CN114080452A

CN114080452A - 具有4-1bb共刺激结构域的嵌合抗原受体

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Publication number: CN114080452A
Application number: CN202080047355.XA
Authority: CN
Inventors: 权炳世; 金光熙; 郑智元; 张荣均; 李保林; 李汀胤; S·R·李; 孙贤台; 李惠美; E·H·柳
Original assignee: Eutilex Co Ltd
Current assignee: Eutilex Co Ltd
Priority date: 2019-06-27
Filing date: 2020-06-26
Publication date: 2022-02-22
Also published as: KR20220030248A; CA3144875A1; EP3990626A1; JP2022538425A; BR112021026406A2; EP3990626A4; MX2021015967A; WO2020261231A1; AU2020307673A1

Abstract

提供了涉及CAR的CAR‑T组合物，所述CAR包含：(i)胞外结构域，所述胞外结构域包括抗原结合结构域；(ii)跨膜结构域；以及(iii)胞内结构域，所述胞内结构域包括共刺激内结构域，其中所述共刺激内结构域包括来自4‑1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸。本公开还提供了载体、组合物以及使用抗原结合分子和包括CAR的工程化免疫细胞的治疗方法。本文提供的CAR组合物可以用于治疗某些癌症。

Description

具有4-1BB共刺激结构域的嵌合抗原受体

相关申请的交叉引用

本申请是要求以下的优先权和权益的PCT申请：于2019年6月27日提交的美国申请62/867,503；于2019年8月12日提交的国际申请PCT/KR2019/010244；于2019年12月16日提交的美国申请16/715,462；于2020年3月18日提交的美国申请62/991,493；于2020年4月3日提交的美国申请63/004,827；于2020年6月24日提交的美国申请63/043,237，所述申请中的每个申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

背景技术

癌症仍然是世界上死亡的主要原因之一。最近的统计报告世界人口的13％死于癌症。根据国际癌症研究机构(IARC)的估计，在2012年，世界范围内有1410万例新癌症病例和820万例癌症死亡。到2030年，由于人口增长和老龄化以及暴露于如吸烟、不健康饮食和身体活动不足等风险因素，预计全球负担将增长到2170万例新癌症病例和1300万例癌症死亡。进一步地，疼痛以及癌症治疗的医疗费用使癌症患者和其家人两者的生活质量下降。

用嵌合抗原受体(CAR-T)工程化的T细胞在治疗如癌症等疾病方面具有极大的治疗潜力。CAR-T治疗赋予T细胞强大的靶亲和力和信号传导功能。然而，CAR-T疗法令人印象深刻的功效经常伴随着严重的副作用，如细胞因子释放综合征(CRS)。因此，仍然存在对于开发具有减少的副作用的CAR-T治疗和策略的未满足的需要。

发明内容

本文提供了免疫细胞，所述免疫细胞包括嵌合抗原受体(CAR)，其中所述(CAR)包括：(a)胞外结构域，所述胞外结构域包括抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域，所述胞内结构域包括共刺激内结构域，其中所述共刺激内结构域包括来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸。

在一些实施例中，所述嵌合抗原受体是单个多肽。在一些实施例中，所述嵌合抗原受体包含两个多肽。

在一些实施例中，所述共刺激内结构域包括来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸，其中所述五个另外的氨基酸由SEQ ID NO:1编码。在一些实施例中，所述共刺激内结构域包括SEQ ID NO:2。

在一些实施例中，所述抗原结合结构域是人源化的。在一些实施例中，所述抗原结合结构域是人的。在一些实施例中，所述抗原结合结构域是scFv。在一些实施例中，所述抗原结合结构域特异性结合与疾病相关的抗原。在一些实施例中，所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。在一些实施例中，所述抗原结合结构域特异性结合选自由以下组成的组的抗原：磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、恶性肿瘤变异受体(MVR)和CD19。

在一些实施例中，所述跨膜结构域是从选自由以下组成的组的蛋白质中选择的跨膜结构域：4-1BB/CD137、活化的NK细胞受体、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8、CD8α、CD8β、CD96(触觉的)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、与CD83特异性结合的配体、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1)、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1和VLA-6。在一些实施例中，所述跨膜结构域是来自CD8α的跨膜结构域。在一些实施例中，所述胞内结构域进一步包括来自CD3ζ的胞内结构域。

在一些实施例中，所述嵌合抗原受体进一步包括信号肽或前导序列。在一些实施例中，所述嵌合抗原受体进一步包括铰链区。在一些实施例中，所述铰链区是CD8α铰链。在一些实施例中，所述嵌合抗原受体进一步包括另外的抗原结合结构域。在一些实施例中，所述另外的抗原结合结构域是scFv。

在一些实施例中，所述免疫细胞是人免疫细胞。在一些实施例中，所述人免疫细胞是自体人免疫细胞。在一些实施例中，所述人免疫细胞是同种异体人免疫细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞是NK细胞。

本文提供了核酸，所述核酸对嵌合抗原受体(CAR)进行编码，其中所述嵌合抗原受体包括：(a)胞外结构域，所述胞外结构域包括抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域，所述胞内结构域包括共刺激内结构域，其中所述共刺激内结构域包括来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸。

在一些实施例中，所述共刺激内结构域包括来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸，其中所述五个另外的氨基酸由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述共刺激内结构域包括SEQ ID NO:2。

在一些实施例中，所述抗原结合结构域是人源化的。在一些实施例中，所述抗原结合结构域是人的。在一些实施例中，所述抗原结合结构域是scFv。在一些实施例中，所述抗原结合结构域特异性结合与疾病相关的抗原。在一些实施例中，所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。在一些实施例中，所述抗原结合结构域特异性结合选自由以下组成的组的抗原：聚糖-3(GPC3)、恶性肿瘤变异受体(MVR)和CD19。

在一些实施例中，所述跨膜结构域是从选自由以下组成的组的蛋白质中选择的跨膜结构域：4-1BB/CD137、活化的NK细胞受体、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8、CD8α、CD8β、CD96(触觉的)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、与CD83特异性结合的配体、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1)、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1和VLA-6。在一些实施例中，所述跨膜结构域是来自CD8α的跨膜结构域。

在一些实施例中，所述胞内结构域进一步包括来自CD3ζ的胞内结构域。在一些实施例中，所述嵌合抗原受体进一步包括信号肽或前导序列。在一些实施例中，所述嵌合抗原受体进一步包括铰链区。在一些实施例中，所述铰链区是CD8α铰链。

本文提供了载体，所述载体包括本文所描述的核酸中的任何一种核酸。在一些实施例中，所述载体进一步包括与核酸可操作地连接的启动子。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是诱导型启动子。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体是慢病毒载体。

本文提供了产生工程化免疫细胞的方法，所述方法包括：将本文所描述的核酸中的任何一种核酸或本文所描述的载体中的任何一种载体引入到免疫细胞中，由此产生所述工程化免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括在所述引入步骤之后，培养所述工程化免疫细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞是NK细胞。

在一些实施例中，所述方法进一步包括在所述引入步骤之前，从受试者获得所述免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用所述工程化免疫细胞。在一些实施例中，所述受试者已被诊断或鉴定为患有癌症。

本文提供了工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞通过本文所描述的方法中的任一方法产生。

本文提供了药物组合物，所述药物组合物包括本文所描述的工程化免疫细胞中的任何一种工程化免疫细胞以及药学上可接受的载体。

本文提供了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所描述的工程化免疫细胞中的任何一种工程化免疫细胞或本文所描述的药物组合物中的任何一种药物组合物。在一些实施例中，所述癌症是抗磷脂酰肌醇聚糖-3相关癌症、抗CD 19相关癌症或抗MVR相关癌症。在一些实施例中，所述癌症是癌、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's and non-Hodgkin's lymphomas))、母细胞瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(livercarcinoma)、其它淋巴组织增殖性病症和各种类型的头颈癌。在一些实施例中，所述受试者先前已被施用选自由以下组成的组的一种或多种另外的抗癌疗法：电离辐射、化学治疗剂、治疗性抗体和检查点抑制剂。在一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有所述癌症。

附图说明

图1示出了示例性MVR CAR构建体的示意图。

图2示出了MVRL2H2-4-1BB克隆后的示例性酶图谱结果。

图3示出了huGC33(VH-VL)-euBBz的限制酶消化结果，其中预期大小标记在DNA序列梯上，并且结果示出在凝胶电泳图像中。

图4示出了huGC33(VH-VL)-BBz的限制酶消化结果，其中预期大小标记在DNA序列梯上，并且结果示出在凝胶电泳图像中。图5A是示出在全天期间CAR-T细胞体外总扩增倍数的图表。

图5B是比较CAR-T细胞体外扩增倍数的图表。

图5C是示出CAR-T细胞体外细胞活力的图表。

图6示出了用huGC33(VH-VL)-euBBz和huGC33(VH-VL)-BBz转导的T细胞的CAR表达的分析。

图7A是示出使用来自Huh-7细胞系的靶细胞的基于LDH的细胞毒性测定的图表。

图7B是示出使用来自PLC/PRF/5细胞系的靶细胞的基于LDH的细胞毒性测定的图表。

图8是比较huGC33(VH-VL)-euBBz和huGC33(VH-VL)-BBz CAR-T细胞的体内功效的一组图表。

图9A是示出来自注射huGC33(VH-VL)-euBBz和huGC33(VH-VL)-BBz CAR-T细胞后5周的小鼠模型的CAR-T细胞计数的图表。

图9B是比较来自注射huGC33(VH-VL)-euBBz和huGC33(VH-VL)-BBz CAR-T细胞后5周的小鼠模型的CAR-T细胞计数的一组图表。

图10示出了使用FACS染色对注射huGC33(VH-VL)-euBBz和huGC33(VH-VL)-BBzCAR-T细胞后5周的小鼠血液、骨髓、脾脏和肝脏中的CAR-T细胞的分析。

图11A示出了用CD19-BBz和CD19-euBBz转导的T细胞中的CAR表达。

图11B是示出用CD19-BBz和CD19-euBBz转导的T细胞中的杀伤活性的来自基于荧光素酶的细胞毒性测定的图表。

图12示出了使用动物模型的CD19-BBz CAR-T细胞和CD19-euBBz CAR-T细胞的作用的IVTS成像结果。

图13是示出注射CD19-BBz CAR-T细胞和CD19-euBBz CAR-T细胞后动物模型中癌细胞的光子值的图表。

图14A是示出在以3到4天的间隔在小鼠中执行眼眶血液采集后，使用FACS的血液中存在的总CD19 CAR-T细胞的百分比的一组图表。

图14B是示出在以3到4天的间隔在小鼠中执行眼眶血液采集后，使用FACS的血液中存在的CD4/CD8 CAR-T细胞的百分比的一组图表。

图14C是示出在以3到4天的间隔在小鼠中执行眼眶血液采集后，使用FACS的血液中存在的总CD19 CAR-T的数量的图表。

图15A示出了示例性GPC3 CAR构建体的示意图。

图15B示出了示例性GPC3 CAR构建体的示意图。

具体实施方式

本公开描述了包含4-1BB共刺激内结构域的嵌合抗原受体(CAR)以及所述CAR的制备和使用方法。

定义

约：当在本文中用于提及值时，术语“约”是指在上下文中与所引用值类似的值。通常，熟悉上下文的本领域的技术人员将理解所述上下文中“约”所涵盖的相关差异程度。例如，在一些实施例中，术语“约”可以涵盖在参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的范围内的值。

施用：如本文所使用的，术语“施用”通常是指向受试者或系统施用组合物，以实现作为组合物或包含在组合物中的药剂的递送。本领域的普通技术人员将意识到，可以在适当情况下用于向例如人的受试者施用的各种途径。例如，在一些实施例中，施用可以是经眼施用、经口施用、肠胃外施用、局部施用等。在一些特定实施例中，施用可以是经支气管施用(例如，通过支气管滴注)、经颊施用、皮肤施用(其可以是或包括例如局部到真皮、皮肤内、皮肤间、透皮等中的一或多种)、肠内施用、动脉内施用、皮肤内施用、胃内施用、髓内施用、肌肉内施用、鼻内施用、腹膜内施用、鞘内施用、静脉内施用、心室内施用、特定器官内(例如，肝内)施用、粘膜施用、经鼻施用、经口施用、直肠施用、皮下施用、舌下施用、局部施用、气管施用(例如，通过气管内滴注)、阴道施用、玻璃体施用等。在一些实施例中，施用可以涉及单剂量、多剂量或固定数量的剂量。在一些实施例中，施用可以涉及给药，所述给药是间歇性给药(例如，在时间上分隔的多个剂量)和/或周期性给药(例如，由共同的时间段分隔的单独剂量)。在一些实施例中，施用可以涉及连续给药(例如，灌注)至少所选时间段。

亲和力：如本领域已知的，“亲和力”是特定配体结合其配偶体的强度的量度。亲和力可以以不同方式测量。在一些实施例中，通过定量测定测量亲和力。在一些此类实施例中，可以将结合配偶体浓度固定在超过配体浓度，以便模拟生理条件。可替代地或另外地，在一些实施例中，结合配偶体浓度和/或配体浓度可以不同。在一些此类实施例中，可以在相当的条件(例如，浓度)下将亲和力与参考值进行比较。

抗体药剂：如本文所使用的，术语“抗体药剂”可以指与特定抗原特异性结合的药剂。在一些实施例中，所述术语涵盖包含足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件的任何多肽或多肽复合物。示例性抗体药剂包含但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和其片段。在一些实施例中，抗体药剂可以包含一种或多种本领域已知的人源化、灵长化、嵌合等的序列元件。在许多实施例中，术语“抗体药剂”用于指用于在替代性呈现中利用抗体结构和功能特征的本领域已知的或开发的构建体或形式中的一种或多种。例如，在一些实施例中，根据本发明利用的抗体药剂呈选自但不限于以下的形式：完整IgA抗体、IgG抗体、IgE抗体或IgM抗体；双特异性抗体或多特异性抗体(例如，

等)；如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd'片段、Fd片段和分离的CDR或其集合等抗体片段；单链Fv；多肽-Fc融合体；单结构域抗体(例如，如IgNAR或其片段等鲨鱼单结构域抗体)；骆驼科(cameloid)抗体；掩蔽抗体(例如，

