WO2022102246A1 - 細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列を解析する方法、その装置、及び、そのプログラム - Google Patents

細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列を解析する方法、その装置、及び、そのプログラム Download PDF

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WO2022102246A1
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sequence
gel capsule
sample
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PCT/JP2021/034361
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章玄 岡本
壮太朗 高野
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国立研究開発法人物質・材料研究機構
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a base sequence derived from a membrane vesicle produced in a cell, an apparatus thereof, and a program thereof.
  • extracellular vesicles membrane vesicles derived from bacteria have various functions, and for example, they are considered to contribute to the expression of pathogenicity of bacteria and are attracting attention.
  • Patent Document 1 states, "Method for identifying a causative agent of a serious bacterial infectious disease, including the following steps: (A) a step of extracting a gene in a nanovesicle from a patient sample containing a nanovesicle derived from a bacterium; (B) the above. Steps of PCR on the extracted genes using the primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2; and (C) If the above PCR results are increased compared to normal individuals, then of a severe bacterial infection. Steps to determine that the causative bacterium is present. "
  • each individual of the membrane vesicles is encapsulated in the droplets, and the droplets are encapsulated.
  • Gelling to form a gel capsule and contacting the gel capsule with a dissolving reagent to dissolve the membrane vesicle the polynucleotide in the membrane vesicle is eluted into the gel capsule, and the inside of the gel capsule
  • the polynucleotide is brought into contact with an amplification reagent to amplify the polynucleotide in the gel capsule, and the first base sequence, which is the base sequence of the polynucleotide, is derived from the amplified polynucleotide.
  • a method comprising confirming that the first base sequence is a base sequence derived from a membrane vesicle produced in the host cell.
  • the host cell is a host bacterium.
  • the reference sequence is a base sequence obtained by metagenomic analysis of the first sample.
  • the reference sequence is a set of the genomic sequences of cells having a known genomic sequence and the first base sequence is mapped to the reference sequence, the cells having the mapped genomic sequence are referred to.
  • the protein coding region in the first base sequence is detected, and a homology search using the protein coding region as a query sequence is performed to obtain a protein coding sequence homologous to the protein coding region.
  • the method according to [5] which comprises selecting the above-mentioned cells having the above-mentioned protein and preparing the above-mentioned reference sequence from the genome sequence of the above-mentioned cells.
  • To obtain the reference sequence is to analyze the second sample by 16S rRNA, estimate the bacterial composition of the second sample, and use the base sequence of the bacterial composition as the reference sequence. 9]. [12] The method according to [9], wherein obtaining the reference sequence is to analyze the second sample in a single cell and use the obtained base sequence as the reference sequence. [13] To obtain the reference sequence, the base sequence obtained by metagenome analysis of the second sample and the base sequence obtained by single-cell analysis of the second sample are merged to obtain the reference sequence. The method according to [9].
  • the suspension is at least one selected from the group consisting of feces, saliva, sputum, surgical lavage fluid, blood, and skin or body mucosa wipes, and swabs collected from humans or animals.
  • the method according to any one of [8] to [13], which is a sample collected from the above.
  • the host bacteria are Porphyromonas, Prevotella, Bayonera, Fusobacterium, Parvimonas, Aggregatibacter, Actinomyces, Actinovacils, Bacteroides, Tannerela, Treponema, Capnocytophaga.
  • a droplet preparation unit that encloses each of the membrane vesicles produced in the host cell and released outside the host cell into the droplet, and a gel that gels the droplet to generate a gel capsule.
  • Amplification that amplifies the polynucleotide in the gel capsule by contacting the chemical conversion part, the dissolution part that brings the gel capsule into contact with the lysis reagent, the removal part that removes contaminants from the gel capsule, and the gel capsule with the amplification reagent.
  • a sequence determination part that determines the first base sequence that is the sequence of the polynucleotide, and the first base sequence are aligned with the reference sequence to check whether the first base sequence maps to the reference sequence.
  • the reference part and the first base sequence are mapped to the reference sequence, the information for confirming that the first base sequence is a base sequence derived from the membrane vesicles produced in the host cell is provided.
  • a device having a confirmation unit to provide.
  • a droplet-making unit that encloses each of the membrane vesicles produced in the host cell and released outside the host cell into the droplet, and gelling the droplet to generate a gel capsule.
  • the gelled portion, the dissolving portion that brings the gel capsule into contact with the dissolving reagent, the removing portion that removes contaminants from the gel capsule, and the gel capsule are brought into contact with the amplification reagent to amplify the polynucleotide in the gel capsule.
  • the procedure for encapsulation, the procedure for gelling the droplets to generate gel capsules, and the procedure for contacting the gel capsules with a lysis reagent to dissolve the membrane vesicles, and the polynucleotide in the membrane vesicles is the gel.
  • a program to execute the procedure for confirming that the base sequence is derived from vesicles. [19] A base sequence derived from the membrane vesicle obtained by the method according to any one of [1] to [16].
  • the present invention it is possible to provide a method capable of analyzing a base sequence derived from a membrane vesicle produced in a host cell (typically produced by a host bacterium). Further, according to the present invention, an apparatus and a program can also be provided.
  • the present invention will be described in detail.
  • the description of the constituent elements described below may be based on a representative embodiment of the present invention, but the present invention is not limited to such embodiments.
  • the numerical range represented by using "-" means a range including the numerical values before and after "-" as the lower limit value and the upper limit value.
  • polynucleotide refers to the polymer form of a nucleotide of any length, either ribonucleotide or deoxyribonucleotide. This term refers only to the primary structure of the molecule. Therefore, the term includes double-stranded and single-stranded DNA, and RNA.
  • a “membrane vesicle” is typically a “outer membrane vesicle” (outer membrane vesicle) that is a microvesicle produced by allowing a portion of the cell membrane of a host bacterium to be constricted outside the cell.
  • OMV outer membrane vesicle
  • the membrane vesicles include “exosomes” produced and released by the endocytosis pathway by outer membrane vesicles produced by host bacteria, animal cells, etc., and “exosomes” produced by apoptosis. "Apopulated vesicles” are also included, and among them, outer membrane vesicles (OMV) are preferable as the membrane vesicles.
  • the host cell is not particularly limited and may be any cell of eukaryotic organism, bacterium, or paleobacteria, but the case where the host cell is a host bacterium will be described below as a typical example.
  • a "host cell” means a cell which produced a membrane vesicle to be analyzed
  • host bacterium means a bacterium which produced a membrane vesicle to be analyzed.
  • single cell analysis means a method of separating cells (bacteria), membrane vesicles, etc. one by one and analyzing their base sequences, and is also referred to as “single particle analysis” or the like. Means the method referred to.
  • FIG. 1 is a flowchart of a first embodiment of the method of the present invention (hereinafter, also referred to as “the present method”).
  • Step S101 is a step (encapsulation step) of encapsulating each individual membrane vesicle produced by the host bacterium in the droplet.
  • the first sample used in the encapsulation step contains membrane vesicles.
  • the number of membrane vesicles contained in the sample may be one or more.
  • the membrane vesicles are produced by the host bacterium and released outside the bacterium, and the first sample is typically from a suspension containing the host bacterium and the membrane vesicle, such as the host bacterium.
  • the first sample containing the membrane vesicles is preferably purified. By suppressing the contamination of the first sample with nucleic acid components other than the membrane vesicles, it is easy to finally obtain the polynucleotide (derived from the membrane vesicles) of the membrane vesicles.
  • the first sample may contain membrane vesicles produced by the host bacterium and released outside the bacterium, and the membrane vesicles may be derived from a single host bacterial strain, but may be of a plurality of species. It may be derived from the bacteria (group) of.
  • the plurality of types of bacteria (group) include one type or two or more types of host bacteria.
