ES2557633T3 - Ribonucleasa H modificada por ingeniería específica de secuencia y el método para determinar la preferencia de secuencia de proteínas de unión de híbrido de ADN-ARN - Google Patents
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Abstract
Una ribonucleasa, que escinde la hebra de ARN en híbridos de ADN-ARN, en la que dicha ribonucleasa es una proteína de fusión que comprende un derivado del dominio catalítico de la ribonucleasa HI (RNasa HI), en la que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI es de Bacillus halodurans, que comprende el polipéptido codificado por los nucleótidos 175 a 588 del gen rnhA mostrado en la SEC ID Nº: 1, y en la que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en el dominio de unión al sustrato seleccionada entre: K81A, K89E y K123A en referencia a la secuencia del polipéptido codificada por la SEC ID Nº: 1, preferentemente contiene todas las sustituciones K81A, K89E y K123A en referencia a la secuencia del polipéptido codificada por la SEC ID Nº: 1, y en la que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI no comprende dominio de unión a híbrido de RNasa HI, con un dominio de unión de dedo de zinc híbrido de ADN-ARN, en el que el dominio de unión de dedo de zinc tiene la capacidad de unirse a una secuencia específica en el híbrido de ADN-ARN.
Description
Ribonucleasa H modificada por ingeniería específica de secuencia y el método para determinar la preferencia de secuencia de proteínas de unión de híbrido de ADN-ARN 5
[0001] La invención se refiere a una ribonucleasa H específica de secuencia, que comprende una fusión de un dominio de ribonucleasa HI (RNasa HI) modificada por ingeniería con un dominio de dedos de cinc. La presente invención se puede aplicar en genética. La ribonucleasa específica de secuencia que actúa en híbridos de ADN-ARN es útil en cualquier aplicación, en la que se puede realizar la escisión de la hebra de ARN en un híbrido de ADN-ARN, por ejemplo en manipulación de ácidos nucleicos in vitro, en particular híbridos de ADN-ARN con una secuencia especificada. Además del uso in vitro, algunas enzimas que escinden híbridos de ADN-ARN de una manera específica de secuencia también se pueden usar en la terapia de ciertas infecciones de virus de ARN (por
15 ejemplo, virus oncogénicos, retrovirus, hepatitis B, gripe), que se replican mediante la formación transitoria de una hebra de ADN en un molde de ARN o para escindir otros híbridos de ADN-ARN que se forman in vivo.
[0002] También se desvela un método para la determinación de la preferencia de secuencia del híbrido de ADN-ARN que se une a proteína(s) o sus dominio(s) y mediante esto la determinación de la secuencia reconocida mediante una proteína de unión a híbrido de ADN-ARN. El método mencionado anteriormente se puede aplicar en genética. El método para la determinación de la preferencia de secuencia proteínas de unión a híbrido de ADN-ARN se puede aplicar en la determinación de la preferencia de secuencia de cualquier proteína o su dominio que se une a secuencias específicas en el híbrido de ADN-ARN y mediante esto la determinación de la secuencia reconocida por una proteína(s) de unión a híbrido de ADN-ARN o su dominio. El método se puede aplicar de forma complementaria
25 con cualquier técnica de modificación por ingeniería específica de tales proteínas. Las proteínas de unión a híbrido de ADN-ARN específicas se pueden usar en el diagnóstico de ciertos virus de ARN (por ejemplo, virus oncogénicos, retrovirus, hepatitis B, gripe), que se replican mediante la transición para la creación de un molde de ARN con hebra de ADN. Tales dominios también se pueden aplicar en modificación por ingeniería de proteínas para obtener enzimas con nueva especificidad tales como fusiones de proteína de unión ADN-ARN condominios enzimáticos, tales como nucleasa, enzimas de modificación de ARN o de modificación de ADN y otros.
[0003] La escisión de ácidos nucleicos en una ubicación específica se usa frecuentemente en muchas técnicas de
35 ingeniería genética. Existen muchos métodos para fragmentar moléculas de ADN, que incluyen las enzimas de restricción disponibles en el mercado usadas ampliamente. No se conocen muchas enzimas de procesamiento de ARN y la mayoría de ellas se caracterizan por una baja especificidad secuencial o por su ausencia total.
[0004] El documento de patente WO 2010076939 A1 describe las composiciones y métodos para realizar recombinación o mutación genética dirigida usando la nucleasa de dedos de cinc quimérica. El documento de patente WO 03087341 A2 describe el uso de una nucleasa de dedos de cinc para la edición dirigida del gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística humana, proporcionando de este modo una terapia potencial para la fibrosis quística. El documento de patente WO 2009146179 A1 describe el desarrollo de un método de ensamblaje modular altamente eficaz y fácil de poner en práctica que usa dedos de cinc disponibles al
45 público para preparar nucleasas de dedos de cinc que son capaces de modificar las secuencias de ADN de varios sitios genómicos en las células humanas. Ninguno de los documentos de patente WO 2010076939 A1, WO 03087341 A2 o WO 2009146179 A1 describe o sugiere el uso de la fusión de la RNasa HI o parte de la misma con un dedo de cinc, en particular con ZfQQR ni en particular desvelan ni sugieren la posibilidad de la escisión dirigida de híbridos de ADN-ARN ni cualquier tipo de escisión dirigida de híbridos de ADN-ARN mediante cualquier proteína. A partir de las descripciones de los documentos de patente WO2007014181A2 y WO2007014182A2 se conocen fusiones de muchos dominios de dedos de cinc y nucleasas FokI que facilitan la edición dirigida del genoma. Sin embargo, a diferencia del primer caso, la fusión de las proteínas nativas solas, la RNasa HI y el dedo de cinc, no conduce a una enzima específica de secuencia.
55 [0005] El método para la determinación de la preferencia de secuencia de proteína(s) de unión a híbrido de ADN-ARN o su dominio(s) y mediante esto la determinación de la secuencia reconocida por una proteína de unión híbrido de ADN-ARN es una modificación del procedimiento de SELEX. SELEX representa la evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial. El principio de este método se basa en la selección iterativa y enriquecimiento de moléculas a partir de una gran biblioteca bifurcada de secuencias de ácidos nucleicos que presentan una afinidad elevada hacia un ligando. La etapa del enriquecimiento se consigue mediante la unión de los ácidos nucleicos a un ligando y la retirada de las secuencias no unidas. Hasta ahora este método se ha usado para obtener aptámeros de ARN y de ADN que se unen a ligandos con especificidad elevadas (Ellington, A.D., Szostak, J.W., 1990. Nature 346, 818-822; Huizenga DE, Szostak JW. 1995. Biochemistry 34 (2): 656-65"), para determinar una preferencia de secuencia de una proteína de unión a ADN o a ARN (Blackwell TK y Weintraub H. 1990. Science
65 250: 1104-1110), pero nunca se usó para proteínas que se unen a híbridos de ADN-ARN. Las bibliotecas de
oligonucleótidos descritas usadas en modificaciones conocidas de SELEX consistían en oligonucleótidos monocatenarios (ARN, ADNss, ARN modificado, o ADNss modificado, PNA), o ADN bicatenario (ADNds), pero ninguna caracteriza el uso de biblioteca de híbrido de ADN-ARN.
5 [0006] El documento de patente WO 2010076939 A1 describe las composiciones y métodos para realizar la recombinación o mutación genética dirigida usando la nucleasa de dedos de cinc quimérica. El documento de patente WO 03087341 A2 describe el uso de una nucleasa de dedos de cinc para la edición dirigida del gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística humana, proporcionando de este modo una terapia potencial para la fibrosis quística. El documento de patente WO2009146179 A1 describe el desarrollo de un método de ensamblaje modular altamente eficaz y fácil de poner en práctica que usa dedos de cinc disponibles al público para preparar nucleasas de dedos de cinc que son capaces de modificar las secuencias de ADN de varios sitios genómicos en las células humanas. Ninguna de las publicaciones mencionadas anteriormente describe el uso del método SELEX para determinar la preferencia de sustrato de proteínas de unión a híbrido de ADN-ARN o el uso de dedos de cinc para la unión de secuencias específicas en híbridos de ADN-ARN o el uso de ZfQQR en particular
15 para esa finalidad.
[0007] Herskovitz M.A. et al., Mol Microbiol. 2000 Dec: 38 (5): 1027-33, " Endoribonuclease RNase III is essential in Bacillus subtilis." describe el crecimiento de una cepa en la que la expresión de Bs-RNasa III (rncS) era dependiente de la transcripción de rncS a partir de un plásmido sensible a la temperatura y a la temperatura no permisiva daba como resultado un 90-95 % de muerte celular, y prácticamente todas las células que sobrevivían retenían el plásmido de expresión de rncS. Por lo tanto, los autores concluyeron en que rncS es esencial en B. subtilis. Dasgupta S. et al., Mol Microbiol. 1998; 28 (3): 629-40, "Genetic uncoupling of the dsRNA-binding and RNA cleavage activities of the Escherichia coli endoribonuclease RNase III --the effect of dsRNA binding on gene expression." describe los fenotípicos de bacterias que portan mutaciones puntuales en rnc, el gen que codifica la RNasa III. Karen
25 Shahbabian et al., The EMBO Journal (2009) 28, 3523-3533, " RNase Y, a novel endoribonuclease, initiates riboswitch turnover in Bacillus subtilis" describe una proteína esencial de función desconocida temprana, YmdA, identificada como una nueva endorribonucleasa (denominada RNasa Y en la actualidad) que era capaz de escindir de forma preferente in vitro la corriente arriba de ribointercambio de yitJ 5’-monofosforilado del dominio del aptámero de unión a SAM. Ninguno de Herskovitz M.A. et al., Dasgupta S. et al., o Karen Shahbabian et al., menciona o sugiere el uso del método SELEX para determinar la preferencia de sustrato de proteínas de unión a híbrido de ADN-ARN o de dos de cinc que se unen a híbridos de ADN-ARN o cualquier método para obtener híbridos de ADN-ARN.
[0008] El documento de patente US 2006057590 describe la generación de una molécula de ARN bicatenario que
35 cubre básicamente la región transcrita completa de un gen y la escisión de esta molécula usando una ARN endonucleasa para generar moléculas pequeñas de ARN, que ya están marcadas o se pueden marcar posteriormente. La patente JP54059392 describe una nueva nucleasa B-1 que ataca la zona de una sola escisión de cadena de una de las cadenas de ADN de un ácido desoxirribonucleico bicatenario, y divide de forma específica la otra cadena de ADN en su zona complementaria. Los documentos de patente US 2006057590 y JP54059392 permanecen en silencio con respecto al uso del método SELEX para determinar la preferencia de sustrato de proteínas de unión a híbrido de ADN-ARN o el uso de dedos de cinc para la unión de secuencias específicas en híbridos de ADN-ARN o el uso de ZfQQR en particular para esa finalidad.
[0009] Por lo tanto, existe una necesidad de una ribonucleasa que escinda la era de ARN de los híbridos de ADN
45 ARN en una ubicación específica. También existe una necesidad de un nuevo método mejorado para determinar la preferencia de sustrato de proteínas de unión a híbrido de ADN-ARN o el uso de dedos de cinc para la unión de secuencias específicas en híbridos de ADN-ARN o en particular del uso de ZfQQR para esa finalidad.
[0010] A la vista del estado de la técnica de descrito, el objeto de la presente invención es superar las desventajas indicadas y proporcionar una ribonucleasa que es sin dar la hebra de ARN de dos híbridos de ADN-ARN en una ubicación específica. Por lo tanto, el objeto de la invención es proporcionar enzimas modificadas por ingeniería basadas en la combinación de dominio catalítico de RNasa HI y el dominio de dedos de cinc que reconoce la
55 secuencia en híbridos de ADN-ARN y obtener una enzima específica de secuencia que escinda solamente la hebra de ARN de los híbridos de ADN-ARN.
