CN114606263B

CN114606263B - 分离的核酸分子及其用途

Info

Publication number: CN114606263B
Application number: CN202210506854.1A
Authority: CN
Inventors: 刘晓军; 赵阳兵
Original assignee: Shanghai Youtijisheng Biomedical Co ltd
Current assignee: Shanghai Youtijisheng Biomedical Co ltd
Priority date: 2022-05-11
Filing date: 2022-05-11
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2042-05-11
Also published as: CN114606263A

Abstract

本申请涉及一种分离的核酸分子，其包含内部核糖体进入位点（IRES）和编码嵌合抗原受体（CAR）的核苷酸序列，所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列位于IRES下游。本申请还提供了所述核酸分子在制备CAR‑T细胞中的应用。

Description

分离的核酸分子及其用途

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种包含IRES的核酸分子及其用途。

背景技术

目前，通常采用逆转录病毒或慢病毒对人类T细胞进行有效的基因转移，其中一些细胞治疗产品已经用于临床。使用整合病毒载体的方法有明显的优势，包括在注入的细胞上长期表达感兴趣的基因，跨越多个细胞分裂。电穿孔介导的mRNA转染是一种潜在的基因表达的补充方法，不会导致细胞的永久性基因修改。Malone等人在脂质体介导的转染中首次描述了mRNA在基因治疗中的应用（Malone, et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA86（16）:6077-6081）。现在已经成功地将mRNA电穿孔到初级T淋巴细胞，并用于高效的TCR基因转移（Zhao, et al., 2006, Mol Ther 13(1):151-159; Zhao, et al., 2005, J.Immunol. 174(7):4415-4423). 最近，针对Her2/neu抗原的CARs通过mRNA电穿孔引入T细胞，发现在乳腺癌异种移植模型中比Her2/neu抗体更有效（Yoon, et al., 2009, CancerGene Ther 16（6）:489-497）。其他通过mRNA电穿孔引入T细胞的人类靶抗原导向的CARs包括针对CEA、ErbB2 CD19和mesothelin的CARs（Birkholz等，2009，Gene Ther 16（5）：596-604，Zhao等，2010 Cancer Res.15；70（22）：9053-61）。因此导致了用针对间皮素、cMat和CD19的mRNA CAR电穿孔T细胞治疗癌症的多项临床试验（Beatty等，2014，Cancer ImmunolRes.2014；2（2）：112-20，Tchou等；Cancer Immunol Res.2017；5（12）：1152-1161，Svoboda等；Blood。2018. 6;132(10):1022-1026）。

位于mRNA分子末端的5’帽由一个鸟嘌呤核苷酸组成，通过5’到5’三磷酸酯连接到mRNA上。已经描述了几种帽结构，包括帽0和帽1（21）。已有几种方法将5’帽结构纳入转基因和聚（A）尾构造。市售的系统使用共转录或酶法将帽0或帽1纳入，以产生有帽mRNA。

一般真核mRNA的翻译都需要5’帽来介导核糖体结合，但真核生物和病毒中还存在一些例外情况，例如一些基因5’'端具有一段较短的RNA序列（约150-250BP），这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译，这段非翻译RNA被称为内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site, IRES）。内部核糖体进入位点（IRES）是一种RNA元件，允许以不依赖帽的方式进行翻译启动，作为蛋白质合成大过程的一部分。它经常被用于多基因表达的双区表达系统中。

发明内容

本申请目的在于提供一种包含来自人类肠道病毒71（EV-A71）、脑心病病毒（EMCV）或丙型肝炎病毒（HCV）的IRES以及编码CAR的核苷酸序列的核酸分子，并用于制备编码CAR的mRNA及CAR-T细胞。该mRNA可以直接在体外转录，并且无需再进行加帽处理，直接引入细胞后即可翻译CAR分子，能够获得具有细胞杀伤效力的CAR-T细胞，且效应持续时间至少3天，与加帽的mRNA相比，去其细胞毒性并未明显下降，且具有制备工艺简单，成本低的优势。

本申请还提供了一种调节T细胞功能的方法，包括将本申请所述核酸分子引入T细胞，表达嵌合抗原受体（CAR），进一步地还可以采用快速扩增T细胞（rapid T cellexpansion, REPed）方法扩增T细胞，该方法获得的T细胞与采用加帽mRNA引入得到的T细胞相比，CAR表达水平和持续时间，CAR-T细胞活性及杀伤效果基本上保持一致。

一方面，本申请提供一种分离的核酸分子，其包含内部核糖体进入位点（IRES）和编码嵌合抗原受体（CAR）的核苷酸序列，所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列位于IRES下游。

在某些实施方式中，其中所述IRES选自：人类肠道病毒71内部核糖体进入位点(EV71 IRES)、脑心病病毒内部核糖体进入位点（EMCV IRES）和脊髓灰质炎病毒内部核糖体进入位点（Polio IRES）。

在某些实施方式中，其中所述内部核糖体进入位点为人类肠道病毒71内部核糖体进入位点(EV71 IRES)。

在某些实施方式中，其中所述人类肠道病毒71内部核糖体进入位点包含SEQ IDNO: 1所示的核苷酸序列；所述脑心病病毒内部核糖体进入位点包含SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列；所述脊髓灰质炎病毒内部核糖体进入位点包含SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列与所述IRES可操作地连接。

在某些实施方式中，所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的5’端与所述嵌合抗原受体的3’端直接或间接相连。

在某些实施方式中，所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的5’端与所述嵌合抗原受体的3’端直接相连。

在某些实施方式中，还包含编码PolyA尾的核苷酸序列，所述编码PolyA尾的核苷酸序列位于所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的下游。

在某些实施方式中，所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列与所述编码PolyA尾的核苷酸序列可操作地连接。

在某些实施方式中，所述编码PolyA尾的核苷酸序列的5’端与编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列的3’端直接或间接相连。

在某些实施方式中，所述编码PolyA尾的核苷酸序列的5’端与编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列的3’端直接相连。

在某些实施方式中，其中自5’端至3’端，依次包含所述内部核糖体进入位点，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列和编码PolyA尾的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸分子包括mRNA或DNA。

在某些实施方式中，所述mRNA包含或不包含5’端帽结构。

在某些实施方式中，所述DNA还包含启动子。

在某些实施方式中，所述启动子位于内部核糖体进入位点上游。

在某些实施方式中，其中自5’端至3’端，依次包含所述启动子，内部核糖体进入位点，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列和编码PolyA尾的核苷酸序列。

在某些实施方式中，其中所述启动子包括体外转录启动子。

在某些实施方式中，其中所述启动子包括T7启动子。

在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体靶向肿瘤抗原。

在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体靶向CD19。

在某些实施方式中，所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列。

另一方面，本申请提供一种载体，其包含本申请所述的分离的核酸分子。

在某些实施方式中，其中所述载体包括DNA载体或RNA载体。

在某些实施方式中，其中所述载体包括体外转录（In Vitro Transcribed, IVT）载体。

在某些实施方式中，其中所述载体包括病毒载体或质粒。

在某些实施方式中，其中所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。

在某些实施方式中，其中所述载体包括基于pGEM.64A的载体。

在某些实施方式中，其中自5’端至3’端，所述载体依次包含所述启动子，内部核糖体进入位点和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列。

