CN110078817A

CN110078817A - 一种改良的铰链区及其在构建car骨架中的应用

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Publication number: CN110078817A
Application number: CN201810079289.9A
Authority: CN
Inventors: 张巍; 单娟娟; 张茜真
Original assignee: Chongqing Precision Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Chongqing Precision Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-01-26
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2038-01-26
Also published as: CN110078817B

Abstract

本发明属于免疫治疗领域，具体涉及一种改造的铰链区及其在构建CAR骨架的应用。本发明提供的铰链区能够延长CAR‑T细胞体内存续和/或提高CAR‑T细胞浸润肿瘤能力，所述铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO.1。本发明提供的铰链区结构能够延长CAR‑T细胞在体内存续时间，该铰链区结构组合的嵌合抗原受体能够更稳定的表达于T淋巴细胞，含有本发明铰链区的CAR‑T在体内存续时间更长、细胞浸润肿瘤能力显著增强，杀伤效果更好。

Description

一种改良的铰链区及其在构建CAR骨架中的应用

技术领域

本发明属于免疫治疗领域，涉及一种改造的铰链区及其在构建CAR骨架的应用，具体涉及一种能够延长CAR-T细胞体内存续和/或提高CAR-T细胞浸润肿瘤能力的铰链区及其在构建CAR骨架的应用。

背景技术

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是模拟TCR功能的人工受体，包含抗原识别域、铰链区、跨膜区及胞内信号域。胞内信号域通常为CD3ζ链或FcRγ，或与一种或多种共刺激分子相连，如4-1BB(CD137)，CD28，ICOS(CD278)。肿瘤细胞表面的抗原(受体)与嵌合抗原受体的抗体(配体)结合时，通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域将信号转化为活化信号，激活效应细胞，效应细胞增殖、产生细胞因子从而杀伤肿瘤细胞。

近年来，嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)在肿瘤治疗中展现了显著的治疗效果尤其是治疗CD19阳性的恶性肿瘤方面。但是即使对于治疗效果显著地急性淋巴细胞白血病(ALL)，治疗后完全缓解中位时间一般均在8个月左右，仍有大量患者复发，这可能和CAR-T细胞在患者体内存续时间短相关，提高CAR-T体内存续时间对于CAR-T治疗疗效有重大意义。

虽然利用CAR-T进行实体瘤的研究也不断得到重视，但是大多数CAR-T治疗实体瘤的效果却并不令人满意，一方面也是因为CAR-T细胞在体内存续差，CAR-T细胞很快死亡影响杀伤有效性；另一方面大多数实体瘤会由于其在代谢、免疫逃逸、组织形成方面的多能性，在多方面限制免疫系统对其的控制和杀伤，导致CAR-T细胞难以浸润到实体瘤肿瘤组织内部，所以对于大的实体瘤CAR-T治疗收效甚微。延长CAR-T在体内存续性，促进CAR-T细胞在实体瘤组织浸润，能够有效杀伤肿瘤并抑制肿瘤细胞的复发，但是目前还没有有效延长CAR-T体内存续和促进CAR-T细胞肿瘤浸润的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够延长CAR-T细胞体内存续和/或提高CAR-T细胞浸润肿瘤能力的铰链区，含有本发明铰链区的CAR-T在体内存续时间更长、细胞浸润肿瘤能力显著增强，杀伤效果更好。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

能够延长CAR-T细胞体内存续和/或提高CAR-T细胞浸润肿瘤能力的铰链区，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。

所述铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

肿瘤细胞表面的抗原(受体)与所述的嵌合抗原受体的抗体(配体)结合时，通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域将信号转化为活化信号，激活效应细胞，效应细胞增殖、产生细胞因子及一系列活化反应从而杀伤肿瘤细胞。申请人通过对CAR结构铰链区改造的研究，发现铰链区结构与CAR-T的体内延续性和肿瘤浸润能力密切相关。

铰链区也称间隔区或hinge，连接CAR抗原识别区和跨膜区。铰链区应该有足够的灵活性，允许抗原结合区定向在不同的方向，以促进抗原识别。不同长度的铰链区对于CAR-T的稳定性起到不同作用，申请人通过多种对比组合意外发现铰链区对于CAR-T体内存续和肿瘤浸润具有重要影响；通过大量筛选工作，最终获得能够有效延长CAR-T体内存续和促进CAR-T细胞肿瘤浸润的铰链序列SEQ ID NO.1，命名为：8H(dc)。