[0011] También se desvela un nuevo método, mejorado para obtener una biblioteca de híbridos de ADN-ARN con una secuencia aleatoria y su uso para determinar la preferencia de secuencia de la proteína de unión a híbrido de ADN-ARN, preferentemente preferencia de secuencia de híbrido de ADN-ARN para unión a dedo de cinc, más preferentemente mediante ZfQQR. Tal método se puede usar de forma eficaz a identificar sistemáticamente biblioteca de híbridos de ADN-ARN. Además, se desvela un método nuevo y mejorado para obtener una biblioteca de híbridos de ADN-ARN.
65 [0012] Los inventores han encontrado de forma inesperada que se podía obtener una ribonucleasa H específica de
secuencia modificada por ingeniería que escinde la hebra de ARN de los híbridos de ADN-ARN en una ubicación específica fusionando un dominio catalítico de la RNasa HI o un derivado de la misma con un dominio de unión de híbrido de ADN-ARN a dedos de cinc, en la que el dominio de unión a dedo de cinc tiene la capacidad de unirse a las secuencias específicas en el híbrido de ADN-ARN.
5 [0013] En el primer aspecto, la invención proporciona una ribonucleasa que escinde la era de ARN en los híbridos de ADN-ARN, en la que dicha ribonucleasa es una proteína de fusión que comprende un derivado del dominio catalítico de la ribonucleasa HI (RNasa HI) en la que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI es de Bacillus halodurans, que comprende polipéptido codificado por los nucleótidos 175 a 588 del gen rnhA que se muestra en la SEC ID Nº: 1, y en la que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI comprende al menos una sustitución de un resto de aminoácido en el dominio de unión al sustrato seleccionada entre: K81A, K89E y K123A que hace referencia a la secuencia del polipéptido codificado por la SEC ID Nº: 1, preferentemente contiene todas las sustituciones K81A, K89E y K123A que hacen referencia a la secuencia del polipéptido codificada por la SEC ID Nº: 1, y en la que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI no comprende dominio de unión a híbrido de RNasa
15 HI, con un dominio de unión de híbrido de ADN-ARN a dedos de cinc, en la que el dominio de unión a dedo de cinc tiene la capacidad de unirse a la secuencia específica en el híbrido de ADN-ARN.
[0014] En la ribonucleasa preferente, el dominio de dedos de cinc es un derivado del dedo de cinc ZfQQR, preferentemente un polipéptido codificado por los nucleótidos de 19 a 303 de la secuencia ZfQQR que se muestra en la SEC ID Nº: 2. La ribonucleasa comprende preferentemente la proteína de fusión catAEA-ZfQQR tal como se muestra en la SEC ID Nº: 4. La ribonucleasa comprende preferentemente la proteína de fusión GQ tal como se muestra en la SEC ID Nº: 6. La ribonucleasa también comprende preferentemente la proteína de fusión GGKKQ tal como se muestra en la SEC ID Nº: 8. En el siguiente aspecto, la invención proporciona la composición comprende una ribonucleasa de acuerdo con la
25 invención. La invención también se refiere al uso de la ribonucleasa de acuerdo con la invención o una composición de acuerdo con la invención para la escisión in vitro de la hebra de ARN en los híbridos de ADN-ARN. En tal uso, la escisión preferente de la hebra de ARN en los híbridos de ADN-ARN se localiza con 2-16 nucleótidos, preferentemente con 5-7 nucleótidos, de separación del sitio de unión con respecto al dedo de cinc.
[0015] La invención también proporciona el método para obtener variante RNasa HI modificada por ingeniería, que escindir la hebra de ARN en híbridos de ADN-ARN que comprende las siguientes etapas:
a) obtener un derivado de dominio catalítico de la RNasa HI, en el que el derivado del dominio catalítico de la
35 RNasa HI es de B. halodurans, que comprende polipéptido codificado por los nucleótidos 175 a 588 del gen rnhA que se muestra en la SEC ID Nº: 1, y en el que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI comprende al menos una sustitución de un resto de aminoácido en el dominio de unión al sustrato seleccionada entre: K81A, K89E y K123A que hacen referencia a la secuencia del polipéptido codificada por la SEC ID Nº: 1, preferentemente contiene todas las sustituciones K81A, K89E y K123A que hacen referencia a la secuencia del polipéptido codificada por la SEC ID Nº: 1, y en el que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI no comprende dominio de unión a híbrido de RNasa HI, b) obtener una RNasa HI modificada por ingeniería mediante la preparación de proteína de fusión que comprende el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI obtenido en la etapa a) con un dominio de unión a
45 dedo de cinc que tiene la capacidad de unirse a las secuencias específicas en el híbrido de ADN-ARN. En el método preferente para obtener una variante modificada por ingeniería de la RNasa HI, el dominio de dedos de cinc es un derivado del dedo de cinc ZfQQR, preferentemente un polipéptido codificado por los nucleótidos de 19 a 303 de la secuencia ZfQQR que se muestra en la SEC ID Nº: 2. El dominio catalítico de la RNasa HI comprende cambios en la región de unión al sustrato.
[0016] La ribonucleasa que escinde la hebra de ARN de los híbridos de ADN-ARN, contiene una fusión de RNasa HI
o derivado de la misma y un dedo de cinc que se une a híbrido de ADN-ARN, en la que la RNasa HI es de B. halodurans y el dedo de cinc tiene la capacidad de unirse a las secuencias específicas en el híbrido de ADN-ARN. La ribonucleasa descrita se caracteriza por que es un derivado de la RNasa HI de B. halodurans, el péptido del
55 dominio catalítico, que comprende un polipéptido codificado por los nucleótidos 175 a 588 del gen rnhA mostrado en la SEC ID Nº: 1. La ribonucleasa descrita se caracteriza por que es un derivado de la RNasa HI nativa, que contiene una supresión del dominio de unión al híbrido de ADN-ARN. La ribonucleasa descrita se caracteriza por que es un derivado del dominio catalítico de la RNasa HI, que contiene una sustitución de aminoácido en la región de unión al sustrato: K81A, K89E y K123A. La ribonucleasa descrita se caracteriza por que es una fusión del polipéptido codificado por los nucleótidos 175 a 588 del gen rnhA que se muestra en la SEC ID Nº: 1 y el dominio de dedos de cinc siendo un derivado del dedo de cinc ZfQQR, preferentemente un polipéptido codificado por los nucleótidos de 19 a 303 del dedo de cinc ZfQQR que se muestra en la SEC ID Nº: 2.
[0017] La ribonucleasa H específica de secuencia se puede usar en un fragmento específico y localizado de ácidos 65 nucleicos para espectrometría de masas de ARN, incluyendo estudios sobre la modificación del ARN. La invención
se puede usar para generar fragmentos de ARN para secuenciación de tercera generación. La RNasa H modificada por ingeniería específica de secuencia se puede usar para detectar o formar mapas de ARN viral con secuencias específicas, en la que el ARN monocatenario se hibrida con ADN, y el híbrido resultante se escinde. La invención se puede usar para la modificación por ingeniería de proteínas mediante fragmentos de barajado y ligación de ARNm,
5 en la que los fragmentos se obtienen por digestión con la ribonucleasa H modificada por ingeniería específica. La invención puede usarse para la escisión específica del sitio directa de híbridos de ADN-ARN persistentes in vivo.
[0018] Se pueden obtener enzimas con nuevas características mediante la construcción de fusiones de varios dominios con diferente funcionalidad. La modificación por ingeniería de una ribonucleasa que es fin de la hebra de 10 ARN del híbrido de ADN-ARN una manera dependiente de la secuencia se basa en la fusión de los dominios de proteínas: RNasa HI modificada por ingeniería y un dedo de cinc que se une a híbrido de ADN-ARN. La RNasa HI de
B. halodurans es una enzima que hidroliza la hebra de ARN en un híbrido de ADN-ARN de una manera independiente de la secuencia. El dedo de cinc ZfQQR tiene la capacidad de unirse a una secuencia bien definida en el híbrido de ADN-ARN. En una de las realizaciones de la enzima de fusión, el dominio que presenta una actividad 15 de ribonucleasa frente a la hebra de ARN en un híbrido de ADN-ARN es un fragmento de un gen de B. halodurans, rnhA, que codifica el dominio catalítico (denominado cat). Se trata de un fragmento de los nucleótidos 175 a 588 del gen rnhA, que corresponde a la región de 59 a 196 restos de aminoácidos de la proteína nativa RNasa HI de B. halodurans. A partir del gen nativo, se retiró un fragmento que codifica el dominio de unión a híbrido (HBD), debido a su capacidad para unirse a híbridos de ADN-ARN independientemente de la secuencia. La fusión del dominio 20 catalítico con ZfQQR se denominó cat-ZfQQR. El dominio catalítico modificado por ingeniería tiene tres sustituciones de aminoácidos introducidas en la región de unión al sustrato: K81A, K89E y K123A. Las sustituciones implican a las lisinas cargadas de forma positiva, que se localizan cerca de la región conocida de unión al sustrato. No se pretende que las sustituciones en el sitio de unión inactiva en a la enzima, sino que hagan que la unión al sustrato de la enzima sea dependiente de la presencia del dominio de unión al híbrido de ADN-ARN adicional. El dominio, que 25 transmite la especificidad de secuencia de la enzima de fusión, es el dedo de cinc ZfQQR. En la enzima de fusión, se usó el fragmento genético que codifica un dedo de cinc ZfQQR de 19 a 303 nucleótidos, que corresponde a una región de 7 a 101 restos de aminoácidos de una proteína. Además, la región conectora de interdominios de la enzima de fusión se modificó para producir dos variantes, denominadas GQ y GGKKQ. GQ es la fusión del dominio catalítico con sustituciones en K81A, K89E y K123A con ZfQQR que carece de un fragmento de codificación de
30 aminoácidos en las posiciones 138-148 de la enzima de fusión. GGKKQ es la fusión del dominio catalítico con sustituciones en K81A, K89E y K123A con ZfQQR que carece de un fragmento de codificación de aminoácidos en las posiciones 138-139 y 141-146 de la enzima de fusión. Las descripciones de las construcciones generadas se resumen en la Tabla 1.
35 Tabla 1. Descripción de construcciones, sus abreviaturas usadas adicionalmente y en los ejemplos y sus referencias a las SEC ID Nºs.
- Descripción
- Abreviatura Referencias a las SEC ID Nºs
- dominio catalítico de la RNasa HI de B. halodurans
- cat fragmento codificado por los nucleótidos 175 a 588 de la SEC ID Nº: 1
- la fusión del dominio catalítico con ZfQQR
- cat-ZfQQR fragmento codificado por los nucleótidos 175 a 588 de la SEC ID Nº: 1 y los nucleótidos 19 a 303 de la SEC ID Nº: 2
- la fusión del dominio catalítico con sustituciones de K81A, K89E y K123A con ZfQQR
- catAEA-ZfQQR construcción codificada por la SEC ID Nº: 3 (secuencia de nucleótidos) y la SEC ID Nº: 4 mostrada (secuencia de aminoácido)
- la fusión del dominio catalítico con sustituciones que introducen cambios en la secuencia de aminoácidos de una proteína en posiciones K81A, K89E y K123A con el dedo de cinc ZfQQR y el conector interdominios acortado con un fragmento que codifica aminoácidos en las posiciones 138-148
- GQ construcción codificada por la SEC ID Nº: 5 (secuencia de nucleótidos) y la SEC ID Nº: 6 (secuencia de aminoácidos)
- la fusión del dominio catalítico con sustituciones que introducen cambios en la secuencia de aminoácidos de una proteína en posiciones K81A, K89E y K123A con el dedo de cinc ZfQQR y el conector interdominios acortado con un fragmento que codifica aminoácidos en las posiciones 138-139 y 141-146
- GGKKQ construcción codificada por la SEC ID Nº: 7 (secuencia de nucleótidos) y la SEC ID Nº: 8 (secuencia de aminoácidos)
[0019] También se desvela el método para determinar la preferencia de sustrato de la proteína(s) de unión a híbrido de ADN-ARN o su dominio(s). Tal método permite determinar la secuencia preferente reconocida por una proteína(s)
o su dominio(s) y/o la unión mediante un dominio de proteína en el híbrido de ADN-ARN.