)；小模块化免疫药物(SMIPs^TM)；单链双抗体或串联双抗体

VHH；

微抗体；

锚蛋白重复蛋白或

DART；TCR样抗体；

微量蛋白；

以及

在一些实施例中，抗体药剂可能缺乏在天然产生时其将会具有的共价修饰(例如，聚糖的附接)。在一些实施例中，抗体药剂可以含有共价修饰(例如，聚糖的附接)、有效载荷[例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等]或其它侧基[例如，聚乙二醇等]。在许多实施例中，抗体药剂是或包括氨基酸序列包含被本领域技术人员识别为互补决定区(CDR)的一个或多个结构元件的多肽。在一些实施例中，抗体药剂是或包括氨基酸序列包含基本上与在参考抗体中发现的CDR相同的至少一个CDR(例如，至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR)的多肽。在一些实施例中，包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为所述包含的CDR与所述参考CDR相比序列一致或含有介于1到5个之间的氨基酸取代。在一些实施例中，包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为所述包含的CDR示出与所述参考CDR具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为所述包含的CDR示出与所述参考CDR具有至少96％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为与所述参考CDR相比，所述包含的CDR内的至少一个氨基酸被缺失、添加或取代，但所述包含的CDR具有与所述参考CDR的氨基酸序列在其它方面相同的氨基酸序列。在一些实施例中，包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为与所述参考CDR相比，所述包含的CDR内的1-5个氨基酸被缺失、添加或取代，但所述包含的CDR具有与所述参考CDR的氨基酸序列在其它方面相同的氨基酸序列。在一些实施例中，包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为与所述参考CDR相比，所述包含的CDR内的至少一个氨基酸被取代，但所述包含的CDR具有与所述参考CDR的氨基酸序列在其它方面相同的氨基酸序列。在一些实施例中，包含的CDR与参考CDR基本上相同，因为与所述参考CDR相比，所述包含的CDR内的1-5个氨基酸被缺失、添加或取代，但所述包含的CDR具有与所述参考CDR的氨基酸序列在其它方面相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体药剂是或包括氨基酸序列包含被本领域技术人员识别为免疫球蛋白可变结构域的结构元件的多肽。在一些实施例中，抗体药剂是具有与免疫球蛋白结合结构域同源或大部分同源的结合结构域的多肽蛋白。在一些实施例中，抗体药剂是或包括嵌合抗原受体(CAR)的至少一部分。

抗原：如本文所使用的，术语“抗原”可以指结合抗体药剂的药剂。在一些实施例中，抗原结合抗体药剂并且可以在或可以不在生物体中诱导特定生理应答。通常，抗原可以是或包含任何化学实体，例如小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂质、聚合物(包括生物聚合物[例如，核酸和/或氨基酸聚合物]和除生物聚合物以外的聚合物[例如，除核酸或氨基酸聚合物以外的聚合物])等。在一些实施例中，抗原是或包含多肽。在一些实施例中，抗原是或包括聚糖。本领域技术人员将了解，通常，抗原可以以经分离的或纯的形式提供或使用，或可替代地可以以粗形式提供(例如，与其它材料一起，例如在如细胞提取物或含有抗原的来源的其它相对粗制剂的提取物中)。

在一些某些实施例中，抗原存在于细胞环境中(例如，抗原在细胞表面表达或在细胞中表达)。在一些实施例中，抗原是重组抗原。

抗原结合结构域：如本文所使用的，术语“抗原结合结构域”可以指特异性结合靶部分或实体的抗体药剂或其部分。通常，抗原结合结构域与其靶标之间的相互作用是非共价的。在一些实施例中，靶部分或实体可以属于任何化学类别，包含例如碳水化合物、脂质、核酸、金属、多肽或小分子。在一些实施例中，抗原结合结构域可以是或包括多肽(或其复合物)。在一些实施例中，抗原结合结构域是融合多肽的一部分。在一些实施例中，抗原结合结构域是嵌合抗原受体(CAR)的一部分。

与...相关：如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另一个事件或实体的存在、水平和/或形式有关，则两个事件或实体彼此“相关”，如所述术语在本文所使用的。例如，如果特定实体(例如，多肽、基因特征、代谢物、微生物等)的存在、水平和/或形式与疾病、病症或病状的发病率和/或易感性有关(例如，跨相关群体)，则所述特定实体被认为与特定疾病、病症或病状相关。在一些实施例中，如果两个或更多个实体直接或间接相互作用，使得其在物理上彼此接近和/或保持彼此接近，则其在物理上彼此“缔合”。在一些实施例中，物理上彼此缔合的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施例中，物理上彼此缔合的两个或更多个实体不是彼此共价连接的，而是例如通过氢键、范德华相互作用(vander Waals interaction)、疏水性相互作用、磁性和其组合非共价缔合的。

结合：应当理解，如本文中所使用的，术语“结合”通常是指两个或更多个实体之间或之中的非共价相关。“直接”结合涉及实体或部分之间的物理接触。间接结合涉及通过与一个或多个中间实体的物理接触进行的物理相互作用。通常可以在各种情况中的任何一种情况下评估两个或更多个实体之间的结合，所述各种情况包含孤立地或在更复杂的系统的情况下(例如，在与载体实体和/或在生物系统或细胞中共价地或以其它方式相关时)研究相互作用的实体或部分。

癌症：术语“癌症(cancer)”、“恶性肿瘤”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌(carcinoma)”在本文中用于指表现出相对异常、不受控制和/或自主生长的细胞，使得所述细胞表现出异常生长表型，所述异常生长表型的特征为细胞增殖显著失控。在一些实施例中，肿瘤可以是或包括癌前(例如，良性)、恶性、转移前、转移性和/或非转移性的细胞。本公开具体地鉴定其教导可能特别相关的某些癌症。在一些实施例中，相关癌症可以通过实体肿瘤表征。在一些实施例中，相关癌症可以通过血液肿瘤表征。

通常，本领域已知的不同类型的癌症的实例包含例如造血系统癌，包含白血病、淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)、骨髓瘤和骨髓增殖性病症；肉瘤、黑色素瘤、腺瘤、实体组织癌、口腔、喉部、喉部和肺部的鳞状细胞癌、肝癌、如前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫癌和子宫内膜癌以及肾细胞癌等泌尿生殖系统癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑色素瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、头颈癌、乳腺癌、胃肠癌和神经系统癌、如乳头状瘤等良性病变等等。

CDR：如本文所使用的，“CDR”可以指抗体药剂的可变区内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在三个CDR，对于每个可变区分别指定为CDR1、CDR2和CDR3。“一组CDR”或“CDR组”是指一组三个或六个出现在能够结合抗原的单个可变区中的CDR或能够结合抗原的同源重链和轻链可变区的CDR。本领域已经建立了用于定义CDR边界的某些系统(例如，Rabat、Chothia等)；本领域技术人员理解这些系统之间的差异并且能够在理解和实践要求保护的本发明所需的程度上理解CDR边界。

化学治疗剂：如本文所使用的，术语“化学治疗剂”具有其本领域理解的含义，指一种或多种促凋亡剂、细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂，例如具体地包含用于和/或推荐用于治疗与不期望的细胞增殖相关的一种或多种疾病、病症或病状的药剂。在许多实施例中，化学治疗剂可用于治疗癌症。在一些实施例中，化学治疗剂可以是或包括一种或多种烷化剂、一种或多种蒽环类、一种或多种细胞骨架破坏剂(例如微管靶向剂，如紫杉烷、美登素(maytansine)和其类似物)、一种或多种埃博霉素(epothilone)、一种或多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC)、一种或多种拓扑异构酶抑制剂(例如，拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II的抑制剂)、一种或多种激酶抑制剂、一种或多种核苷酸类似物或核苷酸前体类似物、一种或多种肽抗生素、一种或多种基于铂的药剂、一种或多种类视黄醇、一种或多种长春花生物碱和/或一种或多种以下物质中的一种或多种类似物(即，共享相关的抗增殖活性)。在一些特定实施例中，化学治疗剂可以是或包括以下中的一种或多种：放线菌素、全反式维甲酸、奥瑞斯他汀(Auiristatin)、氮杂胞苷(Azacitidine)、咪唑硫嘌呤(Azathioprine)、博来霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、卡铂(Carboplatin)、卡培他滨(Capecitabine)、顺铂(Cisplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、姜黄素(Curcumin)、阿糖孢苷(Cytarabine)、柔红霉素(Daunorubicin)、多西他赛(Docetaxel)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、埃博霉素(Epothilone)、依托泊苷(Etoposide)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、吉西他滨(Gemcitabine)、羟基脲(Hydroxyurea)、伊达比星(Idarubicin)、伊马替尼(Imatinib)、伊立替康(Irinotecan)、美登素和/或其类似物(例如，DM1)、氮芥(Mechlorethamine)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、美登醇(Maytansinoid)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、培美曲塞(Pemetrexed)、替尼泊苷(Teniposide)、硫鸟嘌呤(Tioguanine)、拓扑替康(Topotecan)、戊柔比星(Valrubicin)、长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)、长春瑞滨(Vinorelbine)

和其组合。在一些实施例中，化学治疗剂可以在抗体-药物缀合物的上下文中使用。在一些实施例中，化学治疗剂是在选自由以下的组的抗体-药物缀合物中发现的化学治疗剂：hLL1-多柔比星、hRS7-SN-38、hMN-14-SN-38、hLL2-SN-38、hA20-SN-38、hPAM4-SN-38、hLL1-SN-38、hRS7-Pro-2-P-Dox、hMN-14-Pro-2-P-Dox、hLL2-Pro-2-P-Dox、hA20-Pro-2-P-Dox、hPAM4-Pro-2-P-Dox、hLL1-Pro-2-P-Dox、P4/D10-多柔比星、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、维布妥昔单抗奥瑞他汀(brentuximab vedotin)、曲妥珠单抗美坦新(trastuzumab emtansine)、奥英妥珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)、格巴妥木单抗奥瑞他汀(glembatumumab vedotin)、SAR3419、SAR566658、BIIB015、BT062、SGN-75、SGN-CD19A、AMG-172、AMG-595、BAY-94-9343、ASG-5ME、ASG-22ME、ASG-16M8F、MDX-1203、MLN-0264、抗PSMA ADC、RG-7450、RG-7458、RG-7593、RG-7596、RG-7598、RG-7599、RG-7600、RG-7636、ABT-414、IMGN-853、IMGN-529、沃瑟妥珠单抗曼佛他汀(vorsetuzumabmafodotin)和洛沃妥珠单抗莫坦森(lorvotuzumab mertansine)。

工程化：通常，术语“工程化”可以指通过人工操纵的方面。例如，当多肽序列通过人工操纵时，所述多肽被认为是“工程化的”。例如，在本发明的一些实施例中，工程化多肽包括包含已经通过人工引入到参考多肽序列中的一个或多个氨基酸突变、缺失和/或插入的序列。在一些实施例中，工程化多肽包含已经通过人工与一种或多种另外的多肽融合(即，共价连接)以形成不会在体内自然发生的融合多肽的多肽。类似地，如果细胞或生物体已经被操纵使得其基因信息改变(例如，已经例如通过转化、匹配、体细胞杂交、转染、转导或其它机制引入先前不存在的新基因材料，或例如通过取代或缺失突变或通过匹配方案改变或去除先前存在的基因材料)，则所述细胞或生物体被视为“工程化的”。如通常的实践并为本领域技术人员所理解的，即使实际的操纵是在现有实体上进行的，工程化多肽或细胞的衍生物和/或后代通常仍被称为“工程化的”。

宿主细胞：如本文所使用的，术语“宿主细胞”可以指以任何方式被选择、修饰、转化、生长、使用或操纵的生物体的细胞，以通过所述细胞来产生材料，例如基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶在细胞中的表达。宿主细胞可以包含免疫细胞，包含但不限于淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞和NK细胞)、中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞。

体外：如本文中所使用的，术语“体外”是指在人工环境中(例如，在试管或反应容器中、在细胞培养物中等)而非在多细胞生物体内发生的事件。

体内：如本文中所使用的，术语“体内”是指在如人或非人动物等多细胞生物体内发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，术语可以用于指在活细胞内发生的事件(如例如与体外系统相反)。

分离的：如本文所使用的，术语“经分离的”可以指已经(1)从最初生产时(无论是在自然界和/或在实验环境中)与其缔合的组分中的至少一些组分中分离出的物质和/或实体，和/或(2)通过人工设计、生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与其最初缔合的其它组分分离约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％。在一些实施例中，分离的药剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％纯的。如本文所使用的，如果物质基本上不含其它组分，则所述物质是“纯的”。在一些实施例中，如本领域的技术人员将理解的，在与例如一或多种载体或赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)等某些其它组分组合后，物质仍可以被认为是“分离的”或甚至是“纯的”；在此类实施例中，物质的分离或纯度百分比是在不包含此类载体或赋形剂的情况下计算的。仅举一个实例，在一些实施例中，如多肽或多核苷酸等在自然中发生的生物聚合物在以下情况下被认为是“分离的”：a)由于其起源或衍生来源，不与在其天然状态下伴随其的部分或全部组分缔合；b)所述生物聚合物基本上不含来自在自然界中产生其的物种的相同物种的其它多肽或核酸；c)由来自细胞或其它表达系统的组分表达或以其它方式与所述细胞或其它表达系统的组分缔合，所述细胞或其它表达系统不属于在自然界中产生所述生物聚合物的物种。因此，举例来说，在一些实施例中，经化学合成的或在不同于在自然界中产生多肽的细胞系统中合成的多肽被认为是“分离的”多肽。可替代地或另外地，在一些实施例中，经受一种或多种纯化技术的多肽在所述多肽已经与以下分离的程度上可以被认为是“分离的”多肽：a)在自然界中与其缔合的其它组分；和/或b)最初产生时与其缔合的其它组分。

可操作地连接：如本文所使用的，术语“可操作地连接”可以指并置，其中所描述的组分处于允许所述组分按其预期方式起作用的关系。与功能元件“可操作地连接”的控制元件以在与控制元件相容的条件下实现功能元件的表达和/或活性的方式缔合。在一些实施例中，“可操作地连接”的控制元件与所关注编码元件是连续的(例如，共价连接)。在一些实施例中，控制元件与所关注功能元件以反式或以其它方式起作用。

药物组合物：如本文所使用的，术语“药物组合物”是指活性剂在其中与一种或多种药学上可接受的载体一起调配的组合物。在一些实施例中，所述组合物适于向人或动物受试者施用。在一些实施例中，活性剂以适合于在施用给相关群体时显示出实现预定治疗效果的统计学显著概率的治疗方案中施用的单位剂量存在。

多肽：如本文所使用的，术语“多肽”通常指其本领域公认的至少三个氨基酸的聚合物的含义。本领域普通技术人员应当理解，术语“多肽”旨在足够一般，以便涵盖具有本文所列举的完整序列的多肽，同时涵盖表示此类完整多肽的功能性片段(例如，保留至少一种活性的片段)的多肽。此外，本领域普通技术人员应当理解，蛋白质序列通常容忍一些取代而不破坏活性。因此，保留活性并且与同类别的另一种多肽共享至少约30％-40％的整体序列同一性，通常大于约50％、60％、70％或80％，并且通常进一步包含在通常涵盖至少3-4个并且经常至多20个或更多个氨基酸的一个或多个高度保守区中具有更高同一性，通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％的至少一个区的多肽涵盖在如本文所使用的相关术语“多肽”内。多肽可以含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者，并且可以含有本领域中已知的各种氨基酸修饰或类似物中的任一种。有用的修饰包含例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施例中，蛋白质可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其组合。术语“肽”通常用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于约20个氨基酸或小于约10个氨基酸的多肽。在一些实施例中，蛋白质是抗体药剂、抗体片段、其生物活性部分和/或其特性部分。

