JP2013081471A - フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン - Google Patents
フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013081471A JP2013081471A JP2012279894A JP2012279894A JP2013081471A JP 2013081471 A JP2013081471 A JP 2013081471A JP 2012279894 A JP2012279894 A JP 2012279894A JP 2012279894 A JP2012279894 A JP 2012279894A JP 2013081471 A JP2013081471 A JP 2013081471A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- endonuclease
- dna segment
- foki
- domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 241000589579 Planomicrobium okeanokoites Species 0.000 title description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 93
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 93
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 195
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 83
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 61
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 61
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 60
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 22
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 19
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 14
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 5
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 102000023888 sequence-specific DNA binding proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108091008420 sequence-specific DNA binding proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 88
- 108010026638 endodeoxyribonuclease FokI Proteins 0.000 abstract description 42
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 16
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 16
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 abstract description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 72
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 67
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 39
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 39
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 39
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 36
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 29
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 24
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 23
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 15
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 15
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 14
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 13
- 101150057450 fokIR gene Proteins 0.000 description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 8
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 8
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 101150070061 fokIM gene Proteins 0.000 description 6
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 6
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 6
- BOFUZZAQNVYZFF-UHFFFAOYSA-N 2-(3-chlorophenyl)-3-methylmorpholine Chemical compound CC1NCCOC1C1=CC=CC(Cl)=C1 BOFUZZAQNVYZFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101100024586 Planomicrobium okeanokoites fokIM gene Proteins 0.000 description 5
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 5
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 101100312863 Planomicrobium okeanokoites fokIR gene Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 108010087765 Antipain Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N antipain Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 108010062513 snake venom phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical class 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Br VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100539485 Caenorhabditis elegans unc-86 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 1
- 108010090738 DNA Modification Methylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013381 DNA Modification Methylases Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100035591 POU domain, class 2, transcription factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101150054854 POU1F1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 101150022483 SLC22A2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000194023 Streptococcus sanguinis Species 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- YPWFISCTZQNZAU-UHFFFAOYSA-N Thiane Chemical compound C1CCSCC1 YPWFISCTZQNZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100022221 Y-box-binding protein 3 Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 101150054175 cro gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000005363 electrowinning Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 108010083127 phage repressor proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 101150056399 slc20a1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- FQIYBGJSPWHUQN-UHFFFAOYSA-N sulfanyloxymethane Chemical compound COS FQIYBGJSPWHUQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 239000007160 ty medium Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
Abstract
【課題】ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの認識ドメインおよび開裂ドメインを同定し、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの認識ドメインおよび開裂ドメインの夫々をコードするＤＮＡセグメントを提供する。
【解決手段】４１kDaのＮ末端フラグメントはＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの認識ドメインを構成し、４１kDaのＣ末端フラグメントはＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインを構成する。他の酵素の認識ドメインに連結されたＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインを含むハイブリッド制限酵素。このようなハイブリッド制限酵素の一つは、Ｕｂｘ−ＦＮである。この酵素は、ＦｏｋＩの開裂もしくはヌクレアーゼドメインに連結されたＵｂｘのホメオドメインを含んでいる。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの二つの挿入変異体。
【選択図】なし
【解決手段】４１kDaのＮ末端フラグメントはＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの認識ドメインを構成し、４１kDaのＣ末端フラグメントはＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインを構成する。他の酵素の認識ドメインに連結されたＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインを含むハイブリッド制限酵素。このようなハイブリッド制限酵素の一つは、Ｕｂｘ−ＦＮである。この酵素は、ＦｏｋＩの開裂もしくはヌクレアーゼドメインに連結されたＵｂｘのホメオドメインを含んでいる。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの二つの挿入変異体。
【選択図】なし
Description
〔発明の背景〕
１．発明の技術分野
本発明はＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ系に関する。特に、本発明はこの制限エンドヌクレアーゼ系の分離した機能ドメインをコードするＤＮＡセグメントに関する。
１．発明の技術分野
本発明はＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ系に関する。特に、本発明はこの制限エンドヌクレアーゼ系の分離した機能ドメインをコードするＤＮＡセグメントに関する。
本発明はまた、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの二種類の挿入変異体の構築に関する。
加えて、本発明は超双胸系(Ultrabithorax)ＵｂｘホメオドメインをＦｏｋＩの開裂ドメイン（ＦＮ）に連結することによって製造されるハイブリッド酵素（Ｕｂｘ−ＦＮ）に関する。
２．従来技術
ＩＩ型エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼ(modification methylase)は、二本鎖ＤＮＡ中の特定の配列を認識するバクテリア酵素である。このエンドヌクレアーゼはＤＮＡを開裂するのに対し、該メチラーゼはアデニン残基またはシトシン残基をメチル化して宿主ゲノムを開裂から保護する［ＩＩ型制限酵素および修飾酵素；「ヌクレアーゼ」（Mordrich and Roberts編）；ニューヨーク、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ社刊；第109〜154頁；1982年］。これらの制限−修飾（Ｒ−Ｍ）系は、この系がなければ細胞を破壊するようなファージおよびプラスミドによる感染から、細胞を保護するように機能する。
ＩＩ型エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼ(modification methylase)は、二本鎖ＤＮＡ中の特定の配列を認識するバクテリア酵素である。このエンドヌクレアーゼはＤＮＡを開裂するのに対し、該メチラーゼはアデニン残基またはシトシン残基をメチル化して宿主ゲノムを開裂から保護する［ＩＩ型制限酵素および修飾酵素；「ヌクレアーゼ」（Mordrich and Roberts編）；ニューヨーク、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ社刊；第109〜154頁；1982年］。これらの制限−修飾（Ｒ−Ｍ）系は、この系がなければ細胞を破壊するようなファージおよびプラスミドによる感染から、細胞を保護するように機能する。
200以上の特異性を有する2500もの制限酵素が検出され、生成されている（Wilson and Murray, Annu. Rev. Genet. 25:585-627, 1991）。これら殆どの酵素の認識部位は、４〜６塩基対の長さである。ファージゲノムは通常は小さく、またファージにはこれらの小さい認識部位が高頻度で存在するから、認識部位の大きさがこのように小さいことは有益である。
ＩＩＳ型のクラスに属する、35以上の特異性をもった80の異なるＲ−Ｍ系が同定されている。このクラスは、酵素の開裂部位が認識配列から離れている点において特徴的である。通常、認識部位と開裂部部位との間の距離は極めて正確である（Szybalski et al., Gene, 100:13-26, 1991）。これら全ての酵素のうち、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは、最も良く特徴が調べられているＩＩＳ型クラスの酵素である。このＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ（ＲＦｏｋＩ）は、二本鎖ＤＮＡにおける非対称なペンタヌクレオチド、即ち、一方の鎖の５′−ＧＧＡＴＧ−３′（配列番号１）および他方の鎖の３′−ＣＣＴＡＣ−５′（配列番号２）を認識し、該認識部位から離間した部位に千鳥状（段違い）の開裂を導入する（Sugisaki et al., Gene 16:73-78; 1981）。これとは対照的に、 ＦｏｋＩメチラーゼ（ＭＦｏｋＩ）はＤＮＡを修飾することにより、該ＤＮＡを、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼによる消化に対して耐性にする。このＦｏｋＩ制限遺伝子およびＦｏｋＩ修飾遺伝子はクローン化され、そのヌクレオチド配列が推定されている（Kita et al., J. of Biol. Chem., 264:575-5756, 1989）。にもかかわらず、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのドメイン構造は、３ドメイン構造が示唆されてはいるが（Wilson and Murray, Annu. Rev. Genet. 25:585-627）、未だ未知のままである。
〔発明の概要〕
従って、本発明の一つの目的は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの単離されたドメインを提供することである。
従って、本発明の一つの目的は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの単離されたドメインを提供することである。
本発明の他の目的は、ゲノムのマッピングおよび配列決定に有用なハイブリッド制限酵素を提供することである。
本発明の更なる目的は、野生型酵素に比較して、認識部位から開裂部位までの距離が増大された、ＦｏｋＩの二つの挿入変異体を提供することである。この二つの変異体を構築するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が利用される。
本発明の他の種々の目的および利点は、添付の図面および以下の説明から明らかになるであろう。
一つの態様において、本発明は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの配列特異的認識活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメインをコードするＤＮＡセグメント；並びにＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡセグメントに関する。
他の態様において、本発明は、実質的にＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのＮ末端または認識ドメインからなり、且つ前記エンドヌクレアーゼの配列特異的認識活性を有する単離されたタンパク；または実質的にＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのＣ末端または触媒ドメインからなり、且つ前記エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を有する単離されたタンパクに関する。
更なる態様において、本発明はＤＮＡ構築物であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；ベクターとを含んだＤＮＡ構築物に関する。この構築物において、第一のＤＮＡセグメントおよび第二のＤＮＡセグメントは動作可能にベクターに連結されて、ハイブリッド制限酵素を産生するようになる。上記の連結は共有結合を介して行われる。
本発明のもう一つの態様は、原核細胞であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；ベクターとを含む原核細胞に関する。第一のＤＮＡセグメントおよび第二のＤＮＡセグメントは、単一のタンパクが産生されるように、動作可能に前記ベクターに連結される。第一のＤＮＡセグメントは、例えばＦｏｋＩの触媒ドメイン（ＦＮ）をコードしてもよく、また第二のＤＮＡセグメントは、例えばＵｂｘのホメオドメインをコードしてもよい。
他の態様において、本発明は、ハイブリッド制限酵素であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインを含んでおり、該触媒ドメインは、この触媒ドメインの取得源であるＩＩＳ型エンドヌクレアーゼ以外の酵素またはタンパクの認識ドメインに連結されているハイブリッド制限酵素に関する。
更に別の態様において、本発明はＤＮＡ構築物であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；前記第一のＤＮＡセグメントおよび前記第二のＤＮＡセグメントの間に挿入された、１以上のコドンを含む第三のＤＮＡセグメントと；ベクターとを含んだＤＮＡ構築物に関する。好ましくは、前記第三のセグメントは４または７のコドンを含んでいる。
他の態様において、本発明は原核細胞であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；前記第一のＤＮＡセグメントおよび前記第二のＤＮＡセグメントの間に挿入された、１以上のコドンを含む第三のＤＮＡセグメントと；ベクターとを含んだ原核細胞に関する。
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの機能ドメインの同定および特徴付けに基づいている。本発明に至る実験において、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは２ドメイン系であり、その一つのドメインは配列特異的認識活性を有するのに対して、他方のドメインはヌクレアーゼ開裂活性を含んでいることが見出された。
本発明は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの機能ドメインの同定および特徴付けに基づいている。本発明に至る実験において、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは２ドメイン系であり、その一つのドメインは配列特異的認識活性を有するのに対して、他方のドメインはヌクレアーゼ開裂活性を含んでいることが見出された。
このＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ中の非パリンドローム配列である５′−ＧＧＡＴＧ−３′（配列番号１）：５′−ＣＡＴＣＣ−３′（配列番号２）を認識し、該認識部位から９／１３ヌクレオチド下流を開裂させる。このＤＮＡヘリックスの１回転には１０塩基対を必要とするので、発明者は、該酵素は一点で結合することによってＤＮＡ面と相互作用し、該ヘリックスの次の回転の他点で切断するのであろうと仮定した。これは、離間した二つのタンパクドメイン（即ち、一つはＤＮＡの配列特異的認識のためのドメイン、他の一つはエンドヌクレアーゼ活性のためのドメイン）の存在を示唆している。この仮定された２ドメイン構造は、本発明に至る研究によって、 ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ系の正しい構造であることが示された。
従って、一態様において、本発明は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのＮ末端（好ましくは、該タンパクの２／３に当たるＮ末端部分）をコードするＤＮＡセグメントに関する。このセグメントは、当該エンドヌクレアーゼの配列特異的認識活性を有するタンパクをコードする。即ち、このコードされたタンパクは、二本鎖ＤＮＡ中の非パリンドローム配列であるｄ−５′−ＧＧＡＴＧ−３′（配列番号１）：５′−ＣＡＴＣＣ−３′（配列番号２）を認識する。好ましくは、本発明のこのＤＮＡセグメントとは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのアミノ酸1-382をコードする。
更なる態様において、本発明はＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのＣ末端をコードするＤＮＡセグメントに関する。本発明のこのＤＮＡセグメントによってコードされるタンパクは、 ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ開裂活性を有している。好ましくは、本発明のＤＮＡセグメントはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのアミノ酸383-578をコードする。本発明のＤＮＡセグメントは、当該技術において公知の方法、例えばゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはこれらの組合せを用いて、生物学的サンプルから容易に単離することができる。更に、本発明のＤＮＡセグメントは、当該技術において標準的な方法を用いて、化学的に合成することができる。
本発明はまた、本発明のＤＮＡセグメントによってコードされるタンパクに関する。従って、他の態様において、本発明は実質的にＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＮ末端からなり、当該酵素の配列特異的認識活性を保持しているタンパクに関する。本発明のこのタンパクは、2-メルカプトエタノールの存在下でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定された約41キロドルトンの分子量を有している。
更なる態様において、本発明は、実質的にＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのＣ末端（好ましくは該タンパクのＣ末端部分１／３）からなるタンパクに関する。2-メルカプトエタノールの存在下でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定したとき、このタンパクの分子量は約25キロドルトンである。
本発明のタンパクは、当該技術分野において周知の方法によって、生物学的サンプルから単離または精製することができる。例えば、このタンパクはＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼを単離し、開裂することによって得ることができる。或いは、本発明のタンパクは化学的に合成し、または組換えＤＮＡ技術を用いて製造し、精製することができる。
本発明のＤＮＡセグメントは、他のＤＮＡ結合性タンパクドメインをＦｏｋＩのヌクレアーゼ若しくは開裂ドメインと結合することにより、「ハイブリッド」タンパクを作製するために使用することができる。これは組換えＤＮＡ技術によると同様、化学的にも達成することができる。このようなキメラハイブリッド酵素は新規な配列特異性を有し、ヒト、マウスおよび植物のような様々な種におけるゲノムの生理的マッピングおよび配列決定のために有用である。例えば、このような酵素はヒトゲノムのマッピングにおける使用に適しているであろう。また、これらの加工されたハイブリッドエンドヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡの取り扱いを容易にし、タンパク構造およびタンパク設計に関して価値のある情報を提供するであろう。
このようなキメラ酵素はまた、組換えＤＮＡ技術および分子生物学において価値のある研究手段である。現在のところ、４〜６塩基対のカッターおよび幾つかの８塩基対カッターが商業的に入手可能であるに過ぎない。（＞６塩基対を切断する商業的に入手可能な約１０種類のエンドヌクレアーゼが存在している。） 他のＤＮＡ結合性タンパクをＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインに結合させることによって、ＤＮＡ中の７塩基対以上を認識する新規な酵素を作製することができる。
従って、更なる態様においては、本発明はＤＮＡ構築物と、その中に暗号化されているハイブリッド制限酵素に関する。本発明のＤＮＡ構築物は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと、配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと、ベクターとを含んでいる。第一のＤＮＡセグメントおよび第二のＤＮＡセグメントは、これらセグメントを発現してキメラ制限酵素を生じることができるように、動作可能にベクターに連結される。この構築物は、プロモータ（例えば、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｐおよびｌａｃ・ＵＶ５プロモータ）、転写ターミネータまたはレトロ調節因子類(retroregulators)（例えば、ステムループ(stem loop)）のような調節因子を含むことができる。ホスト細胞（E. coliのような原核細胞）は、本発明のＤＮＡ構築物で形質転換して、キメラ制限酵素の製造に用いることができる。
本発明のハイブリッド酵素は、他の酵素またはＤＮＡ結合性タンパク（例えば６塩基対を認識する、天然に存在するＤＮＡ結合性タンパク）に結合されたＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインから構成されている。適切な認識ドメインとしては、ジンクフィンガーモチーフの認識ドメイン；ホメオドメインモチーフ；ＰＯＵドメイン（真核転写レギュレータ、例えば、Ｐｉｔ１、Ｏｃｔ２およびｕｎｃ８６）；ラムダリプレッサ、ｌａｃリプレッサ、ｃｒｏ、ｇａｌ４の他のＤＮＡ結合性タンパクドメイン；ｍｙｃ、ｊｕｎのような発癌遺伝子のＤＮＡ結合性タンパクドメイン；および＞６塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的なＤＮＡ結合性タンパクが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明のハイブリッド制限酵素は、当業者が公知の方法論を用いて製造することができる。例えば、該酵素は化学的に合成することができ、或いは当該技術において周知の組換えＤＮＡ技術を用いて製造することができる。本発明のハイブリッド酵素は、本発明のＤＮＡ構築物を含むホスト細胞（ＨＢ１０１、ＲＲ１、ＲＢ７９１およびＭＭ２９４を培養し、当該タンパクを単離することによって製造することができる。更に、当該ハイブリッド酵素は、当該技術で公知の普通の連結技術、例えばＥＤＣ／ＮＨＳ、ＤＳＰ等のようなタンパク架橋剤を用いて、例えばＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインを認識ドメインに連結することによって、化学的に合成することができる。
