JP2016216492A - 前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロrnaに基づく方法及び組成物 - Google Patents
前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロrnaに基づく方法及び組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016216492A JP2016216492A JP2016139495A JP2016139495A JP2016216492A JP 2016216492 A JP2016216492 A JP 2016216492A JP 2016139495 A JP2016139495 A JP 2016139495A JP 2016139495 A JP2016139495 A JP 2016139495A JP 2016216492 A JP2016216492 A JP 2016216492A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mir
- biomarker
- expression
- prostate
- prostate cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
- C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/31—Combination therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Virology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
【課題】前立腺関連障害の診断、予後診断及び/又は治療のための方法及び組成物の提供。【解決手段】前立腺癌を有する対象における前立腺癌細胞中のタンパク質発現を調節するための医薬組成物であって、前立腺癌細胞中のタンパク質レベルを調節するために十分な有効量のmiR−106b遺伝子産物を含む、医薬組成物。【選択図】なし
Description
関連出願への相互参照
[0001]本出願は、2008年2月28日出願の米国仮出願番号61/067,518の権益を主張し、その全ての開示は参照により本明細書に明確に組み入れられる。
[0001]本出願は、2008年2月28日出願の米国仮出願番号61/067,518の権益を主張し、その全ての開示は参照により本明細書に明確に組み入れられる。
連邦政府委託の研究に関する宣言
[0002]本発明は、NIHのIntramural Research Program、National Cancer Institute、Center for Cancer Research及びNational Institutes of Health の助成金番号 CAO81534及びCA128609のもと、政府の支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有す
る。
[0002]本発明は、NIHのIntramural Research Program、National Cancer Institute、Center for Cancer Research及びNational Institutes of Health の助成金番号 CAO81534及びCA128609のもと、政府の支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有す
る。
本発明の技術分野及び産業上の利用可能性
[0003]本発明は一般的には分子生物学の分野に関する。本発明のある側面は、前立腺関連障害の診断法、治療法及び予後診断法における応用を含む。
[0003]本発明は一般的には分子生物学の分野に関する。本発明のある側面は、前立腺関連障害の診断法、治療法及び予後診断法における応用を含む。
[0004]このセクションで開示された背景技術が合法的に先行技術を構成すると認められるものではない。
[0005]遺伝子マイクロアレイから導き出された発現プロファイルは、前立腺癌の生物学に新しい見識を提供する。前立腺腫瘍におけるmRNA発現のパターンは、グリーソンスコア、浸潤性腫瘍サブタイプ及び疾患再発に関連付けられてきた(1;2)。加えて、原発性腫瘍から導き出されたmRNA発現シグネチャーは、前立腺癌の早期発見のための新規候補診断マーカー、例えば、a−メチルアシル−CoAラセマーゼの発見を導いた(3)。これらの発見は、切除された腫瘍の遺伝子発現プロファイルが、前立腺癌のための新しい診断及び予後マーカーを同定する機会を与えることを示している。
[0005]遺伝子マイクロアレイから導き出された発現プロファイルは、前立腺癌の生物学に新しい見識を提供する。前立腺腫瘍におけるmRNA発現のパターンは、グリーソンスコア、浸潤性腫瘍サブタイプ及び疾患再発に関連付けられてきた(1;2)。加えて、原発性腫瘍から導き出されたmRNA発現シグネチャーは、前立腺癌の早期発見のための新規候補診断マーカー、例えば、a−メチルアシル−CoAラセマーゼの発見を導いた(3)。これらの発見は、切除された腫瘍の遺伝子発現プロファイルが、前立腺癌のための新しい診断及び予後マーカーを同定する機会を与えることを示している。
[0006]最近、マイクロRNAと名付けられた小さなRNAの新規クラスが記述されており(4)、それは、mRNA安定性及びタンパク質へのmRNAの翻訳の両方を変調することにより、mRNA機能を調節することが発見された(5;6)。マイクロRNA遺伝子は、多シストロン性配置に複数のマイクロRNAをコードすることができる、pri−mRNAと呼ばれる大きな前駆体RNAとして発現される(7)。これらの前駆体は、核リボヌクレアーゼIII酵素、ドローシャ及びサイトゾルリボヌクレアーゼIII酵素、ダイサーにより19〜25ヌクレオチドの成熟マイクロRNAに変換される。これらの二つの酵素及びそれらの補助因子、例えば、DGCR8/Pasha、TRBP、及びEIF2C2/アルゴノート−2は、マイクロRNAプロセッシング活性の鍵となる成分である。それらの発現レベルの変化は、細胞機能を変化させることができ、そして細胞形質転換を誘発する(8)。
[0007]癌におけるマイクロRNAの決定的な役割が示されてきた(9)。それらの発現は、一般に固形ヒト腫瘍において変えられている(10−13)。マイクロRNA発現プロファイルは、発生系列及び分化状態によっても腫瘍を分類する(10;14)。複数のマイクロRNAが発癌特性を有していること(15−17)、又は腫瘍抑制遺伝子のように働くこと(18;19)が示されてきた。これらのマイクロRNAはオンコmiR(oncomiR)と名付けられている(20)。それらの発現における変化は、癌発生の原因とし
て関係がある。
て関係がある。
Glinsky,G.V., Glinskii,A.B., Stephenson,A.J., Hoffrnan,R.M., and Gerald,W.L. 2004. Gene expression profiling predicts clinical outcome of prostate cancer. J Clin.Invest 113:913-923.
Lapointe,J., Li,C., Higgins,J.P., Van De,R.M., Bair,E., Montgomery,K., Ferrari,M., Egevad,L., Rayford,'VW., Bergerheim,U, et al. 2004. Gene expression profiling identifies clinically relevant subtypes of prostate cancer. Prot Natl Acad Sc. U.S.A 101:811-816.
Bradford,T.J., Tomlins,S.A., Wang,X., and Chinnaiyan,A.M. 2006. Molecular markers of prostate cancer. Urol. Oncol. 24:538-551.
Barte1,D.P. 2004. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116:281-297.
Lim,L.P., Lau,N.C., Garrett-Engele,P., Grimson,A., Schelter,J.M., Castle,J., Bartel,D.P., Linsley,P.S., and Johnson,J.M. 2005. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature 433:769-773.
He,L. and Hannon,G.J. 2004. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat. Rev. Genet. .5:522-531.
Yu,J., Wang,F., Yang,G.H., Wang,F.L., Ma,Y.N., Du,Z.W., and Zhang,J.W. 2006. Human microRNA clusters: genomic organization and expression profile in leukemia cell lines. Biochern Biophys.Res Commmn.. 349:59-68.
Kumar,M.S., Lu,J., Mercer,K.L., Golub,T.R., and Jacks,T. 2007. Impaired microRNA processing enhances cellular transformation and tumorigenesis. Nat. Genet.. 39:673-677.
Calin,G.A. and Croce,C.M. 2006. MicroRNA signatures in human cancers. Nat.Rev.Cancer 6:857-866.
Volinia,S., Calin,G.A., Liu,C.G., Ambs,S., Cimmino,A., Petrocca,F., Visone,R., Iorio,M., Roldo,C., Ferracin,M. et al. 2006. A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc.Natl.Acad Sci U.S .A 103:2257-2261.
Michael,M.Z., O’Connor,S.M., Hoist Pellekaan,N.G., Young,G.P., and James,R.J. 2003. Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia. Mol. Cancer Res. 1:882-891.
Iorio,M.V., Ferracin,M., Liu,C.G., Veronese,A., Spizzo,R., Sabbioni,S., Magri,E., Pedriali,M., Fabbri,M., Campiglio,M. et al. 2005. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer. Cancer Res 65:7065-7070.
Roldo,C., Missiaglia,E., Hagan,J.P., Falconi,M., Capelli,P., Bersani,S., Calin,G.A., Volinia,S., Liu,C.G., Scarpa,A. et al. 2006. MicroRNA expression abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors are associated with distinctive pathologic features and clinical behavior. J Clin Oncol. 24:4677-4684.
Lu,J., Getz,G., Miska,E.A., Alvarez-Saavedra,E., Lamb,J., Peck,D., Sweet-Cordero,A., Ebert,B.L., Mal:,R.H., Ferrando,A.A. et al. 2005. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature 435:834-838.
He,L., Thomson,J.M.,Hemann,M.T., Hernando-Monge,E., Mu,D., Goodson,S., Powers,S., Cordon-Cardo,C., Lowe,S.W., Hannon,G.J. et al. 2005. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature 435:828-833.
Voorhoeve,P.M., le Sage,C., Schrier,M., Gillis,A.J., Stoop,H., Nagel,R., Liu,Y.P., van Duijse,J., Drost,J., Griekspoor,A. et al. 2006. A genetic screen implicates miRNA-372 and miRNA-373 as oncogenes in testicular germ cell tumors. Cell 124:1169-1181.
Costinean,S., Zanesi,N., Pekarsly,Y., Tili,E., Volinia,S., Heerema,N., and Croce,C.M. 2006. Pre-B cell proliferation and lymphoblastic leukemia/high-grade lymphoma in E(mu)-miR155 transgenic mice. Proc Natl.Acad.,Sci U.S.A 103:7024-7029.
Cimmino,A., Calin,G.A., Fabbri,M., Iorio,M.V., Ferracin,M., Shimizu,M., Wojcik,S.E., Ageilan,R.I., Zupo,S., Dono,M. et al. 2005. miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proc.Natl.Acad.Sci U,S.A 102:13944-13949.
Welch,C., Chen,Y., and Stallings,R.L. 2007. MicroRNA-34a functions as a potential tumor suppressor by inducing apoptosis in neuroblastoma cells. Oncogene 26:5017-5022.
Esquela-Kerscher,A. and Slack,F.J. 2006. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nat. Rev. Cancer 6:259-269.
[0008]これらの疾患を治療するための療法についてのかなりの研究にもかかわらず、現在でも効果的に診断する及び治療するのが困難であり、患者で観察された死亡率は、前立腺癌の診断、治療及び予防の改善が必要とされていることを示している。
要約
[0009]第一の広範な側面において、対象が前立腺関連障害を有する、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する、前立腺癌関連障害を有する対象の予後を決定する、及び/又は前立腺関連障害を有する対象において前立腺関連障害を治療する方法が本明細書に記載され、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較した、該試験サンプル中の該バイオマーカーのレベルの変化は、該対象が該障害を有するか、又は発症するリスクがあることを示す。
[0009]第一の広範な側面において、対象が前立腺関連障害を有する、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する、前立腺癌関連障害を有する対象の予後を決定する、及び/又は前立腺関連障害を有する対象において前立腺関連障害を治療する方法が本明細書に記載され、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較した、該試験サンプル中の該バイオマーカーのレベルの変化は、該対象が該障害を有するか、又は発症するリスクがあることを示す。
[00010]ある態様において、該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーの
レベルは、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも低い。
[00011] ある態様において、該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルは、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも高い。
レベルは、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも低い。
[00011] ある態様において、該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルは、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも高い。
[00012]ある態様において、腫瘍組織及び非腫瘍組織間で差次的に発現される該少なく
とも一つのバイオマーカーは、図11−表2に列挙されたmiR又はそれらの機能的変異体の一つ又はそれ以上である。
とも一つのバイオマーカーは、図11−表2に列挙されたmiR又はそれらの機能的変異体の一つ又はそれ以上である。
[00013]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、前立腺腫瘍におい
て上方調節されている、図11−表2に列挙された一つ以上のmiR:miR−32、miR−182、miR−31、miR−26a−l/2、miR−200c、miR−375、miR−196a−1/2、miR−370、miR−425、miR−194−1/2、miR−181a−l/2、miR−34b、let−7i、miR−188、miR−25、miR−106b、miR−449、miR−99b、miR−93、miR−92−1/2、miR−125a、又はそれらの機能的変異体から選択される。
て上方調節されている、図11−表2に列挙された一つ以上のmiR:miR−32、miR−182、miR−31、miR−26a−l/2、miR−200c、miR−375、miR−196a−1/2、miR−370、miR−425、miR−194−1/2、miR−181a−l/2、miR−34b、let−7i、miR−188、miR−25、miR−106b、miR−449、miR−99b、miR−93、miR−92−1/2、miR−125a、又はそれらの機能的変異体から選択される。
[00014]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、前立腺腫瘍におい
て下方調節されている、図11−表2に列挙された一つ以上のmiR:miR−520h、miR−494、miR−490、miR−133a−l、miR−1−2、miR−218−2、miR−220、miR−128a、miR−221、miR−499、miR−329、miR−340、miR−345、miR−410、miR−126、miR−205、miR−7−1/2、miR−145、miR−34a、miR−487、let−7b、又はそれらの機能的変異体から選択される。
て下方調節されている、図11−表2に列挙された一つ以上のmiR:miR−520h、miR−494、miR−490、miR−133a−l、miR−1−2、miR−218−2、miR−220、miR−128a、miR−221、miR−499、miR−329、miR−340、miR−345、miR−410、miR−126、miR−205、miR−7−1/2、miR−145、miR−34a、miR−487、let−7b、又はそれらの機能的変異体から選択される。
[00015]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、前立腺外の疾患に
関連し、図12−表3に列挙されたmiR:miR−101−1/2、miR−200a、miR−200b、miR−196a−l/2、miR−30c−l/2、miR−484、miR−99b、miR−186、miR−195、let−7f−2、miR−34c、miR−371、miR−373、miR−410及びmiR−491、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
関連し、図12−表3に列挙されたmiR:miR−101−1/2、miR−200a、miR−200b、miR−196a−l/2、miR−30c−l/2、miR−484、miR−99b、miR−186、miR−195、let−7f−2、miR−34c、miR−371、miR−373、miR−410及びmiR−491、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
[00016]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、前立腺腫瘍におい
てmiR−1及び標的遺伝子転写体レベル間で逆相関を示し、図13A−表4Aに列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
てmiR−1及び標的遺伝子転写体レベル間で逆相関を示し、図13A−表4Aに列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
[00017]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、図13B−表4B
に列挙されたmiR:miR−1、miR−31、miR−32、miR−128a、miR−133a、miR−181a、miR−182、miR−194、miR−196a、miR−200c、miR−218−2、miR−220、miR−329、miR−338、miR−369、miR−409−3p、miR−410、miR−448、miR−490、miR−494、miR−499、miR−520 h、及びlet−7i、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
に列挙されたmiR:miR−1、miR−31、miR−32、miR−128a、miR−133a、miR−181a、miR−182、miR−194、miR−196a、miR−200c、miR−218−2、miR−220、miR−329、miR−338、miR−369、miR−409−3p、miR−410、miR−448、miR−490、miR−494、miR−499、miR−520 h、及びlet−7i、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
[00018]ある態様において、該方法は、前立腺腫瘍におけるmiR−181aと負の相
関を示しているプローブセットを含み、該プローブセットは図14−表5に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上を含む。
関を示しているプローブセットを含み、該プローブセットは図14−表5に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上を含む。
[00019]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、アンドロゲン応答
性バイオマーカーであり、図15−表6に列挙されたmiR:miR−338、miR−126−5p、mir−181b−lクラスター、miR181cクラスター、miR−219−5p及びmiR221クラスター、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
性バイオマーカーであり、図15−表6に列挙されたmiR:miR−338、miR−126−5p、mir−181b−lクラスター、miR181cクラスター、miR−219−5p及びmiR221クラスター、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
[00020]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、図16−表7に列
挙されたmiR:miR−126miR−146b、miR−146b、miR−181b−lmiR−181b−lmiR−181b−lmiR−181b−lmiR−181b−lmiR−181cmiR−181cmiR−219−1miR−219−1miR−219−1miR−221、miR−221、miR−221、miR−221、miR−338、miR−338、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
挙されたmiR:miR−126miR−146b、miR−146b、miR−181b−lmiR−181b−lmiR−181b−lmiR−181b−lmiR−181b−lmiR−181cmiR−181cmiR−219−1miR−219−1miR−219−1miR−221、miR−221、miR−221、miR−221、miR−338、miR−338、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される。
[00021]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、前立腺癌において
神経周囲の浸潤を伴った腫瘍中で上方調節されており、図23−表9に列挙された、miR:miR−224、miR−21、miR−10(a/b)、miR−125b(−1/2)、miR−30a/b/c−2/d、miR−100、miR−24(−1/2)、miR−15a−2、miR−191、miR−99b、miR−27a/b、miR−26a(−1/2)、miR−126、miR−145、miR−195、miR−181a−l、miR−199b、miR−151、let−7g又はそれらの機能的変異
体の一つ以上から選択される。
神経周囲の浸潤を伴った腫瘍中で上方調節されており、図23−表9に列挙された、miR:miR−224、miR−21、miR−10(a/b)、miR−125b(−1/2)、miR−30a/b/c−2/d、miR−100、miR−24(−1/2)、miR−15a−2、miR−191、miR−99b、miR−27a/b、miR−26a(−1/2)、miR−126、miR−145、miR−195、miR−181a−l、miR−199b、miR−151、let−7g又はそれらの機能的変異
体の一つ以上から選択される。
[00022]ある態様において、該少なくとも一つのバイオマーカーは、PNT腫瘍組織及
び非PNT腫瘍組織間で差次的に発現され、及び図24−表12に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上である。
び非PNT腫瘍組織間で差次的に発現され、及び図24−表12に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上である。
[00023]ある態様において、方法は、前立腺腫瘍におけるDicer及びDGCR8、
及び/又は高グリーソンスコアを有する腫瘍におけるDicer及びアルゴノート−2をコードするEIF2C2の一つ以上の増加した発現を含む。
及び/又は高グリーソンスコアを有する腫瘍におけるDicer及びアルゴノート−2をコードするEIF2C2の一つ以上の増加した発現を含む。
[00024]ある態様において、該サンプルは血液サンプルを含む。
[00025]ある態様において、該サンプルは血清又は血漿血液サンプルの一つ以上を含む
。
[00025]ある態様において、該サンプルは血清又は血漿血液サンプルの一つ以上を含む
。
[00026]別の側面において、腫瘍組織及び非腫瘍組織間で差次的に発現され、図11−
表2に列挙されたmiR又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
表2に列挙されたmiR又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00027]別の側面において、前立腺腫瘍において上方調節されている、図11−表2に
列挙された一つ以上のmiR:miR−32、miR−182、miR−31、miR−26a−1/2、miR−200c、miR−375、miR−196a−l/2、miR−370、miR−425、miR−194−1/2、miR−181a−l/2、miR−34b、let−7i、miR−188、miR−25、miR−106b、miR−449、miR−99b、miR−93、miR−92−1/2、miR−125a、又はそれらの機能的変異体から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
列挙された一つ以上のmiR:miR−32、miR−182、miR−31、miR−26a−1/2、miR−200c、miR−375、miR−196a−l/2、miR−370、miR−425、miR−194−1/2、miR−181a−l/2、miR−34b、let−7i、miR−188、miR−25、miR−106b、miR−449、miR−99b、miR−93、miR−92−1/2、miR−125a、又はそれらの機能的変異体から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00028]別の側面において、前立腺腫瘍において下方調節されている、図11−表2に
列挙された一つ以上のmiR:miR−520h、miR−494、miR−490、miR−133a−l、miR−1−2、miR−218−2、miR−220、miR−128a、miR−221、miR−499、miR−329、miR−340、miR−345、miR−410、miR−126、miR−205、miR−7−1/2、miR−145、miR−34a、miR−487、let−7b、又はそれらの機能的変異体から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
列挙された一つ以上のmiR:miR−520h、miR−494、miR−490、miR−133a−l、miR−1−2、miR−218−2、miR−220、miR−128a、miR−221、miR−499、miR−329、miR−340、miR−345、miR−410、miR−126、miR−205、miR−7−1/2、miR−145、miR−34a、miR−487、let−7b、又はそれらの機能的変異体から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00029]別の側面において、前立腺外疾患に関連し、そして図12−表3に列挙された
miR:miR−101−1/2、miR−200a、miR−200b、miR−196a−l/2、miR−30c−l/2、miR−484、miR−99b、miR−186、miR−195、let−7f−2、miR−34c、miR−371、miR−373、miR−410及びmiR−491、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
miR:miR−101−1/2、miR−200a、miR−200b、miR−196a−l/2、miR−30c−l/2、miR−484、miR−99b、miR−186、miR−195、let−7f−2、miR−34c、miR−371、miR−373、miR−410及びmiR−491、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00030]別の側面において、図13A−表4Aに列挙された遺伝子又はそれらの機能的
変異体の一つ以上を含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00031]別の側面において、図13B−表4Bに列挙されたmiR:miR−1、mi
R−31、miR−32、miR−128a、miR−133a、miR−181a、miR−182、miR−194、miR−196a、miR−200c、miR−218−2、miR−220、miR−329、miR−338、miR−369、miR−4
09−3p、miR−410、miR−448、miR−490、miR−494、miR−499、miR−520h、及びlet−7i、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択されるバイオマーカーが本明細書に記載されている。
変異体の一つ以上を含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00031]別の側面において、図13B−表4Bに列挙されたmiR:miR−1、mi
R−31、miR−32、miR−128a、miR−133a、miR−181a、miR−182、miR−194、miR−196a、miR−200c、miR−218−2、miR−220、miR−329、miR−338、miR−369、miR−4
09−3p、miR−410、miR−448、miR−490、miR−494、miR−499、miR−520h、及びlet−7i、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択されるバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00032]別の側面において、前立腺腫瘍においてmiR−181aと逆相関を示すプロ
ーブセットを含むバイオマーカーが本明細書に記載されており、該プローブセットは、図14−表5に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上を含む。
ーブセットを含むバイオマーカーが本明細書に記載されており、該プローブセットは、図14−表5に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上を含む。
[00033]別の側面において、アンドロゲン応答性バイオマーカーであり、そして図15
−表6に列挙されたmiR:miR−338、miR−126−5p、mir−181b−lクラスター、miR181cクラスター、miR−219−5p、及びmiR221クラスター、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択された少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
−表6に列挙されたmiR:miR−338、miR−126−5p、mir−181b−lクラスター、miR181cクラスター、miR−219−5p、及びmiR221クラスター、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択された少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00034]別の側面において、図16−表7に列挙されたmiR:miR−126、mi
R−146b、miR−146b、miR−181b−l、miR−181b−l、miR−181b−1、miR−181b−1、miR−181b−l、miR−181c、miR−181c、miR−219−1、miR−219−1、miR−219−1、miR−221、miR−221、miR−221、miR−221、miR−338、miR−338、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
R−146b、miR−146b、miR−181b−l、miR−181b−l、miR−181b−1、miR−181b−1、miR−181b−l、miR−181c、miR−181c、miR−219−1、miR−219−1、miR−219−1、miR−221、miR−221、miR−221、miR−221、miR−338、miR−338、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00035]別の側面において、図23−表9に列挙された、前立腺癌で神経周囲の浸潤を
有する腫瘍において上方調節されているmiR:miR−224、miR−21、miR−10(a/b)、miR−125b(−1/2)、miR−30a/b/c−2/d、miR−100、miR−24(−1/2)、miR−15a−2、miR−191、miR−99b、miR−27a/b、miR−26a(−1/2)、miR−126、miR−145、miR−195、miR−181a−l、miR−199b、miR−151、let−7g、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
有する腫瘍において上方調節されているmiR:miR−224、miR−21、miR−10(a/b)、miR−125b(−1/2)、miR−30a/b/c−2/d、miR−100、miR−24(−1/2)、miR−15a−2、miR−191、miR−99b、miR−27a/b、miR−26a(−1/2)、miR−126、miR−145、miR−195、miR−181a−l、miR−199b、miR−151、let−7g、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00036]別の側面において、PNT腫瘍組織及び非PNT腫瘍組織間で差次的に発現さ
れ、図24−表12に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
れ、図24−表12に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、少なくとも一つのバイオマーカーを含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00037]別の側面において、前立腺腫瘍におけるダイサー及びDGCR8、及び/又は
高グリーソンスコアを有する腫瘍におけるダイサー及びアルゴノート−2をコードするEIF2C2;の一つ以上の増加した発現を含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
高グリーソンスコアを有する腫瘍におけるダイサー及びアルゴノート−2をコードするEIF2C2;の一つ以上の増加した発現を含むバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00038]別の側面において、前立腺腫瘍における特有のマイクロRNA発現シグネチャ
ーが本明細書に記載され、腫瘍マイクロRNAプロセッシングを調節する一つ以上のバイオマーカーの発現の変化を含む。
ーが本明細書に記載され、腫瘍マイクロRNAプロセッシングを調節する一つ以上のバイオマーカーの発現の変化を含む。
[00039]別の側面において、前立腺腫瘍における標的mRNAの転写体存在量及び/又
はタンパク質発現に影響を及ぼす方法が本明細書に記載され、それを必要とする対象において一つ以上のマイクロRNAを調節解除することを含む。
はタンパク質発現に影響を及ぼす方法が本明細書に記載され、それを必要とする対象において一つ以上のマイクロRNAを調節解除することを含む。
[00040]ある態様において、該方法はさらに、癌関連遺伝子のタンパク質発現を抑制す
ることを含む。
[00041] ある態様において、癌関連遺伝子のタンパク質発現を阻害するため、miR−32及びmiR−106bの一つ以上の発現を変化させることをさらに含む。
ることを含む。
[00041] ある態様において、癌関連遺伝子のタンパク質発現を阻害するため、miR−32及びmiR−106bの一つ以上の発現を変化させることをさらに含む。
[00042] 別の側面において、ヒト前立腺腫瘍で生じるマイクロRNA機能の変化を同定するための、マイクロRNA及びタンパク質コードRNAの両方の大規模遺伝子発現プロファイリングの使用が、本明細書に記載される。
[00043]別の側面において、前立腺関連障害についての腫瘍遺伝子シグネチャーが本明
細書に記載され、これは、上方調節されたmiR−32、続いてmiR−182、miR−31、miR−26a、miR−200c、miR−196a及びmiR−106b−25クラスター;の一つ以上;並びに/又は有意に下方制御されたmiR−520h、miR−494、miR−490及びmiR−l−133aクラスターの一つ以上;を含む。
細書に記載され、これは、上方調節されたmiR−32、続いてmiR−182、miR−31、miR−26a、miR−200c、miR−196a及びmiR−106b−25クラスター;の一つ以上;並びに/又は有意に下方制御されたmiR−520h、miR−494、miR−490及びmiR−l−133aクラスターの一つ以上;を含む。
[00044] 別の側面において、低誤差で前立腺外疾患進展に関連する腫瘍シグネチャーが本明細書に記載され、miR−101を含んでいる。
[00045]ある態様において、該バイオマーカーは、前立腺腫瘍で増加した、前立腺腫瘍
における宿主遺伝子発現を含む。
[00045]ある態様において、該バイオマーカーは、前立腺腫瘍で増加した、前立腺腫瘍
における宿主遺伝子発現を含む。
[00046]ある態様において、該バイオマーカーは、上方調節されたC9orf5及びM
CM7の一つ以上を含み、そしてその発現は、イントロン性マイクロRNA、それぞれmiR−32及びmiR−106b−25クラスターの発現と相関している。
CM7の一つ以上を含み、そしてその発現は、イントロン性マイクロRNA、それぞれmiR−32及びmiR−106b−25クラスターの発現と相関している。
[00047]別の側面において、前立腺癌細胞中のE2F1及び/又はCDKN1A遺伝子
を標的とするmiR−106bの使用、及び/又はE2F1及び/又はCDKN1A遺伝子のタンパク質発現を抑制することにおける使用が、本明細書に記載される。
を標的とするmiR−106bの使用、及び/又はE2F1及び/又はCDKN1A遺伝子のタンパク質発現を抑制することにおける使用が、本明細書に記載される。
[00048]別の側面において、前立腺癌細胞中のmiR−1の発現を変化させることによ
り、XP06及びPTK9の一つ以上の調節が、本明細書に記載される。
[00049]別の側面において、哺乳類細胞中の標的とされたmRNAの分解及び/又は蓄
積を導く、3’UTR配列へのマイクロRNAの結合の使用が、本明細書に記載される。
り、XP06及びPTK9の一つ以上の調節が、本明細書に記載される。
[00049]別の側面において、哺乳類細胞中の標的とされたmRNAの分解及び/又は蓄
積を導く、3’UTR配列へのマイクロRNAの結合の使用が、本明細書に記載される。
[00050]別の側面において、マイクロRNA標的遺伝子を予測する、ヒト組織における
マイクロRNAとmRNA間の逆及び/又は正の相関の使用が、本明細書に記載される。
[00051]別の側面において、マイクロRNAによって調節されているmRNAを同定す
る方法が本明細書に記載され、ヒト組織中のマイクロRNA及びmRNA発現の相関分析を行うことを含む。
マイクロRNAとmRNA間の逆及び/又は正の相関の使用が、本明細書に記載される。
[00051]別の側面において、マイクロRNAによって調節されているmRNAを同定す
る方法が本明細書に記載され、ヒト組織中のマイクロRNA及びmRNA発現の相関分析を行うことを含む。
[00052]別の側面において、miR発現アンチセンス阻害剤が本明細書に記載され、m
iR−32及びmiR−106bの一つ以上を含む。
[00053]別の側面において、前立腺障害又は疾患のオンコmiRバイオマーカーが本明
細書に記載され、miR−1、miR−32、及びmiR−106b−25クラスターの一つ以上を含む。
iR−32及びmiR−106bの一つ以上を含む。
[00053]別の側面において、前立腺障害又は疾患のオンコmiRバイオマーカーが本明
細書に記載され、miR−1、miR−32、及びmiR−106b−25クラスターの一つ以上を含む。
[00054]別の側面において、前立腺癌細胞中のmiR−1、miR−32、及びmiR
−106b−25クラスターの一つ以上の発現を変調することを含む、前立腺癌細胞中のタンパク質発現を調節するための方法が本明細書に提供される。
−106b−25クラスターの一つ以上の発現を変調することを含む、前立腺癌細胞中のタンパク質発現を調節するための方法が本明細書に提供される。
[00055]別の側面において、前立腺癌細胞中のエクスポーチン−6及びPTK9の一つ
以上の発現を阻止するための組成物が本明細書に記載され、該組成物は、miR−1又は
それらの機能的変異体を含む。
以上の発現を阻止するための組成物が本明細書に記載され、該組成物は、miR−1又は
それらの機能的変異体を含む。
[00056]別の側面において、E2F1及びp21/WAFlタンパク質レベルの一つ以
上を調節することを、それを必要とする対象において行う方法が本明細書に記載され、miR−106b又はそれらの機能的変異体を使用することを含む。
上を調節することを、それを必要とする対象において行う方法が本明細書に記載され、miR−106b又はそれらの機能的変異体を使用することを含む。
[00057]別の側面において、前立腺癌細胞におけるp21/WAFl及び/又はE2F
1タンパク質レベルを、それを必要とする対象において増加させるために有用なアンチセンスmiR−106bを含む組成物が、本明細書に記載される。
1タンパク質レベルを、それを必要とする対象において増加させるために有用なアンチセンスmiR−106bを含む組成物が、本明細書に記載される。
[00058]ある態様において、該方法は前立腺癌を有する対象の予後を決定することを含
み、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含んでおり、ここで:i)該バイオマーカーは、前立腺癌の予後不良に関連し;そしてii)対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較して、前立腺試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの変化は、予後不良を示す。
み、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含んでおり、ここで:i)該バイオマーカーは、前立腺癌の予後不良に関連し;そしてii)対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較して、前立腺試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの変化は、予後不良を示す。
[00059]ある態様において、該方法は対象が前立腺癌を有するか、又は発症するリスク
があるかどうかを診断する方法を提供し、(1)対象から得られた試験サンプルからのRNAを逆転写して、標的オリゴデオキシヌクレオチドの組を提供し;(2)該標的オリゴデオキシヌクレオチドを、miRNA特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて該試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し;及び、(3)該試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルと対照サンプルから生成されたハイブリダイゼーションプロファイルを比較することを含み、少なくとも一つのmiRNAのシグナルの変化は、該対象が前立腺癌を有する、又は発症するリスクがあることを示す。
があるかどうかを診断する方法を提供し、(1)対象から得られた試験サンプルからのRNAを逆転写して、標的オリゴデオキシヌクレオチドの組を提供し;(2)該標的オリゴデオキシヌクレオチドを、miRNA特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて該試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し;及び、(3)該試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルと対照サンプルから生成されたハイブリダイゼーションプロファイルを比較することを含み、少なくとも一つのmiRNAのシグナルの変化は、該対象が前立腺癌を有する、又は発症するリスクがあることを示す。
[00060]ある態様において、該少なくとも一つのmiRNAのシグナルは、対照サンプ
ルから生成されたシグナルと比較して下方調節されており、及び/又は該少なくとも一つのmiRNAのシグナルは、対照サンプルから発生させたシグナルと比較して上方調節されている。
ルから生成されたシグナルと比較して下方調節されており、及び/又は該少なくとも一つのmiRNAのシグナルは、対照サンプルから発生させたシグナルと比較して上方調節されている。
[00061]ある態様において、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又
