JP2019502394A

JP2019502394A - Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅによるＲＮＡ配列切断の特異性を変更する方法、およびそれらの使用

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Publication number: JP2019502394A
Application number: JP2018537846A
Authority: JP
Inventors: ブジニッキ，ヤヌシュ; スコウロネック，クシシュトフ; グロウ，ダヴィド; クルコウスカ，マウゴジャタ
Original assignee: バイオテックイノベーションズエスピー．ゼットオー．オー．
Priority date: 2016-01-22
Filing date: 2017-01-20
Publication date: 2019-01-31
Also published as: PL415883A1; CN108884450A; WO2017125880A1; AU2017208930A1; US20190032035A1; CA3012221A1; EP3405571A1; KR20180100139A

Abstract

本発明の目的は、アミノ酸配列を有するＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅに関し、アミノ酸配列は、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ構造において、アクセプター部分、および、それぞれ、α４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造を形成する、移植可能なα４ヘリックスおよび移植可能なα５ｂ−α６ループを含み、ここで、α４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造を形成する断片は、それぞれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるバチルス・スブチリスからのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの、それぞれ、４６−５２位および８５−９８位のアミノ酸配列断片によって形成されたα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループのそれぞれの構造に構造的に対応しており、ここで、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、基質のリボヌクレオチド配列にのみ依存している、および基質の構造における二次構造の出現から独立している、並びに他の補助タンパク質の存在から独立しているｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、およびＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１や、Ｄ９４Ｒ突然変異を有するＳＥＱＩＤＮＯ：１のバチルス・スブチリスからのＭｉｎｉ−ＩＩＩタンパク質ではない。本発明はまた、キメラＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅを得る方法、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする構築物、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子を有する細胞、ｄｓＲＮＡ切断のためのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの使用の他に、リボヌクレオチド配列にのみ依存しているｄｓＲＮＡ切断の方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明の目的は、アミノ酸配列を有する新規の天然およびキメラのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅに関し、アミノ酸配列は、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ構造において、アクセプター部分、およびα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造を形成する、それぞれ、移植可能なα４ヘリックスおよび移植可能なα５ｂ−α６ループの部分を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、基質のリボヌクレオチド配列にのみ依存している及び基質の構造における二次構造の出現から独立している、並びに他の補助タンパク質とは無関係であるｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、およびＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１や、Ｄ９４Ｒ突然変異を有するＳＥＱＩＤＮＯ：１のバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのＭｉｎｉ−ＩＩＩタンパク質ではない。本発明はまた、キメラＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅを得る方法、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする構築物、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子を有する細胞、ｄｓＲＮＡ切断のためのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの使用の他に、リボヌクレオチド配列のみに依存しているｄｓＲＮＡ切断の方法にも関する。

分子生物学に関する基本ツールの１つは、例えば、遺伝子工学、診断学、医療、および様々な製品を製造および加工するための産業に使用される、明確に定義された活性を有するタンパク質である。そのような酵素の一例は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の特異的配列を認識する且つ切断する、制限酵素とも呼ばれるＤＮＡエンドヌクレアーゼである。

リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）は、ＤＮＡ限定酵素の対応物であり、ＲＮＡ分子のエキソヌクレアーゼ切断またはエンドヌクレアーゼ切断に基づく様々な生化学反応への関与による細胞中のＲＮＡのプロセシングおよび分解に重要な役割を果たす。エキソリボヌクレアーゼは、それらの末端から開始して、配列非依存的な方法でＲＮＡ分子を分解し、一方でエンドリボヌクレアーゼ（ｅｎｄｏＲＮａｓｅｓ）は、一本鎖または二本鎖のＲＮＡ分子（それぞれ、ｓｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ）を内部で切断する。多くのＲＮａｓｅは基質特異性を示すが、それらの標的配列は、通常、頻繁に分子全体の特定の二次および三次の構造の文脈において、ｓｓＲＮＡ中の１つ又は少数のヌクレオチドに限定される。そのような酵素の１つは、中間でＧＧＡＧ配列を切断する、ファージタンパク質ＲｅｇＢである。効率的に切断するために、ＲｅｇＢは、リボソームタンパク質Ｓ１との適切なＲＮＡ二次構造および酵素の相互作用などの、追加の決定因子を必要とする（Ｌｅｂａｒｓ，Ｉ．，ｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，（２００１）２７６，１３２６４−１３２７２、およびＳａｉｄａ，Ｆ．，ｅｔａｌ．，（２００３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，３１，２７５１−２７５８）。

他の配列特異的なリボヌクレアーゼも知られているが、それらは、適切なヌクレオチド配列に加えて、特定のｓｓＲＮＡ断片によって形成された特有の構造が必要とされるという事実が原因で工学には適していない。Ｔ１およびＭＣ１のＲＮａｓｅの基質特異性を変更する試みがなされてきた（Ｈｏｓｃｈｌｅｒ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ，（１９９９）２９４，１２３１−１２３８，Ｎｕｍａｔａ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００３）４２，５２７０−５２７８）。これらの２つのケースでは、単一のヌクレオチドから２つのヌクレオチドへと縮小された特異性を有する酵素変異体が生成された（Ｎｕｍａｔａ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００３）４２，５２７０−５２７８；Ｃｚａｊａ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００４）４３，２８５４−２８６２；Ｓｔｒｕｈａｌｌａ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，（２００４）５，２００−２０５）。しかしながら、加水分解されたＲＮＡ配列への低い特異性または特異性の欠如によって、そのプロセシングは大きく制限され、したがって、そのような酵素を適用する可能性も制限される。

タンパク質とは別に、ハンマーヘッド型リボザイム、触媒性ＤＮＡ分子（ＤＮＡｚｙｍｅｓ）、およびペプチド核酸に基づいた人工酵素（ＰＮＡｚｙｍｅｓ）も、ＲＮＡ配列を切断するために使用される。記載される分子は、ＲＮＡ分子の配列特異的な切断を得るように設計されてもよい。ハンマーヘッド型リボザイムは、最初に植物ウイルスにおいて発見された３０ヌクレオチドのＲＮＡ分子である（Ｐｒｏｄｙ，ＧＡ．，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８６）２３１，１５７７−１５８０）。それらは３つのステム（ｓｔｅｍｓ）を形成し、ここでステムＩおよびＩＩＩを形成する配列は、中間で切断される標的配列ＵＨ（ここでＨはＧ以外のあらゆるヌクレオチドである）に隣接している基質ＲＮＡ分子の相補的配列に結合する。ハンマーヘッド型リボザイムは、シスまたはトランスの立体構造において標的配列を切断するように設計されてもよい（Ｕｓｍａｎ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）４，５２７？５３３）。ＤＮＡｚｙｍｅｓは、ランダムなＤＮＡ配列からインビトロセレクション法を使用して特定された触媒性ＤＮＡ分子である。これまでのところ、広範囲の特異性を有する多くのＤＮＡｚｙｍｅｓが記載されてきた。設計されたＣｕ^２＋依存性のＰＮＡｚｙｍｅｓも、ＲＮＡ分子の高選択性の切断の可能性を提供する。それらは、ＲＮＡ相補的配列と結合する及び標的分子において４つのヌクレオチドのバルジを形成するように設計されている。形成されたバルジは、ＡＹＲＡ配列を含む（ここでＹ＝Ｃ、Ｕであり；Ｒ＝Ａ、Ｇである）場合、ＰＮＡｚｙｍｅによって切断され得る（ＭｕｒｔｏｌａＭ．，ｅｔａｌ．，ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ（２０１０）２６，８９８４−８９９０）。

ｄｓＲＮＡをプロセシングする能力を有する酵素は、以下の４つのファミリーが特定されたリボヌクレアーゼＩＩＩスーパーファミリーに属する：Ｄｉｃｅｒ、Ｄｒｏｓｈａ、ＲＮａｓｅＩＩＩ、およびＭｉｎｉ−ＩＩＩ。その中へ分類されたタンパク質はすべて、リボヌクレアーゼＩＩＩの触媒性ドメインが特徴である。バチルス・スブチリスからのリボヌクレアーゼＭｉｎｉ−ＩＩＩは、このタイプのドメインを有しているが、リボヌクレアーゼＩＩＩスーパーファミリーの他の既知のメンバーに典型的なｄｓＲＮＡ結合ドメインを有していない。Ｍｉｎｉ−ＩＩＩをコードする遺伝子は、グラム陰性菌のゲノムおよび植物色素体に存在している。細菌および色素体の両方において、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩ酵素は、２３ＳリボソームＲＮＡ成熟のプロセスに関係している。このタンパク質のための天然の基質は、３’および５’末端が切断されている２３ＳプレリボソームＲＮＡである。２３ＳプレリボソームＲＮＡの天然の基質においてＭｉｎｉ−ＩＩＩによって切断された配列が決定され、切断部位に近づいて、２３ＳプレリボソームＲＮＡ断片が、対でない一本鎖要素を有する部分的に二本鎖および部分的に不規則な構造を達成することが分かった。ここまで行われた試験は、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩが、ｄｓＲＮＡヘリックス構造において不規則性を認識する傾向があり得ることを示唆してきた（Ｒｅｄｋｏ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００８）６８（５），１０９６−１１０６）。２３ＳプレリボソームＲＮＡへのＭｉｎｉ−ＩＩＩの活性は、基質に作用するが、酵素立体構造の状態には作用しないＬ３タンパク質によって有意に刺激される（Ｒｅｄｋｏ，Ｙ．ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００９）７１（５），１１４５−１１５４）。植物細胞の色素体において、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩが、その分解によって細胞に存在するイントロンおよびノンコーディングＲＮＡ分子の量を調節することが示された（ＨｏｔｔｏＡ．，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，（２０１５），２７（３），７２４−７４０）。

