TWI831789B - 二聚體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種由兩條多肽鏈形成的二聚體，所述兩條多肽鏈中的每條均包括抗體Fc亞基，其中所述二聚體包括兩個以上免疫球蛋白單可變結構域(ISVD)，至少一個ISVD為PD-L1特異性的，並且至少一個ISVD為CTLA4特異性的。
Description
本申請涉及生物醫藥領域，具體的涉及一種二聚體及其用途。
阻斷PD1/PD-L1相互作用可導致腫瘤特異性T細胞免疫性增強，進而將導致免疫系統清除腫瘤細胞。程序性死亡配體-1(PD-L1)在抗原呈遞細胞以及許多人類癌細胞上表達，並且當結合PD-1時可下調T細胞活化和細胞因子分泌。
類似地，消除免疫調節分子比如細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA4)代表一種藉由控制免疫系統來誘導腫瘤退化和延長患者生存期的有前景的新策略。已經開發了抗CTLA4抗體(比如易普利姆單抗(ipilimumab))，且市售用於治療癌症。
最近，有報道使用PD1/PD-L1抗體和CTLA4抗體單獨靜脈給藥的同步治療。然而，這些同步療法存在大量缺點。例如，患者不便、疼痛增加及製備和表徵多種製劑的困難增加。另外，欠佳療效和安全性問題也已被報道。因此，對有前景的抗癌新製劑、尤其是能夠同時作用於多個靶點的製劑的醫學需求尚未得到滿足。
本申請提供一種包含兩條多肽鏈單體的二聚體，所述兩條多肽鏈單體中的每一條包含抗體Fc亞基。所述二聚體包括兩個以上免疫球蛋白單可變結構域(ISVD)，至少一個所述ISVD是PD-L1特異性的，並且至少一個所述ISVD是CTLA4特異性的。本發明還提供一種包括所述二聚體的免疫綴合物(immunoconjugate)、所述二聚體的製備方法、以及包括所述二聚體的藥物組合物及所述二聚體和所述藥物組合物的用途。所述二聚體可以用於治療有需要的受試者的疾病，或者製備用於治療疾病比如癌症的藥物。
在一個方面，本申請提供一種二聚體，所述二聚體由兩條多肽鏈形成，所述兩條多肽鏈中的每一條包含一個抗體Fc亞基。所述二聚體包括兩個以上免疫球蛋白單可變結構域(ISVD)，至少一個所述ISVD為PD-L1特異性的，且至少一個所述ISVD為CTLA4特異性的。
在某些實施方式中，所述兩條多肽鏈中的至少一條均包括一個PD-L1特異性的ISVD和一個CTLA4特異性的ISVD。
在某些實施方式中，所述兩條多肽鏈中的每條均包括一個PD-L1特異性的ISVD和一個CTLA4特異性的ISVD。
在某些實施方式中，對於所述兩條多肽鏈中的一條或兩條，所述PD-L1特異性的ISVD融合至所述CTLA4特異性的ISVD，視需要地藉由一個連接子。
在某些實施方式中，對於所述兩條多肽鏈的一條或兩條：所述PD-L1特異性的ISVD融合至所述CTLA4特異性的ISVD，視需要地藉由一個連接子；且所述CTLA4特異性的ISVD融合至所述抗體Fc亞基，視需要地藉由一個連接子。
在某些實施方式中，對於所述兩條多肽鏈中的一條或兩條：所述PD-L1特異性的ISVD的C末端融合至所述CTLA4特異性的ISVD的N末端， 視需要地藉由一個連接子；且所述CTLA4特異性的ISVD的C末端融合至所述抗體Fc亞基的N末端，視需要地藉由一個連接子。
在某些實施方式中，對於所述兩條多肽鏈中的一條或兩條：所述PD-L1特異性的ISVD融合至所述CTLA4特異性的ISVD，視需要地藉由一個連接子；且所述PD-L1特異性的ISVD融合至所述抗體Fc亞基，視需要地藉由一個連接子。
在某些實施方式中，對於所述兩條多肽鏈中的一條或兩條：所述CTLA4特異性的ISVD的C末端融合至所述PD-L1特異性的ISVD的N末端，視需要地藉由一個連接子；且所述PD-L1特異性的ISVD的C末端融合至所述抗體Fc亞基的N末端，視需要地藉由一個連接子。
在某些實施方式中，所述抗體Fc亞基來源於IgG Fc亞基，比如為人IgG1。所述抗體Fc亞基可包含SEQ ID NO：35、38和39中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，所述PD-L1特異性的ISVD能夠結合人PD-L1的N-末端IgV結構域。
在某些實施方式中，所述PD-L1特異性的ISVD能夠結合人PD-L1的殘基I54、Y56、E58、Q66和/或R113。
在某些實施方式中，所述PD-L1特異性的ISVD能夠結合人PD-L1的殘基D61、N63、V68、M115、S117、Y123和/或R125。
在某些實施方式中，所述PD-L1特異性的ISVD能夠結合人PD-L1的構象表位，所述構象表位包括所述人PD-L1的殘基I54、Y56、E58、Q66和R113。
在某些實施方式中，所述PD-L1特異性的ISVD能夠結合人PD-L1 N-末端IgV結構域的構象表位，所述構象表位包括所述人PD-L1 N-末端IgV 結構域的殘基I54、Y56、E58、Q66、R113、D61、N63、V68、M115、S117、Y123和R125。
在某些實施方式中，所述人PD-L1 N-末端IgV域包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述PD-L1特異性的ISVD能夠阻斷PD-L1與PD1的結合。
在某些實施方案中，所述PD-L1特異性的ISVD能夠阻斷PD-L1與CD80的結合。
在某些實施方案中，所述PD-L1特異性的ISVD與對照抗PD-L1抗體交叉競爭結合PD-L1，所述對照抗PD-L1抗體包括重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述對照抗PD-L1抗體包括重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO：5和9中任一個所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述對照抗PD-L1抗體包括重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述對照抗PD-L1抗體包括重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO：3和7中任一個所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述對照抗PD-L1抗體包括重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO：4、8和11中任一個所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述對照抗PD-L1抗體為PD-L1特異性的ISVD。在某些實施方案中，所述對照抗PD-L1抗體包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：6、10、12、13、14和15中任一個所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述對照抗PD-L1抗體包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述PD-L1特異性的ISVD包括重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述PD-L1特 異性的ISVD包括重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO：5和9中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述PD-L1特異性的ISVD包括重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述PD-L1特異性的ISVD包括重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO：3和7中任一項所示的胺基酸序列的。
在某些實施方案中，所述PD-L1特異性的ISVD包括重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO：4、8和11中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述PD-L1特異性的ISVD包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：6、10、12、13、14和15中任一項所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述PD-L1特異性的ISVD包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列的。
在某些實施方案中，所述CTLA4特異性的ISVD能夠特異性結合人CTLA4。
在某些實施方案中，所述CTLA4特異性的ISVD能夠阻斷CTLA4與CD80的結合。
在某些實施方案中，所述CTLA4特異性的ISVD能夠阻斷CTLA4與CD86的結合。
在某些實施方案中，所述CTLA4特異性的ISVD與對照抗CTLA4抗體交叉競爭結合CTLA4，所述對照抗CTLA4抗體包括重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述對照抗CTLA4抗體包括重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述對照抗CTLA4抗體包括重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述對照抗CTLA4抗體包括重鏈CDR2，其 包含SEQ ID NO：18、21和23中任一項所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述對照抗CTLA4抗體為CTLA4特異性的ISVD。在某些實施方案中，所述對照抗CTLA4抗體包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：20、22和24-32中任一項所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述對照抗CTLA4抗體包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述CTLA4特異性的ISVD包括重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述CTLA4特異性的ISVD包括重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述CTLA4特異性的ISVD包括重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述CTLA4特異性的ISVD包括重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO：18、21和23中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述CTLA4特異性的ISVD包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：20、22和24-32中任一項所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述CTLA4特異性的ISVD包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，本申請所述的二聚體為同二聚體。
在某些實施方案中，本申請所述的二聚體包括的所述連接子包含SEQ ID NO：33-34中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述二聚體的所述兩條多肽鏈的一條或兩條包含SEQ ID NO：40-43、46、48和50中任一項所示的胺基酸序列。在某些實施方案中，所屬二聚體的所述兩條多肽鏈的一條或兩條包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，本申請所述的二聚體能夠阻斷PD-L1與PD-1的結合。
在某些實施方案中，本申請所述的二聚體能夠阻斷PD-L1與CD80的結合。
在某些實施方案中，本申請所述的二聚體能夠阻斷CTLA4與CD80的結合。
在某些實施方案中，本申請所述的二聚體能夠阻斷CTLA4與CD86的結合。
在另一個方面，本申請提供一種免疫綴合物，包含本申請所述的二聚體。
在另一個方面，本申請提供一種或多種分離的核酸，其編碼本申請所述的二聚體。
在另一個方面，本申請提供一種載體或多種載體，其包含本申請所述的一種分離的核酸或多種分離的核酸。
在另一個方面，本申請提供分離的宿主細胞，其包含本申請所述的分離的核酸或本申請所述的載體或多種載體。
在另一個方面，本申請提供一種用於產生本申請所述的二聚體或所述免疫綴合物的方法。所述方法可以包括：(i)在實現所述二聚體的表達和形成的條件下，培養本申請所述的宿主細胞，和(ii)收集形成的二聚體。
在另一個方面，本申請提供一種藥物組合物，包含有效量的本申請所述的二聚體、本申請所述的免疫綴合物，以及視需要地藥學上可接受的賦形劑。
在另一個方面，本申請提供本申請所述的二聚體、本申請所述的免疫綴合物，或本申請所述的藥物組合物，用於治療有需要的受試者的疾病。所述疾病可以是癌症。
在另一個方面，本申請提供本申請所述的二聚體或本申請所述的免疫綴合物在製備用於治療有需要的受試者的癌症的藥物中的用途。
在另一個方面，本申請提供一種用於治療有需要的受試者的癌症的方法，包括向所述受試者施用有效量的本申請所述的二聚體或本申請所述的免疫綴合物。
在另一個方面，本申請提供一種阻斷CD80和/或CD86與CTLA4結合的方法，包括施用本申請所述的二聚體或免疫綴合物。
在另一個方面，本申請提供一種阻斷PD1和/或CD80與PD-L1結合的方法，包括施用本申請所述的二聚體或免疫綴合物。
在另一個方面，本申請提供一種刺激免疫細胞分泌IL-2的方法，包括向所述免疫細胞施用本申請所述的二聚體或免疫綴合物。
在另一個方面，本申請提供一種增強受試者免疫應答的方法，包括向所述受試者施用本申請所述的二聚體或免疫綴合物。
本領域技術人員能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如本領域技術人員將認識到的，本申請的內容使得本領域技術人員能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
藉由援引併入
將本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請均以引用的方式併入本文，引用程度如同每篇單獨的出版物、專利或專利申請均明確且單獨地被指出併入本文作為參考一樣。
本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明如下：第1圖顯示的是本申請所述二聚體的實例。
第2A圖至第2F圖顯示的是本申請所述二聚體與CTLA4或PD-L1的結合。
第2G圖至第2H圖顯示的是本申請所述二聚體與表達PD-L1或CTLA4的細胞的結合。
第3A圖至第3B圖顯示的是本申請所述二聚體在阻斷PD1與PD-L1結合中的作用。
第3C圖顯示的是本申請所述二聚體在阻斷CD80與PD-L1結合中的作用。
第3D圖至第3E圖顯示的是本申請所述二聚體在阻斷CTLA4與CD80結合中的作用。
第3F圖顯示的是本申請所述二聚體在阻斷CTLA4與CD86結合中的作用。
第4A圖至第4H圖顯示的是本發明二聚體刺激PBMC。
第5A圖至第5B圖顯示的是本申請所述二聚體在體內抑制腫瘤生長。
第6圖顯示的是本申請所述二聚體的體內pK。
第7圖顯示的是本申請所述二聚體在體內被腫瘤攝取。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
雖然本文已經顯示和描述了本發明的各種實施方案，但是對本領域技術人員顯而易見的是提供這樣的實施方案僅僅作為舉例。在沒有背離本發明的情況下，本領域技術人員可以想到大量變化、改變和取代。應當理解，可以使用本文描述的本發明實施方案的各種替代。
如本文使用的術語“免疫綴合物”通常指由一種或多種免疫球蛋白相關分子或其片段與一種或多種另外的分子綴合形成的蛋白質分子。所述另外的分子可以與免疫球蛋白相關分子或其片段相同。在某些情況下，所述另外的分子可以與免疫球蛋白相關分子或其片段不同。所述一種或多種另外的分子可以彼此相同或可以彼此不同。例如，所述另外的分子可以是靶點結合部分和/或效應部分，比如毒素或信號分子。
如本文使用的術語“同源性”、“同源的”或“序列同一性”通常指兩個或多個多核苷酸序列之間或兩個或多個多肽序列之間的序列相似性或可互換性。當使用程序(例如Emboss Needle或BestFit)測定兩個不同的胺基酸序列之間的序列同一性、相似性或同源性時，可以使用默認設置，或者可以選擇合適的評分矩陣比如blosum45或blosum80以最優化同一性、相似性或同源性得分。在某些實施方案中，同源的多核苷酸是在嚴格條件下雜交且與對照序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至 少98%、至少99%和甚至100%序列同一性的核苷酸。當最優地比對可比較長度的序列時，同源的多肽可以彼此具有至少80%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少98%、或至少99%的序列同一性。
在本文所述的多肽序列的上下文中使用的術語“序列同一性百分比(%)”通常指比對序列和引入空位(如有必要)以獲得最大百分比序列同一性並且不考慮作為序列同一性的部分的任何保守取代時，查詢序列中與第二參考多肽序列或其部分的胺基酸殘基或核苷酸相同的胺基酸殘基或核苷酸的百分比。用於測定胺基酸序列同一性百分比的比對可以以本領域技術人員的能力範圍內的各種方式實現，例如使用公眾可獲得的計算機軟件比如BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可確定用於測定比對的合適參數，包括在被比較的序列的全長上實現最大比對所需的任何算法。可以在整個限定的多肽/多核苷酸序列的長度上測量，或者可以在更短的長度上測量，例如，在取自更大的限定的多肽/多核苷酸序列的片段的長度上測量百分比同一性。應當理解，由本文中、表、圖或序列表中所示的序列支持的任何片段長度都可用於描述可在其上測量百分比同一性的長度。
本文使用的術語“雙特異性抗體”通常指具有能夠結合在單個抗原或兩個不同抗原上的兩個不同的表位的抗體。
本文使用的術語“PD-L1”通常指程序性死亡配體1蛋白、其功能變體和/或其功能片段。PD-L1也稱為分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，並且是由(人類中)CD274基因編碼的蛋白。PD-L1結合其受體、細胞程序性死亡蛋白1(PD-1)，所述PD-1在活化的T細胞、B細胞和巨噬細胞中表達(Ishida et al.,1992 EMBO J,11：3887-3395；Okazaki et al.,Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 receptor-deficient mice.Science,2001；291：319-22)。PD-L1和PD-1的絡合藉由抑制T細胞增殖和產生細胞因子IL-2和IFN-γ發揮免疫抑制作用(Freeman et al.,Engagement of PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation,J.Exp.Med.2000,192：1027-1034；Carter et al.,PD-1：PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+) and CD8(+) T cells and is overcome by IL-2.Eur.J.Immunol.2002,32：634-643)。例如，術語“PD-L1”可以包括與NCBI登錄號Q9NZQ7具有至少約85%胺基酸序列同一性且特異性結合PD1的多肽或其片段。術語PD-L1包括整個PD-L1配體、可溶性PD-L1配體及包含共價連接至第二部分例如蛋白質結構域的PD-L1配體的功能活化部分的融合蛋白。在PD-L1的定義之內還包括與天然存在的PD-L1的胺基酸序列不同但保持特異性結合受體PD1的能力的變體。在PD-L1的定義之內還包括增強PD1的生物活性的變體。PD-L1序列是本領域已知的，並且例如以GenBank登錄號29126提供。本文使用的術語“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)、hPD-L1的變體、異構體和種屬同源體以及具有至少一種hPD-L1的常見表位的類似物。例如，術語“PD-L1”還涵蓋來自其他種屬比如其它哺乳動物(例如，大鼠、小鼠、兔、非人靈長類動物、豬或牛)的PD-L1。完整的hPD-L1序列可以在GenBank登錄號29126中找到。
本文使用的術語“人PD-L1的N-末端IgV結構域”通常指位於其N-末端的人PD-L1的胞外域。術語“人PD-L1的N-末端IgV結構域"也可指在所述結構域之內的表位。人PD-L1蛋白(包括信號肽)的N-末端IgV結構域可以包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。