は表10に列挙された群より選択される少なくとも一つのバイオマーカーのシグナルの変化は、該対象が予後不良の前立腺癌を有する、又は発症するリスクがあることを示す。
は表10に列挙された群より選択される少なくとも一つのバイオマーカーのシグナルの変化は、該対象が予後不良の前立腺癌を有する、又は発症するリスクがあることを示す。
[00062]別の側面において、対照細胞と比較して、少なくとも一つのバイオマーカーが
対象の癌細胞で下方調節又は上方調節されている前立腺癌を有する対象において、前立腺癌を治療する方法が本明細書に記載され、(1)該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが下方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、少なくとも一つの単離されたバイオマーカー、又は単離された変異体又はそれらの生物学的に活性な断片の有効量を該対象に投与すること;又は(2)該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが上方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することを含む。
対象の癌細胞で下方調節又は上方調節されている前立腺癌を有する対象において、前立腺癌を治療する方法が本明細書に記載され、(1)該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが下方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、少なくとも一つの単離されたバイオマーカー、又は単離された変異体又はそれらの生物学的に活性な断片の有効量を該対象に投与すること;又は(2)該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが上方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することを含む。
[00063]別の側面において、対象の前立腺癌を治療する方法が本明細書に記載され:(
1)対照細胞と比較して、前立腺癌細胞中の少なくとも一つのバイオマーカーの量を決定すること;そして(2)(i)もし、該癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも少ないならば、少なくとも一つの単離されたバイオマーカーの有効量を該対象に投与することにより;又は(ii)もし、該癌細
胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも多いならば、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することにより、前立腺癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量を変化させること;を含む。
1)対照細胞と比較して、前立腺癌細胞中の少なくとも一つのバイオマーカーの量を決定すること;そして(2)(i)もし、該癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも少ないならば、少なくとも一つの単離されたバイオマーカーの有効量を該対象に投与することにより;又は(ii)もし、該癌細
胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも多いならば、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することにより、前立腺癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量を変化させること;を含む。
[00064]別の側面において、少なくとも一つの単離されたバイオマーカー及び薬学的に
許容できる担体を含む、前立腺癌を治療するための医薬組成物が本明細書に記載される。
[00065]ある態様において、該医薬組成物は、対照細胞と比較して前立腺癌細胞中で下
方調節されているバイオマーカーに対応する、少なくとも一つの単離されたバイオマーカーをその中に含む。
許容できる担体を含む、前立腺癌を治療するための医薬組成物が本明細書に記載される。
[00065]ある態様において、該医薬組成物は、対照細胞と比較して前立腺癌細胞中で下
方調節されているバイオマーカーに対応する、少なくとも一つの単離されたバイオマーカーをその中に含む。
[00066]ある態様において、該医薬組成物は少なくとも一つのmiR発現阻害化合物及
び薬学的に許容できる担体を含む。
[00067]別の側面において、抗前立腺癌剤を同定する方法が本明細書に記載され、細胞
に試験剤を与えること、そして前立腺癌細胞中の減少した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照細胞と比較した、該細胞中のバイオマーカーのレベルの増加は、該試験剤が抗前立腺癌剤であることを示す。
び薬学的に許容できる担体を含む。
[00067]別の側面において、抗前立腺癌剤を同定する方法が本明細書に記載され、細胞
に試験剤を与えること、そして前立腺癌細胞中の減少した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照細胞と比較した、該細胞中のバイオマーカーのレベルの増加は、該試験剤が抗前立腺癌剤であることを示す。
[00068]別の側面において、抗前立腺癌剤を同定する方法が本明細書に記載され、細胞
に試験剤を与えること、そして前立腺癌細胞中の増加した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照細胞と比較した、該細胞中のバイオマーカーのレベルの減少は、該試験剤が抗前立腺癌剤であることを示す。
に試験剤を与えること、そして前立腺癌細胞中の増加した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照細胞と比較した、該細胞中のバイオマーカーのレベルの減少は、該試験剤が抗前立腺癌剤であることを示す。
[00069]別の側面において、前立腺癌関連疾患を予防する、診断する及び/又は治療す
るための療法の有効性を評価する方法が本明細書に記載され:i)その有効性が評価されている療法を動物に供すること;そしてii)表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを評価することにより、該疾患を治療する又は予防することについて試験されている治療の有効性のレベルを決定すること;を含む。
るための療法の有効性を評価する方法が本明細書に記載され:i)その有効性が評価されている療法を動物に供すること;そしてii)表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを評価することにより、該疾患を治療する又は予防することについて試験されている治療の有効性のレベルを決定すること;を含む。
[00070]ある態様において、該候補療法剤は、医薬組成物、栄養補助食品組成物及びホ
メオパシー組成物の一つ以上を含む。
[00071]ある態様において、評価されている療法は、ヒト対象での使用のためである。
メオパシー組成物の一つ以上を含む。
[00071]ある態様において、評価されている療法は、ヒト対象での使用のためである。
[00072]別の側面において、製品が本明細書に記載され:表2、表3、表4A、表4B
、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前立腺癌関連疾患のためのマーカーに結合する少なくとも一つの捕捉試薬を含む。
、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前立腺癌関連疾患のためのマーカーに結合する少なくとも一つの捕捉試薬を含む。
[00073]別の側面において、前立腺癌関連疾患を治療する療法剤の候補化合物をスクリ
ーニングするためのキットが本明細書に記載され、該キットは:表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーの一つ以上の試薬、及び少なくとも一つのバイオマーカーを発現している細胞を含む。
ーニングするためのキットが本明細書に記載され、該キットは:表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーの一つ以上の試薬、及び少なくとも一つのバイオマーカーを発現している細胞を含む。
[00074]ある態様において、該バイオマーカーの存在は、少なくとも一つのバイオマー
カーと特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む試薬を使用して検出される。
[00075]別の側面において、個体における該疾患合併症を治療する、予防する、逆行さ
せる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、前立腺癌関連疾患応答シグナル伝達経路を妨害する剤の使用が本明細書に記載され、該剤は、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む。
カーと特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む試薬を使用して検出される。
[00075]別の側面において、個体における該疾患合併症を治療する、予防する、逆行さ
せる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、前立腺癌関連疾患応答シグナル伝達経路を妨害する剤の使用が本明細書に記載され、該剤は、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む。
[00076]別の側面において、前立腺癌関連疾患合併症を治療する、予防する、逆行させ
る、又は重症度を限定することを、それを必要とする個体で行う方法が本明細書において記載され:少なくとも前立腺癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤を該個体に投与することを含んでおり、該剤は、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む。
る、又は重症度を限定することを、それを必要とする個体で行う方法が本明細書において記載され:少なくとも前立腺癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤を該個体に投与することを含んでおり、該剤は、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む。
[00077]別の側面において、個体の前立腺癌関連疾患合併症を治療する、予防する、逆
行させる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、少なくとも前立腺癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤の使用が、本明細書に記載され、該剤は、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む。
行させる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、少なくとも前立腺癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤の使用が、本明細書に記載され、該剤は、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む。
[00078]別の側面において、miR−1、miR−32及びmiR−106bの一つ以
上のアンチセンス阻害剤を含む組成物が、本明細書に記載される。
[00079]別の側面において、前立腺障害を治療することを、それを必要とする対象にお
いて行う方法が本明細書に記載され、該組成物の療法的に有効量を対象に投与することを含む。
上のアンチセンス阻害剤を含む組成物が、本明細書に記載される。
[00079]別の側面において、前立腺障害を治療することを、それを必要とする対象にお
いて行う方法が本明細書に記載され、該組成物の療法的に有効量を対象に投与することを含む。
[00080]ある態様において、該組成物は予防的に投与される。
[00081]ある態様において、該組成物の投与は、障害の一つ以上の症状の発症を遅延さ
せる。
[00081]ある態様において、該組成物の投与は、障害の一つ以上の症状の発症を遅延さ
せる。
[00082]ある態様において、該ペプチドの投与は、前立腺癌の発生を抑制する。
[00083]ある態様において、該組成物の投与は、腫瘍の増殖を抑制する。
[00084]ある態様において、該ペプチドの投与は、感染を抑制する。
[00083]ある態様において、該組成物の投与は、腫瘍の増殖を抑制する。
[00084]ある態様において、該ペプチドの投与は、感染を抑制する。
[00085]別の側面において、生物学的サンプル中の前立腺癌の存在を検出する方法が本
明細書に記載され:該方法は:a)前立腺癌を含有すると疑われる生物学的サンプルを、それらのためのマーカーに暴露すること;そしてb)もしあれば、該サンプル中の該マーカーの存在又は不存在を検出すること;を含む。
明細書に記載され:該方法は:a)前立腺癌を含有すると疑われる生物学的サンプルを、それらのためのマーカーに暴露すること;そしてb)もしあれば、該サンプル中の該マーカーの存在又は不存在を検出すること;を含む。
[00086]ある態様において、該マーカーは検出可能な標識を含む。
[00087]ある態様において、該方法は、該対象からの生物学的サンプル中の該マーカー
の量と、正常対象からの対応する生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較することをさらに含む。
[00087]ある態様において、該方法は、該対象からの生物学的サンプル中の該マーカー
の量と、正常対象からの対応する生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較することをさらに含む。
[00088]ある態様において、該方法は、異なる時点で対象から複数の生物学的サンプル
を集めること、及び各生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較して、時間とともに該対象において該マーカーの量が増加している又は減少しているかどうかを決定することをさらに含む。
を集めること、及び各生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較して、時間とともに該対象において該マーカーの量が増加している又は減少しているかどうかを決定することをさらに含む。
[00089]別の側面において、対象の前立腺癌を治療する方法が本明細書に記載され、該
方法は:前立腺レセプターアゴニストの療法的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含んでいる。
方法は:前立腺レセプターアゴニストの療法的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含んでいる。
[00090]ある態様において、該レセプターアゴニストは、miR−l、miR−21及
びmiR−106bの一つ以上のアンチセンス阻害剤である。
[00091]別の側面において、前立腺癌の治療のための薬剤を製造するため、表2、表3
、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に示したmiR、それらから派生する配列、こうしたmiRの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の内から選択される核酸分子を含む使用が、本明細書に記載される。
びmiR−106bの一つ以上のアンチセンス阻害剤である。
[00091]別の側面において、前立腺癌の治療のための薬剤を製造するため、表2、表3
、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に示したmiR、それらから派生する配列、こうしたmiRの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の内から選択される核酸分子を含む使用が、本明細書に記載される。
[00092]ある態様において、該使用は、該薬剤が、表2に列挙されたmiR、こうした
miRから派生する配列、こうしたmiRの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の中から選択される配列を示す核酸分子を含むことを含む。
miRから派生する配列、こうしたmiRの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の中から選択される配列を示す核酸分子を含むことを含む。
[00093]別の側面において、前立腺癌細胞の分化を誘発するために有効な療法剤又は療
法剤の組み合わせを同定するためのインビトロの方法が本明細書に記載され、該方法は:i)前立腺腫瘍に由来する細胞を培養すること、ii)該細胞株の培養培地に少なくとも一つの化合物を添加すること、iii)段階(i)及び(ii)間の少なくとも一つのmiRの発現レベルの進展を分析すること、及びiv)段階(i)及び(ii)間のmiRの発現レベルの変化を誘発する化合物又は化合物の組み合わせを同定する;段階を含む。
法剤の組み合わせを同定するためのインビトロの方法が本明細書に記載され、該方法は:i)前立腺腫瘍に由来する細胞を培養すること、ii)該細胞株の培養培地に少なくとも一つの化合物を添加すること、iii)段階(i)及び(ii)間の少なくとも一つのmiRの発現レベルの進展を分析すること、及びiv)段階(i)及び(ii)間のmiRの発現レベルの変化を誘発する化合物又は化合物の組み合わせを同定する;段階を含む。
[00094]ある態様において、段階(iii)は、少なくとも一つのmiRの発現レベル
の分析を含む。
[00095]ある態様において、段階(iv)は、少なくとも一つのmiRの発現レベルを
変調する化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む。
の分析を含む。
[00095]ある態様において、段階(iv)は、少なくとも一つのmiRの発現レベルを
変調する化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む。
[00096]ある態様において、段階(iv)は、少なくとも一つのmiRの発現レベルを
減少させる化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む。
[00097]ある態様において、該化合物は癌の治療のための療法剤である。
減少させる化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む。
[00097]ある態様において、該化合物は癌の治療のための療法剤である。
[00098]別の側面において、対象からの前立腺組織を分類する方法が本明細書に記載さ
れ:a)試験細胞集団中の表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に列挙された群より選択される一つ以上の核酸配列の発現を測定すること、ここで、前記試験細胞集団中の少なくとも一つの細胞は、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に列挙された群より選択される一つ以上の核酸配列を発現することができる;b)該核酸配列(単数又は複数)の発現と、前立腺癌分類が既知である少なくとも一つの細胞を含む参照細胞集団中の核酸配列(単数又は複数)の発現を比較すること;及びc)存在するならば、該試験細胞集団及び参照細胞集団中から成る群より選択される一つ以上の核酸配列の発現レベルの相違を同定し、それにより該対象の前立腺癌を分類すること;を含む。
れ:a)試験細胞集団中の表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に列挙された群より選択される一つ以上の核酸配列の発現を測定すること、ここで、前記試験細胞集団中の少なくとも一つの細胞は、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に列挙された群より選択される一つ以上の核酸配列を発現することができる;b)該核酸配列(単数又は複数)の発現と、前立腺癌分類が既知である少なくとも一つの細胞を含む参照細胞集団中の核酸配列(単数又は複数)の発現を比較すること;及びc)存在するならば、該試験細胞集団及び参照細胞集団中から成る群より選択される一つ以上の核酸配列の発現レベルの相違を同定し、それにより該対象の前立腺癌を分類すること;を含む。
[00099]ある態様において、相違する該参照細胞集団と比較して該試験細胞集団におけ
る核酸(単数又は複数)の発現、該試験細胞集団が該参照細胞集団からの細胞とは異なった分類を有することを示す。
る核酸(単数又は複数)の発現、該試験細胞集団が該参照細胞集団からの細胞とは異なった分類を有することを示す。
[000100]ある態様において、類似する該参照細胞集団と比較して該試験細胞集団における核酸(単数又は複数)の発現パターンは、該試験細胞集団が該参照細胞集団からの細胞と同一の分類を有することを示す。
[000101]ある態様において、該参照細胞集団は、多数の細胞又はデータベースである。
[000102]ある態様において、該参照細胞集団は:正常前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団、良性前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団、及び悪性前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団;から成る群より選
択される。
[000102]ある態様において、該参照細胞集団は:正常前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団、良性前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団、及び悪性前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団;から成る群より選
択される。
[000103]本発明の種々の目的及び利点は、付随する図面を照らし合わせて読むことにより、好ましい態様の以下の詳細な説明から、当業者には明らかになるであろう。
[000104]本特許又は出願ファイルは一枚以上のカラーで仕上げられた図及び/又は一つ以上の写真を含む。カラーの図及び/又は写真を含むこの特許又は特許出願印刷物のコピーは、依頼及び必要な料金の支払い後、本特許事務所により提供されるであろう。
[000104]本特許又は出願ファイルは一枚以上のカラーで仕上げられた図及び/又は一つ以上の写真を含む。カラーの図及び/又は写真を含むこの特許又は特許出願印刷物のコピーは、依頼及び必要な料金の支払い後、本特許事務所により提供されるであろう。
本発明の詳細な記述
[000139]本開示を通して、種々の刊行物、特許及び公開された特許明細書は引用を特定することにより参照される。これらの刊行物、特許及び公開された特許明細書の開示は、本発明が関与する分野の状態をより完全に記述するために、本開示に引用文献として組み入れられる。
[000139]本開示を通して、種々の刊行物、特許及び公開された特許明細書は引用を特定することにより参照される。これらの刊行物、特許及び公開された特許明細書の開示は、本発明が関与する分野の状態をより完全に記述するために、本開示に引用文献として組み入れられる。
[000140]本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の製剤又はプロセスパラメーター(それ自体、もちろん変化することができるので)に限定されないことを理解すべきである。本明細書で使用された用語法は、本発明の特定の態様を説明する目的でのみ使用され、限定する意図がないことも理解すべきである。
[000141]本明細書に記載したものと類似の又は均等な多くの方法及び材料を、本発明の実施において使用し得るが、好ましい材料及び方法が本明細書に記載されている。
[000142]マイクロRNAは、タンパク質コード遺伝子の発現を調節する短鎖非コードRNAである。前立腺癌におけるマイクロRNAの関与を評価するため、60の原発性前立腺腫瘍及び16の非腫瘍前立腺組織中のマイクロRNA及びmRNAのゲノム全域にわたる発現を決定した。
[000142]マイクロRNAは、タンパク質コード遺伝子の発現を調節する短鎖非コードRNAである。前立腺癌におけるマイクロRNAの関与を評価するため、60の原発性前立腺腫瘍及び16の非腫瘍前立腺組織中のマイクロRNA及びmRNAのゲノム全域にわたる発現を決定した。
[000143]マイクロRNA発現は、前立腺癌の発生及び進行とともに変化する。これらのマイクロRNAのいくつかは、前立腺癌細胞において癌関連遺伝子の発現を調節する。
[000144]本明細書で互換的に使用される、「miR遺伝子産物」「マイクロRNA」「miR」又は「miRNA」とは、miR遺伝子からの、プロセッシングを受けていない又はプロセッシングされたRNA転写体を指す。
[000144]本明細書で互換的に使用される、「miR遺伝子産物」「マイクロRNA」「miR」又は「miRNA」とは、miR遺伝子からの、プロセッシングを受けていない又はプロセッシングされたRNA転写体を指す。
[000145]本明細書で使用される「バイオマーカー」は、「miR遺伝子産物」「マイクロRNA」「miR」又は「miRNA」、又はタンパク質コードRNAの一つ以上を含むことができる。
[000146]活性19−25ヌクレオチドRNA分子は、天然のプロセッシング経路(例えば、無傷の細胞又は細胞可溶化物を使用して)又は合成的プロセッシング経路(例えば、単離されたダイサー、アルゴノート又はリボヌクレアーゼIIIのような単離されたプロセッシング酵素を使用して)を介してmiR前駆体から得ることが可能である。活性19−25ヌクレオチドRNA分子は、miR前駆体を加工処理せずに、生物学的又は化学的合成により直接的に生成することが可能であることもわかっている。マイクロRNAが名称により本明細書で参照された場合、特に示されない限り、名称は前駆体及び成熟型の両方に対応する。
[000147]本発明は、対象が前立腺関連障害を有するか、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する方法を包含する。本明細書で使用される「対象」は、前立腺癌を有する、又は有すると疑われる任意の哺乳動物であり得る。
[000148]mRNA分析は、マイクロRNAプロセッシング及びいくつかのマイクロRNA宿主遺伝子、例えば、MCM7及びC9orf5の鍵となる成分が、前立腺腫瘍において有意に上方調節されていることを明らかにした。これらの発見と一致して、腫瘍は、Mcm7のイントロン13に位置するmiR−106b−25クラスター及びC9orf5のイントロン14に位置するmiR−32を、非腫瘍前立腺よりも有意に高いレベルで発現した。
[000149]miR−106b−25クラスター相同体及びmiR−l−133aクラスターを含む他のマイクロRNAの発現レベルも、前立腺腫瘍において変化した。
[000150]マイクロRNA存在量における追加の相違が、器官に限定された腫瘍及び前立腺外疾患進展を有する腫瘍間で見出された。
[000150]マイクロRNA存在量における追加の相違が、器官に限定された腫瘍及び前立腺外疾患進展を有する腫瘍間で見出された。
[000151]マイクロRNAの調節解除が、前立腺におけるタンパク質コード標的遺伝子の転写体存在量に影響する証拠も発見された。
[000152]細胞培養において、E2F1及びp21/WAF1がmiR−106bの、BimがmiR−32の、及びエクスポーチン6及びPTK9がmiR−1の標的として同定された。
[000152]細胞培養において、E2F1及びp21/WAF1がmiR−106bの、BimがmiR−32の、及びエクスポーチン6及びPTK9がmiR−1の標的として同定された。
[000153]遺伝子に基づいた分類手段は、疾患診断を改善することにおける、及び臨床挙動予測のための強力な診断的及び予後予測ツールであり得る。我々は、腫瘍と非腫瘍組織
間を識別するマイクロRNAシグネチャーを同定するためにPAM応用を使用した。PAMは、腫瘍及び非腫瘍組織間を最も良く区別する7プローブセット及び37プローブセットから成る二つのマイクロRNAシグネチャーを同定した(図13B−表4B、ここで7プローブセットシグネチャーは*により示されている)。
間を識別するマイクロRNAシグネチャーを同定するためにPAM応用を使用した。PAMは、腫瘍及び非腫瘍組織間を最も良く区別する7プローブセット及び37プローブセットから成る二つのマイクロRNAシグネチャーを同定した(図13B−表4B、ここで7プローブセットシグネチャーは*により示されている)。
[000154]7プローブセットシグネチャーは、16非腫瘍組織の内の14(88%)及び60腫瘍の内の49(82%)の正しい分類を達成した。このシグネチャーは、四つのマイクロRNA、miR−32、miR−218−2、miR−490及びmiR−520hのみの発現パターンに基づいている。
[000155]総合的予測精度のさらなる改善は、23のマイクロRNAを示す37プローブセットシグネチャーで得られた(図11[表5])。このシグネチャーは、7プローブセットシグネチャーと完全に重複している。37プローブセットシグネチャーにより、PAMは16非腫瘍組織の内の16(100%)及び60腫瘍の内の48(80%)の正しい分類を達成した。
[000156]本発明は以下の実施例でさらに説明され、特に記載しない限り、全ての部分及びパーセンテージは重量によるものであり、度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、例示のためにのみ与えられていることを理解すべきである。上記の議論及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を確かめることができ、そしてそれらの精神及び範囲から離れることなく、多様な使用及び条件に適合させるために本発明の多様な変形及び修正を行うことができる。本明細書で言及された、特許及び非特許文献を含む全ての出版物は、本明細書において特別に援用される。
[000157]実施例I
[000158]臨床サンプル
[000159]60の新鮮凍結前立腺腫瘍は、NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource(CPCTR)及びメリーランド大学病理学部(UMD)から受け取った。書面に
よるインフォームドコンセントは、全てのドナーから得られた。腫瘍は、前立腺切除術に先だっては何の治療も受けていない腺癌を切除した。マクロ解剖腫瘍試料は病理学者により再検討され、凍結標本中の腫瘍の存在が確認された。周辺非腫瘍前立腺組織は、前立腺癌を有する16人の患者から採取した。全ての組織は、2002年から2004年の間に採取された。人種/民族性についての情報は、診療記録(CPCTR)から抽出するか又は疫学的アンケート調査(UMD)のいずれかを介して取得した。前立腺切除術時の年齢、組織学、グリーソンスコア、病理学的病期、診断時のPSA、腫瘍サイズ、前立腺外進展、辺縁病変及び精嚢浸潤を含む患者の臨床病理学的特性はCPCTRから得られた。UMD症例については、この情報は、もし入手可能ならば、診療記録及び病理学的記録から抽出した。本研究は、関与施設の治験審査委員会により認可された。
[000158]臨床サンプル
[000159]60の新鮮凍結前立腺腫瘍は、NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource(CPCTR)及びメリーランド大学病理学部(UMD)から受け取った。書面に
よるインフォームドコンセントは、全てのドナーから得られた。腫瘍は、前立腺切除術に先だっては何の治療も受けていない腺癌を切除した。マクロ解剖腫瘍試料は病理学者により再検討され、凍結標本中の腫瘍の存在が確認された。周辺非腫瘍前立腺組織は、前立腺癌を有する16人の患者から採取した。全ての組織は、2002年から2004年の間に採取された。人種/民族性についての情報は、診療記録(CPCTR)から抽出するか又は疫学的アンケート調査(UMD)のいずれかを介して取得した。前立腺切除術時の年齢、組織学、グリーソンスコア、病理学的病期、診断時のPSA、腫瘍サイズ、前立腺外進展、辺縁病変及び精嚢浸潤を含む患者の臨床病理学的特性はCPCTRから得られた。UMD症例については、この情報は、もし入手可能ならば、診療記録及び病理学的記録から抽出した。本研究は、関与施設の治験審査委員会により認可された。
[000160]RNA抽出
[000161]全RNAは、製造者の取扱説明書に従い、TRIZOL試薬を使用して単離した(Invitrogen, Carlsbad, CA)。各サンプルについてのRNAの完全性は、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)で確認した。各RNAサンプ
ルは次ぎに、2分割量に分け、マイクロRNAマイクロアレイ又はmRNAマイクロアレイのために処理した。
[000161]全RNAは、製造者の取扱説明書に従い、TRIZOL試薬を使用して単離した(Invitrogen, Carlsbad, CA)。各サンプルについてのRNAの完全性は、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)で確認した。各RNAサンプ
ルは次ぎに、2分割量に分け、マイクロRNAマイクロアレイ又はmRNAマイクロアレイのために処理した。
[000162]遺伝子マイクロアレイ
[000163]特別注文マイクロRNAオリゴヌクレオチドチップ。マイクロRNA標識及びハイブリダイゼーションは、以前に記載した如く実施した(21)。マイクロRNAマイ
クロアレイ(Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Version 3.0)は、329のヒト及び249のマウスマイクロRNAについて四通りにスポットされたプローブを含む。アレイプラットホームに関するより詳細な情報は、ArrayExpress及びGEOデータベースで、それぞれ受入番号A−MEXP−620及びGSE8126のもと見ることができる。
[000163]特別注文マイクロRNAオリゴヌクレオチドチップ。マイクロRNA標識及びハイブリダイゼーションは、以前に記載した如く実施した(21)。マイクロRNAマイ
クロアレイ(Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Version 3.0)は、329のヒト及び249のマウスマイクロRNAについて四通りにスポットされたプローブを含む。アレイプラットホームに関するより詳細な情報は、ArrayExpress及びGEOデータベースで、それぞれ受入番号A−MEXP−620及びGSE8126のもと見ることができる。
[000164]Affymetrix GeneChip(商標)
[000165]RNA標識及びハイブリダイゼーションは、Affymetrix標準プロトコルに従って実施した(Santa Clara,CA)。簡単には、全RNAの5μgを、5’末端にT7RNAポリメラーゼプロモーターを有するオリゴ(dT)プライマーで逆転写した。第二鎖合成にcRNA生成が続き、Enzo Life Sciences(Farmingdale,NY)からのBioArray High Yield RNA Transcript Labeking Kit T3を使用してビオチン化リボヌクレオチドを取り込ませた。標識化cRNAは断片化し、Affymetrix GeneChip HG-U133A 2.0アレイにハイブリダイズさせた。このアレイは、およそ13,000のヒトタンパク質コード遺伝子を提示する22,283のプローブセットを含む。ハイブリダイゼーションシグナルは、フィコエリトリン−コンジュゲートストレプトアビジン(Invitrogen)で可視化し、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix)を使用してスキャンした。Minimum Information About a Microarray Experiment(MIAME)ガイドラインに従って我々は、マイクロアレイデー
タ及び追加の患者情報のCELファイルをGEOリポジトリー(ncbi.nlm.nih.zov/aeo/
)に寄託した。マイクロRNA及びmRNAプロファイリングデータのGEO提出受入番号は、それぞれGSE8126及びGSE6956である。
[000165]RNA標識及びハイブリダイゼーションは、Affymetrix標準プロトコルに従って実施した(Santa Clara,CA)。簡単には、全RNAの5μgを、5’末端にT7RNAポリメラーゼプロモーターを有するオリゴ(dT)プライマーで逆転写した。第二鎖合成にcRNA生成が続き、Enzo Life Sciences(Farmingdale,NY)からのBioArray High Yield RNA Transcript Labeking Kit T3を使用してビオチン化リボヌクレオチドを取り込ませた。標識化cRNAは断片化し、Affymetrix GeneChip HG-U133A 2.0アレイにハイブリダイズさせた。このアレイは、およそ13,000のヒトタンパク質コード遺伝子を提示する22,283のプローブセットを含む。ハイブリダイゼーションシグナルは、フィコエリトリン−コンジュゲートストレプトアビジン(Invitrogen)で可視化し、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix)を使用してスキャンした。Minimum Information About a Microarray Experiment(MIAME)ガイドラインに従って我々は、マイクロアレイデー
タ及び追加の患者情報のCELファイルをGEOリポジトリー(ncbi.nlm.nih.zov/aeo/
)に寄託した。マイクロRNA及びmRNAプロファイリングデータのGEO提出受入番号は、それぞれGSE8126及びGSE6956である。
[000166]マイクロアレイのデータ規格化及び統計分析
[000167]Affymetrixチップは、ロバストマルチチップ分析(robust multichip analysis)(RMA)法(22)を使用して正規化した。中央値−中心(Median-centric)正規
化を、特別注文のマイクロRNAオリゴヌクレオチドチップに対して使用した。有意に差次的に発現された遺伝子のリストを発生させるため、生じたデータセットをマイクロアレイの有意性分析(SAM)法(23)にかけた。両側t検定及び意図された誤検出率(false discovery rates(FDR))からの両方のP値に基づいて遺伝子リストを発生させ
た。FDR計算は、Storey and Tibshirani(24)により記載されている方法に従った
。組織を意図されたカテゴリー、例えば、腫瘍又は非腫瘍組織に分類するため、マイクロアレイの予測分析(PAM)(25)を使用した。この分析において、トレーニングエラー率及び変動係数(CV)エラー率両方のについての最良の補償に基づいて、閾値デルタを選択した。PAMにおける適切な閾値パラメータを決定するため、サンプルの10%を除外することにより交差検定を実行した。
[000167]Affymetrixチップは、ロバストマルチチップ分析(robust multichip analysis)(RMA)法(22)を使用して正規化した。中央値−中心(Median-centric)正規
化を、特別注文のマイクロRNAオリゴヌクレオチドチップに対して使用した。有意に差次的に発現された遺伝子のリストを発生させるため、生じたデータセットをマイクロアレイの有意性分析(SAM)法(23)にかけた。両側t検定及び意図された誤検出率(false discovery rates(FDR))からの両方のP値に基づいて遺伝子リストを発生させ
た。FDR計算は、Storey and Tibshirani(24)により記載されている方法に従った
。組織を意図されたカテゴリー、例えば、腫瘍又は非腫瘍組織に分類するため、マイクロアレイの予測分析(PAM)(25)を使用した。この分析において、トレーニングエラー率及び変動係数(CV)エラー率両方のについての最良の補償に基づいて、閾値デルタを選択した。PAMにおける適切な閾値パラメータを決定するため、サンプルの10%を除外することにより交差検定を実行した。
[000168]マイクロRNA標的予測
[000169]マイクロRNA標的予測のため、TargetScanS(http://genes.mit.edu/tscan/taraetscanS.html)を使用した。3’UTR内に位置するマイクロRNAの予測結合部位のみを種を越えて保存し、我々の分析で考慮した。分析及びデータ出力のため、データをWholePathwayScope データベース用にフォーマットした(26)。ヒト前立腺組織において、それらの標的mRNAの転写体存在量を調節するマイクロRNAを同定するため、相関分析を実行した。そのため、ピアソン相関係数を計算した。ピアソン相関係数の統計的有意性は、両側t検定によって決定した。
[000169]マイクロRNA標的予測のため、TargetScanS(http://genes.mit.edu/tscan/taraetscanS.html)を使用した。3’UTR内に位置するマイクロRNAの予測結合部位のみを種を越えて保存し、我々の分析で考慮した。分析及びデータ出力のため、データをWholePathwayScope データベース用にフォーマットした(26)。ヒト前立腺組織において、それらの標的mRNAの転写体存在量を調節するマイクロRNAを同定するため、相関分析を実行した。そのため、ピアソン相関係数を計算した。ピアソン相関係数の統計的有意性は、両側t検定によって決定した。
[000170]定量的リアルタイムPCR
[000171]成熟マイクロRNAの存在量は、公開されたプロトコル(27)に従って、ステムループTaqMan(商標)マイクロRNAアッセイキット(Applied Biosystems, Foster
City, CA)を使用して測定した。簡単には、製造元の取扱説明書に従って、TaqMan(商
標)マイクロRNAアッセイキットからの特異的マイクロRNAプライマー及びTaqMan(
商標)マイクロRNA逆転写キット(Applied Biosystems)からの試薬を使用し、10ngの全RNAからcDNAを逆転写した。Applied Biosystems Tagman 2X Universal PCR
マスター混合物及び問題とする各マイクロRNAについて適切な5X TaqMan(商標)マイクロRNAアッセイ混合物で、cDNAに対するリアルタイムPCRを実行した。3重の反応物をApplied Biosystems 7500リアルタイムPCRシステム内の96ウェルプレート
中、95℃で10分、続いて95℃で15秒及び60℃で1分を40サイクル、インキュベートした。各サンプルについて、閾値サイクル(Ct)をABI 7500配列検出システムソフトウェアにより算出した。検量線をサンプル中のマイクロRNA濃度を決定するために使用し、それは次ぎにU6 RNAで正規化した。
[000171]成熟マイクロRNAの存在量は、公開されたプロトコル(27)に従って、ステムループTaqMan(商標)マイクロRNAアッセイキット(Applied Biosystems, Foster
City, CA)を使用して測定した。簡単には、製造元の取扱説明書に従って、TaqMan(商
標)マイクロRNAアッセイキットからの特異的マイクロRNAプライマー及びTaqMan(
商標)マイクロRNA逆転写キット(Applied Biosystems)からの試薬を使用し、10ngの全RNAからcDNAを逆転写した。Applied Biosystems Tagman 2X Universal PCR
マスター混合物及び問題とする各マイクロRNAについて適切な5X TaqMan(商標)マイクロRNAアッセイ混合物で、cDNAに対するリアルタイムPCRを実行した。3重の反応物をApplied Biosystems 7500リアルタイムPCRシステム内の96ウェルプレート
中、95℃で10分、続いて95℃で15秒及び60℃で1分を40サイクル、インキュベートした。各サンプルについて、閾値サイクル(Ct)をABI 7500配列検出システムソフトウェアにより算出した。検量線をサンプル中のマイクロRNA濃度を決定するために使用し、それは次ぎにU6 RNAで正規化した。
[000172]マイクロRNAによるタンパク質発現の調節。
[000173]LNCaP及びPC3ヒト前立腺癌細胞(ATCC、Manassas,VA)を、50
%コンフルエントまで増殖させ、リポフェクタミン2000試薬(Invitrogen)を使用し、100nM最終濃度のマイクロRNA前駆体又はアンチセンスマイクロRNA阻害剤(両方ともAmbion、Austin、TX)のいずれかでトランスフェクトした。48時間後、細胞をこすり取ることにより採取し、タンパク質をRIPA緩衝液(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)で抽出した。ブラッドフォードアッセイ(BioRad Laboratories, Hercules,
CA: #500-0006)を実施してタンパク質濃度を決定し、タンパク質の50ugを、ウエスタンブロット分析のためにゲルに添加した。以下のマイクロRNA前駆体を使用した:pre−マイクロRNA陰性対照(AM17110);hsa−miR−1(カタログ番号AM17100
製品ID: PM10617);hsa−miR−32(カタログ番号AM17100 製品ID: PM12584)
及びhsa−miR−106b(カタログ番号AM17100 製品ID: PM10067)。以下のマイ
クロRNA阻害剤(アンチセンス)を使用した:抗マイクロRNA陰性対照(AM 17010);hsa−miR−1(カタログ番号AM17000 製品ID: AM10617);hsa−miR−3
2(カタログ番号AMI7000 製品 ID: AM12584)及びhsa−miR−106b(カタログ番号AM17000 製品ID: AM10067)。ウエスタンブロット分析によるタンパク質発現を視覚
化するため、以下の一次抗体を使用した:ポリクローナルウサギ抗エクスポーチン6抗体、1:200(Protein Tech Group, Chicago, IL:11408-1-AP);モノクローナルマウス抗PTK9抗体、1:500(Abnova Corp., Taipei, Taiwan:クローン1E2);モノクローナルマウス抗E2Fl抗体、1:200(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA: sc-251);モノクローナルマウス抗p21/WAF1抗体、1:200(Santa Cruz Biotechnology: sc-6246)及びポリクローナルウサギ抗BIM抗体、1:1000(Cell Signaling/Santa Cruz Biotechnology: #2819)。タンパク質発現の定量化は、AIDA Biopackage, 2D-Densitometry(raytest Isotopenmessgeraete GmbH, Straubenhardt, Germany)で得られた。
[000173]LNCaP及びPC3ヒト前立腺癌細胞(ATCC、Manassas,VA)を、50
%コンフルエントまで増殖させ、リポフェクタミン2000試薬(Invitrogen)を使用し、100nM最終濃度のマイクロRNA前駆体又はアンチセンスマイクロRNA阻害剤(両方ともAmbion、Austin、TX)のいずれかでトランスフェクトした。48時間後、細胞をこすり取ることにより採取し、タンパク質をRIPA緩衝液(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)で抽出した。ブラッドフォードアッセイ(BioRad Laboratories, Hercules,
CA: #500-0006)を実施してタンパク質濃度を決定し、タンパク質の50ugを、ウエスタンブロット分析のためにゲルに添加した。以下のマイクロRNA前駆体を使用した:pre−マイクロRNA陰性対照(AM17110);hsa−miR−1(カタログ番号AM17100
製品ID: PM10617);hsa−miR−32(カタログ番号AM17100 製品ID: PM12584)
及びhsa−miR−106b(カタログ番号AM17100 製品ID: PM10067)。以下のマイ
クロRNA阻害剤(アンチセンス)を使用した:抗マイクロRNA陰性対照(AM 17010);hsa−miR−1(カタログ番号AM17000 製品ID: AM10617);hsa−miR−3
2(カタログ番号AMI7000 製品 ID: AM12584)及びhsa−miR−106b(カタログ番号AM17000 製品ID: AM10067)。ウエスタンブロット分析によるタンパク質発現を視覚