本発明に従って作製することができ、従って本発明の一つの態様である特別なハイブリッド酵素は、Ｕｂｘ−ＦＮである。このキメラ制限エンドヌクレアーゼは、ＵｂｘホメオドメインをＦｏｋＩの開裂ドメイン（ＦＮ）に連結することによって製造することができる。精製に続いて、当該ハイブリッド酵素の特性を分析した。
ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは以下の実験において研究された酵素であるが、他のタイプのＩＩＳエンドヌクレアーゼ類（例えば表２に掲載したもの）は、本発明に基づいて当業者が容易に測定できるであろう同様の２ドメイン構造を用いて機能するであろうことが期待される。
最近、ストレプトコッカス・サングイス(Streptococcus sanguis)から、ＳｔｓＩ、即ちＦｏｋＩのヘテロ分裂体(heteroschizomer)が単離された（Kita et al., Nucleic Acid Research 20 (3),618, 1992）。このＳｔｓＩは、ＦｏｋＩと同じ非パリンドロームのペンタデオキシリボヌクレオチド、即ち、５′−ＧＧＡＴＧ−３′：５′−ＣＡＴＣＣ−３′を認識するが、該認識部位の１０／１４ヌクレオチド下流を開裂する。このＳｔｓＩ・ＲＭ系はクローニングされ、配列決定されている（Kita et al., Nucleic Acid Research 20 (16) 4167-72, 1992）。二つのエンドヌクレアーゼであるＦｏｋＩとＳｔｓＩの間に、顕著なアミノ酸配列の相同性（略３０％）が検出された。
本発明の他の態様は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの二つの挿入変異体の構築に関する。特に、この態様にはＤＮＡ構築物であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；１以上のコドンを含む第三のＤＮＡセグメントとを含んだＤＮＡ構築物に関する。第三のＤＮＡセグメントは、第一のＤＮＡセグメントおよび第二のＤＮＡセグメントの間に挿入される。この構築物はベクターをも含んでいる。上記のＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼである。
適切な認識ドメインとしては、ジンクフィンガーモチーフ；ホメオドメインモチーフ；ＰＯＵドメイン；リプレッサのＤＮＡ結合性ドメイン；発癌遺伝子のＤＮＡ結合性メイン；および＞６塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的なＤＮＡ結合性タンパクが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
上記で述べたように、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの認識ドメインはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのアミノ末端に存在するのに対して、開裂ドメインは、おそらくは該分子のカルボキシ末端側１／３(the carboxyl terminal third of the molecule)に存在する。上記のドメインはリンカー領域によって結合され、これによってＤＮＡ基質の認識部位と開裂部位との間の距離が決定される。このＦｏｋＩのリンカー領域は、ＤＮＡ基質の存在下においてトリプシンにより開裂し、４１kDaのアミノ末端フラグメント（ＤＮＡ結合性ドメイン）および２５kDaのカルボキシ末端フラグメント（開裂ドメイン）を生じ易い。一次アミノ酸配列に基づくＦｏｋＩの二次構造予測はこの仮説を支持している（図１０参照）。この予測された構造は、認識ドメインと開裂ドメインとの連結部における、長く伸びたアルファヘリックス領域を明らかにしている。このヘリックスは多分、該酵素の二つのドメインを結合するリンカーを構成している。こうして、認識部位からのＦｏｋＩの開裂距離はこのスペーサ（アルファヘリックス）の長さを変化させることによって変更できるであろうことが教示された。アルファヘリックスの１回転(one turn)には3.6のアミノ酸が必要とされるから、この領域に４コドンまたは７コドンを挿入することによって、天然の酵素に存在しているヘリックスは夫々１回転または２回転だけ延長されるであろう。このヘリックス領域のアミノ酸配列を詳細に検査することによって、アミノ酸ＥＥＫで離間された二つのＫＳＥＬ反復の存在（図１０）が明らかになった（配列番号２１参照）。ＫＳＥＬセグメント（４コドン）（配列番号２２参照）およびＫＳＥＬＥＥＫ（７コドン）（配列番号２３参照）は、このヘリックスを夫々１回転および２回転だけ延長するためにヘリックス中に挿入するための良好な選択であると思われる。 （実施例ＸおよびＸ
Ｉを参照のこと） こうして、変異体酵素を作製するために遺伝子工学が利用された。
Ｉを参照のこと） こうして、変異体酵素を作製するために遺伝子工学が利用された。
特に、これらの変異体は１以上、好ましくは４または７のコドンをＦｏｋＩの認識ドメインと開裂ドメインとの間に挿入することによって得られる。より特定的には、当該エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド1152に４コドンおよび７コドンが挿入される。この変異体は、野生型酵素と同様のＤＮＡ配列特異性を有している。しかしながら、野生型酵素と比較すると、これらは、ＤＮＡ基質の両鎖の認識部位から更に離間した一つのヌクレオチドを開裂する。
100ｂｐフラグメントの開裂に基づくＦｏｋＩおよび変異体の切断部位の分析が、図１５に纏めてある。ＦｏｋＩの認識部位と開裂部位との間に４（または７）コドンを挿入すると、認識部位から開裂部位までの距離の増加が伴う。この情報は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ内に、二つの離間したタンパクドメイン（一つは配列特異的認識部位であり、他方はエンドヌクレアーゼ活性である）が存在することを更に支持する。この二つのドメインは、ＤＮＡ基質の認識部位と開裂部位との間の距離を決定するリンカー領域によって結合される。この酵素のモジュール構造は、他のＤＮＡ結合性タンパクをＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの開裂ドメインに連結することによって、異なった配列特異性のキメラエンドヌクレアーゼを構築することが容易であろうことを示唆している。
上述した情報の観点から、本発明の他の態様には、原核細胞であって、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；１以上のコドンを含む第三のＤＮＡセグメントとを含んだ原核細胞が含まれる。第三のＤＮＡセグメントは、第一のＤＮＡセグメントおよび第二のＤＮＡセグメントの間に挿入される。また、この細胞はベクターをも含んでいる。加えて、前記第一のＤＮＡセグメント、前記第二のＤＮＡセグメントおよび前記第三のＤＮＡセグメントは、単一のタンパクが産生されるように前記ベクターに対して動作可能に連結される。前記第三のセグメントは、実質的に４または７のコドンからなっていてもよい。
また、本発明には上記で述べた原核細胞によって産生されるタンパクが含まれる。特に、この単離されたタンパクは実質的に、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの認識ドメインと、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインと、前記第三のＤＮＡセグメントに存在するコドンによってコードされるアミノ酸とからなっている。
以下の制限的でない実施例は、本発明をより詳細に説明するために与えられるものである。
〔実施例〕
実施例Ｉ
ＦｏｋＩＲＭ系のクローニング
ＦｏｋＩ系を、変更表現型を選択する事によってクローンした。フラボバクテリウム・オケアノコイテス（Flavobacterium okeanokoites) 株ＤＮＡを、カゼルタら（Caserta et al., J. Biol. Chem., 262:4770-4777, 1987) によって記載された方法によって単離した。
実施例Ｉ
ＦｏｋＩＲＭ系のクローニング
ＦｏｋＩ系を、変更表現型を選択する事によってクローンした。フラボバクテリウム・オケアノコイテス（Flavobacterium okeanokoites) 株ＤＮＡを、カゼルタら（Caserta et al., J. Biol. Chem., 262:4770-4777, 1987) によって記載された方法によって単離した。
数個のフラボバクテリウム・オケアノコイテスのゲノムライブラリーを、プラスミドｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１３中に、クローニング酵素ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩを使用して構築した。プラスミド・ライブラリーＤＮＡ（１０μｇ）を、１００ユニットのＦｏｋＩエンドヌークレアーゼで消化し、ＦｏｋＩＭ＋表現型を発現するプラスミドを選択した。
生存プラスミドをＲＲＩ細胞にトランスフォーム（形質転換）し，形質転換物細胞を適切な抗生物質を含むプレート上で選択した。生化学的濃縮を二回行なった後、ｆｏｋＩＭ＋表現型を発現する数個のプラスミドをこれらのライブラリーから同定した。これらのクローン由来のプラスミドは、ＦｏｋＩによる消化に対して完全に抵抗性を示した。
Ｆ．オケアノコイテスのｐＢＲ３２２ ＰｓｔＩライブラリーから分析して得られた８つの形質転換物の内、二つは，ｆｏｋＩＭ遺伝子を担持していたようであり、これらに由来するプラスミドは、５．５ｋｂのＰｓｔＩ断片を含んでいた。Ｆ．オケアノコイテスのｐＢＲ３２２ ＢａｍＨＩライブラリーからピックアップされた８つの形質転換物の内、二つは，ｆｏｋＩＭ遺伝子を担持していたようであり、これらに由来するプラスミドは、１８ｋｂのＢａｍＨＩ断片を含んでいた。ｐＵＣ１３中のＦ．オケアノコイテスのゲノムＢｇｌＩＩライブラリーから分析された８つの形質転換物の内、６つが、ｆｏｋＩＭ遺伝子を担持していたようであり、これらのクローンの内３つが、８ｋｂのＢｇｌＩＩ挿入物を担持し、残りは１６ｋｂのＢｇｌＩＩ断片を担持していた。
これらのクローンについてのファージλのプレーテイング効率から、これらのクローンもまた、ｆｏｋＩＲ遺伝子を担時している事が示唆される。８ｋｂ のＢｇｌＩＩ挿入物を担持するクローンは、ファージ感染に一番抵抗性を示したようだ。更に，ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ活性が、ホスホセルロース・カラムで、部分精製を行った後のこのクローンの粗抽出物中で検出された。このクローン由来のプラスミド、ｐＵＣｆｏｋＩＲＭを選んで、更に特徴付けを行った。
５．５ｋｂ ＰｓｔＩ断片を、Ｍ１３ファージにトランスファーし、この挿入物の部分的ヌクレオチド配列を、サンガーのシークエンス法 (Sanger et al., PNAS USA, 74:5463-5467, 1977)を使用して決定した。ＦｏｋＩＲＭ系の完全なヌクレオチド配列は、別の研究室（Looney et al., Gene, 80:193-208, 1989; Kita et al., Nucleic Acid Res., 17:8741-8753, 1989; Kita et al., J. Biol. Chem. 264:5751-5756, 1989)によって公表されている。
実施例ＩＩ
ポリメラーゼ・チエイン・リアクションを使用したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの効率的過剰生産者クローンの構築
ＰＣＲテクニックを使用してｆｏｋＩＲ遺伝子を囲む転写及び翻訳信号を変更し、大腸菌における過剰発現を遂行した（Skoglund et al., Gene, 88:1-5, 1990)。ｆｏｋＩＲ及びｆｏｋＩＭ遺伝子に先行するリボソーム結合部位を変更し、共通する大腸菌信号に適合させる。
ポリメラーゼ・チエイン・リアクションを使用したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの効率的過剰生産者クローンの構築
ＰＣＲテクニックを使用してｆｏｋＩＲ遺伝子を囲む転写及び翻訳信号を変更し、大腸菌における過剰発現を遂行した（Skoglund et al., Gene, 88:1-5, 1990)。ｆｏｋＩＲ及びｆｏｋＩＭ遺伝子に先行するリボソーム結合部位を変更し、共通する大腸菌信号に適合させる。
ＰＣＲ反応において、ＢａｍＨＩで直線化されたプラスミドｐＵＣｆｏｋＩＲＭ ＤＮＡが、テンプレートとして使用された。ＰＣＲ反応物（１００μｌ）には、０．２５ ｎｍｏｌの各プライマー 、５０ μＭの各ｄＮＴＰ、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ(ｐＨ８．３、２５℃）、５０ ｍＭ ＫＣｌ, １．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２, ０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、１ ｎｇのテンプレートＤＮＡ、５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが含まれていた。ｆｏｋＩＲ及びｆｏｋＩＭ遺伝子の増幅に使用されるオリゴプライマーを、図１に示す。反応混合物（４重に行なう）上に鉱物油を載置し、パーキン・エルマー・シータス（Perkin-Elmer-Cetus)熱サイクラーを使用して反応を実施した。
最初のテンプレート変性は２分間とプログラムされた。その後、サイクルプロフィルは、３７℃で２分（アニーリング）、７２℃で５分（伸張）、９４℃で１分（変性）というようにプログラムされた。このプロフィルを２５サイクル繰り返し、最後の７２℃伸張を１０分まで延長した。反応混合物の水層をプールし、１：１フェノール／クロロフォルムで一回、クロロフォルムで二回、抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、２０μｌのＴＥ緩衝液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］で再懸濁した。次に、ＤＮＡを適切な制限酵素で切断して付着末端を生成し、ゲル精製を行なった。
過剰生産者クローンの構築は、二段階で行なわれた。はじめに、ｆｏｋＩＭ遺伝子を含むＰＣＲ産生ＤＮＡをＮｃｏＩで消化し、ゲル精製を行った。次に、該ＤＮＡをＮｃｏＩ切断し、脱リン酸化されたｐＡＣＹＣ１８４に連結し、該組替ＤＮＡは、マニアチス（Maniatis et al., Molecular Cloning. A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). 等に記載の様に受容可能状態（コンピテント）にした大腸菌ＰＢ７９１ｉｇまたはＲＲＩ細胞にトランスフェクトされた。 Ｔｃ選択後、数個のクローンをピックアップし、プラスミドＤＮＡを制限分析にかけ、ｆｏｋＩＭ遺伝子断片がベクターのクロラムフェニコールのプロモーターに対して正しい方向で存在しているかどうかについて調べた（図２参照）。該プラスミドは、ＦｏｋＩメチラーゼを構成的に発現する。これは、ｆｏｋＩＲ遺伝子を、適合性プラスミドのホスト中に導入する際のホストの染色体切断を防ぐ。それ故、これらのクローン由来のプラスミドＤＮＡは、ＦｏＫＩ消化に対して、抵抗性がある。
次に、ＰＣＲで産生されたｆｏｋＩＲ断片は、ＢａｍＨＩに切断され、脱リン酸化された高発現ベクターｐＲＲＳまたはｐＣＢに連結された。ｐＲＲＳは、ｌａｃ ＵＶ５ プロモータ及び強ｔａｃプロモータを含むｐＣＢを担持している。加えて、これらのベクターは、挿入されたｆｏｋＩＲ遺伝子のバチルス・サーリンジェンシス（Bacillus Thuringiensis) 下流の結晶タンパク質をコードする遺伝子に由来する陽性レトロ調節ステップループ配列を含んでいる。
該組替ＤＮＡを受容可能な大腸菌ＲＢ７９１ｉｇ［ｐＡＣＹＣｆｏｋＩＭ］または、ＲＲ１［ｐＡＣＹＣｆｏｋＩＭ］細胞にトランスフェクトした。Ｔｃ及びＡｐ抗生物質選択をした後、数個のクローンをピックアップして、プラスミドＤＮＡを制限分析にかけ、ｆｏｋＩＲ遺伝子がベクター・プロモータからの発現について正しい配向にあるかどうかについて調べた。次に、これらの構築物の酵素産生について調べた。
酵素を産生するために、プラスミド含有ＲＢ７９１ｉｇまたは、ＲＲ１細胞を、３７℃で、２０μｇＴｃ／ｍｌ（ｐＵＣｆｏｋＩＲＭプラスミド以外）及び５０μｇ Ａｐ／ｍｌを補給した２倍濃縮のＴＹ培地［１．６％トリプトン、１％酵素抽出物、０．５％ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）］中で、振盪しながら生育させた。細胞密度がＯ．Ｄ．６００＝０．８に達した時、ＩＰＴＧを濃度１ｍＭまで加えた。該細胞を、振盪しながら一晩（１２時間）インキュベートした。 図２に示すように、両構築物はＦｏｋＩを全細胞蛋白の５−８％のレベルまで産生した。
実施例III
ＦｏＫＩエンドヌクレアーゼの精製
シンプルな３段階精製法を使用して、電気泳動法的に均質なＦｏｋＩエンドヌクレアーゼを得た。ＲＲ１［ｐＡＣＹＣｆｏｋＩＭ、ｐＲＲＳｆｏｋＩＲ］を、３７℃で、２０ μｇ Ｔｃ／ｍｌ及び５０ μｇ／Ａｐ ｍｌを含む２倍濃縮のＴＹ６ｌ中で、Ａ６００＝０．８まで生育させ、１ｍＭ ＩＰＴＧで、一晩誘導した。遠心分離によって細胞を収穫し、５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む２５０ｍｌの緩衝液Ａ［１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ燐酸（ｐＨ８．０）、７ ｍＭ ２ーメルカプトメタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ グリセロール］中に再懸濁した。
ＦｏＫＩエンドヌクレアーゼの精製
シンプルな３段階精製法を使用して、電気泳動法的に均質なＦｏｋＩエンドヌクレアーゼを得た。ＲＲ１［ｐＡＣＹＣｆｏｋＩＭ、ｐＲＲＳｆｏｋＩＲ］を、３７℃で、２０ μｇ Ｔｃ／ｍｌ及び５０ μｇ／Ａｐ ｍｌを含む２倍濃縮のＴＹ６ｌ中で、Ａ６００＝０．８まで生育させ、１ｍＭ ＩＰＴＧで、一晩誘導した。遠心分離によって細胞を収穫し、５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む２５０ｍｌの緩衝液Ａ［１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ燐酸（ｐＨ８．０）、７ ｍＭ ２ーメルカプトメタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ グリセロール］中に再懸濁した。
該細胞を、ブランソン(Branson）超音波器で、最高強度、一時間４℃で破砕した。超音波破砕された細胞は１２、０００ｇ、２時間、４℃で、遠心分離された。上澄液を、５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで、１Ｌまで希釈した。上澄液を、５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで予め平衡化された１０ｍｌのホスホセルロース（Whatman)カラムに充填した。該カラムを、５０ｍｌのローデイグ緩衝液で洗浄し、蛋白を緩衝液中、０．０５Ｍから０．５ＭのＮａＣｌの８０ｍｌ全勾配で抽出した。各画分は、Ａ２８０吸光でモニターされ、ＳＤＳ（０．１％）ポリアクリルアミド（１２％）ゲル(Laemmli, Nature 222,:680-685, 1970)上の電気泳動法で分析された。蛋白は、クマシー・ブルーで染色された。
各分画の制限エンドヌクレアーゼ活性を、ｐＴＺ１９Ｒを基質として使用して分析した。ＦｏｋＩを含む各分画はプールされ、燐酸アルミニウムで分画された。５０−７０％の硫酸アルミニウム分画は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼを含有していた。沈澱物は、２５ ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液５０ｍｌ中に再懸濁され、ＤＥＡＥカラムに充填された。多くの不純蛋白はＤＥＡＥに結合するのに対して、ＦｏｋＩ結合しない。流出液は燐酸セルロースカラムで濃縮した。ゲルろ過（ＡｃＡ４４）カラムを使用して精製が更になされた。ＦｏｋＩは、本方法を使用して、電気泳動的に均質になるまで、精製された。
各精製段階に存在する蛋白種のＳＤＳ（０．１％）ポリアクリルアミド（１２％）ゲル電気泳動プロフィルを、図３に示す。精製された酵素の最初の１０アミノ酸の配列が、蛋白のシークエンスにより決定された。決定された配列は、ヌクレオチド配列から推定されたものと同じであった。精製された酵素の結晶を、ＰＥＧ４０００を沈澱剤として使用して、成長させた。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼは、ＡｃＡ４４ゲルろ過カラムを使用して、さらに精製された。
実施例ＩＶ
ＤＮＡ基質の存在下におけるトリプシン開裂によるＦｏｋＩＲエンドヌクレアーゼの分析
トリプシンはセリン・プロテアーゼであり、リジン及びアルギニン残基のＣ末端で開裂する。これは、蛋白及び酵素のドメイン構造を研究するのに大変有用な酵素である。ＦｏｋＩのトリプリン消化は、その基質、d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3'(配列認識番号１０): 5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'(配列認識番号１１)の存在下で、オリゴヌクレオチド二量体：ＦｏｋＩ分子比 ＝２．５：１で、実施された。ＦｏｋＩ（２００μｇ）をオリゴヌクレオチド二量体と一緒に、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ％ グリセロール、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、を含む容積１８０μｌ中で、室温にて１時間インキュベートした。トリプシン（２０ μｌ、０．２ ｍｇ／ｍｌ）を、混合物中に添加した。反応混合物からアリコット（２８μｌ）を別々の時間間隔をおいてとり、過剰のトリプシン阻害剤、アンチパインでクエンチングした。該トリプシン断片を、逆相ＨＰＬＣで精製し、そのＮ末端配列を、Applied Biosystemの自動蛋白シークエンサーを使用して決定した。
ＤＮＡ基質の存在下におけるトリプシン開裂によるＦｏｋＩＲエンドヌクレアーゼの分析
トリプシンはセリン・プロテアーゼであり、リジン及びアルギニン残基のＣ末端で開裂する。これは、蛋白及び酵素のドメイン構造を研究するのに大変有用な酵素である。ＦｏｋＩのトリプリン消化は、その基質、d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3'(配列認識番号１０): 5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'(配列認識番号１１)の存在下で、オリゴヌクレオチド二量体：ＦｏｋＩ分子比 ＝２．５：１で、実施された。ＦｏｋＩ（２００μｇ）をオリゴヌクレオチド二量体と一緒に、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ％ グリセロール、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、を含む容積１８０μｌ中で、室温にて１時間インキュベートした。トリプシン（２０ μｌ、０．２ ｍｇ／ｍｌ）を、混合物中に添加した。反応混合物からアリコット（２８μｌ）を別々の時間間隔をおいてとり、過剰のトリプシン阻害剤、アンチパインでクエンチングした。該トリプシン断片を、逆相ＨＰＬＣで精製し、そのＮ末端配列を、Applied Biosystemの自動蛋白シークエンサーを使用して決定した。
２．５モル過剰オリゴヌクレオチド基質、１０ｍｇ ＭｇＣｌ２、存在下におけるＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシン消化の時間経過が、図４に示される。２．５分時点で、完全なＦｏｋＩ以外、わずか二つの主要断片、４１ｋＤａ，２５ｋＤａ断片のみが存在していた。さらにトリプシンで消化すると、４１ｋＤａ断片は、３０ｋＤａ、１１ｋＤａ断片に分解される。この２５ｋＤａの断片は、更にこれ以上のトリプシン消化に対して抵抗性があるようだ。この断片は、もしＦｏｋＩーオリゴ複合体のトリプシン消化をＭｇＣｌ２非存在下で実施したとしたら、もっと不安定であっただろう。
１６０分時点では、わずか３つの主要断片（３０、２５、および１１ｋＤａ）が存在していた。これらの断片（４１、３０、２５、１１ｋＤａの各々は、逆相ＨＰＬＣで精製され、そのＮ末端のアミノ酸配列が決定された（表１）。これらのＮ末端配列を、ＦｏｋＩの推定配列と比較する事によって、４１ｋＤａ及び２５ｋＤａ断片は、それぞれＮ末端及びＣ末端の断片と同定された。加えて、３０ｋＤａは、Ｎ末端であると同定された。
実施例Ｖ
オリゴｄＴセルロース親和性カラムを使用したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合トリプシン断片の単離
トリプシン断片のＤＮＡ結合性を、オリゴｄＴセルロース・カラムを使用して分析した。ＦｏｋＩ（１６０μｇ）を２．５モル過剰オリゴヌクレチド二量体[d-5'-CCTCTGGATGCTCTC(A)１５-3'(配列認識番号１４）：5'-GAGAGCATCCAGAGG(A)１５-3'( 配列認識番号１５）と一緒に、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８）、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む容積９０ μｌ中で、室温にて１時間インキュベートした。トリプシン（１０ μｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ）を該溶液に添加して消化を開始した。トリプシンとＦｏｋＩの割合は、重量で１：８０であった。消化を１０分間実施し、反応液中に４１ ｋＤａ Ｎ末端断片及び２５ ｋＤａ Ｃ末端断片を優占的に得た。反応物を大過剰のアンチパイン（１０μｇ）で、クエンチングし、ローデイング緩衝液［１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、］で、最終容積が４００ μｌとなるまで希釈した。
オリゴｄＴセルロース親和性カラムを使用したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合トリプシン断片の単離
トリプシン断片のＤＮＡ結合性を、オリゴｄＴセルロース・カラムを使用して分析した。ＦｏｋＩ（１６０μｇ）を２．５モル過剰オリゴヌクレチド二量体[d-5'-CCTCTGGATGCTCTC(A)１５-3'(配列認識番号１４）：5'-GAGAGCATCCAGAGG(A)１５-3'( 配列認識番号１５）と一緒に、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８）、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む容積９０ μｌ中で、室温にて１時間インキュベートした。トリプシン（１０ μｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ）を該溶液に添加して消化を開始した。トリプシンとＦｏｋＩの割合は、重量で１：８０であった。消化を１０分間実施し、反応液中に４１ ｋＤａ Ｎ末端断片及び２５ ｋＤａ Ｃ末端断片を優占的に得た。反応物を大過剰のアンチパイン（１０μｇ）で、クエンチングし、ローデイング緩衝液［１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、］で、最終容積が４００ μｌとなるまで希釈した。
該溶液を、オリゴｄＴセルロース・カラム（０．５ ｍｌ、Sigma, カタログ＃0-7751）に充填し、ローデイング緩衝液で前平衡化した。該ブレイクスルーを、オリゴｄＴセルロース・カラムに６回通した。該カラムを５ｍｌカラムローデイング緩衝液で洗浄し、次に、０．４ｍｌの １０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ ｍｌ ＥＤＴＡで二回抽出した。これらの各分画は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ基質に結合しているトリプシン断片を含んでいた。オリゴｄＴセルロースカラムに結合しているトリプシン断片は、ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で分析された。
別個の反応で、トリプシン消化を１６０分間実施し、反応混合物中に３０ｋＤa，２５ｋＤａ、および１１ｋＤａ断片を優占的に得た。
ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシン消化１０分では、反応混合物中に、４１ｋＤａのＮ末端断片および２５ｋＤａのＣ末端断片が優先種として産生された（図５、レーン３）。該混合物をオリゴｄＴセルロースカラムに通し、４１ｋＤａＮ末端断片のみが該カラムに保持された。これは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合性が、該酵素のＮ末端２／３にある事を示唆している。２５ｋＤａ断片はオリゴｄＴセルロースカラムに保持されない。
ＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化１６０分では、３０、２５、１１ｋＤａの断片が優占的に産生された（図５、レーン５）。この反応混合物をオリゴｄＴセルロースカラムに通すと、 ３０および１１ｋＤａ断片のみがカラムに保持された。これらの種類は共に、ＤＮＡと結合しているようであり、４１ｋＤａ Ｎ末端断片を更に分解する事により生じる。２５ ｋＤａ断片は、オリゴｄＴセルロースカラムに保持されなかった。２５ ｋＤａもまたＤＥＡＥに結合しないので、ＤＥＡＥカラムを通過し、ブレイクスルー容液中で回収する事により精製され得る。
ＦｏｋＩ（３９０ μｇ）を２．５モル過剰オリゴヌクレオチド二量体 d-5'-CTCTGGATGCTCTC-3'（配列認識番号第１０）：5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'（配列認識番号第１１）と一緒に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロールを含む容積１７０ μｌ中で、室温にて１時間インキュベートした。４１ｋＤａＮ末端断片の生産が最大となるのは、ＭｇＣｌ２非存在下でのトリプシン（３μｌ；０．２ ｍｇ／ｍｌ)による消化では、室温で１０分であった。 反応物は、過剰のアンチパイン（２００μｌ）で、クエンチングした。 トリプシンの消化物は、ＤＥＡＥカラムを通した。２５ｋＤａのＣ末端断片を、ブレイクスルー中にて回収した。他の全トリプシン断片（４１ｋＤａ，３０ｋＤａおよび１１ｋＤａは、カラムに保持され、０．５ＭのＮａＣｌ緩衝液（３ｘ２００μｌ）で抽出した。
