PL222512B1 - Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA - Google Patents

Description

(21) Numer zgłoszenia: 395179 (51) Int.Cl.

C12N 9/22 (2006.01)

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 08.06.2011 (54) Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA (73) Uprawniony z patentu:

MIĘDZYNARODOWY INSTYTUT BIOLOGII MOLEKULARNEJ I KOMÓRKOWEJ W WARSZAWIE, Warszawa, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:

17.12.2012 BUP 26/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

31.08.2016 WUP 08/16 (72) Twórca(y) wynalazku:

JANUSZ MAREK BUJNICKI, Warszawa, PL AGATA KAMASZEWSKA, Warszawa, PL MARCIN NOWOTNY, Warszawa, PL KRZYSZTOF JERZY SKOWRONEK, Hornówek, PL (74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Anna Grzelak

PL 222 512 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA, będąca fuzją rybonukleazy HI z palcem cynkowym. Prezentowany wynalazek ma zastosowanie w genetyce.

Specyficzna sekwencyjnie endorybonukleaza przecinająca hybrydy DNA-RNA jest przydatna do jakiegokolwiek przeznaczenia, wtedy gdy reakcja przecinania nici RNA w hybrydzie DNA-RNA może być przeprowadzona, na przykład metodą in vitro manipulacji kwasami nukleinowymi, w szczególności hybrydami DNA-RNA o określonej sekwencji. Oprócz zastosowań in vitro, enzymy przecinające hybrydy DNA-RNA w sekwencyjnie specyficzny sposób mogą również znaleźć zastosowanie w terapii niektórych wirusów RNA (np. wirusy onkogenne, retrowirusy, zapalenia wątroby typu B, gr ypy), które replikują się przez przejściowe utworzenie nici DNA na matrycy RNA. Istotnymi elementami tworzenia takich leków, skierowanych przeciwko konkretnym wirusom, byłoby optymalizowanie sekwencji rozpoznawanej przez enzym.

Znane są z opisów patentowych WO2007014181A2 oraz WO2007014182A2 fuzje wielu domen palców cynkowych oraz nukleazy FokI służące do ukierunkowanej edycji genomu. Sama fuzja niezmienionych białek nie pozwala na uzyskanie specyficznego enzymu. Selektywność sekwencyjna uzyskanego prototypu nie jest wystarczająca, aby miał on zastosowanie w manipulacji RNA. Enzym wymaga wielostopniowej optymalizacji obu domen mającej na celu zwiększenie polaryzacji funkcji w poszczególnych elementach. Istnieje również potrzeba sposobu badania białek oddziałujących z hybrydami DNA-RNA w celu ustalenia pełnego zakresu sekwencji rozpoznawanych przez białko wiążące specyficzną sekwencję w hybrydzie DNA-RNA.

Wynalazek dotyczy endorybonukleazy przecinającej nić RNA w hybrydach DNA-RNA, która to endorybonukleaza jest białkiem fuzyjnym obejmującym:

- pochodną domeny katalitycznej rybonukleazy HI (RNazy HI), z Bacillus halodurans, obejmującą polipeptyd kodowany przez nukleotydy 175 do 588 z genu rnhA przedstawionego WSE ID nr: 1,

- przy czym pochodna domeny katalitycznej RNazy HI obejmuje przynajmniej jedną substytucję reszty aminokwasowej w rejonie wiązania substratu wybraną spośród: K81A, K89E i K123A w odniesieniu do sekwencji polipeptydu kodowanego przez SEQ ID nr: 1, która to zmiana(y) zapewnia destabilizację wiązania substratu przez domenę katalityczną RNazy HI lub jej pochodną; oraz

- domenę palca cynkowego wiążącą hybrydę DNA-RNA, przy czym domena palca cynkowego ma zdolność do wiązania się ze specyficzną sekwencją w hybrydzie DNA-RNA.

W korzystnej endorybonukleazie pochodna domeny katalitycznej RNazy HI obejmuje w rejonie wiązania substratu substytucje reszt aminokwasowych K81A i K89E i K123A w odniesieniu do sekwencji polipeptydu kodowanego przez SEQ ID nr: 1.

W korzystnej endorybonukleazie domeną palca cynkowego jest pochodna palca cynkowego Zf-QQR, korzystnie polipeptyd kodowany przez nukleotydy od 19 do 303 z sekwencji Zf-QQR przedstawionej w SEQ ID Nr: 2.