本文使用的術語“CTLA4”通常指細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4、其功能變體和/或其功能片段。CTLA4是一種屬CD28家族的免疫抑制性受體。在體內，CTLA4僅僅在T細胞(CD 4+和CD 8+細胞)上表達，並且結合兩個配體CD80和CD86(也分別稱為B7-1和B7-2)。例如，術語“CTLA4”可以包括與NCBI登錄號AAL07473.1具有至少約85%胺基酸序列同一性且特異性地結合CD80和/或CD86的多肽或其片段。術語“CTLA4”包括整個CTLA4受體、其胞外域和包含共價連接至第二部分例如蛋白質結構域的CTLA4的功能活性部分的融合蛋白。在CTLA4的定義之內還包括與天然存在的CTLA4的胺基酸序列不同但保持特異性結合配體CD80和/或CD86的能力的變體。CTLA4序列是本領域已知的，並且提供在例如登錄號1493中。本文使用的術語“CTLA4”包括人CTLA4(hCTLA4)、hCTLA4的變體、異構體和種屬同源物以及具有至少一種hCTLA4的常見表位的類似物。例如，術語“CTLA4”還涵蓋來自其他種屬比如其它哺乳動物(例如，大鼠、小鼠、兔子、非人靈長類動物、豬或牛)的CTLA4。完整的hCTLA4序列可以在GenBank登錄號1493中找到。
本文使用的術語“抗體Fc亞基”通常指抗體Fc結構域的組成部分。例如抗體Fc結構域可以由兩個以上成員形成，並且每個成員可以被認為是一個Fc亞基。本文使用的術語“Fc結構域”通常指抗體重鏈的Fc部分或Fc片段。例如，其可以指免疫球蛋白重鏈恆定區的羧基末端部分，或能夠結合Fc受體的類似物或其部分。如已知的，每個免疫球蛋白重鏈恆定區包括四或五個結構域。所述結構域順序命名如下：CH1-鉸鏈-CH2-CH3(-CH4)。CH4存在於IgM中，IgM沒有鉸鏈區。本發明中有用的Fc結構域或Fc亞基可以包括CH3結構域。例如，所述Fc結構域或Fc亞基可以包括CH2結構域和CH3結構域。在某些實施方案 中，所述Fc結構域或Fc亞基也可包括免疫球蛋白鉸鏈區。例如，所述Fc結構域或Fc亞基可以包括從N-末端到C-末端的CH2結構域和CH3結構域，或由其組成。在另一個實例中，所述Fc結構域或Fc亞基可以包括從N-末端到C-末端的免疫球蛋白鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域，或由其組成。在Fc結構域或Fc亞基之內的胺基酸殘基位點可能根據Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,NIH Publication No.91-3242確定。
本文使用的術語“Fc結構域”通常指免疫球蛋白重鏈的C-末端區域，包括天然序列Fc區和變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈的Fc區邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區通常定義為從位於位點Cys226的胺基酸殘基或Pro230延伸至其羧基末端。Fc區的C-末端賴胺酸(殘基447，根據EU編號系統)可以被消除，例如在抗體的生產或純化期間，或者藉由對編碼抗體重鏈的核酸進行重組工程化。因此，完整抗體的組合物可包括所有K447殘基都被消除的抗體群、K447殘基未被消除的抗體群和具有存在和不存在K447殘基的抗體混合物的抗體群。用於本發明抗體的合適的天然序列Fc區包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
除非本文另外指出，否則免疫球蛋白鏈中殘基的編碼為EU索引的那些，如在Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的。“如在Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗體的殘基編號。
本文使用的術語“二聚體”通常指由兩個通常是非共價鍵合的單體單位形成的高分子複合物。每個單體單位可以是大分子，比如多肽鏈或多核苷酸。本文使用的術語“同二聚體”通常指由兩個基本相同的單體，比如兩個基本相 同的多肽鏈組成或由其形成的二聚體。在某些情況下，所述同二聚體的兩個單體可以在一個或多個區域或位點不同，然而，這樣的差異不會引起單體功能或結構的顯著改變。例如，本領域普通技術人員認為兩個單體之間的差異在本發明考慮的生物學特徵背景下的生物學和/或統計學顯著性極小或不存在。所述兩個單體之間的結構/組成差異可以為例如小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%、小於約10%、小於約5%或更小。
本文使用的術語“融合的”或“融合”通常指兩個多肽之間的共價鍵合。所述多肽典型地藉由肽鍵連接，彼此直接連接或藉由胺基酸連接子結合。視需要地，所述肽可以經藉由本領域技術人員已知的非肽共價鍵結合。
如本文使用的術語“融合蛋白”通常指包含直接或間接地(例如，藉由連接子)融合至異源多肽(即，與前述多肽或其結構域無關的多肽)的胺基酸序列的多肽的胺基酸序列的多肽，或由其組成。
本文使用的術語“免疫球蛋白單可變結構域(ISVD)”通常指抗原結合結構域或片段，比如分別為VHH結構域或VH結構域或VL結構域。術語抗原結合分子或抗原結合蛋白可互換地使用，並且還包括術語納米抗體(Nanobodies)。所述免疫球蛋白單可變結構域進一步為輕鏈可變結構域序列(例如，VL-序列)，或重鏈可變結構域序列(例如，VH-序列)；更特別地，它們可以為源自常規四鏈抗體的重鏈可變結構域序列或源自重鏈抗體的重鏈可變結構域序列。因此，免疫球蛋白單可變結構域可以為結構域抗體，或適於用作結構域抗體的免疫球蛋白序列、單結構域抗體，或適於用作單結構域體的免疫球蛋白序列，“dAbs”或適於用作dAbs的免疫球蛋白序列，或納米抗體，包括但不限於VHH序列。免疫球蛋白單可變結構域包括全人的、人源化的、其它序列優化的或嵌合 的免疫球蛋白序列。所述免疫球蛋白單可變結構域和免疫球蛋白單可變結構域的結構可以被認為-但不僅限於-由四個框架區或“FR”組成，其在本領域和本文中分別被稱為“框架區1”或“FR1”；“框架區2"或“FR2”；或“框架區3”或“FR3”；和“框架區4”或“FR4”；其中框架區被插入三個互補決定區或“CDR”，其在本領域分別被稱為“互補決定區1”或“CDR1”；“互補決定區2”或“CDR2”；和“互補決定區3”或“CDR3”。
本文使用的術語“人源化的”通常指非人類抗體的CDR結構域外部的一些、大多數或所有胺基酸被源自人免疫球蛋白的相應胺基酸替代的抗體或其片段。例如，在抗體的人源化形式中，CDR結構域外部的一些、大多數或所有胺基酸已經被來自人免疫球蛋白的胺基酸替代，然而在一個或多個CDR區域之內的一些、大多數或所有胺基酸都未改變。胺基酸的少量增加、缺失、插入、取代或修飾都是允許的，只要它們沒有消除抗體結合其特異性抗原/表位的能力。人源化抗體可以保持與原始抗體類似的抗原特異性。
本文使用的術語“表位”或“抗原決定簇”通常指抗原上抗體結合的位點。表位可以由連續胺基酸(線性表位)或由於蛋白質三級折疊而在空間上相鄰的非連續胺基酸(構象表位)形成。當暴露於變性溶劑時，由連續胺基酸形成的表位通常被保留，然而當用變性溶劑處理時藉由三級折疊形成的表位通常丟失。表位一般包括在獨特空間構象中的至少3個，通常更多個，至少5個或8-10個胺基酸。測定表位的空間構象的方法包括例如X-射線晶體衍射和2-維核磁共振。參見，例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,Glenn E.Morris,Ed(1996)。
本文使用的術語“構象表位”通常指由於蛋白質三級折疊而在空間位置上相鄰的抗原(比如PD-L1抗原)的非連續胺基酸殘基。當多肽鏈折疊形成天然蛋白質時，這些非連續胺基酸殘基可聚集在表面上。構象表位包含但不限於功能性表位。
本文使用的術語“功能性表位”通常指高能促進抗體結合，即形成“高能表位”的抗原的胺基酸殘基。任一個抗原的高能促進殘基向丙胺酸的突變將破壞抗體結合，使得所述抗體的相對KD比(KD突變體/KD野生型)可以為例如大於2倍，比如大於3倍、大於4倍、大於6倍、大於10倍、大於20倍、大於30倍、大於40倍、大於50倍、大於60倍、大於70倍、大於80倍、大於90倍、大於100倍、大於150倍、大於200倍或更多倍。
本文使用的術語“胞外域”通常指從細胞器和/或細胞的外膜突出的蛋白(例如，膜蛋白，比如受體)的一部分。如果多肽鏈橫跨雙分子層數次，則胞外域包括纏繞穿過所述膜的環。胞外域可以識別和響應特異性抗體。
本文使用的術語“連接子”通常指接合或連接兩個多肽序列(例如連接兩個多肽結構域)的合成胺基酸序列。連接子可以藉由肽鍵連接兩個胺基酸序列。在某些實施方案中，本發明的連接子以線性順序將生物學活性部分連接至第二部分。例如，肽連接子可以是非免疫原性的和柔性的，比如包括絲胺酸和甘胺酸序列或Ala-Ala-Ala重複序列的肽連接子。根據二聚體的特定結構，肽連接子可以包括例如3-30個(比如至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少 20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個、至少30個)胺基酸殘基。
術語“N-末端的”可以與“N-末端”可互換地使用，並且如本文使用的，它們通常指多肽鏈的胺基末端/端。
術語“C-末端的”可以與“C-末端”可互換地使用，並且如本文使用的，它們通常指多肽鏈的羧基末端/端。
本文使用的術語“PBMC細胞”通常指外周血單核細胞，其可以包括淋巴細胞(T細胞、B細胞NK細胞)和單核細胞。這些細胞可以使用Ficoll(一種分離血液層的親水性多糖)和/或梯度離心(其可以將血液分離成血漿上層、PBMC層和包括多形核細胞(比如嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞)和紅細胞的下層)從全血中提取。
本文使用的術語“有效量”通常指足以提供足夠高的濃度以對其接受者產生有益作用的劑量。對於任何特定受試者的特定治療有效劑量水平可取決於多種因素，包括待治療的病症、病症的嚴重程度、特定組分的活性、給藥途徑、清除速率、治療的持續時間、受試者的年齡、體重、性別、飲食和一般健康狀況及其它相關因素。
本文使用的術語“藥學上可接受的賦形劑”通常指與藥物給藥相容的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、等滲劑和吸收延遲劑等。
本文使用的術語“宿主細胞”通常指可以是或已經是受試者質粒或載體的接受者的單個細胞、細胞系或細胞培養物，其包括本發明公開的分離的核酸，或表達本發明的二聚體。宿主細胞可以包括單個宿主細胞的後代。由於天然、偶然或有意的突變，後代可以不一定與原始母細胞完全相同(在總DNA互補體 的形態上或在基因組上)。宿主細胞可包括用本發明的載體在體外轉染的細胞。宿主細胞可以是細菌細胞(例如，大腸桿菌)、酵母細胞或其它真核細胞，例如COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞或骨髓瘤細胞。在某些實施方案中，宿主細胞為哺乳動物細胞。在某些實施方案中，哺乳動物細胞為HEK293細胞。
本文使用的術語“載體”通常指能夠在合適的宿主中自我複製的核酸分子，其將插入的核酸分子轉移至宿主細胞中和/或在宿主細胞之間轉移。該術語可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞的載體，主要用於DNA或RNA的複製的載體，以及功能是用於DNA或RNA的轉錄和/或翻譯的表達載體。還包括提供不止一種上述功能的載體。“表達載體”是當被引入合適的宿主細胞時可被轉錄並翻譯成多肽的多核苷酸。“表達系統”通常意味著合適的宿主細胞，其包括能夠產生期望的表達產物的表達載體。
本文使用的術語“分離的核酸”通常指任何長度的分離形式的核苷酸，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或從其天然環境分離的或人工合成的類似物。
本文使用的術語“癌症”通常指任何臨床可測量程度的腫瘤生長或轉移。癌症可以是實體瘤、血液學癌症或淋巴瘤。例如，癌症可選自肺癌(比如，非小細胞肺癌)、乳腺癌(比如，三陰性乳腺癌)、腎癌(比如腎細胞癌)、黑色素瘤、子宮頸癌、子宮癌、胰腺癌、腹膜癌、卵巢癌和結腸癌。癌症可以是晚期癌症或轉移性癌症。
本文使用的術語“IL-2”或“IL2”通常指白細胞介素-2、其功能變體和/或其功能片段。術語IL2涵蓋人IL-2(hIL-2)，以及來自其它種屬比如其它哺 乳動物(例如，大鼠、小鼠、兔子、非人靈長類動物、豬或牛)的IL-2。hIL-2是如Genbank Submission,NCBI；登錄號P60568描述的。術語“IL-2”也可指能夠刺激hIL-2依賴性細胞溶解性或輔助性T細胞系的增殖的多肽，如在Gillis,S.,et al.,J.Immunol.(1978)120：2027-2032和Watson,J.,J.Exp.Med.(1979)150：1510-1519的標準測定中列出的。
本文使用的術語“免疫細胞”通常指免疫系統的細胞。免疫細胞可以包括參與保護集機體抗傳染病和/或外來侵入物的細胞。免疫細胞可以包括先天性免疫系統的細胞和適應性免疫系統的細胞。免疫細胞可以包括白細胞，比如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿細胞、淋巴細胞和單核細胞。可以進一步分類為亞型；例如，在淋巴細胞中，存在B細胞、T細胞和自然殺傷(NK)細胞。
本文使用的術語“受試對者”通常指人類或非人類動物，包括但不限於貓、狗、馬、豬、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
本文使用的術語“約”通常指在本領域正常容許的範圍之內的變化，通常指意味著在所述值的±10%之內，比如在9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%之內。除非另外從上下文明確的，否則本文提供的所有數值都由術語“約”修飾。
本文使用的術語“特異性結合”或“特異性的”通常指可測量的和可再現的相互作用，比如靶標和抗體之間的結合，可在分子(包括生物分子)的異質群體存在的情況可決定靶標的存在。例如，特異性結合靶標(其可以為表位)的抗體是以比它結合其它靶標更大的親和性、親合力、更容易、和/或以更大的持續時間結合該靶標的抗體。在一個實施方案中，抗體結合無關靶標的程度小於抗體對靶標的結合的約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)測量的。在某些實施方 案中，特異性結合靶標的抗體具有<1x10-6M、<1x10-7M、<1x10-8M、<1x10-9M或<1x10-10M的解離常數(KD)。在某些實施方案中，抗體特異性結合蛋白質上的表位，所述表位在不同種屬的蛋白質中是保守的。在另一個實施方案中，特異性結合可以包括但不要求排他性地結合。
如本文使用的術語“抗體”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵蓋包括抗原結合位點的任何多肽，無論其是在體外還是體內產生的。該術語包括但不限於多株的、單株的、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜化的、突變的和移植的抗體。除非另外被術語“完整的”修飾，如在“完整的抗體”中，為了本發明的目的，術語“抗體”也包括抗體片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原結合功能(即，特異性結合例如CTLA-4或PD-L1)的其它抗體片段。通常，這樣的片段應當包括抗原結合結構域。
基本的4鏈抗體單元是由兩個相同的輕(L)鏈和兩個相同的重(H)鏈組成的異四聚體糖蛋白。IgM抗體由5個基本的異四聚體單元與另外一個稱為J鏈的多肽組成，且含有10個抗原結合位點，而IgA抗體包括2-5個可以與J鏈相結合聚合形成多價組合的基本4鏈單元。就IgG而言，4鏈單元一般為約150,000道爾頓。每個L鏈藉由一個共價二硫鍵與H鏈連接，而兩個H鏈藉由一個或多個取決於H鏈同種型的二硫鍵相互連接。每個H和L鏈還具有規則間隔的鏈內二硫化橋鍵。每個H鏈在N末端具有可變結構域(VH)，對於α和γ鏈各自繼之以三個恆定結構域(CH)、對於μ和ε同種型繼之以四個CH結構域。每個L鏈在N末端具有可變結構域(VL)，在其另一端具有恆定結構域。VL與VH對應，且CL與重鏈的第一恆定結構域(CH1)相對應。特定的胺基酸殘基被認為在 輕鏈和重鏈可變結構域之間形成界面。VH和VL配對一起形成單個抗原結合位點。對於不同類別抗體的結構和性質，參見例如Basic and Clinical Immunology,8th Edition,Daniel P.Sties,Abba I.Terr and Tristram G.Parsolw(eds),Appleton & Lange,Norwalk,Conn.,1994，第71頁和第6章。來自任何脊椎動物物種的L鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列被分為兩種明顯不同的類型中的一種，稱為κ和λ。取決於其重鏈(CH)恆定結構域的胺基酸序列，可以將免疫球蛋白分為不同的類別或同種型。存在五類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分別被命名為α、δ、ε、γ和μ的重鏈。基於CH序列和功能方面的相對小的差異，將γ和α類進一步分成亞類，例如，人表達下述亞類：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgK1。
本文使用的術語“多肽鏈”通常指包括兩個或多個共價連接的肽的大分子。多肽鏈之內的肽可以藉由一個肽鍵彼此連接。每條多肽鏈可以包括一個N-末端或胺基末端和一個C-末端或羧基末端。
本文使用的術語“CD80”通常指CD28/CTLA4的配體(也稱為B7.1)、其功能變體和/或其功能片段。CD80通常在專職抗原遞呈細胞(APC)上表達。例如，術語“CD80”可以包含與NCBI登錄號P33681具有至少約85%胺基酸序列同一性且特異性地結合CTLA4的多肽或其片段。在CD80的定義之內還包括與天然存在的CD80的胺基酸序列不同但保持特異性結合CTLA4的能力的變體。在CD80的定義之內進一步包括增強CTLA4的生物活性的變體。CD80序列是本領域已知的，並且例如以GenBank登錄號P33681提供。如本文使用的術語“CD80”包括人CD80(hCD80)、hCD80的變體、異構體和種屬同源體、以及具有至少一種含hCD80的常見表位的類似物。例如，術語“CD80”還涵蓋來自其他 種屬比如其它哺乳動物(例如，大鼠、小鼠、兔、非人靈長類動物、豬或牛)的CD80。完整的hCD80序列可以在GenBank登錄號P33681中找到。
本文使用的術語“CD86”通常指CD28/CTLA4的配體(也稱為B7.2)、其功能變體和/或其功能片段。CD86通常在專職抗原遞呈細胞(APC)上表達。例如，術語“CD86”可以包含與NCBI登錄號P42081具有至少約85%胺基酸序列同一性且特異性地結合CTLA4的多肽或其片段。在CD86的定義之內還包括與天然存在的CD86的胺基酸序列不同但保持特異性結合CTLA4的能力的變體。在CD86的定義之內進一步包括增強CTLA4的生物活性的變體。CD86序列是本領域已知的，並且例如以GenBank登錄號U04343提供。如本文使用的術語“CD86”包括人CD86(hCD86)、hCD86的變體、異構體和種屬同源體、以及具有至少一種含hCD86的常見表位的類似物。例如，術語“CD86”還涵蓋來自其他種類比如其它哺乳動物(例如，大鼠、小鼠、兔、非人靈長類動物、豬或牛)的CD86。完整的hCD86序列可以在GenBank登錄號U04343中找到。
如本文使用的術語“PD1”通常指程序性死亡-1受體(也稱為CD279)、其功能變體和/或其功能片段。PD1通常在T細胞、B細胞、自然殺傷T細胞、活化的單核細胞和樹突細胞(DC)上表達。PD1可以結合其配體PD-L1和PD-L2。例如，術語“PD1”可以包括與NCBI登錄號P42081具有至少約85%胺基酸序列同一性且特異性地結合PD-L1的多肽或其片段。在PD1的定義之內還包括與天然存在的PD1的胺基酸序列不同但保持特異性結合PD-L1的能力的變體。在PD1的定義之內進一步包括增強PD-L1的生物活性的變體。PD1序列是本領域已知的，並且例如以GenBank登錄號Q15116.3提供。如本文使用的術語“PD1”包括人PD1(hPD1)、hPD1的變體、異構體和種屬同源體、以及具有至少 一種含hPD1的常見表位的類似物。例如，術語“PD1”還涵蓋來自其他種屬比如其它哺乳動物(例如，大鼠、小鼠、兔、非人靈長類動物、豬或牛)的PD1。完整的hPD1序列可以在GenBank登錄號Q15116.3中找到。
本文使用的術語“阻斷”通常指抑制或降低分子和其特異性結合配偶體之間(比如配體及其特異性受體之間)的結合活性。
術語"阻斷性抗體"和"拮抗劑抗體"在本文中可互換地使用，通常指抑制或降低其結合的抗原的生物活性的抗體。在某些實施方案中，阻斷性抗體或拮抗劑抗體基本上或完全地抑制抗原的生物活性。本發明的PD-L1特異性ISVD或CTLA4特異性ISVD可以是具有阻斷作用或拮抗作用的ISVD。例如，本發明的PD-L1特異性ISVD可以阻斷PD-L1及其受體PD-1之間的相互作用，從而阻斷PD-1信號通路，將T細胞的功能響應從功能失調狀態修復為抗原刺激狀態。本發明的CTLA4特異性ISVD可以阻斷CTLA4和CD80/CD86之間的相互作用，從而阻斷PD-1信號通路，將T細胞的功能響應從功能失調狀態修復為抗原刺激狀態。