在某些实施方式中，其中自5’端至3’端，所述载体依次包含所述启动子，内部核糖体进入位点，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列和编码PolyA尾的核苷酸序列。

在某些实施方式中，其中所述载体包含SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列。

另一方面，本申请提供一种细胞，其包含本申请所述的分离的核酸分子或本申请所述的载体。

在某些实施方式中，所述细胞包括免疫效应细胞。

在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞或NK细胞。

在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括工程化细胞。

在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括CAR-T细胞或CAR-NK细胞。

另一方面，本申请提供本申请所述的分离的核酸分子、所述的载体或所述的细胞在制备编码嵌合抗原受体的mRNA中的用途。

另一方面，本申请提供本申请所述的分离的核酸分子、所述的载体或所述的细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤或感染性疾病。

在某些实施方式中，其中所述药物包括CAR-T细胞或CAR-NK细胞。

另一方面，本申请提供一种制备工程化细胞的方法，包括将本申请所述的分离的核酸分子或所述的载体引入细胞。

在某些实施方式中，所述方法包括将体外转录的RNA或合成的RNA引入细胞，其中所述RNA包含本申请所述的分离的核酸分子。

在某些实施方式中，所述方法通过选自以下的任一方式将体外转录的RNA或合成的RNA引入细胞：超声处理、电脉冲、电穿孔、渗透压冲击、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染、脂质介导的递送和被动递送。

另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请所述的细胞和药学上可接受的载体。

另一方面，本申请提供一种治疗疾病或病症的方法，包括向有此需要的受试者施用本申请所述的细胞或本申请所述的药物组合物。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下。

图1A-1B显示的是由IRES驱动的非加帽（non-capped）GFP RNA在3h的基因表达结果。

图1C-1D显示的是由IRES驱动的非加帽（non-capped）GFP RNA在5h的基因表达结果。

图1E-1F显示的是由IRES驱动的非加帽（non-capped）GFP RNA在第1天的基因表达结果。

图1G-1H显示的是由IRES驱动的非加帽（non-capped）GFP RNA在第2天的基因表达结果。

图1I-1J显示的是由IRES驱动的非加帽（non-capped）GFP RNA在第3天的基因表达结果。

图2显示的是在用非加帽IRES RNA电穿孔的T细胞中的表达CD19 CAR结果。

图3显示的是电穿孔测试的T细胞的表型。

图4显示的是用非加帽的EV71 IRES CD19BBZ CAR RNA或加帽的CD19BBZ CAR RNA在不同的RNA剂量下电穿孔，24小时后检测CAR表达的结果。

图5显示的是REPed T细胞或Beads T细胞在不同的RNA剂量下电穿孔于非加帽的EV71 IRES CD19BBZ CAR RNA或加帽的CD19BBZ CAR RNA，3天后检测CAR表达的结果。

图6显示的是REPed T细胞在不同的RNA剂量下，用非加帽EV71 IRES CD19BBZ CARRNA或加帽CD19BBZ CAR RNA电穿孔，用CD19阳性细胞刺激电穿孔的REPed T细胞，通过流式细胞仪检查CD107a的上调情况。

图7显示的是用非加帽病毒 IRES CD19BBZ CAR RNA或加帽CD19BBZ CAR RNA以不同的RNA剂量电穿孔T细胞，用CD19阳性细胞刺激电穿孔的Beads T细胞，通过流式细胞仪检查CD107a的上调情况。

图8显示的是用非加帽EV71 IRES CD19BBZ CAR RNA或caped CD19BBZ CAR RNA电穿孔的REPed T细胞的杀伤活性。

图9 显示的是用CD19阳性细胞刺激电穿孔的T细胞，用ELISA测量IFN-γ的结果。

图10显示的是由人类肠道病毒71型的IRES驱动的非加帽CAR RNA的抗肿瘤活性的BLI曲线。

图11显示的是由人类肠道病毒71型的IRES驱动的非加帽CAR RNA的抗肿瘤活性的生物发光成像。

图12显示的是本申请所述pGEM-EV71-GFP.64A的示意图。

图13显示的是本申请所述pGEM-EV71-19BBZ.64A的示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

在本申请中，术语“核酸分子”通常包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选双链DNA。这些核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。术语“分离的核酸分子”是指从5’至3’末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物(例如，本申请提供的GM-CSF siRNA核酸序列)或其类似物，其已与至少约50％的当从来源细胞分离总核酸时与核酸分子一起被天然发现的多肽、肽、脂质、糖类、多核苷酸或其他材料分离。在一些实施方式中，分离的核酸分子大体上不含任何其他污染性核酸分子或在核酸的天然环境中发现的可干扰其在多肽产生中的用途或其治疗性、诊断性、预防性或研究用途的其他分子。

在本申请中，术语“分离的”或“纯化的”通常是指至少部分从在其天然状态中通常与其结合的其他分子中分离的分子（例如多肽、核酸等）。术语“分离的核酸分子”是指从5’至3’末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物(例如，本申请提供的GM-CSF siRNA核酸序列)或其类似物，其已与至少约50％的当从来源细胞分离总核酸时与核酸分子一起被天然发现的多肽、肽、脂质、糖类、多核苷酸或其他材料分离。在一些实施方式中，分离的核酸分子大体上不含任何其他污染性核酸分子或在核酸的天然环境中发现的可干扰其在多肽产生中的用途或其治疗性、诊断性、预防性或研究用途的其他分子。

在本申请中，术语“上游”和“下游”通常是指编码核苷酸序列链的方向或极性。“上游”方向意指核苷酸位于给定多核苷酸序列的5’方向，即朝向起始核苷酸。“下游”方向意指核苷酸位于给定多核苷酸序列的3’方向，即朝向末端核苷酸。在一些实施方式中，IRES位于编码CAR的核苷酸序列的上游。

在本申请中，术语“可操作地连接”通常是指将编码序列表达所必需的调控序列置于相对于编码序列的适当位置，以便实现编码序列的表达。术语“可操作地连接”还可表示表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。该定义有时也适用于其中生成杂交核酸分子的第一和第二核酸分子的核酸序列的排列。

在本申请中，术语“嵌合抗原受体”(CAR)通常是指至少包含特异性地结合抗原或靶标的胞外结构域、跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域的重组多肽。CAR的胞外结构域与靶细胞表面上的靶抗原结合导致CAR聚簇并将激活刺激传送给含CAR细胞。CAR重定向免疫效应细胞的特异性，并且触发了增殖、细胞因子产生、能够以不依赖主要组织相容性(MHC)的方式介导表达靶抗原的细胞死亡的分子的吞噬作用和/或产生。关于CAR和CAR-T细胞的描述，可参见例如 Sadelain M, Brentjens R, Rivi `ere I. The basicprinciplesof chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 2013;3(4):388-398；TurtleCJ, Hudecek M, Jensen MC, Riddell SR. Engineered T cells for anti-cancertherapy. Curr Opin Immunol. 2012;24(5):633-639；Dotti G,Gottschalk S, SavoldoB, Brenner MK. Design and development of therapies using chimeric antigenreceptor-expressing T cells. Immunol Rev. 2014;257(1):107-126 ；以及WO2013154760、WO2016014789。在一些实施方式中，所述CAR包含anti-CD19 scFv，功能性信号传导结构域4-1BB，胞内信号传导结构域CD3zeta，即anti-CD19 CAR（19BBZ）。

