JPH09505728A - フラボバクテリウム・オケアノコイテス(foki)制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン - Google Patents

フラボバクテリウム・オケアノコイテス(foki)制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン

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JPH09505728A
JPH09505728A JP7510290A JP51029095A JPH09505728A JP H09505728 A JPH09505728 A JP H09505728A JP 7510290 A JP7510290 A JP 7510290A JP 51029095 A JP51029095 A JP 51029095A JP H09505728 A JPH09505728 A JP H09505728A
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チャンドラセガラン、スリニバサン
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ザ・ジョンズ − ホプキンス・ユニバーシティー
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    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract

(57)【要約】 発明者等は、FokI制限エンドヌクレアーゼの認識ドメインおよび開裂ドメインを同定した。従って、本発明はFokI制限エンドヌクレアーゼの認識ドメインおよび開裂ドメインの夫々をコードするDNAセグメントに関する。41 kDaのN末端フラグメントはFokI制限エンドヌクレアーゼの認識ドメインを構成し、41 kDaのC末端フラグメントはFokI制限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインを構成する。本発明はまた、他の酵素の認識ドメインに連結されたFokI制限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインを含むハイブリッド制限酵素に関する。このようなハイブリッド制限酵素の一つは、Ubx−FNである。この酵素は、FokIの開裂もしくはヌクレアーゼドメインに連結されたUbxのホメオドメインを含んでいる。加えて、本発明はFokIエンドヌクレアーゼの二つの挿入変異体の構築に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 フラボバクテリウム・オケアノコイテス(FOKI) 制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン 〔発明の背景〕 1.発明の技術分野 本発明はFokI制限エンドヌクレアーゼ系に関する。特に、本発明はこの 制限エンドヌクレアーゼ系の分離した機能ドメインをコードするDNAセグメン トに関する。 本発明はまた、FokIエンドヌクレアーゼの二種類の挿入変異体の構築に関 する。 加えて、本発明は超双胸系(Ultrabithorax)UbxホメオドメインをFokI の開裂ドメイン(FN)に連結することによって製造されるハイブリッド酵素( Ubx−FN)に関する。 2.従来技術 II型エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼ(modification methylase)は 、二本鎖DNA中の特定の配列を認識するバクテリア酵素である。このエンドヌ クレアーゼはDNAを開裂するのに対し、該メチラーゼはアデニン残基またはシ トシン残基をメチル化して宿主ゲノムを開裂から保護する[II型制限酵素および 修飾酵素;「ヌクレアーゼ」(Mordrich and Roberts編);ニューヨーク、コー ルドスプリングハーバーラボラトリーズ社刊;第109〜154頁;1982年]。これら の制限−修飾(R−M)系は、この系がなけれ ば細胞を破壊するようなファージおよびプラスミドによる感染から、細胞を保護 するように機能する。 200以上の特異性を有する2500もの制限酵素が検出され、生成されている(Wil son and Murray,Annu.Rev.Cenet.25:585-627,1991)。これら殆どの酵素の 認識部位は、4〜6塩基対の長さである。ファージゲノムは通常は小さく、また ファージにはこれらの小さい認識部位が高頻度で存在するから、認識部位の大き さがこのように小さいことは有益である。 IIS型のクラスに属する、35以上の特異性をもった80の異なるR−M系が同 定されている。このクラスは、酵素の開裂部位が認識配列から離れている点にお いて特徴的である。通常、認識部位と開裂部部位との間の距離は極めて正確であ る(Szybalski et al.,Gene,100:13-26,1991)。これら全ての酵素のうち、 FokI制限エンドヌクレアーゼは、最も良く特徴が調べられているIIS型ク ラスの酵素である。このFokIエンドヌクレアーゼ(RFokI)は、二本鎖 DNAにおける非対称なペンタヌクレオチド、即ち、一方の鎖の5′−GGAT G−3′(配列番号1)および他方の鎖の3′−CCTAC−5′(配列番号2 )を認識し、該認識部位から離間した部位に千鳥状(段違い)の開裂を導入する (Sugisaki et al.,Gene 16:73-78; 1981)。これとは対照的に、FokIメチ ラーゼ(MFokI)はDNAを修飾することにより、該DNAを、FokIエ ンドヌクレアーゼによる消化に対して耐性にする。このFokI制限遺伝子およ びFokI修飾遺伝子はクローン化され、そのヌクレオチド配列が推定されてい る(Kita et al.,J.of Biol.Chem.,264:575-5756,1989)。にもかかわらず 、FokI制限エンドヌクレアーゼのドメイン構造は、3ドメイン構造が示唆さ れてはいるが(Wilson and Murray,Annu.Rev.Genet.25.585-627)、未だ未 知のままである。 〔発明の概要〕 従って、本発明の一つの目的は、IIS型制限エンドヌクレアーゼの単離され たドメインを提供することである。 本発明の他の目的は、ゲノムのマッピングおよび配列決定に有用なハイブリッ ド制限酵素を提供することである。 本発明の更なる目的は、野生型酵素に比較して、認識部位から開裂部位までの 距離が増大された、FokIの二つの挿入変異体を提供することである。この二 つの変異体を構築するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が利用される。 本発明の他の種々の目的および利点は、添付の図面および以下の説明から明ら かになるであろう。 一つの態様において、本発明は、IIS型エンドヌクレアーゼの配列特異的認 識活性を含んだIIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメインをコードするDNA セグメント;並びにIIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだIIS型エ ンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードするDNAセグメントに関する。 他の態様において、本発明は、実質的にFokI制限エンドヌクレアーゼのN 末端または認識ドメインからなり、且つ 前記エンドヌクレアーゼの配列特異的認識活性を有する単離されたタンパク;ま たは実質的にFokI制限エンドヌクレアーゼのC末端または触媒ドメインから なり、且つ前記エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を有する単離されたタン パクに関する。 更なる態様において、本発明はDNA構築物であって、IIS型エンドヌクレ アーゼの開裂活性を含むIIS型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードす る第一のDNAセグメントと;前記IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン 以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと;ベクタ ーとを含んだDNA構築物に関する。この構築物において、第一のDNAセグメ ントおよび第二のDNAセグメントは動作可能にベクターに連結されて、ハイブ リッド制限酵素を産生するようになる。上記の連結は共有結合を介して行われる 。 本発明のもう一つの態様は、原核細胞であって、IIS型エンドヌクレアーゼ の開裂活性を含んだIIS型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第 一のDNAセグメントと;前記IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外 の配列特異的認識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと;ベクターと を含む原核細胞に関する。第一のDNAセグメントおよび第二のDNAセグメン トは、単一のタンパクが産生されるように、動作可能に前記ベクターに連結され る。第一のDNAセグメントは、例えばFokIの触媒ドメイン(FN)をコー ドしてもよく、また第二のDNAセグメ ントは、例えばUbxのホメオドメインをコードしてもよい。 他の態様において、本発明は、ハイブリッド制限酵素であって、IIS型エン ドヌクレアーゼの開裂活性を含むIIS型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインを 含んでおり、該触媒ドメインは、この触媒ドメインの取得源であるIIS型エン ドヌクレアーゼ以外の酵素またはタンパクの認識ドメインに連結されているハイ ブリッド制限酵素に関する。 更に別の態様において、本発明はDNA構築物であって、IIS型エンドヌク レアーゼの開裂活性を含んだIIS型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコー ドする第一のDNAセグメントと;前記IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメ イン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと;前 記第一のDNAセグメントおよび前記第二のDNAセグメントの間に挿入された 、1以上のコドンを含む第三のDNAセグメントと;ベクターとを含んだDNA 構築物に関する。好ましくは、前記第三のセグメントは4または7のコドンを含 んでいる。 他の態様において、本発明は原核細胞であって、IIS型エンドヌクレアーゼ の開裂活性を含んだIIS型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第 一のDNAセグメントと;前記IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外 の配列特異的認識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと;前記第一の DNAセグメントおよび前記第二のDNAセグメントの間に挿入された、1以上 のコドンを含む第三のDNAセグメントと;ベクターとを含んだ原核細胞に関す る。 〔図面の簡単な説明〕 図1は、PCR増幅の際に、fokIMおよびfokIR遺伝子への新しい翻 訳信号の導入のために用いられる、5′プライマーおよび3′プライマーの配列 (配列番号3−9)を示している。SDは、大腸菌(E.colj)のためのシャイン −ダルガノコンセンサス配列RBSを示しており、該RBSは7塩基対のスペー サによってATG開始コドンから離間されている。fokIMプライマーはBa mHI部位に隣接している。開始コドンおよび停止コドンは太字で示されている 。18塩基対の完全な配列は、MfokI遺伝子の停止コドンの直後に続く配列に 対して相補的である。 図2は、プラスミドpACYCMfokIM、pRRSRfokIRおよびpCBfokIRの構造を示して いる。PCR修飾されたfokIM遺伝子がpRRSおよびpCBのBamHI 部位に挿入されて、それぞれpRRSRfokIRおよびpCBfokIRが形成された。pRRS はlacUV5プロモータを有しており、またpCBは強力なtacプロモータ を含んでいる。加えて、これらのベクター類は、挿入されたfokIR遺伝子の 下流に陽性レトロ調節配列を含んでいる。 図3は、FokIエンドヌクレアーゼを精製する際の各工程における、SDS (0.1%)−ポリアクリルアミド(12%)ゲル電気泳動のプロファイルを示してい る。レーン1はタンパク標準;レーン2は非誘発細胞からの粗抽出物;レーン3 は1mMのIPTGで誘発された細胞からの粗抽出物;レーン4 はホスホセルロースのプール;レーン5は、50-70%の(NH42SO4分画プー ル;レーン6はDEAEプールである。 図4は、オリゴヌクレオチドDNA基質、d-5′-CCTCTGGATGCTCTC-3′(配列 番号10):5′-GAGAGCATCCAGAGG-3′(配列番号11)の存在下でFokIエ ンドヌクレアーゼをトリプシン消化した際の、種々の時点におけるトリプシン分 解フラグメントのSDS(0.1%)−ポリアクリルアミド(12%)ゲル電気泳動 プロファイルを示している。レーン1はタンパク標準、レーン2はFokIエン ドヌクレアーゼであり、またレーン3は2.5分、レーン4は5分、レーン5は10 分、レーン6は20分、レーン7は40分、レーン8は80分、レーン9は160分のト リプシン消化後のプロファイルを示している。レーン10〜13は、HPLC精製さ れたトリプシン分解フラグメントであり、レーン10は41kDaのフラグメント、 レーン11は30 kDaのフラグメント、レーン12は11 kKaのフラグメント、レー ン13は25k Daのフラグメントである。 図5は、オリゴdT-セルロースカラムを用いた、DNA結合性トリプシン分 解フラグメントの同定を示している。レーン1はタンパク標準;レーン2はFo kIエンドヌクレアーセ;レーン3は、FokI−オリゴ複合体の10分間のトリ プシン分解混合物;レーン4は、オリゴdT-セルロースカラムに結合したトリ プシン分解フラグメント;レーン5は、FokI−オリゴ複合体の160分間のト リプシン分解混合物;レーン6は、オリゴdT-セルロースカラムに結合したト リプシ ン分解フラグメントである。 図6は、FokIエンドヌクレアーゼのトリプシン分解フラグメントの開裂特 性分析を示している。 (A)トリプシン分解フラグメントの開裂特性を、アガロースゲル電気泳動に よって分析した。10mMのトリスHCl(pH8)、50mMのNaCl、1mMのDTTおよび10mMのM gCl2の中の1μgのpTZ19Rを、当該フラグメント(夫々トリプシン消化物、ブレ ークスルーおよび溶出物)と共に、37℃で1時間、10μlの反応容量で消化した 。レーン4〜6は、MgCl2の不存在下におけるFokI−オリゴ複合体のト リプシン消化に対応する。レーン7〜9は、MgCl2の存在下におけるFok I−オリゴ複合体のトリプシン消化に対応する。レーン1は1 kbのラダー(梯 子);レーン2はpTZ19R;レーン3はFokIエンドヌクレアーゼで消化された pTZ19R;レーン4および6は、FokI−オリゴ複合体のトリプシン消化物の反 応混合物;レーン5および7は、ブレークスルー容積中の25 kDaのC末端フラグ メント;レーン6および9は、DEAEカラムに結合したFokIのトリプシン分解 フラグメントである。ゲル底部における強いバンドは、過剰のオリゴヌクレオチ ドに対応する。 (B)DEAEカラム〜のフラグメントのSDS(0.1%)−ポリアクリルアミ ド(12%)ゲル電気泳動のプロファイル。レーン3〜5は、MgCl2の不存在下 におけるFokI−オリゴ複合体のトリプシン消化に対応している。レーン6〜 8は、10mMのMgCl2の存在下におけるFokI−オリゴ 複合体のトリプシン消化に対応している。レーン1はタンパク標準;レーン2は FokIエンドヌクレアーゼ;レーン3および6はFokI−オリゴ複合体のト リプシン消化物の反応混合物;レーン4および7はブレークスルー容積中の25kD aのC末端フラグメント;レーン5および8はDEAEカラムに結合したFok Iのトリプシン分解フラグメントである。 図7は、41kDaのN末端DNAによるDNAの配列特異的結合の、ゲル移動度 シフト試験を用いた分析を示している。交換反応のために、この複合体(10μl )を、10mMのトリスHCl(pH8)、50mMのNaCl、および10mMのMgCl2を含む20μl容 量において、1μlの32Pで標識された特異的(または非特異的)なオリゴヌク レオチド二本鎖と共に、時間を種々に変化させて37℃でインキュベートした。32 Pでラベルされた1μlの特異的プローブ[d-5′-CCTCTGGATGCTCTC-3′(配列 番号10):5′-GAGAGCATCCAGAGG-3′(配列番号11)]は、12ピコモルの二 本鎖および略50×103cpmを含んでいた。また、32Pで標識された1μlの特異的 プローブ[d-5′-CCTCTGGATGCTCTC-3′(配列番号10):5′-GAGAGCATCCAGAGG- 3′(配列番号11)]には、12ピコモルの二本鎖および略25×103cpmが含まれ ていた。(A)レーン1は特異的なオリゴヌクレオチド二本鎖;レーン2は41kD aのN末端フラグメント−オリゴ複合体;レーン3および4は、当該複合体とと もに夫々30分間および120分間インキュベートされた特異的プローブである。( B)レーン1は非特異的なオリゴヌクレオチド二本鎖;レーン2は41kDaのN末 端フラグメント −オリゴ複合体;レーン3および4は、当該複合体とともに夫々30分間および12 0分間インキュベートされた非特異的プローブである。 図8は、FokIエンドヌクレアーゼのトリプシン分解の種々の時点における 、トリプシン分解物のSDS(0.1%)−ポリアクリルアミド(12%)ゲル電気泳 動プロファイルを示している。10mMのトリスHCl(pH8)、50mMのNaCl、および10mM のMgCl2を含む最終容量200μl中の酵素(200μg)を、室温においてトリプシ ンで消化した。FokIに対するトリプシンの比率は、重量比で1:50であっ た。一部分(28μl)を異なった時間間隔で反応混合物から取り出し、過剰のア ンチペイン(antipain)で急冷した。レーン1はタンパク標準;レーン2はFo kIエンドヌクレアーゼである。また、それぞれレーン3は2.5分;レーン4は5 .0分;レーン5は10分;レーン6は20分;レーン7は40分;レーン8は80分;レ ーン9は160分のトリプシン消化である。 図9は、FokIエンドヌクレアーゼのトリプシン分解地図を示している。( A)オリゴヌクレオチド基質の不存在下におけるFokIエンドヌクレアーゼの 断片形成パターン。(B)オリゴヌクレオチド基質の存在下におけるFokIエ ンドヌクレアーゼの断片形成パターン。 図10は、PREDICTプログラムを用いた一次配列決定(配列番号31)に基づ く、FokIの推定二次構造を示している。DNA基質の存在下におけるFok Iのトリプシン開裂部位が矢印で示されている。KSELEEKKSEL配列が強調されて いる。図中の記号は次の通りである:hはヘリックス;sはシート;はランダ ムコイル。 図11は、FokIの挿入変異体の構築に用いた5′および3′オリゴヌクレ オチドプライマーの配列(それぞれ配列番号32、配列番号33、配列番号34 、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38および配列番号3 9)を示している。4コドン挿入物および7コドン挿入物が太字で示されている 。アミノ酸配列がヌクレオチド配列の上に示されている。両挿入変異体のPCR 増幅において、同一の3′プライマーが用いられた。 図12は、均一に精製された変異体酵素のSDS/PAGEプロファイルを示 している。レーン1はタンパク標準;レーン2はFokI:レーン3は4コドン 挿入物を含む変異体FokI;レーン4は7コドン挿入物を含む変異体FokI である。 図13は、上記変異体酵素におけるDNA配列特異性の分析を示している。D NA基質を、37℃で2時間、10mMトリスHCl pH8.0/50mM NaCl/1mM DTT/10mM M gCl2の中で消化した。 (A)1%アガロースゲル電気泳動による、pTZ19RDNA基質の開裂パターン 。夫々の反応において、2μgのpTZ19RDNAを用いた。レーン1は、1キロ塩 基(kb)のラダー;レーン2はpTZ19R;レーン3は、FokIで消化したpTZ1 9R;レーン4は、4コドン挿入物を含む変異体FokIで消化したpTZ19R;レー ン5は、7コドン挿入物を含む変異体FokIで消化したpTZ19Rである。 (B)1.5%アガロースゲル電気泳動によって分析された、単一のFokI部 位を含む256kbのDNA基質の開裂パターン。1μgの放射能ラベルした基質 (ここの鎖に32Pラベルを施した)を、上記のようにして消化した。アガロース ゲルを臭化エチジウムで染色し、UV光で可視化した。レーン2〜6は、5′− CATCC−3′鎖が32Pでラベルされた32Pラベル基質に対応する。レーン7 〜11は、5′−GGATG−3′鎖が32Pでラベルされた32Pラベル基質に対 応する。レーン1は、1キロ塩基(kb)のラダー;レーン2および7は、32P でラベルした250kbのDNA基質;レーン3および8は、FokIで開裂され た32Pラベル化基質;レーン4および9は、精製された実験室的野生型(Iaborat ory wild-type)のFokI;レーン5および10は、4コドン挿入物を含む変異 体FokI;レーン6および11は、7コドン挿入物を含む変異体FokIであ る。 (C)上記で得たアガロースゲルのオートラジオグラフ。レーン2〜11は、 上記の(B)と同じである。 図14は、FokIおよび上記変異体酵素による認識部位から開裂部位までの 距離の分析を示している。