別個の実験で、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２存在下、室温６０分で、ＦｏｋＩーオリゴ複合物のトリプシン消化を行なったところ、３０ｋＤａおよび１１ｋＤａ断片の産生が最高となった。この精製された断片は、非メチル化ＤＮＡ基質（ｐＴＺ１９Ｒ、図６）と、メチル化ＤＮＡ基質（ｐＡＣＹＣｆｏｒｋＩＭ）もともに、ＭｇＣｌ２存在下で非特異的に開裂した。これらの産生物は、小さく、開裂は比較的非特異的である事が示される。該生産物は、牛小腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化されるかまたはポリヌクレオチド・キナーゼおよび［γー３２Ｐ］ＡＴＰを使用して、再リン酸化された。３２Ｐ標識された産生物はＤＮａｓｅＩおよび蛇毒ホスホジエステラーゼを使用して消化されてモノヌクレオチドにされた。ＰＥＩセルロース・クロマトグラフィによるモノヌクレオチドの分析では、２５ｋＤａ断片が、優先的にホスホジエステルのボンド５’をＧ＞Ａ＞＞Ｔ−Ｃに開裂した事がわかる。このように、該２５ｋＤａのＣ末端の断片は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの開裂ドメインを構成している。４１ｋＤａ Ｎ末端断片ーオリゴ複合体は、アガロース・ゲル電気泳動によって精製された。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ（２００μｇ）は、２．５モル過剰のオリゴヌクレオチド二量体 d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3' (配列認識番号第１０）：5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'（配列認識番号第１１）と一緒に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロールを含む容積１８０μｌ中で、室温にて１時間インキュベートされた。わずかな量の３２Ｐで標識されたオリゴヌクレオチド二量体が複合体中に組み入れられ、ゲル電気泳動中にそれをモニターした。４１ ｋＤａ Ｎ末端断片の産生を最高にする、トリプシン消化（２０μｌ；０．２ｍｇ／ｍｌ）は、室温１２分であった。反応物は、過剰のアンチパインでクエンチングされた。４１ ｋＤａ Ｎ末端断片ーオリゴ複合体は、アガロース・ゲル電気泳動で精製された。該複合体に対応するバンドが切り出され、透析バッグ（〜６００μｌ）中で、電気抽出によって回収された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる複合体の分析では、４１ｋＤａ Ｎ末端が主要構成物である事が解明された。３０ ｋＤａ Ｎ末端断片及び１１ ｋＤａ Ｃ末端断片は、副成分として存在していた。これらは一緒にＤＮＡに結合し、４１ ｋＤａ Ｎ末端断片ーオリゴ複合物とともに移動するようにみえる。
４１ ｋＤａ Ｎ末端断片の結合特異性は、ゲル・モビリテイシフト分析によって決定された。
実施例ＶＩ
ゲル・モビリテイ・シフト分析
特異的オリゴ（d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3' (配列認識番号第１０）, 5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'（配列認識番号第１１）)は、４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ ＤＴＴ、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（New England Biolabsより入手）、及び２０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む２５ μｌの反応混合物中で３２Ｐ標識された。該混合物は、３７℃で、３０分インキュベートされた。キナーゼは、反応混合物を７０℃１５分加熱する事により失活させた。２００μｌの水を加えた後、溶液をセファデックスＧ−２５（Superfine) カラム（Phamacia)を通過させて未反応［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを除いた。標識された単鎖オリゴの最終濃度は２７μＭであった。
ゲル・モビリテイ・シフト分析
特異的オリゴ（d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3' (配列認識番号第１０）, 5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'（配列認識番号第１１）)は、４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ ＤＴＴ、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（New England Biolabsより入手）、及び２０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む２５ μｌの反応混合物中で３２Ｐ標識された。該混合物は、３７℃で、３０分インキュベートされた。キナーゼは、反応混合物を７０℃１５分加熱する事により失活させた。２００μｌの水を加えた後、溶液をセファデックスＧ−２５（Superfine) カラム（Phamacia)を通過させて未反応［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを除いた。標識された単鎖オリゴの最終濃度は２７μＭであった。
次に、単鎖をアニールして、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ ｍＭ ＮａＣｌ中 に二量体を１２μＭの濃度まで形成した。 1 μｌの溶液は、オリゴ二量体を〜１２ピコモル及び〜５０ｘ１０３ｃｐｍ含んでいた。非特異的オリゴ類、即ちd-5'-TAATTGATTCTTAA-3'（配列認識番号１２）及びd-5'-ATTAAGAATCAATT-3'（配列認識番号１３）は、ここに記載したように［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとポリヌクレオチド・キナーゼで標識された。単鎖オリゴはアニールされ、二量体を濃度１２μＭで産生した。該溶液は、オリゴ二量体を〜１２ピコモル及び〜２５ｘ１０３ｃｐｍ含んでいた。該非特異的オリゴ（d-5'-TAATTGATTCTTAA-3')（配列認識番号１２）及びd-5'-ATTAAGAATCAATT-3'（配列認識番号１３）は、ここに記載したように［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとポリヌクレオチド・キナーゼで標識された。単鎖オリゴはアニールされ、二量体を濃度１２μＭで産生した。該溶液は、オリゴ二量体を〜４２ピコモル及び〜２５ｘ１０３ｃｐｍ含んでいた。１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中に４１ｋＤａＮ末端断片ーオリゴ複合体（〜２ｐモル）を含む溶液１０μｌを、３２Ｐで標識した特異的なオリゴヌクレオチド二量体（または３２Ｐで標識した非特異的なオリゴヌクレオチド二量体）とともに３７℃で夫々３０分および１２０分インキュベートした。７５％のグリセロール５μｌを各サンプルに加え、８％の非変性ポリアクリル・アミド・ゲル上に充填した。電気泳動を、ブロモフェノールがゲルの頂部より６ｃｍ移動するまでＴＢＥ緩衝液中３００ボルトでおこなった。該ゲルを乾燥し、オートラジオグラフを行なった。ゲル・モビリテイ・シフト分析（図７）から理解できるように、複合体は、ＦｏｋＩ認識部位を含んだ、３２Ｐ標識された特異的オリゴヌクレオチド二量体と簡単に置き変わったが、ＦｏｋＩ認識部位を含まない、３２Ｐ標識された非特異的オリゴヌクレオチド二量体とは置き変わらなかった。これらの結果から、ＤＮＡの配列特異的認識に必要な全ての情報がＦｏｋＩの４１ ｋＤａ Ｎ末端断片内にコードされている事がわかる。
実施例ＶＩＩ
ＤＮＡ基質の非存在下でのトリプシン開裂によるＦｏｋＩ分析
ＤＮＡ基質非存在下でのＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシンの時間経過を図８に示す。はじめに、ＦｏｋＩが、５８ｋＤａ断片と８ｋＤａ断片に切断された。該５８ｋＤａ断片はＤＮＡ基質に結合せず、オリゴｄＴセルロースカラムに保持されない。更に消化が進むと、５８ｋＤａ断片は、数個の中間トリプシン消化断片に分解される。 しかしトリプシン消化が完了すると２５ｋＤａ断片のみとなる（二つの重複バンドとして見える）。
ＤＮＡ基質の非存在下でのトリプシン開裂によるＦｏｋＩ分析
ＤＮＡ基質非存在下でのＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシンの時間経過を図８に示す。はじめに、ＦｏｋＩが、５８ｋＤａ断片と８ｋＤａ断片に切断された。該５８ｋＤａ断片はＤＮＡ基質に結合せず、オリゴｄＴセルロースカラムに保持されない。更に消化が進むと、５８ｋＤａ断片は、数個の中間トリプシン消化断片に分解される。 しかしトリプシン消化が完了すると２５ｋＤａ断片のみとなる（二つの重複バンドとして見える）。
これらの種（５８ｋＤａ，２５ｋＤａ、及び８ｋＤａ）は、逆相ＨＰＬＣで精製され、そのアミノ末端配列が決定された（表Ｉ）。Ｎ末端配列と推定されるＦｏｋＩ配列を比較すると、８ｋＤａ断片がＮ末端で、５８ｋＤａ断片がＣ末端である事がわかる。これは、さらにＦｏｋＩのＮ末端が認識ドメインに関与しているという結論を支持している。 ２５ｋＤａ断片のＮ末端をシークエンスすると、二つの異なる成分が存在している事がわかる。非特異的ＤＮＡ基質の存在下でのＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシン消化の時間経過では、非特異的ＤＮＡ基質の非存在下でＦｏｋＩのトリプシン消化で得られたプロフィルと類似していた。
実施例ＶＩＩＩ
ＦｏｋＩの２５ｋＤａＣ末端のトリプシン分解断片の開裂特異性
ＦｏｋＩの２５ｋＤａ Ｃ末端トリプシン断片は、ｐＴＺ１９Ｒを小さな産物に切断し、非特異的な開裂をしめす。分解産物は、牛小腸ホスファターゼによって脱リン酸化され、ポリヌクレオチド・キナーゼおよび［γ−３２Ｐ］ＡＴＰによって３２Ｐ標識された。過剰の標識は、セファデックスＧ２５を使用して除去された。次に、標識された産物は、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｈｃｌ（ｐＨ７．６）、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む緩衝液中で、１ユニットの膵臓ＤＮａｓｅＩ（Boehringer-Mannheim)によって３７℃、１時間で消化された。次に、０．０２ユニットの蛇毒ホスホジエステラーゼを、反応混合物に添加し、３７℃、１時間で消化した。
ＦｏｋＩの２５ｋＤａＣ末端のトリプシン分解断片の開裂特異性
ＦｏｋＩの２５ｋＤａ Ｃ末端トリプシン断片は、ｐＴＺ１９Ｒを小さな産物に切断し、非特異的な開裂をしめす。分解産物は、牛小腸ホスファターゼによって脱リン酸化され、ポリヌクレオチド・キナーゼおよび［γ−３２Ｐ］ＡＴＰによって３２Ｐ標識された。過剰の標識は、セファデックスＧ２５を使用して除去された。次に、標識された産物は、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｈｃｌ（ｐＨ７．６）、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む緩衝液中で、１ユニットの膵臓ＤＮａｓｅＩ（Boehringer-Mannheim)によって３７℃、１時間で消化された。次に、０．０２ユニットの蛇毒ホスホジエステラーゼを、反応混合物に添加し、３７℃、１時間で消化した。
実施例ＩＸ
ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼにおける機能的ドメイン
トリプシンを使用したＦｏｋＩの機能的ドメインの分析（基質の存在下、非存在下における）を図９に要約した。ＦｏｋＩがＤＮＡ基質と結合すると、該酵素構造の変換が伴なった。この研究は、配列特異的認識用とエンドヌクレアーゼ活性用の二つの別個の蛋白ドメインが該酵素中に存在していることを裏付けている。この結果により、認識ドメインがＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＮ末端にあるのに対して、開裂ドメインが、該分子のＣ末端に存在しているであろうことが示される。
ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼにおける機能的ドメイン
トリプシンを使用したＦｏｋＩの機能的ドメインの分析（基質の存在下、非存在下における）を図９に要約した。ＦｏｋＩがＤＮＡ基質と結合すると、該酵素構造の変換が伴なった。この研究は、配列特異的認識用とエンドヌクレアーゼ活性用の二つの別個の蛋白ドメインが該酵素中に存在していることを裏付けている。この結果により、認識ドメインがＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＮ末端にあるのに対して、開裂ドメインが、該分子のＣ末端に存在しているであろうことが示される。
挿入変異物の構築に関する実施例（Ｘ−ＸＩＶ）
ＦｏｋＩ ＲＭ 系の完全なヌクレオチド配列は、多くの研究所によって公表されている（Looney et al., Gene 80: 193-208, 1989 & Kita et al., J. Biol. Chem. 264: 5751-56, 1989)。例えば、ＰＣＲの実験プロトコールは、Skoglund et al., Gene 88:1-5, 1990 Bassing et al., Gene 113:83-88, 1992に、記載されている。細胞生育の方法及び変異酵素の精製は、野生型ＦｏｋＩ（Li et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4275-79, 1992)用に使用された物と同じである。さらに、セファデックスＧ−７５ゲルろ過およびヘパリンーセファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィーが変異酵素を均質になるまで精製するステップが必要であった。
ＦｏｋＩ ＲＭ 系の完全なヌクレオチド配列は、多くの研究所によって公表されている（Looney et al., Gene 80: 193-208, 1989 & Kita et al., J. Biol. Chem. 264: 5751-56, 1989)。例えば、ＰＣＲの実験プロトコールは、Skoglund et al., Gene 88:1-5, 1990 Bassing et al., Gene 113:83-88, 1992に、記載されている。細胞生育の方法及び変異酵素の精製は、野生型ＦｏｋＩ（Li et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4275-79, 1992)用に使用された物と同じである。さらに、セファデックスＧ−７５ゲルろ過およびヘパリンーセファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィーが変異酵素を均質になるまで精製するステップが必要であった。
実施例Ｘ
ｆｏｋＩＲ遺伝子内ヌクレオチド１６２におけるＳｐｅＩ部位の変異
ｆｏｋＩＲ遺伝子内のＳｐｅＩ部位８９のひとつを変位させるのに使用される二段階ＰＣＲ技法は、Landt et al., Gene 96:125-28, 1990)に記載されている。このプロトコール用の３つの合成プライマーは、１）ＳｐｅＩ部位内にひとつの不適性塩基を含む変異プライマー（5'- TCATAATAGCAACTAATTCTTTTTGGATCTT-3')（配列認識番号２４参照）、２）制限部位ＣｌａＩ部位（5'-CCATCGATATAGCCTTTTTTATT-3')(配列認識番号２５）及びＸｂａＩ部位（5'-GCTCTAGAGGATCCGGAGGT-3')(配列認識番号２６）でそれぞれフランキングされるプライマーである。第一段階では、ＸｂａＩプライマー及び変異プライマーを使用して中間断片が増幅された。次に、第２段階ＰＣＲで、ＣｌａＩプライマーが該中間物に添加された。０．３ ｋｂ ＰＣＲ最終産物をＸｂａＩ／ＣｌａＩで消化し、付着末端を精製し、ゲル精製した。発現ベクター（ｐＲＲＳｆｏｋＩＲ）は、ＸｂａＩ／ＣｌａＩで消化された。次に、４．２ｋｂの大断片は、ゲル精製され、ＰＣＲ断片に連結された。組替ＤＮＡは、受容可能な大腸菌ＲＲ１［ｐＡＣＹＣｆｏｋＩＭ］細胞にトランスフェクトされた。テトラサイクリン及びアンピシリン抗生物質による選択の後、数個のクローンを取り上げ、そのプラスミドＤＮＡを、制限分析によって調べた。ＳｐｅＩ部位変異は、プラスミドＤＮＡをサンガーのシークエンシング法（Sanger et al. Proc. Natl. Acd. Sci, USA 74:5463-67, 1977)使用したシークエンシングにより確認された。
ｆｏｋＩＲ遺伝子内ヌクレオチド１６２におけるＳｐｅＩ部位の変異
ｆｏｋＩＲ遺伝子内のＳｐｅＩ部位８９のひとつを変位させるのに使用される二段階ＰＣＲ技法は、Landt et al., Gene 96:125-28, 1990)に記載されている。このプロトコール用の３つの合成プライマーは、１）ＳｐｅＩ部位内にひとつの不適性塩基を含む変異プライマー（5'- TCATAATAGCAACTAATTCTTTTTGGATCTT-3')（配列認識番号２４参照）、２）制限部位ＣｌａＩ部位（5'-CCATCGATATAGCCTTTTTTATT-3')(配列認識番号２５）及びＸｂａＩ部位（5'-GCTCTAGAGGATCCGGAGGT-3')(配列認識番号２６）でそれぞれフランキングされるプライマーである。第一段階では、ＸｂａＩプライマー及び変異プライマーを使用して中間断片が増幅された。次に、第２段階ＰＣＲで、ＣｌａＩプライマーが該中間物に添加された。０．３ ｋｂ ＰＣＲ最終産物をＸｂａＩ／ＣｌａＩで消化し、付着末端を精製し、ゲル精製した。発現ベクター（ｐＲＲＳｆｏｋＩＲ）は、ＸｂａＩ／ＣｌａＩで消化された。次に、４．２ｋｂの大断片は、ゲル精製され、ＰＣＲ断片に連結された。組替ＤＮＡは、受容可能な大腸菌ＲＲ１［ｐＡＣＹＣｆｏｋＩＭ］細胞にトランスフェクトされた。テトラサイクリン及びアンピシリン抗生物質による選択の後、数個のクローンを取り上げ、そのプラスミドＤＮＡを、制限分析によって調べた。ＳｐｅＩ部位変異は、プラスミドＤＮＡをサンガーのシークエンシング法（Sanger et al. Proc. Natl. Acd. Sci, USA 74:5463-67, 1977)使用したシークエンシングにより確認された。
実施例ＸＩ
４（または７）コドン挿入変異物の構築
４（または７）コドン挿入物を含むＰＣＲ産生ＤＮＡは、ＳｐｅＩ／ＸｍａＩで消化され、ゲル精製された。実施例Ｘで得られたプラスミドｐＲＲＳｆｏｋＩＲをＳｐｅＩ／ＸｍａＩで切断し、３、９ｋｂの大断片をゲル精製し、ＰＣＲ産生物に連結した。該組替ＤＮＡは、受容可能なＲＲＩ［ｐＡＣＹＣｆｏｋＩＭ］細胞にトランスフェクトされ、所望のクローンが、実施例Ｘで記載されたように同定された。これらのクローン由来のプラスミドは単離されシークエンスされて、ｆｏｋＩＲ遺伝子の４（または７）コドン挿入物が確認された。
４（または７）コドン挿入変異物の構築
４（または７）コドン挿入物を含むＰＣＲ産生ＤＮＡは、ＳｐｅＩ／ＸｍａＩで消化され、ゲル精製された。実施例Ｘで得られたプラスミドｐＲＲＳｆｏｋＩＲをＳｐｅＩ／ＸｍａＩで切断し、３、９ｋｂの大断片をゲル精製し、ＰＣＲ産生物に連結した。該組替ＤＮＡは、受容可能なＲＲＩ［ｐＡＣＹＣｆｏｋＩＭ］細胞にトランスフェクトされ、所望のクローンが、実施例Ｘで記載されたように同定された。これらのクローン由来のプラスミドは単離されシークエンスされて、ｆｏｋＩＲ遺伝子の４（または７）コドン挿入物が確認された。
特に、変異物の構築は、下記の様になされた：
（１）ｆｏｋＩＲ遺伝子配列内には、ヌクレオチド１６２及び１１５２の夫々に２つのＳｐｅＩ部位がある。１１５２の部位は、ＦｏｋＩのトリプシン開裂部位近隣に位置し、認識ドメインと開裂ドメインを分離している。この領域の周囲に、４（または７）のコドンを挿入するために、もう一方の１６２のＳｐｅＩ部位を２段階ＰＣＲ法（Landt et al. Gene 96:125-28, 1990) を使用して変異させた。このＳｐｅＩ部位変異をｆｏｋＩＲ遺伝子へ導入しても、過剰生産者クローンの発現レベルに影響をあたえない。
（１）ｆｏｋＩＲ遺伝子配列内には、ヌクレオチド１６２及び１１５２の夫々に２つのＳｐｅＩ部位がある。１１５２の部位は、ＦｏｋＩのトリプシン開裂部位近隣に位置し、認識ドメインと開裂ドメインを分離している。この領域の周囲に、４（または７）のコドンを挿入するために、もう一方の１６２のＳｐｅＩ部位を２段階ＰＣＲ法（Landt et al. Gene 96:125-28, 1990) を使用して変異させた。このＳｐｅＩ部位変異をｆｏｋＩＲ遺伝子へ導入しても、過剰生産者クローンの発現レベルに影響をあたえない。
（２）４（または７）のコドンの挿入は、ＰＣＲ法を使用して行われた。ＰＣＲ増殖で使用された変異プライマーは、図１１に示される。各プライマーは、ｆｏｋＩＲ遺伝子と相補的な２１ベースペア配列をもつ。これらのプライマーの５’末端は、ＳｐｅＩ部位でフランクされる。ＫＳＥＬ及びＫＳＥＬＥＥＫの繰り返しに対するコドンは、ＳｐｅＩ部位と２１相補ベースペアの間に取り込まれる。縮重コドンをこれらの繰り返し中に使用し、増幅中に起こり得る問題を回避した。
他のプライマーは、ｆｏｋＩＲ遺伝子の３’末端と相補的であり、ＸｍａＩ部位によってフランクされる。４（または７）コドン挿入物を含む０．６ｋｂＰＣＲ産生断片は、ＳｐｅＩ／ＸｍａＩによって消化され、ゲル精製された。これらの断片は、高発現ベクターｐＲＲＳｆｏｋＩＲに代替し、変異物を精製する。各変異物の数個のクローンが同定され、そのＤＮＡ配列がサンガーのジデオキシ・チェイン・ターミネーション法（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 74.5463-67 1977)によって確認された。
１ｍＭのイソプロピルβーＤ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導して、これらクローン中での変異酵素の発現をＳＤＳ／ＰＡＧＥで測定したところ、３時間でもっとも顕著となった。これは、酵素活性についての分析によって、更に裏付けられた。これらのクローン中における変異酵素の発現レベルは、野生型ＦｏｋＩと比較してはるかに低かった。ＩＰＴＧでもっと長く誘導すると、より低い酵素レベルとなり、変異酵素が、これらのクローン中で積極的に分解される事が示唆された。これによって、ＦｏｋＩの認識ドメインと開裂ドメインの間の４（または７）のコドン挿入物が蛋白構造を不安定にし、細胞内における分解をし易くする事が示唆される。変異酵素のＳＤＳ／ＰＡＧＥプロフィルは、図１２に示される。
実施例ＸＩＩ
単一ＦｏｋＩ部位をもつＤＮＡ基質の調製
それぞれ単一ＦｏｋＩ認識部位をもつ２つの基質は、ｐＴＺ１９Ｒをテンプレートとして使用したＰＣＲによって調製された。オリゴヌクレオチド・プライマー：5'-CGCAGTGTTATCACTCAT-3' 及び 5'-CTTGGTTGAGTACTCACC-3'（夫々、配列認識番号２７及び２８）を使用して、１００ベースペア断片を合成した。プライマー：5'-ACCGAGCTCGAATTCACT-3'及び 5'-GATTTCGGCCTATTGGTT-3'（夫々、配列認識番号２９及び３０）を使用して２５６ベース断片を調製した。これらの基質内の個々のストランドは、対応する３２Ｐ標識されリン酸化されたプライマーを使用して、ＰＣＲ中に放射線標識された。産生物を、低溶融アガロース・ゲルで精製し、エタノールで沈澱させＴＥ緩衝液に再懸濁した。
単一ＦｏｋＩ部位をもつＤＮＡ基質の調製
それぞれ単一ＦｏｋＩ認識部位をもつ２つの基質は、ｐＴＺ１９Ｒをテンプレートとして使用したＰＣＲによって調製された。オリゴヌクレオチド・プライマー：5'-CGCAGTGTTATCACTCAT-3' 及び 5'-CTTGGTTGAGTACTCACC-3'（夫々、配列認識番号２７及び２８）を使用して、１００ベースペア断片を合成した。プライマー：5'-ACCGAGCTCGAATTCACT-3'及び 5'-GATTTCGGCCTATTGGTT-3'（夫々、配列認識番号２９及び３０）を使用して２５６ベース断片を調製した。これらの基質内の個々のストランドは、対応する３２Ｐ標識されリン酸化されたプライマーを使用して、ＰＣＲ中に放射線標識された。産生物を、低溶融アガロース・ゲルで精製し、エタノールで沈澱させＴＥ緩衝液に再懸濁した。
実施例ＸＩＩＩ
変異酵素の配列特異性の分析
図１３に、ｐＴＺ１９Ｒ ＤＮＡのＦｏｋＩおよび変異体酵素による開裂産生物のアガロース・ゲル電気泳動プロフィルが示される。それらが非常に類似している事は、認識ドメイン及び開裂ドメインの間のリンカー領域における４（または７）コドン挿入物がそのＤＮＡ配列の特異性を変えない事を示唆している。この事は、更に、各々単一のＦｏｋＩ部位を含む３２Ｐ標識ＤＮＡ基質（１００ｂｐ及び２５６ｂｐ）を使用する事により確認された。３２Ｐで標識された個々のストランドを含む基質は、実施例ＸＩＩに記載された様に調製された。ＦｏｋＩは、２５６ベースペアの基質を二つの断片、１８０ｂｐ及び７２ｂｐにそれぞれ切断する（図１３Ｂ）。断片の長さは、各ストランドの３２Ｐで標識された５’末端から計算された。アガロース・ゲルのオートラジオグラフが、図１３Ｃに示される。基質中で３２Ｐ標識を担持するストランドに依存して、７２ｂｐ断片または１８０ｂｐ断片が、オートラジオグラフィーにバンドとして現われる。該変異酵素は、同一のアガロース・ゲル・プロフィル及びオートラジオグラフィーを現わす。それ故、認識ドメインと開裂ドメインの間の４（または７）コドン挿入物は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ認識機構を変えない。
変異酵素の配列特異性の分析
図１３に、ｐＴＺ１９Ｒ ＤＮＡのＦｏｋＩおよび変異体酵素による開裂産生物のアガロース・ゲル電気泳動プロフィルが示される。それらが非常に類似している事は、認識ドメイン及び開裂ドメインの間のリンカー領域における４（または７）コドン挿入物がそのＤＮＡ配列の特異性を変えない事を示唆している。この事は、更に、各々単一のＦｏｋＩ部位を含む３２Ｐ標識ＤＮＡ基質（１００ｂｐ及び２５６ｂｐ）を使用する事により確認された。３２Ｐで標識された個々のストランドを含む基質は、実施例ＸＩＩに記載された様に調製された。ＦｏｋＩは、２５６ベースペアの基質を二つの断片、１８０ｂｐ及び７２ｂｐにそれぞれ切断する（図１３Ｂ）。断片の長さは、各ストランドの３２Ｐで標識された５’末端から計算された。アガロース・ゲルのオートラジオグラフが、図１３Ｃに示される。基質中で３２Ｐ標識を担持するストランドに依存して、７２ｂｐ断片または１８０ｂｐ断片が、オートラジオグラフィーにバンドとして現われる。該変異酵素は、同一のアガロース・ゲル・プロフィル及びオートラジオグラフィーを現わす。それ故、認識ドメインと開裂ドメインの間の４（または７）コドン挿入物は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ認識機構を変えない。
実施例ＸＩＶ
変異酵素による認識部位からの開裂距離の分析
変異酵素による開裂の距離を決定するために、３２Ｐで標識された基質の開裂産物をＰＡＧＥで分析した（図１４）。消化物は、これらの基質を合成するためのＰＣＲで使用されたと同じプライマーで行われたｐＴＺ１９Ｒのシークエンシング反応に沿って分析された。１００ｂｐ断片のＦｏｋＩによる開裂パターンおよび変異物が、図１４Ａに示される。野生型酵素と比較すると、変異物の場合は、切断部位が基質の両ストランド上の認識部位からずれている。シークエンシング・ゲルおよび開裂産物の間の観測可能な小さなずれは、シークエンシング反応に使用される非リン酸化プライマーに起因する。
変異酵素による認識部位からの開裂距離の分析
変異酵素による開裂の距離を決定するために、３２Ｐで標識された基質の開裂産物をＰＡＧＥで分析した（図１４）。消化物は、これらの基質を合成するためのＰＣＲで使用されたと同じプライマーで行われたｐＴＺ１９Ｒのシークエンシング反応に沿って分析された。１００ｂｐ断片のＦｏｋＩによる開裂パターンおよび変異物が、図１４Ａに示される。野生型酵素と比較すると、変異物の場合は、切断部位が基質の両ストランド上の認識部位からずれている。シークエンシング・ゲルおよび開裂産物の間の観測可能な小さなずれは、シークエンシング反応に使用される非リン酸化プライマーに起因する。
5'-GGATG-3'ストランド上で、両変異物は、ＤＮＡの認識部位から１０ヌクレオチド離れて切断するのに対して、5'-CATCC-3'ストランド上では、１４のヌクレオチド離れて切断する。これらは両変異物にとって、主要な切断部位であると思われる。また、野生型酵素と同量の開裂が観察された。
２５６ｂｐ断片の開裂パターンは、図１４Ｂに示される。開裂パターンは、図１４Ｂに示される。開裂パターンは、１００ｂｐ断片と類似している。変異物の場合、5'-CATCC-3'ストランド上の認識部位から１５ヌクレオチド離れたところに、ある開裂が見られる。変異酵素の多数の切断部位は、これらの蛋白に異なる構造がある事に起因するのであろう。さもなければ、二つのドメイン間の空間領域の柔軟性が増加する事に起因する。ＤＮＡ基質に依存して、これらの部位における開裂の強さには、あるばらつきが見られた。これは、これらの切断部位の回りのヌクレオチド配列に起因するのかも知れない。多数の切断部位を持つ自然発生型ＩＩＳ酵素は、Szybalski et al., Gene 100: 13-26, 1991)に報告されている。
ハイブリッド酵素Ｕｂｘ−Ｆ Ｎ （ＸＶ−ＸＶＩＩ）の構築に関する実施例
上記に言及したように、ＦｏｋＩ制限ー変更システムの完全なヌクレオチド配列は、別の研究所から公表されている（Kita et al., J. Biol Chem. 264:5751-56 (1989); Looney et al., Gene 80: 193-208 (1989))。ＰＣＲの実験プロトコールは、いたるところに記載されている（Skoglund et al., Gene 88:1-5 (1990))。細胞生育およびＨｉｓｂｉｎｄＴｍ樹脂を使用した蛋白の精製は、ノバジェン（Novagen）ｐＥＴシステムマニュアルに、概説された通りである。さらに、ハイブリッド蛋白Ｕｂｘ−ＦＮをほぼ均質になるまで精製するためには、ホスホセルロースおよびＤＥＡＥカラム・クロマトグラフィーのステップを付加する事が必要である。ＳＤＳ／ＰＡＧＥのプロトコールは、Laemmli (Nature 222:680-685 (1970))によって記載された通りである。
上記に言及したように、ＦｏｋＩ制限ー変更システムの完全なヌクレオチド配列は、別の研究所から公表されている（Kita et al., J. Biol Chem. 264:5751-56 (1989); Looney et al., Gene 80: 193-208 (1989))。ＰＣＲの実験プロトコールは、いたるところに記載されている（Skoglund et al., Gene 88:1-5 (1990))。細胞生育およびＨｉｓｂｉｎｄＴｍ樹脂を使用した蛋白の精製は、ノバジェン（Novagen）ｐＥＴシステムマニュアルに、概説された通りである。さらに、ハイブリッド蛋白Ｕｂｘ−ＦＮをほぼ均質になるまで精製するためには、ホスホセルロースおよびＤＥＡＥカラム・クロマトグラフィーのステップを付加する事が必要である。ＳＤＳ／ＰＡＧＥのプロトコールは、Laemmli (Nature 222:680-685 (1970))によって記載された通りである。
ｐＵＣ１３派生基質の調製
ｐＵＣ１３派生ＤＮＡ基質は、ＳｍａＩ切断ｐＵＣ１３プラスミドの平滑末端と既知のＵｂｘ部位を含む１０倍過剰量の３０ｂｐ挿入物との連結によって調製された。数個のクローンを取り出し、そのプラスミドＤＮＡを、３０ｂｐ挿入物の有無について分析した。夫々、１、２、および３の挿入物を担持するｐＵＣ１３（１），ｐＵＣ１３（２）、ｐＵＣ１３（３）を含クローンが同定された。そのＤＮＡ配列は、サンガーのジデオキシシークエンシング法によって確認された（Proc. Natl. Acd. Sci, USA 74: 5463-67 (1977))。