在本申请中，术语“免疫效应细胞”通常是指参与免疫应答，例如，促进免疫效应子应答的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如，α/β的T细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。

在本申请中，术语“工程化细胞”通常是指将DNA或RNA形式的额外遗传物质加入细胞的总遗传物质而被基因修饰的细胞。在一种实施方式中，工程化细胞可以经过基因修饰以表达本申请的CAR的T细胞或NK细胞。

在本申请中，术语“CAR-T”或“CAR-T细胞”通常是指能够表达CAR（又称“嵌合抗原受体”）的T细胞。所述CAR通常是指包含能够结合抗原的胞外结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部件，其可包括靶向部分（例如，结合肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen, TAA)的部分)、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。

在本申请中，术语“药学上可接受的”通常是指不干扰活性成分生物学活性的有效性的一种或多种无毒物质。这类制剂通常可含有盐、赋形剂、缓冲剂、防腐剂、相容性载体和任选的其它治疗剂。这类药学上可接受的制剂通常也可包含适合给予人的相容性固体或液体填料、稀释剂或包囊材料。

在本申请中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，还通常包括预防疾病的发作，减缓或逆转疾病的进展，预防或减缓与疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与疾病相关的一种或多种症状，降低疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度和/或持续时间和/或预防疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度的进一步增加，预防、减少或逆转由疾病引起的任何生理损伤，以及通常对正在治疗的患者有益的任何药理学作用。本申请的CAR-T细胞或药物组合物形成可行的治疗剂不需要实现完全治愈或根除疾病的任何症状或表现。如在相关领域中所认识到的，用作治疗剂的药物可降低给定疾病状态的严重程度，但不需要消除疾病的每种表现才能被认为是有用治疗剂。类似地，预防性施用的治疗构成可行的预防剂不需要完全有效地预防病症的发作。简单地在受试者中减少疾病的影响(例如，通过减少其症状的数量或严重程度，或通过提高另一种治疗的有效性，或通过产生另一种有益效果)，或减少疾病发生或恶化的可能性就足够了。

在本申请中，术语“疾病”或“病症”可以互换使用，通常是指受试者与正常状态的任意偏离，例如身体或某些器官的状态的任何变化，妨碍或扰乱了功能的履行，和/或在患病或与其接触的人中引起症状例如不适、机能障碍、痛苦或甚至死亡。

在本申请中，术语“肿瘤”通常是指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”,“癌性”,“细胞增殖性病症”,“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。在本申请中，所述肿瘤可以包括实体瘤和/或血液瘤。

在本申请中，术语“肿瘤抗原”，包括本领域已知的含义，其包括在肿瘤细胞上表达(或与肿瘤细胞发育相关)、已知或被认为对肿瘤细胞的致瘤特性有作用的任何分子。肿瘤抗原包括分子如EGFR、HER2/neu、HER3、HER4、EpCAM、CEA、TRAIL、TRAIL受体1、TRAIL受体2、淋巴毒素β受体、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD28、CD33、CD40、CD80、CSF-1R、CTLA-4、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、hepsin、黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、VEGF受体1、VEGF受体2、IGF1-R、TSLP-R、TIE-1、TIE-2、TNF-α、TNF样凋亡微弱诱导剂(TWEAK)或IL-1R。

本申请中，术语“施用”通常是指通过任意引入或递送途径将本申请药物制剂引入受试者的身体中。可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与所述药物接触的任何方法。所述施用可以包括而不限于静脉内、动脉内、鼻内、腹内、肌内、皮下透皮或口服。每日剂量可以划分成一个、两个或更多个合适形式的剂量以在某个时间段期间的一个、两个或更多个时间施用。

在本申请中，术语“接触”通常是指两种两个或更多个不同类型的物质以任何顺序、任何方式以及任何时长接触在一起。接触可以发生在体内(in vivo)、间接体内(exvivo)或体外(in vitro)。

在本申请中，术语“有效量”或“有效剂量”通常是指足以实现或至少部分实现所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”通常是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时促进疾病消退(这通过疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期的频度和持续时间的增加、或者由于罹患疾病而引起的损害或残疾的预防来证明)的任何药物量。药物的“预防有效量”或“预防有效剂量”通常是指当单独或与另一种治疗剂组合给有疾病发展或疾病复发的风险的受试者施用时抑制疾病的发展或复发的药物量。可以使用本领域技术人员已知的多种方法对治疗剂或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力进行评估，比如在处于临床试验期间的人类受试者中、在动物模型系统中预测对人类的功效、或者通过在体外测定中测定药剂的活性。

在本申请中，术语“受试者”通常是指需要诊断、预后、改善、预防和/或治疗疾病的人或非人动物（包括哺乳动物），诸如人、非人灵长类动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(狗和猫)、农场动物(家禽如鸡和鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。人受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人受试者。受试者包括动物疾病模型。

在本申请中，术语“包括”、“包含”、“具有”、“可以”、“含有”及其变体通常旨在是开放式过渡性短语、术语或词语，其不排除额外行为或结构的可能性。术语“由……组成”通常表示不能存在别的组分(或同样地，特征、整数、步骤、等)。除非上下文另有明确规定，单数形式如英文的“a”，“an”，“the”，中文的“一个”、“一种”和“所述/该”一般包括所指代事物的复数形式。

在本申请中，术语“约”通常意指大约(approximately)、在......的附近(in theregion of)、粗略地(roughly)、或左右(around)。当术语“约”当用于指涉数值范围时，截值或特定数值用于指示所载明的数值可与该列举数值有多达10％的差异。因此，术语“约”可用于涵盖自特定值±10％或更少的变异、±5％或更少的变异、±1％或更少的变异、±0.5％或更少的变异、或±0.1％或更少的变异。

一方面，本申请提供一种分离的核酸分子，其包含内部核糖体进入位点(IRES)和编码嵌合抗原受体（CAR）的核苷酸序列，所述编码嵌合抗原受体（CAR）的核苷酸序列位于IRES下游。

在某些实施方式中，其中所述IRES选自：人类肠道病毒71 IRES(EV71 IRES)、脑心病病毒IRES（EMCV IRES）和脊髓灰质炎病毒IRES（Polio IRES）。

在某些实施方式中，其中所述EV71 IRES包含SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；所述EMCV IRES包含SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列；所述Polio IRES包含SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。例如，其中所述IRES可以为EV71 IRES。

在某些实施方式中，所述编码CAR的核苷酸序列与所述IRES可操作地连接。

在某些实施方式中，所述编码CAR的核苷酸序列的5’端与所述IRES的3’端直接或间接相连。例如，所述编码CAR的核苷酸序列的5’端可以与所述IRES的3’端直接相连。