pTZ19RをテンプレートとしたDNA配列決定のために 、非隣酸化オリゴヌクレオチドが用いられた。そのシーケンシング生成物(G, A,T,C)を7M尿素を含む6%アクリルアミドゲル上で電気泳動させ、該ゲ ルを乾燥させた。次いで、その生成物をX線フィルムに2時間露光させた。100 bpおよび256bpのDNA基質からの開裂生成物が、AおよびBにそれぞれ示 されている。Iは、5′−GGATG−3′鎖における32Pラベルを含む基質に 対応している。また、IIは5′−CATCC−3′鎖における32Pでラベルを 含む基質に対応している。レーン1はFokI;レーン2はFokI;レーン3 は4コドン挿入を含む変異体FokI;レーン4は7コドン挿入を含む変異体F okIである。 図15は、単一のFokI部位を含む100bpのDNA基質に基づく、Fok Iおよび変異体酵素の開裂部位の地図を示している。(A)は野生型FokI; (B)は4コドン挿入を含む変異体FokI;(C)は7コドン挿入を含む変異 体FokI(配列番号40参照)である。開裂部位は矢印で示しされている。主 要な開裂部位は大きな矢印で示してある。 図16は、DNA基質に関連させた、FokIヌクレアーゼドメイン(FN) に対するUbxホメオドメインの向きを示す図を表している。尖った波形に縁取 りされた(engrailed)ホメオドメイン−DNA複合体の結晶構造が、Kissinger e t al.(Cell 63:579-90(1990))によって報告されている。 図17は、Ubx−FNハイブリッド酵素の発現ベクターの構築を示している 。(A)ハイブリッド遺伝子のUbx−FNの構築に用いた5′プライマーおよ び3′プライマーの配列。このUbxプライマーは、PstIおよびSpeIに 隣接している(配列番号41および配列番号42を参照のこと)。Ubx−FN プライマーは、NdeIおよびBamHI部位に隣接している(配列番号43お よび配列番号44を参照のこと)。開始コドンおよび終止コドンは太字で示さ れている。(B)プラスミドpRRS・Ubx−FNおよびpET−15b・U bx−FNの構造。pRRSfokIRのPstI/SpeIフラグメントを、 PCR修飾されたUbxホメオボックスで置換して、pRRS・Ubx−FNを 作製した。Ubx−FNプライマーを用いたPCRで作製されたフラグメントを pET−15bのBamHI/NdeI部位に挿入して、pET−15b・Ub x−FNを形成した。 図18は、Ubx−FNハイブリッド酵素の精製における各工程でのSDS/ PAGEプロファイルを表している。レーン1はタンパク標準;レーン2は誘発 された細胞からの粗抽出物;レーン3はHis−bindTM樹脂プール;レーン 4はホスホセルロースのプール;レーン5はDEAEプールである。 図19は、Ubx部位を含む線形化下pUC13・DNA基質を用いた、Ub x−FNハイブリッドタンパクの特徴付けを示している。(A)pUC由来のD NA基質。□は、Ubx部位、即ち5′−TTAATGGTT−3′を含む30b pの挿入物である。これらの基質における30bp挿入物のタンデムリピート(tan dem repeats)の数が、括弧内に示されている。Ubx部位の向きは矢印で示され ている。(B)20mM Tris.HCl(pH7.6),75mM KCl,1mM DTT,50μg/ml tRNAお よび2mM MgCl2を含む緩衝溶液中において、31℃で4〜5時間、上記のDNA基 質(1μg)を部分的に消化した。生成物を1%アガロースゲル電気泳動によっ て分析した。基質 は、Ubx−FNハイブリッドタンパクに比較して大過剰(略100:1)で存在し た。反応条件は、基質分子当たり一つの二本鎖開裂を生じるように最適化された 。この反応は酵素濃度を増大させて進行させるか、或いは31℃で一晩消化するこ とによって完結される(データは示していない)。新たに挿入されたpUC13 のUbx部位でのハイブリッド酵素の結合と、該部位の近傍での開裂によって生 じた二つのフラグメント、即ち略1.8kbおよび略0.95kbのフラグメントが矢 印で示されている。 図20は、Ubx−FNによる認識部位から開裂部位までの距離の分析を示し ている。(G+A)マクサム−ギルバートの配列決定反応(Maxam-Gilbert seque ncing reaction)に従った、単一のUbx部位を含む32PでラベルされたDNA 基質のUbx−FNよる開裂生成物を、6M尿素を含む6%ポリアクリルアミド ゲル上での電気泳動により分離し、乾燥し、X線フィルムに対して6時間露光さ せた。(A)は、5′−TAAT−3′鎖(配列番号45を参照のこと)での32 Pラベルを含む基質からの開裂生成物に対応している。レーン1は(G+A)配 列決定反応;レーン2はUbx−FNである。(B)は相補鎖、即ち5′−AT TA−3′(配列番号46を参照のこと)での32Pラベルを含む基質に対応して いる。レーン1は(G+A)配列決定反応であり;レーン2はUbx−FNであ る。(C)は、単一のUbx部位を含むDNA基質に基づく、Ubx−FN開裂 部位の地図である。認識部位は白抜き文字によって示されている。プリン残基は によって示されている(配列番号47および配列番号48を参照のこと)。 〔発明の詳細な説明〕 本発明は、FokI制限エンドヌクレアーゼの機能ドメインの同定および特徴 付けに基づいている。本発明に至る実験において、FokI制限エンドヌクレア ーゼは2ドメイン系であり、その一つのドメインは配列特異的認識活性を有する のに対して、他方のドメインはヌクレアーゼ開裂活性を含んでいることが見出さ れた。 このFokI制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖DNA中の非パリンドローム 配列である5′−GGATG−3′(配列番号1):5′−CATCC−3′( 配列番号2)を認識し、該認識部位から9/13ヌクレオチド下流を開裂させる 。このDNAヘリックスの1回転には10塩基対を必要とするので、発明者は、 該酵素は一点で結合することによってDNA面と相互作用し、該ヘリックスの次 の回転の他点で切断するのあろうと仮定した。これは、離間した二つのタンパク ドメイン(即ち、一つはDNAの配列特異的認識のためのドメイン、他の一つは エンドヌクレアーゼ活性のためのドメイン)の存在を示唆している。この仮定さ れた2ドメイン構造は、本発明に至る研究によって、FokIエンドヌクレアー ゼ系の正しい構造であることが示された。 従って、一態様において、本発明は、FokI制限エンドヌクレアーゼのN末 端(好ましくは、該タンパクの2/3に当たるN末端部分)をコードするDNA セグメントに関する。 このセグメントは、当該エンドヌクレアーゼの配列特異的認識活性を有するタン パクをコードする。即ち、このコードされたタンパクは、二本鎖DNA中の非パ リンドローム配列であるd−5′−GGATG−3′(配列番号1):5′−C ATCC−3′(配列番号2)を認識する。好ましくは、本発明のこのDNA背 具塩とは、FokIエンドヌクレアーゼのアミノ酸1-382をコードする。 更なる態様において、本発明はFokI制限エンドヌクレアーゼのC末端をコ ードするDNAセグメントに関する。本発明のこのDNAセグメントによってコ ードされるタンパクは、FokI制限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ開裂活 性を有している。好ましくは、本発明のDNAセグメントはFokIエンドヌク レアーゼのアミノ酸383-578をコードする。本発明のDNAセグメントは、当該 技術において公知の方法、例えばゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフ ィー、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、またはこれらの組合せを用いて、生物 学的サンプルから容易に単離することができる。更に、本発明のDNSセグメン トは、当該技術において標準的な方法を用いて、化学的に合成することができる 。 本発明はまた、本発明のDNAセグメントによってコードされるタンパクに関 する。従って、他の態様において、本発明は実質的にFokIエンドヌクレアー ゼのN末端からなり、当該酵素の配列特異的認識活性を保持しているタンパクに 関する。本発明のこのタンパクは、2-メルカプトエタノールの存在下でのSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定さ れた約41キロドルトンの分子量を有している。 更なる態様において、本発明は、実質的にFokI制限エンドヌクレアーゼの C末端(好ましくは該タンパクのC末端部分1/3)からなるタンパクに関する 。2-メルカプトエタノールの存在下でのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動 で測定したとき、このタンパクの分子量は約25キロドルトンである。 本発明のタンパクは、当該技術分野において周知の方法によって、生物学的サ ンプルから単離または精製することができる。例えば、このタンパクはFokI 制限エンドヌクレアーゼを単離し、開裂することによって得ることができる。或 いは、hんは津名のタンパクは化学的に合成し、または組換えDNA技術を用い て製造し、精製することができる。 本発明のDNAセグメントは、他のDNA結合性タンパクドメインをFokI のヌクレアーゼ若しくは開裂ドメインと結合することにより、「ハイブリッド」 タンパクを作製するために使用することができる。これは組換えDNA技術によ ると同様、化学的にも達成することができる。このようなキメラハイブリッド酵 素は新規な配列特異性を有し、ヒト、マウスおよび植物のような様々な種におけ るゲノムの生理的マッピングおよび配列決定のために有用である。例えば、この ような酵素はヒトゲノムのマッピングにおける使用に適しているであろう。また 、これらの加工されたハイブリッドエンドヌクレアーゼは、ゲノムDNAの取り 扱いを容易にし、タンパク構造およびタンパク設計に関して価値のある情報を提 供するであろう。 このようなキメラ酵素はまた、組換えDNA技術および分子生物学において価 値のある研究手段である。現在のところ、4〜6塩基対のカッターおよび幾つか の8塩基対カッターが商業的に入手可能であるに過ぎない。(>6塩基対を切断 する商業的に入手可能な約10種類のエンドヌクレアーゼが存在している。)他 のDNA結合性タンパクをFokIのヌクレアーゼドメインに結合させることに よって、DNA中の7塩基対以上を認識する新規な酵素を作製することができる 。 従って、更なる態様においては、本発明はDNA構築物と、その中に暗号化さ れているハイブリッド制限酵素に関する。本発明のDNA構築物は、FokI制 限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインをコードする第一のDNAセグメ ントと、配列特異的認識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと、ベク ターとを含んでいる。第一のDNAセグメントおよび第二のDNAセグメントは 、これらセグメントを発現してキメラ制限酵素を生じることができるように、動 作可能にベクターに連結される。この構築物は、プロモータ(例えば、T7、t ac、trpおよびlac・UV5プロモータ)、転写ターミネータまたはレト ロ調節因子類(retroregulators)(例えば、ステムループ(stem loop))のような 調節因子を含むことができる。ホスト細胞(E.coliのような原核細胞)は、本 発明のDNA構築物で形質転換して、キメラ制限酵素の製造に用いることができ る。 本発明のハイブリッド酵素は、他の酵素またはDNA結合 性タンパク(例えば6塩基対を認識する、天然に存在するDNA結合性タンパク )に結合されたFokIのヌクレアーゼドメインから構成されている。適切な認 識ドメインとしては、ジンクフィンガーモチーフの認識ドメイン;ホメオドメイ ンモチーフ;POUドメイン(真核転写レギュレータ、例えば、Pit1、Oc t2およびunc86);ラムダリプレッサ・lacリプレッサ、cro、ga l4の他のDNA結合性タンパクドメイン;myc、junのような発癌遺伝子 のDNA結合性タンパクドメイン;および>6塩基対を認識する他の天然に存在 する配列特異的なDNA結合性タンパクが挙げられるが、これらに限定されるも のではない。 本発明のハイブリッド制限酵素は、当業者が公知の方法論を用いて製造するこ とができる。例えば、該酵素は化学的に合成することができ、或いは当該技術に おいて周知の組換えDNA技術を用いて製造することができる。本発明のハイブ リッド酵素は、本発明のDNA構築物を含むホスト細胞(HB101、RR1、 RB791およびMM294を培養し、当該タンパクを単離することによって製 造することができる。更に、当該ハイブリッド酵素は、当該技術で公知の普通の 連結技術、例えばEDC/NHS、DSP等のようなタンパク架橋剤を用いて、 例えばFokIのヌクレアーゼドメインを認識ドメインに連結することによって 、化学的に合成することができる。 本発明に従って作製することができ、従って本発明の一つの態様である特別な ハイブリッド酵素は、Ubx−FNであ る。このキメラ制限エンドヌクレアーゼは、UbxホメオドメインをFokIの 開裂ドメイン(FN)に連結することによって製造することができる。精製に続 いて、当該ハイブリッド酵素の特性を分析した。 FokI制限エンドヌクレアーゼは以下の実験において研究された酵素である が、他のタイプのIISエンドヌクレアーゼ類(例えば表2に掲載したもの)は 、本発明に基づいて当業者が容易に測定できるであろう同様の2ドメイン構造用 いて機能するであろうことが期待される。 最近、ストレプトコッカス・サングイス(Streptococcussanguis)から、Sts I、即ちFokIのヘテロ分裂体(heteroschizomer)が単離された(Kita et al. ,Nucleic AcidResearch 20(3),618,1992)。このStsIは、FokIと同 じ非パリンドロームのペンタデオキシリボヌクレオチド、即ち、5′−GGAT G−3′:5′−CATCC−3′を認識するが、該認識部位の10/14ヌク レオチド下流を開裂する。このStsI・RM系はクローニングされ、配列決定 されている(Kita et al.,Nucleic Acid Research 20(16)4167-72,1992)。二 つのエンドヌクレアーゼであるFokIとStsIの間に、顕著なアミノ酸配列 の相同性(略30%)が検出された。 本発明の他の態様は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いた、FokIエ ンドヌクレアーゼの二つの挿入変異体の構築に関する。特に、この態様にはDN A構築物であって、IIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだIIS型エ ンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のDNAセグメントと;前記 IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコ ードする第二のDNAセグメントと;1以上のコドンを含む第三のDNAセグメ ントとを含んだDNA構築物に関する。第三のDNAセグメントは、第一のDN Aセグメントおよび第二のDNAセグメントの間に挿入される。この構築物はベ クターをも含んでいる。上記のIIS型エンドヌクレアーゼは、FokI制限エ ンドヌクレアーゼである。 適切な認識ドメインとしては、ジンクフィンガーモチーフ;ホメオドメインモ チーフ;POUドメイン;リプレッサのDNA結合性ドメイン;発癌遺伝子のD NA結合性メイン;および>6塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的 なDNA結合性タンパクが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 上記で述べたように、FokI制限エンドヌクレアーゼの認識ドメインはFo kIエンドヌクレアーゼのアミノ末端に存在するのに対して、開裂ドメインは、 おそらくは該分子のカルボキシ末端側1/3(thecarboxyl terminal third of t hemolecule)に存在する。上記のドメインはリンカー領域によって結合され、こ れによってDNA基質の認識部位と開裂部位との間の距離が決定される。このF okIのリンカー領域は、DNA基質の存在下においてトリプシンにより開裂し 、41kDaのアミノ末端フラグメント(DNA結合性ドメイン)および25 kDa のカルボキシ末端フラグメント(開裂ドメイ ン)を生じ易い。一次アミノ酸配列に基づくFokIの二次構造予測はこの仮説 を支持している(図10参照)。この予測された構造は、認識ドメインと開裂ド メインとの連結部における、長く伸びたアルファヘリックス領域を明らかにして いる。このヘリックスは多分、該酵素の二つのドメインを結合するリンカーを構 成している。こうして、認識部位からのFokIの開裂距離はこのスペーサ(ア ルファヘリックス)の長さを変化させることによって変更できるであろうことが 教示された。アルファヘリックスの1回転(one turn)には3.6のアミノ酸が必要 とされるから、この領域に4コドンまたは7コドンを挿入することによって、天 然の酵素に存在しているヘリックスは夫々1回転または2回転だけ延長されるで あろう。このヘリックス領域のアミノ酸配列を詳細に検査することによって、ア ミノ酸EEKで離間された二つのKSEL反復の存在(図10)が明らかになった (配列番号21参照)。KSELセグメント(4コドン)(配列番号22参照) およびKSELEEK(7コドン)(配列番号23参照)は、このヘリックスを 夫々1回転および2回転だけ延長するためにヘリックス中に挿入するための良好 な選択であると思われる。(実施例XおよびXIを参照のこと)こうして、変異 体酵素を作製するために遺伝子工学が利用された。 特に、これらの変異体は1以上、好ましくは4または7のコドンをFokIの 認識ドメインと開裂ドメインとの間に挿入することによって得られる。より特定 的には、当該エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド1152に4 コドンおよび7コドンが挿入される。この変異体は、野生型酵素と同様のDNA 配列特異性を有している。しかしながら、野生型酵素と比較すると、これらは、 DNA基質の両鎖の認識部位から更に離間した一つのヌクレオチドを開裂する。 100bpフラグメントの開裂に基づくFokIおよび変異体の切断部位の分析 が、図15に纏めてある。FokIの認識部位と開裂部位との間に4(または7 )コドンを挿入すると、認識部位から開裂部位までの距離の増加が伴う。この情 報は、FokIエンドヌクレアーゼ内に、二つの離間したタンパクドメイン(一 つは配列特異的認識部位であり、他方はエンドヌクレアーゼ活性である)が存在 することを更に支持する。この二つのドメインは、DNA基質の認識部位と開裂 部位との間の距離を決定するリンカー領域によって結合される。この酵素のモジ ュール構造は、他のDNA結合性タンパクをFokIエンドヌクレアーゼの開裂 ドメインに連結することによって、異なった配列特異性のキメラエンドヌクレア ーゼを構築することが容易であろうことを示唆している。 上述した情報の観点から、本発明の他の態様には、原核細胞であって、IIS 型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだIIS型エンドヌクレアーゼの触媒ド メインをコードする第一のDNAセグメントと;前記IIS型エンドヌクレアー ゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のDNAセグ メントと;1以上のコドンを含む第三のDNAセグメントとを含んだ原核細胞が 含まれる。第三のDNAセグメントは、第一のDNAセグメントおよび第二のD NAセグメントの間に挿入される。また、この細胞はベクターをも含んでいる。 加えて、前記第一のDNAセグメント、前記第二のDNAセグメントおよび前記 第三のDNAセグメントは、単一のタンパクが産生されるように前記ベクターに 対して動作可能に連結される。前記第三のセグメントは、実質的に4または7の コドンからなっていてもよい。 また、本発明には上記で述べた原核細胞によって産生されるタンパクが含まれ る。特に、この単離されたタンパクは実質的に、FokI制限エンドヌクレアー ゼの認識ドメインと、FokI制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインと、前記 第三のDNAセグメントに存在するコドンによってコードされるアミノ酸とから なっている。 以下の制限的でない実施例は、本発明をより詳細に説明するために与えられる ものである。 〔実施例〕 実施例I FokIRM系のクローニング FokI系を、変更表現型を選択する事によってクローンした。フラボバクテ リウム・オケアノコイテス(Flavobacterium okeanokoites)株DNAを、カゼ ルタら(Caserta et al.,J.Biol.Chem.,262:4770-4777,1987)によって記 載された方法によって単離した。数個のフラボバクテリウム・オケアノコイテス のゲノムライブラリーを、プラスミドpBR322及びpUC13中に、クロー ニング酵素PstI、BamHI及びBglIIを使用して構築した。 プラスミド・ライブラリーDNA(10μg)を、100ユニットのFokIエ ンドヌークレアーゼで消化し、FokIM+表現型を発現するプラスミドを選択 した。 生存プラスミドをRRI細胞にトランスフォーム(形質転換)し,形質転換物 細胞を適切な抗生物質を含むプレート上で選択した。生化学的濃縮を二回行なっ た後、fokIM+表現型を発現する数個のプラスミドをこれらのライブラリー から同定した。これらのクローン由来のプラスミドは、Foklによる消化に対 して完全に抵抗性を示した。 F.