Przedstawiona jest endorybonukleza przecinająca hybrydy DNA-RNA, charakteryzująca się tym, że zawiera fuzję rybonukleazy HI lub jej pochodnej i palca cynkowego wiążącego hybrydę DNA-RNA, przy czym rybonukleza HI pochodzi z Bacillus halodurans a palec cynkowy posiada zdolność do wiązania specyficznej sekwencji w hybrydzie DNA-RNA. Korzystnie endorybonukleza charakteryzuje się tym, że pochodna rybonukleazy HI pochodzącej z Bacillus halodurans zawiera polipeptyd stanowiący domenę katalityczną, korzystniej obejmujący polipeptyd kodowany przez nukleotydy od 175 do 488 genu rnhA przedstawionego na SEQ ID Nr 1 (Figura 1). Równie korzystnie endoryb onukleaza charakteryzuje się tym, że natywna pochodna rybonukleazy HI zawiera delecję domeny wiążącej hybrydy. Korzystniej endorybonukleza charakteryzuje się tym, że domena katalityczna pochodnej rybonuklezy HI zawiera substytucję, co najmniej jednego aminokwasu w rejonie wiązania substratu wybraną spośród: K81A, K89E i K123A. Najkorzystniej endorybonukleza charakteryzuje się tym, że domeną palca cynkowego jest pochodna palca cynkowego Zf-QQR, korzystnie polipeptyd kodowany przez nukleotydy od 19 do 303 palca cynkowego Zf-QQR przedstawionego na SEQ ID nr 2 (Figura 2).

Przecinanie łańcuchów kwasów nukleinowych w określonym miejscu jest stosowane w wielu technikach inżynierii genetycznej. Znanych jest wiele metod umożliwiających obróbkę cząsteczek

PL 222 512 B1

DNA, w tym powszechnie stosowane dostępne komercyjnie enzymy restrykcyjne. Znacznie mniej jest enzymów umożliwiających obróbkę cząsteczek RNA i większość ze znanych rybonukleaz charakteryzuje się niską specyficznością sekwencyjną lub jej zupełnym brakiem. Specyficzna s ekwencyjnie rybonukleaza H może znaleźć zastosowanie w określonej i zlokalizowanej fragm entacji kwasów nukleinowych do spektrometrii mas RNA, w tym badania modyfikacji RNA.

Przedmiot wynalazku może znaleźć zastosowanie do generowania fragmentów RNA do sekwencjonowania trzeciej generacji. Specyficzna sekwencyjnie rybonukleaza H może znaleźć zastosowanie do detekcji lub mapowania RNA np. wirusowego o konkretnej sekwencji, gdzie do jednoniciowego RNA dohybrydyzowane zostaje DNA, a powstająca hybryda jest przecinana. Do inżynierii białek przez przetasowanie fragmentów i ligację mRNA, gdzie fragmenty są uzyskiwane przez trawienie specyficzną rybonukleazą H.

Enzymy o nowych cechach można uzyskać przez konstruowanie zrekombinowanych białek składających się z kilku domen o różnej funkcjonalności. Inżynieria endorybonukleazy przecinającej hybrydy DNA-RNA w sposób zależny od sekwencji oparta jest na fuzji dwóch białek: rybonukleazy H i palca cynkowego wiążącego hybrydę DNA-RNA. Rybonukleaza HI z Bacillus halodurans jest enzymem, który hydrolizuje nić RNA w hybrydzie DNA-RNA w sposób niezależny od sekwencji, natomiast palec cynkowy Zf-QQR posiada zdolność do wiązania ściśle określonej sekwencji w hybrydzie DNA-RNA. W enzymie do pełnienia funkcji domeny wykazującej aktywność endonukleazową wobec nici RNA w hybrydzie DNA-RNA wybrano fragment genu rnhA z B. halodurans kodujący domenę katalityczną. Jest to fragment od 175 do 488 nukleotydu genu rnhA, co odpowiada rejonowi od 59 do 196 reszty aminokwasowej natywnego białka rybonukleazy HI z B. halodurans. Z natywnego genu usunięto domenę wiążącej hybrydy (dsRHbd, ang. double-stranded RNA/hybrid binding domain), ze względu na jej zdolność do niezależnego od sekwencji wiązana hybryd DNA-RNA. W domenie katalitycznej wprowadzono dodatkowo substytucje trzech aminokwasów w rejonie wiązania substratu: K81A, K89E i K123A. Reszty dodatnio naładowane znajdują się w pobliżu znanego miejsca wiązania substratu. Substytucje w założeniu nie inaktywują enzymu, ale powodują, że do wiązania substratu potrzebna jest dodatkowa domena wiążąca hybrydy DNA-RNA. Domeną, której zadaniem jest nadawanie specyficzności sekwencyjnej nowemu enzymowi jest palec cynkowy Zf-QQR W fuzji wykorzystano fragment genu kodującego palec cynkowy Zf-QQR od 19 do 303 nukleotydu, co odpowiada rejonowi od 7 do 101 reszty aminokwasowej powstającego białka.