5 [0020] En el método desvelado para determinar la preferencia de secuencia de la proteína(s) de unión a híbrido de ADN-ARN o su dominio(s), el método comprende las siguientes etapas:
a) poner en contacto la proteína purificada o su dominio, con una mezcla de una biblioteca de sustratos de híbridos de ADN-ARN, en la que los sustratos de híbridos de ADN-ARN comprenden secuencias aleatorias en la parte central, preferentemente ordenadas al azar en posiciones de 9 o 10 nucleótidos, con secuencias de flanqueo fijadas y que permite que una proteína o su dominio sometidos a ensayo se unan con la secuencia hacia la que tiene una afinidad; b) separar los híbridos de ADN-ARN no unidos mediante inmovilización de proteína o su dominio, con híbrido de ADN-ARN unido, a la resina, preferentemente glutatión agarosa;
15 c) retirar los híbridos sin unir; d) aislar la proteína recombinante, junto con los híbridos de ADN-ARN asociados, preferentemente mediante la adición de un tampón que contiene glutatión; e) amplificación del individuo aislado usando PCR, preferentemente RT-PCR, en la que en la reacción de amplificación, se usan los cebadores complementarios a secuencias conocidas en las secuencias de flanqueo de la región clasificada al azar, y en la que durante la reacción de PCR en uno de los cebadores, se añade la secuencia de promotor de ARN polimerasa para obtener ADN bicatenario para transcripción in vitro con ARN polimerasa; f) la transcripción inversa se realiza usando transcriptasa inversa que no posee la actividad de RNasa H y un cebador de ADN complementario con el extremo en la posición 3’ del molde de ARN para obtener un híbrido de
25 ADN -ARN, y las etapas de a) a f) se repiten preferentemente.
Por ejemplo, en el método, la secuencia promotora comprende la secuencia promotora para la T7 ARN polimerasa y la ARN polimerasa es T7 ARN polimerasa. Por ejemplo, la proteína o su dominio es una proteína recombinante o dominio recombinante. La proteína o su dominio comprenden preferentemente dedo(s) de cinc. Por ejemplo, la proteína o su dominio es la fusión del dominio de dedos de cinc y GST, preferentemente la fusión del dominio de dedos de cinc y GST codificada por la SEC ID Nº: 37. La proteína o su dominio a modo de ejemplo es la fusión de la RNasa HI o un derivado de la misma, por ejemplo la RNasa HI es de B. halodurans, que comprende por ejemplo polipéptido codificado por los nucleótidos 175 a 588 del gen rnhA mostrado en la SEC ID Nº: 1, y un dedo de cinc. El dedo de cinc tiene por ejemplo la capacidad para unirse a las secuencias específicas en el híbrido de ADN-ARN, el
35 dedo de cinc a modo de ejemplo es ZfQQR, por ejemplo con secuencia codificada por los nucleótidos de 19 a 303 de la secuencia ZfQQR que se muestra en la SEC ID Nº: 2.
[0021] La descripción también desvela un método para obtener biblioteca de híbridos de ADN-ARN que comprende las siguientes etapas:
a) amplificación con PCR de la biblioteca de oligonucleótidos de ADN que contiene una secuencia degenerada
en la posición central, flanqueada con secuencias invariables, que incluyen una secuencia promotora para la
ARN polimerasa,
b) síntesis de hebra de ARN usando ARN polimerasa en la obtenida en a) ADN bicatenario como un molde,
45 c) transcripción inversa del cebador complementario con la secuencia invariable presente en el extremo en la posición 3’ del ARN obtenido en b) con una transcriptasa inversa que no posee una actividad de RNasa H,
en el que durante la transcripción inversa, se obtienen la hebra de ARN no se degrada, y el híbrido que consiste en hebras de ARN y ADN totalmente complementarias. Por ejemplo, en tal método, los oligonucleótidos contienen una secuencia degenerada en la posición central que comprende posiciones clasificadas al azar de 9 o 10 nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia promotora comprende la secuencia promotora para la T7 ARN polimerasa y la ARN polimerasa es la T7 ARN polimerasa.
[0022] Para determinar el intervalo completo de secuencias reconocidas por una proteína de unión al híbrido de
55 ADN-ARN específica de secuencia y la preferencia de sustrato de la proteína(s) o sus dominio(s) de unión a híbrido de ADN-ARN, en los híbridos de ADN-ARN, tal como se describe, se desarrolló una modificación del método SELEX, que permite ciclos iterativos de selección de una secuencia de híbrido de ADN-ARN unidad de forma preferente mediante una proteína (Figura 10). En este proceso, un nuevo elemento es el modo de amplificación y recreación de una biblioteca de híbridos de ADN-ARN, para su uso en el siguiente. Esto implica el uso de amplificación con PCR de una biblioteca de oligonucleótidos de ADN que contienen una secuencia degenerada en la posición central, flanqueada por secuencias invariables, que incluyen una secuencia promotora para la ARN polimerasa, preferentemente la T7 ARN polimerasa. El ADN bicatenario resultante se usa como un molde para la síntesis de la hebra de ARN usando ARN polimerasa, preferentemente la T7 ARN polimerasa. Se obtiene una combinación de ARN monocatenario y sirve como un molde para transcripción inversa para obtener una biblioteca
65 de híbridos de ADN-ARN. La transcripta inversa extiende el cebador complementario a la secuencia invariable
presente en el extremo en la posición 3’ del ARN. Durante la transcripción inversa con una enzima con la actividad de ribonucleasa H eliminada (la transcriptasa inversa que no posee actividad de ribonucleasa H), la hebra de ARN no se degrada, lo que permite la creación de un híbrido que consiste en una hebra de ARN y de ADN totalmente complementarias. De esta manera, se obtiene una biblioteca de híbridos de ADN-ARN, porque el molde de ARN era
5 heterogéneo en la parte central de la secuencia. La eficacia de la modificación desarrollada del método SELEX se confirmó usando el dedo de cinc ZfQQR como ligando, que se une al híbrido de ADN-ARN. Como resultado de la modificación por ingeniería se obtuvo ZFQQR y se une a la secuencia 5 ’GGGGAAGAA-3’ en la hebra de ADN de los híbridos de ADN-ARN (Shi y Berg, Specific DNA-RNA hybrid binding by zinc finger proteins. 1995. Science, vol. 268). Para este ejemplo, se usó la fusión de ZFQQR con dominio de Glutatión S-transferasa (denominado GST).
[0023] Para entender mejor la invención, en las figuras se muestran varios ejemplos, en los que
15 La Figura 1 muestra la secuencia de los cebadores de la SEC ID Nº: 11-25 usados en la preparación de la construcción de ADN final de una fusión genética del gen rnhA con el dedo de cinc ZfQQR y la preparación de sustituciones en la RNasa HI de la secuencia genética de B. halodurans.
La Figura 2 es una secuencia del híbrido de ADN-ARN mostrado en la SEC ID Nº: 9 (Fig. 2(A) -hebra de ARN) y
20 la SEC ID Nº: 10 (Fig. 2(B) -hebra de ADN) que contiene el sitio de unión para el dedo de cinc ZfQQR, que se usó en ensayos de digestión como sustrato específico.
La Figura 3 muestra los productos de digestión resultantes del corte del sustrato de híbrido de ADN-ARN que contiene el sitio de unión para el dedo de cinc, y la dependencia de la escisión en presencia de iones magnesio y 25 cinc. La reacción de digestión mostrada en las Calles 1-14 se realizó con 0,05 µM del sustrato marcado con radiactividad, 0,5 µM del sustrato no marcado, Tris 25 mM (pH 8,0), KCl 100 mM, DTT 2 mM, 30 min a 37 ºC con presencia o no de diferentes enzimas y presencia de MgCl2 5 mM y/o ZnSO4 20 µM como se indica a continuación. Calle 1: sustrato sin escindir, Calle 2: 12,5 nM de RNasa HI de B. halodurans, MgCl2 5 mM, ZnSO4 20 µM, Calle 3: 625 nM de cat, MgCl2 5 mM, ZnSO4 20 µM, Calle 4: cat-ZfQQR 5 nM, MgCl2 5 mM, ZnSO4 20 30 µM, Calle 5: catAEA-ZfQQR 25 nM, MgCl2 5 mM, ZnSO4 20 µM, Calle 6: 12,5 nM de RNasa HI de B. halodurans, MgCl2 5 mM, Calle 7: 625 nM de cat, MgCl2 5 mM, Calle 8: cat-ZfQQR 5 nM, MgCl2 5 mM, Calle 9: 25 nM de catAEA-ZfQQR, MgCl2 5 mM, Calle 10: 12,5 nM de RNasa HI de B. halodurans, ZnSO4 20 µM, Calle 11: 625 nM de cat, ZnSO4 20 µM, Calle 12: 5 nM de cat-ZfQQR, ZnSO4 20 µM, Calle 13: 25 nM de catAEA-ZfQQR, ZnSO4 20 µM, Calle 14: Marcador con un tamaño de 10-100 nucleótidos de ARN monocatenario marcado con
35 radiactividad con isótopo de fósforo 33 (USB) en el que un asterisco (*) marcaba un único sitio de escisión.
