JP7237926B2

JP7237926B2 - 抗ｃｄ１９／ｃｄ２０免疫療法によりがんを処置するための組成物および方法

Info

Publication number: JP7237926B2
Application number: JP2020505240A
Authority: JP
Inventors: オレンタス，リマス・ジェイ; ドロプリク，ボロ; シュナイダー，ディナ
Original assignee: Lentigen Technology Inc
Current assignee: Lentigen Technology Inc
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2023-03-13
Anticipated expiration: 2038-07-31
Also published as: JP2023071842A; US11680103B2; US20180355052A1; EP3661964A1; US10442867B2; JP2020533958A; US20200109210A1; US20240034802A1; CN111183156A; WO2019028051A1; AU2018309735A1; CA3071624A1

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年７月３１日出願の米国仮特許出願第６２／５３９，４８３号に対する優先権の利益を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、その全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年７月３１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＳｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられ、６４キロバイトのサイズである。

本開示の分野
本出願は、がんの分野、特に、ＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメイン、およびこのようなＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびその使用方法に関する。

背景
がんは、ヒトの健康に対する最も致命的な脅威の１つである。米国だけで、がんは毎年ほぼ１３０万人の新たな患者が罹患し、心血管疾患に次いで２番目に多い死因であり、死亡数の約４分の１を占めている。固形腫瘍が、これらの死亡のほとんどの原因である。ある特定のがんの医学的処置においては顕著な進歩があったものの、全てのがんについての５年全生存率は過去２０年間で約１０％しか改善しなかった。がんまたは悪性腫瘍は、制御されずに迅速に転移および成長するため、処置は非常に困難である。

ＣＤ１９は、８５～９５ｋＤａの膜貫通細胞表面糖タンパク質受容体である。ＣＤ１９は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのタンパク質のメンバーであり、２つの細胞外Ｉｇ様ドメイン、膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメインを含有する（ＴｅｄｄｅｒＴＦ、Ｉｓａａｃｓ，ＣＭ、１９８９年、ＪＩｍｍｕｎｏｌ１４３巻：７１２～１７１頁）。ＣＤ１９は、Ｂ細胞受容体シグナル伝達を修飾し、抗原についてのＢ細胞受容体の誘発閾値を低下させ（Ｃａｒｔｅｒ，ＲＨおよびＦｅａｒｏｎ，ＤＴ、１９９２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：１０５～１０７頁）、ＣＤ８１およびＣＤ２１と協調して、この本質的なＢ細胞シグナル伝達複合体を調節する（Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ＬＥ、ＫａｎｓａｓＧＳ、ＬｅｖｙＳ、ＥｖａｎｓＲＬ、ＴｅｄｄｅｒＴＦ、１９９２年、ＪＩｍｍｕｎｏｌ、１４９巻：２８４１～５０頁）。Ｂ細胞発生中、ＣＤ１９は、抗原受容体とは独立にプロＢ、プレ－プレＢ細胞、プレＢ、初期Ｂ細胞段階においてシグナル伝達することができ、Ｓｒｃファミリータンパク質チロシンキナーゼと会合し、チロシンリン酸化され、細胞内カルシウム動員およびイノシトールリン脂質シグナル伝達の両方を誘導する（ＵｃｋｕｎＦＭ、ＢｕｒｋｈａｒｄｔＡＬ、ＪａｒｖｉｓＬ、ＪｕｎＸ、ＳｔｅａｌｙＢ、ＤｉｂｉｒｄｉｋＩ、ＭｙｅｒｓＤＥ、Ｔｕｅｌ－ＡｈｌｇｒｅｎＬ、ＢｏｌｅｎＪＢ、１９８３年、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６８巻：２１１７２～８４頁）。Ｂ細胞悪性腫瘍の処置に関連する重要な点は、ＣＤ１９が、ＩｇＨ遺伝子再配置の段階における初期Ｂ細胞前駆体、成熟Ｂ細胞に限定され、しかし造血幹細胞または成熟血漿細胞上では発現されないように厳しく調節された様式で正常Ｂ細胞上で発現されことである（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＫＣ、Ｂａｔｅｓ，ＭＰ、ＳｌａｕｇｈｅｎｈｏｕｔＢＬ、ＰｉｎｋｕｓＧＳ、ＳｃｈｌｏｓｓｍａｎＳＦ、ＮａｄｌｅｒＬＭ、１９８４年、Ｂｌｏｏｄ６３巻：１４２４～１４３３頁）。

ＣＤ２０（ＬＥＵ－１６、ＭＳ４Ａ１とも呼ばれる）は、プロＢ相から成熟Ｂ細胞相までＢ細胞の表面上に発現され、Ｂ細胞発達および分化において役割を果たす膜貫通４Ａファミリータンパク質である。ＣＤ２０抗原は、様々な血液腫瘍上でも発現され、様々なモノクローナル抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤ２０陽性悪性腫瘍の処置に何年にもわたり適用されている（Ｌｉｍ、ＳｅａｎＨ．ら「Ａｎｔｉ－ＣＤ２０ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＨｉｓｔｏｒｉｃａｌａｎｄＦｕｔｕｒｅＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．」Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ９５．１巻（２０１０年）：１３５～１４３頁．ＰＭＣ．Ｗｅｂ．２０１７年７月３１日で概略される）。抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ならびに慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の処置において広く使用されている（Ｒｉｔｕｘａｎ処方情報）。

Ｂ系統白血病およびリンパ腫のための伝統的な処置手法は、化学療法、放射線療法、および幹細胞移植に関連し得る（ワールドワイドウェブｍａｙｃｌｉｎｉｃ．ｏｒｇを参照）。これらの処置に関連する高い毒性、および再発、二次的悪性腫瘍またはＧＶＨＤなどの合併症リスクが、より良好な治療用代替物の探求を促す。成人および小児（プレＢ－ＡＬＬ）両方のＢ細胞悪性腫瘍においてＣＤ１９が発現することから、抗体およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞ベースの療法の両方のためにこの標的を利用することとなった（ＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒＪＮ、ＷｉｌｓｏｎＷＨ、ＪａｎｉｋＪＥ、ＤｕｄｌｅｙＭＥ、Ｓｔｅｔｌｅｒ－ＳｔｅｖｅｎｓｏｎＭ、ＦｅｌｄｍａｎＳＡ、ＭａｒｉｃＩ、ＲａｆｆｅｌｄＭ、ＮａｔｈａｎＤＡ、ＬａｎｉｅｒＢＪ、ＭｏｒｇａｎＲＡ、ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＳＡ、２０１０年、Ｂｌｏｏｄ１１６巻：４０９９～１０２頁；ＬｅｅＤＷ、ＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒＪＮ、Ｓｔｅｔｌｅｒ－ＳｔｅｖｅｎｓｏｎＭ、ＣｕｉＹＫ、ＤｅｌｂｒｏｏｋＣ、ＦｅｌｄｍａｎＳＡ、ＯｒｅｎｔａｓＲ、ＳａｂａｔｉｎｏＭ、ＳｈａｈＮＮ、ＳｔｅｉｎｂｅｒｇＳＭ、ＳｔｒｏｎｃｅｋＤ、ＴｓｃｈｅｒｎｉａＮ、ＹｕａｎＣ、ＺｈａｎｇＨ、ＺｈａｎｇＬ、ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＳＡ、ＷａｙｎｅＡＳ、ＭａｃｋａｌｌＣＬ、２０１５年、Ｌａｎｃｅｔ３８５巻：５１７～２８頁）。さらに、リンパ腫（ＤＬＢＣＬ、ＦＬ）および白血病（ＣＬＬ）におけるＣＤ２０抗原の存在のために、ＣＤ２０抗原は、効率的な腫瘍排除のためおよび腫瘍抗原エスケープの予防のための魅力的なさらなる標的である。

Ｂ系統白血病のためのケアの現在の標準は、高用量の化学療法または高線量の放射線による寛解導入処置からなる場合があり、その後地固めが続き、必要に応じて幹細胞移植およびさらなる化学療法の過程を特徴とし得る（ワールドワイドウェブｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照）。これらの処置に関連する高い毒性、および再発、二次的悪性腫瘍またはＧＶＨＤなどの合併症リスクが、より良好な治療用代替物の探求を促す。成人および小児（プレＢ－ＡＬＬ）両方のＢ細胞悪性腫瘍におけるＣＤ１９の発現から、抗体およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞ベースの療法の両方のためにこの標的を利用することとなった（ＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒＪＮ、ＷｉｌｓｏｎＷＨ、ＪａｎｉｋＪＥ、ＤｕｄｌｅｙＭＥ、Ｓｔｅｔｌｅｒ－ＳｔｅｖｅｎｓｏｎＭ、ＦｅｌｄｍａｎＳＡ、ＭａｒｉｃＩ、ＲａｆｆｅｌｄＭ、ＮａｔｈａｎＤＡ、ＬａｎｉｅｒＢＪ、ＭｏｒｇａｎＲＡ、ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＳＡ、２０１０年、Ｂｌｏｏｄ１１６巻：４０９９～１０２頁；ＬｅｅＤＷ、ＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒＪＮ、Ｓｔｅｔｌｅｒ－ＳｔｅｖｅｎｓｏｎＭ、ＣｕｉＹＫ、ＤｅｌｂｒｏｏｋＣ、ＦｅｌｄｍａｎＳＡ、ＯｒｅｎｔａｓＲ、ＳａｂａｔｉｎｏＭ、ＳｈａｈＮＮ、ＳｔｅｉｎｂｅｒｇＳＭ、ＳｔｒｏｎｃｅｋＤ、ＴｓｃｈｅｒｎｉａＮ、ＹｕａｎＣ、ＺｈａｎｇＨ、ＺｈａｎｇＬ、ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＳＡ、ＷａｙｎｅＡＳ、ＭａｃｋａｌｌＣＬ、２０１５年、Ｌａｎｃｅｔ３８５巻：５１７～２８頁）。

抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２０結合性モチーフをＴ細胞結合性モチーフに連結する二重特異性抗体を含む、Ｂ細胞白血病およびリンパ腫を処置するためのいくつかの新規の手法が開発されている（即ち、フィラデルフィア染色体陰性再発性または難治性Ｂ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置に適応となるブリナツモマブ、Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（登録商標））。今日までに、ＣＡＲ構築物において使用されているＣＤ１９またはＣＤ２０についての結合性部分の多くは、マウス抗体に由来するドメインを利用する。ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＫｉｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発されたものを含む、いくつかのこれらの製品は、現在、承認を検討されている。２０１７年４月に、Ｎｏｖａｒｔｉｓは、ＣＴＬ０１９（チサゲンレクロイセル）が、２以上の前療法に失敗した難治性または再発性（ｒ／ｒ）ＤＬＢＣＬ（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）を有する成人患者の処置のためのＦＤＡ画期的治療薬指定を受け、この指定をｒ／ｒＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置に追加したことを発表した。これらの適応症は、それぞれ、フェーズＩＩＪＵＬＩＥＴ研究（ＮＣＴ０２４４５２４８）およびＥＬＩＡＮＡ研究（ＮＣＴ０２４３５８４９）に基づいた。ＪＵＬＩＥＴ試験は、３カ月で４５％の奏効率（ＯＲＲ）を示し、３７％の完全奏効（ＣＲ）および８％の部分奏効（ＰＲ）を有した。ＥＬＩＡＮＡ研究において、製品を注入された患者の８２％が、ＣＲまたは回復不完全を伴うＣＲを達成し、６カ月での無再発生存率は６０％であった。ＫｉｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＣＡＲ－Ｔ製品（ＫＴＥ－Ｃ１９、アキシカブタゲンシロロイセル）は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質転換型濾胞性リンパ腫（ＴＦＬ）、および縦隔原発Ｂ細胞性リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）のための画期的治療薬指定を承認された。ｒ／ｒＡＬＬにおけるＫＴＥ－Ｃ１９のＫｉｔｅＺＵＭＡ－３フェーズＩＩ試験において、７３％のＣＲが報告された（２カ月以上で）。ＣＡＲ－Ｔ療法の抗体が利用されるかどうかにかかわらず、これらの療法により救済されない顕著な数の患者がまだ存在しており、治療的手法の改善についてかなりの余地がある。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、３つの本質的な単位を含むハイブリッド分子である：（１）細胞外抗原結合性モチーフ、（２）連結／膜貫通モチーフ、および（３）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達モチーフ（ＬｏｎｇＡＨ、ＨａｓｏＷＭ、ＯｒｅｎｔａｓＲＪ．Ｌｅｓｓｏｎｓｌｅａｒｎｅｄｆｒｏｍａｈｉｇｈｌｙ－ａｃｔｉｖｅＣＤ２－ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１３年；２巻（４号）：ｅ２３６２１頁）。ＣＡＲの抗原結合性モチーフは一般に、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の最小の結合性ドメインである単鎖断片可変（ＳｃＦｖ）を基にして作られる。代替の抗原結合性モチーフとして、例えば、受容体リガンド（即ち、ＩＬ－１３は、腫瘍が発現するＩＬ－１３受容体に結合するように操作されている）、インタクトな免疫受容体、ライブラリー由来ペプチド、および自然免疫系エフェクター分子（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）も操作されている。ＣＡＲ発現のための代替の細胞標的（例えば、ＮＫまたはガンマ－デルタＴ細胞）も開発中である（ＢｒｏｗｎＣＥらＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２０１２年；１８巻（８号）：２１９９～２０９頁；ＬｅｈｎｅｒＭらＰＬｏＳＯｎｅ．２０１２年；７巻（２号）：ｅ３１２１０頁）。ＣＡＲベクターを形質導入するための最も活性なＴ細胞集団を定義すること、最適な培養および増殖の技術を決定すること、ならびにＣＡＲタンパク質構造自体の分子的詳細を定義することに関して、いまだにかなりのかける労力を要している。

ＣＡＲの連結モチーフは、ＩｇＧの定常ドメインなどの比較的安定な構造ドメインとするか、または伸長された可撓性リンカーとなるように設計することができる。ＩｇＧの定常ドメインに由来するものなどの構造モチーフを使用して、ＳｃＦｖ結合性ドメインをＴ細胞原形質膜表面から離れて延在させることができる。これは、結合性ドメインが腫瘍細胞表面膜に特に近い一部の腫瘍標的にとって重要であり得る（例えば、ジシアロガングリオシドＧＤ２にとって；Ｏｒｅｎｔａｓら、未公開の観察）。今日まで、ＣＡＲにおいて使用されるシグナル伝達モチーフは常にＣＤ３－ζ鎖を含んでいるが、それは、このコアモチーフが、Ｔ細胞活性化のための重要なシグナルであるからである。最初に報告された第２世代ＣＡＲは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８膜貫通配列を特徴としていた。このモチーフは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）シグナル伝達モチーフを含有する第３世代ＣＡＲでも同様に使用された（ＺｈａｏＹらＪＩｍｍｕｎｏｌ．２００９年；１８３巻（９号）：５５６３～７４頁）。新たなテクノロジーの進歩に伴い、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体に連結されたビーズによるＴ細胞の活性化、ならびにＣＤ２８由来のカノニカルな「シグナル２」の存在がＣＡＲ自体によってコードされる必要はもはやなくなった。ビーズ活性化を使用して、第３世代ベクターは、ｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおいて第２世代ベクターよりも優れているわけではないことが見出され、また、白血病のマウスモデルにおいては第２世代ベクターを超える明らかな利益は得られなかった（ＨａｓｏＷ、ＬｅｅＤＷ、ＳｈａｈＮＮ、Ｓｔｅｔｌｅｒ－ＳｔｅｖｅｎｓｏｎＭ、ＹｕａｎＣＭ、ＰａｓｔａｎＩＨ、ＤｉｍｉｔｒｏｖＤＳ、ＭｏｒｇａｎＲＡ、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄＤＪ、ＢａｒｒｅｔｔＤＭ、ＷａｙｎｅＡＳ、ＭａｃｋａｌｌＣＬ、ＯｒｅｎｔａｓＲＪ．Ａｎｔｉ－ＣＤ２２－ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓｔａｒｇｅｔｉｎｇＢｃｅｌｌｐｒｅｃｕｒｓｏｒａｃｕｔｅｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｂｌｏｏｄ．２０１３年；１２１巻（７号）：１１６５～７４頁；ＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒＪＮらＢｌｏｏｄ．２０１２年；１１９巻（１２号）：２７０９～２０頁）。これは、第２世代ＣＤ２８／ＣＤ３－ζ（ＬｅｅＤＷらＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ．ＮｅｗＯｒｌｅａｎｓ、ＬＡ；１２月７～１０日、２０１３年）およびＣＤ１３７／ＣＤ３－ζシグナル伝達形式（ＰｏｒｔｅｒＤＬらＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．２０１１年；３６５巻（８号）：７２５～３３頁）のＣＤ１９特異的ＣＡＲの臨床的成功によって裏付けられている。ＣＤ１３７に加えて、ＯＸ４０などの他の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーも、ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞において重要な持続シグナルを提供することができる（ＹｖｏｎＥらＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００９年；１５巻（１８号）：５８５２～６０頁）。ＣＡＲＴ細胞集団が培養された培養条件、例えば、サイトカインＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５を含めることも等しく重要である（ＫａｉｓｅｒＡＤらＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０１５年；２２巻（２号）：７２～７８頁）。

がんに対するＣＡＲ療法のより広範で有効な適応における現在の課題は、説得力のある標的の不足に関する。細胞表面抗原への結合因子を創出することは、現在容易に達成可能であるが、正常組織を見逃しながら腫瘍に対して特異的な細胞表面抗原を発見することは、依然として厄介な課題である。ＣＡＲ発現Ｔ細胞により高い標的細胞特異性を与えるための１つの潜在的な方法は、コンビナトリアルＣＡＲアプローチを使用することである。１つのシステムでは、ＣＤ３－ζとＣＤ２８シグナル単位が、同じ細胞において発現される２つの異なるＣＡＲ構築物間で分割される；別のシステムでは、２つのＣＡＲが、同じＴ細胞において発現されるが、一方はより低い親和性を有し、したがって第２のＣＡＲの完全な活性のために代替的ＣＡＲが最初に結合されることを必要とする（ＬａｎｉｔｉｓＥらＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ．２０１３年；１巻（１号）：４３～５３頁；ＫｌｏｓｓＣＣらＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３年；３１巻（１号）：７１～５頁）。免疫療法剤としての単一のＳｃＦｖベースのＣＡＲの生成のための第２の課題は、腫瘍細胞の不均一性である。少なくとも１つのグループは、標的抗原陰性集団の成長を回避することを期待して、エフェクター細胞集団が複数の抗原（ＨＥＲ２、ＩＬ－１３Ｒａ、ＥｐｈＡ２）を同時に標的化する、神経膠芽腫のためのＣＡＲ戦略を開発している（ＨｅｇｄｅＭらＭｏｌＴｈｅｒ．２０１３年；２１巻（１１号）：２０８７～１０１頁）。

Ｔ細胞ベースの免疫療法は、合成生物学における新たな領域になっている；複数のプロモーターおよび遺伝子産物は、これらの高度に強力な細胞を腫瘍微小環境に導くことが想定され、ここで、Ｔ細胞は、負の調節シグナルを免れることができ、かつ有効な腫瘍死滅を媒介できる。誘導性カスパーゼ９構築物の化学物質ベースの二量体化薬、例えばＡＰ１９０３との薬物誘導性二量体化を介した望ましくないＴ細胞の排除は、Ｔ細胞集団を制御できる強力なスイッチが薬理学的に開始され得る１つの方法を実証している（ＤｉＳｔａｓｉＡらＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．２０１１年；３６５巻（１８号）：１６７３～８３頁）。デコイ受容体の発現によるトランスフォーミング成長因子－βの負の調節効果に対して免疫性であるエフェクターＴ細胞集団の創出は、エフェクターＴ細胞が最適な抗腫瘍活性のために操作され得る程度をさらに実証している（ＦｏｓｔｅｒＡＥらＪＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８年；３１巻（５号）：５００～５頁）。したがって、ＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体と類似した様式でＴ細胞活性化を誘発できるようであるが、今日までのこのテクノロジーの臨床適用に対する主要な障害は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の限定的なｉｎｖｉｖｏ増殖、注入後の細胞の迅速な消失、および期待外れの臨床活性である。これは一部には、使用されたＣＡＲ配列の一部のマウス起源のためであり得る。

ブリナツモマブ（二重特異性抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３抗体）の使用は、この療法を投与された重症患者についてすばらしい結果を示した。それにもかかわらず、長期寛解率は４０％未満であり、最高でもレスポンダーの５０％しか造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）まで救済することができない（Ｇｏｒｅら、２０１４年、ＮＣＴ０１４７１７８２およびＶｏｎＳｔａｃｋｅｌｂｅｒｇら、２０１４年、ＮＣＴ０１４７１７８２を参照、Ｂｅｎｊａｍｉｎ，ＪＥ、ＳｔｅｉｎＡＳ、２０１６年、ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ７巻：１４２～１５６頁に要約されている）。二重特異性抗体またはＣＡＲ－Ｔ療法のいずれかを投与された患者が長期応答を維持するためにＨＳＣＴを続いて受ける必要は、まだ活発に議論されている。ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ試験について高応答が報告されており、一部は９０％を超えるものさえあるが、試験が「治療意図」試験として改められた場合、数値は７０％近くであり得る（ＤａｖｉｓＫＬ、ＭａｃｋａｌｌＣＬ、２０１６年、ＢｌｏｏｄＡｄｖａｎｃｅｓ１巻：２６５～２６８頁）。報告されたＣＡＲ１９処置１２カ月後における最も良好な結果は、ペンシルバニア大学においてＴ細胞製品を投与してもらうことができた患者において５５％のＲＦＳおよび７９％のＯＳを示す（ＭａｕｄｅＳＬ、ＴｅａｃｈｅｙＤＴ、ＲｈｅｉｎｇｏｌｄＳＲ、ＳｈａｗＰＡ、ＡｐｌｅｎｃＲ、ＢａｒｒｅｔｔＤＭ、ＢａｒｋｅｒＣＳ、ＣａｌｌａｈａｎＣ、ＦｒｅｙＮＶ、ＦａｒｚａｎａＮ、ＬａｃｅｙＳＦ、ＺｈｅｎｇＡ、ＬｅｖｉｎｅＢ、ＭｅｌｅｎｈｏｒｓｔＪＪ、ＭｏｔｌｅｙＬ、ＰｒｔｅｒＤＬ、ＪｕｎｅＣＨ、ＧｒｕｐｐＳＡ、２０１６年、ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ３４巻、１５号補遺（２０１６年５月）３０１１～３０１１頁）。

したがって、上述の欠点なしに特異的かつ有効な抗腫瘍効果を示し得る手法を使用する、Ｂ－ＡＬＬならびに他のＣＤ１９および／またはＣＤ２０発現Ｂ細胞悪性腫瘍の処置のための新規の組成物および方法を発見する、当該分野における緊急かつ長年にわたる要求が存在する。

本発明は、ＣＡＲ組成物、ならびにがんならびに他の疾患および／または状態を処置するために使用され得る治療的方法を提供することによって、これらの要求に対処する。特に、本明細書に開示および記載される本発明は、ＣＤ１９および／またはＣＤ２０発現の調節不全と関連する疾患、障害または状態の処置に使用可能なＣＡＲを提供し、ここでＣＡＲは、形質導入Ｔ細胞において高い表面発現を示し、ＣＤ１９発現細胞の高度の細胞溶解を示し、形質導入Ｔ細胞がｉｎｖｉｖｏでの増殖および持続を実証するタンデムＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインを含む。

概要
アミノ酸配列においてＣＤ１９標的化部分がＣＤ２０標的化部分の前または後のいずれかに位置する新規のタンデムＣＤ１９およびＣＤ２０標的化抗体またはその抗原結合性ドメイン（本明細書で以下「ＣＤ１９／ＣＤ２０」）、およびこのようなＣＤ１９および／またはＣＤ２０抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体（タンデムＣＡＲ）、および受容体を発現する宿主細胞（例えばＴ細胞）、および受容体をコードする核酸分子が本明細書で提供される。ＣＡＲは、形質導入Ｔ細胞での高い表面発現、高度の細胞溶解ならびに形質導入Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏでの増殖および持続を示す。例えば対象におけるがんを処置するための、開示されるＣＡＲ、宿主細胞、および核酸分子を使用する方法も提供される。

一態様において、Ｎ末端からＣ末端へ、少なくとも１つのＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むタンデムＣＤ１９／ＣＤ２０キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、単離された核酸分子が提供され、タンデムＣＤ１９／ＣＤ２０ＣＡＲは、配列番号１および３からなる群から選択される核酸配列を含む。

一態様において、Ｎ末端からＣ末端へ、少なくとも１つのＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むタンデムＣＤ１９／ＣＤ２０キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、単離された核酸分子が提供され、配列番号１および３からなる群から選択される核酸配列によってコードされるタンデムＣＤ１９／ＣＤ２０ＣＡＲは、配列番号２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンデムＣＤ１９／ＣＤ２０ＣＡＲをコードする。

一実施形態では、コードされる細胞外ＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９／ＣＤ２０に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変断片を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

別の実施形態では、コードされる細胞外ＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９／ＣＤ２０に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

さらに別の実施形態では、コードされるＣＡＲ細胞外ＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９／ＣＤ２０に結合する少なくとも１つのリポカリンベースの抗原結合性抗原（アンチカリン）をさらに含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

一実施形態では、コードされる細胞外ＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインが、リンカードメインによって膜貫通ドメインに接続される、単離された核酸分子が提供される。

別の実施形態では、コードされるＣＤ１９／ＣＤ２０細胞外抗原結合性ドメインに、リーダーまたはシグナルペプチドをコードする配列が先行する、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

さらに別の実施形態では、配列番号１および３にそれぞれ含まれるＣＤ１９／ＣＤ２０ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によりコードされる少なくとも１つのＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインを含むＣＡＲをコードする、単離された核酸分子が提供され、ＣＡＲは、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＴＳＬＰＲ、ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲ、ＭＡＧＥＡ３ＴＣＲ、またはそれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない抗原を標的化する細胞外抗原結合性ドメインをさらにコードする。

ある特定の実施形態では、さらにコードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗ＣＤ２２ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗メソセリンＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＴＳＬＰＲＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ｃ－ＭｅｔＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ－２ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥＡ３ＴＣＲＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

一態様では、本明細書で提供されるＣＡＲはリンカーまたはスペーサードメインをさらに含む。

一実施形態では、細胞外ＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカーまたはスペーサードメインによって膜貫通ドメインに接続される、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

一実施形態では、コードされるリンカードメインが、ＣＤ８またはＣＤ２８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結される、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

別の実施形態では、コードされるＣＡＲが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

さらに別の実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

一実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに対してＣ末端側に配置される、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

別の実施形態では、コードされる少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

さらなる実施形態では、コードされる少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）の機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

一実施形態では、リーダー配列またはシグナルペプチドをさらに含み、リーダーまたはシグナルペプチドのヌクレオチド配列が配列番号１１のヌクレオチド配列を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

さらに別の実施形態では、コードされるリーダー配列が配列番号１２のアミノ酸配列を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。

一態様では、Ｎ末端からＣ末端へ、少なくとも１つのＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書で提供される。

一実施形態では、細胞外ＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変断片、または抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域、またはそれらの組合せを含む、ＣＡＲが提供される。

別の実施形態において、少なくとも１つの膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＮＦＲＳＦ１９、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、ＣＡＲが提供される。