Przykładowe realizacje wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym:

Figura 1 przedstawia sekwencję DNA genu rnhA rybonukleazy HI (Gene ID 893801, BH 0863) z Bacillus halodurans;

Figura 2 sekwencję DNA genu palca cynkowego Zf-QQR. Gen syntetyzowano w firmie Epoch Life Science;

Figura 3 sekwencję starterów wykorzystywanych do przygotowania finalnego konstruktu DNA fuzji genu rnhA rybonukleazy HI z B. halodurans z genem palca cynkowego Zf-QQR oraz wprowadzenia substytucji w sekwencji genu;

Figura 4 sekwencję DNA genu kodującego enzym fuzyjny zawierającego fragment rybonukleazy HI z B. halodurans z substytucjami wprowadzającymi zmiany w sekwencji aminokwasowej powstającego białka w pozycjach K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR;

Figura 5 sekwencję aminokwasową enzymu fuzyjnego zawierającego domenę katalityczną rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającą substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR;

Figura 6 sekwencję hybrydy DNA-RNA zawierającego miejsce wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR;

Figura 7 sekwencję hybrydy DNA-RNA niezawierającego miejsce wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR dodawanego do reakcji trawienia, jako niespecyficzny kompetytor;

Figura 8 produkty trawienia powstające w wyniku cięcia substratu hybrydy DNA-RNA zawierającego miejsce wiązania dla palca cynkowego w zależności od obecności jonów magnezu i cynku przez enzym domenę katalityczną rybonukleazy HI z B. halodurans, domenę katalityczną rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A oraz fuzję domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR.

Rozdział produktów trawienia przeprowadzono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik. Koniec 5' nici RNA w substracie hybrydzie DNA-RNA wyznakowano

PL 222 512 B1 radioaktywnie izotopem fosforu 33, gdzie opis poszczególnych torów w żelu: Tor 1: 0,1 μΜ domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans, 0,5 μΜ substratu, 5 μΜ niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 2mM DTT, 30 min w 37°C, Tor 2: 0,1 μM domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 2mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 3: 0,1 μM domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCfe, 20 μM ZnSO4, 2mM DTT, 30 min. w 37°C, Tor 4: 0,1 μM domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 20 μM ZnSO₄, 2 mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 5: 0,1 μM domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO₄, 2 mM DTT, 30 min. w 37°C, Tor 6: 0,1 μM domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO₄, 2 mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 7: Marker wielkości 10-100 zasad jednoniciowego RNA znakowane radioaktywnie izotopem fosforu 33 (USB), Tor 8: 0,1 μmola substratu, Tor 9: 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 10: 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 30 min w 37°C, Tor 11: 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 2mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 12: 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂ i 20 μM ZnSO₄, 2mM DTT, 30 min. w 37°C, Tor 13: 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 20 μM ZnSO₄, 2 mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 14: 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO₄, 2 mM DTT, 30 min. w 37°C, Tor 15: 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,5 μM substratu, 5 μM niespecyficznego kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO₄, 2 mM DTT, 1 godz. w 37°C, gdzie gwiazdką (*) oznaczono unikalne miejsce cięcia,

Figura 9 mapowanie miejsca trawienia nici RNA w substracie hybrydzie DNA-RNA zawierającej miejsce wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR przez fuzję domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającą substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR. Rozdział produktów trawienia przeprowadzono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik. Koniec 5' nici RNA w substracie hybrydzie DNA-RNA wyznakowano radioaktywnie izotopem fosforu 33, opis poszczególnych torów w żelu: Tor 1: 0,1 μM substratu, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO₄, 2 mM DTT, 2 godz. w 37°C, Tor 2: Marker wielkości 10-100 zasad jednoniciowego RNA znakowane radioaktywnie izotopem fosforu 33 (USB), Tor 3: 0,1 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,1 μM substratu, 25 μM kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO₄, 2 mM DTT, 30 min w 37°C, Tor 4: 0,1 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,1 μM substratu, 25 μM kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO₄, 2 mM DTT, 1 godz. w 37°C, Tor 5: 0,1 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, 0,1 μM substratu, 25 μM kompetytora, 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO₄, 2 mM DTT, 2 godz. w 37°C, Tor 6: Hydroliza alkaliczna jednoniciowego RNA substratu zawierającego miejsce wiązania dla Zf-QQR,

Figura 10 pozycje cięcia substratu hybrydy DNA-RNA zawierającego miejsce wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR przez fuzję domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającą substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, oznaczono strzałkami nad sekwencją, czarna strzałka oznacza główne miejsce cięcia, szare oznaczają dodatkowe (górna nić RNA, dolna nić DNA, miejsce wiązania dla Zf-QQR oznaczono szarym tłem).