预防(prevent/prevention)：如本文所使用的，当与疾病、病症和/或病状的发生结合使用时，术语“预防(prevent)”或“预防(prevention)”可以指降低发展疾病、病症和/或病状的风险和/或延迟疾病、病症或病状的一种或多种特性或症状的发作和/或严重程度。在一些实施例中，预防是在群体基础上进行评估，使得如果在易患疾病、病症或病状的群体中观察到所述疾病、病症或病状的一种或多种症状的发展、频率和/或强度在统计学上显著降低，则药剂被认为可以“预防”所述特定疾病、病症或病状。

重组：如本文所使用的，术语“重组”可以指通过重组方式设计、工程化、制备、表达、产生、制造和/或分离的多肽，如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽；从重组、组合人多肽库中分离的多肽；从动物(例如，小鼠、兔、羊、鱼等)中分离的多肽，所述动物是转基因的或以其它方式已经被操纵以表达一个或多个基因或编码和/或引导多肽或其一种或多种组分、部分、元件或结构域的表达的基因组分；和/或通过任何其它方式制备、表达、产生或分离的多肽，所述其它方式涉及将所选核酸序列元件彼此剪接或连接、化学合成所选序列元件和/或以其它方式产生编码和/或引导多肽或其一种或多种组分、部分、元件或结构域的表达的核酸。在一些实施例中，此类所选序列元件中的一个或多个元件是在自然界中发现的。在一些实施例中，此类所选序列元件中的一个或多个元件是在计算机上设计的。在一些实施例中，一个或多个此类所选序列元件由已知序列元件的诱变(例如，体内或体外)产生，例如来自天然或合成来源，例如在所关注源生物(例如，人、小鼠等)的种系中。

特异性结合：如本文所使用的，术语“特异性结合”可以指在结合可以发生的环境中区别可能的结合配偶体的能力。当存在其它潜在靶标时，与一个特定靶标相互作用的结合剂被称为“特异性结合”与其相互作用的靶标。在一些实施例中，通过检测或确定结合剂与其配偶体之间的缔合程度来评估特异性结合。在一些实施例中，通过检测或确定结合剂-配偶体复合物的解离程度来评估特异性结合；在一些实施例中，通过检测或确定结合剂对抗其配偶体与另一个实体之间的替代性相互作用的能力来评估特异性结合。在一些实施例中，通过在一定浓度范围内执行此类检测或确定来评估特异性结合。

受试者：如本文所使用的，术语“受试者”是指生物体，通常是指哺乳动物(例如人，在一些实施例中包含出生前的人类形式)。在一些实施例中，受试者患有相关疾病、病症或病状。在一些实施例中，受试者易患疾病、病症或病状。在一些实施例中，受试者表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状或特性。在一些实施例中，受试者未表现出疾病、病症或病状的任何症状或特性。在一些实施例中，受试者是指具有易患或有风险患有疾病、病症或病状的一个或多个特征的人。在一些实施例中，受试者是患者。在一些实施例中，受试者是正在和/或已经对其施用诊断和/或疗法的个体。

治疗剂：如本文所使用的，短语“治疗剂”通常是指当施用于生物体时引发期望的药理学效果的任何药剂。在一些实施例中，如果药剂跨适当的群体表现出统计学显著的效果，则认为所述药剂是治疗剂。在一些实施例中，适当的群体可以是模型生物体的群体。在一些实施例中，适当的群体可以由如某些年龄组、性别、遗传背景、预先存在的临床条件等标准限定。在一些实施例中，治疗剂是可以用于对疾病、病症和/或病状的一或多种症状或特征进行减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发病率的物质。在一些实施例中，“治疗剂”是已经或需要由政府机构批准才能将其销售给人类施用的药剂。在一些实施例中，“治疗剂”是需要医疗处方才能给人类施用的药剂。

治疗有效量：如本文所使用的，术语“治疗有效量”意指在根据治疗给药方案施用到患有或易于有疾病、病症和/或病状的群体时足以治疗疾病、病症和/或病状的量。在一些实施例中，治疗有效量是降低疾病、病症和/或病状的一种或多种症状的发病率和/或严重程度、使疾病、病症和/或病状的一种或多种特性稳定和/或延迟疾病、病症和/或病状的一或多种症状的发作的量。本领域普通技术人员应了解，术语“治疗有效量”事实上不需要实现成功治疗特定个体。相反，治疗有效量可以是在施用到需要此治疗的患者时在大量受试者中提供特定的期望的药理学应答的量。例如，在一些实施例中，术语“治疗有效量”是指当在本发明的疗法的背景下向有需要的个体施用时，将阻断、稳定、减弱或逆转在所述个体中发生的癌症支持过程，或将增强或增加所述个体中的癌症抑制过程的量。在癌症治疗的上下文中，“治疗有效量”是当向被诊断患有癌症的个体施用时将预防、稳定、抑制或减少个体中癌症的进一步发展的量。本文所描述的组合物的特别优选的“治疗有效量”逆转(在治疗性治疗中)如胰腺癌等恶性肿瘤的发展，或者帮助实现或延长恶性肿瘤的缓解。向个体施用以治疗所述个体的癌症的治疗有效量可以与施用以促进缓解或抑制转移的治疗有效量相同或不同。与大多数癌症疗法一样，本文所描述的治疗方法不应被解释为、受限于或以其它方式限于“治愈”癌症；相反，所述治疗方法涉及所描述的组合物用于“治疗”癌症的用途，即，对患有癌症的个体的健康产生期望的或有益的改变。此类益处被肿瘤学领域熟练的医疗保健提供者认可并且包含但不限于患者病状稳定、肿瘤大小减小(肿瘤消退)、生命功能改善(例如，癌组织或器官的功能改善)、进一步转移的减少或抑制、机会性感染的减少、生存能力的增加、疼痛减轻、运动功能改善、认知功能改善、能量感受改善(活力、不适减轻)、幸福感改善、正常食欲的恢复、健康体重增加的恢复和其组合。另外，个体中特定肿瘤的消退(例如，作为本文所描述的治疗的结果)也可以通过从如胰腺癌等肿瘤部位(例如，在治疗过程中)采集癌细胞样品以及测试所述癌细胞的代谢和信号传导标志物水平来评估以监测所述癌细胞的状态，以便在分子水平上验证所述癌细胞向更少恶性表型的消退。例如，通过采用本发明的方法诱导的肿瘤消退将通过发现以下各项来指示：上文讨论的任何促血管生成标志物的减少、本文所描述的抗血管生成标志物的增加、在被诊断患有癌症的个体中表现出异常活动的代谢通路、细胞间信号传导通路或胞内信号传导通路的正常化(即，向在未患癌症的正常个体中发现的状态改变)。本领域普通技术人员应了解，在一些实施例中，可以按单次剂量调配和/或施用治疗有效量。在一些实施例中，可以按多次剂量，例如，作为给药方案的一部分来调配和/或施用治疗有效量。

转染：如本文所使用的，术语“转染”可以指使用重组DNA技术将外源核酸引入到细胞中。如本文所使用的，术语“转化”可以指将外源基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞，使得所述宿主细胞将表达被引入的基因或序列以产生经编码的蛋白质或酶。

转导：如本文所使用的，术语“转导”可以指使用病毒载体将外源核酸引入到细胞中。

变体：如本文在分子(例如，核酸、蛋白质或小分子)的上下文中所使用的，术语“变体”可以指与参考实体相比示出与参考分子显著的结构同一性但在结构上与所述参考分子不同的分子，例如，在存在或不存在一个或多个化学部分的情况下或在所述一个或多个化学部分的水平上。在一些实施例中，变体在功能上也与其参考分子不同。通常，特定分子是否被适当地视为参考分子的“变体”是基于所述特定分子与参考分子的结构同一性程度的。如本领域技术人员将理解的，任何生物或化学参考分子都具有某些特性结构元件。根据定义，变体是共享一个或多个此类特性结构元件，但在至少一个方面与参考分子不同的独特分子。仅举几个实例，多肽可以具有包含多个氨基酸的特性序列元件，所述氨基酸在线性或三维空间中具有相对于彼此的指定位置和/或有助于特定结构基序和/或生物学功能；核酸可以具有包含多个核苷酸残基的特性序列元件，所述核苷酸残基在线性或三维空间中相对于彼此具有指定位置。在一些实施例中，由于氨基酸或核苷酸序列中的一个或多个差异，变体多肽或核酸可以不同于参考多肽或核酸。在一些实施例中，变体多肽或核酸示出与参考多肽或核酸的总体序列同一性为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％。在一些实施例中，变体多肽或核酸不与参考多肽或核酸共享至少一个特性序列元件。在一些实施例中，参考多肽或核酸具有一种或多种生物活性。在一些实施例中，变体多肽或核酸共享参考多肽或核酸的生物活性中的一种或多种生物活性。

载体：如本文所使用的，术语“载体”可以指能够转运其连接到的另一个核酸的核酸分子。载体可以涵盖用于在体外、离体或体内将核酸引入到细胞中的非病毒载体和病毒载体两者。

载体可以是附接有另一个DNA片段以扩增所附接的片段的复制子。术语“复制子”是指能够作为体内DNA复制的自主单元的任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体或病毒)。

本领域已知的许多载体可以用于将核酸工程化、将应答元件和启动子并入到基因中等等。优选的载体包含但不限于质粒(例如，PBR322或pUC质粒衍生物)、经修饰的病毒(例如，腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒或疱疹病毒)或Bluescript载体。例如，通过将适合的DNA片段与具有互补粘性末端的所选载体组合，可以将对应于反应元件和启动子的DNA片段插入到适合的载体中。在一些实施例中，DNA分子的末端可以被酶促修饰，或者任何位点可以通过经由连接子将核苷酸序列与DNA末端结合而产生。在一些实施例中，可以操纵载体以含有选择标志物基因，以便筛选已将标志物并入到细胞基因组中的细胞。此类标志物使得鉴定和/或筛选表达由所述标志物编码的蛋白质的宿主细胞成为可能。

一种类型的载体是“质粒”，所述质粒是指可以将另外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其被引入到其中的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中时可以被整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其操作性地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。可以用于递送本文所描述的嵌合抗原受体的表达载体和包装构建体的非限制性实例包含逆转录病毒载体(例如，SFG、pMX、pSAMEN、pMP71、pLXSN、pMSCV、pMSGV)、慢病毒载体(例如，epHIV7、pLenO、pSIN,pSIEW、pELPS、pELNS、pHR)、包装构建体(psPAX2、pRDF、pEQ-PAM3(-E)、pVSVg、pCL、pMEVSVg、pMD2G、pMDLg/p.RRE、pRSV.REV、pTSV.rev、pCHGP、pCMV-g、pCMV-Rev2、pCMVdR8.91、pGALY)。

在一些实施例中，载体提供必要的调控序列(例如，转录元件和翻译元件)以调控融合蛋白在适合的宿主细胞中的表达。调控序列可以包括启动子区、增强子区、转录终止位点、核糖体结合位点、起始密码子、剪接信号、内含子、聚腺苷酸化信号、Shine/Dalgarno翻译序列和Kozak共有序列。鉴于融合蛋白将产生于的宿主细胞，选择调控序列。在一些实施例中，合适的细菌启动子包含但不限于噬菌体λpL或pR、T6、T7、T7/lacO、lac、recA、gal、trp、ara、hut和trp-lac。在一些实施例中，合适的真核启动子包含但不限于PRBI、GAPDH、金属硫蛋白、胸苷激酶、病毒LTR、巨细胞病毒、SV40或组织特异性或肿瘤特异性启动子，如α胎蛋白、淀粉酶、组织蛋白酶E、M1毒蕈碱受体或γ-谷氨酰转移酶。

在一些实施例中，另外的载体包含脂质复合物(阳离子脂质体-DNA复合物)、多聚复合物(阳离子聚合物-DNA复合物)和蛋白质-DNA复合物。除了核酸之外，载体还可以包括一个或多个可用于选择、测量和监测核酸递送的结果(例如，递送到某些组织或表达的持续时间)的调控区和/或可选择标志物。

可以通过本领域已知的方法将载体引入到期望的宿主细胞中，所述方法如注射、转染、电穿孔、微注射、转导、细胞融合、脂质转染、磷酸钙沉淀(Graham,F.L.等人,《病毒学(Virology)》,52:456(1973)，Chen和Okayama,《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》7:2745-2752(1987))、脂质体介导的结构化盐方法(Wong,T.K.等人,《基因(Gene)》,10:87(1980)，Nicolau和Sene,《生物化学生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)》,721:185-190(1982)，Nicolau等人,《酶学方法(Methods Enzymol.)》,149:157-176(1987))、DEAE-右旋糖酐处理(Gopal,《分子细胞生物学》,5:1188-1190(1985))、使用基因物种或DNA载体转运蛋白(参见Wu等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》267:963(1992)，Wu等人,《生物化学杂志》263:14621(1988)，Hartmut等人,加拿大专利申请第2,012,311号)的基因轰击(Yang等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,87:9568-9572(1990))。

在一些实施例中，病毒载体已广泛用于细胞以及活体动物受试者中的基因转移应用。可以使用的病毒载体包含但不限于腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、痘病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、杆状病毒、仙台病毒、麻疹病毒、猿猴病毒40和爱泼斯坦-巴尔

病毒(Epstein-Barr virus)载体。非病毒载体包含质粒、脂质复合物(阳离子脂质体-DNA复合物)、多聚复合物(阳离子聚合物-DNA复合物)和蛋白质-DNA复合物。除了核酸之外，载体可以包括一个或多个可用于筛选、测量和监测核酸递送结果(例如，递送到组织或表达的持久性)的调控区和/或选择标志物。

在一些实施例中，多核苷酸可以通过脂质转染在体内引入。脂质体用于体外包封和转染核酸的用途有所增加。在一些实施例中，被设计为限制脂质体介导的转染所遇到的困难和风险的合成阳离子脂质可以用于制备用于基因体内转染的脂质体(Feigner等人,《美国国家科学院院刊》84:7413(1987)，Mackey等人,《美国国家科学院院刊》85:8027(1988)，Ulmer等人,《科学(Science)》259:1745(1993))。在一些实施例中，阳离子脂质的使用可以促进带负电荷的核酸的包封，并且也可以促进与带负电荷的细胞膜的融合(Feigner等人,《科学》337:387(1989))。在WO95/18863、WO96/17823和U.S.5,459,127中描述了用于递送核酸的特别有用的脂质化合物和组合物，所述文献以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，对于具有细胞异质性的组织，如胰腺、肝脏、肾脏和脑，特定细胞类型的直接转染显然是特别期望的。在一些实施例中，脂质可以化学地结合用于靶向的其它分子(Mackey等人,1988)。在一些实施例中，如激素或神经递质等靶向肽和如抗体等蛋白质或非肽分子可以化学地结合脂质体。

可以将标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质体转染)。可以根据制造商的说明书或者如本领域通常实现那样或如本文所描述那样执行酶促反应和纯化技术。前述技术和程序通常可以根据本领域熟知的常规方法并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所描述那样执行。参见例如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》第2版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港(ColdSpring Harbor),纽约(1989)，所述文献出于任何目的以引用的方式并入本文中。