发明人共设计了4种铰链结构并命名为：8H(dc)、G4Hinge、G4HH3、G4HH2H3mt，8H(dc)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16。G4Hinge、G4HH3、G4HH2H3mt氨基酸序列如表1所示。

对比目前常用的铰链结构G4h(G4HH2H3)、8H组合的CAR-T细胞CAR阳性率、CAR-T体内体外杀伤以及CAR-T体内存续和/或CAR-T细胞肿瘤浸润，发现包含8H(dc)铰链结构CAR的CAR-T体内存续时间更长，并且与含有G4h或8H铰链的CAR-T对比，含有8H(dc)的CAR-T细胞浸润肿瘤能力显著增强，杀伤效果更好。

延长CAR-T细胞体内存续和/或提高CAR-T细胞浸润肿瘤能力的铰链的改造方法，以人CD8α、G4HH2H3序列为模板以随机突变的方式进行铰链区改造。

本发明的目的之二在于提供一种得到上述铰链区的改造方法，人CD8α氨基酸序列来源的8H铰链序列对第29位半胱氨酸和第46位半胱氨酸进行改造，改造的方式包括随机突变和缺失；8H铰链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述改造的方式包括但不仅限于随机突变和缺失。

进一步，所述铰链区的序列为人CD8α氨基酸序列来源的铰链序列删除第29位半胱氨酸和第46位半胱氨酸。。

本发明的目的之三在于提供一种嵌合抗原受体，包括上述的铰链区。所述铰链区为8H(dc)。

进一步，所述嵌合抗原受体还包含抗原识别区、跨膜区和胞内信号域。

进一步，所述抗原识别区可以识别肿瘤细胞表达抗原，包括PSCA、PSMA、CD19、BCMA、CD123、CD20、CD22、CEA、EGFR、EGFRVIII、GPC3、mesothelin抗原分子。

所述嵌合抗原受体可以识别的肿瘤细胞表达抗原包含但不限于以上抗原分子。

本发明的目的还在于提供一种靶向PSCA的嵌合抗原受体，包含抗人PSCA抗原的单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号域；所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述抗人PSCA抗原的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.15或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。所述抗人PSCA抗原的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

进一步，所述跨膜区为CD28TM或CD8TM，所述CD28TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:3，所述CD8TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:11；所述胞内信号域为CD28和/或CD137和/或CD3，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:12，所述CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO:13，所述CD3的氨基酸序列如SEQ ID NO:14。

进一步，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9或SEQ IDNO.10所示。所述氨基酸序列为SEQ ID NO.8的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ IDNO.21。

本发明的目的还在于提供一种所述的靶向PSCA的嵌合抗原受体的病毒载体的制备方法，包含以下步骤：

1)合成靶向PSCA的嵌合抗原受体的基因序列：合成包含前导肽、抗人PSCA抗原的单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号域的嵌合抗原受体核酸序列；所述前导肽核酸序列如SEQ ID NO.22所示；

2)构建表达嵌合抗原受体的病毒载体：设计引物，正向引物的核苷酸序列如SEQID NO:23所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示，以所述嵌合抗原受体的基因序列为模板进行PCR扩增，得DNA片段；

将所述DNA片段的基因序列用限制性内切酶双酶切，同时用限制性内切酶酶切病毒表达载体pCDH-CAG，然后将酶切后的目的片段和病毒表达载体片段通过T4连接酶进行连接，获得表达嵌合抗原受体的病毒载体。所述病毒载体包含但不限于腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。

作为一种优选，所述限制性内切酶为NheI和SalI。

进一步，步骤1)所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

进一步，在步骤2)之后，包装并纯化所述病毒载体，所述病毒载体为慢病毒载体。

本发明的目的还在于提供一种所述的制备方法所得的慢病毒载体。

在所述的方法下得到所述的慢病毒载体，这样的慢病毒载体转导的阳性细胞表达率高，在病人细胞培养过程中稳定，并且不会随着时间的推移导致CAR阳性率下降。用所述慢病毒载体感染的细胞，这样的细胞具备杀伤靶细胞的功能。

