CN107446051B9 - 靶向cd19的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向CD19的嵌合抗原受体及其用途。具体而言，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：(1)含有依次连接的CD8抗原的前导肽、抗CD19单链抗体、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区、人CD28胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白；和(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白。本发明还提供所述融合蛋白的编码序列、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。

Description

靶向CD19的嵌合抗原受体及其用途
技术领域
本发明属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向CD19的嵌合抗原受体及其 用途。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经 基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增 的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手 术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。 CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究 表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答， 显著改善患者的生存状况。
嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的 方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞 表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关 抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结 合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标 抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来 讲都是关键的决定因素。
随着嵌合抗原受体T细胞技术的不断发展，目前CAR-T主要可划分为四 代。
第一代CAR-T细胞由胞外结合区-单链抗体(single-chain fragment variable，scFV)、跨膜区(transmembrane region，TM)和胞内信号区——免 疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-based activation motif，ITAM) 组成，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD3ζ。第一代CAR 虽然能够看到一些特异性的细胞毒性，但2006年对其进行临床试验总结的时 候却发现疗效差强人意。究其原因是因为第一代CAR-T细胞在病人体内很快 就会耗竭，其持久性(persistence)很差，以至于CAR-T细胞还没有来得及接 触到大量的肿瘤细胞时就已经凋亡了。该种CAR-T细胞可以激发抗肿瘤的细 胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，但其在体内的存活期较短不能激发持 久的抗肿瘤效应〔Zhang T等，Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways，Cancer Res 2007，67(22):11029-11036〕。
第二代CAR-T细胞优化CAR设计中T细胞活化信号区，仍然是研究 的热点。T细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为 特异性信号，由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动；第 二信号为协同刺激信号。早在1998年就出现了第二代CAR(Finney HM等，J Immunol.1998，161(6):2791-7)。第2代CAR在胞内信号肽区添加了一个 协同刺激分子，即把协同刺激信号组装到CAR里面，能够更好的为CAR-T细 胞提供活化信号，这样CAR识别肿瘤细胞后能够同时活化协同刺激分子和胞 内信号，实现双重活化，能明显提高T细胞增殖分泌能力和抗肿瘤效应。第一 个被详细研究的T细胞共刺激信号受体是CD28，它能够与靶细胞表面的B7 家族成员结合。CD28的共刺激能够促进T细胞的增殖，IL-2的合成和表达以 及增强T细胞抵抗凋亡的能力。随后又出现了CD134(OX40)和CD137(4-1BB) 等共刺激分子，以提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T细胞应答，延长 T细胞存活时间等。这样的第二代CAR在随后的临床试验中产生了意想不到的 效果，从2010年起基于第二代CAR的临床报道屡次引发震动，特别是对于复 发性、难治性的ALL病人，其完全缓解率高达90％以上。
第三代CAR信号肽区整合2个以上的协同刺激分子，可使T细胞持续 活化增殖，细胞因子持续分泌，T细胞杀伤肿瘤细胞的能力更加显著，即新一 代的CAR可获得更强的抗肿瘤应答(Pule MA等，Mol Ther.2005，12(5): 933-941)。最典型的就是UPen Carl June在CD28刺激因子的作用下又加了一 个CD137(4-1BB)的刺激因子。
第四代的CAR-T细胞则加入了细胞因子或共刺激配体，例如四代CAR可 以产生IL-12，其能够调节免疫微环境，增加T细胞的激活，同时激活固有免 疫细胞使其发挥作用来清除靶抗原阴性的癌细胞，从而达到双向调节的作用 〔Chmielewski M,Abken H.TRUCKs:the fourth generation of CARs.Expert Opin Biol Ther.2015；15(8)：1145-54〕。
CD19是一种B细胞表面的95kDa的糖蛋白，从B细胞发育的早期即开始 表达，直至其分化为浆细胞。CD19是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员之一，作 为B细胞表面信号转导复合物的组成元素之一，参与调控了B细胞受体的信号 转导过程。在CD19缺陷的小鼠模型中，外周淋巴组织中B细胞的数量会出现 明显的减少，对疫苗和丝裂原的应答也会下降，同时伴有血清Ig水平的减低。 通常认为，CD19的表达只限于B细胞系(B-cell lineage)，而不表达于多能造 血干细胞表面。CD19还表达于大多数B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、ALLs、 CLLs、多毛细胞白血病，和一部分急性髓性白血病细胞的表面。因此，在对白 血病/淋巴瘤的治疗中，CD19是一种非常有价值的免疫治疗靶点。重要的是， CD19不会表达于除B细胞外的大多数正常细胞表面，包括多能造血干细胞， 这一特征使CD19可以作为一种安全的治疗靶点，可将患者发生自身免疫性疾 病或不可逆性骨髓毒性损伤的风险降至最低。当前，已经研制出了抗CD19的 抗体或scFv片段，并且在小鼠模型和人类/灵长类动物中证明了其应用的前景。
