CN109929807A - 一种靶向血液肿瘤的双嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种靶向血液肿瘤的双嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，涉及生物技术领域。该靶向血液肿瘤的双嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其构建步骤为：采集50ml人外周血,使用淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞（PBMC）；在抗体和因子作用下，得到大量增殖性T细胞，提取PBMC中总RNA，逆转录为PCR反应的模板cDNA，将编码上述嵌合抗原的核苷酸片段插入pLVX‑IRES‑Neo载体中，获得重组嵌合抗原受体表达质粒。该靶向血液肿瘤的双嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，通过设置嵌合抗原受体修饰的T细胞与Raji细胞效靶比为5:1，从而达到了使T细胞对Raji细胞的杀伤性最高的目的，通过使用双靶向CD19和CD22分子的嵌合抗原受体，从而解决了患者出现了肿瘤复发现象的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，具体为一种靶向血液肿瘤的双嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。
背景技术
肿瘤一直以来都是严重危害人类健康的重大疾病，因此，寻找有效的肿瘤治疗方法，成为医学界的重大攻关课题，1986年，免疫细胞疗法成为继手术、放疗和化疗之后的肿瘤治疗的第四大模式，目前，免疫肿瘤疗法已取得重大进展，而免疫疗法中效果最显著的疗法是基于嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T疗法），CAR-T，全称是Chimeric AntigenReceptor T-Cell Immunotherapy，指的是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，该疗法已出现多年，但是近几年才被改良用于临床上的新型肿瘤治疗，现已在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一，目前，CAR-T技术已发展到第三代，CAR-T技术的CAR分子由胞外抗原结合区、跨膜区和胞内区组成，胞外抗原结合区由信号肽和靶抗原的单链抗体（scFV）片段组成，这三代的分子组成区别主要在于胞内区，第一代只有一个胞内信号组分，第二代胞内区由一个共刺激分子(主要为CD28或CD137分子)和信号传导区（CD3ζ）组成，第三代胞内区则由两个共刺激分子和信号传导区组成，研究发现第三代的CAR分子极大提高了CAR-T细胞的增殖能力和杀伤肿瘤细胞能力，目前临床应用中第二代最为常见，医学诊断表明，某些血液肿瘤中的部分肿瘤细胞并不表达CD19分子,经过检测其表达CD22分子，仅向患者体内输注靶向CD19分子的CAR-T细胞治疗效果不佳，一段时间后有些患者出现了肿瘤复发现象，因此，很有必要开发出双靶向CD19和CD22分子的嵌合抗原受体，从而给予CD19和CD22分子均表达血液肿瘤患者带来益处。
发明内容
本发明是提供一种血液肿瘤的双靶向嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，提高CAR-T的治疗效果的靶向血液肿瘤的双嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。
技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种靶向血液肿瘤的双嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其构建步骤为：
1）人外周血PBMC的分离
采集50ml人外周血,使用淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞（PBMC）；在抗体和因子作用下，得到大量增殖性T细胞，提取PBMC中总RNA，逆转录为PCR反应的模板cDNA。