La Figura 4 muestra los productos de digestión resultantes del corte del sustrato de híbrido de ADN-ARN, que contiene el sitio de unión para el dedo de cinc, y la dependencia de la escisión mediante la variante GQ del catAEA-ZfQQR en presencia de iones magnesio y cinc. La reacción de digestión mostrada en las Calles 1-14 se 40 realizó con 50 nM de la variante GQ, 0,05 µM del sustrato marcado con radiactividad, 0,5 µM de sustrato sin marcar, Tris 25 mM (pH 8,0), ZnSO4 20 µM, KCl 100 mM, DTT 2 mM, 30 min a 37 ºC con diversas concentraciones de MgCl2 como se indica a continuación. Calle 1: sustrato sin escindir, Calle 2: MgCl2 0,05 mM, Calle 3: 0,1 mM MgCl2 Calle 4: MgCl2 0,2 mM, Calle 5: MgCl2 0,5 mM, Calle 6: MgCl2 1 mM, Calle 7: MgCl2 2 mM, Calle 8: MgCl2 5 mM, Calle 9: MgCl2 10 mM, Calle 10: Marcador con un tamaño de 10-100 nucleótidos de
45 ARN monocatenario marcado con radiactividad con isótopo de fósforo 33 (USB).
La Figura 5 muestra los productos de digestión resultantes del corte del sustrato de híbrido de ADN-ARN, que contiene el sitio de unión para el dedo de cinc, y la dependencia de la escisión mediante la variante GGKKQ del catAEA-ZfQQR en presencia de iones magnesio y cinc. La reacción de digestión mostrada en las Calles 1-14 se 50 realizó con variante de GGKKQ 50 nM, 0,05 µM del sustrato marcado con radiactividad, 0,5 µM de sustrato sin marcar, Tris 25 mM (pH 8,0), ZnSO4 20 µM, KCl 100 mM, DTT 2 mM, 30 min a 37 ºC con diversas concentraciones de MgCl2 como se indica a continuación: Calle 1: sustrato sin escindir, Calle 2: MgCl2 0,05 mM, Calle 3: MgCl2 0,1 mM, Calle 4: MgCl2 0,2 mM, Calle 5: MgCl2 0,5 mM, Calle 6: MgCl2 1 mM, Calle 7: MgCl2 2 mM, Calle 8: MgCl2 5 mM, Calle 9: MgCl2 10 mM, Calle 10: Marcador con un tamaño de 10-100 nucleótidos de
55 ARN monocatenario marcado con radiactividad con isótopo de fósforo 33 (USB).
La Figura 6 muestra la formación de mapas del sitio de escisión generado por catAEA-ZfQQR, la variante GQ y la variante de GGKKQ en el ARN monocatenario de sustrato del híbrido de ADN-ARN que contiene un sitio de unión para el dedo de cinc ZfQQR. La reacción de digestión mostrada en las Calles 1-14 se realizó con 0,05 µM 60 del sustrato marcado con radiactividad, 0,5 µM de sustrato sin marcar, Tris 25 mM (pH 8,0), KCl 100 mM, DTT 2 mM, 30 min a 37 ºC con presencia o no de diferentes enzimas y presencia de concentración apropiada de MgCl2 y/o ZnSO4 20 µM como se indica a continuación. Calle 1: sustrato sin escindir, Calle 2: 35 nM de catAEA-ZFQQR, ZnSO4 20 µM, Calle 3: 50 nM de la variante GQ, MgCl2 1mM, ZnSO4 20 µM, Calle 4: 50 nM de la variante de GGKKQ, MgCl2 2 mM, ZnSO4 20 µM, Calle 5: escisión de ARNss de ribonucleasa T 1, Calle 6: La
La Figura 7 ilustra posiciones de escisión de los híbridos de ADN-ARN de sustrato que contienen el sitio de unión para el dedo de cinc ZfQQR mediante el catAEA-ZfQQR, indicado con flechas en la parte superior de la secuencia, la flecha de color negro más grande indica el sitio de escisión principal, las flechas más pequeñas indican sitios adicionales (hebra de ARN de la parte superior, la hebra de ADN de la parte inferior, el sitio de
5 unión para ZfQQR marcado con caja).
La Figura 8 ilustra posiciones de escisión de los híbridos de ADN-ARN de sustrato que contienen el sitio de unión para el dedo de cinc ZfQQR con la variante GQ del catAEA-ZfQQR, indicado con flechas en la parte superior de la secuencia, la flecha de color negro más grande indica el sitio de escisión principal, las flechas más pequeñas indican sitios adicionales (hebra de ARN de la parte superior, la hebra de ADN de la parte inferior, el sitio de unión para ZfQQR marcado con caja).
La Figura 9 ilustra posiciones de escisión de los híbridos de ADN-ARN de sustrato que contienen el sitio de unión para el dedo de cinc ZfQQR con la variante de GGKKQ del catAEA-ZfQQR, indicado con flechas en la
15 parte superior de la secuencia, la flecha de color negro más grande indica el sitio de escisión principal, las flechas más pequeñas indican sitios adicionales (hebra de ARN de la parte superior, la hebra de ADN de la parte inferior, el sitio de unión para ZfQQR marcado con caja ).
La Figura 10 muestra un diagrama que representa las diferentes etapas de una ronda del procedimiento de SELEX modificado.
La Figura 11 muestran las secuencias de moldes de oligonucleótido de ADN para obtener ARN monocatenario en el proceso de transcripción in vitro usando la T7 ARN polimerasa de bacteriófago. El molde A (SEC ID Nº: 26) contiene un sitio de unión para el dedo de cinc ZfQQR. El molde B (SEC ID Nº: 27), no contiene sitio de unión
25 para el dedo de cinc ZfQQR y tiene un sitio de escisión único para la enzima de restricción XhoI. El molde 9N (SEC ID Nº: 28), contiene nueve regiones degeneradas de nucleótidos (el nucleótido degenerado individual marcado como "N").
La Figura 12 ilustra el proceso de obtención de un híbrido de ADN-ARN. Los fragmentos de ADN se resolvieron en gel poliacrilamida de desnaturalización al 15 % que contenía urea 6 M. Los extremos en la posición 5’ de oligonucleótido de ADN con una longitud de 55 nucleótidos y el cebador 2 se marcaron con isótopo radiactivo de fósforo 33. Calle 1: 0,5 pmol del cebador 2 marcado, Calle 2: 0,25 pmol de producto de transcripción inversa, Calle 3: 0,25 pmol de oligonucleótido de ADN marcado de 55 nt.
35 La Figura 13 ilustra el proceso de obtención de un híbrido de ADN-ARN. Los fragmentos de ADN se resolvieron en gel poliacrilamida nativo al 15 %. Los extremos en la posición 5’ de oligonucleótido de ADN con una longitud de 55 nucleótidos y el cebador 2 se marcaron con isótopo radiactivo de fósforo 33. Calle 1: 0,5 pmol del cebador 2 marcado, Calle 2: 0,25 pmol de producto de transcripción inversa, Calle 3: 0,25 pmol de productos de transcripción inversa que digieren 5 unidades de ribonucleasa H, Calle 4: 0,25 pmol de productos de transcripción inversa que digieren una unidad de ribonucleasa H, Calle 5: 0,25 pmol de oligonucleótido de ADN marcado de 55 nt.
La Figura 14 muestra un gráfico de barras que ilustra el cambio en la proporción entre el ADN bicatenario que contiene un sitio de unión para el dedo de cinc ZfQQR (A) y el ADN bicatenario que no contiene un sitio de unión
45 para ZfQQR (B) en rondas sucesivas del procedimiento de SELEX ("O" significa la entrada, mezcla de partida del híbrido A con B en la proporción de 1:10000, I-V son números de rondas sucesivas).
La Figura 15 ilustra una secuencia logo derivada de 40 secuencias usando WebLogo.
La Figura 16 muestran las secuencias de los híbridos de ADN-ARN usadas para determinar la constante KD para el dedo de cinc ZfQQR, en la que la Figura 16A es un híbrido de ADN-ARN que contiene el sitio de unión que se describe en la bibliografía y la Figura 16B es un híbrido de ADN-ARN con la secuencia consenso después de cinco rondas de SELEX.
55 La Figura 17 muestra un gráfico que representa el cambio de la cantidad de sustrato marcado con radiactividad retenida en un filtro de nitrocelulosa, dependiendo de la concentración del dedo de cinc ZfQQR en la mezcla de reacción (expresado como porcentaje unido).
[0024] Los ejemplos que siguen a continuación se presentan solamente para ilustrar la invención y para explicar ciertos aspectos de la misma y no para limitar la invención, por lo tanto, no se deberían identificar con su alcance completo, que se define en las reivindicaciones adjuntas.
65 [0025] En los siguientes ejemplos, a menos que se indique de otro modo, se usan materiales y métodos
convencionales tal como se describe en Sambrook J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición. 1989. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press, o procediendo de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes para materiales y métodos específicos. Como se usa en el presente documento, a menos que se indique de otro modo con abreviaturas convencionales para aminoácidos y nucleótidos o
5 ribonucleótidos.
[0026] El vector pET15a que porta el gen rnha (SEC ID Nº:1) (la SEC ID Nº:1 es la secuencia de ADN de la RNasa HI de rnhA (ID del Gen 893801, BH0863) de B. halodurans y se obtuvo a partir de fuentes privadas. Un fragmento del gen que codifica cat (dominio catalítico) se anticipó usando la técnica de PCR en condiciones convencionales realizadas en el pET15a que portan un gen rnhA como el molde y 1 U de Phusion polimerasa (New England Biolabs) con 50 pmol de cada ADN de cebador Bhcatr (SEC ID Nº: 12) y Bhcatf (SEC ID Nº: 11) (véase la Figura 1) que codifica el fragmento del gen rnhA que corresponde a 175 -588 nucleótidos y el vector pET 30b de ADN (compañía 15 Novagen) se digirió con NdeI y KpnI (Fermentas). La mezcla de reacción que contenía el ADN se separó en gel de agarosa al 0,7 % en tampón de TAE y los fragmentos correspondientes a los tamaños esperados de 430 pb y 5313 pb, respectivamente, se volvieron a aislar a partir del gel usando un kit para reaislamiento (Gel out, A & A Biotechnology). A continuación, se volvieron a aislar 50 ng del fragmento del gen rnhA y 25 ng del vector de corte pET 30b se trataron con T4 ADN ligasa de bateriófago (Fermentas) y la ligasa se inactivó con calor. A continuación, la mezcla de ligación se usó para transformación de células bacterianas. Se transformaron bacterias competentes de
E. coli (Top 10 (Invitrogen)), con mezcla de ligación (20 -200 ng por 50 µl de células bacterianas). Los transformantes se seleccionaron en placas de LB-agar complementado con 30 µg/ml kanamicina. La selección de transformantes que contenía los recombinantes deseados se basó en análisis de mapas de restricción, y a continuación las muestras se sentenciaron para confirmar la secuencia de las construcciones.
Ejemplo 2 Clonación del gen que codifica un dedo de cinc ZfQQR para el vector de expresión pET28b
[0027] La síntesis del gen que codifica el dedo de cinc ZfQQR se encargó en Epoch’s Life Sciences (véase la SEC ID Nº: 2 que es la secuencia del ADN sintetizado de un gen de dedo de cinc ZFQQR) sobre la base de la secuencia de aminoácidos en el artículo "Shi Y, Berg JM. Specific DNA-RNA hybrid binding proteins. Science. 1995. vol. 268, 282-284). El ADN que codifica ZfQQR y el vector pET28b de ADN (compañía Novagen) se digirió con las enzimas de restricción NcoI y XhoI (las enzimas eran de la Compañía Fermentas, las reacciones se realizaron en un tampón 2X Yellow de acuerdo con las instrucciones del fabricante, 1 unidad de enzima por 1 mg de ADN durante 1 h a 37 ºC). La mezcla de reacción se separó en gel de agarosa al 0,7 % en tampón de TAE y se trató tal como en el
35 Ejemplo 1. A continuación, se ligaron 50 ng del gen de ZfQQR reaislado y 25 ng del vector pET28b digerido con T4 ADN Ligasa (Fermentas, la reacción se realizó en tampón proporcionado por el fabricante) a temperatura ambiente durante 1 hora. La ligasa se inactivó con calor mediante incubación a 75 ºC durante 10 min. A continuación, la mezcla de ligación se usó para transformar células bacterianas tal como en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3 Clonación del gen que codifica el dedo de cinc ZfQQR para el vector de expresión pET 30b que contiene un fragmento de un gen rnhA de Bacillus halodurans
[0028] Un fragmento del gen que codifica ZfQQR a partir del vector pET28b se amplificó con la técnica de PCR. La reacción se realizó en condiciones convencionales realizadas en el pET28b que el gen de ZfQQR como el molde y 1 45 U de Phusion polimerasa (New England Biolabs) con 50 pmol de cada cebador, BhZf (SEC ID Nº: 13) y Kmr (SEC ID Nº: 15) (véase la Figura 1). Un fragmento del gen que codifica el dominio catalítico de la RNasa HI en el vector pET 30b se amplificó con la técnica de PCR. La reacción se realizó en condiciones convencionales realizadas en el vector pET 30b que porta el gen de cat como el molde y 1 U de Phusion polimerasa (New England Biolabs) con 50 pmol de cada cebador Kmf (SEC ID Nº: 14) y Bhcatr (SEC ID Nº: 12) (véase la Figura 1). Los productos de PCR purificados se fosforilaron con T4 polinucleótido quinasa de bacteriófago (Fermentas). El ADN de ambas reacciones (20 ng) se combinó, se ligó y las mezclas de ligación se transformaron en células bacterianas tal como en el Ejemplo
1.