本発明者のチームは、歴史上初めて、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩ酵素およびその突然変異体Ｄ９４Ｒによって示された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）へのＲＮａｓｅの配列特異的な活性について記載した。報告された結果は、バチルス・スブチリスからのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ（ＢｓＭｉｎｉＩＩＩ）による長いｄｓＲＮＡ分子の配列依存性の切断を確証している。バクテリオファージΦ６ゲノムである、長いｄｓＲＮＡ分子の制限された切断中にこの酵素によって切断された部位の分析は、この酵素によって切断されたｄｓＲＮＡにおける配列モチーフの特定につながった。さらに、切断効率に影響を与える切断部位内のヌクレオチド残基が確立され、これらは、酵素がｄｓＲＮＡ配列を認識するのに不可欠である。構造研究に続いて適切な実験に裏付けされているコンピュータモデルも、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅに属する酵素に特徴的な構造要素である、α５ｂ−α６ループが、タンパク質の特異的な活性化に重要な役割を果たすが、結合ｄｓＲＮＡのプロセスにおいてはそうではないことを示した（ＧｌｏｗＤ．，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，（２０１５），４３（５），２８６４−２８７３）。

ｄｓＲＮＡへの配列特異性を示す他のＲＮａｓｅの特定およびその特異性を変更する可能性によって、ＲＮＡ核操作技術の分野における発展に加えて、そのような酵素を用いる新規の調査の方法および適用、およびそのような酵素を使用する新しい技術の発展も可能になるだろう。

前述事項に基づいて、本発明の目標は、第１に、二本鎖ＲＮＡにおいて特定の配列を認識する且つ切断する、ＢｓＭｉｎｉＩＩＩ以外の、高い配列特異性を有するｄｓＲＮＡＲＮａｓｅを提供することであり、第２に、基質選択性およびその活性を変更するために、このエンドヌクレアーゼサブファミリーの酵素間の定義された構造要素の交換に基づいた方法を提供することである。本発明の目標はまた、そのような配列特異的なｄｓＲＮＡＲＮａｓｅを決定する、単離する、得る、選択する、および調製する方法を提供することである。

１セットのＢｓＭｉｎｉＩＩＩホモログの活性および特異性を試験する中で、本発明者は、リボヌクレアーゼＭｉｎｉ−ＩＩＩファミリーの酵素が、ｄｓＲＮＡ切断中にＢｓＭｉｎｉＩＩＩとは異なるヌクレオチド選択性を有していることを想定外に発見した。ＢｓＭｉｎｉＩＩＩのケースでのように、この選択性は、ｄｓＲＮＡ配列のみに依存し、ｄｓＲＮＡにおける不規則なヘリックスの出現および他のタンパク質との協同の両方から独立している。想定外なことに、本発明者は、ｄｓＲＮＡヘリックスの主溝に位置し、それと相互作用している、インシリコのモデリングにおいてポリペプチド鎖断片によって形成されたループを有している、リボヌクレアーゼＩＩＩスーパーファミリーの酵素が、ｄｓＤＮＡのための制限酵素の特性に近い特性を有して、ｄｓＲＮＡの特異的な及び定義された断片化を可能にする活性を示すことを発見した。初めて、本発明者によって行われた試験は、α５ｂ−α６ループ配列に対する切断選択性の依存の証拠を提供した。さらに、モデル分析は、驚いたことに、言及されたループと同様に、ｄｓＲＮＡ配列に十分接近して位置する及びＭｉｎｉ−ＩＩＩ酵素の活性および特異性に影響を与える、追加の構造要素、即ちα４ヘリックスを見つけることを可能にした。タンパク質間の構造要素の交換は、想定外なことに、結果として生じるキメラタンパク質の特異性および活性の両方における変化をもたらした。

本発明の目的は、配列特異的なＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの一群の他に、これらの酵素の配列選択性の要因であるＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅにおける定義する構造要素、並びにこれらの要素またはＭｉｎｉ−ＩＩＩ酵素間のそれらの断片を交換する方法に関する。
本発明は、アミノ酸配列を有するＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅに関し、アミノ酸配列は、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ構造において、アクセプター部分、およびα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造を形成する、それぞれ、移植可能なα４ヘリックス及び／又は移植可能なα５ｂ−α６ループの部分を含み、ここでα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造を形成する断片は、それぞれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるバチルス・スブチリスからのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの、それぞれ、４６−５２位および８５−９８位のアミノ酸配列断片によって形成されたα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループのそれぞれの構造に構造的に対応しており、
ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、基質のリボヌクレオチド配列にのみ依存している及び基質の構造における二次構造の出現から独立している、並びに他の補助タンパク質の存在とは無関係であるｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、およびＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１や、Ｄ９４Ｒ突然変異を有するＳＥＱＩＤＮＯ：１のバチルス・スブチリスからのＭｉｎｉ−ＩＩＩタンパク質ではない。

好ましいＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅにおいて、アミノ酸配列は、１つの微生物のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅに由来するアクセプター部分、および異なる微生物のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅからのα４ヘリックス及び／又はα５ｂ−α６ループの配列に由来する、それぞれ、挿入される移植可能なα４ヘリックス及び／又は移植可能なα５ｂ−α６ループから構成される。

好ましいＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅにおいて、アミノ酸配列は以下を含む：
− ＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、カルディセルロシルプター・クリストヤンソニー（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ）のＭｉｎｉ−ＩＩＩＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、クロストリジウム・ラモーサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｒａｍｏｓｕｍ）のＣｒＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）のＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）のＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）のＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）のＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）、サーモトガ・マリティマ（ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａのＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、または現在はカルダナエロバクター・サブテラネウス亜種テンコンジェンシス（Ｃａｌｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓｓｕｂｓｐ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）である、サーモアナエロバクター・テンコンジェンシス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）のＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）、あるいはそれらと少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一であるアミノ酸配列、に由来するアクセプター部分；
− ＳＥＱＩＤＮＯ：１の４６−５２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の３６−４２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の４０−４６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の５６−６２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２の４３−４９位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１６の５０−５６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、あるいはそれらと少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一であるアミノ酸配列、に由来する移植可能なα４ヘリックス、及び／又は
− ＳＥＱＩＤＮＯ：１の８５−９８位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の７３−８６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の７９−８８位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の９３−１０６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４の８２−９３位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１６の８７−１００位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、あるいはそれらと少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一であるアミノ酸配列、に由来する移植可能なα５ｂ−α６ループ。

好ましいＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるカルディセルロシルプター・クリストヤンソニーからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕであり；Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであり；Ｙ＝Ｃ、Ｕである。

好ましいＲＮａｓｅは、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されるクロストリジウム・ラモーサムからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕであり；Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇである。

好ましいＲＮａｓｅは、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示されるクロストリジウム・サーモセラムからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

ここで、Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇである。

好ましいＲＮａｓｅは、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に示されるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

ここで、Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇである。

好ましいＲＮａｓｅは、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示されるフソバクテリウム・ヌクレアタムからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

ここで、Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇである。

好ましいＲＮａｓｅは、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるスタフィロコッカス・エピデルミデスからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

好ましいＲＮａｓｅは、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示されるサーモトガ・マリティマからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

好ましいＲＮａｓｅは、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に示されるサーモアナエロバクター・テンコンジェンシス（カルダナエロバクター・サブテラネウス亜種テンコンジェンシス）からの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

好ましいＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８のＣｔ（ＦｐＨ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０のＣｔ（ＦｐＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２のＣｔ（ＦｐＨＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４のＢｓ（ＦｐＨ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６のＢｓ（ＦｐＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８のＳｅ（ＦｐＨ）から選択されるキメラタンパク質である。

本発明はまた、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅキメラタンパク質を得る方法に関し、該方法は、
ａ）Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子をクローン化する工程であって、そのアミノ酸配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるバチルス・スブチリスからのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの、それぞれ、４６−５２位および８５−９８位のアミノ酸配列断片によって形成されたα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループにおいてそれぞれの断片に構造的に対応している、それぞれ、α４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造を形成する断片を含む、工程、
ｂ）それぞれ、α４ヘリックス及び／又はα５ｂ−α６ループの構造をコードする断片の少なくとも１つを、異なる微生物のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子からの、それぞれ、α４ヘリックス及び／又はα５ｂ−α６ループの構造をコードする断片と交換することによって、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子を組み換える工程を含み、
ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、リボヌクレオチド配列にのみ依存している及び基質の構造における二次構造の出現から独立している、並びに他の補助タンパク質の存在から独立しているｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、およびＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１や、Ｄ９４Ｒ突然変異を有するＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有するバチルス・スブチリスからのＭｉｎｉ−ＩＩＩタンパク質ではない。

キメラＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅを得る好ましい方法では、工程ｂ）は、アクセプター部分への移植可能なα４ヘリックス及び／又は移植可能なα５ｂ−α６ループの挿入に関し、ここで
− アクセプター部分は、ＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、カルディセルロシルプター・クリストヤンソニーのＭｉｎｉＩＩＩＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、クロストリジウム・ラモーサムのＣｒＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、クロストリジウム・サーモセラムのＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィのＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタムのＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、スタフィロコッカス・エピデルミデスのＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）、サーモトガ・マリティマのＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、または現在はカルダナエロバクター・サブテラネウス亜種テンコンジェンシスである、サーモアナエロバクター・テンコンジェンシスのＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）に由来するか、あるいはそれらと少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一であるアミノ酸配列を含み；
− 移植可能なα４ヘリックスは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の４６−５２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の３６−４２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の４０−４６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の５６−６２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２の４３−４９位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１６の５０−５６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔに由来するか、あるいはそれらと少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一であるアミノ酸配列を含み；
− 移植可能なα５ｂ−α６ループは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の８５−９８位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の７３−８６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の７９−８８位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の９３−１０６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４の８２−９３位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１６の８７−１００位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔに由来するか、あるいはそれらと少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