2）构建重组质粒
将编码上述嵌合抗原的核苷酸片段插入pLVX-IRES-Neo载体中，获得重组嵌合抗原受体表达质粒，重组质粒测序。
3）提取重组质粒
将步骤2）所得的重组质粒使用去内毒素质粒提取试剂盒提取重组质粒，提取后进行酶切鉴定和送往公司测序再次进行验证。
4）慢病毒制备和浓缩：
将步骤3）提取的重组质粒和病毒包装质粒共转染293T细胞，取病毒上清浓缩并测定病毒滴度。
5）双靶点修饰性T细胞的获得
使用步骤4）制备的浓缩慢病毒感染T细胞，进而获得修饰性T细胞。
进一步的，所述CAR-T细胞，旨在表达抗人CD19和抗人CD22的单链抗体，该抗体识别并靶向结合B细胞和B肿瘤细胞表面表达的CD19分子和CD22分子。
进一步的，所述具体操作方法如下：
复苏293T细胞，进行消化传代，接种293T细胞1天后,将重组质粒和病毒包装质粒共转染进入293T细胞，转染后48h、72h收集病毒液，离心去取上清用于病毒浓缩和病毒滴度测定。
本发明提供了一种靶向血液肿瘤的双嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。具备以下有益效果：
该靶向血液肿瘤的双嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，通过设置嵌合抗原受体修饰的T细胞与Raji细胞效靶比为5:1，从而达到了使T细胞对Raji细胞的杀伤性最高的目的，通过使用双靶向CD19和CD22分子的嵌合抗原受体，从而解决了患者出现了肿瘤复发现象的问题。
具体实施方式
本发明实施例提供一种靶向血液肿瘤的双嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，
实施例1：人外周血单个核细胞（PBMC）分离与T细胞扩增
1.1人外周血PBMC的分离
（1）采集供者外周血50ml，800g，离心10min，离心后可观察到分层现象，上层为血浆层，中间层为白膜层，最下端为红细胞层。
（2）用吸液管缓慢收集血浆层，56℃灭活30min。
（3）淋巴细胞分离液分离白膜层：使用吸管小心抽吸白膜层细胞，加入PBS中，两者完全混匀；将淋巴分离液的加入15ml离心管中，再等体积加入PBS混合液，700g，离心15min。
（4）洗涤PBMC：离心后小心抽吸离心管中间的白膜层细胞，加入PBS混匀清洗一次，离心后，弃PBS；再加入培养基重悬，再次清洗细胞。
（5）弃去培养基，加入新的培养基重悬PBMC细胞。
1.2 T细胞激活与扩增
（1）PBMC分离：将步骤1.1最终分离的PBMC全部加入T175cm2培养瓶，移入CO2培养箱中。
（2）2h后取出培养瓶，轻轻晃动，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜，移液器吸取细胞悬浮液转入新的培养瓶中，少许培养基清洗培养瓶将悬浮细胞全部收集。
（3）向新的培养瓶中加CD3/CD28磁珠，并加入IL-2 （100 U/ml）,混匀后移入培养箱中。
（4）第5日去磁珠，定期补液，取激活的T细胞，使用抗体CD4+和CD8+ 单克隆抗体染色，流式细胞仪上机鉴定激活的T细胞的分型。
1.3 RT-PCR获得PBMC中cDNA
（1）Trizol提取PBMC中总RNA:取1-2x106个PBMC细胞，加入1mlTrizol试剂，使用上海生工生物工程股份有限公司的Q-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒抽提PBMC中的总RNA。
（2)反转录RNA获得cDNA :使用上海生工生物工程股份有限公司的AMV 第一链cDNA 合成试剂盒中Oligo dT Primer反转录RNA。反转录体系如下：
| 逆转录反应体系 | 20μl |
| RNA样品 | 3μl |
| Oligo-dT primers | 1μl |
| RNase free ddH20 | 8μl |
| 5×RT Buffer | 4μl |
| RNase Inhibitor (40U/μl) | 1μl |
| dNTPs(10mM) | 2μl |
| AMV Reverse Transcriptase | 2μl |
反转录程序如下：
| cDNA 合成 | 42℃ 60 min |