工程化免疫细胞

如本文所使用的，“免疫细胞”是指免疫系统的细胞，所述免疫细胞可以分类为淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞和NK细胞)、中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞是巨噬细胞。在一些实施例中，免疫细胞是工程化免疫细胞，意味着所述免疫细胞已经被基因修饰以表达非天然存在的蛋白质(例如，嵌合抗原受体)或包含外源核酸。

免疫细胞(例如，T细胞)可以以一种或多于一种方式进行修饰。免疫细胞(例如，T细胞)可以表达至少一种非天然分子，所述分子是存在于一种或多种类型的细胞的表面上的抗原的受体。在一些实施例中，免疫细胞包含在自然界中未发现的免疫细胞(例如，T细胞)，因为所述免疫细胞被工程化以包括或表达在自然界中未发现的至少一种合成分子。在具体实施例中，免疫细胞(例如，T细胞)被工程化以表达至少一种嵌合抗原受体(CAR)，包含靶向特异性肿瘤抗原的CAR，如磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、恶性肿瘤变异受体(MVR)、HLA-DR(人白细胞抗原-D相关)或CD19。在具体实施例中，免疫细胞可以是T细胞，例如，CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、Treg细胞、Th1 T细胞、Th2 T细胞、Th17 T细胞、非特异性T细胞或包括上述任何一项的组合的T细胞群。用嵌合抗原受体工程化的免疫细胞(例如，T细胞)(CAR T细胞)在治疗癌症方面具有极大的治疗潜力。使用CAR，可以对受体进行编程以识别抗原，所述抗原在结合时激活免疫细胞以杀死表达所述抗原的细胞。因此，表达针对在肿瘤细胞上表达的抗原的CAR的免疫细胞可以靶向并且杀死所述肿瘤细胞。例如，最近针对血液系统恶性肿瘤的CD19靶向CAR转导T细胞(CD19-CAR T细胞)的临床试验示出CAR T技术的强大效果。(Kochenderfer,J.N等人,(2010)《血液(Blood)》116:4099-4102；Porter,D.L.等人,(2011)《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》365:725-733；Grupp,S.A.等人,(2013)《新英格兰医学杂志》368:1509-1518；Kochenderfer,J.N.等人,(2015)《临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)》33:540-549；Brown,C.E.等人,(2016)《新英格兰医学杂志》375:2561-2569)。CAR T的临床成功至少部分归功于CAR的融合结构，所述融合结构是通过人工将高亲和力抗原结合结构域与多个信号传导结构域结合而成的(Maus,M.V.等人,(2014)《血液》123:2625-2635；van der Stegen,S.J.等人,(2015)《自然综述：药物发现(Nat.Rev.DrugDiscov.)》14:499-509)。

CAR包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在一些实施例中，胞外抗原结合结构域包括能够识别肿瘤相关抗原的单链可变片段(scFv)，跨膜结构域采用来自如CD8和CD28等分子的跨膜结构域，并且胞内信号传导结构域采用基于免疫受体酪氨酸的活化基序(例如，CD3ζ)和共刺激信号传导分子(例如，CD28和CD137(4-1BB))的胞内信号传导结构域。

如本文所使用的，“单链可变片段，scFv”是指被定义为包括通过连接子连接的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的重组蛋白的抗体的片段，所述连接子将两个结构域缔合在一起使得形成抗原结合位点。

在一些实施例中，跨膜结构域是来自选自以下的蛋白质的跨膜结构域：4-1BB/CD137、活化的NK细胞受体、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8、CD8α、CD8β、CD96(触觉的)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、与CD83特异性结合的配体、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1)、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1和VLA-6。

在一些实施例中，胞内信号传导结构域包括来自选自以下的蛋白质的胞内信号传导结构域：4-1BB/CD137、活化的NK细胞受体、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8、CD8α、CD8β、CD96(触觉的)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、与CD83特异性结合的配体、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、Lyl08、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1)、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1和VLA-6或其任何组合。

在一些实施例中，所述嵌合抗原受体进一步包括另外的抗原结合结构域。在一些实施例中，嵌合抗原受体是双特异性CAR(即，靶向两个抗原结合结构域)。在一些实施例中，嵌合抗原受体是多价的(即，靶向多个抗原结合结构域)。在一些实施例中，所述另外的抗原结合结构域是scFv。

免疫细胞(例如，T细胞)可以来自本领域已知的任何来源。例如，免疫(例如，T)细胞可以从造血干细胞群在体外分化，或者免疫(例如，T)细胞可以从受试者获得。T细胞可以获得自外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。另外，免疫(例如，T)细胞可以源自本领域中可用的一个或多个免疫细胞系。在一些实施例中，可以使用技术人员已知的任何数量的技术(如FICOLL^TM分离和/或单采血液成分术)从采集自受试者的血液中获得T细胞。美国专利公开第2013/0287748号中公开了分离用于T细胞疗法的T细胞的另外方法。其它非限制性实例可以在国际申请第PCT/US2015/014520号(公开为WO2015/120096)和国际申请第PCT/US2016/057983号(公开为WO2017/070395)中找到，所述国际申请中的每个国际申请以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施例中，免疫细胞是自体T细胞。在一些实施例中，免疫细胞是从不是患者的受试者中获得的。在一些实施例中，用于治疗方法的T细胞是同基因的(供体和受体不同，但是同卵双胞胎)。在一些实施例中，用于治疗方法的T细胞与受体受试者是同种异体的(来自同一物种但是不同供体)。在一些实施例中，T细胞是自体干细胞(用于自体干细胞疗法或ASCT)。在一些实施例中，免疫细胞是非自体T细胞。在一些实施例中，免疫细胞是从健康供体中获得的。在一些实施例中，免疫细胞从患有癌症或肿瘤的患者中获得。

T细胞可以被工程化以表达例如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，CAR-T细胞可以被工程化以表达胞外单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，CAR被工程化使得共刺激结构域表达为单独的多肽链。在美国专利公开第2013/0287748号、第2014/0227237号、第2014/0099309号和第2014/0050708号中描述了示例性CAR-T细胞疗法和构建体，所述文献以全文引用的方式并入本文中。

CAR构建体

本公开至少部分地提供了嵌合抗原受体(CAR)多肽。如本文所使用的，“嵌合抗原受体(CAR)”是指自然界中不存在并且能够提供对特定抗原具有特异性的免疫效应细胞的受体。在一些实施例中，CAR是指用于将单克隆抗体药剂的特异性递送到T细胞的受体。通常，CAR包括胞外结合结构域(外结构域)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(内结构域)。

在一些实施例中，为了实现稳健的免疫(例如，CAR-T)细胞扩增、功能、持久性和抗肿瘤活性，可以通过将来自免疫(例如，T细胞)细胞共刺激分子的胞内信号传导结构域并入到CAR构建体中来提供共刺激信号。在一些实施例中，CAR构建体内共刺激结构域的选择和定位可能影响免疫(例如，CAR-T)细胞功能和命运，并且对免疫(例如，CAR-T)细胞动力学、细胞毒性功能和潜在的安全性曲线产生不同的影响。共刺激分子的非限制性实例包含CD28、ICOS、CD27、4-1BB/CD137、OX40和CD40L。

如本文所使用的，4-1BB/CD137是活化诱导的T细胞共刺激分子，在静息CD8+ T细胞的子集上表达，并且在活化后在CD4+和CD8+ T细胞两者上上调。在一些实施例中，表达并入4-1BB/CD137结构域的CAR的T细胞可以表达颗粒酶B、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和抗凋亡蛋白Bcl-XL(Zhong等人,《分子疗法(Mol.Ther.)》2010；18:413-420)，其中并入4-1BB/CD137共刺激结构域的CAR可以示出更长的CAR-T细胞持久性(Zhao等人,《癌细胞(Cancer Cell)》2015；28:415-428)。在一些实施例中，本文所描述的嵌合受体的胞内结构域包含4-1BB信号传导结构域，随后是五个氨基酸序列，所述氨基酸序列可以进一步与在嵌合受体的上下文中有用的任何其它期望的胞外结构域、跨膜结构域和/或胞内结构域组合。

在一些实施例中，CAR包含：(a)胞外结构域，所述胞外结构域包括抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域，所述胞内结构域包括共刺激内结构域，其中所述共刺激内结构域包括来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸。如本文所设想的，CAR构建体可以包含涉及任何期望的抗原结合结构域的胞外结构域。在一些实施例中，所述共刺激内结构域包含来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸，其中所述五个另外的氨基酸由SEQ ID NO:1编码。在一些实施例中，所述共刺激内结构域包括SEQ ID NO:2。在一些实施例中，共刺激内结构域包含与SEQ ID NO:2或4至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

SEQ ID NO:1-五个另外的氨基酸(DNA序列)

SEQ ID NO:2-4-1BB共刺激结构域与五个另外的氨基酸(DNA序列)

SEQ ID NO:3-五个另外的氨基酸(氨基酸序列)

SEQ ID NO:4-4-1BB共刺激结构域与五个另外的氨基酸(氨基酸序列)

在一些实施例中，CAR的胞外结合结构域包括抗原结合结构域。在一些实施例中，所述抗原结合结构域特异性结合与疾病相关的抗原。在一些实施例中，所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。在一些实施例中，所述抗原结合结构域特异性结合任何数量的靶标，包含表面抗原、细胞质抗原或核抗原。例如，抗原结合结构域可以结合BCMA、CD2、CD3、CD4、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD33、CD38、CD44、CD52、CD70、CD99、CD138、CD123、CD274、TIM-3、表皮生长因子受体家族成员(erb1、erb2、erb3、erb4以及其突变体)、肝配蛋白(ephrin)受体家族成员(EphA1-10、EphB1-6)、前列腺特异性抗原(例如，前列腺干细胞抗原PSCA、前列腺特异性膜抗原PSMA)、胚胎抗原(例如，癌胚抗原CEA、胎儿乙酰胆碱受体)、血管内皮生长因子家族成员(VEGFR1-3)、上皮细胞粘附分子EpCAM、α-胎甲球蛋白(AFP)、粘蛋白家族成员(例如，MUC1、MUC16)、促卵泡激素受体(FSHR)、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、叶酸结合蛋白FBP、a-叶酸受体、NKG2D受体的配体、上皮糖蛋白家族成员(例如，EGP-2、EGP-4)、双唾液酸神经节苷脂(diasialogangliosides)(例如，GD2、GD3)、碳酸酐酶家族成员(例如，CAIX)和碳水化合物抗原家族成员(例如，Ley)，包含命名的蛋白质和蛋白质家族的突变体。在一些实施例中，抗原结合结构域可以结合抗体或其片段，所述抗体或其片段结合细胞质抗原或核抗原，像La/SSB抗原、GTP酶Rho家族的成员、高迁移率族蛋白的成员等。同样，抗原结合结构域可以结合T细胞受体(TCR)或其片段的α和β或γ和δ链。在一些实施例中，抗原结合结构域可以结合由人白细胞抗原类(HLA)I和II蛋白复合物呈递的肽。实例为但不限于对源自EGFR家族等蛋白质的肽具有特异性的TCR、生存素、sry样高迁移率族盒(SOX)蛋白家族、黑色素瘤相关抗原(例如，自身免疫原性癌症/睾丸抗原NY-ESO-1、黑色素瘤抗原家族A MAGEA的成员、黑色素瘤中优先表达的抗原PRAME、gp100、MART-1)以及白血病相关抗原(例如，AML1-ETO、DEK-CAN、PML-RARα、Flt3-ITD、NPM1、AurA、Bcl-2、Bl-1、BMI1、BRAP、CML28、CML66、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白E、CYP1B1、ETO/MTG8、G250/CAIX、HOXA9、hTERT、Mcl-1、MAGE、间皮素、mHAg、髓过氧化物酶、MPP11、MUC1、NuSAP1、OFA/iLRP、PASD1、PRAME、蛋白酶3、RAGE-1、RGS5、RHAMM、SSX2IP、生存素、维尔姆斯瘤(Wilms tumor)基因1(WT1))。抗原结合结构域可以结合细胞因子受体(例如，IL-13受体、IL-22受体)、NKG2D受体(例如，ULBP1、ULBP2)、EGFR家族成员或自身反应性TCR。在一些实施例中，抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。实例是但不限于磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC)、恶性肿瘤变异受体(MVR)、HLA-DR(人白细胞抗原-D相关)、AFP、CEA、CA-125、MUC-1、ETA、酪氨酸酶、MAGE、未成熟层粘连蛋白受体、TAG-72、HPV E6、HPV E7、BING-4、钙激活氯离子通道2、细胞周期蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、Her2/neu、端粒酶、间皮素、SAP-1、生存素、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、BRCA1/2、CDK4、CML66或CD19。在一些实施例中，抗原结合结构域是或包括抗体药剂。在一些实施例中，抗原结合结构域是或包括特异性结合GPC3、MVR、HLA-DR或CD19的抗体药剂。

在一些实施例中，跨膜结构域是来自选自以下的蛋白质的跨膜结构域：4-1BB/CD137、活化的NK细胞受体、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8、CD8α、CD8β、CD96(触觉的)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、与CD83特异性结合的配体、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1)、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1和VLA-6。在一些实施例中，所述跨膜结构域是来自CD8α的跨膜结构域。在一些实施例中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NO:5。在一些实施例中，跨膜结构域包含与SEQ IDNO:5至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

SEQ ID NO:5-CD8/铰链/跨膜结构域

在一些实施例中，所述胞内结构域进一步包括来自CD3ζ的胞内结构域。在一些实施例中，所述胞内结构域包括SEQ ID NO:6。在一些实施例中，所述胞内结构域包含与SEQID NO:6至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

SEQ ID NO:6-CD3ζ

在一些实施例中，CAR进一步包括T2A自切割肽。在一些实施例中，CAR进一步包括信号肽或前导序列。在一些实施例中，CAR进一步包括CD8α前导序列。在一些实施例中，CAR进一步包括flag标签序列。在一些实施例中，CAR进一步包括铰链区。在一些实施例中，所述铰链区是CD8α铰链。在一些实施例中，CAR进一步包括SEQ ID NO:7。在一些实施例中，CAR进一步包括SEQ ID NO:8。在一些实施例中，胞外结构域包含与SEQ ID NO:7或8至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

SEQ ID NO:7-CD8α前导序列

SEQ ID NO:8-Flag标签序列

GPC3CAR

磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)是由人类中的GPC3基因编码的细胞表面蛋白，并且是高频率的赘生性肝细胞重新表达的癌胚抗原(Vidali等人,2008,《肝脏病学杂志(Jhepatol)》48:399-406)。GPC3在胎肝中高度表达，并且在正常成人肝组织中不表达，但其表达在肝细胞癌中被重新活化，并且与肝癌的发展密切相关，其中GPC3表达的检出率在肝癌早期相对高并且随着肝癌的发展而升高。进一步地，GPC3也在如黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤和其它肿瘤中表达。考虑到在肝细胞癌、黑色素瘤和其它肿瘤中的高表达，GPC3已成为有用的免疫组织化学诊断测试(Anatelli等人,2008,《美国临床病理学杂志(Am J Clin Path)》130:219-223)和潜在的生物标志物(Aburatani,2005,《胃肠病学杂志(J Gastroenterol)》40.S16:1-6)。