本发明的目的还在于提供一种所述的慢病毒载体感染的细胞，所述细胞包括T细胞、DC细胞和NK细胞。所述细胞包括但不限于T淋巴细胞、DC细胞和NK细胞。

进一步，所述慢病毒载体感染的细胞为T细胞。

本发明的目的还在于提供一种所述的慢病毒载体感染的CAR-T细胞在用于制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步，所述肿瘤的细胞或组织能够表达PSCA。

本发明的目的还在于提供一种SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列作为铰链区在构建CAR骨架的应用。

在某些实施例中对人CD8α序列来源的铰链区的改造，可以对第29半胱氨酸和第46半胱氨酸进行突变。在某些实施例中嵌合抗原受体的铰链区可以是SEQ ID NO.1序列中第29位和/或第46位半胱氨酸突变为：甘氨酸或者丙氨酸。

在某些实施例中嵌合抗原受体的铰链区可以为G4HH2H3序列改造的序列，如包含删除G4HH2H3序列的H2H3段的铰链区的嵌合抗原受体；在某些实施例中，嵌合抗原受体的铰链区序列为G4HH2H3序列删除H2段的序列；在某些实施例的嵌合抗原受体，铰链区序列为G4HH2H3序列第15-18位和/或第79氨基酸进行突变，突变位点如下表1所示。

表1：G4HH2H3铰链序列改造

在某些实施例中，包含8H(dc)铰链结构的嵌合抗原受体的抗原识别区可以是任何可以与PSCA抗原结合的多肽，例如可与PSCA特异结合的配体、双特异抗体、scFV、任选地交联的Fab、F(ab)2、单域抗体以及连接有His-标签或HA-标签的scFV。

在某些实施例中包含发明人改造的铰链的嵌合抗原受体为第二代嵌合抗原受体，即胞内信号为CD28信号和CD3信号，或者CD137信号和CD3信号，具体序列包含但不限于如下表2所示的序列，其中序号1和2氨基酸序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

表2：包含8H(dc)铰链结构的CAR组合

本发明的有益效果在于：

1)本发明提供的铰链区结构能够延长CAR-T细胞在体内存续时间。

2)本发明提供的铰链区结构组合的嵌合抗原受体能够更稳定的表达于T淋巴细胞，具有更好的清除肿瘤细胞的能力，不仅可以维持靶向PSCA的嵌合抗原受体在病人细胞培养过程中的阳性率并且能够加强CAR-T的增殖和杀伤肿瘤的能力，对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗。

3)包含本发明提供的铰链结构的CAR-T细胞浸润肿瘤组织的能力加强，可以有效对实体瘤进行杀伤。

附图说明

图1为不同铰链区及其组成的CAR结构图。

图2为G4H及其改造的铰链区组合的CAR表达率。

图3为8H及其结构改造的铰链区组合的CAR表达率。

图4为G4H及其改造的铰链区组合的CAR-T细胞增殖。

图5为G4H及其改造的铰链区组合的CAR-T细胞杀伤率。

图6为8H及其结构改造的铰链区组合的CAR-T细胞杀伤率。

图7为改造的铰链区组合的CAR-T细胞CAR表达对比。

图8改造的铰链区组合的CAR表达丰度检测。

图9为改造的铰链区组合的CAR-T细胞CAR表达稳定性检测。

图10为改造的铰链区组合的CAR-T细胞长期增殖对比。

图11为改造的铰链区组合的CAR-T细胞体内杀伤效果对比。

图12为不同铰链区组合的CAR-T细胞体内存续及肿瘤浸润能力的研究。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1铰链区改造

以IgG4FC、人CD8α序列来源的G4HH2H3和8H铰链区为模板，以随机突变的方式进行铰链区改造。改造的结果如图1A图所示：G4HH2H3mt为G4HH2H3在第15-17位和第79位进行突变，第18位缺失获得的改造序列；G4HH3为删除H2段序列；G4Hinge为删除H2H3段序列获得的改造。如图1B图所示：8H(dc)为常用铰链区8H序列删除第29位和第46位半胱氨酸获得的改造序列。G4Hinge、G4HH3和G4HH2H3mt核苷酸序列分别如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和SEQID NO.19所示。