ｐＵＣ１３派生ＤＮＡ基質は、ＳｍａＩ切断ｐＵＣ１３プラスミドの平滑末端と既知のＵｂｘ部位を含む１０倍過剰量の３０ｂｐ挿入物との連結によって調製された。数個のクローンを取り出し、そのプラスミドＤＮＡを、３０ｂｐ挿入物の有無について分析した。夫々、１、２、および３の挿入物を担持するｐＵＣ１３（１），ｐＵＣ１３（２）、ｐＵＣ１３（３）を含クローンが同定された。そのＤＮＡ配列は、サンガーのジデオキシシークエンシング法によって確認された（Proc. Natl. Acd. Sci, USA 74: 5463-67 (1977))。
単一Ｕｂｘ部位を持つＤＮＡ基質の調製
単一の３０ｂｐ挿入物を保持するｐＵＣ１３（１）のポリリンカー領域をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用して切り出し、ゲル精製した。この基質の各々のストランドは、３２Ｐ−ｄＡＴＰまたは３２Ｐ−ｄＣＴＰを使用して放射線標識され、クレノー酵素で該断片の付着末端を充填した。該産生物を低溶融アガロース・ゲルで精製し、エタノールで沈澱させ、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再懸濁した。
単一の３０ｂｐ挿入物を保持するｐＵＣ１３（１）のポリリンカー領域をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用して切り出し、ゲル精製した。この基質の各々のストランドは、３２Ｐ−ｄＡＴＰまたは３２Ｐ−ｄＣＴＰを使用して放射線標識され、クレノー酵素で該断片の付着末端を充填した。該産生物を低溶融アガロース・ゲルで精製し、エタノールで沈澱させ、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再懸濁した。
実施例ＸＶ
ハイブリッド酵素Ｕｂｘ−Ｆ Ｎ をＰＣＲを使用して産生するクローンの構築
ＵｂｘのホメオボックスによってコードされるＵｂｘのホメオ・ドメイン、６１アミノ酸蛋白配列は、細菌性ＤＮＡ結合蛋白中に見られるヘリックス・ターン・ヘリックスのモチーフに関係した構造を備えた配列特異的ＤＮＡ結合ドメインである。（Hayashi et al., Cell 63:883-94 (1992); Wolberger et al., Cell 67:517-28 (1991)。Ｕｂｘホメオ・ドメインは、９ｂｐのコンセンサスＤＮＡ部位、5'-TTAAT (G/T)(G/T) cc-3' (Ekker et al., The EMBO Journal 10:1179-86 (1991); Ekker et al., The EMBO Journal 11:4059-4702 (1992))を認識する。本発明者は、ＰＣＲ法を使用して、Ｕｂｘホメオ・ドメインとＦｏｋＩの開裂ドメイン（ＦＮ）を結合させ、また大腸菌中でＵｂｘ−ＦＮ酵素を発現させた。製作されたＵｂｘ−ＦＮハイブリッド蛋白の概略代表例を図１６に示す。ハイブリッド遺伝子を構築するために使用したオリゴヌクレオチド・プライマーを図１７Ａに示す。
ハイブリッド酵素Ｕｂｘ−Ｆ Ｎ をＰＣＲを使用して産生するクローンの構築
ＵｂｘのホメオボックスによってコードされるＵｂｘのホメオ・ドメイン、６１アミノ酸蛋白配列は、細菌性ＤＮＡ結合蛋白中に見られるヘリックス・ターン・ヘリックスのモチーフに関係した構造を備えた配列特異的ＤＮＡ結合ドメインである。（Hayashi et al., Cell 63:883-94 (1992); Wolberger et al., Cell 67:517-28 (1991)。Ｕｂｘホメオ・ドメインは、９ｂｐのコンセンサスＤＮＡ部位、5'-TTAAT (G/T)(G/T) cc-3' (Ekker et al., The EMBO Journal 10:1179-86 (1991); Ekker et al., The EMBO Journal 11:4059-4702 (1992))を認識する。本発明者は、ＰＣＲ法を使用して、Ｕｂｘホメオ・ドメインとＦｏｋＩの開裂ドメイン（ＦＮ）を結合させ、また大腸菌中でＵｂｘ−ＦＮ酵素を発現させた。製作されたＵｂｘ−ＦＮハイブリッド蛋白の概略代表例を図１６に示す。ハイブリッド遺伝子を構築するために使用したオリゴヌクレオチド・プライマーを図１７Ａに示す。
ハイブリッド蛋白を発現するクローンは下記の様に構築された。まず、ＰＣＲで産生されたＵｂｘホメオ・ドメインをＰｓｔＩ／ＳｐｅＩ消化し、ゲル精製した。次に、この断片をベクターｐＲＲＳｆｏｋＩＲ中に代替し、ＦｏｋＩＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡセグメントと置換し、よって、Ｕｂｘ−ＦＮハイブリッド遺伝子を（図１７Ｂ）を作成した。
受容可能なＲＲ１細胞に結合用混合物をトランスフェクションした後、数個のクローンを制限分析によって同定し、そのＤＮＡ配列を、サンガー等のジデオキシ・チェイン・テーミネーション法により確認した（Proc. Natl. Acd. Sci. USA 74:5463-67 (1977))。次に、ハイブリッド遺伝子をＵｂｘ−ＦＮプライマーを使用して増幅した。ＰＣＲ産生されたＤＮＡをＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製した。次に、この断片をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＥＴ−１５ｂベクターに連結した。この構築物は、６つの連続したヒスチジン残基によって、ハイブリッド蛋白のそのＮ末端にタグを付ける事になる。これらは、ノバジェン（Novagen)のｈｉｓ−ｂｉｎｄＴＭ樹脂を使用したメチル・キレーション・クロマトグラフィーによるこの蛋白の精製用の親和性タグとして働く。このＨｉｓタグは、その後、トロンビンによって除去できる。受容可能なＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、結合用混合物でトランスフォームされ、組替ＤＮＡ（図１７Ｂ）を含む数個のクローンが同定された。これらのコロニーは健全でなく、培地での生育も、ダブリング時間が４５分と、悪い。１ｍＭのイソプロピルーβーＤ−チアガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した後、ハイブリッド酵素をＨｉｓ−ｂｉｎｄＴＭ樹脂、ホスホセルロース、及びゲル・クロマトグラフィーを使用して均質になるまで精製した。精製されたハイブリッド酵素のＳＤＳ／ＰＡＧＥプロフィルを、図１８に示す。ハイブリッド蛋白の同定は更に、ウエスタン・ブロットで、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに対して惹起されたラビットの抗血清によってプロービングする事により確認された（データ記載せず）。
実施例ＸＶＩ
Ｕｂｘ−Ｆ Ｎ ハイブリッド酵素のＤＮＡ配列選択性の分析
Ｕｂｘ−ＦＮの特性を調べるのに使用される、基質より派生し直線化したｐＵＣ１３を図１９に示す。既知のＵｂｘ認識配列5'- TTAATGGTT-3'を含む３０ｂｐ ＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１３のＳｍａＩ部位に挿入する事によって誘導体が構築される。挿入されたＵｂｘ部位で切断されると、１．８ｋｂ及び０．９５ｋｂの断片が産物として生じる。Ｕｂｘ−ＦＮによる基質の部分消化物のアガロース・ゲル電気泳動プロフィルが図１９に示される。これらの反応において、ＤＮＡのモル数は、蛋白のモル数に比較して著しく過剰である。反応条件を至適化して、基質分子あたり単一の二本鎖開裂を得るようにした。直線化したｐＵＣ１３ＤＮＡは、４つの断片に切断される。アガロース・ゲル電気泳動プロフィルに４つの異なったバンドが現れた事は、Ｕｂｘ−ＦＮが配列特異性をもってＤＮＡと結合した事、及び直線化したｐＵＣ１３中にハイブリッド蛋白に対する２つの結合部位があることを示している。このことは、単一のＵｂｘ部位を含む直線化されたｐＵＣ１３ＤＮＡ基質が６つの断片に切断されるという事実によって、更に裏付けられる。２つの付加的な断片（夫々、〜１．８ｋｂ及び〜０．９５ｋｂ）は、ｐＵＣ１３の新規に挿入されたＵｂｘ部位でハイブリッド蛋白の結合が行われた事及びこの部位付近で開裂が起きた結果であると説明できよう。予測されたように、バンドの強度は、ｐＵＣ１３中における３０ｂｐ挿入物の数に伴って増加する。ｐＵＣ１３の２つの推定ＵｂＸ結合部位、及び挿入されたＵｂｘ部位が下記表３に示される。これら全ての部位は、5'-TAAT - 3'をその核配列として担持し、それら好ましい部位はＵｂｘホメオ・ドメインに付いて報告された物と一致する。これら部位に対するＵｂｘホメオ・ドメインの親和性は、該核部位を囲むヌクレオチド塩基によって変更される。完全な消化が長期にわたって見られ、或いは蛋白濃度を増やす事によって見られるので、ハイブリッド蛋白はターンオーバー（代謝回転）するようだ
（データ記載せず）。高温での開裂はより特異的である。
Ｕｂｘ−Ｆ Ｎ ハイブリッド酵素のＤＮＡ配列選択性の分析
Ｕｂｘ−ＦＮの特性を調べるのに使用される、基質より派生し直線化したｐＵＣ１３を図１９に示す。既知のＵｂｘ認識配列5'- TTAATGGTT-3'を含む３０ｂｐ ＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１３のＳｍａＩ部位に挿入する事によって誘導体が構築される。挿入されたＵｂｘ部位で切断されると、１．８ｋｂ及び０．９５ｋｂの断片が産物として生じる。Ｕｂｘ−ＦＮによる基質の部分消化物のアガロース・ゲル電気泳動プロフィルが図１９に示される。これらの反応において、ＤＮＡのモル数は、蛋白のモル数に比較して著しく過剰である。反応条件を至適化して、基質分子あたり単一の二本鎖開裂を得るようにした。直線化したｐＵＣ１３ＤＮＡは、４つの断片に切断される。アガロース・ゲル電気泳動プロフィルに４つの異なったバンドが現れた事は、Ｕｂｘ−ＦＮが配列特異性をもってＤＮＡと結合した事、及び直線化したｐＵＣ１３中にハイブリッド蛋白に対する２つの結合部位があることを示している。このことは、単一のＵｂｘ部位を含む直線化されたｐＵＣ１３ＤＮＡ基質が６つの断片に切断されるという事実によって、更に裏付けられる。２つの付加的な断片（夫々、〜１．８ｋｂ及び〜０．９５ｋｂ）は、ｐＵＣ１３の新規に挿入されたＵｂｘ部位でハイブリッド蛋白の結合が行われた事及びこの部位付近で開裂が起きた結果であると説明できよう。予測されたように、バンドの強度は、ｐＵＣ１３中における３０ｂｐ挿入物の数に伴って増加する。ｐＵＣ１３の２つの推定ＵｂＸ結合部位、及び挿入されたＵｂｘ部位が下記表３に示される。これら全ての部位は、5'-TAAT - 3'をその核配列として担持し、それら好ましい部位はＵｂｘホメオ・ドメインに付いて報告された物と一致する。これら部位に対するＵｂｘホメオ・ドメインの親和性は、該核部位を囲むヌクレオチド塩基によって変更される。完全な消化が長期にわたって見られ、或いは蛋白濃度を増やす事によって見られるので、ハイブリッド蛋白はターンオーバー（代謝回転）するようだ
（データ記載せず）。高温での開裂はより特異的である。
実施例ＸＶＩＩ
ハイブリッド酵素による認識部位からの開裂距離の分析
Ｕｂｘ−ＦＮによる認識部位からの開裂距離を決定するために、単一Ｕｂｘ部位を含む３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質の開裂産物が、ＰＡＧＥ（図２０）によって分析された。消化産物は、基質のマキサム・ギルバート（Ｇ＋Ａ）シークエンシング反応にそって分析された。予想されたように、切断部位は、認識部位からはずれた。5'-TAAT-3'ストランドでは、Ｕｂｘ−ＦＮは、ＤＮＡを認識部位から３ヌクレオチド離れて切断するのに対して、5'-ATTA- 3'ストランドでは、認識部位から８、９、または１０ヌクレオチド離れて切断する。単一のＵｂｘ部位を含んだＤＮＡ基質の開裂に基づくＵｂｘ−ＦＮの切断部位の分析は、図２０に要約されている。この開裂によって５’からＴＡＡＴまでの配列が生じ、この開裂はＵｂｘ−ＦＮハイブリッド蛋白を作成した場合（図１６）と一致する。
ハイブリッド酵素による認識部位からの開裂距離の分析
Ｕｂｘ−ＦＮによる認識部位からの開裂距離を決定するために、単一Ｕｂｘ部位を含む３２Ｐ標識されたＤＮＡ基質の開裂産物が、ＰＡＧＥ（図２０）によって分析された。消化産物は、基質のマキサム・ギルバート（Ｇ＋Ａ）シークエンシング反応にそって分析された。予想されたように、切断部位は、認識部位からはずれた。5'-TAAT-3'ストランドでは、Ｕｂｘ−ＦＮは、ＤＮＡを認識部位から３ヌクレオチド離れて切断するのに対して、5'-ATTA- 3'ストランドでは、認識部位から８、９、または１０ヌクレオチド離れて切断する。単一のＵｂｘ部位を含んだＤＮＡ基質の開裂に基づくＵｂｘ−ＦＮの切断部位の分析は、図２０に要約されている。この開裂によって５’からＴＡＡＴまでの配列が生じ、この開裂はＵｂｘ−ＦＮハイブリッド蛋白を作成した場合（図１６）と一致する。
上記で述べた全ての刊行物は参照として本願明細書に組み込まれ、その一部をなす。上記においては、明瞭な理解を助けるために幾らか詳細に説明してきたが、本発明の真実の範囲を逸脱することなく、形態およびその詳細において種々の変更をなし得ることが、当業者には容易に承認されるであろう。
レーン１はタンパク標準、レーン２はＦｏｋＩエンドヌクレアーゼであり、またレーン３は2.5分、レーン４は５分、レーン５は10分、レーン６は20分、レーン７は40分、レーン８は80分、レーン９は160分のトリプシン消化後のプロファイルを示している。レーン１０〜１３は、HPLC精製されたトリプシン分解フラグメントであり、レーン１０は41 kDaのフラグメント、レーン１１は30 kDaのフラグメント、レーン１２は11 kKaのフラグメント、レーン１３は25k Daのフラグメントである。
図５は、オリゴｄＴ-セルロースカラムを用いた、ＤＮＡ結合性トリプシン分解フラグメントの同定を示している。レーン１はタンパク標準；レーン２はＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ；レーン３は、ＦｏｋＩ−オリゴ複合体の10分間のトリプシン分解混合物；レーン４は、オリゴｄＴ-セルロースカラムに結合したトリプシン分解フラグメント；レーン５は、ＦｏｋＩ−オリゴ複合体の160分間のトリプシン分解混合物；レーン６は、オリゴｄＴ-セルロースカラムに結合したトリプシン分解フラグメントである。
図６は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシン分解フラグメントの開裂特性分析を示している。 （Ａ）トリプシン分解フラグメントの開裂特性を、アガロースゲル電気泳動によって分析した。10mMのトリスHCl(pH8)、50mMのNaCl、１mMのDTTおよび10mMのMgCl2の中の１μｇのpTZ19Rを、当該フラグメント（夫々トリプシン消化物、ブレークスルーおよび溶出物）と共に、37℃で１時間、10μｌの反応容量で消化した。レーン４〜６は、ＭｇＣｌ２の不存在下におけるＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化に対応する。レーン７〜９は、ＭｇＣｌ２の存在下におけるＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化に対応する。レーン１は１kbのラダー（梯子）；レーン２はpTZ19R；レーン３はＦｏｋＩエンドヌクレアーゼで消化されたpTZ19R；レーン４および６は、ＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化物の反応混合物；レーン５および７は、ブレークスルー容積中の25 kDaのＣ末端フラグメント；レーン６および９は、DEAEカラムに結合したＦｏｋＩのトリプシン分解フラグメントである。ゲル底部における強いバンドは、過剰のオリゴヌクレオチドに対応する。 （Ｂ）ＤＥＡＥカラムからのフラグメントのＳＤＳ（0.1%）−ポリアクリルアミド（12%）ゲル電気泳動のプロファイル。レーン３〜５は、ＭｇＣｌ２の不存在下におけるＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化に対応している。レーン６〜８は、10mMのＭｇＣｌ２の存在下におけるＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化に対応している。レーン１はタンパク標準；レーン２はＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ；レーン３および６はＦｏｋＩ−オリゴ複合体のトリプシン消化物の反応混合物；レーン４および７はブレークスルー容積中の25kDaのＣ末端フラグメント;レーン５および８はＤＥＡＥカラムに結合したＦｏｋＩのトリプシン分解フラグメントである。
図７は、41kDaのＮ末端ＤＮＡによるＤＮＡの配列特異的結合の、ゲル移動度シフト試験を用いた分析を示している。交換反応のために、この複合体（10μｌ）を、10mMのトリスHCl(pH8)、50mMのNaCl、および10mMのMgCl2を含む20μｌ容量において、１μｌの３２Ｐで標識された特異的（または非特異的）なオリゴヌクレオチド二本鎖と共に、時間を種々に変化させて37℃でインキュベートした。３２Ｐでラベルされた１μｌの特異的プローブ［d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3'（配列番号１０）：5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'（配列番号１１）］は、12ピコモルの二本鎖および略50×10３cpmを含んでいた。また、３２Ｐで標識された１μｌの特異的プローブ［d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3'（配列番号１０）：5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'（配列番号１１）］には、12ピコモルの二本鎖および略25×10３cpmが含まれていた。 （Ａ）レーン１は特異的なオリゴヌクレオチド二本鎖；レーン２は41 kDaのＮ末端フラグメント−オリゴ複合体；レーン３および４は、当該複合体とともに夫々30分間および120分間インキュベートされた特異的プローブである。 （Ｂ）レーン１は非特異的なオリゴヌクレオチド二本鎖；レーン２は41 kDaのＮ末端フラグメント−オリゴ複合体；レーン３および４は、当該複合体とともに夫々30分間および120分間インキュベートされた非特異的プローブである。
図８は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシン分解の種々の時点における、トリプシン分解物のＳＤＳ（0.1%）−ポリアクリルアミド（12%）ゲル電気泳動プロファイルを示している。10mMのトリスHCl(pH8)、50mMのNaCl、および10mMのMgCl2を含む最終容量200μｌ中の酵素（200μｇ）を、室温においてトリプシンで消化した。 ＦｏｋＩに対するトリプシンの比率は、重量比で１：５０であった。一部分（28μｌ）を異なった時間間隔で反応混合物から取り出し、過剰のアンチペイン(antipain)で急冷した。レーン１はタンパク標準；レーン２はＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。また、それぞれレーン３は2.5分；レーン４は5.0分；レーン５は10分；レーン６は20分；レーン７は40分；レーン８は80分；レーン９は160分のトリプシン消化である。
図９は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのトリプシン分解地図を示している。（Ａ）オリゴヌクレオチド基質の不存在下におけるＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの断片形成パターン。（Ｂ）オリゴヌクレオチド基質の存在下におけるＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの断片形成パターン。
図１０は、PREDICTプログラムを用いた一次配列決定（配列番号３１）に基づく、ＦｏｋＩの推定二次構造を示している。ＤＮＡ基質の存在下におけるＦｏｋＩのトリプシン開裂部位が矢印で示されている。KSELEEKKSEL配列が強調されている。図中の記号は次の通りである：ｈはヘリックス；ｓはシート；黒丸はランダムコイル。
図１１は、ＦｏｋＩの挿入変異体の構築に用いた５′および３′オリゴヌクレオチドプライマーの配列（それぞれ配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９）を示している。４コドン挿入物および７コドン挿入物が太字で示されている。アミノ酸配列がヌクレオチド配列の上に示されている。両挿入変異体のＰＣＲ増幅において、同一の３′プライマーが用いられた。
図１２は、均一に精製された変異体酵素のＳＤＳ／ＰＡＧＥプロファイルを示している。レーン１はタンパク標準；レーン２はＦｏｋＩ；レーン３は４コドン挿入物を含む変異体ＦｏｋＩ；レーン４は７コドン挿入物を含む変異体ＦｏｋＩである。
図１３は、上記変異体酵素におけるＤＮＡ配列特異性の分析を示している。ＤＮＡ基質を、37℃で２時間、10mMトリスHCl pH8.0／50mM NaCl／1mM DTT／10mM MgCl2の中で消化した。 （Ａ）１％アガロースゲル電気泳動による、pTZ19RＤＮＡ基質の開裂パターン。夫々の反応において、２μｇのpTZ19RＤＮＡを用いた。レーン１は、１キロ塩基（ｋｂ）のラダー；レーン２はpTZ19R；レーン３は、ＦｏｋＩで消化したpTZ19R；レーン４は、４コドン挿入物を含む変異体ＦｏｋＩで消化したpTZ19R；レーン５は、７コドン挿入物を含む変異体ＦｏｋＩで消化したpTZ19Rである。 （Ｂ）1.5％アガロースゲル電気泳動によって分析された、単一のＦｏｋＩ部位を含む256ｋｂのＤＮＡ基質の開裂パターン。１μｇの放射能ラベルした基質（ここの鎖に３２Ｐラベルを施した）を、上記のようにして消化した。アガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光で可視化した。レーン２〜６は、５′−ＣＡＴＣＣ−３′鎖が３２Ｐでラベルされた３２Ｐラベル基質に対応する。レーン７〜１１は、５′−ＧＧＡＴＧ−３′鎖が３２Ｐでラベルされた３２Ｐラベル基質に対応する。レーン１は、１キロ塩基（ｋｂ）のラダー；レーン２および７は、３２Ｐでラベルした250ｋｂのＤＮＡ基質；レーン３および８は、ＦｏｋＩで開裂された３２Ｐラベル化基質；レーン４および９は、精製された実験室的野生型(laboratory wild-type)のＦｏｋＩ；レーン５および１０は、４コドン挿入物を含む変異体ＦｏｋＩ；レーン６および１１は、７コドン挿入物を含む変異体ＦｏｋＩである。 （Ｃ）上記で得たアガロースゲルのオートラジオグラフ。レーン２〜１１は、上記の（Ｂ）と同じである。
図１４は、ＦｏｋＩおよび上記変異体酵素による認識部位から開裂部位までの距離の分析を示している。pTZ19RをテンプレートとしたＤＮＡ配列決定のために、非燐酸化オリゴヌクレオチドが用いられた。そのシーケンシング生成物（Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃ）を７Ｍ尿素を含む６％アクリルアミドゲル上で電気泳動させ、該ゲルを乾燥させた。次いで、その生成物をＸ線フィルムに２時間露光させた。100ｂｐおよび256ｂｐのＤＮＡ基質からの開裂生成物が、ＡおよびＢにそれぞれ示されている。Ｉは、５′−ＧＧＡＴＧ−３′鎖における３２Ｐラベルを含む基質に対応している。また、ＩＩは５′−ＣＡＴＣＣ−３′鎖における３２Ｐでラベルを含む基質に対応している。レーン１はＦｏｋＩ；レーン２はＦｏｋＩ；レーン３は４コドン挿入を含む変異体ＦｏｋＩ；レーン４は７コドン挿入を含む変異体ＦｏｋＩである。
図１５は、単一のＦｏｋＩ部位を含む100ｂｐのＤＮＡ基質に基づく、 ＦｏｋＩおよび変異体酵素の開裂部位の地図を示している。（Ａ）は野生型ＦｏｋＩ；（Ｂ）は４コドン挿入を含む変異体ＦｏｋＩ；（Ｃ）は７コドン挿入を含む変異体ＦｏｋＩ（配列番号４０参照）である。開裂部位は矢印で示されている。主要な開裂部位は大きな矢印で示してある。
図１６は、ＤＮＡ基質に関連させた、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン（ＦＮ）に対するＵｂｘホメオドメインの向きを示す図を表している。尖った波形に縁取りされた(engrailed)ホメオドメイン−ＤＮＡ複合体の結晶構造が、Kissinger et al. (Cell 63:579-90 (1990))によって報告されている。
図１７は、Ｕｂｘ−ＦＮハイブリッド酵素の発現ベクターの構築を示している。 （Ａ）ハイブリッド遺伝子のＵｂｘ−ＦＮの構築に用いた５′プライマーおよび３′プライマーの配列。このＵｂｘプライマーは、ＰｓｔＩおよびＳｐｅＩに隣接している（配列番号４１および配列番号４２を参照のこと）。Ｕｂｘ−ＦＮプライマーは、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位に隣接している（配列番号４３および配列番号４４を参照のこと）。開始コドンおよび終止コドンは太字で示されている。 （Ｂ）プラスミドｐＲＲＳ・Ｕｂｘ−ＦＮおよびｐＥＴ−１５ｂ・Ｕｂｘ−ＦＮの構造。ｐＲＲＳｆｏｋＩＲのＰｓｔＩ／ＳｐｅＩフラグメントを、ＰＣＲ修飾されたＵｂｘホメオボックスで置換して、ｐＲＲＳ・Ｕｂｘ−ＦＮを作製した。Ｕｂｘ−ＦＮプライマーを用いたＰＣＲで作製されたフラグメントをｐＥＴ−１５ｂのＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩ部位に挿入して、ｐＥＴ−１５ｂ・Ｕｂｘ−ＦＮを形成した。
図１８は、Ｕｂｘ−ＦＮハイブリッド酵素の精製における各工程でのＳＤＳ／ＰＡＧＥプロファイルを表している。レーン１はタンパク標準；レーン２は誘発された細胞からの粗抽出物；レーン３はＨｉｓ−ｂｉｎｄＴＭ樹脂プール；レーン４はホスホセルロースのプール；レーン５はＤＥＡＥプールである。
図１９は、Ｕｂｘ部位を含む線形化したｐＵＣ１３・ＤＮＡ基質を用いた、Ｕｂｘ−ＦＮハイブリッドタンパクの特徴付けを示している。 （Ａ）ｐＵＣ由来のＤＮＡ基質。□は、Ｕｂｘ部位、即ち５′−ＴＴＡＡＴＧＧＴＴ−３′を含む30ｂｐの挿入物である。これらの基質における30ｂｐ挿入物のタンデムリピート(tandem repeats)の数が、括弧内に示されている。Ｕｂｘ部位の向きは矢印で示されている。 （Ｂ）20mM Tris.HCl (pH7.6), 75mM KCl, 1mM DTT, 50μｇ／ml tRNAおよび2mM MgCl2を含む緩衝溶液中において、31℃で４〜５時間、上記のＤＮＡ基質（１μｇ）を部分的に消化した。生成物を１％アガロースゲル電気泳動によって分析した。基質は、Ｕｂｘ−ＦＮハイブリッドタンパクに比較して大過剰（略100：１）で存在した。反応条件は、基質分子当たり一つの二本鎖開裂を生じるように最適化された。この反応は酵素濃度を増大させて進行させるか、或いは31℃で一晩消化することによって完結される（データは示していない）。新たに挿入されたｐＵＣ１３のＵｂｘ部位でのハイブリッド酵素の結合と、該部位の近傍での開裂によって生じた二つのフラグメント、即ち略1.8ｋｂおよび略0.95ｋｂのフラグメントが矢印で示されている。
図２０は、Ｕｂｘ−ＦＮによる認識部位から開裂部位までの距離の分析を示している。（Ｇ＋Ａ）マクサム−ギルバートの配列決定反応(Maxam-Gilbert sequencing reaction)に従った、単一のＵｂｘ部位を含む３２ＰでラベルされたＤＮＡ基質のＵｂｘ−ＦＮによる開裂生成物を、６Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離し、乾燥し、Ｘ線フィルムに対して６時間露光させた。 （Ａ）は、５′−ＴＡＡＴ−３′鎖（配列番号４５を参照のこと）での３２Ｐラベルを含む基質からの開裂生成物に対応している。レーン１は（Ｇ＋Ａ）配列決定反応；レーン２はＵｂｘ−ＦＮである。 （Ｂ）は相補鎖、即ち５′−ＡＴＴＡ−３′（配列番号４６を参照のこと）での３２Ｐラベルを含む基質に対応している。レーン１は（Ｇ＋Ａ）配列決定反応であり；レーン２はＵｂｘ−ＦＮである。 （Ｃ）は、単一のＵｂｘ部位を含むＤＮＡ基質に基づく、Ｕｂｘ−ＦＮ開裂部位の地図である。認識部位は白抜き文字によって示されている。プリン残基は黒星印によって示されている（配列番号４７および配列番号４８を参照のこと）。
Claims (23)
- ＤＮＡ構築物であって：
（ｉ）ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；
（ii）前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；
（iii）ベクターとを具備し、
前記第一のＤＮＡセグメントおよび前記第二のＤＮＡセグメントは、単一のタンパクが産生されるように、前記ベクターに対して動作可能に連結されているＤＮＡ構築物。 - 請求項１に記載のＤＮＡ構築物であって、前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼがＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼであるＤＮＡ構築物。
- 請求項２に記載のＤＮＡ構築物であって、前記認識ドメインが、ジンクフィンガーモチーフ；ホメオドメインモチーフ；リプレッサのＤＮＡ結合性ドメイン；ＰＯＵドメインモチーフ（真核転写レギュレータ）；発癌遺伝子のＤＮＡ結合性ドメイン；および＞６塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的なＤＮＡ結合性タンパクからなる群から選択されるＤＮＡ構築物。
- 請求項３に記載のＤＮＡ構築物であって、前記認識ドメインがＵｂｘのホメオドメインであるＤＮＡ構築物。
- 原核細胞であって：
（ｉ）ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；
（ii）前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；
（iii）ベクターとを含んでおり、
前記第一のＤＮＡセグメントおよび前記第二のＤＮＡセグメントは、単一のタンパクが産生されるように、前記ベクターに対して動作可能に連結されている原核細胞。 - 請求項５に記載の原核細胞であって、前記第一のＤＮＡセグメントがＦｏｋＩの触媒ドメイン（ＦN）をコードし、前記第二のＤＮＡセグメントがＵｂｘのホメオドメインをコードする原核細胞。
- ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインを含むハイブリッド制限酵素であって、前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼ以外の酵素の認識ドメインに対して共有結合的に結合された前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んでいるハイブリッド制限酵素。
- 請求項７に記載のハイブリッド制限酵素であって、前記認識ドメイン（前記ハイブリッド制限酵素の一部なす）が、ジンクフィンガーモチーフ；ホメオドメインモチーフ；ＰＯＵドメインモチーフ；リプレッサのＤＮＡ結合性ドメイン；発癌遺伝子のＤＮＡ結合性ドメイン；および＞６塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的なＤＮＡ結合性タンパクからなる群から選択されるハイブリッド制限酵素。
- 請求項７に記載のハイブリッド制限酵素であって、前記認識ドメインがＵｂｘのホメオドメインであるハイブリッド制限酵素。
- 請求項９に記載のハイブリッド制限酵素であって、前記ＩＩ型エンドヌクレアーゼがＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼであり、前記ハイブリッド酵素がＵｂｘ−ＦNであるハイブリッド制限酵素。