好ましくは、キメラＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅを得る方法において、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子における移植可能なα４ヘリックスおよび移植可能なα５ｂ−α６ループは、異なる微生物に由来する。

キメラＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅを得る好ましい方法では、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、２０、２２、２４、２６、２８から成る群からのアミノ酸配列をコードする配列を含む。

キメラＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅを得る好ましい方法はさらに、
ｃ）工程ｂ）から遺伝子を発現する細胞を培養する工程、および
ｄ）工程ｃ）から発現されたタンパク質を単離し、精製する工程、および随意に
ｅ）工程ｄ）で得られたタンパク質の配列特異性を決定する工程を含む。

本発明はまた、本発明による方法で得られたＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅを含む。

本発明はまた、本発明の方法によって得られたＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする構築物に関する。

本発明はまた、本発明によってＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子、または本発明による構築物を含む、細胞に関する。

本発明はまた、リボヌクレオチド配列にのみ依存している及び基質の構造における二次構造の出現から独立している、並びに他の補助タンパク質の存在とは無関係である方法でｄｓＲＮＡを切断するための、本発明によるＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの使用に関する。

本発明はまた、リボヌクレオチド配列にのみ依存している及び基質構造内の二次構造の出現とは無関係である、並びに他の補助タンパク質の存在とは無関係である方法でｄｓＲＮＡを切断する方法に関し、該方法は、本発明によるｄｓＲＮＡ基質とＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅとの間の相互作用を含む。

ｄｓＲＮＡを切断する好ましい方法では、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるカルディセルロシルプター・クリストヤンソニーからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

ｄｓＲＮＡを切断する好ましい方法では、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されるクロストリジウム・ラモーサムからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

ｄｓＲＮＡを切断する好ましい方法では、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示されるクロストリジウム・サーモセラムからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

ここで、Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇである。

ｄｓＲＮＡを切断する好ましい方法では、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に示されるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

ここで、Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇである。

ｄｓＲＮＡを切断する好ましい方法では、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示されるフソバクテリウム・ヌクレアタムからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

ここで、Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇである。

ｄｓＲＮＡを切断する好ましい方法では、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるスタフィロコッカス・エピデルミデスからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

ｄｓＲＮＡを切断する好ましい方法では、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示されるサーモトガ・マリティマからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

ｄｓＲＮＡを切断する好ましい方法では、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に示されるサーモアナエロバクター・テンコンジェンシス（カルダナエロバクター・サブテラネウス亜種テンコンジェンシス）からの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：

本発明はまた、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅを得る方法に関し、該方法は、
ａ）Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子をクローン化する工程であって、そのアミノ酸配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるバチルス・スブチリスからのエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの、それぞれ、４６−５２位および８５−９８位のアミノ酸配列断片によって形成されたα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造に構造的に対応している、それぞれ、α４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造を形成する断片を含み、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１や、Ｄ９４Ｒ突然変異を有するＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有するバチルス・スブチリスからのＭｉｎｉ−ＩＩＩタンパク質ではない、工程、
ｂ）工程ａ）から遺伝子を発現する細胞を培養する工程、および
ｃ）工程ｂ）から発現されたタンパク質を分離し、精製する工程を含み、
ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、リボヌクレオチド配列にのみ依存している及び基質の構造における二次構造の出現から独立している、並びに他の補助タンパク質の存在から独立しているｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示す。

本発明の方法の一実施形態では、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６から成る群からのアミノ酸配列をコードする配列を含む。

本発明者は、酵素の配列選択性の要因であるＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの構造要素を決定し、これらはα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループである（図６を参照）。α４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループに対応するタンパク質Ｍｉｎｉ−ＩＩＩアミノ酸配列の選択される断片は、有意差を特徴とするが、それらの末端上には、アミノ酸配列のアライメントによって特定され得る、進化の過程で保存された、類似した位置がある。正確な同等物を構成するために分析された酵素間の交換を意図した配列断片に関して、それらの境界は、保存された位置に直接隣接している位置上に設定された（表１１を参照）。例えば、ＢｓＭｉｎｉＩＩＩアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に関して、これらは、α４ヘリックスに対しては４６−５２位のアミノ酸およびα５ｂ−α６ループに対しては８５−９８位のアミノ酸である。ＣｔＭｉｎｉＩＩＩアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）に関して、これらは、α４ヘリックスに対しては５６−６２位のアミノ酸およびα５ｂ−α６ループに対しては９３−１０６位のアミノ酸である。ＦｐＭｉｎｉＩＩＩアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）に関して、これらは、α４ヘリックスに対しては４５−５１位のアミノ酸およびα５ｂ−α６ループに対しては８２−９５位のアミノ酸である。ＳｅＭｉｎｉＩＩＩアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）に関して、これらは、α４ヘリックスに対しては４３−４９位のアミノ酸およびα５ｂ−α６ループに対しては８２−９５位のアミノ酸である。タンパク質のアミノ酸配列に関連する両方の構造要素は、図７に示される。

本発明者は、想定外に、これらの重要な構造要素を交換すること、および選択性が変更された及び／又は基質切断の様々な特異性および特性を有する酵素を得ることが可能であることを発見した。

本発明者は、配列選択性が変更されたキメラタンパク質を得ることを可能にするＭｉｎｉ−ＩＩＩ酵素間の前述の構造要素を交換する方法を開発した。該方法の本質は、他のタンパク質からのα４ヘリックス及び／又はα５ｂ−α６ループの構造を含んでいるＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅに基づいたキメラタンパク質の産生に関する。そのようなキメラタンパク質を産生するために、当業者に既知のキメラタンパク質を構築する適切な方法が使用されてもよい。例えば、該方法は、
ａ）供与体であるＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの配列選択性の要因である特定の移植可能な構造要素、α４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループをコードする、配列特異的なｄｓＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの遺伝子の断片に対応しているオリゴヌクレオチドの合成；
ｂ）交換を意図した、その配列特異性の要因である構成要素をコードする短い配列断片を省いた特定のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの過剰産生に使用されるプラスミドの増幅；
ｃ）得られる２つのＤＮＡ断片の組み合わせ；
ｄ）ｃ）で得られたヌクレオチド配列からのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅキメラタンパク質の発現；
ｅ）発現されたＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅキメラタンパク質の変更された配列特異性の決定を含む。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの誘導体及び／又は変異体における選択性の変化を得るそのような好ましい方法は、結果として、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性への変更された、増加された選択性、及び／又は変更された配列特異性、及び／又は変更された及び／又は増加された酵素活性を有する、誘導体及び／又は変異体を得ることにつながる。

それ故、本発明の方法の具体的な実施形態では、キメラＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子は、それぞれ、α４ヘリックス（さらに移植可能なα４ヘリックスとして言及される）およびα５ｂ−α６ループ（さらに移植可能なα５ｂ−α６ループとして言及される）の構造をコードする断片を使用して構築され、それらの少なくとも１つは、異なるＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子の配列に由来し、それらの少なくとも１つは、別の微生物のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅに由来するアクセプター部分へと挿入される（移植される）。好ましくは、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子は、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅポリペプチドの、バチルス・スブチリスのＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、カルディセルロシルプター・クリストヤンソニーのＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、クロストリジウム・ラモーサムのＣｒＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、クロストリジウム・サーモセラムのＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィのＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタムのＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、スタフィロコッカス・エピデルミデスのＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）、サーモトガ・マリティマのＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、または現在はカルダナエロバクター・サブテラネウス亜種テンコンジェンシスである、サーモアナエロバクター・テンコンジェンシスのＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）をコードする遺伝子を含む群からの遺伝子のいずれかに由来する、α４ヘリックス構造をコードする断片を含む。
好ましくは、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の４６−５２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の３６−４２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の４０−４６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の５６−６２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２の４３−４９位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１６の５０−５６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔからのα４ヘリックス構造をコードする断片を含む。

好ましくは、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子は、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの、バチルス・スブチリスのＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、カルディセルロシルプター・クリストヤンソニーのＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、クロストリジウム・ラモーサムのＣｒＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、クロストリジウム・サーモセラムのＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィのＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタムのＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、スタフィロコッカス・エピデルミデスのＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）、サーモトガ・マリティマのＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、または現在はカルダナエロバクター・サブテラネウス亜種テンコンジェンシスである、サーモアナエロバクター・テンコンジェンシスのＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）をコードする遺伝子を含む群からの遺伝子のいずれかに由来する、α５ｂ−α６ループ構造をコードする断片を含む。

好ましくは、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の８５−９８位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の７３−８６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の７９−８８位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の９３−１０６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４の８２−９３位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１６の８７−１００位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔからのα５ｂ−α６ループ構造をコードする断片を含む。

好ましくは、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、２０、２２、２４、２６、２８から成る群からのアミノ酸配列をコードする配列を含む。

本発明の目的はまた、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性への増加された選択性、及び／又は変更された配列特異性、及び／又は増加された酵素活性を有する、本発明によるＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ変異体を調製する方法に関し、該方法は、
ａ）それぞれ、α４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造をコードする断片の少なくとも１つを、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする別の遺伝子からの、それぞれ、α４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造をコードする断片と交換することによって、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子を組み換える工程、
ｂ）細胞培養において工程ａ）で組み換えられた遺伝子によってコードされたタンパク質を発現する工程、
ｃ）工程ｂ）から発現されたタンパク質を単離し、精製する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られたタンパク質の配列特異性を決定する工程を含む。

好ましい実施形態では、α４ヘリックス構造およびα５ｂ−α６ループ構造は、異なる細菌種の遺伝子に由来する。

本発明はまた、本発明によってＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ変異体を得る方法によって得られたＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅに関する。