发明内容
本发明第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：
(1)含有依次连接的CD8抗原的前导肽、抗CD19单链抗体、人CD8α 铰链区、人CD28跨膜区、人CD28胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白；和
(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基 酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述CD8抗原前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-21位氨基酸所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗CD19单链抗体为抗CD19单克隆抗体 FMC63。
在一个或多个实施方案中，所述抗CD19单链抗体含有轻链可变区和重链 可变区。
在一个或多个实施方案中，所述轻链可变区与所述重链可变区通过接头序 列相连。
在一个或多个实施方案中，所述抗CD19单链抗体含有抗CD19单克隆抗 体FMC63的轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和重链可变区任选地 通过接头相连相连。
在一个或多个实施方案中，所述抗CD19单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第22-263位氨基酸所示。
在一个或多个实施方案中，所述人CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第1-47位氨基酸所示。
在一个或多个实施方案中，所述人CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第48-74位氨基酸所示。
在一个或多个实施方案中，所述人CD28胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第75-115位氨基酸所示。
在一个或多个实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第116-226位氨基酸所示。
在一个或多个实施方案中，所述多肽序列由SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3 依次串联形成。
本发明第二方面提供一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列选自：
(1)编码本文第一方面所述融合蛋白的多核苷酸序列；和
(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列含有SEQ ID NO:2所示的核 苷酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列含有SEQ ID NO:4所示的核 苷酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列含有SEQ ID NO:2和4所示 的核苷酸序列。
本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述含有本文第二方面所述的多核 苷酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为载体。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述表达载体为逆转录病毒载体。
在一个或多个实施方案中，所述逆转录病毒载体含有复制起始位点， 3’LTR，5’LTR，本文第二方面所述多核苷酸序列，以及抗性基因。
本发明第四方面提供一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有本文第三方面 所述的核酸构建物。
在一个或多个实施方案中，所述逆转录病毒含有载体，优选为所述表达载 体。
在一个或多个实施方案中，所述逆转录病毒含有所述逆转录病毒载体。
本发明第五方面提供一种基因修饰的T细胞，该细胞含有本文第二方面的 多核苷酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述T细胞含有本文第三方面所述的逆转录病 毒载体。
在一个或多个实施方案中，所述T细胞感染了本文第四方面所述的逆转录 病毒。
本发明第六方面提供一种离体活化T细胞的方法，所述方法包括使用本文 第四方面所述的逆转录病毒感染所述T细胞的步骤。
本发明第七方面提供采用本发明第六方面所述的方法制备得到的基因修 饰的T细胞。
本发明第八方面提供本文所述融合蛋白、多核苷酸序列、载体或逆转录病 毒在制备活化的T细胞中的应用。
本发明第九方面提供本文所述的融合蛋白、多核苷酸序列、载体、逆转录 病毒或基因修饰的T细胞在制备治疗CD19介导的疾病的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述CD19介导的疾病包括白血病和淋巴瘤。
在一个或多个实施方案中，所述CD19介导的疾病包括B细胞淋巴瘤、套 细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、 和急性髓性白血病。
本发明第十方面还提供一种药物组合物，该组合物含有本文所述的基因修 饰的T细胞。
附图说明
图1为MSCV-CAR逆转录病毒表达载体示意图。
图2为MSCV-CAR逆转录病毒表达质粒的部分测序结果峰值图。
图3为流式细胞仪显示逆转录病毒感染T细胞72小时的CAR+表达效率。
图4为制备3天的CAR-T细胞与靶细胞共培养5小时INF-γ的分泌。
图5为制备3天的CAR-T细胞与靶细胞共培养5小时后对肿瘤细胞的杀 伤作用。
图6制备CAR-T细胞治疗接种RAJI肿瘤细胞的NOG鼠生存曲线，其中 实线代表CAR-T，虚线代表NT。
具体实施方式
本发明提供一种靶向CD19抗原的CAR。该CAR含有依次连接的CD8抗 原的前导肽、抗CD19单链抗体、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区、人CD28 胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白。
适用于本发明的CD8抗原前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-21位 氨基酸所示。
适用于本发明的抗CD19单链抗体为本领域常用于CAR的各种抗CD19 单链抗体。在某些实施方案中，所属抗CD19单链抗体为抗CD19单克隆抗体 FMC63。通常，适用于本发明的抗CD19单链抗体可含有轻链可变区和重链可 变区，或由轻链可变区和重链可变区组成。轻链可变区与所述重链可变区通过 接头序列相连。在某些实施方案中，所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的氨 基酸序列可如SEQ ID NO:1第22-128位氨基酸所示。在其它实施方案中，所 述抗CD19单链抗体的重链可变区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1第144-263 位氨基酸所示。
适用于本发明的人CD8α铰链区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:3第1-47 位氨基酸所示。