術語“交叉競爭結合”、“交叉競爭”、“交叉阻斷”、“交叉阻斷的(cross-blocked)”、“交叉阻斷的(cross-blocking)”在本文中可互換地使用，通常指抗體或其片段藉由對本發明的另一種抗體(例如，本發明的PD-L1特異性ISVD或CTLA4特異性ISVD)進行變構調節，干擾直接地或間接地結合靶標/抗原(例如，分別為PD-L1或CTLA4)的能力。抗體或其片段能夠干擾另一個抗體或其片段結合靶標的程度，且因此無論其是否可以被認為是根據本發明的交叉阻斷或交叉競爭，都可以使用競爭性結合試驗來確定。一種特別合適的定量交叉競爭試驗使用基於FACS或基於AlphaScreen方法測量標記的(例如，His標記的、生物 素化的或放射性標記的)抗體或其片段和另一抗體或其片段之間在結合靶標方面的競爭。通常，交叉競爭抗體或其片段為例如一種下述的：在交叉競爭試驗中結合靶標，使得在試驗期間和在第二抗體或其片段的存在下，本發明的免疫球蛋白單可變結構域或多肽的所記錄的取代達到由以給定量存在的所檢測的潛在交叉阻斷抗體或其片段得到的最大理論取代(例如，由需要被交叉阻斷的冷(例如，未標記的)抗體或其片段取代)的至多100%(例如，在基於FACS的競爭試驗中)。較佳地，交叉競爭抗體或其片段具有在10%至100%之間，比如在50%至100%之間的所記錄的取代。
本文使用的術語“實質上減少”或“實質上不同”通常指兩個數值(通常，一個與分子有關，另一個與參照/比較分子有關)之間的差異程度足夠高，以致本領域技術人員認為這兩個數值之間的差異在所述值(例如，KD值)衡量的生物學特徵背景下具有統計學顯著性。作為對照/比較分子的值的函數，所述兩個值之間的差異是例如，大於約10%、大於約20%、大於約30%、大於約40%和/或大於約50%。
本文使用的術語“基本上類似”或“基本上相同”通常指兩個數值(通常，一個與本發明的分子有關，另一個與參照/比較分子有關)的之間的相似性程度足夠高，以致本領域技術人員認為這兩個數值之間的差異在所述值(例如，KD值)衡量的生物學特徵背景下的生物學和/或統計顯著性極小或不存在。作為參照/比較值的函數，所述兩個值之間的差異為例如小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%和/或小於約10%。
本文使用的術語“增強免疫應答”通常指誘導、引起或刺激免疫細胞(比如，T-細胞或PBMC細胞)具有持續的或增強的生物學功能，或者更新或再 活化耗盡的或失活的免疫細胞。增強免疫細胞功能的實例包括：相對於干預之前的相應水平，增加PBMC細胞分泌IL-2、增加增殖、增強抗原反應性(例如，病毒或病原體清除)。增強的程度可以是至少30%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少120%、至少150%或至少200%。測定該增強的方式是本領域普通技術人員已知的。
如本文使用的術語“可變區”或“可變結構域”通常指抗體重鏈或輕鏈的胺基末端結構域。重鏈和輕鏈的可變結構域可以分別稱為“VH”和“VL”。這些結構域通常是抗體的變化最大的部分(相對於相同類型的其它抗體)，且包含抗原結合位點。
術語“可變”通常指在抗體之間可變結構域的某些區段在序列上存在很大差異的事實。V結構域介導抗原結合並決定特定抗體對其特定抗原的特異性。然而，可變性並非在整個可變結構域範圍內均勻分佈。相反，它集中在輕鏈和重鏈可變結構域中稱為高變區(CDR或HVR)的三個區段中。可變結構域的更高度保守的部分稱為框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區，大多數採用β-折疊構型，藉由三個CDR連接，其形成環形連接，並且在一些情況下形成β-折疊結構的一部分。每條鏈中的CDR藉由FR區緊密靠近地保持在一起，並且來自另一條鏈的CDR一同促進抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat et al,Sequences of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恆定結構域不直接參與抗體與抗原的結合，但顯示出各種效應子功能，例如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。
本文使用的術語“CDR”、“HVR”或“HV”通常指抗體可變結構域的區域，其序列是高度可變的和/或形成結構定義環。通常，抗體包括六個CDR； 在VH中三個(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三個(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。本發明的ISVD可以僅包括3個CDR(例如，在VH中，HCDR1、HCDR2和HCDR3)。在天然抗體中，HCDR3和LCDR3顯示所述六個CDR的大多數多樣性，並且特別地HCDR3被認為在賦予抗體的精細特異性方面起獨特作用。參見，例如Xu et al,Immunity 13：37-45(2000)；Johnson and Wu,in Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2003)。實際上，僅由重鏈組成的天然存在的駱駝抗體在缺乏輕鏈的情況功能正常且穩定。參見，例如，Hamers-Casterman et al.,Nature 363：446-448(1993)；Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。
本文使用且涵蓋大量CDR描述。Kabat互補決定區(CDR)是基於序列可變性，並且是最常使用的(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。相反，Chothia提及了所述結構環的位置(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM CDR代表Kabat HVR與Chothia結構環之間的折衷，而且被Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件使用。
“接觸”CDR是基於可獲得的複合物晶體結構的分析。下文記錄了這些CDR中每一個的殘基：
CDR可包括如下“延伸的CDR”：VL中的24-36或24-34(LCDR1)，46-56或50-56(LCDR2)和89-97或89-96(LCDR3)及VH中的26-35(HCDR1)，50-65或49-65(HCDR2)和93-102、94-102、或95-102(HCDR3)。對於這些定義中的每一個，可變結構域殘基是根據上文的Kabat編號的。
表述“如Kabat中的可變結構域殘基編號方式”或“如Kabat中的胺基酸位置編號”及其變體通常指Kabat等(上文)在編輯二聚體/多肽鏈的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域時使用的編號系統。對於給定多肽，Kabat殘基編號可藉由將多肽序列與“標準”Kabat編號序列對比同源區來確定。
“框架”或“FR”殘基為不同於本文中定義的CDR殘基的那些可變結構域殘基。“人共有框架”或“受體人框架”代表在選擇人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常見的胺基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的選擇來自可變結構域序列亞組。通常，序列亞組為如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的亞組。實例包括對於VL，亞組可以是亞組κI、κII、κIII或κIV，如在Kabat等人(上文)中的。另外，對於VH，亞組可以是亞組I、亞組II或亞組III，如在Kabat等人(上文)中的。可選地，人共有框架可以衍生自上述框架，其中特定殘基，比如當人框架殘基藉由比對供體框架序列與各種人框架序列的集合，基於其與供體框架的同源性選擇時。衍生自“人免疫球蛋白框架”的受體人框架或人共有框架可以包括其相同的胺基酸序列，或者其可以包含先前存在的胺基酸序列變化。在某些實施方案中，先前存在的胺基酸變化的數量為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。
在本發明中，如特定SEQ ID NO.所示的胺基酸序列或核苷酸序列也涵蓋具有與其基本上相同的功能/性質的其同源物或變體。例如，具有與其至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高序列同一性的序列；和/或具有一個或多個(例如，幾個，比如1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2)個胺基酸或核苷酸增加、缺失或取代的變體。
二聚體、免疫綴合物、分離的多核苷酸、載體和宿主細胞在一個方面，本發明提供一種二聚體。所述二聚體可由兩條多肽鏈形成，所述兩條多肽鏈中的每條均包括一個抗體Fc亞基。例如，所述二聚體可以由兩條多肽鏈組成，每條多肽鏈包括一個抗體Fc亞基，並且所述一條多肽鏈的抗體Fc亞基可以與另一條多肽鏈的抗體Fc亞基結合形成二聚體。在一個實例中，所述二聚體的兩條多肽鏈沒有相互融合(例如，藉由肽連接子或肽鍵)成為一條單多肽鏈。
所述二聚體可以包括兩個以上免疫球蛋白單可變結構域(ISVD)。例如，二聚體的一條多肽鏈可以包括兩個以上ISVD，並且所述二聚體的另一條多肽鏈不包括任何ISVD。在另一個實例中，所述兩條多肽鏈中的每條均可以包括一個或多個ISVD。然而在另一個實例中，所述兩條多肽鏈中的每條均可以包括兩個以上ISVD。
至少一個ISVD可以是PD-L1特異性的，並且至少一個ISVD可以是CTLA4特異性的。例如，所述二聚體的一條多肽鏈可包括一個或多個PD-L1特異性的ISVD和一個或多個CTLA4特異性的ISVD，並且所述二聚體的另一條多肽鏈不包括任何ISVD。在另一個實例中，所述二聚體的一條多肽鏈可以包括一個或多個PD-L1特異性的ISVD，並且所述二聚體的另一條多肽鏈可以包括一個或多個CTLA4特異性的ISVD。在另一個實例中，所述二聚體的一條多肽鏈可以包括一個或多個PD-L1特異性的ISVD和一個或多個CTLA4特異性的ISVD，並且所述二聚體的另一條多肽鏈可以包括一個或多個PD-L1特異性的ISVD和/或一個或多個CTLA4特異性的ISVD。
所述一個或多個PD-L1特異性的ISVD可以相同或不同。所述一個或多個CTLA4特異性的ISVD可以相同或不同。
在某些情況下，所述PD-L1特異性的ISVD不包括任何抗體輕鏈CDR。在某些情況下，所述PD-L1特異性的ISVD不包括任何抗體輕鏈可變區。在某些情況下，所述PD-L1特異性的ISVD不包括任何抗體輕鏈或其任何片段。在某些情況下，所述PD-L1特異性的ISVD至少包括重鏈CDR3。在某些情況下，所述PD-L1特異性的ISVD包括重鏈CDR1。在某些情況下，所述PD-L1特異性的ISVD包括重鏈CDR2。在某些情況下，所述PD-L1特異性的ISVD包括 重鏈可變區。在某些情況下，所述PD-L1特異性的ISVD為抗PD-L1 VHH。所述PD-L1特異性的ISVD可以是人源化的。
在某些情況下，所述CTLA4特異性的ISVD不包括任何抗體輕鏈CDR。在某些情況下，所述CTLA4特異性的ISVD不包括任何抗體輕鏈可變區。在某些情況下，所述CTLA4特異性的ISVD不包括任何抗體輕鏈或其任何片段。在某些情況下，所述CTLA4特異性的ISVD至少包括重鏈CDR3。在某些情況下，所述CTLA4特異性的ISVD包括重鏈CDR1。在某些情況下，所述CTLA4特異性的ISVD包括重鏈CDR2。在某些情況下，所述CTLA4特異性的ISVD包括重鏈可變區。在某些情況下，所述CTLA4特異性的ISVD為抗CTLA4 VHH。所述CTLA4特異性的ISVD可以是人源化的。
在某些情況下，所述兩條多肽鏈的至少一條可以包括PD-L1特異性的ISVD和CTLA4特異性的ISVD。例如，所述兩條多肽鏈的一條可以包括一個或多個PD-L1特異性的ISVD和一個或多個CTLA4特異性的ISVD。在另一個實例中，兩條多肽鏈中的每條均可以包括一個或多個PD-L1特異性的ISVD和一個或多個CTLA4特異性的ISVD。
對於兩條多肽鏈的一條或兩條，所述PD-L1特異性的ISVD可以融合至CTLA4特異性的ISVD，視需要地藉由一個連接子。例如，在兩條多肽鏈的一條或兩條中，可以存在一個或多個PD-L1特異性的ISVD，和一個或多個CTLA4特異性的ISVD。當單條多肽鏈中存在兩個以上PD-L1特異性的ISVD時，它們可以相互融合(例如，直接地或藉由肽連接子)，並且其中一個或多個可以進一步融合至一個或多個CTLA4特異性的ISVD。當單條多肽鏈中存在兩個以上CTLA4特異性的ISVD時，它們可以相互融合(例如，直接地或藉由肽連接 子)，並且其中一個或多個可以進一步融合至一個或多個PD-L1特異性的ISVD。在任何兩個ISVD之間，例如在兩個PD-L1特異性的ISVD之間，在兩個CTLA4特異性的ISVD之間，或在一個PD-L1特異性的ISVD和一個CTLA4特異性的ISVD之間，可以存在一個或多個連接子(例如，肽連接子)。
對於兩條多肽鏈中的一條或兩條，所述PD-L1特異性的ISVD可以融合至所述CTLA4特異性的ISVD，視需要地藉由一個連接子；且所述CTLA4特異性的ISVD可以又融合至抗體Fc亞基，視需要地藉由一個連接子。例如，在單條多肽鏈中，所述PD-L1特異性的ISVD可以直接地(例如，在框架內)或藉由一個連接子融合至所述CTLA4特異性的ISVD，且所述CTLA4特異性的ISVD可以直接地(例如，在框架內)或藉由連接子融合至抗體Fc亞基。當在一條單多肽鏈中存在超過一個PD-L1特異性的ISVD和/或超過一個CTLA4特異性的ISVD時，所述PD-L1特異性的ISVD和CTLA4特異性的ISVD可以直接地或藉由一個連接子按照任何順序彼此融合，並且至少一個所述CTLA4特異性的ISVD可以直接地(例如，在框架內)或藉由一個連接子融合至所述抗體Fc亞基。例如，對於所述兩條多肽鏈中的一條或兩條，所述PD-L1特異性的ISVD的C末端可以融合至所述CTLA4特異性的ISVD的N末端，視需要地藉由一個連接子；且所述CTLA4特異性的ISVD的C末端可以融合至抗體Fc亞基的N末端，視需要地藉由一個連接子。例如，在一條單多肽鏈中，所述PD-L1特異性的ISVD之一的C末端可以融合至所述CTLA4特異性的ISVD之一的N末端，直接地(例如，在框架內)或藉由一個連接子，且所述CTLA4特異性的ISVD之一的C末端可以融合至抗體Fc亞基的N末端，直接地(例如，在框架內)或藉由一個連接子。在一個實例中，當在一條單多肽鏈中存在超過一個PD-L1特異性的ISVD 和/或超過一個CTLA4特異性的ISVD時，所述PD-L1特異性的ISVD和CTLA4特異性的ISVD可以直接地或藉由一個連接子按照任何順序彼此融合，然而，至少一個PD-L1特異性的ISVD的C末端可以融合至至少一個CTLA4特異性ISVD的N末端，直接地(例如，在框架內)或藉由一個連接子，且至少一個CTLA4特異性的ISVD的C末端可以融合至所述抗體Fc亞基的N末端，直接地(例如，在框架內)或藉由一個連接子。
對於兩條多肽鏈中的一條或兩條，所述CTLA4特異性的ISVD可以融合至PD-L1特異性的ISVD，視需要地藉由一個連接子；且所述PD-L1特異性的ISVD可以又融合至所述抗體Fc亞基，視需要地藉由一個連接子。例如，在一條單多肽鏈中，所述CTLA4特異性的ISVD可以直接地(例如，在框架內)或藉由一個連接子融合至PD-L1特異性的ISVD，且所述PD-L1特異性的ISVD可以直接地(例如，在框架內)或藉由一個連接子融合至所述抗體Fc亞基。當在一條單多肽鏈中存在超過一個PD-L1特異性的ISVD和/或超過一個CTLA4特異性的ISVD時，所述PD-L1特異性的ISVD和所述CTLA4特異性的ISVD可以直接地或藉由一個連接子按照任何順序彼此融合，並且至少一個PD-L1特異性的ISVD可以直接地(例如，在框架內)或藉由一個連接子融合至所述抗體Fc亞基。例如，對於所述兩條多肽鏈中的一條或兩條，CTLA4特異性的ISVD的C末端可以融合至PD-L1特異性的ISVD的N末端，視需要地藉由一個連接子；且PD-L1特異性的ISVD的C末端可以融合至抗體Fc亞基的N末端，視需要地藉由一個連接子。例如，在一條單多肽鏈中，CTLA4特異性的ISVD之一的C末端可以融合至PD-L1特異性的ISVD之一的N末端，直接地(例如，在框架內)或藉由一個連接子，且PD-L1特異性的ISVD之一的C末端可以融合至抗體Fc 亞基的N末端，直接地(例如，在框架內)或藉由一個連接子。在一個實例中，當在一條單多肽鏈中存在超過一個PD-L1特異性的ISVD和/或超過一個CTLA4特異性的ISVD時，所述PD-L1特異性的ISVD和CTLA4特異性的ISVD可以直接地或藉由一個連接子按照任何順序彼此融合，然而，至少一個CTLA4特異性的ISVD的C末端可以融合至至少一個PD-L1特異性ISVD的N末端，直接地(例如，在框架內)或藉由一個連接子，且至少一個PD-L1特異性的ISVD的C末端可以融合至抗體Fc亞基的N末端，直接地(例如，在框架內)或藉由一個連接子。
本申請中使用的(例如，如本申請的二聚體所包括的)連接子(例如，肽連接子)可以是例如經由肽鍵接合或連接兩個多肽序列的合成胺基酸序列。例如，所述肽連接子可以包括1-10個胺基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個胺基酸)、1-15個胺基酸(例如，1-10、11、12、13、14或15個胺基酸)、1-20個胺基酸(例如，1-15、16、17、18、19或20個胺基酸)、1-30個胺基酸或更多個胺基酸(例如，1-20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個胺基酸)。例如，所述肽連接子可以包含SEQ ID NO：33-34中任一項所示的胺基酸序列。
所述抗體Fc亞基可以來源於IgG Fc亞基。例如，IgG可以選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些實施方案中，IgG為人IgG1，並且IgG Fc亞基為人IgG1 Fc亞基。在某些實施方案中，Fc亞基包括與SEQ ID NO：35、38和39中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%(例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、 至少97%、至少98%、至少99%或至少100%)同一性的胺基酸序列。例如，Fc亞基可以包含SEQ ID NO：35、38和39中任一項所示的胺基酸序列中具有一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸缺失、插入和/或取代的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述Fc亞基可以是IgG Fc亞基的變體(例如，人IgG1 Fc亞基的變體)。例如，所述變體可以包括一個或多個增強或降低ADCC或CDC活性的胺基酸突變。作為另一個實例，所述變體可以包括一個或多個影響FcRn結合活性和/或包括該變體的分子半衰期的胺基酸突變。作為另一個實例，所述變體可以包括一個或多個影響兩個以上Fc亞基(或Fc單體)之間的相互作用(例如，結合)和/或提高或降低Fc異源二聚體形成效率的胺基酸突變，例如，所述變體可以包括一個或多個如CN102558355A、CN103388013A、CN105820251A或CN106883297A中所述的胺基酸取代，將其中每篇都藉由參考併入本文中。
所述PD-L1特異性的ISVD能夠特異性結合人PD-L1。例如，PD-L1特異性的ISVD能夠特異性結合人PD-L1胞外域中的表位。這樣的表位是本領域已知的，例如，如在Gang Hao et al.,J.Mol.Recognit.2015；28：269-276,Zhang et al.,Oncotarget.2017 Oct；08(52)：90215-90224，和Zhang et al.,Cell Discov.2017 Mar 7；3：17004中所示的。
例如，所述PD-L1特異性的ISVD能夠結合人PD-L1的N-末端的IgV結構域。人PD-L1的N-末端IgV結構域(包括信號肽)可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。在本申請中，PD-L1特異性的ISVD能夠結合人PD-L1 N-末端IgV結構域的殘基I54、Y56、E58、Q66和/或R113。在一個特定的實施 方案中，PD-L1特異性的ISVD能夠結合人PD-L1 N-末端IgV結構域的殘基I54、Y56、E58、Q66和R113(例如，SEQ ID NO：64的胺基酸殘基I54、Y56、E58、Q66和/或R113)。PD-L1特異性的ISVD能夠進一步結合人PD-L1 N-末端IgV結構域的殘基D61、N63、V68、M115、S117、Y123和/或R125(例如，SEQ ID NO：64的胺基酸殘基D61、N63、V68、M115、S117、Y123和/或R125)。在某些情況下，PD-L1特異性的ISVD能夠結合人PD-L1 N-末端IgV結構域的殘基I54、Y56、E58、Q66、R113、D61、N63、V68、M115、S117、Y123和/或R125(例如，SEQ ID NO：64的胺基酸殘基I54、Y56、E58、Q66、R113、D61、N63、V68、M115、S117、Y123和/或R125)。在某些情況下，PD-L1特異性的ISVD能夠結合人PD-L1 N-末端IgV結構域的構象表位，所述構象表位可以包括人PD-L1 N-末端IgV結構域的殘基I54、Y56、E58、Q66和/或R113(例如，SEQ ID NO：64的胺基酸殘基I54、Y56、E58、Q66和/或R113)。在某些情況下，PD-L1特異性的ISVD能夠結合人PD-L1 N-末端IgV結構域的構象表位，所述構象表位可以包括人PD-L1 N-末端IgV結構域的殘基I54、Y56、E58、Q66、R113、D61、N63、V68、M115、S117、Y123和/或R125(例如，SEQ ID NO：64的胺基酸殘基I54、Y56、E58、Q66、R113、D61、N63、V68、M115、S117、Y123和/或R125)。