オケアノコイテスのpBR322 PstIライブラリーから分析して得 られた8つの形質転換物の内、二つは,fokIM遺伝子を担持していたようで あり、これらに由来するプラスミドは、5.5kbのPstI断片を含んでいた 。F.オケアノコイテスのpBR322 BamHIライブラリーからピックア ップされた8つの形質転換物の内、二つは,fokIM遺伝子を担持していたよ うであり、これらに由来するプラスミドは、18kbのBamHI断片を含んで いた。pUC13中のF.オケアノコイテスのゲノムBglIIライブラリーか ら分析された8つの形質転換物の内、6つが、fokIM遺伝子を担持していた ようであり、これらのクローンの内3つが、8kbのBglII挿入物を担持し 、残りは16kbのBglII断片を担持していた。 これらのクローンについてのファージλのプレーテイング効率から、これらの クローンもまた、fokIR遺伝子を担時している事が示唆される。8kbのB glII挿入物を担 持するクローンは、ファージ感染に一番抵抗性を示したようだ。更に,FokI エンドヌークレアーゼ活性が、ホスホセルロース・カラムで、部分精製を行った 後のこのクローンの粗抽出物中で検出された。このクローン由来のプラスミド、 pUCfokIRMを選んで、更に特徴付けを行った。 5.5kb PstI断片を、M13ファージにトランスファーし、この挿入 物の部分的ヌクレオチド配列を、サンガーのシークエンス法(Sanger et al.,P NAS USA ,74:5463-5467,1977)を使用して決定した。FokIRM系の完全なヌ クレオチド配列は、別の研究室(Looney et al.,Gene,80:193-208,1989; Kita et al.,Nucleic Acid Res.,17:8741-8753,1989;Kita et al.,J.Biol.Chem 264:5751-5756,1989)によって公表されている。 実施例II ポリメラーゼ・チエイン・リアクションを使用した FokIエンドヌクレアーゼの 効率的過剰生産者クローンの構築 PCRテクニックを使用してfokIR遺伝子を囲む転写及び翻訳信号を変更し 、大腸菌における過剰発現を遂行した(Skoglund et al.,Gene,88:1-5,1990) 。fokIR及びfokIM遺伝子に先行するリボソーム結合部位を変更し、共 通する大腸菌信号に適合させる。 PCR反応において、BamHIで直線化されたプラスミドpUCfokIR M DNAが、テンプレートとして使用された。PCR反応物(100μl)に は、0.25nmol の各プライマー、50 μMの各dNTP、10 mM Tris.HCl(pH 8.3、25℃)、50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.01%(w /v)ゼラチン、1 ngのテンプレートDNA、5ユニットのTaq DNAポ リメラーゼが含まれていた。fokIR及びfokIM遺伝子の増幅に使用され るオリゴプライマーを、図1に示す。反応混合物(4重に行なう)上に鉱物油を 載置し、パーキン・エルマー・シータス(Perkin-Elmer-Cetus)熱サイクラーを使 用して反応を実施した。 最初のテンプレート変性は2分間とプログラムされた。その後、サイクルプロ フィルは、37℃で2分(アニーリング)、72℃で5分(伸張)、94℃で1分 (変性)というようにプログラムされた。このプロフィルを25サイクル繰り返 し、最後の72℃伸張を10分まで延長した。反応混合物の水層をプールし、1 :1フェノール/クロロフォルムで一回、クロロフォルムで二回、抽出した。D NAをエタノールで沈澱させ、20μlのTE緩衝液[10mM Tris.H Cl(pH7.5)、1mM EDTA]で再懸濁した。次に、DNAを適切な 制限酵素で切断して付着末端を生成し、ゲル精製を行なった。 過剰生産者クローンの構築は、二段階で行なわれた。はじめに、fokIM遺 伝子を含むPCR産生DNAをNcoIで消化し、ゲル精製を行った。次に、該 DNAをNcoI切断し、脱リン酸化されたpACYC184に連結し、該組替 DNAは、マニアチス(Maniatis et al.,Molecular Cloning. A Iaboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,N Y, 1982).等に記載の様に受容可能状態(コンピテント)にした大腸菌PB79 1igまたはRRI細胞にトランスフェクトされた。Tc選択後、数個のクロー ンをピックアップし、プラスミドDNAを制限分析にかけ、fokIM遺伝子断 片がベクターのクロラムフェニコールのプロモーターに対して正しい方向で存在 しているかどうかについて調べた(図2参照)。該プラスミドは、FokIメチ ラーゼを構成的に発現する。これは、fokIR遺伝子を、適合性プラスミドの ホスト中に導入する際のホストの染色体切断を防ぐ。それ故、これらのクローン 由来のプラスミドDNAは、FoKI消化に対して、抵抗性がある。 次に、PCRで産生されたfokIR断片は、BamHIに切断され、 脱リン酸化された高発現ベクターpRRSまたはpCBに連結された。pRRS は、lac UV5 プロモータ及び強tacプロモータを含むpCBを担持して いる。加えて、これらのベクターは、挿入されたfokIR遺伝子のバチルス・ サーリンジェンシス(Bacillus Thuringiensis)下流の結晶タンパク質をコード する遺伝子に由来する陽性レトロ調節ステップループ配列を含んでいる。 該組替DNAを受容可能な大腸菌RB791ig[pACYCfokIM]ま たは、RRI[pACYCfokIM]細胞にトランスフェクトした。Tc及び Ap抗生物質選択をした後、数個のクローンをピックアップして、プラスミドD NAを制限分析にかけ、fokIR遺伝子がベクター・プロ モータからの発現について正しい配向にあるかどうかについて調べた。次に、こ れらの構築物の酵素産生について調べた。 酵素を産生するために、プラスミド含有RB791igまたは、RR1細胞を 、37℃で、20μgTc/ml(pUCfokIRMプラスミド以外)及び5 0μgAp/mlを補給した2倍濃縮のTY培地[1.6%トリプトン、1%酵 素抽出物、0.5%NaCl(pH7.2)]中で、振盪しなが生育させた。細 胞密度がO.D.600=0.8に達した時、IPTGを濃度1mMまで加えた 。該細胞を、振盪しながら一晩(12時間)インキュベートした。図2に示すよ うに、両構築物はFokIを全細胞蛋白の5−8%のレベルまで産生した。 実施例III FoKIエンドヌクレアーゼの精製 シンプルな3段階精製法を使用して、電気泳動法的に均質なFokIエンド ヌクレアーゼを得た。RRI[pACYCfokIM、pRRSfokIR]を 、37℃で、20μgTc/ml及び50 μg/Ap mlを含む2倍濃縮のT Y61中で、A600=0.8まで生育させ、1mM IPTGで、一晩誘導し た。遠心分離によって細胞を収穫し、50 mM NaClを含む250mlの緩 衝液A[10 mM Tris燐酸(pH8.0)、7 mM 2ーメルカプトメタ ノール、1mM EDTA、10% グリセロール]中に再懸濁した。 該細胞を、ブランソン(Branson)超音波器で、最高強度、一時間4℃で破砕し た。超音波破砕された細胞は12、00 0g、2時間、4℃で、遠心分離された。上澄液を、50 mM NaClを含む 緩衝液Aで、1Lまで希釈した。上澄液を、50mM NaClを含む緩衝液A で予め平衡化された10mlのホスホセルロース(Whatman)カラムに充填した。 該カラムを、50mlのローデイグ緩衝液で洗浄し、蛋白を緩衝液中、0.05 Mから0.5MのNaClの80ml全勾配で抽出した。各画分は、A280吸 光でモニターされ、SDS(0.1%)ポリアクリルアミド(12%)ゲル(Lae mmli,Nature 222,:680-685,1970)上の電気泳動法で分析された。蛋白は、コマ シアン・ブルーで染色された。 各分画の制限エンドヌクレアーゼ活性を、pTZ19Rを基質として使用して 分析した。FokIを含む各分画はプールされ、燐酸アルミニウムで分画された 。50−70%の硫酸アルミニウム分画は、FokIエンドヌクレアーゼを含有 していた。沈澱物は、25 mM NaClを含む緩衝液50ml中に再懸濁され 、DEAEカラムに充填された。多くの不純蛋白はDEAEに結合するのに対し て、FokI結合しない。流出液は燐酸セルロースカラムで濃縮した。ゲルろ過 (AcA44)カラムを使用して精製が更になされた。FokIは、本方法を使 用して、電気泳動的に均質になるまで、精製された。 各精製段階に存在する蛋白種のSDS(0.1%)ポリアクリルアミド(12 %)ゲル電気泳動プロフィルを、図3に示す。精製された酵素の最初の10アミ ノ酸の配列が、蛋白のシークエンスのより決定された。決定された配列は、ヌク レオチド配列から推定されたものと同じであった。精製された酵素の結晶を、P EG4000を沈澱剤として使用して、成長させた。FokIエンドヌクレアー ゼは、AcA44ゲルろ過カラムを使用して、さらに精製された。 実施例IV DNA基質の存在下における トリプシン開裂によるFokIRエンドヌクレアー ゼの分析 トリプシンはセリン・プロテアーゼであり、リジン及びアルギニン残基のC末 端で開裂する。これは、蛋白及び酵素のドメイン構造を研究するのに大変有用な 酵素である。FokIのトリプリン消化は、その基質、d-5′-CCTCTGGATGCTCTC- 3′(配列認識番号10):5′-GAGAGCATCCAGAGG-3′(配列認識番号11)の存在 下で、オリゴヌクレオチド二量体:FokI分子比=2.5:1で、実施された 。FokI(200μg)をオリゴヌクレオチド二量体と一緒に、10 mM T ris・HCl、50 mM NaCl、10%グリセロール、10 mM MgC l2、を含む容積180μl中で、室温にて1時間インキュベートした。トリプ シン(20 μl、0.2 mg/ml)を、混合物中に添加した。反応混合物か らアリコット(28μl)を別々の時間間隔をおいてとり、過剰のトリプシン阻 害剤、アンチパインでクエンチングした。該トリプシン断片を、逆層HPLCで 精製し、そのN末端配列を、Applied Biosystemの自動蛋白シークエンサーを使 用して決定した。 2.5モル過剰オリゴヌクレオチド基質、10 mg MgC12、存在下にお けるFokIエンドヌークレアーゼのトリプシン消化の時間経過が、図4に示さ れる。2.5分時点で、完全なFokI以外、わずか二つの主要断片、41kD a,25kDa断片のみが存在していた。さらにトリプシンで消化すると、41 kDa断片は、30kDa、11kDa断片に分解される。この25kDaの断 片は、更にこれ以上のトリプシン消化に対して抵抗性があるようだ。この断片は 、もしFokI−オリゴ複合体のトリプシン消化をMgCl2非存在下で実施し たとしたら、もっと不安定であっただろう。 160分時点では、わずか3つの主要断片(30、25、および11kDa) が存在していた。これらの断片(41、30、25、11kDaの各々は、逆層 HPLCで精製され、そのN末端のアミノ酸配列が決定された(表1)。これら のN末端配列を、FokIの推定配列と比較する事によって、41kDa及び2 5kDa断片は、それぞれN末端及びC末端の断片と同定された。加えて、30 kDaは、N末端であると同定された。 実施例V オリゴdTセルロース親和性カラムを使用した FokIエンドヌクレアーゼの DNA結合トリプシン断片の単離 トリプシン断片のDNA結合性を、オリゴdTセルロース・カラムを使用して 分析した。FokI(160μg)を2.5モル過剰オリゴヌクレチドニ量体[ d-5'- CCTCTGGATGCTCTC(A)15-3′(配列認識番号14):5′-GAGAGCATCCAGAGG(A)1 5-3′(配列認識番号15)と一緒に、10 mM Tris・HCl(pH8) 、50 mM NaCl、10%グリセロール、10mM MgCl2を含む容積9 0 μl中で、室温にて1時間インキュベートした。トリプシン(10 μl、0 .2mg/ml)を該溶液に添加して消化を開始した。トリプシンとFokIの 割合は、重量で1:80であった。消化を10分間実施し、反応液中に41kD a N末端断片及び25 kDa C末端断片を優占的に得た。反応物を大過剰の アンチパイン(10μg)で、クエンチングし、ローデイング緩衝液[10 m M Tris・HCl(pH8.0)、1 mM EDTA、10 mM MgCl2 、]で、最終容積が400μlとなるまで希釈した。 該溶液を、オリゴdTセルロース・カラム(0.5ml、Sigma,カタログ#0 -7751)に充填し、ローデイング緩衝液で前平衡化した。該ブレイクスルーを、 オリゴdTセルロース・カラムに6回通した。該カラムを5mlカラムローデイ ング緩衝液で洗浄し、次に、0.4mlの10mM Tris.HCl(pH8 .0)、1 ml EDTAで二回抽出した。これらの各分画は、オリゴヌクレオ チドDNA基質に結合しているトリプシン断片を含んでいた。オリゴdTセルロ ースカラムに結合しているトリプシン断片は、SDSポリアクリルアミド・ゲル 電気泳動で分析された。 別個の反応で、トリプシン消化を160分間実施し、反応混合物中に30kD a,25kDa、および11kDa断片 を優占的に得た。 FokIエンドヌクレアーゼのトリプシン消化10分では、反応混合物中に、 41kDaのN末端断片および25kDaのC末端断片が優先種として産生され た(図5、レーン3)。該混合物をオリゴdTセルロースカラムに通し、41k DaN末端断片のみが該カラムに保持された。これは、FokIエンドヌクレア ーゼのDNA結合性が、該酵素のN末端2/3にある事を示唆している。25k Da断片はオリゴdTセルロースカラムに保持されない。 FokI−オリゴ複合対のトリプシン消化160分では、30、25、11k Daの断片が優占的に産生された(図5、レーン5)。この反応混合物をオリゴ dTセルロースカラムに通すと、30および11kDa断片のみがカラムに保持 された。これらの種類は共に、DNAと結合しているようであり、41kDaN 末端断片を更に分解する事により生じる。25 kDa断片は、オリゴdTセル ロースカラムに保持されなかった。25 kDaもまたDEAEに結合しないの で、DEAEカラムを通過し、ブレイクスルー容液中で回収する事により精製さ れ得る。 FokI(390 μg)を2.5モル過剰オリゴヌクレオチド二量体d-5′-C TCTGGATGCTCTC-3′(配列認識番号第10):5′-GAGAGCATCCAGAGG-3′(配列認 識番号第11)と一緒に、10mM Tris・HCl(pH8.0)、50 mMNaCl、10%グリセロールを含む容積170 μl中で、室温にて1時 間インキュベートした。41kDaN末端断片 の生産が最大となるのは、MgCl2非存在下でのトリプシン(3μl;0.2 mg/ml)による消化では、室温で10分であった。反応物は、過剰のアンチ パイン(200μl)で、クエンチングした。トリプシンの消化物は、DEAE カラムを通した。25kDaのC末端断片を、ブレイクスルー中にて回収した。 他の全トリプシン断片(41kDa,30kDaおよび11kDaは、カラムに 保持され、0.5MのNaCl緩衝液(3x200μl)で抽出した。 別個の実験で、10mM MgCl2存在下、室温60分で、FokI−オリゴ 複合物のトリプシン消化を行なったところ、30kDaおよび11kDa断片の 産生が最高となった。この精製された断片は、非メチル化DNA基質(pTZ1 9R、図6)と、メチル化DNA基質(pACYCforkIM)もともに、M gCl2存在下で非特異的に開裂した。これらの産生物は、小さく、開裂は比較 的非特異的である事が示される。該生産物は、牛小腸ホスファターゼを使用して 脱リン酸化されるかまたはポリヌクレオチド・キナーゼおよび[γ−32P]AT Pを使用して、再リン酸化された。32P標識された産生物はDNaseIおよび 蛇毒ホスホジエステラーゼを使用して消化されてモノヌクレオチドにされた。P EIセルロース・クロマトグラフィによるモノヌクレオチドの分析では、25k Da断片が、優先的にホスホジエステルのボンド5’をG>A>>T−Cに開裂 した事がわかる。このように、該25kDaのC末端の断片は、FokIエンド ヌクレアーゼの開裂ドメインを構成している。41kDaN末端 断片ーオリゴ複合体は、アガロース・ゲル電気泳動によって精製された。Fok Iエンドヌクレアーゼ(200μg)は、2.5モル過剰のオリゴヌクレオチド 二量体 d-5′-CCTCTGGATGCTCTC-3′(配列認識番号第10):5′-GAGAGCATCCA GAGG-3′(配列認識番号第11)と一緒に、10mM Tris・HCl(pH 8.0)、50mM NaCl、10%グリセロールを含む容積180μl中で 、室温にて1時間インキュベートされた。わずかな量の32Pで標識されたオリゴ ヌクレオチド二量体が複合体中に組み入れられ、ゲル電気泳動中にそれをモニタ ーした。41 kDa N末端断片の産生を最高にする、トリプシン消化(20μ l;0.2mg/ml)は、室温12分であった。反応物は、過剰のアンチパイ ンでクエンチングされた。41 kDa N末端断片ーオリゴ複合体は、アガロー ス・ゲル電気泳動で精製された。該複合体に対応するバンドが切り出され、透析 バッグ(〜600μl)中で、電気抽出によって回収された。SDS−PAGE による複合体の分析では、41kDaN末端が主要構成物である事が解明された 。30 kDa N末端断片及び11 kDa C末端断片は、副成分として存在し ていた。これらは一緒にDNAに結合し、41 kDa N末端断片ーオリゴ複合 物とともに移動するようにみえる。 41 kDa N末端断片の結合特異性は、ゲル・モビリテイシフト分析によっ て決定された。 実施例VI ゲル・モビリテイ・シフト分析 特異的オリゴ(d-5′-CCTCTGGATGCTCTC-3′(配列認識番号第10),5′-GAGA GCATCCAGAGG-3′(配列認識番号第11))は、40 mM Tris.HCl(p H7.5)、20 mM MgCl2、50mM NaCl、10mM DTT、1 0ユニットのT4ポリヌクレオチド・キナーゼ(New England Biolabsより入手) 、及び20uCi[γ−32P]ATP(3000Ci/mmol)を含む25 μlの反応混合物中で32P標識された。該混合物は、37℃で、30分インキュ ベートされた。キナーは、反応混合物を70℃15分加熱する事により失活させ た。200μlの水を加えた後、溶液をセファデックスG−25(Superfine) カラム(Phamacia)を通過させて未反応[γ−32P]ATPを除いた。標識された 単鎖オリゴの最終濃度を27μMであった。 次に、単鎖をアニールして、10mM Tris.HCl(pH8.0)、5 0 mM NaCl中に二量体を12μMの濃度まで形成した。1μlの溶液は、 オリゴ二量体を〜12ピコモル及び〜50x103cpm含んでいた。非特異的 オリゴ類、即ちd-5′-TAATTGATTCTTAA-3′(配列認識番号12)及びd-5′-ATTA AGAATCAATT-3′(配列認識番号13)は、ここに記載したように[γ−32P]A TPとポリヌクレオチド・キナーゼで標識された。単鎖オリゴはアニールされ、 二量体を濃度12μMで産生した。該溶液は、オリゴ二量体を〜12ピコモル及 び〜25x103cpm含んでいた。該非特異的オリゴ(d-5′-TAATTGATTCTTAA- 3′)(配列認識番号12)及びd-5′-ATTAAGAATCAATT-3′(配列認識番号13 )は、ここに 記載したように[γ−32P]ATPとポリヌクレオチド・キナーゼで標識された 。単鎖オリゴはアニールされ、二量体を濃度12μMで産生した。該溶液は、オ リゴ二量体を〜42ピコモル及び〜25x103cpm含んでいた。10 mMT ris.HCl(pH8.0)、50 mM NaClおよび10mM MgCl2 中に41kDaN末端断片ーオリゴ複合体(〜2pモル)を含む溶液10μlを 、32Pで標識した特異的なオリゴヌクレオチド二量体(または32Pで標識した非 特異的なオリゴヌクレオチド二量体)とともに37℃で夫々30分および120 分インキュベートした。75%のグリセロール5μlを各サンプルに加え、8% の非変性ポルアクリル・アミド・ゲル上に充填した。電気泳動を、ブロモフェノ ールがゲルの頂部より6cm移動するまでTBE緩衝液中300ボルトでおこな った。該ゲルを乾燥し、オートラジオグラフを行なった。ゲル・モビリテイ・シ フト分析(図7)から理解できるように、複合体は、FokI認識部位を含んだ 、32P標識された特異的オリゴヌクレオチド二量体と簡単に置き変わったが、F okI認識部位を含まない、32P標識された非特異的オリゴヌクレオチド二量体 とは置き変わらなかった。これらの結果から、DNAの配列特異的認識に必要な 全ての情報が,FokIの41 kDa N末端断片内にコードされている事がわ かる。 実施例VII DNA基質の非存在下でのトリプシン開裂によるF okI分析 DNA基質非存在下でのFokIエンドヌークリアーゼのトリプシンの時間経 過を図8に示す。はじめに、FokIが、58kDa断片と8kDa断片に切断 された。該58kDa断片はDNA基質に結合せず、オリゴdTセルロースカラ ムに保持されない。更に消化が進むと、58kDa断片は、数個の中間トリプシ ン消化断片に分解される。しかしトリプシン消化が完了すると25kDa断片の みとなる(二つの重複バンドとして見える)。これらの種(58kDa,25k Da、及び8kDa)は、逆層HPLCで精製され、そのアミノ末端配列が決定 された(表I)。N末端配列と推定されるFokI配列を比較すると、8kDa 断片がN末端で、58kDa断片がC末端である事がわかる。これは、さらにF okIのN末端が認識ドメインに関与しているという結論を指示している。25 kDa断片のN末端をシークエンスすると、二つの異なる成分が存在している事 がわかる。非特異的DNA基質の存在下でのFokIエンドヌクレアーゼのトリ プシン消化の時間経過では、非特異的DNA基質の非存在下でFokIのトリプ シン消化で得られたプロフィルと類似していた。 実施例VIII FokIの25kDaC末端のトリプシン分解断片の 開裂特異性 FokIの25kDaC末端トリプシン断片は、pTZ19Rを小さな産物に切 断し、非特異的な開裂をしめす。