)和CD4+T细胞富集柱(购自R&DSystems公司)，制备新鲜的的PBMC，纯化人T细胞。使用MiltenyiCD14单核细胞纯化试剂盒纯化单核细胞，并在单核细胞与GM-CSF和IL-4(均购自PeproTech公司)一起培养7天后生成DC细胞。将细胞铺板至96孔平底板中，培养过夜后，每份培养物在200μl的总体积中包含10e5个纯化的T细胞和10e4个树突细胞。加入25nmol、5nmol、1nmol三种不同浓度AbB7和AbB8抗体，加入25nmol、5nmol、1nmol三种浓度的同种型对照抗体作为阴性对照。将细胞于37℃培养5天。5天后，从每份培养物中取出100μl培养基用于细胞因子IFN-γ测量。利用OptEIAELISA试剂盒(购自BDBiosciences公司)来测定IFN-γ的水平。结果(如图6所示)显示人源化抗体AbB7和AbB8均可有效刺激T细胞的功能分泌细胞因子IFN-γ，且与浓度有关，而同型对照抗体不能促进T细胞增殖和IFN-γ分泌。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种抗PD-1人源化单克隆抗体，包含轻链和重链，其特征在于，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.6所示。
2.根据权利要求1所述一种抗PD-1人源化单克隆抗体，其特征在于，是抗PD-1人源化单克隆抗体AbB7，包含轻链和重链，其中，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
3.根据权利要求1所述一种抗PD-1人源化单克隆抗体，其特征在于，是抗PD-1人源化单克隆抗体AbB8，包含轻链和重链，其中，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，重链的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。
4.一种编码权利要求1单克隆抗体的基因，其特征在于，编码轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码重链的核苷酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.5所示。
5.根据权利要求4所述基因，其特征在于，所述核苷酸序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.3分别编码抗PD-1人源化单克隆抗体AbB7的轻链和重链。
6.根据权利要求4所述基因，其特征在于，所述核苷酸序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.5分别编码抗PD-1人源化单克隆抗体AbB8的轻链和重链。
7.权利要求1-3所述任一抗体在制备预防、诊断、治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
8.权利要求1-3所述任一抗体在制备预防、诊断、治疗或辅助治疗肿瘤的药物原料中的应用。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，在制备PD-1通路阻断剂中应用。
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Denomination of invention: A humanized monoclonal antibody against PD-1 and its application Granted publication date: 20210409 Pledgee: Anhui Xingtai Financial Leasing Co.,Ltd. Pledgor: ANHUI RUBIOX-VISION BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980023575 |
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