  • This method may include a step of separating and acquiring the membrane vesicles from a suspension containing membrane vesicles before the encapsulation step (pretreatment step).
  • the suspension may contain host bacteria, and if host bacteria are contained, the above step is a step of obtaining a first sample containing membrane vesicles and a second sample containing bacteria. You may.
  • the suspension used in the pretreatment step may contain membrane vesicles and may contain host bacteria. If the suspension contains host bacteria, the host bacteria may be included in the suspension as a single cultured bacterial strain. In this case, the suspension is typically a culture sample of the bacterial strain cultured in a liquid medium. Further, the suspension may be obtained from humans or animals and may contain a plurality of types of bacteria (one or more of them may be difficult-to-culture bacteria).
  • the suspension may be, for example, a sample collected from humans or animals, such as feces, saliva, sputum, surgical cleaning solution, blood, skin / body mucosa wiping solution, and swab.
  • the collected sample may contain a group of bacteria and membrane vesicles produced by the host bacteria contained therein.
  • the membrane vesicles and the bacterial group may be separated from the collected sample into a first sample and a second sample.
  • the collected sample may contain refractory bacteria.
  • classification, functional research, and utilization of membrane vesicles derived from refractory bacteria have been particularly difficult and have not progressed.
  • a method of culturing a bacterial strain to produce a large amount of membrane vesicles and analyzing the membrane vesicles can be applied to the functional analysis of the membrane vesicles produced by the bacterial strain.
  • the method could not be applied to difficult-to-culture bacteria. This was one of the reasons why the functional analysis of membrane vesicles produced by refractory bacteria did not progress.
  • both the absolute amount and the relative amount are often not sufficient for comprehensive analysis by the conventional method. This made the analysis even more difficult.
  • the method of the present invention even if the amount of membrane vesicles contained in the collected sample and the culture sample is small, each individual is separated and one individual of the membrane vesicles (1 solid). Since the polynucleotide (derived from) is amplified and analyzed, the desired data can be obtained.
  • the host bacterium that produces the membrane vesicles to be analyzed is not particularly limited, but is eubacteria, Escherichia coli, bacillus, indigo bacterium, bacillus, bacillus, racen, gram-negative bacterium, gram-positive bacterium, paleobacteria, and , Bacteria and the like.
  • ⁇ Streptococcus mutans Pseudomonas aeruginosa ⁇ Negibacteria ⁇ Eobacteria ⁇ Deinococci ⁇ Deinococci ⁇ Deinococcales ⁇ Thermales ⁇ Chloroflexi ⁇ Anaerolineae ⁇ Anaerolineales ⁇ Caldilineae ⁇ Chloroflexales ⁇ Herpetosiphonales ⁇ Thermomicrobia ⁇ Thermomicrobiales ⁇ Sphaerobacterales ⁇ Ktedonobacteria ⁇ Ktedonobacterales ⁇ Thermogemmatisporales ⁇ Glyco
  • the host bacterium is preferably a periodontal disease bacterium (a causative bacterium of periodontal disease).
  • periodontal disease bacteria include Capnocytophaga, Prevotella, Eikenella, Fusobacterium, Parvimonas, Aggregatibacter, Aggregatibacter, and Aggregatibacter.
  • the genus Capnocytophaga and the like can be mentioned.
  • ⁇ Porphyromonas micra, Aggregatibacter actinomycetemcomitans or Actinovacils actinomycetemcomitens ⁇ (Tannerella forsythensis) ⁇ (Treponema denticola) ⁇ (Campylobactar
  • the host bacteria include Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Aggregatibacter actinomycetemcommitanectemcommitans (Aggregatibacter actinometry), which are called "red complex”. At least one bacterium selected from the group is preferred.
  • the method for separating bacteria (group) and membrane vesicles in a suspension is not particularly limited, and a known method can be used.
  • a known method can be used.
  • the membrane vesicles are contained in the culture supernatant, they can be separated by removing the cells from the culture solution by centrifugation.
  • the colonies can be suspended in buffer and separated in the same manner.
  • the bacterial cells remaining in the supernatant can be easily removed. Since the centrifugation supernatant may contain contaminants such as proteins in addition to bacterial cells, for example, after concentrating with a 100-200 kDa cutoff filter, membrane vesicles are precipitated by ultracentrifugation and collected. You can also use the method of
  • the precipitate thus obtained may contain microbial-derived structures (eg, sucrose, flagella, etc.), and in order to remove these, for example, Further purification may be used by using a density gradient centrifugation method using sucrose or the like.
  • microbial-derived structures eg, sucrose, flagella, etc.
  • this method has a step of further reacting the obtained first sample with a nucleic acid degrading enzyme to decompose these nucleic acid components.
  • a nucleic acid degrading enzyme As such an enzyme, a known enzyme can be used, and examples thereof include deoxyribonuclease and the like.
  • a specific method for obtaining a first sample from a culture medium of a single cell line will be described. First, when the desired growth phase is achieved under predetermined conditions, the culture medium is placed in a centrifuge tube having a volume of 1 to 100 mL and centrifuged at 3000 to 9000 rpm and 1 to 20 ° C. for 1 to 30 minutes.
  • the supernatant is added to the ultracentrifugal tube, and for example, the centrifugal force is 150,000 to 300,000 ⁇ g, and the supernatant is ultracentrifuged at 1 to 10 ° C. for 1 to 3 hours. After ultracentrifugation, the supernatant is discarded and the precipitated adventitial vesicles (OMV) are resuspended in buffer (eg, pH 7.4 PBS buffer) and stored at 1-10 ° C. Further, this ultracentrifugation step may be repeated a plurality of times.
  • buffer eg, pH 7.4 PBS buffer
  • This suspension may be used as the first sample.
  • Deoxyribonuclease DNase
  • DNase Deoxyribonuclease
  • the amount of deoxyribonuclease added is not particularly limited, and examples thereof include a method in which 10 ⁇ L of the above suspension is diluted 10-fold and 2 ⁇ L of DNase (2000U) is added thereto.
  • the suspension may be diluted and used as the first sample.
  • concentration of membrane vesicles contained in a unit amount of the suspension.
  • the method for diluting the suspension is not particularly limited, but for example, the concentration of the membrane vesicles is diluted to an appropriate concentration while observing the concentration of the membrane vesicles in the suspension by a dynamic light scattering method or the like.
  • the method can be mentioned.
  • the particles are irradiated with a laser, the Brownian motion of each particle is tracked from the scattered light (tracking method), and the diameter of the particles is determined from the diffusion rate based on the Stokes-Einstein formula. And the number are preferred.
  • the method of encapsulating each individual membrane vesicle contained in the first sample in the droplet using the first sample is not particularly limited, and a known method can be used.
  • the droplets can be produced, for example, using a microchannel.
  • a microchannel By flowing the suspension described above into a microchannel and shearing the flow of the suspension, droplets containing membrane vesicles of each individual can be produced. Shearing can be done at regular intervals.
  • oil may be used as a method of shearing the suspension. Examples of the oil include mineral oil, vegetable oil, silicone oil, fluorinated oil and the like.
  • the diameter of the droplet is preferably 1 to 250 ⁇ m, more preferably 10 to 200 ⁇ m.
  • Step S102 is a step of gelling the droplet to form a gel capsule.
  • the gelation method is not particularly limited.
  • the gelation of the droplet can be performed by configuring the droplet to contain the material of the gel capsule and cooling the prepared droplet.
  • gelation can be performed by giving a stimulus such as light to the droplet.
  • the inclusion of the gel capsule material in the droplets can be done, for example, by including the gel capsule material in the first sample.
  • the diameter of the gel capsule is preferably 1 to 250 ⁇ m, more preferably 10 to 200 ⁇ m.