化するため、以下の一次抗体を使用した:ポリクローナルウサギ抗エクスポーチン6抗体、1:200(Protein Tech Group, Chicago, IL:11408-1-AP);モノクローナルマウス抗PTK9抗体、1:500(Abnova Corp., Taipei, Taiwan:クローン1E2);モノクローナルマウス抗E2Fl抗体、1:200(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA: sc-251);モノクローナルマウス抗p21/WAF1抗体、1:200(Santa Cruz Biotechnology: sc-6246)及びポリクローナルウサギ抗BIM抗体、1:1000(Cell Signaling/Santa Cruz Biotechnology: #2819)。タンパク質発現の定量化は、AIDA Biopackage, 2D-Densitometry(raytest Isotopenmessgeraete GmbH, Straubenhardt, Germany)で得られた。
[000174]E2FI及びBCL2L11の3’UTRを含有するレポーター構築物のルシフェラーゼアッセイ
[000175]予測miR−106b及びmiR−32標的配列を含有する、それぞれE2FI及びBCL2L11(Bimをコードする)3’UTRを、ゲノムDNA(293T細胞)から増幅し、pGL3ホタルルシフェラーゼ対照ベクター(Promega, Madison, WI)のルシフェラーゼレポーター遺伝子のすぐ下流のXba1制限部位にクローン化した。変異標的配列を有する3’UTRを生成するため、QuikChange部位特異的突然変異導入キット(Stratagene, La Jolla, CA)を使用し、miR−106b及びmiR−32シード領域相補的部位内に最初の3ヌクレオチド欠失を生じさせた。miR−106bあるいはmiR−32によるルシフェラーゼレポーター遺伝子の翻訳抑制は、LNCaP細胞においてアッセイした。簡単には、ウェル当たり1.2x105LNCaP細胞を24ウェルプレートに播種した。翌日、取扱説明書(Invitrogen)に従ってリポフェクタミン2000試薬を使用し、500ngのレポータープラスミド、2ngのウミシイタケレポーター、及び100nM最終濃度でのマイクロRNA陰性対照あるいはマイクロRNA前駆体で細
胞をトランスフェクトした。トランスフェクションは3重に実施した。細胞を、pre−マイクロRNA陰性対照(AM17110)、hsa−miR−106b(カタログ番号AM17100
製品ID: PM10067)、又はhsa−miR−32前駆体(カタログ番号AM17100 製品ID: PM12584)のいずれかでトランスフェクトした。24時間後、細胞を、Promega標準プロトコルに従って溶解し、相対的ルシフェラーゼ活性を DYNEX Technologies MLXルミノメーターを使用して決定した。レポーター活性は、細胞抽出物中のタンパク質濃度で規格化した。
[000175]予測miR−106b及びmiR−32標的配列を含有する、それぞれE2FI及びBCL2L11(Bimをコードする)3’UTRを、ゲノムDNA(293T細胞)から増幅し、pGL3ホタルルシフェラーゼ対照ベクター(Promega, Madison, WI)のルシフェラーゼレポーター遺伝子のすぐ下流のXba1制限部位にクローン化した。変異標的配列を有する3’UTRを生成するため、QuikChange部位特異的突然変異導入キット(Stratagene, La Jolla, CA)を使用し、miR−106b及びmiR−32シード領域相補的部位内に最初の3ヌクレオチド欠失を生じさせた。miR−106bあるいはmiR−32によるルシフェラーゼレポーター遺伝子の翻訳抑制は、LNCaP細胞においてアッセイした。簡単には、ウェル当たり1.2x105LNCaP細胞を24ウェルプレートに播種した。翌日、取扱説明書(Invitrogen)に従ってリポフェクタミン2000試薬を使用し、500ngのレポータープラスミド、2ngのウミシイタケレポーター、及び100nM最終濃度でのマイクロRNA陰性対照あるいはマイクロRNA前駆体で細
胞をトランスフェクトした。トランスフェクションは3重に実施した。細胞を、pre−マイクロRNA陰性対照(AM17110)、hsa−miR−106b(カタログ番号AM17100
製品ID: PM10067)、又はhsa−miR−32前駆体(カタログ番号AM17100 製品ID: PM12584)のいずれかでトランスフェクトした。24時間後、細胞を、Promega標準プロトコルに従って溶解し、相対的ルシフェラーゼ活性を DYNEX Technologies MLXルミノメーターを使用して決定した。レポーター活性は、細胞抽出物中のタンパク質濃度で規格化した。
[000176]アンドロゲンレセプターアゴニストによる前立腺癌細胞の処理
[000177]DU−145(1x106)及びLNCaP(2x106)ヒト前立腺癌細胞(ATCC)を、75cm2フラスコに播種し、10%PBS、100μg/mlストレプトマイシン、100単位/mlペニシリン及び0.25μg/mlアンホテリシンBを補給したRPMI1640で24時間培養した。続いてホルモンを枯渇させるため、細胞を5%デキストラン被覆活性炭処理PBSを含有するフェノールレッドフリーRPMI1640(Invitrogen)内に、48時間おいた。次ぎに細胞を、10nM R1881(メチルトリエノロン、PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA)あるいは溶媒(エタノール)で処理した。24時間後、細胞を採取し、全RNAをmirVana PARISキット(Ambionjnc)を使用して単離した。この実験を5回繰り返した。マイクロRNA標識及びハイブリダイゼーションは以前に記載したように実施し(21)、マイクロRNAの広範囲の発現は、Ohio State University Comprehensive Cancer Centerマイクロアレイ(バージョン
4.0)上で決定した。
[000177]DU−145(1x106)及びLNCaP(2x106)ヒト前立腺癌細胞(ATCC)を、75cm2フラスコに播種し、10%PBS、100μg/mlストレプトマイシン、100単位/mlペニシリン及び0.25μg/mlアンホテリシンBを補給したRPMI1640で24時間培養した。続いてホルモンを枯渇させるため、細胞を5%デキストラン被覆活性炭処理PBSを含有するフェノールレッドフリーRPMI1640(Invitrogen)内に、48時間おいた。次ぎに細胞を、10nM R1881(メチルトリエノロン、PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA)あるいは溶媒(エタノール)で処理した。24時間後、細胞を採取し、全RNAをmirVana PARISキット(Ambionjnc)を使用して単離した。この実験を5回繰り返した。マイクロRNA標識及びハイブリダイゼーションは以前に記載したように実施し(21)、マイクロRNAの広範囲の発現は、Ohio State University Comprehensive Cancer Centerマイクロアレイ(バージョン
4.0)上で決定した。
[000178]実施例Iの結果
[000179]前立腺腫瘍におけるダイサーの上方調節
[000180]前立腺腫瘍は、限局性疾患を有するアフリカ系アメリカ人及びヨーロッパ系アメリカ人患者から採取された(図10−表1)。
[000179]前立腺腫瘍におけるダイサーの上方調節
[000180]前立腺腫瘍は、限局性疾患を有するアフリカ系アメリカ人及びヨーロッパ系アメリカ人患者から採取された(図10−表1)。
[000181]これらの腫瘍からの、及び16の非腫瘍組織からの全RNAの単離後、約13,000のタンパク質コード遺伝子及び329の特有のヒトマイクロRNAをマイクロアレイで決定した。
[000182]最初に、これらのサンプルの遺伝子発現プロファイルは、マイクロRNのプロセッシングを調節することが示されているmRNA(例えば、中でもドローシャ又はダイサーをコードするmRNA)の発現における癌関連変化について探索した。非腫瘍組織と比較した場合、ダイサーが前立腺腫瘍において有意に高く発現されていることを我々の分析は明らかにした(1.6倍;FDR<1%)。ドローシャの必須な補因子をコードするDGCR8も、非腫瘍組織と比較した場合、ダイサーよりも低い程度ではあったが、腫瘍において上方調節されていた(1.2倍;FDR<1%)。ドローシャの必須な補因子をコードしたDGCR8も、腫瘍において上方調節されていた(1.2倍;FDR<1%)。腫瘍におけるダイサー及びDGCR8の発現増加は、qRT−PCRにより確認され、それはマイクロアレイで示されたよりも大きな相違倍数を明らかにした(図4A〜4B)。
[000183]さらなる分析は、ダイサー及びEIF2C2(両方ともRISC複合体の成分)が、低合計グリーソンスコア(スコア5〜6)を有する腫瘍におけるよりも、高合計グリーソンスコア(スコア7〜9)を有する腫瘍において、より高く発現されたことを示した。しかしながら、これらの発現相違はむしろ穏やかであった(ダイサー:1.2倍;EIF2C2:1.3倍)。高頻度の宿主遺伝子及びイントロンマイクロRNAの共発現がヒト細胞で観察されているので(28)、前立腺腫瘍におけるマイクロRNA宿主遺伝子の発現も調べた。
[000184]マイクロRNAについての宿主遺伝子の中で(28;29)、5つの発現が前立腺癌で変化していることが見出された(全てFDR<1%)。これらの内、miR−32の宿主であるC9orf5(2.1倍上方調節)及びmiR−25クラスター (miR−25/miR−93/miR−106b)の宿主であるMCM7(1.7倍上方調節)が腫瘍中で最も高く過剰発現されていた。NFYC(miR−30c−lの宿主)、SMC4L1(miR−15b及びmiR−16−2の宿主)及びPTPRN2(miR−153−2の宿主)は、非腫瘍組織と比較した場合、より穏やかな30%〜40%の増加した発現を示した。
[000185]前立腺癌のマイクロRNA遺伝子シグネチャー
[000186]最初に、腫瘍及び非腫瘍組織間で差次的発現を示したマイクロRNAについて探索した。図11−表2に示したように、前立腺腫瘍において複数のマイクロRNAの発現が変化した。
[000186]最初に、腫瘍及び非腫瘍組織間で差次的発現を示したマイクロRNAについて探索した。図11−表2に示したように、前立腺腫瘍において複数のマイクロRNAの発現が変化した。
[000187]非腫瘍組織よりも腫瘍においてより低い転写体レベルを有するマイクロRNAの中で、miR−520h、miR−494、及びmiR−490が最も高度に減少していた。このリストにおいて他の二つの注目に値するマイクロRNAはmiR−l(−2)及びmiR−133a(−l)であった。これら二つのマイクロRNAは、同じpri−mRNAによりコードされている。miR−32が最も有意に上方調節され、miR−182、miR−31、及びmiR−26aが続く。より高く発現された腫瘍マイクロRNAのリストは、miR−106b−25クラスターの全てのメンバー(miR−106b/miR−93/miR−25)及びmiR−99bクラスターの二つのメンバー(miR−99b及びmiR−125a)も含んでいる。miR−32及びmiR−106b−25クラスター両方の上方調節は、前立腺腫瘍におけるそれら各々の宿主遺伝子、C9orf5及びMCM7の増加した発現と一致している。
[000188]マイクロアレイデータの統計分析は、C9orf5及びmiR−32の組織転写体レベルが統計的に有意に相関していることを確認した(P=0.0003)。ピアソン係数は、この相関が全てのサンプルにわたって中程度に強かったことを示した(0.39;95%信頼区間:0.18〜0.57;n=76)。類似のデータが、MCM7とmiR−106b−25クラスター転写体レベル間の相関についても得られた(miR−106b:0.37(ピアソン係数)、P=0.001;miR−93:0.35、P=0.002;miR−25:0.23、P=0.04)。
[000189]腫瘍及び非腫瘍組織の無作為下位集団の選択されたマイクロRNAのqRT−PCR分析により、マイクロアレイデータを実証した。マイクロアレイと一致して、成熟miR−32(3.2倍)及びmiR−106b(3.0倍)は、非腫瘍組織よりも腫瘍においてより高く発現されていることが見出された(図5A−5D)。非腫瘍組織と比較した場合、腫瘍において成熟miR−1が下方調節され(平均:0.44倍)、そしてmiR−106a(miR−106b相同体)が過剰発現(平均:3.7倍)されていることも見出された。
[000190]その周辺非腫瘍組織が入手可能であった、本研究の10の腫瘍について、マイクロアレイデータの対応のある検定も実行した。対応のある検定は我々の以前の発見を実証した。FDR<10%では、miR−26a、miR−30c−l、miR−32、miR−146b、miR−181a、miR−182、miR−196a、miR−200c、miR−375、及びmiR−106b−25クラスターの全てのマイクロRNAが腫瘍において上方調節されていることが見出された(1.5倍〜2.5倍)。最も有意に下方制御された腫瘍マイクロRNAはmiR−494(0.4倍)及びmiR−126
(0.6倍)であった。しかしながら、miR−133aクラスターは、この腫瘍下位集団においては有意に差次的に発現されていないことが見出された。
(0.6倍)であった。しかしながら、miR−133aクラスターは、この腫瘍下位集団においては有意に差次的に発現されていないことが見出された。
[000191]マイクロRNAと前立腺外進展及びグリーソンスコアの関連
[000192]次ぎに、腫瘍の前立腺外進展に関連したマイクロRNA発現の相違について我々のデータセットを分析した。前立腺外進展は、前立腺癌腫を有する患者において好ましくない予後因子である。FDR<20%で、疾患の前立腺外進展を示した腫瘍(n=17)及び示していない腫瘍(n=35)間の発現において相違を有する15のマイクロRNAを見出した(図12−表3)。
[000192]次ぎに、腫瘍の前立腺外進展に関連したマイクロRNA発現の相違について我々のデータセットを分析した。前立腺外進展は、前立腺癌腫を有する患者において好ましくない予後因子である。FDR<20%で、疾患の前立腺外進展を示した腫瘍(n=17)及び示していない腫瘍(n=35)間の発現において相違を有する15のマイクロRNAを見出した(図12−表3)。
[000193]miR−101は、前立腺(prostate gland)外に広がった限局性前立腺腫瘍において最も一貫して過剰発現されていたマイクロRNAであった(FDR<1%)。前立腺外進展は、腫瘍シグネチャーとそのマイクロRNAシグネチャーの一部を共有した(図11−表2)。
[000194]二つのマイクロRNA、miR−99b及びmiR−196aは、両シグネチャーに共通している。前立腺外進展シグネチャーの他の二つのマイクロRNA、miR−200a及びmiR−200bは、腫瘍シグネチャー中のmiR−200cと広範囲の相同性を有する。本研究でこの特徴を有すると診断された腫瘍はわずかであったが、マイクロRNAと精嚢浸潤の関連も調べた。FDR<20%で、一つのマイクロRNAのみが、精嚢浸潤を有する腫瘍(n=9)及び浸潤を有していない腫瘍(n=43)間で差次的に発現された。このマイクロRNAはmiR−199a−lであり、他の腫瘍と比較した場合、精嚢浸潤を有する腫瘍において2.3倍増加していた。
[000195]マイクロRNA発現プロファイリングは、グリーソンスコアに対するロバスト(robust)シグネチャーを明らかにしなかった。非常にわずかなマイクロRNAのみが、FDR<20%で差次的に発現されていることが見出された。低合計グリーソンスコアを有する腫瘍(スコア5−6、n=15)と比較した場合、高合計グリーソンスコアを有する腫瘍(スコア7−9、n=45)において有意に上方調節されていたマイクロRNA(P<0.01)は、miR−92−2(1.3倍)、miR−25及びmiR−32相同体、及びmiR−335(1.2倍)であり、そして有意に下方制御されていたマイクロRNA(P<0.01)は、miR−1−133aクラスター(0.7倍)及びmiR−130(0.8倍)であった。
[000196]本研究の腫瘍は、臨床病理学的パラメータがよく一致していたアフリカ系アメリカ人及びヨーロッパ系アメリカ人患者から集められたので(図10−表1)、アフリカ系アメリカ人(n=30)及びヨーロッパ系アメリカ人(n=30)間の腫瘍マイクロRNAシグネチャーを比較した。わずかなマイクロRNAしか差次的に発現されなかった(P<0.01)。FDR<20%では、miR−129、miR−196b及びmiR−342が、ヨーロッパ系アメリカ人の腫瘍においてよりもアフリカ系アメリカ人の腫瘍においてより少ない量であることが見出された(20%〜30%より低く)。この分析から、腫瘍マイクロRNAが人種/民族性により非常に差次的に発現されることはないようである。
[000197]マイクロRNAによる腫瘍及び非腫瘍組織の分類
[000198]遺伝子に基づいた分類は、疾患診断を改善することにおける、及び臨床挙動予測のための強力な診断的及び予後予測ツールであり得る。我々は、腫瘍と非腫瘍組織間、器官限局性腫瘍及び前立腺外進展を有する腫瘍間、及び高及び低合計グリーソンスコアを有する腫瘍間を識別するマイクロRNAシグネチャーを同定するためにPAM応用を使用した。PAMは、腫瘍及び非腫瘍組織間を最も良く区別する7プローブセット及び37プ
ローブセットから成る二つのマイクロRNAシグネチャーを同定した。7プローブセットシグネチャーは、16非腫瘍組織の内の14(88%)及び60腫瘍の内の49(82%)の正しい分類を達成した。このシグネチャーは、四つのマイクロRNA、miR−32、miR−218−2、miR−490及びmiR−520hのみの発現パターンに基づいており(図13B−表4B)、それらはすべて最も有意に上方又は下方調節されている腫瘍マイクロRNAであった(図11−表2)。総合的予測精度のさらなる改善は、23のマイクロRNAを示す37プローブセットシグネチャーで得られた(図14−表5)。
[000198]遺伝子に基づいた分類は、疾患診断を改善することにおける、及び臨床挙動予測のための強力な診断的及び予後予測ツールであり得る。我々は、腫瘍と非腫瘍組織間、器官限局性腫瘍及び前立腺外進展を有する腫瘍間、及び高及び低合計グリーソンスコアを有する腫瘍間を識別するマイクロRNAシグネチャーを同定するためにPAM応用を使用した。PAMは、腫瘍及び非腫瘍組織間を最も良く区別する7プローブセット及び37プ
ローブセットから成る二つのマイクロRNAシグネチャーを同定した。7プローブセットシグネチャーは、16非腫瘍組織の内の14(88%)及び60腫瘍の内の49(82%)の正しい分類を達成した。このシグネチャーは、四つのマイクロRNA、miR−32、miR−218−2、miR−490及びmiR−520hのみの発現パターンに基づいており(図13B−表4B)、それらはすべて最も有意に上方又は下方調節されている腫瘍マイクロRNAであった(図11−表2)。総合的予測精度のさらなる改善は、23のマイクロRNAを示す37プローブセットシグネチャーで得られた(図14−表5)。
[000199]このシグネチャーは、7プローブセットシグネチャーと完全に重複している。37プローブセットシグネチャーにより、PAMは16非腫瘍組織の内の16(100%)及び60腫瘍の内の48(80%)の正しい分類を達成した。PAMは、前立腺外進展及びグリーソンスコアについての良好な分類指標を同定することができなかった。グリーソンスコアのための不十分から中程度の分類指標は149プローブセットを必要とした(データは示していない)。
[000200]前立腺組織におけるマイクロRNAの転写体存在量とそれらの標的mRNAの関係
[000201]マイクロRNAは、標的特異性翻訳抑制によりタンパク質コード遺伝子の発現を調節する(4)。しかしながら、いくつかのマイクロRNA(例えば、miR−1)は、哺乳類細胞において多数の標的遺伝子の転写体レベルを下方制御し得ることが最近示された。miR−1は、前立腺腫瘍において最も有意に下方制御されたマイクロRNAであるので、これらの腫瘍におけるmiR−1発現レベルと予測miR−1標的遺伝子の発現レベル間の相関分析を実行した。この試験は、弱められたmiR−1発現のため、前立腺腫瘍中で過剰発現されるようになる候補miR−1標的遺伝子を同定するために実施した。分析により、前立腺腫瘍において上方調節されていることが見出され(FDR<1%)、そしてmiR−1発現と逆相関している推定標的mRNAを得た(図13−表4))。
[000201]マイクロRNAは、標的特異性翻訳抑制によりタンパク質コード遺伝子の発現を調節する(4)。しかしながら、いくつかのマイクロRNA(例えば、miR−1)は、哺乳類細胞において多数の標的遺伝子の転写体レベルを下方制御し得ることが最近示された。miR−1は、前立腺腫瘍において最も有意に下方制御されたマイクロRNAであるので、これらの腫瘍におけるmiR−1発現レベルと予測miR−1標的遺伝子の発現レベル間の相関分析を実行した。この試験は、弱められたmiR−1発現のため、前立腺腫瘍中で過剰発現されるようになる候補miR−1標的遺伝子を同定するために実施した。分析により、前立腺腫瘍において上方調節されていることが見出され(FDR<1%)、そしてmiR−1発現と逆相関している推定標的mRNAを得た(図13−表4))。
[000202]これらの中で、WDR6、XP06及びSMARCA4のための転写体が腫瘍miR−1発現と最も有意な逆相関関係を示した(各々P<1x10−10)。前立腺腫瘍におけるXPO6とmiR−1転写体レベル間の関係は、図6に描かれている。
[000203]該腫瘍におけるXPO6タンパク質レベルが、miR−1と逆相関していることも見出した(−0.29、スピアマン相関係数;n=8)。しかしながら、miR−1の全ての予測標的が、腫瘍においてmiR−1転写体レベルと逆相関を示したわけではない。例えば、TWFl(PTK9とも称される)は、miR−1と正に相関しており、マイクロRNAのその標的配列への結合が、時にはmRNA隔離及び抑制されたmRNAの細胞内蓄積を導くことができることを示唆している(30)。
[000204]我々の分析を、前立腺腫瘍において有意に上方あるいは下方調節されている他のマイクロRNAに拡大した。ここで、我々は最初に、問題とするマイクロRNAと、HG−U133A2.0アレイにより探査された全てのmRNAあるいはマイクロRNAの予測標的であるmRNAのみの間のピアソン相関係数の全体的分布を決定した。二つのマイクロRNA、miR−106b及びmiR−181aについて、相関係数の分布は、全てのmRNAと、miR−106b及びmiR−181aの予測標的であるmRNAとの間で著しく異なっていた(図1A−1B)。
[000205]miR−106b及びmiR−181aの予測標的mRNAについての分布曲線は、負のピアソン相関係数に向かって広がった特有の肩を示した。このパターンは正規分布からの逸脱であり、3’UTR中に予測マイクロRNA標的配列を有する、mRNAの下位集団の組織転写体レベルが、miR−106b及びmiR−181aにより減少す
ることを示す。腫瘍において有意に下方調節されている(FDR<1%)、及びその転写体レベルがmiR−181a発現と逆相関している標的遺伝子のリストが図14−表5に示されている。
ることを示す。腫瘍において有意に下方調節されている(FDR<1%)、及びその転写体レベルがmiR−181a発現と逆相関している標的遺伝子のリストが図14−表5に示されている。
[000206]これらの標的遺伝子と、白血病サンプル中のmir−181a転写体レベルに相関する遺伝子のリスト(31)との比較は、数個(例えば、SLC9A6、RIN2、KLHL2及びGHITM)が両方のリストのmir−181aと負に相関していることを示した。
[000207]前立腺癌細胞における候補オンコmiRによるタンパク質発現の抑制
[000208]腫瘍研究からの我々の結果は、miR−1、miR−32及びmiR−106b−25クラスターは前立腺癌においてオンコmiRであり、miR−32及びmiR−25は高度の相同性を共有し、そしてそれらの予測標的遺伝子は同一である(targetscan.org)ことを示唆する。さらに、miR−106b−25クラスターは、既知のオンコmiR、miR−17−92クラスター(15;32)と高度に相同しており、そしてmiR−17−5p及びmiR−106bの予測標的は同一である。miR−17−92クラスターの標的は、E2F1である(32)。
[000208]腫瘍研究からの我々の結果は、miR−1、miR−32及びmiR−106b−25クラスターは前立腺癌においてオンコmiRであり、miR−32及びmiR−25は高度の相同性を共有し、そしてそれらの予測標的遺伝子は同一である(targetscan.org)ことを示唆する。さらに、miR−106b−25クラスターは、既知のオンコmiR、miR−17−92クラスター(15;32)と高度に相同しており、そしてmiR−17−5p及びmiR−106bの予測標的は同一である。miR−17−92クラスターの標的は、E2F1である(32)。
[000209]miR−1、miR−32、及びmiR−106bがこれらの細胞において癌関連遺伝子のタンパク質発現を調節しているかどうかを調べるため、二つのヒト前立腺癌細胞株を前駆体及びアンチセンスマイクロRNAでトランスフェクトした。
[000210]細胞株中のこれらのマイクロRNAの内在性発現は、qRT−PCRによりmiR−106>miR−32>miR−1であった。miR−1は、検出限界であった。miR−1について、マイクロRNA転写体存在量と腫瘍組織中のそれらの標的mRNAの間の関連性がマイクロRNA標的を同定するために有用であるかどうかを試験し、そしてエクスポーチン−6(XPO6)のタンパク質発現及びタンパク質チロシンキナーゼ9(TWFl)がmiR−1によって調節されているかどうかを試験した。miR−1での前立腺癌細胞のトランスフェクションは、それがエクスポーチン−6及びPTK9両方を、両方の前立腺癌細胞株においてタンパク質レベルで抑制することを確信させた(図2A)。miR−32又はmir−106bのいずれも、これらのタンパク質の発現を変化させなかった(データは示していない)。
[000211]次に、miR−106bによるE2F1及びp21/WAF1タンパク質レベルの調節について調べた。両方のタンパク質とも、それらの3’UTR中にmiR−106bの予測標的配列を有するmRNAによりコードされている。前立腺腫瘍における転写体レベルにはE2F1が相関しなかったのに対し、これらの腫瘍において、CDKN1A(p21/WAF1をコードする)の発現とmiR−106bとの間には、有意な逆相関が存在した(−0.34;95%CI;;−0.9〜−0.55;P=0.003)。
[000212]図2Bに示したように、二つの細胞株において、トランスフェクトされた前駆体miR−106bはp21/WAF1タンパク質レベルを減少させ、そしてアンチセンスmiR−106bはp21/WAF1タンパク質レベルを増加させた。前駆体及びアンチセンスmiR−106bでの前立腺癌細胞トランスフェクション後、E2F1についても同じ結果を得た(図3A)。
[000213]Bimタンパク質発現に対するmiR−32の効果も研究した。Bimは、BCL2L11によりコードされており、miR−32の予測標的である。前駆体miR−32による前立腺癌細胞のトランスフェクションは、Bimタンパク質レベルを減少させ、一方、アンチセンスmiR−32はBimタンパク質レベルを増加させた(図3C)。
BimはBCL2L11によりコードされており、miR−32の予測標的である。BCL2L11及びmiR−32転写体レベルは、組織サンプルでは相関しておらず、miR−32はこの標的をほとんど翻訳抑制により調節することができることを示唆している。
BimはBCL2L11によりコードされており、miR−32の予測標的である。BCL2L11及びmiR−32転写体レベルは、組織サンプルでは相関しておらず、miR−32はこの標的をほとんど翻訳抑制により調節することができることを示唆している。
[000214]これらの細胞株において、E2F1及びp21/WAF1のタンパク質発現は、miR−32により影響されず、Bimのタンパク質発現もmiR−106bにより影響されなかった(データは示していない)。
[000215]E2FI及びBimは、miR−106b及びmiR−32の直接的標的である
[000216]我々の発見をさらに実証するため、及びこれらのタンパク質がmiR−I06b及びmiR−32の直接標的である証拠を提出するため、LNCaP細胞を、マイクロRNA前駆体及び、二つの遺伝子、E2F1及びBCL2L11(Bimをコードする)の野生型あるいは変異3’UTRのいずれかをそれぞれ含有する、のpGL3ルシフェラーゼレポーター構築物で共トランスフェクトした。変異3’UTRはmiR−106b及びmiR−32シード相補領域部位中に、最初の3ヌクレオチドの欠失を含有する。該3’UTRは、マイクロRNAが標的配列に結合した時、ルシフェラーゼレポーターの翻訳抑制を導くであろう位置に置かれている。
[000216]我々の発見をさらに実証するため、及びこれらのタンパク質がmiR−I06b及びmiR−32の直接標的である証拠を提出するため、LNCaP細胞を、マイクロRNA前駆体及び、二つの遺伝子、E2F1及びBCL2L11(Bimをコードする)の野生型あるいは変異3’UTRのいずれかをそれぞれ含有する、のpGL3ルシフェラーゼレポーター構築物で共トランスフェクトした。変異3’UTRはmiR−106b及びmiR−32シード相補領域部位中に、最初の3ヌクレオチドの欠失を含有する。該3’UTRは、マイクロRNAが標的配列に結合した時、ルシフェラーゼレポーターの翻訳抑制を導くであろう位置に置かれている。
[000217]図3B及び図3Dに示したように、E2F1の野生型3’UTRを含有するレポーター構築物によるmiR−106b、あるいはBCL2L11の野生型3’UTRを含有するレポーター構築物によるmiR−32の共トランスフェクションは、前駆体マイクロRNA陰性対照と比較した場合、ルシフェラーゼレポーターの有意な抑制を生じた。3’UTRの非存在下でのマイクロRNAによるレポーターの抑制はなかった。変異3’UTRの存在は、マイクロRNAの効果を無効にするかあるいは減弱した。本結果は、3’UTR標的配列への結合による、タンパク質翻訳に対するマイクロRNAの直接効果と一致している。こうした機構は、ヒト結腸及び胃癌細胞における、miR−106bによるp21/WAF1の調節に対しても確立されている(13、14)。従って、miR−106bはLNCaP細胞において、CDKN1A 3S UTR仲介機構によりルシフェラーゼレポーターを阻害することが観察された(図7)。
[000218]22Rv1ヒト前立腺癌細胞における、miR−106b−25クラスターによるカスパーゼ活性化の阻害
[000219]我々の以前のデータは、miR−32、miR−106b及びそれらの相同体(例えば、miR−25)はBim及びE2F1のアポトーシス促進性機能を標的とするので、それらは癌遺伝子として働くことができることを示している。ドキソルビシン及びエトポシドにより誘発されたアポトーシスに対するmiR−106b−25クラスターの影響を評価するため、非転移性ヒト前立腺癌細胞株である22Rv1細胞を、miR−106b−25クラスターをコードするレンチウイルス発現構築物に感染させた。カスパーゼ−Gloアポトーシスアッセイを使用し、抗癌薬処理細胞において、このクラスターによるカスパーゼ3/カスパーゼ7活性化の有意な阻害を観察した(図8A〜8B)。データは、前立腺癌細胞におけるmiR−106b−25クラスターの抗アポトーシス機能と一致している。
[000219]我々の以前のデータは、miR−32、miR−106b及びそれらの相同体(例えば、miR−25)はBim及びE2F1のアポトーシス促進性機能を標的とするので、それらは癌遺伝子として働くことができることを示している。ドキソルビシン及びエトポシドにより誘発されたアポトーシスに対するmiR−106b−25クラスターの影響を評価するため、非転移性ヒト前立腺癌細胞株である22Rv1細胞を、miR−106b−25クラスターをコードするレンチウイルス発現構築物に感染させた。カスパーゼ−Gloアポトーシスアッセイを使用し、抗癌薬処理細胞において、このクラスターによるカスパーゼ3/カスパーゼ7活性化の有意な阻害を観察した(図8A〜8B)。データは、前立腺癌細胞におけるmiR−106b−25クラスターの抗アポトーシス機能と一致している。
[000220]アンドロゲン調節マイクロRNAの同定
[000221]アンドロゲンは、前立腺の生理学及び腫瘍生物学において鍵となる役割を果たす。我々は、DU145及びLNCaP細胞において、アンドロゲンによるマイクロRNAの調節を検討した。Rl881によるDU145細胞の処理は、マイクロRNA発現において何ら有意な変化を与えなかった。対照的に、Rl881処理後、LNCaP細胞においては多数のマイクロRNAの発現が有意に変化した(FDR<5%)(図15−表6
)。
[000221]アンドロゲンは、前立腺の生理学及び腫瘍生物学において鍵となる役割を果たす。我々は、DU145及びLNCaP細胞において、アンドロゲンによるマイクロRNAの調節を検討した。Rl881によるDU145細胞の処理は、マイクロRNA発現において何ら有意な変化を与えなかった。対照的に、Rl881処理後、LNCaP細胞においては多数のマイクロRNAの発現が有意に変化した(FDR<5%)(図15−表6
)。
[000222]一つのマイクロRNA、miR−338が有意に上方調節された。miR−126−5、miR−146b、miR−219−5p及びmiR181b−l、miR−181c及びmiR−221クラスターの全てのメンバーを含む他のマイクロRNAは下方調節された。培養DU145及びLNCaP細胞におけるベースラインマイクロRNA発現の分析は、アンドロゲン応答性LNCaP細胞におけるよりも、アンドロゲン非応答性DU145細胞において、三つのマイクロRNAクラスターの全てのメンバーが有意に高い発現を有していたことを明らかにした(FDR<5%)。
[000223] Genomatix転写因子結合部位データベースでのモチーフ検索を使用し、前記のマイクロRNAが、それらの隣接領域に推定アンドロゲンレセプター結合部位を有することを見出した(図16−表7)。さらに、1あるいは10nmol/L Rl881で12、24及び48時間処理されたLNCaP細胞での実験において、マイクロアレイ結果をさらに実証した。成熟miR−338及びmiR−221のqRT−PCR分析は、それらの発現レベルがアンドロゲン調節であることを示した(図9A−9B)。
[000224]実施例Iの考察
[000225]我々は、前立腺腫瘍における特有のマイクロRNA発現シグネチャー及び腫瘍マイクロRNAプロセッシングを調節する遺伝子発現の変化をここに発見した。さらに、マイクロRNAの調節解除が、前立腺における転写体存在量及び標的mRNAのタンパク質発現に影響することを見出した。細胞培養において、前立腺癌における候補オンコmiR、例えば、miR−32及びmiR−106bが癌関連遺伝子のタンパク質発現を抑制することを示した。本結果は、ヒト前立腺発癌における変化したマイクロRNA発現の病因的役割と一致している。
[000225]我々は、前立腺腫瘍における特有のマイクロRNA発現シグネチャー及び腫瘍マイクロRNAプロセッシングを調節する遺伝子発現の変化をここに発見した。さらに、マイクロRNAの調節解除が、前立腺における転写体存在量及び標的mRNAのタンパク質発現に影響することを見出した。細胞培養において、前立腺癌における候補オンコmiR、例えば、miR−32及びmiR−106bが癌関連遺伝子のタンパク質発現を抑制することを示した。本結果は、ヒト前立腺発癌における変化したマイクロRNA発現の病因的役割と一致している。
[000226]これは、ヒト前立腺腫瘍で生じるマイクロRNA機能の変化を同定するため、マイクロRNA及びタンパク質コードRNA両方の大規模遺伝子発現プロファイリングを使用する最初の研究である。本研究の他の強みは、大きなサンプルサイズであり、そしてアフリカ系アメリカ人及びヨーロッパ系アメリカ人患者の両方を含むことである。それ故、本研究結果は米国において最も高い前立腺癌負担を有する二つの人種/民族群を代表するものである(34)。
[000227]我々は、前立腺腫瘍におけるダイサー及びDGCR8、及び高グリーソンスコアを有する腫瘍におけるダイサー及びEIF2C2(アルゴノート−2をコードする)の増加した発現を見出した。前立腺癌においてダイサーが上方調節されているという観察は最近の報告(35)に一致しており、マイクロRNA前駆体を成熟マイクロRNAにプロセッシングすることにおいて、前立腺腫瘍は正常前立腺組織よりもより効率的であり得ることを示している。マイクロRNAのプロセッシング障害は、マウスにおいて腫瘍形成を増強することが最近示されており(8)、及び他の報告は、マイクロRNAプロセッシングは一般に、癌において下方調節されていると仮定している(36)。
[000228]しかしながら、前立腺腫瘍においては、前立腺癌細胞におけるダイサーの増加したタンパク質発現及び転移性疾患におけるダイサー及びEIF2C2の過剰発現を示した我々のデータ及び前記の研究(35)により示されたように、増強されたマイクロRNAプロセッシングの逆の効果が起こることもできる。
[000229]マイクロRNA発現プロファイルは、ヒト癌を分類する(10;14)。乳癌、結腸癌、肺癌及び膵臓癌を含むいくつかの上皮癌の特有のシグネチャーが報告されている(11;12;37;38)。他の二つの研究は、前立腺癌におけるマイクロRNA発
現を調べている(39;40)。Baylorの前立腺データ(40)と一致して、我々は前立腺腫瘍においてmiR−45が有意に下方調節されていることを観察した。しかしながら、これら二つの公表された研究は、我々の研究と比較した場合、かなり小規模でそしてわずかな腫瘍のみを検討している。
現を調べている(39;40)。Baylorの前立腺データ(40)と一致して、我々は前立腺腫瘍においてmiR−45が有意に下方調節されていることを観察した。しかしながら、これら二つの公表された研究は、我々の研究と比較した場合、かなり小規模でそしてわずかな腫瘍のみを検討している。
[000230]我々は、上方及び下方調節されたマイクロRNAを含む腫瘍遺伝子シグネチャーを同定した。
[000231]最も高く上方調節されたマイクロRNAは、miR−32であり、miR−182、miR−31、miR−26a、miR−200c及びmiR−196aが続いていた。過剰発現された腫瘍マイクロRNAのリストはmiR−106b−25クラスターも含んでおり、いくつかのヒト悪性腫瘍におけるmir−25、miR−93及びmiR−106bのコピー数の観察された増加と一致している(41)。
[000231]最も高く上方調節されたマイクロRNAは、miR−32であり、miR−182、miR−31、miR−26a、miR−200c及びmiR−196aが続いていた。過剰発現された腫瘍マイクロRNAのリストはmiR−106b−25クラスターも含んでおり、いくつかのヒト悪性腫瘍におけるmir−25、miR−93及びmiR−106bのコピー数の観察された増加と一致している(41)。
[000232]最も有意に下方調節されたマイクロRNAにはmiR−520h、miR−494、miR−490及びmiR−l−133aクラスターが含まれる。
[000233]ヒト癌においてマイクロRNAの変化した発現は、多数の研究で観察されている。腫瘍におけるマイクロRNAの上方調節は普通であり(5、6、8)、多くのマイクロRNAの既知の発癌活性と一致している(22−25)。上方調節の機構には、転写活性化及び遺伝子コピー数の増加が含まれる。成熟マイクロRNAの存在量の減少は、最近示されたように(26)、変化したプロセッシングから生じてもよく、それは成熟マイクロRNAの無差別なより低い発現を導くであろう。本研究においてはそれは観察されなかった。もしくは、変異又はゲノム変化(21)又はマイクロRNA座位エピジェネティックサイレンシング(27、28)のためにマイクロRNA発現を失う可能性もある。エピジェネティックサイレンシングは、前立腺癌において重要な機構であり(29)、将来の研究は、この機構が前立腺腫瘍においてマイクロRNA発現を遅らせているかどうかに取り組まなければならないであろう。
[000233]ヒト癌においてマイクロRNAの変化した発現は、多数の研究で観察されている。腫瘍におけるマイクロRNAの上方調節は普通であり(5、6、8)、多くのマイクロRNAの既知の発癌活性と一致している(22−25)。上方調節の機構には、転写活性化及び遺伝子コピー数の増加が含まれる。成熟マイクロRNAの存在量の減少は、最近示されたように(26)、変化したプロセッシングから生じてもよく、それは成熟マイクロRNAの無差別なより低い発現を導くであろう。本研究においてはそれは観察されなかった。もしくは、変異又はゲノム変化(21)又はマイクロRNA座位エピジェネティックサイレンシング(27、28)のためにマイクロRNA発現を失う可能性もある。エピジェネティックサイレンシングは、前立腺癌において重要な機構であり(29)、将来の研究は、この機構が前立腺腫瘍においてマイクロRNA発現を遅らせているかどうかに取り組まなければならないであろう。
[000234]これらのマイクロRNAの大部分の機能についてはほとんど知られていない。miR−32はmiR−25、miR−92、miR−363及びmiR−367の相同体である。これらのマイクロRNAのいくつかも、前立腺腫瘍において上方調節されている。miR−32は結腸及び膵臓癌で増加しており(10)、ヒト細胞の抗ウイルス防御のメディエーターである(42)。既知の前立腺癌感受性遺伝子のいくつかが宿主防御にも関与するので(43)、その変化した発現及び前立腺癌発生の間にmiR−32のこの機能が関連している可能性がある。他のマイクロRNAについて示されたように、miR−32は標的遺伝子のタンパク質発現を調節するはずである。
[000235]miR−32が、BCL−2ファミリーのアポトーシス促進性メンバー、Bim(44)の発現を抑制するという新たな観察がなされた。Bimはハプロ不全であり、一つのアレルの不活性化がMyc誘発腫瘍形成を促進するのに十分である(45)。Bimは、上皮腫瘍のアポトーシスに重要な役割を果たし、化学療法の抗腫瘍効果を仲介する(46)。それ故、miR−32によるBimの下方調節は、腫瘍環境のアポトーシス刺激への腫瘍細胞の抵抗性に寄与することができる。
[000236]既知の機能を有する他の注目に値するマイクロRNAには、miR−1、miR−133a及びmiR−196aが含まれる。miR−l−133aクラスターは、筋細胞で優先的に発現され、細胞分化を調節することが示されている(47;48)。miR−1は、乳癌における転移の抑制因子であるmiR−206の相同体である(34)。miR−1が前立腺腫瘍において下方調節されているという発明者の発見は、その相同体の腫瘍抑制因子機能と一致している。
[000237]miR−1を試験し、前立腺腫瘍及び培養前立腺癌細胞において、このマイクロRNAの発現が、エクスポーチン−6及びタンパク質チロシンキナーゼ9(A6/ツインフィリンとも名付けられている)の発現と逆相関していることを観察した。これら二つの遺伝子の機能についてはあまり知られていないが、最近のデータは両方とも細胞アクチン動態を調節していることを示唆している(49−51)。miR−196aはHOXB8の抑制因子として同定されており(52)、miR−196aの上昇した発現は膵臓癌において悪い生存率を予測する(38)。このマイクロRNAは、我々の研究の腫瘍シグネチャー及び前立腺外進展シグネチャーの両方に共通であり、前立腺癌でのmiR−196aの上方調節は、疾患進行の因子であり得ることを示している。
[000238]マイクロRNAシグネチャーは、ヒト癌において診断的及び予後診断的意義の両方を有していることが示されてきた(13;38;53;54)。
[000239]マイクロRNAと、患者の腫瘍診断、前立腺外進展、グリーソンスコア及び人種/民族性の関連性を調べることにより、前立腺癌におけるマイクロRNA発現の診断的及び予後診断的意義を決定した。アフリカ系アメリカ人患者及びヨーロッパ系アメリカ人患者の腫瘍マイクロRNAシグネチャーを、これら二つの患者群間で腫瘍生物学における差異が存在してもよいという最近の証拠(55)が現れたので比較した。マイクロRNA発現の大きな差異が前立腺の腫瘍と非腫瘍組織間で見出されたが、前立腺(prostate gland)から広がった腫瘍及び広がっていない腫瘍間、>7のグリーソンスコアを有する腫瘍及びスコア<7を有する腫瘍間、アフリカ系アメリカ人患者及びヨーロッパ系アメリカ人患者からの腫瘍間では相対的に少数のマイクロRNAしか差次的に発現されなかった。
[000239]マイクロRNAと、患者の腫瘍診断、前立腺外進展、グリーソンスコア及び人種/民族性の関連性を調べることにより、前立腺癌におけるマイクロRNA発現の診断的及び予後診断的意義を決定した。アフリカ系アメリカ人患者及びヨーロッパ系アメリカ人患者の腫瘍マイクロRNAシグネチャーを、これら二つの患者群間で腫瘍生物学における差異が存在してもよいという最近の証拠(55)が現れたので比較した。マイクロRNA発現の大きな差異が前立腺の腫瘍と非腫瘍組織間で見出されたが、前立腺(prostate gland)から広がった腫瘍及び広がっていない腫瘍間、>7のグリーソンスコアを有する腫瘍及びスコア<7を有する腫瘍間、アフリカ系アメリカ人患者及びヨーロッパ系アメリカ人患者からの腫瘍間では相対的に少数のマイクロRNAしか差次的に発現されなかった。
[000240]さらに、4マイクロRNAから成る7プローブセットシグネチャーが、腫瘍及び非腫瘍前立腺組織を区別できるPAMにより同定された。しかしながら、PAM分析は、前立腺外進展、グリーソンスコア又は人種/民族性については良好な分類指標を作り出せなかった。
[000241]我々は、低誤差で前立腺外疾患進展に関連していた一つのマイクロRNA、miR−101を同定した。このマイクロRNAの機能は、未知である。我々は前立腺腫瘍の特有の不均一性が、前立腺癌の好ましくない予後因子に関連するより多くのマイクロRNAの発見を妨げていると確信している。
[000242]マイクロRNAの遺伝子位置の解析は、腫瘍における変化したマイクロRNA発現を引き起こすそれらの推定機能及び機構についての手掛かりを提供し得る(56)。最近の研究は、マイクロRNAが高頻度でタンパク質コード遺伝子のイントロン内に位置し、これらの宿主遺伝子と共発現されることを示している(28;29)。我々は、前立腺腫瘍における宿主遺伝子発現を調べ、それらのいくつかが前立腺腫瘍において増加したことを見出した。C9orf5及びMCM7は、二つの最も高く上方調節された宿主遺伝子であり、それらの発現は、それぞれイントロンマイクロRNA、miR−32及びmiR−106b−25クラスターと相関していた。本データは、前立腺腫瘍における宿主遺伝子の上方調節及び同時転写されたマイクロRNAを導く共通の機構を示唆する。
[000243]癌におけるC9orf5の役割は知られていないが、MCM7増幅は以前に前立腺癌と関連付けられている。MCM7座位は、癌再発の症例の88%において増幅されていることが見出されている(57)。MCM7過剰発現は前立腺癌に限定されておらず、子宮頸癌を含む他の悪性腫瘍において観察されている(58)。
[000244]前立腺癌細胞においてmiR−106bがE2F1及びCDKN1A(p21/WAF1をコードする)を標的としているかどうかを検討し、これらの遺伝子のタンパク質発現がmiR−106bにより抑制されていることを見出した。miR−106b−
25クラスターは、候補ヒト癌遺伝子である二つの他のマイクロRNAクラスター、miR−17−92クラスター及びmiR−106a−363クラスターと広範囲な相同体を有している(15;59;60)。E2F1は、miR−17−92クラスター中のmiR−17−5p及びmiR−20aの標的でもあり(32)、癌遺伝子及び腫瘍抑制因子機能の両方を有している(61;62)。Bim同様、翻訳されたE2F1はアポトーシス促進性であり、腫瘍抑制因子p53と協同してアポトーシスを仲介する(63)。その過剰発現は、LNCaP細胞においてアポトーシスを誘発し(64)、miR−106bによるE2F1翻訳の阻害は、腫瘍環境においてアポトーシスから前立腺癌細胞を保護し得ることを示す。
25クラスターは、候補ヒト癌遺伝子である二つの他のマイクロRNAクラスター、miR−17−92クラスター及びmiR−106a−363クラスターと広範囲な相同体を有している(15;59;60)。E2F1は、miR−17−92クラスター中のmiR−17−5p及びmiR−20aの標的でもあり(32)、癌遺伝子及び腫瘍抑制因子機能の両方を有している(61;62)。Bim同様、翻訳されたE2F1はアポトーシス促進性であり、腫瘍抑制因子p53と協同してアポトーシスを仲介する(63)。その過剰発現は、LNCaP細胞においてアポトーシスを誘発し(64)、miR−106bによるE2F1翻訳の阻害は、腫瘍環境においてアポトーシスから前立腺癌細胞を保護し得ることを示す。
[000245]p21/WAF1は、p53腫瘍抑制のメディエーターである(65)。前立腺癌におけるp21/WAF1の増殖阻害効果が示されており(66)、それは、抗癌剤に応答して前立腺癌細胞の細胞周期停止を仲介する(67;68)。我々はmiR−106b−25クラスターが抗アポトーシス活性を有しているかどうか試験し、それが22Rv1細胞において、ドキソルビシン及びエトポシドによるカスパーゼ活性化を阻害することを見出した。
[000246]これらのデータは、E2F1及びp21/WAF1タンパク質発現を抑制するその能力のため、一部、前立腺癌におけるmiR−106bの発癌機能と一致している。
[000247]miR−1、miR−32又はmiR−106b−25クラスターのいずれも、LNCaP細胞のアンドロゲン刺激により調節されなかった。しかしながら、我々はアンドロゲン処理により上方又は下方調節されたいくつかの他のマイクロRNAを同定した。これらには中でも、miR−338及びmiR−126、及びmiR−181b−l、miR−181c、miR−221クラスターが含まれていた。モチーフ検索は、これらのマイクロRNAが、それらの隣接領域に推定アンドロゲンレセプター結合部位を有していることを示した。