实施例2含有不同铰链区的嵌合抗原受体病毒的构建

为了验证不同结构的铰链区对CAR-T体内延续性以及肿瘤浸润的影响，以靶向PSCA的CAR-T为例进行实验。设计如图1所示6种不同铰链结构的CAR。

1合成铰链序列的靶向PSCA的嵌合抗原受体的基因序列

合成含前导肽(又称信号肽)(简称LP)、抗人PSCA抗原的单链抗体，6组不同铰链区、CD28跨膜区(简称为TM)，以及CD28、CD137和CD3胞内信号域的CAR结构。

2构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体

设计如下引物，并将其由南京金斯瑞生物科技公司合成，具体引物如下：

引物1：5’-atcgctagcatggccctgccagtgaccgcc-3’，下划线为NheI限制性内切酶位点；

引物2：5’-ccaggtcgacttagcgagggggcagggcctg-3’，下划线为SalI限制性内切酶位点。

然后以上述所示序列为引物，上述合成的各嵌合抗原受体序列为模板进行PCR扩增，反应体系按KOD FX NEO DNA聚合酶(购自TOYOBO公司)说明书加样，将扩增产物鉴定后用回收试剂盒(Promega公司)进行DNA片段回收，具体方法见说明书，回收获得嵌合抗原受体，将DNA回收片段送南京金斯瑞生物科技公司测序。

将克隆获得的编码嵌合抗原受体的基因序列用限制性内切酶NheI和SalI(购自Thermo公司)双酶切，同时用限制性内切酶NheI和SalI酶切慢病毒表达载体pCDH-CAG(购至addgene Plasmid)，酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒进行DNA片段回收，然后将目的片段和载体片段通过T4连接酶(购自Promega公司)进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体，命名为Lv-hinge。将慢病毒载体转化大肠杆菌TOP10，挑取单克隆培养12h后用质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司)抽提质粒，具体方法见说明书。

按照如上方法分别构建6个慢病毒载体(下划线指代单链抗体)：

“scFv-8H(dc)hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”；

“scFv-8H hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”；

“scFv-G4HH2H3hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”；

“scFv-G4HH2H3mt hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”；

“scFv-G4HH3hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”；

“scFv-G4Hinge-CD28TM-CD28-CD137-CD3Z”。

3慢病毒的包装

本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤见分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)。

4慢病毒的纯化

将病毒上清收集在50ml离心管中，离心过滤，滤液在3000r/min离心10min至新的50ml离心管；根据病毒上清量，分别加入质量分数为50％的PEG6000和4M NaCl，再用医用盐水定容使PEG6000终浓度为8.5％，NaCl终浓度为0.3M，定溶后于4℃冰箱静置后于4℃、条件下离心并弃尽上清，用200μl DMEM培养基重悬病毒，1.5mlEP管分装，每管40μl，-80℃保存备用。

5慢病毒滴度测定

步骤1:病毒感染293T细胞

感染前铺板293T细胞，取已纯化的病毒1μl，用医用生理盐水稀释10倍，再向每孔细胞中加入1μl聚凝胺(Polybrene)溶液，然后分别加到293T细胞中，24h后用含10％FBS(wt)的DMEM培养基换液，感染72h后于1000r/min条件下离心5min以收集细胞，抽提基因组。

步骤2:抽提基因组

基因组抽提试剂盒为QIAamp DNA Blood Mini Kit购于Qiagen公司(货号511004)，按试剂盒说明书操作。

步骤3:qRT-PCR测定病毒滴度

反应体系如下：Premix Ex TaqTM II(2×)10μl，上游引物(GAG up)1μl，下游引物(GAGdn)1μl，抽提的基因组1μl，RNase-Free dH2O 7μl，每个样品、标准品至少3个重复孔。然后按如下程序进行扩增：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，反应结束后，用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度。计算结果显示，病毒滴度为1×10⁸TU/ml。

实施例3 CAR转染T淋巴细胞能力检测

1人外周血单核细胞的分离

用采血管采集外周血约60ml，分装于50ml离心管，加入7.5ml羟乙基淀粉稀释；室温(18～25℃)自然沉降约30min，收集上层血浆，将收集的上层血浆离心后用生理盐水重悬沉淀，按体积比为1:1加到淋巴细胞分离液上，梯度离心；离心后，离心管由上至下分为：第一层：血浆层；第二层：环状乳白色淋巴细胞层；第三层：透明分离液层；第四层：红细胞层；取第二层白色淋巴细胞层，并用生理盐水洗涤2次，离心5min，生理盐水重悬细胞，加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养，得人外周血单核细胞。

