JP2016520803A - 診断及び治療のためのエクソソームにおけるmiRNAバイオジェネシス - Google Patents
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Abstract
Description
幾つかの報告により、エクソソーム中に含まれるmiRNAが標的細胞内での遺伝子発現に影響を及ぼし得ることが示唆されたが(Ismail et al., 2013; Kogure et al., 2011; Kosaka et al., 2013; Narayanan et al., 2013; Pegtel et al., 2010; Valadi et al., 2007; Zhang et al., 2010)、これらのmiRNAが適切なmRNA認識及び効率的翻訳停止のためにpre−miRNAとしてRISCに組み込まれない場合、mRNAをサイレンシングする際にこれらmiRNAがどれほど効率的であるか、という疑問が依然として残る。成熟miRNA(一本鎖)は、標的細胞のRISCと会合できないが、エクソソームのpre−miRNAは、標的細胞のRISCタンパク質を組み入れることにより遺伝子サイレンシングをある程度は誘導し得る。それにもかかわらず、そのようなプロセスは、標的細胞のmiRNAバイオジェネシス経路に関与するタンパク質の潜在的飽和状態により、非常に非効率的で緩やかである。近年の報告から、HIV−1感染細胞の細胞培養上清及びHIV患者の血清のエクソソーム中のドローシャ及びダイサーの存在が示された(Narayanan et al., 2013)。加えて、別の研究で、後期エンドソーム/MVB(多小胞体)内のダイサー、TRBP及びAGO2の共画分(co−fractionation)が示された(Shen et al., 2013)。
腫瘍は、癌細胞及び間質成分を含む(Tse and Kalluri, 2011)。腫瘍細胞と周囲組織とのコミュニケーションもまた癌の全身拡大の速度及び強度を決定づけることが、近年のエビデンスから示唆される(Luga et al., 2012)。原発性腫瘍が、癌細胞分泌因子を介して、その後に転移を起こす続発性腫瘍部位を養成及び準備する可能性が、幾つかの試験から示唆された(Hood et al., 2011; Peinado et al., 2012)。可溶性増殖因子、グルコース代謝産物、ケモカイン、酵素、マイクロ粒子、マイクロ小胞体、エクソソーム及び遊離核酸をはじめとする、複数のそのような仲介物質が同定された(Guermonprez et al., 2002; Luga et al., 2012; Peinado et al., 2012; Simons and Raposo, 2009; Thery and Casas, 2002)。
当該技術分野で周知の様々な技術により、バイオマーカ又は遺伝子の発現を測定することができる。バイオマーカのメッセンジャーRNA(mRNA)のレベルを定量することを利用して、バイオマーカの発現を測定してもよい。あるいはバイオマーカのタンパク質生成物レベルを定量することを利用して、バイオマーカの発現を測定してもよい。以下に議論する方法に関連するさらなる情報は、Ausubel et al. (2003)又はSambrook et al. (1989)に見出すことができる。パラメータを操作して該当するmRNA又はタンパク質の検出を最適化し得ることは、当業者に公知であろう。
本明細書で用いられる「生物学的試料を得ること」又は「血液試料を得ること」は、例えば直接的又は間接的のいずれかで、生物学的試料又は血液試料を受け取ることを指す。例えば幾つかの実施液体において、血液試料又は末梢血単核細胞(PBMC)を含む試料などの生物学的試料は、生物学的試料を分析する実験室又は場所で、又はその付近で対象から直接得られる。他の実施形態において、生物学的試料は、第三団体により引き出され、又は採取され、その後、例えば分析用の別の物体又は場所に輸送されてもよい。別の実施形態において、試料は、ポイント・オブ・ケア試験を利用して、同じ場所で採取し、テストしてもよい。これらの実施形態において、前記採取は、例えば患者から、実験室から、診療所から、郵便物から、裁判所から、又は郵便局から、などにより試料を受け取ることを指す。幾つかのさらなる態様において、該方法は、対象に、保険者、担当医師、薬剤師、薬剤給付管理者、又は決定が該当し得る任意の人に、決定を報告することをさらに含み得る。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例で開示された技術が本発明の実践において十分に機能するために本発明者により発見された技術を表し、つまり実践に好ましい様式を構成すると判断され得ることは、当業者に認識されるはずである。しかし当業者は、本開示に照らせば、多くの変更を開示された特定の実施形態に施すことができ、それでも尚、本発明の主旨及び範囲を逸脱することなく類似又は同様の結果を得ることができることを認識するはずである。