[000247]miR−1、miR−32又はmiR−106b−25クラスターのいずれも、LNCaP細胞のアンドロゲン刺激により調節されなかった。しかしながら、我々はアンドロゲン処理により上方又は下方調節されたいくつかの他のマイクロRNAを同定した。これらには中でも、miR−338及びmiR−126、及びmiR−181b−l、miR−181c、miR−221クラスターが含まれていた。モチーフ検索は、これらのマイクロRNAが、それらの隣接領域に推定アンドロゲンレセプター結合部位を有していることを示した。
[000248]miR−338は、唯一の有意に上方調節されたマイクロRNAであった。このマイクロRNAの機能についての報告はないが、それは3つの上皮癌で頻繁にコピー数増加を伴う領域に位置している。
[000249]miR−181ファミリーメンバーは造血系分化に影響し(69)、それらの発現は、白血病及びいくつかの固形腫瘍で変化している(10;31)。miR−221クラスターは、p27Kipl腫瘍抑制因子を調節することが見出されており、前立腺癌において発癌性を有することができる(70;71)。しかしながら、本クラスターは、癌遺伝子c−Kit及び血管形成も阻害する(72)。
[000250]特異的マイクロRNAにより調節されているタンパク質コード遺伝子の同定は、マイクロRNA標的を予測するためのコンピューターアプローチの開発にもかかわらず、困難であることが証明されている(73;74)。標的mRNAを発見する能力は、マイクロRNAの標的選択性が細胞内微小環境に依存してもよいという事実によりさらに複雑化される。
[000251]我々は、探索型アプローチを使用し、前立腺組織におけるマイクロRNA発現とmRNA発現間の相関分析を行った。理論に縛られるわけではないが、本発明者は、このアプローチは、もし問題とするマイクロRNAが標的mRNAの転写体存在量に影響するならば成功するであろうが、もし標的遺伝子が翻訳抑制によってのみ調節されているならば、それは失敗するであろうと考えている。
[000252]miR−1の発現が、前立腺腫瘍において、いくつかのコンピューターにより
予測された標的遺伝子、例えば、XPO6と逆相関していることが見出された。しかしながら、腫瘍miR−1発現が予測標的、例えば、PTK9の転写体レベルと正に相関していたことも見出した。細胞培養におけるこれらの観察の続いての検証は、前立腺癌細胞において、XP06及びPTK9は両方ともmiR−1により調節されていることを確証した。
予測された標的遺伝子、例えば、XPO6と逆相関していることが見出された。しかしながら、腫瘍miR−1発現が予測標的、例えば、PTK9の転写体レベルと正に相関していたことも見出した。細胞培養におけるこれらの観察の続いての検証は、前立腺癌細胞において、XP06及びPTK9は両方ともmiR−1により調節されていることを確証した。
[000253]データは、3’UTR配列へのマイクロRNAの結合が哺乳類細胞における標的化されたmRNAの分解及び蓄積両方を導くことができ、そしてヒト組織におけるマイクロRNAとmRNA間の逆及び正の相関の両方がマイクロRNA標的遺伝子を示し得る、新しい証拠を提供する。よって、ヒト組織におけるマイクロRNA及びmRNA発現の相関分析は、マイクロRNAによって調節されるmRNAの同定において有用であると証明するだろう。
[000254]ヒト前立腺腫瘍で生じ、及びこれらの組織におけるタンパク質コード遺伝子の発現変動と相関するマイクロRNA発現の変化がここに同定された。細胞培養における実験は、腫瘍マイクロRNAがヒト前立腺癌細胞における癌関連遺伝子の発現を調節し得ることを示した。これらの結果は、前立腺癌生物学におけるマイクロRNAの病因的役割を示している。
[000255]実施例II
[000256]序
[000257]前立腺癌は、米国人男性において最も頻繁に悪性腫瘍と診断され、2番目に高頻度の癌死亡率の原因である[1]。死亡率は、前立腺を越えた癌細胞の拡散が寄与しているのであろう。神経周囲浸潤(PNI)は、前立腺癌における局所浸潤の主要経路であり、疾患の前立腺外拡散の機構でもある[2]。さらに、PNIの予後重要性は議論の余地が残されている[3〜5]。いくつかの研究が、PNIと転帰不良のマーカーの関連性を観察しているが[2,6〜8]、他者は、それが前立腺癌の予後因子であることを見出していない[9〜12]。
[000256]序
[000257]前立腺癌は、米国人男性において最も頻繁に悪性腫瘍と診断され、2番目に高頻度の癌死亡率の原因である[1]。死亡率は、前立腺を越えた癌細胞の拡散が寄与しているのであろう。神経周囲浸潤(PNI)は、前立腺癌における局所浸潤の主要経路であり、疾患の前立腺外拡散の機構でもある[2]。さらに、PNIの予後重要性は議論の余地が残されている[3〜5]。いくつかの研究が、PNIと転帰不良のマーカーの関連性を観察しているが[2,6〜8]、他者は、それが前立腺癌の予後因子であることを見出していない[9〜12]。
[000258]PNIの発生は、臨床疾患の発生の相対的に初期のイベントであり、根治的前立腺切除術からのほとんどの腫瘍試料はPNI陽性である[2]。臨床サンプルにおけるこのPNIの高出現率(85%〜100%)及びその生物学の不適切な知識が、前立腺癌進行及び該疾患の転帰におけるPNIの役割についての我々の理解を制限している。
[000259]PNIは、癌細胞が神経に接着しそして周りを包むプロセスである[13,14]。それは、膵臓、頭部及び頸部癌を含む、多くの他のタイプの癌において発生する[15,16]。神経周囲位置を有する前立腺癌細胞は、生存及び増殖優位性を獲得し、神経から離れて位置する細胞と比較した場合、減少したアポトーシス及び増加した増殖を示す[17,18]。前立腺癌細胞及び隣接した神経の両方で、接着分子の変化した発現がPNIで観察されており、これらの分子の変化した発現が、神経の近くで癌細胞がよく成長することを可能にする[14,19]。
[000260]それにもかかわらず、PNIを導く分子機構は、依然として不明なところが多いままである。
[000261]実施例IIにおいて、発明者は、ヒト前立腺癌におけるPNIに関連する遺伝子発現変化を同定するため、マイクロRNA及びタンパク質コード遺伝子両方の遺伝子発現プロファイルを適用した。発明者は、非PNI腫瘍からPNIを識別する遺伝子発現シグネチャーが、非侵襲性腫瘍からPNIを有する腫瘍への移行時に起こる分子変化を明らかにするであろうかを調べた。癌におけるマイクロRNAの重要な役割が示されてきているので[20,21]、マイクロRNAをアッセイした。それらの発現プロファイルは、
発生系列及び分化状態で腫瘍を分類した[22,23]。
[000261]実施例IIにおいて、発明者は、ヒト前立腺癌におけるPNIに関連する遺伝子発現変化を同定するため、マイクロRNA及びタンパク質コード遺伝子両方の遺伝子発現プロファイルを適用した。発明者は、非PNI腫瘍からPNIを識別する遺伝子発現シグネチャーが、非侵襲性腫瘍からPNIを有する腫瘍への移行時に起こる分子変化を明らかにするであろうかを調べた。癌におけるマイクロRNAの重要な役割が示されてきているので[20,21]、マイクロRNAをアッセイした。それらの発現プロファイルは、
発生系列及び分化状態で腫瘍を分類した[22,23]。
[000262]実施例IIの材料及び方法
[000263]組織サンプル
[000264]凍結腫瘍試料は、NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource(CP
CTR)から得られた。腫瘍は、前立腺切除術に先だっては何の治療も受けていない腺癌を切除した。マクロ解剖腫瘍試料は病理学者により再検討され、凍結標本中の腫瘍の存在が確認された。全ての組織は、2002年から2004年の間に採取された。組織採取は、関与施設の治験審査委員会により認可された。
[000263]組織サンプル
[000264]凍結腫瘍試料は、NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource(CP
CTR)から得られた。腫瘍は、前立腺切除術に先だっては何の治療も受けていない腺癌を切除した。マクロ解剖腫瘍試料は病理学者により再検討され、凍結標本中の腫瘍の存在が確認された。全ての組織は、2002年から2004年の間に採取された。組織採取は、関与施設の治験審査委員会により認可された。
[000265]RNA抽出
[000266]全RNAは、製造者の取扱説明書に従い、TRIZOL試薬を使用して分離した(Invitrogen, Carlsbad, CA)。各サンプルについてのRNAの完全性は、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)で確認した。各RNAサンプ
ルは次ぎに、2分割量に分け、マイクロRNAマイクロアレイ又はmRNAマイクロアレイのために処理した。
[000266]全RNAは、製造者の取扱説明書に従い、TRIZOL試薬を使用して分離した(Invitrogen, Carlsbad, CA)。各サンプルについてのRNAの完全性は、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)で確認した。各RNAサンプ
ルは次ぎに、2分割量に分け、マイクロRNAマイクロアレイ又はmRNAマイクロアレイのために処理した。
[000267]遺伝子マイクロアレイ
[000268]マイクロRNA標識及びハイブリダイゼーションは、以前に記載した如く実施した[24]。マイクロRNAマイクロアレイ(Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Version 3.0)は、235のヒト及び222のマウスマイクロRNAについて四通りにスポットされたプローブを含む[24]。mRNAの標識及びハイブリダイゼーションは、Affymetrix標準プロトコルに従って実施した(Santa Clara,CA)。簡単には、全RNAの5μgを、5’末端にT7RNAポリメラーゼプロモーターを有するオリゴ(dT)プライマーで逆転写した。第二鎖合成にcRNA生成が続き、Enzo Life Sciences(Farmingdale,NY)からのBioArray High Yield RNA Transcript Labeking Kit T3を使用してビオチン化リボヌクレオチドを取り込ませた。標識化cRNAは断片化し、Affymetrix GeneChip HG-U133A 2.0アレイにハイブリダイズさせた。このアレイは、およそ13,000のヒトタンパク質コード遺伝子を提示する22,283のプローブセットを含む。ハイブリダイゼーションシグナルは、フィコエリトリン−コンジュゲートストレプトアビジン(Invitrogen)で可視化し、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix)を使用してスキャンした。Minimum Information About a Microarray Experiment(MIAME)ガ
イドラインに従って我々は、マイクロアレイデータ及び追加の患者情報のCELファイルをGEOリポジトリー(ncbi.nlm.nih.zov/aeo/)に寄託した。マイクロRNA及びmR
NAプロファイリングデータ両方のGEO提出受入番号は、GSE7055である。特別注文のマイクロRNAマイクロアレイ、バージョン2.0についての追加の情報は、ArrayExpress受入番号:A−MEXP−258に見ることができる。
[000268]マイクロRNA標識及びハイブリダイゼーションは、以前に記載した如く実施した[24]。マイクロRNAマイクロアレイ(Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Version 3.0)は、235のヒト及び222のマウスマイクロRNAについて四通りにスポットされたプローブを含む[24]。mRNAの標識及びハイブリダイゼーションは、Affymetrix標準プロトコルに従って実施した(Santa Clara,CA)。簡単には、全RNAの5μgを、5’末端にT7RNAポリメラーゼプロモーターを有するオリゴ(dT)プライマーで逆転写した。第二鎖合成にcRNA生成が続き、Enzo Life Sciences(Farmingdale,NY)からのBioArray High Yield RNA Transcript Labeking Kit T3を使用してビオチン化リボヌクレオチドを取り込ませた。標識化cRNAは断片化し、Affymetrix GeneChip HG-U133A 2.0アレイにハイブリダイズさせた。このアレイは、およそ13,000のヒトタンパク質コード遺伝子を提示する22,283のプローブセットを含む。ハイブリダイゼーションシグナルは、フィコエリトリン−コンジュゲートストレプトアビジン(Invitrogen)で可視化し、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix)を使用してスキャンした。Minimum Information About a Microarray Experiment(MIAME)ガ
イドラインに従って我々は、マイクロアレイデータ及び追加の患者情報のCELファイルをGEOリポジトリー(ncbi.nlm.nih.zov/aeo/)に寄託した。マイクロRNA及びmR
NAプロファイリングデータ両方のGEO提出受入番号は、GSE7055である。特別注文のマイクロRNAマイクロアレイ、バージョン2.0についての追加の情報は、ArrayExpress受入番号:A−MEXP−258に見ることができる。
[000269]データ正規化及び統計分析
[000270]中央値−中心(Median-centric)正規化を、特別注文のマイクロRNAオリゴヌクレオチドチップに対して使用した。Affymetrixチップは、ロバストマルチチップ分析(robust multichip analysis)(RMA)法[25]を使用して正規化した。有意に差
次的に発現された遺伝子のリストを生成するため、生じたデータセットをマイクロアレイの有意性分析(SAM)法[26]にかけた。両側t検定及び意図された誤検出率(false discovery rates(FDR))からの両方のP値に基づいて遺伝子リストを生成した。
FDR計算は、Storey and Tibshirani[27]により記載されている方法に従った。教
師なし(Unsupervised)階層的クラスター分析は、Eisen et al.[28]により記載さ
れている原理に従って実行した。
[000270]中央値−中心(Median-centric)正規化を、特別注文のマイクロRNAオリゴヌクレオチドチップに対して使用した。Affymetrixチップは、ロバストマルチチップ分析(robust multichip analysis)(RMA)法[25]を使用して正規化した。有意に差
次的に発現された遺伝子のリストを生成するため、生じたデータセットをマイクロアレイの有意性分析(SAM)法[26]にかけた。両側t検定及び意図された誤検出率(false discovery rates(FDR))からの両方のP値に基づいて遺伝子リストを生成した。
FDR計算は、Storey and Tibshirani[27]により記載されている方法に従った。教
師なし(Unsupervised)階層的クラスター分析は、Eisen et al.[28]により記載さ
れている原理に従って実行した。
[000271]マイクロRNA及びmRNAの定量的リアルタイムPCR分析
[000272] 成熟マイクロRNAの存在量は、公開されたプロトコル[29]に従って、
ステムループTaqMan(商標)マイクロRNAアッセイキット(Applied Biosystems, Foster City, CA)を使用して測定した。製造元の取扱説明書に従って、10ngの全RNA
を使用し、TaqMan(商標)マイクロRNAアッセイキットからの成熟マイクロRNA特異的ループ化プライマー及びTaqMan(商標)マイクロRNA逆転写キット(Applied Biosystems)からの試薬を使用し、成熟RNAを5’−伸長cDNAに逆転写した。Applied Biosystems Taqman 2X Universal PCR マスター混合物及び問題とする各マイクロRNAに
ついて適切な5X TaqMan(商標)マイクロRNAアッセイ混合物で、cDNAに対するリ
アルタイムPCRを実行した。3重の反応物をApplied Biosystems 7500リアルタイムP
CRシステム内の96ウェルプレート中、95℃で10分、続いて95℃で15秒及び60℃で1分を40サイクル、インキュベートした。各サンプルについて、閾値サイクル(Ct)をABI 7500配列検出システムソフトウェアにより算出した。検量線をサンプル中のマイクロRNA濃度を決定するために使用し、それは次ぎにU6 RNAで正規化した。mRNAの存在量は、以前に記述した定量的リアルタイム(qRT)PCR法[30]に従って決定した。従って、全RNAの100ngを、High-Capacity cDNA Archiveキット(Applied Biosystems, Foster City, CA)を使用し、逆転写した。続いて、検証されて
いる遺伝子に特異的な、前もって最適化されたプローブ及びプライマーセットを含む、TaqMan遺伝子発現アッセイ(Applied Biosystems)を使用してqRT−PCRを3重に実施した。検証された遺伝子のアッセイID番号は、以下の通りである:メタロチオネイン1FについてHs00744661_sH及びメタロチオネイン1MについてHs00828387_gl。データは、ABI PRISM(商標)7500配列検出システムを使用して集めた。18RNAは、内部基準として用いた。正規化発現は、記述されているように比較CT法を使用して計算し、倍率変化は、各遺伝子の2−ΔΔCt値から導いた[30]。
[000272] 成熟マイクロRNAの存在量は、公開されたプロトコル[29]に従って、
ステムループTaqMan(商標)マイクロRNAアッセイキット(Applied Biosystems, Foster City, CA)を使用して測定した。製造元の取扱説明書に従って、10ngの全RNA
を使用し、TaqMan(商標)マイクロRNAアッセイキットからの成熟マイクロRNA特異的ループ化プライマー及びTaqMan(商標)マイクロRNA逆転写キット(Applied Biosystems)からの試薬を使用し、成熟RNAを5’−伸長cDNAに逆転写した。Applied Biosystems Taqman 2X Universal PCR マスター混合物及び問題とする各マイクロRNAに
ついて適切な5X TaqMan(商標)マイクロRNAアッセイ混合物で、cDNAに対するリ
アルタイムPCRを実行した。3重の反応物をApplied Biosystems 7500リアルタイムP
CRシステム内の96ウェルプレート中、95℃で10分、続いて95℃で15秒及び60℃で1分を40サイクル、インキュベートした。各サンプルについて、閾値サイクル(Ct)をABI 7500配列検出システムソフトウェアにより算出した。検量線をサンプル中のマイクロRNA濃度を決定するために使用し、それは次ぎにU6 RNAで正規化した。mRNAの存在量は、以前に記述した定量的リアルタイム(qRT)PCR法[30]に従って決定した。従って、全RNAの100ngを、High-Capacity cDNA Archiveキット(Applied Biosystems, Foster City, CA)を使用し、逆転写した。続いて、検証されて
いる遺伝子に特異的な、前もって最適化されたプローブ及びプライマーセットを含む、TaqMan遺伝子発現アッセイ(Applied Biosystems)を使用してqRT−PCRを3重に実施した。検証された遺伝子のアッセイID番号は、以下の通りである:メタロチオネイン1FについてHs00744661_sH及びメタロチオネイン1MについてHs00828387_gl。データは、ABI PRISM(商標)7500配列検出システムを使用して集めた。18RNAは、内部基準として用いた。正規化発現は、記述されているように比較CT法を使用して計算し、倍率変化は、各遺伝子の2−ΔΔCt値から導いた[30]。
[000273]免疫組織化学
[000274]神経周囲及び非神経周囲癌細胞におけるタンパク質発現は、ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍切片上で、免疫組織化学的に評価した。腫瘍(n=30)は、Baltimore VA Hospital 及びメリーランド大学医療センターで根治的前立腺切除術によって治療された前立腺患者からのものである。5ミクロン切片を免疫組織化学的に、神経幹のためのマーカー、S100について染色し、PNIの領域を視覚化した。14の腫瘍からの切片が神経周囲及び非神経周囲癌細胞を有する代表的領域を含有することが見出された。抗原回復のため、脱パラフィン切片を1x Citra緩衝液(Biogenex, San Ramon, CA)中で
マイクロ波処理した。免疫組織化学的染色は、Dako Envision システム(DakoCytomation, Carpinteria, CA)で実行した。以下の一次抗体を使用した:S100のための1:5
00希釈ウサギポリクロナール抗体(Ventana, Tucson, AR);コクサッキーアデノウイ
ルスレセプター(CXADR)のための1:1000希釈マウスモノクロナール抗体(Atlas Antibodies, Stockholm, Sweden);及びメタロチオネインのための1:500希釈
マウスモノクロナール抗体(DakoCytomation)。この抗体(E9)はメタロチオネイン−1及び−2ファミリーメンバーを認識する(#M0639)。陽性対照:腸(CXADR)及び肝臓(メタロチオネイン)。一次抗体を除いたものが陰性対照であった。マイクロアレイ結果を知らされていない病理学者が神経周囲及び非神経周囲癌細胞の免疫染色の強度を評価し、非神経周囲癌細胞と比較した場合、神経周囲癌細胞中でより弱い、同じ、より強いと分類した。代表的領域のイメージをとり、発現差異を記録した。
[000274]神経周囲及び非神経周囲癌細胞におけるタンパク質発現は、ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍切片上で、免疫組織化学的に評価した。腫瘍(n=30)は、Baltimore VA Hospital 及びメリーランド大学医療センターで根治的前立腺切除術によって治療された前立腺患者からのものである。5ミクロン切片を免疫組織化学的に、神経幹のためのマーカー、S100について染色し、PNIの領域を視覚化した。14の腫瘍からの切片が神経周囲及び非神経周囲癌細胞を有する代表的領域を含有することが見出された。抗原回復のため、脱パラフィン切片を1x Citra緩衝液(Biogenex, San Ramon, CA)中で
マイクロ波処理した。免疫組織化学的染色は、Dako Envision システム(DakoCytomation, Carpinteria, CA)で実行した。以下の一次抗体を使用した:S100のための1:5
00希釈ウサギポリクロナール抗体(Ventana, Tucson, AR);コクサッキーアデノウイ
ルスレセプター(CXADR)のための1:1000希釈マウスモノクロナール抗体(Atlas Antibodies, Stockholm, Sweden);及びメタロチオネインのための1:500希釈
マウスモノクロナール抗体(DakoCytomation)。この抗体(E9)はメタロチオネイン−1及び−2ファミリーメンバーを認識する(#M0639)。陽性対照:腸(CXADR)及び肝臓(メタロチオネイン)。一次抗体を除いたものが陰性対照であった。マイクロアレイ結果を知らされていない病理学者が神経周囲及び非神経周囲癌細胞の免疫染色の強度を評価し、非神経周囲癌細胞と比較した場合、神経周囲癌細胞中でより弱い、同じ、より強いと分類した。代表的領域のイメージをとり、発現差異を記録した。
[000275]インサイツハイブリダイゼーション
[000276]インサイツハイブリダイゼーション(ISH)を、GenPoint(商標) 触媒シグ
ナル増幅システム (DakoCytomation)を使用して、製造業者プロトコルに従って実行した
。簡単には、スライドを60℃で30分インキュベートし、記述されているように脱パラフィンした。切片を、プロテイナーゼK(DakoCytomation)で、室温で30分処理し、d
H2Oで数回濯ぎ、風乾前に95%エタノールに10秒浸漬した。スライドを、インサイツハイブリダイゼーション緩衝液(Enzo Life Sciences, Inc. Farmingdale, NY)で1時間、54℃にてプリハイブリダイズした後、50nMの最終濃度の5’ビオチン標識miR−224 miRCURY(商標)LNA検出プローブ(Exiqon, Woburn, MA)又はスクラン
ブル陰性対照プローブ(Exiqon)のいずれかを含有する緩衝液中、54℃で一晩インキュベーションした。スライドは、TBST及びGenPoint(商標)ストリンジェント洗浄溶液(54℃で30分)の両方で洗浄した。スライドは次ぎにH2O2ブロッキング溶液(DakoCytomation)に20分暴露し、そしてさらにブロッキング緩衝液(DakoCytomation, X0909)中で30分ブロックした後、製造業者プロトコルに従って一次ストレプトアビジン
−HRP抗体、ビオチニル−チラミド、二次ストレプトアビジン−HRP抗体及びDAB色素原溶液に暴露した。スライドは次ぎに短時間ヘマトキシリン中で対比染色し、マウント前にTBST及び水の両方ですすいだ。病理学者は、免疫組織化学で使用されたものと同一の基準を用いて神経周囲及び非神経周囲癌細胞中のmiR−224のISH強度を評価した。
[000276]インサイツハイブリダイゼーション(ISH)を、GenPoint(商標) 触媒シグ
ナル増幅システム (DakoCytomation)を使用して、製造業者プロトコルに従って実行した
。簡単には、スライドを60℃で30分インキュベートし、記述されているように脱パラフィンした。切片を、プロテイナーゼK(DakoCytomation)で、室温で30分処理し、d
H2Oで数回濯ぎ、風乾前に95%エタノールに10秒浸漬した。スライドを、インサイツハイブリダイゼーション緩衝液(Enzo Life Sciences, Inc. Farmingdale, NY)で1時間、54℃にてプリハイブリダイズした後、50nMの最終濃度の5’ビオチン標識miR−224 miRCURY(商標)LNA検出プローブ(Exiqon, Woburn, MA)又はスクラン
ブル陰性対照プローブ(Exiqon)のいずれかを含有する緩衝液中、54℃で一晩インキュベーションした。スライドは、TBST及びGenPoint(商標)ストリンジェント洗浄溶液(54℃で30分)の両方で洗浄した。スライドは次ぎにH2O2ブロッキング溶液(DakoCytomation)に20分暴露し、そしてさらにブロッキング緩衝液(DakoCytomation, X0909)中で30分ブロックした後、製造業者プロトコルに従って一次ストレプトアビジン
−HRP抗体、ビオチニル−チラミド、二次ストレプトアビジン−HRP抗体及びDAB色素原溶液に暴露した。スライドは次ぎに短時間ヘマトキシリン中で対比染色し、マウント前にTBST及び水の両方ですすいだ。病理学者は、免疫組織化学で使用されたものと同一の基準を用いて神経周囲及び非神経周囲癌細胞中のmiR−224のISH強度を評価した。
[000277]パスウェイ解析
[000278]この解析は、自家製WPSソフトウェア[31]で実行した。パスウェイは、ジーンオントロジーバイオロジカルプロセス(GOBP)(Gene Ontology Consortium:geneontology.org)に従ってアノテートした。我々のデータベースは、GOBPについて
アノテートされた16,762ヒト遺伝子を有していた。遺伝子は、マイクロアレイ上のそれらの対応するプローブセットのFDR(<30%)に基づいてパスウェイ解析内に含ませた。もしいくつかのプローブセットが同一の遺伝子をコードしていたならば、ソフトウェアはこれを認識し、該遺伝子はパスウェイレベルでの有意性試験について一度のみ計数されることを保証された。どの生物学的プロセスが差次的に発現された遺伝子の統計的に有意な富化を有していたかを決定するため、片側フィッシャーの直接確率検定を使用した(P<0.05)。クラスター解析のためにフィッシャーの直接確率検定結果をコンパイルし、結果をカラーコード化ヒートマップに示し、有意に変化した生物学的プロセスのパターンを明らかにした。ヒートマップのカラーコーディングは、生物学的プロセスにおける遺伝子の富化に関係し(−Log(P値)−基づいて)、赤い色はより高い富化を示している。
[000278]この解析は、自家製WPSソフトウェア[31]で実行した。パスウェイは、ジーンオントロジーバイオロジカルプロセス(GOBP)(Gene Ontology Consortium:geneontology.org)に従ってアノテートした。我々のデータベースは、GOBPについて
アノテートされた16,762ヒト遺伝子を有していた。遺伝子は、マイクロアレイ上のそれらの対応するプローブセットのFDR(<30%)に基づいてパスウェイ解析内に含ませた。もしいくつかのプローブセットが同一の遺伝子をコードしていたならば、ソフトウェアはこれを認識し、該遺伝子はパスウェイレベルでの有意性試験について一度のみ計数されることを保証された。どの生物学的プロセスが差次的に発現された遺伝子の統計的に有意な富化を有していたかを決定するため、片側フィッシャーの直接確率検定を使用した(P<0.05)。クラスター解析のためにフィッシャーの直接確率検定結果をコンパイルし、結果をカラーコード化ヒートマップに示し、有意に変化した生物学的プロセスのパターンを明らかにした。ヒートマップのカラーコーディングは、生物学的プロセスにおける遺伝子の富化に関係し(−Log(P値)−基づいて)、赤い色はより高い富化を示している。
[000279]実施例IIの結果
[000280]臨床サンプル及び遺伝子発現分析
[000281]我々は57前立腺癌患者の根治的前立腺摘除術からのマクロ解剖腫瘍試料を集めた(図22−表8)。腫瘍の7つ(12%)は、PNIについて陰性であった。文献と一致して、これらの腫瘍は、PNI陽性腫瘍よりもより小さなサイズ及びより低いグリーソンスコアを有していた。加えて、すべてのPNI陰性腫瘍は前立腺に限定されていた。我々は、PNIを有する腫瘍及びPNIについて陰性であった腫瘍間の遺伝子発現差異を調べた。これらの腫瘍からの遺伝子発現プロファイルは、235のヒトマイクロRNAを示す特別注文のマイクロRNAマイクロアレイ及びおよそ13,000ヒトタンパク質コード遺伝子を示すAffymetrix GeneChip HG-U133A 2.0アレイの両方を使用して生成された。
[000280]臨床サンプル及び遺伝子発現分析
[000281]我々は57前立腺癌患者の根治的前立腺摘除術からのマクロ解剖腫瘍試料を集めた(図22−表8)。腫瘍の7つ(12%)は、PNIについて陰性であった。文献と一致して、これらの腫瘍は、PNI陽性腫瘍よりもより小さなサイズ及びより低いグリーソンスコアを有していた。加えて、すべてのPNI陰性腫瘍は前立腺に限定されていた。我々は、PNIを有する腫瘍及びPNIについて陰性であった腫瘍間の遺伝子発現差異を調べた。これらの腫瘍からの遺伝子発現プロファイルは、235のヒトマイクロRNAを示す特別注文のマイクロRNAマイクロアレイ及びおよそ13,000ヒトタンパク質コード遺伝子を示すAffymetrix GeneChip HG-U133A 2.0アレイの両方を使用して生成された。
[000282]我々のデータセットの初期解析において、マイクロRNA及びmRNAの発現がPNIを有する腫瘍及びPNIのない腫瘍間を識別し得るかどうかを試験するため、教師なし階層的クラスター分析を応用した。mRNAの広範囲の発現に基づいた階層的クラスター分析は、非PNI症例からPNI症例を分離できなかった(データは示していない)。しかしながら、これらのサンプルのマイクロRNAの発現パターンは、特有のマイクロRNAプロファイルを有する二つの卓越したクラスターを与えた(図17A−17B)。クラスター#1は全ての非PNI腫瘍及びPNIを有する腫瘍のサブグループを含有し
ていた。クラスター#2は、有意にクラスター#1中の腫瘍よりも高いグリーソンスコア(≧7)及び前立腺外疾患進展を有するようである(P<0.05,それぞれ;両側フィッシャーの直接確率検定)。
ていた。クラスター#2は、有意にクラスター#1中の腫瘍よりも高いグリーソンスコア(≧7)及び前立腺外疾患進展を有するようである(P<0.05,それぞれ;両側フィッシャーの直接確率検定)。
[000283]マイクロアレイの有意性分析データは、19マイクロRNA及び34タンパク質コード遺伝子がPNIと非PNI腫瘍間で有意に差次的に発現された(FDR<10%で)ことを明らかにした。この閾値では全てのマイクロRNAはPNIを有する腫瘍において上方調節されており(図23−表9)、一方、全てのmRNAは、非PNI腫瘍よりPNI腫瘍においてより低い発現を有していた(図24−表10)。
[000284]差次的に発現されたマイクロRNAのこのリストは、我々のデータセットのPNIと非PNI腫瘍間の比較で独特であった。これらのマイクロRNAのいずれも、腫瘍グレード又はステージによっては、有意に差次的に発現されなかった(FDR<30%)。PNIと非PNIとの比較とは対照的に、非常に少数のマイクロRNAのみが、高(合計スコア7〜9)及び低(合計スコア5〜6)グリーソンスコア間(例えば、miR−1は、高グリーソンスコアを有する腫瘍中において下方調節されていた)及び器官限局性腫瘍及び前立腺外進展を有する腫瘍間で有意に差次的に発現された。PNI及び非PNI腫瘍間で差次的に発現されたタンパク質コード遺伝子の中で、多くはメタロチオネイン(メタロチオネインIF、IG、IH、IM、IX、2A)あるいはミトコンドリア局在性のタンパク質(4−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、フェロケラターゼ、長鎖アシル補酵素Aデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリアリボソームタンパク質L39/S1)をコードする。これらの遺伝子の下位集団も、低グリーソンスコア腫瘍と比較した場合、高グリーソンスコアを有する腫瘍において下方調節されていた(図19A−19D)。腫瘍ステージにより差次的に発現された遺伝子との重複はない。
[000285]qRT−PCRによるマイクロアレイデータの検証
[000286]五つのマイクロRNA及び二つのmRNAが、qRT−PCRによる検証のために選択された(図25−表11)。マイクロアレイデータと一致して、非PNI腫瘍と比較した場合、PNI腫瘍において成熟miR−224、miR−10、miR−125b、miR−30c及びmiR−100の有意に高い発現が観察された。メタロチオネイン1M及び1Fの転写体レベルは、非PNI腫瘍と比較した場合、PNI腫瘍において有意に低く、それも我々のマイクロアレイデータと一致していた。
[000286]五つのマイクロRNA及び二つのmRNAが、qRT−PCRによる検証のために選択された(図25−表11)。マイクロアレイデータと一致して、非PNI腫瘍と比較した場合、PNI腫瘍において成熟miR−224、miR−10、miR−125b、miR−30c及びmiR−100の有意に高い発現が観察された。メタロチオネイン1M及び1Fの転写体レベルは、非PNI腫瘍と比較した場合、PNI腫瘍において有意に低く、それも我々のマイクロアレイデータと一致していた。
[000287]PNI状態で差次的に発現されたタンパク質コード遺伝子のパスウェイ関連性
[000288]そのmRNAがPNI及び非PNI腫瘍間で差次的に発現された(FDR<30%)GOBPアノテート遺伝子(n=62)に基づいたパスウェイ解析を実行した。本解析は、PNI腫瘍を非PNI腫瘍と比較して差次的に発現された遺伝子について富化されたいくつかの生物学的プロセスを明らかにした。最も多く有意に変化した生物学的プロセスには、有機(カルボン)酸/脂肪酸、アミノ酸及び(ポリ)アミンの輸送及び代謝が含まれる(図26−表12)。これらは「神経発生」の生物学的プロセスも含んでおり、PNIにおける腫瘍細胞と神経間の既知の相互作用と一致する。
[000288]そのmRNAがPNI及び非PNI腫瘍間で差次的に発現された(FDR<30%)GOBPアノテート遺伝子(n=62)に基づいたパスウェイ解析を実行した。本解析は、PNI腫瘍を非PNI腫瘍と比較して差次的に発現された遺伝子について富化されたいくつかの生物学的プロセスを明らかにした。最も多く有意に変化した生物学的プロセスには、有機(カルボン)酸/脂肪酸、アミノ酸及び(ポリ)アミンの輸送及び代謝が含まれる(図26−表12)。これらは「神経発生」の生物学的プロセスも含んでおり、PNIにおける腫瘍細胞と神経間の既知の相互作用と一致する。
[000289]腫瘍PNI状態(PNI陽性対PNI陰性)によるが、グリーソンスコア(高対低グリーソンスコア)、病理学的ステージ(pT3対pT2)又は前立腺外進展の存在(イエス対ノー)にはよらずに差次的に発現された遺伝子について富化された生物学的プロセスを同定するために、クラスター分析を実行した。ヒートマップにより示されるように、本解析はPNI陽性とPNI陰性腫瘍と比較して差次的に発現された遺伝子について富化されたいくつかの生物学的プロセスを同定した(図18)。これらの生物学的プロセスには、前記の有機(カルボキシの)酸/脂肪酸、アミノ酸及び(ポリ)アミンの代謝及び輸送以外に、プログラム化された細胞死の負の調節に関連するプロセスも含まれる。
[000290]神経周囲癌細胞におけるメタロチオネイン、コクサッキーアデノウイルスレセプター及びmiR−224の発現
[000291]マイクロアレイに基づいた分析は、PNI及び非PNI腫瘍はそれらの遺伝子発現パターンが異なっていることを示したが、このアプローチは神経周囲及び非神経周囲癌細胞におけるこれらの遺伝子の発現に関しては有益ではない。神経周囲及び非神経周囲癌細胞における、二つのタンパク質コード遺伝子、メタロチオネイン(メタロチオネイン−1及び−2)及びコクサッキーアデノウイルスレセプター(CXADR)、及びmiR−224の相対的発現を調べるため、免疫組織化学及びインサイツハイブリダイゼーションを使用した。免疫組織化学は神経周囲及び非神経周囲癌細胞の代表的領域を含有する14の腫瘍からの切片に対して実施した。インサイツハイブリダイゼーションは11の腫瘍からの切片に対して実施した。
[000291]マイクロアレイに基づいた分析は、PNI及び非PNI腫瘍はそれらの遺伝子発現パターンが異なっていることを示したが、このアプローチは神経周囲及び非神経周囲癌細胞におけるこれらの遺伝子の発現に関しては有益ではない。神経周囲及び非神経周囲癌細胞における、二つのタンパク質コード遺伝子、メタロチオネイン(メタロチオネイン−1及び−2)及びコクサッキーアデノウイルスレセプター(CXADR)、及びmiR−224の相対的発現を調べるため、免疫組織化学及びインサイツハイブリダイゼーションを使用した。免疫組織化学は神経周囲及び非神経周囲癌細胞の代表的領域を含有する14の腫瘍からの切片に対して実施した。インサイツハイブリダイゼーションは11の腫瘍からの切片に対して実施した。
[000292]メタロチオネイン、CXADR及びmiR−224は、腫瘍上皮に発現されていることが見出された(図19A−19D、図20A−20D及び図21A−21D)。メタロチオネイン(上皮、細胞質、核)及びCXADR(上皮、膜性、細胞質)の標識パターンは、他の研究者により記載されたものと一致した[32,33]。同一の組織の非神経周囲癌細胞と比較した場合、メタロチオネイン及びCXADRのより低い発現が、それぞれ6腫瘍(43%)及び7腫瘍(50%)の神経周囲癌細胞において観察された(図19A−19D、図20A〜20D)。一つ(7%)を除いて他の腫瘍中では相違は観察されず、そこではメタロチオネインの発現が、非神経周囲癌細胞よりも神経周囲癌細胞においてより高くスコア化されていた。神経周囲癌細胞において著しく増加したmiR−224の発現が4腫瘍(36%)で観察された(図21A〜21D)。こうした差異は他の7腫瘍においては観察されず、miR−224発現の大部分は低く、腫瘍上皮では検出されない。
[000293]実施例IIの考察
[000294]PNI及び非PNI腫瘍の遺伝子発現プロファイルを調べ、それらの間のマイクロRNA及びmRNA発現に有意な差異を見出した。最も際だっては、235マイクロRNAの発現に基づいた教師なし階層的クラスター分析から二つの主な腫瘍クラスターが得られ、その一つは全ての非PNI腫瘍を含んでいた。13,000のタンパク質コード転写体の発現に基づいてはこうした分類は達成できず、前立腺癌において局所浸潤に関連するmRNA発現シグネチャーを見出せなかった他の研究に一致する[34]。
[000294]PNI及び非PNI腫瘍の遺伝子発現プロファイルを調べ、それらの間のマイクロRNA及びmRNA発現に有意な差異を見出した。最も際だっては、235マイクロRNAの発現に基づいた教師なし階層的クラスター分析から二つの主な腫瘍クラスターが得られ、その一つは全ての非PNI腫瘍を含んでいた。13,000のタンパク質コード転写体の発現に基づいてはこうした分類は達成できず、前立腺癌において局所浸潤に関連するmRNA発現シグネチャーを見出せなかった他の研究に一致する[34]。
[000295]我々の発見は、非PNI腫瘍と比較した場合、マイクロRNA発現は、mRNA発現よりもPNI腫瘍のより特有な特色である可能性があることを示している。これらの発見は、発生系列及び分化状態により腫瘍を分類することにおいて、マイクロRNA発現プロファイルはmRNA発現プロファイルよりも優れていることが可能であることを示している以前の報告と一致している[22,23]。
[000296]19のマイクロRNAが、非PNI腫瘍よりもPNI腫瘍においてより高い発現であることが見出されている。それらの内、miR−10、miR−21、及びmiR−125bは、候補癌遺伝子である[35−37]。さらに、miR−21及びmiR−224は、ヒト前立腺癌において増加した遺伝子発現を有することが見出されている悪性度関連染色体領域に位置している[38]。前立腺癌を含むいくつかのヒト固形癌に共通なマイクロRNA発現シグネチャーが記載されている[23]。その研究及び我々のPNIシグネチャー間で共有されているマイクロRNAは、miR−21、miR−24、及びmiR−30cである。しかしながら、最も注目すべきは、PNIシグネチャーと、実験条件下で発見された他のマイクロRNAシグネチャーとの重複である。
[000297]低酸素は、miR−24、miR−26、miR−27、及びmiR−181を誘発することが発見されている[39]。これらのマイクロRNAもPNI腫瘍において上方調節されている。さらにより重要なことは、PNIシグネチャーとLPS処理されたマウスの肺の炎症によって誘起されたマイクロRNAシグネチャー間の類似性である。ここで、LPSは、いくつかの他のマイクロRNAの中で、miR−21、miR−27b、miR−100及びmiR−224を誘発する[40]。それ故、観察されたPNIマイクロRNAシグネチャーは、一部、炎症促進性環境及び癌性前立腺における低酸素の結果であり得る。
[000298]PNIシグネチャーにおける腫瘍グレード及びステージによる交絡効果の可能性を評価するため、PNIと非PNI腫瘍間で差次的に発現されたマイクロRNAのリストと、高及び低グリーソンスコア腫瘍及び器官限局性腫瘍と前立腺外進展を示した腫瘍を比較している同じリストを比較した。この追加の分析は、PNIシグネチャーはこれら二つの対比により共有されていないことを明らかにした。その代わり、非常に少数のマイクロRNAのみが、腫瘍グレード及びステージにより有意に差次的に発現されていることが見出された。前立腺腫瘍の不均一性は、これら二つの予後因子に関連するマイクロRNAシグネチャーを発見する我々の能力を制限することができる。もしくは、PNIシグネチャーは、非PNIからPNIの移行に非常に特有及び独特であることができ、神経と癌細胞間の相互作用を特異的に含むことができる。このシグネチャーは、癌細胞の過渡的現象であることもでき、これらの細胞がそれらの神経周囲部位から広まった時には消失する。神経周囲及び非神経周囲癌細胞において、PNI状態により最も差次的に発現されるマイクロRNA、miR−224の発現を分析し、腫瘍の下位集団の神経周囲癌細胞における、その増加した発現を見出した。全ての腫瘍が神経周囲癌細胞においてmiR−224の上方調節を示すわけではないが、本観察は、癌細胞が神経に接着する機構にmiR−224の誘導が関与する可能性があることを示している。
[000299]mRNA発現プロファイルの分析は、PNI腫瘍において下方調節されている34の遺伝子を<10%のFDR閾値で、明らかにした。我々は、非PNI腫瘍よりもPNI腫瘍においてより高く発現される遺伝子、例えば、CRISP3、PSCA、BMP7又はBCL2、を観察したけれども、それらの高いFDRのため、有意に差次的に発現された遺伝子の我々のリストから除外された。DU−145前立腺癌細胞と神経細胞の共培養モデルを使用するただ二つの他の研究は、PNIに関連するmRNAの発現プロファイルを検討した[18,19]。これらの研究は、PNIにおいてビスチン及びPim−2をコードする遺伝子が上方調節されていることを発見した。我々は、PNI腫瘍において対応するmRNAの増加を検出しなかった。異なった方法論は、多様な研究で発生した遺伝子リスト間の相違のいくつかを説明することができる。加えて、我々のチップは、ビスチンをコードする遺伝子のためのプローブセットを含んでいない。
[000300]34の差次的に発現された遺伝子のいくつかは、メタロチオネイン遺伝子ファミリーのメンバーであった。こうした遺伝子は、染色体16ql3上の遺伝子クラスター中に位置しており[41]、プロモーター過剰メチル化及び減少した亜鉛利用可能性により、前立腺癌において下方調節されていることが見出されている[32,42,43]。免疫組織化学により、前立腺腫瘍の下位集団において、メタロチオネイン発現は非神経周囲癌細胞と比較した場合、神経周囲癌細胞においては著しく低いことが確認できた。非PNI腫瘍からPNI腫瘍への移行時の下方調節は、該疾患のこのステージで起こる癌細胞の金属代謝の重要な変化を示しているのかもしれない。我々の差次的に発現された遺伝子リスト中のいくつかの遺伝子は、ミトコンドリア局在化を伴うタンパク質、例えば、中でも4−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、フェロケラターゼ及び長鎖アシル補酵素Aデヒドロゲナーゼをコードする。アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ及び長鎖アシル補酵素Aデヒドロゲナーゼは、細胞の有機(カルボン)酸代謝(例えば、ケトン体、脂肪酸
)において鍵となる遺伝子であり、一方、フェロケラターゼは、ヘムの生合成に関与する[44]。ミトコンドリアにおける代謝及びゲノム中の変化は、前立腺癌発癌においては一般的なイベントである[45−47]。我々のデータは、これらの変化のいくつかが、PNI陽性腫瘍への移行時に起こることができることを示す。
)において鍵となる遺伝子であり、一方、フェロケラターゼは、ヘムの生合成に関与する[44]。ミトコンドリアにおける代謝及びゲノム中の変化は、前立腺癌発癌においては一般的なイベントである[45−47]。我々のデータは、これらの変化のいくつかが、PNI陽性腫瘍への移行時に起こることができることを示す。
[000301]PNI腫瘍で下方調節されることが見出されている他の遺伝子は、スペルミンシンターゼ、v−MAF癌遺伝子相同体(MAF)及びCXADRをコードするものである。スペルミンシンターゼは、スペルミジンからスペルミンへの転換を触媒する、ポリアミン合成経路の鍵となる酵素である。前立腺癌におけるポリアミン合成経路の転写調節不全が観察されている[48]。スペルミンは、前立腺癌細胞増殖の内因性阻害剤である[49]。それ故、スペルミンシンターゼの下方調節は、神経周囲環境において前立腺癌細胞の増加した増殖及び生存を可能にすることができる。MAFは、リンパ腫及び骨髄腫においては癌遺伝子であるが、前立腺癌においては癌抑制遺伝子候補であることが見出されている[50]。CXADRは、ヒト細胞内へのアデノウイルスの取込みにおいて、極めて重要な機能を有する[51]。このレセプターは、正常前立腺と比較した場合、局所的に進行した前立腺癌において下方調節されていることが見出されている[33]。
[000302]単一遺伝子効果はPNIを起こしそうもないので、PNI腫瘍と非PNI腫瘍間で差次的に発現されたタンパク質コード遺伝子についてのパスウェイ解析を実施した。この解析は、非PNI腫瘍と比較した場合、PNI腫瘍において最も有意に変化した生物学的プロセスは細胞及びエネルギー代謝を調節するプロセスであることを明らかにした。他の変化した生物学的プロセスは、神経発生及び神経インパルスの伝達のような神経機能に、及び細胞死の負の調節に関連する。後者は、神経周囲部位の前立腺癌細胞は減少したアポトーシス及び増加した生存を示す以前の発見[17,18]と一致している。
[000303]非PNI腫瘍からPNI腫瘍への移行時にマイクロRNA及びmRNA発現において有意な変化が観察された。教師なし階層的クラスター分析は、非PNI腫瘍がPNI腫瘍より特有であることを、それらのmRNA発現プロファイルよりもそれらのマイクロRNA発現プロファイルにより明らかにした。PNIにおいて機能的に重要であり得るミトコンドリア機能及び細胞代謝に関連する、多様な遺伝子及び生物学的プロセスも同定した。
[000304]それらの使用及び定義の例
[000305]本発明の実施は、特に示されない限り、当業者が習得している薬理学、化学、生化学、組み換えDNA技術及び免疫学の従来の方法を用いるであろう。こうした技術は文献に十分に説明されている。例えば、Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); A.
L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In
Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)を参照されたい。
[000305]本発明の実施は、特に示されない限り、当業者が習得している薬理学、化学、生化学、組み換えDNA技術及び免疫学の従来の方法を用いるであろう。こうした技術は文献に十分に説明されている。例えば、Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); A.
L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In
Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)を参照されたい。
[000306]そのようであるので、本明細書の定義はさらなる説明のために提供されており、限定と解釈してはならない。
[000307]本明細書で使用される冠詞「a」及び「an」は、冠詞の文法的目的語の一つ又は一つより多く(即ち、少なくとも一つ)を指す。例として、「an element」は一つの要素又は一つより多くの要素を意味する。
[000307]本明細書で使用される冠詞「a」及び「an」は、冠詞の文法的目的語の一つ又は一つより多く(即ち、少なくとも一つ)を指す。例として、「an element」は一つの要素又は一つより多くの要素を意味する。
[000308]「マーカー」及び「バイオマーカー」は、遺伝子及び/又はタンパク質又はそれらの機能的変異体であり、正常又は健康な組織又は細胞におけるその発現レベルから、
組織又は細胞において変化した発現のレベルは、障害及び/又は疾患状態に関連する。
組織又は細胞において変化した発現のレベルは、障害及び/又は疾患状態に関連する。
[000309]マーカーの発現の「正常」レベルとは、障害及び/又は疾患状態に罹患していないヒト対象又は患者の細胞におけるマーカーの発現のレベルである。
[000310]マーカーの「過剰発現」又は「有意により高いレベルの発現」とは、発現を評価するために用いられたアッセイの標準誤差よりも大きく、及びある態様では、対照サンプル(例えば、マーカー関連障害及び/又は疾患状態を有していない健康な対象からのサンプル)中のマーカーの発現レベルの少なくとも2倍、他の態様では、3、4、5又は10倍、及びある態様においては、いくつかの対照サンプル中のマーカーの平均発現レベルである、試験サンプル中の発現レベルを指す。
[000310]マーカーの「過剰発現」又は「有意により高いレベルの発現」とは、発現を評価するために用いられたアッセイの標準誤差よりも大きく、及びある態様では、対照サンプル(例えば、マーカー関連障害及び/又は疾患状態を有していない健康な対象からのサンプル)中のマーカーの発現レベルの少なくとも2倍、他の態様では、3、4、5又は10倍、及びある態様においては、いくつかの対照サンプル中のマーカーの平均発現レベルである、試験サンプル中の発現レベルを指す。
[000311]マーカーの「有意により低いレベルの発現」とは、対照サンプル(例えば、マーカー関連障害及び/又は疾患状態を有していない健康な対象からのサンプル)中のマーカーの発現レベルの少なくとも2分の1、及びある態様では、3、4、5又は10分の1、及びある態様においては、いくつかの対照サンプル中のマーカーの平均発現レベルである、試験サンプル中の発現レベルを指す。
[000312]キットは、マーカーの発現を特異的に検出するための少なくとも一つの試薬、例えば、プローブを含むいずれかの製品(例えば、パッケージ又は容器)である。該キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして、宣伝し、流通させ、又は販売することができる。
[000313]「タンパク質」は、マーカータンパク質及びそれらの断片;変異体マーカータンパク質及びそれらの断片;マーカー又は変異体マーカータンパク質の少なくとも15アミノ酸セグメントを含むペプチド及びポリペプチド;マーカー又は変異体マーカータンパク質、又はマーカー又は変異体マーカータンパク質の少なくとも15アミノ酸セグメントを含む融合タンパク質を包含する。
[000314]本明細書に記載された組成物、キット及び方法は中でも以下の非制限的使用を有する:
1)対象が、障害及び/又は疾患状態を患っているかどうかを評価すること;
2)対象の障害及び/又は疾患状態のステージを評価すること;
3)対象の障害及び/又は疾患状態のグレードを評価すること;
4)対象の障害及び/又は疾患状態の性質を評価すること;
5)対象が障害及び/又は疾患状態を発生する可能性を評価すること;
6)対象の障害及び/又は疾患状態に関連する細胞の組織学的タイプを評価すること;
7)対象の障害及び/又は疾患状態を治療するために有用である抗体、抗体断片又は抗体誘導体を作製すること;
8)対象の細胞における障害及び/又は疾患状態の存在を評価すること;
9)対象の障害及び/又は疾患状態を抑制するための一つ以上の試験化合物の有効性を評価すること;
10)対象の障害及び/又は疾患状態を抑制するための療法の有効性を評価すること;
11)対象の障害及び/又は疾患状態の進行をモニターすること;
12)対象の障害及び/又は疾患状態を抑制するための組成物又は療法を選択すること;13)障害及び/又は疾患状態を患った対象を治療すること;
14)対象の障害及び/又は疾患状態を抑制すること;
15)試験化合物が有害である可能性を評価すること;及び
16)障害及び/又は疾患状態の発症のリスクを有する対象においてそれらを予防すること。
1)対象が、障害及び/又は疾患状態を患っているかどうかを評価すること;
2)対象の障害及び/又は疾患状態のステージを評価すること;
3)対象の障害及び/又は疾患状態のグレードを評価すること;
4)対象の障害及び/又は疾患状態の性質を評価すること;
5)対象が障害及び/又は疾患状態を発生する可能性を評価すること;
6)対象の障害及び/又は疾患状態に関連する細胞の組織学的タイプを評価すること;
7)対象の障害及び/又は疾患状態を治療するために有用である抗体、抗体断片又は抗体誘導体を作製すること;
8)対象の細胞における障害及び/又は疾患状態の存在を評価すること;
9)対象の障害及び/又は疾患状態を抑制するための一つ以上の試験化合物の有効性を評価すること;
10)対象の障害及び/又は疾患状態を抑制するための療法の有効性を評価すること;
11)対象の障害及び/又は疾患状態の進行をモニターすること;
12)対象の障害及び/又は疾患状態を抑制するための組成物又は療法を選択すること;13)障害及び/又は疾患状態を患った対象を治療すること;
14)対象の障害及び/又は疾患状態を抑制すること;
15)試験化合物が有害である可能性を評価すること;及び
16)障害及び/又は疾患状態の発症のリスクを有する対象においてそれらを予防すること。
[000315] スクリーニング法
[000316]動物モデルを作り出すことができ、対象の障害及び/又は疾患状態を治療する又は予防するために有用な療法剤のスクリーニングを可能にするであろう。従って、本方法は対象の障害及び/又は疾患状態を治療する又は予防するための療法剤を同定するために有用である。本方法は、本明細書に記載された方法により作製された動物モデルに候補剤を投与し、そして、候補剤が投与されていない対照動物モデルと比較し、該動物モデルにおける少なくとも一つの応答を評価すること含む。もし、少なくとも一つの応答が症状を軽減し又は発症が遅延したならば、該候補剤は該疾患を治療する又は予防する剤である。
[000316]動物モデルを作り出すことができ、対象の障害及び/又は疾患状態を治療する又は予防するために有用な療法剤のスクリーニングを可能にするであろう。従って、本方法は対象の障害及び/又は疾患状態を治療する又は予防するための療法剤を同定するために有用である。本方法は、本明細書に記載された方法により作製された動物モデルに候補剤を投与し、そして、候補剤が投与されていない対照動物モデルと比較し、該動物モデルにおける少なくとも一つの応答を評価すること含む。もし、少なくとも一つの応答が症状を軽減し又は発症が遅延したならば、該候補剤は該疾患を治療する又は予防する剤である。
[000317]該候補剤は、当該技術分野ですでに公知である薬理的剤であってもよく、又は何らかの薬理学的活性を有する以前には知られていなかった剤でもよい。該剤は、天然に生じたものでも又は実験室で設計されたものでもよい。それらは、微生物、動物又は植物から単離されたものでもよく、又は組換え的に産生された、又は適した化学合成法により合成されてもよい。それらは、小分子、核酸、タンパク質、ペプチド又はペプチド模倣物であることができる。ある態様において、候補剤は、50以上及び約2,500ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物である。候補剤は、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基も含む。候補剤は、限定されるわけではないが:ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体又はそれらの組み合わせを含む生体分子の中でも発見されている。
[000318]候補剤は、合成又は天然化合物のライブラリーを含む広範囲の起源から得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、広範囲の有機化合物及び生体分子の無作為及び方向付けられた合成に、多数の手段が利用可能である。もしくは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、又は容易に産生される。加えて、天然に又は合成的に産生されたライブラリー及び化合物群は、慣用的な化学的、物理的及び生化学的手段を介して容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを産生するために使用することができる。ある態様において、該候補剤は、非制限例として:生物学的ライブラリー;空間的にアドレス可能な並行固相又は液相ライブラリー;デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法;「一ビーズ一化合物」ライブラリー法;及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法によるものを含む、コンビナトリアルライブラリー法分野における多数のアプローチのいずれかを使用して得ることが可能である。
[000319]さらなるある態様において、ある種の薬理学的剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような方向付けられた又は無作為の化学修飾にかけることができ、構造類似体が生成される。
[000320]対象の障害及び/又は疾患状態を治療するための療法剤を同定するためと同じ方法を、インビトロ研究から生じたリード化合物/剤を検証するためにも使用し得る。
[000321]該候補剤は、対象の障害及び/又は疾患状態応答経路の一つ以上を上方又は下方調節する剤であることができる。ある態様において、該候補剤は、こうした経路に影響するアンタゴニストであることができる。
[000321]該候補剤は、対象の障害及び/又は疾患状態応答経路の一つ以上を上方又は下方調節する剤であることができる。ある態様において、該候補剤は、こうした経路に影響するアンタゴニストであることができる。
[000322]障害及び/又は疾患状態を治療するための方法
[000323]本明細書において障害及び/又は疾患状態応答を治療する、抑制する、寛解する又は逆行させるための方法が提供される。本明細書に記載された方法において、シグナル伝達カスケードを妨害する剤が、限定されるわけではないが、こうした合併症がまだ明白ではない、及びすでに少なくとも一つのこうした応答を有する対象のような、それを必要とする個体に投与される。
[000323]本明細書において障害及び/又は疾患状態応答を治療する、抑制する、寛解する又は逆行させるための方法が提供される。本明細書に記載された方法において、シグナル伝達カスケードを妨害する剤が、限定されるわけではないが、こうした合併症がまだ明白ではない、及びすでに少なくとも一つのこうした応答を有する対象のような、それを必要とする個体に投与される。
[000324]前の例において、こうした治療は、こうした応答の発生を予防するため及び/又はそれらが生じる程度を軽減するために有用である。後の例において、こうした治療は、こうした応答の発生の程度を軽減する、それらのさらなる発生を予防する、又は該応答を逆行させるために有用である。
[000325]ある態様において、該応答カスケードを妨害する剤は、こうした応答に特異的な抗体であることができる。
[000326] バイオマーカー(単数又は複数)の発現
[000327]マーカーの発現は、多くの方法で抑制することが可能であり、非制限例として、マーカー(単数又は複数)の転写、翻訳又は両方を抑制するため、疾患細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し得ることを含む。もしくは、マーカータンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体又は抗体断片をコードし、適切なプロモーター/調節因子領域と機能可能なように連結されたポリヌクレオチドを、該タンパク質の機能又は活性を抑制するであろう細胞内抗体を発生させるために細胞に提供し得る。マーカーの発現及び/又は機能は、マーカータンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体又は抗体断片で該疾患細胞を治療することによっても抑制することができる。本明細書に記載された方法を使用し、多様な分子(特に、細胞膜を通過可能な十分に小さい分子を含む)を、マーカーの発現を抑制する又はマーカータンパク質の機能を抑制する分子を同定するためにスクリーニングすることが可能である。そうのように同定された化合物を、対象の疾患細胞を抑制するために該対象に提供し得る。
[000326] バイオマーカー(単数又は複数)の発現
[000327]マーカーの発現は、多くの方法で抑制することが可能であり、非制限例として、マーカー(単数又は複数)の転写、翻訳又は両方を抑制するため、疾患細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し得ることを含む。もしくは、マーカータンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体又は抗体断片をコードし、適切なプロモーター/調節因子領域と機能可能なように連結されたポリヌクレオチドを、該タンパク質の機能又は活性を抑制するであろう細胞内抗体を発生させるために細胞に提供し得る。マーカーの発現及び/又は機能は、マーカータンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体又は抗体断片で該疾患細胞を治療することによっても抑制することができる。本明細書に記載された方法を使用し、多様な分子(特に、細胞膜を通過可能な十分に小さい分子を含む)を、マーカーの発現を抑制する又はマーカータンパク質の機能を抑制する分子を同定するためにスクリーニングすることが可能である。そうのように同定された化合物を、対象の疾患細胞を抑制するために該対象に提供し得る。
[000328]いずれのマーカー又はマーカーの組み合わせ、ならびに該マーカーと組み合わされたいずれのマーカーも、本明細書に記載された組成物、キット及び方法で使用することができる。一般に、疾患細胞中のマーカーの発現のレベル及び正常系細胞中の同じマーカーの発現のレベル間の相違が可能な限り大きなマーカーを使用するのが望ましい。この相違はマーカーの発現を評価するための方法の検出限界ほど小さくすることができるけれども、相違は少なくとも評価法の標準誤差よりも大きく、及びある態様において、正常組織中の同一マーカーの発現のレベルよりも少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000倍またはそれ以上の相違が望ましい。
[000329]ある種のマーカータンパク質が細胞を取り巻く細胞外空間に分泌されることが認められている。こうしたマーカータンパク質は、組織バイオプシサンプルよりもヒト対象からより容易に集めることができる体液サンプル中で検出することができるので、これらのマーカーが、組成物、キット及び方法のある態様において使用された。加えて、マーカータンパク質の検出のためのインビボ技術には、該タンパク質に対して方向付けられた標識抗体を対象内へ導入することが含まれる。例えば、該抗体を放射性マーカーで標識することができ、対象中でのその存在及び位置を標準イメージング技術により検出し得る。
[000330]どの特定のタンパク質が分泌されたタンパク質であるかを決定するため、マーカータンパク質が、例えば、ヒト細胞株のような哺乳類細胞中で発現され、細胞外液を集め、細胞外液中のタンパク質の存在又は不存在を評価する(例えば、該タンパク質に特異的に結合する標識抗体を使用する)。
[000331]こうした細胞を含んでいる対象のサンプルを、本明細書に記載された方法において使用できることが理解されるであろう。これらの態様において、該マーカーの発現のレベルは、サンプル中の量(例えば、絶対量又は濃度)を評価することにより評価し得る。該細胞サンプルは、もちろん、サンプル中のマーカー量を評価することに先立って、多様な採取後調製及び保存技術(例えば、核酸及び/又はタンパク質抽出、固定、保存、凍結、限外濾過、濃縮、蒸発、遠心分離など)にかけることができる。
[000332]該マーカーは、細胞から、例えば、呼吸器系、消化器系、血流及び/又は間質腔内へ排出することもできることも理解されるであろう。該排出マーカーは、例えば、痰、BAL、血清、血漿、尿、便などを試験することにより試験し得る。
[000333]本組成物、キット及び方法は、発現する細胞の表面上に提示された少なくとも一つの部分を有する、マーカータンパク質の発現を検出するために使用し得る。例えば、全細胞上のこうしたタンパク質を検出するために免疫学的方法を使用することができ、少なくとも一つの細胞外ドメインの存在を予測するために、コンピューター支援配列分析法を使用することができる(即ち、分泌されたタンパク質及び少なくとも一つの細胞表面ドメインを有するタンパク質の両方を含む)。細胞の表面上に提示されている少なくとも一つのタンパク質を有するマーカータンパク質の発現は、細胞を溶解する必要なく検出することができる(例えば、該タンパク質の細胞表面ドメインに特異的に結合する標識抗体を使用して)。
[000334]マーカーの発現は、転写された核酸又はタンパク質の発現を検出するための多種多様な方法のいずれかにより評価することができる。こうした方法の非制限例には、分泌された、細胞表面、細胞質又は核タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質機能又は活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法及び核酸増幅法が含まれる。
[000335]特定の態様において、マーカーの発現は、その正常翻訳後修飾を全て又は一部を受けたマーカータンパク質を含むマーカータンパク質又はそれらの断片と特異的に結合する、抗体(例えば、放射標識された、発色団標識された、フルオロフォア標識された又は酵素標識された抗体)、抗体誘導体(例えば、基質又はタンパク質リガンド対のタンパク質又はリガンドとコンジュゲートされた抗体)又は抗体断片(例えば、一本鎖抗体、単離された抗体高頻度可変ドメインなど)を使用して評価される。
[000336]別の特定の態様において、マーカーの発現は、対象サンプル中の細胞からmRNA/cDNA(即ち、転写されたポリヌクレオチド)を調製することにより、及びmRNA/cDNAとマーカー核酸又はそれらの断片と相補的である参照ポリヌクレオチドをハイブリダイズすることにより評価される。cDNAは、参照ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに先立って、多様なポリメラーゼ連鎖反応法のいずれかを使用して増幅されていてもよい;好ましくは、増幅されない。一つ以上のマーカーの発現も同様に、定量的PCRを使用して検出することが可能であり、マーカー(単数又は複数)の発現のレベルが評価される。もしくは、マーカーの突然変異又は変異体(一塩基多型性、欠失など)を検出する任意の多くの方法を対象におけるマーカーの出現を検出するために使用することができる。
[000337]関連する態様において、サンプルから得られた転写されたポリヌクレオチドの混合物と、マーカー核酸の少なくとも一部(例えば、少なくとも7、10、15、20、25、30、40、50、100、500、又はそれ以上のヌクレオチド残基)と相補的又は相同的ポリヌクレオチドが固定された支持体を接触させる。もし、相補的又は相同的ポリヌクレオチドが支持体上で別個に検出可能ならば(例えば、異なる発色団又はフルオロフォアを使用して、又は異なって選択された位置に固定されて検出可能)、複数のマーカーの発現のレベルを、単一支持体(例えば、選択された位置に固定されたポリヌクレオチドの「遺伝子チップ」マイクロアレイ)を使用して同時に評価し得る。一つの核酸と別の核酸のハイブリダイゼーションを含んだマーカー発現の評価方法が使用された場合、ハイブリダイゼーションはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で実施されることが望ましい。
[000338]ある態様において、バイオマーカーアッセイは、質量分析法又は表面プラズモン共鳴法を使用して実施される。多様な態様において、対象の障害及び/又は疾患状態に対して活性な剤を同定する方法は:a)一つ以上のマーカー又はそれらの誘導体を含んでいる細胞のサンプルを提供すること;b)こうした細胞から抽出物を調製すること;c)該抽出物と、マーカー結合を含有する標識核酸プローブを混合すること;及びd)試験剤の存在又は不存在下でマーカー及び核酸プローブ間の複合体の形成を決定すること;の一つ以上を含み得る。決定工程は、前記抽出物/核酸プローブ混合物を電気泳動移動度シフトアッセイにかけることを含み得る。
[000339]ある態様において、該決定工程は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、蛍光に基づいたアッセイ及び超高スループットアッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴法(SPR)又は蛍光相関分光法(FCS)アッセイから選択されるアッセイを含む。こうした態様において、SPRは金属誘電性表面での小さな屈折率変化に敏感であるので、SPRセンサーは生体分子相互作用の直接リアルタイム観察に有用である。SPRは、およそ200nmのSPRセンサー/サンプルインターフェース内の105〜106屈折率(RI)単位の変化に感受性である表面技術である。従って、SPR分光法は、センシング層上に堆積された薄い有機フィルムの成長のモニタリングのために有用である。
[000340]本組成物、キット及び方法は、一つ以上のマーカーの発現レベルの相違の検出に依存しているので、マーカーの発現のレベルは、少なくとも一つの正常細胞及び癌に冒された細胞中での発現を評価するために使用される方法の最小検出限界よりも有意に大きなことが望まれる。
[000341]一つ以上のマーカーを使用する追加の対象サンプルのルーチンスクリーニングにより、ある種のマーカーが、対象の特定の障害及び/又は疾患状態を含む、多様なタイプの細胞中で過剰発現されていることに気付くであろうことが理解される。
[000342]加えて、非常に多くの対象サンプルがマーカーの発現について評価され、及びサンプルが得られた個々の対象の結果が関連付けられるので、ある種のマーカーの変化した発現が対象の障害及び/又は疾患状態と強く関連付けられること、及び他のマーカーの変化した発現が他の疾患と強く関連付けられることも確認されるであろう。本組成物、キット、及び方法はそれ故、対象の障害及び/又は疾患状態のステージ、グレード、組織学的型、及び性質の一つ以上を特徴付けるために有用である。
[000343]本組成物、キット、及び方法が、対象の障害及び/又は疾患状態のステージ、グレード、組織学的型、及び性質の一つ以上を特徴付けるために使用される場合、マーカー又はマーカーのパネルは、対応するステージ、グレード、組織学的型、又は性質の障害及び/又は疾患状態を患っている少なくとも約20%、及びある態様においては、少なくとも約40%、60%又は80%、及び実質的に全ての対象において陽性結果が得られるように選択される。本発明のマーカー又はマーカーのパネルは、一般集団については約10%より大きな陽性予測値が得られるように選択される(非制限例において、80%より大きなアッセイ特異性と組み合わされる)。
[000344]複数のマーカーが本組成物、キット及び方法で使用される場合、対象サンプル中の各マーカーの発現レベルは、単一反応混合物(即ち、各マーカーについて異なった蛍光プローブのような試薬を使用して)か、あるいは一つ以上のマーカーに対応する個々の反応混合物中で、同一タイプの非障害及び/又は非疾患サンプル中の複数のマーカーの各々の発現の正常レベルと比較し得る。一つの態様において、対応する正常レベルと比べ、サンプルにおける複数のマーカーの一つより多くの発現の有意に増加したレベルは、該対
象が障害及び/又は疾患状態を患らっていることの指標である。複数のマーカーが使用される場合、2、3、4、5、8、10、12、15、20、30又は50又はそれ以上の個々のマーカーを使用し得る;ある態様において、より少ないマーカーの使用が望ましいであろう。
象が障害及び/又は疾患状態を患らっていることの指標である。複数のマーカーが使用される場合、2、3、4、5、8、10、12、15、20、30又は50又はそれ以上の個々のマーカーを使用し得る;ある態様において、より少ないマーカーの使用が望ましいであろう。
[000345]本組成物、キット及び方法の感度を最大にするため(即ち、対象サンプル中の系起源の細胞に起因する妨害による)、本明細書で使用されるマーカーは、限定された組織分布を有する、例えば、非系組織では通常発現されないマーカーであることが望ましい。
[000346]本組成物、キット及び方法は、対象において障害及び/又は疾患状態を発症する増強されたリスクを有する対象及びその医学的アドバイザーに対して特に役に立つであろうことが認められる。障害及び/又は疾患を発症する増強されたリスクを有すると認められる対象には、例えば、こうした障害又は疾患の家族歴を持つ対象が含まれる。
[000347]正常ヒト系組織中のマーカーの発現レベルは、多様な方法で評価し得る。一つの態様において、この発現の正常レベルは、正常と思われる系細胞の一部におけるマーカーの発現のレベルを評価することにより、及びこの発現の正常レベルを、異常であると疑われている系細胞の一部における発現のレベルと比較することにより評価される。もしくは、及び特に、さらなる情報が本明細書に記載されたルーチン検査の結果として入手可能であるので、該マーカーの正常発現についての集団平均値を使用することができる。他の態様において、マーカーの発現の「正常」レベルは、非罹患対象から得られた対象サンプル、対象に障害及び/又は疾患状態の発症が疑われる以前の患者サンプル、保存された対象サンプルなどのマーカーの発現を評価することにより決定することができる。
[000348]本明細書において、サンプル(例えば、保存された組織サンプル又は対象から得られたサンプル)中の障害及び/又は疾患状態細胞の存在を評価するための組成物、キット及び方法も提供される。これらの組成物、キット及び方法は、上記のものと実質的に同一であるが、但し必要な場合、該組成物、キット及び方法は、対象サンプル以外のサンプルでの使用に適用される。例えば、使用されるべきサンプルがパラフィン処理された保存ヒト組織サンプルである場合、該サンプル中でのマーカー発現のレベルを評価するため、組成物中、キット中、又は方法において化合物の比を調節する必要があろう。
[000349] キット及び試薬
[000350]該キットは、疾患細胞(例えば、対象サンプルのようなサンプル中の)の存在を評価するために有用である。該キットは、複数の試薬を含み、その各々は、マーカー核酸又はタンパク質と特異的に結合することが可能である。マーカータンパク質との結合に適した試薬には、抗体、抗体誘導体、抗体断片などが含まれる。マーカー核酸(例えば、ゲノムDNA、mRNA、スプライスされたmRNA、cDNAなど)との結合に適した試薬には、相補的核酸が含まれる。例えば、該核酸試薬は、支持体に固定化されたオリゴヌクレオチド(標識又は非標識)、支持体と結合されていない標識オリゴヌクレオチド、PCRプライマーの対、分子指標プローブなどを含むことができる。
[000350]該キットは、疾患細胞(例えば、対象サンプルのようなサンプル中の)の存在を評価するために有用である。該キットは、複数の試薬を含み、その各々は、マーカー核酸又はタンパク質と特異的に結合することが可能である。マーカータンパク質との結合に適した試薬には、抗体、抗体誘導体、抗体断片などが含まれる。マーカー核酸(例えば、ゲノムDNA、mRNA、スプライスされたmRNA、cDNAなど)との結合に適した試薬には、相補的核酸が含まれる。例えば、該核酸試薬は、支持体に固定化されたオリゴヌクレオチド(標識又は非標識)、支持体と結合されていない標識オリゴヌクレオチド、PCRプライマーの対、分子指標プローブなどを含むことができる。
[000351]該キットは、本明細書に記載の方法を実行するために有用な追加の成分を場合により含んでいてもよい。例としては、該キットは、相補的核酸のアニーリングのため、抗体とそれが特異的に結合するタンパク質との結合のために適した液体(例えば、SSC緩衝液)、一つ以上のサンプル区画、該方法の実施を記述している取扱説明書、正常システム細胞のサンプル、癌関連疾患細胞のサンプルなどを含むことができる。
[000352]抗体を産生する方法
[000353]対象が障害及び/又は疾患状態を患らっているかどうかを評価するために有用な抗体を産生する、単離されたハイブリドーマを作製する方法も本明細書において提供される。この方法において、マーカータンパク質の全体又はセグメントを含むタンパク質又はペプチドが合成され又は単離される(例えば、それが発現される細胞からの精製により、又はインビボ又はインビトロでの、該タンパク質ペプチドをコードする核酸の転写及び翻訳により)。脊椎動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ又はヒツジのような哺乳類を、該タンパク質又はペプチドを使用して免疫化する。該脊椎動物が該タンパク質又はペプチドに対して強い免疫応答を示すように、少なくとも追加の一回、場合により(及び好ましくは)免疫化してもよい。免疫化された脊椎動物の脾臓細胞を単離し、多様な方法のいずれかを使用して、不死化細胞株と融合させてハイブリドーマを形成させる。このようにして形成されたハイブリドーマは、標準法を使用してスクリーニングし、該マーカータンパク質又はそれらの断片と特異的に結合する抗体を産生する、一つ以上のハイブリドーマを同定した。この方法により作製されたハイブリドーマ、及びこうしたハイブリドーマを使用して作製された抗体も本明細書で提供される。
[000353]対象が障害及び/又は疾患状態を患らっているかどうかを評価するために有用な抗体を産生する、単離されたハイブリドーマを作製する方法も本明細書において提供される。この方法において、マーカータンパク質の全体又はセグメントを含むタンパク質又はペプチドが合成され又は単離される(例えば、それが発現される細胞からの精製により、又はインビボ又はインビトロでの、該タンパク質ペプチドをコードする核酸の転写及び翻訳により)。脊椎動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ又はヒツジのような哺乳類を、該タンパク質又はペプチドを使用して免疫化する。該脊椎動物が該タンパク質又はペプチドに対して強い免疫応答を示すように、少なくとも追加の一回、場合により(及び好ましくは)免疫化してもよい。免疫化された脊椎動物の脾臓細胞を単離し、多様な方法のいずれかを使用して、不死化細胞株と融合させてハイブリドーマを形成させる。このようにして形成されたハイブリドーマは、標準法を使用してスクリーニングし、該マーカータンパク質又はそれらの断片と特異的に結合する抗体を産生する、一つ以上のハイブリドーマを同定した。この方法により作製されたハイブリドーマ、及びこうしたハイブリドーマを使用して作製された抗体も本明細書で提供される。
[000354]有効性評価の方法
[000355]疾患細胞を抑制するための試験化合物の効力を評価する方法も本明細書において提供される。上記のように、該マーカーの発現のレベルの相違は、対象細胞の異常状態と相関する。ある種のマーカーの、発現のレベルの変化はこうした細胞の異常状態により生じたようであるが、他のマーカーの、発現のレベルにおける変化が、これらの細胞の異常状態を誘導し、維持し及び促進することも同様に認められている。それ故、対象の障害及び/又は疾患状態を抑制する化合物は、一つ以上の該マーカーの発現のレベルを、そのマーカー発現の正常レベルにより近いレベル(即ち、正常細胞におけるマーカの発現レベル)への変化を起こすであろう。
[000355]疾患細胞を抑制するための試験化合物の効力を評価する方法も本明細書において提供される。上記のように、該マーカーの発現のレベルの相違は、対象細胞の異常状態と相関する。ある種のマーカーの、発現のレベルの変化はこうした細胞の異常状態により生じたようであるが、他のマーカーの、発現のレベルにおける変化が、これらの細胞の異常状態を誘導し、維持し及び促進することも同様に認められている。それ故、対象の障害及び/又は疾患状態を抑制する化合物は、一つ以上の該マーカーの発現のレベルを、そのマーカー発現の正常レベルにより近いレベル(即ち、正常細胞におけるマーカの発現レベル)への変化を起こすであろう。
[000356]この方法は従って、試験化合物の存在下で維持された第一の細胞サンプルにおけるマーカーの発現、及び試験化合物の不存在下で維持された第二の細胞サンプルにおけるマーカーの発現を比較することを含む。試験化合物の存在下におけるマーカーの有意に減少した発現は、試験化合物が関連疾患を抑制することの指標である。該細胞サンプルは例えば、対象から得られた正常細胞の単一サンプルの一部、対象から得られた正常細胞のプールされたサンプル、正常細胞株の細胞、対象から得られた関連疾患細胞の単一サンプルの一部、対象から得られた関連疾患細胞のプールされたサンプル、関連疾患細胞株の細胞などであることができる。
[000357]一つの態様において、該サンプルは対象から得られた癌関連疾患細胞であり、多様な癌関連疾患を抑制することについて有効であると信じられている複数の化合物を、対象の癌関連疾患を最もよく抑制するであろう化合物を同定するために試験した。
[000358]この方法は同様に、対象の関連疾患を抑制するための療法の効力を評価するために使用することができる。この方法において、対(一方は療法を受けさせ、他方は療法を受けさせなかった)のサンプル中の一つ以上のマーカーの発現のレベルを評価した。試験化合物の効力を評価する方法として、もし該療法がマーカーの発現の有意に低いレベルを誘導すれば、該療法は癌関連疾患を抑制について有効である。上記のように、選択された対象からのサンプルがこの方法で使用されるなら、該対象の癌関連疾患を抑制するために最も有効であるらしい療法を選択するため、代替療法をインビトロで評価することが可能である。
[000359]上記のように、ヒト細胞の異常状態は、該マーカーの発現のレベルの変化と相関する。試験化合物が有害な可能性を評価する方法も提供される。この方法は、試験化合物の存在下又は不存在下で、ヒト細胞の分離した一定分量を維持することを含む。各一定
分量中のマーカーの発現が比較される。試験化合物の存在下で維持された一定分量におけるマーカー発現の有意に高いレベル(試験化合物の不存在下で維持された一定分量と比べて)は、試験化合物が有害である可能性を有する指標である。多様な試験化合物の相対的有害可能性は、発現のレベルが増強された又は抑制されたマーカーの数を比較することにより、関連マーカーの発現レベルの増強又は抑制の程度を比較することにより、又は両方を比較することにより、評価し得る。多様な側面が、以下の副節により詳細に説明されている。
分量中のマーカーの発現が比較される。試験化合物の存在下で維持された一定分量におけるマーカー発現の有意に高いレベル(試験化合物の不存在下で維持された一定分量と比べて)は、試験化合物が有害である可能性を有する指標である。多様な試験化合物の相対的有害可能性は、発現のレベルが増強された又は抑制されたマーカーの数を比較することにより、関連マーカーの発現レベルの増強又は抑制の程度を比較することにより、又は両方を比較することにより、評価し得る。多様な側面が、以下の副節により詳細に説明されている。
[000360]単離されたタンパク質及び抗体
[000361]一つの側面は、単離されたマーカータンパク質及びそれらの生物学的に活性な部分、ならびに、マーカータンパク質又はそれらの断片に対して方向付けられた抗体を上昇させるための免疫原として使用するのに適したポリペプチド断片に関する。一つの態様において、天然のマーカータンパク質は、標準タンパク質精製技術を使用する、適切な精製スキームにより、細胞又は組織源から単離し得る。別の態様において、マーカータンパク質の全体又はセグメントを含むタンパク質又はペプチドが、組換えDNA技術により産生される。組換え発現の代わりに、こうしたタンパク質又はペプチドは、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
[000361]一つの側面は、単離されたマーカータンパク質及びそれらの生物学的に活性な部分、ならびに、マーカータンパク質又はそれらの断片に対して方向付けられた抗体を上昇させるための免疫原として使用するのに適したポリペプチド断片に関する。一つの態様において、天然のマーカータンパク質は、標準タンパク質精製技術を使用する、適切な精製スキームにより、細胞又は組織源から単離し得る。別の態様において、マーカータンパク質の全体又はセグメントを含むタンパク質又はペプチドが、組換えDNA技術により産生される。組換え発現の代わりに、こうしたタンパク質又はペプチドは、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
[000362]「単離された」又は「精製された」タンパク質又はそれらの生物学的に活性な部分とは、タンパク質が由来する細胞又は組織源からの細胞材料又は他の夾雑タンパク質を含んでいないか、又は化学的に合成された場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含んでいない。用語「実質的に細胞材料を含んでいない」には、該タンパク質が単離された又は組換え的に産生された細胞の細胞性成分から分離されたタンパク質の調製物が含まれる。従って、実質的に細胞材料を含んでいないタンパク質には、約30%、20%、10%、又は5%(乾燥重量による)未満の異種タンパク質(本明細書において夾雑タンパク質とも称される)を有するタンパク質の調製試料が含まれる。
[000363]タンパク質又はそれらの生物学的に活性な部分が組換え的に産生される場合、培養培地を実質的に含んでいないのも好ましい、即ち、培養培地は、タンパク質調製試料の約20%、10%、又は5%未満の量に相当する。タンパク質が化学合成により生成される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含んでいないのが好ましく、即ち、それは、該タンパク質の合成に関与した化学的前駆体又は他の化学物質から分離されている。従って、こうしたタンパク質の調製試料は、約30%、20%、10%、5%(乾燥重量)未満の、化学的前駆体又は目的のポリペプチド以外の化合物しか含んでいない。
[000364]マーカータンパク質の生物学的に活性な部分には、マーカータンパク質のアミノ酸配列と十分に同一である又はマーカータンパク質のアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれ、それは、完全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、及び対応する完全長タンパク質の少なくとも一つの活性を示す。典型的には、生物学的に活性な部分は対応する完全長タンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメイン又はモチーフを含む。マーカータンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、10、25、50、100又はそれ以上のアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。さらに、マーカータンパク質の他の領域が欠損する他の生物学的に活性な部分は、組換え技術により調製することが可能であり、マーカータンパク質の天然形態の機能活性の一つ以上を評価する。ある態様において、有用なタンパク質は、これらの配列の一つと実質的に同一であり(例えば、少なくとも約40%、及びある態様において、50%、60%、70%、80%、90%、95%又は99%)、天然のアレル変異又は変異発生によりアミノ酸配列は異なっているが、対応する天然に存在するマーカータンパク質の機能的活性を保持している。
[000365]加えて、マーカータンパク質のセグメントのライブラリーを、スクリーニング及び続いての変異体マーカータンパク質又はそれらのセグメントの選択のためのポリペプチドの変化に富んだ集団を生成するために使用し得る。
[000366]予測医薬
[000367]予測医薬の分野における動物モデル及びマーカーの使用も本明細書において提供され、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス及び臨床治験のモニタリングが予後(予測)目的のために使用され、それにより個体を予防的に治療する。従って、個体が特定の障害及び/又は疾患を発症するリスクを有するかどうかを決定するため、一つ以上のマーカータンパク質又は核酸の発現のレベルを決定するための診断アッセイも本明細書において提供される。こうしたアッセイは、予後の又は予測目的のために使用され、それにより該障害及び/又は疾患の発症に先立って個体を予防的に治療する。
[000367]予測医薬の分野における動物モデル及びマーカーの使用も本明細書において提供され、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス及び臨床治験のモニタリングが予後(予測)目的のために使用され、それにより個体を予防的に治療する。従って、個体が特定の障害及び/又は疾患を発症するリスクを有するかどうかを決定するため、一つ以上のマーカータンパク質又は核酸の発現のレベルを決定するための診断アッセイも本明細書において提供される。こうしたアッセイは、予後の又は予測目的のために使用され、それにより該障害及び/又は疾患の発症に先立って個体を予防的に治療する。
[000368]別の側面において、該方法は少なくとも同一個体の定期的スクリーニングに有用であり、個体の発現パターンを変化させる化学物質又は毒物に、個体が暴露されたかどうかが判る。
[000369]さらに別の側面は、臨床治験におけるマーカーの発現又は活性に対する、障害及び/又は疾患を抑制するために又はいずれか他の障害を治療するため又は予防するために(例えば、こうした治療が有することができる何らかの系の効果を理解するために)投与された剤(例えば、薬剤又は他の化合物)の影響をモニタリングすることに関する。
[000370]医薬組成物
[000371]該化合物は、適した医薬担体中、局所的、局部的又は全身的投与のための製剤であることができる。E. W. Martin (Mark Publishing Company, 1975) によるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 15th Edition、は典型的な坦体及び製造法を記載してい
る。該化合物は、細胞への標的化のための生分解性又は非生分解性ポリマー又はタンパク質又はリポソームから形成された、適した生体適合性マイクロカプセル、微粒子又はミクロスフェア内に被包することもできる。こうしたシステムは、当業者にはよく知られており、適切な核酸での使用に最適化することができる。
[000371]該化合物は、適した医薬担体中、局所的、局部的又は全身的投与のための製剤であることができる。E. W. Martin (Mark Publishing Company, 1975) によるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 15th Edition、は典型的な坦体及び製造法を記載してい
る。該化合物は、細胞への標的化のための生分解性又は非生分解性ポリマー又はタンパク質又はリポソームから形成された、適した生体適合性マイクロカプセル、微粒子又はミクロスフェア内に被包することもできる。こうしたシステムは、当業者にはよく知られており、適切な核酸での使用に最適化することができる。
[000372]核酸送達のための多様な方法が、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; 及び Ausubel et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York、に記載されている。こうした核酸送達システムは、限定されるわけではないが例として、「裸の」核酸のような「裸の」形態か、又はカチオン性分子又はリポソーム形成脂質との複合体のような、又はベクターの成分又は医薬組成物の成分として、送達に適したビヒクル中に配合されている、所望の核酸を含む。核酸送達システムは、細胞とそれを直接接触させることによるように直接的に、又はいずれかの生物学的プロセスの作用を介して間接的に提供し得る。
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; 及び Ausubel et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York、に記載されている。こうした核酸送達システムは、限定されるわけではないが例として、「裸の」核酸のような「裸の」形態か、又はカチオン性分子又はリポソーム形成脂質との複合体のような、又はベクターの成分又は医薬組成物の成分として、送達に適したビヒクル中に配合されている、所望の核酸を含む。核酸送達システムは、細胞とそれを直接接触させることによるように直接的に、又はいずれかの生物学的プロセスの作用を介して間接的に提供し得る。
[000373]局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体及び粉体を含むことができる。慣用的医薬坦体、水性、粉体又は油性基剤、又は増粘剤を必要に応じ使用し得る。
[000374]例えば、関節内(関節中に)、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内及び皮下経路のような非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有できる水性及び非水性の等張な無菌注射液、及び懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、分散剤、安定剤及び保存剤を含有できる水性及び非水性滅菌懸濁液、溶液又は乳剤が含まれる。注射用製剤は、単位投与剤形、例えば、添加された
保存剤を有するアンプル又は多用量容器、で提供することができる。当業者は、必要以上の実験を行うことなく、化合物を調製する及び配合するための種々のパラメータを容易に決定し得る。化合物は、単独又は他の適した成分と組み合わせて使用し得る。
保存剤を有するアンプル又は多用量容器、で提供することができる。当業者は、必要以上の実験を行うことなく、化合物を調製する及び配合するための種々のパラメータを容易に決定し得る。化合物は、単独又は他の適した成分と組み合わせて使用し得る。
[000375]一般に、核酸を含む化合物の投与方法は、当業者には公知である。特に、核酸療法にすでに使用中の投与の経路は、現在使用中の製剤とともに、選択された核酸の好ましい投与経路及び製剤を提供し、特定の製剤、治療されている対象の状態の重度、及び療法的効力に必要とされる用量のような因子にもちろん依存するであろう。本明細書で一般的に使用されるように、「有効量」とは、化合物を受け取っていないマッチした対象と比較し、製剤が投与された対象において、障害の一つ以上の症状を治療できる、障害の一つ以上の症状の進行を逆転できる、障害の一つ以上の症状の進行を停止できる、又は障害の一つ以上の症状の発生を防止できる量である。化合物の実際の有効量は、利用されている具体的化合物又はそれらの組み合わせ、配合された特定の組成物、投与の様式、及び個体の年齢、体重、状態及び治療されている症状又は状態の重症度に従って変化し得る。
[000376]当業者には既知のいずれかの許容できる方法を、製剤を対象に投与するために使用することができる。投与は、治療されている状態に依存し、局部的(即ち、特定の領域、生理学的システム、組織、器官又は細胞タイプへの)又は全身的であることができる。
[000377]薬理ゲノミクス
[000378]該マーカーは、薬理ゲノミクスマーカーとしても有用である。本明細書で使用される「薬理ゲノミクスマーカー」は、その発現レベルが、対象の特定の臨床薬剤応答又は感受性と相関する客観的な生化学的マーカーである。薬理ゲノミクスマーカー発現の存在又は量は、対象の予測応答、及びより詳細には、特定の薬剤又は薬剤のクラスによる療法に対する対象腫瘍の予測応答に関連する。対象における一つ又はそれより多くの薬理ゲノミクスマーカーの発現の存在又は量を評価することにより、対象に最も適切である、又はより大きな成功度を有すると予測される薬剤療法を選択することができる。
[000378]該マーカーは、薬理ゲノミクスマーカーとしても有用である。本明細書で使用される「薬理ゲノミクスマーカー」は、その発現レベルが、対象の特定の臨床薬剤応答又は感受性と相関する客観的な生化学的マーカーである。薬理ゲノミクスマーカー発現の存在又は量は、対象の予測応答、及びより詳細には、特定の薬剤又は薬剤のクラスによる療法に対する対象腫瘍の予測応答に関連する。対象における一つ又はそれより多くの薬理ゲノミクスマーカーの発現の存在又は量を評価することにより、対象に最も適切である、又はより大きな成功度を有すると予測される薬剤療法を選択することができる。
[000379]臨床治験のモニタリング
[000380]マーカー発現のレベルに対する剤(例えば、薬剤化合物)の影響をモニタリングすることは、基礎的薬剤スクリーニングのみでなく、臨床治験においても適応し得る。例えば、マーカー発現に影響する剤の有効性は、癌関連疾患の治療を受けている対象の臨床治験でモニターし得る。
[000380]マーカー発現のレベルに対する剤(例えば、薬剤化合物)の影響をモニタリングすることは、基礎的薬剤スクリーニングのみでなく、臨床治験においても適応し得る。例えば、マーカー発現に影響する剤の有効性は、癌関連疾患の治療を受けている対象の臨床治験でモニターし得る。
[000381]一つの非制限的態様において、本発明は剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣剤、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、又は他の薬剤候補)による対象の治療の有効性をモニタリングするための方法を提供し、
i)剤の投与に先だって、対象から投与前サンプルを得ること;
ii)投与前サンプル中の、一つ以上の選択されたマーカーの発現のレベルを検出すること;
iii)対象から一つ以上の投与後サンプルを得ること;
iv)投与後サンプル中のマーカー(単数又は複数)の発現のレベルを検出すること;
v)投与前サンプル中のマーカー(単数又は複数)の発現のレベルと、投与後サンプル中のマーカー(単数又は複数)の発現のレベルを比較すること;及び
vi)それに合わせて、対象への剤の投与を変化させること;の工程を含む。
i)剤の投与に先だって、対象から投与前サンプルを得ること;
ii)投与前サンプル中の、一つ以上の選択されたマーカーの発現のレベルを検出すること;
iii)対象から一つ以上の投与後サンプルを得ること;
iv)投与後サンプル中のマーカー(単数又は複数)の発現のレベルを検出すること;
v)投与前サンプル中のマーカー(単数又は複数)の発現のレベルと、投与後サンプル中のマーカー(単数又は複数)の発現のレベルを比較すること;及び
vi)それに合わせて、対象への剤の投与を変化させること;の工程を含む。
[000382]例えば、治療の過程間のマーカー遺伝子(単数又は複数)の増加した発現は、有効ではない用量を示し、望ましくは用量を増加させる。反対に、マーカー遺伝子(単数又は複数)の減少した発現は、有効な治療を示し、用量を変化させる必要はない。
[000383]電子装置可読媒体、システム、配列及びそれを用いた方法