2慢病毒载体感染T淋巴细胞

用含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基培养新制备的单个核细胞PBMC，第1天进行PBMC活化；第3天进行慢病毒感染；加入5MOI对应的慢病毒载体，未感染的T淋巴细胞作为空白对照；24h后将培养基更换为含有500IU/ml重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基，继续培养10-20天。获得表达包含抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号域的嵌合抗原受体的CAR-T细胞，以改造的铰链区命名，命名为：PSCA-CAR-G4HH2H3、PSCA-CAR-G4HH2H3mt、PSCA-CAR-G4HH3、PSCA-CAR-G4Hing、PSCA-CAR-8H以及PSCA-CAR-8H(dc)；为了作图时便于标记，以上CAR-T细胞在后续实施例及说明书附图中以G4HH2H3、G4HH2H3mt、G4HH3、G4Hing、8H以及8H(dc)简写。

1)在培养过程中对培养至10天的已感染病毒的T细胞，离心弃尽上清以收集细胞；用含有体积分数1％胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为1×10⁶个/ml；将收集的细胞分别分装利用流式细胞术检测Protein-L阳性率，为了方便随时监控CAR在T细胞表面表达的阳性率，CAR基因设计有Protein-L共表达，检测结果即表示培养第10天不同CAR组合在T淋巴细胞表达阳性率，同时分析流式检测MFI(平均荧光强度)可以获得CAR表达丰度的结果。

结果如图2，3，7，8所示。如图7结果可见8H(dc)组合的CAR-T有更高的CAR表达；如图2,3,7结果：改造的铰链结构G4HH2H3mt、G4HH3、G4Hing、8H(dc)组合的CAR在T细胞表面表达阳性率均较为稳定与没改造前差异不大。如图8表示不同铰链结构的CAR-T细胞表面CAR表达丰度，其中G4HH2H3、G4HH2H3mt和8H(dc)结构的CAR能够更高的表达于T细胞表面。

2)分别感染获得CAR-T细胞后第5天、第10天以及第14天利用1)的检测方法检测不同铰链结构组合的CAR表达，检测在长时间培养后CAR-T细胞CAR表达的稳定性。

结果如图9所示：检测CAR的长期表达发现改造的结构与未改造结构G4HH2H3和8H对比CAR表达稳定性差异不大，其中8H(dc)有较高的CAR表达，长期表达也较稳定。

实施例4 CAR-T细胞长期增殖能力检测

检测感染PSCA-CAR-T细胞在正常培养条件下的增殖；实施例3获得的CAR-T细胞，采用实施例3步骤2中的培养方法培养CAR-T细胞10天。PSCA抗原包被24孔板四度过夜，CAR-T细胞1*10^6/孔铺板细胞在PSCA抗原包被的24孔板，观察CAR-T细胞在抗原刺激后的存续时间。如图4和图10所示分别在刺激后第3天，第6天，第9天、第12天以及第15天利用细胞计数仪统计CAR-T细胞数目并计算CAR-T细胞增殖倍数。细胞增殖以增殖倍数的方式表示，增殖倍数越高证明CAR-T细胞体外存续能力较强。

实验如图4和图10所示，G4HH2H3mt和8H(dc)铰链组合的CAR-T细胞增殖相对较快，CAR-T细胞体外存续能力更强。

实施例5 CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤能力的影响

不同铰链结构的CAR-T对靶细胞的杀伤能力通过ACEA xCELLigence RTCA MP仪器完成，实验步骤依据仪器说明书进行；第一天将靶细胞(表达PSCA的肿瘤细胞)以2-5*10^4每孔铺板于仪器配备的96孔板中，附着于孔底的肿瘤细胞以电阻指数为数据每15分钟记录一次，24小时后依据预先设计的效靶比每孔铺入相应的CAR-T细胞，CAR-T细胞铺入后每隔15分钟记录一次电阻指数，通过电阻指数判断贴壁的靶细胞的增殖或者死亡情况。利用电阻指数分析结果公式为：CAR-T细胞杀伤率＝基线电阻指数-实时电阻指数。

Hela和RT4为PSCA高表达的肿瘤细胞系，T24为不表达PSCA的阴性对照细胞。

实验结果如图5、图6所示：G4HH2H3、G4HH2H3mt、8H和8H(dc)具有更好的杀伤能力，并且对阴性细胞不杀伤，特异性强。后续以包含G4HH2H3、G4HH2H3mt、8H和8H(dc)铰链结构的CAR-T细胞进行体内实验验证。