エクソソームの単離及び精製。エクソソームを過去に記載された分画遠心法により精製した(Thery et al., 2006; Luga et al., 2012)。手短に言えば、24h培養された細胞から得た上清を、800g及び2000gの連続遠心分離ステップに供して、培養瓶内で0.2μmフィルターを用いて上清をろ過した。エクソソームを、SW40Tiスイングバケットロータ(ベックマン)内で100,000gで2時間、ペレット化した。上清を廃棄して、1時間の洗浄ステップのためにPBSを添加した。ペレットをエクソソームについて分析した。RNA抽出用のエクソソームは、トリゾール500μlに再懸濁させ、タンパク質抽出用のエクソソームは、溶解緩衝液(8M尿素/2.5%SDS、5μg/mlロイペプチン、1μg/mlペプスタチン及び1mMフッ化フェニルメチルスルホニル)250μlに再懸濁させ、処置用のエクソソームは、PBSに再懸濁させた。凍結させた血清試料を氷上で解凍し、500μlをPBS 12mLに添加して、前述と同じ手順に従った。遠心分離により精製されたエクソソームを、RNase不含水に溶解された500g/mLプロテイナーゼK(シグマ−アルドリッチ)で処置し(37℃、60分間)、その後、該プロテアーゼを熱失活させて(60℃、10分間)、2g/mLプロテアーゼ不含RNaseA(シグマ−アルドリッチ)と共にインキュベートして(37℃、15分間)、10倍濃縮されたRNase阻害剤(アンビオン)を添加した。エクソソーム処置については、エクソソームを2本ずつ精製し、一方のペレットをタンパク質精製に用いた。
エクソソームの単離及び同定。癌細胞(MDA−MB231トリプルネガティブヒト転移性乳癌、MCF7ヒト乳房腺癌、67NRマウス非転移性乳癌及び4T1マウス転移性乳癌)から得たエクソソーム、及び対照細胞(MCF10A非腫瘍原性ヒト上皮性乳房及びNMuMG非腫瘍原性マウス上皮性乳房)を、確立された超遠心分離法を利用して単離した(図10A)(Luga et al., 2012; Thery et al., 2006)。採取されたエクソソームは、透過型電子顕微鏡測定(TEM)及び原子間力顕微鏡測定(AFM)により分析した。40〜140nmサイズの粒子を、同定した(図1A〜B)(Thery et al., 2002)。さらに、2種のエクソソームマーカ:TSG101及びCD9を検出することにより、エクソソームの同一性を確認した(図1C)(Ostrowski et al., 2010)。単離されたエクソソームは、免疫金標識電子顕微鏡測定により分析すると、CD9マーカに関しても陽性であった(図1A)。ラテックスビーズに結合されたエクソソームもフローサイトメトリーにより分析して、一般に用いられるエクソソームマーカであるテトラスパニン CD9、CD63、TSG101及びフロチリン1の表面発現を示した(図1D)。さらに、光散乱分光法(LSS)(Fang et al., 2007; Itzkan et al., 2007; Bang and Setabutr, 2010; Benitez−vieyra et al., 2009; Khairkar et al., 2010; Min et al., 2010)を用いて、単利された試料が直径104nmをピークとする狭いサイズ分布を呈することを示した(FIG.1E、右パネル)。LSSシステムは、異なる直径のガラスマイクロスフェアを内部対照として用いることにより、エクソソーム抽出物中の全ての粒子サイズの正確な検出を可能にした。LSSはまた、これらの単離物中のマイクロ小胞体及び細菌又は細胞破片の潜在的混入を排除した(図1E、右グラフの挿入図参照)。さらに、そしてLSSデータと一致して、NanoSightナノ粒子トラッキング分析から、直径105±1.0nmをピークとするサイズ分布の粒子が明らかとなり(図1F)、ろ過されない場合に溶液中に存在する異なるサイズ範囲の潜在的混入物の存在がさらに排除された(図1F、右グラフ)。アポトーシス小体又はランダムな細胞破片が単離物に混入する可能性を排除するために、比色細胞生存率アッセイ(MTT)、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いたdUTPニックエンドラベリング(TUNEL)アッセイ、アネキシンV及びヨウ化プロピジニルのフローサイトメトリー分析、並びにエクソソームのチトクロムC免疫ブロット(図10C〜E)を利用して、エクソソーム抽出前の細胞生存率を示した。癌細胞から単離されたエクソソームは、過去に定義された通り(Lee et al., 2011)、集合的にオンコソームと称される。対照細胞から単離されたエクソソームは、集合的にノルモソームと称される。
参考資料
以下の参考資料は、例示的手順、又は本明細書に示された事柄を補足する他の詳細を提供する限りにおいて、参照により本明細書に取り込まれる。
Claims (54)
- 対象における癌バイオマーカのインビトロ検出方法であって、
(a)前記対象から生物学的試料を得ること;
(b)(i)前記試料のエクソソーム画分中のRISCタンパク質;
(ii)前駆体miRNA;
(iii)前記試料のエクソソーム画分中の表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);及び/又は
(iv)前記試料のエクソソーム画分中の一次miRNA若しくは前駆体miRNAプロセシング活性、
のレベルを測定すること;並びに
(c)前記miRNA(複数可)、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性の測定レベルに基づき、癌バイオマーカを有する又は有さない前記対象を同定すること、
を含む前記方法。 - 前記試料が、本質的に細胞を含まない、請求項1に記載の方法。
- 前記試料が、リンパ、唾液、尿又は血漿試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記試料のエクソソーム画分を精製すること、又は前記試料のエクソソーム画分の生成を増加させること、をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記癌が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、脳癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌又は皮膚癌である、請求項1に記載の方法。