GPC3是在器官发生中的细胞粘附中作为胞外基质或作为细胞生长因子的受体发挥作用的蛋白聚糖家族的成员。GPC3的蛋白核包括两个亚基，N端亚基和C端亚基。将糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚添加到位于GPC3的羧基(C)末端侧的位置560处的丝氨酸上。GPI锚通过与细胞膜脂质的共价结合在将GPC3定位在细胞表面上发挥作用。同样，GPC3的位置495处的丝氨酸和位置509处的丝氨酸被硫酸乙酰肝素链(HS链)修饰，其中已知HS链调控多个生长信号转导通路，如Wnt信号、FGF信号和BMP信号转导通路。已知所涉及的生长信号转导通路因癌症类型而不同。例如，在肝细胞癌(HCC)中，细胞通过Wnt信号通路的刺激生长。

本公开至少部分地提供了GPC3 CAR多肽。在一些实施例中，GPC3 CAR的胞外结合结构域包括抗原结合结构域。在一些实施例中，抗原结合结构域是或包括抗体药剂。在一些实施例中，抗原结合结构域是或包括特异性结合GPC3的抗体药剂。

在一些实施例中，嵌合抗原受体(CAR)多肽包含：i)胞外抗原结合结构域，所述胞外抗原结合结构域包括轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包括：包括SEQ ID NO:9的轻链CDR1；包括SEQ ID NO:10的轻链CDR2；以及包括SEQ ID NO:11的轻链CDR3；以及重链可变结构域，所述重链可变结构域包括：包括SEQ ID NO:12的重链CDR1；包括SEQ ID NO:13的重链CDR2；以及包括SEQ ID NO:14的重链CDR3；ii)跨膜结构域；以及iii)胞内信号传导结构域，当抗原与抗体药剂结合时，所述胞内信号传导结构域会导致T细胞活化。

	序列	SEQ ID NO:
			轻链CDR1	RSSQSLVHSNGNTYLH	9
轻链CDR2	KVSNRFS	10
			轻链CDR3	SQNTHVPPT	11
重链CDR1	DYEMH	12
			重链CDR2	ALDPKTGDTAYSQKFKG	13
重链CDR3	FYSYTY	14

在一些实施例中，CAR多肽包含：i)胞外抗原结合结构域，所述胞外抗原结合结构域包括轻链可变结构域和重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:15至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:16至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；

ii)跨膜结构域；以及iii)胞内信号传导结构域，当抗原与抗体药剂结合时，所述胞内信号传导结构域会导致T细胞活化。在一些实施例中，CAR多肽包含：i)胞外抗原结合结构域，所述胞外抗原结合结构域包括轻链可变结构域和重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:17至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:18至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列；ii)跨膜结构域；以及

iii)胞内信号传导结构域，当抗原与抗体药剂结合时，所述胞内信号传导结构域会导致T细胞活化。

在一些实施例中，CAR多肽包含：i)胞外抗原结合结构域，所述胞外抗原结合结构域包括包含SEQ ID NO:15的轻链可变结构域和包含SEQ ID NO:16的重链可变结构域；ii)跨膜结构域；以及iii)胞内信号传导结构域，当抗原与抗体药剂结合时，所述胞内信号传导结构域会导致T细胞活化。

SEQ ID NO:15-人GC33轻链可变区(氨基酸序列)

SEQ ID NO:16-人GC33重链可变区(氨基酸序列)

SEQ ID NO:17-人GC33轻链可变区(DNA序列)

SEQ ID NO:18-人GC33重链可变区(DNA序列)

MVR CAR

人白细胞抗原-DR(HLA-DR)是经典的主要组织相容性复合物II分子(Shackelford,D.A.等人,1982《免疫学评论(Immunol.Rev.)》66:133-187)。HLA-DR和其配体(长度为9个氨基酸或更长的肽)构成了T细胞受体(TCR)的配体。HLA-DR分子响应于信号传导而上调。在感染的情况下，肽(如葡萄球菌肠毒素I肽)结合到DR分子中并且呈递给在T辅助细胞上发现的T细胞受体。这些细胞然后结合B细胞表面上的抗原，从而刺激B细胞增殖。

HLA-DR的主要功能是向免疫系统呈递可能在来源上外来的肽抗原，以引发或抑制最终导致产生针对同一肽抗原的抗体的T(辅助)细胞应答。HLA-DR是αβ异源二聚体细胞表面受体，其每个亚基含有两个胞外结构域、一个跨膜结构域和一个胞质尾区。α链和β链两者都锚定在膜中。成熟蛋白的N末端结构域形成α螺旋，所述α螺旋构成结合小沟的暴露的部分，C末端细胞质区与另一条链相互作用，从而在结合小沟下形成跨细胞膜的β片层。大多数肽接触位置位于每条链的前80个残基中。

HLA-DR在抗原呈递细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞、单核细胞和B细胞)上具有受限的表达。细胞表面上HLA-DR“抗原”丰度的增加通常是对刺激的应答，并且因此HLA-DR也是免疫刺激的标志物。由于HLA-DR在B细胞恶性肿瘤中的高表达水平和在正常细胞上的有限表达谱，因此针对HLA-DR的抗体已经在临床前和临床研究中开发和测试用于B细胞恶性肿瘤。(Nagy,Z.A.等人,(2002)《自然医学(Nat.Med.)》8:801-807；DeNardo,G.L.等人,(2005)《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》11:7075s-7079s；Ivanov,A.等人,(2009)《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》119:2143-2159；Lin,T.S.等人,(2009)《白血病淋巴瘤(Leuk.Lymphoma)》50:1958-1963)。在I/II期试验中，虽然毒性不严重，但由于功效有限而停止了进一步研究(Lin,T.S.等人,(2009)《白血病淋巴瘤》50:1958-1963)。

如本文所使用的，恶性肿瘤变异受体(MVR)抗体药剂识别HLA-DR的多态性区(在美国专利申请公开第US 2016-0257762号中描述，其通过全文引用的方式并入本文中)。本公开至少部分地提供MVR CAR多肽。图1中示出了根据本公开的示例性MVR CAR构建体的示意图。在一些实施例中，CAR的胞外结构域包括抗原结合结构域。在一些实施例中，抗原结合结构域是或包括抗体药剂。在一些实施例中，抗原结合结构域是或包括特异性结合HLA-DR的抗体药剂。

在一些实施例中，CAR多肽包含抗MVR抗体药剂的单链可变片段(scFv)形式。在一些实施例中，CAR多肽包括SEQ ID NO:19。在一些实施例中，CAR包含与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

在一些实施例中，CAR多肽包含抗MVR抗体药剂的单链可变片段(scFv)形式。在一些实施例中，CAR多肽包括SEQ ID NO:20。在一些实施例中，CAR包含与SEQ ID NO:20至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

SEQ ID NO:19-MVRL2H2(氨基酸序列)

SEQ ID NO:20-MVRL2H2(DNA序列)

CD19 CAR

CD19是正常和赘生性B细胞以及滤泡树突细胞的生物标志物。CD19通过调节B细胞受体依赖性和非依赖性信号传导两者在建立内在B细胞信号传导阈值中起关键作用。此外，CD19作为成熟B细胞表面上多分子复合物的主要信号传导组分与补体受体CD21和四次跨膜蛋白CD81(TAPA-1)以及CD225一起发挥作用，其中CD19在维持体液、抗原诱导应答与耐受诱导之间的平衡方面也起关键作用。

本公开至少部分地提供了CD19 CAR多肽。在一些实施例中，CAR的胞外结构域包括抗原结合结构域。在一些实施例中，抗原结合结构域是或包括抗体药剂。在一些实施例中，抗原结合结构域是或包括特异性结合CD19的抗体药剂。

在一些实施例中，CAR多肽包含抗CD19抗体药剂的单链可变片段(scFv)形式。在一些实施例中，CAR多肽包括SEQ ID NO:21。在一些实施例中，CAR包含与SEQ ID NO:21至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

在一些实施例中，CAR多肽包含抗CD19抗体药剂的单链可变片段(scFv)形式。在一些实施例中，CAR多肽包括SEQ ID NO:22。在一些实施例中，CAR包含与SEQ ID NO:22至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

SEQ ID NO:21-CD19(氨基酸序列)

SEQ ID NO:22-CD19(DNA序列)

核酸

如本文所使用的，“核酸”用于包含包括多核苷酸的任何化合物和/或物质。示例性核酸或多核苷酸可以包含但不限于核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)。

在一些实施例中，核酸构建体包含对CAR进行编码的区，其中所述CAR包括：(a)胞外结构域，所述胞外结构域包括抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域，所述胞内结构域包括来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸。在一些实施例中，核酸构建体可以通过本领域已知的方法插入到表达载体或病毒载体中，并且核酸分子可以与表达控制序列可操作地连接。表达载体的非限制性实例包含质粒载体、转座子载体、粘粒载体和病毒源性载体(例如，任何腺病毒源性载体(AV)、巨细胞病毒源性(CMV)载体、猿猴病毒源性(SV40)载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体)。在一些实施例中，所述表达载体是病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体是慢病毒载体。

在一些实施例中，所述表达载体进一步包括与核酸可操作地连接的启动子。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是诱导型启动子。在一些实施例中，所述表达载体包括SEQ ID NO:23、24、25、26、27和/或28。在一些实施例中，所述表达载体包含与SEQ ID NO:23、24、25、26、27和/或28至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。

SEQ ID NO:23-EF1α-启动子

SEQ ID NO:24-U5重复序列

SEQ ID NO:25-Gag/Pol

SEQ ID NO:26-cPPT

SEQ ID NO:27-土拨鼠/PRE

SEQ ID NO:28-R/区

慢病毒载体源自慢病毒。慢病毒载体基于单链RNA慢病毒，所述单链RNA慢病毒是逆转录病毒的亚类。慢病毒载体将中等克隆能力的优势与稳定的基因表达组合，其中所述慢病毒载体能够转导分裂细胞和非分裂细胞，包含神经元。感染后，慢病毒基因组将转基因整合到宿主基因组中并且促进长期基因表达。如基于HIV的载体等慢病毒载体是示例性的用于基因递送的逆转录病毒载体。不同于其它逆转录病毒，已知基于HIV的载体将其乘客基因并入到非分裂细胞中，并且因此可以用于治疗持续性疾病形式。

可以将另外的序列添加到此类克隆和/或表达序列中，以优化其在克隆和/或表达中的功能，以便帮助多核苷酸的分离或改善多核苷酸向细胞中的引入。克隆载体、表达载体、衔接子和连接子的使用是本领域熟知的。

在一些实施例中，将核酸分子插入到在引入到工程化免疫细胞中时能够表达本公开的CAR的载体中。在一些实施例中，工程化免疫细胞是T细胞。

CAR-T细胞的产生

本文提供了用于产生包括CAR的免疫细胞的方法。在一些实施例中，其中引入CAR的免疫细胞是人免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞是自体人免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞是同种异体人免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞是CD4⁺ T细胞(辅助T细胞，Th细胞)、CD8⁺ T细胞(细胞毒性T细胞，CTL)、记忆T细胞、调控性T细胞(Treg细胞)、凋亡性T细胞，但不限于此。在一些实施例中，所述免疫细胞是NK细胞。

在一些实施例中，免疫细胞的病毒感染可以包括用CAR表达载体和包装质粒转染宿主细胞(例如，293T细胞、PBMC、Plat-GP细胞或PA317)以制备重组病毒以及用所述重组病毒感染免疫细胞。病毒感染方法可以通过本领域已知的任何方法执行。在一些实施例中，CAR表达载体向免疫细胞的转移可以通过用流式细胞术、Northern印迹、Southern印迹、PCR(例如，RT-PCR)、ELISA或蛋白质印迹检查CAR的表达或检查插入在载体中的标志物基因的表达来确认。

在一些实施例中，本公开提供了产生工程化免疫细胞的方法，所述方法包括：将以下各项引入到免疫细胞中：(i)对CAR进行编码的核酸，其中所述CAR包括：(a)胞外结构域，所述胞外结构域包括抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域，所述胞内结构域包括共刺激内结构域，其中所述共刺激内结构域包括来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸；或(ii)包括对CAR进行编码的核酸的载体，其中所述CAR包括：(a)胞外结构域，所述胞外结构域包括抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域，所述胞内结构域包括共刺激内结构域，其中所述共刺激内结构域包括来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸。

在一些实施例中，为了增加细胞质信号结构域4-1BB中的免疫功效，在用于产生CAR作为共刺激信号因子的4-1BB细胞质结构域中添加5个氨基酸。在一些实施例中，完整的构建体包括：抗原结合结构域，所述抗原结合结构域是scFv；EF1-α启动子；人CD8的铰链区和跨膜结构域；以及胞内信号传导结构域。具体地，胞内信号传导结构域包括刺激结构域和共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，跨膜结构域可以包含T细胞受体的α、β或ζ链，或CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154中的一种或多种，但不限于此。在一些实施例中，跨膜结构域包含CD8。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含CD3ζ初级信号传导结构域中的共刺激信号传导结构域，所述共刺激信号传导结构域选自CD28、0X40、CD27、ICAM-1、ICOS(CD278)和4-1BB/CD137。在一些实施例中，共刺激结构域包括4-1BB，向所述4-1BB添加5个连续的氨基酸。在一些实施例中，跨膜结构域连接到CD3ζ。

在一些实施例中，一种产生本公开的工程化免疫细胞的方法进一步包括体外培养所述工程化免疫细胞持续至少3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天。

在一些实施例中，产生工程化免疫细胞的方法进一步包括在所述引入步骤之后，培养所述工程化免疫细胞。在一些实施例中，产生工程化免疫细胞的方法进一步包括在所述引入步骤之前，从受试者获得所述免疫细胞。

在本公开的上下文中，可以使用本领域已知的用于在免疫细胞中表达CAR的任何方法。例如，存在本领域已知的多种用于表达的核酸载体，如线性多核苷酸、结合离子或两亲性化合物的多核苷酸、质粒或病毒载体，即使本公开不限于此。在一些实施例中，用于在免疫细胞中表达CAR的载体可以是或包含自主复制的质粒或病毒或其衍生物。病毒载体可以包含但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施例中，可以使用是逆转录病毒载体的慢病毒载体。在一些实施例中，载体是非质粒和非病毒化合物，例如脂质体。

本公开涵盖认识到通过本文描述的方法产生的CAR-T细胞可以在治疗上有用(例如，用于治疗癌症)。

治疗应用

本文提供了治疗患有癌症或其它恶性肿瘤的受试者的方法，其中所述方法包括向受试者施用包括或递送包括CAR的免疫细胞的组合物。在一些实施例中，所述癌症是抗磷脂酰肌醇聚糖-3相关癌症。在一些实施例中，所述癌症是抗CD19相关癌症。在一些实施例中，所述癌症是抗MVR相关癌症。

癌症可以指一大类疾病，其特征在于身体内异常细胞的不受控生长。不受调控的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，所述恶性肿瘤侵入邻近组织，并且也可以通过淋巴系统或血流转移到身体的远隔部位。癌症或癌组织可以包含肿瘤。