Ejemplo 4 Mutagénesis del gen que codifica la enzima de fusión que introduce sustituciones de aminoácidos 55 en las posiciones de K81A, K89E y K123A
[0029] La ligación de los fragmentos generados en el Ejemplo 3 creó una construcción en la que el marco de lectura abierto contenía al inicio una parte del gen que codifica cat y el fragmento genético que codifica ZfQQR al final. La construcción de ADN obtenida servía como un molde para introducir sustituciones usando la técnica de PCR en los nucleótidos que codifican los restos de aminoácidos en las posiciones 81, 89 y 123 de la proteína. Se introdujeron sustituciones en etapas, en primer lugar se sustituyeron los nucleótidos que codifican los restos 81 (sustitución de lisina por alanina) y 89 (sustitución de lisina por ácido glutámico), solamente después de obtener tal construcción, se realizó PCR para convertir los nucleótidos que codifican el resto en la posición 123 (sustitución de lisina por alanina). La reacción de PCR se realizó en condiciones convencionales realizadas en el pET30b que porta el gen de cat65 ZfQQR como el molde y 1 U de Phusion polimerasa (New England Biolabs) con 50 pmol de cada cebador K81Af
(SEC ID Nº: 17), K81Ar (SEC ID Nº: 16), K89Ef (SEC ID Nº: 19), K89Er (SEC ID Nº: 18), K123Af (SEC ID Nº: 21) y K123Ar (SEC ID Nº: 20) (véase la Figura1).
[0030] Los productos de PCR purificados se trataron tal como en el Ejemplo 1 y las mezclas de ligación se 5 transformaron en células bacterianas. La secuencia final del gen que codifica el catAEA-ZfQQR se muestra en la SEC ID Nº: 3 y la secuencia de aminoácidos resultante de la secuencia de proteínas se muestra en la SEC ID Nº: 4.
Ejemplo 5 Mutagénesis del gen que codifica la enzima de fusión con sustituciones de aminoácidos en las posiciones de K81A, K89E y K123A que acortar la longitud de la región conectora de interdominios
10 [0031] La construcción generada en el Ejemplo 4 porta el marco de lectura abierto que codifica el catAEA-ZfQQR en el extremo y sirvió como un molde para acortar el conector de inter dominios usando la técnica de PCR en la región que codifica el conector interdominios, 409-449, en el gen en la SEC ID Nº: 3. La reacción de PCR se realizó en condiciones convencionales realizadas en el pET30b que exporta el gen de catAEA-ZfQQR como el molde y 1 U de
15 Phusion polimerasa (New England Biolabs) con 50 pmol de cada cebador, dell 1f (SEC ID Nº: 22) y del11r (SEC ID Nº: 23) (que se usaron para generar la variante denominada GQ), o los cebadores del5f (SEC ID Nº: 24) y del5r (SEC ID Nº: 25) (que se usaron para generar la variante denominada GGKKQ) respectivamente (véase la Figura 1 para secuencias de cebadores).
20 [0032] Los productos de PCR purificados se trataron tal como en el Ejemplo 1 y las mezclas de ligación se transformaron en células bacterianas. La secuencia final del gen que codifica la variante de GQ que es el catAEA-ZfQQR con conector inter dominios acortado con un fragmento que codifica los aminoácidos en las posiciones 138148 mostrados en la SEC ID Nº: 5 y la secuencia de aminoácidos resultantes de la secuencia de proteínas mostrada en la SEC ID Nº: 6. La secuencia final del gen que codifica la variante de GGKKQ que es el catAEA-ZfQQR con el
25 conector inter dominios acortado con un fragmento que codifica aminoácidos en las posiciones 138-139 y 141-146 mostradas en la SEC ID Nº: 7 y la secuencia de aminoácidos resultante de la secuencia de proteínas mostrada en la SEC ID Nº: 8.
Ejemplo 6 Expresión y purificación de proteínas mediante cromatografía de intercambio iónico
30 [0033] Cada uno de, el plásmido pET15a con el gen que codifica la RNasa HI de longitud completa de B. halodurans, pET 30b con el gen que codifica cat, pET 30b con el gen que codifica el catAEA-ZfQQR y pET 30b con el gen que codifica la variante de GQ y pET30 con el gen que codifica la variante de GGKKQ se transformó en la cepa ER2566 de en E. coli (New England Biolabs). La expresión de proteínas se indujo con IPTG y las proteínas se
35 purificaron de acuerdo con el protocolo convencional para resina de Ni-NTA (Sigma Aldrich).
Ejemplo 7 Ensayo de actividad de nucleasa de la enzima de fusión
[0034] Se sometió a ensayo el efecto de la presencia de iones magnesio y cinc en reacción sobre la actividad y la
40 especificidad enzimática de la RNasa HI de longitud completa de B. halodurans, cat, cat-ZfQQR y catAEA-ZfQQR. El ensayo de actividad incluía la presencia de MgCl2 5 mM y/o ZnSO4 20 µM. El extremo la posición 5’ de la hebra de ARN en el sustrato de híbrido de ADN-ARN se marcó con isótopo radiactivo de fósforo 33. La reacción de digestión contenía sustrato marcado con radiactividad 0,05 µM y sustrato sin marcar 0,5 µM:
45 ARN:
ADN:
y Tris 25 mM (pH 8,0), KCl 100 mM, 5 mM MgCl2 y/o ZnSO4 20 µM, DTT 2 mM. Las reacciones contenían: 12,5 nM de la RNasa HI de longitud completa de B. halodurans, 625 nM de cat, 5 nM del cat-ZfQQR o 25 nM de catAEA
55 ZfQQR. Las reacciones de digestión se realizaron a 37 ºC y se detuvieron después de 30 min mediante la adición de formamida hasta una concentración final de un 50 %. Los productos de digestión se resolvieron en gel poliacrilamida de desnaturalización al 12 % que contenía urea 6 M (véase la Figura 3). El gel se secó en un secador de vacío y se expuso a Storage Phosphor Screens (GE Healthcare) durante una noche. El audiorradiograma se escaneo en un escáner Typhoon Trio (GE Healthcare).
En presencia de ZnSO4 20 µM, y en ausencia de MgCl2, la digestión del sustrato con el catAEA-ZfQQR genera productos de un tamaño único. La escisión en este lugar no se produce cuando tal sustrato se difiere con la RNasa HI de longitud completa de B. halodurans, cat y cat-ZfQQR.
5 [0035] Se determinó en efecto de la reducción de la longitud del conector sobre la especificidad de la escisión del sustrato con las variantes GQ y GGKKQ. Las condiciones sometidas a ensayo incluían un intervalo de concentración de iones magnesio en presencia de cinc en la reacción. El ensayo de actividad incluía la presencia de un intervalo de 0,05 mM a 10 mM de MgCl2 y ZnSO4 20 µM y composición de tampón tal como se ha mencionado anteriormente. El extremo en la posición 5’ de la hebra de ARN en el sustrato de híbrido de ADN-ARN marcado con isótopo radiactivo de fósforo 33. La reacción de digestión contenía sustrato marcado con radiactividad 0,05 µM y sustrato sin marcar 0,5 µM (Figura 2), Tris 25 mM (pH 8,0), KCl 100 mM, MgCl2 5 mM y ZnSO4 20 µM, DTT 2 mM. En la reacción, se usaron 50 nM de la variante de GQ y 50 nM de la variante de GGKKQ. Las reacciones de digestión se realizaron como anteriormente y los resultados se muestran en la Figura 4 para GQ y en la Figura 5 para GGKKQ. Para la variante de GQ del conector, la concentración óptima de Mg2+ en la reacción era 1 mM y para la variante de GGKKQ
15 era 2mM.
[0036] Para determinar de forma precisa el sitio de escisión en el sustrato de híbrido de ADN-ARN que contiene un sitio de unión para el dedo de cinc ZfQQR generado con el catAEA-ZfQQR y sus variantes de GQ y GGKKQ, los productos de escisión se separaron en un gel de poliacrilamida gel con una resolución que permitía la separación de fragmentos que diferían en un nucleótido. El extremo en la posición 5’ de la hebra de ARN en el híbrido de ADN-ARN sustrato se marcó con el isótopo radiactivo de fósforo 33. La reacción de digestión contenía sustrato marcado con radiactividad 0,05 µM y sustrato sin marcar 0,5 µM (véase la Figura 2), Tris 25 mM (pH 8,0), KCl 100 mM, ZnSO4 20 µM, MgCl2 1 mM (en el caso de la variante de GQ) y MgCl2 2 mM (en el caso de la variante de GGKKQ) y DTT 2 mM. La reacción contenía catAEA-ZfQQR 0,1 µM, 50 nM de la variante de GQ y 50 nM de la variante de
25 GGKKQ. Las reacciones de digestión se realizaron a 37 ºC y se detuvieron después de 1 h mediante la adición de formamida hasta una concentración final de un 50 %. El tamaño del marcador con fragmentos que diferían en un nucleótido se obtuvo mediante hidrólisis alcalina de acuerdo con las reacciones de Ambion (www.ambion.com). Los productos de digestión se resolvieron en gel de poliacrilamida de desnaturalización al 12 % que contenía urea 6 M (véase la Figura 6). Se formaron mapas de los fragmentos resultantes de la longitud de la secuencia identificada en la secuencia del sustrato y se determinó que el producto de escisión principal para el catAEA-ZfQQR tenía una longitud de 54 nucleótidos (véase la Figura 7). Este se ubica en la hebra opuesta a 7 nucleótidos del sitio de unión para el dedo de cinc ZfQQR. En el caso de GQ y GGKKQ, el producto de escisión principal tiene una longitud de 56 nucleótidos (véase la Figura 8 para GQ y la Figura 9 para GGKKQ) y se ubica en la hebra opuesta a 5 nucleótidos del sitio de unión para el dedo de cinc ZfQQR.
35 [0037] La nueva ribonucleasa escinde la hebra de ARN en los híbridos de ADN-ARN, y es una proteína de fusión que comprende el dominio catalítico de la ribonucleasa HI (RNasa HI) con un dominio de unión de híbrido de ADN-ARN a dedos de cinc, en la que el dominio de unión a dedo de cinc tiene la capacidad de unirse a secuencias específicas en el híbrido de ADN-ARN. Las proteínas de fusión obtenidas preferentes son catAEA-ZfQQR, GQ, GGKKQ.
[0038] No era evidente que se podría obtener una RNasa H modificada por ingeniería específica de secuencia mediante la fusión de un dominio de RNasa HI y un dedo de cinc porque el dominio de nucleasa es una enzima de procesamiento que después de la unión al sustrato se escinde múltiples veces en varios sitios del sustrato. Además,
45 como se ha descrito anteriormente, la fusión de una RNasa H sin cambiar por un dedo de cinc no permite la obtención de una enzima específica de secuencia así como la fusión del fragmento cat de la RNasa HI no permite la obtención de una enzima específica de secuencia. Sin desear quedar ligado por teoría alguna, existen algunas razones posibles para esto -la RNasa HI es una enzima de procesamiento que siempre se escindirá en múltiples ocasiones, el dedo de cinc en fusión con otros dominios no se une a su secuencia de unión en híbridos de ADN-ARN, las condiciones de escisión no eran óptimas, el dominio de cat se une al sustrato independientemente de la presencia del dedo de cinc o todas ellas eran importantes.