[000384]本明細書で使用される「電子装置可読媒体」とは、電子装置により読み出し及び直接的にアクセスし得るデータ又は情報を保存する、保持する又は含有する任意の適した媒体を指す。こうした媒体は、限定されるわけではないが、フロッピー(登録商標)
ディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープのような磁気記憶媒体;コンパクトディスクのような光学記憶媒体;RAM、ROM、EPROM、EEPROMなどのような電子記憶媒体;及び一般的なハードディスク及び磁気/光学記憶媒体のようなこれらのカテゴリーの混成物を含み得る。媒体は本明細書に記載されたように、それらにマーカーが記録されるよう適合又は設定されている。
[000384]本明細書で使用される「電子装置可読媒体」とは、電子装置により読み出し及び直接的にアクセスし得るデータ又は情報を保存する、保持する又は含有する任意の適した媒体を指す。こうした媒体は、限定されるわけではないが、フロッピー(登録商標)
ディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープのような磁気記憶媒体;コンパクトディスクのような光学記憶媒体;RAM、ROM、EPROM、EEPROMなどのような電子記憶媒体;及び一般的なハードディスク及び磁気/光学記憶媒体のようなこれらのカテゴリーの混成物を含み得る。媒体は本明細書に記載されたように、それらにマーカーが記録されるよう適合又は設定されている。
[000385]本明細書で使用される用語「電子装置」とは、データ又は情報を保存するよう設計された又は適合された任意の適切な演算又は処理装置および他の装置を含むことを意味する。本発明での使用に適した電子装置の例には、独立型コンピューター装置;ローカルエリアネットワーク(LAN)、ワイドエリアネットワーク(WAN)インターネット、イントラネット及びエクストラネットを含むネットワーク;携帯情報端末(PDA)、携帯電話、ポケットベルなどのような電子機器;及びローカル及び分散型処理システムが含まれる。
[000386]本明細書で使用される「記録される」とは、電子装置可読媒体上に情報を保存する又はエンコードするためのプロセスを指す。当業者は、本明細書に記載されたマーカーを含む器具を生成するため、媒体上に情報を記録するための任意の方法を容易に採択し得る。
[000387]多様なソフトウエアプログラム及びフォーマットを、本発明のマーカー情報を該電子装置可読媒体上に保存するために使用し得る。無数のデータ処理装置構成フォーマット(例えば、テキストファイル又はデータベース)を、その上にマーカーが記録された媒体を得る又は作製するために採用することができる。マーカーを可読なフォームで供給することで、マーカー配列情報にさまざまな目的でごく普通にアクセスし得る。例えば、当業者は標的の配列又は標的の構造モチーフと、データ保存手段内に保存された配列情報を比較するため、可読フォームのヌクレオチド又はアミノ酸配列を使用し得る。特定の標的配列又は標的モチーフに一致する、配列の断片又は領域を同定するために検索手段が用いられる。
[000388]従って、対象が癌関連疾患あるいは癌関連疾患の素因を有しているかどうかを決定する方法を実行する命令を保持するための媒体も提供され、ここで、該方法は、マーカーの存在又は不存在を決定すること、そしてマーカーの存在又は不存在に基づいて、該対象が癌関連疾患又は癌関連疾患への素因を有しているかどうかを決定すること、及び/又は癌関連疾患又は前癌関連疾患状態のための特定の治療を推奨することの工程を含む。
[000389]電子システム及び/又はネットワークにおいて、対象が癌関連疾患又はマーカーに関連する癌関連疾患の素因を有するかどうかを決定するための方法も本明細書において提供され、該方法は、マーカーの存在又は不存在を決定すること、そしてマーカーの存在又は不存在に基づいて、該対象が特定の障害及び疾患及び/又はこうした障害及び疾患への素因を有するかどうかを決定すること、及び/又はこうした障害及び疾患及び/又はこうした前癌関連疾患状態に対する特定の治療を推奨すること、の工程を含む。該方法はさらに、該対象に関連する表現型情報を受け取ること、及び/又は該対象に関連するネットワーク表現型情報を獲得すること、の工程を含む。
[000390]対象が障害及び/又は疾患又はマーカーに関連する障害及び/又は疾患への素
因を有するかどうかを決定するためのネットワーク方法も本明細書において提供され、該方法は、マーカーに関連する情報を受け取ること、対象に関連する表現型情報を受け取ること、マーカー及び/又は障害及び/又は疾患に対応するネットワークから情報を獲得すること、そして一つ以上の表現型情報、該マーカー、及び該獲得した情報に基づいて、該対象が障害及び/又は疾患又はそれらへの素因を有するかどうかを決定すること、の工程を含む。該方法は、該障害及び/又は疾患又はそれらへの素因のための特定の治療を推奨する工程をさらに含むことができる。
因を有するかどうかを決定するためのネットワーク方法も本明細書において提供され、該方法は、マーカーに関連する情報を受け取ること、対象に関連する表現型情報を受け取ること、マーカー及び/又は障害及び/又は疾患に対応するネットワークから情報を獲得すること、そして一つ以上の表現型情報、該マーカー、及び該獲得した情報に基づいて、該対象が障害及び/又は疾患又はそれらへの素因を有するかどうかを決定すること、の工程を含む。該方法は、該障害及び/又は疾患又はそれらへの素因のための特定の治療を推奨する工程をさらに含むことができる。
[000391]対象が障害及び/又は疾患又はそれらへの素因を有するかどうかを決定するためのビジネスモデルも本明細書において提供され、該方法は、該マーカーに関連する情報を受け取ること、該対象に関連する表現型情報を受け取ること、該マーカー及び/又は障害及び/又は疾患に対応するネットワークから情報を獲得すること、そして一つ以上の表現型情報、該マーカー、及び該獲得した情報に基づいて、該対象が障害及び/又は疾患又はそれらへの素因を有するかどうかを決定すること、の工程を含む。該方法は、それらへの特定の治療を推奨する工程をさらに含むことができる。
[000392]アレイ中で一つ以上の遺伝子の発現をアッセイするために使用し得るアレイも本明細書において提供される。一つの態様において、該アレイは、組織における遺伝子発現をアッセイするために使用することが可能であり、アレイ中の遺伝子の組織特異性が確認される。このようにして、約7000までの又はそれ以上の遺伝子が、発現について同時にアッセイし得る。このことは、一つ以上の組織で特異的に発現された遺伝子の集団を示しているプロファイルが展開されるのを可能にする。
[000393]こうした定性的決定に加え、遺伝子発現の定量化が本明細書において提供される。従って、組織特異性のみならず、組織中の遺伝子の集団の発現レベルも確認可能である。従って、遺伝子は、それらの組織発現それ自体及びその組織中での発現のレベルに基づいてグループ化し得る。このことは、例えば、組織間又は組織中での遺伝子発現の関係を確認することにおいて有用である。従って、一つの組織を撹乱させることが可能であり、そして第二の組織中の遺伝子発現に対する影響を決定し得る。これに関連して、生物学的刺激に応答した、別の細胞タイプに対する一つの細胞タイプの影響を決定し得る。
[000394]こうした決定は、例えば、遺伝子発現レベルでの細胞間相互作用の効果を知る上で有用である。もし一つの剤が、一つの細胞タイプを治療するために療法的に投与されて、別の細胞タイプに望まれない効果を有しているならば、本方法は、望まれない効果の分子基盤を決定するアッセイを提供し、そしてそれ故、相殺する剤を同時投与する、さもなければ望まれない効果を治療する機会を提供する。同様に、単一細胞タイプ内でも、望まれない生物学的効果を分子レベルで決定し得る。それ故、標的遺伝子以外の発現に対する、一つの剤の効果を確認及び相殺することが可能である。
[000395]別の態様において、該アレイは、アレイ中で一つ以上の遺伝子の発現の時間経過をモニターするために使用し得る。このことは、本明細書に開示したように、多様な生物学的状況で起こり得る;例えば、障害及び/又は疾患の発症、それらの進行、及びそれらに関連する細胞形質転換のようなプロセス。
[000396]該アレイは、同一細胞における、又は異なった細胞における遺伝子の発現又は他の遺伝子の発現の効果を確認するためにも有用である。このことは、例えば、もし最終又は下流標的を調節できないならば、治療介入のための代替分子標的の選択を提供する。
[000397]該アレイは、正常及び異常細胞における一つ又はそれより多くの遺伝子の発現差異パターンを確認するためにも有用である。このことは、診断又は治療介入のための分
子標的として働くことができる遺伝子の集団を提供する。
子標的として働くことができる遺伝子の集団を提供する。
[000398]代理マーカー
[000399]該マーカーは、一つ以上の障害又は疾患状態のための、又はそれらへ導く状態のための代理マーカーとして働くことができる。本明細書で使用される「代理マーカー」とは、疾患又は障害の不存在又は存在と、又は疾患又は障害の進行と相関する、客観的生化学的マーカーである。こうしたマーカーの存在又は量は、該疾患とは独立である。それ故、これらのマーカーは、治療の特定の経過が、疾患状態又は障害を軽減することに有効であるかどうかを示すために働くことができる。代理マーカーは、疾患状態又は障害の存在又は程度が標準方法論ではアクセスすることが困難である場合、又は危険な臨床的エンドポイントに到達する可能性がある前に疾患進行の評価が望まれる場合に特別に使用される。
[000399]該マーカーは、一つ以上の障害又は疾患状態のための、又はそれらへ導く状態のための代理マーカーとして働くことができる。本明細書で使用される「代理マーカー」とは、疾患又は障害の不存在又は存在と、又は疾患又は障害の進行と相関する、客観的生化学的マーカーである。こうしたマーカーの存在又は量は、該疾患とは独立である。それ故、これらのマーカーは、治療の特定の経過が、疾患状態又は障害を軽減することに有効であるかどうかを示すために働くことができる。代理マーカーは、疾患状態又は障害の存在又は程度が標準方法論ではアクセスすることが困難である場合、又は危険な臨床的エンドポイントに到達する可能性がある前に疾患進行の評価が望まれる場合に特別に使用される。
[000400]該マーカーは、薬力学的マーカーとしても有用である。本明細書で使用される「薬力学的マーカー」は、薬剤効果と特異的に相関する客観的生化学的マーカーである。薬力学的マーカーの存在又は量は、薬剤が投与される疾患状態又は障害とは関係しない;それ故、該マーカーの存在又は量は、対象中の薬剤の存在又は活性を示す。例えば、薬力学的マーカーは、生物学的組織内において当該薬剤のレベルに関連して該マーカーが発現もしくは転写され、または発現もしくは転写されない点において、生物学的組織における当該薬剤の濃度を示すことができる。このようにして、該薬剤の分布又は取り込みを薬力学的マーカーによりモニターすることができる。同様に、薬力学的マーカーの存在または量は薬剤の代謝産物の存在または量に比例することができるので、該マーカーの存在または量は、インビボにおける当該薬剤の相対的な分解率を示す。
[000401]薬力学的マーカーは、特に薬剤が低用量で投与される場合、薬剤効果の検出の感度を増加させることにおいて特に有用である。少量の薬剤でさえも、マーカーの転写又は発現を複数回活性化するのに十分であることができるため、増幅されたマーカーは多量にあり、それは薬剤それ自身よりも容易に検出可能である。また、該マーカーは、マーカー自身の性質によってさらに容易に検出されることができる;例えば、本明細書に記載した方法を使用し、抗体をタンパク質マーカーの免疫に基づいた検出システムで用いることができ、又はマーカー特異的放射標識プローブをmRNAマーカーの検出に使用することができる。さらに、薬力学的マーカーの使用は、直接観察可能な範囲を超えた薬剤治療によるリスクの機構に基づいた予測を与えることができる。
[000402]試験のためのプロトコル
[000403]障害及び/又は疾患のための試験法は、例えば、対象由来の生物学的サンプル中の、各マーカー遺伝子の発現レベルを時間とともに測定すること、および対照生物学的サンプル中のマーカー遺伝子とレベルを比較することを含むことができる。
[000403]障害及び/又は疾患のための試験法は、例えば、対象由来の生物学的サンプル中の、各マーカー遺伝子の発現レベルを時間とともに測定すること、および対照生物学的サンプル中のマーカー遺伝子とレベルを比較することを含むことができる。
[000404]マーカー遺伝子が本明細書に記載された遺伝子の内の一つで、発現レベルが差次的に発現される場合(例えば、対照の場合より高く又は低く)、対象は障害及び/又は疾患の影響を受けていると判断される。マーカー遺伝子の発現レベルが許容範囲内にある場合は、対象がそれらに影響を受けていることはありそうもない。
[000405]発現レベルを比較するため、対照についての標準値を、対照におけるマーカー遺伝子の発現レベルを測定することにより前もって決定できる。例えば標準値は、上述した対照におけるマーカー遺伝子の発現レベルに基づいて決定し得る。例えば、ある態様において、許容範囲を標準値に基づいて±2S.D.とする。標準値が決定されたら、試験法は、対象からの生物学的サンプル中の発現レベルのみを測定すること、その値と対照について決定された標準値を比較することにより実施することができる。
[000406]マーカー遺伝子の発現レベルには、マーカー遺伝子からmRNAへの転写、およびタンパク質への翻訳が含まれる。従って、障害及び/又は疾患を試験する一つの方法は、マーカー遺伝子に相当するmRNAの発現強度、又はマーカー遺伝子によりコードされているタンパク質の発現レベルの比較に基づいて実施される。
[000407]障害及び/又は疾患について試験することにおけるマーカー遺伝子の発現レベルの測定は、様々な遺伝子分析法に従って実施することができる。具体的には、例えばこれらの遺伝子とハイブリダイズする核酸をプローブとして使用するハイブリダイゼーション技術、あるいはマーカー遺伝子とハイブリダイズするDNAをプライマーとして用いる遺伝子増幅技術を使用し得る。
[000408]試験に用いるプローブ又はプライマーは、該マーカー遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計し得る。それぞれのマーカー遺伝子のヌクレオチド配列に対する識別番号が、本明細書に記載されている。
[000409]さらに、高等生物は一般に高い頻度で遺伝子多型を伴うことを理解すべきである。スプライシングプロセスの間に互いに異なったアミノ酸配列を含むアイソフォームを産生する多くの分子もある。マーカー遺伝子と同様の活性を有する癌関連疾患に関連するいずれの遺伝子も、たとえそれが遺伝子多型による又はアイソフォームであることによるヌクレオチド配列相違を有しても、マーカー遺伝子に含まれる。
[000410]マーカー遺伝子はヒトに加え、他の種の相同体を含むことができることも理解すべきである。従って、特に規定しない限り、表現「マーカー遺伝子」は、種に固有のマーカー遺伝子の相同体、又は個体内に導入されている外来のマーカー遺伝子を指す。
[000411]「マーカー遺伝子の相同体」は、ストリンジェント条件下でプローブとしてヒトマーカー遺伝子にハイブリダイズできる、ヒト以外の種由来の遺伝子も指すことを理解すべきである。こうしたストリンジェント条件は、実験的に又は経験的に同様のストリンジェンシーを生み出す適切な条件を選択できる当業者においては公知である。
[000412]マーカー遺伝子のヌクレオチド配列、又はマーカー遺伝子のヌクレオチド配列の相補鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、少なくとも15のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドは、プライマー又はプローブとして使用し得る。それ故、「相補鎖」は、他の鎖に関する二本鎖DNAの一つの鎖を意味し、A:T(RNAについてはU)及びG:C塩基対から構成される。
[000413]さらに、「相補的」は少なくとも15の連続したヌクレオチド領域に対して完全に相補的なもののみでなく、場合によっては少なくとも40%、場合によっては50%、場合によっては60%、場合によっては70%、場合によっては80%、場合によっては90%及び場合によっては95%又はより高い。ヌクレオチド配列間の相同性の程度はBLASTなどのアルゴリズムによって決定し得る。
[000414]こうしたポリヌクレオチドは、マーカー遺伝子を検出するためのプローブ又はマーカー遺伝子を増幅するためのプライマーとして有用である。プライマーとして用いる場合、該ポリヌクレオチドは通常15bp〜100bp、及びある態様においてはヌクレオチドの15bp〜35bpを含む。プローブとして用いる場合、DNAはマーカー遺伝子の全ヌクレオチド配列(又はそれの相補鎖)、又は少なくとも15bpのヌクレオチドを有するそれの部分的配列を含む。プライマーとして用いる場合、3’領域はマーカー遺伝子に対して相補的でなくてはならないが、一方、5’領域は制限酵素認識配列又はタグ
と連結し得る。
と連結し得る。
[000415]「ポリヌクレオチド」はDNA又はRNAのどちらでもよい。これらのポリヌクレオチドは合成又は天然起源のどちらでもよい。また、ハイブリダイゼーション用のプローブとして用いるDNAは通常標識化されている。当事者はこうした標識化法を容易に理解している。本明細書で、用語「オリゴヌクレオチド」とは、相対的に少ない重合度のポリヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドに含まれている。
[000416]ハイブリダイゼーション法を用いた障害及び/又は疾患のための試験は、例えばノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、又はDNAマイクロアレイ技術などを用いて実施し得る。さらに、RT−PCR法のような遺伝子増幅技術も使用できる。RT−PCRの遺伝子増幅段階の間にPCR増幅モニタリング法を使用することにより、マーカー遺伝子の発現のより定量的分析を達成し得る。
[000417]PCR遺伝子増幅モニタリング法において、検出ターゲット(DNA又はRNAの逆転写体)は蛍光色素及び蛍光を吸収する消光剤で標識したプローブとハイブリダイズされる。PCRが進行してTaqポリメラーゼが5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を有するプローブを分解すると、蛍光色素及び消光剤は互いに引き離れ、蛍光が検出される。蛍光はリアルタイムで検出される。標的のコピー数が既知である標準サンプルを同時に測定することにより、PCR増幅が線形の場合、対象サンプル中の標的のコピー数をサイクル数で求めることができる。また、当業者はPCR増幅モニタリング法を、いずれかの適切な手法を使用して実行し得ることを認識している。
[000418]癌関連疾患の試験法は、マーカー遺伝子によりコードされたタンパク質を検出することでも実行し得る。以後、マーカー遺伝子によりコードされたタンパク質を「マーカータンパク質」と記載する。こうした試験法として、例えば、各マーカー遺伝子に結合する抗体を使用し、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、及びELISA法を用いることができる。
[000419]マーカータンパク質に結合する検出に使用された抗体は、如何なる適切な技術でも産生できる。また、マーカータンパク質を検出するため、こうした抗体を適切に標識できる。もしくは、抗体を標識する代わりに、抗体に特異的結合する物質、例えば、プロテインA又はプロテインGを標識化してマーカータンパク質を間接的に検出できる。より具体的には、こうした検出法はELISA法を含み得る。
[000420]抗原として使用したタンパク質又はそれの部分的ペプチドを、例えば、マーカー遺伝子又はその一部を発現ベクターに挿入し、構成物を適切な宿主細胞に導入して形質転換体を産生し、形質転換体を培養して組み換えタンパク質を発現させ、発現された組み換えタンパク質を培養物または培地の上清から精製する。もしくは、遺伝子によりコードされたアミノ酸配列、又は完全長cDNAによりコードされたアミノ酸配列の一部を含むオリゴペプチドを免疫原として用いるために化学合成した。
[000421]さらに、癌関連疾患のための試験は、マーカー遺伝子の発現レベルの指標のみならず、生物学的サンプル中のマーカータンパク質の活性の指標として使用して実施し得る。マーカータンパク質の活性とは、タンパク質固有の生物学的活性を意味する。多様な方法が、各タンパク質の活性を測定するために使用し得る。
[000422]症状が示されているにも関わらず、対象が定期試験において障害及び/又は疾患に罹患していないと診察されても、こうした対象が障害及び/又は疾患に罹患しているかどうかは、本明細書に記載された方法に従って試験を実施することにより容易に決定し
得る。
得る。
[000423]より具体的には、ある態様において、該マーカー遺伝子が本明細書に記載された遺伝子の一つである場合、その症状が障害及び/又は疾患への少なくとも感受性を示唆する対象における発現レベルの増加又は減少は、症状が主としてそれらにより引き起こされていることを示す。
[000424]加えて、本試験は障害及び/又は疾患が対象において改善しているかどうかを決定する上で有用である。言い換えると、本明細書に記載された方法は、それらのための治療の療法効果を判断するために使用し得る。さらに、該マーカー遺伝子が本明細書に記載された遺伝子の一つの場合、それらに罹患していると診断された対象における該マーカー遺伝子の発現レベルの増加又は減少は、疾病がより進行していることを暗示する。
[000425]障害及び/又は疾患の重症度及び/又は感受性は、発現レベルの相違に基づいても決定することができる。例えば、該マーカー遺伝子が本明細書に記載された遺伝子の一つの場合、該マーカー遺伝子の発現レベルの増加の程度は、障害及び/又は疾患の存在及び/又重症度と相関する。
[000426]動物モデル
[000427]別の側面において、一つ以上のマーカー遺伝子又は該マーカー遺伝子と機能的に均等な遺伝子の発現レベルが動物モデルにおいて上昇されている、障害及び/又は疾患のための動物モデルを作製し得る。本明細書で使用される「機能的に均等な遺伝子」とは、一般的に、該マーカー遺伝子によりコードされたタンパク質の既知の活性と同様の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。機能的に均等な遺伝子の代表的例には、該動物に固有である対象動物のマーカー遺伝子のカウンターパートが含まれる。
[000427]別の側面において、一つ以上のマーカー遺伝子又は該マーカー遺伝子と機能的に均等な遺伝子の発現レベルが動物モデルにおいて上昇されている、障害及び/又は疾患のための動物モデルを作製し得る。本明細書で使用される「機能的に均等な遺伝子」とは、一般的に、該マーカー遺伝子によりコードされたタンパク質の既知の活性と同様の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。機能的に均等な遺伝子の代表的例には、該動物に固有である対象動物のマーカー遺伝子のカウンターパートが含まれる。
[000428]動物モデルは、障害及び/又は疾患による生理学的変化を検出するために有用である。ある態様において、該動物モデルは、マーカー遺伝子の追加の機能を明らかにするため、及び標的がマーカー遺伝子である薬剤を評価するために有用である。
[000429]動物モデルは、カウンターパート遺伝子の発現レベルを制御することにより、又はカウンターパート遺伝子を投与することにより作製し得る。該方法は、本明細書に記載した遺伝子のグループから選択される遺伝子の発現レベルを制御することにより、動物モデルを作製することを含み得る。別の態様において、該方法は、本明細書に記載された遺伝子によりコードされたタンパク質を投与することにより、又は該タンパク質に対する抗体を投与することにより、動物モデルを作製することを含み得る。ある他の態様において、該マーカーが適切な方法を使用して測定できるように、該マーカーを過剰発現させることが可能であることも理解すべきである。別の態様において、動物モデルは、遺伝子のこうした群より選択される遺伝子を導入することにより、又はこうした遺伝子によりコードされたタンパク質を投与することにより作製し得る。別の態様において、障害及び/又は疾患は、遺伝子のこうした群より選択される遺伝子の発現を、又はこうした遺伝子によりコードされたタンパク質の活性を抑制することにより誘発し得る。アンチセンス核酸、リボザイム、又はRNAiが該発現を抑制するために使用し得る。タンパク質の活性は、抗体のような、活性を抑制する物質を投与することにより効果的に制御し得る。
[000430]該動物モデルは、障害及び/又は疾患の根底にある機構を評価するため、及びスクリーニングにより得られた化合物の安全性を試験するためにも有用である。例えば、動物モデルが特定の障害及び/又は疾患の症状を発症した場合、又はある種の障害及び/又は疾患に関与する測定値が動物中で変化した場合、疾患を寛解する活性を有する化合物を探索するため、スクリーニングシステムを構築し得る。
[000431]本明細書で使用される表現「発現レベルの増加」とは、以下のいずれか一つを指す:外来遺伝子として導入されたマーカー遺伝子が人工的に発現された場合;対象動物に固有のマーカー遺伝子の転写及びタンパク質へのそれらの翻訳が増強された場合;翻訳生成物であるタンパク質の加水分解が抑制された場合。
[000432]本明細書で使用される表現「発現レベルの減少」とは、対象動物のマーカー遺伝子の転写、及びタンパク質へのそれらの翻訳が抑制された状態、又は翻訳産物である該タンパク質の加水分解が増強された状態を指す。遺伝子の発現レベルは、例えば、DNAチップ上のシグナル強度の相違により決定し得る。さらに、翻訳産物(タンパク質)の活性は、正常状態のものと比較することにより決定し得る。
[000433]該動物モデルはトランスジェニック動物を含むことも企図された範囲内であり、例えば、マーカー遺伝子が導入されており、そして人工的に発現される動物;マーカー遺伝子ノックアウト動物;及び別の遺伝子でマーカー遺伝子が置換されているノックイン動物が含まれる。マーカー遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、RNAi効果を有するポリヌクレオチド、又はデコイ核酸もしくはそうしたものとして機能するDNAが導入されているトランスジェニック動物がトランスジェニック動物として使用できる。こうしたトランスジェニック動物には、例えば、遺伝子のコード領域内に突然変異を導入すること、又はアミノ酸配列が修飾されて加水分解に対して抵抗性又は感受性となることにより、マーカータンパク質の活性が増強されている又は抑制されている動物が含まれる。アミノ酸配列中の突然変異には、置換、欠失、挿入及び付加が含まれる。
[000434]発現の例
[000435]加えて、マーカー遺伝子の発現それ自身を、該遺伝子の転写調節領域内に突然変異(単数又は複数)を導入することにより制御し得る。当業者はこうしたアミノ酸置換を理解している。また、活性が維持されている限り、変異されたアミノ酸の数は特に制限されない。通常、それは50アミノ酸以内、ある非制限態様においては30アミノ酸以内、10アミノ酸以内又は3アミノ酸以内である。突然変異の部位は、活性が維持されている限り、いずれの部位であってもよい。
[000435]加えて、マーカー遺伝子の発現それ自身を、該遺伝子の転写調節領域内に突然変異(単数又は複数)を導入することにより制御し得る。当業者はこうしたアミノ酸置換を理解している。また、活性が維持されている限り、変異されたアミノ酸の数は特に制限されない。通常、それは50アミノ酸以内、ある非制限態様においては30アミノ酸以内、10アミノ酸以内又は3アミノ酸以内である。突然変異の部位は、活性が維持されている限り、いずれの部位であってもよい。
[000436]さらに別の側面において、特定の障害及び/又は疾患を治療する療法剤のための候補化合物についてのスクリーニング法が本明細書において提供される。一つ以上のマーカー遺伝子が本明細書に記載した遺伝子の群から選択される。癌関連疾患のための療法剤は、マーカー遺伝子(単数又は複数)の発現レベルを増加させる又は減少させることが可能な化合物を選択することにより得ることが可能である。
[000437]表現「遺伝子の発現レベルを増加させる化合物」とは、遺伝子転写、遺伝子翻訳又はタンパク質活性の発現のいずれか一つの段階を促進する化合物を指す。一方、本明細書で使用される表現「遺伝子の発現レベルを減少させる化合物」は、これらの段階のいずれか一つを阻害する化合物を指す。
[000438]特定の側面において、障害及び/又は疾患の療法剤についてのスクリーニング法は、インビボかあるいはインビトロで実施し得る。このスクリーニング法は、例えば、1)候補化合物を動物対象に投与すること;
2)動物対象からの生物学的サンプル中のマーカー遺伝子(単数又は複数)の発現レベルを測定すること;又は
3)候補化合物に接触していない対照中のレベルと比較し、マーカー遺伝子(単数又は複数)の発現レベルを増加させる又は減少させる化合物を選択すること、により実施し得る。
2)動物対象からの生物学的サンプル中のマーカー遺伝子(単数又は複数)の発現レベルを測定すること;又は
3)候補化合物に接触していない対照中のレベルと比較し、マーカー遺伝子(単数又は複数)の発現レベルを増加させる又は減少させる化合物を選択すること、により実施し得る。
[000439]さらに別の側面において、動物対象と候補化合物を接触させ、そして該動物対象に由来する生物学的サンプル中のマーカー遺伝子(単数又は複数)の発現レベルに対する化合物の効果をモニタリングすることにより、マーカー遺伝子(単数又は複数)の発現レベルに対する医薬品のための候補化合物の効力を評価する方法が本明細書において提供される。該動物対象に由来する生物学的サンプル中のマーカー遺伝子(単数又は複数)の発現レベルにおける変動は、上記の試験法に使用した同一技術を使用してモニターし得る。さらに、評価に基づいて、医薬品のための候補化合物をスクリーニングにより選択し得る。
[000440]本明細書で引用した全ての特許、特許出願及び参照文献は、その全体が本明細書において援用される。本発明は当業者がそれを作製する及び使用するのに十分に詳しく説明され及び例示されてきたが、本発明の精神及び範囲から離れることなく、多様な変形、修正及び改善ができるのは明らかなはずである。本発明は、課題を実行し、そして記述した目的及び利点、ならびにここに固有のものを得るためにうまく適用されることを、当業者は容易に理解する。
[000441]ある種の核酸塩基配列
[000442]本明細書に記載された成熟miRNA及びそれらの対応するステムループ配列の核酸塩基配列は、http://microrna.sanger.ac.uk/ で見出されたmiRNA配列のオンライン検索可能なデータベース及びアノテーション(annotation)、miRBaseで見出された配列である。miRBase配列データベースへのエントリーで、成熟miRNA配列の位置及び配列についての情報を伴った、miRNA転写体の推定ヘアピン部分(ステムループ)が示される。データベース中のmiRNAステムループ配列は、厳密には前駆体miRNA(pre−miRNA)ではなく、ある場合は、pre−miRNA及び推定一次転写体からのいくらかの隣接配列を含む。本明細書に記載されたmiRNA核酸塩基配列は、miRBase配列データベースのリリース10.0に記載されている配列及びmiRBase配列データベースのより以前のいずれかのリリースに記載されている配列を含む、いずれのバージョンのmiRNAも包含する。配列データベースリリースは、ある種のmiRNAの改称を生じさせることがある。配列データベースリリースは、成熟miRNA配列の変化を生じさせることがある。こうした修飾オリゴヌクレオチドを包含することができる該化合物は、本明細書に記載されたmiRNAのいずれの核酸塩基配列バージョンとも相補的であることができる。
[000442]本明細書に記載された成熟miRNA及びそれらの対応するステムループ配列の核酸塩基配列は、http://microrna.sanger.ac.uk/ で見出されたmiRNA配列のオンライン検索可能なデータベース及びアノテーション(annotation)、miRBaseで見出された配列である。miRBase配列データベースへのエントリーで、成熟miRNA配列の位置及び配列についての情報を伴った、miRNA転写体の推定ヘアピン部分(ステムループ)が示される。データベース中のmiRNAステムループ配列は、厳密には前駆体miRNA(pre−miRNA)ではなく、ある場合は、pre−miRNA及び推定一次転写体からのいくらかの隣接配列を含む。本明細書に記載されたmiRNA核酸塩基配列は、miRBase配列データベースのリリース10.0に記載されている配列及びmiRBase配列データベースのより以前のいずれかのリリースに記載されている配列を含む、いずれのバージョンのmiRNAも包含する。配列データベースリリースは、ある種のmiRNAの改称を生じさせることがある。配列データベースリリースは、成熟miRNA配列の変化を生じさせることがある。こうした修飾オリゴヌクレオチドを包含することができる該化合物は、本明細書に記載されたmiRNAのいずれの核酸塩基配列バージョンとも相補的であることができる。
[000443]本明細書に示したいずれの核酸塩基配列も、糖部分、ヌクレオシド間結合又は核酸塩基への何らかの修飾とは独立であることが理解される。さらに、Uを含む核酸塩基配列は、Uを有する一つ以上の位置でUがTにより置き換えられた同一の核酸塩基配列も包含することが理解される。逆に、Tを含む核酸塩基配列は、Tを有する一つ以上の位置でTがUにより置き換えられた同一の核酸塩基配列も包含することが理解される。
[000444]ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、miRNA又はそれらの前駆体と相補的である核酸塩基配列を有し、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100又はそれ以上の核酸塩基の領域にわたって、miRNA又はそれらの前駆体の相補体と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%同一であること、又は二つの配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。従って、ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、その標的miRNA又は標的miRNA前駆体配列に関して一つ以上の不適正な塩基対を有することができ、
そしてその標的配列へハイブリダイズすることが可能である。ある態様において修飾オリゴヌクレオチドは、miRNA又はそれらの前駆体と100%相補的である核酸塩基配列を有する。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、miRNAに完全長相補性を有する。
そしてその標的配列へハイブリダイズすることが可能である。ある態様において修飾オリゴヌクレオチドは、miRNA又はそれらの前駆体と100%相補的である核酸塩基配列を有する。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、miRNAに完全長相補性を有する。
[000445]miRNA(miR)療法
[000446]いくつかの態様において、本発明は、対象において一つ以上の遺伝子の発現を抑制するマイクロRNAを提供する。マイクロRNA発現プロファイルは、新しい種類の癌バイオマーカーとして働き得る。
[000446]いくつかの態様において、本発明は、対象において一つ以上の遺伝子の発現を抑制するマイクロRNAを提供する。マイクロRNA発現プロファイルは、新しい種類の癌バイオマーカーとして働き得る。
[000447]本明細書に含まれるのは、一つ以上のMiRを使用した、遺伝子発現及び/又は活性を抑制する方法である。いくつかの態様において、miR(単数又は複数)は、タンパク質の発現を阻害する。他の態様において、miRNA(単数又は複数)は、遺伝子活性を阻害する(例えば、細胞侵入活性)。
[000448]miRNAは、細胞又は組織から単離する、組換え的に産生する、又は当業者には公知である多様な技術によりインビトロで合成することができる。一つの態様において、miRNAは細胞又は組織から単離される。細胞又は組織からmiRNAを単離する技術は、当業者には公知である。例えば、miRNAは、Ambion, Incの mirVana miRNA単離キットを使用し、全RNAから単離し得る。別の技術は、flashIPAGE(商標)Fractionator System(Ambion, Inc.)を小さな核酸のPAGE精製に利用する。
[000449]miRNA療法の使用については、インビボで投与された核酸が取り込まれ、そして細胞及び組織に分布することが当業者には認識されている。
[000450]核酸は、剤及び/又は核酸送達システムの組織特異的取込みを可能にする、適した様式で送達することができる。本明細書に記載された製剤は、限定されるわけではないが、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性剤の投与、天然アミノ酸、ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体及び生物学的応答修飾物質を含む、いずれかの既知の慣用的療法による治療状態を補うことができる。二つ又はそれ以上を組み合わせた化合物を一緒に又は連続的に使用することができる。
[000450]核酸は、剤及び/又は核酸送達システムの組織特異的取込みを可能にする、適した様式で送達することができる。本明細書に記載された製剤は、限定されるわけではないが、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性剤の投与、天然アミノ酸、ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体及び生物学的応答修飾物質を含む、いずれかの既知の慣用的療法による治療状態を補うことができる。二つ又はそれ以上を組み合わせた化合物を一緒に又は連続的に使用することができる。
[000451]本発明のある態様は、(a)一つ以上の核酸又は小分子化合物及び(b)一つ以上の他の化学療法剤を含有する医薬組成物を提供する。
[000452]追加の有用な定義
[000453]「対象」とは、治療又は療法のために選択されたヒト又は非ヒト動物を意味する。「有することが疑われる対象」とは、障害、疾患又は状態の一つ以上の臨床指標を示している対象を意味する。
[000452]追加の有用な定義
[000453]「対象」とは、治療又は療法のために選択されたヒト又は非ヒト動物を意味する。「有することが疑われる対象」とは、障害、疾患又は状態の一つ以上の臨床指標を示している対象を意味する。
[000454]「予防すること」又は「予防」とは、状態又は疾患の開始、発症又は進行を週、月、年を含む一時期、遅延させる又は未然に防ぐことを指す。「治療」又は「治療する」とは、障害及び/又は疾患の治癒又は寛解のために使用された一つ以上の具体的過程の適用を意味する。ある態様において、具体的過程は一つ以上の医薬品の投与である。
[000455]「寛解」とは、状態又は疾患の少なくとも一つの指標の重症度の緩和を意味する。ある態様において、寛解は、状態又は疾患の一つ以上の指標の進行を遅延させる又は減速することを含む。指標の重症度は、当業者には公知である主観的又は客観的測定により決定することができる。
[000456]「それを必要とする対象」とは、療法又は治療を必要としていると同定された対象を意味する。
[000457]「投与すること」とは、対象に医薬品又は組成物を提供することを意味し、限定されるわけではないが、医療専門家による投与及び自己投与を含む。
[000457]「投与すること」とは、対象に医薬品又は組成物を提供することを意味し、限定されるわけではないが、医療専門家による投与及び自己投与を含む。
[000458]「非経口投与」とは、注射又は注入を介した投与を意味する。非経口投与には、限定されるわけではないが、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与及び頭蓋内投与が含まれる。「皮下投与」は、皮膚直下への投与を意味する。
[000459]「機能を改善する」とは、正常パラメータに向かう機能の変化を意味する。ある態様において、機能は、対象の体液に観察される分子を測定することにより評価される。「医薬組成物」とは、医薬品を含み、個体に投与するために適した物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は修飾オリゴヌクレオチド及び滅菌水性溶液を含んでいてもよい。
[000460]「標的核酸」、「標的RNA」、「標的RNA転写体」及び「核酸標的」はすべて、アンチセンス化合物により標的化されることが可能な核酸を意味する。「標的化」とは、標的核酸にハイブリダイズし、そして所望の効果を誘発するであろう核酸塩基配列の設計及び選択のプロセスを意味する。「へ標的化された」とは、標的核酸へのハイブリダイゼーションを可能にして所望の効果を誘発するであろう核酸塩基配列を有していることを意味する。ある態様において、所望の効果は標的核酸の減少である。
[000461]「変調」とは、機能又は活性の摂動を意味する。ある態様において、変調は遺伝子発現の増加を意味する。ある態様において、変調は遺伝子発現の減少を意味する。
[000462]「発現」とは、遺伝子のコードされた情報が、存在する構造体に変換されそして細胞中で作動する、いずれかの機能及び段階を意味する。
[000462]「発現」とは、遺伝子のコードされた情報が、存在する構造体に変換されそして細胞中で作動する、いずれかの機能及び段階を意味する。
[000463]「領域」とは、核酸内の連結されたヌクレオシドの一部を意味する。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、標的核酸の領域と相補的である核酸塩基配列を有する。例えば、あるこうした態様において、修飾オリゴヌクレオチドはmiRNAステムループ配列の領域と相補的である。あるこうした態様において修飾オリゴヌクレオチドはmiRNA配列の領域と100%同一である。
[000464]「セグメント」とは、領域よりも小さな又は副部分を意味する。
[000465]「核酸塩基配列」とは、いかなる糖、連結及び/又は核酸塩基修飾とは無関係に、5’から3’方向における近接核酸塩基の順序を意味する。
[000465]「核酸塩基配列」とは、いかなる糖、連結及び/又は核酸塩基修飾とは無関係に、5’から3’方向における近接核酸塩基の順序を意味する。
[000466]「近接核酸塩基」とは、核酸中のお互いにすぐ隣接した核酸塩基を意味する。
[000467]「核酸塩基相補性」とは、水素結合を介して非共有結合で対となる二つの核酸塩基の能力を意味する。「相補的」とは、第一の核酸塩基配列が、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100又はそれ以上の核酸塩基の領域にわたって、第二の核酸塩基配列の相補体と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%同一又は100%同一であることを意味し、該二つの配列はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。ある態様において、miRNA又はそれらの前駆体と100%相補的である核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの全長にわたってmiRNA又はそれらの前駆体と100%相補的でなくてもよい。
[000467]「核酸塩基相補性」とは、水素結合を介して非共有結合で対となる二つの核酸塩基の能力を意味する。「相補的」とは、第一の核酸塩基配列が、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100又はそれ以上の核酸塩基の領域にわたって、第二の核酸塩基配列の相補体と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%同一又は100%同一であることを意味し、該二つの配列はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。ある態様において、miRNA又はそれらの前駆体と100%相補的である核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの全長にわたってmiRNA又はそれらの前駆体と100%相補的でなくてもよい。
[000468]「相補性」とは、第一の核酸及び第二の核酸間の核酸塩基対形成能力を意味する。「完全長相補性」とは、第一の核酸の各々の核酸塩基が、第二の核酸中の対応する位
置の各々の核酸塩基と対形成することができることを意味する。例えば、ある態様において、各核酸塩基がmiRNA中の核酸塩基に相補性を有する修飾オリゴヌクレオチドは、miRNAに対する完全長相補性を有する。
置の各々の核酸塩基と対形成することができることを意味する。例えば、ある態様において、各核酸塩基がmiRNA中の核酸塩基に相補性を有する修飾オリゴヌクレオチドは、miRNAに対する完全長相補性を有する。
[000469]「パーセント相補的」とは、核酸の長さで割られた、核酸中の相補的核酸塩基の数を意味する。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドのパーセント相補性とは、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基数で割られた、標的核酸と相補的である核酸塩基の数を意味する。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドのパーセント相補性とは、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基の数で割られた、miRNAと相補的である核酸塩基の数を意味する。
[000470]「パーセント結合領域」とは、オリゴヌクレオチド領域との領域相補性のパーセントを意味する。パーセント結合領域は、オリゴヌクレオチドと相補性である標的領域の核酸塩基の数を、標的領域の長さで割ることにより計算される。ある態様において、パーセント結合領域は少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%である。
[000471]「パーセント同一性」とは、第一の核酸中の核酸塩基の総数で割られた、第二の核酸中の対応する位置の核酸塩基と同一である第一の核酸中の核酸塩基の数を意味する。
[000472]本明細書で使用する「実質的に同一」とは、第一と第二の核酸塩基配列が8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100又はそれ以上の核酸塩基の領域にわたって、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%同一又は100%同一であることを意味する。
[000473]「ハイブリダイズする」とは、核酸塩基相補性を介して生じる相補的核酸のアニーリングを意味する。
[000474]「不適正」とは、第二の核酸の対応する位置の核酸塩基と対形成ができない、第一の核酸核酸塩基を意味する。
[000474]「不適正」とは、第二の核酸の対応する位置の核酸塩基と対形成ができない、第一の核酸核酸塩基を意味する。
[000475]「非相補的核酸塩基」とは、水素結合を介して対形成ができない二つの核酸塩基を意味する。
[000476]「同一」とは、同じ核酸塩基配列を有していることを意味する。
[000476]「同一」とは、同じ核酸塩基配列を有していることを意味する。
[000477]「miRNA」又は「miR」とは、コードRNAにハイブリダイズし、そして発現を調節する、18から25の間の核酸塩基長の非コードRNAを意味する。ある態様において、miRNAは酵素ダイサーによるpre−miRNA切断の生成物である。miRNAの例は、miRBaseとして知られているmiRNAデータベース(http://microrna.sanger.ac.uk/)にある。
[000478]「pre−miRNA」又は「pre−miR」とは、miRNAを含むヘアピン構造を有する非コードRNAを意味する。ある態様において、pre−miRNAは、ドローシャとして知られている二本鎖RNA特異的リボヌクレアーゼによるpri−miRの切断の生成物である。
[000479]「ステムループ配列」とは、ヘアピン構造を有し、成熟miRNA配列を含有
するRNAを意味する。pre−miRNA配列及びステムループ配列は、重複することができる。ステムループ配列の例は、miRBaseとして知られているmiRNAデータベース(http://microrna.sanger.ac.uk/)にある。
するRNAを意味する。pre−miRNA配列及びステムループ配列は、重複することができる。ステムループ配列の例は、miRBaseとして知られているmiRNAデータベース(http://microrna.sanger.ac.uk/)にある。
[000480]「miRNA前駆体」とは、ゲノムDNAを起源とし、一つ以上のmiRNA配列を含んでいる非コード、構造化RNAを含む転写体を意味する。例えば、ある態様において、miRNA前駆体はpre−miRNAである。ある態様において、miRNA前駆体はpri−miRNAである。
[000481]「アンチセンス化合物」とは、標的核酸へのハイブリダイゼーションを可能にするであろう核酸塩基配列を有している化合物を意味する。ある態様において、アンチセンス化合物は標的核酸と相補的な核酸塩基配列を有しているオリゴヌクレオチドである。
[000482]「オリゴヌクレオチド」とは、その各々がお互いに独立して修飾され得る又は修飾されていない、連結されたヌクレオシドのポリマーを意味する。「天然に存在するヌクレオシド間連結」とは、ヌクレオシド間の3’−5’ホスホジエステル結合を意味する。「天然核酸塩基」とは、その天然に存在する形態と比較して修飾されていない核酸塩基を意味する。「miRアンタゴニスト」とは、miRNAの活性を妨害する又は阻害するように設計された剤を意味する。ある態様において、miRアンタゴニストは、miRNAを標的とするアンチセンス化合物を含む。ある態様において、miRアンタゴニストは、miRNA又はそれらの前駆体の核酸塩基配列と相補的である核酸塩基配列を有している修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある態様において、miRアンタゴニストは、miRNAの活性を妨害する又は阻害する小分子などを含む。
[000483]本明細書に記載された方法及び試薬は、好ましい態様の代表であり、例であり、本発明の範囲の制限を意図するものではない。それらの中の修正及び他の使用を当業者は思いつくであろう。これらの修正は本発明の精神内に包含され、特許請求の範囲により規定される。本発明の範囲及び精神から離れることなく、置換及び修正を変化させることを本明細書に開示した発明に行うことができることも、当業者には容易に明らかになるであろう。
[000484]本発明を、好ましい態様及び随意の特徴により具体的に開示してきたが、本明細書に開示した概念の修正及び変形を当業者は考えることができ、こうした修正及び変形は付随する請求の範囲に規定した本発明の範囲内であると考えられる。
[000485]本発明を多様な及び好ましい態様を参照して説明してきたが、本発明の本質的範囲から離れることなく、多様な変形を行うことができ、そして均等物でそれらの要素を置換することができることを当業者は理解するであろう。加えて、多くの修正を、その本質的範囲から離れることなく、本発明の教示による特定の状況又は材料に適合させるために行うことができる。
[000486]参照文献
[000380]本発明を明らかにする又は本発明の実行についての追加の詳細を提供するため、本明細書で使用された刊行物及び他の材料が参照文献としてここに取り込まれ、そして都合がよいように下記の文献目録に提供されている。
[000380]本発明を明らかにする又は本発明の実行についての追加の詳細を提供するため、本明細書で使用された刊行物及び他の材料が参照文献としてここに取り込まれ、そして都合がよいように下記の文献目録に提供されている。
[000381]本明細書に列挙したいずれの文書の引用も、いずれの先行文献も適切な先行技術であるとの承認を目的とするものではない。日付に関する全ての記載又はこれらの文書の内容に関する全ての表現は、出願者に入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関する承認を構成するものではない。
実施例IIについての参考文献
Claims (96)
- 対象が前立腺関連障害を有する、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する、前立腺癌関連障害を有する対象の予後を決定する、及び/又は前立腺関連障害を有する対象において前立腺関連障害を治療する方法であって、