实施例6 CAR-T细胞在动物模型中的抗肿瘤效果验证

建立人PSCA阳性肿瘤细胞系的小鼠移植瘤模型用于验证表达靶向PSCA的嵌合抗原受体的T淋巴细胞在动物模型中的抗肿瘤效果。

体内验证使用小鼠为NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicCrl，简称NOG小鼠，由日本实验动物研究所(CIEA)的Mamoru Ito培育而成，为国际上CAR-T体内相关成瘤实验的最常见品系。体内验证使用的成瘤靶向细胞为前期体外验证使用的稳定表达萤火虫荧光素酶的PSCA阳性细胞系Hela(简称Hela-luc)。

通过前期体外实验发现改造的铰链G4HH2H3mt和8H(dc)结构具有更好的杀伤和体外存续能力，因此在动物实验中以这2种CAR-T细胞对比常用的G4HH2H3和8H为铰链的CAR-T细胞在小鼠体内杀伤肿瘤的能力。治疗注射的效应细胞为含有G4HH2H3mt、8H(dc)、G4HH2H3和8H铰链结构的CAR-T细胞，对照为生理盐水组、未感染病毒的PBMC细胞。

成瘤后尾静脉注射效应CAR-T细胞5*10^5细胞/只鼠。注射CAR T细胞后每隔7天通过PerkinElmer公司的IVS活体成像系统拍照成像，显示肿瘤生长情况。期间每天观察小鼠存活情况并记录，结果见图11A图所示：包含G4HH2H3mt、8H(dc)及8H铰链的CAR-T细胞在体内对肿瘤细胞均有较好的杀伤效果。进一步在实验终点处死小鼠后取出肿瘤组织进行称重并统计结果，结果如图11B图所示：包含G4HH2H3mt、8H(dc)及8H铰链的CAR-T细胞治疗的小鼠肿瘤重量更轻，尤其是8H(dc)铰链组合的CAR-T细胞治疗的小鼠肿瘤基本得到清除。

实施例7 CAR-T细胞在体内存续和肿瘤浸润能力研究

CAR-T细胞体内延续和CAR-T细胞浸润肿瘤的能力，利用RT-PCR检测肿瘤组织的CAR基因拷贝数进行检测。

1.引物设计：

BBZ-HF：CAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTG；

BBZ-HR:TACTCCTCTCTTCGTCCTAGATTG。

2.肿瘤组织RNA提取

先在研钵中加入液氮，再将肿瘤组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取适量组织粉末加入已盛有Trizol液的EP管中，充分混合均匀。室温放置5min，然后加入200ml的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。离心取上层水相于一新的EP管中，加入500ml异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min离心。小心弃去上清液，加入1ml的75％乙醇，涡旋混匀，离心重复操作一次。弃去上清液，室温或真空干燥5～10min。用30ml DEPC处理过的水将RNA溶解，贮存于70％乙醇并保存于-70℃。

3.RT-PCR

进行RT-PCR，反应体系如下：

反应体系如下：Forward primer(10μM)0.5μl，Reverse primer(10μM)0.5μl，2×SYBR Premix Ex Taq II 10μl，Template 1ul，抽提的基因组1μl，RNase-Free dH2O 7μl，每个样品、标准品至少3个重复孔。然后按如下程序进行扩增：95℃2min，95℃15s，60℃1min，40个循环，反应结束后，用分析软件分析数据，分析结果如表3和图12所示。

表3为检测到的不同结构的CAR-T细胞治疗的肿瘤组织中的CAR拷贝数，图12为依据表3的结果绘制的图表。结果可见8H(dc)作为铰链区可以显著增强CAR-T浸润肿瘤的能力。虽然G4HH2H3mt促进CAR-T肿瘤浸润的能力弱于8H(dc)，但是较没改造前的铰链结构有更好的促进CAR-T细胞肿瘤浸润的能力。

表3:回输CAR-T细胞45天后，不同铰链结果的CAR-T体内存续时间

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110> 重庆精准生物技术有限公司

<120>一种改良的铰链区及其在构建CAR骨架中的应用

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 45

<212> PRT

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<213> Artificial

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Cys Asp

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<213> Artificial

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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro

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Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

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<213> Artificial

<220>

<223>scFV-1

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Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly

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<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

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gaaagcaaat atggcccgcc gtgcccgccg tgcccg 36

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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gaaagcaaat atggcccgcc gtgcccgccg tgcccgggcc agccgcgcga accgcaggtg 60

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gtgaaaggct tttatccgag cgatattgcg gtggaatggg aaagcaacgg ccagccggaa 180

aacaactata aaaccacccc gccggtgctg gatagcgatg gcagcttttt tctgtatagc 240

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catgaagcgc tgcataacca ttatacccag aaaagcctga gcctgagcct gggcaaa 357

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> G4HH2H3mt

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gaaagcaaat atggcccgcc gtgcccgccg tgcccggcgc cgccggtggc gggcccgagc 60

gtgtttctgt ttccgccgaa accgaaagat accctgatga ttagccgcac cccggaagtg 120

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tatcgcgtgg tgagcgtgct gaccgtgctg catcaggatt ggctgaacgg caaagaatat 300

aaatgcaaag tgagcaacaa aggcctgccg agcagcattg aaaaaaccat tagcaaagcg 360

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<212> DNA

<213> Artificial

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gatattcagc tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgca gcgcgagcag cagcgtgcgc tttattcatt ggtatcagca gaaaccgggc 120

aaagcgccga aacgcctgat ttatgatacc agcaaactgg cgagcggcgt gccgagccgc 180

tttagcggca gcggcagcgg caccgatttt accctgacca ttagcagcct gcagccggaa 240

gattttgcga cctattattg ccagcagtgg agcagcagcc cgtttacctt tggccagggc 300

accaaagtgg aaattaaagg cagcaccagc ggcagcggca aaccgggcag cggcgaaggc 360

agcaccaaag gcagcgaagt gcagctggtg gaaagcggcg gcggcctggt gcagccgggc 420

ggcagcctgc gcctgagctg cgcggcgagc ggctttaaca ttaaagatta ttatattcat 480

tgggtgcgcc aggcgccggg caaaggcctg gaatgggtgg cgtggattga tccggaaaac 540

ggcgataccg aatttgtgcc gaaatttcag ggccgcgcga ccattagcgc ggataccagc 600

aaaaacaccg cgtatctgca gatgaacagc ctgcgcgcgg aagataccgc ggtgtattat 660

tgcaaaaccg gcggcttttg gggccagggc accctggtga ccgtgagcag c 711

<210> 21

<211> 1515

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PSCA-CAR -8H(dc)