适用于本发明的人CD28跨膜区可以是本领域常用于CAR的各种人CD28 跨膜区序列。在某些实施方案中，所述人CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第48-74位氨基酸所示。
适用于本发明的人CD28胞内区可以是本领域常用于CAR的各种人CD28 胞内区序列。在某些实施方案中，所述人CD28胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第75-115位氨基酸所示。
适用于本发明的人CD3ζ胞内区可以是本领域常规用于CAR的各种人 CD3ζ胞内区。在某些实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第116-226位氨基酸所示。
形成本发明的融合蛋白的上述各部分，即CD8抗原的前导肽、抗CD19单 链抗体、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区、人CD28胞内区和人CD3ζ胞内区， 相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知 的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或 多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA 和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨 基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度 可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在 某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无 特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨 酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、 苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q) 等。作为例子，接头可由以下氨基酸序列组成：G(SGGGG)2SGGGLGSTEF(SEQ ID NO:7)、RSTSGLGGGS(GGGGS)2G(SEQ ID NO:8)、 QLTSGLGGGS(GGGGS)2G(SEQ ID NO:9)、GGGS(SEQ ID NO:10)、GGGGS (SEQ ID NO:11)、SSSSG(SEQ ID NO:12)、GSGSA(SEQ ID NO:13)、 GGSGG(SEQ ID NO:14)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:15)、 SSSSGSSSSGSSSSG(SEQ ID NO:16)、GSGSAGSGSAGSGSA(SEQ ID NO:17) 和GGSGGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:18)等。
在某些实施方案中，本发明抗CD19单链抗体的轻链可变区和重链可变区 之间由(GGGS)n连接，其中n为1～5的整数。
在某些实施方案中，本发明CAR的氨基酸序列由SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3依次串联形成。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所 表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序 列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细 胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组 蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于， 适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的融合蛋白(即 所述CAR)的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。 任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1， c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE 以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
本发明也包括由SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3依次串联形成的CAR的突 变体。这些突变体包括：与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少 90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活 性(如活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比 对的序列之间的序列相同性。
突变体还包括：在SEQ ID NO:1和3所示的序列中具有一个或数个突变(插 入、缺失或取代)、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数 个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保 守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时， 通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如， 具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例 如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨 酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、 丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨 酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具 有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的 氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中 用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影 响其活性。
本发明包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸序列 可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合 成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。 本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基 酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。
