TWI787687B

TWI787687B - 一種靶向ｃｄ１９的嵌合抗原受體及其用途

Info

Publication number: TWI787687B
Application number: TW109144094A
Authority: TW
Inventors: 王建祥; 王敏; 呂璐璐; 石琳; 安娜; 王瑞; 劉芸
Original assignee: 大陸商合源生物科技（天津）有限公司
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2022-12-21
Also published as: US20220040234A1; CN115103912B; TW202129004A; CN113728096A; WO2021121227A1; AU2020405488A1; TWI794699B; CN112079934B; CN115103912A; EP4029944A4; CN112226463A; US20230146337A1; JP2023502190A; US20220040233A1; WO2021121193A1; AU2020406534A1; JP2024056873A; AU2020104466A4; JP7439128B2; CN113728096B

Abstract

本申請提供一種嵌合抗原受體，其包含SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列。本申請還提供編碼該嵌台抗原受體的核酸、包含該核酸的載體、包含該嵌合抗原受體、該核酸分子和/或該載體的免疫效應細胞、製備該免疫效應細胞的方法、包含該免疫效應細胞的組成物以及該嵌合抗原受體的用途。

Description

一種靶向CD19的嵌台抗原受體及其用途

本申請涉及生物醫藥領域，具體的涉及一種靶向CD19的嵌合抗原受體及其用途。

急性淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)以及B細胞淋巴瘤的臨床治療，目前以化療、幹細胞移植及生物治療等為主，雖然可以取得一定的療效，但復發難治仍然是難以攻克的重點，腫瘤的細胞免疫治療作為一種新的治療策略，成為當今研究的熱點。CD19幾乎表達於所有的B細胞腫瘤細胞表面，而其他實質細胞和造血幹細胞幾乎不表達。

腫瘤細胞藉由下調參與T細胞識別及抗原反應的分子表達、降低免疫原性等迷徑產生免疫逃逸，從而使機體的免疫系統不能很好的清除腫瘤。研究發現，嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)能夠識別腫瘤細胞表面的抗原，特異性殺傷腫瘤細胞，用於腫瘤的治療。

本申請提供了一種嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包含SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列，本申請還提供編碼該嵌合抗原受體的核酸、包含該核酸的載體、包含該嵌合抗原受體、該核酸分子和/或該載體的免疫效應細胞、製備該免疫效應細胞的方法、包含該免疫效應細胞的組成物以及該嵌合抗原受體的用途。

本申請的嵌合抗原受體至少包含以下一種有益效果：(1)在免疫細胞(例如，T細胞)表面穩定表達，表達量高；(2)具有較強的殺傷CD19陽性靶細胞的能力；(3)促進免疫細胞分泌細胞因子，例如，使T細胞分泌細胞因子(INF-γ或IL-6)的能力增強至少1倍、2倍或3倍以上；(4)無溶血性，不引起紅細胞溶血或凝聚；(5)無血管刺激性，給藥後不引起給藥局部或全身異常；(6)無致瘤性，體內或體外不致瘤；(7)延長腫瘤患者的生存時間；(8)有效緩解腫瘤(例如，成人急性淋巴細胞白血病、兒童急性淋巴細胞白血病和/或非霍奇金淋巴瘤)病情；和，(9)安全性高，引起副作用(例如，細胞因子釋放綜合症或CAR-T細胞相關性腦病綜合症)的風險較低。

一方面，本申請提供一種嵌合抗原受體，其包含SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列。

另一方面，本申請還提供一種分離的核酸分子，其編碼本申請的嵌合抗原受體。

另一方面，本申請還提供編碼嵌合抗原受體的分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO.2所示的核酸序列。

另一方面，本申請還提供一種載體，其包含本申請的核酸分子。

另一方面，本申請還提供一種免疫效應細胞，其包含本申請的嵌合抗原受體、核酸分子和/或載體。

在某些實施方式中，該免疫效應細胞選自以下組：T淋巴細胞和自然殺傷細胞。

在某些實施方式中，該免疫效應細胞的表面表達本申請的嵌合抗原受體。

另一方面，本申請還提供製備免疫效應細胞的方法，其包括以下的步驟：向免疫效應細胞中轉導本申請的載體。

另一方面，本申請還提供一種組成物，其包含本申請的免疫效應細胞。

另一方面，本申請還提供該嵌合抗原受體、該核酸分子、該載體和/或該免疫效應細胞用於製備藥物的用途，其中該藥物用於治療與CD19的表達相關的疾病或病症。

在某些實施方式中，該與CD19的表達相關的疾病或病症包括非實體瘤。

在某些實施方式中，該非實體瘤包括白血病和/或淋巴瘤。

在某些實施方式中，該與CD19的表達相關的疾病或病症包括急性淋巴細胞白血病和/或B細胞淋巴瘤。

在某些實施方式中，該急性淋巴細胞白血病包括成人急性淋巴細胞白血病和/或兒童急性淋巴細胞白血病。

在某些實施方式中，用於治療急性淋巴細胞白血病的該藥物的劑量為0.25×10⁸至0.5×10⁸ CAR陽性T細胞。

在某些實施方式中，該B細胞淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤。

在某些實施方式中，用於治療非霍奇金淋巴瘤的該藥物的劑量為1×10⁸至2×10⁸ CAR陽性T細胞。

本領域技術人員能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如本領域技術人員將認識到的，本申請的內容使得本領域技術人員能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的附圖和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。

本申請所涉及的發明的具體特徵如所附請求項書所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和附圖能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對附圖簡要說明書如下：

圖1A和圖1B顯示CAR分子在CNCT19細胞表面表達的檢測結果。

圖2顯示不同共培養條件下的腫瘤細胞殘留率。

圖3顯示RTCA DP系統即時監測CNCT19細胞對靶細胞(CHO-CD19)的殺傷情況。

圖4A顯示不同共培養條件上清中INF-γ濃度的變化。

圖4B顯示不同共培養條件上清中IL-6濃度的變化。

圖5A顯示各試管3小時振搖前的觀察結果。

圖5B顯示各試管3小時振搖後的觀察結果。

圖6A顯示給予CAR-T細胞後給藥局部的顯微鏡照片(HE染色，10倍物鏡)。

圖6B顯示給予氯化鈉注射液後給藥局部的顯微鏡照片(HE染色，10倍物鏡)。

圖7顯示各組細胞接種3週後的軟瓊脂純株形成情況。

圖8為不同細胞治療Nalm-6移植瘤NCG小鼠的生存曲線。

圖9顯示CNCT19細胞單次給藥後的組織分佈情況。

圖10為CNCT19細胞在荷瘤與未荷瘤動物體內分佈的比較。

圖11顯示CNCT19細胞單次給藥後在動物體內各組織分佈的變化。

以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。

以下對本申請做進一步描述：在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的蛋白質和核酸化學、分子生物學、細胞和組織培養、微生物學、免疫學相關術語和實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的術語和常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。

在本申請中，術語“嵌合抗原受體”(Chimeric Antigen Receptor,CAR)通常是指包含能夠結合抗原的胞外結構域和至少一個胞內結構域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)的核心部件，其可包括靶向部分(例如，結合腫瘤相關抗原(tumor-associatedantigen,TAA)的部分)、鉸鏈區、跨膜區和細胞內結構域。在本申請中，該CAR可以基於抗體的抗原特異性與T細胞受體活化胞內結構域組合在一起。表達CAR的T細胞可以特異地識別和消除表達靶抗原的惡性細胞。