在某些实施方式中，还包含编码PolyA尾的核苷酸序列，所述编码PolyA尾的核苷酸序列位于所述编码CAR的核苷酸序列的下游。

在某些实施方式中，其中所述PolyA尾的长度为60-200个核苷酸。例如，所述核酸分子可以包含约60，70，70，90，100，110，120，130，150，160，170，180，190或200个腺苷碱基的聚腺苷酸尾部。又例如，所述核酸分子可以包含约60或150个腺苷碱基的聚腺苷酸尾部。

在某些实施方式中，所述编码CAR的核苷酸序列与所述编码PolyA尾的核苷酸序列可操作地连接。

在某些实施方式中，所述编码PolyA尾的核苷酸序列的5’端与编码所述CAR的核苷酸序列的3’端直接或间接相连。

在一些实施方式中，所述编码PolyA尾的核苷酸序列的5’端与编码所述CAR的核苷酸序列的3’端直接相连。在另一些实施方式中，所述编码PolyA尾的核苷酸序列的5’端与编码所述CAR的核苷酸序列的3’端间接相连。

在某些实施方式中，其中自5’端至3’端，依次包含所述IRES，编码CAR的核苷酸序列和编码PolyA尾的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸分子还包括包含源自人β-球蛋白的至少一个3’UTR的3’UTR(1bgUTR)。在一种实施方式中，所述核酸分子还包括包含源自人β-球蛋白的3’UTR的两个重复序列的3’UTR(2bgUTR)。

在某些实施方式中，其中自5’端至3’端，依次包含所述IRES，编码CAR的核苷酸序列，2bgUTR和编码PolyA尾的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸分子包括mRNA或DNA。

在一些实施方式中，所述核酸分子为mRNA，所述mRNA包含或不包含5’端帽结构。

在某些实施方式中，所述核酸分子为DNA，所述DNA还包含启动子。

在某些实施方式中，所述启动子位于IRES上游。

在某些实施方式中，其中自5’端至3’端，依次包含所述启动子，IRES，编码CAR的核苷酸序列和编码PolyA尾的核苷酸序列。

在某些实施方式中，其中所述启动子包括体外转录启动子。

在某些实施方式中，其中所述启动子包括T7、T3或SP6启动子。

在某些实施方式中，所述CAR包括编码胞外结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和信号传导结构域的核酸。在某些实施方式中，胞外结构域包括抗原结合部分。在某些实施方式中，抗原结合部分结合肿瘤抗原。例如，肿瘤抗原也可为肿瘤-特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。

TSA或TAA抗原的非限制性例子包括下列：分化抗原，比如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤-特异性多谱系抗原，比如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原，比如CEA；过表达的致癌基因和突变肿瘤-抑制基因，比如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原；比如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，比如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、蛋白基抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3\CA27.29\BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

在某些实施方式中，CAR的抗原结合结构域部分靶向下述抗原：其包括但不限于CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR、MAGEA3TCR等。

在某些实施方式中，所述CAR靶向CD19。CD19是局限于B细胞的表面抗原，并且在早期前B(pre-B)细胞和大部分B细胞白血病和淋巴瘤中表达(Nadler，等，1983J Immunol131(1):244-250)。这使得CD19因为其在恶性细胞系和早期及成熟B淋巴细胞的特定子集上表达，但是不在造血干细胞上表达，而成为引人注意的用于靶向治疗的抗原。已经推定CD19耗尽使得从CD19阴性前体群最终恢复正常B细胞库(Cheadle等，2010，J Immunol184(4):1885-1896)。

跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在来源为天然时，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。具体用于本发明的跨膜区可源于T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154(即至少包括上述中的跨膜区(一个或多个))。可选地，跨膜结构域可为合成的，在该情况下，它将包括占主导的疏水残基诸如亮氨酸和缬氨酸。优选地，将在合成跨膜结构域的每一端上发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸之间，可在CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。

在某些实施方式中，跨膜结构域选自CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB跨膜结构域或CD3-ζ跨膜结构域。在一些情况，跨膜结构域可也包括铰链结构域。在一种实施方式中，铰链结构域是CD8a铰链结构域。在另一实施方式中，铰链结构域是IgG铰链结构域。

在某些实施方式中，共刺激信号传导区域包括选自下述的共刺激分子的胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体和其任何组合。

在某些实施方式中，初级细胞质信号传导序列包括源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一种实施方式中，CAR中的细胞质信号传导分子包括源于CD3ζ的细胞质信号传导序列。

在一种实施方式中，CAR包括抗CD19单克隆抗体的单链可变区结构域的胞外结构域，跨膜结构域包括CD8a的铰链和跨膜结构域，和细胞质结构域包括CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。

在某些实施方式中，所述编码CAR的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，其中所述载体包括DNA载体或RNA载体。

在某些实施方式中，其中所述载体包括体外转录（In Vitro Transcribed, IVT）载体。RNA从体外转录载体转录，其中所述载体包括pGEM、pGEM.64A或PD-A(PD-A.2bg(3’UTR).150A)的载体。

在某些实施方式中，其中所述载体包括病毒载体或质粒。

在某些实施方式中，其中自5’端至3’端，所述载体依次包含所述启动子，IRES和编码CAR的核苷酸序列。

在某些实施方式中，其中自5’端至3’端，所述载体依次包含所述启动子，IRES，编码CAR的核苷酸序列和编码PolyA尾的核苷酸序列。

本发明也提供一种T细胞，所述T细胞包括体外转录的RNA或合成的RNA，其包括编码胞外结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和信号传导结构域的核酸。在一种实施方式中，胞外结构域包括抗原结合部分。在一种实施方式中，抗原结合部分结合肿瘤抗原。在一种实施方式中，肿瘤抗原是与选自下述的癌症相关的抗原：脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌和其任何组合。

将核酸引入细胞（如T细胞）的方法是本领域熟知和常规实践的，包括转化、转染、电穿孔、核注射或与诸如脂质体、胶束、鬼影细胞(ghost cell)和原生质体等载体融合。宿主T细胞可以被分离和/或纯化。T细胞也可以是体内转化的细胞，以便引起多肽在体内瞬时或永久表达。该T细胞也可以是离体转化的分离的细胞，在转化后引入，例如以便在体内产生用于治疗目的的多肽。

在某些实施方式中，所述细胞包括免疫效应细胞。

在某些实施方式中，其包括免疫效应细胞，例如，T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、肥大细胞或吞噬细胞。例如，所述免疫效应细胞可以是T细胞或NK细胞。

在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括工程化细胞。

术语“CAR-T”或“CAR-T细胞”通常是指能够表达CAR（又称“嵌合抗原受体”）的T细胞。所述CAR通常是指包含能够结合抗原的胞外结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部件，其可包括靶向部分（例如，结合肿瘤相关抗原(tumor- associated antigen, TAA)的部分)、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。在一个实施方案中，CAR是Anti-CD19 FMC63，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。

另一方面，本申请提供本申请所述的分离的核酸分子、本申请所述的载体或本申请所述的细胞在制备编码CAR的mRNA中的用途。

另一方面，本申请提供本申请所述的分离的核酸分子，本申请所述的载体，或本申请所述的细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤或感染性疾病。

另一方面，本申请提供一种制备工程化细胞的方法，包括将本申请所述的分离的核酸分子或本申请所述的载体引入或转染细胞。

在某些实施方式中，所述方法通过选自以下的任一方式将本申请所述的分离的核酸分子或本申请所述的载体引入细胞：超声处理、电脉冲、电穿孔、渗透压冲击、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染、脂质介导的递送和被动递送。