一部の実施形態において、ＣＡＲが、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ＴＳＬＰＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＴＳＬＰＲ、ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲ、ＭＡＧＥＡ３ＴＣＲ、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む細胞外抗原結合性ドメインをさらにコードする、ＣＡＲが提供される。

一実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインが、抗ＣＤ２２ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗メソセリンＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＴＳＬＰＲＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ｃ－ＭｅｔＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ－２ＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥＡ３ＴＣＲＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む、ＣＡＲが提供される。

別の実施形態において、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが提供される。

さらに別の実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメインを含む、ＣＡＲが提供される。

一実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸配列は配列番号１（リーダー－ＣＤ１９ＶＬ－ＷｈｉｔｌｏｗリンカーＣＤ１９ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－５ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－３ＣＤ２０ＶＬＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚ（構築物ＣＡＲ１９２０）のヌクレオチド配列（図１０Ａ））の核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は配列番号２リーダー－ＣＤ１９ＶＬ－ＷｈｉｔｌｏｗリンカーＣＤ１９ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－５ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－３ＣＤ２０ＶＬＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚ（構築物ＣＡＲ１９２０）（（図１０Ａ））のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする。

別の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸配列は配列番号３（リーダー－ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）３－ＣＤ２０ＶＬ－（ＧＧＧＧＳ）５－ＣＤ１９ＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－ＣＤ１９ＶＨＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚ（構築物２０１９）のヌクレオチド配列（図１０Ｂ））の核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は配列番号４（リーダー－ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）_３－ＣＤ２０ＶＬ－（ＧＧＧＧＳ）_５－ＣＤ１９ＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－ＣＤ１９ＶＨＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚＣＡＲアミノ酸配列（図１０Ｂ））のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする。

一態様では、本明細書で開示されるＣＡＲは、診断、がん患者の無増悪生存期間などの処置転帰のモニタリングおよび／もしくは予測における使用のため、またはかかる処置の進行をモニタリングするために、検出可能なマーカーを発現または含有するように改変される。

一実施形態では、開示されたＣＡＲをコードする核酸分子は、ウイルスベクターなどのベクター中に含有され得る。ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、もしくはレトロウイルスベクター、またはそれらの組合せである。

ある特定の実施形態では、ベクターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、自殺プロモーターまたはそれらの任意の組合せであるプロモーターをさらに含む。

さらに別の実施形態では、ＣＡＲを発現するベクターは、自殺スイッチによって、ＣＡＲＴ細胞の発現を制御するため、またはＣＡＲ－Ｔ細胞を排除するために、１または複数の作動可能なエレメントを含むようにさらに改変され得る。自殺スイッチには、例えば、アポトーシス誘導性シグナル伝達カスケード、または細胞死を誘導する薬物が含まれ得る。好ましい実施形態では、ＣＡＲを発現するベクターは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）などの酵素を発現するようにさらに改変され得る。

別の態様では、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む宿主細胞もまた提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞、例えば、対象から得られた初代Ｔ細胞である。一実施形態では、宿主細胞はＣＤ８^＋Ｔ細胞である。

さらに別の態様では、抗腫瘍有効量のヒトＴ細胞集団を含む医薬組成物であって、Ｔ細胞が配列番号２および４のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、ＣＡＲが、ＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインを含む少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、Ｔ細胞ががんを有するヒトのＴ細胞である、医薬組成物が提供される。がんは、とりわけ血液学的がん、例えば、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）もしくは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、リンパ腫（例えば、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫）または多発性骨髄腫、あるいはそれらの組合せを含む。

一実施形態において、ＣＡＲの少なくとも１つの膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４、ＴＮＦＲＳＦ１９、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、医薬組成物が提供される。

別の実施形態では、ヒトのがんは、口腔および咽頭がん（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器系がん（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器系がん（喉頭、肺および気管支）、骨および関節のがん、軟組織がん、皮膚がん（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌）、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳腫瘍、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫）、ならびに乳房、生殖系（子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、腟、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）ならびに脳および他の神経系のがん、またはそれらの任意の組合せを含む成人癌を含む、医薬組成物が提供される。

さらに別の実施形態では、がんを有するヒトのヒトＴ細胞の集団の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物であって、がんが、１または複数の化学療法剤に対して非応答性の難治性がんである、医薬組成物が提供される。がんは、造血がん、骨髄異形成症候群、膵がん、頭頸部がん、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）、ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む成人Ｂ細胞悪性疾患、小児Ｂ細胞悪性疾患（Ｂ細胞系譜ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）を含む）、多発性骨髄腫、肺がん、乳房がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、黒色腫もしくは他の血液学的がんおよび固形腫瘍、またはそれらの任意の組合せを含む。

別の態様では、ＣＡＲ含有Ｔ細胞（以下「ＣＡＲＴ細胞」）を作製する方法が提供される。この方法は、ＣＤ１９／ＣＤ２０に特異的に結合する開示されるＣＡＲをコードするベクターまたは核酸分子をＴ細胞に形質導入し、それによって、ＣＡＲＴ細胞を作製することを含む。

さらに別の態様では、ＲＮＡ操作された細胞の集団を生成する方法であって、開示されるＣＡＲをコードする核酸分子のｉｎｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを対象の細胞中に導入し、ＣＡＲ細胞を生成することを含む方法が提供される。

一実施形態において、ＣＤ１９発現と関連する疾患、障害または状態は、造血がん、骨髄異形成症候群、膵がん、頭頸部がん、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）、ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む成人Ｂ細胞悪性疾患、小児Ｂ細胞悪性疾患（Ｂ細胞系譜ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）を含む）、多発性骨髄腫、肺がん、乳房がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、黒色腫もしくはその他の血液学的がんおよび固形腫瘍、またはそれらの任意の組合せを含むがんである。

別の実施形態において、ＣＤ１９／ＣＤ２０を発現する細胞により媒介されるＴ細胞阻害を遮断し、哺乳動物における腫瘍増殖を阻害するように腫瘍微小環境を変化させる方法であって、配列番号２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＡＲを含む有効量の組成物を哺乳動物に投与するステップを含む方法が提供される。一実施形態において、細胞は、ＣＤ１９および／またはＣＤ２０を発現する腫瘍細胞、腫瘍関連マクロファージ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

別の実施形態において、哺乳動物における抗腫瘍または抗がん免疫応答の免疫抑制を阻害、抑制または防止する方法であって、配列番号２および４からなる群から選択されるＣＡＲを含む有効量の組成物を哺乳動物に投与するステップを含む方法が提供される。一実施形態において、ＣＡＲは、第１の細胞とＴ細胞の間の相互作用を阻害し、第１の細胞は、ＣＤ１９および／またはＣＤ２０を発現する腫瘍細胞、腫瘍関連マクロファージ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

別の態様では、哺乳動物において抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、開示されるＣＡＲをコードするベクターまたは核酸分子が形質導入された治療有効量のＴ細胞を哺乳動物に投与するステップを含む、方法が提供される。

別の実施形態では、哺乳動物においてがんを処置または予防する方法であって、１つまたは複数の開示されるＣＡＲを、哺乳動物におけるがんを処置または予防するのに有効な量で哺乳動物に投与するステップを含む、方法が提供される。方法は、対象において、ＣＡＲの抗原結合性ドメインと、ＣＤ１９および／またはＣＤ２０および／または１つまたは複数の上述の抗原の細胞外ドメインとの免疫複合体を形成するのに十分な条件下で、ＣＤ１９および／またはＣＤ２０および／または１つまたは複数の上述の抗原に特異的に結合する開示されるＣＡＲを発現する治療有効量の宿主細胞を対象に投与するステップを含む。

さらに別の実施形態では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、抗腫瘍有効量のＴ細胞集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、ＣＡＲが、少なくとも１つの細胞外ＣＤ１９および／またはＣＤ２０抗原結合性ドメインまたはそれらの任意の組合せ、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサードメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、Ｔ細胞ががんを有する対象のＴ細胞である、方法が提供される。

さらに別の実施形態では、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、抗腫瘍有効量のＴ細胞集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、ＣＡＲが配列番号２および４のアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せ、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサードメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、Ｔ細胞ががんを有する対象のＴ細胞である、方法が提供される。上述の方法の一部の実施形態では、少なくとも１つの膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体の膜貫通アルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４、ＴＮＦＲＳＦ１６、ＴＮＦＲＳＦ１９、またはそれらの組合せを含む。

さらに別の実施形態では、がんと診断されたヒトにおいて、遺伝子操作されたＴ細胞の持続性の集団を生成するための方法が提供される。一実施形態では、方法は、ＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたＴ細胞をヒトに投与するステップであって、ＣＡＲが配列番号２および４のアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せ、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、遺伝子操作されたＴ細胞の持続性の集団、またはＴ細胞の子孫の集団が、投与の後少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、２年または３年にわたって、ヒトにおいて持続する、ステップを含む。

一実施形態では、ヒト中の子孫Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。

本明細書に記載される方法の態様および実施形態の全てにおいて、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する上述のがん、疾患、障害または状態のいずれかは、本明細書に開示されるＣＡＲのうち１または複数を使用して、処置または予防または寛解され得る。

さらに別の態様では、上記キメラ抗原受容体Ｔ細胞を作製するためのキット、または上記対象において、腫瘍抗原の上昇した発現と関連するがん、疾患、障害もしくは状態のいずれかを予防、処置もしくは寛解するためのキットであって、上に開示された核酸分子、ベクター、宿主細胞もしくは組成物のいずれか１つまたはそれらの任意の組合せを含むコンテナ、およびキットを使用するための指示書を含むキットが提供される。

ＣＡＲ、宿主細胞、核酸ならびに方法は、本明細書に詳細に記載される具体的な態様および実施形態を超えて有用であることが理解される。本開示の前述の特色および利点は、添付の図面を参照して進む以下の詳細な説明からより明らかになる。

ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的化するＣＡＲの構築を示す。図１Ａ：Ｌｅｕ－１６（ＣＤ２０）のモノクローナル抗体ＦＭＣ－６３（ＣＤ１９）の単鎖断片可変領域をインフレームで、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）シグナル伝達ドメインならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに連結することにより、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０シングル標的化ＣＡＲ構築物を生成した。構築物１９Ａおよび１９Ｂは、ＦＭＣ６３の重鎖と軽鎖とを接続するリンカー配列においてのみ異なる。ＣＤ２０およびＣＤ１９の単鎖断片可変領域を可撓性リンカーにより互いに連続的に連結し、その後ＣＤ８、４－１ＢＢおよびＣＤ３ゼータドメインに連結したことを除いては、タンデム標的化構築物２０１９および１９２０を、シングル標的化構築物と同様の様式で生成した。ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的化するＣＡＲの構築を示す。図１Ｂ：ＣＤ１９およびＣＤ２０腫瘍抗原を標的化するタンデムＣＡＲＴ細胞の略図。タンデムＣＡＲ１９２０（左）および２０１９（右）は、インフレームで、ＣＤ８由来ヒンジおよび膜貫通ドメイン、その後４－１ＢＢ共刺激ドメインならびにＣＤ３ゼータ活性化ドメインに連結されたタンデム細胞外標的化ドメインからなる。各ＣＡＲＴ構築物は、ＣＤ１９またはＣＤ２０腫瘍抗原のいずれか、または両方への結合を介して活性化することができる。図２Ａ：ヒト初代Ｔ細胞上のシングルおよびタンデムＣＡＲＴ構築物の表面発現。フローサイトメトリーによりＣＡＲＴ発現を決定した。材料および方法に記載されるように、ＩＬ－２の存在下でＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）ＣＤ３ＣＤ２８試薬にてＴ細胞を活性化し、ＬＶを形質導入した。培養１０日目に、３種の染色試薬：タンパク質Ｌ（縦列１）；ＣＤ１９Ｆｃ、その後抗Ｆｃ－ＡＦ６４７（縦列２）；またはＣＤ２０－ビオチン、その後ストレプトアビジン－ＰＥ染色（縦列３）のうちの１つを使用して、形質導入した生Ｔ細胞（７－ＡＡＤ陰性）のＣＡＲ表面発現についてアッセイを行った。形質導入において使用したＬＶは、各横列の左に列挙する。非形質導入Ｔ細胞対照に関連するＣＡＲＴ陽性集団のパーセンテージは、各ヒストグラムの右側の隅に示す。ＧＦＰ形質導入細胞は、さらなる陰性対照として機能した。３人の別々のドナーの代表的なデータを示す。図２Ｂ：各タンデムＣＡＲによるＣＤ１９抗原結合対ＣＤ２０抗原結合の比を、ＣＤ１９Ｆｃが結合する細胞パーセントに対するＣＤ２０ビオチンが結合する細胞パーセントの比として表す。３人のドナーを使用した３回の別々の実験の平均＋ＳＤを示す（＊＊ｐ＜０．０１）。ｉｎｖｉｔｒｏでのＣＡＲＴ細胞傷害性を示す。ルシフェラーゼが安定に形質導入された、Ｋ５６２、Ｋ５６２ＣＤ１９＋もしくはＫ５６２ＣＤ２０＋細胞株（図３Ａ）、または白血病もしくはリンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ、ＮＡＬＭ６、ＲＥＨ；図３Ｂ）を使用して、ルシフェラーゼベースの細胞傷害性アッセイを行った。ＣＡＲＴ細胞および標的腫瘍細胞を、列挙されるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比（ｘ軸）で一晩コインキュベートした。一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの事後検定を使用して群間の差を決定した。平均値＋ＳＤ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．０１対同じドナーからの非形質導入対照（Ｎ．Ｔ．）。ｉｎｖｉｔｒｏでのＣＡＲＴ細胞傷害性を示す。ルシフェラーゼが安定に形質導入された、Ｋ５６２、Ｋ５６２ＣＤ１９＋もしくはＫ５６２ＣＤ２０＋細胞株（図３Ａ）、または白血病もしくはリンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ、ＮＡＬＭ６、ＲＥＨ；図３Ｂ）を使用して、ルシフェラーゼベースの細胞傷害性アッセイを行った。ＣＡＲＴ細胞および標的腫瘍細胞を、列挙されるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比（ｘ軸）で一晩コインキュベートした。一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの事後検定を使用して群間の差を決定した。平均値＋ＳＤ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．０１対同じドナーからの非形質導入対照（Ｎ．Ｔ．）。白血病細胞株に応答したＣＡＲＴサイトカイン放出。フローベースのビーズアレイを使用して、ｘ軸に列挙されるＣＡＲ－Ｔによる、Ｒａｊｉ白血病株とのＥ：Ｔ比１０：１での一晩の共培養に際しての、サイトカイン産生を測定した。バーは、反復試料の平均値＋ＳＤを表す。データは、３人の別々のドナーからのＣＡＲＴ細胞で行った３回の独立実験の代表値である。ＣＡＲＴ構築物のｉｎｖｉｖｏ活性を示す。図５Ａは、マウス全身生体発光に基づく腫瘍増殖の経時変化を示す。ＣＡＲＴ処置群当たり１０匹のマウス、および対照群当たり５匹のマウスを研究した。ＣＡＲＴ構築物のｉｎｖｉｖｏ活性を示す。図５Ｂは、マウス当たりのシグナル平均値±ＳＤを示すプロットである。二元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定を使用した、処置なし群に対する、２５日目（処置なし対照群の対象が生存していた最後の時点）の統計解析を示す。平均値＋ＳＤ、＊＊＊Ｐ＜０．００１。Ｒａｊｉ腫瘍エスケープバリアントを強固に選択するシングルＣＡＲ１９構築物を示す。図６Ａ：腫瘍エスケープ実験のための実験設計の図。ＲａｊｉおよびＣＡＲＴ細胞をＥ：Ｔ比１：１で一晩または４日間共培養した。一晩のインキュベーション後および４日目に、培養物を採取し、フローサイトメトリーにより生Ｒａｊｉ細胞を、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２表面発現について調べた。Ｒａｊｉ腫瘍エスケープバリアントを強固に選択するシングルＣＡＲ１９構築物を示す。図６Ｂ：共培養物からの生Ｒａｊｉ細胞（７ＡＡＤ－およびＣＤ３－）を分析するために使用したフローサイトメトリー分析のためのゲーティング法を、代表的な処置群について示し、縦列１に示す。縦列２、３および４は、Ｒａｊｉ細胞がＴ細胞なし（横列１）、１９ＡＣＡＲ（横列２）または２０１９ＣＡＲ（横列３）と共培養された場合の、それぞれ、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２発現レベルを示す。Ｒａｊｉ腫瘍エスケープバリアントを強固に選択するシングルＣＡＲ１９構築物を示す。図６Ｃ：フローサイトメトリーにより決定される、ｘ軸上に列挙されるＣＡＲＴ細胞との一晩または４日間の共培養後の生ＲａｊｉおよびＮＡＬＭ－６細胞におけるＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２表面発現（それぞれ、黒色、白色、灰色）のグラフ。バーは、群平均値＋ＳＤを表す。統計解析は、同じドナーからのＮ．Ｔ．（非形質導入Ｔ細胞）対照に対して、一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定により行った（＊ｐ＜０．０５）。Ｔ．Ａ．－腫瘍単独対照群。Ｒａｊｉ表面上のＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２の下方調節は、ＣＡＲＴ細胞との直接接触を必要とする。トランズウェルインサートを伴うマルチウェルプレートを、この実験で使用した。各ウェルの下部において５ｘ１０^５の各ＲａｊｉおよびＣＡＲＴ細胞を組み合わせ、トランズウェル上部部分において２．５ｘ１０^５のＲａｊｉ細胞をＴ細胞の非存在下で培養した。一晩のインキュベーション後、上部トランズウェル区画からの細胞および下部区画からの細胞を採取し、フローサイトメトリーにより生Ｒａｊｉ細胞を、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２（それぞれ、黒色、薄灰色および濃灰色のバー）表面発現について調べた。下部区画に含まれる特異的ＣＡＲＴ（ｘ軸）に関連する各マーカーについての表面発現を示す。バーは、３人の異なるドナーに由来するＣＡＲＴ細胞を使用して行われた３回の独立実験の平均値＋ＳＤを示す。一元配置ＡＮＯＶＡ、ダネットの多重比較検定＊ｐ＜０．０５。ＣＡＲ１９構築物による、Ｃ１９全長タンパク質およびＣＤ１９スプライスバリアントの下方調節を示す。Ｒａｊｉ細胞をＣＡＲＴ細胞とともにＥ：Ｔ比１：１でコインキュベートした。一晩のインキュベーション後、磁気ビーズを使用してコインキュベートした細胞集団からＴ細胞を除去した。フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットにより精製Ｒａｊｉ集団上のＣＤ１９発現を研究した。図８Ａ：Ｒａｊｉ細胞試料を、抗ＣＤ１９抗体で染色し、フローサイトメトリーにより得た。各処置群を代表するＲａｊｉ細胞についての蛍光強度中央値を示す。バーは、３人の異なるドナーに由来するＣＡＲＴ細胞を使用して行われた３回の独立実験の平均値＋ＳＤを示す。一元配置ＡＮＯＶＡ、ダネットの多重比較検定＊ｐ＜０．０５。ＣＡＲ１９構築物による、Ｃ１９全長タンパク質およびＣＤ１９スプライスバリアントの下方調節を示す。Ｒａｊｉ細胞をＣＡＲＴ細胞とともにＥ：Ｔ比１：１でコインキュベートした。一晩のインキュベーション後、磁気ビーズを使用してコインキュベートした細胞集団からＴ細胞を除去した。フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットにより精製Ｒａｊｉ集団上のＣＤ１９発現を研究した。図８Ｂ：材料および方法に記載されるように、コインキュベート群の各々（ＣＡＲ－Ｔ識別は各ラインの上に列挙する）からの精製Ｒａｊｉ細胞の溶解物を、４％～１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分解し、ＣＤ１９分子のＣ末端を標的化する抗体またはβ－アクチン（ローディング対照）で調査した。ＣＡＲ１９構築物による、Ｃ１９全長タンパク質およびＣＤ１９スプライスバリアントの下方調節を示す。Ｒａｊｉ細胞をＣＡＲＴ細胞とともにＥ：Ｔ比１：１でコインキュベートした。一晩のインキュベーション後、磁気ビーズを使用してコインキュベートした細胞集団からＴ細胞を除去した。フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットにより精製Ｒａｊｉ集団上のＣＤ１９発現を研究した。図８Ｃ：ＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏソフトウェア（ＬＩ－ＣＯＲＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、全長ＣＤ１９タンパク質（ＦＬＣＤ１９）およびエクソン２スプライスＣＤ１９バリアント（Δ２ＣＤ１９）を代表する特異的免疫反応バンドの強度を定量した。ＣＤ１９バンドの相対的バンド強度をシグナルＣＤ１９／シグナルβアクチンとして計算した。高腫瘍負荷モデルにおけるＣＡＲＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ活性を示す。０日目に、ＮＳＧマウス（ｎ＝６）にＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞を静脈内注射し、図に示すように、１２日目に、ＣＡＲＴ細胞で処置した。図９Ａ：疾患負荷を、生体発光シグナル平均（放射輝度平均値［ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ］）±ＳＥＭとしてプロットする。２５日目までにマウスの半分未満しか生存しなかった群は、点線としてプロットする。半分を超えて生存した群は、実線としてプロットする。高腫瘍負荷モデルにおけるＣＡＲＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ活性を示す。０日目に、ＮＳＧマウス（ｎ＝６）にＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞を静脈内注射し、図に示すように、１２日目に、ＣＡＲＴ細胞で処置した。図９Ｂ：腫瘍生着後２５日目の、上記のプロットで示されるシングルおよびタンデムＣＡＲＴ構築物で処置したマウスにおける腫瘍負荷の生体発光画像を示す。赤色Ｘは、研究２５日目まで生存しなかったマウスを示す。ＣＡＲＴ構築物の核酸配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図１０Ａは、ＣＡＲリーダー－ＣＤ１９ＶＬ－ＷｈｉｔｌｏｗリンカーＣＤ１９ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－５ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－３ＣＤ２０ＶＬＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚ（ＣＤ１９２０ＣＡＲ構築物）核酸配列を発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。ＣＡＲＴ構築物の核酸配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。図１０Ｂは、リーダー－ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）３－ＣＤ２０ＶＬ－（ＧＧＧＧＳ）５－ＣＤ１９ＶＬ－ＷｈｉｔｌｏｗリンカーＣＤ１９ＶＨＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚ（ＣＤ２０１９ＣＡＲ構築物）核酸配列を含有するＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター、およびコードされるアミノ酸配列を示す。ＣＤ１９＿２０（図１１Ａ）およびＣＤ２０＿１９（図１１Ｂ）タンデムＣＡＲをコードするタンデムＣＡＲレンチウイルスベクター（ＬＶ）のプラスミドマップを示す。ＣＤ１９＿２０およびＣＤ２０＿１９タンデムＣＡＲは、ＣＤ８、４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに連結された、ヒトＥＦ－１アルファ内部プロモーター（ＥＦ１ａ）、リーダー配列（リーダー）、ＦＭＣ６３およびＬｅｕ１６抗体からのＶＨおよびＶＬ配列（それぞれ、ＣＤ１９ＶＬ、ＣＤ１９ＶＨ、ＣＤ２０ＶＬ、ＣＤ２０ＶＨ）、鎖間リンカー配列ならびにｓｃＦｖ内配列を特徴とするレンチウイルス骨格プラスミドを使用して発現された。ＣＤ１９＿２０（図１１Ａ）およびＣＤ２０＿１９（図１１Ｂ）タンデムＣＡＲをコードするタンデムＣＡＲレンチウイルスベクター（ＬＶ）のプラスミドマップを示す。ＣＤ１９＿２０およびＣＤ２０＿１９タンデムＣＡＲは、ＣＤ８、４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに連結された、ヒトＥＦ－１アルファ内部プロモーター（ＥＦ１ａ）、リーダー配列（リーダー）、ＦＭＣ６３およびＬｅｕ１６抗体からのＶＨおよびＶＬ配列（それぞれ、ＣＤ１９ＶＬ、ＣＤ１９ＶＨ、ＣＤ２０ＶＬ、ＣＤ２０ＶＨ）、鎖間リンカー配列ならびにｓｃＦｖ内配列を特徴とするレンチウイルス骨格プラスミドを使用して発現された。

詳細な説明
定義
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」とは、文脈が明らかに他を示さない限り、単数形および複数形の両方を指す。例えば、用語「１つの抗原」は、単数または複数の抗原を含み、語句「少なくとも１つの抗原」と等価とみなされ得る。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「１つの抗原を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の要素を排除することなく、「１つの抗原を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。語句「および／または」とは、「および」または「または」を意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられた任意のおよび全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびに全ての分子量または分子質量値は、特記しない限り、おおよそであり、便宜的に提供されていることをさらに理解すべきである。本明細書に記載されるものと類似または等価な多くの方法および材料が使用され得るが、特に適切な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図しない。種々の実施形態の再検討を容易にするために、以下の用語の説明が提供される。

用語「約」とは、測定可能な値、例えば、量、時間的持続期間などに言及する場合、特定された値から±２０％、または一部の例では±１０％、または一部の例では±５％、または一部の例では±１％、または一部の例では±０．１％の変動を包含することを意味し、かかる変動は、開示される方法を実施するために適切である。

特記しない限り、本明細書の技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓによって刊行されたＢｅｎｊａｍｉｎＬｅｗｉｎ、ＧｅｎｅｓＶＩＩ、１９９９年；ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅＬｔｄ．によって刊行されたＫｅｎｄｒｅｗら（編）ＴｈｅＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、１９９４年；およびＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．によって刊行されたＲｏｂｅｒｔＡ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＤｅｓｋＲｅｆｅｒｅｎｃｅ、１９９５年；および他の類似の参考文献中に見出すことができる。

本開示は、ＣＤ１９／ＣＤ２０抗体またはその断片、およびこのようなＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ＣＡＲの機能的活性の増強は、ＣＡＲを発現するＴ細胞の機能的活性の増強に直接関連する。これらの１つまたは複数の改変の結果として、ＣＡＲは、形質導入されたＣＡＲ発現Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏでのＴ細胞増殖および持続レベルの増大と共に、高度のサイトカイン誘導性細胞溶解および形質導入Ｔ細胞での細胞表面発現の両方を示す。本開示のＣＡＲは、１種類のＣＡＲＴレンチウイルス製品が多数の患者集団（即ち、ＣＤ１９＋、ＣＤ２０＋または二重ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋がん患者）を処置するために利用することができ、このことはリソースが限定されている状況においてフレキシビリティーを許容する点で有益である。

様々なタンパク質ドメインに由来する機能性部分を組み合わせる独自の能力が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の重要かつ革新的な特色である。これらのタンパク質ドメイン各々の選択は、これらの具体的な組合せ方と同様に、重要な設計特色である。各設計ドメインは、様々なＣＡＲプラットフォームでリンパ球の機能を操作するのに使用可能な必須の構成要素である。例えば、細胞外結合性ドメインの選択によって、それ以外の場合では無効のＣＡＲを有効にすることができる。

ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインを作り出すのに使用される、免疫グロブリン由来のタンパク質配列の非可変フレームワーク構成要素は、完全に中立であるか、自己会合してＴ細胞を代謝疲弊の状態にすることがあり、そのためこのＣＡＲを発現する治療的Ｔ細胞が極度に無効となる。このことは、このＣＡＲドメインの抗原結合機能とは無関係に起こる。さらに、細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）の選択によっても、免疫療法に使用される治療的リンパ球集団の活性および耐久性が決定され得る。これらの細胞外および細胞内ドメインによって、標的抗原と結合する能力および活性化シグナルをＴ細胞に伝達する能力がそれぞれ、ＣＡＲ設計の重要な側面である一方で、細胞外抗原結合性断片の供給源の選択が、ＣＡＲの有効性に対して顕著な効果を有し、それゆえにＣＡＲの機能および臨床的有用性において決定的な役割を有し得ることも明らかとなっている。