本發明的PD-L1特異性的ISVD(例如，PD-L1 ISVD-9和其人源化的變體)結合人PD-L1的N-末端IgV結構域。將PD-L1 ISVD-9作為一個實例，PD-L1 ISVD-9(SEQ ID NO：6)的殘基Phe101與人PD-L1 N-末端IgV結構域的Tyr56相互作用，並且當人PD-L1 N-末端IgV結構域的Tyr56被Ala取代時，PD-L1 ISVD-9和PD-L1之間的結合親和性降低大於200倍。當人PD-L1 N- 末端IgV結構域的Ile54被Ala取代時，PD-L1 ISVD-9和PD-L1之間的結合親和性降低了約40倍。PD-L1 ISVD-9(SEQ ID NO：6)的殘基Asp99與人PD-L1 N-末端IgV結構域的Arg113相互作用，並且當人PD-L1 N-末端IgV結構域的Arg113被Ala取代時，PD-L1 ISVD-9和PD-L1之間的結合親和性降低了約90倍。PD-L1 ISVD-9(SEQ ID NO：6)的殘基Ser100與人PD-L1 N-末端IgV結構域的Glu58相互作用，並且當人PD-L1 N-末端IgV結構域的Glu58被Ala取代時，PD-L1 ISVD-9和PD-L1之間的結合親和性降低了約25倍。PD-L1 ISVD-9(SEQ ID NO：6)的殘基Thr105與人PD-L1 N-末端IgV結構域的Gln66相互作用，並且當人PD-L1 N-末端IgV結構域的Gln66被Ala取代時，PD-L1 ISVD-9和PD-L1之間的結合親和性降低了約82倍。另外，人PD-L1 N-末端IgV結構域的殘基D61、N63、V68、M115、S117、Y123和R125可以參與PD-L1 ISVD-9和人PD-L1之間的相互作用，用Ala取代這些殘基導致結合親和性降低約2-10倍。將這些結果概括在下表1中。
所述PD-L1特異性的ISVD能夠阻斷PD-L1結合PD1。在某些情況下，PD-L1特異性的ISVD能夠阻斷PD-L1結合CD80。
所述PD-L1特異性的ISVD可以與參考抗PD-L1抗體交叉競爭結合PD-L1。
所述對照抗PD-L1抗體可以包括重鏈CDR3。所述重鏈CDR3可以包括如DSFX1X2PTCX3X4X5X6SSGAFQY(SEQ ID NO：1)所示的胺基酸序列，其中X1可以為E或G；X2可以為D或Y；X3可以為T或P；X4可以為L或G； X5可以為V或P；和X6可以為T或A。在某些情況下，所述參考抗PD-L1抗體可以包括重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO：5和9中任一項所示的胺基酸序列。所述對照抗PD-L2抗體也可以包括重鏈CDR1。所述重鏈CDR1可以包括如GX1X2X3X4X5RCMA(SEQ ID NO：2)所示的胺基酸序列，其中X1可以為K或N；X2可以為M或I；X3可以為S或I；X4可以為S或R；和X5可以為R或V。例如，所述對照抗PD-L1抗體可以包括重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO：3和7中任一項所示的胺基酸序列。在某些情況下，所述參考抗PD-L1抗體可以包括重鏈CDR2。所述重鏈CDR2可以包含SEQ ID NO：4、8和11中任一項所示的胺基酸序列。在某些情況下，所述對照抗PD-L1抗體為PD-L1特異性的ISVD，比如抗PD-L1 VHH。所述參考抗PD-L1抗體可以包括重鏈可變結構域。所述參考抗PD-L1抗體可以包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：6、10、12、13、14和15中任一項所示的胺基酸序列。例如，所述重鏈可變結構域可以包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
在本申請中，所述PD-L1特異性的ISVD(例如，如在本申請的二聚體中包括的)可以包括重鏈CDR3。重鏈CDR3可以包含DSFX1X2PTCX3X4X5X6SSGAFQY(SEQ ID NO：1)所示的胺基酸序列，其中X1可以為E或G；X2可以為D或Y；X3可以為T或P；X4可以為L或G；X5可以為V或P；和X6可以為T或A。例如，PD-L1特異性的ISVD可以包括重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO：5和9中任一項所示的胺基酸序列。
例如，所述PD-L1特異性的ISVD可以包括重鏈CDR3，所述重鏈CDR3包含與SEQ ID NO：5和9中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%(例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至 少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%)同一性的胺基酸序列。在某些情況下，所述重鏈CDR3可以包括具有SEQ ID NO：5和9中任一項所示的序列中一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸缺失、插入和/或取代的胺基酸序列。
在本申請中，所述PD-L1特異性的ISVD(例如，如在本申請的二聚體中包括的)也可包括重鏈CDR1。重鏈CDR1可以包含GX1X2X3X4X5RCMA(SEQ ID NO：2)所示的胺基酸序列，其中X1可以為K或N；X2可以為M或I；X3可以為S或I；X4可以為S或R；和X5可以為R或V。例如，PD-L1特異性的ISVD可以包括重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO：3和7中任一項所示的胺基酸序列。
例如，所述PD-L1特異性的ISVD可以包括重鏈CDR1，所述重鏈CDR1包含與SEQ ID NO：3和7中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%(例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%)同一性的胺基酸序列。在某些情況下，所述重鏈CDR1可以包含具有SEQ ID NO：3和7中任一項所示的序列中一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸缺失、插入和/或取代的胺基酸序列。
在本申請中，所述PD-L1特異性的ISVD(例如，如在本發明的二聚體中包括的)可以進一步包括重鏈CDR2。所述重鏈CDR2可以包括任何合適的胺基酸序列。在某些情況下，PD-L1特異性的ISVD可以包括重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO：4、8和11中任一項所示的胺基酸序列。
例如，所述PD-L1特異性的ISVD可以包括重鏈CDR2，所述重鏈CDR2包含與SEQ ID NO：4、8和11中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%(例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%)同一性的胺基酸序列。在某些情況下，所述重鏈CDR2可以包括具有SEQ ID NO：4、8和11中任一項所示的序列中一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸缺失、插入和/或取代的胺基酸序列。
在本申請中，所述PD-L1(例如，如在本發明的二聚體中包括的)特異性的ISVD可以包括重鏈可變結構域。PD-L1特異性的ISVD可以包括重鏈可變結構域，其包含如在SEQ ID NO：6、10、12、13、14和15中任一項所示的胺基酸序列。例如，所述重鏈可變結構域可以包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
例如，PD-L1特異性的ISVD可以包括重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含與SEQ ID NO：6、10、12、13、14和15中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%(例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、 至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%)同一性的胺基酸序列。在某些情況下，PD-L1特異性的ISVD可以包括重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：6、10、12、13、14和15中任一項所示的序列中一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸缺失、插入和/或取代的胺基酸序列。
在本申請中，所述PD-L1特異性的ISVD可以包含SEQ ID NO：6、10、12、13、14和15中任一項所示的胺基酸序列。例如，所述PD-L1(例如，如在本發明的二聚體中包括的)特異性的ISVD可以包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。例如，PD-L1特異性的ISVD可以包含與SEQ ID NO：6、10、12、13、14和15中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%(例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%)同一性的胺基酸序列。在某些情況下，PD-L1特異性的ISVD可以包含具有SEQ ID NO：6、10、12、13、14和15中任一項所示的序列中一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸缺失、插入和/或取代的胺基酸序列。
在某些情況下，所述PD-L1特異性的ISVD包括重鏈可變結構域(VH或VHH)或由其組成。
例如，所述PD-L1特異性的ISVD可選自PD-L1 ISVD-9、PD-L1 ISVD-6、PD-L1 ISVD-m3、PD-L1 ISVD-4、PD-L1 ISVD-11和PD-L1 ISVD-13。
所述CTLA4特異性的ISVD能夠特異性結合人CTLA4。例如，所述CTLA4特異性的ISVD能夠特異性結合人CTLA4的胞外域中的表位，這樣的表位可以包括在CN107400166A中描述的那些和由Udupi A.Ramagopal,et.al.,PNAS 2017 May,114(21)描述的那些。
所述CTLA4特異性的ISVD能夠阻斷CTLA4與CD80的結合。在某些情況下，CTLA4特異性的ISVD能夠阻斷CTLA4與CD86的結合。在某些情況下，CTLA4特異性的ISVD可以是人源化的。
所述CTLA4特異性的ISVD可以與對照抗CTLA4抗體交叉競爭結合CTLA4。
所述對照抗CTLA4抗體可以包括重鏈CDR3。所述重鏈CDR3可以包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。所述對照抗CTLA4抗體也可包括重鏈CDR1。所述重鏈CDR1可以包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列。在某些情況下，所述參考抗CTLA4抗體可以包括重鏈CDR2。所述重鏈CDR2可以包括如AIX1X2GGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：16)所示的胺基酸序列，其中：X1可以為Y或S；和X2可以為I或L。例如，所述重鏈CDR2可以包含SEQ ID NO：18、21和23中任一項所示的胺基酸序列。在某些情況下，所述對照抗CTLA4抗體為CTLA4特異性的ISVD，比如抗CTLA4 VHH。所述對照抗CTLA4抗體可以包括重鏈可變結構域。所述參考抗CTLA4抗體可以包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：20、22和24-32中任一項所示的胺基酸序列。例如，所述重鏈可變結構域可以包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。
在本申請中，所述CTLA4特異性的ISVD(例如，如在本發明的二聚體中包括的)可以包括重鏈CDR3。所述重鏈CDR3可以包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。
在某些情況下，所述CTLA4特異性的ISVD可以包括重鏈CDR3，所述重鏈CDR3包含與SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列具有至少80%(例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%)同一性的胺基酸序列。在某些情況下，所述重鏈CDR3可以包括具有SEQ ID NO：19所示的序列中一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸缺失、插入和/或取代的胺基酸序列。
在本發明中，所述CTLA4(例如，如在本發明的二聚體中包括的)特異性的ISVD也可包括重鏈CDR1。所述重鏈CDR1可以包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列。
在某些情況下，所述CTLA4特異性的ISVD可以包括重鏈CDR1，所述重鏈CDR1包含與SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列具有至少80%(例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%)同一性的胺基酸序列。在某些情況下，所述重鏈CDR1可以包括具有SEQ ID NO：17所示的序列中一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸缺失、插入和/或取代的胺基酸序列。
在本申請中，所述CTLA4特異性的ISVD(例如，如在本發明的二聚體中包括的)可以進一步包括重鏈CDR2。所述重鏈CDR2可以包含AIX1X2GGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：16)所示的胺基酸序列，其中X1可以為Y或S；和X2可以為I或L。在某些情況下，CTLA4特異性的ISVD可以包括重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO：18、21和23中任一項所示的胺基酸序列。
例如，所述CTLA4特異性的ISVD可以包括重鏈CDR2，所述重鏈CDR2包含與SEQ ID NO：18、21和23中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%(例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%)同一性的胺基酸序列。在某些情況下，所述重鏈CDR2可以包括具有SEQ ID NO：18、21和23中任一項所示的序列中一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸缺失、插入和/或取代的胺基酸序列。
在本發明中，所述CTLA4特異性的ISVD(例如，如在本發明的二聚體中包括的)可以包括重鏈可變結構域。CTLA4特異性的ISVD可以包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：20、22和24-32中任一項所示的胺基酸序列。例如，所述重鏈可變結構域可以包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。
例如，所述CTLA4特異性的ISVD可以包括重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含與SEQ ID NO：20、22和24-32中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%(例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至 少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%)同一性的胺基酸序列。在某些情況下，CTLA4特異性的ISVD可以包括重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：20、22和24-32中任一項所示的序列中一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸缺失、插入和/或取代的胺基酸序列。
在本申請中，所述CTLA4特異性的ISVD可以包含SEQ ID NO：20、22和24-32中任一項所示的胺基酸序列。例如，CTLA4特異性的ISVD(例如，如在本發明的二聚體中包括的)可以包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。
例如，所述CTLA4特異性的ISVD可以包括與SEQ ID NO：20、22和24-32中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%(例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%)同一性的胺基酸序列。在某些情況下，CTLA4特異性的ISVD可以包括具有SEQ ID NO：20、22和24-32中任一項所示的序列中一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸缺失、插入和/或取代的胺基酸序列。
在某些情況下，所述CTLA4特異性的ISVD包括重鏈可變結構域(VH或VHH)或由其組成。
例如，所述CTLA4特異性的ISVD可選自CTLA4 ISVD-34、CTLA4 ISVD-C1、CTLA4 ISVD-13、CTLA4 ISVD-26、CTLA4 ISVD-27、CTLA4 ISVD-28、CTLA4 ISVD-29、CTLA4 ISVD-30、CTLA4 ISVD-31、CTLA4 ISVD-32和CTLA4 ISVD-33。
例如，本申請的二聚體可以包括兩條多肽鏈或由其組成。所述兩條多肽鏈的胺基酸序列可以相同或不同。在某些情況下，本申請的二聚體可以為同二聚體。
在本申請中，所述二聚體的兩條多肽鏈中的一條或兩條可以包含權利要求40-43、46、48和50的任一項所示的胺基酸序列。例如，所述二聚體的兩條多肽鏈的一條或兩條可以包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
在特定實例中，所述二聚體的兩條多肽鏈中的一條或兩條可以包括與SEQ ID NO：40-43、46、48和50中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%(例如，至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%)同一性的胺基酸序列。在某些情況下，所述二聚體的兩條多肽鏈中的一條或兩條可以包括具有SEQ ID NO：40-43、46、48和50中任一項所示的序列中一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸缺失、插入和/或取代的胺基酸序列。
在一個實例中，PD-L1特異性的ISVD可以融合(直接地或間接地，例如藉由連接子，比如肽連接子)至CTLA4特異性的ISVD的N-末端胺基酸，形成雙特異性結合部分。然後，一個這樣的雙特異性結合部分可以融合(直接地 或間接地，例如藉由連接子，比如肽連接子)至本發明的一個Fc亞基的N-末端胺基酸，得到二聚體的一條多肽鏈。然後，另一個這樣的雙特異性結合部分可以融合(直接地或間接地，例如藉由連接子，比如肽連接子)至本發明的另一個Fc亞基的N-末端胺基酸，得到二聚體的另一條多肽鏈。所述兩條多肽鏈的兩個Fc亞基可以相互結合(例如，經由非共價相互作用和/或二硫鍵或其它共價鍵，在某些情況下，這樣的共價鍵不是肽鍵)，形成二聚體。所述兩個雙特異性結合部分可以相同或不同。所述兩個Fc亞基可以相同或不同。
在某些實施方案中，所述二聚體為包括兩條相同的多肽鏈的蛋白質同二聚體，每條多肽鏈包括融合至一個Fc亞基的雙特異性結合部分中的一個，所述兩個Fc亞基相互結合形成蛋白質同二聚體。所述兩個Fc亞基可以藉由非共價相互作用和/或二硫鍵或其它共價鍵(在某些情況下，這樣的共價鍵不是肽鍵)相互結合。
