KR20220116239A - 변형된 면역 세포의 제조에서 플라스미드 조합 및 이의 적용 - Google Patents
변형된 면역 세포의 제조에서 플라스미드 조합 및 이의 적용 Download PDFInfo
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Abstract
변형된 면역 이펙터 세포를 제조하기 위해 4-플라스미드 시스템을 사용하는 방법이 본 개시내용에 제공된다. 방법은 293T 세포 내에 4개 플라스미드를 사용하여 렌티바이러스를 형성하고, 렌티바이러스를 추출하고 획득한 다음, 렌티바이러스를 사용하여 면역 이펙터 세포를 형질감염시키고, 키메라 항원 수용체를 발현시키는 것을 포함한다. 또한 기재된 방법을 사용하여 획득한 면역 이펙터 세포 및 면역 이펙터 세포를 함유하는 조성물의 용도가 본 개시내용에 제공된다.
Description
본 개시내용은 바이오의약품 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 293T 세포 내 4개의 플라스미드를 사용함에 의해 렌티바이러스를 형성하고, 렌티바이러스를 추출 및 수득한 다음 T 세포를 렌티바이러스로 형질감염시켜 CD19를 표적화하는 키메라 항원 수용체를 발현시키는 것을 포함하는, 4-플라스미드 시스템을 사용하여 293T 세포를 형질감염시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 본 방법을 사용하여 수득한 면역 이펙터 세포, 면역 이펙터 세포를 포함하는 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.
현재 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프모구성 백혈병(CLL) 및 B-세포 림프종에 대한 임상 치료는 주로 화학요법, 줄기 세포 이식, 생물학적 치료법을 포함한다. 이러한 치료법이 특정 효능을 달성할 수 있지만, 재발성 또는 불응성 백혈병은 여전히 해결하기 어려운 주요 문제로 남아 있다. 새로운 치료 전략으로 종양의 세포 면역치료가 최근 연구에서 화두가 되고 있다. CD19는 거의 모든 B-세포 종양 세포의 표면 상에서 널리 발현되는 반면, 다른 실질 세포 및 조혈 줄기 세포에서는 거의 발현되지 않는다.
종양 세포는 다양한 경로, 예를 들어 T 세포 인식 및 항원 반응에 참여하는 분자의 발현을 하향 조절하거나 면역원성을 감소시키고, 이에 의해 유기체의 면역계가 종양을 효과적으로 제거할 수 없도록 함에 의해 면역 탈출을 생성할 수 있다. 연구는 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포)는 종양 세포의 표면 상의 항원을 인식하고 종양 세포를 특이적으로 사멸할 수 있고, 따라서 이들은 종양의 치료에 유용하다는 것을 밝혔다.
종래 기술에서 현재 이용가능한 플라스미드 패키징 시스템을 사용하여 제조된 렌티바이러스는 낮은 농도의 생존가능한 바이러스 및 낮은 형질감염 역가를 갖는다. T 세포 형질감염의 이상적인 효과를 달성하기 위해, 더 높은 비용, 과도한 잔류 물질 및 열악한 안전성 성능의 단점과 함께 훨씬 더 높은 용량의 렌티바이러스를 추가해야하는 것이 필요하다. 4-플라스미드 패키징 시스템이 3-플라스미드 패키징 시스템을 대체하기 위해 종래 기술에서도 사용되었다는 사실에도 불구하고, 우수한 안전성 성능을 보장하면서 더 높은 형질감염 역가를 제공하기 위해 플라스미드가 조합될 수 있는 적절한 비율은 아직 결정되지 않았다. 따라서, 변형된 면역 이펙터 세포를 제조하기 위해 렌티바이러스 벡터를 패키징하기 위한 4개 플라스미드의 적절한 비율을 스크리닝하는 것이 시급한 요구로 남아 있다.
발명의 요약
종래 기술의 단점을 극복하기 위해, 본 개시내용은 표적 플라스미드 및 3개 헬퍼 플라스미드로 구성된 4-플라스미드 패키징 시스템을 제공하며, 여기서 표적 플라스미드는 바이러스 패키징을 위한 비-필수 성분이 없으며 이에 의해 잠재적인 안전성 위험을 효과적으로 최소화한다. 4개 플라스미드를 특정 비율로 사용함에 의해, 본 개시내용은 수득된 렌티바이러스의 형질감염 역가를 효과적으로 증가시킬 수 있고, 특정 CAR이 장입된 렌티바이러스 벡터로 T 세포를 형질감염시킴에 의해 수득된 월등한 임상 치료 효과 및 더 높은 안전성 성능을 나타내는 CAR-T 세포를 제공할 수 있다.
본 개시내용은 서열번호 1에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공한다. 본 개시내용은 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 키메라 항원 수용체, 상기 핵산 분자 및/또는 상기 벡터를 포함하는 면역 이펙터 세포, 상기 면역 이펙터 세포를 제조하는 방법, 상기 면역 이펙터 세포를 포함하는 조성물, 및 상기 키메라 항원 수용체의 용도를 추가로 제공한다.
본 개시내용에 따른 키메라 항원 수용체는 하기 유리한 효과 중 적어도 하나를 포함한다:
(1) 높은 발현 수준에서 면역 세포(예컨대 T 세포)의 표면 상에서 안정적인 발현;
(2) CD19-양성 표적 세포를 사멸하는 강력한 능력;
(3) 면역 세포가 사이토카인을 분비하도록 촉진하는 능력, 예를 들어 사이토카인(INF-γ 또는 IL-6)을 분비하는 T 세포의 능력을 적어도 1, 2, 또는 3배 증진시키는 능력;
(4) 비-용혈성이고, 적혈구의 용혈 또는 응집을 유도하기 쉽지 않음;
(5) 혈관 자극이 없고, 투여 후 국소적 또는 전신적 이상이 없음;
(6) 발암 가능성이 없고 생체내 또는 시험관내에서 비-종양원성임;
(7) 암 환자의 생존 시간을 연장하는 능력;
(8) 암(예컨대 성인의 급성 림프모구성 백혈병, 소아의 급성 림프모구성 백혈병 및/또는 비-호지킨 림프종)의 중증도를 효과적으로 개선하는 능력; 및
(9) 부작용(예를 들어, 사이토카인 방출 증후군 또는 CAR-T-세포-관련된 뇌병증 증후군)을 유발하는 낮은 위험으로 더 높은 안전성 성능을 나타내는 능력.
일 양태에서, 본 개시내용은 플라스미드 조합을 제공하며, 여기서 플라스미드 조합은 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev를 포함하고; 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 2-6:1-1.5:1-3:1-1.5의 비율로 존재한다.
특정 실시형태에서, 플라스미드 조합 내의 플라스미드 Seq1은 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 키메라 항원 수용체는 서열번호 1에 도시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 플라스미드 조합 내의 플라스미드 Seq1은 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 핵산 분자는 서열번호 2에 도시된 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 플라스미드 조합 내의 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 11.8:3.53:6.33:2.3, 13.8:3.48:5.31:2.54 또는 14:4.67:4.67:4.67의 비율로 존재한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 렌티바이러스 벡터를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 플라스미드 조합을 세포 안으로 도입하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 도입하는 단계는 형질감염시키는 단계를 지칭한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 4-플라스미드 패키징 시스템으로 세포를 형질감염시킴에 의해 렌티바이러스 벡터를 수득하는 방법을 제공하며, 여기서 플라스미드 패키징 시스템은 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev를 포함하고, 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 2-6:1-1.5:1-3:1-1.5의 비율로 존재한다.
특정 실시형태에서, 플라스미드 Seq1은 서열번호 1에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현할 수 있다.
특정 실시형태에서, 플라스미드 Seq1은 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하며, 여기서 핵산 분자는 서열번호 2에 도시된 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 11.8:3.53:6.33:2.3 또는 13.8:3.48:5.31:2.54의 비율로 존재한다.
특정 실시형태에서, 세포는 293T이다. 특정 실시형태에서, 세포는 293T/17이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 서열번호 1에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 추가로 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 추가로 제공하며, 여기서 핵산 분자는 서열번호 2에 도시된 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 포함하는 플라스미드를 추가로 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 렌티바이러스를 제조하는 방법에 따라 렌티바이러스 벡터를 제조하고 수득하는 단계를 포함하는, 변형된 면역 이펙터 세포를 제조하는 방법을 추가로 제공한다.
특정 실시형태에서, 방법은 렌티바이러스 벡터를 면역 이펙터 세포 안으로 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 도입하는 단계는 형질감염시키는 단계를 지칭한다.
특정 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 T 림프구 및 자연 살해 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 변형된 면역 이펙터 세포를 제조하는 방법에 의해 제조되고 수득된, 변형된 면역 이펙터 세포를 포함하는 변형된 면역 이펙터 세포를 추가로 제공한다.
특정 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 T 림프구 및 자연 살해 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체를 발현할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 수득된 변형된 면역 이펙터 세포를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
특정 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 T 림프구 및 자연 살해 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 면역 이펙터 세포의 표면 상에서 발현된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 방법에 의해 제조된 면역 이펙터 세포, 및/또는 면역 이펙터 세포, 키메라 항원 수용체, 핵산 분자, 벡터를 포함하는 조성물 및/또는 의약의 제조에서 면역 이펙터 세포의 용도를 추가로 제공하며, 여기서 의약은 CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애의 치료에 유용하다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 조성물 및/또는 면역 이펙터 세포를 적용하는 것을 포함하는, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 조성물 및/또는 면역 이펙터 세포를 추가로 제공한다.
특정 실시형태에서, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애는 비-고형 종양을 포함한다.
특정 실시형태에서, 비-고형 종양은 백혈병 및/또는 림프종을 포함한다.
특정 실시형태에서, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애는 급성 림프모구성 백혈병 및/또는 B-세포 림프종을 포함한다.
특정 실시형태에서, 급성 림프모구성 백혈병은 성인의 급성 림프모구성 백혈병 및/또는 소아의 급성 림프모구성 백혈병을 포함한다.
특정 실시형태에서, 급성 림프모구성 백혈병을 치료하기 위한 의약은 0.25×108 내지 0.5×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 투여된다.
특정 실시형태에서, B-세포 림프종은 비-호지킨 림프종을 포함한다.
특정 실시형태에서, 비-호지킨 림프종을 치료하기 위한 의약은 1×108 내지 2×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 투여된다.
당업자는 이하의 상세한 설명으로부터 본 개시내용의 다른 양태 및 이점을 용이하게 인지할 수 있다. 다음의 상세한 설명에서는 본 개시내용의 예시적인 실시형태만이 도시되고 설명된다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 본 개시내용의 내용은 당업자가 본 개시내용의 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 본 명세서에 개시된 특정 실시형태에 대한 수정을 할 수 있게 한다. 이에 따라 본 개시내용의 설명에서의 도면 및 예시는 제한적이라기보다는 단지 예시적이다.
본 개시내용과 관련된 특정 특징은 첨부된 청구범위에 나타나 있다. 본 명세서와 관련된 개시내용의 특징 및 이점은 이하에서 상세히 설명되는 예시적인 실시형태 및 첨부된 도면을 참조하면 더 잘 이해될 수 있다. 도면에 대한 간략한 설명은 다음과 같다:
도 1a는 4-플라스미드 시스템으로 형질감염 후의 형질감염 역가를 나타낸다.
도 1b는 4-플라스미드 시스템으로 형질감염 후의 물리적 역가를 나타낸다.
도 2a는 CNCT19 세포의 표면에 발현된 CAR 분자의 검출 결과를 나타낸다.
도 2b는 CNCT19 세포의 표면에 발현된 CAR 분자의 검출 결과를 나타낸다.
도 3은 상이한 공동-배양 조건 하에서 종양 세포의 잔류율을 나타낸다.
도 4는 실시간 세포 분석(RTCA) 이중 목적(DP) 시스템에 의해 실시간으로 모니터링되는 CNCT19 세포에 의한 표적 세포(CHO-CD19)의 사멸을 나타낸다.
도 5a는 상이한 공동-배양 조건 하에서 상등액에서 INF-γ 농도의 변화를 나타낸다.
도 5b는 상이한 공동-배양 조건 하에서 상등액에서 IL-6 농도의 변화를 나타낸다.
도 6a는 3시간 동안 진탕하기 전의 각 시험관의 관찰 결과를 나타낸다.
도 6b는 3시간 동안 진탕한 후의 각 시험관의 관찰 결과를 나타낸다.
도 7a는 CAR-T 세포의 투여 후 국소적으로 주사된 부위의 현미경 사진을 나타낸다(HE 염색, 10×대물렌즈).
도 7b는 염화나트륨 주사 용액 투여 후 국소적으로 주사된 부위의 현미경 사진을 나타낸다(HE 염색, 10×대물렌즈).
도 8은 각 군에서 세포 접종 3주 후의 연질 한천 콜로니 형성을 나타낸다.
도 9는 상이한 세포로 처리된 Nalm-6 이종이식 종양을 갖는 NCG 마우스의 생존 곡선을 나타낸다.
도 10은 CNCT19 세포의 단일 투여 후 조직의 분포를 나타낸다.
도 11은 종양이 있는 동물 및 종양이 없는 동물에서 생체내 분포된 CNCT19 세포의 비교이다.
도 12는 단일 투여 후 동물의 다양한 조직에 분포된 CNCT19 세포의 변화를 나타낸다.