- ＤＮＡ構築物であって：
（ｉ）ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；
（ii）前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；
（iii）前記第一のＤＮＡセグメントおよび前記第二のＤＮＡセグメントの間に挿入された、１以上のコドンを含む第三のＤＮＡセグメントと；
（iv）ベクターとを含み、
前記第一のＤＮＡセグメント、前記第二のＤＮＡセグメントおよび前記第三のＤＮＡセグメントは、単一のタンパクが産生されるように、前記ベクターに対して動作可能に連結されているＤＮＡ構築物。 - 請求項１１に記載のＤＮＡ構築物であって、前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼがＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼであるＤＮＡ構築物。
- 請求項１２に記載のＤＮＡ構築物であって、前記第三のＤＮＡセグメントが実質的に４コドンからなるＤＮＡ構築物。
- 請求項１３に記載のＤＮＡ構築物であって、前記第三のＤＮＡセグメントの前記４コドンが、前記エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド１１５２に挿入されているＤＮＡ構築物。
- 請求項１２に記載のＤＮＡ構築物であって、前記第三のＤＮＡセグメントが実質的に７コドンからなるＤＮＡ構築物。
- 請求項１５に記載のＤＮＡ構築物であって、前記第三のＤＮＡセグメントの前記７コドンが、前記エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド１１５２に挿入されているＤＮＡ構築物。
- 請求項１２に記載のＤＮＡ構築物であって、前記認識ドメインが、ジンクフィンガーモチーフ；ホメオドメインモチーフ；ＰＯＵドメインモチーフ；リプレッサのＤＮＡ結合性ドメイン；発癌遺伝子のＤＮＡ結合性ドメイン；および＞６塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的なＤＮＡ結合性タンパクからなる群から選択されるＤＮＡ構築物。
- 原核細胞であって：
（ｉ）ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含んだＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のＤＮＡセグメントと；
（ii）前記ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のＤＮＡセグメントと；
（iii）前記第一のＤＮＡセグメントおよび前記第二のＤＮＡセグメントの間に挿入された、１以上のコドンを含む第三のＤＮＡセグメントと；
（iv）ベクターとを含み、
前記第一のＤＮＡセグメント、前記第二のＤＮＡセグメントおよび前記第三のＤＮＡセグメントは、単一のタンパクが産生されるように、前記ベクターに対して動作可能に連結されている原核細胞。 - 請求項１８に記載の原核細胞であって、前記第三のＤＮＡセグメントが実質的に４コドンからなる原核細胞。
- 請求項１８に記載の原核細胞であって、前記第三のＤＮＡセグメントが実質的に７コドンからなる原核細胞。
- 請求項１８の原核細胞によって産生された、単離されたＩＩＳ型ハイブリッドエンドヌクレアーゼ。
- 請求項１１に記載のＤＮＡ構築物であって、前記第三のＤＮＡセグメントがアミノ酸配列Lys-Ser-Glu-Leuを含んでいるペプチドをコードするＤＮＡ構築物。
- 請求項１１に記載のＤＮＡ構築物であって、前記第三のＤＮＡセグメントがアミノ酸配列Lys-Ser-Glu-Leu-Glu-Glu-Lysを含んでいるペプチドをコードするＤＮＡ構築物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/126,564 | 1993-09-07 | ||
| US08/126,564 US5436150A (en) | 1992-04-03 | 1993-09-27 | Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008291366A Division JP2009072201A (ja) | 1993-09-27 | 2008-11-13 | フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013081471A true JP2013081471A (ja) | 2013-05-09 |
Family
ID=22425524
Family Applications (6)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7510290A Withdrawn JPH09505728A (ja) | 1993-09-27 | 1994-08-23 | フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン |
| JP2006143294A Expired - Lifetime JP4081119B2 (ja) | 1993-09-27 | 2006-05-23 | フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン |
| JP2007230093A Withdrawn JP2008005851A (ja) | 1993-09-27 | 2007-09-05 | フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン |
| JP2008291366A Withdrawn JP2009072201A (ja) | 1993-09-27 | 2008-11-13 | フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン |
| JP2012037730A Withdrawn JP2012135316A (ja) | 1993-09-27 | 2012-02-23 | フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン |
| JP2012279894A Pending JP2013081471A (ja) | 1993-09-27 | 2012-12-21 | フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン |
Family Applications Before (5)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7510290A Withdrawn JPH09505728A (ja) | 1993-09-27 | 1994-08-23 | フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン |
| JP2006143294A Expired - Lifetime JP4081119B2 (ja) | 1993-09-27 | 2006-05-23 | フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン |
| JP2007230093A Withdrawn JP2008005851A (ja) | 1993-09-27 | 2007-09-05 | フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン |
| JP2008291366A Withdrawn JP2009072201A (ja) | 1993-09-27 | 2008-11-13 | フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン |
| JP2012037730A Withdrawn JP2012135316A (ja) | 1993-09-27 | 2012-02-23 | フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5436150A (ja) |
| EP (1) | EP0721502A4 (ja) |
| JP (6) | JPH09505728A (ja) |
| AU (1) | AU687435B2 (ja) |
| CA (1) | CA2170986A1 (ja) |
| WO (1) | WO1995009233A1 (ja) |
Families Citing this family (365)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5436150A (en) * | 1992-04-03 | 1995-07-25 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease |
| US5916794A (en) * | 1992-04-03 | 1999-06-29 | Johns Hopkins University | Methods for inactivating target DNA and for detecting conformational change in a nucleic acid |
| US6140466A (en) | 1994-01-18 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
| US20050084885A1 (en) * | 1994-01-18 | 2005-04-21 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
| USRE45795E1 (en) | 1994-08-20 | 2015-11-10 | Gendaq, Ltd. | Binding proteins for recognition of DNA |
| GB9824544D0 (en) | 1998-11-09 | 1999-01-06 | Medical Res Council | Screening system |
| CA2209183A1 (en) * | 1994-12-29 | 1996-07-11 | Joel L. Pomerantz | Chimeric dna-binding proteins |
| AU6096296A (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Ohio State University, The | Artificial restriction endonuclease |
| US6261797B1 (en) | 1996-01-29 | 2001-07-17 | Stratagene | Primer-mediated polynucleotide synthesis and manipulation techniques |
| GB9710809D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
| US6444421B1 (en) | 1997-11-19 | 2002-09-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods for detecting intermolecular interactions in vivo and in vitro |
| US6410248B1 (en) | 1998-01-30 | 2002-06-25 | Massachusetts Institute Of Technology | General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites |
| AU746454B2 (en) * | 1998-03-02 | 2002-05-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Poly zinc finger proteins with improved linkers |
| JP2002506640A (ja) | 1998-03-17 | 2002-03-05 | ジェンダック・リミテッド | 核酸結合タンパク質 |
| US6534261B1 (en) * | 1999-01-12 | 2003-03-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
| US7070934B2 (en) | 1999-01-12 | 2006-07-04 | Sangamo Biosciences, Inc. | Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression |
| US7013219B2 (en) * | 1999-01-12 | 2006-03-14 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
| US6599692B1 (en) * | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Sangamo Bioscience, Inc. | Functional genomics using zinc finger proteins |
| US6453242B1 (en) * | 1999-01-12 | 2002-09-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites |
| EP1147209A2 (en) * | 1999-02-03 | 2001-10-24 | The Children's Medical Center Corporation | Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site |
| AU2982300A (en) * | 1999-02-03 | 2000-08-25 | Children's Medical Center Corporation | Gene repair involving (in vivo) excision of targeting dna |
| US20030104526A1 (en) * | 1999-03-24 | 2003-06-05 | Qiang Liu | Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers |
| US7030215B2 (en) * | 1999-03-24 | 2006-04-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers |
| US6794136B1 (en) | 2000-11-20 | 2004-09-21 | Sangamo Biosciences, Inc. | Iterative optimization in the design of binding proteins |
| AU781451B2 (en) | 1999-04-28 | 2005-05-26 | Genencor International, Inc. | Specifically targeted catalytic antagonists and uses thereof |
| US20030207297A1 (en) * | 1999-10-13 | 2003-11-06 | Hubert Koster | Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers |
| US7332275B2 (en) * | 1999-10-13 | 2008-02-19 | Sequenom, Inc. | Methods for detecting methylated nucleotides |
| EP1261932B1 (en) | 1999-10-13 | 2009-09-30 | Sequenom, Inc. | Methods for identifying polymorphic genetic markers |
| ATE309536T1 (de) | 1999-12-06 | 2005-11-15 | Sangamo Biosciences Inc | Methoden zur verwendung von randomisierten zinkfingerprotein-bibliotheken zur identifizierung von genfunktionen |
| CA2398155C (en) * | 2000-01-24 | 2011-07-19 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for linking binding domains in nucleic acid binding proteins |
| WO2001059450A2 (en) | 2000-02-08 | 2001-08-16 | Sangamo Biosciences, Inc. | Cells expressing zinc finger protein for drug discovery |
| CA2407460C (en) * | 2000-04-28 | 2013-06-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted modification of chromatin structure |
| US6958214B2 (en) | 2000-07-10 | 2005-10-25 | Sequenom, Inc. | Polymorphic kinase anchor proteins and nucleic acids encoding the same |
| AU2001278496A1 (en) * | 2000-07-21 | 2002-02-05 | Syngenta Participations Ag | Zinc finger domain recognition code and uses thereof |
| US20030082561A1 (en) * | 2000-07-21 | 2003-05-01 | Takashi Sera | Zinc finger domain recognition code and uses thereof |
| US7026462B2 (en) * | 2000-12-07 | 2006-04-11 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
| US7067317B2 (en) * | 2000-12-07 | 2006-06-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
| EP1353941B1 (en) * | 2001-01-22 | 2013-03-13 | Sangamo BioSciences, Inc. | Modified zinc finger binding proteins |
| WO2003027247A2 (en) | 2001-09-24 | 2003-04-03 | Sangamo Biosciences, Inc. | Modulation of stem cells using zinc finger proteins |
| US7262054B2 (en) * | 2002-01-22 | 2007-08-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants |
| CA2474486C (en) | 2002-01-23 | 2013-05-14 | The University Of Utah Research Foundation | Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases |
| US20100151556A1 (en) * | 2002-03-15 | 2010-06-17 | Cellectis | Hybrid and single chain meganucleases and use thereof |
| WO2009095742A1 (en) * | 2008-01-31 | 2009-08-06 | Cellectis | New i-crei derived single-chain meganuclease and uses thereof |
| JP2005520519A (ja) * | 2002-03-15 | 2005-07-14 | セレクティス | ハイブリッドおよび単鎖メガヌクレアーゼならびにその使用 |
| US20030232410A1 (en) * | 2002-03-21 | 2003-12-18 | Monika Liljedahl | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
| US7101697B2 (en) * | 2002-04-30 | 2006-09-05 | Charité—Universitätsmedizin Berlin | Restriction endonucleases, method of synthesis and use thereof |
| CA2484676A1 (en) | 2002-05-03 | 2003-11-13 | Sequenom, Inc. | Kinase anchor protein muteins, peptides thereof, and related methods |
| CA2396345C (en) * | 2002-07-31 | 2007-04-10 | Rousseau Metal Inc. | Frontal latch handle assembly |
| US7361635B2 (en) * | 2002-08-29 | 2008-04-22 | Sangamo Biosciences, Inc. | Simultaneous modulation of multiple genes |
| EP2806025B1 (en) | 2002-09-05 | 2019-04-03 | California Institute of Technology | Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting |
| US7563600B2 (en) | 2002-09-12 | 2009-07-21 | Combimatrix Corporation | Microarray synthesis and assembly of gene-length polynucleotides |
| CA2507189C (en) * | 2002-11-27 | 2018-06-12 | Sequenom, Inc. | Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery |
| US20060206949A1 (en) | 2003-01-28 | 2006-09-14 | Sylvain Arnould | Custom-made meganuclease and use thereof |
| AU2004235331B2 (en) * | 2003-04-25 | 2008-12-18 | Sequenom, Inc. | Fragmentation-based methods and systems for De Novo sequencing |
| US20120196370A1 (en) | 2010-12-03 | 2012-08-02 | Fyodor Urnov | Methods and compositions for targeted genomic deletion |
| US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
| EP3222715A1 (en) | 2003-08-08 | 2017-09-27 | Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| US11311574B2 (en) | 2003-08-08 | 2022-04-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| WO2005024068A2 (en) * | 2003-09-05 | 2005-03-17 | Sequenom, Inc. | Allele-specific sequence variation analysis |
| WO2005028630A2 (en) | 2003-09-19 | 2005-03-31 | Sangamo Biosciences, Inc. | Engineered zinc finger proteins for regulation of gene expression |
| PT2025756E (pt) | 2003-11-18 | 2011-09-28 | Bayer Bioscience Nv | Inserção direccionada de adn em plantas |
| US7972854B2 (en) | 2004-02-05 | 2011-07-05 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| US7608394B2 (en) | 2004-03-26 | 2009-10-27 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation |
| EP2395098B1 (en) * | 2004-03-26 | 2015-07-15 | Agena Bioscience, Inc. | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis |
| CA2580070A1 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Sequenom, Inc. | Methods for long-range sequence analysis of nucleic acids |
| CA2579677A1 (en) * | 2004-09-16 | 2006-03-30 | Sangamo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for protein production |
| CA2584984A1 (en) * | 2004-10-18 | 2006-04-27 | Codon Devices, Inc. | Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides |
| US20070122817A1 (en) * | 2005-02-28 | 2007-05-31 | George Church | Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides |
| AU2006232828B2 (en) | 2005-04-04 | 2011-01-27 | Bayer Cropscience Nv. | Methods and means for removal of a selected DNA sequence |
| KR101419729B1 (ko) * | 2005-07-26 | 2014-07-17 | 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 | 외래 핵산 서열의 표적화된 통합 및 발현 |
| WO2009134714A2 (en) * | 2008-04-28 | 2009-11-05 | Precision Biosciences, Inc. | Fusion molecules of rationally-designed dna-binding proteins and effector domains |
| US8021867B2 (en) | 2005-10-18 | 2011-09-20 | Duke University | Rationally-designed meganucleases with altered sequence specificity and DNA-binding affinity |
| WO2007060495A1 (en) * | 2005-10-25 | 2007-05-31 | Cellectis | I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof |
| US7627401B2 (en) | 2006-02-07 | 2009-12-01 | Glenbrook Associates, Inc. | System and method for remotely regulating the power consumption of an electric appliance |
| US20080015164A1 (en) * | 2006-05-19 | 2008-01-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for inactivation of dihydrofolate reductase |
| WO2007139982A2 (en) | 2006-05-25 | 2007-12-06 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for gene inactivation |
| PL2049663T3 (pl) | 2006-08-11 | 2015-08-31 | Dow Agrosciences Llc | Homologiczna rekombinacja za pośrednictwem nukleazy z palcami cynkowymi |
| WO2008027558A2 (en) | 2006-08-31 | 2008-03-06 | Codon Devices, Inc. | Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits |
| CA2664414C (en) | 2006-09-28 | 2016-07-12 | Bayer Bioscience N.V. | Methods and means for removal of a selected dna sequence |
| US9217026B2 (en) * | 2006-11-13 | 2015-12-22 | Sangamo Biosciences, Inc. | Method of inactivating a glucocorticoid receptor gene in an isolated cell |
| SI2415872T1 (sl) * | 2006-12-14 | 2016-09-30 | Dow Agrosciences Llc | Optimizirani nekanonični proteini s cinkovim prstom |
| US8748146B2 (en) * | 2007-04-19 | 2014-06-10 | Celexion, Llc | Engineered nucleases and their uses for nucleic acid assembly |