在本申請中，術語“分離的”通常指從天然狀態下經人工手段獲得的。如果自然界中出現某一種“分離”的物質或成分，那麼可能是其所處的天然環境發生了改變，或從天然環境下分離出該物質，或二者情況均有發生。例如，某一活體動物體內天然存在某種未被分離的多聚核苷酸或多肽，而從這種天然狀態下分離出來的高純度的相同的多聚核苷酸或多肽即稱之為分離的。術語“分離的”不排除混有人工或合成的物質，也不排除存在不影響物質活性的其它不純物質。

在本申請中，術語“免疫效應細胞”通常是指參與免疫應答，例如促進免疫效應應答的細胞。在本申請中，免疫效應細胞可以選自以下組：T淋巴細胞和自然殺傷細胞。

在本申請中，術語“特異性結合和/或識別”通常是指可測量的和可再現的相互作用，比如靶標和抗體(或CAR結構片段)之間的結合，可在分子(包括生物分子)的異質群體存在的情況可決定靶標的存在。例如，特異性結合靶標(其可以為表位)的抗體(或CAR結構片段)是以比它結合其它靶標更大的親和性、親合力、更容易、和/或以更大的持續時間結合該靶標的抗體(或CAR結構片段)。

在本申請中，術語“分離的核酸分子”通常指任何長度的分離形式的核苷酸、去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或從其天然環境分離的或人工合成的類似物。

在本申請中，術語“載體”通常指可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中並使蛋白獲得表達的一種核酸運載工具。載體可藉由轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內表達得以表達。舉例來說，載體包括：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。載體還有可能包括有協助其進入細胞的成分，如病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質。

在本申請中，術語“組成物”通常指涉及適合施用於患者的組成物。例如，本申請組成物，其可以包含本申請的免疫效應細胞。此外，該組成物還可以包含一種或多種(藥學上有效的)載劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑和/或防腐劑的合適的製劑。組成物的可接受成分在所用劑量和濃度下對接受者無毒。本申請的組成物包括但不限於液體、冷凍和凍幹組成物。

在本申請中，術語“CD19”通常是指分化抗原簇19蛋白，是白血病前體細胞上可檢出的抗原決定簇。可以在公共資料庫(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠的CD19的胺基酸序列和核酸序列。例如，人CD19的胺基酸序列可以按UniProt/Swiss-Prot登錄號P15391找到，編碼人CD19的核苷酸序列可以按登錄號NM_001178098找到。在本申請中，“CD19”可以包括突變(例如，全長野生型CD19的點突變、片段、插入、缺失和剪接變體)的蛋白質。

在本申請中，術語“受試者”通常指人類或非人類動物，包括但不限於貓、狗、馬、豬、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。

在本申請中，術語“包含”通常是指包括明確指定的特徵，但不排除其他要素。

在本申請中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%的範圍內變動。

嵌合抗原受體、核酸、載體、免疫效應細胞、組成物

一方面，本申請提供一種嵌合抗原受體，其包含如SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列。本申請還提供了包含與SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列具有至少80%(如至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%)同一性的胺基酸序列。

在某些實施方式中，本申請的嵌合抗原受體可以特異性結合和/或識別腫瘤抗原。例如，本申請的嵌合抗原受體可以特異性結合和/或識別抗原CD19。

在某些實施方式中，本申請的嵌合抗原受體能夠促進免疫效應細胞分泌細胞因子。該免疫效應細胞可以選自以下組：T淋巴細胞和自然殺傷細胞。該細胞因子可以選自下組：IFN-γ和IL-6。該免疫效應細胞可以為哺乳動物的免疫效應細胞。該T淋巴細胞可以為哺乳動物的T淋巴細胞，該自然殺傷細胞也可以為哺乳動物的自然殺傷細胞。該T淋巴細胞可以為人的T淋巴細胞，該自然殺傷細胞也可以為人的自然殺傷細胞。

在某些實施方式中，本申請的嵌合抗原受體無溶血及血管刺激性。

在某些實施方式中，本申請的嵌合抗原受體無體外致瘤性。

在某些實施方式中，本申請的嵌合抗原受體無體內致瘤性。

在某些實施方式中，本申請的嵌合抗原受體可以有效治療腫瘤。該腫瘤可以為CD19陽性的腫瘤。例如，本申請的嵌合抗原受體可以有效延長CD19陽性腫瘤患者的生存時間。例如，本申請的嵌合抗原受體可以有效延長非實體瘤患者的生存時間。例如，本申請的嵌合抗原受體可以有效延長淋巴瘤和/或白血病的生存時間。又例如，本申請的嵌合抗原受體可以有效延長成人急性淋巴細胞白血病患者的生存時間。又例如，本申請的嵌合抗原受體可以有效延長兒童急性淋巴細胞白血病患者的生存時間。又例如，本申請的嵌合抗原受體可以有效延長B細胞淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤)患者的生存時間。

在某些實施方式中，本申請的嵌合抗原受體可以有效治療成人急性淋巴細胞白血病。

在某些實施方式中，本申請的嵌合抗原受體可以有效治療兒童急性淋巴細胞白血病。

在某些實施方式中，本申請的嵌合抗原受體可以有效治療非霍奇金淋巴瘤。

另一方面，本申請提供一種分離的核酸分子，其編碼本申請的嵌合抗原受體。

另一方面，本申請提供一種編碼嵌合抗原受體的分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO.2所示的核酸序列。

另一方面，本申請提供一種編碼嵌合抗原受體的分離的核酸分子，其包含如SEQ ID NO.2所示的核酸序列類似並且編碼該嵌合抗原受體的核酸分子。

在某些實施方式中，該跟SEQ ID NO.2的核酸序列類似是指如SEQ ID NO.2所示的核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列。

在某些實施方式中，該跟SEQ ID NO.2的核酸序列類似是指由於核酸密碼子第三位元鹼基的擺動性(簡併性)而跟SEQ ID NO.2的核酸不同，但是卻編碼該嵌合抗原受體的核酸分子。

本申請包括基因和蛋白質的變體(例如，本文的如SEQ ID NO.1所示的胺基酸序列的變體，或如SEQ ID NO.2所示的核酸序列的變體)，其保留一種或多種生物活性。蛋白質或多肽的此類變體包括已經或可以使用重組DNA技術進行修飾的蛋白質或多肽，使得該蛋白質或多肽具有改變的或附加的屬性，例如，變體賦予蛋白質在血漿中增強的蛋白質穩定性或賦予蛋白質增強的活性。變體可以不同於參照序列，如不同於天然存在的多核苷酸、蛋白質或肽。在核苷酸序列水準，天然存在的變體基因和非天然存在的變體基因與參照基因將典型地至少約50%相同，更典型地至少約70%相同，甚至更典型地至少約80%相同(90%或更高同一性)。在胺基酸序列水準上，天然存在的變異蛋白質和非天然存在的變異蛋白質與參照蛋白質將典型地至少約70%相同，更典型地至少約80%相同，甚至更典型地至少約90%或者有更高的同一性，但在非保守區域允許有大部分非同一性的區域(例如，相同部分小於70%，諸如小於60%，小於50%或者甚至小於40%)。在其他實施方式中，該序列與參照序列具有至少60%，70%，75%或更高的同一性(例如，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或更高的同一性)。對於本領域技術人員而言，在多核苷酸、蛋白或多肽中導入核苷酸和胺基酸的變化的程式是已知的(參見，例如，Sambrook et al.(1989))。