本明細書で開示されるＣＡＲは、細胞において高レベルで発現される。ＣＡＲを発現する細胞は、ｉｎｖｉｖｏで高い増殖速度を有し、多量のサイトカインを産生し、ＣＡＲが結合するＣＤ１９／ＣＤ２０抗原を表面に有する細胞に対し高い細胞傷害活性を有する。細胞外ＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインの使用により、ｉｎｖｉｖｏでより良好に機能するＣＡＲの生成がもたらされ、一方で宿主免疫応答での抗ＣＡＲ免疫の誘導およびＣＡＲＴ細胞集団の死滅が回避される。細胞外ＣＤ１９／ＣＤ２０ＳｃＦｖ抗原結合性ドメインを発現するＣＡＲは、ｉ）マウス由来の結合性配列で見られる、ＣＡＲＴの持続および機能不足の防止；ｉｉ）有効となるべきＣＡＲの局所（即ち、胸膜内）送達がないこと；ならびにｉｉｉ）ＣＤ１９／ＣＤ２０に対し高親和性および低親和性を有するバインダー両方に基づいてＣＡＲＴ細胞設計を生成する能力、を含む優れた活性／特性を示す。この最後の特性により、腫瘍には正常な組織よりもＣＤ１９／ＣＤ２０が多く発現していることで、親和性がより小さいバインダーは正常な組織よりも腫瘍に対しより大きい特異性を有することができ、それによりオンターゲットな腫瘍以外への毒性およびバイスタンダー細胞の死滅が防止され得るため、研究者は、ＣＡＲＴ産物の毒性に対する有効性、および／または組織特異性をよりよく調整することができる。

ＣＡＲ、抗体およびその抗原結合性断片、コンジュゲート、ヌクレオチド、発現、ベクターおよび宿主細胞、開示されたＣＡＲを使用する処置の方法、組成物およびキットのさらなる記載と共に、それらの細胞外ＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの記載を含む本発明のＣＡＲの詳細な記載は以下である。

Ａ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書で開示されるＣＡＲは、ＣＤ１９／ＣＤ２０に結合することが可能な少なくとも１つのＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、膜貫通ドメインを介してＴ細胞シグナル伝達ドメインに連結された、抗体の抗原結合性ドメイン（例えば、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ））を含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。ＣＡＲの特徴には、非ＭＨＣ拘束様式で、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用して、選択された標的に向かってＴ細胞の特異性および反応性を再指向させるそれらの能力が含まれる。非ＭＨＣ拘束的な抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングと無関係に抗原を認識する能力を与え、そうして、腫瘍エスケープの主要な機構を迂回する。さらに、Ｔ細胞中で発現される場合、ＣＡＲは、有利なことに、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖およびベータ鎖と二量体化しない。

本明細書に開示するように、ＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインには、例えば、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその両方が含まれ得る。Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとは、Ｔ細胞受容体の細胞内ドメイン、例えば、限定としてではなく、ＣＤ３ゼータタンパク質の細胞内部分などを含む、ＣＡＲの一部分を指す。共刺激シグナル伝達ドメインとは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である共刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＣＡＲの一部分を指す。

１．細胞外ドメイン
一実施形態では、ＣＡＲは、さもなければ抗原結合性ドメインまたは部分と呼ばれる標的特異的結合エレメントを含む。ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの型および数に依存する。例えば、抗原結合性ドメインは、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、ＣＡＲ中の抗原結合性ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌および寄生生物感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞と関連するものが含まれる。

一実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合性ドメインを操作することによって、目的の腫瘍抗原を標的化するように操作され得る。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を惹起する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。抗原結合性ドメインの選択は、処置される特定の型のがんに依存する。腫瘍抗原は、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ベータ－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体ならびにＣＤ１９／ＣＤ２０が含まれる。本明細書に開示される腫瘍抗原は、例として含まれるにすぎない。このリストは、排他的である意図はなく、さらなる例が、当業者に容易に明らかである。

一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する１または複数の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として機能し得るいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子には、組織特異的抗原、例えば、黒色腫におけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼおよびＧＰ１００、ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が含まれるがこれらに限定されない。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ－２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ－２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などのがん胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンが、個々の腫瘍に独自の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。Ｂ細胞分化抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、およびＣＤ３７は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原の一部（ＣＥＡ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）は、限定的な成功で、モノクローナル抗体による受動免疫療法の標的として使用されている。

好ましい一実施形態において、腫瘍抗原はＣＤ１９／ＣＤ２０であり、ＣＤ１９／ＣＤ２０発現と関連する腫瘍は、高レベルの細胞外タンパク質ＣＤ１９／ＣＤ２０を発現する肺中皮腫、卵巣および膵がん、またはそれらの任意の組合せを含む。

腫瘍抗原の型は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）でもあり得る。ＴＳＡは、腫瘍細胞に独自であり、身体中の他の細胞上には存在しない。ＴＡＡは、腫瘍細胞に独自ではなく、その代わり、抗原に対する免疫学的寛容の状態を誘導できない条件下で正常細胞上でも発現される。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答できるようにする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟であり応答できない胎児発生の間に正常細胞上で発現される抗原であり得、または正常細胞上では非常に低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上ではかなり高いレベルで発現される抗原であり得る。

ＴＳＡまたはＴＡＡの非限定的な例には、以下が含まれる：分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２および腫瘍特異的多系列抗原、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５；過剰発現された胚抗原、例えば、ＣＥＡ；過剰発現された癌遺伝子および変異した腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；染色体転座から生じる独自の腫瘍抗原；例えば、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７。他の大きいタンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３／ＣＡ２７．２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０／Ｍａｃ－２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳが含まれる。

一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＦＧＦＲ４、ＴＳＬＰＲ、ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲ、ＭＡＧＥＡ３ＴＣＲなどを含むがこれらに限定されない抗原を標的化する。

好ましい実施形態において、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、細胞外ＣＤ１９／ＣＤ２０抗原を標的化する。

本明細書で開示されるＣＤ１９／ＣＤ２０特異的ＣＡＲについての種々の実施形態では、一般的図式が図１Ａおよび１Ｂに示され、Ｎ末端からＣ末端へ、シグナルまたはリーダーペプチド、抗ＣＤ１９／ＣＤ２０ＳｃＦｖ、細胞外リンカー、ＣＤ８膜貫通部、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータを含む。

一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１（リーダー－ＣＤ１９ＶＬ－ＷｈｉｔｌｏｗリンカーＣＤ１９ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－５ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－３ＣＤ２０ＶＬＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚ（構築物ＣＡＲ１９２０））の核酸配列を含み、配列番号２（リーダー－ＣＤ１９ＶＬ－ＷｈｉｔｌｏｗリンカーＣＤ１９ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－５ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－３ＣＤ２０ＶＬＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚ（構築物ＣＡＲ１９２０）に示すアミノ酸配列（図１０Ａに示す）］を含むＣＡＲをコードする。

一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１の核酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、配列番号２に示すアミノ酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列（リーダー－ＣＤ１９ＶＬ－ＷｈｉｔｌｏｗリンカーＣＤ１９ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－５ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－３ＣＤ２０ＶＬＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚ（構築物ＣＡＲ１９２０））アミノ酸配列（図１０Ａに示す）］を含むＣＡＲをコードする。

別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号３（リーダー－ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）３－ＣＤ２０ＶＬ－（ＧＧＧＧＳ）５－ＣＤ１９ＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－ＣＤ１９ＶＨＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚ（構築物２０１９）（図２Ｂ）））の核酸配列を含み、配列番号４［リーダー－ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）３－ＣＤ２０ＶＬ－（ＧＧＧＧＳ）５－ＣＤ１９ＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－ＣＤ１９ＶＨＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚＣＡＲアミノ酸配列（図１０Ｂに示す）］に示すアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする。

別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号３の核酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、配列番号４に示すアミノ酸配列、またはそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列［リーダー－ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）３－ＣＤ２０ＶＬ－（ＧＧＧＧＳ）５－ＣＤ１９ＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－ＣＤ１９ＶＨＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚＣＡＲアミノ酸配列（図１０Ｂに示す）］を含むＣＡＲをコードする。

ＣＤ１９／ＣＤ２０抗原と反応する免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および単鎖断片可変（ＳｃＦｖ）配列を組み込んだ抗ＣＤ１９／ＣＤ２０ＣＡＲの表面発現について、以下の実施例１に示す。ＳｃＦｖを含む各ＣＡＲについての発現レベルは、３つの検出方法：ｉ）タンパク質Ｌ－ビオチン、その後ストレプトアビジンＰＥ；ｉｉ）ＣＤ１９Ｆｃ組換えタンパク質、その後抗ＦｃＡＦ６４７（ＡＰＣ）；ｉｉｉ）組換えＣＤ２０ビオチンコンジュゲート、その後ストレプトアビジンＰＥのうちの１つを使用する、健康なドナー由来のＬＶ形質導入Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析により決定した。ＳｃＦｖベースの抗ＣＤ１９／ＣＤ２０ＣＡＲ構築物ＬＴＧ１９２０およびＬＴＧ２０１９は、非形質導入Ｔ細胞対照（ゲーティングされなかった細胞集団）と比較して、ヒト初代Ｔ細胞（ゲーティングされた集団により示される）で高度に発現された。

実施例１ならびに図３Ａおよび３Ｂで示されるように、ＣＤ１９／ＣＤ２０ＣＡＲの高い細胞傷害活性が実証された。ヒト初代Ｔ細胞に、ＣＡＲ構築物（１９Ａ、１９Ｂ、２０Ａ、１９２０、２０１９、方法を参照）をコードするＬＶを形質導入し、次いでホタルルシフェラーゼが安定に形質導入されたＲａｊｉ、ＮＡＬＭ－６、ＲＥＨ、Ｋ５６２または２９３Ｔ細胞株とともに１８時間インキュベートし、発光に基づくｉｎｖｉｔｒｏ死滅アッセイを行った。試験された全ての白血病株は、それらの表面上にＣＤ１９を発現するが、陰性対照、Ｋ５６２および２９３Ｔは発現しない。ＣＤ２０発現は、腫瘍株間で変動した。Ｒａｊｉ株はＣＤ２０陽性であるが、ＲＥＨはＣＤ２０陰性であり、対照株Ｋ５６２および２９３Ｔも陰性である。ＮＡＬＭ－６株は、弱いが検出可能なＣＤ２０発現を有する。さらなる対照として、ＣＤ１９を発現するＫ５６２株（Ｋ５６２－１９＋）またはＣＤ２０を発現するＫ５６２株（Ｋ５６２－２０＋）を作り出した。

Ｋ５６２－１９＋は、ＣＡＲ１９Ａおよび１８Ｂ構築物、タンデムＣＡＲ構築物１９２０および２０１９により溶解されたが、シングル２０ＡＣＡＲによっては溶解されなかった（図３Ａ）。Ｋ５６２－ＣＤ２０＋は、シングルＣＡＲ１９構築物以外の全てのＣＡＲＴ構築物により溶解され、標的抗原限定的死滅を実証した。試験された他の白血病細胞株で同様の結果が見られた。ＣＤ１９を標的化するシングルおよびタンデムＣＡＲＴ構築物は、Ｒａｊｉ、ＮＡＬＭ－６およびＲＥＨを溶解したが、２９３Ｔ（図３Ｂ）またはＫ５６２（図３Ａ）は溶解しなかった。特に、２０Ａシングル標的化ＣＡＲ構築物は、ＣＤ２０陰性ＲＥＨ株に対して特異的死滅活性を有しなかったが、低いが検出可能なレベルのＣＤ２０表面発現を有するＮＡＬＭ－６の死滅を実証した。さらに、また、フローサイトメトリーによりＣＤ１９－Ｆｃへの結合よりも低いＣＤ２０ペプチドへの結合を示すように見えたタンデムＣＡＲ１９２０は、Ｋ５６２－１９＋およびＫ５６２－２０＋に対してより低い細胞傷害性を有するが、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－ＲＥＨに対してはより低い細胞傷害性を有しない。このことは、１９２０タンデムＣＡＲは、一部の腫瘍標的について２０１９タンデムＣＡＲよりも劣っていることを示唆し得る。

次いで、抗ＣＤ１９／ＣＤ２０ＣＡＲＴ細胞のサイトカイン分泌能力を評価した。腫瘍細胞をＣＡＲＴ細胞または対照Ｔ細胞とともに、エフェクター対標的比１０：１で一晩コインキュベートし、培養上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、ＩＬ－２およびＧＭ－ＣＳＦについて分析した（図４参照）。全てのＣＡＲＴ群は、腫瘍細胞に応答してサイトカインを誘導したが、陰性対照（非形質導入、Ｎ．Ｔ．）およびＧＦＰはサイトカイン誘導をほとんど生じなかった。５つのＣＡＲＴ群のうち、シングルＣＡＲＴ２０Ａは、最も高レベルのサイトカインを産生したが、１９Ａおよび１９ＢＣＡＲＴは、最も低レベルのサイトカイン誘導を有した。特に、タンデムＣＡＲＴ発現細胞ＬＴＧ１９２０および／またはＬＴＧ２０１９は、中レベルのＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、ＩＬ－２およびＧＭ－ＣＳＦを示し、これは、臨床的安全性の関係およびサイトカイン放出症候群の回避に有用であることを証明し得る。

任意の特定の作用機構に限定する意図はないが、本発明の例示的なＣＡＲと関連する増強された治療機能の可能な理由には、例えば、限定としてではなく、ａ）より効率的なシグナル伝達を可能にする、原形質膜内での改善された側方の動き、ｂ）脂質ラフトなどの原形質膜マイクロドメイン内の優れた位置、およびＴ細胞活性化と関連する膜貫通シグナル伝達カスケードと相互作用するより高い能力、ｃ）抑制的もしくは下方調節性の相互作用から離れる優先的な動きによる、原形質膜内の優れた位置、例えば、ＣＤ４５などのホスファターゼとあまり近接していないこと、もしくはそれとのより少ない相互作用、ならびにｄ）Ｔ細胞受容体シグナル伝達複合体（即ち、免疫シナプス）への優れたアセンブリ、またはそれらの任意の組合せが含まれると考えられる。

本開示は、例示的な細胞外ＣＤ１９／ＣＤ２０可変重鎖単独およびＳｃＦｖ抗原結合性ドメインを用いて例示しているが、本明細書に記載されるＣＡＲにおいて使用するためのＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインを得るのに、ＣＤ１９／ＣＤ２０可変重鎖単独およびＳｃＦｖ抗原結合性ドメイン内のその他のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸バリアントを使用してもよい。

標的化される所望の抗原に依存して、ＣＡＲは、所望の抗原標的に対して特異的な適切な抗原結合性ドメインを含むようにさらに操作され得る。例えば、ＣＤ１９／ＣＤ２０が標的化される所望の抗原である場合、ＣＤ１９／ＣＤ２０に対する抗体が、ＣＡＲ中への抗原結合ドメイン取込みとして使用され得る。

例示的な一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、ＣＤ３３をさらに標的化する。好ましくは、ＣＡＲ中の抗原結合性ドメインは、抗ＣＤ３３ＳｃＦｖであり、ここで、抗ＣＤ３３ＳｃＦｖの核酸配列は、配列番号４６に示される配列を含む。一実施形態では、抗ＣＤ３３ＳｃＦｖは、配列番号４６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＡＲの抗ＣＤ１９／ＣＤ２０ＳｃＦｖ部分は、配列番号４７に示されるアミノ酸配列を含む。

例示的な一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、メソセリンをさらに標的化する。好ましくは、ＣＡＲ中の抗原結合性ドメインは、抗メソセリンＳｃＦｖであり、ここで、抗メソセリンＳｃＦｖの核酸配列は、配列番号４８に示される配列を含む。一実施形態では、抗メソセリンＳｃＦｖは、配列番号４８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＡＲの抗メソセリンＳｃＦｖ部分は、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を含む。

本発明の一態様では、例えば、限定としてではなく、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－ＬＰ）、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルスおよびエコーウイルス）、風疹ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科［例えば、１型および２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ならびにヘルペスウイルス］、ポックスウイルス科（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルスおよびポックスウイルス）もしくはＣ型肝炎ウイルスに由来する抗原、またはそれらの任意の組合せを含む非ＴＳＡまたは非ＴＡＡに結合することが可能なＣＡＲが提供される。

本発明の別の態様では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの細菌株に由来する抗原に結合することが可能なＣＡＲが提供される。特に、感染性細菌、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｓｐｓ．の細菌株（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉまたはＭ．ｇｏｒｄｏｎｅａ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅもしくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉに由来する抗原、またはそれらの組合せに結合することが可能なＣＡＲが提供される。

２．膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインに融合された１つまたは複数の膜貫通ドメインを含む。

膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合型または膜貫通タンパク質に由来し得る。

本明細書に記載されるＣＡＲにおいて特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＮＦＲＳＦ１６またはＴＮＦＲＳＦ１９に由来し得る（即ち、それらの膜貫通領域（複数可）を少なくとも含み得る）。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であり得、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を優勢に含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組が、合成膜貫通ドメインの各末端において見出される。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２アミノ酸長と１０アミノ酸長との間が、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間での連結を形成し得る。グリシン－セリン二つ組は、特に適切なリンカーを提供する。

一実施形態では、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然に関連する膜貫通ドメインが、上記膜貫通ドメインに加えて使用される。

一部の場合には、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するために、かかるドメインの、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避するために、アミノ酸置換により選択され得る。

一実施形態では、本発明のＣＡＲ中の膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号３５の核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。

一実施形態において、コードされる膜貫通ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つもしくは３つの改変（例えば、置換）であるが２０、１０もしくは５以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または配列番号２８のアミノ酸配列に対し９５～９９％の同一性を有する配列を含む。

一部の場合には、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファヒンジドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号３７の核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列、またはそれに対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。

一実施形態では、コードされるリンカードメインが、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ＣＤ８ドメイン、膜貫通ＣＤ２８ドメイン、またはそれらの組合せに連結される、単離された核酸分子が提供される。

３．スペーサードメイン
ＣＡＲでは、スペーサードメインは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、または細胞内ドメインと膜貫通ドメインとの間に配置され得る。スペーサードメインは、膜貫通ドメインを細胞外ドメインと連結させるように、および／または膜貫通ドメインを細胞内ドメインと連結させるように機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大で３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸、最も好ましくは２５～５０アミノ酸を含む。

いくつかの実施形態では、リンカーは、存在する場合には、リンカーのサイズを増加させ、その結果、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合性断片との間の距離が増加される、スペーサーエレメントを含み得る。例示的なスペーサーは、当業者に公知であり、これには、米国特許第７，９６４，５６６号、米国特許第７，４９８，２９８号、米国特許第６，８８４，８６９号、米国特許第６，３２３，３１５号、米国特許第６，２３９，１０４号、米国特許第６，０３４，０６５号、米国特許第５，７８０，５８８号、米国特許第５，６６５，８６０号、米国特許第５，６６３，１４９号、米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，５９９，９０２号、米国特許第５，５５４，７２５号、米国特許第５，５３０，０９７号、米国特許第５，５２１，２８４号、米国特許第５，５０４，１９１号、米国特許第５，４１０，０２４号、米国特許第５，１３８，０３６号、米国特許第５，０７６，９７３号、米国特許第４，９８６，９８８号、米国特許第４，９７８，７４４号、米国特許第４，８７９，２７８号、米国特許第４，８１６，４４４号および米国特許第４，４８６，４１４号、ならびに米国特許出願公開第２０１１０２１２０８８号および米国特許出願公開第２０１１００７０２４８号中に列挙されるものが含まれ、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。

スペーサードメインは、好ましくは、抗原とのＣＡＲの結合を促進し、細胞中へのシグナル伝達を増強する配列を有する。結合を促進すると予測されるアミノ酸の例には、システイン、荷電アミノ酸、ならびに潜在的グリコシル化部位中のセリンおよびスレオニンが含まれ、これらのアミノ酸は、スペーサードメインを構成するアミノ酸として使用され得る。

スペーサードメインとして、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のヒンジ領域であるアミノ酸番号１３７～２０６（配列番号３９）、ＣＤ８ベータ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１３５～１９５、ＣＤ４（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号３１５～３９６、またはＣＤ２８（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１３７～１５２の全体または一部が使用され得る。また、スペーサードメインとして、抗体Ｈ鎖またはＬ鎖の定常領域の一部が使用され得る。さらに、スペーサードメインは、人工的に合成された配列であり得る。

さらにＣＡＲでは、シグナルペプチド配列を、Ｎ末端に連結することができる。シグナルペプチド配列は、多くの分泌タンパク質および膜タンパク質のＮ末端に存在し、１５～３０アミノ酸の長さを有する。細胞内ドメインとして上で言及されるタンパク質分子の多くは、シグナルペプチド配列を有するので、これらのシグナルペプチドがＣＡＲのためのシグナルペプチドとして使用され得る。一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。

４．細胞内ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたはさもなければ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが中に置かれた免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つの活性化を担う。用語「エフェクター機能」とは、細胞の特殊化した機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を実行するように細胞を指示する、タンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が使用され得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分が使用される限りにおいて、かかる短縮された部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、用語、細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含むことを意味する。

ＣＡＲでの使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例には、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始させるように協力して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体もしくはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列が含まれる。

ＴＣＲ単独を通じて生成されるシグナルが、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であること、および二次または共刺激シグナルもまた必要とされることは公知である。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言われ得る：ＴＣＲを介した抗原依存的な一次活性化を開始させるもの（一次細胞質シグナル伝達配列）および二次または共刺激シグナルを提供するように抗原依存的に作用するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）。

一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激性の方法または阻害性の方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激性の様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。

本明細書に開示されるＣＡＲにおいて特に使用される一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例には、ＴＣＲゼータ（ＣＤ３ゼータ）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。ＩＴＡＭの具体的な非限定的な例には、ＣＤ３ゼータ（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿９３２１７０．１）のアミノ酸番号５１～１６４、ＦｃイプシロンＲＩガンマ（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４０９７．１）のアミノ酸番号４５～８６、ＦｃイプシロンＲＩベータ（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００１３０．１）のアミノ酸番号２０１～２４４、ＣＤ３ガンマ（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００００６４．１）のアミノ酸番号１３９～１８２、ＣＤ３デルタ（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２３．１）のアミノ酸番号１２８～１７１、ＣＤ３イプシロン（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２４．１）のアミノ酸番号１５３～２０７、ＣＤ５（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、００２２（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７６２．２）のアミノ酸番号７０７～８４７、ＣＤ７９ａ（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７７４．１）のアミノ酸番号１６６～２２６、ＣＤ７９ｂ（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６１７．１）のアミノ酸番号１８２～２２９、およびＣＤ６６ｄ（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１８０６．２）のアミノ酸番号１７７～２５２の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するのと同じ機能を有するそれらのバリアントが含まれる。本明細書に記載されるＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸配列情報に基づくアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体（シグナルペプチド配列などを含む）の全長に基づいて番号付けされる。一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。

好ましい実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、それ自体で、またはＣＡＲの状況で有用な任意の他の所望の細胞質ドメイン（複数可）と組み合わせて、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含むように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。かかる共刺激分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。かかる共刺激分子の具体的な非限定的な例には、ＣＤ２（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５８．２）のアミノ酸番号２３６～３５１、ＣＤ４（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号４２１～４５８、ＣＤ５（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸番号２０７～２３５、ＣＤ８３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１９６～２１０、ＣＤ２８（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１８１～２２０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１５５２．２）のアミノ酸番号２１４～２５５、ＣＤ１３４（ＯＸ４０、ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００３３１８．１）のアミノ酸番号２４１～２７７およびＩＣＯＳ（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０３６２２４．１）のアミノ酸番号１６６～１９９の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するのと同じ機能を有するそれらのバリアントが含まれる。したがって、本明細書の開示は、４－１ＢＢを共刺激シグナル伝達エレメントとして主に例示するが、他の共刺激エレメントが本開示の範囲内である。

ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムにまたは特定された順序で、互いに連結され得る。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２アミノ酸長と１０アミノ酸長との間が、連結を形成し得る。グリシン－セリン二つ組は、特に適切なリンカーを提供する。

一実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。別の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。さらに別の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインならびにＣＤ２８および４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。

一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号４０に示される核酸配列を含み、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号４２に示される核酸配列を含む。

一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号４３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。

一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む。

５．ＣＡＲのさらなる記載
本明細書で開示されるＣＡＲの機能的部分もまた、本発明の範囲内に明示的に含まれる。用語「機能的部分」とは、ＣＡＲに関して使用する場合、本明細書に開示されるＣＡＲの１または複数の任意の一部または断片を指し、この一部または断片は、それがその一部であるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、親ＣＡＲと類似の程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力、または疾患を検出、処置もしくは予防する能力を保持する、ＣＲＡの一部を包含する。親ＣＡＲに関して、機能的部分は、例えば、親ＣＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％またはそれ超を構成し得る。

機能的部分は、その部分のアミノ末端もしくはカルボキシ末端において、または両方の末端において、さらなるアミノ酸を含み得、このさらなるアミノ酸は、親ＣＡＲのアミノ酸配列中には見出されない。望ましくは、さらなるアミノ酸は、例えば、標的細胞を認識し、がんを検出し、がんを処置または予防するなどの、機能的部分の生物学的機能を妨害しない。より望ましくは、さらなるアミノ酸は、親ＣＡＲの生物学的活性と比較して、その生物学的活性を増強する。

本明細書に開示されるＣＡＲの機能的バリアントが、本開示の範囲内に含まれる。用語「機能的バリアント」とは、本明細書で使用する場合、親ＣＡＲに対する実質的なまたは著しい配列同一性または類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチドまたはタンパク質を指し、この機能的バリアントは、それがそのバリアントであるＣＡＲの生物学的活性を保持する。機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲと類似の程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）のバリアントを包含する。親ＣＡＲに関して、機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲに対して、少なくとも約３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９８％またはそれ超、アミノ酸配列が同一であり得る。

機能的バリアントは、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。あるいは、またはさらに、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を妨害も阻害もしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を増強し得、その結果、機能的バリアントの生物学的活性は、親ＣＡＲと比較して増加される。

ＣＡＲのアミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、当該分野で公知であり、これには、ある特定の物理的および／または化学的特性を有する１つのアミノ酸が、同じまたは類似の化学的または物理的特性を有する別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換が含まれる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性／負に荷電した別の極性アミノ酸（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）を置換する酸性／負に荷電した極性アミノ酸、非極性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌなど）を置換する非極性側鎖を有するアミノ酸、塩基性／正に荷電した別の極性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇなど）を置換する塩基性／正に荷電した極性アミノ酸、極性側鎖を有する別の非荷電アミノ酸（例えば、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）を置換する極性側鎖を有する非荷電アミノ酸、ベータ分岐側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ｈｅ、ＴｈｒおよびＶａｌ）を置換するベータ分岐側鎖を有するアミノ酸、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ）を置換する芳香族側鎖を有するアミノ酸などであり得る。

ＣＡＲは、本明細書に記載される特定されたアミノ酸配列（単数または複数）から本質的になり得、その結果、他の構成要素、例えば、他のアミノ酸は、機能的バリアントの生物学的活性を著しくは変化させない。

ＣＡＲ（機能的部分および機能的バリアントを含む）は、任意の長さであり得る、即ち、任意の数のアミノ酸を含み、但し、ＣＡＲ（またはその機能的部分もしくは機能的バリアント）は、それらの生物学的活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力、哺乳動物において罹患細胞を検出する能力、または哺乳動物において疾患を処置もしくは予防する能力などを保持する。例えば、ＣＡＲは、約５０～約５０００アミノ酸長、例えば、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ超アミノ酸長であり得る。