ｄｓＲＮＡ切断の配列特異性は、そのリボヌクレオチド配列にのみ依存しており、ｄｓＲＮＡの１つ又は両方の鎖におけるループアウト（ｌｏｏｐｉｎｇ−ｏｕｔ）の出現及び／又は他の補助タンパク質との相互作用には依存していないｄｓＲＮＡを認識する且つ切断するＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの能力として理解されるべきである。

用語「Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ」または「ＲＮａｓｅＭｉｎｉ−ＩＩＩ」は、ＲＮａｓ−ＩＩＩファミリーにおけるクラス４のｄｓＲＮＡリボヌクレアーゼを意味する。
この群に属するタンパク質は、ホモ二量体であり、触媒性ドメイン（ＲＮａｓｅＩＩＩ）のみで構成されている（Ｏｌｍｅｄｏ，Ｇ．，ｅｔａｌ．，（２００８））。

本明細書に従う、用語「アクセプター部分」は、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのうちの１つのアミノ酸配列、またはＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのうちの１つのアクセプター部分のアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％、またはそれ以上同一である配列を意味し、ここでアクセプター部分は、α４ヘリックス及び／又はα５ｂ−α６ループのアミノ酸配列を部分的にまたは完全に除去することが可能であり、供与体に由来する移植可能なα４ヘリックス及び／又は移植可能なα５ｂ−α６ループをこの／これらの部位へと挿入することが可能である。

本明細書に従う、用語「Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅキメラタンパク質」または「キメラＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ」は、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのうちの１つのアミノ酸配列（アクセプター部分と呼ばれる）、またはＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのうちの１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％、またはそれ以上同一である配列を含む構築物を意味し、ここで、α４ヘリックス及び／又はα５ｂ−α６ループのアミノ酸配列は、供与体と呼ばれる、アクセプター部分とは異なるＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅに由来する移植可能なα４ヘリックス及び／又は移植可能なα５ｂ−α６ループの類似したアミノ酸配列と、あるいは異なるＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅに由来するα４ヘリックス及び／又はα５ｂ−α６ループの類似したアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％、またはそれ以上同一である配列と部分的に又は完全に取り替えられている。

本明細書で使用される用語「同一性」は、２つのポリペプチド鎖間の配列類似性を指す。同じアミノ酸残基が、両方の比較された配列における位置を占めるとき、それぞれの分子はこの位置において同一である。本明細書に使用されるパーセント同一性は、アミノ酸配列間の比較を指し、２つの最適に整列された配列を比較することにより判定され、ここで、比較されているアミノ酸配列の部分は、２つの配列を最適に整列させるために参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して付加（即ちアミノ酸残基の挿入）または欠失（即ちアミノ酸残基の除去）を含んでもよい。

上に言及されるように、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるバチルス・スブチリスからのエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのアミノ酸配列の、それぞれ、４６−５２位および８５−９８位のアミノ酸残基を有する断片によって形成された、それぞれ、α４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造に構造的に対応している重要な構造要素、即ち、α４ヘリックス及び／又はα５ｂ−α６ループの操作することによって、配列にのみ依存する方法で様々な配列特異性を有するＲＮＡ基質を切断する酵素を構築することが可能であるという予期されない観察に基づいている。当業者にとって、実施例に示されるＲＮａｓｅが、単に本発明の特定の実施形態であることは自明となる。したがって、本発明はまた、本明細書に記載される酵素のいずれか１つと少なくとも８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載されるＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの誘導体及び／又は変異体に関する。特に、本明細書に記載されるＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの誘導体及び／又は変異体は、参照配列における対応するアミノ酸残基の保存的置換を含む。

参照配列における「保存的置換」は、例えば、類似したサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を含む化学的性質などを有する、対応する参照残基に物理的にまたは機能的に類似したアミノ酸残基を含む置換である。特に、好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆｅｔａｌ．（“ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ”，１９７８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｓｕｐｐｌ．３，２２：３５４−３５２）によって「受容された点突然変異」に対して定義された基準を満たす置換である。

本発明による、ｄｓＲＮＡへの配列特異性を示すＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、及び／又はＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのキメラタンパク質、及び／又は誘導体及び／又は変異体、およびそれらの使用は、ＲＮＡ操作技術の全体的な新しい分野の発展と同様に、そのような酵素の新規の調査の方法および適用およびそのような酵素を利用する新規の技術の発展を可能にする。配列特異性を示すＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、およびそれらの誘導体及び／又は変異体は、例えば、リボヌクレオチド修飾、ＲＮＡ分子の構造及び／又はその修飾を理解するためのＲＮＡに関する構造研究、ＲＮＡｉ分子、特にｓｉＲＮＡの生成、植物および動物のウイルス性疾患の診断および処置の他に、ＲＮＡに基づいたナノテクノロジー、いわゆる「ＲＮＡテクトニクス」の適用に使用される。

本発明による、ｄｓＲＮＡへの配列特異性を示す新しいＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、及び／又はＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのキメラタンパク質、及び／又は誘導体及び／又は変異体が、新規の生物工学的応用に使用される。配列依存的な方法で一本鎖ＲＮＡを切断する既知の酵素が存在しているが、それらの活性は、基質配列だけでなくその構造にも依存し、それらは実際にはそれほど有用ではない。対照的に、本発明による、ｄｓＲＮＡへの配列特異性を示す新しいＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、及び／又はＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのキメラタンパク質、及び／又は誘導体及び／又は変異体は、これらの欠点がなく、ｄｓＤＮＡ切断のための分子生物学に使用される制限酵素などの、一般にｄｓＲＮＡ切断に使用される実験用試薬として使用することができる。配列特異性を示すＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、及び／又はｄｓＲＮＡへの配列特異性を示すＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのキメラタンパク質、及び／又は誘導体及び／又は変異体のインビトロでの使用に加えて、これらを医療、診断およびナノテクノロジーにおいて利用する可能性もある。例えば、ＲＮＡに関する構造研究において、逆転写反応による直接のＲＮＡ配列決定が、修飾を特定するために現在最も使用されるか、あるいは質量分析が同じ目的で使用される。両方のケースにおいて、大きなＲＮＡ分子（例えば、ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の分析が問題となっている。これらの方法では、ＲＮＡを断片化するためにヌクレアーゼが使用され、切断産物は、短いＲＮＡ断片またはリボヌクレオチドである。そのような切断は非特異的であり、結果として多数の産物が生じることによって、得られた結果の解釈が困難になるか、または不可能になる。本発明による、配列特異性を示す新しいＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、及び／又はキメラタンパク質、及び／又はＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの誘導体及び／又は変異体の使用によって、抑制された方法でそのようなＲＮＡ分子をより小さな反復可能な断片へと切断することが可能になる。それらのモル質量および特性が、独立して判定され得ることで、リボヌクレオチド修飾の分析の他に、これまで不可能であったか又は非常に困難であったＲＮＡの構造研究を実行することが可能になる。ＲＮＡ分子の修飾および構造に関するそのような研究は、例えば、抗生物質に対する菌耐性のメカニズムのような、潜在的な治療標的についての情報を提供する。本発明による、配列特異性を示す新しいＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、及び／又はキメラタンパク質、及び／又はＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの誘導体及び／又は変異体の使用によって、ＲＮＡｉ、即ち、短干渉ｄｓＲＮＡ分子に基づいた技術の発展が可能になる。本発明による、配列特異性を示すＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、及び／又はｄｓＲＮＡへの配列特異性を示すＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのキメラタンパク質、及び／又は誘導体及び／又は変異体は、例えば、癌、代謝疾患および神経変性疾患を処置するために医療に使用される、遺伝子発現抑制に対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用する方法および適用に使用される。現在、短い二本鎖ＲＮＡ断片を結果として得る方策の１つは、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）からのリボヌクレアーゼＩＩＩを有する、特定のＤＮＡ断片から得られた、長いｄｓＲＮＡを処置することである。この酵素は、ｄｓＲＮＡを非特異的に切断し、１８〜２５の塩基対の断片を生成する。それによって得られた短いｓｉＲＮＡ断片は、遺伝子発現抑制に使用される。本発明による、配列特異性を示すＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、及び／又はキメラタンパク質、及び／又はＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの誘導体及び／又は変異体の使用によって、特異的なｓｉＲＮＡの産生の完全に新しい未知の可能性が与えられ、これらのｄｓＲＮＡ断片の定義されたプールの生成が可能になり、それにより、特定の遺伝子の発現を最も効率的に抑制し、他の遺伝子を発現抑制する副作用も低減するだろう。

本発明による、ｄｓＲＮＡへの配列特異性を示す、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、および／または、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのキメラタンパク質、および／または誘導体、および／または変異体は、診断において適用可能であり、また、遺伝子情報担体としてのｄｓＲＮＡを有するウイルスによって引き起こされる疾患の処置にも適用可能である。そのようなウイルスの１つの例は、レオウイルス科のロタウイルスであり、そのうち３つの群はヒトに対して病原性である。現在、これらの群を検出および同定するために、逆転写およびそれに続くＰＣＲ技術が用いられる。本発明による、配列特異性を示すＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、および／または、ｄｓＲＮＡへの配列特異性を示すＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのキメラタンパク質、および／または誘導体、および／または変異体の利用可能性は、ｄｓＲＮＡの操作を可能にし、診断を著しく促進する。現在、ロタウイルス感染の処置は非常に効果がない。本発明による、ｄｓＲＮＡへの配列特異性を示す、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、および／または、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのキメラタンパク質、および／または誘導体、および／または変異体は、ロタウイルスによって引き起こされる疾患の処置のための手段として使用され、ウイルスゲノムの特異的切断を可能にし、したがってその複製をさらに防止するだろう。