在本申請中，術語“同一性”、“同源性”及其語法變體通常指兩個或更多個實體是“對齊”的序列時，它們是相同的。因此，例如，當兩個多肽序列是相同的時，它們至少所參照的區域或部分之內具有相同的胺基酸序列。如果兩個多核苷酸序列是相同的，則它們至少在所參照的區域或部分之內具有相同的多核苷酸序列。同一性可以是序列的所限定的區(區域或結構域)。同一性的“區”或“區域”是指兩個或兩個以上所參照的實體的相同的部分。因此，如果兩個蛋白質或核酸序列在一個或多個序列區或區域內是相同的，則它們在該區域內有同一性。“對齊”的序列是指多個多核苷酸或蛋白質(胺基酸)序列，相比於參照序列，常含補正缺失或附加的鹼基或胺基酸(間隙)。兩個序列之間的同一性(同源性)的程度可以使用電腦程式和數學演算法確定。計算百分比序列同一性(同源性)的這樣的演算法一般計算比較區域或區的序列間隙和不匹配。例如，BLAST(例如，BLAST 2.0)搜索演算法(參見，例如，Altschul et al.,J.Mol.Biol.215：403(1990)，公眾可藉由NCBI獲得)具有示範性的搜索參數如下：不匹配-2，間隙打開5，間隙延伸2。

在本申請中，該核酸分子可以為任何長度的分離形式的核苷酸、去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或從其天然環境分離的或人工合成的類似物，但可以編碼本申請的嵌合抗原受體。

另一方面，本申請提供一種載體，其包含本申請的核酸分子。

在本申請中，該載體可藉由轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內表達得以表達。例如，載體可以包括：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。又例如，該載體可以含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，該載體還可以含有複製起始位點。此外，該載體還可以包括有協助其進入細胞的成分，如病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質。

另一方面，本申請提供一種免疫效應細胞，其包含該嵌合抗原受體、該核酸分子和/或該載體。

在本申請中，該免疫效應細胞可以選自以下組：T淋巴細胞和自然殺傷細胞。在某些實施方式中，該免疫效應細胞可以為人的免疫效應細胞。例如，該免疫效應細胞可以為人的T淋巴細胞。又例如，該免疫效應細胞可以為人的自然殺傷細胞。

在本申請中，該免疫效應細胞的表面可以表達本申請的嵌合抗原受體。

在某些實施方式中，本申請的免疫效應細胞可以有效殺傷腫瘤細胞。該腫瘤細胞可以是CD19陽性細胞。例如，本申請的免疫效應細胞可以明顯降低CD19陽性人白血病細胞系Nalm-6的殘留率。

在某些實施方式中，本申請的免疫效應細胞與CD19陽性細胞接觸後，能夠有效促進細胞因子的分泌。該細胞因子可以選自下組：IFN-γ和IL-6。例如，本申請的免疫效應細胞與CD19陽性人白血病細胞系Nalm-6共培養後，其IFN-γ和IL-6細胞因子的分泌明顯增加。

在某些實施方式中，本申請的免疫效應細胞無溶血性及血管刺激性。例如，在體外溶血試驗中，本申請的免疫效應細胞不會導致溶血和血液凝聚。又例如，本申請的免疫效應細胞無血管刺激性。

在某些實施方式中，本申請的免疫效應細胞無體外致瘤性。

在某些實施方式中，本申請的免疫效應細胞無體內致瘤性。

在某些實施方式中，本申請的免疫效應細胞可以有效治療腫瘤。該腫瘤可以為CD19陽性的腫瘤。例如，本申請的免疫效應細胞可以有效延長CD19陽性腫瘤患者的生存時間。又例如，本申請的免疫效應細胞可以有效延長成人急性淋巴細胞白血病患者的生存時間。又例如，本申請的免疫效應細胞可以有效延長兒童急性淋巴細胞白血病患者的生存時間。又例如，本申請的免疫效應細胞可以有效延長B細胞淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤)患者的生存時間。

在某些實施方式中，本申請的免疫效應細胞可以有效治療成人急性淋巴細胞白血病。

在某些實施方式中，本申請的免疫效應細胞可以有效治療兒童急性淋巴細胞白血病。

在某些實施方式中，本申請的免疫效應細胞可以有效治療B細胞淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤)。

另一方面，本申請提供一種組成物，其包含本申請的免疫效應細胞。

在本申請中，該組成物還可以包含一種或多種(藥學上有效的)載劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑和/或防腐劑的合適的製劑。組成物的可接受成分在所用劑量和濃度下對接受者無毒。本申請的組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾組成物。

在某些實施方案中，該組成物可以包含腸胃外、經皮、腔內、動脈內、鞘內和/或鼻內施用或直接注射到組織中。例如，該組成物可以藉由輸注或注射施用於患者或者受試者。在另一些實施方案中，該組成物的施用可以藉由不同的方式進行，例如靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、局部或真皮內施用。在其他一些實施方案中，該組成物可以不間斷施用。該不間斷(或連續)施用可以藉由患者佩戴的小泵系統來實現，以測量流入患者體內的治療劑，如WO2015/036583所述。

在本申請中，該組成物的給藥方案可以是施用快速灌注劑，可以隨時間推移施用多個分劑量，或者劑量可以隨治療情況的危急程度成比例降低或提高。在某些實施方式中，治療方案可以是每週施用一次、兩週一次、三週一次、四週一次、一個月一次、3個月一次、或3-6個月一次。在某些實施方式中，給藥方案包括靜脈內施用，施用劑量範圍可以是0.1×10⁸至3×10⁸ CAR陽性T細胞，例如，0.15×10⁸至2×10⁸ CAR陽性T細胞、0.5×10⁸至2×10⁸ CAR陽性T細胞、1×10⁸至2×10⁸ CAR陽性T細胞、0.2×10⁸至2×10⁸ CAR陽性T細胞、0.2×10⁸ 至1×10⁸ CAR陽性T細胞、0.25×10⁸至1×10⁸ CAR陽性T細胞、0.25×10⁸至0.5×10⁸ CAR陽性T細胞，或0.5×10⁸ CAR陽性T細胞，或2×10⁸ CAR陽性T細胞。