ＣＡＲ（本発明の機能的部分および機能的バリアントを含む）は、１または複数の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。かかる合成アミノ酸は、当該分野で公知であり、これには、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－ヒドロキシプロリンおよびトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリン、β－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、ａ－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リシン、Ν’，Ν’－ジベンジル－リシン、６－ヒドロキシリシン、オルニチン、－アミノシクロペンタンカルボン酸、ａ－アミノシクロヘキサンカルボン酸、ａ－アミノシクロヘプタンカルボン酸、ａ－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、γ－ジアミノ酪酸、β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニンおよびａ－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが含まれる。

ＣＡＲ（機能的部分および機能的バリアントを含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、例えばジスルフィド架橋を介した環化、もしくは酸付加塩へ変換および／または任意選択で二量体化もしくは重合、あるいはコンジュゲートされ得る。

ＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）は、当該分野で公知の方法によって得られ得る。ＣＡＲは、ポリペプチドまたはタンパク質を作製する任意の適切な方法によって作製され得る。ポリペプチドおよびタンパク質をデノボ合成する適切な方法は、Ｃｈａｎら、ＦｍｏｃＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ、２０００年；ＰｅｐｔｉｄｅａｎｄＰｒｏｔｅｉｎＤｒｕｇＡｎａｌｙｓｉｓ、Ｒｅｉｄ，Ｒ．編、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、２０００年；ＥｐｉｔｏｐｅＭａｐｐｉｎｇ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄら編、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ、２００１年；および米国特許第５，４４９，７５２号などの参考文献に記載されている。また、ポリペプチドおよびタンパク質は、標準的な組換え法を使用し、本明細書に記載される核酸を用いて組換え産生可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、３ｒｄｅｄ．、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ２００１；およびＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９４を参照のこと。さらに、一部のＣＡＲ（機能性部分およびその機能性バリアントを含む）は、植物、細菌、昆虫、哺乳動物、例えばラット、ヒトなどの供給源から単離および／または精製することができる。単離および精製方法は当技術分野で周知である。あるいは、本明細書に記載されるＣＡＲ（機能性部分およびその機能性バリアントを含む）を、企業が商業的に合成することもできる。この点で、ＣＡＲは合成であっても、組換えであっても、単離されていても、かつ／または精製されていてもよい。

Ｂ．抗体および抗原結合性断片
一実施形態は、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、本明細書で開示された抗原のうち１または複数に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性ドメインもしくは部分をさらに提供する。本明細書で使用する場合、「ＣＡＲを発現するＴ細胞」または「ＣＡＲＴ細胞」とは、ＣＡＲを発現するＴ細胞を意味し、例えば、ＣＡＲの抗体由来の標的化ドメインによって決定される抗原特異性を有する。

本明細書で使用する場合、「抗原結合性ドメイン」は、抗体およびその抗原結合性断片を含み得る。用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書において使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、およびそれらの抗原結合性断片を含むがこれらに限定されない種々の抗体構造を包含する。抗体の非限定的な例には、例えば、当該分野で公知のインタクトな免疫グロブリン、ならびに抗原に対する結合親和性を保持するそのバリアントおよび断片が含まれる。

「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体である、即ち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性エピトープに対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を示すのであって、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。一部の例では、モノクローナル抗体は、単一クローンのＢリンパ球によって産生された抗体、または単一の抗体（またはその抗原結合性断片）の抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸がトランスフェクトされた細胞、もしくはその子孫によって産生された抗体である。一部の例では、モノクローナル抗体は、対象から単離される。モノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に対する影響を実質的に有さない保存的アミノ酸置換を有し得る。モノクローナル抗体の産生の例示的な方法は公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（２０１３年）を参照のこと。

典型的には、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含む。２つの型の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。

各重鎖および軽鎖は、定常領域（または定常ドメイン）および可変領域（または可変ドメインを含有する；例えば、ＫｉｎｄｔらＫｕｂｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．、９１頁（２００７年）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖の可変領域は、組み合わさって、抗原に特異的に結合する。さらなる実施形態では、重鎖可変領域のみが必要とされる。例えば、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科動物（camelid）抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安定である（例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６～４４８頁、１９９３年；Ｓｈｅｒｉｆｆら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、３巻：７３３～７３６頁、１９９６年を参照のこと）。「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、抗原結合性断片、例えば、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含む、抗体重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含む、抗体軽鎖の可変ドメインを指す。

軽鎖および重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有する（例えば、Ｋａｂａｔら、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１年を参照のこと）。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。構成成分である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、３次元空間にＣＤＲを位置付けアラインさせるように機能する。

ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合を担う。所与のＣＤＲのアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔら（「ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１年；「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、（ＪＭＢ２７３巻、９２７～９４８頁、１９９７年；「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、およびＬｅｆｒａｎｃら（「ＩＭＧＴｕｎｉｑｕｅｎｕｍｂｅｒｉｎｇｆｏｒｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎａｎｄＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｓａｎｄＩｇｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙＶ－ｌｉｋｅｄｏｍａｉｎｓ」、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７巻：５５～７７頁、２００３年；「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）に記載されるものを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る。各鎖のＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（Ｎ末端からＣ末端へ）と呼ばれ、典型的には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても同定される。したがって、ＶＨＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ３であるが、ＶＬＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる場合もある。重鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる場合もある。

「抗原結合性断片」は、同族抗原を特異的に認識する能力を保持する全長抗体の部分、ならびにかかる部分の種々の組合せである。抗原結合性断片の非限定的な例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ＳｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多特異的抗体が含まれる。抗体断片には、抗体全体の改変によって産生された抗原結合性断片、または組換えＤＮＡ方法論を使用してｄｅｎｏｖｏで合成された抗原結合性断片が含まれる（例えば、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編）、ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１～２巻、第２版、ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｒｅｓｓ、２０１０年を参照のこと）。

単鎖抗体（ＳｃＦｖ）は、適切なポリペプチドリンカーによって連結された１または複数の抗体（複数可）のＶＨおよびＶＬドメインを遺伝学的に融合された単鎖分子として含有する遺伝子操作された分子である（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３～４２６頁、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５巻：５８７９～５８８３頁、１９８８年；Ａｈｍａｄら、Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年、ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／９８０２５０；Ｍａｒｂｒｙ、ＩＤｒｕｇｓ、１３巻：５４３～５４９頁、２０１０年を参照のこと）。ＳｃＦｖ中のＶＨドメインおよびＶＬドメインの分子内配向は、典型的には、ＳｃＦｖにとって決定的ではない。したがって、両方の可能な配置（ＶＨドメイン－リンカードメイン－ＶＬドメイン；ＶＬドメイン－リンカードメイン－ＶＨドメイン）を有するＳｃＦｖが使用され得る。

ｄｓＦｖでは、重鎖および軽鎖の可変鎖は、鎖の会合を安定化させるために、ジスルフィド結合を導入するように変異されている。ＶＨおよびＶＬドメインが、単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、そのドメインを別の鎖の相補的ドメインとペアリングさせ、２つの抗原結合部位を創出する、二価の二重特異的抗体であるディアボディもまた含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０巻：６４４４～６４４８頁、１９９３年；Ｐｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻：１１２１～１１２３頁、１９９４年を参照のこと）。

抗体は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異的抗体）などの、遺伝子操作された形態もまた含む。ＰｉｅｒｃｅＣａｔａｌｏｇａｎｄＨａｎｄｂｏｏｋ、１９９４～１９９５年（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９７年もまた参照のこと。

天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築され得、組換え産生され得、または、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６巻：１２７５～１２８１頁（１９８９年）に記載されるように、可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。例えば、キメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植、単鎖および二機能性抗体を作製するこれらおよび他の方法は、当業者に周知である（ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１４巻：２４３～２４６頁（１９９３年）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ３４１巻：５４４～５４６頁（１９８９年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記、１９８８年；Ｈｉｌｙａｒｄら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ１９９２年）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ、ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ１９９５年）；その各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいてその抗原への参照抗体の結合を５０％またはそれ超遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいてその抗原への抗体の結合を５０％またはそれ超遮断する。抗体競合アッセイは公知であり、例示的な競合アッセイが本明細書で提供される。

「ヒト化」抗体または抗原結合性断片は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（例えば、マウス、ラットまたは合成）抗体または抗原結合性断片由来の１または複数のＣＤＲを含む。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体または抗原結合性断片は、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト抗体または抗原結合性断片は、「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、全てのＣＤＲが、ヒト化免疫グロブリン中のドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、例えば、少なくとも約８５～９０％、例えば、約９５％またはそれ超同一であり得る。したがって、ヒト化抗体または抗原結合性断片の全ての部分は、おそらくはＣＤＲを除いて、天然ヒト抗体配列の対応する部分と実質的に同一である。

「キメラ抗体」は、典型的には異なる種のものである２つの異なる抗体に由来する配列を含む抗体である。一部の例では、キメラ抗体は、１つのヒト抗体由来の１または複数のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域ならびに別のヒト抗体由来のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域を含む。

「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」は、ヒトゲノム由来の（またはヒトゲノムに由来する）配列を含むが、別の種由来の配列を含まない抗体である。一部の実施形態では、ヒト抗体は、ヒトゲノム由来の（またはヒトゲノムに由来する）ＣＤＲ、フレームワーク領域および（存在する場合には）Ｆｃ領域を含む。ヒト抗体は、例えば、ファージディスプレイによって、ヒトゲノムに由来する配列に基づいて配列を創出するためのテクノロジーを使用して、またはトランスジェニック動物を使用して、同定および単離され得る（例えば、ＢａｒｂａｓらＰｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕｅｌ．第１版ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、２００４年Ｐｒｉｎｔ．；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３巻：１１１７～１１２５頁、２００５年；Ｌｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０巻：４５０～４５９頁、２００８年を参照のこと）。

抗体は、１または複数の結合部位を有し得る。１よりも多い結合部位が存在する場合、これらの結合部位は、互いに同一であってもよく、異なってもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、２つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂ断片は、１つの結合部位を有するが、二重特異的または二機能性抗体は、２つの異なる結合部位を有する。

ＣＡＲの任意の機能的部分に結合する能力について抗体を試験する方法は、当該分野で公知であり、これには、任意の抗体－抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降および競合阻害アッセイなどが含まれる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、以下、米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号Ａｌ、および米国特許第７，３３８，９２９号を参照のこと）。

また、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、検出可能な標識、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および元素粒子（例えば、金粒子）などを含むように改変され得る。

Ｃ．コンジュゲート
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、または本明細書に開示された抗原のうち１もしくは複数に対して特異的なモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片は、当業者に公知のいくつもの手段を使用して、エフェクター分子または検出可能なマーカーなどの薬剤にコンジュゲートされ得る。共有結合および非共有結合の両方の手段が使用され得る。コンジュゲートには、本明細書に開示された抗原のうち１または複数に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片へのエフェクター分子または検出可能なマーカーの共有結合的連結が存在する分子を含むがこれらに限定されない。当業者は、化学療法剤、抗血管新生剤、毒素、放射活性剤、例えば、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^３Ｈおよび^３５Ｓ、ならびに他の標識、標的部分およびリガンドなどを含む（がこれらに限定されない）種々のエフェクター分子および検出可能なマーカーが使用され得ることを理解する。

特定のエフェクター分子または検出可能なマーカーの選択は、特定の標的分子または細胞、および所望の生物学的効果に依存する。したがって、例えば、エフェクター分子は、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の死をもたらすために使用される細胞毒であり得る。

エフェクター分子または検出可能なマーカーを抗体または抗原結合性断片に結合させるための手順は、エフェクターの化学構造に従って変動する。ポリペプチドは、典型的には、種々の官能基；例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（－ＮＨ_２）またはスルフヒドリル（－ＳＨ）基を含有し、これらは、エフェクター分子または検出可能なマーカーの結合を生じるための、抗体上の適切な官能基との反応のために利用可能である。あるいは、抗体または抗原結合性断片は、さらなる反応性官能基を曝露または結合するために誘導体化される。誘導体化は、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから入手可能なものなどの、いくつかの公知のリンカー分子のいずれかの結合を含み得る。リンカーは、抗体または抗原結合性断片をエフェクター分子または検出可能なマーカーに結合させるために使用される任意の分子であり得る。リンカーは、抗体または抗原結合性断片およびエフェクター分子または検出可能なマーカーの両方への共有結合を形成することが可能である。適切なリンカーは、当業者に周知であり、これには、直鎖もしくは分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカーまたはペプチドリンカーが含まれるがこれらに限定されない。抗体または抗原結合性断片およびエフェクター分子または検出可能なマーカーがポリペプチドである場合、リンカーは、それらの側基を介して（例えば、システインへのジスルフィド連結を介して）構成成分アミノ酸に、または末端アミノ酸のアルファ炭素のアミノおよびカルボキシル基に結合され得る。

一部の実施形態では、リンカーは、細胞内条件下で切断可能であり、その結果、リンカーの切断は、細胞内環境中で、抗体または抗原結合性断片からエフェクター分子または検出可能なマーカーを放出させる。さらに他の実施形態では、リンカーは切断不能であり、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、例えば、抗体分解によって放出される。一部の実施形態では、リンカーは、細胞内環境中（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断剤によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチドリンカーであり得る。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。しかし、リンカーは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸長、例えば、１～２、１～３、２～５、３～１０、３～１５、１～５、１～１０、１～１５アミノ酸長であり得る。プロテアーゼには、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンが含まれ得、その全ては、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞の内側での活性薬物の放出を生じることが公知である（例えば、ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９年、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ８３巻：６７～１２３頁を参照のこと）。例えば、チオール依存的プロテアーゼであるカテプシンＢによって切断可能なペプチドリンカーが使用され得る（例えば、フェニルアラニン－ロイシンまたはグリシン－フェニルアラニン－ロイシン－グリシンリンカー）。かかるリンカーの他の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１４，３４５号に記載されている。具体的な実施形態では、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーは、バリン－シトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）リンカーまたはフェニルアラニン－リシンリンカーである（例えば、バリン－シトルリンリンカーを用いたドキソルビシンの合成を記載する米国特許第６，２１４，３４５号を参照のこと）。

他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性、即ち、ある特定のｐＨ値において加水分解に対して感受性である。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソームにおいて加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス－アコニットアミド（cis-aconitic amide）、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）が使用され得る（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号；米国特許第５，８２４，８０５号；米国特許第５，６２２，９２９号；ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９年、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ８３巻：６７～１２３頁；Ｎｅｖｉｌｌｅら、１９８９年、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻：１４６５３～１４６６１頁を参照のこと）。かかるリンカーは、血液中などの中性のｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０を下回るｐＨでは不安定である。ある特定の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合されたチオエーテルなど）である（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照のこと）。

他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。種々のジスルフィドリンカーが当該分野で公知であり、これには、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－（２－ピリジル－ジチオ）トルエン）－、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを使用して形成され得るものが含まれる（例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８７年、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４７巻：５９２４～５９３１頁；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋら、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ＡｎｔｉｂｏｄｙＣｏｎｊｕｇａｔｅｓｉｎＲａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙａｎｄＴｈｅｒａｐｙｏｆＣａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ編、ＯｘｆｏｒｄＵ．Ｐｒｅｓｓ、１９８７年）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．６８巻：９２８０～９２９０頁、２００８年を参照のこと）。米国特許第４，８８０，９３５号もまた参照のこと。

さらに他の具体的な実施形態では、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５年、ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ．１５巻：１３８７～９３頁）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５年、Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ．３巻（１０号）：１２９９～１３０４頁）または３’－Ｎ－アミドアナログ（Ｌａｕら、１９９５年、Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ．３巻（１０号）：１３０５～１２頁）である。

さらに他の実施形態では、リンカーは切断不能であり、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、抗体分解によって放出される（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞外環境中での切断に対して抵抗性である。例えば、コンジュゲートが細胞外環境中（例えば、血漿中）に存在する場合、コンジュゲートのサンプル中のリンカーの約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約３％以下、または約１％以下が切断される。リンカーが細胞外環境中での切断に対して抵抗性であるか否かは、例えば、目的のリンカーを含有するコンジュゲートを、所定の期間（例えば、２、４、８、１６または２４時間）にわたって血漿と共にインキュベートし、次いで、血漿中に存在する遊離のエフェクター分子または検出可能なマーカーの量を定量することによって決定され得る。コンジュゲート中で使用され得る種々の例示的なリンカーは、ＷＯ２００４－０１０９５７、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号、米国特許出願公開第２００５０２３８６４９号および米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号に記載されており、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲのコンジュゲート、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分、および１または複数の小分子毒素、例えば、カリチアマイシン、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ドラスタチン、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、トリコテシンおよびＣＣ１０６５ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体が提供される。

マイタンシノイド毒素部分としての使用に適切なマイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）化合物は、当該分野で周知であり、公知の方法に従って天然供給源から単離され得、遺伝子操作技術（Ｙｕら（２００２年）ＰＮＡＳ９９巻：７９６８～７９７３頁を参照のこと）、または公知の方法に従って合成により調製されたマイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）およびマイタンシノールアナログを使用して産生され得る。マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。引き続いて、ある特定の微生物もまた、マイタンシノールおよびＣ－３マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノールならびにその誘導体およびアナログは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；米国特許第４，２４８，８７０号；米国特許第４，２５６，７４６号；米国特許第４，２６０，６０８号；米国特許第４，２６５，８１４号；米国特許第４，２９４，７５７号；米国特許第４，３０７，０１６号；米国特許第４，３０８，２６８号；米国特許第４，３０８，２６９号；米国特許第４，３０９，４２８号；米国特許第４，３１３，９４６号；米国特許第４，３１５，９２９号；米国特許第４，３１７，８２１号；米国特許第４，３２２，３４８号；米国特許第４，３３１，５９８号；米国特許第４，３６１，６５０号；米国特許第４，３６４，８６６号；米国特許第４，４２４，２１９号；米国特許第４，４５０，２５４号；米国特許第４，３６２，６６３号；および米国特許第４，３７１，５３３号に開示されており，その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。マイタンシノイドを含有するコンジュゲート、それを作製する方法、およびそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号；米国特許第５，４１６，０６４号；米国特許第６，４４１，１６３号および欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１に開示されており、それらの開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

さらなる毒素が、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分と共に使用され得る。例示的な毒素には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ヒマ毒、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、リボトキシン（ｒｉｂｏｔｏｘｉｎ）、リボヌクレアーゼ、サポリンおよびカリチアマイシン、ならびにボツリヌス毒素Ａ～Ｆが含まれる。これらの毒素は、当該分野で周知であり、多くは、商業的供給源（例えば、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から容易に入手可能である。企図される毒素には、これらの毒素のバリアントも含まれる（例えば、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照のこと）。

サポリンは、リボソーム複合体の６０Ｓ部分を不活性化することによってタンパク質合成を破壊する、Ｓａｐｏｎａｒｉａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓに由来する毒素である（Ｓｔｉｒｐｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：４０５～４１２頁、１９９２年）。しかし、この毒素は、細胞中への特異的進入のための機構を有さず、したがって、細胞によって効率的に取り込まれるために、内在化される細胞表面タンパク質を認識する抗体または抗原結合性断片へのコンジュゲートを必要とする。

ジフテリア毒素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅから単離される。典型的には、免疫毒素における使用のためのジフテリア毒素は、非特異的毒性を低減または排除するために変異される。完全な酵素活性を有するが非特異的毒性が顕著に低減された、ＣＲＭ１０７として公知の変異体は、１９７０年代以降公知であり（ＬａｉｒｄおよびＧｒｏｍａｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９巻：２２０頁、１９７６年）、ヒト臨床試験において使用されてきた。米国特許第５，７９２，４５８号および米国特許第５，２０８，０２１号を参照のこと。

ヒマ毒は、Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）由来のレクチンＲＣＡ６０である。ヒマ毒の例については、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照のこと。Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニン（ＲＣＡ）は、それぞれ、およそ６５ｋＤおよび１２０ｋＤの分子量に従って、ＲＣＡ_６０およびＲＣＡ_１２０と称される２つの形態で存在する（ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＢｌａｕｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ２６６巻：５４３頁、１９７２年）。Ａ鎖は、タンパク質合成の不活性化および細胞の死滅を担う。Ｂ鎖は、ヒマ毒を細胞表面ガラクトース残基に結合させ、細胞質ゾル中へのＡ鎖の輸送を促進する（Ｏｌｓｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ２４９巻：６２７～６３１頁、１９７４年および米国特許第３，０６０，１６５号）。

リボヌクレアーゼもまた、免疫毒素としての使用のために標的化分子にコンジュゲートされてきた（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７巻：２６５～７０頁、１９９９年を参照のこと）。例示的なリボトキシン、例えば、α－サルシン（α－ｓａｒｃｉｎ）およびレストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）は、例えば、Ｒａｔｈｏｒｅら、Ｇｅｎｅ１９０巻：３１～５頁、１９９７年；ならびにＧｏｙａｌおよびＢａｔｒａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４５巻２部：２４７～５４頁、２０００年で議論されている。カリチアマイシンは、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａから最初に単離されたものであり、ＤＮＡ中にアポトーシスをもたらす二本鎖切断を生じさせて、エンジイン抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである（例えば、Ｌｅｅら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２巻：１０７０～８７頁、１９８９年を参照のこと）。この薬物は、臨床試験中の免疫毒素の毒性部分である（例えば、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１巻：７３５～４１頁、２０００年を参照のこと）。

アブリンは、Ａｂｒｕｓｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ由来の毒性レクチンを含む。毒性素であるアブリンａ、ｂ、ｃおよびｄは、約６３ｋＤおよび６７ｋＤの分子量を有し、２つのジスルフィド連結されたポリペプチド鎖ＡおよびＢから構成される。Ａ鎖はタンパク質合成を阻害する；Ｂ鎖（アブリン－ｂ）は、Ｄ－ガラクトース残基に結合する（Ｆｕｎａｔｓｕら、Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２巻：１０９５頁、１９８８年；およびＯｌｓｎｅｓ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．５０巻：３３０～３３５頁、１９７８年を参照のこと）。

ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、本明細書に開示された抗原のうち１または複数に対して特異的なモノクローナル抗体、その抗原結合性断片はまた、検出可能なマーカー；例えば、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、顕微鏡法または画像診断技術（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、コンピューター体軸断層撮影（ｃｏｍｐｕｔｅｄａｘｉａｌｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＡＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法（ＮＭＲＩ）、磁気共鳴断層撮影（ＭＴＲ）、超音波、光ファイバー試験および腹腔鏡下試験）による検出が可能な検出可能なマーカーとコンジュゲートされ得る。検出可能なマーカーの具体的な非限定的な例には、フルオロフォア、化学発光剤、酵素的連結、放射活性同位体および重金属または化合物（例えば、ＭＲＩによる検出のための超常磁性酸化鉄ナノ結晶）が含まれる。例えば、有用な検出可能なマーカーには、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５－ジメチルアミン－１－ナフタレンスルホニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）塩化物、フィコエリトリン、ランタニドリン光体などを含む蛍光化合物が含まれる。ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの生物発光マーカーもまた使用される。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、検出のために有用な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどにもコンジュゲートされ得る。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分が、検出可能な酵素とコンジュゲートされる場合、それは、識別できる反応産物を産生するために酵素が使用するさらなる試薬を添加することによって検出され得る。例えば、薬剤西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加が、視覚的に検出可能な着色反応産物をもたらす。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分はまた、ビオチンとコンジュゲートされ得、アビジンまたはストレプトアビジンの結合の間接的な測定を介して検出され得る。アビジン自体が酵素または蛍光標識とコンジュゲートされ得ることに留意すべきである。

ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、ガドリニウムなどの常磁性薬剤とコンジュゲートされ得る。超常磁性酸化鉄などの常磁性薬剤もまた、標識として使用される。抗体は、ランタニド（例えば、ユーロピウムおよびジスプロシウム）およびマンガンともコンジュゲートされ得る。抗体または抗原結合性断片はまた、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体への結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）で標識され得る。

ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分はまた、放射標識されたアミノ酸とコンジュゲートされ得る。放射標識は、診断目的および治療目的の両方のために使用され得る。例えば、放射標識は、ｘ線、発光スペクトルまたは他の診断技術によって本明細書に開示された抗原および抗原発現細胞のうち１または複数を検出するために使用され得る。さらに、放射標識は、対象における腫瘍の処置のため、例えば、神経芽細胞腫の処置のために、毒素として治療的に使用され得る。ポリペプチドのための標識の例には、以下の放射性同位体または放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が含まれるがこれらに限定されない：^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ。

かかる検出可能なマーカーを検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出され得、蛍光マーカーは、発せられた照明を検出するために光検出器を使用して検出され得る。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって産生された反応産物を検出することによって検出され、発色標識は、着色標識を単純に可視化することによって検出される。

Ｄ．ヌクレオチド、発現、ベクターおよび宿主細胞
本明細書に記載されるＣＡＲ、抗体またはその抗原結合性部分（その機能的部分および機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、本発明の一実施形態によってさらに提供される。本発明の核酸は、本明細書に記載されるリーダー配列、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含み得る。

一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン改変され得る。特定の理論に束縛されないが、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ｍＲＮＡ転写物の翻訳効率を増加させると考えられる。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ネイティブコドンを、同じアミノ酸をコードするが、細胞内でより容易に利用可能なｔＲＮＡによって翻訳され得る別のコドンに置換し、そうして翻訳効率を増加させることを含み得る。ヌクレオチド配列の最適化はまた、翻訳を妨害する二次ｍＲＮＡ構造を低減させ得、そうして翻訳効率を増加させる。

本発明の実施形態では、核酸は、本発明のＣＡＲの抗原結合性ドメインをコードするコドン改変されたヌクレオチド配列を含み得る。本発明の別の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするコドン改変されたヌクレオチド配列を含み得る。

「核酸」は、本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸分子」を含み、一般に、一本鎖または二本鎖の、合成のまたは天然供給源から得られた（例えば、単離および／または精製された）ものであり得、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有し得、未改変のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見出されるホスホジエステルの代わりに、天然、非天然または変更されたヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）連結またはホスホロチオエート連結を含有し得る、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味する。一部の実施形態では、核酸は、いずれの挿入、欠失、逆位および／または置換も含まない。しかし、一部の場合には、本明細書で議論されるように、核酸は、１または複数の挿入、欠失、逆位および／または置換を含むことが適切であり得る。

組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するもの、または配列の２つのさもなければ分離されたセグメントの人工的な組合せによって作製される配列を有するものであり得る。この人工的な組合せは、化学的合成によって、またはより一般的には、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載されるものなどの遺伝子操作技術による、核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって達成される場合が多い。核酸は、当該分野で公知の手順を使用する化学的合成および／または酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照のこと。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくはハイブリダイゼーションの際に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々に改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学合成され得る。核酸を生成するために使用され得る改変型ヌクレオチドの例には、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－置換されたアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシルおよび２，６－ジアミノプリンが含まれるがこれらに限定されない。あるいは、本発明の核酸のうち１または複数は、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）などの会社から購入できる。

核酸は、ＣＡＲまたはその機能的部分もしくは機能的バリアントのいずれかをコードする任意の単離または精製されたヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、ヌクレオチド配列は、配列のいずれかと縮重するヌクレオチド配列、または縮重配列の組合せを含み得る。

一実施形態は、本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列、または本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離または精製された核酸もまた提供する。