  • the diameter of the gel capsule may be the same as that of the droplet to be produced, but the diameter may change during gelation.
  • the material of the gel capsule may contain agarose, acrylamide, a photocurable resin (for example, PEG-DA), PEG (polyethylene glycol), gelatin, sodium alginate, matrigel, collagen and the like.
  • a photocurable resin for example, PEG-DA
  • PEG polyethylene glycol
  • gelatin sodium alginate, matrigel, collagen and the like.
  • the gel capsule may be a hydrogel capsule.
  • hydrogel is meant that the solvent or dispersion medium retained by the network structure of the polymeric substance or colloidal particles is water.
  • Step S103 is a step of contacting the gel capsule with a lysing reagent to lyse the membrane vesicles, elute the polynucleotide, and retain it in the gel capsule.
  • a lysing reagent to lyse the membrane vesicles, elute the polynucleotide, and retain it in the gel capsule.
  • the polynucleotide in the membrane vesicles can be eluted into the gel capsule and retained in the gel capsule with the substance binding to the polynucleotide removed.
  • the dissolving reagent enzymes, surfactants, other denaturing agents, reducing agents, pH adjusting agents, combinations thereof and the like can be used.
  • Dissolving reagents include lysoteam, labiase, yatalase, achromopeptidase, protease, nuclease, zymolyase, chitinase, lysostaphin, mutanolaicin, sodium dodecyl sulfate, sodium lauryl sulfate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, phenol, chloroform, guanidine hydrochloride, Urea, 2-mercaptoethanol, dithiotreitol, TCEP (Tris (2-carboxythyl) phosphorine) -HCl, sodium coliate, sodium deoxycholate, Triton® X-100, Triton X-114, Nonidet (registered) Trademarks) P-40, Brij®-35, Brij-58, Tween® 20, Tween 80, octylglucoside, octylthioglucoside, CHAPS (3
  • the dissolving reagent preferably contains lysozyme, achromopeptidase, protease, sodium dodecyl sulfate, potassium hydroxide and the like.
  • Step S104 is a step of removing contaminants in the gel capsule.
  • the purified genetic substance for example, DNA
  • the purified genetic substance can be retained in the gel capsule, and there is a possibility of contamination of molecules from the outside. Can be eliminated.
  • a large amount of membrane vesicles can be processed in parallel for each unit with a very simple operation.
  • the step of centrifuging the test tube containing the gelled droplets, removing the supernatant and replacing it with a cleaning solution can be performed. Alternatively, it can be performed by filtering the gelled droplets with a filter, removing the supernatant, passing the washing liquid through the filter, and finally collecting the gel capsules.
  • the residual reagent can be diluted while retaining the genetic material. This step can be repeated. By diluting the reagent to a level that does not cause inhibition, downstream operations such as amplification reactions can be smoothly performed.
  • the lysing reagent When the lysing reagent is sufficiently removed before the downstream reaction, it is preferable that the reaction such as DNA amplification is not easily inhibited.
  • the lysing reagent When a gel capsule is used, since the gel capsule holds the genetic substance to be analyzed or amplified, the lysing reagent can be removed even in the analysis per membrane vesicle in which the amount of the genetic substance is small. Therefore, it is possible to use a strong dissolving reagent or a combination of dissolving reagents. And, using a strong lysing reagent or a combination of lysing reagents may enable more reliable amplification of nucleic acid and analysis of base sequence.
  • Step S105 is a step of contacting the polynucleotide with an amplification reagent to amplify the polynucleotide in a gel capsule. After immersing in the amplification reagent, the temperature of the gel capsule may be adjusted if necessary.
  • the heating is preferably 60 ° C. or lower from the viewpoint that the gel (for example, agarose gel) is difficult to dissolve. Heating within this range is preferable in that it further promotes the amplification of DNA.
  • the enzyme used for amplification include fi29 polymerase, Bst polymerase, Aac polymerase, and recombinase polymerase. In this method, it is preferable to use a random primer in order to amplify the total DNA in the gel.
  • Step S106 is a step of determining the first base sequence from the amplified polynucleotide.
  • a method for determining the base sequence from the amplified polynucleotide commercially available reagent kits, devices, application software and the like can be used without particular limitation for any of library preparation, sequence, assembly and the like.
  • Step S107 is a step of aligning the obtained first base sequence with the reference sequence and examining whether the first base sequence maps to the reference sequence.
  • step S108 YES
  • the first base sequence is a base sequence derived from the membrane vesicle produced by the host bacterium (base sequence inside the membrane vesicle).
  • Step S109 confirmation step.
  • “mapped” means that the first base sequence coincides with a part of the region of the base sequence of the reference sequence.
  • Matching means that 90% or more of the sequences are identical, preferably 95% or more, more preferably 99% or more, and even more preferably completely identical.
  • the reference sequence may be a base sequence obtained by metagenomic analysis of the first sample.
  • metagenomic analysis of a first sample means a method of extracting DNA from a first sample and obtaining a base sequence by a comprehensive analysis method. Specific methods of metagenomic analysis are known to those of skill in the art.
  • This method has a step of amplifying a polynucleotide in a gel capsule.
  • the primers used may bind to each other or a chimeric sequence may be generated to amplify nucleotides other than the polynucleotide of the membrane vesicle.
  • sequence information is obtained without intervention of amplification. Therefore, if the sequence obtained by this is used as a reference sequence, and if the first base sequence is mapped to this reference sequence, the amplification step or the like. It can be confirmed that no error has occurred in.
  • the reference sequence may be the genomic sequence of the cell line. If the genomic sequence of the cell line is known, the known sequence will be the reference sequence. Further, the genomic sequence of the single cell line may be analyzed (for example, single cell analysis), and the sequence may be used as a reference sequence.
  • the analysis method at that time is not particularly limited, and for example, the method described in International Publication No. 2019-216271 can be used.
  • the method comprises the step of amplifying the polynucleotide in a gel capsule.
  • the primers used may bind to each other or a chimeric sequence may be generated to amplify nucleotides other than the polynucleotide of the membrane vesicle. Whether or not such polynucleotide contamination has occurred can be confirmed by this step.
  • the base sequence indicates that no error or contamination has occurred in each step. From this, it can be confirmed that the first base sequence is derived from the above-mentioned host bacterium.
  • step S108 when the first base sequence is not mapped to the reference sequence (step S108: NO), it is strongly suggested that some error (for example, the amplification problem described above) may have occurred in each upstream step.
  • the analysis may be completed and the first base sequence may be discarded.
  • the host (origin) of the membrane vesicle contained in the first base sequence is unknown, that is, the analysis target is a membrane vesicle purified from a sample containing multiple types of bacteria.
  • the sequence may be a set of genomic sequences of a plurality of types of bacteria. For the set of genome sequences, if the composition of the above "multiple species of bacteria" is clear, obtain the genome sequences of each of the “multiple species of bacteria" from a database such as "Genbank” and list them. You can use it.
  • the composition and / or genomic sequence of the bacterium that should be a candidate for the host bacterium (the above-mentioned “multiple kinds of bacteria") is unknown, refer to the result of the comprehensive analysis of the second sample as described later. It may be an array. In that case, the method may further include a step of performing metagenomic analysis and / or single cell analysis of the second sample to determine the reference sequence.
  • the membrane vesicles are produced by any of the above-mentioned multiple types of bacteria.
  • the host bacterium is contained in the plurality of kinds of bacteria will be described.
  • the first base sequence is mapped to the reference sequence which is a list of the genomic sequences of the above-mentioned "multiple species of bacteria"
  • the first base sequence is produced by the bacteria corresponding to the mapped genomic sequence. It can be confirmed as a thing.