- 前記癌が、乳癌である、請求項5に記載の方法。
- 前記miRNAの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9.10のレベルを測定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ダイサー、AGO2、又はTRBPのレベルを測定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前駆体miRNAのレベルを測定することが、表5のmiRNA(複数可)の1つの前駆体のレベルを測定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、過去に癌を処置されている、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、過去に腫瘍を外科的に摘出されている、請求項10に記載の方法。
- 前記対象を癌バイオマーカを有する又は有さないと同定することが、前記測定されたmiRNAレベル(複数可)、前駆体miRNAレベル、RISCレベル、又はmiRNAプロセシング活性を、癌のリスクと相関させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象を癌バイオマーカを有する又は有さないと同定することが、アルゴリズムを用いた、前記測定されたmiRNAレベル(複数可)、前駆体miRNAレベル、RISCレベル、又はmiRNAプロセシング活性の解析をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分析が、コンピュータにより実施される、請求項13に記載の方法。
- b)(i)前記試料及び参照試料のエクソソーム画分中のRISCタンパク質;
(ii)前記試料及び参照試料のエクソソーム画分中の前駆体miRNA;
(iii)前記試料及び参照試料のエクソソーム画分中の表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);並びに/又は
(iv)前記試料及び参照試料のエクソソーム画分中のmiRNAプロセシング活性、のレベルを測定すること;並びに
(c)前記対象の前記試料中のRISC、前駆体miRNA、miRNA(複数可)、又はmiRNAプロセシング活性のレベルを、前記参照試料中のmiRNA(複数可)、前駆体miRNA、RISC又はmiRNAプロセシング活性のレベルに比較することにより、前記対象を癌バイオマーカを有する又は有さないと同定すること、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - RISCタンパク質レベルを測定することが、ウェスタンブロット、ELISA、又は抗体アレイへの結合を実施することを含む、請求項1に記載の方法。
- miRNAレベルを測定することが、プロセシングされたmiRNAレベルを測定することを含む、請求項1に記載の方法。
- miRNAレベルを測定することが、RT−PCR、ノーザンブロット又はアレイハイブリダイゼーションを実施することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が癌バイオマーカを有するか、又は有さないかを報告することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 報告することが、記載された報告書又は電子的報告書を用意すること含む、請求項19に記載の方法。
- 前記報告書を患者、医者、病院、又は保険会社に提出することをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 対象の処置方法であって、
請求項1に記載の癌バイオマーカを有すると同定された対象を選択すること;及び
前記対象に抗癌治療を施すこと、
を含む、前記方法。 - 前記抗癌治療が、化学療法、放射線治療、ホルモン療法、標的治療、免疫療法、又は外科的治療である、請求項22に記載の方法。
- 前記抗癌治療が、脳をターゲットとする、請求項22に記載の方法。
- 対象の処置方法であって、
(a)前記対象から得た試料のエクソソーム画分中の、(i)表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNAレベル;(iii)RISCタンパク質;又は(iv)miRNAプロセシング活性、のレベルを得ること;
(b)前記mRNA(複数可)、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性のレベルに基づき、癌バイオマーカを有する対象を選択すること;及び
(c)前記選択された対象を抗癌治療で処置すること、
を含む、前記方法。 - 前記抗癌治療が、化学療法、放射線治療、ホルモン療法、標的治療、免疫療法、又は外科的治療である、請求項25に記載の方法。
- 診断手順のための対象の選択方法であって、
(a)前記対象から得た試料のエクソソーム画分中の、(i)表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNA;(iii)RISCタンパク質、又は(iv)miRNAプロセシング活性、のレベルを得ること;