本發明的二聚體能夠與CD80和/或CD86競爭結合CTLA4。例如，所述競爭可以使用表達CTLA4的細胞系比如表達CTLA4的HEK293細胞系在體外實驗中檢驗。作為另一個實例，所述競爭可以在ELISA試驗中檢驗，比如競爭性ELISA試驗。
本發明的二聚體能夠與PD1和/或CD80競爭結合PD-L1。例如，所述競爭可以使用表達PD-L1的細胞系比如表達PD-L1的A375細胞系在體外實驗中檢驗。作為另一個實例，所述競爭可以在ELISA試驗中檢驗，比如競爭性ELISA試驗。
本發明的二聚體能夠阻斷PD-L1與PD-1的結合。在某些情況下，本發明的二聚體能夠阻斷PD-L1與CD80的結合。在某些情況下，本發明的二 聚體能夠阻斷CTLA4與CD80的結合。在某些情況下，本發明的二聚體能夠阻斷CTLA4與CD86的結合。
本發明的二聚體可以結合CTLA4，K D 值不大於約1×10-6M，例如，不大於約1×10-7M，不大於約1×10-8M，不大於約0.5×10-8M，不大於約1×10-9M，不大於約1×10-10M或更低。
本發明的二聚體可以結合PD-L1，K D 值不大於約1×10-6M，例如，不大於約1×10-7M，不大於約1×10-8M，不大於約0.5×10-8M，不大於約1×10-9M，不大於約1×10-10M或更低。
本發明的二聚體能夠刺激免疫細胞(例如，PBMC細胞)分泌免疫調節劑(例如，IL-2)。
例如，本發明的二聚體可選自aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.9-L-aCTLA4.34-Fc、aCTLA4.34-aPDL1.9-Fc、aCTLA4.34-L-aPDL1.9-Fc、aPDL1.6-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.m3-aCTLA4.34-Fc和aPDL1.9-aCTLA4.13-Fc。
在另一個方面，本發明提供一種免疫綴合物。所述免疫綴合物可以包括一種或多種根據本發明的二聚體。所述免疫綴合物可以進一步包括一種或多種另外的部分，比如一種或多種另外的結合部分或一種或多種另外的效應部分。
在另一個方面，本發明提供一種分離的核酸或多種分離的核酸，其能夠編碼本申請的二聚體。例如，所述分離的核酸或所述多種分離的核酸可以包括一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)核酸分子。每個核酸分子可以編碼完整二聚體或其部分。例如，核酸分子可以包括編碼所述二聚體的不同部分(例如，所述PD-L1特 異性的ISVD或其部分，所述CTLA4特異性的ISVD或其部分，所述Fc亞基或其部分，和/或所述雙特異性結合部分或其部分，等)的各種片段，並且所述各種片段可以為直接地或間接地連接在一起形成一個核酸分子。在某些情況下，存在超過一個核酸分子，並且每個核酸分子編碼所述二聚體的一個部分(例如，所述PD-L1特異性的ISVD或其部分，所述CTLA4特異性的ISVD或其部分，所述Fc亞基或其部分，和/或所述雙特異性結合部分或其部分，等)。
根據本發明的一種分離的核酸或多種分離的核酸可以基於反映它們編碼的表達產物的胺基酸序列的信息來製備或獲得。這可以根據本領域一般實踐獲得，例如自動化DNA合成和/或DNA重組技術。可選地，在某些情況下，根據本發明分離的核酸可以從合適的天然來源分離。
在另一個方面，本發明提供一種載體或多種載體，其包括一種分離的核酸或多種分離的核酸。例如，所述載體或多種載體可以包括一種或多種(例如，1-2種、1-3種、1-4種、1-5種、1-6種、1-7種、1-8種、1-9種、1-10種或更多種)本發明的分離的核酸。
合適的載體可以包括例如質粒、內質質粒或YAC。所述載體可以為能夠在體外和/或體內(即，在合適的宿主細胞、宿主生物和/或表達系統中)表達本發明的二聚體的表達載體。表達載體通常可以包括至少一種可操作地連接至一種或多種合適的表達調控元件(例如，啟動子、增強子、終止子等)的本發明的分離的核酸。所述元件及其在特定宿主中表達的序列的選擇是本領域技術人員常見的。調控元件和對本發明的二聚體表達有用的或必需的其它元件的特定實例包括例如啟動子、增強子、終止子、整合因子、可選的標記物、前導序列、報告基因。
在某些實施方案中，根據本發明的載體可選自：質粒、病毒載體、粘性質粒和人工染色體。在某些情況下，載體可選自：PET32b(Novagen)、pCMVp-NEO-BAN、pEGFP、pEGFT-Actin、pSV2和CMV4。在某些實施方案中，載體為pCDNA4(Invitrogen,Cat V86220)和/或PET32b(Novagen,product number：69016-3)。
在另一個方面，本發明提供包括一種分離的核酸或多種分離的核酸、或一種載體或多種載體的分離的宿主細胞。例如，所述宿主細胞可以包括一種或多種(例如，1-2種、1-3種、1-4種、1-5種、1-6種、1-7種、1-8種、1-9種、1-10種或更多種)根據本發明的分離的核酸，和/或一種或多種(例如，1-2種、1-3種、1-4種、1-5種、1-6種、1-7種、1-8種、1-9種、1-10種、或更多種)根據本發明的載體。
根據本發明的宿主細胞可選自：細菌細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞和兩棲動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞和本領域用於表達異源蛋白的任何其它細胞。
細菌細胞可以包括革蘭氏陰性菌株(例如，大腸桿菌菌株(Escherichia coli strains)、變形桿菌菌株(Proteus strains)和假單胞菌菌株(Pseudomonas strains))和革蘭氏陽性菌株(例如，芽孢桿菌屬芽胞桿菌菌株(Bacillus sp.Bacillus strain)、鏈黴菌菌株(Streptomyces strain)、葡萄球菌菌株(Staphylococcus strain)和乳球菌菌株(Lactococcus strain))。
真菌細胞可以包括木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)和麯黴屬(Aspergillus)、或酵母菌屬(Saccharomyces)(例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、溶菌酶酵母菌(lysozyme Yeast)(裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces))(例 如裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤氏酵母屬(Pichia)(例如，巴斯德畢赤酵母)(Pichia pastoris)和甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))和漢遜酵母(Hansenula)屬的種類的細胞。
哺乳動物細胞可以包括例如HEK293細胞、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞和由其衍生的工程化細胞比如GS敲除CHO細胞。
藥物組合物
在另一個方面，本發明提供一種藥物組合物，其包括有效量的本發明的二聚體和/或本發明的免疫綴合物；和視需要的藥學上可接受的賦形劑。在某些情況下，藥物組合物可以包括細胞或組織(比如，基因工程細胞或組織)、根據本發明的二聚體和/或免疫綴合物、或所述細胞或組織包括的片段。
藥學上可接受的賦形劑的實例包括，但不限於，惰性固體稀釋劑和填充劑、稀釋劑、無菌水溶液和各種有機溶劑、滲透促進劑、增溶劑和佐劑。
在某些實施方案中，所述二聚體或免疫綴合物配製用於口服給藥、靜脈內給藥、肌內給藥、在腫瘤部位的原位給藥、吸入、直腸給藥、陰道給藥、經皮給藥或藉由皮下儲庫給藥。
所述藥物組合物可用於抑制腫瘤生長。例如，藥物組合物可抑制或延遲疾病的發展或進展，可減小腫瘤大小(並且甚至基本上消除腫瘤)，和可緩解和/或穩定疾病狀況。
如下所述為非限制性的示例性藥物組合物及其製備方法。
所述藥物組合物可以例如為適用於胃腸外注射的形式，如無菌溶液、混懸劑或乳劑。藥物組合物可以以適於精確劑量的單次給藥的單元劑型存在。藥物組合物可以進一步包括根據本申請的二聚體和/或免疫綴合物作為活性 成分，並且可包括常規藥物載體或賦形劑。進一步，其可包括其它藥物或藥劑、載體、佐劑等。
示例性的腸胃外給藥形式包括但不限於本發明的二聚體和/或免疫綴合物在無菌水溶液，例如丙二醇水溶液或右旋糖水溶液中的溶液或混懸劑。如果需要，這樣的劑型可以合適地用鹽比如組胺酸和/或磷酸鹽作為緩衝劑。
在某些實施方案中，本發明提供一種用於注射的藥物組合物，其包含本發明的二聚體和/或免疫綴合物和適於注射的藥用賦形劑。
其中本發明的藥物組合物可以摻入的注射給藥的形式包括水性或油性混懸液、或含有合適油的乳劑、或無菌水溶液、及類似的藥物載體。
本發明進一步涵蓋包括活性成分(例如，本發明的二聚體和/或免疫綴合物)的無水藥物組合物和劑型，因為水可促進某些多肽的降解。本發明的無水藥物組合物和劑型可以使用無水或水分含量低的成分，並在低水分或低濕度條件下製備。
本發明的二聚體和/或免疫綴合物可以根據常規藥物混合技術與藥物載體混合成緊密混合物。載體可以採用多種形式，取決於期望給藥的製劑形式。在製備組合物中，可以使用任一種常用藥物介質作為載體，比如例如水、二醇、油、醇、矯味劑、防腐劑、著色劑等。
本發明的藥物組合物可以包括治療有效量的活性劑(例如，本發明的二聚體和/或免疫綴合物)。治療有效量為所述藥物組合物能夠預防和/或治癒(至少部分地)患有疾病或病症或存在罹患所述疾病或病症的風險的受試者的所述疾病或病症(例如，癌症)和/或其任何併發症的量。所包括的活性劑的特定數量/濃度可以根據給藥方法和患者需要變化，並且可以基於例如患者的體積、粘度 和/或體重等確定。例如，合適的劑量可以為約0.1mg或1mg/kg/天至約150mg/kg/天(比如，約0.1mg/kg-約0.3mg/kg、約0.1mg/kg-約1mg/kg、約0.1mg/kg-約3mg/kg、約0.1mg/kg-約5mg/kg、約0.1mg/kg-約10mg/kg，比如約1mg/kg至約5mg/kg，比如約3mg/kg至約5mg/kg)；有時，所述劑量可以甚至更高。
醫學用途和治療方法
根據本發明的二聚體、免疫綴合物或藥物組合物可以用於治療有需要的受試者的疾病。
在另一個方面，本發明提供根據本發明的二聚體、免疫綴合物或藥物組合物在治療有需要的受試者的疾病中的用途。
在另一個方面，本發明提供根據本發明的二聚體、免疫綴合物或藥物組合物在製備用於治療有需要的受試者的疾病的藥物中的用途。
在另一個方面，本發明提供一種用於治療有需要的受試者的疾病的方法，包括向所述受試者施用有效量的根據本發明的二聚體、免疫綴合物或藥物組合物。
所述疾病或病症可以為潛在地受PD-L1結合部分和/或CTLA4結合部分影響的任何疾病或病症。
藥物可以配製成適於靜脈內給藥的形式。
在某些實施方案中，所述疾病或病症為癌症。癌症可以為實體瘤、血液癌或淋巴瘤。例如，癌症可選自肺癌(比如，非小細胞肺癌)、乳腺癌(比如，三陰性乳腺癌)、腎癌(比如腎細胞癌)、黑素瘤、子宮頸癌、子宮癌、胰腺癌、腹膜癌、卵巢癌和結腸癌。癌症可以為晚期(疾病)或轉移性的癌症。
在某些情況下，癌症可以為用PD-1拮抗劑和/或PD-L1拮抗劑治療無反應性的。例如，用PD-1拮抗劑和/或PD-L1拮抗劑治療沒有引起實質性或可觀察到的癌症進展或腫瘤生長的延遲或抑制。在某些情況下，在施用本發明的二聚體/組合物/免疫綴合物之前，所述癌症沒有用PD-1拮抗劑和/或PD-L1拮抗劑治療。所述PD-1拮抗劑可以為PD-1阻斷性抗體。所述PD-L1拮抗劑可以為PD-L1阻斷性抗體。
所述癌症或癌細胞可以位於受試者的體內，例如，在人類或非人類動物(例如，哺乳動物)體內的癌症或癌細胞。
在某些情況下，所述癌症/腫瘤可以是不可切除的。
在某些情況下，所述癌症/腫瘤可以為轉移性的(比如，轉移性實體瘤)。
在某些情況下，所述癌症/腫瘤可以為標準療法難治的和/或不耐受的。
受試者可以為哺乳動物。在某些實施方案中，所述哺乳動物為人類。在某些實施方案中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、貓、狗、兔、豬、羊、馬、牛、山羊、沙鼠、倉鼠、豚鼠、猴或任何其它哺乳動物。許多這樣的哺乳動物可以是本領域已知作為某些疾病或病症(包括實體瘤和/或其他癌症)的臨床前模型的受試者(例如，Talmadge et al.,2007 Am.J.Pathol.170：793；Kerbel,2003 Canc.Biol.Therap.2(4 Suppl 1)：S134；Man et al.,2007 Canc.Met.Rev.26：737；Cespedes et al.,2006 Clin.TransL Oncol.8：318)。
在另一個方面，本發明提供一種阻斷CD80和/或CD86與CTLA4結合的方法，包括給予根據本發明的二聚體、免疫綴合物或藥物組合物。
在另一個方面，本發明提供一種阻斷PD1和/或CD80與PD-L1結合的方法，包括給予根據本發明的二聚體、免疫綴合物或藥物組合物。
在另一個方面，本發明提供一種刺激免疫細胞分泌細胞因子(比如白細胞介素，例如IL-2)的方法，包括向所述免疫細胞施用本發明的二聚體、免疫綴合物或藥物組合物。所述免疫細胞可以包括例如PBMC細胞、T細胞或其它免疫細胞。
在另一個方面，本發明提供一種增強受試者的免疫應答的方法，包括向所述受試者施用根據本發明的二聚體、免疫綴合物或藥物組合物。
增強的免疫應答可以包括例如增強的體液免疫應答(即，B細胞應答)和/或細胞應答(即，T細胞應答)。增強的體液免疫應答可以藉由例如顯示處理的受試者中的抗體滴度升高(例如，如藉由ELISA試驗的)證實。增強的細胞免疫應答可以藉由例如處理的T細胞或來自處理的受試者的T細胞被高度活化來證實。T細胞活化可以藉由當用抗原(例如，ELISpot)體外刺激T-細胞時測定T細胞增殖或T細胞細胞因子生成(elaboration)來評價。T細胞活化也可將經由流式細胞儀測定。
二聚體的製備方法
在另一個方面，本發明提供一種用於製備根據本發明的二聚體的方法，包括：(i)在實現所述二聚體表達和形成的條件下，培養本發明的宿主細胞，和(ii)收集所形成的二聚體。
在某些實施方案中，所述方法不包括將所述二聚體富集在由根據本發明的宿主細胞表達的產物中。
在某些實施方案中，所述方法進一步包括分離和/或純化所述二聚體的步驟。
在某些實施方案中，所述方法進一步包括用編碼/表達本發明的二聚體的多核苷酸/載體、其一個或多個成員或其片段轉染/轉化宿主細胞。
在某些實施方案中，藉由在適用於蛋白表達的條件下在細胞中表達載體來製備本發明的二聚體。
適用於蛋白質表達的條件之間變化的因素包括多種因素，比如培養時間、溫度和培養基，且可以取決於細胞類型，將由本領域普通技術人員容易地確定。
在某些實施方案中，在製備本發明的二聚體的過程期間，使宿主細胞在培養物和可用於使培養物生長的任何裝置(包括發酵罐)中生長。所述細胞可以呈單細胞層或附著於表面生長。可選地，宿主細胞可以在懸浮液中生長。所述細胞可以在不含血清的培養基中生長。所述培養基可以為市售可獲得的培養基。
雖然本文已經顯示和描述了本發明的較佳的實施方案，但是對本領域技術人員而言將顯而易見的是這樣的實施方案僅藉由舉例提供。現在，在沒有背離本發明的情況下，本領域技術人員將想到許多變化、改變和替代。應當理解，在實施本發明時可以使用本發明所述的實施方案的各種替代。預期下述權利要求書限定了本申請的範圍，但是所述方法和結構都在這些申請專利範圍及其涵蓋的等同物的範圍之內。
給出下述實施例以便給本領域普通技術人員提供如何製備和使用本發明的完整內容和說明，而不意欲限制本發明人認為其發明的範圍，也不意欲表示下述試驗是進行的全部和唯一的試驗。已經進行了努力以確保所用數值(例如數量、溫度等)的準確性，但是應當考慮到某些實驗誤差和偏差。除非另有說明，否則份數為重量份，分子量為重均分子量，溫度為攝氏溫度，壓力為常壓或接近常壓。可以使用標準縮寫詞，例如bp，堿基對；kb，千堿基對；pl，微微升；s或sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時；aa，胺基酸；nt，核苷酸；i.m.，肌內；i.p.，腹膜內；s.c.，皮下等。
實施例1 蛋白質的製備
重組DNA技術
使用標準方法處理DNA，如在例如Sambrook et al.,Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989中描述的。根據製造商的說明使用分子生物學試劑。關於人免疫球蛋白的輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息在下述中給出：Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publication No.91-3242。
基因合成
期望的基因片段是藉由PCR使用合適的模板製備得到，或者由合成的寡核苷酸和PCR產物藉由自動基因合成試劑合成得到。這樣的基因合成試劑可商購，例如Invitrogen(Life Technologies,Inc.Carlsbad,Calif.)和Geneart AG(Regensburg,Germany)。將單一限制性核酸內切酶裂解位點兩側的基因片段選殖到標準選殖/測序載體中。質粒DNA是由轉化的細菌純化的，並藉由UV光譜測定濃度。藉 由DNA測序確認亞次選殖基因片段的DNA序列。基因片段設計有合適的限制性位點，以允許次選殖到各自表達載體中。
1.1 CTLA4特異性的ISVD
下述CTLA4特異性的ISVD是根據如下所述胺基酸序列重組產生的。
在CTLA4特異性的ISVD中，CTLA4 ISVD-13和CTLA4 ISVD C1具有相同的CDR1序列和相同的CDR3序列，但它們的CDR2區域稍有不同。
使用蛋白質表面重排法(protein resurfacing method)和將CDR移植到VHH的通用框架中來製備CTLA4 ISVD-C1和CTLA4 ISVD-13的人源化的變體。簡而言之，使用軟件Modeller9分別對CTLA4 ISVD-C1和CTLA4 ISVD-13建模，使用的參考抗體為抗體cAb-Lys3(PDB號：number：1XFP)，並且計算其相對溶劑可及性。藉由取代預測為暴露於溶劑的CTLA4 ISVD-C1或CTLA4 ISVD-13中一個或多個胺基酸產生人源化的變體。
CTLA4 ISVD-C1包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列的HCDR3。CTLA4 ISVD-C1包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列。
CTLA4 ISVD-31是CTLA4 ISVD-C1的一種人源化變體。CTLA4 ISVD-31包含一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列的HCDR3。CTLA4 ISVD-31包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
CTLA4 ISVD-32是CTLA4 ISVD-C1的另一種人源化變體。CTLA4 ISVD-32包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列的HCDR3。CTLA4 ISVD-32包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
CTLA4 ISVD-33是CTLA4 ISVD-C1的另一種人源化變體。CTLA4 ISVD-33包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列的HCDR3。CTLA4 ISVD-33包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。
CTLA4 ISVD-34是CTLA4 ISVD-C1的另一種人源化變體。CTLA4 ISVD-34包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列的HCDR3。CTLA4 ISVD-34包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列。
CTLA4 ISVD-13包含一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列的HCDR3。CTLA4 ISVD-13包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
CTLA4 ISVD-26是CTLA4 ISVD-13的一種人源化變體。CTLA4 ISVD-26包括一種重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列的 HCDR2、和具有SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列的HCDR3。CTLA4 ISVD-26包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
CTLA4 ISVD-27是CTLA4 ISVD-13的另一種人源化變體。CTLA4 ISVD-27包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列的HCDR3。CTLA4 ISVD-27包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