| 终止反应 | 85℃ 5 min（酶失活）处理后，冰上放置或-20℃保存 |
实施例2: 嵌合抗原CAR19-CAR22重组载体的构建
2.1 抗CD19和CD22单链抗体（scFV）基因序列的获得
CD19和CD22蛋白免疫小鼠后纯化得到其抗体片段，对其进行氨基酸测序，之后进行密码子优化，得到其核苷酸序列，修饰并构建为抗CD19和抗CD22的单链抗体，分别命名为CD19-scFV和CD22-scFV；两单链抗体均由重链和轻链组成，重链与轻链之间的连接片段是GGGGSGGGGSGGGGS (3G4S)。本专利，双靶点CAR-T构建需要使用(G4S)5 linker片段将两个单链抗体连接起来，标记为CD19-scFV-(G4S)5-CD22-scFV，将修饰后的单链抗体送往上海生工生物工程股份有限公司合成。
2.2 PCR扩增CD8a信号肽、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、41BBL和CD3ζ
（1）设计引物：使用Primer 5.0软件，设计PCR扩增所需的上下游引物，引物送往上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列见下表：
（2）PCR反应体系(50μl)
| PCR反应试剂 | 体积 |
| 模板cDNA | 2μl |
| 上游引物（F Primer 10μm） | 1μl |
| 下游引物（R Primer 10μm） | 1μl |
| 10 × PCR buffer | 5μl |
| dNTP mix(25mM) | 8μl |
| LA Taq(5U/μl) | 0.5μl |
| ddH2O | 32.5μl |
（3）PCR扩增程序
首先设置PCR仪盖温为95℃。PCR扩增程序为：94℃预变性3min; 94℃变性30s；56℃退火30s; 72℃ 2min；第2步到第4步重复32Cycles ;72℃再延伸8min；4℃保温30min。反应体系完全混匀后，开始进行目的片段的扩增。
（4）PCR产物鉴定、纯化和测序
PCR扩增程序完成后，将PCR产物加入加样孔中，进行1%琼脂糖电泳鉴定。胶回收试剂盒回收与目的片段一致的PCR产物,并送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序；与目的片段序列一致的PCR产物，将用于嵌合抗原受体基因序列的连接反应。
2.3 CD8a-hCD19scFV-linker-hCD22 scFV-CD8aH-CD8aTM-41BBL -CD3ζ基因序列的连接
（1）序列比对
从GenBank(NCBI)数据库中搜索到人CD8a信号肽基因、人CD8a铰链区和跨膜区基因、人CD137(4-1BBL)胞内区基因、以及人CD3ζ胞内区基因序列。将PCR扩增的片段测序结果与数据库序列进行Blast比对，两者核苷酸序列完全一致。
（2）重叠延伸PCR技术扩增CD8a信号肽- hCD19scFV-linker-hCD22 scFV
扩增体系中加入CD8a信号肽上游引物和双靶点scFV的下游引物，以CD8a信号肽和双靶点PCR纯化片段为模板，扩增体系和扩增程序参照步骤2.2。将PCR扩增产物纯化并送往公司测序获得CD8a信号肽- hCD19scFV–linker -hCD22 scFV。
（3）重叠延伸PCR技术扩增CD8aHM–CD8aTM-41BBL-CD3ζ：扩增方法参照步骤2.2。
（4）重叠延伸PCR技术扩增双靶点序列
向扩增体系中加入CD8a信号肽上游引物和CD3ζ下游引物，以CD8a信号肽- hCD19scFV-linker-hCD22 scFV和CD8aHM–CD8aTM-41BBL-CD3ζPCR纯化片段为模板，扩增方法参照步骤2.2，最终得到双靶点嵌合抗原受体。
2.4双靶点嵌合抗原重组载体的构建
在CD8a信号肽上游引物头端依次加入EcoRI酶切位点（GAATTC）、KozaK序列(GCCACC)；在CD3ζ末端加入BamHI限制性酶切位点(GGATCC)。分别用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切空载pLVX-IRES-Neo和CD8a-hCD19scFV-linker- hCD22 scFV -CD8aHM–CD8aTM-41BBL-CD3ζPCR扩增片段，使用胶回收试剂盒纯化酶切片段。再通过T4-DNA连接酶作用，完成双靶点重组载体的构建。