도 1a는 4-플라스미드 시스템으로 형질감염 후의 형질감염 역가를 나타낸다.
도 1b는 4-플라스미드 시스템으로 형질감염 후의 물리적 역가를 나타낸다.
도 2a는 CNCT19 세포의 표면에 발현된 CAR 분자의 검출 결과를 나타낸다.
도 2b는 CNCT19 세포의 표면에 발현된 CAR 분자의 검출 결과를 나타낸다.
도 3은 상이한 공동-배양 조건 하에서 종양 세포의 잔류율을 나타낸다.
도 4는 실시간 세포 분석(RTCA) 이중 목적(DP) 시스템에 의해 실시간으로 모니터링되는 CNCT19 세포에 의한 표적 세포(CHO-CD19)의 사멸을 나타낸다.
도 5a는 상이한 공동-배양 조건 하에서 상등액에서 INF-γ 농도의 변화를 나타낸다.
도 5b는 상이한 공동-배양 조건 하에서 상등액에서 IL-6 농도의 변화를 나타낸다.
도 6a는 3시간 동안 진탕하기 전의 각 시험관의 관찰 결과를 나타낸다.
도 6b는 3시간 동안 진탕한 후의 각 시험관의 관찰 결과를 나타낸다.
도 7a는 CAR-T 세포의 투여 후 국소적으로 주사된 부위의 현미경 사진을 나타낸다(HE 염색, 10×대물렌즈).
도 7b는 염화나트륨 주사 용액 투여 후 국소적으로 주사된 부위의 현미경 사진을 나타낸다(HE 염색, 10×대물렌즈).
도 8은 각 군에서 세포 접종 3주 후의 연질 한천 콜로니 형성을 나타낸다.
도 9는 상이한 세포로 처리된 Nalm-6 이종이식 종양을 갖는 NCG 마우스의 생존 곡선을 나타낸다.
도 10은 CNCT19 세포의 단일 투여 후 조직의 분포를 나타낸다.
도 11은 종양이 있는 동물 및 종양이 없는 동물에서 생체내 분포된 CNCT19 세포의 비교이다.
도 12는 단일 투여 후 동물의 다양한 조직에 분포된 CNCT19 세포의 변화를 나타낸다.
하기 특정 실시예는 개시내용의 특정 실시형태를 예시한다. 이 기술에 익숙한 사람은 본 명세서에 개시된 내용으로부터 개시내용의 다른 장점과 효과를 쉽게 이해할 수 있다.
이하, 개시내용을 더 설명한다: 본 개시내용에 따르면, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 부가하여, 본 명세서에서 사용되는 단백질 및 핵산 화학, 분자생물학, 세포 및 조직 배양, 미생물학, 면역학의 관련 용어 및 실험 절차는 모두 해당 분야에서 널리 사용되는 용어 및 통상적인 절차이다. 한편, 본 개시내용을 더 잘 이해하기 위해, 관련된 용어의 정의 및 설명은 아래에 제공된다.
본 명세서에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체"(CAR)는 일반적으로 항원에 결합할 수 있는 세포외 도메인 및 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함하는 융합된 단백질을 지칭한다. CAR은 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T)의 핵심 구성요소이며, 여기에는 표적화 모이어티(예를 들어, 종양-연관된 항원(TAA)에 결합하는 모이어티), 힌지 영역, 막횡단 영역 및 세포내 도메인이 포함될 수 있다. 본 개시내용에서, CAR은 항체의 항원 특이성에 기초한 T 세포 수용체 활성화를 위해 세포내 도메인과 조합될 수 있다. CAR을 발현하는 T 세포는 표적 항원을 발현하는 악성 세포를 특이적으로 인식하고 제거할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "단리된"은 일반적으로 자연 상태로부터 인공적인 수단에 의해 얻어지는 것을 지칭한다. 특정 "단리된" 물질 또는 구성요소가 자연에 나타나는 경우, 그것이 위치한 자연 환경이 변경되었거나 물질이 자연 환경에서 단리되었거나 둘 다일 수 있다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어, 어떤 비-단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 살아있는 동물에서 자연적으로 발생하며, 이 자연 상태에서 단리되고 순도가 높은 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드로 지칭한다. 용어 "단리된"은 인공 또는 합성 물질과 혼합되는 경우를 배제하지 않으며 물질의 활성을 손상시키지 않는 기타 불순물의 존재를 배제하지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "면역 이펙터 세포"는 일반적으로 면역 이펙터 반응을 촉진하는 것과 같은 면역 반응에 참여하는 세포를 지칭한다. 본 개시내용에서 면역 이펙터 세포는 T 림프구 및 자연 살해 세포로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "특이적으로 결합하고/하거나 특이적으로 인식한다"는 일반적으로 표적과 항체(또는 CAR 구조 단편) 사이의 결합과 같이 측정가능하고 재현가능한 상호작용을 지칭하며, 이는 분자(생체분자 포함)의 이종성 세포 모집단이 존재할 때 표적의 존재를 결정할 수 있다. 예를 들어, 표적(에피토프일 수 있음)에 특이적으로 결합하는 항체(또는 CAR 구조 단편)는 다른 표적에 대한 결합과 비교하여, 보다 쉬운 방식으로 더 높은 친화도 및 결합력으로 및/또는 더 긴 기간 동안 표적에 결합하는 항체(또는 CAR 구조 단편)이다.
본 명세서에 사용된 용어 "단리된 핵산 분자"는 일반적으로 그 단리된 형태의 임의의 길이의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 자연 환경에서 단리되거나 인공적으로 합성된 유사체를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "플라스미드" 또는 "벡터"는 일반적으로 특정 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있고 이에 의해 단백질이 발현될 수 있는 핵산을 전달하기 위한 도구를 지칭한다. 벡터는 그것이 운반하는 유전 물질 요소가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 숙주 세포 안으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드: 파지미드; 코스미드; 인공 염색체(예컨대 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유래된 인공 염색체(PAC)); λ 파지 또는 M13 파지와 같은 파지 및 동물 바이러스 등을 포함한다. 벡터로서 동물 바이러스의 유형은 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 헤르페스 바이러스(예컨대 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 배큘로바이러스, 유두종 바이러스 및 유두종 액포 바이러스(예컨대 SV40)를 포함한다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함하여 발현을 제어하는 다양한 요소를 함유할 수 있다. 부가하여 벡터는 복제의 기점을 함유할 수도 있다. 벡터는 또한 바이러스 입자, 리포솜 또는 단백질 코트와 같이 세포 내로의 진입을 돕는 성분을 포함할 수 있지만 이들 물질에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "조성물"은 일반적으로 환자에게 투여하기에 적합한 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 조성물은 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포를 포함할 수 있다. 더욱이, 조성물은 (약학적으로 유효한) 담체, 안정화제, 부형제, 희석제, 가용화제, 계면활성제, 유화제 및/또는 보존제의 하나 이상의 적합한 제형을 또한 포함할 수 있다. 조성물의 허용가능한 성분은 사용된 임의의 용량 및 농도에서 수용체에 비-독성이다. 본 개시내용의 조성물은 액체, 및 냉동 또는 동결건조된 조성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "CD19"는 통상적으로 백혈병 전구체 세포에서 검출될 수 있는 항원 결정기의 클러스터인 분화(CD) 19 단백질의 클러스터를 지칭한다. 인간 및 뮤어라인 CD19의 아미노산 및 핵산 서열은 공개 데이터베이스(예를 들어, GenBank, UniProt 및 Swiss-Prot)에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 인간 CD19의 아미노산 서열은 UniProt/Swiss-Prot 수탁 번호 P15391 하에서 액세스할 수 있고, 인간 CD19를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 NM_001178098 하에서 액세스할 수 있다. 본 개시내용에 따르면, "CD19"는 돌연변이(예를 들어, 전장 야생형 CD19의 점 돌연변이, 단편, 삽입, 결실 및 스플라이스 변이체)를 갖는 단백질을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "대상체"는 일반적으로 고양이, 개, 말, 돼지, 소, 양, 토끼, 마우스, 랫트 또는 원숭이를 포함하나 이에 제한되지 않는 인간 또는 비-인간 동물을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "렌티바이러스 벡터"는 일반적으로 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 지칭한다. 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터의 하나 이상의 단백질의 비-코딩 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "표적 플라스미드"는, 예를 들어, 세포 내로 전달될 이종 핵산 서열(예를 들어, CAR을 인코딩하는 핵산 서열)을 포함할 수 있고, 예를 들어, 하나 이상의 렌티바이러스 유전자 또는 그의 일부를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "헬퍼 플라스미드"는 렌티바이러스 단백질 또는 그의 일부를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 렌티바이러스 캡시드 단백질을 인코딩하는 유전자가 포함될 수 있고, 또 다른 예로서, env 단백질 또는 그의 일부를 인코딩하는 유전자가 포함될 수 있다. 숙주 세포를 표적 플라스미드 및 하나 이상의 헬퍼 플라스미드로 형질감염시켜 바이러스를 생성할 수 있으며, 이는 표적 세포(예를 들어, T 세포)를 감염시켜 표적 세포에서 이종 핵산 서열에 함유된 하나 이상의 이식유전자(예를 들어, CAR을 인코딩하는 유전자)를 발현하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "포함하는"은 일반적으로 명시적으로 특정된 특징의 포함을 지칭하지만 다른 요소를 배제하지 않는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "약"은 일반적으로 명시된 값의 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10% 초과 또는 미만의 범위 내에서 변화하는 것과 같이, 명시된 값보다 0.5%-10% 크거나 작은 범위 내에서 변화하는 것을 지칭한다.
4-플라스미드 시스템
일 양태에서, 본 개시내용은 플라스미드 조합을 제공하며, 여기서 플라스미드 조합은 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev를 포함한다.
4-플라스미드 시스템은 본 개시내용에서 그 설명서에 기재된 방법에 따라 렌티바이러스를 형질감염시키기 위해 사용된다. 4-플라스미드 시스템은 표적 플라스미드(Seq1)와 3개의 헬퍼 플라스미드(PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev)를 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따르면, 표적 플라스미드는 Seq1일 수 있다. Seq 1은 관심 유전자 서열을 담지한다. 벡터 플라스미드에서 관심 유전자는 렌티바이러스 벡터에 의해 표적 세포(293 세포)의 게놈 안으로 삽입되어 CAR의 안정적인 발현을 달성한다. 트랜스퍼 플라스미드는 서열번호 1에 도시된 아미노산 서열과 서열번호 2에 도시된 핵산 서열을 갖는다.
헬퍼 플라스미드 1은 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G를 인코딩하는 VSV-G 유전자를 제공하는 데 사용되는 PMD2.G일 수 있다. VSVG-엔벨로프-유사형 렌티바이러스 벡터는 벡터의 표적 세포 친화성 범위를 확장하고 렌티바이러스의 안정성을 증가시켜, 이에 의해 렌티바이러스 벡터를 고속 원심분리에 의해 농축되도록 허용하여 더 높은 역가를 얻을 수 있다.
헬퍼 플라스미드 2는 Rev 단백질-결합 부위를 제공하는 데 사용되고 Gag 및 Pol 유전자를 함유하는 pMDLg-pRRE일 수 있다. Gag 유전자는 뉴클레오캡시드 단백질, 막 단백질 및 캡시드 단백질과 같은 바이러스 입자의 주요 구조 단백질을 인코딩한다. pol 유전자는 프로테아제, 역전사효소 및 인테그라제와 같은 바이러스 복제-연관된 효소를 인코딩한다. 그것은 바이러스 조립에 중요한 역할을 한다.
헬퍼 플라스미드 3은 Gag 및 Pol 유전자의 발현 수준을 조절하고 단일-가닥 DNA의 복제 과정을 가이드하기 위한 Rev 유전자를 제공하는 데 사용되는 pRSV-Rev일 수 있고, 스플라이싱/RNA 이송을 조절할 수 있다. 그것은 바이러스 조립에 중요한 역할을 한다.
특정 실시형태에서, 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 2-6: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 예컨대 2-5: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 2-4: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 2-3: 1-1.5 :1-3: 1-1.5, 3-6: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 3-5: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 3-4: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 4-6: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 4-5: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 또는 5-6: 1-1.5: 1-3: 1-1.5의 비율로 플라스미드 조합에 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 예컨대 2.1: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 2.2: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 2.3: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 2.4: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 2.5: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 2.6: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 2.7: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 2.8: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 2.9: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 3.0: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 3.1: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 3.2: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 3.3: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 3.4: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 3.5: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 3.6: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 3.7: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 3.8: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 3.9: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 4.0: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 4.1: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 4.2: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 4.3: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 4.4: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 4.5: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 4.6: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 4.7: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 4.8: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 4.9: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 5.0: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 5.1: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 5.2: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 5.3: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 5.4: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 5.5: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 5.6: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 5.7: 1-1.5: 1-3:1-1.5, 5.8: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 5.9: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 또는 6.0: 1-1.5: 1-3: 1-1.5의 비율로 존재할 수 있다.