分解産物は、牛小腸ホスファターゼによって脱 リン酸化され、ポリ ヌクレオチド・キナーゼおよび[γ−32P]ATPによって32P標識された。過 剰の標識は、セファデックスG25を使用して除去された。次に、標識された産 物は、50 mM Tris.Hcl(pH7.6)、10 mM MgCl2を含 む緩衝液中で、1ユニットの膵臓DNaseI(Boehringer-Mannheim)によって 37℃、1時間で消化された。次に、0.02ユニットの蛇毒ホスホジエステラ ーゼを、反応混合物に添加し、37℃、1時間で消化した。 実施例IX FokI制限エンドヌクレアーゼにおける機能的ドメイン トリプシンを使用したFokIの機能的ドメインの分析(基質の存在下、非存 在下における)を図9に要約した。FokIがDNA基質と結合すると、該酵素 構造の変換が伴なった。この研究は、配列特異的認識用とエンドヌクレアーゼ活 性用の二つの別個の蛋白ドメインが該酵素中に存在していることを裏付けている 。この結果により、認識ドメインがFokIエンドヌクレアーゼのN末端にある のに対して、開裂ドメインが、該分子のC末端に存在しているであろうことが示 される。 挿入変異物の構築に関する実施例(X−XIV) FokI RM 系の完全なヌクレオチド配列は、多くの研究所によって公表さ れている(Looney et al.,Gene 80:193-208,1989 & Kita et al.,J.Biol.C hem. 264: 5751-56,1989)。 例えば、PCRの実験プロトコールは、Skoglundet al.,Gene 88:1-5,1990 Bassinget al.,Gene 113:83-88,1992に、記載されている。細胞 生育の方法及び変異酵素の精製は、野生型FokI(Li et al.,Proc.Nat′l A cad.Sci.USA 89:4275-79,1992)用に使用された物と同じである。さらに、セフ ァデックスG−75ゲルろ過およびへパリンーセファロースCL−6Bカラムク ロマトグラフィーが変異酵素を均質になるまで精製するステップが必要であった 。 実施例X fokIR遺伝子内ヌクレオチド162における SpeI部位の変異 fokIR遺伝子内のSpeI部位89のひとつを変位させるのに使用される 二段階PCR技法は、Landt et al.,Gene 96:125-28,1990)に記載されている。 このプロトコール用の3つの合成プライマーは、1)SpeI部位内にひとつの 不適性塩基を含む変異プライマー(5′-TCATAATAGCAACTAATTCTTTTTGGATCTT-3′ )(配列認識番号24参照)、2)制限部位ClaI部位(5′-CCATCGATATAGCC TTTTTTATT-3′)(配列認識番号25)及びXbaI部位(5′-GCTCTAGAGGATCCG GAGGT-3′)(配列認識番号26)でそれぞれフランキングされるプラーマーで ある。第一段階では、XbaIプライマー及び変異プライマーを使用して中間断 片が増幅された。次に、第2段階PCRで、ClaIプライマーが該中間物に添 加された。0.3 kb PCR最終産物をXbaI/ClaIで消化し、付着末 端を精製し、ゲル精製した。発現ベクター(pRRSfokIR)は、X baI/ClaIで消化された。次に、4.2kbの大断片は、ゲル精製され、 PCR断片に連結された。組替DNAは、受容可能な大腸菌RRI[pACYC fokIM]細胞にトランスフェクトされた。テトラサイクリン及びアンピシリ ン抗生物質による選択の後、数個のクローンを取り上げ、そのプラスミドDNA を、制限分析によって調べた。SpeI部位変異は、プラスミドDNAをサンガ ーのシークエンシング法(Sanger et al.Proc.Natl.Acd.Sci,USA 74:5463-6 7,1977)使用したシークエンシングにより確認された。 実施例XI 4(または7)コドン挿入変異物の構築 4(または7)コドン挿入物を含むPCR産生DNAは、SpeI/XmaIで 消化され、ゲル精製された。実施例Xで得られたプラスミドpRRSfokIR をSpeI/XmaIで切断し、3、9kbの大断片をゲル精製し、PCR産生 物に連結した。該組替DNAは、受容可能なRRI[pACYCfokIM]細 胞にトランスフェクトされ、所望のクローンが、実施例Xで記載されたように同 定された。これらのクローン由来のプラスミドは単離されシークエンスされて、 fokIR遺伝子の4(または7)コドン挿入物が確認された。 特に、変異物の構築は、下記の様になされた: (1)fokIR遺伝子配列内には、ヌクレオチド162及び1152の夫々に 2つのSpeI部位がある。1152の部位は、FokIのトリプシン開裂部位 近隣に位置し、認識 ドメインと開裂ドメインを分離している。この領域の周囲に、4(または7)の コドンを挿入するために、もう一方の162のSpeI部位を2段階PCR法( Landt et al.Gene 96:125-28,1990)を使用して変異させた。このSpeI部 位変異をfokIR遺伝子へ導入しても、過剰生産者クローンの発現レベルに影 響をあたえない。 (2)4(または7)のコドンの挿入は、PCR法を使用して行われた。PCR 増殖で使用された変異プライマーは、図11に示される。各プライマーは、fo kIR遺伝子と相補的な21ベースペア配列をもつ。これらのプライマーの5’ 末端は、SpeI部位でフランクされる。KSEL及びKSELEEKの繰り返 しに対するコドンは、SpeI部位と21相補ベースペアの間に取り込まれる。 縮重コドンをこれらの繰り返し中に使用し、増幅中に起こり得る問題を回避した 。 他のプライマーは、fokIR遺伝子の3’末端と相補的であり、XmaI部 位によってフランクされる。4(または7)コドン挿入物を含む0.6kbPC R産生断片は、SpeI/XmaIによって消化され、ゲル精製された。これら の断片は、高発現ベクターpRRSfokIRに代替し、変異物を精製する。各 変異物の数個のクローンが同定され、そのDNA配列がサンガーのジデオキシ・ チェイン・ターミネーション法(Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci, USA 7 4.5463-67 1977)のよって確認された。 1mMのイソプロピルβーD−チオガラクトシド (IPTG)で誘導して、これらクローン中での変異酵素の発現をSDS/PA GEで測定したところ、3時間でもっとも顕著となった。これは、酵素活性につ いての分析によって、更に裏付けられた。これらのクローン中における変異酵素 の発現レベルは、野生型FokIと比較してはるかに低かった。IPTGでもっ と長く誘導すると、より低い酵素レベルとなり、変異酵素が、これらのクローン 中で積極的に分解される事が示唆された。これによって、FokIの認識ドメイ ンと開裂ドメインの間の4(または7)のコドン挿入物が蛋白構造を不安定にし 、細胞内における分解をし易くする事が示唆される。変異酵素のSDS/PAG Eプロフィルは、図12に示される。 実施例XII 単−FokI部位をもつDNA基質の調整 それそれ単一FokI認識部位をもつ2つの基質は、pTZ19Rをテンプレ ートとして使用したPCRによって調整された。オリゴヌクレオチド・プライマ ー:5′-CGCAGTGTTATCACTCAT-3′及び5′-CTTGGTTGAGTACTCACC-3′(夫々、配列 認識番号27及び28)を使用して、100ベースペア断片を合成した。プライ マー:5′-ACCGAGCTCGAATTCACT-3′及び5′-GATTTCGGCCTATTGGTT-3′(夫々、配 列認識番号29及び30)を使用して256ベース断片を調整した。これらの基 質内の個々のストランドは、対応する32P標識されリン酸化されたプライマーを 使用して、PCR中に放射線標識された。産生物を、低溶融アガロ ース・ゲルで精製し、エタノールで沈澱させTE緩衝液に再懸濁した。 実施例XIII 変異酵素の配列特異性の分析 図13に、pTZ19R DNAのFokIおよび変異体酵素による開裂産生 物のアガロース・ゲル電気泳動プロフィルが示される。それらが非常に類似して いる事は、認識ドメイン及び開裂ドメインの間のリンカー領域における4(また は7)コドン挿入物がそのDNA配列の特異性を変えない事を示唆している。こ の事は、更に、各々単一のFokI部位を含む32P標識DNA基質(100bp 及び256bp)を使用する事により確認された。32Pで標識された個々のスト ランドを含む基質は、実施例XIIに記載された様に調整された。FokIは、 256ベースペアの基質を二つの断片、180bp及び72bpにそれぞれ切断 する(図13B)。断片の長さは、各ストランドの32Pで標識された5’末端か ら計算された。アガロース・ゲルのオートラジオグラフが、図13Cに示される 。基質中で32P標識を担持するストランドに依存して、72bp断片または18 0bp断片が、オートラジオグラフィーにバンドとして現われる。該変異酵素は 、同一のアガロース・ゲル・プロフィル及びオートラジオグラフィーを現わす。 それ故、認識ドメインと開裂ドメインの間の4(または7)コドン挿入物は、F okIエンドヌクレアーゼのDNA認識機構を変えない。 実施例XIV 変異酵素による認識部位からの開裂距離の分析 変異酵素による開裂の距離を決定するために、32Pで標識された基質の開裂産 物をPAGEで分析した(図14)。消化物は、これらの基質を合成するための PCRで使用されたと同じプライマーで行われたpTZ19Rのシークエンシン グ反応に沿って分析された。100bp断片のFokIによる開裂パターンおよ び変異物が、図14Aに示される。野生型酵素と比較すると、変異物の場合は、 切断部位が基質の両ストランド上の認識部位からずれている。シークエンシング ・ゲルおよび開裂産物の間の観測可能な小さなずれは、シークエンシング反応に 使用される非リン酸化プライマーに起因する。 5′-GGATG-3′ストランド上で、両変異物は、DNAの認識部位から10ヌク レオチド離れて切断するのに対して、5′-CATCC-3′ストランド上では、14の ヌクレオチド離れて切断する。これらは両変異物にとって、主要な切断部位であ ると思われる。また、野生型酵素と同量の開裂が観察された。 256bp断片の開裂パターンは、図14Bに示される。開裂パターンは、図 14Bに示される。開裂パターンは、100bp断片と類似している。変異物の 場合、5′-CATCC-3′ストランド上の認識部位から15ヌクレオチド離れたとこ ろに、ある開裂が見られる。変異酵素の多数の切断部位は、これらの蛋白に異な る構造がある事に起因するのであろう。さもなければ、二つのドメイン間の空間 領域の柔軟性が増加する事に起因する。DNA基質に依存して、これらの部位に お ける開裂の強さには、あるばらつきが見られた。これは、これらの切断部位の回 りのヌクレオチド配列に起因するのかも知れない。多数の切断部位を持つ自然発 生型IIS酵素は、Szybalski et al.,Gene 100: 13-26,1991)に報告されてい る。 ハイブリッド酵素Ubx−F N(XV−XVII)の 構築に関する実施例 上記に言及したように、FokI制限ー変更システムの完全なヌクレオチド配 列は、別の研究所から公表されている(Kita et al.,J.Biol Chem.264:5751-5 6(1989);Looney et al.,Gene 80: 193-208(1989))。PCRの実験プロトコー ルは、いたるところに記載されている(Skoglund et al.,Gene 88:1-5(1990))。 細胞生育およびHisbindTm樹脂を使用した蛋白の精製は、ノバジェン(No vagen)pETシステムマニュアルに、概説された通りである。さらに、ハイブ リッド蛋白Ubx−FNをほぼ均質になるまで精製するためには、ホスホセルロ ースおよびDEAEカラム・クロマトグラフィーのステップを付加する事が必要 である。SDS/PAGEのプロトコールは、Laemmli(Nature 222:680-685(197 0))によって記載された通りである。 pUC13派生基質の調整 pUC13派生DNA基質は、SmaI切断pUC13プラスミドの平滑末端 と既知のUbx部位を含む10倍過剰量の30bp挿入物との連結によって調整 された。数個のクローンを取り出し、そのプラスミドDNAを、30bp挿入物 の有無について分析した。夫々、1、2、および3の挿入物を担持するpUC1 3(1),pUC13(2)、pUC13(3)を含クローンが同定された。そ のDNA配列は、サンガーのジデオキシシークエンシング法によって確認された (Proc.Natl.Acd.Sci,USA 74: 5463-67(1977))。 単一Ubx部位を持つDNA基質の調整 単一の30bp挿入物を保持するpUC13(1)のポリリンカー領域をEc oRI/HindIIIを使用して切り出し、ゲル精製した。この基質の各々の ストランドは、32P−dATPまたは32P−dCTPを使用して放射線標識され 、クレノー酵素で該断片の付着末端を充填した。該産生物を低溶融アガロース・ ゲルで精製し、エタノールで沈澱させ、緩衝液(10mM Tris.HCl/ 1mM EDTA、pH8.0)中に再懸濁した。 実施例XV PCRを使用して産生するクローンの構築 UbxのホメオボックスによってコードされるUbxのホメオ・ドメイン、6 1アミノ酸蛋白配列は、細菌性DNA結合蛋白中に見られるヘリックス・ターン ・ヘリックスのモチーフに関係した構造を備えた配列特異的DNA結合ドメイン である。(Hayashi et al.,Cell 63:883-94(1992);Wolberger et al.,Cell 67 :517-28(1991)。Ubxホメオ・ドメインは、9bpのコンセンサスDNA部位 、5′-TTAAT(G/T)(G/T)cc-3′(Ekker et al,The EMBO Journal 10:1179-86(199 1); Ekker et al.,The EMBO Journal 11:4059-4702(1992))を認識する。本発明者は 、PCR法を使用して、Ubxホメオ・ドメインとFokIの開裂ドメイン(FN )を結合させ、また大腸菌中でUbx−FN酵素を発現させた。製作されたUb x−FNハイブリッド蛋白の概略代表例を図16に示す。ハイブリッド遺伝子を 構築するために使用したオリゴヌクレオチド・プライマーを図17Aに示す。 ハイブリッド蛋白を発現するクローンは下記の様に構築された。まず、PCR で産生されたUbxホメオ・ドメインをPstI/SpeI消化し、ゲル精製し た。次に、この断片をベクターpRRSfokIR中に代替し、FokIDNA 結合ドメインンをコードするDNAセグメントと置換し、よって、Ubx−FN ハイブリッド遺伝子を(図17B)を作成した。 受容可能なRRI細胞に結合用混合物をトランスフェクションした後、数個の クローンを制限分析によって同定し、そのDNA配列を、サンガー等のジデオキ シ・チェイン・テーミネーション法により確認した(Proc.Natl.Acd.Sci.USA 74:5463-67(1977))。次に、ハイブリッド遺伝子をUbx−FNプライマーを使用 して増幅した。PCR産生されたDNAをNdeI/BamHIで消化し、ゲル 精製した。次に、この断片をNdeI/BamHIで切断したpET−15bベ クターに連結した。この構築物は、6つの連続したヒスチジン残基によって、ハ イブリッド蛋白のそのN末端にタグを付ける事になる。これらは、ノバジェン(N ovagen)のhis −bindTM樹脂を使用したメチル・キレーション・クロマトグラフィーによる この蛋白の精製用の親和性タグとして働く。このHisタグは、その後、トロン ビンによって除去できる。受容可能なBL21(DE3)細胞は、結合用混合物 でトランスフォームされ、組替DNA(図17B)を含む数個のクローンが同定 された。これらのコロニーは健全でなく、培地での生育も、ダブリング時間が4 5分と、悪い。1mMのイソプロピルーβーD−チアガラクトシド(IPTG) で誘導した後、ハイブリッド酵素をHis−bindTM樹脂、ホスホセルロース 、及びゲル・クロマトグラフィーを使用して均質になるまで精製した。精製され たハイブリッド酵素のSDS/PAGEプロフィルを、図18に示す。ハイブリ ッド蛋白の同定は更に、ウエスタン・ブロットで、FokIエンドヌクレアーゼ に対して惹起されたラビットの抗血清によってプロービングする事により確認さ れた(データ記載せず)。 実施例XVI Ubx−F Nハイブリッド酵素のDNA配列選択性 の分析 Ubx−FNの特性を調べるのに使用される、基質より派生し直線化したpU C13を図19に示す。既知のUbx認識配列5′-TTAATGGTT-3′を含む30b pDNA断片を、pUC13のSmaI部位に挿入する事によって誘導体が構築 される。挿入されたUbx部位で切断されると、1.8kb及び0.95kbの 断片が産物として生じる。Ubx−FN による基質の部分消化物のアガロース・ゲル電気泳動プロフィルが図19に示さ れる。これらの反応において、DNAのモル数は、蛋白のモル数に比較して著し く過剰である。反応条件を至適化して、基質分子あたり単一の二本鎖開裂を得る ようにした。直線化したpUC13DNAは、4つの断片に切断される。アガロ ース・ゲル電気泳動プロフィルに4つの異なったバンドが現れた事は、Ubx− FNが配列特異性をもってDNAと結合した事、及び直線化したpUC13中に ハイブリッド蛋白に対する2つの結合部位があることを示している。このことは 、単一のUbx部位を含む直線化されたpUC13DNA基質が6つの断片に切 断されるという事実によって、更に裏付けられる。2つの付加的な断片(夫々、 〜1.8kb及び〜0.95kb)は、pUC13の新規に挿入されたUbx部 位でハイブリッド蛋白の結合が行われた事及びこの部位付近で開裂が起きた結果 であると説明できよう。予測されたように、バンドの強度は、pUC13中にお ける30bp挿入物の数に伴って増加する。pUC13の2つの推定UbX結合 部位、及び挿入されたUbx部位が下記表3に示される。これら全ての部位は、 5′-TAAT-3′をその核配列として担持し、それら好ましい部位はUbxホメオ・ ドメインに付いて報告された物と一致する。これら部位に対するUbxホメオ・ ドメインの親和性は、該核部位を囲むヌクレオチド塩基によって変更される。完 全な消化が長期にわたって見られ、或いは蛋白濃度を増やす事によって見られる ので、ハイブリッド蛋白はターンオーバー(代謝回転)する ようだ(データ記載せず)。高温での開裂はより特異的である。 実施例XVII ハイブリッド酵素による認識部位からの開裂距離の分析 Ubx−FNによる認識部位からの開裂距離を決定するために、単一Ubx 部位を含む32P標識されたDNA基質の開裂産物が、PAGE(図20)によっ て分析された。消化産物は、基質のマキサム・ギルバート(G+A)シークエン シング反応にそって分析された。予想されたように、切断部位は、認識部位から はずれた。5′-TAAT-3′ストランドでは、Ubx−FNは、DNAを認識部位か ら3ヌクレオチド離れて切断するのに対して、5′-ATTA-3′ストランドでは、認 識部位から8、9、または10ヌクレオチド離れて切断する。単一のUbx部位 を含んだDNA基質の開裂に基づくUbx−FNの切断部位の分析は、図20に 要約されている。この開裂によって5’からTAATまでの配列が生じ、この開 裂はUbx−FNハイブリッド蛋白を作成した場合(図16)と一致する。 上記で述べた全ての刊行物は参照として本願明細書に組み込まれ、その一部を なす。 上記においては、明瞭な理解を助けるために幾らか詳細に説明してきたが、本 発明の真実の範囲を逸脱することなく、形態およびその詳細において種々の変更 をなし得ることが、当業者には容易に承認されるであろう。