“抗磷脂酰肌醇聚糖-3相关癌症”是特征在于癌细胞表面上存在磷脂酰肌醇聚糖-3的癌症。膜结合的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖GPC3在大约70％到80％的肝细胞癌中过表达，但在健康组织中通常不表达。另外，在若干种肿瘤中发现GPC3过表达，如但不限于肝细胞癌、肝母细胞瘤、生殖细胞肿瘤(例如，卵黄囊瘤、绒毛膜癌)、维尔姆斯瘤、胃癌、非小细胞肺癌和甲状腺癌。

“抗CD19相关癌症”是特征在于CD19表达的癌症，其中CD19示出在B细胞发育和成熟中发挥重要作用。CD19表达在大多数B细胞肿瘤中高度保守。CD19在大多数急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和B细胞淋巴瘤中表达。

“抗MVR相关癌症”的特征在于癌细胞相对于来自受试者的非癌细胞具有增加的HLA-DR抗原表达。在一些实施例中，具有较高HLA-DR抗原表达的癌症可以包含但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道癌、头颈癌、血液癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰腺癌和前列腺癌。在一些实施例中，与HLA-DR表达相关的疾病包含但不限于非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病状或表达HLA-DR的增殖性疾病或其任何组合。

在一些实施例中，通过本公开的方法治疗的癌症可以包含但不限于癌、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。在一些实施例中，癌症可以包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(liver carcinoma)、白血病和其它淋巴组织增殖性病症以及各种类型的头颈癌。

在一些实施例中，适合于通过本公开的方法治疗的癌症是血液癌症。在一些实施例中，血液癌症是白血病。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：一种或多种急性白血病，包含但不限于B细胞急性淋巴性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴性白血病(“TALL”)、急性淋巴性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包含但不限于慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；另外的血液癌症或血液病状，包含但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞赘生物、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增殖性病状、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增殖异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞赘生物、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)和“白血病前期”，这些是由髓系血细胞的无效产生(或发育不良)联合起来的血液病状的多种集合。

在一些实施例中，通过本公开的方法治疗的癌症是B细胞淋巴瘤(即，B细胞起源的恶性淋巴瘤)。B细胞淋巴瘤包含霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、结节边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病和AIDS相关淋巴瘤，但不特别限于此，只要所述B细胞淋巴瘤是B细胞来源的淋巴瘤。

免疫细胞(例如，CAR-T细胞)可以以治疗有效量施用于有需要的患者。例如，免疫细胞(例如，CAR-T细胞)的治疗有效量可以为至少约10⁴个细胞、至少约10⁵个细胞、至少约10⁶个细胞、至少约10⁷个细胞、至少约10⁸个细胞、至少约10⁹或至少约10¹⁰。在一些实施例中，T细胞的治疗有效量为约10⁴个细胞、约10⁵个细胞、约10⁶个细胞、约10⁷个细胞或约10⁸个细胞。在一些实施例中，T细胞的治疗有效量介于约0.4×10⁸个与约2×10⁸个T细胞之间。在一些实施例中，T细胞的治疗有效量为约0.4×10⁸个、约0.5×10⁸个、约0.6×10⁸个、约0.7×10⁸个、约0.8×10⁸个、约0.9×10⁸个、约1.0×10⁸个、约1.1×10⁸个、约1.2×10⁸个、约1.3×10⁸个、约1.4×10⁸个、约1.5×10⁸个、约1.6×10⁸个、约1.7×10⁸个、约1.8×10⁸个、约1.9×10⁸或约2.0×10⁸个T细胞。

在一些实施例中，CAR T细胞的治疗有效量为约2×10⁶个细胞/kg、约3×10⁶个细胞/kg、约4×10⁶个细胞/kg、约5×10⁶个细胞/kg、约6×10⁶个细胞/kg、约7×10⁶个细胞/kg、约8×10⁶个细胞/kg、约9×10⁶个细胞/kg、约1×10⁷个细胞/kg、约2×10⁷个细胞/kg、约3×10⁷个细胞/kg、约4×10⁷个细胞/kg、约5×10⁷个细胞/kg、约6×10⁷个细胞/kg、约7×10⁷个细胞/kg、约8×10⁷个细胞/kg或约9×10⁷个细胞/kg。在一些实施例中，免疫细胞(例如，CAR-T细胞)的治疗有效量为介于每kg体重约1×10⁶个与约2×10⁶个T细胞之间到最大剂量约1×10⁸个T细胞。在一些实施例中，T细胞的治疗有效量为每kg体重约1×10⁶个或约2×10⁶个T细胞到最大剂量约1×10⁸个T细胞。

细胞的数目将取决于组合物期望的最终用途，其中包含的细胞的类型也是如此。例如，在一些实施例中，包括CAR的T细胞群将含有大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％或大于35％的此类细胞。在一些实施例中，包括CAR的T细胞群将含有10％到50％、15％到45％、20％到40％、25％到35％或20％到30％的此类T细胞。在一些实施例中，用于施用的T细胞群的体积为一升或更少。在一些实施例中，用于施用的T细胞的体积小于500ml、小于250ml或100ml或更小。在一些实施例中，期望的T细胞的密度通常大于10⁶个细胞/ml，并且通常大于10⁷个细胞/ml，通常为10⁸个细胞/ml或更大。临床相关数目的免疫细胞可以分配到累积等于或超过10⁷个细胞、10⁸个细胞、10⁹个细胞、10¹⁰个细胞、10¹¹个细胞或10¹²个细胞的多次输注中。

在一些实施例中，组合物可以肠胃外施用于患者。在一些实施例中，包括或递送包括CAR的T细胞的组合物可以在一次或多次施用中肠胃外施用于患者。在一些实施例中，包括或递送包括CAR的T细胞的组合物可以每天一次、每2到7天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每三个月一次或每6个月一次肠胃外施用于患者。

在一些实施例中，本公开提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括CAR的工程化免疫细胞，其中所述CAR包括：(a)胞外结构域，所述胞外结构域包括抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域，所述胞内结构域包括共刺激内结构域，其中所述共刺激内结构域包括来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸。

在一些实施例中，所述受试者先前已被施用选自由以下组成的组的一种或多种另外的抗癌疗法：电离辐射、化学治疗剂、治疗性抗体和检查点抑制剂。在一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有癌症。

药物组合物

在一些实施例中，本公开提供了药物组合物，所述药物组合物包含包括CAR的T细胞以及药学上可接受的载体，其中所述CAR包括：(a)胞外结构域，所述胞外结构域包括抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内结构域，所述胞内结构域包括共刺激内结构域，其中所述共刺激内结构域包括来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸。在一些实施例中，包括CAR的T细胞是自体T细胞。在一些实施例中，药物组合物可以包含缓冲剂、稀释剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂、佐剂、赋形剂或其任何组合。在一些实施例中，如果期望的话，组合物还可以含有一种或多种另外的治疗活性物质。

在一些实施例中，通过首先从培养基中采集T细胞，并且然后在适合于以治疗有效量施用的介质和容器系统(“药学上可接受的”载体)中洗涤并且浓缩细胞来调配本公开的T细胞。合适的输注介质可以是任何等渗介质调配物，通常是生理盐水，Normosol R(雅培公司(Abbott))或血浆-裂解物A(百特公司(Baxter))，但是也可以使用在水中或林格氏乳酸中的5％葡萄糖。输注介质可以用人血清白蛋白补充。

在一些实施例中，组合物被调配成用于肠胃外施用。例如，本文提供的药物组合物可以以无菌可注射形式(例如，适合于皮下注射或静脉内输注的形式)提供。例如，在一些实施例中，药物组合物以适合于注射的液体剂型提供。在一些实施例中，药物组合物以粉末形式(例如，冻干的和/或灭菌的)提供，任选地在真空下，其可以在注射前用水性稀释剂(例如，水、缓冲液、盐溶液等)重构。在一些实施例中，药物组合物在水、氯化钠溶液、乙酸钠溶液、苯甲醇溶液、磷酸盐缓冲盐水等中稀释和/或重构。在一些实施例中，粉末应平缓地与水性稀释剂混合(例如，不振荡)。

在一些实施例中，本公开的包括CAR和/或对CAR进行编码的核酸的T细胞与药学上可接受的肠胃外媒剂一起调配。此类媒剂的实例是水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和1％-10％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和如固定油等非水性媒剂。媒剂或冻干粉末可以含有维持等渗性(例如，氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如，缓冲剂和防腐剂)的添加剂。在一些实施例中，调配物是通过已知的或合适的技术灭菌的。药物组合物可以另外地包括药学上可接受的赋形剂，如本文所使用的，所述赋形剂包括如适用于期望的特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等等。《雷明顿的科学与实践药学(Remington's The Science and Practice of Pharmacy)》,第21版,A.R.Gennaro(马里兰州巴尔的摩利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD),2006)公开了用于调配药物组合物的各种赋形剂及其制备的已知技术。除非任何常规的赋形剂介质与某种物质或其衍生物不相容，如通过产生任何不期望的生物学作用或以其它有害的方式与药物组合物的任何其它一种或多种组分进行相互作用，否则设想其将在本公开的范围内使用。

在一些实施例中，稳定地调配本公开的包含包括CAR和/或对CAR进行编码的核酸的T细胞群的组合物。在一些实施例中，包括本公开的CAR和/或对CAR进行编码的核酸的T细胞群的稳定调配物可以包括含盐水或选择的盐的磷酸盐缓冲液、以及含有防腐剂的防腐溶液和调配物以及适用于药物或兽医用途的多用途防腐调配物。在水性稀释剂中，防腐调配物含有至少一种已知防腐剂或任选地选自由以下组成的组：至少一种苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如，六水合物)、烷基对羟基苯甲酸酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物。可以使用如本领域已知的任何合适的浓度或混合物，如0.001-5％或其中的任何范围或值，如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或其中的任何范围或值。非限制性实例包含无防腐剂、0.1-2％间甲酚(例如，0.2、0.30.4、0.5、0.9、1.0％)、0.1-3％苯甲醇(例如，0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、0.001-0.5％硫柳汞(例如，0.005、0.01)、0.001-2.0％苯酚(例如，0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％烷基对羟基苯甲酸酯(例如，0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等等。

在一些实施例中，药物组合物以可以冷藏和/或冷冻的形式提供。在一些实施例中，药物组合物以不可以冷藏和/或冷冻的形式提供。在一些实施例中，重构溶液和/或液体剂型可以在重构之后储存一定时间段(例如，2小时、12小时、24小时、2天、5天、7天、10天、2周、一个月、两个月或更长)。在一些实施例中，将包含抗体药剂的组合物储存超过指定时间会导致所述抗体药剂降解。在施用之前，液体剂型和/或重构溶液可以包括微粒物质和/或脱色。在一些实施例中，如果脱色或混浊和/或如果在过滤之后微粒物质保留，则不应使用溶液。可以在例如《雷明顿：药学科学与实践》,第21次编辑,利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司,2005中找到药剂的调配和/或制造中的一般考虑因素。

在一些实施例中，包含包括本公开的CAR和/或对CAR进行编码的核酸的T细胞的药物组合物可以包含在用于储存或施用的容器中，例如，小瓶、注射器(例如，静脉内注射器)或袋子(例如，静脉内输液袋)。根据本公开的药物组合物可以作为单次单位剂量和/或作为多个单次单位剂量批量制备、包装和/或出售。如本文所使用的，“单位剂量”是包括预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将向受试者施用的活性成分的剂量和/或此类剂量的便利分率，例如此类剂量的一半或三分之一。

试剂盒

本公开进一步提供了试剂盒，所述试剂盒包括一个或多个容器，所述容器中填充有如本文所描述的至少一种CAR和/或对CAR进行编码的核酸。试剂盒可以用于任何适用的方法，包含例如治疗方法、诊断方法、细胞增殖和/或分离方法等。与此类容器任选地相关的可以是呈由调控药物或生物产品的制造、使用或出售的政府机构指定的形式的通知，所述通知反映(a)由所述机构批准制造、使用或出售用于人类施用，(b)使用说明或两者。

在一些实施例中，试剂盒可以包含用于检测(例如，检测CAR和/或对CAR进行编码的核酸)的一种或多种试剂。在一些实施例中，试剂盒可以包含呈可检测形式(例如，与可检测部分或实体共价缔合)的CAR和/或对CAR进行编码的核酸。在一些实施例中，如本文提供的一种或多种CAR和/或对CAR进行编码的核酸可以包含在用于治疗受试者的试剂盒中。在一些实施例中，如本文提供的CAR和/或对CAR进行编码的核酸可以包含在用于制备表达CAR的自体T细胞的试剂盒中。

在一些实施例中，试剂盒可以提供一种、两种、三种、四种或更多种抗原特异性抗体药剂，其中每种都适合于克隆到CAR构建体中。在一些实施例中，试剂盒可以提供用于测定抗体药剂和/或CAR和/或CAR T细胞对从受试者鉴定或分离的T细胞的结合亲和力的其它试剂。在一些实施例中，试剂盒可以提供用于测定抗体药剂和/或CAR和/或CAR T细胞对受试者的T细胞的功能亲合力的其它试剂。

实例

本公开在以下实例中进一步描述，所述实例不限制权利要求中所描述的本公开的范围。

实例1-GPC3慢病毒转移质粒

使用本领域已知的标准DNA克隆技术，通过连接VH和VL区产生对人源化抗GC33抗体药剂的单链可变片段(scFv)形式(图2)进行编码的DNA构建体。表1中示出了本文使用的慢病毒转移质粒。

表1.

huGC33 VH-VL-scFv被克隆到慢病毒载体pELPS4-MVRL2H2-euBBz中，其中pELPS4-MVRL2H2-euBBz是包含共刺激结构域4-1BB和五个另外的氨基酸的慢病毒载体。用限制酶消化慢病毒载体构建体pELPS4-huGC33 VH-VL，其中图3中示出了限制酶消化结果。

为了创建CAR构建体而不需要在4-1BB共刺激结构域的五个另外的氨基酸，将huGC33 VH-VL-scFv克隆到慢病毒载体pELPS2-CD19-BBz中，其中pELPS2-CD19-BBz是包含没有五个另外的氨基酸的共刺激结构域4-1BB的慢病毒载体。用限制酶消化慢病毒载体构建体huGC33(VH-VL)-BBz，其中图4中示出了限制酶消化结果。

实例2-GPC3 CAR-T细胞的药物组合物

通过将PBMC冷冻管(5×10⁷个细胞/1mL/瓶)放置在水浴中持续2-3分钟来解冻和活化PBMC。将10mL CAR-T细胞培养基和1mL PBMC放置在50mL锥形管中，并且以1500rpm离心5分钟。去除上清液，并且在将5mL细胞重新悬浮于新鲜培养基中之后对CAR-T细胞进行计数。加入新鲜细胞培养基以将细胞密度调整为1×10⁶个细胞/mL。向每1×10⁶个细胞加入10μL的T细胞活化珠粒，并且向培养基补充IL-2。在CO₂ 5％和37℃下，在温育箱中在T75烧瓶中培养细胞培养基。