PL 222 512 B1

Przykład 1

Klonowanie fragmentu genu rnhA z Bacillus halodurans do wektora ekspresyjnego pET30b

Uzyskano wektor pET15a z genem rnhA (sekwencja genu Figura 1, Gene ID 893801, BH 0863) z B. halodurans ze źródeł prywatnych. Fragment genu kodujący domenę katalityczną był amplifikowany na matrycy uzyskanego konstruktu przy użyciu techniki PCR. Reakcję prowadzono w 50 gl, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 200 gM dNTP mix, po 50 gmoli każdego startera Bhcatf i Bhcatr (Figura 3), ok. 0,1 gg matrycy i 1 jednostką Phusion polimerazy (New England Biolabs). W arunki reakcji: wstępna denaturacja 98°C 1 min, następnie 25 cykli po 15 s denaturacji w 98°C, 15 s renaturacji w temp. 70°C i 30 s wydłużania w 72°C. DNA kodujące fragment genu rnhA oraz DNA wektora pET30b (firma Novagen) zostało strawione enzymami restrykcyjnymi Ndel i KpnI (enzymy pochodziły z firmy Fermentas, reakcje prowadzono w buforze zgodnie z zaleceniami producenta, 1 jednostkę enzymu na 1 gg DNA przez 1 godz. w 37°C). Mieszaninę reakcyjną zawierającą DNA rozdzielano w 0,7% żelu agarozowym w buforze TAE (40 mM Tris-base, 18,8 mM kwas octowy, 1 mM EDTA) i fragmenty odpowiadające oczekiwanym wielkościom reizolowano z żelu przy użyciu zestawu do reizolacji z żelu agarozowego (Gel out, A&A Biotechnology). Następnie 50 gg reizolowanego fragmentu genu rnhA oraz 25 gg przeciętego wektora pET30b poddano działaniu ligazy DNA bakteriofaga T4 (Fermentas, reakcja prowadzona zgodnie z zaleceniami producenta w dostarczonym buforze) w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Ligazę dezaktywowano termicznie przez inkubację w 75°C przez 10 min. Następnie używano mieszaniny ligacyjnej do transformacji. 100 gl wcześniej przygotowanych bakterii kompetentnych (szczep Escherichia coli Top 10: F^- mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ801acZ AM15 A1acX74 deoR recA1 araD139 A(araA-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG [Invitrogen]), metody przygotowania komórek kompetentnych za „Sambrook J., Firtsh E. F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory mannual, 2^nd edition. 1989. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor laboratory Press” rozmrażano w lodzie, dodawano do nich DNA plazmidowy (10-50 ng na 50 gl komórek bakteryjnych) i pozostawiono w lodzie na 30 min. Po tym czasie, bakterie poddano szokowi termicznemu inkubując w temp. 42°C przez 1 min, a następnie schładzano w lodzie przez 2 min. Komórki inkubowano w temp. 37°C po dodaniu 800 pl płynnego LB (bakto-trypton 1%, ekstrakt drożdżowy 0,5%, NaCl 1%) przez 1 godz. i wysiewano na płytki ze stałym LB (skład jak wyżej, dodatkowo 1,5% (w/v) agar-agar) uzupełnionym końcowym stężeniem 30 gg/ml kanamycyny, inkubowano przez noc w 37°C. Selekcja odpowiednich transformantów zawierających pożądane rekombinanty bazowała na analizie mapy restrykcyjnej, a następnie sekwencjonowano próbki w celu potwierdzenia poprawności sekwencyjnej konstruktu.