【手続補正書】特許法第184条の8 【提出日】1995年8月15日 【補正内容】 請求の範囲 1.DNA構築物であって: (i)IIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むIIS型エンドヌクレ アーゼの触媒ドメインをコードする第一のDNAセグメントと; (ii)前記IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認 識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと; (iii)ベクターとを具備し、 前記第一のDNAセグメントおよび前記第二のDNAセグメントは、単一のタ ンパクが産生されるように、前記ベクターに対して動作可能に連結されているD NA構築物。 2.請求項1に記載のDNA構築物であって、前記IIS型エンドヌクレアー ゼがFokI制限エンドヌクレアーゼであるDNA構築物。 3.請求項2に記載のDNA構築物であって、前記認識ドメインが、ジンクフ ィンガーモチーフ;ホメオドメインモチーフ;リプレッサのDNA結合性ドメイ ン;POUドメインモチーフ(真核転写レギュレータ);発癌遺伝子のDNA結 合性ドメイン;および>6塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的なD NA結合性タンパクからなる群から選択されるDNA構築物。 4.請求項3に記載のDNA構築物であって、前記認識ドメインがUbxのホ メオドメインであるDNA構築物。 5.原核細胞であって: (i)IIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むIIS型エンドヌクレ アーゼの触媒ドメインをコードする第一のDNAセグメントと; (ii)前記IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認 識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと; (iii)ベクターとを含んでおり、 前記第一のDNAセグメントおよび前記第二のDNAセグメントは、単一のタ ンパクが産生されるように、前記ベクターに対して動作可能に連結されているD NA構築物。 6.請求項5に記載の原核細胞であって、前記第一のDNAセグメントがFo kIの触媒ドメイン(FN)をコードし、前記第二のDNAセグメントがUbx のホメオドメインをコードする原核細胞。 7.IIS型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインを含むハイブリッド制限酵素 であって、前記IIS型エンドヌクレアーゼ以外の酵素の認識ドメインに対して 共有結合的に結合された前記IIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んでい るハイブリッド制限酵素。 8.請求項7に記載のハイブリッド制限酵素であって、前記認識ドメイン(前 記ハイブリッド制限酵素の一部なす)が、ジンクフィンガーモチーフ;ホメオド メインモチーフ;POUドメインモチーフ;リプレッサのDNA結合性ドメイン ;発癌遺伝子のDNA結合性ドメイン;および>6塩基対を認識する他の天然に 存在する配列特異的なDNA結合性タンパ クからなる群から選択されるハイブリッド制限酵素。 9.請求項7に記載のハイブリッド制限酵素であって、前記認識ドメインがU bxのホメオドメインであるハイブリッド制限酵素。 10.請求項9に記載のハイブリッド制限酵素であって、前記II型エンドヌ クレアーゼがFokI制限エンドヌクレアーゼであり、前記ハイブリッド酵素が Ubx−FNであるハイブリッド制限酵素。 11.DNA構築物であって: (i)IIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだIIS型エンドヌク レアーゼの触媒ドメインをコードする第一のDNAセグメントと; (ii)前記IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認 識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと; (iii)前記第一のDNAセグメントおよび前記第二のDNAセグメントの 間に挿入された、1以上のコドンを含む第三のDNAセグメントと; (iv)ベクターとを含み、 前記第一のDNAセグメント、前記第二のDNAセグメントおよび前記第三の DNAセグメントば、単一のタンパクが産生されるように、前記ベクターに対し て動作可能に連結されているDNA構築物。 12.請求項11に記載のDNA構築物であって、前記IIS型エンドヌクレ アーゼがFokI制限エンドヌクレアー ゼであるDNA構築物。 13.請求項12に記載のDNA構築物であって、前記第三のDNAセグメン トが実質的に4コドンからなるDNA構築物。 14.請求項13に記載のDNA構築物であって、前記第三のDNAセグメン トの前記4コドンが、前記エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子のヌクレオチ ド1152に挿入されているDNA構築物。 15.請求項12に記載のDNA構築物であって、前記第三のDNAセグメン トが実質的に7コドンからなるDNAセグメント。 16.請求項15に記載のDNA構築物であって、前記第三のDNAセグメン トの前記7コドンが、前記エンドヌクレアーゼ遺伝子のヌクレオチド1152に 挿入されているDNA構築物。 17.請求項12に記載のDNA構築物であって、前記認識ドメインが、ジン クフィンガーモチーフ;ホメオドメインモチーフ;POUドメインモチーフ;リ プレッサのDNA結合性ドメイン;発癌遺伝子のDNA結合性ドメイン;および >6塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的なDNA結合性タンパクか らなる群から選択されるDNA構築物。 18.原核細胞であって: (i)IIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだIIS型エンドヌク レアーゼの触媒ドメインをコードする第一のDNAセグメントと; (ii)前記IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認 識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと; (iii)前記第一のDNAセグメントおよび前記第二のDNAセグメントの 間に挿入された、1以上のコドンを含む第三のDNAセグメントと; (iv)ベクターとを含み、 前記第一のDNAセグメント、前記第二のDNAセグメントおよび前記第三の DNAセグメントは、単一のタンパクが産生されるように、前記ベクターに対し て動作可能に連結されているDNA構築物。 19.請求項18に記載の原核細胞であって、前記第三のDNAセグメントが 実質的に4コドンからなる細胞。 20.請求項18に記載の原核細胞であって、前記第三のDNAセグメントが 実質的に7コドンからなる細胞。 21.請求項18の原核細胞によって産生された、単離されたIIS型ハイブ リッドエンドヌクレアーゼ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 9/16 C12R 1:19)

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメインをコードする単離されたDN Aセグメントであって、前記IIS型エンドヌクレアーゼの配列特異的認識活性 を含むDNAセグメント。 2.請求項1に記載のDNAセグメントであって、前記IIS型エンドヌクレ アーゼがFokI制限エンドヌクレアーゼであるDNAセグメント。 3.請求項2に記載のDNAセグメントであって、前記コードされるタンパク が、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したときに約41キロド ルトンの分子量を有するDNAセグメント。 4.請求項3に記載のDNAセグメントであって、FokI制限エンドヌクレ アーゼのアミノ酸1〜382をコードするDNAセグメント。 5.IIS型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする単離されたDN Aセグメントであって、前記IIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むDN Aセグメント。 6.請求項5に記載のDNAセグメントであって、前記IIS型エンドヌクレ アーゼがFokI制限エンドヌクレアーゼであるDNAセグメント。 7.請求項6に記載のDNAセグメントであって、前記コードされるタンパク が、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したときに約25キロド ルトンの分子量を有するDNAセグメント。 8.請求項7に記載のDNAセグメントであって、FokIエンドヌクレアー ゼのアミノ酸383〜578をコードするDNAセグメント。 9.実質的にFokI制限エンドヌクレアーゼのN末端からなる単離されたタ ンパクであって、前記エンドヌクレアーゼの配列特異的認識活性を有するタンパ ク。 10.請求項9に記載のタンパクであって、FokI制限エンドヌクレアーゼ のアミノ酸1〜382であるタンパク。 11.実質的にFokI制限エンドヌクレアーゼのC末端からなる単離された タンパクであって、前記エンドヌクレアーゼの開裂活性を有するタンパク。 12.請求項11に記載のタンパクであって、FokI制限エンドヌクレアー ゼのアミノ酸383〜578であるタンパク。 13.DNA構築物であって: (i)IIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むIIS型エンドヌクレ アーゼの触媒ドメインをコードする第一のDNAセグメントと; (ii)前記IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認 識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと; (iii)ベクターとを具備し、 前記第一のDNAセグメントおよび前記第二のDNAセグメントは、単一のタ ンパクが産生されるように、前記ベクターに対して動作可能に連結されているD NA構築物。 14.請求項13に記載のDNA構築物であって、前記IIS型エンドヌクレ アーゼがFokI制限エンドヌクレアーゼであるDNA構築物。 15.請求項14に記載のDNA構築物であって、前記認識ドメインが、ジン クフィンガーモチーフ;ホメオドメインモチーフ;リプレッサのDNA結合性ド メイン;POUドメインモチーフ(真核転写レギュレータ);発癌遺伝子のDN A結合性ドメイン;および>6塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的 なDNA結合性タンパクからなる群から選択されるDNA構築物。 16.請求項15に記載のDNA構築物であって、前記認識ドメインがUbx のホメオドメインであるDNA構築物。 17.原核細胞であって: (i)IIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むIIS型エンドヌクレ アーゼの触媒ドメインをコードする第一のDNAセグメントと; (ii)前記IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認 識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと; (iii)ベクターとを含んでおり、 前記第一のDNAセグメントおよび前記第二のDNAセグメントは、単一のタ ンパクが産生されるように、前記ベクターに対して動作可能に連結されているD NA構築物。 18.請求項17に記載の原核細胞であって、前記第一のDNAセグメントが FokIの触媒ドメイン(FN)をコー ドし、前記第二のDNAセグメントがUbxのホメオドメインをコードする原核 細胞。 19.IIS型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインを含むハイブリッド制限酵 素であって、前記IIS型エンドヌクレアーゼ以外の酵素の認識ドメインに対し て共有結合的に結合された前記IIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだ ハイブリッド制限酵素。 20.請求項19に記載のハイブリッド制限酵素であって、前記認識ドメイン (前記ハイブリッド制限酵素の一部なす)が、ジンクフィンガーモチーフ;ホメ オドメインモチーフ;POUドメインモチーフ;リプレッサのDNA結合性ドメ イン;発癌遺伝子のDNA結合性ドメイン;および>6塩基対を認識する他の天 然に存在する配列特異的なDNA結合性タンパクからなる群から選択されるハイ ブリッド制限酵素。 21.請求項20に記載のハイブリッド制限酵素であって、前記認識ドメイン がUbxのホメオドメインであるハイブリッド制限酵素。 22.請求項21に記載のハイブリッド制限酵素であって、前記II型エンド ヌクレアーゼがFokI制限エンドヌクレアーゼであり、前記ハイブリッド酵素 がUbx−FNであるハイブリッド制限酵素。 23. DNA構築物であって: (i)IIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだIIS型エンドヌク レアーゼの触媒ドメインをコードする第一のDNAセグメントと; (ii)前記IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認 識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと; (iii)前記第一のDNAセグメントおよび前記第二のDNAセグメントの 間に挿入された、1以上のコドンを含む第三のDNAセグメントと; (iv)ベクターとを含み、 前記第一のDNAセグメント、前記第二のDNAセグメントおよび前記第三の DNAセグメントは、単一のタンパクが産生されるように、前記ベクターに対し て動作可能に連結されているDNA構築物。 24.請求項23に記載のDNA構築物であって、前記IIS型エンドヌクレ アーゼがFokI制限エンドヌクレアーゼであるDNA構築物。 25.請求項24に記載のDNA構築物であって、前記第三のDNAセグメン トが実質的に4コドンからなるDNA構築物。 26.請求項25に記載のDNA構築物であって、前記第三のDNAセグメン トの前記4コドンが、前記エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子のヌクレオチ ド1152に挿入されているDNA構築物。 27.請求項24に記載のDNA構築物であって、前記第三のDNAセグメン トが実質的に7コドンからなるDNAセグメント。 28.請求項24に記載のDNA構築物であって、前記認 識ドメインが、ジンクフィンガーモチーフ;ホメオドメインモチーフ;POUド メインモチーフ;リプレッサのDNA結合性ドメイン;発癌遺伝子のDNA結合 性ドメイン;および>6塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的なDN A結合性タンパクからなる群から選択されるDNA構築物。 30.原核細胞であって: (i)IIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだIIS型エンドヌク レアーゼの触媒ドメインをコードする第一のDNAセグメントと; (ii)前記IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認 識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと; (iii)前記第一のDNAセグメントおよび前記第二のDNAセグメントの 間に挿入された、1以上のコドンを含む第三のDNAセグメントと; (iv)ベクターとを含み、 前記第一のDNAセグメント、前記第二のDNAセグメントおよび前記第三の DNAセグメントは、単一のタンパクが産生されるように、前記ベクターに対し て動作可能に連結されているDNA構築物。 31.請求項30に記載の原核細胞であって、前記第三のDNAセグメントが 実質的に4コドンからなる細胞。 32.請求項30に記載の原核細胞であって、前記第三のDNAセグメントが 実質的に7コドンからなる細胞。 33.請求項30の原核細胞によって産生された、単離さ れたIIS型ハイブリッドエンドヌクレアーゼ。 34.IIS型エンドヌクレアーゼのN末端(該II型エンドヌクレアーゼの 配列特異的認識活性を含む)をコードする単離されたDNAセグメントであって 、前記II型エンドヌクレアーゼはFokI制限エンドヌクレアーゼであり、且 つ前記N末端はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定したときに約4 1キロドルトンの分子量を有するDNAセグメント。 35.IIS型エンドヌクレアーゼのC末端(該II型エンドヌクレアーゼの 開裂活性を含む)をコードする単離されたDNAセグメントであって、前記II 型エンドヌクレアーゼはFokI制限エンドヌクレアーゼであり、且つ前記C末 端はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定したときに約25キロドル トンの分子量を有するDNAセグメント。 36.実質的にFokI制限エンドヌクレアーゼのN末端からなる単離された タンパクであって、該タンパクは前記エンドヌクレアーゼの配列特異的認識活性 を有し、且つ該タンパクはFokI制限エンドヌクレアーゼのアミノ酸1〜38 2であるタンパク。 37.実質的にFokI制限エンドヌクレアーゼのC末端からなる単離された タンパクであって、該タンパクは前記エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を 有し、且つ該タンパクはFokI制限エンドヌクレアーゼのアミノ酸383〜5 87であるタンパク。
JP7510290A 1993-09-27 1994-08-23 フラボバクテリウム・オケアノコイテス(foki)制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン Withdrawn JPH09505728A (ja)

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Families Citing this family (367)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5436150A (en) * 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5916794A (en) * 1992-04-03 1999-06-29 Johns Hopkins University Methods for inactivating target DNA and for detecting conformational change in a nucleic acid
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US20050084885A1 (en) * 1994-01-18 2005-04-21 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
JP4118327B2 (ja) 1994-08-20 2008-07-16 ゲンダック・リミテッド Dna認識のための結合タンパク質におけるまたはそれに関連する改良
AU719001B2 (en) * 1994-12-29 2000-05-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric DNA-binding proteins
WO1996040882A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 The Ohio State University Artificial restriction endonuclease
US6261797B1 (en) 1996-01-29 2001-07-17 Stratagene Primer-mediated polynucleotide synthesis and manipulation techniques
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6444421B1 (en) 1997-11-19 2002-09-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for detecting intermolecular interactions in vivo and in vitro
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
ATE466952T1 (de) * 1998-03-02 2010-05-15 Massachusetts Inst Technology Poly-zinkfinger-proteine mit verbesserten linkern
DE69932813D1 (de) 1998-03-17 2006-09-28 Gendaq Ltd Nukleinsäurebindungsproteine
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
WO2000046386A2 (en) 1999-02-03 2000-08-10 The Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
JP2002535994A (ja) * 1999-02-03 2002-10-29 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレイション 標的dnaのインビボ除去による遺伝子修復
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US20030104526A1 (en) * 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US7030215B2 (en) * 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
JP5180417B2 (ja) * 1999-04-28 2013-04-10 ジェネンコー・インターナショナル・インク 特異的に標的化された触媒性アンタゴニストおよびその使用
CA2387035A1 (en) 1999-10-13 2001-04-19 Sequenom, Inc. Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers
US20030207297A1 (en) * 1999-10-13 2003-11-06 Hubert Koster Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers
US20030190644A1 (en) 1999-10-13 2003-10-09 Andreas Braun Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers
DE60023936T2 (de) * 1999-12-06 2006-05-24 Sangamo Biosciences Inc., Richmond Methoden zur verwendung von randomisierten zinkfingerprotein-bibliotheken zur identifizierung von genfunktionen
AU2001226935B2 (en) * 2000-01-24 2006-06-22 Gendaq Limited Nucleic acid binding polypeptides characterized by flexible linkers connected nucleic acid binding modules
AU5077401A (en) 2000-02-08 2001-08-20 Sangamo Biosciences Inc Cells for drug discovery