在某些实施方式中，所述方法通过电穿孔将体外转录的RNA或合成的RNA引入细胞。

在某些实施方式中，其中所述体外转录的RNA或合成的RNA包括mRNA。

在某些实施方式中，所述细胞包括免疫效应细胞。

在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞。

在某些实施方式中，还包括扩增T细胞。

在某些实施方式中，还包括采用快速扩增T细胞方法扩增T细胞。

药学上可接受的载体通常是指适合给予对象的物质，其中该载体在生物学上无害，或不引起其它不良影响。此类载体通常是药物的惰性成分。通常，将载体与活性成分一起给予对象，而不会引起任何不希望的生物学效应或以有害的方式与其中所包含的药物组合物的任何其它组分相互作用。合适的药物载体描述于Ma r t i n ,《雷明顿药物科学》(Remington 's Pharmaceutical Sciences) ,第18版.,马克出版社.,伊斯顿,宾夕法尼亚州.,(1990)，其内容通过引用纳入本文。应当理解，本公开提供的药物组合物可以通过本领域已知的任何方式给予。例如，用于给药的药物组合物可以通过注射、口服或通过肺或鼻途径给药。

在某些实施方式中，所述疾病或病症包括肿瘤。

在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤。

在某些实施方式中，其中所述肿瘤表达肿瘤相关抗原。

在某些实施方式中，其中所述肿瘤表达CD19，CD22，CD20和/或BCMA。

在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、B细胞急性淋巴样白血病(BALL)、母细胞性浆细胞样树突状细胞赘生物、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性髓样白血病、慢性或急性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、毛细胞白血病、霍奇金病、恶性淋巴组织增生性病况、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、浆细胞增殖性病症、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞赘生物、浆细胞瘤(包括浆细胞恶液质；孤立性骨髓瘤；孤立性浆细胞瘤；髓外浆细胞瘤；和多发性浆细胞瘤)、POEMS综合征(也称为Crow-Fukase综合征；Takatsuki病；和PEP综合征)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBC)、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变、T细胞急性淋巴样白血病(TALL)、T细胞淋巴瘤、转化滤泡性淋巴瘤或瓦氏巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤(MCL)、转化滤泡性淋巴瘤(TFL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)、多发性骨髓瘤、毛细胞淋巴瘤/白血病或其组合。

在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括急性淋巴细胞白血病(BALL)、慢性B淋巴细胞白血病(BCLL)，B细胞霍奇金氏淋巴瘤(BHL)和非霍奇金氏淋巴瘤(BNHL)。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的核酸分子、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

实施例1

1.1细胞系和原代人类T淋巴细胞培养

Nalm6（DSMZ, Braunschweig, GERMANY）、Raji（ATCC, Manassas, VA）和K562（ATCC）细胞系按照厂家的说明进行培养。表达CD19的K562细胞和表达甲壳虫绿（CBG）的Nalm6细胞是按照以前的描述生成的^[1]。

原代T淋巴细胞通过两种不同的方法进行刺激和扩增：

（1）使用CD3/CD28 Dynabeads（Life Technologies, Grand Island, NY）^[2]。

（2）快速T细胞扩增（REPed）：将1×10⁶个纯化的CD4和CD8 T细胞以1:1的比例加入到T150烧瓶中的1×10⁸个辐照的异体外周血单核细胞（PBMCs）中，在50ng/ml OKT3的存在下，总体积为150ml的R/10培养基。在第2天向培养物中加入IL-2，最终浓度为300 IU/ml。在第5天，用含有300 IU/ml IL-2的新鲜R/10培养基替换120毫升的培养上清液。刺激后7天开始，每隔一天分裂一次T细胞，直到第11天。扩增的T细胞被抽出并冷冻以备进一步使用^[3]。

用快速T细胞扩增（REPed）或CD3/CD28 Dynal Beads（Beads）刺激和扩增T细胞，并按指示用抗体染色，用流式细胞仪检查。

图3显示电转前T细胞表型测试结果，从左到右分别表示，REPed T 细胞中，效应记忆细胞高于中央记忆细胞，Beads T细胞则相反；表明REPed T 细胞含有较多的效应记忆细胞，更适合用于RNA电转，而Beads T细胞含有较多的中心记忆细胞，更适合用于病毒转染。

体外转录（IVT）RNA载体的构建和RNA体外转录及电穿孔

1.2.1 载体构建及电穿孔：

GFP和不同类型的IRES-GFP的IVT载体被构建成基于pGEM.64A的IVT载体（图12-13）。为确定不同转录启动方式对CAR表达的影响，将CD19BBZ、IRES-CD19BBZ等的IVT载体构建成基于pGEM.64A的IVT载体。其中，IRES-GFP的IVT载体包含编码IRES-GFP的序列；CD19BBZ的IVT载体包含编码CD19 scfv-4-1BB-CD3ζ的序列；IRES-CD19BBZ的IVT载体包含编码IRES-CD19 scfv-4-1BB-CD3ζ的序列；图12显示的是pGEM-ev71-GFP.64A的结构，本领域技术人员容易想到将EV71 IRES替换为其他病毒IRES的载体结构，同理，本领域技术人员也容易想到将GFP替换为其他目的蛋白基因（如编码anti-CD19 CAR的序列）后的载体结构（参考图13）；同理,本领域技术人员也容易想到将pGEM.64A替换为其他载体时(如PD-A.2bg(3’UTR).150A)的结构。

用适当的限制性酶消化IVT载体，使其线性化，根据试剂盒提供的程序，使用mMESSAGE mMACHINE® T7（用于无帽RNA）或mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra试剂盒（用于有帽RNA）来生成IVT RNA。

在电穿孔之前，将冷冻的受刺激T细胞解冻并在R/10培养基中培养过夜。在电穿孔之前，T细胞用OPTI-MEM洗涤三次，并在电穿孔之前以1-3×10⁸个细胞/ml的最终浓度重新悬浮于OPTI-MEM中。随后，将0.1毫升的T细胞与指定的IVT RNA混合，用ECM830方波仪（Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA）在2毫米的比色皿中电穿孔^[4]。

1.2.2 流式检测不同转录启动方式的T细胞RNA表达情况：

（1）染色前，用50 ng/ml PMA、1 ug/ml Ionomycin和GolgiStop（BD Biosciences，1500倍稀释）处理上述电穿孔之后的T细胞6小时；

（2）6小时后，将T细胞转移到96孔板，在4℃，1500rpm下旋转3分钟；

（3）将细胞颗粒重悬于100ul/孔的1×固定/透化缓冲液中，4℃30分钟（固定/透化缓冲液是由固定/透化浓缩液（Thermofisher，Cat.No.00-5123-43）和固定/透化稀释液（Thermofisher，Cat. No.00-5223-56）按1:3比例混合而成）；

（4）在每个固定/透化细胞孔中加入100ul的1X透化缓冲液（Thermofisher，Cat.No.00-8333-56），在4℃，1800rpm下旋转3分钟；