針對不同的適應症，給藥劑量可以不同。在某些實施方式中，該免疫效應細胞治療復發難治的成人急性淋巴細胞白血病患者的給藥劑量可以為0.25×10⁸至0.5×10⁸ CAR陽性T細胞，或0.5×10⁸ CAR陽性T細胞，例如可以是0.3×10⁸至0.5×10⁸、0.4×10⁸至0.5×10⁸、0.25×10⁸至0.4×10⁸、0.3×10⁸至0.4×10⁸或0.4×10⁸至0.5×10⁸ CAR陽性T細胞。在某些實施方式中，該免疫效應細胞治療復發難治的成人急性淋巴細胞白血病患者的給藥劑量可以為0.25×10⁸、0.26×10⁸、0.27×10⁸、0.28×10⁸、0.29×10⁸、0.3×10⁸、0.31×10⁸、0.32×10⁸、0.33×10⁸、0.34×10⁸、0.35×10⁸、0.36×10⁸、0.37×10⁸、0.38×10⁸、0.39×10⁸、0.4×10⁸、0.41×10⁸、0.42×10⁸、0.43×10⁸、0.44×10⁸、0.45×10⁸、0.46×10⁸、0.47×10⁸、0.48×10⁸、0.49×10⁸或0.5×10⁸ CAR陽性T細胞。

在某些實施方式中，該免疫效應細胞治療復發難治的兒童急性淋巴細胞白血病患者的給藥劑量可以為0.25×108至0.5×108 CAR陽性T細胞，或0.5×108 CAR陽性T細胞，例如可以是0.3×108至0.5×108、0.4×108至0.5×108、0.25×108至0.4×108、0.3×108至0.4×108或0.4×108至0.5×108 CAR陽性T細胞。在某些實施方式中，該免疫效應細胞治療復發難治的兒童急性淋巴細胞白血病患者的給藥劑量可以為0.25×10⁸、0.26×10⁸、0.27×10⁸、0.28×10⁸、0.29×10⁸、0.3×10⁸、0.31×10⁸、0.32×10⁸、0.33×10⁸、0.34×10⁸、0.35×10⁸、0.36×10⁸、0.37×10⁸、0.38×10⁸、0.39×10⁸、0.4×10⁸、0.41×10⁸、0.42×10⁸、0.43×10⁸、0.44×10⁸、0.45×10⁸、0.46×10⁸、0.47×10⁸、0.48×10⁸、0.49×10⁸或0.5×10⁸ CAR陽性T細胞。

在另一些實施方式中，該免疫效應細胞治療復發難治的非霍奇金淋巴瘤患者的給藥劑量可以為1×10⁸至2×10⁸ CAR陽性T細胞，或2×10⁸ CAR陽性T細胞，例如1×10⁸至1.8×10⁸、1×10⁸至1.5×10⁸、1×10⁸至1.3×10⁸、1.3×10⁸至2×10⁸、1.3×10⁸至1.5×10⁸、1.5×10⁸至2×10⁸、1.5×10⁸至1.8×10⁸或1.8×10⁸至2×10⁸ CAR陽性T細胞。在另一些實施方式中，該免疫效應細胞治療復發難治的霍奇金淋巴瘤患者的給藥劑量可以為1×10⁸、1.1×10⁸、1.2×10⁸、1.3×10⁸、1.4×10⁸、1.5×10⁸、1.6×10⁸、1.7×10⁸、1.8×10⁸、1.9×10⁸或2.0×10⁸ CAR陽性T細胞。

製備方法和用途

另一方面，本申請還提供了製備免疫效應細胞的方法，其包括以下的步驟：向免疫效應細胞中轉導本申請的載體。

在某些實施方式中，該免疫效應細胞可以選自以下組：T淋巴細胞和自然殺傷細胞。

另一方面，本申請還提供了該嵌合抗原受體、該核酸分子、該載體和/或該免疫效應細胞用於製備藥物的用途，其中該藥物用於治療與CD19的表達相關的疾病或病症。該藥物的給藥劑量可以參考上文提到的該免疫效應細胞的給藥劑量。

另一方面，本申請還提供了治療與CD19的表達相關的疾病或病症的方法，該方法包括向有需要的受試者施用該嵌合抗原受體、該核酸分子、該載體和/或該免疫效應細胞。在本申請中，該施用可以藉由不同的方式進行，例如靜脈內、瘤內、腹膜內、皮下、肌肉內、局部或真皮內施用。

另一方面，本申請該嵌合抗原受體、該核酸分子、該載體和/或該免疫效應細胞，其可以用於治療與CD19的表達相關的疾病或病症。

在本申請中，該藥物可以包括T細胞免疫治療劑。

在本申請中，該與CD19的表達相關的疾病或病症可以包括非實體瘤。

在本申請中，該與CD19的表達相關的疾病或病症可以包括白血病和/或淋巴瘤。

在某些實施方式中，該與CD19的表達相關的疾病或病症可以包括急性淋巴細胞白血病(ALL)，例如，可包括成人急性淋巴細胞白血病(ALL)和/或兒童急性淋巴白血病(ALL)。在另一些實施方式中，該與CD19的表達相關的疾病或病症可以包括成人慢性淋巴細胞白血病(CLL)。在另一些實施方式中，該與CD19的表達相關的疾病或病症可以包括B細胞淋巴瘤。例如，該B細胞淋巴瘤可以包括非霍奇金淋巴瘤。

在本申請中，該受試者可以包括人類和非人類動物。例如，該受試者可以包括但不限於貓、狗、馬、豬、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。

不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的嵌合抗原受體、免疫效應細胞、製備方法和用途等，而不用於限制本申請發明的範圍。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於構建載體和質粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法。這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E．F．and Maniais，T．(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

本申請中引用的所有專利、專利申請和參考文獻均藉由引用的方式全文納入本申請，納入程度就如同每一篇文獻單獨引用作為參考。如果本申請和本文提供的文獻之間存在衝突，應以本申請中的內容為准。

[實施例]

實施例1. 慢病毒載體的構建

人工合成包含本申請該CAR結構的片段(其胺基酸序列和核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)，並構建到慢病毒載體(廠家：SBI公司，貨號：CD500-CD800)，將得到的表達載體命名為CNCT19表達載體，隨後依照其說明書記載的方式轉染獲得慢病毒，並用流式細胞術測定病毒轉染滴度，確認得到有功能性的慢病毒載體。

實施例2. 慢病毒感染T細胞的製備

感染實驗按照本領域技術人員已知的常規方法進行。簡述感染步驟如下：

1.分選T細胞

從受試者單採血細胞中分離獲得外周血單個核細胞(PBMC)，然後從PBMC細胞中分選獲得T細胞。

2.對T細胞進行啟動處理

將分離的T細胞用完全淋巴細胞培養液(Xvivo15培養基+5% FBS+100IU/ml IL-2或Xvivo15培養基+5% FBS+20ng/ml IL-21+10ng/ml IL-7)進行重新懸浮，使終濃度為(1~2)×10⁶個細胞/ml，並加入5~10μl的CD3/CD28刺激磁珠，混勻後置於培養箱培養，培養條件為37℃+5%CO₂，培養時間至少24小時。

3.慢病毒感染T細胞

取出啟動培養的T細胞，加入終濃度為8μg/ml的聚凝胺(polybrene)，混勻，並按MOI=2緩慢加入慢病毒載體，混勻後將其置於離心機中，1500rpm，離心1.5小時。然後將其置於培養箱培養，培養條件為37℃+5%CO₂，培養時間至少24小時。

4.感染後T細胞的擴增培養

取出感染後的細胞，監測細胞密度，使細胞維持在(0.5~1)×10⁶個細胞/ml，以備後續實施例使用，將獲得的感染的T細胞命名為CNCT19細胞(即本申請的免疫效應細胞)。