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし得る。「高いストリンジェンシーの条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に強い量で、標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高いストリンジェンシーの条件には、ヌクレオチド配列と一致したいくつかの小領域（例えば、３～１０塩基）を偶然に有するランダム配列から、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、またはいくつかの散在するミスマッチしか含有しないポリヌクレオチドを識別する条件が含まれる。相補性のかかる小領域は、１４～１７またはそれ超塩基の全長相補体よりも容易に融解され、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、それらを容易に識別可能にする。比較的高いストリンジェンシーの条件には、例えば、約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌまたは等価物によって、約５０～７０℃の温度で提供されるような、低塩および／または高温条件が含まれる。かかる高いストリンジェンシーの条件は、存在するとしても、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間のミスマッチをほとんど忍容せず、本発明のＣＡＲのいずれかの発現を検出するのに特に適切である。一般に、条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントにされ得ることが理解される。

本明細書に記載される核酸のいずれかに対して、少なくとも約７０％またはそれ超、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供される。

一実施形態では、核酸は、組換え発現ベクター中に取り込まれ得る。これに関して、一実施形態は、核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書の目的のために、用語「組換え発現ベクター」とは、構築物が、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合、およびベクターが、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが細胞内で発現されるのに十分な条件下で細胞と接触させられる場合に、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現を可能にする、遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物を意味する。ベクターは、全体としては天然に存在しない。

しかし、ベクターの一部は、天然に存在し得る。組換え発現ベクターは、一本鎖または二本鎖の、合成または一部天然供給源から得られたものであり得、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有し得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むがこれらに限定されない任意の型のヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然に存在するもしくは天然に存在しないヌクレオチド間連結、またはその両方の型の連結を含み得る。好ましくは、天然に存在しないまたは変更されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間連結は、ベクターの転写も複製も邪魔しない。

一実施形態では、組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得、任意の適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。適切なベクターには、プラスミドおよびウイルスなどの、繁殖および増殖のためもしくは発現のため、またはその両方のために設計されたものが含まれる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（ＦｅｒｍｅｎｔａｓＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＧｌｅｎＢｕｒｎｉｅ、ＭＤ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）からなる群から選択され得る。

バクテリオファージベクター、例えば、λυΤΙ Ο、λυΤΙ １、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＭＢＬ４およびλΝΜΙ １４９もまた使用され得る。植物発現ベクターの例には、ｐＢＩＯｌ、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＨＯｌ．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。動物発現ベクターの例には、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。レンチウイルスベクターは、特に、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７巻（８号）：１４５３～１４６４頁（２００９年）に提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターである。クリニックにおいて使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、限定としてではなく、ＯｘｆｏｒｄＢｉｏＭｅｄｉｃａｐｌｃのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達テクノロジー、ＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系などが含まれる。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者に公知である。

いくつかのトランスフェクション技術が、当該分野で一般に公知である（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６～４６７頁（１９７３年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；Ｄａｖｉｓら、ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６年）；およびＣｈｕら、Ｇｅｎｅ、１３巻：９７頁（１９８１年）を参照のこと）。

トランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈（例えば、Ｇｒａｈａｍら、上記を参照のこと）、培養細胞中への直接的マイクロインジェクション（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、２２巻：４７９～４８８頁（１９８０年）を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：７４２～７５１頁（１９８８年）を参照のこと）、リポソーム媒介性遺伝子移入（例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２～６９０頁（１９８８年）を参照のこと）、脂質媒介性形質導入（例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：７４１３～７４１７頁（１９８７年）を参照のこと）および高速微小推進剤（ｈｉｇｈｖｅｌｏｃｉｔｙｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を使用する核酸送達（例えば、Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻：７０～７３頁（１９８７年）を参照のこと）が含まれる。

一実施形態では、組換え発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記に記載される、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。環状または直鎖状である発現ベクターの構築物は、原核生物または真核生物宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来し得る。

組換え発現ベクターは、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮に入れて、必要に応じて、ベクターが導入される宿主細胞の型（例えば、細菌、真菌、植物または動物）に特異的な調節配列、例えば、転写および翻訳開始および終結コドンを含み得る。組換え発現ベクターは、クローニングを容易にするための制限部位を含み得る。

組換え発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする、１または複数のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子には、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における補完などが含まれる。本発明の発現ベクターに適切なマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。

組換え発現ベクターは、ＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列に、またはＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に対して相補的なもしくはかかるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結したネイティブまたは非ネイティブのプロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的および発生特異的は、当業者の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることもまた、当業者の技術範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルスの末端反復配列において見出されるプロモーターであり得る。

組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のため、またはその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現または誘導性発現のために作製され得る。

さらに、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用する場合、用語「自殺遺伝子」とは、自殺遺伝子を発現する細胞を死なせる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、この遺伝子が発現される細胞に薬物などの薬剤に対する感受性を付与する遺伝子、または細胞が薬剤と接触した場合もしくは薬剤に曝露された場合にその細胞を死なせる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該分野で公知であり（例えば、ＳｕｉｃｉｄｅＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＲｅｖｉｅｗｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＣａｒｏｌｉｎｅＪ．（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＵＫＣｅｎｔｒｅｆｏｒＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓａｔｔｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｕｔｔｏｎ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、２００４年を参照のこと）、これには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ｄａｍｉｎａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびニトロレダクターゼが含まれる。

一実施形態は、本明細書に記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」とは、本発明の組換え発現ベクターを含有し得る任意の型の細胞を指す。宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、植物、動物、真菌もしくは藻類であり得る、または原核生物細胞、例えば、細菌もしくは原生生物であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞であり得る、即ち、ヒトなどの生物から直接単離され得る。宿主細胞は、接着細胞または懸濁細胞、即ち、懸濁物中で成長する細胞であり得る。適切な宿主細胞は、当該分野で公知であり、これには、例えば、ＤＨ５ａＥ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが含まれる。組換え発現ベクターを増幅または複製することを目的とすると、宿主細胞は、原核生物細胞、例えば、ＤＨ５ａ細胞であり得る。組換えＣＡＲを産生することを目的とすると、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞は、ヒト細胞であり得る。宿主細胞は任意の細胞型のものであり得、任意の型の組織に起源し得、任意の発生段階のものであり得るが、宿主細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。宿主細胞は、Ｔ細胞であり得る。

本明細書の目的のために、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴｌなど由来のＴ細胞、または哺乳動物から得られたＴ細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺または他の組織もしくは体液を含むがこれらに限定されない多数の供給源から得られ得る。Ｔ細胞はまた、富化または精製され得る。Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞、メモリーＴ細胞、メモリー幹細胞、即ち、Ｔｓｃｍ、ナイーブＴ細胞などを含むがこれらに限定されない、任意の型のＴ細胞であり得、任意の発生段階のものであり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＤ４^＋Ｔ細胞であり得る。

一実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、適切な非Ｔ細胞において使用され得る。かかる細胞は、免疫エフェクター機能を有する細胞、例えば、多能性幹細胞から生成されたＮＫ細胞およびＴ様細胞などである。

本明細書に記載される少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団もまた、一実施形態によって提供される。細胞の集団は、いずれの組換え発現ベクターも含まない少なくとも１つの他の細胞、例えば宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、またはＴ細胞以外の細胞、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞などに加えて、記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む不均一な集団であり得る。あるいは、細胞の集団は、実質的に均質な集団であり得、ここで、集団は主に、組換え発現ベクターを含む（例えば、それらから本質的になる）宿主細胞を含む。集団はまた、細胞のクローン性集団であり得、ここで、集団の全ての細胞は、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、その結果、集団の全ての細胞は、その組換え発現ベクターを含む。本発明の一実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載される組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン性集団である。

ＣＡＲ（その機能的部分およびバリアントを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）および抗体（その抗原結合性部分を含む）は、単離および／または精製され得る。例えば、精製（または単離）された宿主細胞の調製物は、宿主細胞が身体内のその天然環境中の細胞よりも純粋である調製物である。かかる宿主細胞は、例えば、標準的な精製技術によって産生され得る。一部の実施形態では、宿主細胞の調製物は精製され、その結果、宿主細胞は、調製物の総細胞含量の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７０％を示す。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり得、約６０％、約７０％もしくは約８０％よりも上であり得、または約１００％であり得る。

Ｅ．処置の方法
本明細書で開示されるＣＡＲは、哺乳動物において疾患を処置または予防する方法において使用され得ることが企図される。これに関して、一実施形態は、ＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および／もしくはその抗原結合性部分、ならびに／または医薬組成物を、哺乳動物においてがんを処置または予防するのに有効な量で哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物においてがんを処置または予防する方法を提供する。

一実施形態は、本明細書に開示されるＣＡＲを投与するステップの前に、哺乳動物をリンパ枯渇させる（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）ステップをさらに含む。リンパ枯渇の例には、非骨髄破壊的リンパ枯渇性化学療法、骨髄破壊的リンパ枯渇性化学療法、全身照射などが含まれ得るがこれらに限定されない。

宿主細胞、または細胞の集団が投与される方法を目的として、細胞は、哺乳動物にとって同種または自家である細胞であり得る。好ましくは、細胞は、哺乳動物にとって自家である。本明細書で使用する場合、同種とは、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を意味する。１または複数の遺伝子座において遺伝子が同一でない場合、２以上の個体は、互いに同種であると言われる。一部の態様では、同じ種の個体由来の同種材料は、抗原性に相互作用するのに十分に遺伝的に異なり得る。本明細書で使用する場合、「自家」とは、個体に後に再導入される、同じ個体に由来する任意の材料を意味する。

本明細書で言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。本明細書で使用する場合、用語「哺乳動物」とは、齧歯目の哺乳動物、例えば、マウスおよびハムスター、ならびにウサギ（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）目の哺乳動物、例えば、ウサギを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ（Ｆｅｌｉｎｅ）（ネコ（ｃａｔ））およびイヌ（Ｃａｎｉｎｅ）（イヌ（ｄｏｇ））を含む食肉目由来であり得る。哺乳動物は、ウシ（Ｂｏｖｉｎｅ）（ウシ（ｃｏｗ））およびブタ（Ｓｗｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇ））を含む偶蹄目由来、またはウマ（Ｅｑｕｉｎｅ）（ウマ（ｈｏｒｓｅ））を含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）のものであり得る。哺乳動物は、霊長目、新世界ザル（Ｃｅｂｏｉｄ）目もしくはサル（Ｓｉｍｏｉｄ）目（サル（ｍｏｎｋｅｙ））または類人猿（Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄ）目（ヒトおよび類人猿（ａｐｅ））のものであり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

これらの方法に関して、がんは、急性リンパ性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱がん（例えば、膀胱癌）、骨がん、脳がん（例えば、髄芽腫）、乳房がん、肛門、肛門管もしくは肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢もしくは胸膜のがん、鼻、鼻腔もしくは中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん（ｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｉｄｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞肺癌および肺腺癌）、リンパ腫、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、Ｂ－慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）およびバーキットリンパ腫、卵巣がん、膵がん、腹膜、網および腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、固形腫瘍、滑膜肉腫、胃がん、精巣がん、甲状腺がんならびに尿管がんのいずれかを含む任意のがんであり得る。

用語「処置する」および「予防する」ならびにそれらから派生した単語は、本明細書で使用する場合、１００％または完全な処置または予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な有益な効果または治療効果を有すると認識する、種々の程度の処置または予防が存在する。これに関して、この方法は、任意の量または任意のレベルの、哺乳動物におけるがんの処置または予防を提供し得る。

さらに、この方法によって提供される処置または予防には、処置または予防されているがんなどの疾患の１または複数の状態または症状の処置または予防が含まれ得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患、またはその症状もしくは状態の発病を遅延させることを包含し得る。

別の実施形態は、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法であって、（ａ）哺乳動物由来の１または複数の細胞を含む試料を、ＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および／もしくはその抗原結合性部分、または医薬組成物と接触させ、それによって、複合体を形成するステップ、ならびに（ｂ）複合体を検出するステップであって、複合体の検出が、哺乳動物におけるがんの存在を示す、ステップを含む方法を提供する。

試料は、任意の適切な方法、例えば、生検または剖検によって得られ得る。生検は、個体からの組織および／または細胞の取り出しである。かかる取り出しは、取り出された組織および／または細胞に対する実験を実施するために、個体から組織および／または細胞を収集することであり得る。この実験には、個体がある特定の状態もしくは疾患状態を有するかどうか、および／またはある特定の状態もしくは疾患状態に罹患しているかどうかを決定するための実験が含まれ得る。状態または疾患は、例えば、がんであり得る。

哺乳動物における増殖障害、例えばがんの存在を検出する方法の実施形態に関して、哺乳動物の細胞を含む試料は、細胞全体、その溶解物、または細胞全体溶解物の画分、例えば、核もしくは細胞質画分、タンパク質全体画分、または核酸画分を含む試料であり得る。試料が細胞全体を含む場合、これらの細胞は、哺乳動物の任意の細胞、例えば、血液細胞または内皮細胞を含む任意の臓器または組織の細胞であり得る。

接触させるステップは、哺乳動物に関してｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで起こり得る。好ましくは、接触させるステップは、ｉｎｖｉｔｒｏである。

また、複合体の検出は、当該分野で公知の多くの方法によって行われ得る。例えば、本明細書に記載される、本明細書に開示されるＣＡＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、または抗体もしくはその抗原結合性部分は、検出可能な標識、例えば、上に開示される放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および元素粒子（例えば、金粒子）などで標識され得る。

標的細胞を認識する能力および抗原特異性についてＣＡＲを試験する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｌａｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６３巻：５０７～５１３頁（１９９９年）は、サイトカイン（例えば、インターフェロン－γ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ－ａ）またはインターロイキン２（ＩＬ－２））の放出を測定する方法を教示している。さらに、ＣＡＲ機能は、Ｚｈａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４巻：４４１５～４４２３頁（２００５年）に記載されるように、細胞傷害性の測定によって評価され得る。

別の実施形態は、本発明のＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体もしくはその抗原結合性部分、および／または医薬組成物の使用、哺乳動物におけるがんなどの増殖障害の処置または予防を提供する。がんは、本明細書に記載されるがんのいずれかであり得る。

局所および全身投与を含む任意の投与方法が、開示された治療剤のために使用され得る。例えば、外用、経口、静脈内などの血管内、筋内、腹腔内、鼻腔内、皮内、くも膜下腔内および皮下投与が使用され得る。特定の投与様式および投薬レジメンは、症例の特徴（例えば、対象、疾患、関与する疾患状態、および処置が予防的かどうか）を考慮して、担当の臨床医によって選択される。１よりも多い薬剤または組成物が投与されている場合、１または複数の投与経路が使用され得る；例えば、化学療法剤は、経口投与され得、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートまたは組成物は、静脈内投与され得る。投与方法には、ＣＡＲ、ＣＡＲＴ細胞、コンジュゲート、抗体、抗原結合性断片または組成物が、非毒性の薬学的に許容される担体、例えば、水、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、５％ヒト血清アルブミン、固形油、オレイン酸エチルまたはリポソーム中に提供される注射が含まれる。一部の実施形態では、開示された化合物の局所投与は、例えば、腫瘍が除去された組織の領域、または腫瘍発達の傾向があると疑われる領域に、抗体または抗原結合性断片を適用することによって使用され得る。一部の実施形態では、治療有効量の抗体または抗原結合性断片を含む医薬調製物の持続性の腫瘍内（または腫瘍近傍）放出が有益であり得る。他の例では、コンジュゲートが、角膜に点眼薬として外用で、または目に硝子体内で適用される。

開示された治療剤は、正確な投薬量の個々の投与に適切な単位剤形で製剤化され得る。さらに、開示された治療剤は、単一の用量でまたは複数用量のスケジュールで投与され得る。複数用量のスケジュールは、処置の主要な過程が、１よりも多い別々の用量、例えば１～１０用量と、その後の、組成物の作用を維持または強化するために必要に応じて引き続く時間間隔で与えられる他の用量とによるものであり得るスケジュールである。処置は、数日～数カ月またはさらには数年の期間にわたる、１日用量または複数の１日用量の化合物（複数可）を含み得る。したがって、投薬レジームはまた、処置される対象の特定の要求に基づいて少なくとも一部決定され、投与する実務者の判断に依存する。

抗体またはコンジュゲートの典型的な投薬量は、約０．０１～約３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。

特定の例では、対象には、複数の１日投薬スケジュールで、例えば、少なくとも２連続日、１０連続日など、例えば、数週間、数カ月または数年の期間にわたって、コンジュゲート、抗体、組成物、ＣＡＲ、ＣＡＲＴ細胞またはさらなる薬剤のうち１または複数を含む治療組成物が投与される。一例では、対象には、少なくとも３０日、例えば、少なくとも２カ月、少なくとも４カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月の期間にわたって、コンジュゲート、抗体、組成物またはさらなる薬剤が投与される。

一部の実施形態では、開示された方法は、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞と組み合わせて、手術、放射線療法および／または化学療法薬を（例えば、連続的に、実質的に同時にまたは同時に）対象に提供することを含む。かかる薬剤および処置の方法および治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。さらなる薬剤についての調製および投薬スケジュールは、製造業者の指示に従って使用され得る、または当業者によって実験的に決定される通りであり得る。かかる化学療法についての調製および投薬スケジュールは、ＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙＳｅｒｖｉｃｅ、（１９９２年）Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄにも記載されている。

一部の実施形態では、併用治療は、治療有効量のさらなるがん阻害剤の、対象への投与を含み得る。併用治療で使用され得るさらなる治療剤の非限定的な例には、微小管結合剤、ＤＮＡインターカレーターまたはクロスリンカー、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子調節因子ならびに血管新生阻害剤が含まれる。これらの薬剤（治療有効量で投与される）および処置は、単独でまたは組み合わせて使用され得る。例えば、任意の適切な抗がん剤または抗血管新生剤は、本明細書に開示されるＣＡＲ、ＣＡＲ－Ｔ細胞、抗体、抗原結合性断片またはコンジュゲートと組み合わせて投与され得る。方法およびかかる薬剤の治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。

さらなる化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンおよびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパおよびウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）；代謝拮抗薬、例えば、葉酸（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセドおよびラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリンおよびチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシルおよびゲムシタビン；植物アルカロイド、例えば、ポドフィルム（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）；細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質、例えば、アントラサイクリンファミリーのメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびバルルビシン）、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシウレアおよびマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン；モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブ；腫瘍親和性感光色素、例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウムおよびベルテポルフィン；ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｉｎｉｂ）、バンデタニブおよびトレチノインが含まれるがこれらに限定されない。かかる薬剤の選択および治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。

併用療法は、相乗作用を提供し得、相乗的であることが証明され得る、即ち、活性成分が一緒に使用される場合に達成される効果は、それらの化合物を別々に使用することから生じ得る効果の合計よりも大きい。相乗効果は、活性成分が、（１）共製剤化され、併用される単位投薬製剤と同時に投与もしくは送達される場合；（２）別々の製剤として交互にもしくは並行して送達される場合；または（３）一部の他のレジメンによる場合に、達成され得る。交互に送達される場合、相乗効果は、それらの化合物が、例えば、別々のシリンジ中の異なる注射によって連続的に投与または送達される場合に達成され得る。一般に、交代の間、有効投薬量の各活性成分が、連続的に、即ち、順次に投与されるが、併用療法では、有効投薬量の２以上の活性成分が一緒に投与される。

一実施形態では、本明細書に開示された抗原のうち１もしくは複数に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合性断片またはそのコンジュゲートの有効量が、抗がん処置後に腫瘍を有する対象に投与される。投与された抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートがそれぞれのがん細胞上で発現された抗原と免疫複合体を形成するのに十分な量の時間が経過した後で、免疫複合体が検出される。免疫複合体の存在（または非存在）は、処置の有効性を示す。例えば、処置の前に採取された対照と比較した免疫複合体の増加は、その処置が有効でないことを示し、処置の前に採取された対照と比較した免疫複合体の減少は、その処置が有効であることを示す。

Ｆ．バイオ医薬組成物
担体（例えば、薬学的に許容される担体）中に、開示されたＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、ＣＡＲ、または本明細書に開示された１もしくは複数の抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１または複数を含む、遺伝子治療、免疫療法および／または細胞療法における使用のためのバイオ医薬組成物または生物製剤組成物（本明細書で以下「組成物」）が、本明細書で提供される。これらの組成物は、対象への投与のために単位投薬形態で調製され得る。所望の転帰を達成するための投与の量およびタイミングは、処置を行う臨床医の裁量である。これらの組成物は、全身（例えば、静脈内）または局所（例えば、腫瘍内）投与のために製剤化され得る。一例では、開示されたＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片、コンジュゲートは、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化される。本明細書に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物は、腫瘍、例えば、限定としてではなく、神経芽細胞腫の、例えば、処置および検出などのために使用される。一部の例では、これらの組成物は、癌の処置または検出に有用である。本明細書に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物は、例えば、病理学的血管新生の検出にも使用される。

投与のための組成物には、水性担体などの薬学的に許容される担体中に溶解されたＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片の溶液が含まれ得る。例えば緩衝食塩水などの種々の水性担体が使用され得る。これらの溶液は無菌であり、一般に、望ましくない物質を含まない。組成物は、従来の周知の無菌化技術によって無菌化され得る。組成物は、生理学的条件に近付くのに必要な薬学的に許容される補助的物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、アジュバント薬剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中のＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートの濃度は、広く変動し得、選択された特定の投与様式および対象の要求に従って、液量、粘度、体重などに主に基づいて選択される。遺伝子治療、免疫療法および／または細胞療法における使用のためのかかる投薬形態を調製する実際の方法は、当業者に公知であり、または明らかとなる。

静脈内投与のための典型的な組成物は、１日当たり対象１人当たり約０．０１～約３０ｍｇ／ｋｇの抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲート（あるいは対応する用量のＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片を含むコンジュゲート）を含む。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ、第１９版、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９５年）などの刊行物中により詳細に記載されている。

ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片、またはコンジュゲートは、凍結乾燥形態で提供され得、投与前に無菌水で再水和され得るが、これらは、既知の濃度の無菌溶液中でも提供される。次いで、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートの溶液が、０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有する注入バッグに添加され、一部の場合には、０．５～１５ｍｇ／体重ｋｇの投薬量で投与される。抗体または抗原結合性断片およびコンジュゲート薬物の投与では、当該分野でかなりの経験が利用可能である；例えば、抗体薬物は、１９９７年のＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の承認以降、米国で市販されている。ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片およびそれらのコンジュゲートは、静注または静脈内ボーラスでではなく、緩徐な注入によって投与され得る。一例では、より高い負荷用量が、より低いレベルで投与される引き続く維持用量と共に投与される。例えば、４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量の抗体または抗原結合性断片（または対応する用量の、抗体もしくは抗原結合性断片を含むコンジュゲート）が、およそ９０分の期間にわたって注入され得、その後、以前の用量が十分に忍容された場合に３０分の期間にわたって注入される４～８週間にわたる２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量が注入され得る。

制御放出非経口製剤は、インプラント、油性注射として、または粒状の系として作製され得る。タンパク質送達系の広い概説については、Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｊ．、ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ、ＴｅｃｈｎｏｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、ＰＡ（１９９５年）を参照のこと。粒状の系には、ミクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェアおよびナノ粒子が含まれる。マイクロカプセルは、中心コアとして、細胞毒または薬物などの治療的タンパク質を含有する。ミクロスフェアでは、治療薬は、粒子の至る所に分散される。約１μｍよりも小さい粒子、ミクロスフェアおよびマイクロカプセルは一般に、それぞれ、ナノ粒子、ナノスフェアおよびナノカプセルと呼ばれる。毛細管は、ナノ粒子だけが静脈内投与されるように、およそ５μｍの直径を有する。マイクロ粒子は、典型的には、直径がおよそ１００μｍであり、皮下または筋内投与される。例えば、Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．、ＣｏｌｌｏｉｄａｌＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ編、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ、２１９～３４２頁（１９９４年）；ならびにＴｉｃｅおよびＴａｂｉｂｉ、ＴｒｅａｔｉｓｅｏｎＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ、Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ、３１５～３３９頁（１９９２年）を参照のこと。

ポリマーは、本明細書に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲート組成物のイオン制御された放出のために使用され得る。制御された薬物送達に使用される種々の分解性および非分解性ポリマーマトリックスは、当該分野で公知である（Ｌａｎｇｅｒ、ＡｃｃｏｕｎｔｓＣｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６巻：５３７～５４２頁、１９９３年）。例えば、ブロックコポリマーであるｐｏｌａｘａｍｅｒ４０７は、低温で粘性であるがなお可動性の液体として存在するが、体温では半流動性ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン－２およびウレアーゼの製剤化および持続性送達のための有効なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９巻：４２５～４３４頁、１９９２年；およびＰｅｃら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４巻（２号）：５８～６５頁、１９９０年）。あるいは、ヒドロキシアパタイトが、タンパク質の制御された放出のための微小担体として使用されてきた（Ｉｊｎｔｅｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２巻：２１５～２２４頁、１９９４年）。さらに別の態様では、リポソームが、脂質カプセル化薬物の制御された放出および薬物標的化に使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉら、ＬｉｐｏｓｏｍｅＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ、ＴｅｃｈｎｏｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｉｎｃ．、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、ＰＡ（１９９３年））。治療的タンパク質の制御された送達のための多数のさらなる系が公知である（米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，１８８，８３７号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，９５７，７３５号；米国特許第５，０１９，３６９号；米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，５１４，６７０号；米国特許第５，４１３，７９７号；米国特許第５，２６８，１６４号；米国特許第５，００４，６９７号；米国特許第４，９０２，５０５号；米国特許第５，５０６，２０６号；米国特許第５，２７１，９６１号；米国特許第５，２５４，３４２号および米国特許第５，５３４，４９６号を参照のこと）。

Ｇ．キット
一態様では、本明細書に開示されるＣＡＲを使用するキットもまた提供される。例えば、対象における腫瘍を処置するためのキットまたは本明細書に開示されるＣＡＲのうち１もしくは複数を発現するＣＡＲＴ細胞を作製するためのキット。キットは、典型的には、本明細書に開示される、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞を含む。開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１よりも多くが、キット中に含まれ得る。

キットは、コンテナ、およびコンテナ上のまたはコンテナと関連したラベルまたは添付文書を含み得る。適切なコンテナには、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが含まれる。コンテナは、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。コンテナは、典型的には、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１または複数を含む組成物を保持する。いくつかの実施形態では、コンテナは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、コンテナは、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、その組成物が特定の状態を処置するために使用されることを示す。

ラベルまたは添付文書は、典型的には、例えば、腫瘍を処置もしくは予防する方法、またはＣＡＲＴ細胞を作製する方法における、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞の使用のための指示書をさらに含む。添付文書は、典型的には、治療的製品の使用に関する、適応症、用法、投薬量、投与、禁忌および／またはかかる警告についての情報を含む、治療的製品の市販の包装中に習慣的に含まれる指示書を含む。教材は、電子的形態（例えば、コンピューターディスケットまたはコンパクトディスク）で書かれ得、または視覚的（例えば、動画ファイル）であり得る。キットは、キットが設計される特定の適用を容易にするためのさらなる構成要素もまた含み得る。したがって、例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）をさらに含み得る。キットは、特定の方法の実施のために慣用的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含み得る。かかるキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。

本発明は以下の実施例によってさらに例証され、これらの実施例は決して本発明の範囲に制約を課すものとして解釈すべきではない。反対に、その様々な他の実施形態、変更形態、および均等物に頼らなければならず、これらは本明細書の記載を読んだ後、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲から逸脱せずに、当業者の念頭に浮かび得ることは容易に理解される。