P r z y k ł a d 2

Klonowanie genu kodującego palec cynkowy Zf-QQR do wektora ekspresyjnego pET28b

Zamówiono syntezę genu kodującego palec cynkowy Zf-QQR z firmy Epoch Life Sciences (sekwencja genu Figura 2) na podstawie sekwencji aminokwasowej z artykułu Shi Y., Berg JM. Specific DNA-RNA hybrid binding proteins. Science. 1995. Vol.268, 282-284”. DNA kodujące Zf-QQR oraz DNA wektora pET28b (firma Novagen) zostało strawione enzymami restrykcyjnymi Ncol i XhoI (enzymy pochodziły z firmy Fermentas, reakcje prowadzono w buforze 2X Yellow zgodnie z zaleceniami producenta, 1 jednostkę enzymu na 1 gg DNA przez 1 godz. w 37°C). Mieszaninę reakcyjną rozdzielano w 0,7% żelu agarozowym w buforze TAE i prążki odpowiadające oczekiwanym wielkościom reizolowano z żelu (opis jak wyżej). Następnie 50 ng reizolowanego genu Zf-QQR oraz 25 ng przeciętego wektora pET28b poddano działaniu ligazy DNA faga T4 (Fermentas, reakcja prowadzona zgodnie z zaleceniami producenta w dostarczonym buforze) w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Ligazę dezaktywowano termicznie przez inkubację w 75°C przez 10 min. Następnie używano mieszaniny ligacyjnej do transformacji (opis jak wyżej).

P r z y k ł a d 3

Klonowanie genu kodującego palec cynkowy Zf-QQR do wektora ekspresyjnego pET30b zawierającego fragment genu rnhA z Bacillus halodurans

Amplifikowano fragment wektora pET28b wraz z genem kodującym Zf-QQR. Reakcję prowadzono w 50 gl, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 200 gM dNTP mix, po 50 gmoli każdego startera BhZf i Kmr (Figura 3), ok. 0,1 gg matrycy i 1 jednostką Phusion polimerazy (New England Biolabs). Warunki reakcji: wstępna denaturacja 98°C 1 min, następnie 25 cykli po 15 s denaturacji w 98°C, 15 s renaturacji w temp. 63°C i 1,5 min wydłużania w 72°C. Amplifikowano fragment wektora pET30b wraz z genem kodującym domenę katalityczną rybonukleazy HI. Reakcję prowadzono w 50 gl, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 200 gM dNTP mix, po 50 gmoli każdego

PL 222 512 B1 startera Bhcatr i Kmf (Figura 3), ok. 0,1 pg matrycy i 1 jednostką Phusion polimerazy (New England Biolabs). Warunki reakcji: wstępna denaturacja 98°C 1 min, następnie 25 cykli po 15 s denaturacji w 98°C, 15 s renaturacji w temp. 70°C i 3,5 min wydłużania w 72°C. Mieszaniny PCR oczyszczono przy użyciu zestawu do oczyszczania reakcji enzymatycznych (Clean Up, A&A Biotechnology). Oczyszczony produkt PCR poddano reakcji z kinazą polinukleotydową bakteriofaga T4 (Fermentas). Reakcję prowadzono w buforze do ligacji, z dodatkiem PEG 4000 o końcowym stężeniu 5% i 0,5 mM ATP przez 30 min w temperaturze 37°C. Następnie kinazę dezaktywowano termicznie przez inkubację w 70°C przez 10 min. DNA z obu reakcji (po 20 ng) łączono i poddano działaniu ligazy DNA bakteriofaga T4 (Fermentas, reakcja prowadzona zgodnie z zaleceniami producenta w dostarczonym buforze) w temperaturze pokojowej przez 1 godz. Ligazę dezaktywowano termicznie przez inkubację w 75°C przez 10 min. Następnie używano mieszaniny ligacyjnej do transformacji (opis jak wyżej).

P r z y k ł a d 4

Mutageneza genu kodującego enzym fuzyjny wprowadzająca substytucje aminokwasów w pozycjach K81A, K89E i K123A