本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据 本文所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的 cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩 增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再 将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码 本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:2和4所示。
本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的融合蛋白的编码 序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的融合 蛋白的编码序列可以多种方式被操作以保证所述蛋白的表达。在将核酸构建物 插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重 组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码 序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核 苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞 同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的 序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择 的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻 译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿 主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。通常通过可操作地连接编码 CAR的多核苷酸序列至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码CAR的 多核苷酸序列的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克 隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启 动子。
编码本发明CAR的多核苷酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，可 被克隆入质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，载体是 表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域 中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物 学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、 腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序 列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO 01/96584； WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载 体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的 可选择的标记。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启 动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的 强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1 α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40) 早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR) 启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、 鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、 肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用 诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打 开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的 时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激 素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可 选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被 转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被 携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的 侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标 记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在DNA 已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报 道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性 磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技 术制备或从商业上获得。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可 通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵 母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细 胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子 轰击、微注射、电穿孔等等。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法 包括使用DNA和RNA载体。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体 分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包 括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载体，特别是逆转录 病毒载体，这已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。 其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒 等等。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例 如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用本领域中已知 的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被 分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知 的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知 的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
因此，在某些实施方案中，本发明还提供用于活化T细胞的逆转录病毒， 该病毒含有本文所述的逆转录病毒载体以及相应的包装基因，如gag、pol和 vsvg。
适用于本发明的T细胞可以是各种来源的各种类型的T细胞。例如，T细 胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。
在某些实施方案中，获得T细胞后，可先用适量的(例如30～80ng/ml， 如50ng/ml)的CD3抗体刺激活化，然后在含有适量的(例如30～80IU/ml， 如50IU/ml)的IL2培养基进行培养备用。
本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以 高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理 论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，本发明的CAR-T细 胞可体内分化成中心记忆样状态。
本发明还包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达本文所述的 CAR，和CAR-T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者 的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤 控制的长期持久性。
由CAR-T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外， CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-T细胞诱导 对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。
可治疗的癌症可以是非实体瘤，如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤。尤其 是，可采用本发明的CAR、其编码序列、核酸构建物、表达载体、病毒以及 CAR-T细胞治疗的疾病优选为CD19介导的疾病，尤其是CD19介导的血液肿 瘤。
具体而言，本文中，“CD19介导的疾病”包括但不限于白血病和淋巴瘤， 例如B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血 病、多毛细胞白血病、和急性髓性白血病。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/ 或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药 物组合物可包括如本文所述的CAR-T细胞，与一种或多种药学或生理学上可 接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐 水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、 甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA 或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用 的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重 度。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或 “治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对 象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出： 包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量， 优选105至106个细胞/kg体重的剂量。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施 用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可 通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、 吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、 脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中， 本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案 中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉注射施用。T细胞的组合物可被直接 注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
在本发明的一些实施方案中，本发明的CAR-T细胞或其组合物可与本领 域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例 如，可结合各种放疗制剂进行治疗，这些放疗制剂包括：环孢菌素、硫唑嘌呤、 甲氨喋呤、麦考酚酯、FK506、氟达拉滨、雷帕霉素和麦考酚酸等。在进一步 的实施方案中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、 外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如OKT3或CAMPATH的T细胞 烧蚀疗法结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。
本文中，“抗肿瘤效应”指一种生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿 瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌相关的各种生理症状 的改善表示。
“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫 应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和 其转基因物种。
实施例
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出 于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决 不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得 显而易见的任何和全部的变化。