該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、
ここで、対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較した、該試験サンプル中の該バイオマーカーのレベルの変化が、該対象が該障害を有するか、又は発症するリスクがあることを示す、前記方法。 - 該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも低い、請求項1に記載の方法。
- 該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも高い請求項1に記載の方法。
- 腫瘍組織及び非腫瘍組織間で差次的に発現される該少なくとも一つのバイオマーカーが、図11−表2に列挙されたmiR又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、前立腺腫瘍において上方調節されている、図11−表2に列挙された一つ以上のmiR:miR−32、miR−182、miR−31、miR−26a−l/2、miR−200c、miR−375、miR−196a−1/2、miR−370、miR−425、miR−194−1/2、miR−181a−l/2、miR−34b、let−7i、miR−188、miR−25、miR−106b、miR−449、miR−99b、miR−93、miR−92−1/2、miR−125a、又はそれらの機能的変異体から選択される、請求項4に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、前立腺腫瘍において下方調節されている、図11−表2に列挙された一つ以上のmiR:miR−520h、miR−494、miR−490、miR−133a−l、miR−1−2、miR−218−2、miR−220、miR−128a、miR−221、miR−499、miR−329、miR−340、miR−345、miR−410、miR−126、miR−205、miR−7−1/2、miR−145、miR−34a、miR−487、let−7b、又はそれらの機能的変異体から選択される、請求項4に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーは、前立腺外疾患に関連し、図12−表3に列挙されたmiR:miR−101−1/2、miR−200a、miR−200b、miR−196a−l/2、miR−30c−l/2、miR−484、miR−99b、miR−186、miR−195、let−7f−2、miR−34c、miR−371、miR−373、miR−410及びmiR−491、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、前立腺腫瘍において、miR−1及び標的遺伝子転写体レベル間で逆相関を示し、図13A−表4Aに列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、図13B−表4Bに列挙されたmiR:miR−1、miR−31、miR−32、miR−128a、miR−133a、miR−18
1a、miR−182、miR−194、miR−196a、miR−200c、miR−218−2、miR−220、miR−329、miR−338、miR−369、miR−409−3p、miR−410、miR−448、miR−490、miR−494、miR−499、miR−520 h、及びlet−7i、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、請求項1に記載の方法。 - 該少なくとも一つのバイオマーカーが、図13B−表4Bに列挙されたmiR:miR−32、miR−282−2、miR490及びmiR−520h、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前立腺腫瘍におけるmiR−181aと負の相関を示しているプローブセットを含み、該プローブセットが図14−表5に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上を含む、前記方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、アンドロゲン応答性バイオマーカーであり、図15−表6に列挙されたmiR:miR−338、miR−126−5p、mir−181b−lクラスター、miR181cクラスター、miR−219−5p及びmiR221クラスター、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、図16−表7に列挙された一つ以上のアンドロゲンレセプター結合部位である、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、前立腺癌において神経周囲の浸潤を伴った腫瘍中で上方調節されており、図23−表9に列挙された、miR:miR−224、miR−21、miR−10(a/b)、miR−125b(−1/2)、miR−30a/b/c−2/d、miR−100、miR−24(−1/2)、miR−15a−2、miR−191、miR−99b、miR−27a/b、miR−26a(−1/2)、miR−126、miR−145、miR−195、miR−181a−l、miR−199b、miR−151、let−7g又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、PNT腫瘍組織及び非PNT腫瘍組織間で差次的に発現され、及び図24−表10に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、請求項1に記載の方法。
- 前立腺腫瘍におけるダイサー及びDGCR8、及び/又は高グリーソンスコアを有する腫瘍におけるダイサー及びアルゴノート−2をコードするEIF2C2の一つ以上の増加した発現を含む、請求項1に記載の方法。
- 該サンプルが血液サンプルを含む、請求項1に記載の方法。
- 該サンプルが血清又は血漿血液サンプルの一つ以上を含む、請求項15に記載の方法。
- バイオマーカーであって、腫瘍組織及び非腫瘍組織間で差次的に発現され、図11−表2に列挙されたmiR又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、前立腺腫瘍において上方調節されている、図11−表2に列挙された一つ以上のmiR:miR−32、miR−182、miR−31、miR−26
a−1/2、miR−200c、miR−375、miR−196a−l/2、miR−370、miR−425、miR−194−1/2、miR−181a−l/2、miR−34b、let−7i、miR−188、miR−25、miR−106b、miR−449、miR−99b、miR−93、miR−92−1/2、miR−125a、又はそれらの機能的変異体から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。 - バイオマーカーであって、前立腺腫瘍において下方調節されている、図11−表2に列挙された一つ以上のmiR:miR−520h、miR−494、miR−490、miR−133a−l、miR−1−2、miR−218−2、miR−220、miR−128a、miR−221、miR−499、miR−329、miR−340、miR−345、miR−410、miR−126、miR−205、miR−7−1/2、miR−145、miR−34a、miR−487、let−7b、又はそれらの機能的変異体から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、前立腺外疾患に関連し、図12−表3に列挙されたmiR:miR−101−1/2、miR−200a、miR−200b、miR−196a−l/2、miR−30c−l/2、miR−484、miR−99b、miR−186、miR−195、let−7f−2、miR−34c、miR−371、miR−373、miR−410及びmiR−491、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、前立腺腫瘍においてmiR−1及び標的遺伝子転写体レベル間で逆相関を示し、図13A−表4Aに列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、図13B−表4Bに列挙されたmiR:miR−1、miR−31、miR−32、miR−128a、miR−133a、miR−181a、miR−182、miR−194、miR−196a、miR−200c、miR−218−2、miR−220、miR−329、miR−338、miR−369、miR−409−3p、miR−410、miR−448、miR−490、miR−494、miR−499、miR−520h、及びlet−7i、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、図13B−表4Bに列挙されたmiR:miR−32、miR−282−2、miR490及びmiR−520h、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、前立腺腫瘍においてmiR−181aと負の相関を示すプローブセットを含み、該プローブセットが、図14−表5に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上を含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、アンドロゲン応答性バイオマーカーであり、図15−表6に列挙されたmiR:miR−338、miR−126−5p、mir−181b−lクラスター、miR181cクラスター、miR−219−5p及びmiR221クラスター、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、図16−表7に列挙された一つ以上のアンドロゲンレセプター結合部位、又はそれらの機能的変異体を含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、図23−表9に列挙された、前立腺癌で神経周囲の浸潤を有する腫瘍において上方調節されているmiR:miR−224、miR−21、miR−10(a/b)、miR−125b(−1/2)、miR−30a/b/c−2/d、miR−100、miR−24(−1/2)、miR−15a−2、miR−191、miR−99b、miR−27a/b、miR−26a(−1/2)、miR−126、miR−145、miR−195、miR−181a−l、miR−199b、miR−151、let−7g、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、PNT腫瘍組織及び非PNT腫瘍組織間で差次的に発現され、図24−表10に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、前立腺腫瘍におけるダイサー及びDGCR8、及び/又は高グリーソンスコアを有する腫瘍におけるダイサー及びアルゴノート−2をコードするEIF2C2;の一つ以上の増加した発現を含む、前記バイオマーカー。
- 前立腺腫瘍における特有のマイクロRNA発現シグネチャーであって、腫瘍マイクロRNAプロセッシングを調節する一つ以上のバイオマーカーの発現の変化を含む、前記マイクロRNA発現シグネチャー。
- 前立腺腫瘍における標的mRNAの転写体存在量及び/又はタンパク質発現に影響を及ぼす方法であって、それを必要とする対象において一つ以上のマイクロRNAを調節解除することを含む、前記方法。
- 癌関連遺伝子のタンパク質発現を抑制することを含む、前記の請求項に記載の方法。
- 癌関連遺伝子のタンパク質発現を阻害するため、miR−32及びmiR−106bの一つ以上の発現を変化させることを含む、前記の請求項に記載の方法。
- ヒト前立腺腫瘍で生じるマイクロRNA機能の変化を同定するための、マイクロRNA及びタンパク質コードRNAの両方の大規模遺伝子発現プロファイリングの使用。
- 前立腺関連障害についての腫瘍遺伝子シグネチャーであって、以下:上方調節されたmiR−32、続いてのmiR−182、miR−31、miR−26a、miR−200c、miR−196a及びmiR−106b−25クラスターの;一つ以上;並びに/又は有意に下方制御されたmiR−520h、miR−494、miR−490及びmiR−l−133aクラスターの一つ以上;を含む、前記腫瘍遺伝子シグネチャー。
- 低誤差で前立腺外疾患進展に関連する腫瘍シグネチャーであって、miR−101を含む、前記腫瘍シグネチャー。
- 該バイオマーカーが、前立腺腫瘍で増加した、前立腺腫瘍における宿主遺伝子発現を含む、請求項1に記載の方法。
- 該バイオマーカーが、上方調節されたC9orf5及びMCM7の一つ以上を含み、その発現が、イントロン性マイクロRNA、それぞれmiR−32及びmiR−106b−25クラスターの発現と相関する、前記の請求項に記載の方法。
- 前立腺癌細胞中のE2F1及び/又はCDKN1A遺伝子を標的とするmiR−106bの使用、及び/又はE2F1及び/又はCDKN1A遺伝子のタンパク質発現を抑制することにおける使用。
- 前立腺癌細胞中のmiR−1の発現を変化させることによる、XP06及びPTK9の一つ以上の調節。
- 哺乳類細胞中の標的とされたmRNAの分解及び/又は蓄積を導く、3’UTR配列へのマイクロRNAの結合の使用。
- マイクロRNA標的遺伝子を予測する、ヒト組織におけるマイクロRNAとmRNA間の逆及び/又は正の相関の使用。
- マイクロRNAによって調節されているmRNAを同定する方法であって、ヒト組織中のマイクロRNA及びmRNA発現の相関分析を行うことを含む、前記方法。
- miR発現アンチセンス阻害剤であって、miR−32及びmiR−106bの一つ以上を含む、前記アンチセンス阻害剤。
- 前立腺障害又は疾患のオンコmiRバイオマーカーであって、miR−1、miR−32、及びmiR−106b−25クラスターの一つ以上を含む、前記オンコmiRバイオマーカー。
- 前立腺癌細胞中のタンパク質発現を調節するための方法であって、前立腺癌細胞中のmiR−1、miR−32、及びmiR−106b−25クラスターの一つ以上の発現を変調することを含む、前記方法。
- 前立腺癌細胞中のエクスポーチン−6及びPTK9の一つ以上の発現を阻止するための組成物であって、miR−1又はそれらの機能的変異体を含む、前記組成物。
- E2F1及びp21/WAFlタンパク質レベルの一つ以上を調節することを、それを必要とする対象において行う方法であって、miR−106b又はそれらの機能的変異体を使用することを含む、前記方法。
- 組成物であって、前立腺癌細胞におけるp21/WAFl及び/又はE2F1タンパク質レベルを、それを必要とする対象において増加させるために有用なアンチセンスmiR−106bを含む、前記組成物。
- 請求項1に記載の方法であって、前立腺癌を有する対象の予後を決定することを含み、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含んでおり、ここで:i)該バイオマーカーは、前立腺癌の予後不良に関連し;そしてii)対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較して、前立腺試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの変化は、予後不良を示す、前記方法。
- 請求項1に記載の方法であって、対象が前立腺癌を有するか、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する方法を含み、(1)対象から得られた試験サンプルからのRNAを逆転写して、標的オリゴデオキシヌクレオチドの組を提供すること;(2)該標的オリゴデオキシヌクレオチドを、miRNA特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて該試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること;及び、(3)該試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイル
と対照サンプルから生成されたハイブリダイゼーションプロファイルを比較することを含み、少なくとも一つのmiRNAのシグナルの変化は、該対象が前立腺癌を有する、又は発症するリスクがあることを示す、前記方法。 - 該少なくとも一つのmiRNAのシグナルが、対照サンプルから発生させたシグナルと比較して下方調節されており、及び/又は該少なくとも一つのmiRNAのシグナルが、対照サンプルから生成されたシグナルと比較して上方調節されている、前記の請求項に記載の方法。
- 表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に列挙された群より選択される少なくとも一つのバイオマーカーのシグナルの変化が、該対象が予後不良の前立腺癌を有する、又は発症するリスクがあることを示す、前記の請求項に記載の方法。
- 対照細胞と比較して、少なくとも一つのバイオマーカーが対象の癌細胞で下方調節又は上方調節されている前立腺癌を有する対象において、前立腺癌を治療する方法であって、(1)該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが下方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、少なくとも一つの単離されたバイオマーカー、又は単離された変異体又はそれらの生物学的に活性な断片の有効量を該対象に投与すること;又は(2)該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが上方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することを含む、前記方法。
- 対象の前立腺癌を治療する方法であって:(1)対照細胞と比較して、前立腺癌細胞中の少なくとも一つのバイオマーカーの量を決定すること;そして(2)(i)もし、該癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも少ないならば、少なくとも一つの単離されたバイオマーカーの有効量を該対象に投与することにより;又は(ii)もし、該癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも多いならば、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することにより、
前立腺癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量を変化させること;を含む、前記方法。 - 少なくとも一つの単離されたバイオマーカー及び薬学的に許容できる担体を含む、前立腺癌を治療するための医薬組成物。
- 該医薬組成物が、対照細胞と比較して前立腺癌細胞中で下方調節されているバイオマーカーに対応する、少なくとも一つの単離されたバイオマーカーをその中に含む、前記の請求項に記載の医薬組成物。
- 該医薬組成物が、少なくとも一つのmiR発現阻害化合物及び薬学的に許容できる担体を含む、前記の請求項に記載の医薬組成物。
- 抗前立腺癌剤を同定する方法であって、細胞に試験剤を与えること、そして前立腺癌細胞中の減少した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照細胞と比較した、該細胞中のバイオマーカーのレベルの増加は、該試験剤が抗前立腺癌剤であることを示す、前記方法。
- 抗前立腺癌剤を同定する方法であって、細胞に試験剤を与えること、そして前立腺癌細胞中の増加した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定する
ことを含み、ここで、対照細胞と比較した、該細胞中のバイオマーカーのレベルの減少は、該試験剤が抗前立腺癌剤であることを示す、前記方法。 - 前立腺癌関連疾患を予防する、診断する及び/又は治療するための療法の有効性を評価する方法であって:i)その有効性が評価されている療法を動物に供すること;そしてii)表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを評価することにより、該疾患を治療する又は予防することについて試験されている治療の有効性のレベルを決定すること;を含む、前記方法。
- 該候補療法剤が、医薬組成物、栄養補助食品組成物及びホメオパシー組成物の一つ以上を含む、前記の請求項に記載の方法。
- 評価されている療法が、ヒト対象での使用のためである、前記の請求項に記載の方法。
- 製品であって:表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前立腺癌関連疾患のためのマーカーに結合する少なくとも一つの捕捉試薬を含む、前記製品。
- 前立腺癌関連疾患を治療する療法剤の候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーの一つ以上の試薬、及び少なくとも一つのバイオマーカーを発現している細胞を含む、前記キット。
- 該バイオマーカーの存在が、少なくとも一つのバイオマーカーと特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む試薬を使用して検出される、前記の請求項に記載のキット。
- 個体における該疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、前立腺癌関連疾患応答シグナル伝達経路を妨害する剤の使用であって、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記使用。
- 前立腺癌関連疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重症度を限定することを、それを必要とする個体で行う方法であって:少なくとも前立腺癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤を該個体に投与することを含んでおり、該剤が、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記方法。
- 個体の前立腺癌関連疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、少なくとも前立腺癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤の使用であって、該剤が、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記使用。
- miR−1、miR−32及びmiR−106bの一つ以上のアンチセンス阻害剤を含む組成物。
- 前立腺障害を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記の請求項の組成物の療法的に有効量を対象に投与することを含む、前記方法。
- 該組成物が予防的に投与される、前記の請求項に記載の方法。
- 該組成物の投与が、該障害の一つ以上の症状の発症を遅延させる、前記の請求項に記載の方法。
- 該ペプチドの投与が、前立腺癌の発生を抑制する、前記の請求項に記載の方法。
- 該ペプチドの投与が、腫瘍増殖を抑制する、前記の請求項に記載の方法。
- 該ペプチドの投与が、感染を阻害する、前記の請求項に記載の方法。
- 生物学的サンプル中の前立腺癌の存在を検出する方法であって:a)前立腺癌を含有すると疑われる生物学的サンプルを、それらのためのマーカーに暴露すること;そしてb)もしあれば、該サンプル中の該マーカーの存在又は不存在を検出すること;を含む、前記方法。
- 該マーカーが検出可能な標識を含む、前記の請求項に記載の方法。
- 該対象からの生物学的サンプル中の該マーカーの量と、正常対象からの対応する生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較することをさらに含む、前記の請求項に記載の方法。
- 異なる時点で対象から複数の生物学的サンプルを集めること、及び各生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較して、時間とともに該対象において該マーカーの量が増加している又は減少しているかどうかを決定することをさらに含む、前記の請求項に記載の方法。
- 対象の前立腺癌を治療する方法であって、前立腺レセプターアゴニストの療法的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
- 該レセプターアゴニストが、miR−l、miR−21及びmiR−106bの一つ以上のアンチセンス阻害剤である、前記の請求項に記載の方法。
- 前立腺癌の治療のための薬剤を製造するための使用であって、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に示したmiR、それらから派生する配列、こうしたmiRの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の内から選択される核酸分子を含む、前記使用。
- 該薬剤が、表2に列挙されたmiR、こうしたmiRから派生する配列、こうしたmiRの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の中から選択される配列を示す核酸分子を含む、前記の請求項に記載の方法。
- 前立腺癌細胞の分化を誘発するために有効な療法剤又は療法剤の組み合わせを同定するためのインビトロの方法であって、i)前立腺腫瘍に由来する細胞を培養すること、ii)該細胞株の培養培地に少なくとも一つの化合物を添加すること、iii)段階(i)及び(ii)間の少なくとも一つのmiRの発現レベルの進展を分析すること、及びiv)段階(i)及び(ii)間のmiRの発現レベルの変化を誘発する化合物又は化合物の組み合わせを同定する;段階を含む、前記方法。
- 段階(iii)が、少なくとも一つのmiRの発現レベルの分析を含む、前記の請求項に記載の方法。
- 段階(iv)が、少なくとも一つのmiRの発現レベルを変調する化合物又は化合物の組
み合わせの同定を含む、前記の請求項に記載の方法。 - 段階(iv)が、少なくとも一つのmiRの発現レベルを減少させる化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む、前記の請求項に記載の方法。
- 該化合物が癌の治療のための療法剤である、前記の請求項に記載の方法。
- 対象からの前立腺組織を分類する方法であって:a)試験細胞集団中の表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に列挙された群より選択される一つ以上の核酸配列の発現を測定すること、ここで、前記試験細胞集団中の少なくとも一つの細胞は、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に列挙された群より選択される一つ以上の核酸配列を発現することができる;b)該核酸配列(単数又は複数)の発現と、前立腺癌分類が既知である少なくとも一つの細胞を含む参照細胞集団中の核酸配列(単数又は複数)の発現を比較すること;及びc)存在するならば、該試験細胞集団及び参照細胞集団中から成る群より選択される一つ以上の核酸配列の発現レベルの相違を同定し、それにより該対象の前立腺癌を分類すること;を含む、前記方法。
- 該参照細胞集団と比較して相違する該試験細胞集団における核酸(単数又は複数)の発現、該試験細胞集団が該参照細胞集団からの細胞とは異なった分類を有することを示す、請求項86に記載の方法。
- 該参照細胞集団と比較して類似する該試験細胞集団における核酸(単数又は複数)の発現パターンが、該試験細胞集団が該参照細胞集団からの細胞と同一の分類を有することを示す、請求項86に記載の方法。
- 該参照細胞集団が、複数の細胞又はデータベースである、請求項86に記載の方法。
- 該参照細胞集団が:正常前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団、良性前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団、及び悪性前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団;から成る群より選択される、前記の請求項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US6751808P | 2008-02-28 | 2008-02-28 | |
US61/067,518 | 2008-02-28 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014131080A Division JP5976726B2 (ja) | 2008-02-28 | 2014-06-26 | 前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロrnaに基づく方法及び組成物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016216492A true JP2016216492A (ja) | 2016-12-22 |
Family
ID=41016728
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010548904A Pending JP2011517283A (ja) | 2008-02-28 | 2009-02-27 | 前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロrnaに基づく方法及び組成物 |
JP2014131080A Expired - Fee Related JP5976726B2 (ja) | 2008-02-28 | 2014-06-26 | 前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロrnaに基づく方法及び組成物 |
JP2016139495A Pending JP2016216492A (ja) | 2008-02-28 | 2016-07-14 | 前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロrnaに基づく方法及び組成物 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010548904A Pending JP2011517283A (ja) | 2008-02-28 | 2009-02-27 | 前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロrnaに基づく方法及び組成物 |
JP2014131080A Expired - Fee Related JP5976726B2 (ja) | 2008-02-28 | 2014-06-26 | 前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロrnaに基づく方法及び組成物 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (7) | US20110054009A1 (ja) |
EP (3) | EP3112477A1 (ja) |
JP (3) | JP2011517283A (ja) |
CN (2) | CN104031984A (ja) |
AU (2) | AU2009219197B2 (ja) |
CA (1) | CA2716938A1 (ja) |
ES (1) | ES2600165T3 (ja) |
WO (1) | WO2009108860A2 (ja) |
Families Citing this family (111)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105902559A (zh) | 2005-08-01 | 2016-08-31 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物 |
EP2586455B1 (en) | 2006-01-05 | 2014-06-25 | The Ohio State University Research Foundation | MicroRNA expressions abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors |
EP2468890B1 (en) | 2006-01-05 | 2014-03-19 | The Ohio State University Research Foundation | MicroRNA-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers of the breast or lung |
CN103993082B (zh) | 2006-01-05 | 2017-01-11 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于肺癌的诊断、预后和治疗的基于微小rna 的方法和组合物 |
EP2369013A1 (en) | 2006-03-20 | 2011-09-28 | The Ohio State University Research Foundation | Micro-RNA fingerprints during human megakaryocytopoiesis |
US8768629B2 (en) | 2009-02-11 | 2014-07-01 | Caris Mpi, Inc. | Molecular profiling of tumors |
IL282783B2 (en) | 2006-05-18 | 2023-09-01 | Caris Mpi Inc | A system and method for determining a personalized medical intervention for a disease stage |
EP2455492B1 (en) | 2006-07-13 | 2013-11-20 | The Ohio State University Research Foundation | Micro-RNA-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of colon related diseases |
ES2374446T3 (es) | 2006-09-19 | 2012-02-16 | The Ohio State University Research Foundation | Expresión de tcl1 en la leucemia linfocítica crónica (llc) regulada por mir-29 y mir-181. |
WO2008054828A2 (en) | 2006-11-01 | 2008-05-08 | The Ohio State University Research Foundation | Microrna expression signature for predicting survival and metastases in hepatocellular carcinoma |
EP2109687B1 (en) | 2007-01-31 | 2014-06-04 | The Ohio State University Research Foundation | Micro-rna-based methods for the treatment of acute myeloid leukemia |
EP2610347B1 (en) * | 2007-04-30 | 2015-04-15 | The Ohio State University Research Foundation | Methods of determining the prognosis of a subject with pancreatic cancer |
AU2008262252B2 (en) | 2007-06-08 | 2013-09-12 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Methods for determining hepatocellular carcinoma subtype and detecting hepatic cancer stem cells |
US8053186B2 (en) | 2007-06-15 | 2011-11-08 | The Ohio State University Research Foundation | Oncogenic ALL-1 fusion proteins for targeting Drosha-mediated microRNA processing |
JP2010535782A (ja) | 2007-07-31 | 2010-11-25 | ズィ、オハイオウ、ステイト、ユーニヴァーサティ、リサーチ、ファウンデイシャン | Dnmt3a及びdnmt3bを標的にすることによるメチル化を元に戻す方法 |
EP2173908B1 (en) | 2007-08-03 | 2016-01-06 | The Ohio State University Research Foundation | Ultraconserved regions encoding ncrnas |
CA2696887C (en) | 2007-08-22 | 2016-06-28 | The Ohio State University Research Foundation | Methods and compositions for inducing deregulation of epha7 and erk phosphorylation in human acute leukemias |
US20100285471A1 (en) * | 2007-10-11 | 2010-11-11 | The Ohio State University Research Foundation | Methods and Compositions for the Diagnosis and Treatment of Esphageal Adenocarcinomas |
AU2008316577B2 (en) | 2007-10-26 | 2014-04-10 | The Ohio State University Research Foundation | Methods for identifying fragile histidine triad (FHIT) interaction and uses thereof |
CA2716906A1 (en) * | 2008-02-28 | 2009-09-03 | The Ohio State University Research Foundation | Microrna-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of gastric cancer |
JP5745401B2 (ja) | 2008-06-11 | 2015-07-08 | アメリカ合衆国 | 肝細胞癌についての予測マーカーとしてのMiR−26ファミリーの使用および療法に対する反応性 |
JP2012507300A (ja) | 2008-10-30 | 2012-03-29 | カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス | Rnaパターンを評価する方法 |
GB2465088C (en) * | 2008-10-30 | 2016-01-27 | Caris Mpi Inc | miRNA expression in the characterisation and classification of cancer |
US8691510B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-04-08 | Sequenta, Inc. | Sequence analysis of complex amplicons |
US8748103B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-06-10 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
US9506119B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-11-29 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of sequence determination using sequence tags |
US9365901B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-06-14 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia |
US9528160B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-12-27 | Adaptive Biotechnolgies Corp. | Rare clonotypes and uses thereof |
US8628927B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-01-14 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
CN104195227B (zh) | 2008-11-07 | 2017-04-12 | 适应生物技术公司 | 通过序列分析监测状况的方法 |
CN107254538A (zh) | 2008-11-12 | 2017-10-17 | 卡里斯生命科学瑞士控股有限责任公司 | 使用外来体来确定表现型的方法和系统 |
US8685898B2 (en) | 2009-01-15 | 2014-04-01 | Imdaptive, Inc. | Adaptive immunity profiling and methods for generation of monoclonal antibodies |
CA2762986C (en) | 2009-05-22 | 2018-03-06 | Asuragen, Inc. | Mirna biomarkers of prostate disease |
CA2765949C (en) | 2009-06-25 | 2016-03-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Method of measuring adaptive immunity |
EP2283846A1 (en) | 2009-08-12 | 2011-02-16 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | miRNA compounds for treatment of prostate carcinoma |
US8822144B2 (en) * | 2009-08-19 | 2014-09-02 | Rosetta Genomics Ltd. | Compositions and methods for prognosis and treatment of prostate cancer |
EP2316972A1 (en) * | 2009-10-29 | 2011-05-04 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Circulating miRNAs as non-invasive markers for diagnosis and staging in prostate cancer |
US9043160B1 (en) | 2009-11-09 | 2015-05-26 | Sequenta, Inc. | Method of determining clonotypes and clonotype profiles |
AU2010321555B2 (en) | 2009-11-23 | 2015-10-15 | The Ohio State University | Materials and methods useful for affecting tumor cell growth, migration and invasion |
US8859287B2 (en) * | 2009-12-02 | 2014-10-14 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for treatment of cancer using tissue-specific oncolytic adenoviruses |
EP2341145A1 (en) * | 2009-12-30 | 2011-07-06 | febit holding GmbH | miRNA fingerprint in the diagnosis of diseases |
JP5808349B2 (ja) | 2010-03-01 | 2015-11-10 | カリス ライフ サイエンシズ スウィッツァーランド ホールディングスゲーエムベーハー | セラノーシスのためのバイオマーカー |
CA2795776A1 (en) | 2010-04-06 | 2011-10-13 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. | Circulating biomarkers for disease |
ES2606146T3 (es) | 2010-11-12 | 2017-03-22 | The Ohio State University Research Foundation | Métodos relacionados con microARN-21 y reparación de desapareamiento en cáncer colorrectal |
CN103313706A (zh) | 2010-11-15 | 2013-09-18 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 控制释放粘膜粘合系统 |
PL237807B1 (pl) * | 2010-12-22 | 2021-05-31 | Wroclawskie Centrum Badan Eit Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia | Sposób różnicowania zmian nowotworowych tarczycy oraz zastosowanie metalotioneiny (MT) do różnicowania zmian nowotworowych tarczycy |
JPWO2012121178A1 (ja) * | 2011-03-04 | 2014-07-17 | 独立行政法人国立がん研究センター | 腫瘍血管形成阻害剤 |
EP2683387A4 (en) | 2011-03-07 | 2014-09-03 | Univ Ohio State | MUTATORY ACTIVITY INDUCED BY INFLAMMATION OF MICROARN-155 (MIR-155) BINDING AND CANCER |
WO2012142313A2 (en) * | 2011-04-12 | 2012-10-18 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Micro-rna inhibitors and their uses in disease |
WO2012174282A2 (en) * | 2011-06-16 | 2012-12-20 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. | Biomarker compositions and methods |
US10385475B2 (en) | 2011-09-12 | 2019-08-20 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Random array sequencing of low-complexity libraries |
WO2013056217A1 (en) | 2011-10-14 | 2013-04-18 | The Ohio State University | Methods and materials related to ovarian cancer |
AU2012325791B2 (en) | 2011-10-21 | 2018-04-05 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
SE536352C2 (sv) * | 2011-10-24 | 2013-09-03 | Chundsell Medicals Ab | Markörgener för klassificiering av prostatacancer |
EP3106168A3 (en) * | 2011-11-30 | 2017-02-22 | Cedars-Sinai Medical Center | Targeting micrornas mir-409-5p, mir-379 and mir-154* to treat prostate cancer bone metastasis and drug resistant lung cancer |
US9745578B2 (en) | 2011-11-30 | 2017-08-29 | Cedars-Sinai Medical Center | Targeting microRNA miR-409-3P to treat prostate cancer |
CN102443638B (zh) * | 2011-12-05 | 2014-04-09 | 南京医科大学 | 一种用于血清/血浆miRNA检测的内参及其应用 |
ES2683037T3 (es) | 2011-12-09 | 2018-09-24 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Diagnóstico de tumores malignos linfoides y detección de enfermedad residual mínima |
JP2015501645A (ja) * | 2011-12-10 | 2015-01-19 | オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション | 肺がんの腫瘍発生および化学療法耐性を低減するために有用なmiRNAならびに関連する組成物および方法 |
JP2015501843A (ja) | 2011-12-13 | 2015-01-19 | オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション | miR−21およびmiR−29a、エキソソーム阻害、およびがん転移に関する方法および組成物 |
US9499865B2 (en) | 2011-12-13 | 2016-11-22 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes |
JP2015511121A (ja) | 2012-01-20 | 2015-04-16 | ジ・オハイオ・ステート・ユニバーシティ | 浸潤性および予後に関する乳がんバイオマーカーシグネチャー |
US10077478B2 (en) | 2012-03-05 | 2018-09-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits |
SG10201507700VA (en) | 2012-05-08 | 2015-10-29 | Adaptive Biotechnologies Corp | Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed pcr reactions |