(b)前記mRNA(複数可)、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性のレベルに基づき、癌バイオマーカを有する対象を選択すること;及び
(c)前記対象において前記選択された通り、診断手順を実施すること、
を含む、前記方法。 - 前記診断手順が、診断画像を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記画像が、X線、CT、MRI又はPET画像である、請求項28に記載の方法。
- コンピュータ可読コードを含む有体のコンピュータ可読媒体であって、コンピュータに実行させる際に、
a)対象から得た試料のエクソソーム画分中の、(i)表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNA;(iii)RISCタンパク質;又は(iv)miRNAプロセシング活性、のレベルに対応する情報を受け取ること、及び;
b)前記miRNA又はRISCタンパク質の1つ以上の、参照レベルに比較した相対的レベルを決定すること、
を含む操作を前記コンピュータに実施させ、参照レベルに比較したレベルの変化により前記対象が癌バイオマーカを有することが示される、
前記有体のコンピュータ可読媒体。 - 癌を有さない対象のエクソソーム画分中の、(i)表5に示されたmiRNAから選択される1つ以上のmiRNA(複数可);(ii)前駆体miRNA;(iii)RISCタンパク質、又は(iv)miRNAプロセシング活性、の参照レベルに対応する情報を受け取ることをさらに含む、請求項30に記載の有体のコンピュータ可読媒体。
- 前記参照レベルが保存される、請求項30に記載の有体のコンピュータ可読媒体。
- 前記情報を受け取ることが、対象から得た試料中の、miRNA、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性のレベルに対応する情報を、有体のデータ保存デバイスから受け取ることを含む、請求項30に記載の有体のコンピュータ可読媒体。
- コンピュータに実行させる際に、miRNA、前駆体miRNA、RISCタンパク質又はmiRNAプロセシング活性の相対レベルに対応する情報を、有体のデータ保存デバイスに送信すること、を含む1つ以上のさらなる操作を前記コンピュータに実施させる、コンピュータ可読コードをさらに含む、請求項30に記載の有体のコンピュータ可読媒体。
- 前記情報を受け取ることが、対象から得た試料中の、前記miRNAの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、又は10のレベルに対応する情報を受け取ることをさらに含む、請求項30に記載の有体のコンピュータ可読媒体。
- 前記コンピュータ可読コードが、コンピュータに実行させる際に、c)前記患者の診断スコアを計算すること、をさらに含む操作を前記コンピュータに実施させ、前記診断スコアが、前記試料が癌を有する対象のものである可能性を示す、請求項30に記載の有体のコンピュータ可読媒体。
- 対象における癌バイオマーカのインビトロ検出方法であって、
(a)前記対象から生物学的試料を得ること;
(b)表5に示された前記miRNAから選択される、前記試料中の1つ以上のmiRNA(複数可)のレベルを測定すること;及び
(c)前記miRNA(複数可)の前記測定レベルに基づき、癌バイオマーカを有する、又は有さない前記対象を同定すること、を含む、前記方法。 - 前記試料が、本質的に細胞を含まない、請求項37に記載の方法。
- 前記試料が、体液のエクソソーム画分である、請求項37に記載の方法。
- 前記試料が、リンパ、唾液、尿又は血漿試料である、請求項37に記載の方法。
- 細胞を、RISCタンパク質複合体と会合して提供される阻害性RNAと接触させることを含む、活性の阻害性RNAのインビトロ送達方法。
- 前記RISCタンパク質複合体が、TRBP、ダイサー及びAGO2を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記阻害性RNAが、siRNA又はshRNAである、請求項41に記載の方法。
- 前記阻害性RNAが、ヒトmiRNAである、請求項41に記載の方法。
- 前記阻害性RNA及びRISCタンパク質複合体が、脂質二重層を含むリポソーム、ナノ粒子又はマイクロカプセル中に含まれる、請求項41に記載の方法。
- 前記マイクロカプセルが、エクソソームである、請求項46に記載の方法。
- 細胞を接触させることが、細胞を、前記阻害性RNA及びRISCタンパク質複合体でトランスフェクトすることを含む、請求項41に記載の方法。
- 前記阻害性RNA及びRISCタンパク質複合体を対象に投与することをさらに含む、請求項41に記載の方法。
- RISCタンパク質複合体と会合した組換え又は合成阻害性RNAを含む組成物であって、前記複合体が、リポソーム、ナノ粒子又はマイクロカプセル中に含まれる、前記組成物。
- 前記RISCタンパク質複合体が、TRBP、ダイサー及びAGO2を含む、請求項49に記載の組成物。
- 前記阻害性RNAが、siRNA又はshRNAである、請求項49に記載の組成物。
- 前記阻害性RNAが、ヒトmiRNAである、請求項49に記載の組成物。
- 前記複合体が、合成リポソーム、ナノ粒子又はマイクロカプセル中に含まれる、請求項49に記載の組成物。
- 前記マイクロカプセルが、エクソソームである、請求項49に記載の組成物。
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