[0039] Además, no era evidente que las sustituciones en la región de unión al sustrato: K81A, K89E y K123A de cat condujeran a una enzima específica de secuencia. Existen varias hipótesis que pueden proporcionar una explicación
55 para la no obtención de un específico: el dominio cat se puede unir al sustrato independientemente de la presencia del dominio de cinc, o las sustituciones en la región de unión podrían haber influido en la catálisis de la enzima y haber producido una variante que es inactiva, o las sustituciones de los aminoácidos en proteínas pueden conducir a variantes que no pueden plegarse de forma apropiada y por lo tanto no son solubles. No había datos ni sugerencias disponibles en la técnica anterior que permitieran estar seguro de que la desestabilización de la unión mediante el dominio de cat permitiera obtener una enzima que se escindiera en una distancia definida desde el sitio de unión.
Ejemplo 8 Preparación de híbridos de ADN-ARN de sustrato
[0041] Estos oligonucleótido se usaron como un molde para crear una ADN bicatenario usando la técnica de PCR. La reacción se realizó en condiciones convencionales, aproximadamente 0,1 pmol de molde y 1 unidad de Phusion polimerasa (New England Biolabs) con 10 pmol de cada cebador 1 y 2:
cebador 1: AATTTAATACGACTCACTATAGGGCTCTAGATCTCACTAAGCATAG (SEC ID Nº: 33)
cebador 2: GAGATCTAGACGGAACATG (SEC ID Nº: 34)
[0042] Los cebadores 1 y 2 se usaron para la amplificación de ADN bicatenario en la reacción de PCR y el cebador 2 también se usó en la reacción de transcripción inversa.
[0043] Condiciones de reacción: desnaturalización inicial a 98 ºC durante 1 min, seguido de 15 ciclos de desnaturalización de 15 s a 98 ºC, 15 s, renaturalización a 72 ºC (una reducción de la temperatura de renaturalización con cada ciclo con 1 ºC hasta una temperatura final de 58 ºC) y 2 s de extensión a 72 ºC, seguido de 10 ciclos de desnaturalización de 15 s a 98 ºC , 15 s de renaturalización a 58 ºC y 2 s de extensión a 72 ºC. La
15 mezcla de reacción se extrajo con fenol y la fase acuosa recogida se precipitó con acetato sódico 0,5 M a pH 4,5 y etanol. El precipitado se secó al aire y se volvió a suspender en agua. Los transcritos de ARN monocatenario se obtuvieron en un molde de ADN bicatenario con la secuencia promotora para la T7 ARN polimerasa de bacteriófago usando un kit para transcripción MEGAshortscript ™ T7 (Ambion). La reacción se realizó en condiciones convencionales con 200 -500 ng de ADN. La reacción de transcripción se resolvió en gel de poliacrilamida de desnaturalización al 15 % que contenía urea 6 M y el tampón de TBE y se visualizó usando bromuro de etidio con luz UV. Una banda que correspondía a la longitud de 55 nucleótidos se escindió y la elución del ARN a partir del gel se realizó de acuerdo con procedimientos convencionales usando columnas Costar Spin X (Corning Life Sciences).
[0044] El híbrido de ADN-ARN se obtuvo en un molde de ARN monocatenario usando transcriptasa inversa con
25 actividad de RNasa H eliminada. Se incubaron 200 pmol del cebador 2 ((SEC ID Nº: 34) y 200 pmol de la hebra de ARN monocatenario durante 2 min a 70 ºC, seguido de 2 min en hielo. El molde preparado se sometió a transcripción inversa. La reacción se realizó en 40 µl en un tampón proporcionado por el fabricante, con una concentración final de mezcla de dNTP 1 mM, 200 pmol de molde hibridado con cebador, 40 unidades de RiboLock (Fermentas) y 400 unidades de RevertAid H menos Transcriptasa inversa (Fermentas) durante 2 h a 42 ºC. Los híbridos de ADN-ARN de la mezcla de reacción se separaron del tampón y los dNTP usando la resina G-25 (Sigma Aldrich) en un procedimiento convencional.
[0045] Para confirmar que el protocolo desarrollado conduce a la formación de híbridos de ADN-ARN complementarios, se realizó transcripción inversa (descripción tal como anteriormente) usando un cebador 2 35 marcado de forma radiactiva con el isótopo de fósforo 33 (SEC ID Nº: 34). La síntesis de ADN del tamaño apropiado (la longitud esperada es de 55 nucleótidos) se confirmó mediante la comparación del tamaño del ADN resultante con un control de oligonucleótido de ADN de 55 nucleótidos de longitud. Las muestras se resolvieron en gel de poliacrilamida desnaturalización al 15 % que contenía urea 6 M en el tampón de TBE (véase la Figura 12). El gel se secó en un secador de vacío y se expuso al Storage Phosphor Screens (GE Healthcare) durante una noche. El audiorradiograma se escaneo en un escáner Typhoon Trio (GE Healthcare). La creación de híbridos de ADN-ARN se confirmó mediante digestión del producto de transcripción inversa con la ribonucleasa H y mediante comparación de la migración del producto de la reacción con un control de oligonucleótido de ADN de 55 nucleótidos de longitud en gel de poliacrilamida nativo al 15 %en el tampón de TBE (véase la Figura 13). La digestión de las hebras de ARN de los híbridos de ADN-ARN se realizó en 10 µl en el tampón proporcionado por el fabricante con 1 y 5 unidades de
45 RNasa H (Fermentas) durante 30 min a 37 ºC.
Ejemplo 9 Clonación, expresión y purificación de proteína de fusión de GST con el dedo de cinc ZFQQR
[0046] Para obtener la fusión del dominio de dedos de cinc con GST, se clonó un gen que codifica ZFQQR en el vector de expresión pGEX-4T-1 (Amersham). La síntesis del gen que codifica el dedo de cinc ZfQQR se encargó en Epoch’s Life Sciences sobre la base de la secuencia de aminoácidos en el artículo "Shi Y, Berg JM. Specific DNA-RNA hybrid binding proteins. Science. 1995. vol. 268, 282-284). El ADN que codifica ZfQQR se amplificó usando la técnica de PCR. Los cebadores ZFf y ZFr se sintetizaron y se usaron para la preparación de construcción de ADN de la fusión de genes que codifican el dominio de GST y el dedo de cinc ZfQQR. La reacción se realizó en condiciones
55 convencionales y 1 unidad de Phusion polimerasa (New England Biolabs) con 50 pmol de cada cebador, ZFf y ZFr:
ZFf: GGTTCTGGTGACCCGGG (SEC ID Nº: 35)
ZFr: CGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAG (SEC ID Nº: 36)
[0047] El ADN que codifica el dedo de cinc ZfQQR y el vector pGEX-4T-1 DNA se digirieron con las enzimas de restricción SmaI y XhoI (Fermentas). La digestión de SmaI se realizó en un tampón de 1X Yellow de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Después de este tiempo, el tampón se añadió hasta una concentración final de 2X Yellow en la reacción, 1 unidad de la enzima XhoI para 1 mg de ADN durante 1 h a 37 ºC. La reacción se separó en gel de agarosa al 0,7 % en tampón de TAE y los fragmentos que correspondían a los tamaños esperados se 65 volvieron a aislar a partir del gel usando un kit para el nuevo aislamiento a partir de los geles de agarosa (Gel Out, A
& A Biotechnology). A continuación, se ligaron 50 ng del ADN aislado de nuevo que codifica el dedo de cinc ZfQQR y 25 ng del vector pGEX-4T-1 de corte con T4 ADN ligasa de bateriófago (Fermentas, la reacción se realizó en tampón proporcionado por el fabricante) a temperatura ambiente durante 1 hora. La ligasa se inactivó con calor incubando a 75 ºC durante 10 min. A continuación, la mezcla de ligación se usó a la transformación en una cepa bacteriana,
5 Top10 F, de E. coli (Invitrogen). Los transformantes se seleccionaron en 100 µg/ml de ampicilina. La selección de los transformantes adecuados que contenían los recombinantes deseados se basó en el análisis de mapas de restricción, y a continuación los clones se secuencian para confirmar la secuencia de las construcciones.
[0048] El gen pGEX-4T-1 de plásmido que codifica el dedo de cinc ZfQQR se transformó en la cepa BL21 de E. coli (DE3): (Promega). Los transformantes de un cultivo de una noche se inocularon en líquido LB con 100 mg/ml de ampicilina, y se incubaron a 37 ºC durante 2 h. Después de este periodo de tiempo, se añadió IPTG (concentración final 1 mM) y el cultivo se incubó con agitación a 25 ºC durante un periodo adicional de 5 horas. Después de la inducción, los cultivos se centrifugaron a 4000 rpm a 4 ºC durante 10 min se lavaron con 2 ml de STE, se centrifugaron a 10.000 g durante 10 min. El sedimento resultante del cultivo se volvió a suspender en 35 ml de PBS
15 y a continuación las células bacterianas se desintegraron mediante un solo pasaje a través de la prensa francesa (Constant Systems LTD) a 1360 atmósferas. Los lisados se eliminaron mediante centrifugación en la ultracentrífuga a 20 000 g a 4 ºC durante 20 min. La proteína se purificó en resina de Glutatión Sepharose (GE Healthcare) de acuerdo con procedimientos convencionales.
Ejemplo 10 Unión de proteína a híbrido de ADN-ARN, separación de híbridos sin unir y elución del complejo de proteína-híbrido de ADN-ARN a partir de la resina
[0049] La reacción de unión del híbrido de ADN-ARN con el dedo de cinc ZfQQR se realizó en 40 µl y contenía: 200 pmol de híbridos de ADN-ARN, 1 pmol de fusión de GST con el dedo de cinc ZfQQR, Tris 25 mM a pH 8,0, KCl 25 100 mM, ZnSO4 20 µM, DTT 2 mM. La reacción se realizó en temperatura ambiente durante 30 min. Después de este periodo de tiempo, la reacción se añadió a 7,5 µl de resina de Glutatión Sepharose y se incubó durante 30 min en Thermomixer compact (Eppendorf) a 22 ºC con agitación (1.400 rpm). En la siguiente etapa, la resina se lavó tres veces con 100 µl de tampón P (Tris 25 mM a pH 8,0, KCl 100 mM, ZnSO4 20 µM, DTT 2 mM), en cada ocasión, la muestra se centrifugaba a 1000 g durante 2 min a temperatura ambiente y el sobrenadante se retiraba. La siguiente etapa era la elución, que se repitió dos veces con 30 µl de tampón E y un periodo de incubación de 10 min a temperatura ambiente. Después de cada periodo de incubación, la muestra se centrifugó a 1000 g durante 2 min a temperatura ambiente y el sobrenadante se transfirió a un tubo. 5 µl del eluato que contenía la fusión de GST con el dedo de cinc finger asociado con el híbrido de ADN-ARN se sometieron a amplificación usando PCR para obtener ADN bicatenario, a continuación el ARN se transcribió y los híbridos de ADN-ARN se sintetizaron mediante
35 transcripción inversa tal como en el Ejemplo 8. El híbrido de ADN-ARN obtenido era el material de partida para la siguiente ronda de SELEX.