  • the host bacterium can be determined to be the "corresponding bacterium” described above.
  • the reference sequence may be a base sequence obtained from the analysis of the second sample containing the above-mentioned "multiple kinds of bacteria", a list of genome sequences of known bacteria recorded in a public database such as "Genbank”, and a list of genome sequences of known bacteria. , A list of genomic sequences selected and obtained from this genomic sequence, etc. may be used.
  • the first base sequence is not mapped to any of the sequences contained in the reference sequence, it is strongly suggested that the first base sequence was generated by some error in the upstream process.
  • the base sequence may be discarded.
  • the method for obtaining a reference sequence from a plurality of types of bacteria contained in the suspension is not particularly limited, but as one form, a method for obtaining a reference sequence using a second sample is preferable.
  • a method for obtaining a reference sequence using a second sample for example, a method of obtaining a reference sequence by metagenome analysis of the second sample, 16S rRNA analysis of the second sample, and bacteria of the second sample using an existing database. Examples include a method of estimating the composition and estimating the reference sequence from the bacterial composition, and a method of single-cell analysis of the second sample to obtain the reference sequence.
  • the second sample is metagenome. A method of analyzing to obtain a reference sequence is preferable.
  • This method has a step of amplifying a polynucleotide derived from a membrane vesicle, and by mapping to a genomic sequence obtained by an analysis method that does not undergo an amplification step, an error due to amplification can be detected with higher sensitivity. be.
  • a method for obtaining a reference sequence a method for obtaining a reference sequence by merging a sequence obtained by metagenome analysis of a second sample and a sequence obtained by single-cell analysis of a second sample. May be good. By contrasting and synthesizing the entire sequence obtained by single-cell analysis and the sequence obtained by metagenomic analysis, the unclear parts of each other's results are complemented and a higher-resolution reference sequence can be obtained. ..
  • the method of merging the sequence obtained by metagenomic analysis of the second sample and the sequence obtained by single cell analysis is not particularly limited, and can be aligned using a conventionally known homology search algorithm. good. More specifically, a homology search may be performed using a computer algorithm such as a "FASTA" program with known parameters. You may also use the Needleman-Wunsch algorithm. BLAST or Clustal W may be used.
  • This method may further include a step of clustering the obtained first base sequence to confirm the heterogeneity of the membrane vesicles.
  • this method has a step (confirmation step) for separating membrane vesicles one by one in advance, analyzing the DNA, and eliminating errors due to steps such as amplification, surely, The base sequence of the polynucleotide derived from each of the membrane vesicles can be obtained. Therefore, by clustering this, the heterogeneity of the membrane vesicles contained in the first sample can be confirmed.
  • FIG. 6 is a flowchart of a second embodiment of the method of the present invention (hereinafter, also referred to as “the present method”).
  • the present method the differences from the first embodiment of the method of the present invention, which have already been described, will be mainly described.
  • step S601 One of the differences between the first embodiment of the method of the present invention described above and the present method is as step S601 after step S106 (step of determining the first base sequence from the amplified polynucleotide).
  • a protein coding sequence homologous to the above protein coding region is detected by detecting a protein coding region in the first base sequence and performing a homology search using this protein coding region as a query sequence (the reference may be the protein coding sequence of the database described later). It is to have a step (reference sequence preparation step) of selecting a bacterium having a protein and creating a reference sequence from the genomic sequence of the above cells.
  • the method for detecting the protein coding region in the first base sequence is not particularly limited, and a method known to those skilled in the art can be used. For example, it can be more easily performed by using a software tool for genome annotation, such as "prokka” (Seemann, Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics, 30, 14, 2014).
  • the method for performing a homology search for the detected protein coding region is not particularly limited, but is typically provided by NCBI (National Center for Biotechnology Information), EBI (European Bioinformatics Institute), or the like.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • EBI European Bioinformatics Institute
  • a method of performing a homology search using the protein coding sequence of an organism over the entire domain as a reference can be mentioned.
  • a known software tool can be used for the homology search.
  • the corresponding method is based on the annotations tagged in each protein coding sequence information matched on the database. There is a method of identifying the bacteria to be used.
  • the bacterial genome sequence selected by the above procedure is the reference sequence.
  • the selected "bacteria” are, so to speak, candidates for host bacteria, and a plurality of species may be included.
  • the reference sequence is a list containing the genomic sequences of multiple "bacteria”.
  • this method narrows down the bacterial species that are candidates for host bacteria by homology search using the protein coding region of the first base sequence, and creates a reference sequence that is a smaller list than the entire public database. Has a process. Therefore, even when the host bacterium of the membrane vesicle is unknown, the range of the reference sequence can be narrowed down more easily, and the subsequent alignment of the first base sequence to the reference sequence and the evaluation of the possibility of mapping can be performed more quickly. And it can be done more reliably.
  • step S107 the obtained first base sequence is aligned with the reference sequence and the first base sequence is mapped to the reference sequence. If this is mapped to a reference sequence (step S108: YES), then step S602 includes determining a cell having the mapped genomic sequence as a host cell.
  • the host bacterium When the host bacterium is unknown, such as when the membrane vesicle to be analyzed is purified from a sample collected from humans or animals, there is a base sequence to which the first base sequence is mapped in the reference sequence. If (ie, if the first base sequence is mapped to a reference sequence), the bacterium having that mapped sequence (genome sequence) is strongly suggested to be the host bacterium of the membrane vesicle.
  • this method can be preferably applied when the membrane vesicles are purified from a sample collected from a human or an animal. This is because, in many cases, the bacterial species contained in the collected sample is unknown, and the host bacterium of the membrane vesicle is unknown. According to this method, the host bacterium can be identified as well as the confirmation of the first base sequence.
  • a droplet-making unit that encloses membrane vesicles produced in a host cell and released outside the host cell one by one into a droplet, and a droplet-gelling unit.
  • Amplification unit for amplification a sequence determination unit for determining the first base sequence which is a polynucleotide sequence, and a reference sequence for aligning the first base sequence with a reference sequence to check whether the first base sequence maps to a reference sequence.
  • a device having a unit and a confirmation unit that provides information for confirming that the first base sequence is a membrane vesicle produced by a host bacterium when the first base sequence is mapped to a reference sequence. ..
  • FIG. 2 is a hardware configuration diagram of this device.
  • the apparatus 200 includes a processor 201, a storage device 202, an input device 203, a display device 204, a microchannel 205, a temperature controller 206, and a dispenser 207 (dissolution reagent tank 208, and amplification reagent tank). 209 is connected), a centrifuge 210, a sequencer 211, and a flow cytometer 212, and each hardware is configured to exchange data with each other via a bus. ..
  • the processor 201 is, for example, a microprocessor, a processor core, a multi-processor, an ASIC (application-specific integrated circuit), an FPGA (field programgable gate array), a GPGPU (general-purpose processing) processing, etc.
  • ASIC application-specific integrated circuit
  • FPGA field programgable gate array
  • GPGPU general-purpose processing
  • the storage device 202 has a function of temporarily and / or non-temporarily storing various programs and data, and provides a work area of the processor 201.
  • the storage device 202 is, for example, a ROM (Read Only Memory), a RAM (Random Access Memory), an HDD (Hard Disk Drive), a flash memory, an SSD (Solid State Drive), or the like.
  • the input device 203 can accept input of measurement conditions, sample name, etc., and can also accept input of instructions to the device 200.
  • the input device 203 may be a keyboard, a mouse, a scanner, a touch panel, or the like.
  • the display device 204 can display the measurement result, the sample name, the operation procedure, and the like.
  • the display device 204 may be a liquid crystal display, an organic EL (Electroluminescence) display, or the like. Further, the display device 204 may be configured integrally with the input device 203. In this case, the display device 204 is a touch panel display, and a form of providing a GUI (Graphical User Interface) can be mentioned.