AU5391401A (en) 2000-04-28 2001-11-12 Sangamo Biosciences Inc Targeted modification of chromatin structure
US6958214B2 (en) * 2000-07-10 2005-10-25 Sequenom, Inc. Polymorphic kinase anchor proteins and nucleic acids encoding the same
EP1303608A2 (en) * 2000-07-21 2003-04-23 Syngenta Participations AG Zinc finger domain recognition code and uses thereof
US20030082561A1 (en) * 2000-07-21 2003-05-01 Takashi Sera Zinc finger domain recognition code and uses thereof
US7067317B2 (en) * 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
CA2431308C (en) * 2000-12-07 2010-04-13 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
AU2002241946B2 (en) 2001-01-22 2007-04-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Modified zinc finger binding proteins
EP2266396A3 (en) 2001-09-24 2011-06-15 Sangamo BioSciences, Inc. Modulation of stem cells using zinc finger proteins
US7262054B2 (en) * 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
CN100575485C (zh) 2002-01-23 2009-12-30 犹他大学研究基金会 使用锌指核酸酶的定向染色体诱变
WO2009095742A1 (en) * 2008-01-31 2009-08-06 Cellectis New i-crei derived single-chain meganuclease and uses thereof
US20100151556A1 (en) * 2002-03-15 2010-06-17 Cellectis Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
DK1485475T3 (da) * 2002-03-15 2008-01-21 Cellectis Hybrid meganuklease og enkeltkædet maganuklease og brug deraf
EP2368982A3 (en) * 2002-03-21 2011-10-12 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7101697B2 (en) * 2002-04-30 2006-09-05 Charité—Universitätsmedizin Berlin Restriction endonucleases, method of synthesis and use thereof
AU2003228809A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Sequenom, Inc. Kinase anchor protein muteins, peptides thereof, and related methods
CA2396345C (en) * 2002-07-31 2007-04-10 Rousseau Metal Inc. Frontal latch handle assembly
US7361635B2 (en) * 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
US9447434B2 (en) * 2002-09-05 2016-09-20 California Institute Of Technology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
US7563600B2 (en) 2002-09-12 2009-07-21 Combimatrix Corporation Microarray synthesis and assembly of gene-length polynucleotides
US7820378B2 (en) * 2002-11-27 2010-10-26 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery
EP3202899B1 (en) 2003-01-28 2020-10-21 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
EP1618216A2 (en) * 2003-04-25 2006-01-25 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods and systems for de novo sequencing
US20120196370A1 (en) 2010-12-03 2012-08-02 Fyodor Urnov Methods and compositions for targeted genomic deletion
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
ES2808687T3 (es) 2003-08-08 2021-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para escisión dirigida y recombinación
US11311574B2 (en) 2003-08-08 2022-04-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US9394565B2 (en) * 2003-09-05 2016-07-19 Agena Bioscience, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
CA2539439C (en) 2003-09-19 2012-10-23 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered zinc finger proteins for regulation of gene expression
PT2025756E (pt) 2003-11-18 2011-09-28 Bayer Bioscience Nv Inserção direccionada de adn em plantas
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7608394B2 (en) 2004-03-26 2009-10-27 Sequenom, Inc. Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation
WO2005098050A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-20 Sequenom, Inc. Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis
EP1802772A4 (en) * 2004-09-10 2008-12-31 Sequenom Inc METHOD FOR NUCLEIC ACID SEQUENCE ANALYSIS WITH GREAT RANGE
KR20070060115A (ko) 2004-09-16 2007-06-12 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 단백질 생산을 위한 조성물 및 방법
JP2008523786A (ja) * 2004-10-18 2008-07-10 コドン デバイシズ インコーポレイテッド 高忠実度合成ポリヌクレオチドのアセンブリ方法
US20070122817A1 (en) * 2005-02-28 2007-05-31 George Church Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides
JP5639336B2 (ja) 2005-04-04 2014-12-10 バイエル・クロップサイエンス・エヌ・ヴェーBayer Cropscience N.V. 選ばれたdna配列を除去するための方法および手段
EP1913149A4 (en) 2005-07-26 2009-08-05 Sangamo Biosciences Inc TARGETED INTEGRATION AND EXPRESSION OF EXOGENOUS NUCLEIC ACID SEQUENCES
WO2009134714A2 (en) * 2008-04-28 2009-11-05 Precision Biosciences, Inc. Fusion molecules of rationally-designed dna-binding proteins and effector domains
WO2007047859A2 (en) 2005-10-18 2007-04-26 Precision Biosciences Rationally-designed meganucleases with altered sequence specificity and dna-binding affinity
WO2007060495A1 (en) * 2005-10-25 2007-05-31 Cellectis I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof
US7627401B2 (en) 2006-02-07 2009-12-01 Glenbrook Associates, Inc. System and method for remotely regulating the power consumption of an electric appliance
WO2007136685A2 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for inactivation of dihydrofolate reductase
EP2206782A1 (en) 2006-05-25 2010-07-14 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
SI2049663T1 (sl) 2006-08-11 2015-12-31 Dow Agrosciences Llc Homologna rekombinacija, posredovana z nukleazo s cinkovim prstom
WO2008027558A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Codon Devices, Inc. Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
CA2664414C (en) 2006-09-28 2016-07-12 Bayer Bioscience N.V. Methods and means for removal of a selected dna sequence
EP2089427B1 (en) * 2006-11-13 2014-07-30 Sangamo BioSciences, Inc. Zinc finger nuclease for targeting the human glucocorticoid receptor locus
WO2008076290A2 (en) 2006-12-14 2008-06-26 Dow Agrosciences Llc Optimized non-canonical zinc finger proteins
WO2008130629A2 (en) * 2007-04-19 2008-10-30 Codon Devices, Inc. Engineered nucleases and their uses for nucleic acid assembly
US8110379B2 (en) 2007-04-26 2012-02-07 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into the PPP1R12C locus
EP2160467B1 (en) 2007-06-05 2015-10-28 Bayer CropScience NV Methods and means for exact replacement of target dna in eukaryotic organisms
EP2171052B1 (en) 2007-07-12 2014-08-27 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for inactivating alpha 1,6 fucosyltransferase (fut 8) gene expression
CA2700231C (en) * 2007-09-27 2018-09-18 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
DK2205749T3 (en) 2007-09-27 2016-08-22 Dow Agrosciences Llc MODIFIED PROTEINS zinc finger, which target the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes
US8563314B2 (en) 2007-09-27 2013-10-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
US11235026B2 (en) 2007-09-27 2022-02-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
WO2009054985A1 (en) 2007-10-25 2009-04-30 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted integration
EP2215252A4 (en) * 2007-12-07 2011-01-26 Prec Biosciences Inc MEGANUCLEASES DESIGNED RATIONALLY WITH IDENTIFICATION SEQUENCES FOUND IN HUMAN GENOME DNAASE HYPERSENSIVE REGIONS
WO2009114321A2 (en) * 2008-03-11 2009-09-17 Precision Biosciencs, Inc. Rationally-designed meganucleases for maize genome engineering
US20100071083A1 (en) * 2008-03-12 2010-03-18 Smith James J Temperature-dependent meganuclease activity
AU2009238629C1 (en) 2008-04-14 2015-04-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Linear donor constructs for targeted integration
WO2009146179A1 (en) 2008-04-15 2009-12-03 University Of Iowa Research Foundation Zinc finger nuclease for the cftr gene and methods of use thereof
AU2009258117B2 (en) 2008-06-10 2014-10-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for generation of Bax- and Bak-deficient cell lines
EP3211075B1 (en) * 2008-07-14 2018-10-24 Precision Biosciences, Inc. Recognition sequences for i-crei-derived meganucleases and uses thereof
WO2010019526A1 (en) * 2008-08-14 2010-02-18 Brent Lee Dynamic filtration device using centrifugal force
EP2313515B1 (en) 2008-08-22 2015-03-04 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
WO2010053518A2 (en) 2008-10-29 2010-05-14 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for inactivating glutamine synthetase gene expression
US20110023159A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Ovine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023149A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in tumor suppression in animals
US20110023153A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in alzheimer's disease
US20110030072A1 (en) * 2008-12-04 2011-02-03 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of immunodeficiency genes in animals
US20110023147A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of prion disorder-related genes in animals
US20110023141A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved with parkinson's disease
US20110023140A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Rabbit genome editing with zinc finger nucleases
US20110023150A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of genes associated with schizophrenia in animals
US20110023156A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Feline genome editing with zinc finger nucleases
US20110016539A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of neurotransmission-related genes in animals
US20110023146A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in secretase-associated disorders
US20110016540A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of genes associated with trinucleotide repeat expansion disorders in animals
US20110016546A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Porcine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023158A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Bovine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023139A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in cardiovascular disease
US20110016543A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in inflammation
US20110023154A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Silkworm genome editing with zinc finger nucleases