| CN101679977B (zh) * | 2007-04-26 | 2013-05-01 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 向ppp1r12c基因座的靶向整合 |
| US8765448B2 (en) | 2007-06-05 | 2014-07-01 | Bayer CropScience, N.V. | Methods and means for exact replacement of target DNA in eukaryotic organisms |
| KR101510778B1 (ko) | 2007-07-12 | 2015-04-10 | 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 | 알파 1,6 당전이효소(ｆｕｔ8) 유전자 발현을 비활성화시키기 위한 방법 및 조성물 |
| CA2700231C (en) * | 2007-09-27 | 2018-09-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Rapid in vivo identification of biologically active nucleases |
| EP2205749B1 (en) * | 2007-09-27 | 2016-05-18 | Dow AgroSciences LLC | Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes |
| US11235026B2 (en) | 2007-09-27 | 2022-02-01 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for modulating PD1 |
| US8563314B2 (en) | 2007-09-27 | 2013-10-22 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for modulating PD1 |
| EP2597155B1 (en) | 2007-10-25 | 2016-11-23 | Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for targeted integration |
| EP2215252A4 (en) * | 2007-12-07 | 2011-01-26 | Prec Biosciences Inc | MEGANUCLEASES DESIGNED RATIONALLY WITH IDENTIFICATION SEQUENCES FOUND IN HUMAN GENOME DNAASE HYPERSENSIVE REGIONS |
| WO2009114321A2 (en) * | 2008-03-11 | 2009-09-17 | Precision Biosciencs, Inc. | Rationally-designed meganucleases for maize genome engineering |
| US20100071083A1 (en) * | 2008-03-12 | 2010-03-18 | Smith James J | Temperature-dependent meganuclease activity |
| EP2281050B1 (en) | 2008-04-14 | 2014-04-02 | Sangamo BioSciences, Inc. | Linear donor constructs for targeted integration |
| WO2009146179A1 (en) | 2008-04-15 | 2009-12-03 | University Of Iowa Research Foundation | Zinc finger nuclease for the cftr gene and methods of use thereof |
| KR101802393B1 (ko) * | 2008-06-10 | 2017-11-28 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | Ｂａｘ- 및 ｂａｋ-결함 세포주들의 제조 방법 및 조성물 |
| AU2009271011B2 (en) * | 2008-07-14 | 2015-10-22 | Precision Biosciences, Inc. | Recognition sequences for I-Crei-derived meganucleases and uses thereof |
| US8048307B2 (en) * | 2008-08-14 | 2011-11-01 | Brent Lee | Dynamic filtration device using centrifugal force |
| CN102159722B (zh) | 2008-08-22 | 2014-09-03 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 用于靶向单链切割和靶向整合的方法和组合物 |
| AU2009311697B2 (en) | 2008-10-29 | 2014-12-18 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for inactivating glutamine synthetase gene expression |
| US20110023145A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in autism spectrum disorders |
| US20110023152A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of cognition related genes in animals |
| US20110016539A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of neurotransmission-related genes in animals |
| US20110016541A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of sensory-related genes in animals |
| US20110023159A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Ovine genome editing with zinc finger nucleases |
| US20110023146A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in secretase-associated disorders |
| US20110023157A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Equine genome editing with zinc finger nucleases |
| US20110016542A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Canine genome editing with zinc finger nucleases |
| US20110023144A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in amyotrophyic lateral sclerosis disease |
| US20110023151A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of abc transporters |
| US20110023153A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in alzheimer's disease |
| US20110023156A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Feline genome editing with zinc finger nucleases |
| KR101803737B1 (ko) | 2008-12-04 | 2017-12-01 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 징크 핑거 뉴클레아제를 이용한 랫트의 유전체 편집 |
| US20110023154A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Silkworm genome editing with zinc finger nucleases |
| US20110016543A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in inflammation |
| US20110030072A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-02-03 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of immunodeficiency genes in animals |
| US20110023158A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Bovine genome editing with zinc finger nucleases |
| US20110023140A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Rabbit genome editing with zinc finger nucleases |
| US20110023139A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in cardiovascular disease |
| US20110016546A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Porcine genome editing with zinc finger nucleases |
| US20110023143A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of neurodevelopmental genes in animals |
| US20110023149A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in tumor suppression in animals |
| US20110023141A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved with parkinson's disease |
| US20110016540A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of genes associated with trinucleotide repeat expansion disorders in animals |
| US20110023148A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of addiction-related genes in animals |
| US20110023150A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of genes associated with schizophrenia in animals |
| US20110023147A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of prion disorder-related genes in animals |
| AR074783A1 (es) | 2008-12-17 | 2011-02-09 | Dow Agrosciences Llc | Metodos y composiciones para expresar uno o mas productos de un acido nucleico exogeno integrado al locus zp15 de una celula vegetal |
| EP2206723A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
| US20110239315A1 (en) | 2009-01-12 | 2011-09-29 | Ulla Bonas | Modular dna-binding domains and methods of use |
| CA2756833C (en) * | 2009-04-09 | 2019-11-19 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted integration into stem cells |
| US8772008B2 (en) * | 2009-05-18 | 2014-07-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for increasing nuclease activity |
| AU2010266705B2 (en) | 2009-06-30 | 2014-06-05 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Rapid screening of biologically active nucleases and isolation of nuclease-modified cells |
| CA2766123A1 (en) | 2009-07-08 | 2011-01-13 | Cellular Dynamics International, Inc. | Modified ips cells having a mutant form of human immunodeficiency virus (hiv) cellular entry gene |
| US9234016B2 (en) * | 2009-07-28 | 2016-01-12 | Sangamo Biosciences, Inc. | Engineered zinc finger proteins for treating trinucleotide repeat disorders |
| WO2011019385A1 (en) | 2009-08-11 | 2011-02-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Organisms homozygous for targeted modification |
| MY174390A (en) * | 2009-10-22 | 2020-04-15 | Sangamo Biosciences Inc | Engineered zinc finger proteins targeting plant genes involved in fatty acid biosynthesis |
| US10207240B2 (en) | 2009-11-03 | 2019-02-19 | Gen9, Inc. | Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly |
| US8956828B2 (en) | 2009-11-10 | 2015-02-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases |
| WO2011066185A1 (en) | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Gen9, Inc. | Microfluidic devices and methods for gene synthesis |
| SG181601A1 (en) | 2009-12-10 | 2012-07-30 | Univ Minnesota | Tal effector-mediated dna modification |
| WO2011085075A2 (en) | 2010-01-07 | 2011-07-14 | Gen9, Inc. | Assembly of high fidelity polynucleotides |
| EA031322B1 (ru) * | 2010-01-22 | 2018-12-28 | Дау Агросайенсиз Ллс | Клетка или клеточная линия для экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей и применение клетки или клеточной линии |
| US9255259B2 (en) * | 2010-02-09 | 2016-02-09 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules |
| CA2793633A1 (en) | 2010-03-29 | 2011-10-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Pharmacologically induced transgene ablation system |
| US9315825B2 (en) | 2010-03-29 | 2016-04-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Pharmacologically induced transgene ablation system |
| CA2796600C (en) | 2010-04-26 | 2019-08-13 | Sangamo Biosciences, Inc. | Genome editing of a rosa locus using zinc-finger nucleases |
| WO2011139349A1 (en) | 2010-05-03 | 2011-11-10 | Sangamo Biosciences, Inc. | Compositions for linking zinc finger modules |
| EP2571512B1 (en) | 2010-05-17 | 2017-08-23 | Sangamo BioSciences, Inc. | Novel dna-binding proteins and uses thereof |
| US9593317B2 (en) | 2010-06-09 | 2017-03-14 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| BR112012031323A2 (pt) | 2010-06-09 | 2015-09-08 | Bayer Cropscience Nv | métodos e meios para modificação de genoma vegetal em uma sequência de nucleotídeos comumente usada na engenahria genética de plantas |
| AU2011281062B2 (en) | 2010-07-21 | 2015-01-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for modification of a HLA locus |
| JP2013537410A (ja) | 2010-07-23 | 2013-10-03 | シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 標的化エンドヌクレアーゼおよび一本鎖核酸を用いたゲノム編集 |
| WO2012047598A1 (en) | 2010-09-27 | 2012-04-12 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for inhibiting viral entry into cells |
| CA2814143C (en) | 2010-10-12 | 2020-09-08 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Methods and compositions for treating hemophilia b |
| ES2548400T3 (es) | 2010-11-12 | 2015-10-16 | Gen9, Inc. | Métodos y dispositivos para la síntesis de ácidos nucleicos |
| WO2012064975A1 (en) | 2010-11-12 | 2012-05-18 | Gen9, Inc. | Protein arrays and methods of using and making the same |
| EP2659404B1 (en) | 2010-12-29 | 2018-08-08 | Sigma-Aldrich Co., LLC | Cells having disrupted expression of proteins involved in adme and toxicology processes |
| US9267123B2 (en) | 2011-01-05 | 2016-02-23 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for gene correction |
| CN103597082B (zh) | 2011-06-06 | 2017-09-15 | 拜尔作物科学公司 | 用于在预选位点修饰植物基因组的方法和手段 |
| ES2671733T3 (es) | 2011-06-30 | 2018-06-08 | Sigma Aldrich Co. Llc | Células deficientes en ácido CMP-N-acetilneuramínico hidroxilasa y/o glucoproteína alfa-1,3-galactosil transferasa |
| JP6072788B2 (ja) | 2011-07-25 | 2017-02-01 | サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド | 嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ｃｆｔｒ）遺伝子を改変するための方法および組成物 |
| EP2748323B1 (en) | 2011-08-22 | 2019-05-01 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Methods and means to modify a plant genome |
| EP2944693B1 (en) | 2011-08-26 | 2019-04-24 | Gen9, Inc. | Compositions and methods for high fidelity assembly of nucleic acids |
| CN103917644A (zh) | 2011-09-21 | 2014-07-09 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 调控转基因表达的方法和组合物 |
| AU2012323042B2 (en) | 2011-10-12 | 2015-01-15 | Bayer Cropscience Ag | Plants with decreased activity of a starch dephosphorylating enzyme |
| CA2851565A1 (en) | 2011-10-12 | 2013-04-18 | Bayer Cropscience Ag | Plants with decreased activity of a starch dephosphorylating enzyme |
| EP2771457B1 (en) | 2011-10-27 | 2017-11-22 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for modification of the hprt locus |
| CA2854819C (en) | 2011-11-16 | 2022-07-19 | Sangamo Biosciences, Inc. | Modified dna-binding proteins and uses thereof |
| CN104245932A (zh) | 2012-01-11 | 2014-12-24 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 具有简单糖型的重组蛋白的产生 |
| JP6490426B2 (ja) | 2012-02-29 | 2019-03-27 | サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド | ハンチントン病を治療するための方法および組成物 |
| US9150853B2 (en) | 2012-03-21 | 2015-10-06 | Gen9, Inc. | Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis |
| US11518997B2 (en) | 2012-04-23 | 2022-12-06 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome engineering in plants |
| EP4001427A1 (en) | 2012-04-24 | 2022-05-25 | Gen9, Inc. | Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning |
| MX369788B (es) | 2012-05-02 | 2019-11-21 | Dow Agrosciences Llc | Modificacion dirigida de deshidrogenasa de malato. |
| RU2650819C2 (ru) | 2012-05-07 | 2018-04-17 | Сангамо Терапьютикс, Инк. | Способы и композиции для опосредованной нуклеазой направленной интеграции трансгенов |
| US11120889B2 (en) | 2012-05-09 | 2021-09-14 | Georgia Tech Research Corporation | Method for synthesizing a nuclease with reduced off-site cleavage |
| CN104540382A (zh) | 2012-06-12 | 2015-04-22 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 用于产生条件性敲除等位基因的方法和组合物 |
| EP2861737B1 (en) | 2012-06-19 | 2019-04-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Gene targeting in plants using dna viruses |
| JP6509727B2 (ja) | 2012-06-25 | 2019-05-15 | ギンゴー バイオワークス， インコーポレイテッド | 核酸アセンブリおよび高処理シークエンシングのための方法 |
| US10648001B2 (en) | 2012-07-11 | 2020-05-12 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II |
| HUE041553T2 (hu) | 2012-07-11 | 2019-05-28 | Sangamo Therapeutics Inc | Lizoszomális tárolási betegségek (LSD) kezelése és génterápia |
| CA2878037C (en) | 2012-07-11 | 2021-08-31 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for delivery of biologics |
| ES2812599T3 (es) | 2012-08-29 | 2021-03-17 | Sangamo Therapeutics Inc | Procedimientos y composiciones para el tratamiento de una afección genética |
| WO2014039513A2 (en) | 2012-09-04 | 2014-03-13 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive t cell transfer |
| CN105264067B (zh) | 2012-09-07 | 2020-11-10 | 美国陶氏益农公司 | Fad3性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白 |
| UA118090C2 (uk) | 2012-09-07 | 2018-11-26 | ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі | Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив |
| ES2824024T3 (es) | 2012-10-10 | 2021-05-11 | Sangamo Therapeutics Inc | Compuestos modificadores de células T y usos de los mismos |
| JP6450683B2 (ja) | 2012-11-01 | 2019-01-09 | セレクティス | 治療用タンパク質の生産のための植物 |
| KR20150096696A (ko) | 2012-12-13 | 2015-08-25 | 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 | 메이즈에서 특정 유전자좌로의 정밀 유전자 표적화 |
| CN105120656A (zh) | 2012-12-21 | 2015-12-02 | 塞尔克蒂斯股份有限公司 | 冷诱导甜味降低的马铃薯 |
| AU2014207618A1 (en) | 2013-01-16 | 2015-08-06 | Emory University | Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto |
| US10113162B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-30 | Cellectis | Modifying soybean oil composition through targeted knockout of the FAD2-1A/1B genes |
| US10760064B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-09-01 | The General Hospital Corporation | RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci |
| CA2906553C (en) | 2013-03-15 | 2022-08-02 | The General Hospital Corporation | Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci |
| US9937207B2 (en) | 2013-03-21 | 2018-04-10 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted disruption of T cell receptor genes using talens |
| US20160053274A1 (en) | 2013-04-02 | 2016-02-25 | Bayer Cropscience Nv | Targeted genome engineering in eukaryotes |
| CN105263312A (zh) | 2013-04-05 | 2016-01-20 | 美国陶氏益农公司 | 用于在植物基因组内整合外源序列的方法和组合物 |
| WO2014186435A2 (en) | 2013-05-14 | 2014-11-20 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for reducing neointima formation |
| CA2910489A1 (en) | 2013-05-15 | 2014-11-20 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for treatment of a genetic condition |
| US10011850B2 (en) | 2013-06-21 | 2018-07-03 | The General Hospital Corporation | Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing |
| CA2920899C (en) | 2013-08-28 | 2023-02-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains |
| EP3043774B1 (en) | 2013-09-11 | 2020-11-04 | Eagle Biologics, Inc. | Liquid protein formulations containing ionic liquids |
| CN105899665B (zh) | 2013-10-17 | 2019-10-22 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 用于核酸酶介导的基因组工程改造的递送方法和组合物 |
| UY35816A (es) | 2013-11-04 | 2015-05-29 | Dow Agrosciences Llc | ?locus óptimos de la soja?. |
| AU2014341929B2 (en) | 2013-11-04 | 2017-11-30 | Corteva Agriscience Llc | Optimal maize loci |
| UA120503C2 (uk) | 2013-11-04 | 2019-12-26 | Дау Агросайєнсиз Елелсі | Спосіб одержання трансгенної клітини рослини кукурудзи |
| BR112016010175A2 (pt) | 2013-11-11 | 2017-10-03 | Sangamo Biosciences Inc | Repressor genético, seus usos, e composição farmacêutica |
| EP3960856A1 (en) | 2013-11-13 | 2022-03-02 | Children's Medical Center Corporation | Nuclease-mediated regulation of gene expression |
| EP2878667A1 (en) | 2013-11-29 | 2015-06-03 | Institut Pasteur | TAL effector means useful for partial or full deletion of DNA tandem repeats |
| EP3757116A1 (en) | 2013-12-09 | 2020-12-30 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for genome engineering |
| PL3102673T3 (pl) | 2014-02-03 | 2020-11-02 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Sposoby i kompozycje do leczenia talasemii beta |
| EP3102702B1 (en) | 2014-02-05 | 2019-04-03 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Error-free sequencing of dna |
| EP3736325A1 (en) | 2014-03-04 | 2020-11-11 | Sigma Aldrich Co. LLC | Viral resistant cells and uses thereof |
| US9624498B2 (en) | 2014-03-18 | 2017-04-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression |
| CA2946514C (en) | 2014-04-22 | 2023-08-29 | Q-State Biosciences, Inc. | Optogenetic analysis of compounds |
| WO2015164748A1 (en) | 2014-04-24 | 2015-10-29 | Sangamo Biosciences, Inc. | Engineered transcription activator like effector (tale) proteins |
| US11918695B2 (en) | 2014-05-09 | 2024-03-05 | Yale University | Topical formulation of hyperbranched polymer-coated particles |
| WO2015172149A1 (en) | 2014-05-09 | 2015-11-12 | Yale University | Hyperbranched polyglycerol-coated particles and methods of making and using thereof |
| CA2947622A1 (en) | 2014-05-13 | 2015-11-19 | Sangamo Biosciences, Inc. | Genome editing methods and compositions for prevention or treatment of a disease |
| CA2949710A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods to treat latent viral infections |
| US9970001B2 (en) | 2014-06-05 | 2018-05-15 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for nuclease design |
| US10301637B2 (en) | 2014-06-20 | 2019-05-28 | Cellectis | Potatoes with reduced granule-bound starch synthase |
| CA2955203C (en) | 2014-07-14 | 2022-01-04 | Washington State University | Nanos knock-out that ablates germline cells |
| WO2016011210A2 (en) | 2014-07-15 | 2016-01-21 | Juno Therapeutics, Inc. | Engineered cells for adoptive cell therapy |
| US11071289B2 (en) | 2014-08-14 | 2021-07-27 | Biocytogen Boston Corp | DNA knock-in system |
| ES2886012T3 (es) | 2014-09-16 | 2021-12-16 | Sangamo Therapeutics Inc | Métodos y composiciones para la ingeniería y corrección de genomas mediadas por nucleasas en células madre hematopoyéticas |
| EP3200804A4 (en) | 2014-10-01 | 2018-04-18 | Eagle Biologics, Inc. | Polysaccharide and nucleic acid formulations containing viscosity-lowering agents |
| CA2963080A1 (en) | 2014-10-01 | 2016-04-07 | The General Hospital Corporation | Methods for increasing efficiency of nuclease-induced homology-directed repair |
| US10889834B2 (en) | 2014-12-15 | 2021-01-12 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration |
| EP3247366A4 (en) | 2015-01-21 | 2018-10-31 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for identification of highly specific nucleases |
| US10048275B2 (en) | 2015-03-13 | 2018-08-14 | Q-State Biosciences, Inc. | Cardiotoxicity screening methods |
| ES2959608T3 (es) | 2015-04-03 | 2024-02-27 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Composición y métodos de edición del genoma de células B |
| US10738290B2 (en) | 2015-04-21 | 2020-08-11 | Novartis Ag | RNA-guided gene editing system and uses thereof |
| DK3289080T3 (da) | 2015-04-30 | 2021-11-08 | Univ Columbia | Genterapi til autosomalt dominante sygdomme |
| EP3298448A4 (en) | 2015-05-21 | 2019-03-27 | Q-State Biosciences, Inc. | OPTOGENETIC MICROSCOPE |
| GB2543873A (en) | 2015-05-29 | 2017-05-03 | Agenovir Corp | Compositions and methods for cell targeted HPV treatment |
| CA2986060A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-12-08 | Valerie Odegard | Composition and methods for regulating inhibitory interactions in genetically engineered cells |
| US10117911B2 (en) | 2015-05-29 | 2018-11-06 | Agenovir Corporation | Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections |
| US9957501B2 (en) | 2015-06-18 | 2018-05-01 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Nuclease-mediated regulation of gene expression |
| AU2016291778B2 (en) | 2015-07-13 | 2021-05-06 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
| MA42895A (fr) | 2015-07-15 | 2018-05-23 | Juno Therapeutics Inc | Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive |
| WO2017023570A1 (en) | 2015-08-06 | 2017-02-09 | The Curators Of The University Of Missouri | Pathogen-resistant animals having modified cd163 genes |
| US9512446B1 (en) | 2015-08-28 | 2016-12-06 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| US9926546B2 (en) | 2015-08-28 | 2018-03-27 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| US10837024B2 (en) | 2015-09-17 | 2020-11-17 | Cellectis | Modifying messenger RNA stability in plant transformations |
| AU2016369490C1 (en) | 2015-12-18 | 2021-12-23 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted disruption of the T cell receptor |
| CN108699132B (zh) | 2015-12-18 | 2023-08-11 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | Mhc细胞受体的靶向破坏 |
| EP3402533B1 (en) | 2016-01-15 | 2021-08-04 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the treatment of neurologic disease |
| UY37108A (es) | 2016-02-02 | 2017-08-31 | Cellectis | Modificación de la composición de aceites de soja mediante el knockout dirigido de los genes fad3a/b/c |
| CN109069568B (zh) | 2016-02-02 | 2023-07-07 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | 用于连接dna结合结构域和切割结构域的组合物 |
| CN109476706A (zh) | 2016-02-16 | 2019-03-15 | 耶鲁大学 | 用于促进靶向基因编辑的组合物及其使用方法 |
| WO2017143061A1 (en) | 2016-02-16 | 2017-08-24 | Yale University | Compositions and methods for treatment of cystic fibrosis |
| CN109069870B (zh) | 2016-02-24 | 2022-04-29 | 洛克菲勒大学 | 基于胚胎细胞的用于亨廷顿氏病的治疗候选物筛选系统、模型及它们的应用 |
| WO2017165167A1 (en) | 2016-03-23 | 2017-09-28 | The Regents Of The University Of California | Methods of treating mitochondrial disorders |
| WO2017173453A1 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications |
| WO2017189870A1 (en) | 2016-04-27 | 2017-11-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Stable nanoscale nucleic acid assemblies and methods thereof |
| WO2017189914A1 (en) | 2016-04-27 | 2017-11-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Sequence-controlled polymer random access memory storage |
| US11021713B2 (en) | 2016-05-25 | 2021-06-01 | Cargill, Incorporated | Engineered nucleases to generate deletion mutants in plants |
| CN109476715B (zh) | 2016-05-26 | 2023-06-27 | 纽海姆有限公司 | 产无籽果实的植物 |
| ES2901215T3 (es) | 2016-05-27 | 2022-03-21 | Aadigen Llc | Péptidos y nanopartículas para la liberación intracelular de moléculas de edición del genoma |
| EP3475446A1 (en) | 2016-06-27 | 2019-05-01 | Juno Therapeutics, Inc. | Method of identifying peptide epitopes, molecules that bind such epitopes and related uses |
| MA45491A (fr) | 2016-06-27 | 2019-05-01 | Juno Therapeutics Inc | Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés |
| US11124805B2 (en) | 2016-07-13 | 2021-09-21 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Methods, compositions and kits for increasing genome editing efficiency |
| US20190247436A1 (en) | 2016-07-21 | 2019-08-15 | Maxcyte, Inc. | Methods and compositions for modifying genomic dna |
| CA3033505A1 (en) | 2016-08-11 | 2018-02-15 | The Jackson Laboratory | Methods and compositions relating to improved human red blood cell survival in genetically modified immunodeficient non-human animals |
| AU2017315414B2 (en) | 2016-08-24 | 2024-02-15 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Engineered target specific nucleases |
| WO2018039440A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Regulation of gene expression using engineered nucleases |
| EP3503927A1 (en) | 2016-08-29 | 2019-07-03 | The Regents of the University of California | Topical formulations based on ionic species for skin treatment |
| US20190225974A1 (en) | 2016-09-23 | 2019-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome optimization in plants |
| US10961505B2 (en) | 2016-10-05 | 2021-03-30 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Generating mature lineages from induced pluripotent stem cells with MECP2 disruption |
| CN110381963A (zh) | 2016-10-13 | 2019-10-25 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 涉及色氨酸代谢途径调节剂的免疫治疗方法和组合物 |
| CA3039673A1 (en) | 2016-10-20 | 2018-04-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the treatment of fabry disease |
| WO2018081138A1 (en) | 2016-10-24 | 2018-05-03 | Yale University | Biodegradable contraceptive implants |
| US11020492B2 (en) | 2016-10-31 | 2021-06-01 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Gene correction of SCID-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells |
| CN109906030B (zh) | 2016-11-04 | 2022-03-18 | 安健基因公司 | 用于产生仅重链抗体的经基因修饰的非人动物和方法 |
| US11261428B2 (en) | 2018-03-15 | 2022-03-01 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
| US11332713B2 (en) | 2016-11-16 | 2022-05-17 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
| WO2018092072A1 (en) | 2016-11-16 | 2018-05-24 | Cellectis | Methods for altering amino acid content in plants through frameshift mutations |
| CA3045323A1 (en) | 2016-12-02 | 2018-06-07 | Juno Therapeutics, Inc. | Engineered b cells and related compositions and methods |
| JP7416406B2 (ja) | 2016-12-08 | 2024-01-17 | ケース ウェスタン リザーブ ユニバーシティ | 機能的ミエリン産生を増進させるための方法および組成物 |
| WO2018112470A1 (en) | 2016-12-16 | 2018-06-21 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Co-delivery of nucleic acids for simultaneous suppression and expression of target genes |
| US20190390241A1 (en) | 2017-01-24 | 2019-12-26 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Viral resistant cells and culture systems |
| JP2020515248A (ja) | 2017-03-21 | 2020-05-28 | ザ ジャクソン ラボラトリーＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ | ヒトＡＰＯＥ４およびマウスＴｒｅｍ２ ｐ．Ｒ４７Ｈを発現する遺伝子改変されたマウス、ならびにその使用の方法 |
| WO2018187493A1 (en) | 2017-04-04 | 2018-10-11 | Yale University | Compositions and methods for in utero delivery |
| SG11201906948UA (en) | 2017-04-20 | 2019-08-27 | Univ Oregon Health & Science | Human gene correction |
| CA3060622A1 (en) | 2017-04-25 | 2018-11-01 | Cellectis | Alfalfa with reduced lignin composition |
| JP7129426B2 (ja) | 2017-05-12 | 2022-09-01 | ザ ジャクソン ラボラトリー | Ｍｈｃクラスｉおよびｍｈｃクラスｉｉを欠損しているｎｓｇマウス |
| PL3538645T3 (pl) | 2017-06-20 | 2021-11-08 | Institut Curie | Komórki odpornościowe z defektem suv39h1 |
| US11851679B2 (en) | 2017-11-01 | 2023-12-26 | Juno Therapeutics, Inc. | Method of assessing activity of recombinant antigen receptors |
| WO2019094928A1 (en) | 2017-11-10 | 2019-05-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Microbial production of pure single stranded nucleic acids |
| EP3713644A1 (en) | 2017-11-20 | 2020-09-30 | University of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for modulating hif-2& x391; to improve muscle generation and repair |
| DK3501268T3 (da) | 2017-12-22 | 2021-11-08 | Kws Saat Se & Co Kgaa | Regenerering af planter i tilstedeværelse af histondeacetylase hæmmere |
| EP3508581A1 (en) | 2018-01-03 | 2019-07-10 | Kws Saat Se | Regeneration of genetically modified plants |
| WO2019138083A1 (en) | 2018-01-12 | 2019-07-18 | Basf Se | Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a |
| BR112020014140A2 (pt) | 2018-01-17 | 2020-12-01 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | inibidores de dna-pk |
| AU2019209293B2 (en) | 2018-01-17 | 2023-07-27 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | DNA-PK inhibitors |
| WO2019143677A1 (en) | 2018-01-17 | 2019-07-25 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Quinoxalinone compounds, compositions, methods, and kits for increasing genome editing efficiency |
| BR112020015488A2 (pt) | 2018-02-08 | 2020-12-08 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Nucleases alvo-específicas modificadas |
| EP3765094A4 (en) | 2018-03-15 | 2021-12-22 | KSQ Therapeutics, Inc. | GENE REGULATION COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING IMMUNOTHERAPY |
| JP2021519067A (ja) | 2018-03-23 | 2021-08-10 | ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク | 常染色体優性疾患のための遺伝子編集 |