Ejemplo 11 SELEX de control
[0050] Un control del método SELEX se realizó en una mezcla de híbridos de ADN-ARN que contenían el sitio de unión para el dedo de cinc ZfQQR (híbrido A, se forma en un molde A de la SEC ID Nº: 26) y un híbrido, que no tiene tal sitio de unión, en lugar de un sitio de restricción de XhoI (híbrido B, se crea el molde B de la SEC ID Nº: 27). Se realizaron cinco rondas de SELEX en una combinación de control que consistía en una mezcla de los híbridos A y B en la proporción de 1:10000. Para distinguir las dos secuencias, se digirieron 100 ng de ADN resultantes de 45 amplificación con PCR del eluato después de cada ronda con 2 unidades de enzima XhoI durante 16 h a 37 ºC. Los productos de digestión se separaron en gel de poliacrilamida nativo al 15 % en el tampón de TBE. El gel se incubó 2 min en una solución de bromuro de etidio hasta una concentración final de 0,5 µg/ml. Las bandas se visualizaron con luz UV usando una cámara CCD para el archivo digital de imágenes MultiImager Fluoro-S (BioRad). La intensidad de las bandas que corresponden al tamaño del ADN sin escindir (78 pb) y los productos de digestión (55 y 23 pares de bases) se midió usando Quantity One (BioRad) y se calcularon las proporciones relativas del ADN obtenido en un molde de híbridos de ADN-ARN después de cada ronda (véase la Figura 14). Después de cinco rondas de selección con la fusión de GST y el dedo de cinc ZfQQR, las proporciones de ADN, que portan el sitio de unión para ZfQQR y sin tal secuencia, han cambiado a 1:1,7. Esto significa que mediante la realización del procedimiento de SELEX, la combinación de las secuencias de control se enriquecía 8500 veces con una secuencia unida de forma específica
55 por ZfQQR.
Ejemplo 12 en los híbridos de ARN-ADN de la biblioteca SELEX
[0051] En la siguiente etapa, la biblioteca de híbridos de ADN-ARN que contiene una secuencia aleatoria central (generada en el molde 9N -SEC ID Nº: 28) se usó para realizar el procedimiento de SELEX y determinar la preferencia de la secuencia del dedo de cinc ZfQQR tal como en el Ejemplo 11. Para determinar la secuencia de los híbridos seleccionados, se digirieron 500 ng de producto de PCR de ADN obtenido en el molde del eluato después de las cinco rondas de SELEX con 5 unidades de la enzima XbaI (Fermentas) en tampón proporcionado por el fabricante. Los productos de digestión se separaron en gel de poliacrilamida nativo al 15 % en el tampón de TBE. La 65 banda correspondiente al fragmento con una longitud de 43 pares de bases se escindió y se aisló del gel de acuerdo
con procedimientos convencionales. Para obtener concatémeros, 100 ng de fragmentos de ADN digerido se ligaron con T4 ADN ligasa de bacteriófago (Fermentas) en tampón proporcionado por el fabricante a temperatura ambiente durante 3 horas. La ligasa se inactivó con calor incubando a 75 ºC durante 10 min. Se digirieron 200 ng del vector pUC18 de plásmido de ADN (Fermentas) con la enzima XbaI en el tampón proporcionado por el fabricante durante 5 3 h a 37 ºC. La mezcla de reacción se separó en gel de agarosa al 0,7 % en TAE y los fragmentos correspondientes a los tamaños esperados se volvieron a aislar a partir del gel usando un kit para reaislamiento de geles de agarosa (Gel out, A & A Biotechnology). El vector y los concatémeros preparados de este modo se ligaron y a continuación se transformaron en una cepa bacteriana. La selección de los transformantes adecuados que contenían los recombinantes deseados se basó en un análisis del color de la colonia y secuenciaron 12 clones y se encontró que
10 contenían un total de 42 fragmentos obtenidos con el procedimiento de SELEX como se indica en la Tabla 2.
Tabla 2. Las secuencias obtenidas en el procedimiento de SELEX adquiridas después de la secuenciación del ADN obtenido en un molde de híbrido de ADN-ARN al final de cinco rondas del procedimiento de SELEX modificado realizado en el dedo de cinc ZfQQR y una biblioteca de secuencias que contiene 9 regiones degeneradas de nucleótidos.
- Número
- Secuencia de la biblioteca Número Secuencia de la biblioteca
- 1
- TGGGGACGC 22 GTCAGATGT
- 2
- AGTGCTCGA 23 GAGATCAGT
- 3
- GACGCATGG 24 GCCGAGCGG
- 4
- GGTCTGGAG 25 GCTCGGTGA
- 5
- GAGCGGGAA 26 CGTAGGGAA
- 6
- TCGTTGCAT 27 GTCGGATGG
- 7
- CTAGCGGGT 28 CAGCGGGGT
- 8
- GCCAGCGAG 29 GGGGGGAGG
- 9
- AGAGGGGCA 30 TCGGCCAAG
- 10
- TGGCAGGTT 31 CATGTGTTG
- 11
- GGGTGGGAG 32 GACTGTAGA
- 12
- GGTCCGGGC 33 CTGCCTGAA
- 13
- CTCCGATCA 34 CGGCGGAGA
- 14
- GCAAATGAA 35 CGTACAAGG
- 15
- GGGCGGCGT 36 GGTGGTTGA
- 16
- ACTCTGAGA 37 ATCAGGGGG
- 17
- TGGGAATGG 38 TTGGCGGGG
- 18
- AGCGGAGGG 39 GGGGTCCGA
- 19
- GGATGGAAA 40 GAGAGAGCG
- 20
- GGGCTGTCA 41 TGGCAGCTT
- 21
- ACTCCTGAG 42 CGAGATGGA
Ejemplo 13 Unión del dedo de cinc ZFQQR a la secuencia consenso de SELEX
[0052] Sobre esta base, la secuencia consenso de unión a ZFQQR, 5’-GGNCGGNGGG-3’ (Figura 15), se obtuvo usando WebLogo (Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE WebLogo: A sequence logo generator, Genome Research, 14: 1188-1190, (2004), Schneider TD, Stephens RM. 1990. Sequence Logos: A New Way to Display
20 Consensus Sequences. Nucleic Acids Res. 18: 6097-6100).
[0053] Para confirmar que la secuencia consenso, obtenida después de cinco rondas de SELEX, se une mediante el
25 dedo de cinc, se midió una constante KD usando el método de unión a filtro de nitrocelulosa. El ensayo se realizó con sustratos marcados con radiactividad que se describen en la bibliografía (LDNA, LRNA) y con una secuencia consenso (CDNA, CRNA), véase la Figura 16:
LDNA: TCACTGGGGAAGAAGAATCCTC (SEC ID Nº: 29)
LRNA: GAGGAUUCUUCUUCCCCAGUGA (SEC ID Nº: 30)
CDNA: TCACTGGTCGGTGGGAATCCTC (SEC ID Nº: 31)
CRNA: GAGGAUUCCCACCGACCAGUGA (SEC ID Nº: 32)
5 [0054] La reacción de unión contenía 2 nM de sustrato marcado, 2 µg de poli dI-dC como un competidor no específico, Tris 25 mM a pH 8,0, KCl 100 mM, ZnSO4 20 µM, DTT 2 mM. La reacción de unión se incubó durante 30 min a temperatura ambiente y a continuación se filtró inmediatamente a través de un filtro de nitrocelulosa y se lavó con 8 volúmenes de tampón de reacción de Tris 25 mM a pH 8,0, KCl 100 mM, ZnSO4 20 µM, DTT 2 mM. La medida de la intensidad de la señal que proviene de la retención de sustrato marcado con radiactividad se realizó en un audiorradiograma del filtro de nitrocelulosa usando un escáner Typhoon Trio y el software ImageQuant TL. Las constantes de unión KD se midieron y para ambos sustratos eran similares, 188 ± 38 nM para la unión del sustrato que se describe en la bibliografía y 155 ± 32 nM para la secuencia consenso de SELEX (Figura 17).
SEC ID Nº: 1 -secuencia de ADN del gen rnhA de ribonucleasa HI (ID del Gen 893801, BH0863) de B.
halodurans (longitud completa);
SEC ID Nº: 2 -secuencia de nucleótidos del dedo de cinc ZfQQR;
SEC ID Nº: 3 -secuencia de nucleótidos de un gen que codifica la fusión enzimática que contiene un fragmento
de la ribonucleasa HI de B. halodurans con las sustituciones K81A, K89E y K123A con el dedo de cinc ZfQQR denominada catAEA-ZfQQR;
SEC ID Nº: 4 -secuencia de fusión de aminoácidos que contiene un fragmento de ribonucleasa HI de B.
25 halodurans con las sustituciones K81A, K89E, K123A y con el dedo de cinc ZfQQR-denominada catAEA-ZfQQR; SEC ID Nº: 5-secuencia de nucleótidos del gen que codifica la variante GQ de catAEA-ZfQQR (la fusión enzimática que contiene un fragmento de ribonucleasa HI de B. halodurans con sustituciones que introducen cambios en la secuencia de aminoácidos de proteína en las posiciones K81A, K89E y K123A con el conector interdominios de dedo de cinc ZfQQR acortado con un fragmento que codifica los aminoácidos en las posiciones 138-148) -denominada GQ; SEC ID Nº: 6 -secuencia de aminoácidos de la variante GQ de catAEA-ZfQQR, la fusión enzimática denominada GQ; SEC ID Nº: 7 -secuencia de nucleótidos de la variante GGKKQ de catAEA-ZfQQR (fusión enzimática que
35 contiene un fragmento de ribonucleasa HI de B. halodurans con sustituciones que introducen cambios en la secuencia de aminoácidos de proteína en las posiciones K81A, K89E y K123A con el dedo de cinc ZfQQR con el conector interdominios con un fragmento que codifica los aminoácidos en las posiciones 138-139 y 141-146)denominada GGKKQ; SEC ID Nº: 8 -secuencia de aminoácidos de la variante GGKKQ de la función enzimática -denominada GGKKQ; SEC ID Nº: 9-hebra de ARN del sustrato que contiene la secuencia de unión para ZfQQR; SEC ID Nº: 10 -hebra de ADN del sustrato que contiene la secuencia de unión para ZfQQR; SEC ID Nº: 11 -secuencia de nucleótidos del cebador Bhcatf; SEC ID Nº: 12 -secuencia de nucleótidos del cebador Bhcatr; SEC ID Nº: 13 -secuencia de nucleótidos del cebador BhZf;
45 SEC ID Nº: 14 -secuencia de nucleótidos del cebador Kmf; SEC ID Nº: 15 -secuencia de nucleótidos del cebador Kmr; SEC ID Nº: 16 -secuencia de nucleótidos del cebador K81 Ar; SEC ID Nº: 17 -secuencia de nucleótidos del cebador K81 Af; SEC ID Nº: 18 -secuencia de nucleótidos del cebador K89Er; SEC ID Nº: 19 -secuencia de nucleótidos del cebador K89Ef; SEC ID Nº: 20 -secuencia de nucleótidos del cebador K123Ar; SEC ID Nº: 21 -secuencia de nucleótidos del cebador K123Af; SEC ID Nº: 22 -secuencia de nucleótidos del cebador del11f; SEC ID Nº: 23 -secuencia de nucleótidos del cebador del11r;
55 SEC ID Nº: 24 -secuencia de nucleótidos del cebador del5f; SEC ID Nº: 25 -secuencia de nucleótidos del cebador del5r; SEC ID Nº: 26 -secuencia de la hebra de ADN del sustrato usado para control del método de SELEX que contiene el sitio de unión para ZfQQR (Molde A); SEC ID Nº: 27 -secuencia de la hebra de ADN del sustrato usado para control del método SELEX que no tienen un sitio de unión para ZfQQR, en su lugar tiene un sitio de restricción XhoI (Molde B); SEC ID Nº: 28 -secuencia de la hebra de ADN del sustrato usado para la construcción de la biblioteca de híbridos de ADN-ARN que contiene una secuencia aleatoria nonanucleótido central (Molde 9N); SEC ID Nº: 29 -secuencia de nucleótidos de la hebra de ADN del híbrido de ADN-ARN que contiene la secuencia de unión a ZfQQR usada para la determinación de KD;
65 SEC ID Nº: 30 -secuencia de nucleótidos de la hebra de ARN del híbrido de ADN-ARN que contiene la
secuencia de unión de ZfQQR usada para la determinación de KD;
SEC ID Nº: 31 -secuencia de nucleótidos de la hebra de ADN del híbrido de ADN-ARN que contiene la
secuencia consenso deducida a partir de SELEX usada para la determinación de KD;
SEC ID Nº: 32 -secuencia de nucleótidos de la hebra de ARN del híbrido de ADN-ARN que contiene la
5 secuencia consenso deducida a partir de SELEX usada para la determinación de KD; SEC ID Nº: 33 -cebador 1 -cebador usado para la amplificación del ADN de los moldes A, B y 9N en la reacción de PCR; SEC ID Nº: 34 -cebador 2 -cebador usado para la amplificación del ADN de los moldes A, B y 9N en la reacción de PCR;
10 SEC ID Nº: 35 -cebador ZFf -cebador usado en PCR para la preparación de la construcción de ADN del gen de fusión que codifica el dominio GST y el gen que codifica el dedo de cinc Zf-QQ; SEC ID Nº: 36 -cebador ZFr -cebador usado para la preparación de la construcción de ADN del gen de fusión que codifica el dominio GST y el gen que codifica el dedo de cinc Zf-Q; SEC ID Nº: 37-es la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la fusión del dominio GST y el gen que
15 codifica el dedo de cinc ZfQQR (GST-ZfQQR de fusión).