實施例3. CAR分子在CNCT19細胞表面表達的檢測

實驗步驟如下：

(1)將CNCT19細胞懸液於300g離心5分鐘，棄上清，加入鞘液重新懸浮至活細胞密度為0.5~1×10⁷細胞/mL。

(2)每份樣本取2支流式管，標記為1~2管，第1管為空白對照，不需要加抗體，第2管中加入10倍稀釋的Alexa Fluor^® 647-羊抗鼠IgG F(ab’)₂抗體(廠家：Jackson，貨號：115-605-072)10μL。

(3)每管加入100μl細胞懸液，室溫避光反應15~20分鐘。

(4)每管加入2ml鞘液洗滌，300g離心5分鐘。

(5)棄上清，在第2管中加入FITC-CD3(廠家：同生時代，貨號：Z6410047-100T)20μl，室溫避光孵育15~20分鐘。

(6)每管加入2ml鞘液洗滌，300g離心5分鐘，棄上清，每管再加入2ml鞘液洗滌，300g離心5分鐘。

(7)棄上清，每管加入300μl鞘液重新懸浮後，流式細胞儀檢測。

結果如圖1A和圖1B所示，可以看出，圖1A為空白對照管，在右上角CD3+CAR+象限未顯示有細胞群，圖1B為實驗檢測管，CART細胞經IgGF(ab’)₂和CD3抗體的標記，藉由流式細胞儀，可以在CD3⁺CAR⁺象限明顯的檢測到CAR表達率為68.6%。結果表示本申請的CAR分子在CNCT19細胞表面表達效果良好。

實施例4. CNCT19細胞對靶細胞的體外殺傷作用檢測

本實施例的實驗步驟如下：

1)腫瘤細胞(即靶細胞)分別選用CD19陽性人白血病細胞系Nalm-6(購自上海酶研生物科技有限公司，目錄號：CH179)及CD19陰性人白血病細胞系KG-1a(購自上海酶研生物科技有限公司，目錄號：CC-Y1305)。效應細胞分別為CD19 CAR-T細胞(即實施例2獲得的CNCT19細胞)和未轉染的T細胞(用NTD表示)；

2)按效靶比1：2和2：1，分別混合上述靶細胞和效應細胞接種於24孔板中。使每孔中共培養的細胞總數約為1×10⁶/孔，各條件均設3個平行孔。各孔補充培養液至1mL，置37℃、5%CO₂孵箱培養並記錄時間；

3)共培養24小時後，收集各孔細胞懸液移至1.5mL EP管分別標記。此外，離心後吸取各樣品管中上清液至新的1.5mL EP管，於-20℃凍存以備後續細胞因子檢測使用(詳見實施例6)；

4)各孔混合細胞中按腫瘤細胞種類分別加入相應檢測量的抗體標記，並按抗體說明書操作。使用PE-CD10抗體標記Nalm-6細胞，使用Percp-cy5.5-CD45抗體標記KG-1a細胞；

5)流式細胞儀檢測各樣品中不同腫瘤靶細胞的比例變化。

結果如圖2所示，可以看出，相比於與未轉染的T細胞(即NTD)共培養，CD19陽性腫瘤細胞Nalm-6與CAR-T細胞(即CNCT19細胞)共培養後，其殘留率明顯降低；而CD19陰性腫瘤細胞KG-1a與不同效應細胞共培養後的殘留率沒有明顯差異。具體來說，在效靶比為1：2時，CNCT19細胞與Nalm-6細胞共同孵育後，靶細胞殘留率為(2.8±1.3)，顯著低於未轉染的T細胞與Nalm-6細胞共同孵育後的靶細胞殘留率(12.1±1.2)%(P<0.01)。同樣的，在效靶比為2：1時，CNCT19細胞與Nalm-6細胞共同孵育後的靶細胞殘留率為(1.1±0.1)%，顯著低於未轉染的T細胞與Nalm-6細胞共同孵育後的靶細胞殘留率(7.3±1.2)%(P<0.01)。且CNCT19細胞對CD19陽性腫瘤細胞的殺傷效果隨著效靶比的增加而增強。

實施例5. 即時監測CNCT19細胞的殺傷功能

實驗步驟如下：

(1)取出靶細胞CHO-CD19，吸棄培養瓶內培養液，以生理鹽水液清洗1次，加入1ml含EDTA的胰蛋白酶溶液，置37℃溫箱中溫育2-6分鐘後終止消化。需要說明的是，CHO細胞採購自上海酶研生物科技有限公司，目錄號：CC-Y2110；CD19細胞分子序列來源於NCBI，藉由分子生物學的方法將CD19分子序列構建到CHO細胞中，經篩選獲得該靶細胞CHO-CD19細胞株。

(2)加入適量培養基至培養瓶，使該靶細胞形成細胞懸液，並用移液管將細胞吹打均勻。用計數板計數細胞懸液濃度後，配製成實驗需要的細胞濃度1×10⁵細胞/ml。

(3)在RTCA DP系統的E-Plate 16的孔中加入50μl培養基。將E-Plate 16放到RTCA Station上。RTCA系統會自動進行掃描(“Scan Plate”)，檢查是否接觸良好(在“Message”頁面顯示Connection OK)。開始檢測基線(Background)確定所選擇的孔接觸正常。

(4)取出E-Plate 16，在孔中加入100μl混合均勻的靶細胞懸液，使孔中細胞數目為1×10⁴細胞/孔。將E-Plate 16置於超淨台中室溫放置30分鐘後，將E-Plate 16放到培養箱中的RTCA Station上。在系統自動掃描“Scan Plate”後，開始Step2，即時動態檢測細胞增殖曲線。

(5)取出E-Plate 16，在一些孔中加入靶細胞懸液和CNCT19細胞懸液，在另一些孔中加入靶細胞懸液和未轉染的T細胞(即NTD)懸液(作為對照)，其中效靶比(即效應細胞與靶細胞的比值，即CNCT19細胞：靶細胞；NTD：靶細胞)為1：1，靶細胞懸液的體積為50μl，將E-Plate 16檢測板置於RTCA DP檢測臺上即時監測60小時，觀察CNCT19細胞對靶細胞的影響。

結果如圖3所示，圖中線1為NTD對照組曲線，線2為CNCT19處理組曲線。對比線1和線2，可以看出，腫瘤細胞(即靶細胞)隨時間的延長，其增殖被CNCT19細胞抑制。具體來說，與未轉染的T細胞共同孵育後，靶細胞生長趨勢並無明顯變化(線1)，而與CNCT19細胞共同孵育後，靶細胞生長趨勢明顯降低，甚至數量開始減少(線2)，說明CNCT19對靶細胞具有較強的殺傷能力。