（5）用200ul 1X通透性缓冲液再洗一次细胞，在4℃，1800rpm条件下旋转5分钟；

（6）在1X通透性缓冲液中稀释抗体，T细胞在4℃下染色30分钟；

（7）加入150ul/孔的1X通透缓冲液，在4℃，1800rpm下旋转5分钟；

（8）用200ul 1X通透性缓冲液再洗一次细胞；

（9）将细胞重悬于200ul FACS中，进行流式分析。

1.2.3. 流式分析结果：

如图1A至图1J所示，用非加帽的EV71 IRES GFP RNA、EMCV IRES GFP RNA或加帽的GFP RNA在不同的RNA剂量下电穿孔T细胞，显示出高水平的GFP表达量，且持续时间至少3天。

图2为按照本实施例载体构建和检测方法进行的流式分析，用非加帽IRESCD19BBZ CAR RNA（non-Capped EV71 IRES-19BBZ或non-Capped EMCV IRES-19BBZ）或加帽CD19BBZ CAR RNA（Capped 19BBZ）在电穿孔后的不同时间检测CAR表达，结果显示上述电穿孔的T细胞均能够表达了CAR。

图4-5分别显示了，用非加帽EV71 IRES CD19BBZ CAR RNA和加帽CD19BBZ CARRNA在不同的RNA剂量下电穿孔后，在REPed或Beads扩增T细胞中的24h和3天的CAR的表达量，结果显示采用非加帽EV71 IRES CD19BBZ CAR RNA电穿孔T细胞可以表达CAR且至少持续3天，且REPed T细胞的CAR表达水平较Beads T细胞水平高。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

用ELISA测量不同的RNA剂量下非加帽EV71 IRES CD19BBZ CAR RNA或加帽CD19BBZ CAR RNA电穿孔的REPed T细胞或Beads T细胞的IFN-γ水平：

将T细胞或靶细胞洗净并悬浮在R/10培养基中，浓度为1×10⁶细胞/毫升。将每种细胞系约0.1毫升加入96孔板（Corning）的一个孔中，在37℃下孵育18至20小时。收获上清液并进行ELISA测试。

在收集上清液之前，用50ng/ml PMA和1ug/ml Ionomycin在96孔板处理T细胞6小时；6小时后，在4℃，1500rpm下旋压3分钟；然后将上清液转移到新的96孔板中；根据制造商的建议，用ELISA检测IFN-γ细胞因子水平。

图9结果显示，非加帽EV71 IRES CD19BBZ CAR RNA电穿孔的T细胞IFN-γ水平呈剂量依赖性增加，且REPed T细胞的IFN-γ总体水平高于Beads T细胞。

检测

在96孔板的160微升R/10培养基中，以效应物：目标物（E:T）细胞的比例为1:1（105个效应物：105个目标物）进行培养。加入抗CD107a抗体并在37℃下与细胞孵化1小时，然后加入高尔基止血剂并再孵化2.5小时。加入抗CD8和抗CD3抗体并在37℃下孵育30分钟。孵化后，样品被清洗一次，用BD FACSCalibur进行流式细胞测量。用FlowJo软件对数据进行分析。

图6显示的是REPed T细胞在不同的RNA剂量下，用非加帽EV71 IRES CD19BBZ CARRNA或加帽CD19BBZ CAR RNA电穿孔，用CD19阳性细胞刺激电穿孔的REPed T细胞，通过流式细胞仪检查CD107a的上调情况，二者的CD107a上调水平类似。

图7显示的是用非加帽病毒 IRES CD19BBZ CAR RNA或加帽CD19BBZ CAR RNA以不同的RNA剂量电穿孔T细胞，用CD19阳性细胞刺激电穿孔的Beads T细胞，通过流式细胞仪检查CD107a的上调情况，非加帽EV71 IRES CD19BBZ转移的T细胞比用加帽CD19BBZ RNA转移的T细胞CD107a上调水平降低。

流式细胞毒性T淋巴细胞（CTL）测定

按照以前的描述^[4,5]，在以CD19阳性细胞系Nalm6为靶细胞的流动细胞毒性(CTL)试验中，测试了电穿孔T细胞的杀伤活性。

结果如图8所示，与CD107a试验的结果相似，在不同的RNA剂量下，用非加帽EV71IRES CD19BBZ CAR RNA或加帽 CD19BBZ CAR RNA电穿孔的REPed T细胞显示出类似的细胞杀伤活性。而用非加帽的EV71 IRES CD19BBZ CAR RNA电穿孔的beads T细胞比用加帽的CD19BBZ CAR RNA转移的beads T细胞的杀伤效力要低。

非加帽EV71 IRES CAR RNA的抗肿瘤活性

NSG小鼠静脉注射白血病细胞株Nalm6 7天，用非加帽的EV71 IRES-19.BBZ CARRNA或加帽的CD19BBZ CAR RNA电穿孔的REPed T细胞，用非电穿孔T细胞作为对照（No EP）静脉注射到肿瘤小鼠体内。通过生物发光成像（BLI）监测肿瘤负担。

结果如图10-11所示，采用用非加帽的EV71 IRES-19.BBZ CAR RNA或加帽的CD19BBZ CAR RNA电穿孔的REPed T细胞均能够产生较强肿瘤抑制效果，且抑瘤效应持续至少约20天。

参考文献

1. Barrett DM, Liu X, Jiang S, June CH, Grupp SA, Zhao Y: Regimen-specific effects of rna-modified chimeric antigen receptor t cells in micewith advanced leukemia. Human gene therapy (2013) 24(8):717-727.

2. Barrett DM, Zhao Y, Liu X, Jiang S, Carpenito C, Kalos M, CarrollRG, June CH, Grupp SA: Treatment of advanced leukemia in mice with mrnaengineered t cells. Human gene therapy (2011) 22(12):1575-1586.

3. Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, Even J, Rosenberg SA:Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptivetransfer therapy for melanoma patients. J Immunother (2003) 26(4):332-342.

4. Zhao Y, Moon E, Carpenito C, Paulos CM, Liu X, Brennan AL, Chew A,Carroll RG, Scholler J, Levine BL, Albelda SM et al: Multiple injections ofelectroporated autologous t cells expressing a chimeric antigen receptormediate regression of human disseminated tumor. Cancer research (2010) 70(22):9053-9061.

5. Hermans IF, Silk JD, Yang J, Palmowski MJ, Gileadi U, McCarthy C,Salio M, Ronchese F, Cerundolo V: The vital assay: A versatile fluorometrictechnique for assessing ctl- and nkt-mediated cytotoxicity against multipletargets in vitro and in vivo. Journal of immunological methods (2004) 285(1):25-40.