本発明による、ｄｓＲＮＡへの配列特異性を示す、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ、および／または、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのキメラタンパク質、および／または誘導体、および／または変異体はまた、ナノテクノロジー、特に「ＲＮＡテクトニクス」および所与の配列および構造を有するＲＮＡに基づくナノ構造の形成において使用されるだろう。

本明細書に引用された刊行物およびそこに含まれる参考文献は、参照としてその全体が本明細書に含まれる。

本発明のより良い理解のために、実施形態および添付図面を用いて例証した。
バクテリオファージΦ６ゲノムｄｓＲＮＡのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ切断パターンの差を示す。ＭはｄｓＤＮＡマーカー（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳＭ０２２３）を示し、

は酵素を添加しない対照反応を示す。
高スループット配列決定からのデータ分析の結果、得られた特定のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅにとって好ましい配列モチーフを示す。Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ切断産物の高スループット配列決定で同定された部位を含む５つの選択されたファージｄｓＲＮＡ断片の切断を示す。黒色のアスタリスクは基質を示し、灰色のアスタリスクは、予想される部位で基質の切断の結果として得られる、より大きな生成物を示す。最初のｄｓＲＮＡ配列に関して、選択されたＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの切断効率に対する、９１０Ｓ基質に導入された中央のテトラヌクレオチドＡＣＣＵ位置内での置換の効果を示す。アスタリスクは、特定のｄｓＲＮＡ基質のテトラヌクレオチド配列に相補的な配列を示す。選択されたＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの切断効率に対する、９１０Ｓ基質に導入された中央のテトラヌクレオチドの外側の選択された位置（図中の６、７、８、９位）の置換の効果を示す。Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの切断部位を含む基質の元の配列の断片が、図の上部に示されている。また、特定の基質における置換の位置およびタイプの数表現が提供される。図面の下部には、最初のｄｓＲＮＡ配列に関連する特定の基質の切断効率が示されている。ｄｓＲＮＡと複合するＢｓＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの理論モデルをしめす。円および矢印は、好ましいｄｓＲＮＡ配列（ＡＣＣＵ）およびＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの基質選択性の要因となる構造要素を示す（Ａ−α４ヘリックス、Ｂ−α５ｂ−α６ループ）。選択されたＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのアミノ酸配列のアライメント（Ａ−α４ヘリックス、Ｂ−α５ｂ−α６ループ）。アミノ酸残基および二次構造の提供される数表現は、ＢｓＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの配列および二次構造を指す。保存された触媒アミノ酸残基は、灰色のフォントでマークされている（Ｄ−２３位、Ｅ−１０６位）。キメラタンパク質の形成中に交換される、構造要素の断片であるα４ヘリックス（Ｈ）およびα５ｂ−α６ループ（Ｌ）は、灰色の背景で示される。キメラタンパク質の酵素活性（Ａパネル）およびその配列選択性（Ｂパネル）に対する、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ配列選択性の要因となる構造要素、すなわちα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループ、の交換の効果をしめす。

以下の実施例は、本発明を例示し、その特定の態様を説明するためのものであって、本発明を限定するものではなく、添付の特許請求の範囲に規定されるその全範囲として解釈されるべきではない。

以下の実施例において、他に示されない限り、ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．らの「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ．１９８９．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ」に記載された標準的な材料および方法を使用し、または、特定の材料および方法に関する製造業者の指示に従って手順を踏襲した。

本明細書において、他に示さない限り、アミノ酸およびヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの標準的な略語が使用される。

＜実施例＞
＜実施例１＞
特定のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする配列のクローン化
微生物をＤＳＭＺ（ＬｅｉｂｎｉｚＩｎｓｔｉｔｕｔｅＤＳＭＺ−ＧｅｒｍａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ）から凍結乾燥形態で購入した（表１）。５００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０）中で凍結乾燥物を懸濁させた後、懸濁液をフェノール（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で飽和）で抽出した。水相をフェノール：クロロホルム（１／１ｖ／ｖ）混合物で再抽出し、続いて５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２および１ｍｌのエタノールを添加することによって核酸を沈殿させた。沈殿した核酸を遠心分離し（１２０００ｇ、１０分間、４℃）、流体を除去した。ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、次いで乾燥させた。得られたＤＮＡを、２０μｌのＴＥ緩衝液中に懸濁させた。

Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする配列を、Ｐｆｕポリメラーゼおよび表２に記載のプライマーを用いてＰＣＲにおいてゲノムＤＮＡから増幅した。

Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグを有するＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの誘導可能な過剰発現を可能にする組換えプラスミドを得るために、ＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ酵素で切断し、同じ酵素で切断したｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）とライゲーションした。１ＵのファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、室温で１時間、ライゲーションを行った。次に、１０μｌの反応混合物を用いて、１００μｌの化学的にコンピテント細菌を形質転換させ（エシェリキア・コリ上位１０株：Ｆ−ｍｃｒＡΔ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ） φ８０ｌａｃＺ ΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ｄｅｏＲｒｅｃＡ１ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａＡ−ｌｅｕ）７６９７ｇａｌＵｇａｌＫｒｐｓＬｅｎｄＡ１ｎｕｐＧ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充した固体ＬＢ培地上で形質転換体を選択した。選択されたクローンから、プラスミドＤＮＡをＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｋｉｔ（Ａ＆ＡＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて単離し、続いて得られた構築物の正確性を確認するために配列決定した。

このようにして、特定の微生物からのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの効率的な誘導可能な過剰産生を可能にする構築物が得られた。

＜実施例２＞
野性型Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする組換えプラスミドからのタンパク質の発現および精製
エシェリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｆ−ｏｍｐＴｇａｌｄｃｍｌｏｎｈｓｄＳＢ（ｒＢ− ｍＢ−）λ（ＤＥ３［ｌａｃＩｌａｃＵＶ５−Ｔ７遺伝子１ｉｎｄ１ｓａｍ７ｎｉｎ５］）を、実施例１で得られたＭｉｎｉ−ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドで形質転換した。実施例１と同様にして形質転換を行った。５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１％グルコースを補充したＬＢ固体培地上で形質転換体を選択した。５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１％グルコースを備えた２５ｍＬの液体ＬＢ培地に、選択された形質転換体のコロニーを播種し、それを振盪しながら３７℃の温度で５時間インキュベートした。次いで、１００μｇ／ｍＬの濃度までカナマイシンを補充した５００ｍＬの液体ＺＹ（Ｓｔｕｄｉｅｒ２００５）に、ＬＢ培地で成長した培養物２５ｍＬを接種し、３７℃の温度で２４時間振盪しながらインキュベートした。培養物を５０００ｇで４℃で１０分間遠心分離し、ＳＴＥ緩衝液（０．１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０）に懸濁させ、再び遠心分離した。このペレットを２０ｍＬの溶解溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、３００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール）に懸濁させ、次いで、バクテリア細胞を１３６０気圧の過圧で細胞分解器（ＣｏｎｓｔａｎｔＳｙｓｔｅｍｓＬＴＤ）に１回通過させて崩壊させた。溶解物を２００００ｇで４℃の温度で２０分間遠心分離することにより清澄化して、不溶性の細胞破片を除去した。組換え型タンパク質をポリペプチド鎖に存在するポリヒスチジンタグを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製した。

５Ｌの培養物（それぞれ５００ｍＬの１０個のフラスコ）から得られた細胞溶解物を、４つの容積の溶解緩衝液で平衡化した５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース床（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む７×１．５ｃｍのカラムにかけた。カラムを、次の緩衝液で連続して洗浄した：溶解緩衝液（１５０ｍＬ）、２ＭＮａＣｌ（５０ｍＬ）を補充した溶解緩衝液、イミダゾールを２０ｍＭ（５０ｍＬ）の濃度まで補充した溶解緩衝液。精製組換えタンパク質をイミダゾールを２５０ｍＭの濃度まで補充した溶解緩衝液で溶出し、１．５ｍＬの画分を収集した。精製中の流速は０．９ｍＬ／分であり、温度は４℃であった。精製タンパク質画分を等量のグリセロールと混合し、−２０℃で保存した。

それによって、高度に精製された酵素調製物を、その活性を維持しながら得られ、緩衝液中で、−２０℃の温度で簡単に保存することができる。

＜実施例３＞
精製された酵素によるｄｓＲＮＡ基質のインビトロ切断のための最適な反応条件の判定
反応緩衝液の最適条件を判定するために、Φ６ファージゲノムの限定された切断を、表３に列挙した緩衝液中で行った。

実験では、１．５μｇのｄｓＲＮＡを使用し、３．３μｇのＢｓＭｉｎｉＩＩＩ、８０ｎｇのＣｋＭｉｎｉＩＩＩ、２３．５μｇのＣｒＭｉｎｉＩＩＩ、５μｇのＣｔＭｉｎｉＩＩＩ、０．８μｇのＦｎＭｉｎｉＩＩＩ、１．１μｇのＦｐＭｉｎｉＩＩＩ、２．１μｇのＳｅＭｉｎｉＩＩＩ、０．１８５μｇのＴｍＭｉｎｉＩＩＩ、１１．５ｎｇのＴｔＭｉｎｉＩＩＩ、が実施例２で得られた。反応時間がそれぞれ２、４および６分および２０、４０および６０分であるＴｔＭｉｎｉＩＩＩおよびＳｅＭｉｎｉＩＩＩを除き、０．５μｇのｄｓＲＮＡに相当するアリコートを反応の５、１０および１５分後に収集した。

