JP2006254921A - フラボバクテリウム・オケアノコイテス(foki)制限エンドヌクレアーゼにおける機能ドメイン - Google Patents
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Abstract
【解決手段】FokI制限エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むFokI制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のDNAセグメントと、FokI制限エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のDNAセグメント。これらのDNAセグメントをベクターに対して動作可能に連結してDNA構築物を得る。前記認識ドメインは、Ubxのホメオドメインである。
【選択図】 なし
Description
1.発明の技術分野
本発明はFokI制限エンドヌクレアーゼ系に関する。特に、本発明はこの制限エンドヌクレアーゼ系の分離した機能ドメインをコードするDNAセグメントに関する。
II型エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼ(modification methylase)は、二本鎖DNA中の特定の配列を認識するバクテリア酵素である。このエンドヌクレアーゼはDNAを開裂するのに対し、該メチラーゼはアデニン残基またはシトシン残基をメチル化して宿主ゲノムを開裂から保護する[II型制限酵素および修飾酵素;「ヌクレアーゼ」(Mordrich and Roberts編);ニューヨーク、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ社刊;第109〜154頁;1982年]。これらの制限−修飾(R−M)系は、この系がなければ細胞を破壊するようなファージおよびプラスミドによる感染から、細胞を保護するように機能する。
従って、本発明の一つの目的は、IIS型制限エンドヌクレアーゼの単離されたドメインを提供することである。
本発明は、FokI制限エンドヌクレアーゼの機能ドメインの同定および特徴付けに基づいている。本発明に至る実験において、FokI制限エンドヌクレアーゼは2ドメイン系であり、その一つのドメインは配列特異的認識活性を有するのに対して、他方のドメインはヌクレアーゼ開裂活性を含んでいることが見出された。
実施例I
FokIRM系のクローニング
FokI系を、変更表現型を選択する事によってクローンした。フラボバクテリウム・オケアノコイテス(Flavobacterium okeanokoites) 株DNAを、カゼルタら(Caserta et al., J. Biol. Chem., 262:4770-4777, 1987) によって記載された方法によって単離した。 数個のフラボバクテリウム・オケアノコイテスのゲノムライブラリーを、プラスミドpBR322及びpUC13中に、クローニング酵素PstI、BamHI及びBglIIを使用して構築した。プラスミド・ライブラリーDNA(10μg)を、100ユニットのFokIエンドヌークレアーゼで消化し、FokIM+表現型を発現するプラスミドを選択した。
ポリメラーゼ・チエイン・リアクションを使用したFokIエンドヌクレアーゼの効率的過剰生産者クローンの構築
PCRテクニックを使用してfokIR遺伝子を囲む転写及び翻訳信号を変更し、大腸菌における過剰発現を遂行した(Skoglund et al., Gene, 88:1-5, 1990)。fokIR及びfokIM遺伝子に先行するリボソーム結合部位を変更し、共通する大腸菌信号に適合させる。
FoKIエンドヌクレアーゼの精製
シンプルな3段階精製法を使用して、電気泳動法的に均質なFokIエンドヌクレアーゼを得た。RR1[pACYCfokIM、pRRSfokIR]を、37℃で、20 μg Tc/ml及び50 μg/Ap mlを含む2倍濃縮のTY6l中で、A600=0.8まで生育させ、1mM IPTGで、一晩誘導した。遠心分離によって細胞を収穫し、50 mM NaClを含む250mlの緩衝液A[10 mM Tris燐酸(pH8.0)、7 mM 2ーメルカプトメタノール、1mM EDTA、10% グリセロール]中に再懸濁した。