  • GUI Graphic User Interface
  • the processor 201, the storage device 202, the input device 203, and the display device 204 capable of communicating data with each other by the data bus are typically computers.
  • the microchannel 205 is a device capable of producing a droplet and enclosing each individual membrane vesicle in the droplet.
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional view showing an embodiment of the microchannel 205.
  • the micro flow path 205 is composed of a cross-shaped flow path 301 in which two flow paths are formed substantially orthogonal to each other.
  • the first sample 302 containing the membrane vesicle 303 flows from the top to the bottom of the drawing in the flow path extending downward from the top of the drawing, and the flow path in a direction substantially orthogonal to this flows from the left and right to the center of the drawing. Oil 304 is flowing toward.
  • the diameter of this flow path is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is generally preferably 10 to 60 ⁇ m.
  • the first sample 302 containing the membrane vesicle 303 is sheared by the oil 304 flowing from the left and right to the center of the drawing, and becomes a droplet 305 containing the membrane vesicle 303.
  • the content of the membrane vesicle 303 in the first sample 302 it is possible to adjust so that one individual of the membrane vesicle 303 is enclosed in the droplet 305.
  • the membrane vesicle 303 is Unencapsulated droplets 306 may also be produced.
  • the temperature controller 206 is a device capable of gelling droplets to form a gel capsule.
  • gel can be generated from the droplet by lowering the temperature of the droplet with a temperature controller.
  • the gelation temperature is not particularly limited, but is preferably 4 to 10 ° C.
  • the dispenser 207 is a device capable of dissolving the membrane vesicle 303 enclosed in the gel capsule by obtaining the dissolving reagent from the dissolving reagent tank 208 and contacting it with each gel. Specifically, the dispenser 207 sucks the lysis reagent from the lysis reagent tank 208 and discharges the lysis reagent to the gel capsule held in the container (for example, the microtube and each well of the microplate). It may be composed of a flow path for the purpose, a pump for the purpose, a valve and the like.
  • the dispenser 207 can also amplify the DNA molecule in the gel capsule by obtaining the amplification reagent from the amplification reagent tank 209 and contacting it with each gel capsule after dissolution of the membrane vesicle 303. ..
  • the dispenser 207 has a flow path for sucking the amplification reagent from the amplification reagent tank 209 and discharging it.
  • the apparatus 200 further has a cleaning liquid tank (not shown), which is connected to the dispenser 207 by a flow path to supply the cleaning liquid to the gel capsule. It is configured to be able to discharge.
  • the gel capsule can be washed to remove excess dissolving reagent, amplification reagent and the like.
  • the centrifuge 210 can remove the lysis reagent, the amplification reagent, and the washing liquid from the gel capsule. That is, the gel capsule and the liquid component (dissolving reagent, amplification reagent, and washing liquid) can be separated by the centrifuge 210, and the gel capsule can be taken out.
  • the flow cytometer 212 is a device for selecting gel capsules holding DNA amplified more than a predetermined value and individually collecting them in a storage container.
  • the sequencer 211 determines the first base sequence, which is the base sequence of the amplified DNA.
  • a capillary sequencer, a next-generation sequencer, or the like can be used as the sequencer.
  • FIG. 4 is a functional block diagram of this device.
  • the device 400 includes a control unit 401, a storage unit 402, an input unit 403, a display unit 404, an arrangement determination unit 405, a confirmation unit 406, a droplet preparation unit 407, a gelling unit 408, a dissolution unit 409, a removal unit 410, and an amplification unit. It has a 411, a selection unit 412, and a reference unit 413.
  • the control unit 401 includes the processor 201.
  • the control unit 401 controls each unit to realize the function of the device 200.
  • the storage unit 402 includes a storage device 202.
  • a program for controlling each unit is stored in the storage unit 402 in advance, and a first base sequence or the like determined by the sequence determination unit 405, which will be described later, can be stored.
  • the storage unit 402 is controlled by the control unit 401, and data can be read and written.
  • the input unit 403 includes the input device 203. Further, the display unit 404 includes a display device 204. By controlling these, the control unit 401 receives the input from the user of the device 200 and stores it in the storage unit 402, or stores the sequence information in the storage unit 402 to the user of the device 200. Can be displayed.
  • the sequence determination unit 405 is configured to include the sequencer 211, and is a function realized by the control unit 401 executing the program stored in the storage unit 402 and controlling the sequencer 211.
  • the first base sequence which is the base sequence of the polynucleotide derived from the membrane vesicle amplified in the gel capsule, is determined by the sequencing unit 405.
  • the confirmation unit 406 is a function realized by the control unit 401 executing the program stored in the storage unit 402.
  • the confirmation unit 406 is a base sequence derived from a membrane vesicle produced by a host bacterium when the first base sequence aligned with the reference sequence by the reference part 413 described later is mapped to the reference sequence. Provide information to confirm that.
  • the provided information is displayed on the display unit 404 controlled by the control unit 401.
  • the droplet preparation unit 407 is configured to include the micro flow path 205, and is a function realized by the control unit 401 executing the program stored in the storage unit 402 and controlling the micro flow path 205.
  • the droplet preparation unit 407 encapsulates each individual membrane vesicle contained in the first sample in the droplet.
  • the gelling unit 408 is configured to include the temperature controller 206, and is a function realized by the control unit 401 executing the program stored in the storage unit 402 and controlling the temperature controller 206.
  • the gelling unit 408 lowers the temperature of the droplets produced by the droplet producing unit 407 to gelle them to form a gel capsule.
  • the dissolution unit 409 includes a dispenser 207 connected to the dissolution reagent tank 208, the control unit 401 executes a program stored in the storage unit 402, and the dispenser 207 is controlled and realized. It is a function.
  • the lysing unit 409 contacts the gel capsule produced by the gelling unit 408 with the lysing reagent contained in the lysing reagent tank 208 to dissolve the membrane vesicles in the gel capsule.
  • the removal unit 410 is configured to include the centrifuge 210, and is a function realized by the control unit 401 executing the program stored in the storage unit 402 and controlling the centrifuge 210.
  • the removing unit 410 separates and purifies the gel capsule from the dispersion liquid containing the gel capsule, the surplus dissolving reagent (or the surplus amplification reagent tank described later), and the contaminants generated by these reactions.
  • the amplification unit 411 includes a dispenser 207 connected to the amplification reagent tank 209, the control unit 401 executes a program stored in the storage unit 402, and the dispenser 207 is controlled and realized. It is a function.
  • the amplification unit 411 discharges the amplification reagent into the gel capsule purified by the removal unit 410, and amplifies the polynucleotide derived from the membrane vesicle in the gel capsule.
  • the selection unit 412 is configured to include the flow cytometer 212, and is a function realized by the control unit 401 executing the program stored in the storage unit 402 and controlling the flow cytometer 212.
  • the selection unit 412 selects gel capsules holding a polynucleotide amplified above a predetermined level by the amplification unit 411, and individually collects them in a storage container.
  • the reference unit 413 is a function realized by the control unit 401 executing the program stored in the storage unit 402.
  • the reference unit 413 aligns the first base sequence with the reference sequence and examines whether the first base sequence maps to the reference sequence.
  • FIG. 5 is a flowchart showing the operation of the control unit 401 of the present apparatus.
  • the control unit 401 controls the droplet preparation unit 407 to instill one individual of the membrane vesicles from the first sample containing the membrane vesicles produced by the bacterium and released outside the cells. Enclose in.
  • step S502 the control unit 401 controls the gelling unit 408 to lower the temperature of the droplet and gel the droplet to generate a gel capsule.