| EP3545756A1 (en) | 2018-03-28 | 2019-10-02 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Regeneration of plants in the presence of inhibitors of the histone methyltransferase ezh2 |
| RU2020136054A (ru) | 2018-04-05 | 2022-05-06 | Джуно Терапьютикс, Инк. | Т-клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, соответствующие полинуклеотиды и способы |
| BR112020020245A2 (pt) | 2018-04-05 | 2021-04-06 | Editas Medicine, Inc. | Métodos de produzir células expressando um receptor recombinante e composições relacionadas |
| EP3567111A1 (en) | 2018-05-09 | 2019-11-13 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Gene for resistance to a pathogen of the genus heterodera |
| US11291176B2 (en) | 2018-06-15 | 2022-04-05 | Nunhems B.V. | Seedless watermelon plants comprising modifications in an ABC transporter gene |
| CA3103500A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-19 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Methods for improving genome engineering and regeneration in plant ii |
| CN112566924A (zh) | 2018-06-15 | 2021-03-26 | 科沃施种子欧洲股份两合公司 | 改善植物中基因组工程化和再生的方法 |
| BR112020025284A2 (pt) | 2018-06-15 | 2021-03-09 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Métodos para melhorar a eficiência da engenharia genômica |
| WO2020028617A1 (en) | 2018-08-01 | 2020-02-06 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Compositions and methods for improving embryo development |
| SG11202101801RA (en) | 2018-08-23 | 2021-03-30 | Sangamo Therapeutics Inc | Engineered target specific base editors |
| CN112912502A (zh) | 2018-08-31 | 2021-06-04 | 耶鲁大学 | 用于增强基于三链体和核酸酶的基因编辑的组合物和方法 |
| US20210348177A1 (en) | 2018-09-05 | 2021-11-11 | The Regents Of The University Of California | Generation of heritably gene-edited plants without tissue culture |
| EP3623379A1 (en) | 2018-09-11 | 2020-03-18 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Beet necrotic yellow vein virus (bnyvv)-resistance modifying gene |
| CN113015741A (zh) | 2018-09-18 | 2021-06-22 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | 程序性细胞死亡1(pd1)特异性核酸酶 |
| SG11202104560XA (en) | 2018-11-08 | 2021-05-28 | Triton Algae Innovations Inc | Methods for overproducing protoporphyrin ix in algae and compositions therefrom |
| KR20200071198A (ko) | 2018-12-10 | 2020-06-19 | 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 | Nrf2 발현 조절 기반 T 세포 항암면역치료법 |
| AU2020204657A1 (en) | 2019-01-04 | 2021-07-29 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Engineered nucleases to generate mutations in plants |
| US11419932B2 (en) | 2019-01-24 | 2022-08-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Nucleic acid nanostructure platform for antigen presentation and vaccine formulations formed therefrom |
| CN113490747A (zh) | 2019-01-29 | 2021-10-08 | 华威大学 | 用于提高基因组工程化效率的方法 |
| EP3708651A1 (en) | 2019-03-12 | 2020-09-16 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Improving plant regeneration |
| EP3946384A1 (en) | 2019-04-02 | 2022-02-09 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods for the treatment of beta-thalassemia |
| CA3136119A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | University Of Utah Research Foundation | Htra1 modulation for treatment of amd |
| AU2020265741A1 (en) | 2019-05-01 | 2021-11-25 | Editas Medicine, Inc. | Cells expressing a recombinant receptor from a modified TGFBR2 Locus, related polynucleotides and methods |
| KR20220016474A (ko) | 2019-05-01 | 2022-02-09 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | 변형된 ｃｄ247 유전자 자리로부터 키메라 수용체를 발현하는 세포, 관련 폴리뉴클레오타이드 및 방법 |
| US11905532B2 (en) | 2019-06-25 | 2024-02-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and methods for molecular memory storage and retrieval |
| EP3757219A1 (en) | 2019-06-28 | 2020-12-30 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Enhanced plant regeneration and transformation by using grf1 booster gene |
| WO2021013950A1 (en) | 2019-07-23 | 2021-01-28 | Mnemo Therapeutics | Immune cells defective for suv39h1 |
| KR20220101073A (ko) | 2019-08-30 | 2022-07-19 | 예일 유니버시티 | 핵산을 세포로 전달하기 위한 조성물 및 방법 |
| BR112022009067A2 (pt) | 2019-11-12 | 2022-08-09 | Kws Saat Se & Co Kgaa | Gene para resistência a um patógeno do gênero heterodera |
| JP2023525513A (ja) | 2020-05-06 | 2023-06-16 | セレクティス ソシエテ アノニム | 細胞ゲノムにおける外因性配列の標的化挿入のための方法 |
| JP2023525510A (ja) | 2020-05-06 | 2023-06-16 | セレクティス ソシエテ アノニム | 治療用タンパク質の送達のために細胞を遺伝子改変する方法 |
| WO2021231661A2 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-18 | Juno Therapeutics, Inc. | Process for producing donor-batched cells expressing a recombinant receptor |
| EP4171616A1 (en) | 2020-06-26 | 2023-05-03 | Juno Therapeutics GmbH | Engineered t cells conditionally expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods |
| EP4188395A1 (en) | 2020-07-30 | 2023-06-07 | Institut Curie | Immune cells defective for socs1 |
| WO2022046760A2 (en) | 2020-08-25 | 2022-03-03 | Kite Pharma, Inc. | T cells with improved functionality |
| CN116802203A (zh) | 2020-11-04 | 2023-09-22 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 从经修饰的恒定cd3免疫球蛋白超家族链基因座表达嵌合受体的细胞、相关多核苷酸和方法 |
| CA3200855A1 (en) | 2020-11-16 | 2022-05-19 | Pig Improvement Company Uk Limited | Influenza a-resistant animals having edited anp32 genes |
| EP4019638A1 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-29 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Promoting regeneration and transformation in beta vulgaris |
| EP4019639A1 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-29 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Promoting regeneration and transformation in beta vulgaris |
| WO2022204071A1 (en) | 2021-03-22 | 2022-09-29 | Juno Therapeutics, Inc. | Method to assess potency of viral vector particles |
| WO2022240846A1 (en) | 2021-05-10 | 2022-11-17 | Sqz Biotechnologies Company | Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof |
| WO2022251644A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-12-01 | Lyell Immunopharma, Inc. | Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof |
| CA3177712A1 (en) | 2021-06-02 | 2022-12-02 | Lyell Immunopharma, Inc. | Nr4a-deficient cells expressing c-jun and uses thereof |
| US20230045095A1 (en) | 2021-06-23 | 2023-02-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions, Methods and Systems for the Delivery of Gene Editing Material to Cells |
| WO2023064924A1 (en) | 2021-10-14 | 2023-04-20 | Codiak Biosciences, Inc. | Modified producer cells for extracellular vesicle production |
| WO2023081756A1 (en) | 2021-11-03 | 2023-05-11 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Precise genome editing using retrons |
| WO2023081923A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Frequency Therapeutics, Inc. | Platelet-derived growth factor receptor (pdgfr) alpha inhibitors and uses thereof |
| WO2023081900A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Juno Therapeutics, Inc. | Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods |
| WO2023086790A1 (en) | 2021-11-09 | 2023-05-19 | Amgen Inc. | Method for producing an antibody peptide conjugate |
| WO2023105244A1 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Pig Improvement Company Uk Limited | Editing tmprss2/4 for disease resistance in livestock |
| WO2023126458A1 (en) | 2021-12-28 | 2023-07-06 | Mnemo Therapeutics | Immune cells with inactivated suv39h1 and modified tcr |
| WO2023141602A2 (en) | 2022-01-21 | 2023-07-27 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Engineered retrons and methods of use |
| WO2023168397A1 (en) | 2022-03-04 | 2023-09-07 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Metabolic selection via the asparagine biosynthesis pathway |
| WO2023225665A1 (en) | 2022-05-19 | 2023-11-23 | Lyell Immunopharma, Inc. | Polynucleotides targeting nr4a3 and uses thereof |
| EP4279085A1 (en) | 2022-05-20 | 2023-11-22 | Mnemo Therapeutics | Compositions and methods for treating a refractory or relapsed cancer or a chronic infectious disease |
| WO2024013514A2 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Pig Improvement Company Uk Limited | Gene edited livestock animals having coronavirus resistance |
| WO2024044723A1 (en) | 2022-08-25 | 2024-02-29 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Engineered retrons and methods of use |
| WO2024062138A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | Mnemo Therapeutics | Immune cells comprising a modified suv39h1 gene |
| WO2024064958A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | Lyell Immunopharma, Inc. | Methods for culturing nr4a-deficient cells |
| WO2024064952A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | Lyell Immunopharma, Inc. | Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun |
| WO2024073692A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Metabolic selection via the glycine-formate biosynthesis pathway |
| WO2024073686A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Metabolic selection via the serine biosynthesis pathway |
| WO2024077174A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-11 | Lyell Immunopharma, Inc. | Methods for culturing nr4a-deficient cells |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU1972392A (en) * | 1991-06-11 | 1993-01-12 | General Hospital Corporation, The | Universal site-specific nucleases |
| US5436150A (en) * | 1992-04-03 | 1995-07-25 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease |
| ATE239785T1 (de) * | 1993-02-12 | 2003-05-15 | Univ Johns Hopkins | Funktionelle domänen der restriktionsendonukleasen aus -i(flavobakterium okeanokoites)(foki) |
-
1993
- 1993-09-27 US US08/126,564 patent/US5436150A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-08-23 JP JP7510290A patent/JPH09505728A/ja not_active Withdrawn
- 1994-08-23 CA CA002170986A patent/CA2170986A1/en not_active Abandoned
- 1994-08-23 EP EP94925854A patent/EP0721502A4/en not_active Withdrawn
- 1994-08-23 AU AU75636/94A patent/AU687435B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-23 WO PCT/US1994/009143 patent/WO1995009233A1/en not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-05-23 JP JP2006143294A patent/JP4081119B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-09-05 JP JP2007230093A patent/JP2008005851A/ja not_active Withdrawn
-
2008
- 2008-11-13 JP JP2008291366A patent/JP2009072201A/ja not_active Withdrawn
-
2012
- 2012-02-23 JP JP2012037730A patent/JP2012135316A/ja not_active Withdrawn
- 2012-12-21 JP JP2012279894A patent/JP2013081471A/ja active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN6011042331; Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ Ｖｏｌ．９０， Ｎｏ．７, 19930401, ｐｐ．２７６４-２７６８ * |
| JPN6011042332; ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．１０， Ｎｏ．５, 1991, ｐｐ．１１７９-１１８６ * |
| JPN6011042333; Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ Ｖｏｌ．８９, 1992, ｐ．４２７５-４２７９ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2009072201A (ja) | 2009-04-09 |
| WO1995009233A1 (en) | 1995-04-06 |
| JPH09505728A (ja) | 1997-06-10 |
| JP2008005851A (ja) | 2008-01-17 |
| EP0721502A4 (en) | 1997-02-12 |
| US5436150A (en) | 1995-07-25 |
| EP0721502A1 (en) | 1996-07-17 |
| JP2012135316A (ja) | 2012-07-19 |
| AU687435B2 (en) | 1998-02-26 |
| JP2006254921A (ja) | 2006-09-28 |
| JP4081119B2 (ja) | 2008-04-23 |
| CA2170986A1 (en) | 1995-04-06 |
| AU7563694A (en) | 1995-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4081119B2 (ja) | フラボバクテリウム・オケアノコイテス（ｆｏｋｉ）制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン | |
| EP0682699B1 (en) | FUNCTIONAL DOMAINS IN $i(FLAVOBACTERIUM OKEANOKOITES) (FOKI) RESTRICTION ENDONUCLEASE | |
| US5356802A (en) | Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease | |
| US5916794A (en) | Methods for inactivating target DNA and for detecting conformational change in a nucleic acid | |
| US5792640A (en) | General method to clone hybrid restriction endonucleases using lig gene | |
| Brent et al. | Mechanism of action of the lexA gene product. | |
| JP2021019617A (ja) | Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ複合体によるＲＮＡ指向性ＤＮＡ切断 | |
| Li et al. | Alteration of the cleavage distance of Fok I restriction endonuclease by insertion mutagenesis. | |
| US6265196B1 (en) | Methods for inactivating target DNA and for detecting conformational change in a nucleic acid | |
| Heitman et al. | Mutants of the EcoRI endonuclease with promiscuous substrate specificity implicate residues involved in substrate recognition. | |
| WO2001073079A2 (en) | Chimeric proteins for detection and quantitation of dna mutations, dna sequence variations, dna damage and dna mismatches | |
| US5089406A (en) | Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences | |
| Rettberg et al. | A three-way junction and constituent stem-loops as the stimulator for programmed− 1 frameshifting in bacterial insertion sequence IS911 | |
| JPH11506932A (ja) | 点変異の検出及びインビトロ突然変異誘発のための核酸修復酵素方法 | |
| Wickner et al. | Deletion analysis of the mini-P1 plasmid origin of replication and the role of Escherichia coli DnaA protein. | |
| Julien et al. | Purification and characterization of the bacteriophage P4 delta protein | |
| WO1995032281A1 (en) | A METHOD FOR DIRECT CLONING OF NUCLEASE GENES IN $i(E. COLI) | |
| EP0329710A1 (en) | Microbial production of peptide oligomers | |
| Golz et al. | Improved large-scale preparation of phage T4 endonuclease VII overexpressed in E. coli | |
| Kowalski et al. | Characterization of homing endonucleases | |
| US5824530A (en) | Overexpression of recombinant bacteriophage T4 endonuclease VII and uses thereof | |
| US6277614B1 (en) | Deoxyribonuclease | |
| Li | Studies on FokI (A type IIS) restriction endonuclease | |
| JP2007530046A (ja) | 新規モジュラーＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＣｓｐＣＩ、および新規特異性を有するエンドヌクレアーゼを製造するためのモジュラーエンドヌクレアーゼの用途 | |
| Yu-Keung | Purification, characterization and molecular cloning of thermophilic restriction endonucleases from soil Bacillus spp. and the use of Xcm I as a universal restriction enzyme |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130528 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130827 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130830 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131128 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140114 |