切断産物を、最終濃度の０．５μｇ／ｍＬ臭化エチジウムで補充した１．５％アガロースゲル中での電気泳動により分離した。最も可視のバンドパターンを生成した緩衝液を最適なものとして選択した。その結果、次の緩衝液が選択された：ＣｒＭｉｎｉＩＩＩについてはＢｓ緩衝液；ＣｋＭｉｎｉＩＩＩについてはＧ１緩衝液；ＣｔＭｉｎｉＩＩＩについてはＢ１緩衝液；ＦｐＭｉｎｉＩＩＩについてはＢｓ緩衝液；ＦｎＭｉｎｉＩＩＩについてはＢＧ緩衝液；ＳｐＭｉｎｉＩＩＩについてはＲ緩衝液；ＴｍＭｉｎｉＩＩＩについてはＲ緩衝液；ＴｔＭｉｎｉＩＩＩについてはＢ１緩衝液。これらの条件では、明瞭な差が、切断産物の電気泳動の分離において得られたバンドパターンで観察され、これは、分析された酵素の配列選択性の差を反映する（図１）。

このように、インビトロ反応において精製された酵素を使用するための便利な条件が判定され、この特別のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ間の配列特異性の差の存在が示された。

＜実施例４＞
高スループット配列決定を使用する、特定のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅのための好ましい切断配列の判定
５μｇのΦ６ゲノムの限定された切断を、５分間各酵素で行なった（条件は表４に示されている）。反応で使用される特定の酵素の量は実施例３において示されるとおりのものだった。

反応は、２０ｍＭの濃度までＥＤＴＡを追加することによりクエンチされ、続いて、ＲＮＡをＧｅｎｅＪＥＴＲＮＡＣｌｅａｎｕｐａｎｄＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＭｉｃｒｏＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して精製した。精製された反応産物を、１分間９５度で変性させ、氷上で冷却し、次に、３’ＲＮＡ末端を、切断型ＲＮＡＫ２２７ＱリガーゼＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用して、１６度の温度で１６時間、５０ｐｍｏｌｓの５’の予めアデニル化されたアダプターＵｎｉＳｈＰｒｅＡ（表５）でライゲーションした。ライゲーション産物を、ＧｅｎｅＪＥＴＲＮＡＣｌｅａｎｕｐａｎｄＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＭｉｃｒｏＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、未使用のアダプターから精製し、次に、これらを、Ｍａｘｉｍａｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＵｎｉＳｈＰｒｅＡ配列に相補的なＵｎｉＳｈＲＴプライマー（表５）を使用して、逆転写反応の鋳型として使用した。反応は５０度の温度で５分間インキュベートされ、８０度の温度で５分間加熱することにより終了した。得られたｃＤＮＡをＧｅｎｅＪＥＴのＧｅｎｅＪＥＴＤＮＡＭｉｃｒｏＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して精製し、次に、３’−末端を、熱安定性リガーゼＡｐｐＤＮＡ／ＲＮＡ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を利用する、５０ｐｍｏｌｓの予めアデニル化されたアダプターＰｒｅＡ３Ｕｎｉｖ（表５）でライゲーションした。ライゲーション産物をＧｅｎｅＪＥＴＤＮＡＭｉｃｒｏＫｉｔで精製した。したがって、調製された二本鎖ｃＤＮＡを、ＭｉＳｅｑシークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において得られた産物の配列決定を可能にした一対のプライマー／アダプター（表５）を使用して、ＰＣＲ（１５−１８回の増幅サイクル）で増幅した。ＰＣＲ産物を１．５％のアガロースゲル上で分離し、２００〜７００の塩基対の間のサイズの断片をＧｅｎｅＪＥＴＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して再度単離した。

調製した材料を、ＭｉＳｅｑシークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いた高スループット配列決定に供した。この分析から得られた読み取り値は、エンドツーエンドモード（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄｍｏｄｅ）およびデフォルトパラメーターを用いるＧａｌａｘｙプラットフォーム（ｈｔｔｐ：／／ｕｓｅｇａｌａｘｙ．ｏｒｇ）上で利用可能なＢｏｗｔｉｅ２ソフトウェア（バージョン０．２）を用いて、Φ６バクテリオファージゲノム配列に整列された。Ｍｉｎｉ−ＩＩＩによる基質切断の幾何学的配置を考慮して、「＋」鎖のＸ位および「−」鎖のＸ＋１位で開始する読み取り値の総数を計算した。このようにして、Φ６バクテリオファージゲノム中の特定の部位の切断の評価を各酵素について確立した。各酵素の基質選択性を決定するために、２００個の最も頻繁な切断部位に隣接する１４ヌクレオチドの配列断片を使用した。この分析では、デノボモチーフ−ＭＥＭＥ２を見出すためのソフトウェアを使用し、１４ヌクレオチドに設定されたモチーフの最小幅を除いて、パラメーターをデフォルトに設定した。試験したＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの好ましい切断配列について確立されたプロファイルを図２に示す。このように、試験されたＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの配列選択性を特徴づけた。

＜実施例５＞
ＲＴ−ＰＣＲとＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅを用いた酵素合成とを使用して生成される、単離されたｄｓＲＮＡ基質の切断
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩヌクレアーゼによるＲＮＡ切断の産物の高スループット配列決定からのデータの分析から得られた結果を確認するために、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩヌクレアーゼの潜在的切断部位を含むバクテリオファージゲノムの短い断片（表６）を合成した。これを達成するために、Φ６ｄｓＲＮＡゲノムの逆転写を、Ｍａｘｉｍａｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびランダムな６ヌクレオチドプライマーを使用して行なった。続いて、高スループット配列決定の結果に基づいて、バクテリオファージゲノム中の部位を選択し、対のプライマーを設計して、ｄｓＲＮＡ中のこれらの部位を含む断片の増幅を可能にした。プライマーの一方はファージＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を導入し、他方はファージΦ６ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を導入した（表７）。

ｄｓＲＮＡ合成反応を、ＲｅｐｌｉｃａｔｏｒＲＮＡｉＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者が推奨するプロトコルに従って行った。合成反応の産物の濃度を分光測光法で測定した。

単離されたφ６バクテリオファージゲノム断片である基質を切断するために、記載の酵素のパネルを表４に記載の最適条件で使用した。切断産物を、ポリアクリルアミドゲル（８％、ＴＡＥ：４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ酢酸、および１ｍＭＥＤＴＡ）を用いた電気泳動により分離し、臭化エチジウムで１０分間染色し、ＵＶ光を用いて可視化した。選択された基質の切断の結果は図３に示される。

このように、高スループット配列決定の結果と、Φ６バクテリオファージゲノムにおけるＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの切断部位を同定するための記載された方法の適用性とが確認された。

＜実施例６＞
置換を備えた基質ライブラリの準備、および導入された置換を備えたｄｓＲＮＡ基質の世代
ｄｓＲＮＡ９１０Ｓ合成のための鋳型ＤＮＡを生成するために、および、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅによって認識されたモチーフの置換を導入するために、８０４位から９４８位までのファージゲノムＳ部分の断片を含むバクテリオファージゲノム断片のＲＴ−ＰＣＲで得られたｄｓＤＮＡをｐＵＣ１９プラスミドのＳｍａＩ部位に挿入し、それにより、ｐＵＣ９１０Ｓプラスミドが生成された。切断部位の各位置での置換は、ｐＵＣ９１０Ｓプラスミドを鋳型として用いたインサイドアウトＰＣＲ（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔＰＣＲ）と、ならびに変化を受けた位置に縮重配列を含む３組のプライマーと、を用いて得た（表８）。切断部位の外側の位置での置換は、ｐＵＣ９１０Ｓプラスミドを鋳型として用いたインサイドアウトＰＣＲ（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔＰＣＲ）、ならびにＡＣＣＵ配列外で単一の置換を導入する一対のプライマーを用いて得た（表８）。

得られたＰＣＲ産物の５’−末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してリン酸化し、Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して環状分子を再構築した。得られたプラスミドは、特定のクローンにおける置換を特徴づけるためにＤＮＡ配列決定に供された。ＭｉｎｉＩＩＩによって認識されたモチーフ配列の変化を含む、選択されたクローン（表９および１０）を、ＲｅｐｌｉｃａｔｏｒＲＮＡｉＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ｄｓＲＮＡ合成に使用した。

このように、厳密に制御されたシステムにおいてＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの配列選択性の正確かつ系統的な決定を可能にする基質のパネルが得られた。

＜実施例７＞
選択されたＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの切断速度に対する、認識された配列における置換の効果
表９に示される、ＡＣＣＵ配列の置換を含む９１０Ｓ基質の合成パネルを用いて、選択されたＭｉｎｉＩＩＩ酵素の切断速度を調べた。反応は、表（表４）に記載の特定の酵素にとって最適な状態で行なわれた。各反応に、１．２μｇのｄｓＲＮＡを添加した。続いて、反応開始から１５、３０、６０および１２０分後、１５μｌのアリコートを集め、３μｌのローディング色素および１．５μｌのフェノール：クロロホルム（１：１ｖ：ｖ）混合物と混合し、次いで試料を氷上で冷却した。ポリアクリルアミドゲル（８％、ＴＡＥ：４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ酢酸、および１ｍＭＥＤＴＡ）を５μｌの得られた混合物で充填し、続いて電気泳動し、臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）で１０分間染色し、ＵＶ光を用いてＲＮＡを可視化した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬソフトウェア（ＧＥＨｅａｌｔｃａｒｅ）を使用して、基質と、反応産物の中でより反応が大きかったものと、に対応するバンドの強度を測定することにより、産物対基質のモル比を濃度測定で判定した。速度は、反応が時間において直線的であった範囲から判定された。次に、得られた値を、ＡＣＣＵ配列を含む基質を切断する初速度に正規化した。結果を図４に示す。