實施例6. CNCT19細胞與靶細胞共培養後分泌細胞因子的檢測

本實施例的實驗步驟如下：

1)將實施例4中的各孔混合培養上清樣品(即步驟3獲得的樣品)從-20℃冰箱取出，室溫融化；

2)使用LEGENDplex^TM試劑盒(廠家：Biolegned，貨號：740013)，按說明書操作處理各樣品；

3)流式細胞儀檢測各樣品中不同細胞因子的水準。

結果如圖4A和圖4B所示，相比於未轉染的T細胞(即NTD)，CAR-T細胞(即CNCT19細胞)與Nalm-6細胞(CD19⁺)共培養後，其細胞因子IFN-γ和IL-6的分泌量明顯增加。具體來說，與靶細胞以效靶比2：1共培養24小時後，CNCT19細胞在靶細胞的刺激下，分泌INF-γ的量為(6186.37±861.13)pg/ml，顯著高於未轉染的T細胞的分泌量(2096.85±228.16pg/ml，P<0.05)；CNCT19細胞分泌IL-6的量(32.22±1.46pg/ml)顯著高於未轉染的T細胞的分泌量(12.23±4.37pg/ml，P<0.05)。

實施例7. CNCT19細胞的溶血及刺激性檢測

7.1. CNCT19細胞體外溶血試驗

本實施例的實驗步驟如下：

1)使用玻璃試管共7個，編為1~7號，各管中加入2.5mL 2%兔紅細胞懸液(取自紐西蘭兔，生產單位：中國食品藥品檢定研究院，品質合格證編號：No.11400500032425)。

2)CNCT19細胞以1×10⁷細胞/mL的濃度(以總T細胞數計)按不同劑量(0.5~0.1mL)加入已有不同劑量(2.0~2.4mL)氯化鈉注射液的1~5號管中，同時6號管和7號管分別加入2.5mL氯化鈉注射液(陰性對照)和2.5mL滅菌注射用水(陽性對照)。

3)每個試管的總體積為5.0mL，置於37℃±0.5℃恆溫箱中溫育3小時，放入恆溫箱後15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時和3小時觀察紅細胞有無溶解或凝聚。

結果如圖5A和圖5B所示，圖5A顯示各試管3小時振搖前的觀察結果，圖5B顯示各試管3小時振搖後的觀察結果，可以看出，陰性對照管(6號)可見試管上層液體無色澄明，管底紅細胞下沉，經振搖後均勻分散，判斷為無溶血無凝聚；陽性對照管(7號)可見溶液澄明紅色，未見分層，管底無紅細胞殘留判斷為完全溶血。而觀察至3小時加入不同劑量CNCT19細胞的各試管均可見試管上層液體為無色澄明，管底紅細胞下沉，經振搖後均勻分散，判斷為無溶血無凝聚。

7.2. CNCT19細胞靜脈輸注的血管刺激性試驗

本實施例的實驗步驟如下：

1)選擇檢疫合格、注射局部無異常的紐西蘭兔6隻，雌雄各半。採用同體自身對照法，各隻動物右、左耳分別靜脈輸注給予凍存劑型CAR-T細胞(即CNCT19細胞)和陰性對照品(氯化鈉注射液)。

2)經右耳緣靜脈輸注的CAR-T細胞濃度為1×10⁷細胞/mL，劑量為1×10⁷細胞/kg(按總T細胞數計)；經左耳緣靜脈注射氯化鈉注射液作為陰性對照，兩側耳緣靜脈給藥劑量皆為1mL/kg。

3)靜脈給藥後對動物進行一般觀察、給藥局部觀察及病理學檢查。

結果如圖6A和圖6B所示，圖6A顯示給予CAR-T細胞後給藥局部的顯微鏡照片(HE染色，10倍物鏡)，圖6B顯示給予氯化鈉注射液後給藥局部的顯微鏡照片(HE染色，10倍物鏡)，可以看出，凍存劑型CAR-T細胞經靜脈輸注後，與陰性對照側比較，未發現動物全身或局部症狀及病理學檢查異常。

實施例8. CNCT19細胞的體外致瘤性試驗

本實施例的實驗步驟如下：

1)以軟瓊脂培養基分別培養兩個供體來源的CAR-T細胞(即CNCT19細胞)，兩個供體分別是供體1(健康人供者T細胞，批號：TC20180613015)和供體2(健康人供者T細胞，批號：TC20180613016)，另設人胚肺成纖維細胞系MRC-5為陰性對照，人宮頸癌細胞系Hela為陽性對照。

2)試驗使用6孔培養板，每孔細胞數約為1×10³個、每組設3個平行孔，置於CO₂培養箱中培養並觀察3週。

3)每隔1週取出培養板，用顯微鏡觀察是否有純株形成、並拍照，以陽性對照組生長出明顯純株為準。

結果如圖7所示，可以看出，陽性對照組細胞(Hela)在培養基中形成純株，且隨著時間的延長，純株明顯增大。而觀察至23天，不同供體來源的CAR-T細胞及陰性對照組細胞(MRC-5)均未見純株形成生長，細胞全部死亡，不具有體外永生化增殖特徵。

實施例9. CNCT19細胞的體內成瘤性試驗

本實施例的實驗步驟如下：

1)兩個供體來源的凍存劑型CAR-T細胞(即CNCT19細胞)及相應未轉染的T細胞(即NTD)，分別皮下接種BALB/c裸鼠，其中兩個供體分別是供體2(健康人供者T細胞，批號：TC20180613016)和供體3(健康人供者T細胞，批號：TC20180808019)。

2)CAR-T細胞接種量為1×10⁷個/隻(以總T細胞數計)。設陰性對照組接種人胚肺成纖維細胞系MRC-5細胞1×10⁷個/隻，及陽性對照組接種人宮頸癌細胞系Hela細胞1×10⁶個/隻。

3)連續觀察16週，檢測體重變化、是否發生結節，以及結節是否會誘發成腫瘤性結節，並與陰性及陽性細胞組對照比較。

4)觀察結束後，進行大體解剖，取各臟器稱重並計算臟器係數。對接種部位及可疑症狀的組織或器官進行病理組織學檢查。

結果發現CAR-T細胞不具有體內成瘤性。陰性對照組(接種MRC-5細胞)至接種後第9天所有動物液性結節均消失。而陽性對照組(接種HeLa細胞)所有動物皮下結節均緩慢增大，病理檢查顯示為腫瘤組織生長所致結節，成瘤率達100%，綜上，本次試驗有效。兩個供體來源的CAR-T細胞及未轉染的T細胞接種組，所有動物接種後第5天液性結節全部消失，至第114天安樂死時，均未再次生長結節，病理檢查顯示在接種部位或轉移部位均未見腫瘤形成。

實施例10. CNCT19細胞單次靜脈注射給予Nalm-6移植瘤NCG小鼠的毒性試驗

本實施例的實驗步驟如下：

1)使用6-8週齡的NCG小鼠，雌雄各半。於給藥前三天尾靜脈注射Nalm-6細胞，接種濃度為2.5×10⁶個/mL的細胞懸液，劑量為10mL/kg。

2)篩選動物分性別區段按照體重隨機分為4組(即第2~5組)，第2~5組分別為溶媒對照組、T細胞對照組和CAR-T細胞低、高劑量組，每組40隻，雌雄各半。未荷瘤對照組(即第1組)和溶媒對照組(即第2組)均給予溶媒對照品(即生理鹽水，其中含人血白蛋白含量4%(W/V))。T細胞對照組(即第3組)給予未轉染的T細胞(即NTD)，劑量為1×10⁹cells/kg(以總T細胞數計，下同)。CAR-T細胞低、高劑量組(即第4組和第5組)的劑量分別為1×10⁸和1×10⁹細胞/kg。