CTLA4 ISVD-28是CTLA4 ISVD-13的另一種人源化變體。CTLA4 ISVD-28包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列的HCDR3。CTLA4 ISVD-28包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
CTLA4 ISVD-29是CTLA4 ISVD-13的另一種人源化變體。CTLA4 ISVD-29包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列的HCDR3。CTLA4 ISVD-29包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
CTLA4 ISVD-30是CTLA4 ISVD-13的另一種人源化變體。CTLA4 ISVD-30包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列的HCDR3。CTLA4 ISVD-30包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
CDR序列藉由結合Kabat定義和Chothia定義進行定義。
1.2 PD-L1特異性的ISVD
下述PD-L1特異性的ISVD是根據如下所述胺基酸序列重組製備的。
PD-L1 ISVD-6(特別是在CDR3區域中)的胺基酸序列與PD-L1 ISVD-4及其人源化的變體高度類似。PD-L1 ISVD-m3的CDR1和CDR3與PD-L1 ISVD-4的相同，然而，其CDR2區域與PD-L1 ISVD-4的完全不同。
使用蛋白表面重排法和將CDR移植到VHH的通用框架中製備PD-L1 ISVD-4的人源化的變體。簡而言之，使用軟件Modeller9對PD-L1 ISVD-4造模，使用的參考抗體為抗體cAb-Lys3(PDB號：1XFP)，並計算其相對溶劑可及性。藉由取代預測為暴露於溶劑的PD-L1 ISVD-4中的一個或多個胺基酸產生人源化的變體。
PD-L1 ISVD-4包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列的HCDR3。PD-L1 ISVD-4包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。
PD-L1 ISVD-9是PD-L1 ISVD-4的一種人源化變體。PD-L1 ISVD-9包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列的HCDR3。PD-L1 ISVD-9包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
PD-L1 ISVD-11是PD-L1 ISVD-4的另一種人源化變體。PD-L1 ISVD-11包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO： 3所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列的HCDR3。PD-L1 ISVD-11包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列。
PD-L1 ISVD-13是PD-L1 ISVD-4的另一種人源化變體。PD-L1 ISVD-13包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列的HCDR2、和SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列的HCDR3。PD-L1 ISVD-13包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
PD-L1 ISVD-6包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列的HCDR3。PD-L1 ISVD-6包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
PD-L1 ISVD-m3包括一個重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含具有SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列的HCDR2、和具有SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列的HCDR3。PD-L1 ISVD-m3包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列。
CDR序列藉由結合Kabat定義和Chothia定義進行定義。
1.3 產生本發明的二聚體
作為實例，產生下述本發明的二聚體：aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.9-L-aCTLA4.34-Fc、aCTLA4.34-aPDL1.9-Fc、aCTLA4.34-L-aPDL1.9-Fc、aPDL1.6-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.m3-aCTLA4.34-Fc和aPDL1.9-aCTLA4.13-Fc。
基於來自蛋白質數據庫Uniprot(P01857)(SEQ ID NO：36)的人免疫球蛋白γ1(IgG1)的恆定區胺基酸序列獲得具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的胺基酸序列(SEQ ID NO：35或38)。然後，使用在線工具DNAworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)設計編碼其的相應DNA序列。
對於aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc，將實施例1.2的PD-L1 ISVD-9藉由較短的連接子GAP(SEQ ID NO：33)融合至實施例1.1的CTLA4 ISVD-34的N-末端，得到雙特異性結合部分aPDL1.9-aCTLA4.34。然後，將aPDL1.9-aCTLA4.34融合至具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的N-末端胺基酸，得到aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc，其包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
對於aPDL1.9-L-aCTLA4.34-Fc，將實施例1.2的PD-L1 ISVD-9藉由較長連接子GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：34)融合至實施例1.1的CTLA4 ISVD-34的N-末端，得到雙特異性結合部分aPDL1.9-L-aCTLA4.34。然後，將aPDL1.9-L-aCTLA4.34融合至具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的N-末端胺基酸，得到aPDL1.9-L-aCTLA4.34-Fc，其包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列。
對於aCTLA4.34-aPDL1.9-Fc，將實施例1.1的CTLA4 ISVD-34藉由較短的連接子基GAP(SEQ ID NO：33)融合至實施例1.2的PD-L1 ISVD-9的N-末端，得到雙特異性結合部分aCTLA4.34-aPDL1.9。然後，將aCTLA4.34-aPDL1.9融合至具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的N-末端胺基酸，得到aCTLA4.34-aPDL1.9-Fc，其包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
對於aCTLA4.34-L-aPDL1.9-Fc，將實施例1.1的CTLA4 ISVD-34藉由較長連接子GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：34)融合至實施例1.2的PD-L1 ISVD-9的N-末端，得到雙特異性結合部分aCTLA4.34-L-aPDL1.9。然後， 將使aCTLA4.34-L-aPDL1.9融合至具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的N-末端胺基酸，得到aCTLA4.34-L-aPDL1.9-Fc，其包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
對於aPDL1.6-aCTLA4.34-Fc，將實施例1.2的PD-L1 ISVD-6藉由較短的連接子GAP(SEQ ID NO：33)融合至實施例1.1的CTLA4 ISVD-34的N-末端，得到雙特異性結合部分aPDL1.6-aCTLA4.34。然後，將aPDL1.6-aCTLA4.34融合至具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的N-末端胺基酸，得到aPDL1.6-aCTLA4.34-Fc，其包含SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
對於aPDL1.m3-aCTLA4.34-Fc，將實施例1.2的PD-L1 ISVD-m3藉由較短的連接子GAP(SEQ ID NO：33)融合至實施例1.1的CTLA4 ISVD-34的N-末端，得到雙特異性結合部分aPDL1.m3-aCTLA4.34。然後，將aPDL1.m3-aCTLA4.34融合至具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的N-末端胺基酸，得到aPDL1.m3-aCTLA4.34-Fc，其包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列。
對於aPDL1.9-aCTLA4.13-Fc，將實施例1.2的PD-L1 ISVD-9藉由較短的連接子GAP(SEQ ID NO：33)融合至實施例1.1的CTLA4 ISVD-13的N-末端，得到雙特異性結合部分aPDL1.9-aCTLA4.13。然後，使aPDL1.9-aCTLA4.13融合至具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的N-末端胺基酸，得到aPDL1.9-aCTLA4.13-Fc，其包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列。
1.4 產生對照分子
作為對照，製備dAb，其為無功能的單結構域多肽(在野生型或雙敲除的小鼠中都沒有功能)，包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列。
基於來自蛋白質數據庫Uniprot(P01857)(SEQ ID NO：36)的人免疫球蛋白γ1(IgG1)的恆定區胺基酸序列獲得具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的胺基酸序列(SEQ ID NO：35或38)。然後，使用在線工具DNAworks(helixweb.nih.gov/dnaworks/)設計編碼其相應的DNA序列。
然後，製備下述對照二聚體：aPDL1.9-dAb-Fc、dAb-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.6-dAb-Fc、aPDL1.m3-dAb-Fc和dAb-aCTLA4.13-Fc。
在aPDL1.9-dAb-Fc中，將實施例1.2的PD-L1 ISVD-9藉由短的連接子GAP(SEQ ID NO：33)融合至所述對照dAb的N-末端，得到aPDL1.9-dAb。然後，將aPDL1.9-dAb融合至具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的N-末端胺基酸，得到aPDL1.9-dAb-Fc，其包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列。
在aPDL1.6-dAb-Fc中，將實施例1.2的PD-L1 ISVD-6藉由短的連接子GAP(SEQ ID NO：33)融合所述對照dAb的N-末端，得到aPDL1.6-dAb。然後，將aPDL1.6-dAb融合至具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的N-末端胺基酸，得到aPDL1.6-dAb-Fc，其包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列。
在aPDL1.m3-dAb-Fc中，將實施例1.2的PD-L1 ISVD-m3藉由短的連接子GAP(SEQ ID NO：33)融合至所述對照dAb的N-末端，得到aPDL1.m3-dAb。然後，將aPDL1.m3-dAb融合至具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的N-末端胺基酸，得到aPDL1.m3-dAb-Fc，其包含SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列。
在dAb-aCTLA4.34-Fc中，將對照dAb藉由短的連接子GAP(SEQ ID NO：33)融合至實施例1.1的CTLA4 ISVD-34，得到dAb-aCTLA4.34。然後，將dAb-aCTLA4.34融合至具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的N-末端胺基酸，得到dAb-aCTLA4.34-Fc，其包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列。
在dAb-aCTLA4.13-Fc中，將對照dAb藉由短的連接子GAP(SEQ ID NO：33)融合至實施例1.1的CTLA4 ISVD-13，得到dAb-aCTLA4.13。然後， 使dAb-aCTLA4.13融合至具有鉸鏈的人IgG1-Fc區的N-末端胺基酸，得到dAb-aCTLA4.13-Fc，其包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列。
第1A圖至第1B圖提供本發明的二聚體的實例，其中1指PD-L1特異性的ISVD，2指CTLA4特異性的ISVD，3指包括Fc亞基的Fc結構域，和4指雙特異性部分。
1.5 表達和純化
將上述實施例1.3和1.4中描述的編碼aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.9-L-aCTLA4.34-Fc、aCTLA4.34-aPDL1.9-Fc、aCTLA4.34-L-aPDL1.9-Fc、aPDL1.6-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.m3-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.9-aCTLA4.13-Fc、aPDL1.9-dAb-Fc、dAb-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.6-dAb-Fc、aPDL1.m3-dAb-Fc或dAb-aCTLA4.13-Fc的核酸序列選殖到表達載體pCDNA4(Invitrogen,Cat V86220)中，分別得到相應的重組表達載體。
然後，用這些重組表達載體轉染HEK293細胞，進行重組蛋白表達。簡而言之，將質粒用Freestyle293培養基稀釋，其中加入PEI(聚乙烯亞胺)溶液。將每種質粒/PEI溶液加入到HEK293細胞懸液中，並在37℃、10% CO2、90rpm下培養5-6天。收集上清液，並使用A蛋白親和色譜純化，分別得到純化的重組蛋白質二聚體或對照分子：aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.9-L-aCTLA4.34-Fc、aCTLA4.34-aPDL1.9-Fc、aCTLA4.34-L-aPDL1.9-Fc、aPDL1.6-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.m3-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.9-aCTLA4.13-Fc、aPDL1.9-dAb-Fc、dAb-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.6-dAb-Fc、aPDL1.m3-dAb-Fc和dAb-aCTLA4.13-Fc。
作為實例，檢測二聚體aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc、aPDL1.9-L-aCTLA4.34-Fc、aCTLA4.34-aPDL1.9-Fc和aCTLA4.34-L-aPDL1.9-Fc及對照aPDL1.9-dAb-Fc和dAb-aCTLA4.34-Fc的產量，結果顯示在表2中。
實施例2 結合活性
2.1 方法
2.1.1 藉由ELISA試驗測定的與可溶性CTLA4的結合親和力
用CTLA4-muFc(融合至小鼠Fc的N-末端的人CTLA4胞外域，其胺基酸序列為SEQ ID NO：52所示的)塗布96孔板。加入各種濃度的樣品以及對照分子。使用HRP標記的山羊抗人Fc抗體進行檢測。在用TMB顯色後，在微板讀數儀中以450/650nm的波長讀板。
2.1.2 藉由ELISA試驗測定的與可溶性PD-L1的結合親和力
用PD-L1-muFc(融合至小鼠Fc的N-末端的人PD-L1胞外域，其胺基酸序列為SEQ ID NO：53所示的)塗布96孔板。加入各種濃度的樣品以及對照分子。 使用HRP標記的山羊抗人Fc抗體進行檢測。在用TMB顯色後，在微板讀數儀中以450/650nm的波長讀板。
2.1.3 藉由橋聯ELISA試驗測定的與可溶性PD-L1和CTLA4結合的親和力
用PD-L1-huFc(融合至人Fc的N-末端的人PD-L1胞外域，其胺基酸序列為SEQ ID NO：54所示的)塗布96孔板。加入各種濃度的樣品以及對照分子。然後，使用CTLA4-muFc檢測結合的樣品，然後，使用HRP標記的山羊抗小鼠Fc抗體作為二級抗體。在用TMB顯色後，在微板讀數器中以450/650nm的波長讀板。
2.1.4 藉由SPR檢測結合親和力
使用Biacore X100進行該測定。將樣品稀釋並以3nM的濃度固定在A蛋白傳感芯片的表面上。將包含CTLA4的溶液稀釋，並分別製備成800nM、400nM、200nM、100nM和50nM的濃度。或者，如果使用PD-L1-muFc，將其稀釋成100nM、33.3nM、11.1nM、3.70nM、1.23nM。在結合、解離和再生之後，測量結合的動力學常數(KD)。
2.1.5 藉由BLI測量結合
使用Fortebio's Octet K2平臺進行該測定。將樣品稀釋，並使用生物傳感器在10μg/mL的濃度進行捕獲。將包含PD-L1的溶液稀釋，並分別製備成50nM、25nM、12.5nM、6.25nM和3.125nM。在進行標準化(基準)、結合、解離和再生過程後，得到結合的動力學常數(KD)。
2.1.6 與膜結合配體的結合活性
體外結合A375-hPD-L1細胞
將樣品稀釋，並分別製備成0.091、0.27、0.82、2.45、7.41、22.22、66.67和200μM的濃度。將A375-hPD-L1細胞(具有恆定表達人PD-L1蛋白質的A375細胞系，將人PD-L1的表達盒穩定地轉染到A374細胞系中產生)密度調節為4×106細胞/mL。在結合和洗滌過程之後，將樣品載入流式細胞儀進行分析，以測量熒光強度中位值(MFI)。
體外結合HEK293-CTLA4細胞
將樣品稀釋至2μM(採用1μM的儲備溶液製備)，然後用稀釋緩衝液連續稀釋5倍。將HEK293-CTLA4細胞(具有瞬時表達人CTLA4蛋白的HEK293細胞系，其藉由將人CTLA4表達盒瞬時轉染到HEK293細胞系中產生)的密度調節為4×106細胞/ml。在結合和洗滌過程之後，測試總共8個濃度梯度。
2.2 結果
第2A圖顯示本發明的二聚體與可溶性人CTLA4的結合。可以看出，對於所述二聚體的N-末端的CTLA4特異性的ISVD，或者在所述二聚體的N-末端的PD-L1特異性的ISVD，觀察到類似的結合親和力，例如，如EC50值所示的。類似地，當在CTLA4特異性的ISVD和PD-L1特異性的ISVD之間使用短連接子(例如，GAP)或較長連接子(例如，GGGGSGGGGSGGGGS)時，觀察到相當的結合親和力。對於aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc、aCTLA4.34-aPDL1.9-Fc、aPDL1.9-L-aCTLA4.34-Fc和aCTLA4.34-L-aPDL1.9-Fc，EC50值為約40ng/mL。