然后通过用编码CAR的慢病毒对经活化的T细胞进行旋转接种来产生CAR-T细胞。对来自细胞培养物的经活化的PBMC进行计数，并且在存在500μL细胞培养基和慢病毒的情况下将细胞接种在24孔板中。旋转接种转导后，在补充有IL-2的细胞培养基中培养来自1孔的经转导的细胞。

每2-3天对经培养的CAR-T细胞进行计数，并且每次计数后加入新鲜培养基和IL-2(图5)。在第12天，采集经培养的CAR-T细胞并且在-80℃下储存在冷冻容器中。

在培养的第12天分析CAR表达，并且结果示出对照组未示出表达，而CAR-T细胞组示出54-66％CAR表达(图6)。

采集靶细胞(GPC3阳性细胞系)并且将其接种在96孔U形底板中。然后将效应细胞(CAR-T细胞)以10:1、3:1、1:1、0.3:1的效应细胞:靶细胞比率加入孔，并且在37℃下温育24小时。温育后，将CytoTox96试剂加入每个孔，并且通过测量490nm处的吸光度来定量细胞毒性(图7)。

实例3-体内huGC33(VH-VL)-BBz CAR-T细胞和huGC33(VH-VL)-euBBz CAR-T细胞

为了验证和比较huGC33(VH-VL)-BBz CAR-T细胞和huGC33(VH-VL)-euBBz CAR-T细胞的功效，将Huh-7_Luf-GFP细胞(2×10⁶个细胞/200μL/头)注射到NSG小鼠(6-8周龄，雄性)中，并且在注射后35天后，将肿瘤大小为约200mm³的小鼠分成5组，每组4只小鼠。对照组接受5％HSA注射，而其它组接受CAR-T细胞注射。通过使用TM900每周两次测量肿瘤大小来观察肿瘤的生长(图8)。

CAR-T细胞施用后，每周一次对小鼠进行眼眶血液采集，其中100μL每份血液样品以12,000rpm离心10分钟，以确认CAR-T细胞的比例和细胞计数。将100μL血液放置在FACS管中，并且使用Zombie NIR^TM可固定活力试剂盒进行活/死细胞染色。在达到0.1μL/100μDPBS/管的浓度后，在室温下执行染色持续10分钟。将计数珠粒25μL、CD45 0.5μL、CD8 0.5μL、CD45RO 1.0μL、CD62L 1.0μL、PD-1 1.0μL、Tim-3 1.0μL、CD4 0.5μL、CD69 0.5μL和Flag0.0125μL加入100μL FACS缓冲液中，并且在室温下染色持续30分钟。30分钟后，加入IX RBC裂解缓冲液并且在室温下反应5分钟。在以2,000rpm离心4分钟后，丢弃所有上清液。将2mLFACS缓冲液加入管中并且以2,000rpm离心4分钟，并且使用FACSCelesta进行分析(图9)。

在CAR-T注射后6周后，采集小鼠脾脏、肝脏和骨髓以评估huGC33(VH-VL)-BBzCAR-T细胞与huGC33(VH-VL)-euBBz CAR-T细胞的比率。处理组织样品并且通过40μm细胞滤网过滤，然后以2,000rpm离心5分钟并且丢弃所有上清液。加入5μL IX ACK缓冲液并且反应10分钟。然后，加入10mL DPBS并且以2,000rpm离心5分钟。如上文所描述的进行FACS染色(图10)。

实例4-CD19-euBBz CAR的构建

为了增加细胞质信号结构域4-1BB的免疫功效，在CAR-T中使用的4-1BB细胞质结构域中加入5个氨基酸作为共刺激信号因子，以新构建CAR表达载体(CD19-euBBz CAR)。完成的构建体包括是scFv的抗CD 19，所述scFv包含EF1α启动子、铰链区和人CD8的跨膜结构域以及胞内信号传导结构域。具体地，胞内信号传导结构域由刺激结构域和共刺激信号传导结构域组成。胞内信号传导结构域是共刺激信号结构域4-1BB，所述4-1BB中添加了5个连续的氨基酸，CD3ζ与所述氨基酸连接。最终产生的CAR基因片段与用BamH I和Sal I切割的ELPS慢病毒表达载体缀合。另外，使用BamH I/Nhe I限制酶执行克隆以仅替换scFv部分。

实例5-CD19-euBBz和CD19-BBz CAR-T细胞

用于产生重组慢病毒的293T细胞培养物含有包括10％FBS(密理博公司(Millipore)，TMS-013-BKR)和含1×P/S(吉博科公司(Gibco)，15140-122)的高葡萄糖DMEM(威健公司(Welgene)，LM001-05)的培养基。在37℃5％CO₂温育箱中转导之前，在包括10％FBS的DMEM培养基中温育293T细胞持续24小时。第二天转染时，将转染试剂和慢病毒质粒按适当比例混合，并且温育持续48小时。然后收集含慢病毒的上清液并且以400x g离心10分钟。另外，使用50mL注射器用0.45μm注射器过滤器过滤上清液。将所获得的上清液与慢病毒富集试剂盒(克隆泰克公司(Clontech)，631231)按3:1混合，并且在4℃下反应24小时到48小时。然后在4℃下并且以4,000rpm离心2小时以获得病毒，将所述病毒重新悬浮于不包括FBS的0.5mL RPMI(威健公司,LM001-01)中以产生慢病毒。

为了确定哺乳动物细胞的转导效率，通过使用Jurkat细胞分析实际具有转导能力的慢病毒的颗粒计数来测量转化单元(TU/mL)。CAR表达可以通过FACS进行测定。第一天，将Jurkat细胞以每孔1×10⁵个细胞/100μL接种到96孔板中。第二天，慢病毒在96孔板中连续稀释1/3，并且对已经接种的Jurkat细胞执行慢病毒转导。此时，通过将聚凝胺(密理博公司)引入到RPMI培养基(10％FBS和1×P/S)中，进一步增加了慢病毒的转导。在1200xg和32℃下离心2小时后，在37℃5％CO₂温育箱中温育细胞持续3小时，并且每孔仅加入100μLRPMI。在第5天，用抗Flag-DYKDDDDK(生物传奇公司(Biolegend)，目录号637310)对感染到细胞中的慢病毒的flag进行染色，以分析用流式细胞仪转导的细胞的百分比。使用此，如在Follenzi和Naldini,2002(Follenzi和Naldini,2002)中所描述的计算滴度。

执行FACS染色以确认温育14天后两种CAR-T细胞的产生比例。对于每种CAR-T细胞类型，在FACS管(福尔肯(FALCON)，目录号352052)中收集2×10⁵个细胞，并且然后加入2mLFACS缓冲液，并且使用离心机(赛默(Thermo)，ST16)以2,000rpm离心5分钟。丢弃上清液后，加入0.5μL/管抗CD8 APC(SKI，生物传奇公司，目录号344722)、0.5μL/管抗CD4 BV650(RPA-T4，生物传奇公司，目录号300536)和0.125μL/管抗flag PE(L5，生物传奇公司，目录号637310)，并且在室温下染色30分钟。在加入2mL FACS缓冲液并且以2,000rpm离心5分钟后，再重复此过程一次。为了对存活/死细胞进行染色，加入1μL/管7-AAD(生物传奇公司，目录号420404)并且将混合物在室温下放置5分钟，并且然后使用FACS(BD，FACSCelesta)进行分析。

使用FACS染色确认所产生的CD19 CAR-T细胞的比例确认，在经改进的构建体CD19-euBBZ CAR-T细胞的情况下，细胞比率为CD4+/CAR+29.4％、CD8+/CAR+50.8％以及总CAR-T 80.2％。确认了对于非构建体改进的CD19-BBz CAR-T细胞，CD4+/CAR+的细胞比率为42.7％，CD8+/CAR+的细胞比率为29.3％，并且总CAR-T的细胞比率为72.0％。因此，确认了CD19-euBBz CAR-T细胞的CAR表达比CD19-BBz CAR-T细胞高8.2％，并且CD8+/CAR+细胞为21.5％或约2倍一样多。(图11A)

实例6-所产生的CD19 CAR-T细胞的细胞毒性确认

为了确定培养14天的两种CAR-T细胞类型的细胞毒性，使CAR-T(E):LCL(T)以30:1、10:1、3:1和1:1的比例存在于96孔白板(康宁(Corning)，目录号3917)中。首先，将CAR-T细胞分别以6×10⁵个细胞/50μL、2×10⁵个细胞/50μL、9×10⁴个细胞/50μL和2×10⁴个细胞/50μL放置在孔中。接下来，将靶细胞系，即CBK LCL-Luc细胞系，在37℃CO₂温育箱(Mammert，INCO153med)中加入2×10⁴个细胞/50μL并且反应4小时。4小时后，将100μL Bright-Glo^TM(普洛麦格(Promega)，目录号E2620)加入每个孔中，并且5分钟后，使用光度计(赛默，Fluoroskan FL)测量相对光单位(RLU)值。

发现在引入常规4-1BB的CAR-T细胞与引入含添加到4-1BB结构域的5个氨基酸的euBBz的CAR-T细胞之间的细胞毒性没有差异。

结果示出，当两种CAR-T细胞和CBK LCL-Luc细胞系以30:1的比例一起温育时，发现4小时后细胞毒性为约80％，并且当以10:1的比例温育时，细胞毒性为约50％。随着用癌细胞温育的CAR-T细胞的相应数量减少3倍，细胞毒性降低约3倍；另外，当在体外将5个氨基酸加入到4-1BB结构域时，确认了这不影响体外细胞毒性。(图11B)

实例7-通过自动卡尺和IVIS成像进行的皮下动物模型诱导和CAR-T验证

对于实验动物，在动物保育室中在恒定条件下使用和管理NSG(NOD-scid IL2rγμL1)小鼠(杰克逊实验室(The Jackson Laboratory))。温度为23±2℃，并且12小时亮/暗循环以及湿度50±10％；随意提供饲料和饮品。在使用CD19-euBBz CAR-T并且在4-1BB结构域中加入五个氨基酸的功效实验中，CBK LCL-Luc细胞系以2×10⁶个细胞/100μL DPBS/头制备，并且皮下注射到6周龄雌性小鼠中以诱导皮下动物模型。当如使用自动卡尺(亦柏(Youngbio)，TM900)测量的癌大小达到介于50与100mm³之间时，CD19-euBBz CAR-T细胞和CD19-BBz CAR-T细胞以2×10⁶个细胞/100μL DPBS/头(剂量1)和6×10⁶个细胞/100μLDPBS/头(剂量2)通过尾静脉施用一次，以确认功效。在所有动物实验中，都会定期确认癌大小和活力。

更具体地，使用自动卡尺和IVIS成像设备(珀金埃尔默(PerkinElmer)，LunaIII)，在CAR-T施用后每隔3天和4天测量癌大小和光子值(图12、13)。在使用TM900的情况下，在将设备放置在癌位点后确定癌大小。当使用IVIS成像装置确认成像和光子值时，首先对小鼠腹膜内施用150mg/kg XenoLight^TM D-荧光素(珀金埃尔默，目录号122799)。15分钟后，使用异氟烷诱导吸入麻醉，并且5分钟后，使用IVIS对癌细胞的存在进行成像。成像后，执行归一化，并且然后确认荧光素酶值(光子值)并且作图。在使用CBK LCL-Luc细胞系构建皮下动物模型后，使用IVIS成像比较CD19-BBz CAR-T和CD19-euBBz CAR-T细胞的效果。如图12中示出的，可以在施用2种CAR-T细胞后1周内确认效果。

在以2×10⁶个细胞/100μL DPBS/头和6×10⁶个细胞/100μL DPBS/头施用CD19-euBBz CAR-T细胞的实验组中，施用1周后在IVIS成像上观察到癌细胞。另外，在用CD19-BBzCAR-T处理的组中，当施用6×10⁶个细胞/100μL DPBS/头时，通过在施用1周内成像很少观察到癌细胞。然而，1周后，在施用CD19-BBz CAR-T的实验组中鉴定出癌细胞。

CAR-T施用后1周后，如成像所示出的，确定成像过程后在每个受试者中成像的荧光素酶的值；仅在以2×10⁶个细胞/100μL DPBS/头施用CD19 CAR-T的组中确认荧光素酶值。当在此后3周或更长时间观察时，肿瘤在未施用CAR-T细胞的小鼠中继续生长，并且在癌细胞最初消失的三个实验组中没有鉴定出癌细胞。然而，10天后，接受2×10⁶个细胞/100μLDPBS/头的CD19 CAR-T的组中的荧光素酶水平下降，但3周后癌细胞并未完全消失。当施用CD19-euBBz CAR-T 2×10⁶个细胞/100μL DPBS/头时，通过对癌细胞的实验成像发现，功效与以6×10⁶个细胞/100μL DPBS/头用CD19-BBz CAR-T处理的组类似。结果示出CD19-euBBzCAR-T和CD19-BBz CAR-T体外细胞毒性没有差异，但是确认了所述功效是CD19-euBBz CAR-T在动物模型中的功效的5倍。(图12)

实例8-CD19-euBBz CAR-T在体内动物模型中的比例的确认

在皮下动物模型中施用CAR-T细胞以验证经改进的构建体CAR-T细胞的功效后，从小鼠血液中确认了CAR-T的存在。更具体地，在CAR-T施用后，以3天和4天的间隔对小鼠执行眼眶血液采集。在每次血液采集时，采集70μL血液，并且60μL的血液用于确认CAR-T细胞比例和细胞计数。将60μL血液放置在5mL FACS管中，并且使用Zombie Aqua BV510(生物传奇公司，目录号423101)进行活/死细胞染色。在达到0.1μL/100μL DPBS/管的浓度后，在室温下执行染色持续10分钟。由于对珠粒(Molecularprobes，目录号C36950)进行计数，添加抗CD45 FITC(HI30，生物传奇公司，目录号304006)、抗CD8 BV786(SK-1，生物传奇公司，目录号344740)、抗CD4 BV650和抗flag PE并且在室温下染色30分钟。以0.5μL/100μL FACS缓冲液/管混合每种抗体，并且向其中加入25μL计数珠粒。30分钟后，加入2mL 1X RBC裂解缓冲液(生物传奇公司，目录号422401)并且在

室温下反应5分钟。在使用离心机以2,000rpm离心5分钟后，丢弃所有上清液。向此管中加入2mL FACS洗涤缓冲液，并且以2,000rpm离心5分钟。此过程再重复一次，并且然后加入50μL FACS缓冲液并且使用FACS进行分析。