实施例1：CD8前导序列-mCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ基因序列的确定 及逆转录病毒载体的构建
从NCBI网站数据库搜索到人的CD8α铰链区、人的CD28跨膜区、人的 CD28胞内区和人的CD3ζ胞内区基因序列信息，抗CD19单链抗体克隆号为 FMC63，这些序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编 码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。
采用重叠PCR将上述序列依次按抗CD19scFv、人CD8α铰链区基因、人 CD28跨膜区基因、人CD28胞内区基因、人CD3ζ胞内区基因序列进行连接， 在各序列连接处引入不同酶切位点，形成完整的mCD19-CAR基因序列，获得 CAR分子。
用NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切该CAR分子的核苷酸序列，经 T4连接酶(NEB)连接插入逆转录病毒MSCV(Addgene)载体的NotI-EcoRI 位点，转化到感受态大肠杆菌(DH5α)。
将所获得的逆转录病毒载体送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测 序结果与拟合成的mCD19-CAR序列比对来验证序列是否正确。测序引物为：
有义：AGCATCGTTCTGTGTTGTCTC(SEQ ID NO:5)
反义：TGTTTGTCTTGTGGCAATACAC(SEQ ID NO:6)
经测序正确后，使用Qigene公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化逆转录病 毒载体。
本实施例所构建得到的质粒图谱如图1所示。图2显示该MSCV-CAR逆 转录病毒表达质粒的部分测序结果峰值图。
实施例2：逆转录病毒包装
将实施例1纯化获得的逆转录病毒载体采用磷酸钙法转染293T细胞进行 逆转录病毒包装实验，具体步骤如下：
第1天：选择小于20代、未过分长满的293T细胞，以0.6×106个细胞/ml 铺板，10cm皿添加10ml DMEM培养基，充分混匀细胞，37度培养过夜。
第2天：293T细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左 右)；准备质粒复合物，各种质粒的量为：实施例1制备得到的MSCV骨架载 体12.5ug，Gag-pol 10ug，VSVg6.25ug，CaCl2 250ul，H2O 1ml，总体积1.25ml； 在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的HBSS(Hank’s平衡盐缓冲液)，边 加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到293T皿中，37 ℃培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基。
第4天：转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后分装保存于-80℃， 继续添加预热的新鲜DMEM培养基。
实施例3：逆转录病毒感染人T细胞
1、用Ficcol分离液(天津灏洋)分离获得较纯的CD3+T细胞，用含5％AB 血清X-VIVO(LONZA)培养基调整细胞密度为1×106/mL。将细胞以1ml/孔 接种到预先用抗人50ng/ml CD3抗体(北京同立海元)和50ng/ml CD28抗体(北 京同立海元)包被的细胞培养板上，再加入100IU/ml的白细胞介素2(北京双 鹭)，刺激培养48小时后进行病毒感染。
2、T细胞活化培养后隔天，PBS稀释至终浓度为15μg/ml的Retronectin (Takara)包被非组织处理培养板，24孔板每孔250μl。避光，4℃过夜备用。
3、T细胞活化培养两天后，取出2块包被好的24孔板，吸弃包被液，加 入含2％BSA的HBSS室温封闭30min。封闭液体积为每孔500μl，吸弃封闭液， 用含2.5％HEPES的HBSS洗板两次。
4、病毒液加入孔内，每孔加2ml病毒液，32℃，2000g，离心2h。
5、弃去上清液，24孔板每孔加入活化后的T细胞1×106个，体积1ml，培 养基为T细胞培养基中添加IL-2 200IU/ml。30℃，1000g，离心10min。
6、离心完毕后，将培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
7、感染后24h，将细胞悬液吸出，1200rpm，4℃，离心7min。
8、细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 100IU/ml的T细 胞培养液，使T细胞的密度维持在5×105/ml左右，使细胞扩增。
实施例4：流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的比例及表面CAR蛋白的表 达
分别离心收集感染后72小时的CAR-T细胞和NT细胞(对照组)，PBS洗涤 1次后弃上清，加入相应的抗体避光30min后PBS洗涤，重悬，最后流式细胞仪 检测。CAR+由抗鼠IgG F(ab')抗体(Jackson Immunoresearch)检测。
结果如图3所示。图中显示，逆转录病毒感染T细胞72小时后，CAR+表达 效率达68.2％。此感染效率显著超过很多研究机构的效率(J Immunother.，2009 年9月，32(7)：689–702，doi:10.1097/CJI.0b013e3181ac6138)。
实施例5：CAR-T细胞与靶细胞(Raji)共培养后INF-γ分泌检测
1、取实施例3制备好的CAR-T细胞，重悬于Lonza培养基中，调整细胞 浓度为1×106/mL。
2、阳性对照组的培养板预先使用CD3单抗500ng/mL加CD28单抗 500ng/ml包被，培养基中不添加IL-2。充分混匀后加入24孔板中，每孔1mL 细胞悬液。同时加入BD GolgiPlug(含BFA，每1ml细胞培养基中加入1μl BD GolgiPlug)，充分混匀后，37℃孵育5-6小时。收集细胞，作为CAR-T细胞阳 性对照。
3、实验组每孔含k562-CD19+细胞或Raji细胞2×105个，CD19-CAR-T细 胞2×105个，200μl不含IL-2的Lonza培养基。充分混匀后加入96孔板中。同 时加入BD GolgiPlug(含BFA，每1ml细胞培养基中加入1μl BD GolgiPlug)， 充分混匀后，37℃孵育5-6小时。收集细胞，作为实验组。
4、每管用1mL的PBS清洗细胞1次，300g离心5分钟。仔细吸去或倒 掉上清。
5、PBS洗细胞后，加入250μl/EP管固定/渗透液，4℃孵育20分钟以固定 细胞及破膜。用1×BD Perm/WashTM缓冲液清洗细胞2次，1mL/次。
6、进行胞内因子染色，取适量IFN-γ、IL-2细胞因子荧光抗体或阴性对照， 用BDPerm/WashTM缓冲液稀释至50μl。用此抗体稀释液充分重悬已固定破膜的 细胞，4℃避光孵育30min，1×BD Perm/WashTM缓冲液1mL/次清洗细胞2次， 然后用PBS重悬。
7、流式细胞仪检测。
图4显示了制备3天的CAR-T细胞与靶细胞共培养5小时后INF-γ的分 泌情况。CAR-T细胞与靶细胞分泌后CAR-T细胞大量被激活(54.5％)，激活 量超过阳参(45.3％)。
实施例6：CAR-T细胞与靶细胞(Raji)共培养后检测肿瘤特异性细胞杀 伤作用