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> IBMIK
<120> Ribonucleasa H modificada por ingeniería específica de secuencia y el método para determinar la
preferencia de secuencia de proteínas de unión de híbrido de ADN-ARN 25
<130> PZ/1574/AGR/PCT
<160> 37
30 <170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 688
<212> ADN 35 <213> Bacillus halodurans
<400> 1
- 40
- <210> 2
- <211> 305
- <212> ADN
- <213> artificial
- 45
- <220>
- <223> Secuencia de nucleótidos ZfQQR
- <400> 2
- 50
<210> 3
<211> 720
5 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> secuencia de nucleótidos -fusión catAEA-ZfQQR 10
<400> 3
<210> 4
<211> 240
<212> PRT
<213> artificial 20
<220>
<223> secuencia de fusión de aminoácidos de catAEA-ZfQQR
<400> 4 25
<210> 5
<213> artificial
<220>
<223> secuencia de nucleótidos -fusión de la variante GQ de catAEA-ZfQQR 10
<400> 5
<210> 6
<213> artificial
<220>
<223> secuencia de aminoácidos -fusión de la variante GQ de catAEA-ZfQQR 10
<400> 6
<210> 7
<213> artificial
<220>
<223> secuencia de nucleótidos -fusión de la variante GGKKQ de catAEA-ZfQQR 10
<400> 7
15 <210> 8
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
<223> secuencia de aminoácidos -fusión de la variante GGKKQ de catAEA-ZfQQR
<400> 8
<210> 9
<213> Artificial
<220>
<223> hebra de ARN que contiene la secuencia de unión para ZfQQR 10
<400> 9
<210> 10
<211> 74
<212> ADN
5 <213> artificial
<220>
<223> hebra de ADN del sustrato que contiene la secuencia de unión para ZfQQR
10 <400> 10
- 15
- <210> 11 <211> 32 <212> ADN <213> artificial
- 20
- <220> <223> cebador
- <400> 11 gacgcatatg gcaaaagagg agattatttg gg 32
- 25
- <210> 12 <211> 26 <212> ADN <213> artificial
- 30
- <220> <223> cebador
- 35 40
- <400> 12 gtggtacctt ttctcccgta atcggc 26 <210> 13 <211> 17 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cebador
- 45
- <400> 13 ggttctggtg acccggg 17
- 50
- <210> 14 <211> 21 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> cebador
- 55
- <400> 14 gggatcgcag tggtgagtaa c 21
- 60
- <210> 15 <211> 26 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> cebador
- 5
- <400> 15 cgggaaaaca gcattccagg tattag 26
- 10
- <210> 16 <211> 23 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> cebador
- 15
- <400> 16 ccgtctggga atcagaatag atc 23
- 20
- <210> 17 <211> 27 <212> ADN <213> artificial
- 25
- <220> <223> cebador <400> 17 caatcgcatg ggtgaaggat aaaaaag 27
- 30
- <210> 18 <211> 21 <212> ADN <213> artificial
- 35
- <220> <223> cebador
- <400> 18 ctgctttttt atccttcacc c 21
- 40
- <210> 19 <211> 27 <212> ADN <213> artificial
- 45
- <220> <223> cebador
- 50 55
- <400> 19 caatcgcatg ggtgaaggat aaaaaag 27 <210> 20 <211> 24 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cebador
- 60
- <400> 20 taagatgggc gtttcatagg tatg 24
- 65
- <210> 21 <211> 20 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> cebador
- 5
- <400> 21 gcatggcaga ccgataagtg 20
- 10
- <210> 22 <211> 25 <212> ADN <213> artificial
- 15
- <220> <223> cebador <400> 22 ggctccggcc agcacgcgtg cccgg 25
- 20
- <210> 23 <211> 31 <212> ADN <213> artificial
- 25
- <220> <223> cebador
- <400> 23 agaaccgctc ccgtaatcgg ccttaatttc c 31
- 30
- <210> 24 <211> 21 <212> ADN <213> artificial
- 35
- <220> <223> cebador
- 40 45
- <400> 24 caaaaaacag cacgcgtgcc c 21 <210> 25 <211> 25 <212> ADN <213> artificial <220> <223> cebador
- 50
- <400> 25 cccccgtaat cggccttaat ttccc 25
- 55
- <210> 26 <211> 78 <212> ADN <213> artificial
- <220> <223> contiene el sitio de unión para ZfQQR
- 60
- <400> 26
<210> 27
<211> 78
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> no contiene el sitio de unión para ZfQQR
<400> 27
<210> 28 15 <211> 78
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> Molde con secuencia aleatoria nonanucleótido
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(30) 25 <223> n es a, c, g o t
<400> 28
<210> 29
<211> 22
<212> ADN
<213> artificial 35
<220>
<223> hebra de ADN del híbrido de ADN-ARN
<400> 29
tcactgggga agaagaatcc tc 22
<210> 30
<211> 22
<212> ARN 45 <213> artificial
<220>
<223> hebra de ARN del híbrido ADN-ARN
<400> 30
gaggauucuu cuuccccagu ga 22
<210> 31
<211> 22 55 <212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> hebra de ADN del híbrido ADN-ARN
<400> 31
tcactggtcg gtgggaatcc tc 22
<210> 32
5 <211> 22
<212> ARN
<213> artificial
<220>
<223> hebra de ARN del híbrido ADN-ARN
<400> 32
gaggauuccc accgaccagu ga 22
15 <210> 33
<211> 46
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> iniciador
<400> 33
aatttaatac gactcactat agggctctag atctcactaa gcatag 46 25
<210> 34
<211> 19
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> iniciador
<400> 34 35 gagatctaga cggaacatg 19
<210> 35
<211> 17
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> iniciador
45 <400> 35 ggttctggtg acccggg 17
<210> 36
<211> 26
<212> ADN
<213> artificial
<220>
<223> iniciador 55
<400> 36
cgggaaaaca gcattccagg tattag 26
<210> 37
<211> 975
<212> ADN
<213> artificial
<220> 65 <223> fusión del dominio GST y dedo de cinc ZfQQR
<400> 37
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Una ribonucleasa, que escinde la hebra de ARN en híbridos de ADN-ARN, en la que dicha ribonucleasa es unaproteína de fusión que comprende 5 un derivado del dominio catalítico de la ribonucleasa HI (RNasa HI),en la que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI es de Bacillus halodurans, que comprende el polipéptido codificado por los nucleótidos 175 a 588 del gen rnhA mostrado en la SEC ID Nº: 1, y en la que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI comprende al menos una sustitución de un residuo de10 aminoácido en el dominio de unión al sustrato seleccionada entre: K81A, K89E y K123A en referencia a la secuencia del polipéptido codificada por la SEC ID Nº: 1, preferentemente contiene todas las sustituciones K81A, K89E y K123A en referencia a la secuencia del polipéptido codificada por la SEC ID Nº: 1, y en la que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI no comprende dominio de unión a híbrido de RNasa HI,15 con un dominio de unión de dedo de zinc híbrido de ADN-ARN, en el que el dominio de unión de dedo de zinc tiene la capacidad de unirse a una secuencia específica en el híbrido de ADN-ARN.
- 2. La ribonucleasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el dominio de dedo de zinc es un derivado del dedo20 de cinc ZfQQR, preferentemente un polipéptido codificado por los nucleótidos de 19 a 303 de la secuencia ZfQQR que se muestra en la SEC ID Nº: 2.
- 3. La ribonucleasa de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, que comprende una proteína de fusión catAEA-ZfQQRcomo se muestra en la SEC ID Nº: 4, o una proteína de fusión GQ como se muestra en la SEC ID Nº: 6, o 25 comprende una proteína de fusión GGKKQ como se muestra en la SEC ID Nº: 8.
-
- 4.
- Una composición que comprende la ribonucleasa de acuerdo con las reivindicaciones 1-3.
-
- 5.
- Uso de una ribonucleasa de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 o de una composición de acuerdo con la
30 reivindicación 4 para la escisión in vitro de la hebra de ARN en híbridos de ADN-ARN, preferentemente en el que la escisión de la hebra de ARN en híbridos de ADN-ARN se localiza a 2-16 nucleótidos, preferentemente a 5-7 nucleótidos, del sitio de unión para el dedo de zinc. - 6. Un método para obtener una variante modificada por ingeniería de la RNasa HI que escinde la hebra de ARN en 35 híbridos de ADN-ARN que comprende las siguientes etapas:a) obtener un derivado del dominio catalítico de la RNasa HI, en el que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI es de Bacillus halodurans, que comprende el polipéptido codificado por los nucleótidos 175 a 588 del gen rnhA que se muestra en la SEC ID Nº: 1, y40 en el que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en el dominio de unión al sustrato seleccionada entre: K81A, K89E y K123A en referencia a la secuencia del polipéptido codificada por la SEC ID Nº: 1, preferentemente contiene todas las sustituciones K81A, K89E y K123A en referencia a la secuencia del polipéptido codificada por la SEC ID Nº: 1, y en el que el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI no comprende dominio de unión a híbrido de RNasa45 HI, b) obtener una RNasa HI modificada por ingeniería mediante la preparación de una proteína de fusión que comprende el derivado del dominio catalítico de la RNasa HI obtenido en la etapa a) con un dominio de unión de dedo de zinc que tiene la capacidad de unirse a secuencias específicas en el híbrido de ADN-ARN, preferentemente en el que el dominio de dedo de zinc es un derivado del dedo de zinc ZfQQR, preferentemente50 un polipéptido codificado por los nucleótidos de 19 a 303 de la secuencia ZfQQR que se muestra en la SEC ID Nº: 2.REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓNEsta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las 5 referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.Documentos de patentes citados en la descripciónLiteratura diferente de patentes citada en la descripción
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