序列表

<110> 上海优替济生生物医药有限公司

<120> 分离的核酸分子及其用途

<130> 0260-PA-002

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> EV71 IRES

<400> 1

aaacgtcgac aaaacagcct gtgggttgca caaaacagcc tgtgggttgc acccacccac 60

agggcccact gggcgctagc actctggtac tgaggtacct ttgtgcgcct gtttttactc 120

cccttccccc gaagtaactt agaagctgta aatcaacgat caatagcagg tgtggcacac 180

cagtcatacc ttgatcaagc acttctgttt ccccggactg agtatcaata ggctgctcgc 240

gcggctgaag gagaaaacgt tcgttacccg accaactact tcgagaagct tagtaccacc 300

atgaacgagg cagggtgttt cgctcagcac aaccccagtg tagatcaggc tgatgagtca 360

ctgcaacccc catgggcgac catggcagtg gctgcgttgg cggcctgccc atggagaaat 420

ccatgggacg ctctaattct gacatggtgt gaagagccta ttgagctagc tggtagtcct 480

ccggcccctg aatgcggcta atcctaactg cggagcacat gctcacaaac cagtgggtgg 540

tgtgtcgtaa cgggcaactc tgcagcggaa ccgactactt tgggtgtccg tgtttccttt 600

tattcctata ttggctgctt atggtgacaa tcaaaaagtt gttaccatat agctattgga 660

ttggccatcc ggtgtgcaac agggcaattg tttacctatt tattggtttt gtaccattat 720

cactgaagtc tgtgatcact ctcaaattca ttttgaccct caacacaatc aaacatg 777

<210> 2

<211> 401

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> HCV IRES

<400> 2

accaaagctt gccagccccc tgatgggggc gacactccac catgaatcac tcccctgtga 60

ggaactactg tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag 120

cctccaggac cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg 180

gaattgccag gacgaccggg tcctttcttg gataaacccg ctcaatgcct ggagatttgg 240

gcgtgccccc gcaagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact 300

gcctgatagg gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catgagcacg 360

aatcctaaac ctcaaagaaa aaccaaacgt aacacgccac c 401

<210> 3

<211> 652

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Polio IRES

<400> 3

aagcttttaa aacagctctg gggttgtacc caccccagag gcccacgtgg cggctagtac 60

tccggtattg cggtaccctt gtacgcctgt tttatactcc cttcccgtaa cttagacgca 120

caaaaccaag ttcaatagaa gggggtacaa accagtacca ccacgaacaa gcacttctgt 180

ttccccggtg atgtcgtata gactgcttgc gtggttgaaa gcgacggatc cgttatccgc 240

ttatgtactt cgagaagccc agtaccacct cggaatcttc gatgcgttgc gctcagcact 300

caaccccaga gtgtagctta ggctgatgag tctggacatc cctcaccggt gacggtggtc 360

caggctgcgt tggcggccta cctatggcta acgccatggg acgctagttg tgaacaaggt 420

gtgaagagcc tattgagcta cataagaatc ctccggcccc tgaatgcggc taatcccaac 480

ctcggagcag gtggtcacaa accagtgatt ggcctgtcgt aacgcgcaag tccgtggcgg 540

aaccgactac tttgggtgtc cgtgtttcct tttattttat tgtggctgct tatggtgaca 600

atcacagatt gttatcataa agcgaattgg attgcggcgc gccgaattcg aa 652

<210> 4

<211> 523

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> EMCV IRES

<400> 4

ctcgagctca agcttcgaat tccggttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt 60

gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct 120

cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc 180

ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga 240

caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc 300

ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt 360

attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg 420

gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaacgtct aggccccccg 480

aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat aat 523

<210> 5

<211> 144

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> TEV IRES

<400> 5

aaaataacaa atctcaacac aacatataca aaacaaacga atctcaagca atcaagcatt 60

ctacttctat tgcagcaatt taaatcattt cttttaaagc aaaagcaatt ttctgaaaat 120

tttcaccatt tacgaacgat agcc 144

<210> 6

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> GFP

<400> 6

gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60

gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120

aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180

gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300

aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420

ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480

atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540

cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600

ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caag 714

<210> 7

<211> 1502

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> EV71-GFP

<400> 7

aaacgtcgac aaaacagcct gtgggttgca caaaacagcc tgtgggttgc acccacccac 60

agggcccact gggcgctagc actctggtac tgaggtacct ttgtgcgcct gtttttactc 120

cccttccccc gaagtaactt agaagctgta aatcaacgat caatagcagg tgtggcacac 180

cagtcatacc ttgatcaagc acttctgttt ccccggactg agtatcaata ggctgctcgc 240

gcggctgaag gagaaaacgt tcgttacccg accaactact tcgagaagct tagtaccacc 300

atgaacgagg cagggtgttt cgctcagcac aaccccagtg tagatcaggc tgatgagtca 360

ctgcaacccc catgggcgac catggcagtg gctgcgttgg cggcctgccc atggagaaat 420

ccatgggacg ctctaattct gacatggtgt gaagagccta ttgagctagc tggtagtcct 480

ccggcccctg aatgcggcta atcctaactg cggagcacat gctcacaaac cagtgggtgg 540

tgtgtcgtaa cgggcaactc tgcagcggaa ccgactactt tgggtgtccg tgtttccttt 600

tattcctata ttggctgctt atggtgacaa tcaaaaagtt gttaccatat agctattgga 660

ttggccatcc ggtgtgcaac agggcaattg tttacctatt tattggtttt gtaccattat 720

cactgaagtc tgtgatcact ctcaaattca ttttgaccct caacacaatc aaacatggtg 780

agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac 840

gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag 900

ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg 960

accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 1020

gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 1080

gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 1140

cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 1200

gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc 1260

aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 1320

taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg 1380

agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg 1440

gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaagcggcc 1500

gc 1502

<210> 8

<211> 1129

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> HCV-GFP

<400> 8

accaaagctt gccagccccc tgatgggggc gacactccac catgaatcac tcccctgtga 60

ggaactactg tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag 120

cctccaggac cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg 180

gaattgccag gacgaccggg tcctttcttg gataaacccg ctcaatgcct ggagatttgg 240

gcgtgccccc gcaagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact 300

gcctgatagg gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catgagcacg 360

aatcctaaac ctcaaagaaa aaccaaacgt aacacgccac catggtgagc aagggcgagg 420

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 480

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 540

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 600

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 660

ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 720

acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 780

agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 840

acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 900

agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 960

cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 1020

ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 1080

ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta agcggccgc 1129

<210> 9

<211> 1380

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Polio-GFP

<400> 9

aagcttttaa aacagctctg gggttgtacc caccccagag gcccacgtgg cggctagtac 60

tccggtattg cggtaccctt gtacgcctgt tttatactcc cttcccgtaa cttagacgca 120

caaaaccaag ttcaatagaa gggggtacaa accagtacca ccacgaacaa gcacttctgt 180

ttccccggtg atgtcgtata gactgcttgc gtggttgaaa gcgacggatc cgttatccgc 240

ttatgtactt cgagaagccc agtaccacct cggaatcttc gatgcgttgc gctcagcact 300

caaccccaga gtgtagctta ggctgatgag tctggacatc cctcaccggt gacggtggtc 360

caggctgcgt tggcggccta cctatggcta acgccatggg acgctagttg tgaacaaggt 420

gtgaagagcc tattgagcta cataagaatc ctccggcccc tgaatgcggc taatcccaac 480

ctcggagcag gtggtcacaa accagtgatt ggcctgtcgt aacgcgcaag tccgtggcgg 540

aaccgactac tttgggtgtc cgtgtttcct tttattttat tgtggctgct tatggtgaca 600

atcacagatt gttatcataa agcgaattgg attgcggcgc gccgaattcg aaatggtgag 660

caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 720

aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 780

gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 840

caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 900

cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 960

cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 1020

catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 1080

gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa 1140

ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 1200

ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 1260

cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 1320

gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aagcggccgc 1380

<210> 10

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> EMCV-GFP

<400> 10

ctcgagctca agcttcgaat tccggttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt 60

gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct 120

cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc 180

ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga 240

caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc 300

ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt 360

attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg 420

gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaacgtct aggccccccg 480

aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat aatatggtga gcaagggcga 540

ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca 600

caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa 660

gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac 720

ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa 780

gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa 840

ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct 900

gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta 960

caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt 1020

caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa 1080

cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc 1140

cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac 1200

cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taagcggccg c 1251

<210> 11

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> TEV-GFP

<400> 11

aaaataacaa atctcaacac aacatataca aaacaaacga atctcaagca atcaagcatt 60

ctacttctat tgcagcaatt taaatcattt cttttaaagc aaaagcaatt ttctgaaaat 120

tttcaccatt tacgaacgat agccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 180

gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 240

gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 300

aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 360

agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 420

tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 480

gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 540

gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 600

atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 660

gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 720

cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 780

aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 840

ggcatggacg agctgtacaa gtaa 864

<210> 12

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 CAR 核苷酸序列

<400> 12

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcta a 1461

<210> 13

<211> 2238

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> EV71-19BBZ

<400> 13

aaacgtcgac aaaacagcct gtgggttgca caaaacagcc tgtgggttgc acccacccac 60

agggcccact gggcgctagc actctggtac tgaggtacct ttgtgcgcct gtttttactc 120

cccttccccc gaagtaactt agaagctgta aatcaacgat caatagcagg tgtggcacac 180

cagtcatacc ttgatcaagc acttctgttt ccccggactg agtatcaata ggctgctcgc 240

gcggctgaag gagaaaacgt tcgttacccg accaactact tcgagaagct tagtaccacc 300

atgaacgagg cagggtgttt cgctcagcac aaccccagtg tagatcaggc tgatgagtca 360

ctgcaacccc catgggcgac catggcagtg gctgcgttgg cggcctgccc atggagaaat 420

ccatgggacg ctctaattct gacatggtgt gaagagccta ttgagctagc tggtagtcct 480

ccggcccctg aatgcggcta atcctaactg cggagcacat gctcacaaac cagtgggtgg 540

tgtgtcgtaa cgggcaactc tgcagcggaa ccgactactt tgggtgtccg tgtttccttt 600

tattcctata ttggctgctt atggtgacaa tcaaaaagtt gttaccatat agctattgga 660

ttggccatcc ggtgtgcaac agggcaattg tttacctatt tattggtttt gtaccattat 720

cactgaagtc tgtgatcact ctcaaattca ttttgaccct caacacaatc aaacatgatg 780

gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 840

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 900

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 960

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 1020

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 1080

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 1140

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 1200

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 1260

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 1320

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 1380

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 1440

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 1500

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 1560

tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 1620

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 1680

gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 1740

cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1800

atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1860

tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1920

gcagacgccc ccgcgtacaa gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1980

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 2040

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 2100

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 2160

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 2220

gccctgcccc ctcgctaa 2238

<210> 14

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 CAR 氨基酸序列

<400> 14

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

325 330 335

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

340 345 350

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

355 360 365

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380

Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

435 440 445

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 15

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 scFv 核苷酸序列

<400> 15

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720

tcctca 726

<210> 16

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 scFv 氨基酸序列

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 17

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD8 signal peptide 核苷酸序列

<400> 17

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 18

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD8 signal peptide 氨基酸序列

<400> 18

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 19

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD8 Hinge 核苷酸序列

<400> 19

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 20

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD8 Hinge 氨基酸序列

<400> 20

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 21

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> 4-1BB costimulatory domain 核苷酸序列

<400> 21

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 22

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> 4-1BB costimulatory domain 氨基酸序列

<400> 22

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 23

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD3-zeta 核苷酸序列

<400> 23

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 24

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD3-zeta 氨基酸序列

<400> 24

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 25

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 LFR1

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys

20

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 LCDR1

<400> 26

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 LFR2

<400> 27

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 LCDR2

<400> 28

His Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 29

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 LFR3

<400> 29

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 LCDR3

<400> 30

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 31

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 LFR4

<400> 31

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

1 5 10

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 VL

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 33

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 HFR1

<400> 33

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro

20 25 30

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 HCDR1

<400> 34

Asp Tyr Gly Val Ser

1 5

<210> 35

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 HFR2

<400> 35

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

1 5 10

<210> 36

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 HCDR2

<400> 36

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 37

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 HFR3

<400> 37

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

<210> 38

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 HCDR3

<400> 38

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 39

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 HFR4

<400> 39

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 40

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Anti-CD19 FMC63 VH

<400> 40

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

Claims

1.分离的核酸分子，自5’端至3’端，其依次包含人类肠道病毒71内部核糖体进入位点，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列和编码PolyA尾的核苷酸序列；所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列分别与所述内部核糖体进入位点，所述编码PolyA尾的核苷酸序列可操作地连接；其中所述人类肠道病毒71内部核糖体进入位点的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，且所述核酸分子不包含5’端帽结构。

2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述PolyA尾的长度为60-200个核苷酸。

3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，所述核酸分子包括mRNA或DNA。

4.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，所述DNA还包含启动子。

5.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，自5’端至3’端，所述DNA依次包含所述启动子，内部核糖体进入位点，编码嵌合抗原受体的核苷酸序列和编码PolyA尾的核苷酸序列。

6.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述启动子包括T7启动子。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸分子，所述嵌合抗原受体靶向肿瘤抗原。

8.根据权利要求7所述的分离的核酸分子，所述嵌合抗原受体靶向CD19。

9.根据权利要求7所述的分离的核酸分子，所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQID NO: 12所示。

10.根据权利要求9所述的分离的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示。

11.载体，其包含权利要求1-10中任一项所述的分离的核酸分子。

12.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体包括体外转录载体。

13.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体包括质粒。

14.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体包括pGEM.64A载体。

15.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列。

16.细胞，其包含权利要求1-10中任一项所述的分离的核酸分子或权利要求11-15中任一项所述的载体。

17.权利要求1-10中任一项所述的分离的核酸分子、权利要求11-15中任一项所述的载体或权利要求16所述的细胞在制备编码嵌合抗原受体的mRNA中的用途。

18.权利要求1-10中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求11-15中任一项所述的载体或权利要求16所述的细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤。

19.根据权利要求18所述的用途，其中所述药物包括CAR-T细胞。

20.制备工程化细胞的方法，包括将权利要求1-10中任一项所述的分离的核酸分子或权利要求11-15中任一项所述的载体引入细胞。

21.根据权利要求20所述的方法，所述细胞包括免疫效应细胞。

22.根据权利要求21所述的方法，所述免疫效应细胞包括T细胞。

23.根据权利要求22所述的方法，还包括采用快速扩增T细胞方法扩增所述T细胞。

24.药物组合物，其包含权利要求16所述的细胞和药学上可接受的载体。