W wyniku połączenia powstał konstrukt, w którym otwarta ramka odczytu zawierała na początku fragment genu kodujący domenę katalityczną rybonukleazy HI oraz połączony z nim fragment genu kodującego Zf-QQR. Uzyskane DNA posłużyło do wprowadzenia substytucji nukleotydów kodujących reszty aminokwasowe w pozycjach 81, 89 i 123 powstającego białka przy użyciu techniki PCR. Zmiany wprowadzano etapowo, najpierw substytucje w nukleotydach kodujących reszty 81 (zamiana lizyny na alaninę) i 89 (zamiana lizyny na kwas glutaminowy), dopiero po uzyskaniu takiego konstruktu przeprowadzono PCR w celu zamiany nukleotydów kodujących resztę w pozycji 123 (zamiana lizyny na alaninę). Reakcję prowadzono w 50 pl, w buforze od producenta, z końcowym stężeniem 200 pM dNTP mix, po 50 pmoli każdego startera (pozycje 81 i 89 przy użyciu starterów K81Ar i K89Ef oraz pozycja 123 przy użyciu starterów K123Ar i K123Af), ok. 0,1 pg matrycy i 2,5 U Pfu polimerazy. Warunki reakcji: wstępna denaturacja 95°C 2 min, następnie 25 cykli po 15 s denaturacji w 98°C, 15 s renaturacji w temp. 62°C i 6 min wydłużania w 72°C. W wyniku reakcji PCR amplifikowany był cały plazmid ze sklonowanym genem. Mieszaninę reakcyjną rozdzielano w 0,7% żelu agarozowym w buforze TAE i prążki odpowiadające oczekiwanym wielkościom reizolowano z żelu (opis jak wyżej). DNA poddano reakcji kinazowania, ligacji i transformowano do komórek bakteryjnych (opis jak wyżej). Ostateczna sekwencja genu kodującego enzym fuzyjny zawierającego fragment rybonukleazy HI z B. halodurans z substytucjami wprowadzającymi zmiany w sekwencji aminokwasowej powstającego białka w pozycjach K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR oraz sekwencję aminokwasową powstającego białka przedstawiono kolejno na Figurze 4 i Figurze 5.

P r z y k ł a d 5

Ekspresja i oczyszczanie białek metodą chromatografii metalopowinowactwa

Plazmid pET30 z genem kodującego enzym fuzyjny zawierającego fragment rybonukleazy HI z B. halodurans z substytucjami wprowadzającymi zmiany w sekwencji aminokwasowej powstającego białka w pozycjach K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR transformowano do szczepu E. coli ER2566 (F^- XfhuA2 [lon] ompT lacZ::T7 gene1 gal sulA11 A(mcr)114::IS10 R(mcr73::miniTn10-Tet^s)2 R(zgb-210::Tn10)(Tet^s) endA1 [dcm] [New England Biolabs]). Kilkoma koloniami transformantów zaszczepiano 25 ml płynnej pożywki LB, uzupełnionej kanamycyną i 1% glukozą i inkubowano przez noc w temp. 37°C. Następnie zaszczepiano w stosunku 1:50, 500 ml płynnego LB uzupełnionego kanamycyną, inkubowano z wytrząsaniem w temp. 37°C przez 2 godz. Po tym czasie dodawano IPTG (końcowe stężenie 1 mM) i inkubowano z wytrząsaniem w 37°C przez 5 godz. Po indukcji hodowle wirowano przy 4000 rpm w temp. 4°C przez 10 min. płukano 2 ml STE, wirowano 10000 g 10 min i osad zamrażano w -20°C.Uzyskany osad z hodowli, zawieszano w 35 ml buforu A (50 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl, 10 mM imidazol (pH 8,0), 10% glicerol, 10 mM β-merkaptoetanol), a następnie komórki bakteryjne dezintegrowano za pomocą jednokrotnego przepuszczenia przez prasę Frencha (Constant Systems LTD) przy nadciśnieniu 1360 atmosfer. Lizaty klarowano przez odwirowanie nierozpuszczalnego peletu w ultrawirówce przy 20 000 g w temp. 4°C przez 20 min. 500 pl złoża Ni-NTA Agarose (Sigma Aldrich) równoważono buforem A w probówce typu falkon, po czym wirowano 30 s, 1000 g, 4°C i usuwano supernatant. Do tak przygotowanego złoża, dodawano supernatant pochodzący z odwirowanego lizatu po dezintegracji i inkubowano z łagodnym mieszaniem w 4°C przez 30-60 min. Po tym czasie wirowano 5 min, 1000 g, 4°C i usuwano supernatant, a złoże ze związanym białkiem płukano po 3 ml buforu B (50 mM HEPES (pH 8,0), 3 M NaCl, 10 mM imidazol (pH 8,0), 10% glicerol, 10 mM β-merkaptoetanol) dwa razy i raz C (50 mM

PL 222 512 B1

HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl, 20 mM imidazol (pH 8,0), 10% glicerol, 10 mM β-merkaptoetanol), za każdym razem wirując 5 min przy 1000 g w 4°C i usuwając supernatant. Następnym etapem była elucja, którą powtarzano dwa razy, po 200 pl buforu E (50 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl, 250 mM imidazol (pH 8,0), 10% glicerol, 10 mM β-merkaptoetanol), inkubacja 15 min w Thermomixer compact (Eppendorf), w 4°C, wytrząsając 1000 rpm. Po każdej inkubacji wirowano 30 s przy 5000 g w 4°C i przenoszono supernatant do probówki. Bufor elucyjny zmieniano na bufor do przechowywania (25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 10% glicerol, 2 mM DTT) przy użyciu złoża G-25 (Sigma Aldrich). Supernatant był używany do badań aktywności nukleazowej i przechowywano go w temp -70°C.