DNA基質の存在下におけるトリプシン開裂によるFokIRエンドヌクレアーゼの分析
トリプシンはセリン・プロテアーゼであり、リジン及びアルギニン残基のC末端で開裂する。これは、蛋白及び酵素のドメイン構造を研究するのに大変有用な酵素である。FokIのトリプリン消化は、その基質、d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3'(配列認識番号10): 5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'(配列認識番号11)の存在下で、オリゴヌクレオチド二量体:FokI分子比 =2.5:1で、実施された。FokI(200μg)をオリゴヌクレオチド二量体と一緒に、10 mM Tris・HCl、50 mM NaCl、10 % グリセロール、10 mM MgCl2、を含む容積180μl中で、室温にて1時間インキュベートした。トリプシン(20 μl、0.2 mg/ml)を、混合物中に添加した。反応混合物からアリコット(28μl)を別々の時間間隔をおいてとり、過剰のトリプシン阻害剤、アンチパインでクエンチングした。該トリプシン断片を、逆相HPLCで精製し、そのN末端配列を、Applied Biosystemの自動蛋白シークエンサーを使用して決定した。
オリゴdTセルロース親和性カラムを使用したFokIエンドヌクレアーゼのDNA結合トリプシン断片の単離
トリプシン断片のDNA結合性を、オリゴdTセルロース・カラムを使用して分析した。FokI(160μg)を2.5モル過剰オリゴヌクレチド二量体[d-5'-CCTCTGGATGCTCTC(A)15-3'(配列認識番号14):5'-GAGAGCATCCAGAGG(A)15-3'( 配列認識番号15)と一緒に、10 mM Tris・HCl(pH8)、50 mM NaCl、10% グリセロール、10mM MgCl2を含む容積90 μl中で、室温にて1時間インキュベートした。トリプシン(10 μl、0.2mg/ml)を該溶液に添加して消化を開始した。トリプシンとFokIの割合は、重量で1:80であった。消化を10分間実施し、反応液中に41 kDa N末端断片及び25 kDa C末端断片を優占的に得た。反応物を大過剰のアンチパイン(10μg)で、クエンチングし、ローデイング緩衝液[10 mM Tris・HCl(pH8.0)、1 mM EDTA、10 mM MgCl2、]で、最終容積が400 μlとなるまで希釈した。
ゲル・モビリテイ・シフト分析
特異的オリゴ(d-5'-CCTCTGGATGCTCTC-3' (配列認識番号第10), 5'-GAGAGCATCCAGAGG-3'(配列認識番号第11))は、40 mM Tris.HCl(pH7.5)、20 mM MgCl2、50mM NaCl、10 mM DTT、10ユニットのT4ポリヌクレオチド・キナーゼ(New England Biolabsより入手)、及び20μCi[γ−32P]ATP(3000Ci/mmol)を含む25 μlの反応混合物中で32P標識された。該混合物は、37℃で、30分インキュベートされた。キナーゼは、反応混合物を70℃15分加熱する事により失活させた。200μlの水を加えた後、溶液をセファデックスG−25(Superfine) カラム(Phamacia)を通過させて未反応[γ−32P]ATPを除いた。標識された単鎖オリゴの最終濃度は27μMであった。
DNA基質の非存在下でのトリプシン開裂によるFokI分析
DNA基質非存在下でのFokIエンドヌクレアーゼのトリプシンの時間経過を図8に示す。はじめに、FokIが、58kDa断片と8kDa断片に切断された。該58kDa断片はDNA基質に結合せず、オリゴdTセルロースカラムに保持されない。更に消化が進むと、58kDa断片は、数個の中間トリプシン消化断片に分解される。 しかしトリプシン消化が完了すると25kDa断片のみとなる(二つの重複バンドとして見える)。 これらの種(58kDa,25kDa、及び8kDa)は、逆相HPLCで精製され、そのアミノ末端配列が決定された(表I)。N末端配列と推定されるFokI配列を比較すると、8kDa断片がN末端で、58kDa断片がC末端である事がわかる。これは、さらにFokIのN末端が認識ドメインに関与しているという結論を支持している。 25kDa断片のN末端をシークエンスすると、二つの異なる成分が存在している事がわかる。非特異的DNA基質の存在下でのFokIエンドヌクレアーゼのトリプシン消化の時間経過では、非特異的DNA基質の非存在下でFokIのトリプシン消化で得られたプロフィルと類似していた。
FokIの25kDaC末端のトリプシン分解断片の開裂特異性
FokIの25kDa C末端トリプシン断片は、pTZ19Rを小さな産物に切断し、非特異的な開裂をしめす。分解産物は、牛小腸ホスファターゼによって脱リン酸化され、ポリヌクレオチド・キナーゼおよび[γ−32P]ATPによって32P標識された。過剰の標識は、セファデックスG25を使用して除去された。次に、標識された産物は、50 mM Tris.Hcl(pH7.6)、10 mM MgCl2を含む緩衝液中で、1ユニットの膵臓DNaseI(Boehringer-Mannheim)によって37℃、1時間で消化された。次に、0.02ユニットの蛇毒ホスホジエステラーゼを、反応混合物に添加し、37℃、1時間で消化した。
FokI制限エンドヌクレアーゼにおける機能的ドメイン
トリプシンを使用したFokIの機能的ドメインの分析(基質の存在下、非存在下における)を図9に要約した。FokIがDNA基質と結合すると、該酵素構造の変換が伴なった。この研究は、配列特異的認識用とエンドヌクレアーゼ活性用の二つの別個の蛋白ドメインが該酵素中に存在していることを裏付けている。この結果により、認識ドメインがFokIエンドヌクレアーゼのN末端にあるのに対して、開裂ドメインが、該分子のC末端に存在しているであろうことが示される。
FokI RM 系の完全なヌクレオチド配列は、多くの研究所によって公表されている(Looney et al., Gene 80: 193-208, 1989 & Kita et al., J. Biol. Chem. 264: 5751-56, 1989)。
例えば、PCRの実験プロトコールは、Skoglund et al., Gene 88:1-5, 1990 Bassing et al., Gene 113:83-88, 1992に、記載されている。細胞生育の方法及び変異酵素の精製は、野生型FokI(Li et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4275-79, 1992)用に使用された物と同じである。さらに、セファデックスG−75ゲルろ過およびヘパリンーセファロースCL−6Bカラムクロマトグラフィーが変異酵素を均質になるまで精製するステップが必要であった。
fokIR遺伝子内ヌクレオチド162におけるSpeI部位の変異
fokIR遺伝子内のSpeI部位89のひとつを変位させるのに使用される二段階PCR技法は、Landt et al., Gene 96:125-28, 1990)に記載されている。このプロトコール用の3つの合成プライマーは、1)SpeI部位内にひとつの不適性塩基を含む変異プライマー(5'- TCATAATAGCAACTAATTCTTTTTGGATCTT-3')(配列認識番号24参照)、2)制限部位ClaI部位(5'-CCATCGATATAGCCTTTTTTATT-3')(配列認識番号25)及びXbaI部位(5'-GCTCTAGAGGATCCGGAGGT-3')(配列認識番号26)でそれぞれフランキングされるプライマーである。第一段階では、XbaIプライマー及び変異プライマーを使用して中間断片が増幅された。次に、第2段階PCRで、ClaIプライマーが該中間物に添加された。0.3 kb PCR最終産物をXbaI/ClaIで消化し、付着末端を精製し、ゲル精製した。発現ベクター(pRRSfokIR)は、XbaI/ClaIで消化された。次に、4.2kbの大断片は、ゲル精製され、PCR断片に連結された。組替DNAは、受容可能な大腸菌RR1[pACYCfokIM]細胞にトランスフェクトされた。テトラサイクリン及びアンピシリン抗生物質による選択の後、数個のクローンを取り上げ、そのプラスミドDNAを、制限分析によって調べた。SpeI部位変異は、プラスミドDNAをサンガーのシークエンシング法(Sanger et al. Proc. Natl. Acd. Sci, USA 74:5463-67, 1977)使用したシークエンシングにより確認された。
4(または7)コドン挿入変異物の構築
4(または7)コドン挿入物を含むPCR産生DNAは、SpeI/XmaIで消化され、ゲル精製された。実施例Xで得られたプラスミドpRRSfokIRをSpeI/XmaIで切断し、3、9kbの大断片をゲル精製し、PCR産生物に連結した。該組替DNAは、受容可能なRRI[pACYCfokIM]細胞にトランスフェクトされ、所望のクローンが、実施例Xで記載されたように同定された。これらのクローン由来のプラスミドは単離されシークエンスされて、fokIR遺伝子の4(または7)コドン挿入物が確認された。
(1)fokIR遺伝子配列内には、ヌクレオチド162及び1152の夫々に2つのSpeI部位がある。1152の部位は、FokIのトリプシン開裂部位近隣に位置し、認識ドメインと開裂ドメインを分離している。この領域の周囲に、4(または7)のコドンを挿入するために、もう一方の162のSpeI部位を2段階PCR法(Landt et al. Gene 96:125-28, 1990) を使用して変異させた。このSpeI部位変異をfokIR遺伝子へ導入しても、過剰生産者クローンの発現レベルに影響をあたえない。
単一FokI部位をもつDNA基質の調製
それぞれ単一FokI認識部位をもつ2つの基質は、pTZ19Rをテンプレートとして使用したPCRによって調製された。オリゴヌクレオチド・プライマー:5'-CGCAGTGTTATCACTCAT-3' 及び 5'-CTTGGTTGAGTACTCACC-3'(夫々、配列認識番号27及び28)を使用して、100ベースペア断片を合成した。プライマー:5'-ACCGAGCTCGAATTCACT-3'及び 5'-GATTTCGGCCTATTGGTT-3'(夫々、配列認識番号29及び30)を使用して256ベース断片を調製した。これらの基質内の個々のストランドは、対応する32P標識されリン酸化されたプライマーを使用して、PCR中に放射線標識された。産生物を、低溶融アガロース・ゲルで精製し、エタノールで沈澱させTE緩衝液に再懸濁した。
変異酵素の配列特異性の分析
図13に、pTZ19R DNAのFokIおよび変異体酵素による開裂産生物のアガロース・ゲル電気泳動プロフィルが示される。それらが非常に類似している事は、認識ドメイン及び開裂ドメインの間のリンカー領域における4(または7)コドン挿入物がそのDNA配列の特異性を変えない事を示唆している。この事は、更に、各々単一のFokI部位を含む32P標識DNA基質(100bp及び256bp)を使用する事により確認された。32Pで標識された個々のストランドを含む基質は、実施例XIIに記載された様に調製された。FokIは、256ベースペアの基質を二つの断片、180bp及び72bpにそれぞれ切断する(図13B)。断片の長さは、各ストランドの32Pで標識された5’末端から計算された。アガロース・ゲルのオートラジオグラフが、図13Cに示される。基質中で32P標識を担持するストランドに依存して、72bp断片または180bp断片が、オートラジオグラフィーにバンドとして現われる。該変異酵素は、同一のアガロース・ゲル・プロフィル及びオートラジオグラフィーを現わす。それ故、認識ドメインと開裂ドメインの間の4(または7)コドン挿入物は、FokIエンドヌクレアーゼのDNA認識機構を変えない。
変異酵素による認識部位からの開裂距離の分析
変異酵素による開裂の距離を決定するために、32Pで標識された基質の開裂産物をPAGEで分析した(図14)。消化物は、これらの基質を合成するためのPCRで使用されたと同じプライマーで行われたpTZ19Rのシークエンシング反応に沿って分析された。100bp断片のFokIによる開裂パターンおよび変異物が、図14Aに示される。野生型酵素と比較すると、変異物の場合は、切断部位が基質の両ストランド上の認識部位からずれている。シークエンシング・ゲルおよび開裂産物の間の観測可能な小さなずれは、シークエンシング反応に使用される非リン酸化プライマーに起因する。
上記に言及したように、FokI制限ー変更システムの完全なヌクレオチド配列は、別の研究所から公表されている(Kita et al., J. Biol Chem. 264:5751-56 (1989); Looney et al., Gene 80: 193-208 (1989))。PCRの実験プロトコールは、いたるところに記載されている(Skoglund et al., Gene 88:1-5 (1990))。細胞生育およびHisbindTm樹脂を使用した蛋白の精製は、ノバジェン(Novagen)pETシステムマニュアルに、概説された通りである。さらに、ハイブリッド蛋白Ubx−FNをほぼ均質になるまで精製するためには、ホスホセルロースおよびDEAEカラム・クロマトグラフィーのステップを付加する事が必要である。SDS/PAGEのプロトコールは、Laemmli (Nature 222:680-685 (1970))によって記載された通りである。
pUC13派生DNA基質は、SmaI切断pUC13プラスミドの平滑末端と既知のUbx部位を含む10倍過剰量の30bp挿入物との連結によって調製された。数個のクローンを取り出し、そのプラスミドDNAを、30bp挿入物の有無について分析した。夫々、1、2、および3の挿入物を担持するpUC13(1),pUC13(2)、pUC13(3)を含クローンが同定された。そのDNA配列は、サンガーのジデオキシシークエンシング法によって確認された(Proc. Natl. Acd. Sci, USA 74: 5463-67 (1977))。
単一の30bp挿入物を保持するpUC13(1)のポリリンカー領域をEcoRI/HindIIIを使用して切り出し、ゲル精製した。この基質の各々のストランドは、32P−dATPまたは32P−dCTPを使用して放射線標識され、クレノー酵素で該断片の付着末端を充填した。該産生物を低溶融アガロース・ゲルで精製し、エタノールで沈澱させ、緩衝液(10mM Tris.HCl/1mM EDTA、pH8.0)中に再懸濁した。
ハイブリッド酵素Ubx−F N をPCRを使用して産生するクローンの構築
UbxのホメオボックスによってコードされるUbxのホメオ・ドメイン、61アミノ酸蛋白配列は、細菌性DNA結合蛋白中に見られるヘリックス・ターン・ヘリックスのモチーフに関係した構造を備えた配列特異的DNA結合ドメインである。(Hayashi et al., Cell 63:883-94 (1992); Wolberger et al., Cell 67:517-28 (1991)。Ubxホメオ・ドメインは、9bpのコンセンサスDNA部位、5'-TTAAT (G/T)(G/T) cc-3' (Ekker et al., The EMBO Journal 10:1179-86 (1991); Ekker et al., The EMBO Journal 11:4059-4702 (1992))を認識する。本発明者は、PCR法を使用して、Ubxホメオ・ドメインとFokIの開裂ドメイン(FN)を結合させ、また大腸菌中でUbx−FN酵素を発現させた。製作されたUbx−FNハイブリッド蛋白の概略代表例を図16に示す。ハイブリッド遺伝子を構築するために使用したオリゴヌクレオチド・プライマーを図17Aに示す。
Ubx−F N ハイブリッド酵素のDNA配列選択性の分析
Ubx−FNの特性を調べるのに使用される、基質より派生し直線化したpUC13を図19に示す。既知のUbx認識配列5'- TTAATGGTT-3'を含む30bp DNA断片を、pUC13のSmaI部位に挿入する事によって誘導体が構築される。挿入されたUbx部位で切断されると、1.8kb及び0.95kbの断片が産物として生じる。Ubx−FNによる基質の部分消化物のアガロース・ゲル電気泳動プロフィルが図19に示される。これらの反応において、DNAのモル数は、蛋白のモル数に比較して著しく過剰である。反応条件を至適化して、基質分子あたり単一の二本鎖開裂を得るようにした。直線化したpUC13DNAは、4つの断片に切断される。アガロース・ゲル電気泳動プロフィルに4つの異なったバンドが現れた事は、Ubx−FNが配列特異性をもってDNAと結合した事、及び直線化したpUC13中にハイブリッド蛋白に対する2つの結合部位があることを示している。このことは、単一のUbx部位を含む直線化されたpUC13DNA基質が6つの断片に切断されるという事実によって、更に裏付けられる。2つの付加的な断片(夫々、〜1.8kb及び〜0.95kb)は、pUC13の新規に挿入されたUbx部位でハイブリッド蛋白の結合が行われた事及びこの部位付近で開裂が起きた結果であると説明できよう。予測されたように、バンドの強度は、pUC13中における30bp挿入物の数に伴って増加する。pUC13の2つの推定UbX結合部位、及び挿入されたUbx部位が下記表3に示される。これら全ての部位は、5'-TAAT - 3'をその核配列として担持し、それら好ましい部位はUbxホメオ・ドメインに付いて報告された物と一致する。これら部位に対するUbxホメオ・ドメインの親和性は、該核部位を囲むヌクレオチド塩基によって変更される。完全な消化が長期にわたって見られ、或いは蛋白濃度を増やす事によって見られるので、ハイブリッド蛋白はターンオーバー(代謝回転)するようだ(データ記載せず)。高温での開裂はより特異的である。
ハイブリッド酵素による認識部位からの開裂距離の分析
Ubx−FNによる認識部位からの開裂距離を決定するために、単一Ubx部位を含む32P標識されたDNA基質の開裂産物が、PAGE(図20)によって分析された。消化産物は、基質のマキサム・ギルバート(G+A)シークエンシング反応にそって分析された。予想されたように、切断部位は、認識部位からはずれた。5'-TAAT-3'ストランドでは、Ubx−FNは、DNAを認識部位から3ヌクレオチド離れて切断するのに対して、5'-ATTA- 3'ストランドでは、認識部位から8、9、または10ヌクレオチド離れて切断する。単一のUbx部位を含んだDNA基質の開裂に基づくUbx−FNの切断部位の分析は、図20に要約されている。この開裂によって5’からTAATまでの配列が生じ、この開裂はUbx−FNハイブリッド蛋白を作成した場合(図16)と一致する。
上記においては、明瞭な理解を助けるために幾らか詳細に説明してきたが、本発明の真実の範囲を逸脱することなく、形態およびその詳細において種々の変更をなし得ることが、当業者には容易に承認されるであろう。
Claims (4)
- DNA構築物であって:
(i)IIS型エンドヌクレアーゼの開裂活性を含むIIS型エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをコードする第一のDNAセグメントと;
(ii)前記IIS型エンドヌクレアーゼの認識ドメイン以外の配列特異的認識ドメインをコードする第二のDNAセグメントと;
(iii)ベクターとを具備し、
前記第一のDNAセグメントおよび前記第二のDNAセグメントは、単一のタンパクが産生されるように、前記ベクターに対して動作可能に連結されているDNA構築物。 - 請求項1に記載のDNA構築物であって、前記IIS型エンドヌクレアーゼがFokI制限エンドヌクレアーゼであるDNA構築物。
- 請求項2に記載のDNA構築物であって、前記認識ドメインが、ジンクフィンガーモチーフ;ホメオドメインモチーフ;リプレッサのDNA結合性ドメイン;POUドメインモチーフ(真核転写レギュレータ);発癌遺伝子のDNA結合性ドメイン;および>6塩基対を認識する他の天然に存在する配列特異的なDNA結合性タンパクからなる群から選択されるDNA構築物。
- 請求項3に記載のDNA構築物であって、前記認識ドメインがUbxのホメオドメインであるDNA構築物。
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