第2B圖顯示本發明的二聚體與可溶性人PD-L1的結合。使用抗PD-L1抗體durvalumab(AstraZeneca)作為陽性對照，另外，使用aPDL1.9-dAb-Fc作為對照，其不含任何功能性CTLA4靶標部分。
可以看出，對於本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)、抗PD-L1抗體durvalumab和對照分子aPDL1.9-dAb-Fc，觀察到相當的結合親和力，EC50值為約0.6nM。
第2C圖顯示本發明的二聚體與可溶性人CTLA4的結合。使用抗CTLA4抗體易普利姆瑪(ipilimumab)(Bristol-Myers Squibb)作為陽性對照，另外，使用dAb-aCTLA4.34-Fc作為對照，其不含任何功能性PD-L1靶標部分。
可以看出，對於本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)、抗CTLA4抗體易普利姆瑪和對照分子dAb-aCTLA4.34-Fc，觀察到相當的結合親和力，EC50值為約0.5nM。
第2D圖顯示本發明的二聚體與可溶性人CTLA4和可溶性PD-L1結合，如橋聯ELISA試驗所示。可以看出，對於所述二聚體的N-末端的CTLA4特異性的ISVD，或者所述二聚體的N-末端的PD-L1特異性的ISVD，觀察到類似的結合親和性，例如，如EC50值所示的。類似地，當在CTLA4特異性的ISVD和PD-L1特異性的ISVD之間使用短連接子(例如，GAP)或較長連接子(例如，GGGGSGGGGSGGGGS)時，觀察到相當的結合親和力。另外，結果表明本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc、aCTLA4.34-aPDL1.9-Fc、aPDL1.9-L-aCTLA4.34-Fc、aCTLA4.34-L-aPDL1.9-Fc)可以同時結合CTLA4和PD-L1，具有相當的結合親和力。
第2E圖顯示本發明的二聚體與可溶性人CTLA4和可溶性PD-L1的結合，如用橋聯ELISA試驗所示。可以看出，對於所述二聚體的CTLA4 ISVD-34或所述二聚體的CTLA4 ISVD-13，獲得可比較的結合親和力。
第2F圖顯示本發明的二聚體與可溶性人CTLA4和可溶性PD-L1的結合，如橋聯ELISA試驗所示。可以看出，與所述二聚體中的PD-L1 ISVD-9、PD-L1 ISVD-6或PD-L1 ISVD-m3具有相當的結合親和力，aPDL1.6-aCTLA4.34-Fc的EC50值稍高於aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc或aPDL1.m3-aCTLA4.34-Fc的EC50值。有趣地是，儘管PD-L1 ISVD-9和PD-L1 ISVD-m3包含幾乎完全不同的CDR2序列，但是當它們應用於本發明的二聚體時表現類似，表明CDR2序列可能對所述二聚體的功能不重要。
還檢驗了本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)與在細胞表面上表達的PD-L1或CTLA4的結合活性，並與對照分子(例如，度伐魯單抗(durvalumab)、易普利姆單抗、aPDL1.9-dAb-Fc、或dAb-aCTLA4.34-Fc)進行比較。結果顯示在第2G圖和第2H圖。
第2G圖顯示本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)可以結合A375-hPDL1細胞，與度伐魯單抗和aPDL1.9-dAb-Fc具有相近的EC50值。
第2H圖顯示本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)可以結合HEK293-CTLA4細胞，與dAb-aCTLA4.34-Fc具有相近的EC50值。然而，本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)結合HEK293-CTLA4細胞，具有比易普利姆瑪更高的EC50值，表明與細胞表面CTLA4的結合親和力降低。這些結果表明本發明的二聚體可以具有比易普利姆單抗更低的毒性。
實施例3 阻斷效力
3.1 方法
3.1.1 阻斷PD-L1結合PD1或CD80的效力
藉由競爭性ELISA評價本發明的二聚體阻斷PD-L1結合PD1或CD80的能力。
簡而言之，用3μg/mL的PD-L1-huFc(SEQ ID NO：54)包被96孔板。然後，將PD1-muFc(SEQ ID NO：58)和本發明的二聚體的混合物，或CD80-muFc(SEQ ID NO：55)和本發明的二聚體的混合物加入到包被PD-L1-huFc的板中。使用的PD1-muFc的濃度為10μg/ml，CD80-muFc的濃度為100μg/mL。將本發明的二聚體連續稀釋。使用HRP標記的山羊抗小鼠IgG1抗體檢測結合的PD1-muFc或CD80-muFc，其含量與本發明的二聚體的阻斷效力反向相關。在用TMB顯色後，在微板讀數儀中以450/650nm的波長讀板。使用度伐魯單抗作為陽性對照。
3.1.2 阻斷CTLA4結合CD80或CD86的效力
藉由競爭性ELISA評價本發明的二聚體阻斷CTLA4結合CD80或CD86的能力。
簡而言之，用3μg/ml的CTLA4-huFc(SEQ ID NO：56)包被96孔板。然後，將CD80-muFc(SEQ ID NO：55)和本發明的二聚體的混合物或CD86-muFc(SEQ ID NO：57)和本發明的二聚體的混合物加入到CTLA4-huFc包被的板中。將本發明的二聚體連續稀釋。使用HRP標記的山羊抗小鼠IgG1抗體檢測結合的CD86-muFc或CD80-muFc。在用TMB顯色後，在微板讀數儀中以450/650nm的波長讀板。使用易普利姆單抗作為陽性對照。
3.2 結果
第3A圖顯示本發明的二聚體在阻斷PD-L1與PD-1結合中的能力。可以看出，對於二聚體的N-末端的CTLA4特異性的ISVD，或者二聚體的N-末端的PD-L1特異性的ISVD，觀察到相近的阻斷能力，例如，如EC50值所示的。類似 地，當在CTLA4特異性的ISVD和PD-L1特異性的ISVD之間使用短連接子(例如，GAP)或較長連接子(例如，GGGGSGGGGSGGGGS)時，觀察到相當的阻斷能力。
第3B圖顯示本發明的二聚體在阻斷PD-L1與PD-1結合中的能力。可以看出，本發明的二聚體的阻斷能力與陽性對照度伐魯單抗或aPDL1.9-dAb-Fc的相當。
第3C圖顯示本發明的二聚體在阻斷PD-L1與CD80結合中的能力。可以看出，本發明的二聚體的阻斷能力與陽性對照度伐魯單抗或aPDL1.9-dAb-Fc的相當。
第3D圖顯示本發明的二聚體在阻斷CTLA4與CD80結合中的能力。可以看出，二聚體aCTLA4.34-aPDL1.9-Fc和aCTLA4.34-L-aPDL1.9-Fc的阻斷能力比aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc和aPDL1.9-L-aCTLA4.34-Fc的阻斷能力更強。
第3E圖顯示本發明的二聚體在阻斷CTLA4與CD80結合中的能力。可以看出，本發明的二聚體的阻斷能力與陽性對照易普利姆單抗或dAb-aCTLA4.34-Fc的相當。
第3F圖顯示本發明的二聚體在阻斷CTLA4與CD86結合中的能力。可以看出，本發明的二聚體的阻斷能力與陽性對照dAb-aCTLA4.34-Fc的相當。另外，本發明的二聚體的結合能力稍弱於易普利姆單抗的結合能力。
實施例4 PBMC刺激
4.1 方法
檢驗本發明的二聚體在刺激免疫應答中的體外活性，如藉由PBMC細胞分泌IL-2所顯示的。簡而言之，從各種健康供體分離PBMC，並分別用200ng/mL 濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)培養。加入不同濃度(0.015nM、0.15nM、1.5nM或15nM)的本發明的二聚體或對照分子。在培養5天之後，收集上清液，並用人IL-2 DuoSet ELISA試劑盒分析IL-2水平。
4.2 結果
第4A圖至第4H圖證實在加入本發明的二聚體下，SEB刺激的PBMC分泌IL-2。X坐標表示加入的二聚體或對照分子的濃度；Y坐標表示分泌的IL-2的濃度。
第4A圖至第4D圖顯示從來自4名不同供體的PBMC得到的結果。可以看出，本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)在增強免疫應答方面的能力比對照分子或其組合顯著增強，說明具有強協同作用。
如第4A圖至第4H圖中所示，使用二聚體aPDL1.6-aCTLA4.34-Fc、aCTLA4.34-aPDL1.9-Fc、aCTLA4.34-L-aPDL1.9-Fc、aPDL1.m3-aCTLA4.34-Fc和aPDL1.9-aCTLA4.13-Fc得到了類似的結果。
實施例5 體內腫瘤抑制
5.1 方法
5.1.1 評價所述二聚體在轉染A375-PD-L1細胞和人PBMC的異種移植動物模型中的抗腫瘤功效
為了評價本發明的二聚體的抗腫瘤功效，使用A375-hPD-L1/hPBMC異種移植小鼠模型。用人PD-L1穩定地轉染人黑色素瘤細胞系A375(指定為A375-hPD-L1)，用於產生荷瘤小鼠異種移植模型。簡而言之，將A375-hPD-L1細胞與健康人PBMC以4：1的比例混合，然後皮下接種到NSG小鼠中。在腫瘤接種2-3小時後，向小鼠每週兩次藉由腹腔注射施用劑量為0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、 3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)。在指定時間點測量腫瘤體積。
5.1.2 評價所述二聚體在MC38-hPD-L1雙敲入模型中的抗腫瘤功效
由於本發明的二聚體不能與小鼠PD-L1或小鼠CTLA4交叉反應，藉由用相應人基因替代小鼠CTLA4和PD-L1基因產生人源化的雙敲入(KI)小鼠，在本實施例中使用該雙敲入小鼠模型。此外，藉由用人PD-L1替代小鼠PD-L1構建小鼠結腸癌MC38-hPD-L1細胞系(恆定地表達人PD-L1蛋白的MC38細胞系，其藉由將人PD-L1表達盒穩定地轉染到MC38細胞系中產生)。給雙KI C57BL/6小鼠的右前腹側皮下接種MC38-hPD-L1腫瘤細胞(3×105)。當平均腫瘤尺寸達到約60-80mm3時，將荷瘤動物隨機納入三個組之一中。將本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)或對照免疫球蛋白(IVIG)經靜脈注射至所述小鼠，每週兩次，一共5次。
5.2 結果
本發明的二聚體的腫瘤抑制作用顯示在第5A圖和第5B圖中。X坐標表示施用各種濃度的二聚體之後的日期；Y坐標表示測量的腫瘤體積。
第5A圖顯示從A375-hPD-L1/PBMC異種移植小鼠模型得到的結果，第5B圖顯示從MC38-hPD-L1/雙KI模型得到的結果。IVIG代表靜脈注射的免疫球蛋白，使用其作為同種型對照。
可以看出，在0.3mg/kg或更高的劑量下，本發明的二聚體在兩個模型中均具有顯著的抗腫瘤活性。在雙KI模型中，例如，在首次給藥後21天時，腫瘤被劑量為3.0mg/kg和30mg/kg的本發明的二聚體完全抑制。
實施例6 體內藥物代謝動力學
6.1 方法
在Sprague Dawley大鼠中的單劑量藥物代謝動力學研究
經靜脈單次給予8隻Sprague Dawley(SD)大鼠10mg/kg的本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)。在一系列時間點採集血樣，監測大鼠血清中的二聚體濃度，直至注射後第29天。
6.2 結果
在施用約305.15±19.34μg/mL的所述二聚體之後立即達到Cmax，平均T1/2為約142.59±29.89小時，平均AUC(0-384h)為約10.58±0.68h *mg/mL，平均MRT為127.86±20.75小時。其它藥物代謝動力學參數顯示在表3中，濃度時間曲線顯示在第6圖中。
在第6圖中，X坐標表明在二聚體施用前和施用後的時間；和Y坐標表示施用的二聚體的濃度。1-8表示來自8個獨立重複(即，8隻不同的SD大鼠)的結果。
實施例7 腫瘤對二聚體的攝取
將本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)或對照分子(例如，dAb-aCTLA4.34-Fc)用Na125I標記，然後用PD10管柱純化，用0.02mol/L的磷酸鹽緩衝液pH 7.4洗滌，檢查標記分子的放射性。如上述實施例5中描述的，將腫瘤細胞注射到小鼠中，當腫瘤達到約100-200mm3的體積時，將小鼠隨機分成兩組，每組3隻小鼠，一組小鼠施用本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)，另一組小鼠施用對照分子(例如，dAb-aCTLA4.34-Fc)。
將荷瘤小鼠用異氟烷麻醉，然後將Na125I標記的二聚體或對照分子注射到小鼠尾靜脈中，每隻小鼠約5MBq(或約135uCi)的劑量。
分別在給藥後1h、8h、1d、2d、3d、4d、5d和7d，用Micro-SPECT/CT掃描小鼠。使用靜態10min SPECT和中分辨率全身CT。記錄動物的體重、注射劑量、注射時間和體內剩餘劑量。使用PMOD軟件定量腫瘤攝取的二聚體或對照分子的量。
結果顯示在第7圖中。X坐標表示所述二聚體或對照分子給予後的時間；Y坐標表示腫瘤吸收的量。可以看出，與對照分子相比，本發明的二聚體更快地被攝取和富集在腫瘤中，並且更慢地從腫瘤消失，表明潛在更好的功效和較低的毒性。
實施例8 本申請的二聚體在非人類靈長類動物中的安全性和毒性
在非人類靈長類動物(例如，食蟹猴)中研究本發明的二聚體的安全性和毒性。當將本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)施用於猴時，在所有處理組(至多100mg/kg/週，其與150mg/kg/週的易普利姆單抗與150mg/kg/週的納武利尤單抗(nivolumab)組合等同)都沒有觀察到藥物相關的結腸炎。
然而，當將易普利姆單抗和納武利尤單抗組合施用於所述猴時，在所有處理組中都發現了治療相關的腹瀉(3mg/kg/週的易普利姆單抗與10mg/kg/週的納武利尤單抗的組合；或10mg/kg/週的易普利姆單抗與50mg/kg/週的納武利尤單抗的組合時)，發現在給藥之後第23天時，高劑量組(10mg/kg/週的易普利姆單抗與50mg/kg/週的納武利尤單抗的組合)的一隻猴由於急性胃擴張死亡。觀察到該猴子持續的腹瀉和體重減輕。對於所有處理組，都觀察到治療相關的結腸變化。
因此，與抗PD-1抗體(例如，納武利尤單抗)和抗CTLA4抗體(例如，易普利姆單抗)的組合相比，對於本發明的二聚體，觀察到更好的安全性和更低的毒性。
實施例9 二聚體在人類患者中的安全性、有效性和藥物代謝動力學
在患有晚期實體瘤的人類患者中研究了本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)的安全性、耐受性、藥物代謝動力學和有效性。
簡而言之，將標準療法難治的或不耐受的患有晚期不可切除的或轉移性的實體瘤的患者納入該臨床試驗中。在納入本臨床試驗之前，某些患者接受抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體治療，但對這些療法無應答。
將本申請的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)靜脈注射給藥至患者，每2週1次(Q2W)。劑量限制性毒性(DLT)評價期為28天。給藥劑量水平分別為0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg和10mg/kg。每8週，根據RECIST 1.1進行有效性評價。
研究入組10例患者(3例患有乳腺癌，1例患有子宮頸癌，1例患有卵巢癌，1例患有腎癌，1例患有肺癌，1例患有胰腺癌，1名患有腹膜癌和1名患有子宮癌)(1例在0.3mg/kg組中；3例在1mg/kg組中；3例在3mg/kg組中，3例在5mg/kg組中)。治療的平均持續時間為8週(範圍2-24週)。觀察到5mg/kg劑量組的1例DLT(3級免疫相關肝炎，總膽紅素沒有升高；在兩週內可逆)。最常見的(
30%)治療引起的不良反應(TEAE)為疲乏、腹瀉、噁心和嘔吐。在3例患者中觀察到某些免疫相關的TEAE(即，下腹痛、關節痛、肝功能異常、甲狀腺功能亢進、噁心和轉胺酶升高)。
3mg/kg隊列中1例患有非小細胞肺癌(NSCLC)的患者顯示完全緩解(CR)。1mg/kg隊列的2例患者(1例患有三陰性乳腺癌(TNBC)，和1例患有納武利尤單抗難治性腎細胞癌(RCC))顯示所述疾病長期穩定(>12週)。另外，3mg/kg隊列的1例患有卵巢癌的患者顯示腫瘤顯著縮小(腫瘤縮小56%)。
在較低劑量(例如，低於1mg/kg的劑量)下觀察到本發明的二聚體(例如，aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc)的清除更快，這可能是由於靶標介導的清除引起的。
對於3mg/kg以上的劑量，本發明的二聚體的T1/2為約7天至9天。
這些結果顯示本發明的二聚體具有可接受的安全性特徵，其與之前報告的其它免疫檢查點抑制劑的安全性數據一致。初步有效性結果是有希望的。來自最初4個隊列的藥物代謝動力學數據支持了所述每2週1次的給藥方案。
雖然本文已經顯示和描述了本發明的較佳的實施方案，但是對本領域技術人員而言將顯而易見的是這樣的實施方案僅藉由舉例提供。不打算將本發明限定為說明書之內提供的特定實施例。雖然本發明已經參照前述說明書進行了描述，然是本文實施方案的說明和示例不是意味著以限定的含義解釋。現在，在沒有背離本公開內容下，本領域技術人員將想到許多變化、改變和替代。進一步，應當理解本發明的所有方面都不限於本文列出的具體描述、構型或相對比例，其取決於多種條件和變量。應當理解在實施本發明中，可以使用本文描述的本發明實施方案的各種替代。因此，本發明預期還將涵蓋任何這樣的替代、修飾、變化或等同物。預期下述權利要求書定義了本發明的範圍，但是所述方法和結構都在這些申請專利範圍及其涵蓋的等同物的範圍之內。
<110> 江蘇康寧杰瑞生物製藥有限公司(Jiangsu Alphamab Biopharmaceuticals Co.,Ltd.)
<120> 二聚體及其用途
<130> 0096-PA-005TW
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<150> PCT/CN2018/090012；PCT/CN2019/086821
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<160> 64
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD-L1抗體CDR3的通式
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
<223> X1=E/G
<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X=D/Y
<220>
<221> X
<222> (9)..(9)
<223> X=T/P
<220>
<221> X
<222> (10)..(10)
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<220>
<221> X
<222> (11)..(11)
<223> X=V/P
<220>
<221> X
<222> (12)..(12)
<223> X=T/A
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<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD-L1抗體CDR1的通式
<220>
<221> X
<222> (2)..(2)
<223> X=K/N
<220>
<221> X
<222> (3)..(3)
<223> X=M/I
<220>
<221> X
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> X
<222> (5)..(5)
<223> X=S/R
<220>
<221> X
<222> (6)..(6)
<223> X=R/V
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<210> 3
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<223> PD-L1 ISVD-9 CDR1
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<210> 4
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<223> PD-L1 ISVD-9 CDR2
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<220>
<223> PD-L1 ISVD-9 CDR3
<400> 5 
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<223> PD-L1 ISVD-9
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<210> 7
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<223> PD-L1 ISVD-6 CDR1