表１０に示す、ＡＣＣＵ配列外の置換を含む９１０Ｓ基質変異体の合成パネルを用いて、選択されたＭｉｎｉ−ＩＩＩ酵素の切断効率を調べた。酵素の選択は高スループット配列決定の結果の分析に基づいて行なわれた。この実験では、４つの主要なヌクレオチドに加えて、この配列の外側のヌクレオチドも含む、認識された配列モチーフを有する酵素を使用した。反応は、ＡＣＣＵ配列における置換を含む９１０Ｓ基質の場合のように進行し、ここでは、反応はその開始から６０分後に終了した。切断効率を、産物のうちでより大きなものの量のパーセンテージを、反応時間の分の数値で割ることによって判定した。次に、得られた値を、ＡＣＣＵ配列を含む基質を切断する初速度に正規化した。結果を図５に示す。

このように、試験された酵素の正確な配列選択性が確立された。

＜実施例８＞
好ましい配列の認識に関与し得る構造要素の選択のためのｄｓＲＮＡ−ＢｓＭｉｎｉＩＩＩ複合体構造のモデルの使用
ｄｓＲＮＡ二量体複合体構造でのＢｓＭｉｎｉＩＩＩのモデルの視覚的分析の結果、構造の２つの要素が、切断する基質配列の選択に関与するＲＮＡ基質に十分近接して位置し、および、これらの２つの要素のアミノ酸配列の差は、種々の基質に対する選択において試験した酵素の間で観察される差の原因となり得る、ということがわかった。選択された構造要素はα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループ（図６）である。これらの構造要素によって果たされる役割の実験的検証のための方法の１つは、異なる配列を切断する選択性に対するこれらのＭｉｎｉ−ＩＩＩ領域のアミノ酸配列の変化の効果を試験することである。機能領域を正確に確立するために、アミノ酸配列のアライメントを、実施例１に記載された酵素について行った。α４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループに対応するタンパク質Ｍｉｎｉ−ＩＩＩアミノ酸配列の選択された断片は、配列レベルでの有意差を特徴とするが、その末端においては、進化の過程に保存された同様の位置が存在する。正確な同等物を構成するために、分析された酵素間の交換を目的とする配列フラグメントについては、その境界を、保存位置に直接隣接する位置に設定した。ＢｓＭｉｎｉＩＩＩアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）については、これらは、α４ヘリックスについてはアミノ酸４６−５２位であり、α５ｂ−α６ループについては８５−９８位である。ＣｔＭｉｎｉＩＩＩアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）については、これらは、α４ヘリックスについては５６−６２位であり、α５ｂ−α６ループについては９３−１０６位である。ＦｐＭｉｎｉＩＩＩアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）については、これらは、α４ヘリックスについては４５−５１位であり、α５ｂ−α６ループについては８２−９５位である。ＳｅＭｉｎｉＩＩＩアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）については、これらは、α４ヘリックスについては４３−４９位であり、α５ｂ−α６ループについては８２−９５位である。タンパク質のアミノ酸配列に関して、両方の構造要素を図７に示す。隣接するアミノ酸の位置は、表１１に示される。

このように、酵素間の配列特異性の要因となる要素の交換のための最適配列領域を画定するアミノ酸位置を選択した。

＜実施例９＞
野性型Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ間の構造要素を交換する方法
交換される（移植される）構造要素をコードする配列の短い断片を省いて、鋳型として用いた全プラスミドを含む産物を得るように、特定の酵素（ＦｐＭｉｎｉＩＩＩ、ＣｔＭｉｎｉＩＩＩ、ＢｓＭｉｎｉＩＩＩおよびＳｐＭｉｎｉＩＩＩ）の過剰産生に使用される組換えプラスミドをＰＣＲで増幅する。使用したプライマーの配列を表１２に示す。

ＰＣＲはＰｆｕポリメラーゼを使用して行なわれた。反応産物を、ＤＮＡ５’−末端をリン酸化するために、１ｍＭＡＴＰの存在下でファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、続いて、これらを、異なる微生物に由来する交換された要素をコードする配列を含む合成二本鎖オリゴヌクレオチドと、結合した（表１０）。α５ｂ−α６ループをコードする配列の場合、挿入物を、部分的に相補的な配列（表１１）を有する２つのオリゴヌクレオチドの再生から生じるハイブリッドの３’末端を埋めることによって得た。

ライゲーションを、５％ＰＥＧ４０００および５ユニットのファージＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で、室温で１時間行った。ライゲーション産物を用いてエシェリキア・コリ上位１０株を形質転換し、次いで実施例１に記載したように選択を行った。単一のコロニーからの材料を、挿入物全体を増幅したＴａｑポリメラーゼおよびＥＴ−ロングプライマーおよびＥＴ−リバースプライマー（表１２）を用いたＰＣＲで使用した。増幅産物を、ベクター配列に関して所望の挿入方向でクローンの選択を可能にする配列決定に供した。得られたキメラタンパク質が表（表１３）に列挙される。

このように、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅによる標的配列選択に関与する構造要素を交換するための有効な方法が開発され使用された。

＜実施例１０＞
交換された構造要素を有するＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅタンパク質変異体の発現および精製、およびその配列選択性の分析
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅキメラタンパク質の過剰発現および精製を、実施例２に記載のように行い、ここにおいて、エシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株をＭｉｎｉ−ＩＩＩキメラをコードする遺伝子を有するプラスミドで形質転換した。次の工程は、ｐＵＣ９１０Ｓ置換変異体から選択された基質を切断する初速度を測定することだった。
例８に記載されているように、これらの基質の切断のための導体測定を行なった。結果を図８に示す。酵素Ｃｔ（ＦｐＨ）ＭｉｎｉＩＩＩ、Ｃｔ（ＦｐＬ）ＭｉｎｉＩＩＩ、Ｃｔ（ＦｐＨＬ）ＭｉｎｉＩＩＩおよびＢ（ＦｐＨ）ＭｉｎｉＩＩＩは、キメラタンパク質（ＣｔＭｉｎｉＩＩＩおよびＦｐＭｉｎｉＩＩＩ）を形成する初期の酵素両方に関して増加した活性を示した。酵素Ｃｔ（ＦｐＨ）ＭｉｎｉＩＩＩ、Ｃｔ（ＦｐＬ）ＭｉｎｉＩＩＩおよびＣｔ（ＦｐＨＬ）ＭｉｎｉＩＩＩは、著しく変更された配列選択性を示した。９１０Ｓ−ＵＧＣＡ基質は野生型ＣｔＭｉｎｉＩＩＩにより非常にゆっくり切断されるが、キメラタンパク質Ｃｔ（ＦｐＬ）はこの基質をはるかに速く切断し、キメラタンパク質Ｃｔ（ＦｐＨ）はこの基質を９１０Ｓ−ＡＣＣＵ基質を切断する速度に近い速度で切断する。キメラタンパク質Ｃｔ（ＦｐＨＬ）の場合、９１０Ｓ−ＵＧＣＡ基質は、ＦｐＭｉｎｉＩＩＩ供与体の効率と同様の効率で、元の９１０Ｓ−ＡＣＣＵ基質よりも約３倍速く切断される（図８）。

このように、触媒活性の変化／増加、および／または、配列選択性の変化を有する酵素を得るための方法として、移植可能なα４ヘリックスおよび／または移植可能なα５ｂ−α６ループを交換する方法の有効性を実証した。

＜配列表＞
ＳＥＱＩＤＮＯ１−バチルス・スブチリスからのＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのアミノ酸配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ２−カルディセルロシルプター・クリストヤンソニーからのＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのアミノ酸配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ３−カルディセルロシルプター・クリストヤンソニーからのＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのヌクレオチド配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ４−クロストリジウム・ラモーサムからのＣｒＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのアミノ酸配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ５−クロストリジウム・ラモーサムからのＣｒＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのヌクレオチド配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ６−クロストリジウム・サーモセラムからのＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのアミノ酸配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ７−クロストリジウム・サーモセラムからのＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのヌクレオチド配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ８−フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからのＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのアミノ酸配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ９−フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからのＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのヌクレオチド配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ１０−フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタムからのＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのアミノ酸配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ１１−フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタムからのＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのヌクレオチド配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ１２−スタフィロコッカス・エピデルミデスからのＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのアミノ酸配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ１３−スタフィロコッカス・エピデルミデスからのＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのヌクレオチド配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ１４−サーモトガ・マリティマからのＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのアミノ酸配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ１５−サーモトガ・マリティマからのＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのヌクレオチド配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ１６−現在はカルダナエロバクター・サブテラネウス亜種テンコンジェンシスである、サーモアナエロバクター・テンコンジェンシスからのＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのアミノ酸配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ１７−現在はカルダナエロバクター・サブテラネウス亜種テンコンジェンシスである、サーモアナエロバクター・テンコンジェンシスからのＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔＲＮａｓｅのヌクレオチド配列；
ＳＥＱＩＤＮＯ１８−キメラタンパク質のアミノ酸配列−Ｃｔ（ＦｐＨ）；
ＳＥＱＩＤＮＯ１９−キメラタンパク質のヌクレオチド配列−Ｃｔ（ＦｐＨ）；
ＳＥＱＩＤＮＯ２０−キメラタンパク質のアミノ酸配列−Ｃｔ（ＦｐＬ）；
ＳＥＱＩＤＮＯ２１−キメラタンパク質のヌクレオチド配列−Ｃｔ（ＦｐＬ）；
ＳＥＱＩＤＮＯ２２−キメラタンパク質のアミノ酸配列−Ｃｔ（ＦｐＨＬ）；
ＳＥＱＩＤＮＯ２３−キメラタンパク質のヌクレオチド配列−Ｃｔ（ＦｐＨＬ）；
ＳＥＱＩＤＮＯ２４−キメラタンパク質のアミノ酸配列−Ｂｓ（ＦｐＨ）；
ＳＥＱＩＤＮＯ２５−キメラタンパク質のヌクレオチド配列−Ｂｓ（ＦｐＨ）；
ＳＥＱＩＤＮＯ２６−キメラタンパク質のアミノ酸配列−Ｂｓ（ＦｐＬ）；
ＳＥＱＩＤＮＯ２７−キメラタンパク質のヌクレオチド配列−Ｂｓ（ＦｐＬ）；
ＳＥＱＩＤＮＯ２８−キメラタンパク質のアミノ酸配列−Ｓｅ（ＦｐＨ）；
ＳＥＱＩＤＮＯ２９−キメラタンパク質のヌクレオチド配列−Ｓｅ（ＦｐＨ）；
ＳＥＱＩＤＮＯ２９〜１０２−意味は明細書中に提供される；
ＳＥＱＩＤＮＯ１０３−ｄｓＲＮＡ切断が生じる、バクテリオファージｐｈｉ６（Φ６）ゲノムの断片である、基質（９１０Ｓ）のうちの１つからの断片のヌクレオチド配列。