  • a method of lowering the temperature of the droplet a method of controlling the output of the temperature controller 206 constituting the gelling unit 408 based on the program stored in the storage unit 402 can be mentioned.
  • step S503 the control unit 401 controls the dissolution unit 409 to bring the gel capsule into contact with the dissolution reagent.
  • the gel capsule in which each individual membrane vesicle is encapsulated is contained in a container together with a solvent by the gelling unit 408, and the dissolving reagent is discharged into this container.
  • the membrane vesicles encapsulated in the gel capsule are lysed, and the DNA is eluted in the gel capsule.
  • step S504 the control unit 401 controls the removal unit 410 to remove the excess dissolving reagent and the contaminants generated by the reaction between the gel capsule and the dissolving reagent. Specifically, the gel capsule is separated from the gel capsule, the dissolving reagent, and the contaminants contained in the container by the centrifuge 210.
  • step S505 the control unit 401 controls the amplification unit 411 to bring the purified gel capsule into contact with the amplification reagent.
  • DNA derived from membrane vesicles is encapsulated in the gel capsule, and this is amplified.
  • the amplification reagent sucked from the amplification reagent tank 209 is discharged by the dispenser 207 and brought into contact with the gel capsule to amplify the DNA.
  • step S506 the control unit 401 controls the sequence determination unit 405 to determine the first base sequence, which is the base sequence of the polynucleotide. Specifically, the sequencer 211 determines the first base sequence.
  • steps S505 and S506 a step of selecting a gel capsule having a predetermined or higher amplified DNA by the selection unit 412 controlled by the control unit 401 may be performed.
  • the droplets generated in step S501 without containing the membrane vesicles can be excluded from the measurement target of step S506, so that the processing capacity per hour of the apparatus may be improved.
  • step S507 the control unit 401 controls the reference unit 413 to align the first base sequence with the reference sequence and check whether the first base sequence is mapped to the reference sequence.
  • the control unit 401 controls the confirmation unit 406, and the first base sequence is a base sequence derived from a membrane vesicle produced by a bacterium. Provide information to confirm that. This information is displayed on the display unit 404 controlled by the control unit 401.
  • the confirmation unit 406 provides information for determining that the first base sequence contains some error (for example, an amplification error). May be provided.
  • the control unit 401 may control the display unit 404 to display the information on the display unit 404.
  • the device amplifies a polynucleotide (typically DNA) in a gel capsule containing individual membrane vesicles, further aligns it to a reference sequence, and when mapped, the DNA is produced by bacteria. It provides information to confirm that it is derived from the membrane vesicles produced. Therefore, for example, even if a bias occurs when DNA is amplified by using Phi29 DNA polymerase, the obtained base sequence is aligned with the reference sequence, and when it is mapped, it is judged to be derived from membrane vesicles. It is possible to accurately analyze the base sequence derived from membrane vesicles.
  • a polynucleotide typically DNA
  • a second embodiment of the apparatus of the present invention includes a droplet forming portion, a gelling portion, a dissolving portion, a removing portion, and an amplifying portion, which are included in the first embodiment of the apparatus of the present invention described above.
  • a device having a sequence determination unit, an alignment unit, and a reference unit, and further including a host determination unit and a reference sequence creation unit. Since this embodiment is the same as the first embodiment except that it has a host determination unit and a reference sequence creation unit, only the differences will be described below.
  • FIG. 7 is a functional block diagram of the present device.
  • the device 700 includes a control unit 401, a storage unit 402, an input unit 403, a display unit 404, an arrangement determination unit 405, a confirmation unit 406, a droplet preparation unit 407, a gelling unit 408, a melting unit 409, a removing unit 410, and an amplification unit. It has a selection unit 412, a reference unit 413, a reference sequence creation unit 701, and a host determination unit 702.
  • the reference sequence creation unit 701 is a function realized by the control unit 401 executing the program stored in the storage unit 402.
  • the reference sequence preparation unit 701 detects the protein coding region of the first base sequence determined by the sequencing unit 405, and uses this protein coding region as the query sequence for the result of this homology search to obtain the homologous protein coding sequence. Select the bacterium to have and create a reference sequence from the genomic sequence of this bacterium.
  • the host determination unit 702 is a function realized by the control unit 401 executing the program stored in the storage unit 402. When the first base sequence is mapped to the reference sequence, the host determinant 702 determines the bacterium having the mapped genomic sequence as the host bacterium.
  • FIG. 8 is a flowchart showing the operation of the control unit 401 of the present device.
  • the points different from the first embodiment of the apparatus of the present invention will be mainly described.
  • step S801 the control unit 401 controls the reference sequence creation unit 701 to detect the protein code of the first base sequence, and the genomic sequence recorded in a public database or the like is homologous to the protein code sequence of a known bacterium. Do a search. As a result, a bacterium having a homologous protein coding sequence is selected, and a reference sequence is created from the genomic sequence of the bacterium.
  • step S802 the control unit 401 controls the host determination unit 702 to determine the bacterium having the mapped base sequence as the bacterium.
  • the present apparatus may also display the information on the host cell (bacteria) on the display unit.
  • This device is preferably applicable when the membrane vesicles are purified from a sample collected from humans or animals. This is because, in many cases, the cell (bacteria) species contained in the collected sample is unknown, and the host cell (bacteria) of the membrane vesicles is unknown. This device can obtain a higher quality base sequence of a membrane vesicle and can also provide information on the host cell (bacteria) of the membrane vesicle.
  • Example 1 (Preparation of specimens containing membrane vesicles derived from a single cell line) Streptococcus mutans (hereinafter "SM”: Streptococcus mutans NG8), Capnocytophaga occlasea (hereinafter “CO”: Capnocytophaga ochracea DSM 7721), Porphyromonas gingivalis (hereinafter "PG”) , And Pseudomonas eruginoza (hereinafter, “PAO1”: Pseudomonas aeruguinossa PAO1) were used as bacterial strains, and they were cultured at 37 ° C. using DSMZ medium or Gifu medium.
  • SM Streptococcus mutans
  • CO Capnocytophaga occlasea
  • PG Porphyromonas gingivalis
  • PAO1 Pseudomonas eruginoza
  • a vial containing a bacterial strain and a medium was filled with an N 2 / CO 2 (80: 20 v / v) mixed gas for 20 minutes to obtain anaerobic conditions. Then, the culture was carried out until the optical concentration (OD600) of the culture solution reached 1.0. After culturing, the culture broth of the bacterial strain was centrifuged at 7800 rpm at 4 ° C. for 10 minutes. Since the membrane vesicles are contained in this supernatant, they were purified by the following method.
  • the supernatant was passed through a 0.22 ⁇ m filter to remove cell debris, and a filtered supernatant was obtained.
  • the filtered supernatant was centrifuged at 126,000 ⁇ g at 4 ° C. for over 2 hours. After ultracentrifugation, the supernatant was removed, the pelleted membrane vesicles were resuspended, placed in phosphate buffered saline (PBS) and stored at 4 ° C.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the purification of membrane vesicles was performed using an iodoxanol (OptiPrep) density gradient.
  • the 60% iodoxanol stock solution was diluted with PBS to 35%, 30%, 25%, 20%, 15% and 10%.
  • the suspension containing the preserved membrane vesicles was centrifuged at 4 ° C. at 140,000 xg for 2 hours.
  • the obtained pellet was resuspended in a 35% iodoxanol solution.
  • the six prepared iodoxanol solutions were filled in ultracentrifugal tubes in ascending order of density. At this time, a 35% suspension containing membrane vesicles was placed in a 7 mL ultracentrifugal tube at the bottom and a 10% solution at the top. The tube was ultracentrifuged at 140,000 xg, 4 ° C. for 16 hours using a swing rotor. After ultracentrifugation, 1 mL fractions were collected from each layer and stored in separate Eppendorf tubes.