<400> 7 
<210> 8
<211> 17
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<220>
<223> PD-L1 ISVD-6 CDR2
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<210> 9
<211> 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD-L1 ISVD-6 CDR3
<400> 9 
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<211> 128
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<223> PD-L1 ISVD-6
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<223> PD-L1 ISVD-m3 CDR2
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<223> PD-L1 ISVD-m3
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<223> PD-L1 ISVD-4
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<223> PD-L1 ISVD-11
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<223> PD-L1 ISVD-13
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4抗體CDR2的通式
<220>
<221> X
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<223> X=Y/S
<220>
<221> X
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<400> 16 
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<223> CTLA4 ISVD-34 CDR1
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<223> CTLA4 ISVD-34 CDR2
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<211> 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> CTLA4 ISVD-34 CDR3
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<223> CTLA4 ISVD-34
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<211> 17
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<223> CTLA4 ISVD-C1 CDR2
<400> 21 
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<211> 128
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> CTLA4 ISVD-C1
<400> 22 
<210> 23
<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> CTLA4 ISVD-13 CDR2
<400> 23 
<210> 24
<211> 128
<212> PRT
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<220>
<223> CTLA4 ISVD-13
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<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 ISVD-26
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<210> 26
<211> 128
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> CTLA4 ISVD-27
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<210> 27
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<212> PRT
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<220>
<223> CTLA4 ISVD-28
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> CTLA4 ISVD-29
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<210> 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> CTLA4 ISVD-30
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<210> 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> CTLA4 ISVD-31
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<212> PRT
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<223> CTLA4 ISVD-32
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 ISVD-33
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 短連結子
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 長連結子
<400> 34 
<210> 35
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有鉸鏈的IgG1-Fc區
<400> 35 
<210> 36
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人類IgG1恆定區
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 對照dAb
<400> 37 
<210> 38
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有鉸鏈的IgG1-Fc區(C-S)
<400> 38 
<210> 39
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 不具有鉸鏈的人類IgG1-Fc區
<400> 39 
<210> 40
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> aPDL1.9-aCTLA4.34-Fc
<400> 40 
<210> 41
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> aPDL1.9-L-aCTLA4.34-Fc
<400> 41 
<210> 42
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> aCTLA4.34-aPDL1.9-Fc
<400> 42 
<210> 43
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> aCTLA4.34-L-aPDL1.9-FC
<400> 43 
<210> 44
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> aPDL1.9-dAb-Fc
<400> 44 
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<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> dAb-aCTLA4.34-Fc
<400> 45 
<210> 46
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> aPDL1.6-aCTLA4.34-Fc
<400> 46 
<210> 47
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> aPDL1.6-dAb-Fc
<400> 47 
<210> 48
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> aPDL1.m3-aCTLA4.34-Fc
<400> 48 
<210> 49
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> aPDL1.m3-dAb-Fc
<400> 49 
<210> 50
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> aPDL1.9-aCTLA4.13-Fc
<400> 50 
<210> 51
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> dAb-aCTLA4.13-Fc
<400> 51 
<210> 52
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4-muFc
<400> 52 
<210> 53
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD-L1-muFc
<400> 53 
<210> 54
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD-L1-huFc
<400> 54 
<210> 55
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD80-muFc
<400> 55 
<210> 56
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4-huFc
<400> 56 
<210> 57
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD86-muFc
<400> 57 
<210> 58
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD1-muFc
<400> 58 
<210> 59
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 易普利姆單抗(Ipilimumab)HC
<400> 59 
<210> 60
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 易普利姆單抗(Ipilimumeb)LC
<400> 60 
<210> 61
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 度伐魯單抗(Durvalumab)HC
<400> 61 
<210> 62
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 度伐魯單抗(Durvalumab)LC
<400> 62 
<210> 63
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人類PD-L1
<400> 63 
<210> 64
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人類PD-L1的N-終端IgV域
<400> 64 
Claims (36)
- 一種由兩條多肽鏈形成的二聚體，其中該兩條多肽鏈中的每條均包括一個PD-L1特異性的ISVD和一個CTLA4特異性的ISVD，該兩條多肽鏈中的每條均包括一個抗體Fc亞基，其中該PD-L1特異性的ISVD包括重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列；該PD-L1特異性的ISVD包括重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列；該PD-L1特異性的ISVD包括重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列；其中該CTLA4特異性的ISVD包括重鏈CDR1，其包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列；該CTLA4特異性的ISVD包括重鏈CDR2，其包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列；該CTLA4特異性的ISVD包括重鏈CDR3，其包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的二聚體，其中對於該兩條多肽鏈的一條或兩條：該PD-L1特異性的ISVD融合至該CTLA4特異性的ISVD，直接地或藉由一個連接子；且該CTLA4特異性的ISVD融合至該抗體Fc亞基，視需要地藉由一個連接子。
- 如申請專利範圍第1項所述的二聚體，其中對於該兩條多肽鏈中的一條或兩條：該PD-L1特異性的ISVD的C末端融合至該CTLA4特異性的ISVD的N末端，直接地或藉由一個連接子；且該CTLA4特異性的ISVD的C末端融合至該抗體Fc亞基的N末端，直接地或藉由一個連接子。
- 如申請專利範圍第1項所述的二聚體，其中對於該兩條多肽鏈中 的一條或兩條：該PD-L1特異性的ISVD融合至該CTLA4特異性的ISVD，直接地或藉由一個連接子；且該PD-L1特異性的ISVD融合至該抗體Fc亞基，直接地或藉由一個連接子。
- 如申請專利範圍第4項所述的二聚體，其中對於該兩條多肽鏈中的一條或兩條：該CTLA4特異性的ISVD的C末端融合至該PD-L1特異性的ISVD的N末端，直接地或藉由一個連接子；且該PD-L1特異性的ISVD的C末端融合至該抗體Fc亞基的N末端，直接地或藉由一個連接子。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其中該抗體Fc亞基來源於IgG Fc亞基。
- 如申請專利範圍第6項所述的二聚體，其中該IgG為人IgG1。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其中該抗體Fc亞基包含SEQ ID NO：35、38和39中任一項所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其中該PD-L1特異性的ISVD能夠阻斷PD-L1與PD1的結合。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其中該PD-L1特異性的ISVD能夠阻斷PD-L1與CD80的結合。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其中該PD-L1特異性的ISVD包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列的。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其中該CTLA4特異性的ISVD能夠特異性結合人CTLA4。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其中該CTLA4特異性的ISVD能夠阻斷CTLA4與CD80的結合。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其中該CTLA4特異性的ISVD能夠阻斷CTLA4與CD86的結合。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其中該CTLA4特異性的ISVD包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：20、30、31及32中任一項所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其中該CTLA4特異性的ISVD包括重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列的。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其為同二聚體。
- 如申請專利範圍第2項所述的二聚體，其中該連接子包含SEQ ID NO：33至34中任一項所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的二聚體，其中該兩條多肽鏈的一條或兩條包含SEQ ID NO：40至43中任一項所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其中該兩條多肽鏈的一條或兩條包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其能夠阻斷PD至L1與PD至1的結合。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其能夠阻斷PD至L1與CD80的結合。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其能夠阻斷CTLA4與CD80的結合。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的二聚體，其能夠阻斷CTLA4與CD86的結合。
- 一種免疫綴合物，包含如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的二聚體。
- 一種分離的核酸，其編碼如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的二聚體。
- 一種載體，其包含如申請專利範圍第26項所述的分離的核酸或多種分離的核酸。
- 一種分離的宿主細胞，其包含如申請專利範圍第26項所述的分離的核酸或如申請專利範圍第27項的所述載體。
- 一種用於產生如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的二聚體的方法，包括：(i)在實現該二聚體的表達和形成的條件下，培養如申請專利範圍第28項所述的宿主細胞，和(ii)收集形成的二聚體。
- 一種藥物組合物，包含有效量的如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的二聚體或如申請專利範圍第25項所述的免疫綴合物，以及藥學上可接受的賦形劑。
- 如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的二聚體、如申請專利範圍第25項所述的免疫綴合物，或如申請專利範圍第30項所述的藥物組合物，其用於治療有需要的受試者的癌症。
- 一種如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的二聚體或申請專利範圍第25項所述的免疫綴合物的用途，其用在製備用於治療有需要的對象的癌症的藥物。
- 一種如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的二聚體或申請專利範圍第25項所述的免疫綴合物的用途，其用在製備用於阻斷CD80和/或 CD86與CTLA4結合的藥物。
- 一種如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的二聚體或申請專利範圍第25項所述的免疫綴合物的用途，其用在製備用於阻斷PD1和/或CD80與PD至L1結合的藥物。
- 一種如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的二聚體或申請專利範圍第25項所述的免疫綴合物的用途，其用在製備用於刺激免疫細胞分泌IL-2的藥物。
- 一種如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的二聚體或申請專利範圍第25項所述的免疫綴合物的用途，其用在製備用於增強對象免疫應答的藥物。
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