Przykład 6

Badanie aktywności nukleazowej enzymu fuzyjnego

Zbadano wpływ obecności jonów magnezu i cynku na aktywność enzymatyczną i specyficzność cięcia domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans i fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR. Badano wpływ obecności 5 mM MgCL i 20 μM ZnSO₄. Koniec 5' nici RNA w substracie hybrydzie DNARNA wyznakowano radioaktywnie izotopem fosforu 33. Reakcja trawienia zawierała: 0,5 μM substratu (Figura 6), 5 μM niespecyficznego kompetytora (Figura 7), 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂ lub/i 20 μM ZnSO₄, 2 mM DTT. Do reakcji użyto 0,1 μM domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans oraz 0,2 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR. Reakcje trawienia prowadzono w 37°C i zatrzymywano po 30 min oraz 1 godz. przez dodanie formamidu do końcowego stężenia 50%. Ro zdział produktów trawienia przeprowadzono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik (Figura 8).

Stwierdzono, że w obecności 20 μM ZnSO₄ i przy jednoczesnym braku MgCl₂ w reakcji trawienia enzym fuzja domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR przecina nić RNA w unikalnym miejscu. Cięcie w tym miejscu nici RNA nie występuje przy trawieniu takiego substratu przez samą domenę katalityczną rybonukleazy HI z B.halodurans. W celu dokładnego określenia miejsca trawienia nici RNA w substracie hybrydzie DNA-RNA zawierającej miejsce wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR przez fuzję domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającą substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR, wykonano ponowne trawienie substratu i rozdzielano produkty w żelu poliakrylamidowym o rozdzielczości pozwalającej na separację fragmentów różniących się o jeden nukleotyd (Figura 9). Koniec 5' nici RNA w substracie hybrydzie DNA-RNA wyznakowano radioaktywnie izotopem fosforu 33. Reakcja trawienia zawierała: 0,1 μM substratu (Figura 6), 25 μM kompetytora (Figura 7), 25 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCl, 20 μM ZnSO₄, 2 mM DTT. Do reakcji użyto 0,1 μM fuzji domeny katalitycznej rybonukleazy HI z B. halodurans zawierającej substytucje K81A, K89E i K123A z palcem cynkowym Zf-QQR. Reakcje trawienia prowadzono w 37°C i zatrzymywano po 30 min, 1 godz. oraz 2 godz. przez dodanie formamidu do końcowego stężenia 50%. Marker wielkości z fragmentami różniącymi się o jeden nukleotyd wykonano metodą hydrolizy alkalicznej zgodnie z zaleceniami firmy Ambion (http://www.ambion.com/techlib/misc/RNA_sequencing.html). Rozdział produktów trawienia przeprowadzono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym zawierającym 6 M mocznik. Powstające fragmenty o zidentyfikowanej długości naniesiono na sekwencję substratu i ust alono, że główny produkt cięcia posiada długość 53 nukleotydów (Figura 10) i znajduje się w odległości 8 nukleotydów na przeciwnej nici od miejsca wiązania dla palca cynkowego Zf-QQR.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA, znamienna tym, że endorybonukleaza jest białkiem fuzyjnym obejmującym:

   - pochodną domeny katalitycznej rybonukleazy HI (RNazy HI), z Bacillus halodurans, obejmującą polipeptyd kodowany przez nukleotydy 175 do 588 z genu rnhA przedstawionego w SEQ ID nr: 1,

   - przy czym pochodna domeny katalitycznej RNazy HI obejmuje przynajmniej jedną substytucję reszty aminokwasowej w rejonie wiązania substratu wybraną spośród: K81A, K89E i K123A w odniesieniu do sekwencji polipeptydu kodowanego przez SEQ ID nr: 1,

   PL 222 512 B1 która to zmiana(y) zapewnia destabilizację wiązania substratu przez domenę katalityczną RNazy HI lub jej pochodną; oraz