3)所有動物給藥劑量均為25mL/kg，給藥方式為單次靜脈注射，給藥速度約為1mL/min。

4)給藥當天藥後連續觀察4小時，試驗期間每天上午和下午各進行1次一般臨床觀察，每週進行1次詳細臨床觀察、體重和攝食量測定，並在試驗期間進行體溫、臨床病理指標(血細胞計數和血生化指標)和免疫學指標(T淋巴細胞亞群、細胞因子和C反應蛋白)的檢測。

5)第1-5組的10隻/性別/組於第2天，5隻/性別/組於第15天實施安樂死並進行臟器稱重和大體解剖觀察，1、5組動物主要臟器進行組織病理學檢查。

本次試驗結果顯示，CAR-T細胞(即CNCT19細胞)單次給藥的最大耐受劑量大於1×10⁹細胞/kg。試驗期間CAR-T細胞低、高劑量組所有動物均未見死亡或瀕死情況，一般和詳細臨床觀察均未見異常反應，體重、食量、體溫、C反應蛋白、血生化均未見明顯異常改變。組織病理學檢查發現，CAR-T細胞低、高劑量組與T細胞對照組比較，未見明顯異常。

實施例11. CNCT19細胞的動物治療情況

11.1. CNCT19細胞對Nalm-6移植瘤NCG小鼠的治療作用

本實施例的實驗步驟如下：

1)使用6-8週齡的雌性NCG小鼠，於給藥前三天，尾靜脈注射5x10⁵的Nalm-6細胞，所用Nalm-6細胞以2.5x10⁶/ml的密度溶解於生理鹽水，每隻小鼠注射200μl的細胞重新懸浮液；

2)各實驗組注射相應的CAR-T細胞(即CNCT19細胞)、未轉染的T細胞(即NTD)或細胞保存液(即生理鹽水，其中人血白蛋白含量4%(W/V))。共分5組，分別為CAR-T低劑量組(注射CNCT19細胞，5×10⁶細胞/隻，按總T細胞數計，下同)、CAR-T中劑量組(注射CNCT19細胞，1×10⁷細胞/隻)、CAR-T高劑量組(注射CNCT19細胞，2×10⁷細胞/隻)、T細胞對照組(注射未轉染的T細胞，2×10⁷細胞/隻)及溶媒對照組(注射細胞保存液，200μl/隻)。每隻小鼠注射體積為200μl。

3)每週兩次進行體重檢測及一般臨床觀察。記錄小鼠存活情況，繪製生存曲線。

結果如圖8所示，CNCT19細胞各劑量組均對生存期有顯著的延長作用，且劑量依賴關係明顯。具體來說，中位生存時間：生理鹽水對照組為24天，NTD對照組為23天，CNCT19低劑量組為40天，而CNCT19中、高劑量組實驗動物至觀察終點全部存活。與生理鹽水及NTD對照組相比，CNCT19各劑量組皆能夠延長白血病動物生存時間達16天以上。

11.2. CNCT19細胞在動物體內的分佈情況

本實施例的實驗步驟如下：

1)用6-8週齡的NCG小鼠，雌雄各半。使用11.1實施例的方法建立Nalm-6移植瘤模型。

2)荷瘤及非荷瘤動物均接受CAR-T細胞(即CNCT19細胞)單次尾靜脈注射給藥，劑量為5×10⁶細胞/隻(按總T細胞數計)。

3)荷瘤組動物分別在給藥後24小時(即D2)、72小時(即D4)、168小時(即D8)、336小時(即D15)、504小時(即D22)、672小時(即D29)，非荷瘤組動物分別在給藥後24小時(即D2)、168小時(即D8)、336小時(即D15)按計劃安樂死，按順序採集動物全血(EDTA抗凝)、大腦、脊髓(頸段)、骨骼肌、生殖腺(卵巢、睾丸、附睾)、膀胱、胃、小腸、腸系膜淋巴結、骨髓、肝、腎、脾、心、肺等組織或體液。

4)採用經驗證的Q-PCR的方法測定血液及各組織樣品中嵌合抗原受體(即CAR)的含量。

結果顯示，CNCT19細胞以5×10⁶細胞/隻的劑量單次靜脈注射給予荷瘤鼠及非荷瘤鼠後，主要分佈於全血和肺、肝、心臟、脾等血流量較大的組織(見圖9)，其中，心臟和全血中分佈最多，藥時曲線下面積約為15000小時*拷貝數/微克，其次為肺部和脊髓，藥時曲線下面積約在40000-60000小時*拷貝數/微克之間，脾、肝等其他組織的藥時曲線下面積為20000小時*拷貝數/微克以下。

結果還顯示，CNCT19細胞在荷瘤鼠組織中的含量略高於非荷瘤鼠(見圖10)，給藥後24小時，荷瘤鼠的全血、心和脊髓的CNCT19細胞濃度分別約為非荷瘤鼠的3倍、6倍、5倍以上。

此後，各組織中藥物含量逐漸下降，至給藥後兩週基本降至方法學檢測限以下。而當疾病進展時，隨著CD19抗原刺激的增強，小鼠體內CNCT19細胞反應性地再次增殖(見圖11)，其中，腦、肺、肝、全血、脊髓的CNCT19細胞的濃度增加至1200拷貝數/微克DNA以上，甚至達到3500拷貝數/微克DNA。

實施例12. CNCT19細胞對急性淋巴細胞白血病的治療情況

12.1. CNCT19細胞的臨床使用情況

臨床應用流程如表1所示，其中某些環節的具體實驗步驟請見下文描述。

1、清淋預處理

在計畫CNCT19細胞懸液回輸前-5天內進行。

預處理方案：

氟達拉濱：30mg/m²，1次/天，連續使用2-4天；

環磷醯胺：500mg/m²，1次/天，連續使用2天。

預處理化療的兩種藥物需在同一天起開始使用。

2、CNCT19細胞懸液回輸

(1)細胞製備成功後<-100℃條件下凍存，使用時在同等溫度條件下運輸至醫院，輸注前根據試驗操作指南復蘇；

(2)細胞回輸方法：根據試驗操作指南復蘇細胞，細胞懸液需在復蘇後30分鐘內完成回輸。單次輸注，藉由輸血器經靜脈輸入受試者體內，若細胞懸液有1袋以上，每袋回輸之間可無時間間隔，連續輸注。受試者在細胞回輸期間需密切觀察，若出現嚴重不良事件則停止輸注，並根據不良事件的具體情況進行相應處理。若未發生嚴重不良事件，可按照訪視流程進行隨訪；

(3)受試者細胞回輸後需密切觀察24小時，若出現嚴重不良事件，則根據不良事件的具體情況進行相應處理；若未發生嚴重不良事件，可按照訪視流程進行隨訪；

(4)細胞回輸後，受試者繼續住院觀察14天或根據研究者對受試者的情況綜合評估以決定住院觀察時間。

3、CNCT19細胞懸液管理

為了嚴格管理和使用CNCT19細胞懸液，建立嚴格的CNCT19細胞懸液專人管理制度，由專人將研究用細胞懸液運輸至醫院科室，由專人負責研究用細胞懸液的接收、建立登記制度。