특정 실시형태에서, 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 2-6: 1-1.5: 1-3:1-1.5, 예컨대 2-6: 1-1.3: 1-3: 1-1.5, 2-6: 1.2-1.5: 1-3: 1-1.5, 또는 2-6: 1.1-1.4: 1-3: 1-1.5의 비율로 플라스미드 조합에 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 2-6: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 예컨대 2-6: 1.1: 1-3: 1-1.5, 2-6: 1.2: 1-3: 1-1.5, 2-6: 1.3: 1-3: 1-1.5, 2-6: 1.4: 1-3: 1-1.5, 또는 2-6: 1.5: 1-3: 1-1.5의 비율로 존재할 수 있다.
특정 실시형태에서, 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 2-6: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 예컨대 2-6: 1-1.5: 1-2.5: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 1-2.0: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 1-1.5: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 1.5-3: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 1.5-2.5: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 1.5-2: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 2-3: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 2-2.5: 1-1.5, 또는 2-6: 1-1.5: 2.5-3: 1-1.5의 비율로 플라스미드 조합에 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 2-6: 1-1.5: 1-3: 1-1.5, 예컨대 2-6: 1-1.5: 1.1: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 1.2: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 1.3: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 1.4: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 1.5: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 1.6: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 1.7: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 1.8: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 1.9: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 2: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 2.1: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 2.2: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 2.3: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 2.4: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 2.5: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 2.6: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 2.7: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 2.8: 1-1.5, 2-6: 1-1.5: 2.9: 1-1.5, 또는 2-6: 1-1.5: 3: 1-1.5의 비율로 존재할 수 있다.
특정 실시형태에서, 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 11.8: 3.53: 6.33: 2.3, 13.8: 3.48: 5.31: 2.54 또는 14: 4.67: 4.67: 4.67의 비율로 플라스미드 조합에 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 11.8: 3.53: 6.33: 2.3의 비율로 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 13.8: 3.48: 5.31: 2.54의 비율로 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 14: 4.67: 4.67: 4.67의 비율로 존재할 수 있다.
키메라 항원 수용체, 핵산, 벡터, 면역 이펙터 세포 및 조성물
본 개시내용의 플라스미드 Seq1은 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현할 수 있다. 본 개시내용은 서열번호 1에 나타난 아미노산 서열과 적어도 80%(예컨대 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 키메라 항원 수용체를 추가로 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 종양 항원에 특이적으로 결합하고/하거나 종양 항원을 인식할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 CD19 항원에 특이적으로 결합하고/하거나 CD19 항원을 인식할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 면역 이펙터 세포가 사이토카인을 분비하도록 촉진할 수 있다. 면역 이펙터 세포는 T 림프구 및 자연 살해 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 사이토카인은 IFN-γ 및 IL-6으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 면역 이펙터 세포는 포유동물 면역 이펙터 세포일 수 있다. T 림프구는 포유동물 T 림프구일 수 있고, 자연 살해 세포는 또한 포유동물 자연 살해 세포일 수 있다. T 림프구는 인간 T 림프구일 수 있고, 자연 살해 세포는 또한 인간 자연 살해 세포일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 비-용혈성이고 혈관 자극이 없다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 시험관내 비-종양원성이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 생체내 비-종양원성이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 종양을 효과적으로 치료할 수 있다. 종양은 CD19-양성 종양일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 CD19-양성 종양을 갖는 환자의 생존 시간을 효과적으로 연장할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 키메라 항원 수용체는 비-고형 종양 환자의 생존 시간을 효과적으로 연장할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 키메라 항원 수용체는 림프종 및/또는 백혈병의 생존 시간을 효과적으로 연장할 수 있다. 다른 예를 들어, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 급성 림프모구성 백혈병을 갖는 성인 환자의 생존 시간을 효과적으로 연장할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 급성 림프모구성 백혈병을 갖는 소아 환자의 생존 시간을 효과적으로 연장할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 B-세포 림프종(예를 들어, 비-호지킨 림프종)을 갖는 환자의 생존 시간을 효과적으로 연장할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 성인의 급성 림프모구성 백혈병을 효과적으로 치료할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 소아의 급성 림프모구성 백혈병을 효과적으로 치료할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 비-호지킨 림프종을 효과적으로 치료할 수 있다.
본 개시내용의 플라스미드 Seq1은 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.
본 개시내용의 플라스미드 Seq1은 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하며, 여기서 핵산 분자는 서열번호 2에 나타난 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 플라스미드 Seq1은 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하며, 여기서 핵산 분자는 서열번호 2에 나타난 서열과 유사한 핵산 서열을 포함하고 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자이다.
특정 실시형태에서, 서열번호 2에 나타난 서열과 유사한 핵산 서열은 서열번호 2에 나타난 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 지칭한다.
특정 실시형태에서, 서열번호 2에 나타난 서열과 유사한 핵산 서열은, 핵산 코돈의 위치 3에서 염기의 워블(축퇴)에 기인하여 핵산 분자가 서열번호 2에 나타난 핵산 서열과 상이하지만 키메라 항원 수용체를 인코딩할 수 있음을 의미한다.
본 개시내용은 하나 또는 더 많은 생물학적 활성을 보유하는 유전자 및 단백질의 변이체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 서열번호 1에 나타난 아미노산 서열의 변이체, 또는 서열번호 2에 나타난 핵산 서열의 변이체)를 포함한다. 단백질 또는 폴리펩티드의 이러한 변이체는 단백질 또는 폴리펩티드가 변경되거나 추가적인 특성을 갖도록 재조합 DNA 기술을 사용하여 변형되었거나 변형될 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하며; 예를 들어, 변이체는 혈장에서 증강된 안정성 또는 단백질에 대해 증가된 활성을 부여한다. 변이체는 참조 서열과 상이할 수 있으며, 예를 들어 자연 발생 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는 펩티드와 상이할 수 있다. 뉴클레오티드 서열 수준에서, 자연 발생 변이 유전자와 비-자연 발생 변이 유전자는 참조 유전자에 전형적으로 적어도 약 50%, 보다 전형적으로 적어도 약 70%, 훨씬 더 전형적으로 적어도 약 80% 동일성(90% 또는 더 높은 동일성)을 가질 것이다. 아미노산 서열 수준에서, 자연 발생 변이 단백질 및 비-자연 변이 단백질은 참조 단백질에 전형적으로 적어도 약 70%, 보다 전형적으로 적어도 약 80%, 훨씬 더 전형적으로 적어도 약 90% 이상의 동일성을 가질 것이고, 반면 비-보존된 영역에서 더 높은 퍼센트 비-동일성 영역을 허용한다(예를 들어, 퍼센트 동일성은 70% 미만, 예컨대 60% 미만, 50% 미만, 또는 심지어 40% 미만임). 다른 실시형태에서, 서열은 참조 서열과 적어도 60%, 70%, 75% 또는 그 초과의 동일성(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성)을 갖는다. 뉴클레오티드 및 아미노산을 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는 폴리펩티드 안으로 도입하는 변형 절차는 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, Sambrook et al.(1989) 참조).
본 명세서에 사용된 용어 "동일성", "상동성" 및 이의 문법적 변형은 일반적으로 이들의 서열이 "정렬"될 때 둘 이상의 엔티티가 동일함을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 2개의 폴리펩티드가 동일한 서열을 가질 때, 그들은 적어도 참조 영역 또는 부분 내에서 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 2개의 폴리뉴클레오티드가 동일한 서열을 갖는다면, 그들은 적어도 참조 영역 또는 부분 내에서 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다. 동일성은 서열의 정의된 구역(영역 또는 도메인)의 동일성일 수 있다. 동일성의 "구역" 또는 "영역"은 둘 이상의 참조 엔티티의 동일한 부분을 지칭한다. 따라서, 2개의 단백질 또는 핵산 서열이 하나 이상의 서열 구역 또는 영역에서 동일하면 그들은 그 영역에서 동일성을 갖는다. "정렬된" 서열은 참조 서열과 비교하여 종종 보충 또는 추가 염기 또는 아미노산(갭)을 함유하는 더 많은 폴리뉴클레오티드 또는 단백질(아미노산) 서열을 지칭한다. 두 서열 사이의 동일성(상동성)의 정도는 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 퍼센트 서열 동일성(상동성)을 계산하는 이러한 알고리즘은 일반적으로 비교되는 영역 또는 구역에서 서열 갭 및 불일치를 계산한다. 예를 들어, BLAST(예를 들어, BLAST 2.0) 검색 알고리즘(예를 들어, Altschul et al., J.Mol. Biol. 215: 403(1990) 참조, NCBI에서 공개적으로 이용가능)은 다음과 같은 예시적인 검색 매개변수를 제공한다: 불일치 -2, 갭 오프닝 5, 갭 확장 2.
본 개시내용에 따르면, 핵산 분자는 그의 단리된 형태에서 임의의 길이의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체를 인코딩할 수 있는 한, 그의 자연 환경으로부터 단리되거나 인공적으로 합성된 유사체일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시내용에 따르면, 벡터는 그것이 운반하는 유전 물질 요소가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 숙주 세포 내로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드; 파지미드; 코스미드; 인공 염색체(예컨대 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유래된 인공 염색체(PAC)); λ 파지 또는 M13 파지와 같은 파지 및 동물 바이러스 등을 포함한다. 벡터로서 동물 바이러스의 유형은 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 헤르페스 바이러스(예컨대 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 배큘로바이러스, 유두종 바이러스 및 유두종 액포 바이러스(예컨대 SV40)를 포함한다. 또 다른 예를 들어, 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함하여 발현을 제어하는 다양한 요소를 함유할 수 있다. 부가하여 벡터는 복제 기점을 포함할 수도 있다. 더욱이, 벡터는 바이러스 입자, 리포솜 또는 단백질 코트와 같이 세포 내로의 진입을 돕는 성분을 포함할 수 있지만 이러한 물질에 제한되지는 않는다.
일 양태에서, 본 개시내용은 렌티바이러스 벡터를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 플라스미드 조합을 세포 안으로 도입하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체, 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 면역 이펙터 세포를 제공한다.
본 개시내용에 따르면, 면역 이펙터 세포는 T 림프구 및 자연 살해 세포로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 인간 면역 이펙터 세포일 수 있다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 인간 T 림프구일 수 있다. 다른 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 인간 자연 살해 세포일 수 있다.
본 개시내용에 따르면, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체는 면역 이펙터 세포의 표면 상에서 발현된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포는 종양 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있다. 종양 세포는 CD19-양성 세포일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포는 CD19-양성 인간 백혈병 세포주 Nalm-6 세포의 잔류율을 상당히 낮출 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포는 CD19-양성 세포와 접촉할 때 사이토카인 분비를 효과적으로 촉진할 수 있다. 사이토카인은 IFN-γ 및 IL-6으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 면역 이펙터 세포를 CD19-양성 인간 백혈병 세포주 Nalm-6 세포와 공동-배양하면 IFN-γ 및 IL-6 사이토카인의 분비에서 상당한 증가를 초래한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포는 비-용혈성이고 혈관 자극이 없다. 예를 들어, 시험관내 용혈 시험에서, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포는 용혈 및 혈액 응집을 유도하지 않을 것이다. 또 다른 예를 들어, 본 명세서에 기술된 면역 이펙터 세포는 혈관 자극이 없다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포는 시험관내 비-종양원성이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포는 생체내 비-종양원성이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포는 종양을 효과적으로 치료할 수 있다. 종양은 CD19-양성 종양일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 면역 이펙터 세포는 CD19-양성 종양을 갖는 환자의 생존 시간을 효과적으로 연장할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포는 급성 림프모구성 백혈병을 갖는 성인 환자의 생존 시간을 효과적으로 연장할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포는 급성 림프모구성 백혈병을 갖는 소아 환자의 생존 시간을 효과적으로 연장할 수 있다. 다른 예를 들어, 본 명세서에 기술된 면역 이펙터 세포는 B-세포 림프종(예를 들어, 비-호지킨 림프종)을 갖는 환자의 생존 시간을 효과적으로 연장할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포는 성인의 급성 림프모구성 백혈병을 효과적으로 치료할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포는 소아의 급성 림프모구성 백혈병을 효과적으로 치료할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포는 B-세포 림프종(예컨대 비-호지킨 림프종)을 효과적으로 치료할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용에 따르면, 조성물은 또한 (약학적으로 유효한) 담체, 안정화제, 부형제, 희석제, 가용화제, 계면활성제, 유화제 및/또는 보존제의 하나 이상의 적합한 제형을 포함할 수 있다. 조성물의 허용가능한 성분은 사용된 임의의 용량 및 농도에서 수용체에 비-독성이다. 본 개시내용의 조성물은 액체, 및 냉동 또는 동결건조된 조성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 조성물은 비경구, 경피, 관강내, 동맥내, 척추강내 및/또는 비강내 투여 또는 조직 안으로의 직접 주사를 위한 조성물일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 주입 또는 주사를 통해 환자 또는 대상체에게 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 조성물의 투여는 상이한 방식, 예를 들어 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 피내 투여에 의해 수행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 조성물은 중단 없이 투여될 수 있다. 중단되지 않은(또는 연속적인) 투여는 WO2015/036583에 기술된 바와 같이 환자의 체내로의 치료제의 유입을 측정하기 위해 환자가 착용하는 소형 펌프 시스템에 의해 실현될 수 있다.
본 개시내용에 따르면, 조성물의 투여량 요법은 급속 주입제의 용량, 시간에 걸쳐 투여되는 다중 분할 용량일 수 있거나, 또는 용량을 치료 상황의 심각성과 긴급성에 비례하여 줄이거나 증가시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 치료 요법은 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 월 1회, 3개월마다 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 투여 요법은 정맥내 투여를 포함하고, 용량은 0.1×108 내지 3×108 CAR-양성 T 세포, 예를 들어, 0.15×108 내지 2×108 CAR-양성 T 세포, 0.5×108 내지 2×108 CAR-양성 T 세포, 1×108 내지 2×108 CAR-양성 T 세포, 0.2×108 내지 2×108 CAR-양성 T 세포, 0.2×108 내지 1×108 CAR-양성 T 세포, 0.25×108 내지 1×108 CAR-양성 T 세포, 0.25×108 내지 0.5×108 CAR-양성 T 세포, 또는 0.5×108 CAR-양성 T 세포, 또는 2×108 CAR-양성 T 세포의 범위로 투여될 수 있다.
투여를 위한 용량은 상이한 적응증에 대해 다를 수 있다. 특정 실시형태에서, 재발성 및 불응성 급성 림프모구성 백혈병을 갖는 성인 환자의 치료를 위한 면역 이펙터 세포는 0.25×108 내지 0.5×108 CAR-양성 T 세포, 또는 0.5×108 CAR-양성 T 세포, 예를 들어, 0.3×108 내지 0.5×108, 0.4×108 내지 0.5×108, 0.25×108 내지 0.4×108, 0.3×108 내지 0.4×108, 또는 0.4×108 내지 0.5×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 재발성 및 불응성 급성 림프모구성 백혈병을 갖는 성인 환자의 치료를 위한 면역 이펙터 세포는 0.25×108, 0.26×108, 0.27×108, 0.28×108, 0.29×108, 0.3×108, 0.31×108, 0.32×108, 0.33×108, 0.34×108, 0.35×108, 0.36×108, 0.37×108, 0.38×108, 0.39×108, 0.4×108, 0.41×108, 0.42×108, 0.43×108, 0.44×108, 0.45×108, 0.46×108, 0.47×108, 0.48×108, 0.49×108 또는 0.5×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 투여될 수 있다.
특정 실시형태에서, 재발성 및 불응성 급성 림프모구성 백혈병을 갖는 소아 환자의 치료를 위한 면역 이펙터 세포는 0.25×108 내지 0.5×108 CAR-양성 T 세포, 또는 0.5×108 CAR-양성 T 세포, 예를 들어, 0.3×108 내지 0.5×108, 0.4×108 내지 0.5×108, 0.25×108 내지 0.4×108, 0.3×108 내지 0.4×108, 또는 0.4×108 내지 0.5×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재발성 및 불응성 급성 림프모구성 백혈병을 갖는 소아 환자의 치료를 위한 면역 이펙터 세포는 0.25×108, 0.26×108, 0.27×108, 0.28×108, 0.29×108, 0.3×108, 0.31×108, 0.32×108, 0.33×108, 0.34×108, 0.35×108, 0.36×108, 0.37×108, 0.38×108, 0.39×108, 0.4×108, 0.41×108, 0.42×108, 0.43×108, 0.44×108, 0.45×108, 0.46×108, 0.47×108, 0.48×108, 0.49×108 또는 0.5×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 재발성 및 불응성 비-호지킨 림프종을 갖는 환자의 치료를 위한 면역 이펙터 세포는 1×108 내지 2×108 CAR-양성 T 세포, 또는 2×108 CAR-양성 T 세포, 예를 들어, 1×108 내지 1.8×108, 1×108 내지 1.5×108, 1×108 내지 1.3×108, 1.3×108 내지 2×108, 1.3×108 내지 1.5×108, 1.5×108 내지 2×108, 1.5×108 내지 1.8×108 또는 1.8×108 내지 2×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 재발성 및 불응성 호지킨 림프종을 갖는 환자의 치료를 위한 면역 이펙터 세포는 1×108, 1.1×108, 1.2×108, 1.3×108, 1.4×108, 1.5×108, 1.6×108, 1.7×108, 1.8×108, 1.9×108 또는 2.0×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 투여될 수 있다.
제조 방법 및 용도
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 플라스미드 또는 벡터를 면역 이펙터 세포 안으로 형질도입하는 단계를 포함하는, 면역 이펙터 세포를 제조하는 방법을 추가로 제공한다.
특정 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 T 림프구 및 자연 살해 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 의약의 제조에서 키메라 항원 수용체, 핵산 분자, 벡터 및/또는 면역 이펙터 세포의 용도를 추가로 제공하며, 여기서 의약은 CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애의 치료에 유용하다. 투여를 위한 의약의 용량은 상기 언급된 바와 같이 면역 이펙터 세포에 대해 정의된 용량을 참조할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체, 핵산 분자, 벡터 및/또는 면역 이펙터 세포를 치료를 필요로 하는 대상체에게 적용하는 것을 포함하는, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 개시내용에 따르면, 조성물의 투여는 상이한 방식, 예를 들어 정맥내, 종양내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 피내 투여에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 항원 수용체, 핵산 분자, 벡터 및/또는 면역 이펙터 세포는 CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애의 치료에 유용하다.
본 개시내용에 따르면, 의약은 T-세포 면역요법제를 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따르면, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애는 비-고형 종양을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따르면, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애는 백혈병 및/또는 림프종을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애는 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 예를 들어 성인 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 및/또는 소아 급성 림프모구성 백혈병(ALL)을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애는 성인 만성 림프모구성 백혈병(CLL)을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애는 B-세포 림프종을 포함할 수 있다. 예를 들어, B-세포 림프종은 비-호지킨 림프종을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따르면, 대상체는 인간 또는 비-인간 동물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체는 고양이, 개, 말, 돼지, 소, 양, 토끼, 마우스, 랫트 또는 원숭이를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않았다.
어떠한 이론에도 구속되지 않고, 다음의 실시예는 본 개시내용의 키메라 항원 수용체, 면역 이펙터 세포, 제조 방법 및 용도를 예시하기 위해 설명될 뿐이고, 그의 범주를 제한하기 위해 사용되지 않는다. 실시예는 벡터 및 플라스미드를 구성하는 데 사용되는 방법, 단백질을 인코딩하는 유전자를 이러한 벡터 및 플라스미드에 삽입하는 방법 또는 플라스미드를 숙주 세포 안으로 도입하는 방법과 같은 전통적인 방법에 대한 자세한 설명을 포함하지 않는다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniais, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold spring Harbor Laboratory Press를 포함한 많은 공개물에 개시되어 있다.
본 개시내용에 인용된 모든 특허, 출원 및 참고문헌은 각각의 문서가 개별적으로 참조용으로 인용되는 범위 내에서 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다. 참조로 포함된 자료가 이 상세한 설명과 모순되거나 불일치하는 경우 상세한 설명이 임의의 그러한 자료를 대체한다.
실시예
실시예 1. 렌티바이러스 벡터의 구축 및 제조
본 개시내용에 기재된 CAR 구조를 함유하는 단편(그 아미노산 서열 및 염기서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로 나타냄)을 인공적으로 합성하고, 변형된 빈 벡터(제조사: SBI Corporation, 카탈로그 번호: CD500-CD800) 안으로 구축되었다. 3개의 헬퍼 플라스미드를 패키징에 사용하여 렌티바이러스 벡터를 수득하였고, 수득된 렌티바이러스 벡터를 발현 벡터 CNCT19로 명명하였다. 구체적인 단계는 다음과 같이 기술된다.
1.1 플라스미드 벡터의 구축
본 개시내용에서는 표적 플라스미드(Seq1), PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev를 함유하는 4-플라스미드 시스템을 사용하였다.
먼저, 표적 플라스미드 Seq1을 구축하였다. 빈 벡터(제조사: SBI System BioScience, 명칭: PCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP, 카탈로그 번호: CD526A-1)를 2개의 제한 효소 Nhe I(GCTAGC) 및 Not I(GCGGCCGC)로 절단하고, Nhe I 및 Not I 효소-분해 서열을 양 말단에 함유하고 서열번호 1에 나타난 아미노산 서열을 인코딩하는 CAR 유전자 단편에 연결하고, GFP 서열을 제거하여 벡터 ①을 얻었다. 벡터 ①을 Not I(GCGGCCGC)과 Sal I(GTCGAC)의 2가지 제한효소로 절단하고 T2A 서열을 제거하였다. 끈적거리는 말단을 크레나우 분절 효소로 무디게 하고, 용액 I 리가제를 결찰을 위해 첨가하여 벡터 ②를 얻었다. PCR 방법을 수행하여 암피실린 내성(AmpR) 유전자를 제외한 벡터 ②의 서열을 증폭하고, 합성 카나마이신 내성(KanR) 유전자를 증폭하고, 그 다음 두 단편을 재조합효소로 결찰하여 서열번호: 2에 나타난 뉴클레오티드 서열을 함유하는 표적 플라스미드 Seq1을 얻었다.
그 후, 3개의 헬퍼 플라스미드가 제조되었으며, 여기서 헬퍼 플라스미드 1은 PMD2.G(제품 번호 Biovector 12259로 Biovector로부터 구매)이고; 헬퍼 플라스미드 2는 pMDLg-pRRE(제품 번호 Biovector012251로, Biovector Corporation으로부터 구매)이고; 헬퍼 플라스미드 3은 pRSV-Rev(제품 번호 Biovector012253으로, Biovector Corporation으로부터 구매)였다.
4개의 플라스미드인 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 다음의 상이한 4개 플라스미드 비율로 패키징하는데 사용되었다:
Seq1: PMD2.G: pMDLg-pRRE: pRSV-Rev의 비율 1은 11.8:3.53:6.33:2.3이었고;
Seq1: PMD2.G: pMDLg-pRRE: pRSV-Rev의 비율 2는 13.8:3.48:5.31:2.54이었고;
Seq1: PMD2.G: pMDLg-pRRE: pRSV-Rev의 비율 3은 14:4.67:4.67:4.67이었고;
Seq1: PMD2.G: pMDLg-pRRE: pRSV-Rev의 비율 4는 2:1:1:1이었고;
Seq1: PMD2.G: pMDLg-pRRE: pRSV-Rev의 비율 5는 7:3:5:5이었고;
Seq1: PMD2.G: pMDLg-pRRE: pRSV-Rev의 비율 6은 9:3:4:6이었고; 그리고
비교예에서, Seq1:PsPAX2:PMD2.G의 비율은 14:10.5:3.5이었다.
1.2 렌티바이러스 벡터의 제조
(1) 세포의 회수: 냉동보존된 293T/17 세포를 회수하고 회수된 세포를 37℃에서 5% CO2로 배양하였다;
(2) 세포의 계대배양: 회수된 세포를 세포 성장 밀도가 플라스크 바닥의 85-95%에 도달할 때까지 T175 배양 플라스크에서 계대배양하였다;
(3) 세포 전처리: 세포를 5×106 세포/접시로 10cm-배양 접시에 첨가하고, 5% CO2로 37℃에서 배양하였다;
(4) 패키징 시스템의 제조: DMEM 2ml를 취하고, 표적 플라스미드 및 3개의 헬퍼 플라스미드를 특정 비율로 첨가하여 4-플라스미드 시스템을 형성하고, PEI 28μl를 첨가하고 혼합물을 완전히 혼합하고 실온에서 15분 동안 정치하였다;
(5) 플라스미드 형질감염: 세포 성장 밀도가 접시 바닥의 60-90%에 도달할 때까지 세포를 전처리하고 배양하고, 패키징 시스템의 제조된 용액을 형질감염을 위해 배양 접시로 옮겼다; 형질감염은 5% CO2로 37℃에서 수행하였다;
(6) 바이러스의 수집: 형질감염 16-18시간 후, 10% FBS를 함유하는 동일한 부피의 DMEM으로 배지를 교체하고 인큐베이션을 24시간 동안 계속한 후 바이러스 액체를 처음 수집한 다음 배지를 교체하고 10% FBS를 함유하는 동일한 부피의 DMEM을 첨가하고, 또 다른 24시간의 인큐베이션을 수행한 후 두 번째로 바이러스 액체를 수집하였으며, 여기서 인큐베이션은 5% CO2로 37℃에서 수행하였다;
(7) 바이러스 액체의 정화: 렌티바이러스 벡터 액체를 19℃에서 3000rpm에서 15분 동안 원심분리하고 침전물을 버리고 상등액을 얻었다;
(8) 바이러스의 농도: 상등액을 0.45μm 필터로 고속 원심분리관으로 여과하고 50,000g의 속도에서 4℃에서 90분간 원심분리하여 상등액을 버리고 침전물을 림프구 배양 배지에서 용해한 후 나중에 사용하기 위해 -80℃에서 저온 냉장고에 보관하고, 4-플라스미드 시스템에 의해 패키징된 렌티바이러스 벡터를 얻어 CNCT19 렌티바이러스 벡터로 명명했다.
1.3 물리적 역가 및 형질감염 역가의 결정
농축된 바이러스 용액을 210μl/튜브로 취하고, 물리적 역가는 ELISA를 사용하여 결정하고, 형질감염 역가는 유세포분석기를 사용하여 검출하였다. 물리적 역가는 렌티바이러스 입자의 수를 나타낸다. 형질감염 역가는 활성 렌티바이러스 입자의 수를 표시한다.
시험 결과를 표 1과 표 2, 및 도 1a와 도 1b에 나타내었다. 표 1, 도 1a 및 도 1b의 결과는 11.8: 3.53: 6.33: 2.3, 13.8: 3.48: 5.31: 2.54 및 14: 4.67: 4.67: 4.67의 4개 플라스미드(Seq1: PMD2.G: pMDLg-pRRE: pRSV-Rev)의 품질 비율에서 렌티바이러스 패키징 시스템의 구성은 거의 동일한 패키징 효율을 초래하였고 모두 비교예보다 더 높은 형질감염 역가를 유도하였다는 것을 보여준다. 표 2는 7: 3: 5: 5 및 9: 3: 4: 6의 4개 플라스미드(Seq1: PMD2.G: pMDLg-pRRE: pRSV-Rev)의 품질 비율이, 비율 4 및 비교예의 비율로 초래된 것보다 2배 초과로 도달하는 형질감염 역가로, 비율 4 및 비교예의 비율보다 유의하게 더 높은 형질감염 역가를 유도했음을 보여준다. 결과는 비율 1, 2 및 3으로부터 초래된 형질감염 역가가 비율 4, 5 및 6 및 비교예의 비율로부터 초래된 것보다 더 높았다는 것을 보여주며, 여기서 비율 1, 2 및 3으로부터 초래된 형질감염 역가는 비율 4 및 비교예의 비율로부터 초래된 것보다 2배 초과였다.
[표 1]: 비율 1, 2 및 3으로부터 초래된 형질감염 역가 및 물리적 역가
[표 2]: 비율 4, 5, 6 및 7 및 비교예의 비율로부터 초래된 형질감염 역가 및 물리적 역가
실시예 2. 렌티바이러스로 감염된 T 세포의 제조
감염 실험은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 따라 수행하였다. 감염의 단계는 다음과 같이 간략하게 기술된다:
1. T 세포의 분류
말초혈액단핵구(PBMC)를 대상체의 혈장교환 세포에서 단리한 다음 T 세포를 PBMC 세포로부터 분류하였다.
2. T 세포의 활성화
단리된 T 세포를 완전한 림프구 배양 배지(Xvivo15 배지 + 5% FBS + 100IU/ml IL-2 또는 Xvivo15 배지 + 5% FBS + 20ng/ml IL-21 + 10ng/ml IL-7)로 최종 농도 (1~2)×106 세포/ml로 재현탁하였고, CD3/CD28 자극 마그네틱 비드 5 내지 10μl를 첨가하였다. 혼합물을 잘 혼합하고 37℃ + 5% CO2의 배양 조건 하에서 적어도 24시간 동안 배양을 위해 인큐베이터에 두었다.
3. 렌티바이러스로 T 세포의 감염
활성화된 배양된 T 세포를 꺼내고 최종 농도 8μg/ml에서 폴리브렌을 첨가하여 잘 혼합하였다. 실시예 1에서 획득된 CNCT19 렌티바이러스 벡터를 MOI=2에서 천천히 첨가하였다. 잘 혼합한 후, 혼합물을 원심분리기 안에 넣고 1500rpm에서 1.5시간 동안 원심분리하였다. 그 후 그것을 37℃ + 5% CO2의 배양 조건 하에서 적어도 24시간 동안 배양을 위해 인큐베이터에 두었다.
4. 감염된 T 세포의 확장 배양
감염된 세포를 꺼내고 세포 밀도를 모니터링하여 후속 실시예에서 사용하기 위해 (0.5~1)×106 세포/ml로 유지하였다. 수득된 감염된 T 세포를 CNCT19 세포(즉, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포)로 명명하였다.
실시예 3. CNCT19 세포의 표면 상에 CAR 분자의 발현의 검출
실험의 단계는 다음과 같다:
(1) CNCT19 세포 현탁액을 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 버리고, 생존 세포 밀도가 (0.5~1)×107 세포/ml에 도달할 때까지 시쓰 유체를 첨가하여 재현탁시켰다.
(2) 각 샘플에 대해 2개의 유세포분석 튜브를 채취하여 튜브 1 및 튜브 2로 표지했다; 튜브 1은 블랭크 대조군이었고 여기에 항체를 첨가할 필요가 없었고, 튜브 2에는 Alexa Fluor® 647-염소 항-마우스 IgG F(ab')2 항체(제조사: Jackson, 카탈로그 번호: 115-605-072)의 10-배 희석물 10μL를 첨가하였다.
(3) 각 튜브에 세포 현탁액 100μl를 첨가하고, 실온에서 암실에서 15 내지 20분간 반응을 수행하였다.
(4) 각 튜브에 세정용 시쓰 유체 2ml를 첨가하고 300g에서 5분간 원심분리하였다.
(5) 상등액을 버리고 FITC-CD3(제조사: Tongsheng Shidai, 카탈로그 번호: Z6410047-100T) 20μl를 튜브 2에 첨가하고 암실에서 15 내지 20분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
(6) 각 튜브에 세정용 시쓰 유체 2ml를 첨가하고 300g에서 5분간 원심분리한 후 상등액은 버리고 각각의 세정용 튜브에 시쓰 유체 2ml를 첨가하고 300g에서 5분간 원심분리하였다.
(7) 상등액은 버리고 각 튜브에 시쓰 유체 300μl를 첨가하여 재현탁시킨 후, 유세포분석에 의해 검출하였다.
결과는 도 2a 및 도 2b에 제시되어 있다. 알 수 있는 바와 같이, 도 2a는 블랭크 대조 튜브를 나타내고; 그 오른쪽-상단 CD3+CAR+ 사분면은 무 세포 모집단을 나타낸다. 도 2b는 실험적 검출 튜브를 나타낸다. CART 세포는 IgG F(ab')2 및 CD3 항체로 표지되었고 68.6%의 CAR 발현율이 유세포분석에 의해 CD3+CAR+ 사분면에서 명확하게 검출될 수 있다. 결과는 본 개시내용에 따른 CAR 분자가 CNCT19 세포의 표면 상에서 잘 발현됨을 나타낸다.
실시예 4.
시험관내
표적 세포에 대한 CNCT19 세포의 사멸 효과의 검출
이 실시예의 실험 단계는 다음과 같다:
1) CD19-양성 인간 백혈병 세포주 Nalm-6(Shanghai Enzyme Research Bioscience Co., Ltd.에서 구매, 카탈로그 번호: CH179) 및 CD19-음성 인간 백혈병 세포주 KG-1a(Shanghai Enzyme Research Bioscience Co., Ltd.에서 구매, 카탈로그 번호: CC-Y1305)를 종양 세포(즉, 표적 세포)로 각각 선택하였다. CD19 CAR-T 세포(즉, 실시예 2에서 얻은 CNCT19 세포) 및 형질감염되지 않은 T 세포(NTD로 표시)를 이펙터 세포로 각각 선택하였다.
2) 전술한 표적 세포와 이펙터 세포를 각각 1:2 및 2:1의 이펙터/표적 비율로 혼합하고 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 각 웰에서 동시-배양된 세포의 총 수는 약 1×106/웰이 되도록 하였고, 각 조건에 대해 3개의 평행 웰을 설정하였다. 각 웰에 배양 용액을 1ml로 보충하고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 배양을 위해 인큐베이터에 넣고 시간을 기록하였다.
3) 24시간의 공동-배양 후, 각 웰에서 세포 현탁액을 수집하고, 1.5mL EP 튜브로 옮기고, 각각 표지하였다. 부가하여, 원심분리 후, 각 샘플 튜브로부터 상등액을 새로운 1.5mL EP 튜브 안으로 흡입하고 후속 사이토카인 검출을 위해 -20℃에서 동결보존했다(자세한 내용은 실시예 6 참조).
4) 종양 세포의 유형에 따라 표지를 위해 각 웰에서 혼합된 세포에 해당 검출량의 항체를 각각 첨가하고 항체 지시에 따라 조작을 수행하였다. PE-CD10 항체를 사용하여 Nalm-6 세포를 표지하고 Percp-cy5.5-CD45 항체를 사용하여 KG-1a 세포를 표지했다.
5) 유세포분석을 사용하여 각 샘플에서 상이한 표적 종양 세포의 비율에서 변화를 검출했다.
결과를 도 3에 나타내었다. 볼 수 있는 바와 같이, 형질감염되지 않은 T 세포(즉, NTD)와의 공동-배양과 비교하여, CD19-양성 종양 세포 Nalm-6과 CAR-T 세포(즉, CNCT19 세포)의 공동-배양은 Nalm-6의 현저하게 감소된 잔류율을 유도하고; 그럼에도 불구하고, CD19 음성 종양 세포 KG-1a를 다양한 이펙터 세포와 공동-배양한 후 KG-1a의 잔류율에는 유의한 차이가 없었다. 구체적으로, 이펙터/표적 비율이 1:2인 경우 Nalm-6 세포와 CNCT19 세포의 공동-배양은 (2.8±1.3)%의 표적 세포의 잔류율을 유도는데, 이는 Nalm-6 세포로 형질감염되지 않은 T 세포의 공동-인큐베이션에서 초래되는 것((12.1±1.2)%(P<0.01))보다 유의하게 낮았다. 마찬가지로, 이펙터/표적 비율이 2:1인 경우 Nalm-6 세포와 CNCT19 세포의 공동-인큐베이션은 (1.1±0.1)%의 표적 세포의 잔류율을 유도했으며, 이는 Nalm-6 세포로 형질감염되지 않은 T 세포의 공동-인큐베이션에서 초래되는 것((7.3±1.2)%(P<0.01))보다 유의하게 낮았다. 더욱이, CD19-양성 종양 세포에 대한 CNCT19 세포의 사멸 효과는 이펙터/표적 비율의 증가에 따라 증강되었다.
실시예 5. CNCT19 세포의 사멸 기능의 실시간 모니터링
실험 단계는 다음과 같다:
(1) 표적 세포 CHO-CD19를 꺼내고, 배양 플라스크 내의 배양 용액을 흡인하여 폐기하고, 배양 플라스크를 생리 식염수 용액으로 1회 세정하고, EDTA를 함유하는 트립신 용액 1ml를 첨가하고, 단리가 중단되기 전에 2 내지 6분 동안 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션을 수행하였다. CHO 세포는 카탈로그 번호 CC-Y2110으로 Shanghai Enzyme Research Bioscience Co., Ltd.에서 구입하였고; CD19 세포의 분자서열은 NCBI로부터 유래하였고, CD19의 분자서열은 분자생물학의 방법으로 CHO 세포에 구축하였고, 스크리닝을 통해 표적 세포 CHO-CD19 세포주를 얻었다는 것을 인지하여야 한다.
(2) 적절한 양의 배양 배지를 배양 플라스크에 첨가하여 표적 세포가 세포 현탁액을 형성하도록 하고, 세포를 피펫팅에 의해 균일하게 만들었다. 세포 현탁액의 농도를 카운팅 플레이트로 계수한 후, 세포 현탁액을 실험에서 요구하는 세포 농도 1×105 세포/ml로 제형화하였다.
(3) RTCA DP 시스템의 E-Plate 16의 웰에 50μl의 배양 배지를 첨가하였다. E-Plate 16은 RTCA 스테이션 상에 배치하였다. RTCA 시스템은 접촉이 양호한지("연결 OK"가 "메시지" 페이지에 표시됨) 여부를 확인하기 위해 자동으로 스캔할 것이다("스캔 플레이트"). 기준선(배경)의 검출을 시작하여 선택된 웰이 정상적인 접촉 상태에 있는지 확인하였다.
(4) E-Plate 16을 꺼내고 잘-혼합된 표적 세포 현탁액 100μl를 웰당 1×104 세포로 웰에 첨가하였다. E-Plate 16을 실온에서 슈퍼 클린 벤치에 30분간 둔 다음 인큐베이터에서의 RTCA 스테이션 상에 놓았다. 시스템이 자동으로 스캔된 후("스캔 플레이트"), 단계 2를 시작하여 실시간으로 세포 증식 곡선을 동적으로 검출하였다.
(5) E-Plate 16을 꺼내고 표적 세포 현탁액 및 CNCT19 세포 현탁액을 일부의 웰에 첨가하고, 표적 세포 현탁액 및 형질감염되지 않은 T 세포(즉, NTD) 현탁액(대조군으로서)을 다른 웰에 첨가하였으며, 여기서 이펙터/표적 비율(즉, 이펙터 세포 대 표적 세포의 비율, 즉, CNCT19 세포: 표적 세포; 및 NTD: 표적 세포)은 1:1이고, 표적 세포 현탁액의 부피 50μl였다. E-Plate 16 검출 플레이트는 표적 세포에 대한 CNCT19 세포의 효과를 관찰하기 위해 60시간 실시간 모니터링을 위해 RTCA DP 검출 플랫폼 상에 배치되었다.
그 결과는 도 4에 도시되어 있다. 도면에서 라인 1은 NTD 대조군의 곡선을 나타내고 라인 2는 CNCT19 처리군의 곡선을 나타낸다. 라인 1과 라인 2를 비교함으로써, 시간이 지남에 따라 CNCT19 세포에 의해 종양 세포(즉, 표적 세포)의 증식이 억제되었음을 알 수 있다. 구체적으로, 형질감염되지 않은 T 세포와 공동-인큐베이션 후, 표적 세포는 성장 경향에서 유의한 변화를 나타내지 않았다(라인 1). 대조적으로, CNCT19 세포와의 공동-인큐베이션 후, 표적 세포는 현저하게 감소된 성장 경향을 보였고 심지어 그 수에서 감소를 나타내기 시작했다(라인 2). 이는 CNCT19가 표적 세포에 대해 강력한 사멸 능력을 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 6. 표적 세포와 CNCT19 세포의 공동-배양 후 분비된 사이토카인의 검출
이 실시예의 실험 단계는 다음과 같다:
1) 실시예 4에서의 각 웰에서 혼합된 배양물로부터 상등액 샘플(즉, 단계 3에서 얻은 샘플)을 -20℃ 냉장고에서 꺼내고 실온에서 녹였다;
2) LEGENDplex™ 키트(제조사: Biolegned, 카탈로그 번호: 740013)를 사용하여 설명서에 따라 각 샘플을 처리했다; 그리고
3) 각 샘플에서 상이한 사이토카인의 수준은 유세포분석에 의해 검출하였다.
결과는 도 5a 및 도 5b에 도시되어 있다. 형질감염되지 않은 T 세포(즉, NTD)와 비교하여, Nalm-6 세포(CD19+)와 CAR-T 세포(즉, CNCT19 세포)의 공동-배양은 CAR-T 세포에 의한 사이토카인 IFN-γ 및 IL-6의 현저하게 증가된 분비를 초래했다. 구체적으로, 표적 세포와 2:1의 이펙터/표적 비율로 24시간 동안 공동-배양한 후, CNCT19 세포는 표적 세포에 의해 자극되어 (6186.37±861.13) pg/ml의 양으로 INF-γ를 분비하였으며, 이는 형질감염되지 않은 T 세포에 의해 분비된 INF-γ의 양(2096.85±228.16pg/ml, P<0.05)보다 유의하게 높았고; CNCT19 세포에 의해 분비된 IL-6의 양(32.22±1.46pg/ml)은 형질전환되지 않은 T 세포에 의해 분비된 양(12.23±4.37pg/ml, P<0.05)보다 유의하게 높았다.
실시예 7. CNCT19 세포의 용혈 및 자극의 검출
7.1.
시험관내
CNCT19 세포의 용혈의 시험
이 실시예의 실험 단계는 다음과 같다:
1) 총 7개의 유리 테스트 튜브를 사용하고 1에서 7까지 번호를 매겼고, 각 튜브에 2% 토끼 적혈구 현탁액(뉴질랜드 토끼에서 채취하고 중국 국립 식품 및 약품 관리 연구소에서, 11400500032425의 품질 인증 번호로 생산됨) 2.5mL를 첨가했다.
2) 1×107 세포/mL 농도(총 T 세포의 수 기준)에서 CNCT19 세포의 다른 용량(0.5 내지 0.1mL)은 다른 용량(2.0 내지 2.4mL)의 염화나트륨 주입을 이미 함유하는 튜브 1 내지 5에 첨가했다. 한편, 2.5mL의 염화나트륨 주입(음성 대조군) 및 2.5mL의 주입용 멸균수(양성 대조군)를 튜브 6 및 튜브 7에 각각 첨가하였다.
3) 각 테스트 튜브는 총 부피 5.0mL였다. 테스트 튜브를 3시간 동안 인큐베이션하기 위해 37℃±0.5℃ 인큐베이터에 넣었다. 테스트 튜브를 인큐베이터에 넣은 후 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간 및 3시간에서 적혈구가 용해되거나 응집되는지 관찰했다.
결과는 도 6a 및 도 6b에 도시되어 있다. 도 6a는 3시간 동안 진탕 전 각 테스트 튜브의 관찰 결과를 나타내고, 도 6b는 3시간 동안 진탕 후 각 테스트 튜브의 관찰 결과를 나타낸다. 음성 대조군 튜브(번호 6)에서는 상등액이 무색 투명하고 적혈구가 튜브의 바닥으로 가라앉고 이들은 진탕 후 고르게 분산됨을 알 수 있다; 용혈 및 응집이 없는 것으로 판단하였다. 양성 대조군 튜브(번호 7)에서 용액은 투명하고 붉은색을 띠며 분리된 층이 없었고, 튜브의 바닥에 적혈구 잔류물이 없었다; 완전한 용혈이 있는 것으로 판단하였다. 각각 다른 용량의 CNCT19 세포가 첨가된 각 테스트 튜브를 3시간 동안 관찰한 결과, 각 테스트 튜브에서 상등액은 무색 투명하였고 적혈구는 튜브의 바닥으로 가라앉고 있음을 알 수 있었고, 그것은 쉐이킹 후 고르게 분산되었다; 용혈 및 응집이 없는 것으로 판단하였다.
7.2. CNCT19 세포의 정맥 주입 시 혈관 자극의 시험
이 실시예의 실험 단계는 다음과 같다:
1) 검역을 통과하고 주사 부위에 이상이 없는 뉴질랜드 토끼 6마리(수컷 3마리, 암컷 3마리)를 선발하였다. 자가-제어 방법이 사용되었다: 냉동보존된 CAR-T 세포(즉, CNCT19 세포) 및 음성 대조군(염화나트륨 주입)을 각 동물의 오른쪽 및 왼쪽 귀에 각각 정맥내 주입했다.
2) 우이변 정맥을 통해 주입된 CAR-T 세포는 1×107 세포/mL의 농도이었고, 1×107 세포/kg(총 T 세포의 수 기준)의 용량을 가졌다. 좌이변 정맥을 통해 감염된 염화나트륨 주입을 음성 대조군으로 사용했다. 좌이변 및 우이변 정맥 둘 모두를 통해 정맥내로 투여되는 용량은 1mL/kg이었다.
3) 정맥 투여 후, 동물의 전신관찰, 주입 부위의 관찰 및 병리학적 검사를 실시하였다.
결과는 도 7a 및 도 7b에 도시되어 있다. 도 7a는 CAR-T 세포의 투여 후 주입 부위의 현미경사진(HE-염색, 10× 대물렌즈)을 나타내고, 도 7b는 염화나트륨 주입의 투여 후 주입 부위의 현미경사진(HE-염색, 10× 대물렌즈)를 나타낸다. 동결보존된 CAR-T 세포의 정맥내 주입 후 음성 대조군 측면과 비교하여 동물의 전신적 또는 국소적 증상 및 병리학적 이상이 발견되지 않았음을 알 수 있다.
실시예 8.
시험관내
CNCT19 세포의 발암성의 실험
이 실시예의 실험 단계는 다음과 같다:
1) 2명의 공여자로부터의 CAR-T 세포(즉, CNCT19 세포)를 연질 한천 배지에서 각각 인큐베이션하였다. 두 공여자는 각각 공여자 1(건강한 인간 공여자 T 세포, 로트 번호: TC20180613015)과 공여자 2(건강한 인간 공여자 T 세포, 로트 번호: TC20180613016)였다. 부가하여, 인간 배아 폐 섬유아세포주 MRC-5를 음성 대조군으로 설정하고, 인간 자궁경부암 세포주 Hela를 양성 대조군으로 설정하였다.
2) 실험에는 6-웰 배양 플레이트를 사용하였다. 각 웰에서 세포의 수는 약 1×103이었고, 각 그룹에 대해 3개의 등가(parallel) 웰을 설정하였다. 배양 플레이트를 배양을 위해 CO2 인큐베이터에 넣어 3주간 관찰하였다.
3) 1주일마다 배양 플레이트를 꺼내어 클론의 형성이 있는지 여부를 현미경으로 관찰하고 사진을 찍는다. 양성 대조군에서 명백한 클론의 형성까지 실험을 중단하였다.
결과는 도 8에 도시되어 있다. 배양 배지에서 양성 대조군 세포(Hela)가 클론을 형성하였고, 시간이 지남에 따라 클론의 크기가 유의하게 증가함을 알 수 있다. 관찰 23일차에, 다른 공여자로부터 CAR-T 세포와 음성 대조군 세포(MRC-5)는 클론 성장을 나타내지 않았고, 그것은 모두 죽어 시험관내 불멸화된 증식을 특징으로 하지 않았다.
실시예 9.
생체내
CNCT19 세포의 종양원성의 실험
이 실시예의 실험 단계는 다음과 같다:
1) BALB/c 누드 마우스에 두 공여자로부터의 동결보존된 CAR-T 세포(즉, CNCT19 세포) 및 상응하는 형질감염되지 않은 T 세포(즉, NTD)를 각각 피하로 접종했으며, 여기서 두 공여자는 공여자 2(건강한 인간 공여자 T 세포, 로트 번호: TC20180613016) 및 공여자 3(건강한 인간 공여자 T 세포, 로트 번호: TC20180808019)였다.
2) CAR-T 세포로 접종은 1×107 세포/마우스(총 T 세포의 수 기준)로 진행하였다. 음성 대조군은 마우스당 1×107 인간 배아 폐 섬유아세포주 MRC-5 세포로 접종하였고, 양성 대조군은 마우스당 1×106 인간 자궁경부암 세포주 Hela 세포로 접종하였다.
3) 체중에서 변화 여부, 결절 발생 여부, 결절이 종양성 결절로 유도되는지 여부를 검출하기 위해 16주 동안 연속 관찰을 수행하였다. 결과를 음성 및 양성 세포군의 결과와 비교하였다.
4) 관찰 후 총체적 해부학을 시행하였다. 각 장기의 무게를 측정하고 장기 계수를 계산했다. 접종 부위 및 의심되는 증상이 있는 조직 또는 장기에 대해 조직병리학적 검사를 실시하였다.
결과는 CAR-T 세포가 생체내 종양유발을 하지 않는다는 것을 나타낸다. 음성 대조군(MRC-5 세포로 접종됨)에서는 접종 후 9일차에 모든 동물의 액체 결절이 사라졌다. 양성 대조군(HeLa 세포로 접종됨)에서는 모든 동물의 피하 결절이 서서히 증가하였다. 병리학적 검사는 이들 결절이 100%의 종양-형성률로 종양 조직의 성장으로 인해 발생했다는 것을 나타냈다. 요약하면 이 실험은 유효했다. CAR-T 세포(두 공여자로부터 유래됨)와 형질전환되지 않은 T 세포를 접종한 그룹에서, 접종 후 5일차에 모든 액체 결절이 사라졌고, 114일차에 안락사를 수행하기 전 다시 형성된 결절은 없었다. 병리학적 검사는 접종 부위나 전이 부위에 종양이 형성되지 않았다는 것을 나타냈다.
실시예 10. Nalm-6 이종이식 종양을 갖는 NCG 마우스에 대한 CNCT19 세포의 단일 정맥내 주사의 독성의 시험
이 실시예의 실험 단계는 다음과 같다:
1) 6-8주령의 NCG 마우스를 사용하였으며, 그 절반은 수컷이었다. 투여 3일 전에 Nalm-6 세포 현탁액을 2.5×106 세포/mL의 농도 및 10mL/kg의 용량으로 꼬리 정맥 안으로 주사하였다.
2) 선별된 동물을 그 체중에 따라 4개 성별-균형된 그룹(즉, 그룹 2 내지 5)으로 무작위로 나누었다. 그룹 2 내지 5는 각각 비히클 대조군, T 세포 대조군, CAR-T 세포 저-용량 그룹 및 CAR-T 세포 고-용량 그룹으로, 각 그룹에는 40마리(수컷 20마리, 암컷 20마리)를 갖는다. 종양이 없는 대조군(즉, 그룹 1) 및 비히클 대조군(즉, 그룹 2) 둘 모두에는 비히클 대조군(즉, 4%(W/V) 인간 알부민을 함유하는 생리 식염수)을 제공했다. T 세포 대조군(즉, 그룹 3)에는 형질감염되지 않은 T 세포(즉, NTD)를 1×109 세포/kg(총 T 세포의 수 기준, 이하 동일)의 용량으로 제공했다. CAR-T 세포 저-용량 그룹(그룹 4)에는 1×108 세포/kg의 용량으로 접종하였고, CAR-T 세포 고-용량 그룹(그룹 5)에는 1×109 세포/kg의 용량으로 접종하였다.
3) 각 동물에 대한 투여량은 25mL/kg이었고, 투여는 단일 정맥 주사에 의해 수행하였고, 투여의 속도는 약 1mL/분이었다.
4) 투여 후 투여 당일에 4시간 동안 지속적으로 관찰하였다. 시험 동안, 일반 임상관찰은 매일 오전 1회, 오후 1회 실시하였다. 체중과 음식물 섭취의 상세한 임상 관찰 및 측정을 주 1회 수행하였다. 시험 동안 체온, 임상병리학적 지표(혈구 수 및 혈액 생화학적 지표) 및 면역학적 지표(T 림프구 하위집합, 사이토카인 및 C-반응성 단백질)가 검출되었다.
5) 그룹 1-5에서, 2일차에 10마리 동물/성별/그룹을 안락사시키고, 15일차에 5마리 동물/성별/그룹을 안락사시켰다. 이들의 장기 무게를 측정하고 총체적 해부학적 관찰을 수행하였다. 그룹 1과 5에서의 동물의 주요 장기에 대해 조직병리학적 검사를 실시하였다.
이 실험의 결과는 단일 투여에 대한 CAR-T 세포(즉, CNCT19 세포)의 최대 허용 용량이 1×109 세포/kg 초과임을 나타낸다. 시험 동안 CAR-T 세포 저-용량 그룹과 CAR-T 세포 고-용량 그룹의 동물은 한 마리도 죽었거나 죽지 않았다. 일반 또는 상세 임상 관찰에서 비정상적인 반응은 관찰되지 않았다. 체중, 음식물 섭취, 체온, C-반응성 단백질, 및 혈액 생화학적 지표에서 뚜렷한 비정상적인 변화는 관찰되지 않았다. 조직병리학적 검사에서는 T 세포 대조군과 비교하여 CAR-T 세포 저-용량 그룹과 CAR-T 세포 고-용량 그룹에서 뚜렷한 비정상이 발견되지 않았다.
실시예 11. CNCT19 세포로 동물의 처리
11.1. Nalm-6 이종이식 종양이 있는 NCG 마우스에 대한 CNCT19 세포의 치료 효과
이 실시예의 실험 단계는 다음과 같다:
1) 6-8주령의 암컷 NCG 마우스를 사용하였다. 투여 3일 전에 꼬리 정맥에 5×105 Nalm-6 세포를 주입하고, 여기서 Nalm-6 세포를 생리 식염수에 2.5×106 세포/ml의 농도로 용해시키고 각 마우스에 200μl의 세포 재현탁액을 주입하였다.
2) 각 실험군에는 상응하는 CAR-T 세포(즉, CNCT19 세포), 형질전환되지 않은 T 세포(즉, NTD) 또는 세포 보존 용액(즉, 4%(W/V) 인간 알부민을 함유하는 생리 식염수)을 주사하였다 총 5개 그룹은 다음과 같이 분할되었다: CAR-T 저-용량 그룹(CNCT19 세포를 총 T 세포의 수를 기준으로 5×106 세포/마우스로 주사, 이하 동일), CAR-T 중-용량 그룹(CNCT19 세포를 1×107 세포/마우스로 주사), CAR-T 고-용량 그룹(CNCT19 세포를 2×107 세포/마우스로 주사), T 세포 대조군(형질감염되지 않은 T 세포를 2×107 세포/마우스로 주사) 및 비히클 대조군(세포 보존 용액을 200μl/마우스로 주사). 마우스당 주사 부피는 200μl였다.
3) 체중을 측정하고 주 2회 일반 임상 관찰을 시행하였다. 마우스의 생존을 기록하고 생존 곡선을 플롯팅하였다.
결과는 도 9에 도시되어 있다. 알 수 있는 바와 같이, CNCT19 세포는 모든 용량에서 생존 시간을 연장하는데 상당한 영향을 미쳤고 이들 효과는 분명히 용량 의존적이다. 구체적으로, 생리식염수 대조군의 중앙 생존 기간은 24일, NTD 대조군은 23일, CNCT19 저-용량 그룹은 40일인 반면, CNCT19 중-용량 그룹과 CNCT19 고-용량 그룹에서 실험 동물 모두는 관찰 기간이 끝날 때까지 생존했다. 생리 식염수 그룹 및 NTD 대조군과 비교하여 CNCT19의 모든 용량 그룹은 백혈병이 있는 동물의 생존 기간을 16일보다 더 많이 연장할 수 있다.
11.2. 동물에서 CNCT19 세포의 분포
이 실시예의 실험 단계는 다음과 같다:
1) 6-8주령의 NCG 마우스를 사용하였으며, 그 절반은 수컷이었다. 실시예 11.1에서의 방법에 의해 Nalm-6 이종이식 종양 모델을 확립하였다.
2) 종양이 있는 동물과 종양이 없는 동물 둘 모두는 CAR-T 세포(즉, CNCT19 세포)의 단일 꼬리 정맥 주사를 5×106 세포/마우스(총 T 세포의 수를 기준으로 함)의 용량으로 받았다.
3) 투여 후 각각 24시간(즉, D2), 72시간(즉, D4), 168시간(즉, D8), 336시간(즉, D15), 504시간(즉, D22) 및 672시간(즉, D29)에 종양이 있는 그룹의 동물을 계획대로 안락사시켰다. 투여 후 각각 24시간(즉, D2), 168시간(즉, D8) 및 336시간(즉, D15)에 종양이 없는 그룹의 동물을 계획된 대로 안락사시켰다. 동물 전혈(EDTA 항응고), 뇌, 척수(경추 분절), 골격근, 생식선(난소, 고환 및 부고환), 방광, 위, 소장, 장간막 림프절, 골수, 간, 신장, 비장, 심장, 폐 및 기타 조직 또는 체액을 순서대로 수집하였다.
4) 혈액 및 다양한 조직 샘플에서 키메라 항원 수용체(즉, CAR)의 함량은 검증된 Q-PCR 방법을 사용하여 결정되었다.
결과는 종양이 있는 마우스와 종양이 없는 마우스에 5×106 세포/마우스의 단일 정맥 주사에 의한 투여된 후 CNCT19 세포가 주로 전혈과 폐, 간, 심장 및 비장과 같은 대혈 흐름을 갖는 조직에 분포됨을 나타낸다(도 10 참조). 그 중 심장과 전혈이 가장 큰 분포를 가졌고, 곡선하 면적(gDNA-시간에서 CAR을 인코딩하는 핵산 분자의 카피 수, AUC)은 약 150,000 시간*카피 수/μg이었다. 폐 및 척수가 뒤따랐으며, AUC는 약 40,000 내지 60,000 시간*카피 수/μg이었다. 비장, 간 및 기타 조직의 경우 AUC는 약 20,000 시간*카피 수/μg 미만이었다.
결과는 또한 종양이 있는 마우스 조직에서 CNCT19 세포의 함량이 종양이 없는 마우스 조직보다 약간 더 높음을 나타낸다(도 11 참조). 종양이 있는 마우스의 전혈, 심장 및 척수에서 CNCT19 세포의 농도는 투여 24시간 후 종양이 없는 마우스에서의 것에 비해 약 3배, 6배 및 5배 더 높았다.
이후 각 조직에서 약물 함량이 점진적으로 감소하여 투여 2주 후 기본적으로 방법론적 검출 한계 이하로 떨어졌다. 질환이 진행됨에 따라, CD19 항원 자극이 증가함으로 마우스에서 CNCT19 세포가 다시 반응성으로 증식하였으며(도 12 참조), 뇌, 폐, 간, 전혈 및 척수에서 CNCT19 세포의 농도가 1200 카피/μg DNA 초과로 증가했고, 심지어 3500 카피/μg DNA에 도달했다.
실시예 12. CNCT19 세포로 급성 림프모구성 백혈병의 치료
12.1. CNCT19 세포의 임상 사용
임상 적용 과정은 표 3에 나타나 있고, 일부 단계에서 구체적인 실험 단계는 아래에 기술되어 있다.
[표 3]. CNCT19 세포의 임상 적용의 과정
1. 림프절 절개 전처리
림프절 절개 전처리는 CNCT19 세포 현탁액이 계획대로 재주입되기 전 -5일차에 수행된다.
전처리 계획은 다음과 같다:
플루다라빈은 2-4 연속 일 동안 하루에 한 번 30mg/㎡으로 투여된다; 그리고
사이클로포스파미드는 2 연속 일 동안 하루에 한 번 500mg/㎡으로 투여된다.
전처리 화학요법에 대한 두 약물의 사용은 같은 날부터 시작해야 한다.
2. CNCT19 세포 현탁액의 재주입
(1) 세포가 성공적으로 준비된 후에 <-100℃의 조건 하에서 냉동보존하고, 동일한 온도 조건 하에서 병원으로 이송하여 사용하고 주입 전 실험 조작 가이드에 따라 회수한다.
(2) 세포를 재주입하는 방법은 다음과 같다. 실험 조작 가이드에 따라 세포를 회수하고, 회수 후 30분 이내에 세포 현탁액의 재주입이 완료되어야 한다. 세포 현탁액은 수혈 장치로 정맥을 통해 대상체 안으로 단일 주입으로 주입된다. 세포 현탁액의 백이 하나 초과인 경우 각 백의 재주입 사이의 시간 간격 없이 연속적으로 주입할 수 있다. 세포 재주입 동안 대상체를 면밀히 관찰할 필요가 있다. 심각한 이상반응이 발생한 경우에는 주입을 중단하고 구체적인 이상반응에 따라 상응하는 치료를 수행하여야 한다. 심각한 이상반응이 발생하지 않은 경우 방문 워크플로에 따라 후속 조치를 수행할 수 있다.
(3) 세포 재주입 후 24시간 동안 대상체를 면밀히 관찰할 필요가 있다. 심각한 이상반응이 발생한 경우에는 구체적인 이상반응에 따라 상응하는 치료를 수행하여야 한다. 심각한 이상반응이 발생하지 않은 경우 방문 워크플로에 따라 후속 조치를 수행할 수 있다.
(4) 세포 재주입 후, 대상체는 14일 동안 또는 연구원의 대상체의 상태에 대한 종합 평가에 따라 결정된 기간 동안 관찰을 위해 계속 입원해야할 필요가 있다.
3. CNCT19 세포 현탁액의 관리
CNCT19 세포 현탁액을 엄격하게 관리하고 사용하기 위해, 특별히 지정된 인원에 의한 CNCT19 세포 현탁액을 관리하는 엄격한 시스템을 구축했다. 연구용 세포 현탁액을 병원 부서로 이송하기 위해 특정 인원을 배정하고, 연구용 세포 현탁액을 접수하고 등록 시스템을 구축하는 임무를 특정 인원에게 배정한다.
주입 후, 세포 현탁액의 포장은 약물 관리 인원에 의해 회수되고 저장/파기된다.
4. 재발성 또는 불응성 급성 림프모구성 백혈병의 치료에서 CNCT19 세포 현탁액의 임상적 효능 및 안전성 결과
이 실험은 2016년 9월부터 2020년 10월까지 시작되었다. 탐색적 및 1상 임상 시험 동안 재발성 또는 불응성 급성 림프모구성 백혈병(ALL)을 갖는 63명 환자(성인 환자 23명과 소아 환자 40명)는 CNCT로 치료 받았다. 성인 ALL에 대해 투여된 조사 용량은 0.25×108 내지 0.5×108 CAR-양성 T 세포의 범위였다.
(a) 임상적 효능에 대한 데이터는 표 4 및 표 5에 나타나 있다. 표 4는 성인과 소아를 포함한 63명 환자의 회복을 나타낸다. 표 5는 23명 성인 환자의 회복을 나타낸다. 재발성 또는 불응성 급성 림프모구성 백혈병을 갖는 63명 환자 중 CNCT19 세포 현탁액의 주사 및 재주입 후 대다수(93.7%)의 환자가 완전 관해였고, 88.9%의 환자는 MRD 음성이었다는 것을 알 수 있었다. 결과는 CNCT19 세포 현탁액의 주사 및 재주입이 재발성 또는 불응성 급성 림프모구성 백혈병을 갖는 성인 환자 및 소아 환자를 효과적으로 치료할 수 있음을 보여준다.
[표 4]: 성인 및 소아에서 급성 림프모구성 백혈병 치료에 대한 CNCT19 세포 현탁액의 임상 효능
[표 5]: 성인에서 급성 림프모구성 백혈병 치료에 대한 CNCT19 세포 현탁액의 임상 효능
참고: 표 4 및 5에서
ORR은 전체 관해율을 나타내고;
MRD(최소 잔류 질환) 음성은 (가장 민감한 방법에 의해) 종양 세포가 검출되지 않았음을 의미하고;
CR은 완전 관해를 나타내고; 그리고
Cri는 불완전한 혈구 수 회복을 갖는 형태학적 완전 관해를 나타낸다.
b) 예비 안전성 결과의 데이터는 표 6 및 표 7에 나타나 있다. 표 6은 성인 및 소아 환자를 포함한 63명 환자에 대한 안전성 결과를 나타내고, 표 7은 23명 성인 환자에 대한 안전성 결과를 나타낸다. 63명 ALL 환자 중, 3등급 이상 CRS의 발병률과 뇌병증의 발병률은 각각 19%와 20.6%였다. 연령군 간의 비교는 성인군에서 중증 CRES의 발생률(39.1%)이 소아군에서의 것(7.5%)보다 높고, 성인군에서 중증 CRES의 발생률(17.4%)은 소아군에서의 것(22.6%)보다 약간 낮거나 그에 근접하는 것을 밝혔다. 이는 초기 시험에서 CNCT19가 체중에 따라 주어졌고 체중이 더 큰 성인 환자에게 더 높은 용량을 투여했다는 사실에 기인할 수 있다. 예를 들어, 초기 시험에서 46명 대상체에게 주어진 용량은 0.71×106 내지 4.08×106/kg 범위였으며, 이는 0.16×108-2.36×108 CAR-양성 T 세포에 해당한다. 초기 용량-탐색이 CNCT19 생성물의 특성에 대해 점차적으로 밝혀내면서, 후속 임상 연구에서 더 안전한 용량 범위가 선택되었다. 예를 들어, 0.2×108 내지 1.1×108 CAR-양성 T 세포의 범위인 용량(중앙값: 0.5×108)을 투여받은 17명 환자 중, 등급≥3 CRS 및 CRES의 발병률은 5.9%(1/17)로 떨어졌다.
CNCT19 세포 현탁액의 주입은 심각한 CRS 또는 CRES 부작용을 일으킬 가능성이 낮고 그의 전반적인 안전성이 제어가능하므로 CNCT19가 우수한 안전성 성능을 가지고 있음을 알 수 있다. CNCT19의 우수한 안전성 성능은 제품의 품질을 향상시키고 임상 위험을 감소시킨다.
[표 6]. 급성 림프모구성 백혈병을 갖는 성인 및 소아에 대한 CNCT19 세포 현탁액의 안전성 결과
[표 7]. 급성 림프모구성 백혈병을 갖는 성인에 대한 CNCT19 세포 현탁액의 안전성 결과
참고: 표 6 및 7에서,
CRS는 사이토카인 방출 증후군을 나타내고; 그리고
CRES는 CAR-T-세포-관련된 뇌병증 증후군을 나타낸다.
실시예 13. CNCT19 세포로 재발성 또는 불응성 비-호지킨 림프종의 치료
13.1. CNCT19 세포의 임상 사용
임상 적용 과정은 표 8에 나타나 있고, 일부 단계에서 구체적인 실험 단계는 아래에 기술되어 있다.
[표 8]. CNCT19 세포의 임상 적용의 과정
1. 림프절 절개 전처리
림프절 절개 전처리는 CNCT19 세포 현탁액이 계획대로 재주입되기 전 -5일차에 수행된다.
전처리 계획은 다음과 같다:
플루다라빈은 2-4 연속 일 동안 하루에 한 번 30mg/㎡으로 투여된다; 그리고
사이클로포스파미드는 2 연속 일 동안 하루에 한 번 500mg/㎡으로 투여된다.
전처리 화학요법에 대한 두 약물의 사용은 같은 날부터 시작해야 한다.
2. CNCT19 세포 현탁액의 재주입
(1) 세포가 성공적으로 준비된 후에 <-100℃의 조건 하에서 냉동보존하고, 동일한 온도 조건 하에서 병원으로 이송하여 사용하고 주입 전 실험 조작 가이드에 따라 회수한다.
(2) 세포를 재주입하는 방법은 다음과 같다. 실험 조작 가이드에 따라 세포를 회수하고, 회수 후 30분 이내에 세포 현탁액의 재주입이 완료되어야 한다. 세포 현탁액은 수혈 장치로 정맥을 통해 대상체 안으로 단일 주입으로 주입된다. 세포 현탁액의 백이 하나 초과인 경우 각 백의 재주입 사이의 시간 간격 없이 연속적으로 주입할 수 있다. 세포 재주입 동안 대상체를 면밀히 관찰할 필요가 있다. 심각한 이상반응이 발생한 경우에는 주입을 중단하고 구체적인 이상반응에 따라 상응하는 치료를 수행하여야 한다. 심각한 이상반응이 발생하지 않은 경우 방문 워크플로에 따라 후속 조치를 수행할 수 있다.
(3) 세포 재주입 후 24시간 동안 대상체를 면밀히 관찰할 필요가 있다. 심각한 이상반응이 발생한 경우에는 구체적인 이상반응에 따라 상응하는 치료를 수행하여야 한다. 심각한 이상반응이 발생하지 않은 경우 방문 워크플로에 따라 후속 조치를 수행할 수 있다.
(4) 세포 재주입 후, 대상체는 14일 동안 또는 연구원의 대상체 상태에 대한 종합 평가에 따라 결정된 기간 동안 관찰을 위해 계속 입원해야할 필요가 있다.
3. CNCT19 세포 현탁액의 관리
CNCT19 세포 현탁액을 엄격하게 관리하고 사용하기 위해, 특별히 지정된 인원에 의한 CNCT19 세포 현탁액을 관리하는 엄격한 시스템을 구축했다. 연구용 세포 현탁액을 병원 부서로 이송하기 위해 특정 인원을 배정하고, 연구용 세포 현탁액을 접수하고 등록 시스템을 구축하는 임무를 특정 인원에게 배정한다.
주입 후, 세포 현탁액의 포장은 약물 관리 인원에 의해 회수되고 저장/파기된다.
4. 재발성 또는 불응성 비-호지킨 림프종의 치료에서 CNCT19 세포 현탁액의 임상적 효능 및 안전성 결과
이 실험은 2016년 9월부터 2020년 10월까지 시작되었다. 탐색적 및 1상 임상 시험 동안 재발성 또는 불응성 비-호지킨 림프종(NHL)을 갖는 50명 환자를 CNCT19 세포 현탁액으로 치료했다. NHL에 대해 투여된 조사 용량(성인 전용)은 1×108 내지 2×108 CAR-양성 T 세포의 범위였다.
(a) 임상적 효능에 대한 데이터는 표 9에 나타나 있다. 표 9는 50명 환자의 회복을 나타낸다. 재발성 또는 불응성 비-호지킨 림프종이 있는 50명 환자 중, CNCT19 세포 현탁액의 주사 및 재주입 후, 환자의 약 80%가 완전 관해 또는 부분 관해에 있었다는 것을 알 수 있으며, 여기서 완전 관해율은 54%(27건)이었고, 부분관해율은 24%(12건)였다. 이는 CNCT19 세포 현탁액이 재발성 또는 불응성 비-호지킨 림프종을 갖는 환자를 효과적으로 치료할 수 있음을 보여준다.
[표 9]: 비-호지킨 림프종 치료에 대한 CNCT19 세포 현탁액의 임상 효능
참고: 표 9에서
ORR은 전체 관해율을 나타내고;
CR은 완전 관해를 나타내고; 그리고
PR은 부분 관해를 나타낸다.
b) 예비 안전성 결과의 데이터는 표 10에 나타나 있다. 표 10은 50명 환자에 대한 안전성 결과를 나타낸다. CNCT19 세포 현탁액의 주입은 심각한 CRS 또는 CRES 부작용을 야기할 확률이 낮고, 10% 미만의 등급≥3 부작용을 야기할 확률을 갖는다는 것을 알 수 있으며, 여기서 등급≥3 CRS를 야기할 확률은 0%이고 등급≥3 CRES를 야기할 확률은 6%이다. 따라서, CNCT19는 우수한 안전성 성능을 가지고 있다.
[표 10]. 비-호지킨 림프종에 대한 CNCT19 세포 현탁액의 안전성 결과
참고: 표 10에서,
CRS는 사이토카인 방출 증후군을 나타내고; 그리고
CRES는 CAR-T-세포-관련된 뇌병증 증후군을 나타낸다.
전술한 상세한 설명은 설명 및 예로서 제공되지만, 첨부된 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 개시내용에 열거된 실시형태에 대한 다양한 변경은 당업자에게 명백하고 첨부된 청구범위 및 그 균등물의 범주 내에서 유지된다.
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<110> JUVENTAS CELL THERAPY LTD.
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tn Amino Acid Sequence of The Chimeric Antigen Receptor
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys
20 25 30
Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala
35 40 45
Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln
100 105 110
Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro
145 150 155 160
Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly
195 200 205
Lys Phe Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
210 215 220
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
225 230 235 240
Phe Cys Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp
245 250 255
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Glu Phe Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
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Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
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Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<211> 1482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The Nucleic Acid Sequence Ecoding The Chimeric Antigen Receptor
<400> 2
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgggatccg atattgtgct gacccagagc cccaagttca tgagcaccag cgtgggcgat 120
agagtgagcg tgacctgcaa ggcaagccag aacgtgggaa caaacgtggc ctggtaccaa 180
cagaaacccg gccaaagccc taagcccctg atttacagcg ccacctacag aaatagcggc 240
gtgcccgaca gatttacagg aagcggcagc ggaaccgatt tcacactgac catcaccaac 300
gtgcagagca aagacctggc cgactacttc tgccagcagt acaacagata cccctacacc 360
agcggaggag gaacaaagct ggagatcaag agaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc 420
tccggtggtg gtggttctca agtgcaactg caacagagcg gagccgaact ggtgagaccc 480
ggaagcagcg tgaagatcag ctgcaaggct tccggctacg cctttagcag ctactggatg 540
aactgggtga agcagagacc tggacaggga ctggaatgga tcggccagat ttaccctgga 600
gacggcgaca caaactacaa cggcaagttc aagggccaag ctacactgac cgccgacaaa 660
agcagcagca ccgcctatat gcagctgagc ggactgacca gcgaagatag cgctgtgtac 720
ttctgcgcca gaaagaccat cagcagcgtg gtggacttct acttcgacta ctggggacaa 780
ggcaccaccc tgacagtgag cagcgaattc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 840
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 900
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 960
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 1020
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 1080
actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 1140
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1200
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1260
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1320
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1380
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1440
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 1482
Claims (36)
- 플라스미드 조합으로서, 상기 플라스미드 조합은 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev를 포함하고; 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 2-6: 1-1.5: 1-3: 1-1.5의 비율로 존재하는, 플라스미드 조합.
- 제1항에 있어서, 플라스미드 Seq1은 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 키메라 항원 수용체는 서열번호 1에 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 플라스미드 조합.
- 제1항에 있어서, 플라스미드 Seq1은 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 핵산 분자는 서열번호 2에 도시된 핵산 서열을 포함하는, 플라스미드 조합.
- 제1항에 있어서, 플라스미드 Seq1, PMD2.G, pMDLg-pRRE 및 pRSV-Rev는 11.8: 3.53: 6.33: 2.3, 13.8: 3.48: 5.31: 2.54 또는 14: 4.67: 4.67: 4.67의 비율로 존재하는, 플라스미드 조합.
- 렌티바이러스 벡터의 제조 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드 조합을 세포 안으로 도입하는 것을 포함하는, 방법.
- 제5항에 있어서, 세포는 293T인, 방법.
- 제5항 또는 제6항에 따른 방법에 따라 렌티바이러스 벡터를 제조하는 것을 포함하는, 변형된 면역 이펙터 세포의 제조 방법.
- 제7항에 있어서, 렌티바이러스 벡터를 면역 이펙터 세포 안으로 도입하는 것을 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 면역 이펙터 세포는 T 림프구 및 자연 살해 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 변형된 면역 이펙터 세포.
- 제10항에 있어서, 면역 이펙터 세포는 키메라 항원 수용체를 발현할 수 있는, 변형된 면역 이펙터 세포.
- 제10항 또는 제11항에 따른 변형된 면역 이펙터 세포를 포함하는 조성물.
- 의약의 제조에 제10항 또는 제11항에 따른 면역 이펙터 세포 및/또는 제12항에 따른 조성물의 용도로서, 상기 의약은 CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애의 치료에 유용한, 용도.
- 제13항에 있어서, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애는 비-고형 종양을 포함하는, 용도.
- 제14항에 있어서, 비-고형 종양은 백혈병 및/또는 림프종을 포함하는, 용도.
- 제13항에 있어서, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애는 급성 림프모구성 백혈병 및/또는 B-세포 림프종을 포함하는, 용도.
- 제16항에 있어서, 급성 림프모구성 백혈병은 성인의 급성 림프모구성 백혈병 및/또는 소아의 급성 림프모구성 백혈병을 포함하는, 용도.
- 제17항에 있어서, 의약은 0.25×108 내지 0.5×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 투여되는, 용도.
- 제16항에 있어서, B-세포 림프종은 비-호지킨 림프종을 포함하는, 용도.
- 제19항에 있어서, 의약은 1×108 내지 2×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 투여되는, 용도.
- 제10항 또는 제11항에 따른 면역 이펙터 세포 및/또는 제12항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
- 제21항에 있어서, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애는 비-고형 종양을 포함하는, 방법.
- 제22항에 있어서, 비-고형 종양은 백혈병 및/또는 림프종을 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애는 급성 림프모구성 백혈병 및/또는 B-세포 림프종을 포함하는, 방법.
- 제24항에 있어서, 급성 림프모구성 백혈병은 성인의 급성 림프모구성 백혈병 및/또는 소아의 급성 림프모구성 백혈병을 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 투여하는 단계는 0.25×108 내지 0.5×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 투여되는, 방법.
- 제24항에 있어서, B-세포 림프종은 비-호지킨 림프종을 포함하는, 방법.
- 제27항에 있어서, 투여하는 단계는 1×108 내지 2×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 투여되는, 방법.
- CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 제10항 또는 제11항에 따른 면역 이펙터 세포 및/또는 제12항에 따른 조성물.
- 제29항에 있어서, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애는 비-고형 종양을 포함하는, 조성물 및/또는 면역 이펙터 세포.
- 제30항에 있어서, 비-고형 종양은 백혈병 및/또는 림프종을 포함하는, 조성물 및/또는 면역 이펙터 세포.
- 제29항에 있어서, CD19 발현과 연관된 질환 또는 장애는 급성 림프모구성 백혈병 및/또는 B-세포 림프종을 포함하는, 조성물 및/또는 면역 이펙터 세포.
- 제32항에 있어서, 급성 림프모구성 백혈병은 성인의 급성 림프모구성 백혈병 및/또는 소인의 급성 림프모구성 백혈병을 포함하는, 조성물 및/또는 면역 이펙터 세포.
- 제33항에 있어서, 투여는 0.25×108 내지 0.5×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 수행되는, 조성물 및/또는 면역 이펙터 세포.
- 제32항에 있어서, B-세포 림프종은 비-호지킨 림프종을 포함하는, 조성물 및/또는 면역 이펙터 세포.
- 제35항에 있어서, 투여는 1×108 내지 2×108 CAR-양성 T 세포의 용량으로 수행되는, 조성물 및/또는 면역 이펙터 세포.
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