实施例3:重组质粒的提取与测序
（1）转化：分别高压LB液体培养基、LB固体培养基、三蒸水和50%甘油，超净台中制备无抗性LB平板和Amp抗性的LB平板。转化空载质粒和重组质粒。
（2）第2日观察平板上单克隆菌落生长情况，若生长良好表明转化成功。挑取转化的单克隆菌落，接种于5ml含有Amp的LB液体培养基中。37℃下200rpm振荡培养过夜。
（3）菌液培养14-16h后，停止摇菌。使用北京天根生物无内毒素质粒中提试剂盒抽提质粒；此后对抽提的质粒进行1%琼脂糖电泳，观察质粒抽提效果。完好的质粒电泳应呈现出三条带。
（4）质粒酶切：限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切重组质粒2h，将酶切混合液进行1%琼脂糖电泳，观察质粒酶切结果。由电泳图可判定质粒双酶切后形成两条带，两条带的片段大小与目的片段大小一致。将酶切成功的质粒送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果与目的片段的核苷酸序列完全一致，测序成功的质粒将用于包装慢病毒。
实施例4 :慢病毒包装、滴度测定及浓缩
4.1 293T细胞复苏与传代
（1）从液氮中取出细胞，立即置于37℃水浴中，边晃动边观察细胞溶解状况。全部溶解后，对冻存管表面喷洒酒精，擦拭酒精后迅速移入超净工作台。
（2）将1ml冻存液移入已加有预热的9ml培养基离心管中，两者轻轻混匀；混匀后100g，离心5min。
（3）弃上清，加入5ml完全培养基，混匀吹打成单细胞状态，之后将其移入TC处理的25cm2培养瓶中。
（4）第2日，镜下观察复苏后的细胞状态，并弃去原液，更换为新的完全培养基。
4.2. 293T细胞传代与冻存
（1）传代：细胞融合度至80%-90%时，37℃下胰酶消化细胞。弃胰酶，加入4ml培养基终止消化，再加入6ml预热的PBS充分吹打细胞；此后将细胞液移入15ml离心管中，100g，离心5min。
（2）弃上清，加入完全培养基混匀后，计数并分瓶。
（3）再次传代后，离心弃上清，可加入细胞冻存液进行细胞冻存。剩余的细胞将用于包装慢病毒。
4.3 慢病毒包装、滴度测定及浓缩
（1）T100B包被100mm2平皿，常温孵育2-4h。胰酶消化293T细胞，用无抗生素的完全培养基吹打细胞，并计数，每个平皿接种 4x106个细胞。
（2）包装病毒：第2日，待细胞密度达到80%-90%，细胞状态良好，可进行病毒包装。分别将对照质粒和重组质粒转染混合液小心加入平皿中，37℃培养6h，更换为无抗生素的完全培养基。
（3）分别于换液后24h、48h和72h收集病毒液。
（4）病毒滴度测定：收集病毒液离心，弃沉淀，取上清进行滴度测定。
（5）病毒浓缩：取病毒液离心后所得上清进行浓缩，病毒浓缩倍数约为20倍。浓缩液等量分装于-80℃保存。
实施例5: 慢病毒感染T细胞
（1）PBMC分离步骤同1.2.
（2）2h后取出培养瓶，轻轻晃动，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜，移液器吸取细胞悬浮液转入新的培养瓶中，少许培养基清洗培养瓶将悬浮细胞全部收集。
（3）向新的培养瓶中加CD3/CD28磁珠，并加入IL-2 （100 U/ml）,混匀后移入培养箱中。
（4）次日，调整细胞密度至0.5x106个/ml，加入病毒液（MOI=3），polybrene终浓度8ug/ml，混匀后，2000rpm离心1h。离心后重悬混合液，移入培养袋中。每隔两天进行补液，IL-2维持浓度为100U/ml。
（5）第5日去磁珠，定期补液并观察细胞状态。
（6）第7日取病毒感染的细胞进行流式细胞仪检测CAR分子表达情况、并对细胞进行内毒素、细菌和支原体的检测。
（7）第9日，取T淋巴细胞与Raji细胞共培养，检测CAR-T细胞对Raji细胞的杀瘤效果。
实施例6: 修饰性T细胞表面CAR分子的表达效率检测
（1）取0.5-1 x106个病毒感染96h的细胞，400g，离心5min，去上清；再加入PBS溶液，轻柔混匀后再次离心去上清。
（2）加入100ul PBS溶液，轻柔悬浮细胞沉淀，加入2ul抗体Goat F(ab')2 Anti-Mouse IgG (Fab’)2 (FITC)，4度避光孵育1h。
（3）1000rpm，离心5min ，去上清；再加入1ml PBS溶液，再次离心去上清。
（4）加入100ul PBS溶液，轻柔悬浮细胞。流式细胞仪上机检测T细胞表面CAR分子的表达效率。
实施例7: 流式检定CAR-T细胞对Raji细胞体外杀伤检测
慢病毒感染一周后，取感染的T细胞与B淋巴细胞瘤细胞系Raji(CD19阳性表达)体外共培养。24孔板中，每孔取0.2x106个T细胞，T细胞与B细胞瘤细胞系Raji三种效靶比（E:T=5：1；1:1；1:2）。每组均设实验组和对照组，实验组为双靶点CAR-T细胞，对照组为空载体病毒感染的T细胞。分别于共培养24h，36h和48h后收集细胞进行流式鉴定靶细胞比例的变化（CD19抗体鉴定），从而判定T淋巴细胞的杀伤作用。
实施例8: CytoTox 96非放射性细胞毒性法检测CAR-T细胞对Raji细胞的杀伤活性：
杀伤实验进行之前，先进行靶细胞数目的优化。将Raji细胞加入96孔板中，经过乳酸脱氢酶活性测定，将靶细胞数目确定为1 x 104个/孔。随后分别将对照组和双靶标组CAR-T细胞与Raji以1：1，2.5：1，5：1进行共培养，200g离心平板4min，将平板移入37℃恒温箱中进行共培养；分别设置对照组和双靶标CAR-T细胞的自发释放孔，即只加入效应细胞。同时设置培养基背景对照组，体积校正对照组，靶细胞最大释放组，效应细胞自发释放组。每孔总体积为110ul。培养6h后，200g离心平板4min，每孔取出50ul，移入新的96孔板中，按照说明书步骤加入反应底物，常温孵育半小时后，加入终止液并轻柔混匀，避免气泡的产生。迅速将平板放入酶标仪中，于450nm下测定吸光值，进而统计得到实验组的靶细胞杀伤值。
本发明通过筛选，获得携带双靶点嵌合抗原受体序列，该嵌合抗原受体序列经过密码子优化，插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-Neo（空载）中，包装的慢病毒加入浓缩试剂进行浓缩，获得可达1x108IU/ml高滴度的慢病毒，T细胞铺板48小时后，加入慢病毒感染，获得修饰性的T细胞，利用流式细胞术，检测嵌合抗原受体的表达效率，并将构建成功的修饰性T细胞与B细胞系来源的Raji肿瘤细胞共培养，前者对Raji细胞具有显著的杀伤性，由此可见，构建的嵌合抗原受体修饰的T细胞，用于治疗携带CD19和CD22的血液恶性肿瘤。
Claims (3)
1.一种靶向血液肿瘤的双嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于：包括以下步骤：
1）人外周血PBMC的分离
采集50ml人外周血,使用淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞（PBMC）；在抗体和因子作用下，得到大量增殖性T细胞，提取PBMC中总RNA，逆转录为PCR反应的模板cDNA。
2）构建重组质粒
将编码上述嵌合抗原的核苷酸片段插入pLVX-IRES-Neo载体中，获得重组嵌合抗原受体表达质粒，重组质粒测序。
3）提取重组质粒
将步骤2）所得的重组质粒使用去内毒素质粒提取试剂盒提取重组质粒，提取后进行酶切鉴定和送往公司测序再次进行验证。
4）慢病毒制备和浓缩：
将步骤3）提取的重组质粒和病毒包装质粒共转染293T细胞，取病毒上清浓缩并测定病毒滴度。
5）双靶点修饰性T细胞的获得
使用步骤4）制备的慢病毒感染T细胞，获得双靶标修饰性T细胞。
2.根据权利要求1所述的一种靶向血液肿瘤的双嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于：所述CAR-T细胞，旨在表达抗人CD19和抗人CD22的单链抗体，该抗体识别并靶向结合B细胞和B肿瘤细胞表面表达的CD19分子和CD22分子。
3.根据权利要求1所述的一种靶向血液肿瘤的双嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于：所述具体操作方法如下：
复苏293T细胞，进行消化传代，接种293T细胞1天后,将重组质粒和病毒包装质粒共转染进入293T细胞，转染后48h、72h收集病毒液，离心去取上清用于病毒浓缩和病毒滴度测定。
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