<400> 21

gatattcagc tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

attacctgca gcgcgagcag cagcgtgcgc tttattcatt ggtatcagca gaaaccgggc 120

aaagcgccga aacgcctgat ttatgatacc agcaaactgg cgagcggcgt gccgagccgc 180

tttagcggca gcggcagcgg caccgatttt accctgacca ttagcagcct gcagccggaa 240

gattttgcga cctattattg ccagcagtgg agcagcagcc cgtttacctt tggccagggc 300

accaaagtgg aaattaaagg cagcaccagc ggcagcggca aaccgggcag cggcgaaggc 360

agcaccaaag gcagcgaagt gcagctggtg gaaagcggcg gcggcctggt gcagccgggc 420

ggcagcctgc gcctgagctg cgcggcgagc ggctttaaca ttaaagatta ttatattcat 480

tgggtgcgcc aggcgccggg caaaggcctg gaatgggtgg cgtggattga tccggaaaac 540

ggcgataccg aatttgtgcc gaaatttcag ggccgcgcga ccattagcgc ggataccagc 600

aaaaacaccg cgtatctgca gatgaacagc ctgcgcgcgg aagataccgc ggtgtattat 660

tgcaaaaccg gcggcttttg gggccagggc accctggtga ccgtgagcag caaaccgacc 720

accaccccgg cgccgcgccc gccgaccccg gcgccgacca ttgcgagcca gccgctgagc 780

ctgcgcccgg aagcgcgccc ggcggcgggc ggcgcggtgc atacccgcgg cctggatttt 840

gcggattttt gggtgctggt ggtggtgggc ggcgtgctgg cgtgctatag cctgctggtg 900

accgtggcgt ttattatttt ttgggtgcgc agcaaacgca gccgcctgct gcatagcgat 960

tatatgaaca tgaccccgcg ccgcccgggc ccgacccgca aacattatca gccgtatgcg 1020

ccgccgcgcg attttgcggc gtatcgcagc gtgaaacgcg gccgcaaaaa actgctgtat 1080

atttttaaac agccgtttat gcgcccggtg cagaccaccc aggaagaaga tggctgcagc 1140

tgccgctttc cggaagaaga agaaggcggc tgcgaactgc gcgtgaaatt tagccgcagc 1200

gcggatgcgc cggcgtatca gcagggccag aaccagctgt ataacgaact gaacctgggc 1260

cgccgcgaag aatatgatgt gctggataaa cgccgcggcc gcgatccgga aatgggcggc 1320

aaaccgcgcc gcaaaaaccc gcaggaaggc ctgtataacg aactgcagaa agataaaatg 1380

gcggaagcgt atagcgaaat tggcatgaaa ggcgaacgcc gccgcggcaa aggccatgat 1440

ggcctgtatc agggcctgag caccgcgacc aaagatacct atgatgcgct gcatatgcag 1500

gcgctgccgc cgcgc 1515

<210> 22

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 前导肽

<400>22

atggcactgc cagtgaccgc cctgctgctg cccctggcac tgctgctgca cgcagctcgg 60

cct 63

<210> 23

<211> 30

<212>DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向引物

<400>23

atcgctagca tggccctgcc agtgaccgcc 30

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向引物

<400> 24

ccaggtcgac ttagcgaggg ggcagggcct g 31

Claims

1.能够延长CAR-T细胞体内存续和/或提高CAR-T细胞浸润肿瘤能力的铰链区，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。

2.铰链区的改造方法，其特征在于，人CD8α氨基酸序列来源的铰链序列在第29位半胱氨酸和第46位半胱氨酸进行改造，改造的方式包括随机突变和缺失；人CD8α氨基酸序列来源的铰链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的改造方法，其特征在于，所述铰链区的序列为人CD8α氨基酸序列来源的铰链序列删除第29位半胱氨酸和第46位半胱氨酸。

4.权利要求2所述的改造方法所得的铰链区序列。

5.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包含权利要求1所述的铰链结构。

6.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包含抗原识别区、跨膜区和胞内信号域。

7.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原识别区可以识别肿瘤细胞表达抗原，包括PSCA、PSMA、CD19、BCMA、CD123、CD20、CD22、CEA、EGFR、EGFRVIII、GPC3、mesothelin抗原分子。

8.靶向PSCA的嵌合抗原受体，其特征在于，包含抗人PSCA抗原的单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号域；所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

9.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗人PSCA抗原的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

10.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为CD28TM或CD8TM，所述CD28TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:3，所述CD8TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:11；所述胞内信号域为CD28和/或CD137和/或CD3，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:12，所述CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO:13，所述CD3的氨基酸序列如SEQ ID NO:14。

11.根据权利要求7-9任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。

12.权利要求7-9任一项所述的嵌合抗原受体的病毒载体的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)合成靶向PSCA的嵌合抗原受体的基因序列：合成包含前导肽、抗人PSCA抗原的单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号域的嵌合抗原受体的核酸序列；所述前导肽核酸序列如SEQ ID NO.22所示；

2)构建表达嵌合抗原受体的病毒载体：设计引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:23所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示，以所述嵌合抗原受体的基因序列为模板进行PCR扩增，得DNA片段；

将所述DNA片段的基因序列用限制性内切酶双酶切，同时用限制性内切酶酶切病毒表达载体pCDH-CAG，然后将酶切后的目的片段和病毒表达载体片段通过T4连接酶进行连接，获得表达嵌合抗原受体的病毒载体，所述病毒载体包含但不限于腺病毒、逆转录病毒和慢病毒载体。

13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)之后，包装并纯化所述病毒载体，所述病毒载体为慢病毒载体。

15.权利要求13所述的慢病毒载体感染的细胞，其特征在于，所述细胞包括T细胞、DC细胞和NK细胞。

16.根据权利要求14所述的细胞，其特征在于，所述细胞为T细胞。

17.权利要求14-15任一项所述的细胞在用于制备治疗肿瘤的药物中的应用。

18.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述肿瘤的细胞或组织能够表达PSCA。

19.SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列作为铰链区在构建CAR骨架的应用。