在CAR-T细胞施用后一周，在CD19-euBBz CAR-T处理组中，在2×10⁶个细胞/100μLDPBS/头组和6×10⁶个细胞/100μL DPBS/头组两者的血液中确认了大约20％CD19-euBBzCAR-T细胞；但是在施用CD19-BBz CAR-T的组中，当施用6×10⁶个细胞/100μL DPBS/头时，仅确认了5％CD19 CAR-T。3天后，小鼠体内CAR-T细胞的数量和比例达到最大并且减少。一周内，在鉴定出CAR-T细胞的3个实验组中(CD19-euBBz CAR-T；2×10⁶个细胞/100μL DPBS/头和6×10⁶个细胞/100μL DPBS/头，CD19-BBz CAR-T；6×10⁶个细胞/100μL DPBS/头)，癌细胞被迅速杀死，因为所述癌细胞可能在其在小鼠体内增殖之前接触到相对较多的CAR-T细胞。然而，在以2×10⁶个细胞/100μL DPBS/头施用CD19-BBz CAR-T的实验组中，CAR-T细胞的比例和数量在2周时达到最大，并且CAR-T比例为约25％，其中癌细胞增殖相对较好。在CAR-T比例最初增加并且之后减少之后，CD19-euBBz CAR-T在数量上比CD19-BBz CAR-T更稳定。然而，在CD19-BBz CAR-T的情况下，CAR-T细胞的比例在稍晚的时间增加和减少，并且因此肿瘤在小鼠体内消失花费更长的时间。因此，如在此实验的结果中一样，以2×10⁶个细胞/100μL DPBS/头施用CD19-euBBz CAR-T的组在小鼠中表现出与以6×10⁶个细胞/100μLDPBS/头施用CD19-BBz CAR-T的组类似的CAR-T水平和效果，指示CD19-euBBz CAR-T具有优越的效果。(图14)。

序列表

<110> Eutilex有限公司（Eutilex Co., Ltd.）

<120> 具有4-1BB共刺激结构域的嵌合抗原受体

<130> 47683-0044WO1

<150> 62/867,503

<151> 2019-06-27

<150> PCT/KR2019/010244

<151> 2019-08-12

<150> 16/715,462

<151> 2019-12-16

<150> 62/991,493

<151> 2020-03-18

<150> 63/004,827

<151> 2020-04-03

<150> 63/043,237

<151> 2020-06-24

<160> 28

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 1

cgtttctctg ttgtt 15

<210> 2

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 2

cgtttctctg ttgttaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 60

atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 120

gaagaaggag gatgtgaact g 141

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成多肽

<400> 3

Arg Phe Ser Val Val

1 5

<210> 4

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成多肽

<400> 4

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

1 5 10 15

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

20 25 30

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40 45

<210> 5

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> CD8/铰链/跨膜结构域

<400> 5

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgctag ccagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180

ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 207

<210> 6

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 6

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 7

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> CD8α前导序列

<400> 7

ggatccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc 60

gccaggccg 69

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> Flag标签序列

<400> 8

gactacaagg acgacgatga caag 24

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 轻链CDR1

<400> 9

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 轻链CDR2

<400> 10

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 轻链CDR3

<400> 11

Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr

1 5

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 重链CDR1

<400> 12

Asp Tyr Glu Met His

1 5

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 重链CDR2

<400> 13

Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 重链CDR3

<400> 14

Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr

1 5

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 人GC33轻链可变区

<400> 15

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 16

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 人GC33重链可变区

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 人GC33轻链可变区

<400> 17

gacgtcgtta tgacacagag tcccctctcc ttgccggtga ccctgggtca gcctgcgtcc 60

atctcttgca gatcctccca gtctctggta cactccaacg gcaacacata cttgcactgg 120

taccaacaaa gacctggtca gtcaccgcga cttctcatat ataaagtttc caataggttc 180

agtggagtgc cagacaggtt cagtggttca ggatcaggca ctgatttcac gcttaaaatc 240

agtcgggttg aggcggagga cgtaggagtt tactattgca gccagaatac gcacgtgccg 300

cctacttttg gctctggaac caagttggaa ataaag 336

<210> 18

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 人GC33重链可变区

<400> 18

caagtgcaac tcgtacaatc aggtgctgaa gtcaaaaagc cgggagcctc tgttaaagtg 60

tcctgtaaag ccagcggcta cacctttacc gattatgaga tgcactgggt tcggcaggct 120

ccgggccaag gtctggagtg gatcggggct cttgacccaa agacgggcga cacggcttat 180

tcacaaaaat tcaaaggtag ggctactctg actgccgata agtccaccag caccgcgtat 240

atggagctct ctagcttgcg aagcgaggac acggcggtgt actattgcac acgcttctat 300

agttacacat attggggtca aggcacgctt gtgaccgtgt ctagc 345

<210> 19

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成多肽

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser Val His Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Gly

165 170 175

Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Glu Gly Asp Thr

210 215 220

Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser

<210> 20

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 20

gatattcaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60

atcacctgca aggccagtga ccacatcaac aactggctgg cctggtatca acagaaacca 120

ggaaaagctc cgaaactact gatcagcggc gccacctctc tggaaaccgg agtcccttct 180

cgcttctctg gttccggatc tgggaaggat tacactctga ccatcagcag tctgcagccg 240

gaagacttcg caacttatta ctgtcagcag tactggtcca cccccttcac cttcggacag 300

ggtaccaagg tggagatcaa aggcggaggc ggatctggcg gcggaggaag tggcggaggg 360

ggatctcagg tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg tgaagccttc ggagaccctg 420

tccctcacct gcactgtctc tggtttctcc ctgagtcggt actctgtgca ttggatccgg 480

cagcccccag ggaagggact ggagtggctg gggatgatct ggggaggcgg cagcaccgac 540

tacaacagcg ccctgaagtc ccgactgacc atatcaaagg acaactccaa gaaccaggtg 600

tccttgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaaat 660

gagggcgata ccaccgccgg cacttggttt gcctattggg gccagggaac cctggtcacc 720

gtctcctca 729

<210> 21

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成多肽

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 22

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 22

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720

tcctca 726

<210> 23

<211> 1184

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 23

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360

ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420

cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480

ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540

tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600

gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660

tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720

tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780

caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840

ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900

ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccactgagta ccgggcgccg tccaggcacc 960

tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020

cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080

tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140

agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184

<210> 24

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 24

agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta 60

gtcagtgtgg aaaatctcta gcag 84

<210> 25

<211> 1377

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 25

cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac cagaggagct ctctcgacgc aggactcggc 60

ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg ccaaaaattt 120

tgactagcgg aggctagaag gagagagatg ggtgcgagag cgtcagtatt aagcggggga 180

gaattagatc gcgatgggaa aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa aaatataaat 240

taaaacatat agtatgggca agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat cctggcctgt 300

tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac tgggacagct acaaccatcc cttcagacag 360

gatcagaaga acttagatca ttatataata cagtagcaac cctctattgt gtgcatcaaa 420

ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt tagacaagat agaggaagag caaaacaaaa 480

gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg atcttcagac ctggaggagg agatatgagg 540

gacaattgga gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc attaggagta 600

gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagagagaaa aaagagcagt gggaatagga 660

gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta tgggcgcagc gtcaatgacg 720

ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg 780

agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg caactcacag tctggggcat caagcagctc 840

caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg 900

ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt ggaatgctag ttggagtaat 960

aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag agaaattaac 1020

aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat 1080

gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca 1140

aattggctgt ggtatataaa attattcata atgatagtag gaggcttggt aggtttaaga 1200

atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc accattatcg 1260

tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat agaagaagaa 1320

ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatctcg acggtat 1377

<210> 26

<211> 547

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 26

tagactgtag cccaggaata tggcagctag attgtacaca tttagaagga aaagttatct 60

tggtagcagt tcatgtagcc agtggatata tagaagcaga agtaattcca gcagagacag 120

ggcaagaaac agcatacttc ctcttaaaat tagcaggaag atggccagta aaaacagtac 180

atacagacaa tggcagcaat ttcaccagta ctacagttaa ggccgcctgt tggtgggcgg 240

ggatcaagca ggaatttggc attccctaca atccccaaag tcaaggagta atagaatcta 300

tgaataaaga attaaagaaa attataggac aggtaagaga tcaggctgaa catcttaaga 360

cagcagtaca aatggcagta ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt 420

acagtgcagg ggaaagaata gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac 480

aaaaacaaat tacaaaaatt caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag 540

tttggct 547

<210> 27

<211> 591

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 27

atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60

cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120

tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180

ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240

gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300

ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360

tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg 420

cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480

atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540

gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct g 591

<210> 28

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 28

gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60

ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttca 98

Claims

1.一种免疫细胞，其包括嵌合抗原受体(CAR)，其中所述(CAR)包括：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域包括抗原结合结构域；

(b)跨膜结构域；以及

(c)胞内结构域，所述胞内结构域包括共刺激内结构域，其中所述共刺激内结构域包括来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸。

2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述嵌合抗原受体是单个多肽。

3.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述嵌合抗原受体包含两个多肽。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的免疫细胞，其中所述共刺激内结构域包括来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸，其中所述五个另外的氨基酸由SEQID NO:1编码。

5.根据权利要求4所述的免疫细胞，其中所述共刺激内结构域包括SEQ ID NO:2。

6.根据权利要求1到5中任一项所述的免疫细胞，其中所述抗原结合结构域是人源化的。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的免疫细胞，其中所述抗原结合结构域是人的。

8.根据权利要求1到7中任一项所述的免疫细胞，其中所述抗原结合结构域是scFv。

9.根据权利要求1到8中任一项所述的免疫细胞，其中所述抗原结合结构域特异性结合与疾病相关的抗原。

10.根据权利要求1到9中任一项所述的免疫细胞，其中所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。

11.根据权利要求1到10中任一项所述的免疫细胞，其中所述抗原结合结构域特异性结合选自由以下组成的组的抗原：磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、恶性肿瘤变异受体(MVR)和CD19。

12.根据权利要求1到11中任一项所述的免疫细胞，其中所述跨膜结构域是从选自由以下组成的组的蛋白质中选择的跨膜结构域：4-1BB/CD137、活化的NK细胞受体、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8、CD8α、CD8β、CD96(触觉的)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、与CD83特异性结合的配体、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1)、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1和VLA-6。

13.根据权利要求1到12中任一项所述的免疫细胞，其中所述跨膜结构域是来自CD8α的跨膜结构域。

14.根据权利要求1到13中任一项所述的免疫细胞，其中所述胞内结构域进一步包括来自CD3ζ的胞内结构域。

15.根据权利要求1到14中任一项所述的免疫细胞，其中所述嵌合抗原受体进一步包括信号肽或前导序列。

16.根据权利要求1到15中任一项所述的免疫细胞，其中所述嵌合抗原受体进一步包括铰链区。

17.根据权利要求16所述的免疫细胞，其中所述铰链区是CD8α铰链。

18.根据权利要求1到17中任一项所述的免疫细胞，其中所述嵌合抗原受体进一步包括另外的抗原结合结构域。

19.根据权利要求18所述的免疫细胞，其中所述另外的抗原结合结构域是scFv。

20.根据权利要求1到19中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是人免疫细胞。

21.根据权利要求20所述的免疫细胞，其中所述人免疫细胞是自体人免疫细胞。

22.根据权利要求20所述的免疫细胞，其中所述人免疫细胞是同种异体人免疫细胞。

23.根据权利要求1到22中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。

24.根据权利要求1到23中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是NK细胞。

25.一种核酸，其对嵌合抗原受体(CAR)进行编码，其中所述嵌合抗原受体包括：

(a)胞外结构域，所述胞外结构域包括抗原结合结构域；

(b)跨膜结构域；以及

26.根据权利要求25所述的核酸，其中所述嵌合抗原受体是单个多肽。

27.根据权利要求25所述的核酸，其中所述嵌合抗原受体包含两个多肽。

28.根据权利要求25到27中任一项所述的核酸，其中所述共刺激内结构域包括来自4-1BB/CD137的胞内信号传导结构域和五个另外的氨基酸，其中所述五个另外的氨基酸由SEQID NO:1的核苷酸序列编码。

29.根据权利要求28所述的核酸，其中所述共刺激内结构域包括SEQ ID NO:2。

30.根据权利要求25到29中任一项所述的核酸，其中所述抗原结合结构域是人源化的。

31.根据权利要求25到30中任一项所述的核酸，其中所述抗原结合结构域是人的。

32.根据权利要求25到31中任一项所述的核酸，其中所述抗原结合结构域是scFv。

33.根据权利要求25到32中任一项所述的核酸，其中所述抗原结合结构域特异性结合与疾病相关的抗原。

34.根据权利要求25到33中任一项所述的核酸，其中所述抗原结合结构域特异性结合肿瘤抗原。

35.根据权利要求25到34中任一项所述的核酸，其中所述抗原结合结构域特异性结合选自由以下组成的组的抗原：聚糖-3(GPC3)、恶性肿瘤变异受体(MVR)和CD19。

36.根据权利要求25到35中任一项所述的核酸，其中所述跨膜结构域是从选自由以下组成的组的蛋白质中选择的跨膜结构域：4-1BB/CD137、活化的NK细胞受体、免疫球蛋白、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8、CD8α、CD8β、CD96(触觉的)、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、整合素、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、与CD83特异性结合的配体、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1)、SLAMF4(CD244)、SLAMF6(NTB-A)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1和VLA-6。

37.根据权利要求25到36中任一项所述的核酸，其中所述跨膜结构域是来自CD8α的跨膜结构域。

38.根据权利要求25到37中任一项所述的核酸，其中所述胞内结构域进一步包括来自CD3ζ的胞内结构域。

39.根据权利要求25到38中任一项所述的核酸，其中所述嵌合抗原受体进一步包括信号肽或前导序列。

40.根据权利要求25到39中任一项所述的核酸，其中所述嵌合抗原受体进一步包括铰链区。

41.根据权利要求40所述的核酸，其中所述铰链区是CD8α铰链。

42.一种载体，其包括根据权利要求25到41中任一项所述的核酸。

43.根据权利要求42所述的载体，其进一步包括启动子，所述启动子与所述核酸可操作地连接。

44.根据权利要求43所述的载体，其中所述启动子是组成型启动子。

45.根据权利要求43所述的载体，其中所述启动子是诱导型启动子。

46.根据权利要求42到45中任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

47.根据权利要求46所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

48.一种产生工程化免疫细胞的方法，所述方法包括：将根据权利要求25到41中任一项所述的核酸或根据权利要求42到47中任一项所述的载体引入到免疫细胞中，由此产生所述工程化免疫细胞。

49.根据权利要求48所述的方法，所述方法进一步包括在所述引入步骤之后，培养所述工程化免疫细胞。

50.根据权利要求48到49中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。

51.根据权利要求48到50中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是NK细胞。

52.根据权利要求48到51中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述引入步骤之前，从受试者获得所述免疫细胞。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用所述工程化免疫细胞。

54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述受试者已被诊断或鉴定为患有癌症。

55.一种工程化免疫细胞，其通过根据权利要求48到54中任一项所述的方法产生。

56.一种药物组合物，其包括根据权利要求55所述的工程化免疫细胞以及药学上可接受的载体。

57.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求55所述的工程化免疫细胞或根据权利要求56所述的药物组合物。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述癌症是抗磷脂酰肌醇聚糖-3相关癌症、抗CD19相关癌症或抗MVR相关癌症。

59.根据权利要求57所述的方法，其中所述癌症是癌、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's and non-Hodgkin's lymphomas))、母细胞瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(liver carcinoma)、其它淋巴组织增殖性病症和各种类型的头颈癌。

60.根据权利要求57到59中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已被施用选自由以下组成的组的一种或多种另外的抗癌疗法：电离辐射、化学治疗剂、治疗性抗体和检查点抑制剂。

61.根据权利要求57到60中任一项所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有所述癌症。