実施例１
タンデムＣＤ１９／ＣＤ２０ＣＡＲレンチウイルスベクターは、白血病細胞株においてオンターゲットおよびオフターゲット抗原調節を駆動する
遺伝子操作された自家ヒトＴ細胞によるがんのための養子免疫療法は、現在多くの拠点で評価されている。養子免疫療法のための細胞集団を作り出すための通常の一手法は、［１］で概略される、患者からアフェレーシスによりＴ細胞を単離すること、およびｅｘｖｉｖｏでこれらの細胞に、ホストゲノムに組み込まれキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを形質導入することである。キメラ抗原受容体は、免疫学的に活性なタンパク質の様々なサブユニットからの機能的配列ドメインを連結することにより作り出される。例えば、抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２０抗体のＶＨおよびＶＬドメインから作り出されたｓｃＦｖドメインは、ＣＤ２８またはＣＤ８に由来する膜貫通配列に連結され、次いでＣＤ３－ゼータ鎖およびＣＤ２８またはＣＤ１３７に由来する細胞内シグナル伝達ドメインに連結され得る［２、３］。したがって、ＣＡＲは、単一の膜貫通タンパク質内にｓｃＦｖに由来する結合性ドメインおよび連結されたシグナル伝達ドメインの両方を与え、これは、ベクターが形質導入されたＴ細胞の活性化を可能にする。これで、この形質導入されたＴ細胞集団（ＣＡＲ－Ｔ）は、活性細胞溶解、およびインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）および腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦα）などのサイトカイン産生により組織される間接的免疫エフェクター機構による破壊について、同族抗原を有する細胞を機能的に標的化し得る。ＣＤ１９を特異的に標的化するキメラ抗原受容体改変Ｔ細胞による養子免疫療法は、小児プレＢＡＬＬに対する有効性を証明した［４、５］。成人血液悪性腫瘍におけるＣＡＲ改変Ｔ細胞の有効性は、より不均一である。

ペンシルバニア大学における３人のＣＬＬ患者による抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ療法での経験は、普遍的な陽性応答を示すように見え、ＮＣＩのＳｕｒｇｅｒｙＢｒａｎｃｈは、成人Ｂ細胞悪性腫瘍を有する８人の患者の多様な収集物において部分奏効、安定疾患および１つの完全奏効の混合を報告した［６、７］。したがって、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、不偏的に有効ではなく、その抗腫瘍標的化可能性のさらなる増強から利益を得ることができる。Ｔｈｏｍａｓ－Ｔｉｋｈｏｎｅｎｋｏの研究室は、抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ療法中にＢ－ＡＬＬにより使用されるエスケープ機構を見事に説明し、これは、ＣＤ１９の選択的スプライシング、フレームシフト変異およびミスセンス変異を含む［８］。ＣＡＲ－Ｔ製品の標的範囲を広げるため、およびより大きな効果で悪性腫瘍を標的化するための一手段は、単一のＣＡＲ構造内に２つの結合性ドメインを含めることである。タンデムＣＤ１９およびＣＤ２０発現悪性腫瘍としては、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）および絨毛リンパ球を伴う脾リンパ腫（ＳＬＶＬ）が挙げられる［９］。両方の抗原を標的化する単一のＣＡＲベクターは、より広い様々な血液悪性腫瘍を標的化し、潜在的にそれらをより有効に標的化し得る。

この実施例では、タンデムＣＡＲ構築物の有効性の増大は、一連のシングル特異性およびタンデム特異的ＣＡＲ－Ｔ構築物の両方との共培養の際のＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｒａｊｉ細胞株上の両方の標的抗原の発現を試験することによりモデリングされる。存在する迅速なＣＤ１９標的抗原下方調節機構は、この白血病細胞株において実証される。驚くべきことに、標的抗原下方調節は、ベクター構築物のいずれによっても標的化されていないＣＤ２２を含む非標的化Ｂ細胞受容体分子も含んだ。私たちのタンデム標的化ベクターによる標的細胞数のより迅速な減少は、より強い抗白血病免疫圧（ｉｍｍｕｎｅｐｒｅｓｓｕｒｅ）の存在を示す。特に、シングル特異性ＣＡＲが使用された場合の、白血病細胞株による免疫圧からのエスケープの動態は、遺伝的エスケープ変異体についての選択に依存する標的抗原調節または喪失の機構とは対照的に、抗原性調節が白血病細胞の既存の特性であることを示す。

材料および方法
細胞株（ＰＢＭＣおよび標的）
特記しない限り、全ての細胞株および試薬を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、急性リンパ性白血病細胞株ＲＥＨおよびＮＡＬＭ－６（ＡＣＣ－１２８ＤＳＭＺ、ＬｅｉｂｎｉｚＩｎｓｔｉｔｕｔｅＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｉｅｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ならびに慢性骨髄性白血病株Ｋ５６２を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および２ｍＭＬ－Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。ヒト胚腎臓細胞株２９３Ｔを、１０％熱不活化ＦＢＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地で増殖させた。

野生型腫瘍株にホタルルシフェラーゼ（ＬｅｎｔｉｇｅｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）をコードするレンチウイルスベクターを安定に形質導入し、その後ルシフェラーゼ陽性クローンをクローニングおよび選択することにより、ルシフェラーゼ発現細胞株のシングルセルクローンを生成した。ＮＡＬＭ６細胞株について以前に報告されているように［１０］、ホタルルシフェラーゼを安定に発現するＲａｊｉクローンをＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）に生着させ、陽性選択（ＣＤ１９マイクロビーズ、ヒト、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）または陰性選択（マウス細胞枯渇キット、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）のいずれかによりマウス脾臓から生着したＲａｊｉ－ｌｕｃ腫瘍細胞を単離し、培養で増殖させ、再クローニングしてホタルルシフェラーゼ高発現を有するクローンの選択を促進することにより、マウスに適合させたＲａｊｉ－ｌｕｃ株を生成した。

ＯｋｌａｈｏｍａＢｌｏｏｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＯＢＩ）において健康なボランティアから全血をドナーの同意書とともに収集した。処理済み軟膜を、ＯＢＩ（ＯｋｌａｈｏｍａＣｉｔｙ、ＯＫ）から購入した。ＣＤ４マイクロビーズおよびＣＤ８マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）の１：１混合物を製造業者のプロトコールに従って使用する陽性選択により、ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性ヒトＴ細胞を軟膜から精製した。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現ベクターの作出
ＣＡＲ抗原結合性ドメイン、ｓｃＦｖ、配列は、追加ファイルの節のように、ＣＤ１９についてマウスハイブリドーマＦＭＣ－６３（ＦＭＣ－６３：ＡＡ１～２６７、ＧｅｎＢａｎｋＩＤ：ＨＭ８５２９５２．１）およびＣＤ２０についてＬｅｕ－１６［１５］（ＶＬおよびＶＨの全配列）に由来した。

ＣＡＲ１９Ａ、ＣＡＲ１９ＢおよびＣＡＲ２０Ａを、各抗体のｓｃＦｖをインフレームで、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン（ＡＡ１２３～１９１、参照配列ＩＤＮＰ＿００１７５９．３）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＡＡ２１４～２５５、ＵｎｉＰｒｏｔ配列ＩＤＱ０７０１１）トランス活性化ドメインならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２４７、ＡＡ５２～１６３、参照配列ＩＤ：ＮＰ＿０００７２５．１．）に連結することにより生成した。構築物１９Ａおよび１９Ｂは、ｓｃＦｖ結合性ドメインの可変Ｈ鎖およびＬ鎖を接続する可撓性リンカーを除いては同一であり、１９ＡではＷｈｉｔｌｏｗリンカー［１１］および１９Ｂでは（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号１３）リンカーを使用した。タンデム標的化構築物、ＣＡＲ１９２０およびＣＡＲ２０１９を、同様の様式で生成した。１９Ａおよび２０ＡのｓｃＦｖ領域を、順に可撓性鎖間リンカー（ＧＧＧＧＳ）_５（配列番号１４）により連結し、その後ＣＤ８、４－１ＢＢおよびＣＤ３ゼータドメインに連結した。［１２］で報告されているように、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体アルファサブユニットからのリーダー配列を、全ての構築物に含めた。ＣＡＲ構築物配列を、コドン最適化し（ＤＮＡ２．０、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）、ヒトＥＦ－１αプロモーターの調節下で第３世代レンチウイルスプラスミド骨格（ＬｅｎｔｉｇｅｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）にクローニングした。以前に報告されているように［１３］、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによりレンチウイルスベクター（ＬＶ）を含む上清を生成した。採取、ペレット化したレンチウイルスベクターを含む上清を、－８０℃で保存した。

初代Ｔ細胞形質導入
正常なドナー由来の選択したＣＤ４＋およびＣＤ８＋ヒト初代Ｔ細胞を、密度０．３～２ｘ１０^６細胞／ｍｌで、４０ＩＵ／ｍｌＩＬ－２を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地（血清非含有）で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）試薬（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）で活性化し、３日目に１０μｇ／ｍｌ硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）存在下で一晩、ＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、４日目に培地を交換した。５日目に、２００ＩＵ／ｍｌＩＬ－２を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地に培養物を移し、１０～１３日目の採取まで繁殖させた。

免疫エフェクターアッセイ（ＣＴＬおよびサイトカイン）
細胞媒介性の細胞傷害性を決定するため（ＣＴＬアッセイ）、ホタルルシフェラーゼが安定に形質導入された標的細胞５，０００個を種々のエフェクター対標的比でＣＡＲＴ細胞と組み合わせ、一晩インキュベートした。ＳｔｅａｄｙＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）を各ウェルに添加し、生じた発光をＥｎＳｐｉｒｅプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）で分析し、秒あたりのカウントとして記録した（試料ＣＰＳ）。標的のみのウェル（最大ＣＰＳ）および１％Ｔｗｅｅｎ－２０を加えた標的のみのウェル（最小ＣＰＳ）を使用してアッセイ範囲を決定した。特異的な溶解のパーセントを（１－（試料ＣＰＳ－最小ＣＰＳ）／（最大ＣＰＳ－最小ＣＰＳ））として算出した。サイトカイン放出アッセイのために、エフェクターおよび標的細胞を比１０：１で混合し、一晩インキュベートした。ＭＡＣＳｐｌｅｘヒト１２サイトカインビーズアレイキット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して製造業者の指示に従って、分泌されたサイトカインについて採取した上清を分析した。ＣＡＲＴ処置群において、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２およびＧＭ－ＣＳＦの強い誘導が検出された。以下のサイトカインは検出することができなかった：ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１０、ＩＦＮα。ＩＬ－９は、一部の試料において低レベルで検出され、報告されなかった。全ての試料は、二重または三重で行われた。特記しない限り、示される全てのデータは、３回以上の独立実験の代表値である。

ウェスタンブロット
２００万個のＣＡＲＴ細胞を、冷ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で２回洗浄し、次いでプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤混合物（Ｔｈｅｒｍｏ－ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含有する１００μｌ冷ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で溶解した。溶解物を４℃で２０分間インキュベートし、４℃で卓上遠心分離機において１３０００ＲＰＭにて１０分間ペレット化し、上清を収集し、－２０℃で凍結した。試料を還元ローディング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で７０℃にて１０分間変性させ、ＭＯＰＳ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ－ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）中での還元条件下において製造業者のプロトコールに従って４％～１２％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで展開した。タンパク質を０．４５ミクロンニトロセルロース転写膜（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に移し、全ＣＤ３ゼータに対する抗体（クローンａｂ４０８０４、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で調査した。ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣ－ＡＭＰ試薬キット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を使用して製造業者のプロトコールに従ってバンドを現像し、Ｏｄｙｓｓｅｙ画像化システムおよびＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏｌｉｔｅソフトウェア（ＬＩ－ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）でバンドを可視化および定量した。Ｒａｊｉ腫瘍細胞について、ＣＤ１９についてのウェスタンブロットも行った。簡潔に言えば、Ｒａｊｉ細胞とＣＡＲＴ細胞との一晩のインキュベーション後、ＣＤ３磁気ビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用するＬＤカラムにより製造業者のプロトコールに従ってＣＤ３陽性細胞を枯渇させ、回復したＲａｊｉ細胞を上記のようにプロセスした。ＣＤ１９Ｃ末端（ｓｃ－６９７３５、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＣＡ）およびベータ－アクチン（８４５７、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）に対する抗体を使用して特異的バンドを検出した。ＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏソフトウェア（ＬＩ－ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ）により、バンド強度を定量した。全長ＣＤ１９およびΔエクソン２ＣＤ１９イソ型の相対的バンド強度を、シグナルＣＤ１９／シグナルβアクチンとして計算した。

フローサイトメトリー分析
特記しない限り、フローサイトメトリーのための全ての細胞染色試薬は、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃからのものであった。１００万個のＣＡＲＴ形質導入細胞を培養物から採取し、冷染色緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミンを含むＡｕｔｏＭＡＣＳ溶液）で２回洗浄し、３５０ｘｇで４℃にて５分間ペレット化した。

形質導入Ｔ細胞上のＣＡＲ表面発現を、タンパク質Ｌ－ビオチンコンジュゲート（ストック１ｍｇ／ｍｌ、１：１０００希釈、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で４℃にて３０分間染色し、その後２回洗浄し、ストレプトアビジン－ＰＥコンジュゲート（ストック：１．０ｍｌ、１：２００希釈、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、ＰＡ）で４℃にて３０分間染色することにより検出した。非形質導入細胞、およびストレプトアビジン－ＰＥのみで染色した形質導入細胞を、陰性対照として使用した。ＣＡＲＴ陽性集団のＣＤ４対ＣＤ８比を決定するために抗ＣＤ４抗体を使用し、第２のインキュベーションステップ中に添加した。７ＡＡＤ染色（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）により死滅細胞を除外した。細胞を２回洗浄し、２００μｌ染色緩衝液に再懸濁し、その後フローサイトメトリーにより定量分析を行った。

Ｆｃタグ付きＣＤ１９ペプチド（以下に説明する、１μｇ／ｍｌ）を細胞と４℃で１５分間インキュベートし、その後抗Ｆｃ－ＡＦ６４７Ｆ（ａｂ’）２断片（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：２００）と４℃で１５分間インキュベートすることにより特異的ＣＡＲＴ染色を行い、ＡＰＣチャネルにおいて検出した。ビオチニル化ＣＤ２０ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）およびストレプトアビジンＰＥ（両方とも１μｇ／ｍｌ）を細胞に同時に添加し、暗室において室温で１０分間インキュベートした。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）１０分析器（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）でフローサイトメトリー分析を行った。ＣＤ１９－ＦＩＴＣ、ＣＤ２０ＶｉｏＢｌｕｅおよびＣＤ２２－ＡＰＣ抗体を使用して、標的腫瘍株およびルシフェラーゼ陽性サブクローンの特徴付けを行った。７ＡＡＤ染色（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）により死滅細胞を分析から除外した。

Ｆｃタグ付きＣＤ１９ペプチドの生成
組換えヒトＣＤ１９ペプチドの産生のために、細胞外ドメイン（アミノ酸２０～２９１、ＵｎｉｐｒｏｔＰ１５３９１）をヒトＩｇＧ１Ｆｃ（ＣＤ１９－Ｆｃ）に融合し、ＨＥＫ２９３細胞における形質導入によりＣＭＶ駆動哺乳動物発現ベクターにおいて発現した。トランスフェクトした細胞をＤＭＥＭ、５％ＦＢＳで培養し、ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（登録商標）細胞培養容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中でのインキュベーション１０および２０日後に、ＣＤ１９－Ｆｃを含有する細胞培養上清を採取した。細胞屑を除去するための遠心分離および０．２２μｍ滅菌濾過後、タンパク質Ａクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＣＤ１９－Ｆｃを精製し、ＰＢＳ中で４℃にて保存した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色により決定されるように、純度は９７％を超えた。トリプシン消化（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）後のインタクト質量分析およびペプチドマスフィンガープリント法により、ＣＤ１９－Ｆｃの同一性が確認された。

ＣＡＲ－Ｔ活性のｉｎｖｉｖｏ分析
全ての動物研究は、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）により承認された。ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスの尾部静脈に５０万個のマウス適合Ｒａｊｉ－ｌｕｃ細胞を注射した。Ｒａｊｉ－ｌｕｃ注射後６日目に、１５０ｍｇ／ｋｇルシフェリンのｉ．ｐ．注射および１０分後のＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ－２００器具（ＣａｌｉｐｅｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、現ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）での４０秒間の画像化により腫瘍生着を測定した。ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ、第４．１版ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して画像を分析し、各マウスについての生体発光シグナル束を放射輝度平均（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）として表した。７日目に、マウスに尾部静脈注射によりＣＡＲＴ細胞を投与した。注射後４、６、１１、１４、１８、２５、３２、４６日目に画像化を行って、腫瘍増殖の動態およびＣＡＲＴ細胞による根絶を確立した。

高腫瘍負荷ｉｎｖｉｖｏ研究のために、０日目に、ＮＳＧマウスにＲａｊｉ－ルシフェラーゼ細胞をｉ．ｖ．注射した。１１日目に、腫瘍負荷に基づいてマウスを研究群に均等に分布させた。次いで研究１２日目に、タンデムＣＡＲ２０１９のＣＡＲＴ細胞調製物、または等しいＣＡＲＴ＋細胞数で混合した２つのシングルＣＡＲＴ組合せ調製物（１９Ａ＋２０Ａ、１９Ｂ＋２０Ａ）をｉ．ｖ．投与した。全てのＣＡＲＴ調製物は、全部で５ｘ１０^６のＣＡＲＴ細胞／マウスで試験された。同じドナーからの非形質導入Ｔ細胞（Ｎ．Ｔ．）および腫瘍単独群は、対照として機能した。研究１８および２５日目に、マウス全身放射輝度平均に基づいて腫瘍増殖を評価した。Ｎ＝６／群。

白血病免疫回避のｉｎｖｉｔｒｏ分析
Ｒａｊｉ腫瘍エスケープバリアントを分析するために、ＣＡＲＴおよびＲａｊｉ細胞を、ｉｎｖｉｔｒｏでエフェクター対標的比１：１にて混合した。共培養物の一晩のインキュベーション後および４日目に、フローサイトメトリーにより、生存Ｒａｊｉ細胞について、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２の表面発現を決定した。培養物を採取し、洗浄し、ＣＤ３－ＰＥ、ＣＤ１９－ＦＩＴＣ、ＣＤ２０－ＶｉｏＢｌｕｅ、ＣＤ２２－ＡＰＣ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）および７ＡＡＤに特異的な抗体で染色した。各Ｒａｊｉ：Ｔ細胞共培養物中の生存Ｒａｊｉ細胞の分析を促進するために、私たちは、ＣＤ３陰性７ＡＡＤ陰性（即ち、生Ｒａｊｉ）細胞集団についてゲーティングし、この集団を、次いでＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２の残留の表面発現について分析した。

トランズウェル共培養アッセイにおいて、それぞれ５ｘ１０^５のＣＡＲＴおよびＲａｊｉ細胞を、２４トランズウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＲＥＦ３４７０、０．４μＭ孔膜）の下部区画に、１ｍｌのＴｅｘＭＡＣＳ培地中にて播種した。２．５ｘ１０^５のＲａｊｉ細胞を、上部トランズウェル区画に、ＴｅｘＭＡＣＳ培地中にてＴ細胞の非存在下で播種した。一晩のインキュベーション後、上部および下部区画からの細胞を、上記に説明するようにフローサイトメトリーにより分析した。各群についてのＲａｊｉ細胞上のＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２の発現パーセンテージを測定した。示されるデータは、３人の異なるドナーからの、３回の独立実験からの平均値＋ＳＤを示す。統計解析は、Ｒａｊｉ単独対照に対して、一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定により行った（＊ｐ＜０．０１）。

統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７．０１ソフトウェアを使用して、統計解析を行った。ｉｎｖｉｔｒｏ死滅アッセイにおいて、反復決定についての群平均値を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてダネットの多重比較検定により比較して、個々の処置群と非形質導入対照との間の差を同定した。第１のｉｎｖｉｖｏ研究において、全ての群が生存マウスを有した最後の測定日である実験２５日目のＩＶＩＳ放射輝度データを、処置なし群に対して、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてダネットの多重比較検定により分析した。ＣＡＲＴ細胞との一晩および４日間の共培養後のＲａｊｉおよびＮＡＬＭ－６細胞におけるＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２発現の分析を、Ｎ．Ｔ．（同じドナーからの非形質導入Ｔ細胞）対照に対して、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてダネットの多重比較検定により行った。タンデムＣＡＲにおけるＣＤ２０／ＣＤ１９結合比の分析を、スチューデントｔ検定により行った。

結果
タンデムＣＤ１９およびＣＤ２０標的化ＣＡＲの有効性を研究するために、マウス抗体ＦＭＣ６３およびＬｅｕ１６からの抗原結合性ドメインをコードする配列を、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号１４）配列と連結した。この研究における全ての構築物について、連結、膜貫通およびシグナル伝達ドメインは同一であり、以前に報告されているように［１２］（図１Ａ）、それぞれ、ヒトＣＤ８由来ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７シグナル伝達ドメインならびにＣＤ３－ゼータ由来シグナル伝達ドメインをコードする。最初に公開されるように（ＧｅｎＢａｎｋＩＤＨＭ８５２９５２．１、ＡＡ１３０～１４８、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーとして公知）［１１］、ＦＭＣ６３の重鎖および軽鎖をともにｓｃＦｖ構造に連結し、一方、Ｌｅｕ１６の重鎖および軽鎖は（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１３）配列により連結した。そのうえ、単一の転写産物においてＦＭＣ６３由来およびＬｅｕ１６由来の重鎖および軽鎖配列を多ＧＧＧＧＳ（配列番号１５）配列で結合することによって、タンデムＣＡＲを作り出した。それらのシングル特異性相対物とは異なり、タンデムＣＡＲは、ＣＤ１９またはＣＤ２０のいずれかを発現する標的細胞に遭遇することにより、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性化を誘導し得る。

４０ＩＵ／ｍｌＩＬ－２中で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ナノマトリックスにより、初代ヒトＴ細胞を活性化し、３日後にＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、その後培養期間全体を通して維持された２００ＩＵ／ｍｌＩＬ－２中で増殖させた。ビオチニル化タンパク質Ｌを使用したフローサイトメトリー、続いてストレプトアビジン－ＰＥによる染色により、形質導入Ｔ細胞の表面上のＣＡＲ発現を測定した（図２Ａ）。形質導入Ｔ細胞の表面上のＣＡＲ発現は、６１％～９３％に及んだ。両方のｓｃＦｖ結合性ドメインがインタクトであることを確証するために、私たちは、また、ＣＡＲＴ細胞をＣＤ１９－Ｆｃ融合タンパク質またはビオチニル化ＣＤ２０ペプチドとともにコインキュベートした（方法を参照）。タンデム特異的構築物において、両方のドメインは、標的抗原に結合する能力を保持していた。ＣＡＲ２０１９について、タンパク質Ｌ染色は８９％発現を与え、ＣＤ１９－Ｆｃ発現は８０％であり、ＣＤ２０ペプチド発現は８５％であった。ＣＡＲ１９２０について、タンパク質Ｌ染色は８５％ＣＡＲ発現を与え、ＣＤ１９－Ｆｃ染色は８０％を生じ、ＣＤ２０ペプチドは６８％であった。３人の別々のドナーから生成されたＣＡＲＴ細胞において、この観察は再現された。

抗原結合における差を比較するために、ＣＡＲＴＣＤ２０／ＣＤ１９結合比を計算した。この比は、ＣＤ２０可溶性ペプチドで陽性染色されたタンデムＣＡＲＴ細胞のパーセンテージを、同じ試料中のＣＤ１９－Ｆｃペプチドにより陽性染色されたＣＡＲＴ細胞のパーセンテージで割ったものとして定義された。３人の別々のドナーのＴ細胞形質導入についてのＣＤ２０／ＣＤ１９結合比の平均値は、ＣＡＲ１９２０について０．７４±０．０６、およびＣＡＲ２０１９について１．０５±０．０２であった（図２Ｂ）。したがって、ＣＡＲＴ構築物２０１９において、可溶性ＣＤ１９およびＣＤ２０ペプチドの結合は同様であり、タンパク質Ｌ結合に匹敵するが、ＣＡＲ１９２０構築物におけるＣＤ２０結合は、部分的に立体障害を受け得る。

フロープロファイルが単一のより大きな転写産物によることを確証するために、ＣＡＲタンパク質の分子量を、還元条件下でのウェスタンブロットにより確証した（データは示さない）。シングル（５４ＫＤａ）およびタンデム（８１ＫＤａ）ＣＡＲについて、予測されたサイズの特異的バンドが検出された。相対的発現レベルを把握するために、内因性ＣＤ３ゼータに対するＣＡＲ関連ゼータ鎖シグナルの比を計算することにより、バンド強度を比較した。ＣＡＲ１９Ｂ単鎖ベクターにおけるＣＡＲ発現レベルを１（任意単位）に正規化すると、１９Ａ、２０Ａ、１９２０および２０１９についての発現は、それぞれ、１．８、１．５、０．９および１．２であった。したがって、タンデムＣＡＲの発現レベルは、シングルＣＡＲ発現ベクターで見られた変動性の範囲内に入る。タンデムＣＡＲを発現するＬＶを作り出すことが可能であり、また２つの機能的ｓｃＦｖを発現するＴ細胞表面上の全長ＣＡＲタンパク質の発現が今や実証されているので、タンデムＣＡＲ構築物の抗白血病活性を、次いでｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおいて評価した。

ヒト初代Ｔ細胞に、ＣＡＲ構築物（１９Ａ、１９Ｂ、２０Ａ、１９２０、２０１９、方法を参照）をコードするＬＶを形質導入し、次いでホタルルシフェラーゼが安定に形質導入されたＲａｊｉ、ＮＡＬＭ－６、ＲＥＨ、Ｋ５６２または２９３Ｔ細胞株とともに１８時間インキュベートし、発光に基づくｉｎｖｉｔｒｏ死滅アッセイを行った。試験された全ての白血病株は、それらの表面上にＣＤ１９を発現するが、陰性対照、Ｋ５６２および２９３Ｔは発現しない。ＣＤ２０発現は、腫瘍株間で変動した。Ｒａｊｉ株はＣＤ２０陽性であるが、ＲＥＨはＣＤ２０陰性であり、対照株Ｋ５６２および２９３Ｔも陰性である。ＮＡＬＭ－６株は、弱いが検出可能なＣＤ２０発現を有する。さらなる対照として、ＣＤ１９を発現するＫ５６２株（Ｋ５６２－１９＋）またはＣＤ２０を発現するＫ５６２株（Ｋ５６２－２０＋）を作り出した。

次いで、腫瘍活性化ＣＡＲＴ細胞によるサイトカイン分泌を調べた。１０：１の比でのＣＡＲ－ＴエフェクターおよびＲａｊｉ細胞株との一晩のインキュベーション後、共培養培地上清を採取し、１２種の異なるサイトカインの同時検出を可能にするＭＡＣＳＰｌｅｘサイトカイン特異的ビーズアレイにより分析した（図４）。全てのＣＡＲＴ構築物は、Ｒａｊｉ細胞とともに共培養された場合、非形質導入Ｔ細胞と比較して、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、ＩＬ－２およびＧＭ－ＣＳＦについてサイトカインレベルの増大を生じたが、陰性対照群Ｎ．Ｔ．およびＧＦＰのサイトカインレベルは検出不可能であった。特に、２０ＡＣＡＲは、一貫してＩＬ－２、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファおよびＧＭ－ＣＳＦを最も高く産生した。これは、ＣＤ４／ＣＤ８比における上下いずれかの見られる小変化が一致しないので、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の優先的増殖のためではなかった（以下の補足表１）。