輸注完畢後，細胞懸液包裝由藥物管理人員回收保存/銷毀。

4、CNCT19細胞懸液治療復發或難治性急性淋巴細胞白血病的臨床療效和安全性結果

本試驗從2016年9月開始，至2020年10月，在探索性和I期臨床期間，CNCT共治療63例復發或難治性急性淋巴細包白血病(ALL)患者，其中，成人患者23例，兒童患者40例。用於成人ALL摸索給藥範圍：0.25×10⁸至0.5×10⁸ CAR陽性T細胞。

(a)臨床療效結果資料如表2和表3所示，表2顯示的是包括成人和兒童患者在內的63例患者的病情恢復情況，表3顯示的是23例成人患者的病情恢復情況。可以看出，在63例復發難治的急性淋巴細胞白血病患者中，絕大部分(93.7%)的患者經該CNCT19細胞懸液注射回輸後，病情得到了完全緩解。且，MRD陰性的患者比例為88.9%。結果顯示，CNCT19細胞懸液的注射回輸能有效治療復發或難治性急性淋巴細胞白血病成人患者和兒童患者。

(b)安全性初步結果資料如表4和表5所示，表4顯示的是包括成人和兒童患者在內的63例患者的安全性結果，表5顯示的是23例成人患者的安全性結果。在63例ALL患者中，3級及以上CRS和腦病的發生率分別為19%和20.6%。年齡組之間相比，成人組的嚴重CRS發生率較兒童組高，其中成人為39.1%，兒童為7.5%，成人組嚴重CRES發生率與兒童組略低或接近，其中，成人為17.4%，兒童為22.6%。考慮可能是由於早期試驗中，按體重給予CNCT19，成人體重大，劑量較高。例如，早期46例受試者中，劑量範圍為0.71×10⁶-4.08×10⁶/kg，相當於0.16×10⁸-2.36×10⁸ CAR陽性T細胞。隨著前期劑量探索逐漸瞭解CNCT19產品特性，在之後的臨床研究中選擇了較為安全性的劑量範圍，如，在17例細胞劑量使用範圍0.2×10⁸-1.1×10⁸CAR陽性T細胞(中位元值為0.5×10⁸)的患者中，3級及以上CRS和CRES發生率均降至5.9%(1/17)。

可以看出，該CNCT19細胞懸液的注射引起嚴重的CRS或CRES副作用的概率相對較低，總體安全性可控，因此具有良好的安全性能。說明CNCT19的良好的安全性能提升了產品品質，降低了臨床風險。

實施例13. CNCT19細胞對復發或難治性非霍奇金淋巴瘤的治療情況

13.1. CNCT19細胞的臨床使用情況

臨床應用流程如表6所示，其中某些環節的具體實驗步驟請見下文描述。

1、清淋預處理

在計畫CNCT19細胞懸液回輸前-5天內進行。

預處理方案：

氟達拉濱：30mg/m²，1次/天，連續使用2-4天；

環磷醯胺：500mg/m²，1次/天，連續使用2天。

預處理化療的兩種藥物需在同一天起開始使用。

2、CNCT19細胞懸液回輸

3、CNCT19細胞懸液管理

輸注完畢後，細胞懸液包裝由藥物管理人員回收保存/銷毀。

4、CNCT19細胞懸液治療復發或難治性非霍奇金淋巴瘤的臨床療效及安全性結果資料

本試驗從2016年9月開始，至2020年10月，在探索性和I期臨床期間，CNCT19細胞懸液共治療50例復發或難治性非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者。其中，用於NHL(僅成人)摸索給藥範圍：1×10⁸至2×10⁸ CAR陽性T細胞。

(a)臨床療效結果資料如表7，表7顯示的是50例患者的病情恢復情況。可以看出，在50例復發難治的非霍奇金淋巴瘤患者中，有約80%的患者經該CNCT19細胞懸液的注射回輸後，病情得到了完全緩解或部分緩解，其中，完全緩解率為54%(27例)，部分緩解率為24%(12例)。說明CNCT19細胞懸液能有效治療復發或難治性非霍奇金淋巴瘤患者。

b)安全性初步結果資料如表8所示，表8顯示的是50例患者的安全性結果。可以看出，該CNCT19細胞懸液注射引起嚴重的CRS或CRES副作用的概率低，級別在3級以上的副作用概率低於10%，其中，引起3級以上CRS的概率為0%，引起3級以上CRES的概率為6%，因此具有良好的安全性能。

CRES(CAR-T-cell-related Encephalopathy Syndrome)：CAR-T細胞相關腦病綜合症

前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附請求項的範圍。目前本申請所列舉的實施方式的多種變化對本領域普通技術人員來說是顯而易見的，且保留在所附的請求項和其等同方案的範圍內。

<110> 合源生物科技(天津)有限公司(JUVENTAS CELL THERAPY LTD.)

<120> 一種靶向CD19的嵌合抗原受體及其用途

<130> 0155-PA-001TW

<150> CN2019113015188

<151> 2019-12-17

<150> CN2020112748108

<151> 2020-11-16

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 嵌合抗原受體的胺基酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 編碼嵌合抗原受體的核酸序列

<400> 2

Claims

一種嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體的胺基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一種分離的核酸分子，該核酸分子編碼請求項1所述的嵌合抗原受體。
一種編碼嵌合抗原受體的分離的核酸分子，該核酸分子的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一種載體，該載體包含請求項2或3所述的核酸分子。
一種免疫效應細胞，該免疫效應細胞包含請求項1所述的嵌合抗原受體。
一種免疫效應細胞，該免疫效應細胞包含請求項2或3所述的核酸分子。
一種免疫效應細胞，該免疫效應細胞包含請求項4所述的載體。
如請求項5至7中任一項所述的免疫效應細胞，其中該免疫效應細胞選自以下組：T淋巴細胞和自然殺傷細胞。
如請求項5至7中任一項所述的免疫效應細胞，該免疫效應細胞表面表達請求項1所述的嵌合抗原受體。
一種製備免疫效應細胞的方法，該方法包括以下的步驟：向免疫效應細胞中轉導請求項4所述的載體。
如請求項10所述的方法，該免疫效應細胞選自以下組：T淋巴細胞和自然殺傷細胞。
一種組成物，該組成物包含請求項5至9中任一項所述的免疫效應細胞。
一種請求項1所述的嵌合抗原受體、請求項2或3所述的核酸分子、請求項4所述的載體和/或請求項5至9中任一項所述的免疫效應細胞用於製備藥物的用途，其中該藥物用於治療與CD19的表達相關的疾病或病症。
如請求項13所述用途，其中該與CD19的表達相關的疾病或病症包括非實體瘤。
如請求項14所述的用途，其中該非實體瘤包括白血病和/或淋巴瘤。
如請求項13所述的用途，其中該與CD19的表達相關的疾病或病症包括急性淋巴細胞白血病和/或B細胞淋巴瘤。
如請求項16所述的用途，其中該急性淋巴細胞白血病包括成人急性淋巴細胞白血病和/或兒童急性淋巴細胞白血病。
如請求項16所述的用途，其中該B細胞淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤。