ES2749108T3 - Escisión de ADN dirigida por ARN mediante el complejo Cas9-ARNcr - Google Patents

Abstract

Un procedimiento in vitro para la modificación específica de sitio de una molécula de ADN diana, comprendiendo el procedimiento poner en contacto, en condiciones adecuadas, una molécula de ADN diana; y una endonucleasa de ADN guiada por ARN que comprende al menos una secuencia de ARN y al menos uno de un motivo de sitio activo RuvC y un motivo de sitio activo HNH; en el que la endonucleasa de ADN guiada por ARN es un complejo Cas9-ARNcr comprendiendo dicho complejo Cas9-ARNcr una Cas9, ARNcr y ARNtracr para dar como resultado la molécula de ADN diana modificada en una región que está determinada por la unión complementaria del ARNcr a la molécula de ADN diana, comprendiendo el procedimiento adicionalmente ensamblar el complejo polipéptido-polirribonucleótidos in vitro incubando dichos componentes del complejo en condiciones adecuadas para el ensamblaje del complejo, en el que el ADN diana es bicatenario o monocatenario, y en el que un ADN diana bicatenario contiene un motivo adyacente al protoespaciador.

Description

DESCRIPCIÓN

Escisión de ADN dirigida por ARN mediante el complejo Cas9-ARNcr

Resumen

Los sistemas CRISPR/Cas proporcionan una inmunidad adaptativa contra virus y plásmidos en las bacterias y las arqueas. El silenciamiento de los ácidos nucleicos invasores es ejecutado por complejos de ribonucleoproteína (RNP) cargados previamente con pequeños ARNcrs interferentes que actúan como guías para el direccionamiento hacia ácidos nucleicos extraños y la degradación de los mismos. En este documento describimos el aislamiento del complejo Cas9-ARNcr y demostramos que genera in vitro una rotura de la hebra doble en sitios específicos, en moléculas de ADN diana que son complementarias a las secuencias de ARNcr y son portadoras de un motivo adyacente al protoespaciador (PAM) corto en las inmediaciones de la secuencia que se aparea. Mostramos que la escisión del a Dn es ejecutada por dos sitios activos distintos (RuvC y HNH) dentro de Cas9, para generar mellas específicas del sitio en hebras de ADN opuestas. La especificidad de secuencia del complejo Cas9-ARNcr viene dictada por el ARNcr de 42 nt que incluye un fragmento de 20 nt complementario a la secuencia del protoespaciador en el ADN diana. El complejo se puede ensamblar in vitro o in vivo. En conjunto, nuestros datos demuestran que el complejo Cas9-ARNcr actúa como una endonucleasa guiada por ARN con reconocimiento y corte del sitio diana específico de la secuencia, a través de dos mellas en hebras distintas.

Antecedentes

Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas e intercaladas regularmente (CRISPR, del inglés “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”) junto con los genes cas (asociados a CRISPR, del inglés “CRISPR-associated”) comprenden un sistema inmune adaptativo que proporciona una resistencia adquirida frente a ácidos nucleicos extraños invasores en bacterias y arqueas (Barrangou y col., 2007. Science 315:1709-12). CRISPR consiste en disposiciones de secuencias de repeticiones cortas conservadas, intercaladas con secuencias de ADN variables únicas de tamaño similar, denominadas espaciadores, que a menudo provienen del ADN de un fago o plásmido (Ba­ rrangou y col., 2007. Science 315:1709-12; Bolotin y col., 2005. Microbiology 151:2551-61; Mojica y col., 2005. J Mol Evol 60:174-82). El sistema CRISPR-Cas actúa mediante la adquisición de segmentos cortos de ADN extraño (espa­ ciadores) que se insertan en la región CRISPR y proporcionan inmunidad frente a exposiciones posteriores a fagos y plásmidos que son portadores de secuencias que se aparean (Barrangou y col., 2007. Science 315:1709-12; Brouns y col., 2008. Science 321:960-4). La inmunidad CRISPR-Cas generalmente se lleva a cabo a través de tres etapas, denominadas i) adaptación/inmunización/adquisición de espaciadores, ii) expresión de CRISPR/biogénesis de ARNcr, iii) interferencia/inmunidad. (Horvath y Barrangou, 2010. Science 327:167-70; Deveau y col., 2010. Annu Rev Microbiol. 64:475-93; Marraffini y Sontheimer, 2010. Nat Rev Genet 11, 181-90; Bhaya y col., Annu Rev Genet 45:273-97; Wiedenheft y col., 2012. Nature 482:331-338). En este documento, nos centramos específicamente en la etapa de interferencia/inmunidad que permite el silenciamiento mediado por ARNcr de ácidos nucleicos extraños.

El documento US 2010/0076057 A1 desvela la interferencia de una diana con ARNcr.

Los sistemas CRISPR-Cas altamente diversos se clasifican en tres tipos principales, que se subdividen adicionalmente en diez subtipos según el contenido y las secuencias del elemento central (Makarova y col., 2011. Nat Rev Microbiol 9:467-77). La organización estructural y la función de los complejos de nucleoproteína implicados en el silenciamiento mediado por ARNcr de ácidos nucleicos extraños, difieren entre los distintos tipos de CRISPR/Cas (Wiedenheft y col., 2012. Nature 482:331-338). En el sistema de Tipo I-E, tal y como se ejemplifica con Escherichia coli, los ARNcrs se incorporan en un complejo efector con multisubunidades denominado Cascade (complejo asociado con CRISPR para la defensa antiviral, del inglés “CRISPR-associated complex for antiviral defence”) (Brouns y col., 2008. Science 321:960-4), que se une al ADN diana y desencadena una degradación a través de la proteína Cas3 distintiva (Sinkunas y col., 2011. EMBO J 30:1335-42; Beloglazova y col., 2011. EMBO J 30:616-27). En los sistemas CRISPR/Cas de Tipo III de Sulfolobus solfataricus y Pyrococcus furiosus, el módulo Cas RAMP (Cmr) y el complejo ARNcr reconocen y escinden el ARN sintético in vitro (Hale y col., 2012. Mol Cell 45:292-302; Zhang y col., 2012. Mol Cell, 45:303-13) mientras que el sistema CRISPR/Cas de Staphylococcus epidermidis se dirige al ADN in vivo (Marraffini y Sontheimer, Science. 322:1843-5).

Los complejos de RNP involucrados en el silenciamiento del ADN a través de los sistemas CRISPR/Cas de Tipo II, más específicamente en el sistema CRISPR3/Cas de Streptococcus thermophilus DGCC7710 (Horvath y Barrangou, 2010. Science 327:167-70), consisten en cuatro genes cas cas9, cas1, cas2 y csn2, que se encuentran corriente arriba de 12 unidades de repetición-espaciador (Figura 1A). Cas9 (anteriormente denominado cas5 o csn1) es el gen distin­ tivo para los sistemas de Tipo II (Makarova y col., 2011. Nat Rev Microbiol 9:467-77). En el sistema CRISPR1/Cas de S. thermophilus estrechamente relacionado, la alteración de cas9 anula la interferencia del ADN mediada por ARNcr (Barrangou y col., 2007. Science 315:1709-12). Hemos observado recientemente que el sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus se puede transferir a Escherichia coli, y que este sistema heterólogo proporciona una protección contra la transformación con plásmidos y la infección con fagos, de novo (Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82). La interferencia contra el ADN de fagos y plásmidos proporcionada por CRISPR3 de S. thermophilus requiere la presencia, dentro del ADN diana, de una secuencia de protoespaciador complementaria al ARNcr obtenido a partir del espaciador, y una secuencia PAM (motivo adyacente al protoespaciador) conservada, NGGNG, ubicada inmediatamente corriente abajo del protoespaciador (Deveau y col., 2008. J Bacteriol 190:1390-400; Horvath y col., 2008. J Bacteriol 190:1401-12; Mojica y col., 2009. Microbiology 155:733-40). Mutaciones puntuales aisladas en PAM o posiciones del protoespaciador definidas permiten que los fagos o plásmidos eviten la inmunidad mediada por c RiSPR (Deveau y col., 2008. J Bacteriol 190:1390-400; Garneau y col., 2010. Nature 468:67-71; Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82). Hemos establecido que en el sistema heterólogo, cas9 es el único gen cas necesario para la interferencia codificada por CRISPR (Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82), lo que sugiere que esa proteína está involucrada en el procesamiento del ARNcry/o el silenciamiento mediado por ARNcr del ADN invasor. Cas9 del sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus es una proteína con multidominios grande com­ puesta por 1.409 restos de aa (Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82). Contiene dos dominios de nucleasa, un dominio de nucleasa similar a RuvC cerca del extremo amino terminal y un dominio de nucleasa similar a HNH en el medio de la proteína. El análisis mutacional ha establecido que la interferencia proporcionada in vivo por Cas9 requiere ambos motivos RuvC y HNH (Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82).

Se proporciona el aislamiento del complejo Cas9-ARNcr del sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus, así como el ensamblaje del complejo in vitro a partir de componentes distintos y la demostración de que escinde tanto un oligodesoxinucleótido sintético como ADN plasmídico que es portador de una secuencia de nucleótidos complementaria al ARNcr, de una manera dependiente de PAM. Además, proporcionamos una evidencia experimental de que el PAM es reconocido en el contexto de un ADN bicatenario y es decisivo para la unión y la escisión de ADN in vitro. Finalmente, observamos que los sitios activos RuvC y HNH de Cas9 son responsables de la escisión de las hebras de ADN opuestas. Resumiendo, nuestros datos demuestran que el complejo Cas9-ARNcr actúa como una endonucleasa guiada por ARN que utiliza el ARN para el reconocimiento del sitio diana y Cas9 para la escisión del ADN. La organi­ zación modular simple del complejo Cas9-ARNcr, en donde la especificidad hacia las dianas de ADN está codificada por un ARNcr pequeño y la maquinaria para la escisión consiste en una única proteína Cas con multidominios, pro­ porciona una plataforma versátil para la modificación genética de endonucleasas universales de ADN guiadas por ARN. De hecho, proporcionamos una evidencia de que alterando la secuencia de ARN dentro del complejo Cas9-ARNcr, se pueden diseñar endonucleasas programables tanto para aplicaciones in vitro como in vivo, y proporciona­ mos una prueba de concepto para esta aplicación novedosa. Estos hallazgos allanan el camino para el desarrollo de nuevas herramientas moleculares para la cirugía del ADN dirigida por ARN.

Compendio de la invención

El procedimiento de la invención se define en la reivindicación 1. Además se desvela un procedimiento para una modificación específica de sitio de una molécula de ADN diana a través de la puesta en contacto en condiciones adecuadas, de una molécula de polidesoxinucleótido diana; y se proporciona una endonucleasa de ADN guiada por ARN que comprende al menos una secuencia de ARN y al menos uno de un motivo de sitio activo RuvC y un motivo de sitio activo HNH; para dar como resultado la molécula de polidesoxinucleótido diana modificada en una región que se determina mediante la unión complementaria de la secuencia de ARN a la molécula de ADN diana. El procedimiento incluye incubar en condiciones adecuadas una composición que incluye un polidesoxinucleótido bicatenario diana o un polidesoxinucleótido monocatenario diana; en el que un polidesoxinucleótido bicatenario contiene un motivo adya­ cente al protoespaciador corto (PAM), que no es obligatorio para un polidesoxinucleótido monocatenario; y en donde PAM comprende una secuencia 5'NGGNG-3'; un polirribonucleótido (ARNcr) que comprende regiones 3' y 5' en el que la región 3' comprende al menos 22 nt de la repetición presente en un microbio que contiene un locus CRISPR y una región 5' comprende al menos 20 nt de la secuencia del espaciador inmediatamente corriente abajo de la repetición en el locus CRISPR, que es sustancialmente complementaria, opcionalmente complementaria, a una porción del polinucleótido diana, un polipéptido en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 tienen al menos un 80 % de identidad, aislado a partir de S. thermophilus, o un microorganismo modificado genéticamente que incluye una E. coli modificada genéticamente, o en el que el polipéptido se produce mediante un procedimiento seleccionado de tecnología de ADN recombinante o síntesis química; un ARNtracr de polirribonucleótido con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5 (o que tiene al menos el 80 % de identidad) que comprende regiones 5' y 3', en el que la región 5' que está compuesta por al menos 22 nucleótidos es complementaria a la región 3' de 22 nucleótidos del ARNcr, y una región 3'. En el que los polirribonucleótidos son producidos mediante transcripción in vitro o síntesis química. En el que, unas condiciones adecuadas significa condiciones in vitro en las que puede tener lugar la reacción.

Se desvela un procedimiento para la conversión de un polipéptido Cas9 en una mellasa (del inglés “nickase”), que corta solo una hebra del ADN bicatenario, inactivando uno de los sitios activos (RuvC o HNH) en el polipéptido me­ diante al menos una mutación puntual, se proporcionan mutaciones puntuales ejemplificadas por D31A (SEQ ID NO: 2), N891A (SEQ ID NO: 3) y H868A (SEQ ID NO: 4). El mutante del motivo RuvC corta solo la hebra de ADN inferior con respecto al motivo 5'NGGNG-3', mientras que el mutante del motivo de HNH corta la hebra superior.

El complejo polipéptido-polirribonucleótidos se puede aislar a partir de un microbio modificado genéticamente (por ejemplo, Escherichia coli o Streptococcus thermophilus), o ensamblar in vitro a partir de componentes distintos. En el microbio modificado genéticamente, los componentes del complejo se pueden codificar en uno, dos o tres plásmidos distintos que contienen promotores del hospedador del microbio modificado genéticamente o promotores procedentes del genoma de un hospedador natural.

Se desvela un procedimiento para ensamblar un complejo polipéptido-polirribonucleótidos activo in vitro que comprende incubar los componentes del complejo en condiciones adecuadas para proporcionar el ensamblaje del complejo. El complejo se puede ensamblar utilizando tres o cuatro componentes. El procedimiento para ensamblar tres componentes comprende la incubación del polipéptido Cas9, el polirribonucleótido ARNtracr de 78 nt (SEQ ID NO: 5) y el polirribonucleótido ARNcr de 42 nt (5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GUUUUAGA-GCUGUGUUGUUUCG-3') (SEQ ID NO: 15) en condiciones adecuadas para ensamblar el complejo. El procedimiento para ensamblar cuatro componentes comprende incubar el polipéptido Cas9; el polirribonucleótido ARNtracr de 102 nt (SEQ ID NO: 6); la secuencia que contiene el polirribonucleótido 5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GUUUUAGA-GCUGUGUUGUUUCG-3' (SEQ ID NO: 15) y regiones flanqueantes y polipéptido RNasa III, que escinde un polinucleótido de ARN bicatenario. Ejemplos para la secuencia que contiene el polirribonucleótido 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3' (SEQ ID NO: 15) son la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12. Ejemplos de una fuente de RNasaIII adecuada incluyen Escherichia coli o Streptococcus thermophilus.

Se desvela un procedimiento que se proporciona para reprogramar una especificidad del complejo Cas9-ARNcr mez­ clando componentes distintos o usando un casete que contiene una sola unidad de repetición-espaciador-repetición. Cualquier secuencia se puede insertar entre dos repeticiones en el casete usando endonucleasas de restricción ade­ cuadas. El casete se puede usar para direccionar secuencias in vivo, o para producir ARN ribonucleótido adecuado para ensamblar el complejo in vitro.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 muestra que la proteína Cas9 se purifica junto con ARNcr. (A) Representación esquemática del sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus. Cuatro genes cas (cas9, cas1, cas2, csn2) se encuentran corriente arriba de la disposición de repetición-espaciador de CRISPR, que consiste en 13 secuencias de repeticiones (R) y 12 espacia­ dores únicos (S1-S12). El ARNtracr, requerido para la maduración del ARNcr en los sistemas CRISPR de Tipo II (Deltcheva y col., 2011. Nature 471:602-7), se encuentra corriente arriba del gen cas9 y se codifica en la hebra de ADN opuesta (mostrada por una flecha) con respecto a los otros elementos del sistema CRISPR3/Cas. (B) Repre­ sentación esquemática de loci heterólogos en dos plásmidos utilizados para la coexpresión del complejo Cas9-ARNcr. La cepa de E. coli RR1 contenía los plásmidos pCas9(-)1SP (que codifica Cas1, Cas2, Csn2, Sp 1 y ARN­ tracr) y pASKIBA-Cas9 (que codifica la versión marcada con Strep de Cas9). (C) Análisis Northern de complejos Cas9-ARNcr usando un oligonucleótido anti-ADNcr como sonda. M1 - oligodesoxinucleótido de 84 nt correspon­ diente a la unidad de espaciador S1-repetición; M2 - oligorribonucleótido sintético de 42 nt correspondiente al ARNcr CRISPR3 de S. thermophilus previsto (véase la Figura 4); ARNcr (wt) - ARNcr aislado a partir del complejo Cas9 wt; K1 - ARNcr (wt) tratado con DNasa I durante 15 min; K2 - ARNcr (wt) tratado con RNasal durante 15 minutos, D31A - ARNcr purificado a partir del complejo mutante Cas9 D31A; N891A - ARNcr purificado a partir del complejo mutante Cas9 N891A.

La Figura 2 muestra la escisión de ADN a través de complejos Cas9-ARNcr obtenidos mediante la coexpresión de Cas9 con el locus CRISPR de longitud completa. (A) Representación esquemática del locus CRISPR/Cas del plásmido pCas9(-) recombinante que es portador de una disposición autóctona de 12 espaciadores-repeticiones del sistema SthCRISPR3/Cas y el plásmido pASKIBA-Cas9 que es portador del gen cas9 con un marcador Strep en el extremo C-terminal. (B) Ensayo de escisión de oligodúplex. Ambos plásmidos, pCas9(-) y pASKIBA-Cas9 se coexpresaban en E. coli, los complejos Cas9-ARNcrse purificaron y se sometieron a un análisis de escisión usando los oligodúplex SP1 (primer protoespaciador) y SP2 (segundo protoespaciador) marcados con 33P en el extremo 5' de la hebra (+). Los productos de la reacción se analizaron en gel de PAA.

La Figura 3 muestra inmunidad frente a una transformación con plásmido en células de E. coli proporcionada por el sistema SthCRISPR3/Cas. (A) Representación esquemática del locus CRISPR/Cas del plásmido recombinante pCRISPR3 que es portador de una disposición autóctona de 12 espaciadores-repeticiones del sistema Sth-CRISPR3/Cas y el plásmido pCRISPR3-SP1 modificado genéticamente que es portador de 1 unidad de espacia­ dor-repetición. (B) Interferencia de la transformación de un plásmido a través del sistema SthCRISPR3/Cas en células de E. coli. Las cepas receptoras de Escherichia coli r R1 que eran portadoras de los plásmidos pACYC184, pCRISPR3 o pCRISPR3-SP1, se transformaron con el plásmido pSP1 que era portador de protoespaciadores y PAM o pUC18 (1). La eficacia de la transformación se expresa como ufc por nanogramo de ADN plasmídico (media ± DE).

La Figura 4 muestra una comparación de los sistemas CRISPR/Cas de Tipo IIA procedentes de las cepas de S. thermophilus DGCC7710, l MD-9 y S. pyogenes SF370. (A) Organización esquemática de los sistemas CRISPR/Cas. Las secuencias de nucleótidos correspondientes al ARNtracr requerido para la maduración del ARNcr en S. pyogenes (2) están presentes en LMD-9 y DGCC7710. Porcentaje de restos idénticos y similares (entre paréntesis) entre las secuencias de proteínas correspondientes que están conectadas por líneas disconti­ nuas. (B). Alineación de las secuencias repetidas conservadas y ARNtracr. Las secuencias correspondientes pro­ cedentes de DGCC7710 y LMD-9 son idénticas. Las posiciones de nucleótidos que son idénticas en las tres cepas están marcadas con un asterisco debajo de las secuencias alineadas. La Figura 4(B) desvela las SEQ ID NOS 50, 50-52 y 52-53, respectivamente, por orden de aparición. (C) Comparación de las secuencias de ARNcr. La se­ cuencia y la longitud del ARNcr de S. pyogenes se determinaron mediante un análisis de secuenciación profunda (2). La longitud aproximada del ARNcr procedente de las cepas de S. thermophilus LMD-9 (2) y DGCC7710 (este trabajo), se determinaron mediante el análisis de transferencia Northern. La Figura 4(C) desvela las SEQ ID NOS 54-56, respectivamente, por orden de aparición.

La Figura 5 muestra que el complejo Cas9-ARNcr corta in vitro ADN bicatenario dentro de un protoespaciador. (A) Sustrato de oligodúplex utilizado en el ensayo de escisión. El oligodúplex SP1 de 55 nt contiene el protoespaciador1 (letras rojas), PAM (letras azules) y secuencias flanqueantes de 10 nt a ambos lados, idénticas a las del plásmido pSP1. En el oligodúplex SP1, la hebra de ADN complementaria al fragmento 5'-terminal del ARNcr (letras rojas) se denomina hebra (+), una hebra de ADN opuesta se denomina hebra (-). La Figura 5(A) desvela las SEQ ID NOS 31, 7 y 34, respectivamente, por orden de aparición. (B) Escisión del oligodúplex SP1. Se incubaron 2,5 nM del complejo Cas9-ARNcry 1 nM del oligodúplex SP1 marcado con 33P en el extremo 5' de la hebra (+) o (-), en tampón de reacción (Tris-HC 10 mM pH = 7,5, NaCl 10 mM, MgCl210 mM, 0,1 mg/ml de BSA) a 37 °C durante intervalos de tiempo variados (de 30 s a 10 min) y los productos de la reacción se analizaron en el gel de PAA al 20%. Los carriles M1 y M2 contienen oligodesoxinucleótidos de 37 nt y 18 nt, sintetizados químicamente, marcados con 33P en el extremo 5' que se corresponden con los productos de escisión de las hebras de ADN (-) y (+), respectivamente. Las posiciones de la escisión se indican con flechas. La Figura 5(B) desvela la SEQ ID NO: 31. (C) Representación esquemática del plásmido pSP1 (Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82) utilizado en el ensayo de escisión del plásmido. La Figura 5(C) desvela la SEQ ID NO: 57. (D) Escisión del plásmido pSP1. Análisis en gel de agarosa de los productos de escisión de pSP1 (panel izquierdo). SC - ADN plasmídico superenrollado, OC - ADN circular abierto mellado en una de las hebras, FLL - ADN lineal de longitud completa cortado en ambas hebras. Las mezclas de reacción finales a 37 °C contenían 2,5 nM de plásmido pSP1 y 2,5 nM de complejo Cas9-ARNcren el tampón de reacción (sección B). Electroferogramas de secuenciación directa (panel derecho) de las hebras (+) (parte superior) y (-) (parte inferior) del producto de escisión del plásmido pSP1. La adición sin molde de adenina (T en la secuencia complementaria inversa que se muestra en este documento) en el extremo de la secuencia, es un artefacto de la secuenciación causado por la polimerasa. La Figura 5(D) desvela las SEQ ID NOS 57-59, 58 y 60, respectivamente, por orden de aparición.

La Figura 6 muestra un análisis de la unión y la escisión del ADN de la proteína Cas9-Chis que carece de ARNcr. Análisis del cambio de la movilidad electroforética (EMSA) de la proteína Cas9-Chis que se une a (A) el oligodúplex SP1 bicatenario y (B) el oligonucleótido s(+)SP1 monocatenario. Los experimentos de cambio de la movilidad electroforética se realizaron en el tampón de unión (Tris-acetato 40 mM, pH 8,3 a 25 °C, EDTA 0,1, 0,1 mg/ml de BSA, glicerol al 10% v/v). Las reacciones contenían 0,5 nM del oligodúplex marcado con 33P y la proteína, en las concentraciones indicadas encima de cada carril. (C). Ensayo de escisión de oligonucleótidos. Se incubaron 5 nM de proteína Cas9-Chis en el tampón de reacción (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, NaCl 10 mM, MgCl210 mM, 0,1 mg/ml de BSA) a 37 °C con oligonucleótido 1 nM. El oligodúplex SP1 se marcó con 33P en el extremo 5' de la hebra (+) o (-). El oligonucleótido monocatenario s(+)SP1 se marcó con 33P en el extremo 5'.

La Figura 7 muestra una reprogramación del complejo Cas9-ARNcr. (A) Representación esquemática de loci heterólogos en dos plásmidos utilizados para la reprogramación del complejo Cas9-ARNcr. pCas(-)SPN se constru­ yeron a partir del plásmido pCas9(-) (véase la Figura 2A), insertando una secuencia espaciadora (SN) nueva (5'-^{CC ACC CAG} CaA ^{AAT TCG GTT TTC TGG CTG-3'} (SeQ ^{ID NO: 16)) e inactivando el gen Cas9 como se describe} en (1). (B) Análisis en gel de agarosa de los productos de escisión del ADN plasmídico. pSP1 y pSP1+SPN (plás­ mido pSP1 con un nuevo protoespaciador y PAM insertados en el sitio Aatll, se incubaron a una concentración de 2,5 nM con 2 nM de complejo Cas9-ARNcr en tampón de reacción (Tris-HCI 10 mM pH = 7,5, NaCl 10 mM, MgCl2 10 mM, 0,1 mg/ml de BSA) a 37 °C durante intervalos de tiempo variados y los productos de la reacción se anali­ zaron en gel de agarosa. SC - ADN plasmídico superenrollado, OC - ADN circular abierto mellado en una de las hebras de ADN, FLL - ADN lineal de longitud completa cortado en ambas hebras. (C) Escisión del oligodúplex SP1. Se incubaron 2,5 nM del complejo Cas9-ARNcr y oligodúplex SPN 1 nM (Tabla S2) marcado con 33P en el extremo 5' de la hebra (+) o (-), en tampón de reacción (Tris-HCl 10 mM pH = 7,5, NaCl 10 mM, MgCl2 10 mM, 0,1 mg/ml de BSA) a 37 °C. M1 - marcador de 18 nt de longitud. Los carriles M1 y M2 contienen oligodesoxinucleótidos de 18 nt y 37 nt marcados con 33P en el extremo 5', sintetizados químicamente, correspondientes a los productos de escisión de las hebras de ADN (+) y (-), respectivamente. (D) Representación esquemática del sustrato del oligo­ dúplex SPN y los productos de escisión. El oligodúplex SPN contiene el nuevo protoespaciador (letras rojas), PAM (letras azules). Las posiciones de la escisión se indican con flechas. La Figura 7(D) desvela la SEQ ID NO: 39.

La Figura 8 muestra el impacto de la longitud del espaciador sobre la inmunidad codificada por CRISPR. (A) Re­ presentación esquemática de versiones acortadas de protoespaciadores insertados en los plásmidos transforma­ dos. La Figura 8(A) desvela las SEQ ID NOS 7 y 61-66, respectivamente, por orden de aparición. (B) Efecto de la longitud del protoespaciador sobre la eficacia de la transformación del plásmido. La eficacia de la transformación se expresa como ufc por nanogramo de ADN plasmídico (media ± DE). (C). Representación esquemática de oli­ godúplex utilizados en la escisión in vitro y experimentos de unión. La Figura 8(C) desvela las SEQ ID NOS 31 y 38, respectivamente, por orden de aparición. (D) Cursos temporales de la escisión del oligodúplex de 27 pb (pro­ toespaciador SP1 de longitud completa, círculos negros) y el oligodúplex de 20 pb (protoespaciador SP1-20 trun­ cado, cuadrados) a través del complejo Cas9-ARNcr. (E) Ensayo de cambio de la movilidad electroforética de la unión del oligodúplex SP1 y SP1-20 a través del complejo Cas9-ARNcr.

La Figura 9 muestra que se requiere PAM para la unión in vitro de ADN y la escisión con el complejo Cas9-ARNcr. (A) Análisis en gel de agarosa de productos de escisión de ADN plasmídico. Tres plásmidos diferentes: PAM+protoespaciador+ (plásmido pSP1 que contiene el protoespaciador y PAM), PAM-protoespaciador- (plásmido pUC18 que contiene múltiples PAMs pero sin protoespaciador) y PAM-protoespaciador+ (pSP1-pA (Sapranauskas y col., 20l1. Nucleic Acids Res 39:9275-82) que contiene un protoespaciador sin PAM) se incubaron a una con­ centración de 2,5 nM con 2 nM de complejo Cas9-ARNcr en el tampón de reacción (Tris-HCI 10 mM pH = 7,5, NaCl 10 mM, MgCl2 10 mM, 0,1 mg/ml de BSA) a 37 °C durante intervalos de tiempo variados y los productos de la reacción se analizaron en gel de agarosa. SC - ADN de plásmido superenrollado, OC - a Dn circular abierto mellado en una de las hebras de ADN, FLL - ADN lineal de longitud completa cortado en ambas hebras. (B) Cursos temporales de la hidrólisis de la hebra (+) en los oligodesoxinucleótidos monocatenarios y bicatenarios. Las reac­ ciones que contenían 2 nM de Cas9-ARNcr y 1 nM de oligodesoxinucleótido se llevaron a cabo a 37 °C en el tampón de reacción (sección A). Se usaron los oligodúplex SP1 (círculos negros) y SP1-pA (cuadrados blancos) como ADNds. s(+)SP1 (triángulos blancos) y s(+)SP1-pA (cuadrados negros) se usaron como ADNss. (C) y (D) ADNds y ADNss (hebra (+)) que se unen mediante el complejo Cas9-ARNcr. Las reacciones contenían 0,5 nM del oligonucleótido ADNss o ADNds marcado con 33P, y la proteína en las concentraciones indicadas encima de cada carril. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, las muestras se sometieron a PAGE durante 2 horas y se analizaron como se describe en "Materiales y procedimientos".

La Figura 10 muestra el análisis de la unión y la escisión de ARN del complejo Cas9-ARNcr. (A) Análisis del cambio de la movilidad electroforética (EMSA) del complejo Cas9-ARNcr que se une al fragmento de ARN de 84 nt que contiene el protoespaciador-1, PAM y secuencias flanqueantes de 24 nt en ambos lados. Panel izquierdo: hebra (-) de ARN; panel central: hebra (+) de ARN; panel derecho: ARN bicatenario. Los fragmentos de ARN utilizados para el análisis se generaron mediante transcripción in vitro (TranscriptAid™ T7 High Yield Transcription Kit, Fer­ mentas) a partir de fragmentos de PCR con el promotor T7 insertado en el extremo frontal de la secuencia codifi­ cadora de ARN. Los fragmentos de PCR que codificaban las hebras (+) y (-) de ARN se obtuvieron a partir del plásmido pSP1 (1) con las siguientes parejas de cebadores correspondientes: 5' taatacgactcactataGggtaccgagctcgaattg 3' (SEQ ID NO: 17)/5' GGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTC -3' (SEQ ID NO: 18) y 5' gggtaccgagctcgaattgaaattcTAAACG 3' (SEQ ID NO: 19)/5' taatacgactcactataGggAAACAGCTATGACCATGAT-TACG 3' (SEQ ID NO: 20) (promotor de ARN polimerasa T7 subrayado, inicio de la transcripción en negrita). Las reacciones contenían 1 nM del fragmento de ARN marcado con 33P, y la proteína en las concentraciones tal y como se indican encima de cada carril. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, las muestras se sometie­ ron a PAGE durante 2 horas y se analizaron como se describe en "Materiales y procedimientos". (B) Ensayo de escisión del ARN. Se incubaron 2,5 nM de complejo Cas9-ARNcr en el tampón de reacción (Tris-HCI 10 mM pH = 7,5, NaCl 10 mM, MgCl2 10 mM, 0,1 mg/ml de BSA) a 37 °C en presencia de 1 nM de las hebras (+) y (-) de ARN (panel izquierdo) o ARN bicatenario marcado en la hebra (+) o (-) (panel derecho). Los productos de la reacción se analizaron en gel de PAA desnaturalizante.

La Figura 11 muestra que los motivos del sitio activo RuvC y HNH de Cas9 contribuyen a la escisión de hebras de ADN opuestas. (A) Localización de los motivos de un sitio activo conservado dentro de la proteína Cas9. Se indican los restos de aminoácidos identificados como cruciales para la actividad in vivo de Cas9 (Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82). (B) Análisis en gel de agarosa de la escisión del plásmido pSP1 mediante Cas9 y proteínas mutantes. Las reacciones se llevaron a cabo como se describe en "Materiales y procedimientos". (C) Preferencia de hebra del mutante D31A. Las reacciones se realizaron como se describe en la Figura 2A y “Materiales y procedimientos”. El mutante D31 escinde solo la hebra (+) del oligodúplex SP1. La Figura 11(C) desvela las s Eq ID NOS 31 y 67, respectivamente, por orden de aparición. (D) Preferencia de hebra del mutante N891A. El mutante N891 escinde solo la hebra (-) del oligodúplex SP1. Las posiciones de la escisión se indican con flechas. La Figura 11(D) desvela las SEQ ID NOS 31 y 68, respectivamente, por orden de aparición.

La Figura 12 muestra las propiedades de los complejos de mutante del sitio activo de Cas9-ARNcr. (A) Secuenciación directa de los productos de reacción obtenidos con el mutante de Cas9, D31A (motivo de sitio activo similar a RuvC). La Figura 12(A) desvela las SEQ ID NOS 58, 59, 58 y 58, respectivamente, por orden de aparición. (B) Secuenciación directa de los productos de reacción obtenidos con el mutante de Cas9 N891A (motivo de sitio activo similar a HNH). La Figura 12(B) desvela las SEQ ID NOS 58, 58, 58 y 60, respectivamente, por orden de aparición. (C) Unión del oligodúplex SP1 mediante los complejos Cas9-ARNcr wt y mutantes del sitio activo. (D) Escisión de la hebra (+)SP1 por complejos mutantes Cas9-ARNcr.

La Figura 13 muestra la masa molecular de la proteína Cas9-Chis wt. Los experimentos de filtración en gel se llevaron a cabo a temperatura ambiente usando una columna Superdex 200 10/300 GL (GE healthcare) equilibrada previamente con tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4) que contenía cloruro de sodio 500 mM. Los PMs apa­ rentes de Cas9 (triángulo negro) fueron calculados mediante interpolación a partir de la curva estándar obtenida, usando un conjunto de proteínas de PMs conocidos (círculos negros) (patrones de filtración en gel de Bio-Rad).

La Figura 14 muestra una disposición esquemática y el mecanismo de escisión de ADN dirigido por ARNcra través del complejo Cas9-ARNcr. La estructura del dominio de Cas9 se muestra esquemáticamente en la parte superior. El complejo Cas9-ARNcr se une al ADNds que contiene PAM. El ARNcr se une a la hebra (+) complementaria dando como resultado la separación de la hebra de ADN y la formación del bucle R. En el complejo ternario, el sitio activo RuvC de Cas9 está ubicado en el fosfato escindible sobre la hebra (-) no apareada, mientras que el sitio activo HNH está ubicado en el fosfato escindible en la hebra (+) del ADN unido al ARNcr. La acción coordinada de ambos sitios activos da como resultado la rotura de la hebra doble a 4 nt de distancia del PAM, lo que genera un ADN de extremos romos. La Figura 14 desvela las SEQ ID NOS. 31 y 69, respectivamente, por orden de aparición.

La Figura 15 muestra una electroforesis natural de Cas9-ARNcr y los productos de escisión. La proteína en las concentraciones indicadas encima de cada carril, se incubó en tampón de reacción (Tris-HCI 10 mM pH = 7,5, NaCl 10 mM, MgCl2 10 mM, 0,1 mg/ml de BSA) a 37 °C durante 30 min en presencia de oligodúplex SP1 0,5 nM. Las muestras se mezclaron con solución de colorante de carga (azul de bromofenol al 0,01% y EDTA 75 mM en glicerol al 50% v/v) y se analizaron mediante PAGE no desnaturalizante. Los carriles del gel marcados con M -forma mezclada de los productos de reacciones de escisión. Las viñetas a cada lado del gel ilustran los complejos de proteína-ADN y el ADN que se corresponde a cada banda, mientras que las viñetas debajo del gel ilustran la forma principal del sustrato después de la reacción.

La Figura 16 muestra la escisión del ADN plasmídico a través del complejo Cas9-ARNcr. (A) escisión del ADN plasmídico de pSP1 y pUC18. El complejo Cas9-ARNcr se incubó con los plásmidos pSP1 y pUC18 en un tampón de reacción proporcionado en el Ejemplo 1. El plásmido pSP1 contenía una secuencia de protoespaciador1 flan­ queada por la secuencia 5'-GGNG-3'PAM. La secuencia del protoespaciador1 no estaba presente en pUC18. Los productos de la reacción se analizaron en el gel de agarosa. En esas condiciones, el plásmido pSP1 se convierte en una forma lineal, mientras que el plásmido pUC18 que carece de la secuencia de protoespaciador1, es resis­ tente a la escisión. (B) Reacciones de escisión de pSP1 en ausencia de uno de los componentes. En las mezclas de reacción que carecen de uno de los componentes (Cas9, ARNcr o ARNtracr, respectivamente), el plásmido pSP1 no se escinde. SC - ADN de plásmido superenrollado, OC - ADN circular abierto mellado en una de las hebras de ADN, FLL - ADN lineal de longitud completa cortado en ambas hebras.

La Figura 17 muestra la escisión del oligodúplex de ADN a través del complejo Cas9-ARNcr. La hebra del oligodú­ plex que es complementaria a ARNcr está marcada como hebra (+), mientras que la otra hebra - es la hebra (-). Para controlar las reacciones de escisión, la hebra (+) o (-) del oligodúplex se marcó con P33 en el extremo 5'. M1 y M2 son marcadores de oligonucleótidos sintéticos correspondientes a los 37 nt de la hebra (-) y a los 18 nt de la hebra (+), los cuales se usaron para determinar el tamaño de los productos de escisión y para cartografiar la posición de la escisión. La proteína Cas9 corta ambas hebras del oligodúplex dentro del protoespaciador, después del nucleótido 37, 4 nt corriente arriba del PAM (5'-GGNG-3') dejando extremos romos. Ambas hebras de sustrato no específico (K1 y K2) no se escinden cuando se incuban con el complejo Cas9-ARNcr durante 30 minutos. La Figura 17 desvela la s Eq ID NO: 31.

La Figura 18 muestra la escisión del ADN plasmídico a través del complejo Cas9-ARNcr ensamblado en ausencia de RNasaIII. El complejo Cas9-ARNcr se incubó con el plásmido pSP1 y los productos de la reacción se analizaron en los geles de agarosa. El plásmido pSP1 es resistente a la escisión en presencia de complejo ensamblado sin ARNcr (panel izquierdo). El plásmido pSP1 se convierte en una forma lineal en presencia del complejo ensamblado usando un ARNcr sintético de 42 nt (sin RNasalll) (panel central). El plásmido pSP1 se convierte en una mezcla de formas de ADN lineales y circulares en presencia de complejo ensamblado usando un transcrito de ARN CRISPR (sin RNasalll) (panel derecho).

La Figura 19 muestra la escisión del oligodúplex de ADN a través del complejo Cas9-ARNcr. La hebra del oligodú­ plex que es complementaria al ARNcr está marcada como hebra (+), mientras que la otra hebra - es la hebra (-). Para controlar la reacción de escisión, la hebra (+) o (-) del oligodúplex se marcó con P33 en el extremo 5'. M1 y M2 son marcadores de oligonucleótidos sintéticos correspondientes a los 37 nt de la hebra (-) y a los 18 nt de la hebra (+), los cuales se usaron para determinar el tamaño de los productos de escisión y para cartografiar la posición de la escisión. La proteína Cas9 corta ambas hebras del oligodúplex dentro del protoespaciador, después del nucleótido 37 a partir del extremo 5', 4 nt corriente arriba del PAM (5'-GGNG-3') dejando extremos romos. Ambas hebras de sustrato no específico (K1 y K2) no se escinden cuando se incuban con el complejo Cas9-ARNcr durante 30 minutos. La Figura 19 desvela la SEQ ID NO: 31.

La Figura 20 muestra (A) una representación esquemática del sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus DGCC7710. Cuatro genes cas (cas9, casi, cas2, csn2) se encuentran corriente arriba de la disposición de espa­ ciador-repetición de CRISPR, que consiste en 13 secuencias de repeticiones (R) y 12 espaciadores únicos (S1-S12). El ARNtracr, requerido para la maduración del ARNcr en los sistemas CRISPR/Cas de Tipo II (Deltcheva y col., 2011. Nature 471, 602-7), se encuentra corriente arriba del gen cas9 y está codificado en la hebra de ADN opuesta (mostrada por una flecha) con respecto a los otros elementos de ese sistema. (B) Rutas para una nueva inserción de espaciador en la región CRISPR y síntesis de ARN CRISPR. El oligodúplex sintético que codifica una secuencia espaciadora deseada y que contiene extremos compatibles con la restricción Sapl y Eco31I, se insertó entre dos repeticiones. La región CRISPR se amplificó usando PCR. El nuevo espaciador que codificaba el ARN CRISPR se obtuvo mediante transcripción in vitro. (C) Ensamblaje in vitro del complejo Cas9-ARN. Los transcritos de ARN CRISPR y ARNtracr se ensamblaron en un dúplex. La proteína Cas9 se preincubó primero con un dúplex de ARN, seguido de una incubación posterior con RNasaIII para generar un complejo Cas9-ARN catalíticamente competente.

La Figura 21 muestra A. Representación esquemática del plásmido pUC18. La distancia entre los sitios de restric­ ción SapI y Aatll es de 775 pb, mientras que la distancia entre dos espaciadores es de 612 pb. B. Escisión del plásmido pUC18 mediante complejos reprogramados de Cas9-ARNcr. "1" - plásmido pUC18; "2" - pUC18 cortado con Aatll; "3" - pUC18 cortado con un complejo que contiene un protoespaciador1 que se aparea con el ARNcr; "4" - pUC18 cortado con Sapl; "5" - pUC18 cortado con un complejo que contiene un protoespaciador2 que se aparea con el ARNcr; "6" - pUC18 cortado con Aatll y Sapl; "7" - pUC18 cortado con una mezcla de los complejos utilizados en las pistas 3 y 5.

La Figura 22 muestra la escisión de ADN genómico con el complejo Cas9-ARN ensamblado in vitro. (A) Análisis en gel de agarosa de los productos de la escisión de ADN de A lineal. El ADN del fago A se incubó con el complejo Cas9-ARN en el tampón de reacción durante varios intervalos de tiempo. El sitio diana para el complejo Cas9-ARN se encuentra a 8 kb de distancia del sitio eos. (B). Selección de sondas para experimentos de transferencia Sout­ hern. El ADN genómico se fragmentó mediante tratamiento con la enzima PstI. El protoespaciador se encuentra entre dos sitios Pstl. Si el ADN genómico se escinde con el complejo Cas9-ARN, se debe detectar un fragmento de 466 pb. De lo contrario, la sonda se hibridará con un fragmento de 1499 pb de longitud. (C) Análisis con trans­ ferencia Southern de fragmentos de ADN genómico. Pista C - ADN genómico de E. eoli fragmentado con PstI. Cas9-ARN - el ADN genómico se incubó con el complejo Cas9-ARN antes de la fragmentación (D). Escisión del ADN genómico humano a través del complejo Cas9-ARNcr. La cantidad relativa de fragmentos de ADN intactos se estimó mediante qPCR.

La Figura 23 ilustra esquemáticamente secuencias de direccionamiento contenidas en el plásmido informador (pMTC-DSR+eGFP). La secuencia que codifica eGFP está separada por un intrón procedente del gen GAPDH. Se indican las secuencias que codifican RFP 5' y 3'. homol indica secuencias homólogas en el gen RFP, necesarias para que tenga lugar una recombinación homóloga. A, B, C y D indican cuatro sitios diana distintos para la escisión mediada por Cas9. Las dianas A y B se encuentran en el intrón. Las dianas C y D se encuentran en las regiones codificadoras de eGFP. Cre indica un sitio diana para la endonucleasa Cre y se encuentra en la secuencia intrónica.

La Figura 24 muestra una reducción de las células positivas para eGFP después de la introducción de complejos Cas9/ARN. Las células CHO-K1 se transfectaron con el plásmido informador y los complejos Cas9/ARN que con­ tenían ARNcr dirigido a la secuencia A de eGFP (intrónica), a la secuencia C de eGFP (codificadora) o a una secuencia K no específica. Se determinó el porcentaje de células positivas para eGFP mediante citometría de flujo. Como controles negativos había células no transfectadas (NC) o transfectadas solo con el plásmido informador (ADN) o solo con el plásmido informador y la proteína Cas9, así como con el plásmido informador y el complejo Cas9-ARNcr no específico (ADN+K).

La Figura 25 muestra imágenes de células en las que la aparición de RFP sugería la reparación de la rotura de la hebra doble mediada por Cas9/ARN, mediante una recombinación homóloga (HR). Cuarenta y ocho horas después de la cotransfección con el plásmido informador y los complejos Cas9/ARN dirigidos a la secuencia C de eGFP, se visualizaron células CHO-k1 mediante microscopía de fluorescencia para eGFP y RFP.

La Figura 26 ilustra esquemáticamente secuencias de direccionamiento contenidas en el plásmido informador (pMTC-DSR+eGFP). La secuencia que codifica eGFP está separada por el intrón GAPDH copiado del ADN genó­ mico. Las secuencias que codifican N y C de RFP son las indicadas. Las secuencias homólogas en el gen RFP son necesarias para que tenga lugar una recombinación homóloga. La diana E ubicada dentro del intrón de eGFP, se indica en negrita.

La Figura 27 es un gel que muestra los complejos Cas9/ARN usando ARNcr sintético y la función ARNtracr de manera similar a los complejos Cas9/ARN usando ARNcr sintético y ARNtracr transcrito in vitro. Los plásmidos se visualizaron después de una electroforesis en gel de agarosa. Carril C: plásmido sin cortar. Carriles 1-3: plásmidos cortados con Cas9+ARNcr y o bien 1: ARNtracr control, transcrito in vitro; 2: ARNtracr sintético sin modificar (89 nt); o 3: ARNtracr sintético sin modificar (74 nt).

Las Figuras 28A-E muestran esquemáticamente secuencias de direccionamiento contenidas en el plásmido infor­ mador (pMTC-DSR+eGFP) y resultados de un procesamiento/reordenamiento genético potencial.

La Figura 29 muestra una reducción de las células positivas para eGFP después de la introducción de complejos Cas9/ARN. Las células CHO-K1 se transfectaron con el plásmido informador y los complejos Cas9/ARN que con­ tenían ARNcr dirigido a la secuencia A de eGFP (intrónica), a la secuencia C de eGFP (codificadora) o a una secuencia K no específica. Se determinó el porcentaje de células positivas para eGFP mediante citometría de flujo. Como controles negativos había células no transfectadas (NC) o transfectadas con el plásmido informador solo (ADN) o solo con el plásmido informador y la proteína Cas9, así como con el plásmido informador y el complejo Cas9-ARNcr no específico (ADN+K).

La Figura 30 muestra esquemáticamente secuencias de direccionamiento contenidas en el plásmido informador (pMTC-DSR+eGFP). La secuencia que codifica eGFP se indica en negro y está separada por el intrón GAPDH copiado del ADN genómico. Las secuencias que codifican N y C de RFP se indican en gris. Las secuencias homó­ logas en el gen RFP (gris claro) son necesarias para que tenga lugar una recombinación homóloga. La diana E ubicada dentro del intrón de eGFP se indica en negrita.

Los siguientes ejemplos no limitantes describen adicionalmente los procedimientos, las composiciones, los usos y las realizaciones.

Descripción detallada de realizaciones ilustrativas

Ejemplo 1

En este ejemplo, hemos aislado el complejo Cas9-ARNcr del sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus y hemos demostrado que corta de manera dependiente de PAM tanto un oligodesoxinucleótido sintético como ADN plasmídico que es portador de una secuencia de nucleótidos complementaria al ARNcr. Además, hemos proporcionado una evi­ dencia experimental de que PAM es reconocido en el contexto de ADN bicatenario y es decisivo para la unión y la escisión de ADN in vitro. Finalmente, hemos mostrado que los motivos RuvC y HNH de Cas9 contribuyen a la escisión de hebras de ADN opuestas. En conjunto, nuestros datos demuestran que el complejo Cas9-ARNcr actúa como una endonucleasa guiada por ARN que utiliza un módulo de ARN para el reconocimiento del sitio diana y emplea dos sitios activos distintos en el módulo de la proteína para la escisión del ADN. Estos hallazgos allanan el camino para modificar genéticamente complejos Cas9-ARNcr programables como endonucleasas guiadas por ARN universales.

Materiales y procedimientos

Manipulaciones del ADN. Se empleó ADN genómico de la cepa de Streptococcus thermophilus DGCC7710 como molde en reacciones de PCR para clonar cas9. Para generar un plásmido pASKIBA3-Cas9 que se usó para la expre­ sión de la variante de la proteína Cas9 marcada con Strep en el extremo C-terminal, un fragmento de PCR amplificado con los siguientes cebadores: 5'-ACGTCTCAAATGTTGTTTAATAAGTGTATAATAATTTC-3' (SEQ ID NO: 21) y 5'-ACGTCTCCGCGCTACCCTCTCCTAGTTTG-3' (SEQ ID NO: 22), se clonó en el vector de expresión pASK-IBA3 a través de los sitios Esp3I. Para generar un plásmido pBAD-Cas9 que se utilizó para la expresión de la variante de la proteína Cas9 marcada con 6xHis en el extremo C-terminal ("6xHis" desvelada como la SEQ ID NO: 23), un fragmento de PCR amplificado con la siguiente pareja de cebadores: 5'-ACGTCTCACATGACTAAGCCATACTCAATTGGAC-3' (SEQ ID NO: 24) y 5'-ACTCGAGACCCTCTCCTAGTTTGGCAA-3' (SEQ ID NO: 25) se clonó en el vector de expresión pBAD24-Chis a través de los sitios Ncol y Xhol. Una secuenciación completa del gen cas9 en los plásmidos pASKIBA3-Cas9 y pBAD-Cas9 no reveló ninguna diferencia con la secuencia original de cas9. Para obtener los plásmidos pCas9(-)SP1 (Figura 1B) y pCRISPR3-SP1 (Figura 2A), que eran portadores de un solo espaciador1, un fragmento de PCR amplificado procedente del plásmido pCRISPR3 con la siguiente pareja de cebadores: 5' GACCACTTATT-GAGGTAAATGAG 3' (SEQ ID NO: 26)/5' CAAACCAGGATCCAAGCTAATACAGCAG-3' (SEQ ID NO: 27) ((los sitios BamHI (GGATCC) están subrayados), se clonó en los plásmidos pCas9(-) y pCRISPR3 (Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82), respectivamente.

Expresión y purificación de la proteína Cas9 y el complejo Cas9-ARNcr. Una versión marcada con (His)6 ("(His)6" desvelada como la SEQ ID NO: 23) de la proteína Cas9 se expresó y se purificó utilizando un esquema descrito para la proteína Cas3 procedente del sistema CRISPR4/Cas de S. thermophilus (Sinkunas y col., 2011. EMBO J 30:1335-42). Para la purificación del complejo Cas9-ARNcr, una versión marcada con Strep de la proteína Cas9 se expresó en la cepa de E. coli RR1, que era portadora del plásmido pCas9(-)SP1 (Figura 1B). El medio LB se complementó con Ap (100 |jg/ml) y Cm (10 jg/ml). Las células de E. coli para el aislamiento del complejo Cas9-ARNcr se cultivaron en dos etapas. En primer lugar, se cultivaron 4 ml de cultivo celular a 37 °C hasta una DO600 de ~0,5, y se indujo la expresión mediante la adición de 0,2 jg/m l de anhidrotetraciclina (AHT) (Sigma). Después de 4 h, se inoculó 1/400 del cultivo preinducido en medio LB de nuevo aporte, complementado con Ap (100 jg/ml), Cm (12 jg/m l) y AHT (0,2 jg/m l) y se cultivó a 37 °C durante la noche. Las células recogidas se rompieron con ultrasonidos y los restos celulares se eliminaron por centrifugación. El material sobrenadante se cargó en la columna StrepTrap HP de 1 ml (GE Healthcare) y se eluyó con 2,5 mM de destiobiotina. Se obtuvieron aproximadamente 1,5 jg de la proteína Cas9 en un solo ciclo a partir de 1 L de cultivo de E. coli. Las fracciones que contenían Cas9 se almacenaron a 4 °C durante varios días. La homogeneidad de las preparaciones de proteína se estimó mediante SDS-PAGE. Las concentraciones de proteína en los complejos Cas9-ARNcr se determinaron mediante análisis densitométrico en geles de SDS-PAGE que contenían muestras de proteínas Cas9 purificadas con Strep-Tactin junto con cantidades conocidas de proteína Cas9 marcada con His. La concentración de los complejos Cas9-ARNcr se expresa como la concentración de proteína Cas9, suponiendo que Cas9 es un monómero y se une al ARNcr en un complejo con una estequiometría de 1:1.

Análisis por transferencia Northern. El ARN unido a Cas9 se aisló a partir de Cas9 purificada con Strep-Tactin, coex­ presada con el plásmido pCas9(-)SP1, usando el mini kit miRNeasy (Qiagen). Las transferencias Northern se realiza­ ron haciendo correr el a Rn sobre un gel de poliacrilamida al 10% con urea 7 M en tampón MOPS/NaOH 20 mM pH 8. El ARN se transfirió a una membrana de nailon SensiBlot™ Plus (Fermentas) mediante transferencia semiseca utilizando Trans-blot SD (Bio-Rad). El ARN se reticuló con la membrana con I-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida 0,16 M (EDC) (Pierce)/1-metilimidazol 0,13 M (Sigma) pH 8 a 60 °C durante 1 h. La membrana se prehibridó con tampón 2 * SSC que contenía SDS al 1% y 0,1 mg/ml de ADN desnaturalizado procedente de testículos de peces (Ambion) durante 1 h a 40 °C. Las transferencias se sometieron a ensayo durante 12 h con un oligonucleótido de ADN anti-ARNcr de 42 nt, marcado con 32P-5' que contenía 20 nt del espaciador1 y 22 nt de la secuencia de repetición (5'-TCGAAACAACACAGCTCTAAAACTGTCCTCTTCCTCTTTAGC-3' (SEQ ID NO: 28)). Las transferencias se lavaron 3 * durante 15 minutos con tampón 0,2 * SSC que contenía SDS al 0,2%, y se visualizaron usando la formación de imágenes de fósforo. Un oligorribonucleótido sintético de 42 nt (5'-CGCUAAAGAGGAAGAGGACAGUUUUAGA-GCUGUGUUGUUUCG-3' (SEQ ID NO: 7)) y un oligonucleótido de ADN de 84 nt.

Sustratos de oligonucleótidos. Todos los sustratos de oligonucleótidos utilizados en este estudio se proporcionan en la Tabla 1. Los oligodesoxirribonucleótidos se compraron en Metabion (Martinsried, Alemania). Los extremos 5' de los oligonucleótidos se radiomarcaron usando PNK (Fermentas) y [y-33P]ATP (Hartmann Analytic). Los dúplex se prepa­ raron apareando dos oligonucleótidos con secuencias complementarias (SP1, SP1-Ap, SP2). El marcador radiactivo se introdujo en el extremo 5' de una hebra de ADN individual antes del apareamiento con la hebra sin marcar.

Reacciones con sustratos de oligonucleótidos. Las reacciones se llevaron a cabo normalmente añadiendo 2 nM de complejo Cas9-ARNcr a un oligonucleótido 1 nM marcado en Tris-HCI 10 mM (pH 7,5 a 37 °C), NaCl 10 mM, 0,1 mg/ml de BSA y MgCl2 10 mM a 37 °C. Se extrajeron partes alícuotas a intervalos programados y se inactivaron con colorante de carga (formamida al 95% v/v, azul de bromofenol al 0,01%, EDTA 25 mM, pH 9,0) y se sometieron a electroforesis en gel desnaturalizante a través de poliacrilamida al 20%, seguido de detección mediante formación de imágenes de fósforo con FLA-5100 (Fujifilm).

Reacciones con sustratos plasmídicos. Las reacciones con el plásmido pUC18 y sus derivados (Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82) se llevaron a cabo a 37 °C en el tampón utilizado para las reacciones con sus­ tratos de oligonucleótidos. Las mezclas de reacción normalmente contenían plásmido superenrollado 2,5 nM y com­ plejo Cas9-ARNcr 2 nM. Las reacciones se iniciaron añadiendo proteína a la mezcla de los otros componentes. Se extrajeron partes alícuotas a intervalos programados y se inactivaron con fenol/cloroformo. La fase acuosa se mezcló con una solución de colorante de carga (azul de bromofenol al 0,01% y EDTA 75 mM en glicerol al 50% v/v) y se analizó mediante electroforesis a través de agarosa.

Determinación de la posición del corte en el plásmido. Para lograr un corte completo del sustrato plasmídico, se incu­ baron 8 nM de complejo Cas9-ARNcrcon 2,5 nM de plásmido superenrollado en el tampón de reacción a 37 °C durante 10 min. Los productos de la reacción se purificaron y se concentraron usando el kit de purificación de PCR GeneJET (Fermentas). La región que circundaba al espaciador1 de Cas9 linealizada y los plásmidos mellados se secuenciaron directamente con los siguientes cebadores: 5'-ccgcatcaggcgccattcgcc-3' (SEQ iD NO: 29) (secuenciación de la hebra (+)) y 5'-gcgaggaagcggaagagcgccc-3' (SEQ ID NO: 30) (secuenciación de la hebra (-)).

Ensayo de la unión. Cantidades crecientes de complejo proteína-ARNcr se mezclaron con 0,5 nM de sustratos de ADN bicatenarios y monocatenarios marcados con 33P (Tabla 1) en el tampón de unión (Tris-acetato 40 mM, pH 8,3 a 25 °C, EDTA 0,1, 0,1 mg/ml de BSA, glicerol al 10% v/v) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los complejos exentos de ADN y proteína-ADN se separaron sobre el gel de poliacrilamida al 8% no desnaturalizante (relación de acrilamida/N,N'-metilenbisacrilamida 29:1) usando Tris-acetato 40 mM (pH 8,3) complementado con EDTA 0,1 mM como tampón de ejecución. La electroforesis se realizó a temperatura ambiente durante 3 ha 6 V/cm.

Mutagénesis. Los mutantes D31A y N891A se obtuvieron mediante mutagénesis dirigida al sitio como se ha descrito previamente (Tamulaitis y col., 2007. Nucleic Acids Res 35:4792-9). La secuenciación del gen completo para cada mutante confirmó que solo se había introducido la mutación diseñada.

Resultados

Expresión y purificación del complejo Cas9-ARNcr. El gen cas9 procedente del sistema CRISR3 de la cepa DGCC7710 de S. thermophilus se clonó en el vector pASK-IBA3 para producir una estructura artificial que codificaba una proteína Cas9 de fusión que contenía un marcador Strep(II) en el extremo C-terminal (Figura 1B). Inicialmente, tratamos de purificar el complejo Cas9-ARNcr a partir de la cepa de E. coli RR1 que expresaba la proteína Cas9 sobre el vector pASK-IBA3, y otras proteínas Cas (excepto Cas9) sobre el plásmido pCas9(-) (Sapranauskas y col, 2011). pCas9(-) también contenía una disposición CRISpR3 completa compuesta por 12 unidades de espaciador-repetición (Figura 2A). Para lograr una transcripción simultánea de todos los genes diana, realizamos la expresión del gen cas9 en dos etapas. En primer lugar, indujimos la expresión de Cas9 en un volumen pequeño de cultivo de E. coli y después de 4 h transferimos una parte alícuota de cultivo preinducido a un volumen mayor de medio LB de nuevo aporte que ya contenía inductor y se incubó durante la noche. El complejo de proteína Cas9 se purificó a partir del extracto celular bruto usando sefarosa Strep-Tactin. Logramos aislar una pequeña cantidad de complejo Cas9-ARNcr que únicamente mostraba rastros de actividad nucleolítica sobre el oligodúplex SP1 que contenía un protoespaciador1 y PAM. Asumi­ mos que la baja actividad de escisión se podía deber a la heterogeneidad intrínseca de los complejos Cas9-ARNcr resultantes de la transcripción de 12 unidades de espaciador-repetición. Si todas las unidades de espaciador-repeti­ ción se transcriben uniformemente en un ARNcr maduro, la concentración del complejo Cas9 que contiene un ARNcr contra el espaciador-1, constituirá una fracción de un 1/12 de la concentración total de Cas9-ARNcr. La actividad de escisión de la preparación de Cas9-ARNcr contra el oligodúplex SP2 que contiene un protoespaciador-2 y PAM, es compatible con la heterogeneidad de los complejos Cas9-ARNcr (Figura 2B). Para aumentar el rendimiento del com­ plejo Cas9-ARNcr específico, diseñamos un plásmido pCas9(-)SP1 que contenía una sola unidad de R-espaciador1-R en la disposición de CRISPR (Figura 1B). El ensayo de interferencia de la transformación del plásmido confirmaba que el sistema CRISPR3/Cas que es portador de un solo espaciador1, evita la transformación del plásmido pSP1 en E. coli con la misma eficacia que el sistema CRISPR3/Cas que es portador de una región CRISPR completa (Figura 3B). Hemos aislado un complejo Cas9-ARNcr siguiendo el procedimiento descrito anteriormente y hemos analizado el ARNcr unido a la proteína Cas9.

La proteína Cas9 se purifica conjuntamente con ARNcr. El sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus pertenece al subtipo Tipo IIA (antiguo Nmeni o CASS4) de los sistemas CRISPR/Cas (Makarova y col., 2011. Nat Rev Microbiol 9:467-77). Se ha observado que en el sistema CRISPR/Cas de Tipo IIA de Streptococcus pyogenes, el ARN pequeño transcodificado (ARNtracr) y la RNasaIII bacteriana están implicados en la generación del ARNcr (Deltcheva y col., 2011. Nature 471:602-7). El ARNcr de Streptococcus pyogenes tiene solo 42 nt de longitud y no tiene un "asa 5'" que se conserva en los ARNcrs de los sistemas CRISPR de Tipo I y III (Hale y col., 2009. Cell 139:945-56; Jore y col., 2011. Nat Struct Mol Biol 18:529-36). De acuerdo con el análisis de transferencia Northern, se genera un ARNcr de longitud similar en el sistema LMD-9 CRISPR3/Cas de Streptococcus thermophilus (Makarova y col., 2011. Nat Rev Microbiol 9:467-77), que es casi idéntico al sistema CRISPR3/Cas de la cepa DGCC7710 (Figuras 4A y B). Asumimos que el ARNcr aislado a partir del complejo Cas9-ARNcr, expresado en la cepa heteróloga de E. coli (Figura 1) puede tener la misma longitud (Figura 4). Por lo tanto, para analizar ácidos nucleicos extraídos a partir del complejo Cas9 purificado con Strep-Tactin, utilizamos un oligonucleótido de ADN anti-ARNcr de 42 nt, que comprendía la región de 22 nt correspondiente al extremo 3' de la secuencia de la repetición y 20 nt en el extremo 5' del fragmento SP1. El ácido nucleico presente en el complejo Cas9 se hibridaba con un oligonucleótido anti-ARNcr, y era sensible al trata­ miento con RNasa pero no con DNasa (Figura 1C). El tamaño del ARNcr extraído era idéntico al oligorribonucleótido sintético de 42 nt correspondiente al ARNcr putativo del sistema CRISPR3 de la cepa DGCC7710 de S. thermophilus (Figura 3A, Figura 4C). Tomados en conjunto, estos datos confirman que la proteína Cas9 marcada con Strep se purifica junto con un ARNcr de 42 nt, que se obtiene a partir de la región CRISPR3.

La proteína Cas9 escinde el ADN bicatenario dentro de un protoespaciador. Para analizar la actividad in vitro de un complejo Cas9-ARNcr purificado, primero usamos el oligodúplex s P1 (Tabla 1) que contiene la secuencia del proto­ espaciador idéntica al espaciador SP1 en la disposición CRISPR3, la secuencia PAM 5'-TGGTG-3' corriente abajo del protoespaciador y secuencias flanqueantes de 10 nt procedentes del plásmido pSP1 (Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82) (Figura 5A). La hebra del oligodúplex complementaria al ARNcr se denomina hebra (+), mientras que la hebra dúplex opuesta se denomina hebra (-). Para controlar la reacción de escisión, la hebra (+) o (-) del oligodúplex SP1 se marcó con P33 en el extremo 5'. Los datos mostrados en la Figura 5B demuestran que el complejo Cas9-ARNcr corta ambas hebras del oligodúplex en una posición fija. El cartografiado de la posición del corte utilizando oligonucleótidos sintéticos como marcadores del tamaño, reveló que el complejo Cas9-ARNcr corta ambas hebras del oligodúplex SP1 dentro del protoespaciador, 4 nt corriente arriba del pAm (Figura 5B) dejando extremos romos. Cabe mencionar que no se observa ninguna escisión después de 2 h de incubación del oligodúplex SP1 con la proteína Cas9 que carece de ARNcr (Figura 6C).

Para someter a ensayo si el complejo Cas9-ARNcr puede localizar el protoespaciador y cortar el ADN in vitro en sustratos de ADN largos que imitan un ADN extraño invasor in vivo, analizamos la escisión del plásmido pSP1 (Sa­ pranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82) (Figura 5C) que era portador del protoespaciador1 y PAM. En presencia del complejo Cas9-ARNcr, la forma superenrollada del plásmido pSP1 se convertía en una forma lineal (Figura 5D), mientras que el plásmido pUC18 que carecía de protoespaciador1 no se escindía. Esto significa que ambas hebras del plásmido pSC1 se escindían específicamente dentro de la región del protoespaciador. Utilizamos una secuenciación directa para determinar los extremos de la forma de ADN lineal, formada después de la escisión con Cas9-ARNcr. Los resultados de la secuenciación confirmaron que la escisión del ADN plasmídico se producía a una distancia de 4 nt de la secuencia de PAM, de manera similar a la escisión del oligodúplex SP1 (Figura 5D). Las posiciones de la escisión identificadas en experimentos in vitro (Figura 4) para el sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus son idénticas a las determinadas en experimentos de escisión in vivo para el sistema CRISPR1/Cas en S. thermophilus (Garneau y col., 2010. Nature 468:67-71). Para verificar si la escisión inducida por Cas9-ARNcr ocurre en la misma posición en otras secuencias de protoespaciador, analizamos la escisión del oligodúplex SP2 que es portador de un protoespaciador-2 y secuencias PAM a través del complejo heterogéneo Cas9-ARNcr aislado a partir del hospedador que es portador de 12 unidades de espaciador-repetición. Hemos encontrado que ese complejo hete­ rogéneo Cas9-ARNcr corta la hebra (+) del oligodúplex SP2 exactamente en la misma posición que en el oligodúplex SP1. La especificidad de la escisión con Cas9-ARNcr está dirigida por la secuencia de ARNcr. Para demostrar direc­ tamente que la especificidad del complejo Cas9-ARNcr se puede reprogramar cambiando el ARNcr en el complejo de ribonucleoproteína, insertamos un nuevo espaciador (SN) en lugar del espaciador S1 en la región CRISPR, generando el plásmido pCas(-)SN que contenía solo una región CRISPR mínima y una secuencia codificadora de ARNtracr (Fi­ gura 7), coexpresamos este plásmido junto con pASKIBA-Cas9 y purificamos el complejo Cas9-ARNcr. La especifici­ dad de la escisión del complejo Cas9-ARNcr se analizó usando los plásmidos pSP1+SPN y pSP1. El plásmido pSP1+SPN que contiene la secuencia del protoespaciador que se aparea con el espaciador SN en la región CRISPR, se linealizó a través del complejo Cas9-ARNcr, mientras que el plásmido pSP1 que carece de una secuencia comple­ mentaria, permaneció intacto (Figura 7B). Para determinar la posición de la escisión dentro de la secuencia del espa­ ciador SPN, realizamos experimentos con oligodúplex SPN, que contenía un protoespaciador complementario al es­ paciador SN y PAM (Figura 7D). El ensayo de escisión del oligodúplex confirmaba (Figura 7C y D) que el complejo Cas9-ARNcr con una especificidad rediseñada, escinde ambas hebras de ADN dentro del protoespaciador SN, 4 nt corriente arriba de PAM, de forma idéntica a otros complejos Cas9-ARNcr.

La longitud del espaciador en la región CRISPR3 de S. thermophilus es de 30 nt. De acuerdo con los datos proporcio­ nados en la Figura 1C, el ARNcr maduro copurificado con la proteína Cas9 está compuesto por 42 nt. Esto significa que solo 20 nt de ARNcr son complementarios a la hebra (+) del protoespaciador. Para evaluar si el extremo 5' del protoespaciador es importante para la interferencia del plásmido a través del sistema CRISPR3 de S. thermophilus, diseñamos los plásmidos pSP1-27, pSP1-23, pSP1-19, pSP1-15, pSP1-11 con el protoespaciador1 truncado en 5 '(la longitud del protoespaciador era de 27 pb, 23 pb, 19 pb, 15 pb, 11 pb, respectivamente), y analizamos la eficacia de la transformación de la cepa receptora que contenía pCRISPR3 (Figura 8B). Los plásmidos que contenían trunca­ mientos de 4 o 7 pb en el extremo 5' del protoespaciador1, no tenían ningún efecto sobre la capacidad de la cepa receptora para interferir con la transformación del plásmido. Las versiones más cortas de protoespaciador (11, 15, 19 pb) anulaban la capacidad de la cepa receptora para evitar una transformación del plásmido. Estos datos muestran que el extremo 5' del protoespaciador, que no tiene complementariedad con el ARNcr maduro, no es importante para la función de CRISPR3/Cas. Respaldando totalmente los experimentos in vivo, el oligodúplex SP1-20 que contiene solo 20 nt del protoespaciador-1, es escindido con eficacia con Cas9-ARNcr (Figura 8D y E).

Se requiere PAM para la unión y la escisión del ADN a través de Cas9-ARNcr. Los plásmidos que son portadores de un protoespaciador pero no de PAM (pSP1-pA) o múltiples PAMs, pero no tienen protoespaciador (pUC18), son resis­ tentes a la escisión con Cas9-ARNcr (Figura 8A). Por lo tanto, de acuerdo con los datos in vivo, se requiere tanto PAM como un protoespaciador para la escisión de un ADN bicatenario a través del complejo Cas9-ARNcr (Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82). Para averiguar si PAM es reconocido en el contexto de un ADN bicate­ nario o monocatenario, analizamos la unión de Cas9-ARNcr y la escisión de oligodesoxinucleótidos i) SP1 (que con­ tiene tanto protoespaciador como PAM), ii) SP1-Ap (contiene solo protoespaciador) y iii) SP2 (contiene solo PAM). Las hebras (+) de estos oligodesoxinucleótidos se usaron como sustratos de ADN monocatenario (s(+)SP1, s(+)SP1-Ap, s(+)SP2, en consecuencia) (Tabla 1).

De acuerdo con los experimentos de escisión de plásmidos, los oligodúplex que tienen solo protoespaciador, pero no tienen PAM, no se escinden a través de Cas9-ARNcr (Figura 9B). Por otro lado, la hebra (+) en la forma monocatenaria se corta a una velocidad similar, independientemente de si tiene o no PAM (Figura 9B). Estos datos muestran clara­ mente que se requiere PAM solo para una escisión del ADN bicatenario pero no para una hebra monocatenaria.

Para someter a ensayo si PAM es importante para la unión del ADN a través del complejo Cas9-ARNcr, se realizaron experimentos de cambio de la movilidad electroforética. Para evitar una escisión, se realizaron experimentos de unión en ausencia de iones Mg2+ que son necesarios para la escisión. Cas9-ARNcr mostraba diferentes patrones de unión para oligonucleótidos bicatenarios y monocatenarios. En el caso del oligodúplex SP1, se observa un complejo de baja movilidad ya con una concentración de 1 nM (Figura 9C). Por otro lado, no se observa unión con las mismas condi­ ciones experimentales en los oligodúplex sin PAM (SP1-Ap) o sin protoespaciador (SP2). Además, no se observa un complejo de baja movilidad en el caso de una proteína Cas9 sin ARNcr (Figura 6A), lo que confirma que el ARNcr es importante para la formación del complejo. Por lo tanto, en conjunto, los experimentos de unión muestran claramente que el complejo de la proteína Cas9 no se puede unir al ADN bicatenario en ausencia de PAM, incluso si contiene un ARNcr complementario al protoespaciador. Dicho con otras palabras, los sustratos de ADN bicatenarios que carecen de PAM no se escinden porque se requiere PAM para la unión de Cas9-ARNcr.

Por otro lado, los oligonucleótidos monocatenarios (hebra (+)) están unidos mediante Cas9-ARNcr con la misma afi­ nidad, independientemente de la presencia de PAM (Figura 9D). Nuevamente, no se observó una unión del oligonucleótido de ADN monocatenario sin protoespaciador (Figura 9D), o de la proteína Cas9 que carecía de ARNcr (Figura 6C). En conjunto, estos datos indican que el complejo Cas9-ARNcr discrimina PAM solo en el ADN bicatenario pero no en el monocatenario.

Dado que algunos sistemas CRISPR de Tipo III proporcionan una interferencia del ARN en lugar del ADN, hemos estudiado la unión y escisión de ARN a través del complejo Cas9-ARNcr. El Cas9-ARNcr no escindía específicamente ni el ARN monocatenario ni el ARN bicatenario que era portador de un protoespaciador y PAM (Figura 10B). Este hallazgo confirma una vez más que el ADN es una diana principal para el sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus. El complejo Cas9-ARNcr se une a un ARN complementario que contiene un protoespaciador, pero esa interacción probablemente no es funcionalmente importante, porque un ARN monocatenario no se corta específicamente con Cas9 dentro de un protoespaciador.

Mutagénesis de los motivos RuvC y HNH de la proteína Cas9. Los experimentos de transformación de plásmidos indican que los motivos RuvC y HNH (Figura 11A) son importantes para la función de Cas9 (Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82). Para someter a ensayo si estos motivos están implicados en la escisión del ADN diana, expresamos y purificamos los mutantes D31A y N891A siguiendo un procedimiento descrito para Cas9 wt. Ambos mutantes se purificaron conjuntamente con ARNcr idéntico al ARNcr en el complejo Cas9 wt (Figura 11C). Para someter a ensayo si las proteínas mutantes conservaban la actividad de escisión, realizamos un seguimiento de la escisión del plásmido pSP1 mediante complejos Cas9-ARNcr mutantes. Sorprendentemente, en lugar del producto de reacción lineal observado para la proteína Cas9 wt, ambos mutantes producían una forma de ADN mellada (Figura 11B), lo que indica que ambos mutantes de los sitios activos escinden solo una hebra de ADN del sustrato plasmídico dentro de un protoespaciador.

Para determinar si las proteínas mutantes muestran una preferencia por una hebra, analizamos la escisión del mutante D31A y N891A del oligodúplex SP1. El mutante del sitio activo RuvC (D31A) cortaba la hebra (+) del oligodúplex en la misma posición que la proteína Cas9-ARNcr wt, mientras que la hebra (-) permanecía intacta (Figura 11C). Y vice­ versa, el mutante del sitio activo HNH (N891A) cortaba solo la hebra (-), pero no la hebra (+) del oligodúplex SP1 (Figura 11D). Tomados en conjunto, estos datos indican que los sitios activos RuvC y HNH actúan sobre hebras de ADN opuestas para generar una rotura de la hebra doble. Para someter a ensayo si se conserva el mismo patrón de corte durante la escisión del ADN plasmídico, secuenciamos regiones de protoespaciador de plásmidos mellados. Los datos de secuencias “run-off” confirmaron que el mutante del sitio activo RuvC cortaba solo la hebra (+) del ADN, mientras que el mutante HNH/McrA solo la hebra (-) (Figura 12A y B). Además, encontramos que el mutante RuvC cortaba la hebra (+) de un ADN monocatenario pero no se detectó tal corte para el mutante HNH (Figura 12D).

Para someter a ensayo si las mutaciones alteraban la afinidad de la unión al ADN de los complejos mutantes de proteína-ARNcr, se estudió la unión del ADN utilizando el ensayo de cambio de la movilidad electroforética. Ambos complejos mutantes de proteína-ARNcr se unen al oligodúplex SP1 con la misma afinidad que la proteína de tipo silvestre (wt, del inglés “wild type”) (Figura 12C). Por lo tanto, las mutaciones en los sitios activos putativos de Cas9 no tienen un efecto significativo sobre las propiedades de unión al ADN de hebra doble del complejo Cas9-ARNcr. Dado que el ARNcr de 42 nt estaba presente en los complejos de proteínas mutantes (Figura 12C), llegamos a la conclusión de que los complejos mutantes de Cas9-ARNcr perdían la capacidad de cortar una de las hebras del ADN diana debido a una mutación del sitio activo. Dado que la proteína Cas9-marcador His es un monómero en solución (Figura 13), es probable que la proteína Cas9 sea funcional como monómero y utilice dos sitios activos para el corte de hebras de ADN opuestas. Una estrategia similar es explotada por algunas endonucleasas de restricción (Armalyte y col., 2005. J Biol Chem 28041584-94).

Discusión

El complejo Cas9-ARNcr del sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus es una endonucleasa guiada por ARNcr. Este trabajo demuestra que el complejo Cas9-ARNcr del sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus es una endonucleasa dirigida por ARNcr que corta ambas hebras de ADN en presencia de iones Mg2+ dentro de un protoespaciador situado 4 nt corriente abajo de la secuencia PAM, para producir productos de escisión con extremos romos. La especificidad de secuencia del complejo Cas9-ARNcr viene dictada por el ARNcr de 42 nt que incluye un fragmento de ~20 nt complementario a la secuencia del protoespaciador en el ADN diana. A este respecto, el ARNcr maduro en el complejo Cas9 del sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus, es similar al ARNcr de Streptococcus pyogenes que tiene un asa en 3' de una secuencia de repetición, pero carece de parte de la secuencia del espaciador y del asa en 5' correspon­ diente al fragmento de repetición (Deltcheva y col, 2011). Por lo tanto, el ARNcr presente en el complejo Cas9-ARNcr del sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus es complementario solo a la parte de la secuencia de protoespaciador distal de PAM. No es sorprendente que el truncamiento del extremo 3' de la secuencia del protoespaciador de 10 nucleótidos no tenga ningún efecto sobre la escisión con Cas9-ARNcr de oligodúplex sintéticos o ADN plasmídico (Figura 8).

La maquinaria para el corte del complejo Cas9-ARNcr reside en la proteína Cas9 que proporciona dos sitios activos para la escisión del enlace fosfodiéster. Los sitios activos similares a RuvC y HNH de la proteína Cas9 están ubicados en diferentes dominios y actúan independientemente sobre hebras de ADN individuales. La sustitución de la alanina de los restos del sitio activo en los motivos RuvC y HNH, transforma el complejo Cas9-ARNcr en una endonucleasa que realiza una mella específica de la hebra de forma similar a las enzimas mellasas (Chan y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:1-18). De forma consistente con estudios in vivo, una actividad funcional del complejo Cas9-ARNcr in vitro es absolutamente dependiente de la presencia del motivo adyacente al protoespaciador NGGNG, corriente arriba de la secuencia del protoespaciador. Los datos presentados en la Figura 3 muestran que se requiere PAM para la unión de Cas9-ARNcr al ADN bicatenario. Si falta la secuencia de PAM en el ADN bicatenario, el complejo Cas9-ARNcr no se une a ese ADN, incluso si contiene una secuencia de protoespaciador complementaria. Por otro lado, Cas9-ARNcr no muestra una unión al ADN si PAM (o múltiples PAMs) está presente, pero la secuencia de protoespaciador está au­ sente. Por lo tanto, de forma compatible con los datos in vivo, tanto las secuencias de PAM como del protoespaciador son requisitos previos necesarios para la unión al ADN bicatenario y la posterior escisión. Contrariamente a la unión de Cas9-ARNcr al ADN bicatenario, el motivo de la secuencia PAM no tiene ningún efecto sobre la unión al ADN monocatenario ya que: un oligodesoxinucleótido monocatenario que contiene un protoespaciador con o sin secuencia PAM, se une igualmente bien pero con menor afinidad que al ADN bicatenario. En presencia de iones Mg2+, Cas9 corta un ADN monocatenario unido al ARNcr usando su sitio activo HNH.

Mecanismo de interferencia del ADN en los sistemas de Tipo II. Nuestros resultados establecen un modelo simple para el mecanismo de corte del ADN bicatenario a través del complejo Cas9-ARNcr en el sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus (Figura 14). Los complejos Cas9-ARNcr que utilizan un mecanismo que todavía debe definirse, loca­ lizan y se unen a una secuencia de protoespaciador dentro del ADN bicatenario en un procedimiento dependiente de PAM. Es posible que PAM en el ADN bicatenario sirva como un sitio de iniciación (señal) para la separación de hebras y promueva un emparejamiento posterior del ARNcr con la hebra (+) complementaria del ADN. Queda por establecer si un módulo de proteína Cas9 o un ARNcr unido a Cas9 (por ejemplo, usando nucleótidos en el "asa 3'" conservada de la secuencia de repetición conservada) reconoce la secuencia PAM. A pesar de la falta de estos detalles del me­ canismo, nuestros datos demuestran claramente que PAM es reconocido por Cas9-ARNcr en el contexto de un ADN bicatenario. La unión de Cas9-ARNcr a la secuencia diana en el ADNds presumiblemente da como resultado la es­ tructura de bucle R, en la que la hebra (-) se desplaza y la hebra de ADN complementaria (+) se empareja con el ARNcr. En presencia de iones Mg2+, la escisión del enlace fosfodiéster se produce en ambas hebras, 4 nt corriente arriba en 5' de la secuencia PAM para generar extremos romos en el ADN. El análisis de la escisión del ADN a través de los mutantes de los motivos RuvC o HNH demuestra que los sitios activos similares a RuvC y HNH de la proteína Cas9, actúan sobre las hebras (-) y (+), respectivamente. Por lo tanto, en el complejo Cas9-ARNcr catalíticamente competente, el dominio N-terminal que contiene el resto catalítico D31A del motivo RuvC, está situado en la hebra de ADN (-) desplazada, mientras que la parte central de Cas9 que contiene el motivo HNH, está localizada próxima al enlace fosfodiéster escindible de la hebra de ADN (+) emparejada con el ARNcr. Después de la escisión del ADN, Cas9-ARNcr permanece unido a los productos de reacción (Figura 15). En conjunto, los datos presentados en este documento sugieren un primer mecanismo molecular para la etapa de interferencia del ADN a través del sistema CRISPR3/Cas de S. thermophilus. Ya que Cas9 es un gen distintivo (Makarova y col., 2011. Nat Rev Microbiol 9:467-77) para los sistemas de Tipo IIA y Tipo IIB, el mecanismo de corte propuesto en este documento es probable que se conserve en otros sistemas de Tipo IIA y Tipo IIB. Versiones independientes de proteínas similares a Cas9 que no forman parte del sistema CRISPR, se han identificado mediante bioinformática (Makarova y col., 2011. Biol Direct 6:38). En vista de los datos proporcionados en este documento, sugerimos que esas proteínas pueden proporcionar ^{una interferencia contra un} AdN ^{extraño de manera similar a Cas9, si se cargan con moléculas pequeñas de ARNcr} que se pueden generar a través de la ruta diferente de CRISPR.

Comparación con otros complejos de interferencia de ARN. El mecanismo propuesto en este documento para la esci­ sión de ADN bicatenario a través del complejo Cas9-ARNcr difiere significativamente del sistema de Tipo I-E (antiguo Ecoli o CASS2) (Jore y col., 2011. Nat Struct Mol Biol 18:529-36). En el sistema de E. coli, ARNcr y las proteínas Cas se ensamblan en un gran complejo de ribonucleoproteína denominado Cascade que facilita el reconocimiento de la diana al mejorar la hibridación específica de secuencia entre el ARN CRISPR y las secuencias diana complementarias (Jore y col., 2011. Nat Struct Mol Biol 18:529-36). El reconocimiento de la diana depende de PAM y se rige por la secuencia de ARNcr "semilla" ubicada en el extremo 5' de la región del espaciador (Semenova y col., 2011. Proc Natl Acad Sci USA 108:10098-103) Sin embargo, aunque el complejo Cascade-ARNcr solo es capaz de unirse a ADN bicatenario que contiene PAM y un protoespaciador, requiere una proteína Cas3 accesoria para la escisión del ADN. Cas3 es una nucleasa y helicasa de ADN monocatenario que es capaz de escindir el ADN monocatenario produciendo múltiples cortes (Sinkunas y col., 2011. EMBO J 30:1335-42). Los detalles del mecanismo de acción de Cas3 sobre un sustrato biológico adecuado (por ejemplo, Cascade-ARNcr unido al ADN bicatenario en el complejo de tipo bucle R) aún no se han establecido. Sin embargo, se ha demostrado recientemente que Cas3 de M. jannaschii solo es capaz de cortar ambas hebras de ADN en el sustrato sintético que imita el bucle R (Beloglazova y col., 2011. EMBO J 30:616-^{27). Se ha propuesto que Cas3 puede seguir un mecanismo similar para la escisión del} aDn ^{en presencia del complejo} Cascade-ARNcr. Por lo tanto, los datos actuales muestran claramente que los detalles del mecanismo de la etapa de interferencia para el sistema de Tipo I-E, difieren de los del sistema CRISPR3 tanto por la maquinaria catalítica como por el mecanismo y la complejidad.

En los sistemas CRISPR de subtipo III-B presentes en muchas arqueas y algunas bacterias, las proteínas RAMP de módulo Cas (Cmr) y el ARNc se ensamblan en el complejo efector que se dirige hacia el ARN invasor (Hale y col., 2009. Cell 139:945-56; Hale y col., 2012. Mol Cell 45:292-302). En Pyroccus furiosus, el complejo silenciador de ARN está compuesto por seis proteínas Cmr1-6 y el ARNcr se une al ARN diana y lo corta a una distancia fija con respecto al extremo 3' del psiARN. La actividad de corte depende de los iones Mg2+, sin embargo, la o las proteínas Cmr individuales responsables de la escisión del ARN diana aún no se han identificado. El complejo efector de Sulfolobus solfataricus compuesto por siete proteínas Cmr1-7 y ARNcr, corta el ARN invasor en una reacción endonucleolítica en los dinucleótidos UA (Zhang y col., 2012. Mol Cell 45:303-13). Es importante destacar que ambos complejos CmrARNcr realizan la escisión del ARN de manera independiente de PAM.

Los datos proporcionados en esta memoria muestran que el complejo Cas9-ARNcr del sistema CRISPR3 es hasta ahora el sistema de interferencia de ADN más simple, compuesto por una sola proteína Cas9 unida a la molécula de ARNcr. La organización modular simple del complejo Cas9-ARNcr, en donde la especificidad hacia la diana de ADN está codificada por el ARNcr y la maquinaria para la escisión es aportada por la proteína Cas, proporciona una plata­ ^{forma versátil para la modificación genética de endonucleasas universales de} aDn ^{guiadas por} aRn.

Ejemplo 2

Ensamblado in vitro del complejo Cas9-ARNcr a partir de 4 componentes

En este ejemplo demostramos que el complejo Cas9-ARNcr catalíticamente activo se puede ensamblar in vitro mez­ clando 4 componentes individuales: la variante de la proteína Cas9 marcada en el extremo C-terminal con (His)6 ("(His)6" desvelada como la SEQ ID NO: 23), el transcrito de ARNtracr (SEQ ID NO: 5), el transcrito de ARN CRISPR (SEQ ID NO: 8) y la RNasaIII de E. coli(Abgene). La proteína Cas9 se incuba previamente con transcritos de ARNtracr y de ARN CRISPR, seguido por una incubación adicional con RNasaIII para generar un complejo Cas9-ARNcr catalí­ ticamente competente que se usa para la escisión de ADN específica de sitio.

Más específicamente, los fragmentos de ARN necesarios para ensamblar el complejo fueron producidos mediante transcripción in vitro (kit de transcripción TranscriptAid™ T7 High Yield, Fermentas) del fragmento generado por PCR que contenía un promotor T7 en el extremo proximal de la secuencia que codifica el ARN. Los fragmentos de ADN generados con PCR que codificaban el ARN CRISPR y ARNtracr se produjeron usando el plásmido pCas9(-)SP1 como molde con la siguiente pareja de cebadores: 5'-taatacgactcactataGggtagaaaagatatcctacgagg-3' (SEQ ID NO: 40)/5'-CAACAACCAAGCTAATACAGCAG-3' (SEQ ID NO: 41) y 5'-aaaaacaccgaatcggtgccac-3' (SEQ ID NO: 42)/5'-taatacgactcactataGggTAATAATAATTGTGGTTTGAAACCATTC-3' (SEQ ID NO: 43) (promotor de la polimerasa de ARN T7 subrayado, inicio de la transcripción en negrita). El transcrito de ARN CRISPR de 150 nt está compuesto por secuencias de Repetición-Espaciador1-Repetición de 102 nt, flanqueadas por las regiones de 23 nt corriente arriba y 25 nt corriente abajo, necesarias para aparear el cebador. El transcrito de 105 nt de ARNtracr se compone de un segmento de 38 nt parcialmente complementario al fragmento de la secuencia de la repetición de CRISPR3 de DCGG7710 de S. thermophilus (secuencia anti-repetición), flanqueado por la región de 16 nt corriente arriba y 51 nt corriente abajo. Los fragmentos de ARN producidos mediante transcripción in vitro se purificaron usando el kit de limpieza RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen).

Para ensamblar in vitro el complejo Cas9-ARNcr catalíticamente competente, la proteína Cas9 marcada con (His)6 ^{("(His)6" desvelada como la SEQ} iD ^{NO: 23), se mezcló con transcritos de ARN CRISPR y de ARNtracr en una relación} molar de 1:0,5:1 y se incubó previamente en un tampón que contenía Tris-HCI 10 mM (pH 7,5 a 37 °C), NaCl 100 mM a 37 °C durante 30 minutos, seguido por la adición de RNasaIII (Ambion), MgCl2 y DTT y una incubación posterior durante 30 minutos adicionales. Las concentraciones finales de los componentes en la mezcla del ensamblado eran las siguientes: 100 nM de proteína Cas9 marcada con (His)6 ("(His)6" desvelada como la SEQ ID NO: 23), 50 nM de ARN CRISPR, 100 nM de ARNtracr, RNasalll 50 nM, MgCl2 10 mM y DTT 1 mM.

A continuación proporcionamos evidencias experimentales de que el complejo Cas9-ARNcr ensamblado in vitro guiado por la secuencia de ARNcr, escinde el ADN en el sitio específico para generar extremos romos. A este respecto, el complejo Cas9-ARNcr se puede usar como una alternativa para una endonucleasa de restricción o meganucleasa para la escisión de ADN específica de sitio in vitro. La especificidad de secuencia del complejo viene dictada por la secuencia de ARNcr que se puede modificar genéticamente para dirigirla a una diana de ADN conveniente.

En primer lugar, la actividad de escisión del ADN del complejo Cas9-ARNcr ensamblado in vitro, se sometió a ensayo sobre los sustratos plasmídicos pSP1 y pUC18. El plásmido pSP1 contenía una secuencia de protoespaciador1 flan­ queada por la secuencia 5'-GGNG-3'PAM. La secuencia del protoespaciador1 no estaba presente en pUC18. Se lle­ varon a cabo reacciones en los plásmidos pUC18 y pSP1 (Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82) a 37 °C en Tris HCl 10 mM (pH 7,5 a 37 °C), NaCl 50 mM, 0,05 mg/ml de BSA, DTT 0,5 mM y MgCl2 10 mM. Las mezclas de reacción normalmente contenían 3,0 nM de ADN plasmídico superenrollado. Las reacciones se iniciaron ^{mezclando volúmenes de 50 pl de complejo Cas9-ARNcr y} aDn ^{plasmídico (relación 1:1 v/v) en un tampón de reac­} ción. Se extrajeron partes alícuotas a intervalos programados y se inactivaron con fenol/cloroformo. La fase acuosa se mezcló con una solución de colorante de carga (azul de bromofenol al 0,01% y EDTA 75 mM en glicerol al 50% v/v) y los productos de la reacción se analizaron mediante electroforesis a través de agarosa (Figura 16). Para verificar si el plásmido pSP1 previamente escindido por el complejo Cas9-ARNcrse podía volver a ligar, purificamos el producto de la escisión de pSP1 lineal a partir del gel de agarosa usando el kit de extracción en gel GeneJET (Fermentas) y lo ligamos de nuevo usando ADN ligasa T4 (Fermentas). Después de la transformación de células de E. coli con la mezcla de ligación, se seleccionaron cinco clones individuales a partir de los transformantes resultantes, se purificó el ADN plasmídico y se sometió a secuenciación usando los siguientes cebadores: 5'-ccgcatcaggcgccattcgcc-3' (SEQ ID NO: 29) (secuenciación de la hebra (+)) y 5'-gcgaggaagcggaagagcgccc-3' (SEQ ID NO: 30) (secuenciación de la hebra (-)). El análisis de la secuencia reveló que la secuencia de ADN del plásmido pSP1 en el locus que se había escindido con el complejo Cas9-ARNcr y ligado de nuevo, era idéntica a la secuencia del plásmido que no se había tratado. La transformación de E. coli con la mezcla de ligación en ausencia de la ADN ligasa T4, no produjo transformantes indicando que no se purifican conjuntamente trazas de plásmido superenrollado con el producto de reacción lineal.

A continuación, se sometió a ensayo la actividad de corte del complejo Cas9-ARNcr ensamblado in vitro sobre un dúplex de oligodesoxinucleótido de SP1 de 55 pb sintético que contenía una secuencia de protoespaciador que se apareaba con la secuencia del espaciador de ARNcr (Figura 17). Las condiciones de la reacción eran idénticas a las descritas anteriormente para la escisión del ADN plasmídico, excepto que se usó 1 nM de oligodúplex. El análisis del producto de la reacción reveló que el complejo Cas9-ARNcr ensamblado in vitro cortaba ambas hebras del oligodúplex en una posición fija, dentro del protoespaciador, después del 37° nucleótido desde el extremo 5', 4 nt corriente arriba de la secuencia PAM 5'-GGNG-3', dejando extremos romos (Figura 17).

Ejemplo 3

Complejo Cas9-ARNcr ensamblado in vitro a partir de 3 componentes

En este ejemplo, demostramos que el complejo Cas9-ARNcr activo se puede ensamblar in vitro mezclando 3 compo­ nentes individuales: la variante de la proteína Cas9 marcada en el extremo C-terminal con (His)6 ("(His)6" desvelada como la SEQ ID NO: 23), el transcrito de ARNtracr proporcionado en el Ejemplo 1 (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) y el transcrito de ARN CRISPR (SEQ ID NO: 8) proporcionado en el Ejemplo 1 o ARNcr sintético (SEQ ID NO: 8) que se corresponde con el ARNcr putativo del sistema CRISPR3/Cas de la cepa DGCC7710 de S. thermophilus. El oligorribonucleótido sintético de 42 nt está compuesto por 20 nt idénticos al espaciador1 de la región CRISPR3 en el extremo 5'-terminal y 22 nt de la secuencia de repetición en el extremo 3'. Más específicamente, se obtuvieron los transcritos de ARNtracr y ARN CRISPR como se ha descrito en el Ejemplo 1. Para generar el complejo Cas9-ARNcr, la proteína Cas9 marcada con (His)6 ("(His)6" desvelada como la SEQ ID NO: 23) se mezcló con el transcrito de ARNtracr y de ARN CRISPR, o ARNcr sintético de 42 nt, en una relación molar de 1:0,5:1, y se incubó en un tampón que contenía Tris-HCI 10 mM (pH 7,5 a 37 °C), NaCl 100 mM a 37 °C durante 1 h. Las concentraciones finales de los componentes en la mezcla del ensamblado eran las siguientes: 100 nM de proteína Cas9 marcada con (His)6 ("(His)6" desvelada como la SEQ ID NO: 23), 50 nM de ARN CRISPR o ARNcr sintético de 42 nt, 100 nM de ARNtracr.

A continuación proporcionamos evidencias experimentales de que el complejo Cas9-ARNcr ensamblado in vitro guiado por la secuencia de ARNcr escinde el ADN en el sitio específico para generar extremos romos. A este respecto, el complejo Cas9-ARNcr se puede usar como una alternativa para una endonucleasa de restricción o meganucleasa para la escisión de ADN específica de sitio in vitro. La especificidad de secuencia del complejo viene dictada por la secuencia de ARNcr que se puede modificar genéticamente para dirigirla a una diana de ADN conveniente.

En primer lugar, la actividad de escisión del ADN del complejo Cas9-ARNcr ensamblado in vitro, se sometió a ensayo sobre los sustratos plasmídicos pSP1 y pUC18. El plásmido pSP1 contenía una secuencia de protoespaciador1 flan­ queada por la secuencia 5'-GGNG-3'PAM. La secuencia del protoespaciador1 no estaba presente en pUC18. Se lle­ varon a cabo reacciones en los sustratos de plásmidos (Sapranauskas y col., 2011. Nucleic Acids Res 39:9275-82) a 37 °C en Tris HCl 10 mM (pH 7,5 a 37 °C), NaCl 50 mM, 0,05 mg/ml de BSA, DTT 0,5 mM y MgCl2 10 mM. Las mezclas de reacción normalmente contenían 3,0 nM de ADN plasmídico superenrollado. Las reacciones se iniciaron mezclando volúmenes de 50 pl de complejo Cas9-ARNcr y a Dn plasmídico (relación 1:1 v/v) en un tampón de reac­ ción. Se extrajeron partes alícuotas a intervalos programados y se inactivaron con fenol/cloroformo. La fase acuosa se mezcló con una solución de colorante de carga (azul de bromofenol al 0,01% y EDTA 75 mM en glicerol al 50% v/v) y los productos de la reacción se analizaron mediante electroforesis a través de agarosa (Figura 18).

A continuación, se sometió a ensayo la actividad de corte del complejo Cas9-ARNcr ensamblado in vitro sobre un dúplex de oligodesoxinucleótido de SP1 de 55 pb sintético que contenía una secuencia de protoespaciador que se apareaba con la secuencia del espaciador de ARNcr (Figura 19). Las condiciones de la reacción eran idénticas a las descritas anteriormente para la escisión del ADN plasmídico, excepto que se usó 1 nM de oligodúplex. El análisis del producto de la reacción reveló que el complejo Cas9-ARNcr ensamblado in vitro cortaba ambas hebras del oligodúplex en una posición fija, dentro del protoespaciador, después del 37° nucleótido desde el extremo 5', 4 nt corriente arriba de la secuencia PAM 5'-GGNG-3', dejando extremos romos (Figura 19).

Ejemplo 4

Casete de espaciador intercambiable para la reprogramación de la especificidad del complejo Cas9-ARNcr

En este ejemplo describimos un casete de espaciador intercambiable que permite producir ARNcr que es portador de una secuencia de nucleótidos contra cualquier diana de ADN conveniente, para ser utilizado para ensamblar el com­ plejo Cas9-ARNcr descrito en los Ejemplos 1 y 2 (Figura 20B). El casete es portador de una única unidad de repeticiónespaciador-repetición que permite la inserción del oligodúplex que es portador de la nueva secuencia espaciadora requerida para generar un ARNcr deseado. Para diseñar un casete, primero construimos un casete que contenía una secuencia líder, una secuencia de repetición y un sitio de reconocimiento Sapl único, próximo a la secuencia de la repetición, seguido por el sitio BamHI (Figura 20C). Para generar una región CRISPR que contenía el espaciador único deseado, insertamos un oligodúplex sintético que contenía una secuencia espaciadora única y una unidad de repeti­ ción en el plásmido cortado previamente con las enzimas de restricción SapI y BamHI. Usando este casete produjimos transcritos de ARNcr que contenían secuencias de nucleótidos complementarias a los protoespaciadores N1 y N2 presentes en el plásmido pUC18 (véase más abajo).

Como prueba de la demostración del principio, utilizamos un casete de espaciador intercambiable para generar ARNcrl y ARNcr2 que estaban diseñados para dirigirse al plásmido pUC18 en el protoespaciadorl y el protoespaciador2, respectivamente, incorporamos ARNcr1 y ARNcr2 en el complejo Cas9 como se ha descrito en el Ejemplo 1 y utilizamos esos complejos para la escisión del plásmido pUC18. El protoespaciador N1 está ubicado cerca del sitio de la endonucleasa de restricción Sapl, mientras que el protoespaciador N2 está cerca del sitio Aatll. La distancia entre los sitios de restricción Sapl y Aatll es de 775 pb, mientras que la distancia entre los sitios de escisión del complejo Cas9-ARNcr putativos, ubicados en los espaciadores N1 y n 2, es de 612 pb (Figura 21A). Los fragmentos de PCR de ARNcr1 y ARNcr2 que contenían el promotor T7 en el extremo proximal, se obtuvieron a partir de los plásmidos del casete de espaciador intercambiable correspondiente y se usaron para producir mediante transcripción in vitro, trans­ critos de ARN CRISPR que eran portadores de secuencias que se emparejaban con las secuencias del espaciador N1 o el espaciador N2. Los complejos catalíticamente activos de Cas9 con ARNcr1 y ARNcr2 se ensamblaron para la escisión del ADN como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los complejos ensamblados in vitro que contenían ARNcr1 o ARNcr2 linealizaban el plásmido pUC18 (Figura 21B). Cuando ambos complejos se incubaban con el plásmido pUC18, se obtenían dos fragmentos de ADN (2074 y 612 pb) (Figura 21B), lo que indica que la escisión del plásmido se producía en sitios dirigidos por las moléculas de ARNcr presentes en los complejos.

Ejemplo 5

Procedimiento de clonación que emplea el complejo Cas9-ARNcr

En este ejemplo demostramos que el complejo Cas9-ARNcr se puede usar para preparar un vector para el procedi­ miento de clonación. Primero demostramos que los productos de escisión obtenidos a través del complejo Cas9-ARNcr se pueden volver a ligar mediante una ADN ligasa. Purificamos el producto de escisión de pSP1 lineal a partir de un gel de agarosa y lo volvimos a ligar usando ADN ligasa. Después de la transformación de células de E. coli con la mezcla de ligación, se seleccionaron cinco clones individuales a partir de los transformantes resultantes, se purificó el ADN plasmídico y se sometió a secuenciación. El análisis de la secuencia reveló que la secuencia de ADN del plásmido pSP1 en el locus que se había escindido con el complejo Cas9-ARN y vuelto a ligar, era idéntica a la se­ cuencia del plásmido sin tratar. La transformación de E. coli con la mezcla de ligación en ausencia de ADN ligasa T4 no producía transformantes, lo que indica que no se purificaban conjuntamente trazas de plásmido superenrollado con el producto de reacción lineal. Este resultado ilustra que los extremos del ADN generados por la escisión con Cas9, son sustratos para la ADN ligasa T4 y, por lo tanto, deben contener un fosfato en el extremo 5'-terminal y un grupo OH libre en el extremo 3'-terminal (Lehman, 1974).

A continuación, analizamos la escisión del plásmido pUC18 con el complejo Cas9 cargado con ARNcr1 y ARNcr2 descrito en el Ejemplo 5 (Figura 21A). En primer lugar, pUC18 se escindió con un complejo, se purificó y se volvió a ligar. La secuenciación de 10 clones en cada caso confirmaba que la secuencia del plásmido escindido y vuelto a ligar era idéntica a la secuencia del plásmido sin tratar (Figura 21C). Este experimento sugiere que no se introducen muta­ ciones adicionales después de la escisión a través del complejo Cas9-ARNcr y la ligación, y que el complejo Cas9-ARNcr se puede usar para experimentos de clonación. Cuando se incubaban ambos complejos con el plásmido pUC18, se obtuvieron dos fragmentos de ADN (2074 y 612 pb) (Figura 21B), lo que indica que se había producido una escisión del plásmido en sitios seleccionados por las moléculas de ARNcr presentes en los complejos. Para demostrar que el plásmido pUC18 escindido con los complejos Cas9-ARN es adecuado para una modificación genética, clona­ mos un fragmento de PCR que contenía un promotor y un gen de resistencia a la tetraciclina procedente del plásmido pACYC184, con el vector pUC18 cortado previamente con la mezcla de complejo Cas9 que contenía ARNcr1 o ARNcr2. Los clones se seleccionaron en medio enriquecido con tetraciclina y ampicilina. La secuenciación de 4 clones seleccionados confirmaba que el fragmento de PCR intacto se había insertado en una posición deseada ((Figura 21C).

Más específicamente, los 2 |jg de pUC18 se incubaron con la mezcla de complejos de Cas9-ARN ensamblados por separado (250 nM cada uno) que contenían diferentes ARNcrs, durante 1 hora a 37 °C en 100 j l de volumen de reacción (Tris-HCI 10 mM (pH 7,5 a 37 °C), NaCl 100 mM, DTT 1 mM y MgCh 10 mM). El fragmento de vector obtenido se purificó desde el gel de agarosa usando el kit de extracción en gel GeneJET (Thermo Fisher Scientific) y se dividió en dos partes iguales. Una parte del vector cortado previamente se desfosforiló con la fosfatasa alcalina FastAP mien­ tras que la otra parte no se trató. Se obtuvo un inserto de 1282 pb que contenía un promotor y un gen de resistencia a la tetraciclina a partir del plásmido pACYC184 mediante PCR. Después de la purificación usando el kit de purificación de PCR GeneJET (Thermo Fisher Scientific), una solución que contenía el fragmento de PCR se dividió en dos partes. Una parte se fosforiló con una polinucleótido cinasa T4 (Thermo Fisher Scientific) mientras que la otra parte no se trató. El vector sin tratar se ligó con el fragmento de PCR sin tratar, mientras que un vector desfosforilado se ligó con un fragmento fosforilado usando la ADN ligasa T4 (Thermo Fisher Scientific). Los clones se seleccionaron en un medio complementado con 100 jg/m l de Ap y 25 jg/m l de Tc.

Ejemplo 6

Escisión de sustratos de ADN largos mediante el complejo Cas9 ARNcr

En este ejemplo, demostramos que Cas9-ARNcr se puede dirigir para escindir dianas en moléculas de ADN largas, incluyendo el fago A, E. coli y ADNs genómicos humanos.

Más específicamente, dirigimos el complejo Cas9-ARN para escindir sitios específicos en el bacteriófago A (48 kb), la cepa de E. coli BL-21 (4,6 Mb) y ADNs genómicos humanos (3,2 Gb). El complejo Cas9-ARNcr se ensambló como se ha descrito en los Ejemplos 2 y 3. Utilizamos ARNcrs sintéticos de 42 nt de longitud, preARNcrs de 150 nt y ARNtracrs sintetizados usando transcripción in vitro a partir de moldes generados como se ha descrito en el Ejemplo 4.

Las reacciones de escisión del ADN de A se iniciaron mezclando el ADN de A (Thermo Fisher Scientific) con el complejo Cas9-ARN ensamblado (relación 1:1 v/v) e incubando a 37 °C. La mezcla de reacción final contenía 2 |jg de ADN de A, complejo Cas9-ARN 50 nM, Tris-HCI 10 mM (pH 7,5 a 37 °C), NaCl 100 mM, DTT 1 mM y MgCh 10 mM en 100 j l de volumen de reacción. Se extrajeron partes alícuotas a intervalos programados y se inactivaron con fenol/cloroformo. La fase acuosa se mezcló con una solución de tinte de carga 3X (azul de bromofenol al 0,01% y EDTA 75 mM en glicerol al 50% v/v) y los productos de la reacción se analizaron mediante electroforesis a través de geles de agarosa y tinción con bromuro de etidio. El análisis de los productos de la escisión del ADN genómico del fago A lineal en gel de agarosa, confirmaba que el ADN de ~40 pb de longitud se escinde de forma eficaz en un solo sitio (Figura 22A).

El ADN procedente de la cepa de E. coli BL21 (DE3) se aisló usando el kit de purificación de ADN genómico (Thermo Fisher Scientific). Para el ensayo de escisión, el ADN genómico de E. coli se combinó con el complejo Cas9-ARN ensamblado (relación 1:1 v/v) y se incubó durante 3 horas a 37 °C. La mezcla de reacción final contenía 30 jg de ADN genómico, complejo Cas9-ARN 1 jM , Tris-HCI 10 mM (pH 7,5 a 37 °C), NaCl 100 mM, DTT 1 mM y MgCh 10 mM en 300 j l de volumen de reacción. Después de la incubación, se añadieron 30 j l de PstI FastDigest (Thermo Fisher Scientific) y la mezcla de reacción se incubó durante 16 horas adicionales a 37 °C. La reacción terminó calentando la mezcla de reacción durante 30 minutos a 55 °C con Proteinasa K (0,5 mg/ml; Thermo Fisher Scientific) y SDS (0,5%, p/v), seguido de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente con RNasa A (0,25 mg/ml; Thermo Fisher Scienti­ fic). Después de la extracción con fenol/cloroformo, el ADN precipitó con isopropanol y se disolvió en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 y EDTA 1 mM). Se mezclaron 10 jg de ADN con solución de colorante de carga 3X (azul de bromofenol al 0,01% y EDTA 75 mM en glicerol al 50% v/v) y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1%.

Para analizar los productos de la escisión con Cas9-ARNcr de ADN genómico de E. coli, diseñamos una sonda contra un fragmento de ADN que contenía una diana del complejo Cas9-ARN (un protoespaciador) (Figura 22B) y realizamos un análisis de transferencia Southern. El análisis de transferencia Southern se realizó como se describe en (Sambrook y col, 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual) con las siguientes modificaciones. El ADN fraccionado se trans­ firió desde el gel de agarosa a una membrana de nailon SensiBlot Plus (Thermo Fisher Scientific) mediante una trans­ ferencia semiseca. El ADN se desnaturalizó y se fijó sobre la membrana colocándolo sobre papel absorbente saturado con NaOH 0,4 M durante 10 minutos, se aclaró con 2X SSC y se secó al aire. La membrana se prehibridó con tampón 6X SSC que contenía SDS al 0,5% y 100 jg/m l de ADN de esperma de salmón desnaturalizado (Amresco) durante 1 hora a 65 °C. La sonda de hibridación se generó mediante PCR usando ADN genómico de BL21(DE3) de E. coli como molde, obteniendo un producto de 397 pb. Los extremos 5' se desfosforilaron con fosfatasa FastAP (Thermo Fisher Scientific) y se radiomarcaron mediante incubación con [y-32P]ATP (Hartmann Analytic) y T4 PNK (Thermo Fisher Scientific). La sonda marcada se purificó usando el kit de purificación de PCR GeneJET (Thermo Fisher Scientific), se desnaturalizó calentando a 95 °C durante 5 minutos, se enfrió rápidamente sobre hielo y se añadió directamente a la solución de prehibridación. La membrana se hibridó durante 16 horas a 65 °C y se lavó dos veces con 2X SSC, SDS al 0,5% y dos veces con 2X SSC, SDS al 0,1% a temperatura ambiente, se secó al aire y se visualizó mediante formación de imágenes de fósforo (FLA-5100; Fujifilm).

La sonda se diseñó para que se dirigiera al fragmento de ADN que contenía una diana (un protoespaciador) para el complejo Cas9-ARN (Figura 22B). La distancia entre dos dianas de Pstl es de -1500 pb, mientras que la distancia entre el protoespaciador y la diana de Pstl izquierda es de 466 pb. Después de la escisión con el complejo Cas9, detectamos solo un fragmento de ADN de 466 pb (Figura 22C), lo que significa que todas las dianas de ADN se escindían con la proteína Cas9 en la posición deseada. Estos datos demuestran claramente que la proteína Cas9 encuentra de forma eficaz dianas en moléculas muy largas y complejas, como el ADN vírico y bacteriano.

Para analizar los productos de la escisión con Cas9-ARNcr del ADN genómico humano, usamos ADN extraído a partir de cerebro humano. El ADN genómico humano se combinó con el complejo Cas9-ARNcr ensamblado (relación 1:1 v/v) y se incubó durante 30 minutos a 37 °C. La mezcla de reacción final contenía 1 jg de ADN genómico, Cas9 100 nM, Tris-HCI 10 mM (pH 7,5 a 37 °C), NaCl 100 mM, DTT 1 mM y MgCh 10 mM en 100 j l de volumen de reacción. Los complejos Cas9-ARNcr-HS1 (SeqID n° 13) y Cas9-ARNcr-HS2 (SeqID n° 14) se ensamblaron para dirigirse a los loci RASGEF1C o ARL15, respectivamente. Los productos de la escisión se analizaron usando qPCR (Figura 22D). Después del tratamiento con el complejo Cas9-ARNcr, la cantidad de dianas de ADN intactas disminuía más de 25 veces. El análisis de los resultados obtenidos a partir de los datos de la qPCR reveló que los complejos Cas9-ARN escinden el ADN genómico humano de manera eficaz en los loci deseados. Estos datos demuestran claramente que la proteína Cas9 encuentra las dianas de forma eficaz en moléculas muy largas y complejas, tales como el ADN vírico, bacteriano y de mamífero.

Ejemplo 7

Evidencia para la edición de genes de un plásmido informador en células de mamífero después de la transfección de complejos Cas9/ARN.

Se construyó un plásmido informador para controlar la reparación de roturas de la hebra doble, ya fuera mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o por recombinación homóloga (HR). El plásmido contenía GFP con un intrón y flanqueando las secuencias eGFP hay secuencias RFP 5' y 3', así como sitios de homología (Figura 23). La reducción de la fluorescencia de eGFP usando este plásmido informador era una indicación de NHEJ, en donde se había reparado de forma imperfecta mediante NHEJ una rotura de la hebra doble mediada por Cas9/ARN en las dianas C o D, alterando de este modo la secuencia codificadora de eGFP. El direccionamiento hacia las dianas intró­ nicas A y B y la reparación mediante NHEJ probablemente no da lugar a una reducción de la fluorescencia de eGFP porque las mutaciones inducidas por NHEJ generalmente delecionan o insertan <20 bps y, por lo tanto, no afectarán a las regiones que codifican eGFP o a las uniones en sitios de empalme. La aparición de fluorescencia de RFP, por otro lado, era una indicación de HR, en donde la rotura de la hebra doble mediada por Cas9/ARN se repara mediante HR usando las secuencias homólogas de RFP indicadas.

El direccionamiento del ARNcr empleaba moléculas de ARN de 42 nucleótidos, como se ha descrito anteriormente, que tenían 22 nucleótidos que son la secuencia de repetición, y 20 nucleótidos (secuencia espaciadora) son para la diana específica. Como se ha descrito anteriormente, el ADN diana necesita el motivo de S. thermophilus o pA m que es "NGGNG", corriente abajo del protoespaciador en la diana. GFP no se había "modificado genéticamente" para contener ese motivo PAM; varias secuencias diana dentro de eGFP se presentan de forma natural con la secuencia PAM y los ARNcrs se diseñaron para que se dirigieran a las secuencias de espaciadores adyacentes. RFP era un marcador de la recombinación homóloga después de que Cas9/ARN creara una rotura de la hebra doble en eGFP.

La Figura 28A muestra la estructura artificial de un gen informador para el análisis de la actividad de la proteína Cas9 en células eucariotas in vivo. La secuencia del intrón contiene tres sitios diana de cas9 (A, E, B); el gen GFP contiene dos (C, D) sitios diana de Cas9. El gen RFP se divide en la posición Y196, en donde se anula la fluorescencia de RFP. La Figura 28B muestra que se observa fluorescencia de g Fp después del procesamiento del intrón in vivo. La Figura 28C muestra que las roturas del ADNds facilitadas por el complejo Cas9/ARNcr, en cualquiera de los sitios diana de nucleasa mencionados anteriormente, pueden inducir HR, dando como resultado el reensamblamiento del gen RFP y la aparición de fluorescencia RFP. Las Figuras 28D y E muestran que las roturas del ADNds facilitadas por el complejo Cas9/ARNcr, en cualquiera de los sitios diana de nucleasa mencionados anteriormente, pueden inducir NHEJ. Las mutaciones en la secuencia del gen GFP darán como resultado una pérdida o disminución de la fluorescencia de GFP; las mutaciones en el intrón puede que no afecten a la fluorescencia de GFP, sin embargo, en otros casos pueden producir un ARN mensajero maduro con secuencias de intrón empalmadas incorrectamente y provocar una pérdida o disminución de la fluorescencia de GFP.

La proteína Cas9 de S. thermophilus, purificada a partir de E. coli, formaba un complejo con ARNtracr transcrito in vitro y ARNcr sintético no modificado dirigido a la secuencia A (intrónica) o la secuencia C (codificadora) de eGFP. Para la transfección, los complejos Cas9/ARN (ya sea dirigidos a A o a C) se incubaron con el reactivo de transfección TurboFECT y el ADN plasmídico informador también se incubó con TurboFECT en tubos separados y ambos se aña­ dieron a las células CHO-K1. El porcentaje de células positivas para eGFP se determinó por citometría de flujo. Como se muestra en las Figuras 24 y 29, cuando las células se transfectaban con el plásmido informador solo o con el plásmido informador con proteína Cas9 sola, el porcentaje de células positivas para GFP era de aproximadamente un 40-50%, lo que es indicativo de la eficacia global de la transfección. Sin embargo, cuando los complejos Cas9/ARN que se dirigían a la secuencia C de eGFP, se añadían a las células junto con el plásmido informador, el porcentaje de células positivas para eGFP se reducía a aproximadamente un 15%. Esta disminución de las células positivas para eGFP se observaba solo con los complejos Cas9/ARN dirigidos a la secuencia C y no había una disminución signifi­ cativa en las células positivas para eGFP observadas con los complejos Cas9/ARN dirigidos a la secuencia A o con un ARN no específico. Este resultado indicaba que Cas9/ARN que se dirigía a la secuencia C de eGFP daba como resultado una edición génica de eGFP mediante la introducción de una rotura de la hebra doble y una corrección imperfecta mediante NHEJ, creando una deleción en la secuencia codificadora de eGFP.

Además de analizar el porcentaje de células positivas para eGFP, las células transfectadas también se visualizaron mediante microscopía fluorescente para controlar la aparición de células positivas para RFP, una indicación de repa­ ración mediante h R de la rotura de la hebra doble mediada por Cas9, en lugar de mediante NHEJ. Como se observa en la Figura 25, se observa RFP en algunas células después de la transfección con el plásmido informador y los complejos Cas9/ARN dirigidos a la secuencia C de eGFP, lo que sugiere una reparación de la rotura de la hebra doble mediante HR.

Ejemplo 8

Los complejos Cas9/ARN preparados empleando ARNtracrs y ARNcrs sintéticos no modificados son funcionales in vitro

Los experimentos descritos en el Ejemplo 7 anterior empleaban complejos Cas9/ARN que comprendían Cas9 purifi­ cada, ARNcrs sintéticos y ARNtracr transcrito in vitro. Para determinar si los complejos Cas9/ARN eran funcionales cuando se preparaban usando componentes de ARN totalmente sintéticos (ARNcr y ARNtracr), se sintetizaron ARN­ tracrs sin modificar de S. thermophilus (tanto la versión de 89 meros endógena como una versión más corta de 74 meros que se esperaba que conservara la funcionalidad). Los ARNcrs sintéticos sin modificar se generaron contra la diana E (véanse las Figuras 26 y 30) localizada dentro del intrón de eGFP en el plásmido informador descrito anteriormente y se generaron complejos Cas9/ARN (ARNcr y ARNtracr). Para analizar estos complejos, el plásmido informador utilizado anteriormente se incubó con los complejos in vitro y se realizó un seguimiento de la restricción mediante electroforesis en gel.

Como se observa en la Figura 27, los complejos Cas9/ARN compuestos por ARNs totalmente sintéticos eran igualmente funcionales en el ensayo in vitro que los complejos Cas9/ARN compuestos por ARNcr sintético y ARNtracr transcrito in vitro.

Secuencias

SEQ ID NO: 1

Cepa WT_Cas9_S. thermophilus DGCC7710 CRISPR3-Cas

Una letra:

mlfiikciiisinldfsnkekcmtkpysigldigtnsvgwavitdnykvpskkmkvlgntskkyikknllgvllfdsgitaegrrlkrtarrrytrrr nrilylqeifstematlddaffqrlddsflvpddkrdskypifgnlveekvyhdefptiyhlrkyladstkkadlrlvylalahmikyrghfliegef nsknndiqknfqdfldtynaifesdlslenskqleeivkdkisklekkdrilklfpgeknsgifseflklivgnqadfrkcfnldekaslhfskesy dedletllgyigddysdvflkakklydaillsgfltvtdneteaplssamikrynehkedlallkeyimislktynevfkddtkngyagyidgktn qedfyvylknllaefegadyflekidredflrkqrtfdngsipyqihlqemraildkqakfypflaknkeriekiltfripyyvgplargnsdfaws irkmekitpwnfedvidkessaeafinrmtsfdlylpeekvlpkhsllyetfnvyneltkvrfiaesmrdyqfldskqkkdivrlyfkdkrkvtd kdiieylhaiygydgielkgiekqfhsslstyhdllniindkeflddssneaiieeiihtltifedremikqrlskfenifdksvlkklsrrhytgwgkl saklingirdeksgntildyliddgisnmfmqlihddalsfkkkiqkaqiigdedkgnikevvkslpgspaikkgilqsikivdelvkvmggrk pesiwemarenqytnqgksnsqqrlkrlekslkelgskilkenipaklskidnnalqndrlylyylqngkdmytgddldidrlsnydidhiip qaflkdnsidnkvlvssasnrgksddfpslewkkrktfwyqllksklisqrkfdnltkaerggllpedkagfiqrqlvetrqitkhvarlldekfn nkkdennravrtvkiitlkstlvsqfrkdfelykvreindfhhahdaylnaviasallkkypklepefvygdypkynsfrerksatekvyfysni mnifkksisladgrvierplievneetgesvwnkesdlatvrrvlsypqvnvvkkveeqnhgldrgkpkglfnanlsskpkpnsnenlvgak eyldpkkyggyagisnsfavlvkgtiekgakkkitnvlefqgisildrinyTkdklnfllekgykdieliielpkyslfelsdgsrrmlasilstnnkr geihkgnqiflsqkfVkllyhaknsntinenhrkyvenhkkefeelfyyilefnenyvgakkiigkllnsafqswqnhsidelcssfigptgser kglfeltsrgsaadfeflgvkipryrdytpssllkdatlihqsvtglyetridlaklgeg

Tres letras:

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SEQ ID NO: 2

Mutante D31A

Una letra:

mlfiikciiisinldfsnkekcmtkpysiglaigtnsvgwavitdnykvpskkmkvlgntskkyikknllgvllfdsgitaegrrlkrtarrrytrrr nrilylqeifstematlddaffqrlddsflvpddkrdskypifgnlveekvyhdefptiyhlrkyladstkkadlrlvylalahmikyrghfliegef nsknndiqknfqdfldtynaifesdlslenskqleeivkdkisklekkdrilklfpgeknsgifseflklivgnqadfrkcfnldekaslhfskesy dedletllgyigddysdvflkakklydaillsgfltvtdneteaplssamikrynehkedlallkeyimislktynevfkddtkngyagyidgktn qedfyvylknllaefegadyflekidredflrkqrtfdngsipyqihlqemraildkqakfypflaknkeriekiltfripyyvgplargnsdfaws irkmekitpwnfedvidkessaeafinrmtsfdlylpeekvlpkhsllyetfnvyneltkvrfiaesmrdyqfldskqkkdivrlyfkdkrkvtd kdiieylhaiygydgielkgiekqfiisslstyhdllniindkeflddssneaiieeiihtltifedremikqrlskfenifdksvlkklsrrhytgwgkl saklingirdeksgntildyliddgisnmñnqlihddalsfkkkiqkaqiigdedkgnikevvkslpgspaikkgilqsikivdelvkvmggrk pesiwemarenqytnqgksnsqqrlkrlekslkelgskilkenipaklskidnnalqndrlylyylqngkdmytgddldidrlsnydidhiip qaflkdnsidnkvlvssasnrgksddipslewkkrktfwyqllksklisqrkfdnltkaerggllpedkagñqrqlvetrqitkhvarlldekfn nkkdennravrtvkiitlkstlvsqfrkdfelykvreindfhhahdaylnaviasallkkypklepefvygdypkynsfrerksatekvyfysni mnifkksisladgrvierplievneetgesvwnkesdlatvrrvlsypqvnvvkkveeqnhgldrgkpkglfnanlsskpkpnsnenlvgak eyldpkkyggyagisnsfavlvkgtiekgakkkitnvlefqgisildrinyrkdklnfllekgykdieliielpkyslfelsdgsmnlasilstnnkr geihkgnqiflsqkfVkllyhakrisntinenhrkyvenhkkefeelfyyilefnenyvgakkngkllnsafqswqnhsidelcssfigptgser kglfeltsrgsaadfeflgvkipryrdytpssllkdatlihqsvtglyetridlaklgeg

Tres letras:

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SEQ ID NO: 3

Mutante N891A

Una letra:

mlfiikciiisinldfsnkekcmtkpysigldigtiisvgwavitdriykvpskkmkvlgntskkyikknllgvllfdsgitaegrrlkrtarrrytrrr nnlylqeifstematlddaffqrlddsflvpddkrdskypifgnlveekvyhdefptiyhlrkyladstkkadlrlvylalahmikyrghfliegef nsknndiqknfqdfldtynaifesdlslenskqleeivkdkisklekkdrilklfpgeknsgifseflklivgnqadfrkcfnldekaslhfskesy dedletllgyigddysdvflkakklydaillsgfltvtdneteaplssamikrynehkedlallkeyimislktynevfkddtkngyagyidgktn qedfyvylknllaefegadyflekidredflrkqrtfdngsipyqihlqemraildkqakfypflaknkeriekiltfripyyvgplargnsdfaws irkmekitpwnfedvidkessaeafmrmtsfdlylpeekvlpkhsllyetfnvyneltkvrfiaesmrdyqfldskqkkdivrlyfkdkrkvtd kdiicylhaiygydgiclkgiekqfnsslstyhdllniindkeflddssneaiieeiihtlüfedremikqrlskfenifdksvlkklsrrhytgwgkl saklingirdeksgntikiyliddgisnmfmqlihddalsfkkkiqkaqiigdedkgnikevvkslpgspaikkgilqsikivdelvkvmggrk pesiwemarenqytiiqgksnsqqrlkrlekslkelgskilkenipaklskidniialqndrlylyylqngkdmytgddldidrlsnydidhiip qaflkdnsidnkvlvssasargksddfpslevvkkrktfwyqllksklisqrkfdnltkaerggllpedkagfiqrqlvetrqitkhvarlldekfn nkkdennravrtvkiitlkstlvsqfrkdfelykvreindfhhahdaylnaviasallkkypklepefvygdypkynsfrerksatekvyfysni mnifkksisladgrvierplievneetgesvwnkesdlatvrrvlsypqvnvvkkveeqnhgldrgkpkglfnanlsskpkpnsnenlvgak eyldpkkyggyagisiisfavlvkgtickgakkkitnvlefqgisildrinyrkdklnfllekgykdicliielpkyslfelsdgsrrmlasilstiinkr geihkgnqiflsqkfvkllyhakrisntinenhrkyvenhkkefeelfyyilefnenyvgakkngkllnsafqswqnhsidelcssfígptgser kglfeltsrgsaadfeflgvkipryrdytpssllkdatlihqsvtglyetridlaklgeg

Tres letras:

MetLeuPheAsnLysCysIlellelleSerlleAsnLeuAspPheSerAsnLysGluLys

CysMetThrLysProTyrSerlleGlyLeuAspIleGlyThrAsnSerValGlyTrpAla ValIleThrAspAsnTyrLysValProSerLysLysMetLysValLeuGlyAsnThrSer LysLysTyrlleLysLysAsnLeuLeuGlyValLeuLeuPheAspSerGlylleThrAla GluGlyArgArgLeuLysArgThrAlaArgArgArgTyrThrArgArgArgAsnArglle LeuTyrLeuGlnGluIlePheSerThrGluMetAlaThrLeuAspAspAlaPhePheGln ArgLeuAspAspSerPheLeuValProAspAspLysArgAspSerLysTyrProIlePlie GlyAsnLeuValGluGluLysValTyrHisAspGluPheProThrlleTyrlIisLeuArg LysTyrLeuAlaAspSerThrLysLysAlaAspLeuArgLeuValTyrLeuAlaLeuAla HisMetlleLysTyrArgGlyHisPheLeuIleGliiGlyGIuPheAsiiSerLysAsnAsn AspIleGlnLysAsnPheGlnAspPheLeuAspThrTyrAsnAlallePheGluSerAsp LeuSerLeuGluAsnSerLysGlnLeuGluGluIleValLysAspLysIleSerLysLeu GluLysLysAspArglleLeuLysLeuPheProGlyGluLysAsnSerGlyllePheSer GluPheLeuLysLeuIleValGlyAsnGlnAlaAspPheArgLysCysPheAsnLeuAsp GluLysAlaSerLeuHisPheSerLysGluSerTyrAspGluAspLeuGluThrLeuLeu GlyTyrlleGlyAspAspTyrSerAspValPheLeuLysAlaLysLysLeuTyrAspAla IleLeuLeuSerGlyPheLeuThrValThrAspAsnGluThrGluAlaProLeiiSerSer AlaMetlleLysArgTyrAsnGluHisLysGluAspLeuAlaLeuLeuLysGluTyrlle ArgAsnlleSerLeuLysThrTyrAsnGluValPheLysAspAspThrLysAsnGlyTyr AlaGly T yrlleAspGlyLy sThrAsnGlnGlu AspPheT yrV alTy rLeuLy sAsnLeu LeuAlaGluPheGluGly AlaAspTyrPheLeuGhiLy si le Asp ArgGlu AspPheLeu ArgLysGlnArgThrPheAspAsnGlySerlleProTyrGlnlleHisLeuGlnGluMel ArgAlalleLeuAspLysGlnAlaLysPheTyrProPheLeuAlaLysAsnLysGluArg I leGluLy si leLeuThrPlie Ar gl leProT yrT y rValGly ProLeuAla Ar gGly Asn SerAspPheAlaTrpSerlleArgLysArgAsnGluLysIIeTlirProTrpAsnPheGlu AspValIleAspLysGluSerSerAlaGluAlaPhelleAsnArgMetThrSerPheAsp LeuTyrLeuProGluGliiLysValLeuProLysHisSerLeuLeuTyrGluThrPheAsii ValTyrAsnGluLeuThrLysValArgPhelleAlaGluSerMetArgAspTyrGlnPhe LeuAspSerLysGlnLysLysAspIleValArgLeuTyrPlieLysAspLysArgLysVal T h r Asp Ly s Asp 11 e 11 eG luT yrLeuHisAlalleTyrGlyT yrAspGlylleGluLeu LysGlylleGluLysGlnPheAsnSerSerLeuSerThrTyrHisAspLeiiLeuAsnlle IleAsnAspLysGluPheLeuAspAspSerSerAsnGluAlallelleGluGluIlelle HisThrLeuThrllePheGluAspArgGluMetlleLysGlnArgLeuSerLysPheGlu AsnllePheAspLysSerValLeuLysLysLeuSerArgArgHisTyrTlirGlyTrpGly LysLeuSerAlaLysLeuIleAsnGlylleArgAspGluLysSerGlyAsnThrlleLeu AspTyrLeuIleAspAspGlylleSerAsiiArgAsnPheMetGlnLeuIleHisAspAsp AlaLeuSerPheLysLysLysIleGInLysAiaGlnllelleGlyAspGluAspLysGly AsnlleLysGluValValLysSerLeuProGlySerProAIalleLysLysGlylleLeu GlnSerlleLysIleValAspGluLeuValLysValMetGlyGlyArgLysProGluSer IleValValGluMetAlaArgGluAsnGlnTyrThrAsnGlnGlyLysSerAsnSerGln GlnArgLeuLysArgLeuGluLysSerLeuLysGluLeuGlySerLysIleLeuLysGlu AsnlleProAlaLysLeuSerLysIleAspAsnAsnAlaLeuGlnAsnAspArgLeuTyr LeuTyrTyrLeuGliiAsnGlyLysAspMetTyrTlirGlyAspAspLeiiAspIleAspArg LeuSerAsnTyrAspIleAspHisIlelleProGliiAlaPheLeuLysAspAsnSerlle AspAsnLysValLeuValSerSerAlaSerAlaArgGlyLysSerAspAspPheProSer LeuGluValValLysLysArgLysThrPheTrpTyrGlnLeuLeuLysSerLysLeuIle SerGlnArgLysPheAspAsnLeuThrLysAlaGluArgGlyGlyLeuLeuProGluAsp LysAlaGlyPhelleGlnArgGlnLeuValGluThrArgGlnlleThrLysHisValAla ArgLeuLeuAspGluLysPheAsnAsnLysLysAspGluAsnAsnArgAlaValArgThr ValLysIlelleThrLeuLysSerThrLeuValSerGlnPheArgLysAspPheGluLeu TyrLysValArgGluIleAsnAspPlieHisHisAlaHisAspAlaTyrLeuAsnAlaVal IleAlaSerAlaLeuLeuLysLysTyrProLysLeuGluProGluPheValTyrGlyAsp T yrProLysT yrAsnSerPheArgGluArgLy sSerAlaThrGluLys ValT yrPheT yr SerAsnlleMetAsnllePheLysLysSerlleSerLeuAlaAspGlyArgValIleGlu ArgProLeuIleGluValAsnGluGliiThrGlyGluSerValTrpAsnLysGliiSerAsp LeuAlaThrValArgArgValLeuSerTyrProGlnValAsnValValLysLysValGlu GluGlnAsnHisGlyLeuAspArgGlyLysProLysGlyLeuPheAsnAlaAsnLeuSer SerLysProLysProAsnSerAsnGluAsnLeuValGlyAlaLysGluTyrLeuAspPro LysLysTyrGlyGlyTyrAlaGlylleSerAsnSerPheAlaValLeuValLysGlyThr IleGluLysGlyAlaLysLysLysIleThrAsnValLeuGluPheGlnGlylleSerlle LeuAspArglleAsnTyrArgLysAspLysLeuAsnPheLeuLeuGluLysGlyTyrLys AspIleGluLeuIlelleGluLeuProLysTyrSerLeuPheGluLeuSerAspGlySer ArgArgMetLeuAlaSerlleLeuSerTlirAsiiAsnLysArgGlyGluIleHisLysGly AsnGlnllePheLeuSerGlnLysPheValLysLeuLeuTyrHisAlaLysArglleSer AsnThrlleAsnGluAsnHisArgLysTyrValGluAsnHisLysLysGluPheGluGlu LeuPheTyrTyrlleLeuGluPheAsnGlaAsnTyrValGlyAlaLysLysAsnGlyLys LeuLeuAsnSerAlaPheGlnSerTrpGlnAsnHisSerlleAspGluLeuCysSerSer PhelleGlyProThrGlySerGluArgLysGlyLeuPheGluLeuThrSerArgGlySer AlaAlaAspPheGluPheLeuGlyValLysIleProArgTyrArgAspTyrThrProSer SerLeuLeuLysAspAlaThrLeuIleHisGlnSerValThrGlyLeuTyrGluThrArg IleAspLeuAlaLysLeuGlyGluGly

SEQ ID NO: 4

Mutante H868A

Una letra

mlfhkciiisinldfsnkekcmtkpysigldigtnsvgwavitdnykvpskkmkvlgntskkyikknllgvllfdsgitaegrrlkrtarrrytrrr nrilylqdfstematlddaffqrlddsflvpddkrdskypifgnlveekvyhdefptiyhlrkyladstkkadlrlvylalahmikyrghfliegef nsknndiqknfqdfldtynaifesdlslenskqleeivkdkisklekkdrilklfpgeknsgifseflklivgnqadfrkcfnldekaslhfskesy dedletllgyigddysdvflkakklydaillsgfltvtdneteaplssamikrynehkedlallkeyimislktynevfkddtkngyagyidgktn qedfyvylknllaefegadyflekidredflrkqrtfdngsipyqihlqemraildkqakfypflaknkeriekiltfripyyvgplargnsdfaws irkmekitpwnfedvidkessaeafinrmtsfdlylpeekvlpkhsllyetfnvyneltkvrfiaesmrdyqfldskqkkdivrlyfkdkrkvtd k d i ¡ ey lhaiygydgielkgi ekqfhsslstyhdlln i indkeflddssnea i i eci i htlt ¡ fedrem i kqrlskfeni fdksvlkklsrrhytgwgkl sak 1 ingirdeksgntildyliddgisnrnfmq 1 i hddalsfkkkiqkaqiigdedkgnikevvkslpgspa i kkgilqsik i vdelvkvmggrk pesiwemarenqytnqgksnsqqrlkrlekslkelgskilkenipaklskidnnalqndrlylyylqngkdmytgddldidrlsnydidaiipq aflkdnsidnkvlvssasnrgksddfpslevvkkrktfwyqllksklisqrkfdnltkaerggllpedkagfíqrqlvetrqitkhvarlldekfhn kkdennravrtvkiitlkstlvsqfrkdfelykvieindfhhahdaylnaviasallkkypklepefVygdypkynsfrerksatekvyfysnim niíkksisladgrvierplievneetgesvwnkesdlatvrrvlsypqvnvvkkveeqnhgldrgkpkglfnanlsskpkpnsnenlvgakey ldpkkyggyagisnsfavlvkgtickgakkkitnvlefqgisildrinyrkdklnfllekgykdieliielpkyslfelsdgsrrmlasilstnnkrge ihkgnqiflsqkfvkllyhakrisntinenhrkyvenhkkefeelfyyilefhenyvgakkngkllnsafqswqnhsidelcssfigptgserkgl feltsrgsaadfeflgvkipryrdytpssllkdatlihqsvtglyetridlaklgeg

Tres letras:

MetLeuPheAsnLysCysIlellelleSerlleAsnLeuAspPheSerAsnLysGluLys

CysMetThrLysProTyrSerlleGlyLeuAspIleGlyThrAsnSerValGlyTrpAla

ValIleThrAspAsnTyrLysValProSerLysLysMetLysValLeuGlyAsnThrSer

LysLysTyrlleLysLysAsnLeuLeuGlyValLeuLeuPheAspSerGlylleThrAla

GluGlyArgArgLeuLysArgThrAlaArgArgArgTyrThrArgArgArgAsnArglle

LeuTyrLeuGlnGluIlePheSerThrGluMetAlaThrLeuAspAspAlaPhePheGln

ArgLeuAspAspSerPheLeuValProAspAspLysArgAspSerLysTyrProIlePhe

GlyAsnLeuValGluGluLysValTyrHisAspGluPheProThrlleTyrHisLeuArg

LysTyrLeuAlaAspSerThrLysLysAlaAspLeuArgLeuValTyrLeuAlaLeuAla

HisMetlleLysTyrArgGlyHisPheLeulleGluGlyGluPheAsnSerLysAsnAsn

AspIleGlnLysAsnPheGlnAspPheLeuAspThrTyrAsnAlallePheGluSerAsp

LeuSerLeuGluAsnSerLysGlnLeuGluGluIleValLysAspLysIleSerLysLeu

GluLysLysAspArglleLeuLysLeuPheProGlyGluLysAsnSerGlyllePheSer

GluPheLeuLysLeuIleValGlyAsnGlnAlaAspPheArgLysCysPheAsnLeuAsp

GluLysAlaSerLeuHisPheSerLysGluSerTyrAspGluAspLeuGluThrLeuLeu GlyTyrlleGlyAspAspTyrSerAspValPheLeuLysAlaLysLysLeuTyrAspAla IleLeuLeuSerGlyPheLeuThrValThrAspAsnGluThrGluAlaProLeuSerSer AlaMetlleLysArgTyrAsnGluHisLysGluAspLeiiAlaLeuLeuLysGluTyrlle ArgAsnlleSerLeuLysThrTyrAsnGluValPheLysAspAspThrLysAsnGlyTyr AlaGlyTyrlleAspGlyLysThrAsnGlnGluAspPheTyrValTyrLeuLysAsnLeu LeuAlaGluPheGhiGlyAlaAspTyrPheLeuGluLysIleAspArgGluAspPheLeu ArgLysGlnArgThrPheAspAsnGlySerlleProTyrGlnlleHisLeuGlnGluMet ArgAlalleLeuAspLysGlnAlaLysPheTyrProPheLeuAlaLysAsnLysGluArg IleGluLysIleLeuThrPheArglleProTyrTyrValGlyProLeuAlaArgGlyAsn Ser AspPheAlaT rpSerlleArgLys ArgAsnGluLysIleThrProT rpAsnPheGlu AspValIleAspLysGluSerSerAlaGluAlaPhelleAsnArgMetThrSerPheAsp LeuTyrLeuProGluGluLysValLeuProLysHisSerLeuLeuTyrGluThrPheAsn ValT yrAsnGluLeuThrLys Val ArgPhelleAlaGluSerMetArgAspT yrGlnPhe LeuAspSerLysGlnLysLysAspIleValArgLeuTyrPheLysAspLysArgLysVal ThrAspLysAspIlelleGluTyrLeuHisAlalleTyrGlyTyrAspGlylleGluLeu LysGlylleGluLysGlnPheAsnSerSerLeuSerThrTyrHisAspLeuLeuAsnlle IleAsnAspLysGluPheLeuAspAspSerSerAsnGluAlallelleGluGluIlelle HisThrLeuThrllePheGluAspArgGluMetlleLysGlnArgLeuSerLysPheGlu AsnllePheAspLysSerValLeuLysLysLeuSerArgArgHi sTyrThrGlyTrpGly LysLeuSerAlaLysLeuIleAsnGlylleArgAspGluLysSerGlyAsnThrlleLeu AspTyrLeulleAspAspGlylleSerAsnArgAsnPheMetGInLeulleHisAspAsp AlaLeuSerPheLysLysLysIleGlnLysAlaGlnllelleGlyAspGluAspLysGly AsnlleLysGluValValLysSerLeuProGlySerProAlalleLysLysGlylleLeu GlnSerlleLysIleValAspGluLeuValLysValMetGlyGlyArgLysProGluSer IleValValGluMetAlaArgGliiAsnGliiTyrTlirAsnGlnGlyLysSerAsnSerGln GlnArgLeuLysArgLeuGluLysSerLeuLysGluLeuGlySerLysIleLeuLysGlu AsnlleProAlaLysLeuSerLysIleAspAsnAsnAlaLeuGlnAsnAspArgLeuTyr LeuTyrTyrLeuGlnAsnGlyLysAspMetTyrThrGlyAspAspLeuAspIleAspArg LeuSerAsnTyrAspIleAspAlallelleProGlnAlaPheLeuLysAspAsnSerlle AspAsnLysValLeuValSerSerAlaSerAsnArgGlyLysSerAspAspPheProSer LeuGluValValLysLysArgLysThrPheTrpTyrGlnLeuLeuLysSerLysLeuIle SerGlnArgLysPheAspAsnLeuThrLysAlaGluArgGlyGlyLeuLeuProGluAsp LysAlaGlyPhelleGlnArgGlnLeuValGluThrArgGlnlleThrLysHisValAla ArgLeuLeuAspGluLysPheAsnAsnLysLysAspGhiAsnAsnArgAlaValArgTlir ValLysIlelleThrLeuLysSerThrLeuValSerGlnPheArgLysAspPheGluLeu TyrLysValArgGluIleAsnAspPheHisHisAlaHisAspAlaTyrLeuAsnAlaVal I leAlaSerAlaLeuLeuLysLy sT yrProLy sLeuGluProGluPhe V alT yrGly Asp TyrProLysTyrAsnSerPheArgGluArgLysSerAlaThrGluLysValTyrPheTyr SerAsnlleMetAsnllePheLysLysSerlleSerLeuAlaAspGlyArgValIleGlu ArgProLeuIleGluValAsnGluGluThrGlyGluSerValTrpAsnLysGluSerAsp LeuAlaThrValArgArgValLeuSerTyrProGlnValAsnValValLysLysValGlu GluGlnAsnHisGlyLeuAspArgGlyLysProLysGlyLeuPheAsnAlaAsnLeuSer SerLysProLysProAsnSerAsnGluAsnLeuValGlyAlaLysGluTyrLeuAspPro I.ysLysTyrGlyGlyTyrAlaGlylleSerAsnSerPheAlaValLeuValLysGlyThr IleGluLysGlyAlaLysLysLysIleTlirAsnValLeuGliiPheGlnGlylleSerlle LeuAspArglleAsnTyrArgLysAspLysLeuAsnPheLeuLeuGluLysGlyTyrLys AspIleGluLeuIlelleGluLeuPioLysTyrSerLeuPlieGliiLeiiSerAspGlySer ArgArgMetLeuAlaSerlleLeuSerThrAsnAsnLysArgGlyGluIleHisLysGly AsnGlnllePheLeuSerGlnLysPheValLysLeuLeuTyrHisAlaLysArglleSer AsnThrlleAsnGluAsnHisArgLysTyrValGluAsnHisLysLysGluPheGluGlu LeuPheTyrTyrlleLeuGluPheAsnGluAsnTyrValGlyAlaLysLysAsnGlyLys I, euLeuAsn SerAlaPheGln SerT rpGln AsnH is SerlleAspGluLeuCy sSerSer PhelleGlyProThrGlySerGluArgLysGlyLeuPheGluLeuThrSerArgGlySer AlaAlaAspPheGluPheLeuGlyValLysIleProArgTyrArgAspTyrThrProSer SerLeuLeuLysAspAlaThrLeuIleHisGlnSerValThrGlyLeuTyrGliiThrArg IleAspLeuAlaLysLeuGlyGluGly

SEQ ID NO: 5

ARNtra-cr, inmaduro (102 nt): uaauaauaamiguggimugaaaccaimcgaaacaacacagcgagimaaaauaaggcimaguccguacucaacmigaaaagguggcac cgauucggugiramra

SEQ ID NO: 6

ARNtracr maduro de 78 nt: gggcgaaacaacacagcgaguuaaaauaaggcuuaguccguacucaacuugaaaagguggcaccgauucgguguuuuu Variantes más cortas: gggcgaaacaacacagcgaguuaaaauaaggcuuaguccguacucaacuugaaaagguggcaccgauucggug (SEQ ID NO: 44) gggcgaaacaacacagcgaguuaaaauaaggcuuaguccguacucaacuugaaaagguggcaccgauu (SEQ ID NO: 45) gggcgaaacaacacagcgaguuaaaauaaggcuuaguccguacucaacuugaaaagguggcac(SEQ ID NO: 46) gggcgaaacaacacagcgaguuaaaauaaggcuuaguccguacucaacuugaaaaggu (SEQ ID NO: 47) gggcgaaacaacacagcgaguuaaaauaaggcuuaguccguacucaacuugaa (SEQ ID NO: 48) gggcgaaacaacacagcgaguuaaaauaaggcuuaguccguacucaac(SEQ ID NO: 49)

SEQ ID NO: 7

ARNcr de 42 nt procedente del espaciador 1:

5'-CGCUAAAGAGGAAGAGGACAGUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'

SEQ ID NO: 8

pre-ARNcr de 150 nt

5 ^{' -}g g g u a g a a a a g a u a u c c u a c g a g g u u u u a g a g c u g u g u u g u u u c g a a u g g u u c c a a a a c a a a u u c u a a a c g c u a a a g a g g a a g a g g a c a g u u u u a g a g c u g u g u u g u u u c g a a u g g u u c c a a a a c u a c u g c u g u a u u a g c u u g g u u g u u g - 3 '

SEQ ID NO: 9

ARNcrl

5 ^{' -}g g g u a g a a a a g a u a u c c u a c g a g g u u u u a g a g c u g u g u u g u u u c g a a u g g u u c c a a a a c T G T C A T G A T A A T A A T G G T T T C T T A G A C G T C g u u u u ag a g cu g u g u u g u u u cg aa u g g u u cca aaa cu ac u g cu g u a u u a g c u u g g u u g u u g - 3 '

SEQ ID NO: 10

ARNcr2

5 ^{' -}g g g u a g a a a a g a u a u c c u a c g a g g u u u u a g a g c u g u g u u g u u u c g a a u g g u u c c a a a a c a c g a g c c g g a a g c a t a a a g t g t a a a g c c t g g u u u u a g a g c u g u g u u g u u u c g a a u g g u u c c a a a a c u a c u g c u g u a u u a g c u u g g u u g u u g - 3 '

SEQ ID NO: 11

ARN CRISPR anti-fago A

5 ^{' -}g g g u a g a a a a g a u a u c c u a c g a g g u u u u a g a g c u g u g u u g u u u c g a a u g g u u c c a a a a c t c a a g g g a g a a t a g a g g c t c t c g t t g c a t t g u u u u a g a g c u g u g u u g u u u c g a a u g g u u c c a a a a c u a c u g c u g u a u u a g c u u g g u u g u u g - 3 '

SEQ ID NO: 12

ARN CRISPR anti E. coli

5 ^{' -}g g g u a g a a a a g a u a u c c u a c g a g g u u u u a g a g c u g u g u u g u u u c g a a u g g u u c c a a a a c c g g g a g g g a a g c t g c a t g a t g c g a t g t t a t g u u u u a g a g c u g u g u u g u u u c g a a u g g u u c c a a a a c u a c u g c u g u a u u a g c u u g g u u g u u g - 3 '

SEQ ID NO: 13

ARNcr-HS1

5'-GCUCCCGGGGCUCGAUGAAGGUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3'

SEQ ID NO: 14

ARNcr-HS2

UGAAUCGUGAAAUCUGCUCAGUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG

La solicitud contiene una Lista de Secuencias que se ha presentado en formato ASCII y se incorpora a este documento como referencia en su totalidad. La copia ASCII, creada el 20 de marzo de 2013, se denomina 078981_6_SL.txt y tiene un tamaño de 64,4 kilobytes.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro para la modificación específica de sitio de una molécula de ADN diana, comprendiendo el procedimiento poner en contacto, en condiciones adecuadas,

una molécula de ADN diana; y

una endonucleasa de ADN guiada por ARN que comprende al menos una secuencia de ARN y al menos uno de un motivo de sitio activo RuvC y un motivo de sitio activo HNH;

en el que

la endonucleasa de ADN guiada por ARN es un complejo Cas9-ARNcr

comprendiendo dicho complejo Cas9-ARNcr una Cas9, ARNcr y ARNtracr

para dar como resultado la molécula de ADN diana modificada en una región que está determinada por la unión complementaria del ARNcr a la molécula de ADN diana,

comprendiendo el procedimiento adicionalmente ensamblar el complejo polipéptido-polirribonucleótidos in vitro incubando dichos componentes del complejo en condiciones adecuadas para el ensamblaje del complejo, en el que el ADN diana es bicatenario o monocatenario, y en el que un ADN diana bicatenario contiene un motivo adyacente al protoespaciador.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el complejo comprende

a) un polipéptido que tiene al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1,

b) un primer ARNcr polirribonucleotídico que comprende una región 3' y una región 5', en la que la región 3' comprende al menos 22 nucleótidos de una repetición presente en un locus CRISPR y la región 5' comprende al menos 20 nucleótidos de una secuencia espaciadora inmediatamente corriente abajo de la repetición en el locus CRISPR, y

c) un segundo ARNtracr polirribonucleotídico que comprende una región 5' y 3' en las que al menos una porción de la región 5' es complementaria a la región 3' del ARNcr.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la región 5' del ARNtracr es al menos de 22 nucleótidos y es complementaria a la región 3' de 22 nucleótidos del ARNcr.

4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que los componentes del complejo se aíslan de un microorganismo modificado genéticamente.

5. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el polipéptido se aísla de una Escherichia coli modificada genéticamente.

6. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el polipéptido se produce por un procedimiento seleccionado de tecnología de ADN recombinante o síntesis química.

7. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el polipéptido se expresa como un polipéptido de fusión que incluye al menos una secuencia adicional de aminoácidos.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la secuencia adicional se utiliza para la purificación del polipéptido de fusión mediante cromatografía de afinidad.

9. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el polipéptido contiene una mutación puntual en el motivo de sitio activo RuvC.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la mutación puntual es D31A.

11. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el polipéptido contiene una mutación puntual en el motivo de sitio activo HNH.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la mutación puntual es N891A.

13. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la primera secuencia polirribonucleotídica (ARNcr) comprende 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3' (SEQ ID NO: 15).

14. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el complejo se genera in vitro, comprendiendo el procedimiento incubar los componentes del complejo en condiciones adecuadas para el ensamblaje del complejo, en el que el complejo comprende el primer polirribonucleótido que tiene una secuencia que comprende 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3' (SEQ ID NO: 15) con cualquier secuencia espaciadora conveniente.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el primer polirribonucleótido se obtiene mediante transcripción in vitro a partir de un fragmento de ADN que contiene una sola unidad de repetición-espaciador-repetición, donde el espaciador tiene cualquier secuencia conveniente, o se sintetiza químicamente.

16. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que los componentes comprenden polipéptido Cas9 (SEQ ID NO: 1), polirribonucleótido ARNtracr (SEQ ID NO: 5) y polirribonucleótido ARNcr (5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUGUGUUGUUUCG-3') (SEQ ID NO: 15) con cualquier secuencia espaciadora conveniente.