1、K562细胞(不含CD19靶蛋白，为靶细胞的阴性对照细胞)重悬在无血 清培养基(1640)中，调整细胞浓度为1×106/ml，加入荧光染料BMQC(2,3,6,7- 四氢-9-溴甲基-1H,5H喹嗪并(9,1-gh)香豆素)至终浓度为5μM。
2、混匀，37℃孵育30min。
3、室温，1500rpm离心5min，弃上清，并重悬细胞于细胞毒性培养基(无 酚红1640+5％AB血清)中，37℃孵育60min。
4、新鲜细胞毒性培养基清洗细胞两遍，并重悬在新鲜细胞毒性培养基中， 密度1×106/ml。
5、Raji细胞悬浮在含有0.1％BSA的PBS中，调整浓度为1×106/ml。
6、加入荧光染料CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)至终浓度为 1μM。
7、混匀，37℃孵育10min。
8、孵育结束后，加入与细胞悬液等体积的FBS，室温孵育2min以终止标记 反应。
9、清洗细胞并重悬在新鲜细胞毒性培养基中，密度1×106/ml。
10、清洗效应T细胞(即实施例3制备得到的CAR-T细胞)并悬浮在细胞毒 性培养基中，调整浓度为5×106/ml。
11、在所有的实验中，感染了抗-CD19CAR的效应T细胞(CAR-T细胞) 的细胞毒性和感染了未感染的阴性对照效应T细胞(NT细胞)的细胞毒性做比 较，并且这些效应T细胞来自同一个病人。
12、对于感染了抗-CD19CAR的效应T细胞和阴性对照效应T细胞，按照T 细胞：靶细胞＝10:1，3:1，1:1的比例，于5ml无菌试验管(BD Biosciences)进 行培养，每组设置两复孔。每一个共培养组中，靶细胞为Raji细胞50,000个 (50μl)，阴性对照细胞为50,000个K562细胞(50μl)。同时设置一组只包含 Raji靶细胞和K562阴性对照细胞。
13、将共培养细胞置于37℃孵育4h。
14、孵育完成后，PBS清洗细胞，然后立即按照说明书推荐的浓度快速加 入7-AAD(7-氨基放线菌素D)，冰上孵育30min。
15、不需清洗，直接进行流式上机检测，数据用Flow Jo进行分析。
16、分析使用7AAD阴性的活细胞设门，测定T细胞和靶细胞共培养后活的 Raji靶细胞和活的K562阴性对照细胞的比例。
a)对于每一组共培养的T细胞和靶细胞，
靶细胞存活％＝Raji活细胞数/K562活细胞数。
b)细胞毒性杀伤细胞％＝100-校准的靶细胞存活％，即(无效应细胞时Raji 活细胞数-含效应细胞时Raji活细胞数)/K562活细胞数的比例。
结果如图5所示。CAR-T细胞与靶细胞(Raji细胞)共培养后，随着效靶 比的增加其杀伤能力也增加，呈现剂量依靠型。
实施例7：CART细胞对Raji诱导生瘤的NOG小鼠的治疗作用评价
1、用8周龄的雌性NOG小鼠，于注射T细胞前一天，尾静脉注射0.2x106 的Raji细胞，所用Raji细胞以2x106/ml的密度溶解于生理盐水，每只小鼠注 射100ul的细胞重悬液；
2、按各个实验组注射对应的CAR-T细胞和对照细胞(NT)，细胞用量为 1x107。所用T细胞以5x107/ml的密度溶解于生理盐水，每只小鼠注射200ul 的细胞重悬液。
3、每周两次定期观察小鼠，记录小鼠存活情况。
4、绘制小鼠生存曲线。
结果如图6所示。用CAR-T细胞治疗接种Raji的NOG小鼠(淋巴瘤鼠) (图6中以实线表示)相对于对照组(NT，未处理组；图6中以虚线表示)， 显著延长了小鼠的生存时间。

Claims (15)

1.一种融合蛋白，含有依次连接的CD8抗原的前导肽、抗CD19单链抗体、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区、人CD28胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白；
其中，所述抗CD19单链抗体为抗CD19单克隆抗体FMC63，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第22-128位氨基酸所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第144-263位氨基酸所示。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一个或多个特征：
所述CD8抗原前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-21位氨基酸所示；
所述人CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第1-47位氨基酸所示；
所述人CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第48-74位氨基酸所示；
所述人CD28胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第75-115位氨基酸所示；和
所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第116-226位氨基酸所示。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3依次串联形成。
4.一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列选自：
（1）编码权利要求1－3中任一项所述融合蛋白的多核苷酸序列；和
（2）（1）所述多核苷酸序列的互补序列。
5.如权利要求4所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或由SEQ ID NO:2和4所示的核苷酸序列依次串联而成。
6.一种核酸构建物，所述核酸构建物含有权利要求4或5所述的多核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物为载体。
8.如权利要求7所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点、3’LTR、5’LTR以及权利要求4或5所述的多核苷酸序列。
9.一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有权利要求6-8中任一项所述的核酸构建物。
10.一种离体活化T细胞的方法，所述方法包括使用权利要求9所述的逆转录病毒感染所述T细胞的步骤。
11.一种基因修饰的T细胞或含该基因修饰的T细胞的药物组合物，其特征在于，所述细胞含有权利要求4或5所述的多核苷酸序列，或含有权利要求8所述的逆转录病毒载体，或感染了权利要求9所述的逆转录病毒，或采用权利要求10所述的方法制备得到。
12.权利要求1－3中任一项所述的融合蛋白、权利要求4或5所述的多核苷酸序列、权利要求6-8中任一项所述的核酸构建物或权利要求9所述的逆转录病毒在制备活化的T细胞中的应用。
13.权利要求1－3中任一项所述的融合蛋白、权利要求4或5所述的多核苷酸序列、权利要求6-8中任一项所述的核酸构建物、权利要求9所述的逆转录病毒、或权利要求11所述的基因修饰的T细胞在制备治疗CD19介导的疾病的药物中的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述CD19介导的疾病包括白血病和淋巴瘤。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述CD19介导的疾病包括B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病和急性髓性白血病。
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