US20110023152A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of cognition related genes in animals
US20110023145A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in autism spectrum disorders
US20110016541A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of sensory-related genes in animals
US20110023148A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of addiction-related genes in animals
US20110016542A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Canine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023143A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of neurodevelopmental genes in animals
WO2010065123A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
US20110023157A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Equine genome editing with zinc finger nucleases
US20110023144A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genomic editing of genes involved in amyotrophyic lateral sclerosis disease
US20110023151A1 (en) * 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of abc transporters
AR074783A1 (es) 2008-12-17 2011-02-09 Dow Agrosciences Llc Metodos y composiciones para expresar uno o mas productos de un acido nucleico exogeno integrado al locus zp15 de una celula vegetal
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
EP2419511B1 (en) 2009-04-09 2018-01-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted integration into stem cells
US8772008B2 (en) * 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
JP5798116B2 (ja) 2009-06-30 2015-10-21 サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド 生物活性のあるヌクレアーゼの迅速なスクリーニングおよびヌクレアーゼ修飾細胞の単離
US20120171771A1 (en) 2009-07-08 2012-07-05 Cellular Dynamics International, Inc. Modified ips cells having a mutant form of a human immunodeficiency virus (hiv) cellular entry gene
EP2461819A4 (en) * 2009-07-28 2013-07-31 Sangamo Biosciences Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING TRI-NUCLEOTIDE REPEAT DISORDERS
CA2770312A1 (en) 2009-08-11 2011-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Organisms homozygous for targeted modification
EP2722392B1 (en) * 2009-10-22 2017-11-22 Dow AgroSciences LLC Engineered zinc finger proteins targeting plant genes involved in fatty acid biosynthesis
WO2011056872A2 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Gen9, Inc. Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
WO2011066185A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Gen9, Inc. Microfluidic devices and methods for gene synthesis
EP2510096B2 (en) 2009-12-10 2018-02-07 Regents of the University of Minnesota Tal effector-mediated dna modification
US9217144B2 (en) 2010-01-07 2015-12-22 Gen9, Inc. Assembly of high fidelity polynucleotides
CN102812034B (zh) * 2010-01-22 2016-08-03 陶氏益农公司 靶向基因组改造
WO2011100058A1 (en) * 2010-02-09 2011-08-18 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
JP5922095B2 (ja) 2010-03-29 2016-05-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 薬理学的に誘導される導入遺伝子アブレーション系
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
SG185367A1 (en) 2010-04-26 2012-12-28 Sangamo Biosciences Inc Genome editing of a rosa locus using zinc-finger nucleases
JP5898179B2 (ja) 2010-05-03 2016-04-06 サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド ジンクフィンガーモジュールを連結するための組成物
CA2798988C (en) 2010-05-17 2020-03-10 Sangamo Biosciences, Inc. Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof
US9593317B2 (en) 2010-06-09 2017-03-14 Bayer Cropscience Nv Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering
WO2011154159A1 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Bayer Bioscience N.V. Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering
JP6050230B2 (ja) 2010-07-21 2016-12-21 サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド Hla遺伝子座の修飾のための方法及び組成物
EP3489359A1 (en) 2010-07-23 2019-05-29 Sigma Aldrich Co. LLC Genome editing using targeting endonucleases and single-stranded nucleic acids
EP3511420B1 (en) 2010-09-27 2021-04-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for inhibiting viral entry into cells
CA2814143C (en) 2010-10-12 2020-09-08 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions for treating hemophilia b
WO2012064975A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
JP6118725B2 (ja) 2010-11-12 2017-04-19 ジェン9・インコーポレイテッドGen9,INC. 核酸合成のための方法およびデバイス
WO2012092379A2 (en) 2010-12-29 2012-07-05 Sigma-Aldrich Co. Llc Cells having disrupted expression of proteins involved in adme and toxicology processes
WO2012094132A1 (en) 2011-01-05 2012-07-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for gene correction
WO2012168124A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 Bayer Cropscience Nv Methods and means to modify a plant genome at a preselected site
ES2671733T3 (es) 2011-06-30 2018-06-08 Sigma Aldrich Co. Llc Células deficientes en ácido CMP-N-acetilneuramínico hidroxilasa y/o glucoproteína alfa-1,3-galactosil transferasa
US9161995B2 (en) 2011-07-25 2015-10-20 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for alteration of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene
AU2012299691B2 (en) 2011-08-22 2015-01-29 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Methods and means to modify a plant genome
LT3594340T (lt) 2011-08-26 2021-10-25 Gen9, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti nukleorūgščių didelio tikslumo sąrankai
EP3498833B1 (en) 2011-09-21 2023-08-16 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for regulation of transgene expression
US20140283819A1 (en) 2011-10-12 2014-09-25 Bayer Cropscience Ag Plants with decreased activity of a starch dephosphorylating enzyme
AU2012323042B2 (en) 2011-10-12 2015-01-15 Bayer Cropscience Ag Plants with decreased activity of a starch dephosphorylating enzyme
US9222105B2 (en) 2011-10-27 2015-12-29 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of the HPRT locus
JP6144691B2 (ja) 2011-11-16 2017-06-07 サンガモ セラピューティクス, インコーポレイテッド 修飾されたdna結合タンパク質およびその使用
ES2733248T3 (es) 2012-01-11 2019-11-28 Sigma Aldrich Co Llc Producción de proteínas recombinantes con glicoformas simples
MX359327B (es) 2012-02-29 2018-09-25 Sangamo Biosciences Inc Composiciones y sus usos para tratar y prevenir la enfermedad de huntington.
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
CA2871008C (en) 2012-04-23 2022-11-22 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in plants
CA2871505C (en) 2012-04-24 2021-10-12 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
US9523098B2 (en) 2012-05-02 2016-12-20 Dow Agrosciences Llc Targeted modification of malate dehydrogenase
WO2013169802A1 (en) 2012-05-07 2013-11-14 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
US11120889B2 (en) 2012-05-09 2021-09-14 Georgia Tech Research Corporation Method for synthesizing a nuclease with reduced off-site cleavage
KR20150023670A (ko) 2012-06-12 2015-03-05 제넨테크, 인크. 조건적 녹아웃 대립유전자의 생성 방법 및 이를 위한 조성물
US20150225734A1 (en) 2012-06-19 2015-08-13 Regents Of The University Of Minnesota Gene targeting in plants using dna viruses
AU2013280661A1 (en) 2012-06-25 2015-01-22 Gen9, Inc. Methods for nucleic acid assembly and high throughput sequencing
WO2014011901A2 (en) 2012-07-11 2014-01-16 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for delivery of biologics
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
AU2013289206B2 (en) 2012-07-11 2018-08-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of lysosomal storage diseases
MX367081B (es) 2012-08-29 2019-08-05 Sangamo Biosciences Inc Modificación genética mediada por nucleasas para usarse en el tratamiento de una condición genética.
US9937205B2 (en) 2012-09-04 2018-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive T cell transfer
CN105264067B (zh) 2012-09-07 2020-11-10 美国陶氏益农公司 Fad3性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
HUE050797T2 (hu) 2012-10-10 2021-01-28 Sangamo Therapeutics Inc T-sejt módosító vegyületek és alkalmazásaik
CN104968193B (zh) 2012-11-01 2021-02-09 塞尔克蒂斯股份有限公司 用于生成治疗性蛋白质的植物
AR093980A1 (es) 2012-12-13 2015-07-01 Dow Agrosciences Llc Genes de precision que tienen como objetivo un locus particular en el maiz
WO2014096972A2 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Cellectis Potatoes with reduced cold-induced sweetening
AU2014207618A1 (en) 2013-01-16 2015-08-06 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
US10113162B2 (en) 2013-03-15 2018-10-30 Cellectis Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the FAD2-1A/1B genes
CN113563476A (zh) 2013-03-15 2021-10-29 通用医疗公司 遗传和表观遗传调节蛋白至特定基因组基因座的rna引导的靶向
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
JP6346266B2 (ja) 2013-03-21 2018-06-20 サンガモ セラピューティクス, インコーポレイテッド 操作されたジンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼを使用するt細胞受容体遺伝子の標的化された破壊
CN105121650A (zh) 2013-04-02 2015-12-02 拜尔作物科学公司 真核生物中的靶向基因组工程
KR102192599B1 (ko) 2013-04-05 2020-12-18 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 식물의 게놈 내의 외인성 서열의 통합을 위한 방법 및 조성물
WO2014186435A2 (en) 2013-05-14 2014-11-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for reducing neointima formation
CN116083487A (zh) 2013-05-15 2023-05-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
US10011850B2 (en) 2013-06-21 2018-07-03 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
EP3039136B8 (en) 2013-08-28 2020-12-16 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
RU2675824C2 (ru) 2013-09-11 2018-12-25 Игл Байолоджикс, Инк. Жидкие белковые составы, содержащие ионные жидкости
AU2014337248B2 (en) 2013-10-17 2020-09-24 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
BR102014027466B1 (pt) 2013-11-04 2022-09-27 Dow Agrosciences Llc Molécula de ácido nucleico recombinante, método para produzir uma célula vegetal transgênica e usos de uma planta de soja, parte de planta de soja ou célula de planta de soja transgênica
AU2014341927B2 (en) 2013-11-04 2017-12-14 Corteva Agriscience Llc Optimal maize loci
MX364662B (es) 2013-11-04 2019-05-03 Dow Agrosciences Llc Óptimos loci de maíz.