  • each obtained fraction was measured using a nanoparticle tracking device, and the fraction containing the largest number of particles having a diameter of about 100 to 200 nm was "concentrated membrane vesicles". It was considered to be a "fraction" and was used for further analysis.
  • FASTp an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Described in Bioinformatics 34, 17, 2018, and for "SPAdes”, refer to Bankevic et al. , SPAdes: A New Genome Algorithm and It's Applications to Single-Cell Sequencing. J. Date. Biol. , 19, 5, 2012.
  • FIG. 9 is the above result.
  • the horizontal axis represents the type of host bacterium.
  • the vertical axis shows the percentage of membrane vesicles determined to be derived from the correct host bacterium in percentage.
  • Example 2 preparation of specimens containing saliva-derived membrane vesicles
  • saliva-derived membrane vesicles The saliva of a patient with periodontal disease was collected using a saliva collection kit. The collected saliva was passed through a 0.22 ⁇ m filter to remove cell debris, and the filtered supernatant was purified by the same procedure as in Example 1. The 192 membrane vesicle particles obtained as a result were subjected to single cell analysis by the same procedure as in Example 1.
  • the protein coding region (CDS) in the base sequence inside each membrane vesicle is predicted and detected using "prokka", which is a software tool for genomic annotation, and each of these base sequences is predicted and detected.
  • prokka a software tool for genomic annotation
  • nr the protein coding sequence of the organism over all domains registered in NCBI.
  • a sequence aligner software tool “diamond” (Buchfunk et al., Sensitive protein alignments at tree-of-life scaling, DIAMOND, 18th, 18D, NAT. 202) was used. ..
  • the phylogenetic group information tagged with each protein coding sequence information matched on the database is described in taxonkit (Shen and Ren, TaxonKit: A practical and effective NCBI taxony toolkit, J. Genetics and gent. Extraction was performed by a pipeline combining two tools (Kans, Entrez Direct: E-proteins on the Unix (registered trademark) Command Line, 2021), and the classification group of the bacteria from which each CDS was derived was identified.
  • FIG. 10 is the above result, and is a heat map showing the result (frequency) of dividing each bacterial strain at the class level and mapping the base sequence inside 192 membrane vesicles. It can be seen that each membrane vesicle is mapped to a reference sequence and its host bacterium (net) is identified.

Abstract

本発明は、宿主細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列を解析できる方法を提供する。本発明の方法は、宿主細胞で産生され、宿主細胞外に放出された膜小胞を含む第１試料を用い、これをシングルセル解析して、膜小胞の１個体に由来するポリヌクレオチドの塩基配列である第１塩基配列を決定し、得られた第１塩基配列を参照配列に整列させたとき、参照配列にマップされる場合、この第１塩基配列が、上記宿主細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列であると確認することを含む。

Description

細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列を解析する方法、その装置、及び、そのプログラム
　本発明は、細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列を解析する方法、その装置、及び、そのプログラムに関する。
　細菌に由来する細胞外ベシクル（膜小胞）は種々の機能を有していると考えられており、例えば、細菌の病原性の発現等にも寄与しているとされ、注目されている。
　特許文献１には「下記のステップを含む、細菌性重症感染疾患原因菌の同定方法：（Ａ）細菌由来のナノベシクルを含有する患者サンプルからナノベシクル内の遺伝子を抽出するステップ；（Ｂ）上記の抽出された遺伝子に対して配列番号１および２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；および（Ｃ）上記のＰＣＲ結果物が正常人に比べて増加されている場合、細菌性重症感染疾患の原因菌が存在するものと判定するステップ。」が記載されている。
特表２０１７－５３８４２１号公報
　膜小胞の（膜小胞内部の）ＤＮＡの塩基配列の解析法としては、従来、精製した膜小胞から核酸を抽出し、その全体を網羅的に解析する方法等が用いられてきた。解析のターゲットとする膜小胞が明らかな場合には、特許文献１に記載されるような特定のプライマーによって所定の配列を増幅し、シークエンスする方法等も用いられてきた。
　ところが、複数種の膜小胞が含まれる可能性のある検体を用い、個別の膜小胞のＤＮＡの塩基配列を決定しようとする場合、検体に含まれる膜小胞の種類、及び、ＤＮＡの塩基長すらも未知であることが多い。そのため、検体のＤＮＡを網羅的解析して複数の塩基配列（配列断片）を得ても、その配列が、膜小胞に由来する塩基配列の一部なのか、又は、全部なのか、更には、膜小胞の１種に由来するのか、又は、２種以上に由来するものかを認定することは容易ではなく、膜小胞の機能解明やその後の応用の妨げとなっていた。
　そこで、本発明は、宿主細胞で産生された（典型的には宿主細菌により産生された）膜小胞に由来する塩基配列を解析できる方法を提供することを課題とする。また、本発明は、その装置、及び、そのプログラムを提供することも課題とする。
　本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。
［１］　宿主細胞で産生され、上記宿主細胞外に放出された膜小胞を含む第１試料を用い、上記膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入することと、上記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成することと、上記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させて、上記膜小胞を溶解させ、上記膜小胞中のポリヌクレオチドが上記ゲルカプセルに溶出し、上記ゲルカプセル内に保持させることと、上記ポリヌクレオチドを増幅試薬に接触させて、上記ポリヌクレオチドを上記ゲルカプセル内で増幅することと、上記増幅したポリヌクレオチドから、上記ポリヌクレオチドの塩基配列である第１塩基配列を決定することと、上記第１塩基配列を参照配列に整列させて上記第１塩基配列が上記参照配列にマップするかを調べることと、上記第１塩基配列が上記参照配列にマップされる場合、上記第１塩基配列が、上記宿主細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列であると確認することと、を含む、方法。
［２］　上記宿主細胞が、宿主細菌である、［１］に記載の方法。
［３］　上記参照配列が、上記第１試料のメタゲノム解析によって得られた塩基配列である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］　上記参照配列が、上記宿主細胞のゲノム配列である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］　上記参照配列が、ゲノム配列が既知の細胞の上記ゲノム配列の集合であり、上記第１塩基配列が上記参照配列にマップされる場合、上記マップされたゲノム配列を有する上記細胞を上記宿主細胞と決定することを更に含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［６］　上記第１塩基配列を決定した後、上記第１塩基配列におけるタンパク質コード領域を検出し、上記タンパク質コード領域をクエリー配列とした相同性検索によって、上記タンパク質コード領域と相同のタンパク質コード配列を有する上記細胞を選択し、上記細胞のゲノム配列から上記参照配列を作成することを含む、［５］に記載の方法。