   - domenę palca cynkowego wiążącą hybrydę DNA-RNA, przy czym domena palca cynkowego ma zdolność do wiązania się ze specyficzną sekwencją w hybrydzie DNA-RNA.
2. 2. Endorybonukleaza według zastrz. 1, znamienna tym, że pochodna domeny katalitycznej RNazy HI obejmuje w rejonie wiązania substratu substytucje reszt aminokwasowych K81A i K89E i K123A w odniesieniu do sekwencji polipeptydu kodowanego przez SEQ ID nr: 1.
3. 3. Endorybonukleaza według zastrz. 1-2, znamienna tym, że domeną palca cynkowego jest pochodna palca cynkowego Zf-QQR, korzystnie polipeptyd kodowany przez nukleotydy od 19 do 303 z sekwencji Zf-QQR przedstawionej w SEQ ID Nr: 2.

   Rysunki

   Atggcaaagtcaaaatactatgtcgtatggaatggacggaagcccggcatttatacgagctggtctgcatgtgaagctcaagtaaaag gatataccggcgccaaatttaaatcctatccttccaaggaagaagcagaggctgcttttagaggagaagaggcaacaccgaagcttgc aaaagaggagattatttgggagagcctgtctgtagatgttggcagccaagggaatcccggaattgtggaatataaaggcgttgatacga aaacgggagaagtcctttttgaacgagagccgattccgatcgggacaaacaatatgggtgagtttctcgcgatcgttcacgggcttcgtt accttaaggaacggaacagtcgtaagccgatctattctgattcccagacggcaatcaaatgggtgaaggataaaaaagcaaaatcgac cctcgtgcgcaatgaagaaacagcgcttatttggaagcttgtagatgaagcggaggagtggctaaacactcatacatatgaaacgccc atcttaaaatggcagaccgataagtggggggaaattaaggccgattacgggagaaaataa

   Figura 1

   Ccatggaaaaactgcgtaacggttctggtgacccgggtaaaaaaaaacagcacgcgtgcccggaatgcggtaaatctttctctcagtc ttctaacctgcagaaacaccagcgtacccacaccggtgaaaaaccgtacaaatgtccagaatgtggcaaaagctttagtcaaagttcta atcttcaaaaacatcaacgcacgcataccggcgagaagccatataagtgtccggagtgcggcaaaagcttctcccgctctgatcacctc cagcgtcatcagcgcactcatcagaacaaaaaactcgag

   Figura 2

   PL 222 512 B1

   Bhcatf: GACGCATATGGCAAAAGAGGAGATTATTTGGG Bhcatr: GTGGTACCTTTTCTCCCGTAATCGGC BhZf: GGTTCTGGTGACCCGGG

   Kmf: GGGATCGCAGTGGTGAGTAAC

   Kmr: CGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAG

   K81 Ar: TTCACCCATGCGATTGCCGTCTGGGAATCAG

   K89Ef: GGATAAAAAAGCAGAATCGACCCTCGTGCGC

   K123Ar: TAAGATGGGCGTTTCATAGGTATG

   K123Af: GCATGGCAGACCGATAAGTG

   Figura 3

   Atggcaaaagaggagattatttgggagagcctgtctgtagatgttggcagccaagggaatcccggaattgtggaatataaaggcgttg atacgaaaacgggagaagtcctttttgaacgagagccgattccgatcgggacaaacaatatgggtgagtttctcgcgatcgttcacggg cttcgttaccttaaggaacggaacagtcgtaagccgatctattctgattcccagacggcaatcgcatgggtgaaggataaaaaagcaga atcgaccctcgtgcgcaatgaagaaacagcgcttatttggaagcttgtagatgaagcggaggagtggctaaacactcatacctatgaaa cgcccatcttagcatggcagaccgataagtggggggaaattaaggccgattacgggagaaaaggttctggtgacccgggtaaaaaaa aacagcacgcgtgcccggaatgcggtaaatctttctctcagtcttctaacctgcagaaacaccagcgtacccacaccggtgaaaaacc gtacaaatgtccagaatgtggcaaaagctttagtcaaagttctaatcttcaaaaacatcaacgcacgcataccggcgagaagccatataa gtgtccggagtgcggcaaaagcttctcccgctctgatcacctccagcgtcatcagcgcactcatcagaacaaaaaactcgagcaccac caccaccaccac

   Figura 4

   MAKEEIIWESLSVDVGSQGNPGIVEYKGVDTKTGEVLFEREPIPIGTNNMGEFLA1VH

   GLRYLKERNSRKPIYSDSQTAIAWVKDKKAESTLVRNEETALIWKLVDEAEEWLNTH