CN105934524A (zh) 2013-11-11 2016-09-07 桑格摩生物科学股份有限公司 用于治疗亨廷顿氏病的方法和组合物
PT3068881T (pt) 2013-11-13 2019-05-31 Childrens Medical Center Regulação da expressão de genes mediada por nucleases
EP2878667A1 (en) 2013-11-29 2015-06-03 Institut Pasteur TAL effector means useful for partial or full deletion of DNA tandem repeats
JP6535684B2 (ja) 2013-12-09 2019-06-26 サンガモ セラピューティクス, インコーポレイテッド ゲノム操作のための方法および組成物
RS60514B1 (sr) 2014-02-03 2020-08-31 Sangamo Therapeutics Inc Postupci i sastavi za tretman beta talasemije
DK3102702T3 (da) 2014-02-05 2019-06-17 Fraunhofer Ges Forschung Fejlfri sekvensering af DNA
SG10201807208RA (en) 2014-03-04 2018-09-27 Sigma Aldrich Co Llc Viral resistant cells and uses thereof
CN106459894B (zh) 2014-03-18 2020-02-18 桑格摩生物科学股份有限公司 用于调控锌指蛋白表达的方法和组合物
EP3134729A1 (en) 2014-04-22 2017-03-01 Q-State Biosciences, Inc. Analysis of compounds for pain and sensory disorders
WO2015164748A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered transcription activator like effector (tale) proteins
US11918695B2 (en) 2014-05-09 2024-03-05 Yale University Topical formulation of hyperbranched polymer-coated particles
WO2015172153A1 (en) 2014-05-09 2015-11-12 Yale University Topical formulation of hyperbranched polyglycerol-coated particles thereof
WO2015175642A2 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
WO2015184262A1 (en) 2014-05-30 2015-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods of delivering treatments for latent viral infections
US9970001B2 (en) 2014-06-05 2018-05-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease design
CA2952906A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Cellectis Potatoes with reduced granule-bound starch synthase
WO2016011029A2 (en) 2014-07-14 2016-01-21 Washington State University Nanos knock-out that ablates germline cells
JP7113618B2 (ja) 2014-07-15 2022-08-05 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 養子細胞療法用の操作された細胞
WO2016025759A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Shen Yuelei Dna knock-in system
SG11201702134RA (en) 2014-09-16 2017-04-27 Sangamo Therapeutics Inc Methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering and correction in hematopoietic stem cells
KR102630014B1 (ko) 2014-10-01 2024-01-25 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 뉴클레아제-유도 상동성-지정 복구의 효율 증가 방법
SG11201702614SA (en) 2014-10-01 2017-04-27 Eagle Biolog Inc Polysaccharide and nucleic acid formulations containing viscosity-lowering agents
US10889834B2 (en) 2014-12-15 2021-01-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration
EP3247366A4 (en) 2015-01-21 2018-10-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for identification of highly specific nucleases
US10048275B2 (en) 2015-03-13 2018-08-14 Q-State Biosciences, Inc. Cardiotoxicity screening methods
EP4335918A3 (en) 2015-04-03 2024-04-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of b-cells
EP3286322A1 (en) 2015-04-21 2018-02-28 Novartis AG Rna-guided gene editing system and uses thereof
DK3289080T3 (da) 2015-04-30 2021-11-08 Univ Columbia Genterapi til autosomalt dominante sygdomme
CA2986583A1 (en) 2015-05-21 2016-11-24 Q-State Biosciences, Inc. Optogenetics microscope
WO2016196282A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Agenovir Corporation Compositions and methods for cell targeted hpv treatment
MA43344A (fr) 2015-05-29 2018-04-11 Juno Therapeutics Inc Composition et procédés de régulation des interactions inhibitrices dans les cellules génétiquement modifiées
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
US10450585B2 (en) 2015-07-13 2019-10-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
US10091975B2 (en) 2015-08-06 2018-10-09 The Curators Of The University Of Missouri Pathogen-resistant animals having modified CD163 genes
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US10837024B2 (en) 2015-09-17 2020-11-17 Cellectis Modifying messenger RNA stability in plant transformations
WO2017106528A2 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of the t cell receptor
IL297018A (en) 2015-12-18 2022-12-01 Sangamo Therapeutics Inc Directed cleavage of cell mhc receptor
ES2895430T3 (es) 2016-01-15 2022-02-21 Univ Minnesota Métodos y composiciones para el tratamiento de enfermedad neurológica
KR20180101442A (ko) 2016-02-02 2018-09-12 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 Dna-결합 도메인 및 절단 도메인을 연결시키기 위한 조성물
EP3410843A1 (en) 2016-02-02 2018-12-12 Cellectis Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the fad3a/b/c genes
WO2017143061A1 (en) 2016-02-16 2017-08-24 Yale University Compositions and methods for treatment of cystic fibrosis
JP2019508037A (ja) 2016-02-16 2019-03-28 イェール ユニバーシティーYale Universit 標的化遺伝子編集を増強するための組成物およびその使用方法
WO2017147536A1 (en) 2016-02-24 2017-08-31 The Rockefeller University Embryonic cell-based therapeutic candidate screening systems, models for huntington's disease and uses thereof
WO2017165167A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 The Regents Of The University Of California Methods of treating mitochondrial disorders
US20190117799A1 (en) 2016-04-01 2019-04-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications
WO2017189914A1 (en) 2016-04-27 2017-11-02 Massachusetts Institute Of Technology Sequence-controlled polymer random access memory storage
US11410746B2 (en) 2016-04-27 2022-08-09 Massachusetts Institute Of Technology Stable nanoscale nucleic acid assemblies and methods thereof
US11021713B2 (en) 2016-05-25 2021-06-01 Cargill, Incorporated Engineered nucleases to generate deletion mutants in plants
MA44031B1 (fr) 2016-05-26 2021-06-30 Nunhemes B V Plantes produisant des fruits sans graines
WO2017205846A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Aadigen, Llc Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of genome-editing molecules
CN110291402B (zh) 2016-06-27 2023-09-01 朱诺治疗学股份有限公司 鉴定肽表位的方法、结合此类表位的分子和相关用途
MA45491A (fr) 2016-06-27 2019-05-01 Juno Therapeutics Inc Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés
EP4219462A1 (en) 2016-07-13 2023-08-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods, compositions and kits for increasing genome editing efficiency
JP2019520844A (ja) 2016-07-21 2019-07-25 マックスサイト インコーポレーティッド ゲノムdnaを改変するための方法および組成物
WO2018031920A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 The Jackson Laboratory Methods and compositions relating to improved human red blood cell survival in genetically modified immunodeficient non-human animals
SG10201913315SA (en) 2016-08-24 2020-02-27 Sangamo Therapeutics Inc Regulation of gene expression using engineered nucleases
SG11201901364VA (en) 2016-08-24 2019-03-28 Sangamo Therapeutics Inc Engineered target specific nucleases
WO2018044920A1 (en) 2016-08-29 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Topical formulations based on ionic species for skin treatment
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
US10961505B2 (en) 2016-10-05 2021-03-30 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generating mature lineages from induced pluripotent stem cells with MECP2 disruption
ES2939646T3 (es) 2016-10-13 2023-04-25 Juno Therapeutics Inc Métodos y composiciones de inmunoterapia que comprenden moduladores de la vía metabólica del triptófano
EP3528852A4 (en) 2016-10-20 2020-06-03 Sangamo Therapeutics, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF FABRY'S DISEASE
WO2018081138A1 (en) 2016-10-24 2018-05-03 Yale University Biodegradable contraceptive implants
WO2018081775A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Sangamo Therapeutics, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
WO2018144097A1 (en) 2016-11-04 2018-08-09 Akeagen Llc Genetically modified non-human animals and methods for producing heavy chain-only antibodies
US11332713B2 (en) 2016-11-16 2022-05-17 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
CA3042857A1 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Cellectis Methods for altering amino acid content in plants through frameshift mutations
WO2018102612A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 Juno Therapeutics, Inc. Engineered b cells and related compositions and methods
CN110249051A (zh) 2016-12-08 2019-09-17 凯斯西储大学 增强功能性髓鞘产生的方法和组合物
WO2018112470A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Co-delivery of nucleic acids for simultaneous suppression and expression of target genes
WO2018140478A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Sigma-Aldrich Co. Llc Viral resistant cells and culture systems
CN110891417B (zh) 2017-03-21 2023-05-23 杰克逊实验室 表达人APOE4和小鼠Trem2 p.R47H的遗传修饰小鼠及其使用方法
WO2018187493A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Yale University Compositions and methods for in utero delivery
KR20190140950A (ko) 2017-04-20 2019-12-20 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 인간 유전자 교정
WO2018198049A1 (en) 2017-04-25 2018-11-01 Cellectis Alfalfa with reduced lignin composition
SG10202112528QA (en) 2017-05-12 2021-12-30 Jackson Lab Nsg mice lacking mhc class i and class ii
DK3538645T3 (da) 2017-06-20 2021-04-19 Inst Curie Immunceller der mangler suv39h1
US11851679B2 (en) 2017-11-01 2023-12-26 Juno Therapeutics, Inc. Method of assessing activity of recombinant antigen receptors
US10940171B2 (en) 2017-11-10 2021-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Microbial production of pure single stranded nucleic acids
WO2019100053A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for modulating hif-2α to improve muscle generation and repair
EP3501268B1 (en) 2017-12-22 2021-09-15 KWS SAAT SE & Co. KGaA Regeneration of plants in the presence of histone deacetylase inhibitors
EP3508581A1 (en) 2018-01-03 2019-07-10 Kws Saat Se Regeneration of genetically modified plants
CN111566121A (zh) 2018-01-12 2020-08-21 巴斯夫欧洲公司 小麦7a染色体上决定每穗小穗数QTL的基因
AU2019209292B2 (en) 2018-01-17 2023-10-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Quinoxalinone compounds, compositions, methods, and kits for increasing genome editing efficiency
CN111757876B (zh) 2018-01-17 2024-03-22 沃泰克斯药物股份有限公司 Dna-pk抑制剂
CA3088788A1 (en) 2018-01-17 2019-07-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Dna-pk inhibitors
JP7275152B2 (ja) 2018-02-08 2023-05-17 サンガモ セラピューティクス, インコーポレイテッド 操作された標的特異的なヌクレアーゼ
EP3765092A4 (en) 2018-03-15 2022-01-12 KSQ Therapeutics, Inc. GENE REGULATORY COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVED IMMUNOTHERAPY
US20190284553A1 (en) 2018-03-15 2019-09-19 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
EP3768327A4 (en) 2018-03-23 2022-04-13 The Trustees of Columbia University in the City of New York GENE EDIT FOR AUTOSOMAL DOMINANT DISEASES
EP3545756A1 (en) 2018-03-28 2019-10-02 KWS SAAT SE & Co. KGaA Regeneration of plants in the presence of inhibitors of the histone methyltransferase ezh2
JP2021520211A (ja) 2018-04-05 2021-08-19 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 組換え受容体を発現するt細胞、関連ポリヌクレオチド、および方法
CA3094468A1 (en) 2018-04-05 2019-10-10 Juno Therapeutics, Inc. Methods of producing cells expressing a recombinant receptor and related compositions
EP3567111A1 (en) 2018-05-09 2019-11-13 KWS SAAT SE & Co. KGaA Gene for resistance to a pathogen of the genus heterodera
US20210254087A1 (en) 2018-06-15 2021-08-19 KWS SAAT SE & Co. KGaA Methods for enhancing genome engineering efficiency
AU2019285085B2 (en) 2018-06-15 2024-04-18 KWS SAAT SE & Co. KGaA Methods for improving genome engineering and regeneration in plant II
US20220025388A1 (en) 2018-06-15 2022-01-27 KWS SAAT SE & Co. KGaA Methods for improving genome engineering and regeneration in plant
US11291176B2 (en) 2018-06-15 2022-04-05 Nunhems B.V. Seedless watermelon plants comprising modifications in an ABC transporter gene
WO2019246483A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 The Jackson Laboratory Genetically modified mouse models of alzheimer's disease
WO2020028617A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for improving embryo development
IL280951B1 (en) 2018-08-23 2024-04-01 Sangamo Therapeutics Inc Engineered target-specific base editors
MX2021002266A (es) 2018-08-31 2021-05-27 Univ Yale Composiciones y metodos para aumentar la edicion de genes basados en nucleasa y triplex.
WO2020051283A1 (en) 2018-09-05 2020-03-12 The Regents Of The University Of California Generation of heritably gene-edited plants without tissue culture
EP3623379A1 (en) 2018-09-11 2020-03-18 KWS SAAT SE & Co. KGaA Beet necrotic yellow vein virus (bnyvv)-resistance modifying gene
WO2020061161A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Programmed cell death 1 (pd1) specific nucleases
SG11202104561YA (en) 2018-11-08 2021-05-28 Triton Algae Innovations Inc Compositions and methods for incorporating heme from algae in edible products
KR20200071198A (ko) 2018-12-10 2020-06-19 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 Nrf2 발현 조절 기반 T 세포 항암면역치료법
CA3123890A1 (en) 2019-01-04 2020-07-09 Cargill Incorporated Engineered nucleases to generate mutations in plants
US11419932B2 (en) 2019-01-24 2022-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid nanostructure platform for antigen presentation and vaccine formulations formed therefrom
US20220112511A1 (en) 2019-01-29 2022-04-14 The University Of Warwick Methods for enhancing genome engineering efficiency
EP3708651A1 (en) 2019-03-12 2020-09-16 KWS SAAT SE & Co. KGaA Improving plant regeneration
KR20210146986A (ko) 2019-04-02 2021-12-06 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 베타-지중해빈혈의 치료 방법
JP2022526429A (ja) 2019-04-10 2022-05-24 ザ ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデイション Amdの処置のためのhtra1調節
KR20220016475A (ko) 2019-05-01 2022-02-09 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 변형된 tgfbr2 유전자 좌에서 재조합 수용체를 발현하는 세포, 관련 폴리뉴클레오티드 및 방법
WO2020223571A1 (en) 2019-05-01 2020-11-05 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified cd247 locus, related polynucleotides and methods
US11905532B2 (en) 2019-06-25 2024-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for molecular memory storage and retrieval
EP3757219A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 KWS SAAT SE & Co. KGaA Enhanced plant regeneration and transformation by using grf1 booster gene
CA3146895A1 (en) 2019-07-23 2021-01-28 Mnemo Therapeutics Immune cells defective for suv39h1
CN115151275A (zh) 2019-08-30 2022-10-04 耶鲁大学 用于向细胞递送核酸的组合物和方法
BR112022009067A2 (pt) 2019-11-12 2022-08-09 Kws Saat Se & Co Kgaa Gene para resistência a um patógeno do gênero heterodera
JP2023525513A (ja) 2020-05-06 2023-06-16 セレクティス ソシエテ アノニム 細胞ゲノムにおける外因性配列の標的化挿入のための方法
US20230279440A1 (en) 2020-05-06 2023-09-07 Cellectis S.A. Methods to genetically modify cells for delivery of therapeutic proteins
WO2021231661A2 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing donor-batched cells expressing a recombinant receptor
JP2023531531A (ja) 2020-06-26 2023-07-24 ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー 組換え受容体を条件付きで発現する操作されたt細胞、関連ポリヌクレオチド、および方法
CN116096864A (zh) 2020-07-30 2023-05-09 居里研究所 Socs1缺陷的免疫细胞
WO2022046760A2 (en) 2020-08-25 2022-03-03 Kite Pharma, Inc. T cells with improved functionality
CN116802203A (zh) 2020-11-04 2023-09-22 朱诺治疗学股份有限公司 从经修饰的恒定cd3免疫球蛋白超家族链基因座表达嵌合受体的细胞、相关多核苷酸和方法
CA3200855A1 (en) 2020-11-16 2022-05-19 Pig Improvement Company Uk Limited Influenza a-resistant animals having edited anp32 genes
EP4019638A1 (en) 2020-12-22 2022-06-29 KWS SAAT SE & Co. KGaA Promoting regeneration and transformation in beta vulgaris
EP4019639A1 (en) 2020-12-22 2022-06-29 KWS SAAT SE & Co. KGaA Promoting regeneration and transformation in beta vulgaris
CA3208944A1 (en) 2021-03-22 2022-09-29 Edith NALBANDIAN Method to assess potency of viral vector particles
CA3218511A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Sqz Biotechnologies Company Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
WO2022251644A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
EP4347826A1 (en) 2021-06-02 2024-04-10 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
WO2022271548A2 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Massachusetts Institute Of Technology Compositions, methods and systems for the delivery of gene editing material to cells
WO2023064924A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Codiak Biosciences, Inc. Modified producer cells for extracellular vesicle production
CA3237482A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
WO2023081923A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Frequency Therapeutics, Inc. Platelet-derived growth factor receptor (pdgfr) alpha inhibitors and uses thereof
WO2023081900A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Juno Therapeutics, Inc. Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods
TW202328201A (zh) 2021-11-09 2023-07-16 美商安進公司 產生抗體肽軛合物的方法
WO2023105244A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Pig Improvement Company Uk Limited Editing tmprss2/4 for disease resistance in livestock
WO2023126458A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Mnemo Therapeutics Immune cells with inactivated suv39h1 and modified tcr
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023168397A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Sigma-Aldrich Co. Llc Metabolic selection via the asparagine biosynthesis pathway
WO2023225665A1 (en) 2022-05-19 2023-11-23 Lyell Immunopharma, Inc. Polynucleotides targeting nr4a3 and uses thereof
EP4279085A1 (en) 2022-05-20 2023-11-22 Mnemo Therapeutics Compositions and methods for treating a refractory or relapsed cancer or a chronic infectious disease
WO2024013514A2 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Pig Improvement Company Uk Limited Gene edited livestock animals having coronavirus resistance
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2024062138A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Mnemo Therapeutics Immune cells comprising a modified suv39h1 gene
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024073692A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Sigma-Aldrich Co. Llc Metabolic selection via the glycine-formate biosynthesis pathway
WO2024073686A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Sigma-Aldrich Co. Llc Metabolic selection via the serine biosynthesis pathway
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0589958A4 (en) * 1991-06-11 1995-04-26 Gen Hospital Corp UNIVERSAL NUCLEASES ACTING ON A SPECIFIED SITE.
US5436150A (en) * 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
JPH08510375A (ja) * 1993-02-12 1996-11-05 ザ・ジョンズ−ホプキンス・ユニバーシティー フラボバクテリウム・オケアノコイテス(foki)制限エンドヌクレアーゼの機能ドメイン

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