補足表１について、３人の別々のドナーからのＣＡＲＴ細胞調製物におけるＣＤ４／ＣＤ８比を、フローサイトメトリーにより決定した。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を軟膜から共精製し、細胞をＩＬ－２の存在下でＴｒａｎｓＡｃｔＣＤ３ＣＤ２８試薬にて活性化し、材料および方法で説明するようにＬＶを形質導入し、免疫機能についてアッセイを行った培養１０日目にＣＤ４／ＣＤ８組成についてアッセイを行った。３人のドナーのそれぞれについてのＣＤ４／ＣＤ８細胞の比は縦列に示し、ＣＡＲＴ群は横列に示す。

両方のタンデム構築物、ＣＡＲ１９２０およびＣＡＲ２０１９は、腫瘍標的の存在下で大きさが同様、かつ非形質導入対照に対して有意な強いサイトカイン誘導を生じた。ＭＡＣＳＰｌｅｘサイトカインアレイにおいてこれらもまた調査されたサイトカインＩＦＮ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１７Ａは、私たちの試料においては有意なレベルで検出されなかった。

ＣＡＲ改変ヒトＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ活性を評価するために、０日目に、０．５ｘ１０^６Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞を、ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した。６日目に、画像化により生着した白血病の存在を確証し、マウスを実験群にランダム化した。７日目に、ＣＡＲ構築物を形質導入した１０ｘ１０^６ヒトＴ細胞をｉ．ｖ．注射し、ＩＶＩＳ画像化により疾患をモニターした。代表的な画像は、各群における疾患の進行または退行を示す（図５Ａ）。２０ＡシングルＣＡＲまたはタンデムＣＡＲ１９２０もしくは２０１９を投与した動物において、腫瘍負荷は、１１日目にピークに達し、１８日目までに処置前レベル未満まで低下した。シングルＣＡＲ１９群における腫瘍排除は、比較するとより遅かった。興味深いことに、ＳｃＦｖ重鎖および軽鎖がＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーにより接続されたＣＡＲ１９Ｂは、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーを伴うＣＡＲ１９Ａより良好に機能した（図５Ｂ）。全体的に、ＣＡＲ１９２０およびＣＡＲ２０１９タンデムＣＡＲ構築物の両方は、このモデル系において、シングルＣＡＲ１９のｉｎｖｉｖｏ活性より優れたｉｎｖｉｖｏ活性を実証した。さらに、このデータは、細胞傷害性、サイトカイン産生およびＮＳＧマウス系におけるｉｎｖｉｖｏ活性がそれぞれ重要であることを強調するが、データは、形質導入Ｔ細胞集団の生物学を理解するためにまとめて解釈されなければならない。

一連の一重および二重特異的ＣＡＲを確立したので、それらの活性をさらに活用した。特に、白血病エスケープ機構の最近の説明に照らして、ｉｎｖｉｔｒｏでのタンデムＣＡＲ構築物の相対的有効性を探索するために、私たちは、Ｒａｊｉ細胞株（ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２を発現する）およびＮＡＬＭ－６細胞株（ＣＤ１９、ＣＤ２２および低レベルのＣＤ２０を発現する）を使用して、ＣＡＲ－Ｔの強いエフェクター活性を回避する白血病細胞株の能力を探索した（図６Ａ）。ＣＡＲＴ免疫圧下での白血病細胞エスケープをモデル化するために、ＣＡＲ－Ｔを、白血病細胞とともに低いエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でコインキュベートした。Ｅ：Ｔがより高い場合、全ての白血病細胞が排除された。短期（一晩）またはより長期（４日）の共培養後、白血病細胞株の表面上の３種のＢ細胞マーカーの発現を、フローサイトメトリーにより分析した（図６Ｂ、６Ｃ）。ＣＤ２２は、私たちのＣＡＲ－Ｔ細胞により特異的に標的化されておらず、その喪失は、多抗原喪失バリアントを生成する、より全体的な免疫エスケーププログラムの開始を示し得るので、興味深いものであった。

ＲａｊｉがＣＡＲ１９－Ｔ細胞と一晩共培養された場合、ＣＤ１９抗原は、迅速に細胞表面から下方調節された（図６Ｂ、６Ｃ）。ＣＤ２０は比較的一定であり、ＣＤ２２においては、抗原陰性細胞小集団が出現し始めた。タンデム構築物２０１９がＲａｊｉと共培養された場合、ＣＤ１９は下方調節され、ＣＤ２０も中程度に下方調節され、ＣＤ２２発現も半分近くが失われた。４日目に調べた場合、全てのＢ細胞抗原が大きく低減していた（図６Ｃ）。ＣＤ１９単独の標的化（構築物１９Ａおよび１９Ｂ）は、ＣＤ１９発現に対して最も高い影響を有した。タンデム構築物２０１９は、代替的１９２０構築物より大きな影響を有し、より強い免疫圧が２０１９により媒介されたことを示した。短期共培養であるか、長期共培養であるかにかかわらず、ＣＤ２０は、免疫圧を生き延びる細胞からあまり失われることができない。シングルＣＤ２０標的化構築物２０Ａと比較して、タンデム構築物２０１９は、よりＣＤ１９エピトープ喪失を生成したが、他の標的化抗原ＣＤ２０および非標的化抗原ＣＤ２２に対して同様の組み合わさった圧を発揮するように見えた。

ＮＡＬＭ－６白血病細胞株が標的として使用された場合、ＣＤ２０標的化ＣＡＲ２０Ａが利用された場合を除いては、ＣＤ２０発現に対する影響はほとんど見られなかった（図６Ｃ）。このことは再度、白血病細胞株の表面上のＣＤ２０発現を変更することに対するより大きな抵抗を反映し得る。一晩の共培養物において、ＣＤ１９発現は、再度、高度に可塑的であり、生存細胞集団上の抗原喪失が容易に実証された。４日目に、研究に使用可能なＮＡＬＭ－６細胞はほとんどなかった。これは、間接的サイトカインおよび直接的細胞媒介死滅効果の両方に対するＮＡＬＭ－６のはるかにより大きな感受性のためのようである。特に、ＣＤ２２のみ陽性の細胞は検出されず、免疫エフェクター機構に対するこの株の全体的な感受性、即ち、非選択的細胞喪失を示した。

慢性リンパ性白血病における炎症促進性サイトカインによる腫瘍表面分子の発現調節は、以前に報告されている［３０］。図４に示されるように、ＣＡＲＴ細胞は、腫瘍細胞に曝露された場合、高レベルの炎症促進性サイトカインを産生するので、ＣＡＲＴ細胞とのコインキュベーション後のＲａｊｉ細胞上のＣＤ１９、ＣＤ２２またはＣＤ２０の下方調節は、ＣＡＲＴ－腫瘍細胞接触の直接的効果であるか、またはＣＡＲＴ細胞により培地に放出された可溶性因子のためであるかを決定することが求められた。ＲａｊｉおよびＣＡＲＴ細胞を、トランズウェルプレートの下部においてエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１で混合した。上部区画に、私たちは、Ｒａｊｉ細胞のみを入れた。一晩のインキュベーション後、トランズウェル区画からの細胞およびウェルの下部からの細胞を採取し、フローサイトメトリーにより、生Ｒａｊｉ細胞上のＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２の細胞表面発現を分析した（図７）。私たちの以前の結果と一致して、ＣＡＲＴ細胞とコインキュベートされたＲａｊｉ細胞は、ＣＡＲ１９Ａおよび１９ＢによるＣＤ１９表面発現の劇的な低減、およびＣＤ２０およびＣＤ２２のより中程度であるが有意な低減を実証した。対照的に、上部トランズウェル区画から回復されたＲａｊｉ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２の完全な発現を保存し、陰性対照群：Ｎ．Ｔ．、ＧＦＰおよびＲａｊｉ単独と区別不能であった。それゆえ、ＣＡＲＴ細胞１９Ａおよび１９ＢによるＣＤ１９Ｒａｊｉ発現の下方調節は、腫瘍：ＣＡＲＴ接触の直接的効果である。

ＣＤ１９保有腫瘍は、ＦＭＣ６３の結合性エピトープを含有するＣＤ１９細胞外ドメインの一部を除去する、エクソン２を欠くスプライスバリアントの優先的発現を通して、ＣＡＲ１９による排除を避け得ることが最近報告されている［８］。Ｒａｊｉ白血病細胞株上のＣＤ１９可塑性を探索するために、共培養実験を行った。Ｒａｊｉ細胞を、ＣＡＲＴとともに一晩共培養し、次いでフローサイトメトリーにより分析して、ＣＤ１９発現のアッセイを行った。１９Ａおよび１９Ｂ実験群の両方において、ＣＤ１９ＭＦＩの有意な低減が測定された（図８Ａ）。次いで、共培養物を枯渇させるために免疫磁気ビーズを使用し、精製Ｒａｊｉ細胞をウェスタンブロッティングにより分析した（図８Ｂ、Ｃ）。

エクソン２のスプライシングが全長ＣＡＲ１９タンパク質の発現の減少に寄与したかどうかを評価するために、以前に報告されているように［８］、ウェスタンブロット分析を行った。Ｒａｊｉ細胞は、標準培養物（Ｒａｊｉ単独群）において全長およびΔ２スプライスＣＤ１９イソ型の両方を発現した（図８Ｂ）。全長ＣＤ１９の発現とそのΔ２スプライスバリアントの発現との間の関係を定量するために、ウェスタンブロットバンドの強度を分析した（図８Ｃ）。全長ＣＤ１９イソ型の発現の減少は、私たちのフローサイトメトリーの結果と一致して、ＣＡＲ１９構築物１９Ａおよび１９Ｂで処置した群において起こった。逆に、Δ２スプライスＣＤ１９の発現は、ＣＡＲＴ処置にかかわらず、比較的安定なままであった（図８Ｃ）。ＣＡＲＴが共培養物から除去され、精製Ｒａｊｉが単独でインキュベートされた場合、全ての処置群は、４日目までに標的抗原ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２を非処置レベルで（９８％以上、示さない）再発現した。このことは、細胞表面タンパク質発現の非常に動的な調節を実証する。

シングルＣＡＲとタンデムＣＡＲとの間の腫瘍排除の差をさらに探索するために、Ｒａｊｉ腫瘍を、ＣＡＲＴ投与前に、７日目までではなく、１２日目まで増殖させる、さらなる研究を行った（図９Ａおよび９Ｂ）。１２日目の腫瘍保有マウスは、形質導入Ｔ細胞製品を投与され、シングルＣＡＲまたはタンデム２０１９ＣＡＲについてマウス１匹当たり５ｘ１０^６ＣＡＲＴ＋細胞であった。ＣＤ１９Ａ＋２０ＡまたはＣＤ１９Ｂ＋２０ＡＣＡＲの別々の形質導入を含有する、２種のＴ細胞製品を同時に共投与した。各構築物について全部で２．５ｘ１０^６ＣＡＲＴ細胞を得た（全部で５ｘ１０^６）。タンデムＣＡＲ２０１９は、死滅を伴わずに腫瘍負荷において強い低減を達成したが、組合せ処置１９Ａ＋２０Ａおよび１９Ｂ＋２０Ａは、有効であるが高度に毒性であり、各群において６匹のマウスのうちの２匹のみが２５日目まで生存した。シングルＣＡＲ１９Ａおよび１９Ｂ群について、腫瘍負荷は、比較的高いままであり、各群における６匹のマウスのうちの５匹のみが２５日目まで生存した。シングル２０Ａ群において、腫瘍は効率的に取り除かれたが、６匹のうちの２匹のマウスのみが生存した。驚くべきことに、研究は、ＣＡＲ投与の毒性を強調し、これはシングル２０Ａ群で、または２０Ａが１９Ａまたは１９ＢＣＡＲＴ細胞と混合された場合、最も大きかった。

考察
抗ＣＤ１９および抗Ｈｅｒ２ドメインの単一のタンデムＣＡＲ（著者によりＴａｎＣＡＲと呼ばれる）への連結は、二重特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の生成が可能であるという多くの研究者による理論上の提案を実施することとなった［１４］。血液悪性腫瘍の養子免疫療法のための改善されたＣＡＲを作り出そうとして、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０ベースの結合性モチーフを、単一の膜貫通糖タンパク質に連結して、一連のタンデムＣＡＲを作り出した。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、これらのＣＡＲ構築物は、ＣＤ１９またはＣＤ２０腫瘍分子いずれかの結合を介して活性化することができ、モデル白血病細胞株に対してｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの両方で有効である。標準の動物モデルは、明確な利点を示さなかったか、またはＣＡＲ構造それ自体内のＣＤ１９およびＣＤ２０ｓｃＦｖの好ましい順序を確立しなかった。それにもかかわらず、２０１９ＣＡＲ構築物は、フローサイトメトリーによりＣＤ２０ペプチド染色試薬のより良好な結合、およびｉｎｖｉｔｒｏでの一部の腫瘍細胞株の死滅の改善を示した（図２Ａ、２Ｂ、３Ａおよび３Ｂ）。さらに、一晩および４日の共培養実験における免疫圧の分析は、２０１９ＣＡＲが、標的白血病細胞株に対してより強い免疫圧を発揮し得ることを示した（図６Ａ～６Ｃおよび８Ａ～８Ｃ）。

ＣＡＲタンパク質のポリペプチド配列に関して、ＶＨおよびＶＬドメインの両方をポリグリシンリンカー（ＧＧＧＧＳ；配列番号１５）と連結すること、およびタンデムＣＡＲ構造における２つの独立したｓｃＦｖの連結の有効性が示された。ＶＨおよびＶＬ連結配列の長さ、およびそれらのアミノ酸組成は、ディアボディ形成およびｓｃＦｖドメインの適切な折り畳みを支配することが示されているので［１５］、これは重要である。私たちのデータは、（ＧＧＧＧＳ；配列番号１５）配列を使用して独立したＣＤ１９およびＣＤ２０ｓｃＦｖドメインを連結することができたＺａｈらの発見［１６］も支持する。ウェスタンブロット分析により実証されるように、ネイティブＣＤ３－ゼータ鎖バンドの強度は、ゼータ鎖のようなＴＣＲ関連転写産物の転写または翻訳が、ＬＶ系におけるＥＦ－１－アルファ駆動ＣＡＲペイロードを使用するＣＡＲ転写により圧倒または置換されないことを示す（ＳｃｈｎｅｉｄｅｒらＪｏｕｒｎａｌｆｏｒＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙｏｆＣａｎｃｅｒ（２０１７年）５巻：４２号の図３は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。

ＣＤ１９およびＣＤ２０の組換え断片の発現により生成される一連の独特なツールを使用して、ＣＡＲおよびタンデムＣＡＲベクターによりコードされるｓｃＦｖによる標的タンパク質に結合する能力の実証が達成された（図２Ａおよび２Ｂ）。以前の報告は、細胞表面ＣＡＲ発現について染色するために、カッパー軽鎖配列に結合するタンパク質Ｌを使用した［１２］。ＣＤ１９に特異的な両方のＦＭＣ６３ベースのｓｃＦｖＣＡＲ（構築物１９Ａ、１９Ｂ）について、タンパク質Ｌは十分に結合したが、元のＷｈｉｔｌｏｗリンカーはより明るいＭＦＩを有した。組換えＣＤ１９断片での染色についても、このことは当てはまったが、差はあまり大きくなかった。タンパク質Ｌおよび組換えＣＤ２０ペプチドは、Ｌｅｕ１６ベースの抗ＣＤ２０ＣＡＲ（構築物２０Ａ）について非常に類似する結果を与えた。タンデムＣＡＲにおいて、タンパク質Ｌ染色は、同等に強かった。標的ペプチドの抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ結合は、タンデムおよびシングルＣＡＲにおいて本質的に同等であったが、ＣＤ２０－ビオチンベースの染色のシグナルは、２０１９と比較して、構築物１９２０において減少し（図２Ｂ）、これは、この構築物におけるＣＤ２０への結合についての立体障害を示し得る。ＣＤ２０陰性白血病細胞株において、私たちは、ＣＡＲ２０１９タンデムベクターとは反対に、ＣＡＲ１９２０による、いくらかより低い溶解レベルを観察した。この機能の違いについての可能性のある１つの説明は、タンデムＣＡＲにおいて、ＣＤ１９バインダーは、ＣＤ１９エピトープの腫瘍細胞表面からの距離を適合させるためにＴ細胞膜の近くに位置していなければならないというものである。この考えは、細胞外スペーサーの長さが、ＣＡＲ腫瘍認識の決定において決定的であった、ＲＯＲ１ＣＡＲの例［１７］により支持される。興味深いことに、Ｔ細胞膜に近位のＣＤ１９バインダーの設置は、現在開発中の別のタンデムＣＡＲ、ＣＤ２２＿ＣＤ１９ＣＡＲの最適機能にも必要とされた（Ｗ．Ｈａｓｏ、非公開の観察）。ＣＤ２０バインダーは、適切なＶＨ対ＶＬ折り畳みが起きるためにはカルボキシ末端が繋がれていない状態にある必要があること、または１９２０構築物においては、ＣＤ２０結合部位が隣接リンカー－ＣＤ１９ドメインにより隠されてしまうことを、２０１９ＣＡＲによるより良好な抗原結合が反映し得ることが仮定される。

ｉｎｖｉｔｒｏサイトカイン放出活性も、タンデムＣＡＲ活性を実証した（図４）。しかしながら、ＣＤ２０特異的ＣＡＲ２０Ａは、Ｔｈ－１様サイトカイン：ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－アルファ、ならびにＧＭ－ＣＳＦの産生においてタンデムおよびシングルＣＤ１９ＣＡＲ構築物より優れていた。両方のタンデムＣＡＲは、サイトカイン産生において同様であり、シングル１９Ａおよび１９Ｂ構築物より大きかった。タンデムＣＡＲ構築物１９２０および２０１９により産生されたサイトカインレベルは、ＣＤ２０認識により主に駆動され、別のタンデムＣＡＲ利点を反映し得る、つまり、各バインダーからの最適特徴は、より良好な治療効果可能性のために保存された。

ｉｎｖｉｖｏで、ＣＡＲ１９Ｂは、ＣＡＲ１９Ａより良好に機能した（図５Ａおよび５Ｂ）。これは、一部には、私たちがヒトサイトカインの添加により補完しなかったＮＳＧマウスモデルにおいてＩＬ－２を産生し、したがってＴ細胞活性を維持する１９Ｂの優れた能力のためであり得る。これらのデータを一緒にすると、ＮＳＧマウス系における抗白血病ＣＡＲのｉｎｖｉｖｏ活性を予測することにおいて、サイトカイン産生は重要であることが示される。

次いで、白血病表現型を調節するＣＡＲ媒介免疫圧の能力を試験した。この目標を達成するために、ＣＴＬアッセイにおいてエフェクター対標的比５：１以上が白血病細胞を有効に排除するが、より低いエフェクター対標的比１：１が使用された場合、私たちは、生存白血病細胞をそれでも採取し、それらの表面抗原発現を分析することができることが分かった。フローサイトメトリーにより、操作者は生細胞をゲーティングし、Ｔ細胞を排除し、抗原発現を定量することができる（図６Ａ、６Ｂ）。１９Ａおよび１９ＢＣＡＲとの一晩のインキュベーション後、ＣＤ１９の強い下方調節が見られた。タンデムＣＡＲは、より少ない抗原喪失しか誘導しなかったが、残っている細胞は、はるかにより少なかった。ＣＤ２０発現の調節は減少していた。興味深いことに、一部のＣＤ２２下方調節も検出された。このことは、エスケープの抗原特異的および非抗原特異的機構の両方が、分析されたＲａｊｉ細胞集団において可能であることを示し得る。次いで、ＲａｊｉおよびＮＡＬＭ－６細胞株で、一晩および４日のＣＡＲコインキュベーションの両方を行った（図６Ｃ）。ＮＡＬＭ－６の分析は、活性化リンパ球に対するＮＡＬＭ－６のより一般的な感受性により限定された。低いＥ：Ｔ比１：１でさえも、４日目の分析のために、共培養物からのＮＡＬＭ－６白血病細胞はほとんど使用可能でなかった。一晩のインキュベーション後、ＣＤ１９発現の強い下方調節が見られ、ＣＡＲ１９Ａおよび１９ＢＬＶ形質導入Ｔ細胞は最大の効果を有した。タンデムＣＡＲおよび驚くべきことに、２０ＡＣＤ２０ＣＡＲの全ては、ＣＤ１９に対して測定可能な効果を有した（図６Ｃ）。ＣＤ２２発現が１５～２０％減少し、非標的化Ｂ細胞分化抗原も影響されることを示すことも留意される。Ｒａｊｉ細胞株を使用して、ＣＤ２０に対するＣＡＲ媒介免疫圧の効果を観察することはより容易であった。ＣＡＲ－Ｔ共培養実験において、ＣＤ２０は、表面抗原発現の喪失に関して非標的化抗原ＣＤ２２より変動性が低かった。ＮＡＬＭ－６と同様に、ＣＤ１９下方調節は迅速であり、大多数の細胞において起こった。Ｒａｊｉ細胞における４日間の免疫圧後、全ての３種のＢ細胞抗原は中程度に下方調節されたので、タンデムＣＡＲ２０１９および１９２０は、免疫圧を維持するように見えた。特に、ＣＤ１９シングル特異性ベクターで、ＣＤ１９発現は、強く下方調節されたままであった。２０ＡＣＡＲ免疫圧は、一晩および４日目の両方で、エスケープ変異体を選択するより小さい能力しか示さず、おそらく、その発現なしで済ませるか、またはその発現を変更するＲａｊｉ細胞のより小さい能力を示す。

炎症性細胞により産生される可溶性サイトカインによる腫瘍抗原表面発現の下方調節は、慢性リンパ性白血病において記録されている［３０］。次いで、トランズウェル共培養アッセイにおいて、共培養されたＣＡＲＴおよび腫瘍細胞の培地中に存在する可溶性因子が、Ｒａｊｉ細胞上のＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２の下方調節の原因であるかどうかを研究した。私たちは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞とＣＡＲＴ細胞との間の直接接触が、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２のＲａｊｉ表面発現を下方調節するために必要であることを見出した。

フローサイトメトリーにより抗体染色に関するＣＤ１９喪失の機構を調査するために、Ｔｈｏｍａｓ－Ｔｉｋｈｏｎｅｎｋｏ研究室の発見を使用して、ＣＡＲＴに曝露されたＲａｊｉ細胞におけるＣＤ１９イソ型の出現率を研究した［８］。その目標を達成するために、Ｒａｊｉ細胞をＣＡＲ－Ｔと共培養し、次いで一晩のインキュベーションの終わりにフローサイトメトリーによりそれらを分析して、ＣＤ１９発現における低減を実証した。続いて、私たちは免疫磁気ビーズを使用して、Ｔ細胞の共培養物を枯渇させた。分離されたＲａｊｉ細胞をウェスタンブロッティングにより分析した。驚くべきことに、全長ＣＤ１９イソ型の低減が、ＣＤ１９染色において観察された減少の主な原因であったこと、およびΔ２ＣＤ１９イソ型のレベルは、処置にかかわらず比較的安定なままであったことが分かった。

Ｂ細胞表面抗原発現の変動が非常に意味深かったので、私たちは、その相対的永久性を研究したいと考えた。言い換えれば、これは真の変異効果であったか、それとも表現型適応であったか。この疑問に取り組むために、ＣＡＲＴを分離したＲａｊｉ細胞を培養に戻し、次いで４日目に再度フローサイトメトリーにより分析した。全ての腫瘍集団は、完全な回復を実証し、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２発現は９８％を超えた。

腫瘍抗原エスケープは、養子細胞療法の分野が今日直面している主要な問題の１つである。ＣＡＲ１９を使用した再発性または難治性ＡＬＬの処置において達成された顕著な進歩にもかかわらず、腫瘍細胞上でＣＤ１９エピトープを下方調節することによる腫瘍エスケープが報告されており［５、１８、１９］、疾患再発のかなりの部分の原因である。特に、［２０］において概略される、ＮＨＬなどの、小児プレＢ－ＡＬＬよりも処置が困難である疾患タイプにおいて、コンビナトリアル手法が、血液悪性腫瘍における腫瘍エスケープを克服するために必要であることが明らかになっている。さらに、白血病のＣＡＲ１９処置について証明されるように、かつＰＳＣＡおよびＭＵＣ１陽性腫瘍のｉｎｖｉｖｏモデルにおいても示されたように［２１］、単一のＣＡＲＴ療法が使用された場合、不均一な標的抗原発現は、腫瘍エスケープバリアントをもたらし得る。それゆえ、単一のＣＡＲＴ療法製品で多数の腫瘍抗原を標的化することは、腫瘍抗原エスケープを軽減し得る。

Ｓｏｔｉｌｌｏおよび共同研究者ら［８］は、ＣＤ１９喪失は、変異およびＣＤ１９陰性バリアントの増殖の両方、ならびにエクソン２欠損ＣＤ１９バリアントを生じる選択的スプライシングを含む様々な機構により、ＣＡＲ１９圧下で原発性疾患ならびに白血病およびリンパ腫細胞株において起こることを実証した。最近の研究は、ＣＤ１９抗原に対する長期ＣＡＲ－Ｔ免疫圧後、腫瘍は、ＣＤ１９陰性骨髄性表現型に戻ることによっても、検出を回避し得ることを示した［２２、２３］。使用された実験モデルにおいて、ＣＤ１９ＣＡＲ構築物１９Ａおよび１９Ｂの存在下におけるＲａｊｉ白血病上のＣＤ１９下方調節は迅速であり、ＣＡＲＴとのただ一晩の共培養後に、検出されるＣＤ１９発現の顕著な喪失が起こった。ＣＤ１９発現の喪失は、ＣＡＲＴ細胞が培養物から除去された後４日以内に完全に回復した。変化の迅速さが測定されていることを考え、かつＲａｊｉ細胞が約２０時間毎に１回複製することを考慮すると、私たちのモデルにおいて実際のＣＤ１９喪失変異およびＣＤ１９陰性リンパ腫クローンの優先的増殖によるＣＤ１９下方調節は、起こりそうにない。さらに、フローサイトメトリーにより調査される減少したＣＤ１９染色と一致して、シングルＣＡＲ１９構築物１９Ａおよび１９Ｂの存在下で、Ｒａｊｉ全細胞溶解物中の全長ＣＤ１９タンパク質の量は低減されるが、エクソン２スプライスＣＤ１９の量は、使用されたＣＡＲＴのタイプにかかわらず、比較的安定なままであったことが決定された。それゆえ、ＣＤ１９エクソン２の選択的スプライシングは、全長ＣＤ１９のＣＡＲ媒介下方調節により修飾されない。