Claims

アミノ酸配列を有するＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅであって、アミノ酸配列は、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ構造において、アクセプター部分、およびα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造を形成する、それぞれ、移植可能なα４ヘリックス及び／又は移植可能なα５ｂ−α６ループを含み、
ここでα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造を形成する断片は、それぞれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるバチルス・スブチリスからのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの、それぞれ、４６−５２位および８５−９８位のアミノ酸配列断片によって形成されたα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループのそれぞれの構造に構造的に対応しており、
ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、基質のリボヌクレオチド配列にのみ依存している、および基質の構造における二次構造の出現から独立している、並びに他の補助タンパク質の存在から独立しているｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、およびＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１や、Ｄ９４Ｒ突然変異を有するＳＥＱＩＤＮＯ：１のバチルス・スブチリスからのＭｉｎｉ−ＩＩＩタンパク質ではない、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ。
アミノ酸配列が、１つの微生物のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅに由来するアクセプター部分、および異なる微生物のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅからのα４ヘリックス及び／又はα５ｂ−α６ループの配列に由来する、それぞれ、挿入される移植可能なα４ヘリックス及び／又は移植可能なα５ｂ−α６ループから構成されることを特徴とする、請求項１に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ。
アミノ酸配列が、
ＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、カルディセルロシルプター・クリストヤンソニーのＭｉｎｉ−ＩＩＩＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、クロストリジウム・ラモーサムのＣｒＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、クロストリジウム・サーモセラムのＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィのＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタムのＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、スタフィロコッカス・エピデルミデスのＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）、サーモトガ・マリティマのＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、または現在はカルダナエロバクター・サブテラネウス亜種テンコンジェンシスである、サーモアナエロバクター・テンコンジェンシスのＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）、あるいはそれらと少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一であるアミノ酸配列に由来する、アクセプター部分；
ＳＥＱＩＤＮＯ：１の４６−５２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の３６−４２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の４０−４６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の５６−６２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２の４３−４９位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１６の５０−５６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、あるいはそれらと少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一であるアミノ酸配列に由来する、移植可能なα４ヘリックス、及び／又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：１の８５−９８位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の７３−８６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の７９−８８位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の９３−１０６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４の８２−９３位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１６の８７−１００位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、あるいはそれらと少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一であるアミノ酸配列に由来する、移植可能なα５ｂ−α６ループ、を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるカルディセルロシルプター・クリストヤンソニーからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕであり；Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであり；Ｙ＝Ｃ、Ｕであることを特徴とする、請求項１に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されるクロストリジウム・ラモーサムからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕであり；Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであることを特徴とする、請求項１に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示されるクロストリジウム・サーモセラムからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであることを特徴とする、請求項１に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に示されるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであることを特徴とする、請求項１に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示されるフソバクテリウム・ヌクレアタムからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであることを特徴とする、請求項１に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるスタフィロコッカス・エピデルミデスからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕであり；Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであることを特徴とする、請求項１に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示されるサーモトガ・マリティマからの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕであり；Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであることを特徴とする、請求項１に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ活性を維持し、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に示されるサーモアナエロバクター・テンコンジェンシス（カルダナエロバクター・サブテラネウス亜種テンコンジェンシス）からの配列またはアミノ酸配列の断片を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕであり；Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであり；Ｙ＝Ｃ、Ｕであることを特徴とする、請求項１に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８のＣｔ（ＦｐＨ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０のＣｔ（ＦｐＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２のＣｔ（ＦｐＨＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４のＢｓ（ＦｐＨ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６のＢｓ（ＦｐＬ）、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８のＳｅ（ＦｐＨ）から選択されるキメラタンパク質であることを特徴とする、請求項１−３に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ。
キメラＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅを得る方法であって、該方法が、
ａ）Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子をクローン化する工程であって、そのアミノ酸配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるバチルス・スブチリスからのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの、それぞれ、４６−５２位および８５−９８位のアミノ酸配列断片によって形成されたα４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループのそれぞれの構造に構造的に対応している、それぞれ、α４ヘリックスおよびα５ｂ−α６ループの構造を形成する断片を含む、工程、
ｂ）それぞれ、α４ヘリックス及び／又はα５ｂ−α６ループの構造をコードする断片の少なくとも１つを、異なる微生物のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子からの、それぞれ、α４ヘリックス及び／又はα５ｂ−α６ループの構造をコードする断片と交換することによって、Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子を組み換える工程を含み、
ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、リボヌクレオチド配列にのみ依存している及び基質の構造における二次構造の出現から独立している、並びに他の補助タンパク質の存在から独立しているｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、
およびＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１や、Ｄ９４Ｒ突然変異を有するＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有するバチルス・スブチリスからのＭｉｎｉ−ＩＩＩタンパク質ではないことを特徴とする、方法。
工程ｂ）が、アクセプター部分への移植可能なα４ヘリックス及び／又は移植可能なα５ｂ−α６ループの挿入を含み、ここで
アクセプター部分が、ＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔのＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、カルディセルロシルプター・クリストヤンソニーのＭｉｎｉ−ＩＩＩＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、クロストリジウム・ラモーサムのＣｒＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、クロストリジウム・サーモセラムのＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィのＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタムのＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）、スタフィロコッカス・エピデルミデスのＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）、サーモトガ・マリティマのＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）、または現在はカルダナエロバクター・サブテラネウス亜種テンコンジェンシスである、サーモアナエロバクター・テンコンジェンシスのＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）に由来するか、あるいはそれらと少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一であるアミノ酸配列を含み、
移植可能なα４ヘリックスが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の４６−５２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の３６−４２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の４０−４６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の５６−６２位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２の４３−４９位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４の４５−５１位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１６の５０−５６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔに由来するか、あるいはそれらと少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一であるアミノ酸配列を含み、及び／又は
移植可能なα５ｂ−α６ループが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の８５−９８位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＢｓＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の７３−８６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｋＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の７９−８８位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の９３−１０６位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＣｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｐＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＦｎＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２の８２−９５位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＳｅＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４の８２−９３位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｍＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔ、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１６の８７−１００位のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＴｔＭｉｎｉＩＩＩ^ｗｔに由来するか、あるいはそれらと少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子における移植可能なα４ヘリックスおよび移植可能なα５ｂ−α６ループが、異なる微生物に由来することを特徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子が、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、２０、２２、２４、２６、２８から成る群からのアミノ酸配列をコードする配列を含むことを特徴とする、請求項１３−１５に記載の方法。
ｃ）工程ｂ）から遺伝子を発現する細胞を培養する工程、および
ｄ）工程ｃ）から発現されたタンパク質を単離し、精製する工程、および随意に
ｅ）工程ｄ）で得られたタンパク質の配列特異性を決定する工程、をさらに含むことを特徴とする、請求項１３−１６に記載の方法。
請求項１３−１７に記載の方法で得られたＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅ。
請求項１−１２、１８に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする構築物。
請求項１−１２、１８に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅをコードする遺伝子、または請求項１９に記載の構築物を含む、細胞。
リボヌクレオチド配列にのみ依存している、および基質の構造における二次構造の出現から独立している、並びに他の補助タンパク質の存在から独立している方法でｄｓＲＮＡを切断するための請求項１−１２および１８に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅの使用。
リボヌクレオチド配列にのみ依存している、および基質の構造における二次構造の出現から独立している、並びに他の補助タンパク質の存在から独立している方法でｄｓＲＮＡを切断する方法であって、該方法が、ｄｓＲＮＡ基質と請求項１−１２または請求項１８に記載のＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅとの間の相互作用を含むことを特徴とする、方法。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示されるカルディセルロシルプター・クリストヤンソニーからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕであり；Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであり；Ｙ＝Ｃ、Ｕであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されるクロストリジウム・ラモーサムからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕであり；Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示されるクロストリジウム・サーモセラムからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に示されるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に示されるフソバクテリウム・ヌクレアタムからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に示されるスタフィロコッカス・エピデルミデスからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕであり；Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に示されるサーモトガ・マリティマからの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕであり；Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
Ｍｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に示されるサーモアナエロバクター・テンコンジェンシス（カルダナエロバクター・サブテラネウス亜種テンコンジェンシス）からの配列を含み、ここでＭｉｎｉ−ＩＩＩＲＮａｓｅが、ｄｓＲＮＡ切断における配列特異性を示し、以下のコンセンサス配列内のｄｓＲＮＡを切断し：
ここで、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕであり；Ｗ＝Ａ、Ｕであり；Ｓ＝Ｃ、Ｇであり；Ｙ＝Ｃ、Ｕであることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。