GB2505237A (en) * | 2012-08-24 | 2014-02-26 | Stefan Grimm | Method of screening for therapeutic agents using cell lines including a reference cell line |
AU2013317818A1 (en) * | 2012-09-23 | 2015-04-09 | The Ohio State University | Use of miR-494 to modulate trail-induced apoptosis through BIM down-regulation |
AU2013327423B2 (en) | 2012-10-01 | 2017-06-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization |
US10150996B2 (en) | 2012-10-19 | 2018-12-11 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
CN109852695B (zh) * | 2013-03-15 | 2023-11-21 | 得克萨斯州大学系统董事会 | 用于诊断和疗法的外来体中的miRNA生物发生 |
CN103215359A (zh) * | 2013-04-11 | 2013-07-24 | 百瑞德(南京)生物科技有限公司 | 一种前列腺癌生物标志物miR-21*、诊断试剂盒及应用 |
WO2014172376A2 (en) * | 2013-04-15 | 2014-10-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Markers of tumor cell response to anti-cancer therapy |
US9708657B2 (en) | 2013-07-01 | 2017-07-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method for generating clonotype profiles using sequence tags |
US20160237505A1 (en) * | 2013-10-15 | 2016-08-18 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Serum mirnas for the prognosis of prostate cancer |
ES2741740T3 (es) | 2014-03-05 | 2020-02-12 | Adaptive Biotechnologies Corp | Métodos que usan moléculas sintéticas que contienen segmentos de nucleótidos aleatorios |
US10066265B2 (en) | 2014-04-01 | 2018-09-04 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific t-cells |
KR20170007317A (ko) * | 2014-05-01 | 2017-01-18 | 스티칭 브이유엠씨 | 바이오마커로서의 소형 ncrna |
US10619213B2 (en) | 2014-06-12 | 2020-04-14 | Toray Industries, Inc. | Prostate cancer detection kit or device, and detection method |
CN104138603A (zh) * | 2014-07-02 | 2014-11-12 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 应用microRNA-7抑制前列腺肿瘤生长及其肿瘤进程 |
CN104278100B (zh) * | 2014-10-16 | 2016-02-10 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | miRNA-188作为标记分子在制备诊断试剂中的用途 |
ES2784343T3 (es) | 2014-10-29 | 2020-09-24 | Adaptive Biotechnologies Corp | Detección simultánea altamente multiplexada de ácidos nucleicos que codifican heterodímeros de receptores inmunes adaptativos emparejados de muchas muestras |
US10246701B2 (en) | 2014-11-14 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture |
CA2968543C (en) | 2014-11-25 | 2024-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing |
CN104651492B (zh) * | 2015-01-06 | 2017-10-03 | 中国人民解放军第二军医大学 | miRNA410‑在制备前列腺癌诊断试剂盒中的应用 |
WO2016119113A1 (zh) * | 2015-01-26 | 2016-08-04 | 中国科学院动物研究所 | miRNA对m6A修饰水平的调控方法及其应用 |
WO2016138122A1 (en) | 2015-02-24 | 2016-09-01 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Methods for diagnosing infectious disease and determining hla status using immune repertoire sequencing |
EP3277294B1 (en) | 2015-04-01 | 2024-05-15 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target |
CN104894251A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-09-09 | 基因科技(上海)有限公司 | 一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法 |
MA45481A (fr) | 2015-06-10 | 2018-04-18 | Univ Texas | Utilisation d'exosomes pour le traitement de maladies |
CN105056250B (zh) * | 2015-07-15 | 2018-01-05 | 中国农业大学 | 一种microRNA在制备治疗前列腺癌的药物中的应用 |
EP3359689B1 (en) * | 2015-10-08 | 2021-04-14 | Decipher Biosciences, Inc. | Use of a genetic signature diagnostically to evaluate treatment strategies for prostate cancer |
CN106636310B (zh) * | 2015-10-30 | 2020-06-02 | 益善生物技术股份有限公司 | 前列腺癌相关microRNA检测试剂盒 |
CN105243293B (zh) * | 2015-11-06 | 2019-04-19 | 吴志宏 | 前列腺相关癌基因信息收集及分析系统和方法 |
EP3484348A4 (en) * | 2016-07-13 | 2021-11-24 | Psomagen, Inc. | MICROBIAL PHARMACOGENOMICS PROCESS AND SYSTEM |
EP3504348B1 (en) | 2016-08-24 | 2022-12-14 | Decipher Biosciences, Inc. | Use of genomic signatures to predict responsiveness of patients with prostate cancer to post-operative radiation therapy |
US10428325B1 (en) | 2016-09-21 | 2019-10-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Identification of antigen-specific B cell receptors |
US11236337B2 (en) | 2016-11-01 | 2022-02-01 | The Research Foundation For The State University Of New York | 5-halouracil-modified microRNAs and their use in the treatment of cancer |
CN110290794A (zh) | 2016-11-01 | 2019-09-27 | 纽约州州立大学研究基金会 | 5-卤代尿嘧啶修饰的微rna及其在癌症治疗中的用途 |
US11873532B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-01-16 | Decipher Biosciences, Inc. | Subtyping prostate cancer to predict response to hormone therapy |
BR112019015244A2 (pt) | 2017-03-24 | 2020-04-14 | Curevac Ag | ácidos nucleicos codificando proteínas associadas a crispr e usos dos mesmos |
CN109593835B (zh) * | 2017-09-29 | 2023-12-12 | 深圳华大基因股份有限公司 | 用于微量ffpe rna样本评估的方法、试剂盒及应用 |
WO2019094780A2 (en) * | 2017-11-12 | 2019-05-16 | The Regents Of The University Of California | Non-coding rna for detection of cancer |
US11254980B1 (en) | 2017-11-29 | 2022-02-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements |
CN108018354A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-05-11 | 贵州医科大学 | MicroRNA-34在抑制前列腺癌转移治疗中的新用途 |
EP3835434A4 (en) | 2018-08-10 | 2022-06-08 | Toray Industries, Inc. | PROSTATE CANCER DETECTION KIT, DEVICE AND METHOD |
EP3946470A4 (en) * | 2019-04-05 | 2023-05-31 | Earli Inc. | IMPROVED METHODS AND COMPOSITIONS FOR SYNTHETIC BIOMARKERS |
CN111249552B (zh) * | 2020-03-16 | 2020-11-17 | 南京鼓楼医院 | 基于人iPSCs诱导类肝细胞及多层多孔生物反应器的生物人工肝 |
CN112094910B (zh) * | 2020-09-25 | 2023-03-24 | 无锡市中医医院 | 一种用于前列腺癌患病风险评估的miRNA标志物 |
CN114272378B (zh) * | 2020-09-27 | 2023-06-23 | 四川大学华西医院 | 一种使cttnbp2nl功能缺失的试剂在制备治疗疾病的药物中的用途 |
WO2022209943A1 (ja) * | 2021-03-29 | 2022-10-06 | 東レ株式会社 | 生体試料中のマイクロrnaの検出方法、中性アミノ酸の塩酸塩の組成物および容器 |
CN114540496A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-05-27 | 东南大学 | miR-7在制备/筛选前列腺癌诊治产品中的应用 |
WO2024097892A1 (en) * | 2022-11-03 | 2024-05-10 | Mirimus, Inc. | Regulation of artificial mirnas by endogenous tissue-specific mirnas and methods of using the same |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006133022A2 (en) * | 2005-06-03 | 2006-12-14 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for decreasing microrna expression for the treatment of neoplasia |
WO2007081680A2 (en) * | 2006-01-05 | 2007-07-19 | The Ohio State University Research Foundation | Microrna expression abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors |
WO2007081740A2 (en) * | 2006-01-05 | 2007-07-19 | The Ohio State University Research Foundation | Micrornarna-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers |
WO2007140352A2 (en) * | 2006-05-26 | 2007-12-06 | Invitrogen Corporation | Plasma membrane and secreted cancer biomarkers |
WO2007147067A2 (en) * | 2006-06-14 | 2007-12-21 | Rosetta Inpharmatics Llc | Methods and compositions for regulating cell cycle progression |
Family Cites Families (86)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4196265A (en) * | 1977-06-15 | 1980-04-01 | The Wistar Institute | Method of producing antibodies |
US4608337A (en) * | 1980-11-07 | 1986-08-26 | The Wistar Institute | Human hybridomas and the production of human monoclonal antibodies by human hybridomas |
US5015568A (en) * | 1986-07-09 | 1991-05-14 | The Wistar Institute | Diagnostic methods for detecting lymphomas in humans |
US5202429A (en) * | 1986-07-09 | 1993-04-13 | The Wistar Institute | DNA molecules having human BCL-2 gene sequences |
US5198338A (en) * | 1989-05-31 | 1993-03-30 | Temple University | Molecular probing for human t-cell leukemia and lymphoma |
WO1993012136A1 (en) * | 1991-12-11 | 1993-06-24 | Thomas Jefferson University | Detection and treatment of acute leukemias resulting from chromosome abnormalities in the all-1 region |
US5633135A (en) * | 1991-12-11 | 1997-05-27 | Thomas Jefferson University | Chimeric nucleic acids and proteins resulting from ALL-1 region chromosome abnormalities |
US6040140A (en) * | 1991-12-11 | 2000-03-21 | Thomas Jefferson University | Methods for screening and treating leukemias resulting from all-1 region chromosome abnormalities |
DK0667920T3 (da) * | 1992-10-29 | 2003-04-14 | Univ Jefferson | Fremgangsmåder til påvisning af prostatacancermetastase |
US5674682A (en) * | 1992-10-29 | 1997-10-07 | Thomas Jefferson University | Nucleic acid primers for detecting micrometastasis of prostate cancer |
US5985598A (en) * | 1994-10-27 | 1999-11-16 | Thomas Jefferson University | TCL-1 gene and protein and related methods and compositions |
US7175995B1 (en) * | 1994-10-27 | 2007-02-13 | Thomas Jefferson University | TCL-1 protein and related methods |
US5928884A (en) * | 1996-02-09 | 1999-07-27 | Croce; Carlo M. | FHIT proteins and nucleic acids and methods based thereon |
US6242212B1 (en) * | 1996-02-09 | 2001-06-05 | Thomas Jefferson University | Fragile histidine triad (FHIT) nucleic acids and methods of producing FHIT proteins |
AU6659298A (en) * | 1997-02-18 | 1998-09-08 | Thomas Jefferson University | Compositions that bind to pancreatic cancer cells and methods of using the same |
EP0972083A1 (en) * | 1997-04-04 | 2000-01-19 | THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM | Noninvasive detection of colonic biomarkers using fecal messenger rna |
US6303323B1 (en) * | 1997-10-21 | 2001-10-16 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Detection of dysplastic or neoplastic cells using anti-MCM5 antibodies |
EP1098968A4 (en) * | 1998-07-20 | 2002-01-02 | Univ Jefferson | NITRILASE APPROVALS |
US6255293B1 (en) * | 1998-07-24 | 2001-07-03 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Prevention of metastasis with 5-aza-2′-deoxycytidine |
US7141417B1 (en) * | 1999-02-25 | 2006-11-28 | Thomas Jefferson University | Compositions, kits, and methods relating to the human FEZ1 gene, a novel tumor suppressor gene |
US6924414B2 (en) * | 2000-04-11 | 2005-08-02 | Thomas Jefferson University | Muir-torre-like syndrome in Fhit deficient mice |
WO2001087958A2 (en) * | 2000-05-16 | 2001-11-22 | Thomas Jefferson University | CRYSTAL STRUCTURE OF WORM NitFhit REVEALS THAT A Nit TETRAMER BINDS TWO Fhit DIMERS |
US7060811B2 (en) * | 2000-10-13 | 2006-06-13 | Board Of Regents, The University Of Texas System | WWOX: a tumor suppressor gene mutated in multiple cancers |
US20040033502A1 (en) * | 2001-03-28 | 2004-02-19 | Amanda Williams | Gene expression profiles in esophageal tissue |
EP2428568B1 (en) * | 2001-09-28 | 2018-04-25 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Microrna molecules |
US7371736B2 (en) * | 2001-11-07 | 2008-05-13 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Gene expression profiling based identification of DKK1 as a potential therapeutic targets for controlling bone loss |
GB0128898D0 (en) * | 2001-12-03 | 2002-01-23 | Biotech Res Ventures Pte Ltd | Materials and methods relating to the stabilization and activation of a tumour suppressor protein |
EP1496928A4 (en) * | 2002-04-08 | 2005-08-10 | Ciphergen Biosystems Inc | SERUM BIOMARKERS IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA |
CA2484920A1 (en) * | 2002-04-29 | 2003-11-13 | Thomas Jefferson University | Human chronic lymphocytic leukemia modeled in mouse by targeted tcl1 expression |
WO2003102215A2 (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods of identifying and isolating stem cells and cancer stem cells |
WO2004033659A2 (en) * | 2002-10-11 | 2004-04-22 | Thomas Jefferson University | Novel tumor suppressor gene and compositions and methods for making and using the same |
AU2003291433B2 (en) * | 2002-11-13 | 2008-05-22 | Thomas Jefferson University | Compositions and methods for cancer diagnosis and therapy |
WO2004071464A2 (en) * | 2003-02-12 | 2004-08-26 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Diagnostic application of differentially-expressed genes in lympho-hematopoietic stem cells |
US20050069918A1 (en) * | 2003-05-29 | 2005-03-31 | Francois Claret | JAB1 as a prognostic marker and a therapeutic target for human cancer |
US8106180B2 (en) * | 2003-08-07 | 2012-01-31 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods and products for expression of micro RNAs |
US20050037362A1 (en) * | 2003-08-11 | 2005-02-17 | Eppendorf Array Technologies, S.A. | Detection and quantification of siRNA on microarrays |
US20070054849A1 (en) * | 2003-09-24 | 2007-03-08 | Oncotherapy Science, Inc. | Method for diagnosing hepatocellular carcinomas |
EP2299266A1 (en) * | 2003-12-19 | 2011-03-23 | The Regents of the University of California | Methods and materials for assessing prostate cancer therapies |
WO2005078139A2 (en) * | 2004-02-09 | 2005-08-25 | Thomas Jefferson University | DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCERS WITH MicroRNA LOCATED IN OR NEAR CANCER-ASSOCIATED CHROMOSOMAL FEATURES |
CA2566519C (en) * | 2004-05-14 | 2020-04-21 | Rosetta Genomics Ltd. | Micrornas and uses thereof |
EP2471924A1 (en) * | 2004-05-28 | 2012-07-04 | Asuragen, INC. | Methods and compositions involving microRNA |
US7635563B2 (en) * | 2004-06-30 | 2009-12-22 | Massachusetts Institute Of Technology | High throughput methods relating to microRNA expression analysis |
US20060037088A1 (en) * | 2004-08-13 | 2006-02-16 | Shulin Li | Gene expression levels as predictors of chemoradiation response of cancer |
US7642348B2 (en) * | 2004-10-04 | 2010-01-05 | Rosetta Genomics Ltd | Prostate cancer-related nucleic acids |
FR2877350B1 (fr) * | 2004-11-03 | 2010-08-27 | Centre Nat Rech Scient | IDENTIFICATION ET UTILISATION DE miRNAs IMPLIQUES DANS LA DIFFERENCIATION DE CELLULES ISSUES D'UNE LEUCEMIE MYELOIDE |
CA2850323A1 (en) * | 2004-11-12 | 2006-12-28 | Asuragen, Inc. | Methods and compositions involving mirna and mirna inhibitor molecules |
JP2008523157A (ja) * | 2004-12-14 | 2008-07-03 | アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | MLL−AF4のRNAi調節およびその使用方法 |
WO2006069584A2 (en) * | 2004-12-29 | 2006-07-06 | Exiqon A/S | NOVEL OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND PROBE SEQUENCES USEFUL FOR DETECTION AND ANALYSIS OF microRNAs AND THEIR TARGET mRNAs |
JP2008528003A (ja) * | 2005-01-25 | 2008-07-31 | ロゼッタ インファーマティックス エルエルシー | 小rna分子の定量方法 |
US20070065840A1 (en) * | 2005-03-23 | 2007-03-22 | Irena Naguibneva | Novel oligonucleotide compositions and probe sequences useful for detection and analysis of microRNAS and their target mRNAS |
US20070065844A1 (en) * | 2005-06-08 | 2007-03-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Solution-based methods for RNA expression profiling |
WO2007021896A2 (en) * | 2005-08-10 | 2007-02-22 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro rna and uses thereof |
CN101296702B (zh) * | 2005-09-12 | 2012-11-28 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于诊断或治疗bcl2相关癌症的组合物和方法 |
US7390792B2 (en) * | 2005-12-15 | 2008-06-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | MicroRNA1 therapies |
EP2023944A4 (en) * | 2006-04-24 | 2011-10-05 | Univ Ohio State Res Found | PRE-B CELL PROLIEFERATION AND LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA / HIGH GRADE LYMPHOMA IN MIR155 TRANSGENIC MICE |
JPWO2007126150A1 (ja) * | 2006-04-27 | 2009-09-17 | 国立大学法人名古屋大学 | 癌の新規治療用組成物 |
WO2008036741A2 (en) * | 2006-09-19 | 2008-03-27 | Asuragen, Inc. | Mir-200 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
EP2145001A2 (en) * | 2006-09-19 | 2010-01-20 | Asuragen, Inc. | Mir-15, mir-26, mir -31,mir -145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216 mir-331, mmu-mir-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
CA2664383C (en) * | 2006-09-19 | 2017-08-22 | Asuragen, Inc. | Micrornas differentially expressed in pancreatic diseases and uses thereof |
ES2374446T3 (es) * | 2006-09-19 | 2012-02-16 | The Ohio State University Research Foundation | Expresión de tcl1 en la leucemia linfocítica crónica (llc) regulada por mir-29 y mir-181. |
WO2008054828A2 (en) * | 2006-11-01 | 2008-05-08 | The Ohio State University Research Foundation | Microrna expression signature for predicting survival and metastases in hepatocellular carcinoma |
US8293684B2 (en) * | 2006-11-29 | 2012-10-23 | Exiqon | Locked nucleic acid reagents for labelling nucleic acids |
WO2008070082A2 (en) * | 2006-12-04 | 2008-06-12 | The Johns Hopkins University | Stem-progenitor cell specific micro-ribonucleic acids and uses thereof |
EP2104734A2 (en) * | 2006-12-08 | 2009-09-30 | Asuragen, INC. | Mir-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
AU2007333109A1 (en) * | 2006-12-08 | 2008-06-19 | Asuragen, Inc. | Functions and targets of let-7 micro RNAs |
AU2007333107A1 (en) * | 2006-12-08 | 2008-06-19 | Asuragen, Inc. | miR-21 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
CN101622348A (zh) * | 2006-12-08 | 2010-01-06 | 奥斯瑞根公司 | 作为治疗性干预靶标的miR-20调节的基因和途径 |
CA2671270A1 (en) * | 2006-12-29 | 2008-07-17 | Asuragen, Inc. | Mir-16 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
EP1944609A1 (en) * | 2007-01-10 | 2008-07-16 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | In vitro method for diagnosing prostate cancer |
EP2109687B1 (en) * | 2007-01-31 | 2014-06-04 | The Ohio State University Research Foundation | Micro-rna-based methods for the treatment of acute myeloid leukemia |
WO2008112283A2 (en) * | 2007-03-12 | 2008-09-18 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Microrna profiling of androgen responsiveness for predicting the appropriate prostate cancer treatment |
EP2610347B1 (en) * | 2007-04-30 | 2015-04-15 | The Ohio State University Research Foundation | Methods of determining the prognosis of a subject with pancreatic cancer |
US20090005336A1 (en) * | 2007-05-08 | 2009-01-01 | Zhiguo Wang | Use of the microRNA miR-1 for the treatment, prevention, and diagnosis of cardiac conditions |
US20090131354A1 (en) * | 2007-05-22 | 2009-05-21 | Bader Andreas G | miR-126 REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION |
US20090099034A1 (en) * | 2007-06-07 | 2009-04-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Reagents and Methods for miRNA Expression Analysis and Identification of Cancer Biomarkers |
US8053186B2 (en) * | 2007-06-15 | 2011-11-08 | The Ohio State University Research Foundation | Oncogenic ALL-1 fusion proteins for targeting Drosha-mediated microRNA processing |
WO2009015071A1 (en) * | 2007-07-23 | 2009-01-29 | Dharmacon, Inc. | Screening of micro-rna cluster inhibitor pools |
EP2173908B1 (en) * | 2007-08-03 | 2016-01-06 | The Ohio State University Research Foundation | Ultraconserved regions encoding ncrnas |
US20090061424A1 (en) * | 2007-08-30 | 2009-03-05 | Sigma-Aldrich Company | Universal ligation array for analyzing gene expression or genomic variations |
US8440637B2 (en) * | 2007-10-04 | 2013-05-14 | Santaris Pharma A/S | Combination treatment for the treatment of hepatitis C virus infection |
US20090123933A1 (en) * | 2007-11-12 | 2009-05-14 | Wake Forest University Health Sciences | Microrna biomarkers in lupus |
US8071562B2 (en) * | 2007-12-01 | 2011-12-06 | Mirna Therapeutics, Inc. | MiR-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
WO2009086156A2 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-09 | Asuragen, Inc. | Mir-10 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
ES2936256T3 (es) * | 2008-02-01 | 2023-03-15 | Massachusetts Gen Hospital | Uso de microvesículas en el diagnóstico, y pronóstico de enfermedades y afecciones médicas |
CN107254538A (zh) * | 2008-11-12 | 2017-10-17 | 卡里斯生命科学瑞士控股有限责任公司 | 使用外来体来确定表现型的方法和系统 |
WO2010056993A2 (en) * | 2008-11-14 | 2010-05-20 | Emory University | Prostate cancer biomarkers to predict recurrence and metastatic potential |
-
2009
- 2009-02-27 US US12/919,888 patent/US20110054009A1/en not_active Abandoned
- 2009-02-27 AU AU2009219197A patent/AU2009219197B2/en not_active Ceased
- 2009-02-27 ES ES14170625.9T patent/ES2600165T3/es active Active
- 2009-02-27 CA CA2716938A patent/CA2716938A1/en not_active Abandoned
- 2009-02-27 CN CN201410133658.XA patent/CN104031984A/zh active Pending
- 2009-02-27 EP EP16175539.2A patent/EP3112477A1/en not_active Withdrawn
- 2009-02-27 WO PCT/US2009/035470 patent/WO2009108860A2/en active Application Filing
- 2009-02-27 EP EP14170625.9A patent/EP2799557B1/en not_active Not-in-force
- 2009-02-27 CN CN200980111708.1A patent/CN102027129B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2009-02-27 JP JP2010548904A patent/JP2011517283A/ja active Pending
- 2009-02-27 EP EP09715064A patent/EP2260109A4/en not_active Withdrawn
-
2012
- 2012-09-19 US US13/622,487 patent/US20130085077A1/en not_active Abandoned
-
2014
- 2014-05-20 AU AU2014202735A patent/AU2014202735B2/en not_active Ceased
- 2014-06-26 JP JP2014131080A patent/JP5976726B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-03-07 US US15/062,407 patent/US20160177311A1/en not_active Abandoned
- 2016-03-07 US US15/062,404 patent/US20160186184A1/en not_active Abandoned
- 2016-03-07 US US15/062,414 patent/US20160177316A1/en not_active Abandoned
- 2016-03-07 US US15/062,411 patent/US20160177312A1/en not_active Abandoned
- 2016-07-14 JP JP2016139495A patent/JP2016216492A/ja active Pending
-
2017
- 2017-04-06 US US15/480,753 patent/US20170211066A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006133022A2 (en) * | 2005-06-03 | 2006-12-14 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods for decreasing microrna expression for the treatment of neoplasia |
WO2007081680A2 (en) * | 2006-01-05 | 2007-07-19 | The Ohio State University Research Foundation | Microrna expression abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors |
WO2007081740A2 (en) * | 2006-01-05 | 2007-07-19 | The Ohio State University Research Foundation | Micrornarna-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers |
WO2007140352A2 (en) * | 2006-05-26 | 2007-12-06 | Invitrogen Corporation | Plasma membrane and secreted cancer biomarkers |
WO2007147067A2 (en) * | 2006-06-14 | 2007-12-21 | Rosetta Inpharmatics Llc | Methods and compositions for regulating cell cycle progression |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MOL CELL BIOL., vol. 28, no. 7, JPN6017020910, April 2008 (2008-04-01), pages 2167 - 2174 * |
ONCOGENE, vol. vol.25, JPN6017020907, 2006, pages 1090 - 1098 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2009108860A3 (en) | 2010-01-14 |
CN102027129A (zh) | 2011-04-20 |
WO2009108860A2 (en) | 2009-09-03 |
AU2014202735B2 (en) | 2015-09-10 |
US20160177316A1 (en) | 2016-06-23 |
JP5976726B2 (ja) | 2016-08-24 |
EP2260109A4 (en) | 2011-06-08 |
AU2009219197B2 (en) | 2014-04-10 |
EP2799557A1 (en) | 2014-11-05 |
CN104031984A (zh) | 2014-09-10 |
CA2716938A1 (en) | 2009-09-03 |
CN102027129B (zh) | 2014-03-12 |
ES2600165T3 (es) | 2017-02-07 |
JP2011517283A (ja) | 2011-06-02 |
US20170211066A1 (en) | 2017-07-27 |
EP2799557B1 (en) | 2016-09-07 |
AU2014202735A1 (en) | 2014-06-12 |
US20160177312A1 (en) | 2016-06-23 |
JP2014221786A (ja) | 2014-11-27 |
WO2009108860A8 (en) | 2011-01-27 |
US20130085077A1 (en) | 2013-04-04 |
US20160177311A1 (en) | 2016-06-23 |
EP3112477A1 (en) | 2017-01-04 |
AU2009219197A1 (en) | 2009-09-03 |
US20110054009A1 (en) | 2011-03-03 |
US20160186184A1 (en) | 2016-06-30 |
EP2260109A2 (en) | 2010-12-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5976726B2 (ja) | 前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロrnaに基づく方法及び組成物 | |
EP2257647B1 (en) | Micro rna-based methods and compositions for the diagnosis of gastric cancer | |
US9499869B2 (en) | MicroRNA-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of ovarian cancer using a real-time PCR platform | |
JP5778708B2 (ja) | 結腸癌関連疾患の診断及び治療のためのマイクロrnaに基づいた方法及び組成物 | |
AU2009219203B2 (en) | MicroRNA signatures associated with cytogenetics and prognosis in acute myeloid leukemia (AML) and uses thereof | |
JP2010535782A (ja) | Dnmt3a及びdnmt3bを標的にすることによるメチル化を元に戻す方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170608 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20171227 |