ＣＤ１９はＢ細胞共受容体であり、それは、初期および後期Ｂ細胞発達において変異、増殖および生存の正のレギュレーターとして働く［２４、２５］。ＣＤ１９は、リガンドによるその嵌合後にＢ細胞受容体とともに内部移行される。同様に、ＣＤ１９は、特異的抗体による結合後に内部移行される場合があり、これは抗体コンジュゲート（ＡＤＣ）療法において活用される事実である。Ｂ細胞表面からのＣＤ２０の内部移行も、治療用抗体リツキシマブの使用後に起こることが公知である［２６］。ＣＡＲ１９圧は、ＣＤ１９内部移行を引き起こし得ることも推測することができた。しかしながら、私たちの系において、単なるＣＤ１９の内部移行は、ウェスタンブロットにより示されるように、１９Ａおよび１９Ｂ処置後に全長ＣＤ１９タンパク質レベルが減少するという事実を説明することができなかった。したがって、ＣＤ１９タンパク質下方調節は、ＣＡＲ駆動内部移行の際に、転写もしくは翻訳レベルで、またはＣＤ１９タンパク質の分解の増大により起こるはずである。この効果は非常に動的であり、ＣＡＲ１９圧が除去された後すぐに元に戻る。

腫瘍増殖についてのＣＡＲＴ療法への曝露によるＣＤ１９発現の低減の意義は、未だ完全に解明されてはいない。機構的に言えば、ＣＤ１９は、Ｂ細胞受容体－抗原マイクロクラスター形成を促進することにより、Ｂ細胞活性化閾値を低減し、いくつかの下流のシグナル伝達経路を開始する［２７］。ＣＤ１９は典型的に、リンパ腫形成のプロモーターと考えられ、ＭＹＣ腫瘍性タンパク質による正のフィードバックループを介してＢ細胞増殖を駆動することが示されている［２８、２９］。しかしながら、ＣＤ１９は、ＣＬＬ、Ｂ－ＰＬＬ、ＳＬＶＬおよびＭＣＬを含む一部のタイプの白血病Ｂ細胞上で下方調節される［９］。それゆえ、ＣＤ１９標的化ＣＡＲＴ細胞により選択圧が適用された場合などの一部の場合、ＣＤ１９喪失が腫瘍増殖利益を与え得る可能性がある。白血病細胞で証明されたＣＤ１９の可塑性は、正常Ｂ細胞の生物学から保存されている特徴である可能性があり、これがここでは悪性腫瘍にさらなる生存利益を提供してしまう。

最後に、より高い腫瘍負荷を有するより進行した疾患環境において、タンデムＣＡＲ対シングルＣＡＲの活性を試験した。それぞれシングルＣＤ１９－ＣＡＲまたはＣＤ２０－ＣＡＲを発現する２つのＣＡＲ製品を混合して、１つのエフェクター集団にした単純化した手法も比較した（図９Ａおよび９Ｂ）。ＣＤ２０１９ＣＡＲは、腫瘍を制御することができた唯一の処置群であり、この群では全ての対象が研究２５日目まで生存した。シングルＣＡＲ１９Ａおよび１９Ｂそれら自体は、強い抗疾患効果を有さず、各群から１匹のマウスが失われた。２０ＡＣＡＲそれ自体、またはいずれかのＣＤ１９ＣＡＲとの組合せの２０ＡＣＡＲは、明らかにマウスから疾患を取り除いたが、６匹のマウスのうちの４匹は、２５日目まで生存しなかった。これは、２０ＡＣＡＲと比較して、タンデム２０１９ＣＡＲが腫瘍細胞により活性化されるより大きな可能性、およびそのより中程度のサイトカイン産生プロファイルのためであり得る（図４）。この研究において、私たちは、進行疾患による死亡またはＣＡＲ関連毒性による死亡を区別することができなかった。しかしながら、生存マウスからの疾患の完全な除去のために、２０ＡＣＡＲ関連毒性が役割を果たした可能性が疑われる。私たちは、モデル腫瘍細胞株を使用しているので、私たちの研究の全てにおいて同種抗原反応性が役割を果たし得るが、使用されるアッセイのいずれかにおけるＧＦＰまたはＮ．Ｔ．対照の活性の欠損は、それが主要な効果ではないことを実証する。

結論
本明細書で説明される研究それ自体は、ＣＡＲＴ免疫圧が持続的エスケープ変異体を生成することを証明しないが、今日までの臨床経験は、ＣＤ１９陰性再発は稀な事象ではないことを示している［８、１８、１９］。さらに、データは、ＣＤ１９抗原調節は非常に迅速な事象であること、および２つの抗原を同時に標的化することは、この問題に取り組むための合理的な手法であり得ることを実証する。高腫瘍負荷研究は、タンデムＣＡＲＴ製品に起因し得る興味深い新しい生物学を強調し、翻訳研究のための優れたＣＡＲ設計形式を示し得る。あるいは、この研究において、有効なｉｎｖｉｔｒｏ活性、特にサイトカイン産生と死滅活性との間で独特な平衡が達成されており、これは、エフェクター細胞により発現されるＣＡＲおよび全体的な疾患負荷の両方を考慮することによる最適ｉｎｖｉｖｏ活性のために確認される必要がある。

略語
ＡＡ－アミノ酸、７ＡＡＤ－７－アクチノマイシンＤ、ＡＦ－ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ、ＡＬＬ－急性リンパ芽急性白血病、ＡＮＯＶＡ－分散分析、ＡＰＣ－アロフィコシアニン、ＣＡＲＴ－キメラ抗原受容体Ｔ細胞、ＣＤ－表面抗原分類、ＣＬＬ－慢性リンパ性白血病、ＣＰＳ－カウント毎秒、ＣＴＬ－細胞傷害性Ｔリンパ球、ＥＬＩＳＡ－酵素結合免疫吸着アッセイ、ＦＢＳ－ウシ胎児血清、Ｆｃ－Ｆｃ領域（ｆｒａｇｍｅｎｔｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ）、ＦＩＴＣ－フルオレセインイソチオシアネート、ＧＦＰ－緑色蛍光タンパク質、ＧＭ－ＣＳＦ－顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＧＭＰ－優良医薬品製造基準、ＨＣＬ－有毛細胞白血病、ＨＥＫ－ヒト胚腎臓細胞、Ｈｅｒ２－ヒト上皮増殖因子受容体２、ＩＦＮγ－インターフェロンガンマ、ＩＬ－２－インターロイキン２、ＩＵ－国際単位、ＬＶ－レンチウイルスベクター、Ｌｕｃ－ホタルルシフェラーゼ、ＭＣＬ－マントル細胞リンパ腫、ＭＯＰＳ－３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸、ＮＳＧ－ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、Ｎ．Ｔ．－同じドナーからの非形質導入Ｔ細胞対照、ＯＢＩ－ＯｋｌａｈｏｍａＢｌｏｏｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＰＥ－フィコエリスリン、ＰＬＬ－前リンパ球性白血病、ＲＯＲ１－受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１、ＲＰＭ－毎分回転数、ｓｃＦｖ－単鎖可変断片、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ－ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＬＶＬ－絨毛リンパ球を伴う脾リンパ腫、Ｔ．Ａ．－腫瘍単独対照群、ＴＮＦα－腫瘍壊死因子アルファ、ＶＨ－可変重鎖ドメイン、ＶＬ－可変軽鎖ドメイン。

実施例１についての参考文献
1. Lee, D.W., et al., The future is now: chimeric antigen receptors as new targeted therapies for childhood cancer. Clinical Cancer Research, 2012. 18(10): p. 2780-2790.
2. Kochenderfer, J.N., et al., Construction and pre-clinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md.: 1997), 2009. 32(7): p. 689.
3. Jensen, M., et al., CD20 is a molecular target for scFvFc: zeta receptor redirected T cells: implications for cellular immunotherapy of CD20+ malignancy. Biology of Blood and Marrow Transplantation, 1998. 4(2): p. 75-83.
4. Lee, D.W., et al., T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. The Lancet, 2015. 385(9967): p. 517-528.
5. Grupp, S.A., et al., Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine, 2013. 368(16): p. 1509-1518.
6. Porter, D.L., et al., Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine, 2011. 365(8): p. 725-733.
7. Kochenderfer, J.N., et al., B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood, 2012. 119(12): p. 2709-2720.
8. Sotillo, E., et al., Convergence of acquired mutations and alternative splicing of CD19 enables resistance to CART-19 immunotherapy. Cancer discovery, 2015. 5(12): p. 1282-1295.
9. Ginaldi, L., et al., Levels of expression of CD19 and CD20 in chronic B cell leukaemias. Journal of clinical pathology, 1998. 51(5): p. 364-369.
10. Barrett, D.M., et al., Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood, 2011. 118(15): p. e112-e117.
11. Whitlow, M., et al., An improved linker for single-chain Fv with reduced aggregation and enhanced proteolytic stability. Protein engineering, 1993. 6(8): p. 989-995.
12. Haso, W., et al., Anti-CD22-chimeric antigen receptors targeting B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood, 2013. 121(7): p. 1165-1174.
13. Kuroda, H., et al., Simplified lentivirus vector production in protein-free media using polyethylenimine-mediated transfection. Journal of virological methods, 2009. 157(2): p. 113-121.
14. Grada, Z., et al., TanCAR: a novel bispecific chimeric antigen receptor for cancer immunotherapy. Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2013. 2(7): p. e105.
15. Wu, A.M., et al., Multimerization of a chimeric anti-CD20 single-chain Fv-Fc fusion protein is mediated through variable domain exchange. Protein engineering, 2001. 14(12): p. 1025-1033.
16. Zah, E., et al., T cells expressing CD19/CD20 bi-specific chimeric antigen receptors prevent antigen escape by malignant B cells. Cancer immunology research, 2016.
17. Hudecek, M., et al., Receptor affinity and extracellular domain modifications affect tumor recognition by ROR1-specific chimeric antigen receptor T cells. Clinical cancer research, 2013. 19(12): p. 3153-3164.
18. Grupp, S.A., et al., Durable remissions in children with relapsed/refractory aLL treated with T cells engineered with a CD19-targeted chimeric antigen receptor (CTL019). Blood, 2015. 126(23): p. 681-681.
19. Ruella, M., et al., Dual CD19 and CD123 targeting prevents antigen-loss relapses after CD19-directed immunotherapies. The Journal of Clinical Investigation, 2016. 126(10).
20. Onea, A.S. and A.R. Jazirehi, CD19 chimeric antigen receptor (CD19 CAR)-redirected adoptive T-cell immunotherapy for the treatment of relapsed or refractory B-cell Non-Hodgkin’s Lymphomas. American journal of cancer research, 2016. 6(2): p. 403.
21. Usanarat Anurathapan, R.C.C., Hakeem F Hindi, Roopa Mucharla, Pradip Bajgain, Brendan C Hayes, William E Fisher, Helen E Heslop, Cliona M Rooney, Malcolm K Brenner, Ann M Leen, and Juan F Vera,. Kinetics of Tumor Destruction by Chimeric Antigen Receptor-modified T Cells. . Molecular Therapy, 2014. 22(3): p. 623-633.
22. Jacoby, E., et al., CD19 CAR immune pressure induces B-precursor acute lymphoblastic leukaemia lineage switch exposing inherent leukaemic plasticity. Nature Communications, 2016. 7.
23. Gardner, R., et al., Acquisition of a CD19-negative myeloid phenotype allows immune escape of MLL-rearranged B-ALL from CD19 CAR-T-cell therapy. Blood, 2016. 127(20): p. 2406-2410.
24. Otero, D.C. and R.C. Rickert, CD19 function in early and late B cell development. II. CD19 facilitates the pro-B/pre-B transition. The Journal of Immunology, 2003. 171(11): p. 5921-5930.
25. Otero, D.C., A.N. Anzelon, and R.C. Rickert, CD19 function in early and late B cell development: I. Maintenance of follicular and marginal zone B cells requires CD19-dependent survival signals. The Journal of Immunology, 2003. 170(1): p. 73-83.
26. Beers, S.A., et al., Antigenic modulation limits the efficacy of anti-CD20 antibodies: implications for antibody selection. Blood, 2010. 115(25): p. 5191-5201.
27. Depoil, D., et al., CD19 is essential for B cell activation by promoting B cell receptor-antigen microcluster formation in response to membrane-bound ligand. Nature immunology, 2008. 9(1): p. 63-72.
28. Chung, E.Y., et al., CD19 is a major B cell receptor-independent activator of MYC-driven B-lymphomagenesis. The Journal of clinical investigation, 2012. 122(6): p. 2257-2266.
29. Poe, J.C., et al., A c-Myc and surface CD19 signaling amplification loop promotes B cell lymphoma development and progression in mice. The Journal of Immunology, 2012. 189(5): p. 2318-2325.
30. Vilpo J, et al., Surface membrane antigen expression changes induced in vitro by exogenous growth factors in chronic lymphocytic leukemia cells. Leukemia, 2002 (16), 1691-1698.
均等物
本文中に引用したそれぞれの出願と特許、および（訴訟中のそれぞれの交付済特許、「出願引用文書」を含めた）それぞれの出願と特許中で引用されたそれぞれの文書または参照文献、およびこれらの出願と特許のいずれかに対応するおよび／またはその優先権を主張するそれぞれのＰＣＴと外国出願または特許、およびそれぞれの出願引用文書中で引用もしくは参照されたそれぞれの文書は、ここで明確に参照により本明細書に組み込まれ、本発明を実施する際に利用することができる。より一般的には、文書または参照文献は本文中、特許請求の範囲の前の参照文献一覧中、または本文自体中のいずれかに引用され、それぞれのこれらの文書または参照文献（「本明細書中引用参照文献」）、および（任意の製造者の仕様書、説明書などを含めた）それぞれの本明細書中引用参照文献中に引用されたそれぞれの文書または参照文献は、ここで明確に参照により本明細書に組み込まれる。

一部の具体的実施形態の前述の記載によって、他者が、本発明の知識を適用することによって、一般的概念から逸脱せずに、具体的実施形態などの様々な適用例に関して容易に変更または適合させることができるのに充分な情報を与え、したがってこのような適合および変更形態は、開示した実施形態の均等物の意味および範囲内と理解すべきであり、理解することが意図されている。本明細書で利用する語句または述語は、限定の目的ではなく記載の目的であることは理解される。図面および記載中、例示的実施形態を開示しており、特異的用語が利用された可能性はあるが、他に言及しない限り、それらは限定の目的ではなく一般的および叙述的な意味でのみ使用され、したがって特許請求の範囲もそのように限定されない。さらに当業者は、本明細書で論じた方法の、ある特定ステップは別の順序で順に並べることができ、またはステップを組み合わせることができることを理解する。したがって、添付の特許請求の範囲は本明細書で開示した詳細な実施形態に限られないことが意図される。当業者は、ごく普通の実験を使用した、本明細書に記載した本発明の実施形態の多くの均等物を理解し、把握することができる。このような均等物は以下の特許請求の範囲によって包含される。

本開示の配列
以下に列挙する核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２で規定されるように、ヌクレオチド塩基用の標準的な略語、およびアミノ酸用の３文字コードを使用して示される。各核酸配列のうち一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示される鎖を参照することによって含まれるものと理解される。添付の配列表では：
配列番号１リーダー－ＣＤ１９ＶＬ－ＷｈｉｔｌｏｗリンカーＣＤ１９ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－５ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－３ＣＤ２０ＶＬＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚ（構築物ＣＡＲ１９２０）のヌクレオチド配列
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTG
ATTCCCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGC
GTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAG
AAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTG
CCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTG
GAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTT
GGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCC
GGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCC
CCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGA
GTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGT
TCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAAC
TCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTAC
TATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGG
ACCAGCGTGACCGTGTCATCCGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGT
GGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGA
GCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACC
TTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATT
GGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCC
ACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCC
GAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTC
TTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGT
GGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTG
TCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTAC
ATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCT
AACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCG
CTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCC
TTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCAACTACC
ACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTG
CGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTT
GCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCG
CTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAG
CCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCT
GAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCC
GCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAG
TACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGG
AAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTAC
TCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAG
GGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCC
CGG
配列番号２リーダー－ＣＤ１９ＶＬ－ＷｈｉｔｌｏｗリンカーＣＤ１９ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－５ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）－３ＣＤ２０ＶＬＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚ（構築物ＣＡＲ１９２０）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号３リーダー－ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）３－ＣＤ２０ＶＬ－（ＧＧＧＧＳ）５－ＣＤ１９ＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－ＣＤ１９ＶＨＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚ（構築物２０１９）のヌクレオチド配列
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTG
ATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTG
AAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAA
CAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACT
TCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACC
GCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGG
TCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTG
ACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGAC
ATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATG
ACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCG
TCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTC
AGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGAC
GCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACT
AAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCT
GGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCC
CTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCG
AAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCAC
ACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGAC
TACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAA
GGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACA
TCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAG
GAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCC
GGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTG
GAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCC
AGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTG
CAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTAC
GCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCAACTACC
ACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTG
CGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTT
GCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCG
CTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAG
CCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCT
GAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCC
GCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAG
TACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGG
AAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTAC
TCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAG
GGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCC
CGG
配列番号４リーダー－ＣＤ２０ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）３－ＣＤ２０ＶＬ－（ＧＧＧＧＳ）５－ＣＤ１９ＶＬ－Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー－ＣＤ１９ＶＨＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ｚアミノ酸配列（構築物ＣＡＲ２０１９）
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号５ＣＤ１９ＬＴＧ１４９４（ＣＡＲ１９Ａ）のヌクレオチド配列
ATGGTCATGCTTCTCCTGGTCACCTCCCTGCTCCTCTGCGAACTGCCTCACCCTGCCTTC
CTTCTGATTCCTGACACTGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCTTCCTTGTCCGCGTCA
CTGGGAGACAGAGTGACCATCTCGTGTCGCGCAAGCCAGGATATCTCCAAGTACCTGAAC
TGGTACCAACAGAAGCCCGACGGGACTGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCACGCCTG
CACAGCGGAGTGCCAAGCAGATTCTCCGGCTCCGGCTCGGGAACCGATTACTCGCTTACC
ATTAGCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGAAATACCCTG
CCCTACACCTTCGGCGGAGGAACCAAATTGGAAATCACCGGCTCCACGAGCGGCTCCGGG
AAGCCTGGTTCCGGGGAAGGCTCCACTAAGGGTGAAGTGAAGCTCCAGGAGTCCGGCCCC
GGCCTGGTGGCGCCGTCGCAATCACTCTCTGTGACCTGTACCGTGTCGGGAGTGTCCCTG
CCTGATTACGGCGTGAGCTGGATTCGGCAGCCGCCGCGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGT
GTCATCTGGGGATCCGAGACTACCTACTACAACTCGGCCCTGAAGTCCCGCCTGACTATC
ATCAAAGACAACTCGAAGTCCCAGGTCTTTCTGAAGATGAACTCCCTGCAAACTGACGAC
ACCGCCATCTATTACTGTGCTAAGCACTACTACTACGGTGGAAGCTATGCTATGGACTAC
TGGGGCCAGGGGACATCCGTGACAGTCAGCTCCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCT
CGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCT
TGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATC
TACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACC
CTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGG
CCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAG
GGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAG
GGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTG
GACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAG
GAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGG
ATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACC
GCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号６ＣＤ１９ＬＴＧ１４９４（ＣＡＲ１９Ａ）タンパク質のアミノ酸配列
MVMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDTDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLN
WYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTL
PYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSL
PDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDD
TAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEA
CRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMR
PVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVL
DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRGKGHDGLYQGLST
ATKDTYDALHMQALPPR
配列番号７ＣＤ１９ＬＴＧ１５３８（ＣＡＲ１９Ｂ）ＤＮＡのヌクレオチド配列
ATGCTTCTCCTGGTCACCTCCCTGCTCCTCTGCGAACTGCCTCACCCTGCCTTCCTTCTG
ATTCCTGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCTTCCTTGTCCGCGTCACTGGGAGACAGA
GTGACCATCTCGTGTCGCGCAAGCCAGGATATCTCCAAGTACCTGAACTGGTACCAACAG
AAGCCCGACGGGACTGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCACGCCTGCACAGCGGAGTG
CCAAGCAGATTCTCCGGCTCCGGCTCGGGAACCGATTACTCGCTTACCATTAGCAACCTC
GAGCAGGAGGACATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGAAATACCCTGCCCTACACCTTC
GGCGGAGGAACCAAATTGGAAATCACCGGCGGAGGAGGCTCCGGGGGAGGAGGTTCCGGG
GGCGGGGGTTCCGAAGTGAAGCTCCAGGAGTCCGGCCCCGGCCTGGTGGCGCCGTCGCAA
TCACTCTCTGTGACCTGTACCGTGTCGGGAGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGAGCTGG
ATTCGGCAGCCGCCGCGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGTGTCATCTGGGGATCCGAGACT
ACCTACTACAACTCGGCCCTGAAGTCCCGCCTGACTATCATCAAAGACAACTCGAAGTCC
CAGGTCTTTCTGAAGATGAACTCCCTGCAAACTGACGACACCGCCATCTATTACTGTGCT
AAGCACTACTACTACGGTGGAAGCTATGCTATGGACTACTGGGGGCAAGGCACTTCGGTG
ACTGTGTCAAGCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCA
ACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGA
GCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCC
GGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGG
AAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAA
GAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTC
AAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAAC
GAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGAC
CCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTC
CAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGG
GGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGAT
GCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号８ＣＤ１９ＬＴＧ１５３８（ＣＡＲ１９Ｂ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQ
KPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTF
GGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSW
IRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCA
KHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG
AVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQE
EDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRD
PEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD
ALHMQALPP
配列番号９ＣＤ２０ＡＬＴＧ１４９５（ＣＡＲ２０Ａ）のヌクレオチド配列
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTG
ATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTG
AAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAA
CAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACT
TCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACC
GCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGG
TCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTG
ACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGAC
ATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATG
ACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCG
TCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTC
AGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGAC
GCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACT
AAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCC
CCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGT
GGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTG
GCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGC
CGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAG
GAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGC
GTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTAC
AACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGC
GACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAA
CTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGG
AGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTAC
GATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号１０ＣＤ２０Ａ１４９５（ＣＡＲ２０Ａ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVK
QTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCAR
SNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTM
TCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAED
AATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAG
GAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQ
EEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGR
DPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY
DALHMQALPPR
配列番号１１リーダー／シグナルペプチド配列（ＬＰ）のヌクレオチド配列
atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgaactgccgcatccggcgtttctgctgattccg
配列番号１２リーダー／シグナルペプチド配列（ＬＰ）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
配列番号３５ＤＮＡＣＤ８膜貫通ドメインのヌクレオチド配列
atttgggccccgctggccggcacttgcggcgtgctcctgctgtcgctggtcatcaccctt
tactgc
配列番号３６ＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
配列番号３７ＤＮＡＣＤ８ヒンジドメインのヌクレオチド配列
actaccacccctgcccctcggccgccgactccggccccaaccatcgcaagccaacccctc
tccttgcgccccgaagcttgccgcccggccgcgggtggagccgtgcatacccgggggctg
gactttgcctgcgatatctac
配列番号３８ＣＤ８ヒンジドメインのアミノ酸配列
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
配列番号３９ＣＤ８．アルファのアミノ酸番号１３７～２０６のヒンジおよび膜貫通領域（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ．ｓｕｂ．－－００１７５９．３）のアミノ酸配列
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
配列番号４０４－１ＢＢのＤＮＡシグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列
aagaggggccggaagaagctgctttacatcttcaagcagccgttcatgcggcccgtgcag
acgactcaggaagaggacggatgctcgtgcagattccctgaggaggaagaggggggatgc
gaactg
配列番号４１４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
配列番号４２ＣＤ３－ゼータのＤＮＡシグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列
cgcgtcaagttctcacggtccgccgacgcccccgcatatcaacagggccagaatcagctc
tacaacgagctgaacctgggaaggagagaggagtacgacgtgctggacaagcgacgcgga
cgcgacccggagatgggggggaaaccacggcggaaaaaccctcaggaaggactgtacaac
gaactccagaaagacaagatggcggaagcctactcagaaatcgggatgaagggagagcgg
aggaggggaaagggtcacgacgggctgtaccagggactgagcaccgccactaaggatacc
tacgatgccttgcatatgcaagcactcccaccccgg
配列番号４３ＣＤ３ゼータのアミノ酸配列
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
配列番号４４ＳｃＦｖＣＤ１９（ＦＭＣ６３）のヌクレオチド配列
gacattcagatgactcagaccacctcttccttgtccgcgtcactgggagacagagtgaccat
ctcgtgtcgcgcaagccaggatatctccaagtacctgaactggtaccaacagaagcccga
cgggactgtgaagctgctgatctaccacacctcacgcctgcacagcggagtgccaagcag
attctccggctccggctcgggaaccgattactcgcttaccattagcaacctcgagcagga
ggacatcgctacctacttctgccagcaaggaaataccctgccctacaccttcggcggagg
aaccaaattggaaatcaccggcggaggaggctccgggggaggaggttccgggggcggggg
ttccgaagtgaagctccaggagtccggccccggcctggtggcgccgtcgcaatcactctc
tgtgacctgtaccgtgtcgggagtgtccctgcctgattacggcgtgagctggattcggca
gccgccgcggaagggcctggaatggctgggtgtcatctggggatccgagactacctacta
caactcggccctgaagtcccgcctgactatcatcaaagacaactcgaagtcccaggtctt
tctgaagatgaactccctgcaaactgacgacaccgccatctattactgtgctaagcacta
ctactacggtggaagctatgctatggactactgggggcaaggcacttcggtgactgtgtc
aagc
配列番号４５ＳｃＦｖＣＤ１９（ＦＭＶ６３）のアミノ酸配列
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser Gl yGly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
配列番号４６抗ＣＤ３３ＣＡＲ（ＬＴＧ１９３６）のヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGCAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAGGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATTCAGTTTTCCCACCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACTAGTTGGAGATGGCTACAATACGGGGGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGTGGCGGTAGCGGTGGTGGCGGATCCGATATTGTGATGACCCACACTCCACTCTCTCTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAAGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGAAAGACCTATTTGTATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGCCTCCACAGCTCCTGATCTATGGAGCTTCCAACCGGTTCTCTGGAGTGCCAGACAGGTTCAGTGGCAGCGGGTCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCCGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAAGTATACAGCTTCCTATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４７抗ＣＤ３３ＣＡＲ（ＬＴＧ１９３６）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGFSFPTYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLVGDGYNTGAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTHTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSNGKTYLYWYLQKPGQPPQLLIYGASNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSIQLPITFGQGTRLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
配列番号４８抗メソセリンＣＡＲ（ＬＴＧ１９０４）のヌクレオチド配列
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATTTATCGTCAGTGGCTGGACCCTTTAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCTGGTATTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCGGTGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４９抗メソセリンＣＡＲ（ＬＴＧ１９０４）のアミノ酸配列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDLSSVAGPFNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHLVFGGGTQLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

Claims

リンパ腫を治療するための医薬を製造するためのＴ細胞の集団の使用であって、Ｔ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、ここにおいてＣＡＲは、配列番号２または４のアミノ酸配列を含むＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメインを含む少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサードメイン、少なくとも１つの共刺激ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここにおいて核酸配列はＥＦ－１アルファプロモーターに作動可能に連結され、配列番号１または３を含むか、または、それに対して８５％の同一性を有する配列を含み、ここにおいてＴ細胞は、がん患者のＴ細胞であり、ここにおいて投与がリンパ腫を治療する、使用。
少なくとも１つの膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、Ｔ細胞受容体のベータ鎖もしくはＴ細胞受容体のゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、およびＴＮＦＲＳＦ１９からなる群から選択されたタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の使用。
少なくとも１つのＣＤ１９／ＣＤ２０抗原結合性ドメイン、前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサードメインによって膜貫通ドメインに接続されている、請求項１に記載の使用。
少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、請求項１に記載の使用。
少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、追加的な共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の使用。
少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択された少なくとも１つの機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項５に記載の使用。
前記リンパ腫が、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫である、請求項１に記載の使用。