［７］　更に、上記第１試料を核酸分解酵素で処理することを含む［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］　更に、上記宿主細胞と、上記膜小胞とを含む懸濁液から、上記宿主細胞と上記膜小胞とを分離させ、上記膜小胞を含む上記第１試料と、上記宿主細胞を含む第２試料とを得ることと、を含む［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］　更に、上記第２試料を用いて、上記参照配列を得ることと、を含む［８］に記載の方法。
［１０］　上記参照配列を得ることが、上記第２試料をメタゲノム解析して、得られる塩基配列を上記参照配列とすることである、［９］に記載の方法。
［１１］　上記参照配列を得ることが、上記第２試料を１６Ｓ　ｒＲＮＡ解析して、上記第２試料の細菌組成を推定し、上記細菌組成の塩基配列を上記参照配列とすることである、［９］に記載の方法。
［１２］　上記参照配列を得ることが、上記第２試料をシングルセル解析して、得られる塩基配列を上記参照配列とすることである、［９］に記載の方法。
［１３］　上記参照配列を得ることが、上記第２試料をメタゲノム解析して得られた塩基配列と、上記第２試料をシングルセル解析して得られた塩基配列とをマージして上記参照配列とすることである、［９］に記載の方法。
［１４］　上記懸濁液が、ヒト又は動物から採取した、糞便、唾液、喀痰、手術洗浄液、血液、並びに、皮膚又は身体粘膜の拭い液、及び、スワブからなる群より選択される少なくとも１種の採取試料である、［８］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］　上記宿主細菌が、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、ベイヨネラ属、フソバクテリウム属、パルビモナス属、アグリゲイティバクター属、アクチノマイセス属、アクチノバチルス属、バクテロイデス属、タンネレラ属、トレポネーマ属、カンピロバクター属、エイケネラ属、ストレプトコッカス属、及び、カプノサイトファーガ属からなる群より選択される少なくとも１種の細菌である、［２］に記載の方法。
［１６］　更に、上記第１塩基配列をクラスタリングして、上記膜小胞の異種性を確認すること、を含む［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］　宿主細胞で産生され、上記宿主細胞外に放出された膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入する液滴作製部と、上記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲル化部と、上記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させる溶解部と、上記ゲルカプセルから夾雑物質を除去する除去部と、上記ゲルカプセルを増幅試薬に接触させ、ゲルカプセル内のポリヌクレオチドを増幅する増幅部と、上記ポリヌクレオチドの配列である第１塩基配列の決定を行う配列決定部と、上記第１塩基配列を参照配列に整列させて上記第１塩基配列が上記参照配列にマップするかを調べる参照部と、上記第１塩基配列が上記参照配列にマップされる場合、上記第１塩基配列が、上記宿主細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列であると確認するための情報を提供する確認部と、を有する装置。
［１８］　宿主細胞で産生され、上記宿主細胞外に放出されたた膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入する液滴作製部と、上記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲル化部と、上記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させる溶解部と、上記ゲルカプセルから夾雑物質を除去する除去部と、上記ゲルカプセルを増幅試薬に接触させ、ゲルカプセル内のポリヌクレオチドを増幅する増幅部と、を有する装置に、コンピュータにより、宿主細胞で産生され、上記宿主細胞外に放出された膜小胞を含む第１試料を用い、上記膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入する手順と、上記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する手順と、上記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させて、上記膜小胞を溶解させ、上記膜小胞中のポリヌクレオチドが上記ゲルカプセルに溶出し、上記ゲルカプセル内に保持させる手順と、上記増幅したポリヌクレオチドから、上記ポリヌクレオチドの塩基配列である第１塩基配列を決定する手順と、上記第１塩基配列を参照配列に整列させて上記第１塩基配列が上記参照配列にマップするかを調べる手順と、上記第１塩基配列が上記参照配列にマップされる場合、上記第１塩基配列が、上記宿主細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列であると確認する手順と、を実行させるプログラム。
［１９］　［１］～［１６］のいずれかに記載の方法により得られた上記膜小胞に由来する塩基配列。
　本発明によれば、宿主細胞で産生された（典型的には宿主細菌により産生された）膜小胞に由来する塩基配列を解析できる方法が提供できる。また、本発明によれば、装置、及び、プログラムも提供できる。
本発明の方法の第１の実施形態のフローチャートである。 本発明の装置の第１の実施形態のハードウェア構成図である。 マイクロ流路の実施形態を示す模式的な断面図である。 本発明の装置の第１の実施形態の機能ブロック図である。 本発明の装置の第１の実施形態の制御部の動作を示すフローチャートである。 本発明の方法の第２の実施形態のフローチャートである。 本発明の装置の第２の実施形態の機能ブロック図である。 本発明の装置の第２の実施形態の制御部の動作を示すフローチャートである。 ｋ－ｍｅｒ　ｉｄｅｎｔｉｔｙを指標にして各膜小胞粒子内の塩基配列と最も相同性の高い配列を探索し、それが宿主細菌株の塩基配列かを調べた結果である。 ヒト唾液サンプルから膜小胞を精製し、１９２個の膜小胞粒子について検出された塩基配列の情報を基に、各膜小胞内部の塩基配列が由来する細菌の分類群の特定を行なった結果である。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
　なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
　本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は上記分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は二本鎖と一本鎖のＤＮＡ、及び、ＲＮＡを含む。
　本明細書において、「膜小胞」とは、典型的には、宿主細菌の細胞膜の一部が菌体外にくびり取られるようにして産生されたマイクロベシクルである「外膜小胞（ＯＭＶ；ｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｖｅｓｉｃｌｅ）」が挙げられ、その大きさは、特に制限されないが、１０～１０００ｎｍである場合が多く、グラム陰性細菌では１０～３００ｎｍであることが多く、グラム陽性細菌では５０～１５０ｎｍであることが多い。
　なお、本明細書において、膜小胞には、宿主細菌等により産生される外膜小胞、動物細胞等により、エンドサイトーシス経路により産生、放出される「エクソソーム」、及び、アポトーシスによって生ずる「アポトーシス小体」も含まれるものとし、なかでも、膜小胞としては、外膜小胞（ＯＭＶ）が好ましい。
　宿主細胞としては特に制限されず、真核生物、細菌、又は、古細菌のいずれの細胞であってもよいが、以下では、典型例として、宿主細胞が宿主細菌である場合について述べる。なお、本明細書において「宿主細胞」とは、分析対象となる膜小胞を産生した細胞を意味し、「宿主細菌」とは、分析対象となる膜小胞を産生した細菌を意味する。
　本明細書において、「シングルセル解析」とは、細胞（細菌）、及び、膜小胞等を１個体ずつ分離してその塩基配列を解析する方法を意味し、「単一粒子解析」等とも称される方法を意味する。
[方法（１）]
　図１は、本発明の方法の第１の実施形態（以下「本方法」ともいう。）のフローチャートである。
　ステップＳ１０１は、宿主細菌が産生した膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入する工程（封入工程）である。封入工程で用いられる第１試料は、膜小胞を含む。試料に含まれる膜小胞は、１種でも２種以上でもよい。この膜小胞は、宿主細菌が産生し、菌体外に放出したものであり、第１試料は、典型的には、宿主細菌と、膜小胞とを含む懸濁液から、宿主細菌等の膜小胞以外の成分を分離除去することで得られたものである。
　膜小胞を含む第１試料は、精製されたものであることが好ましい。第１試料に対する膜小胞以外の核酸成分の混入を抑制することで、最終的に、膜小胞の（膜小胞に由来する）ポリヌクレオチドが得られやすい。
　第１試料は、宿主細菌が産生し、菌体外に放出した膜小胞を含んでいればよく、その膜小胞は、単一の宿主細菌株に由来するものであっても、複数種の細菌（群）に由来するものであってもよい。なお、複数種の細菌（群）には、１種又は２種以上の宿主細菌が含まれる。
　本方法は、封入工程の前に、膜小胞を含む懸濁液から、上記膜小胞を分離取得する工程を有してもよい（前処理工程）。
　懸濁液には、宿主細菌が含まれてもよく、宿主細菌が含まれている場合、上記工程は、膜小胞を含む第１試料と、細菌を含む第２試料とを得る工程であってもよい。
　前処理工程で用いられる懸濁液は、膜小胞を含み、宿主細菌が含まれていてもよい。懸濁液に宿主細菌が含まれる場合、宿主細菌は培養された単一の細菌株として懸濁液に含まれてもよい。この場合、懸濁液は、典型的には液体培地で培養した上記細菌株の培養試料である。
　また、懸濁液は、ヒトや動物から取得され、複数種の細菌（このうちの１種以上が難培養性細菌であってもよい）が含まれるものでもよい。
　懸濁液としては、例えば、ヒト又は動物から採取した、糞便、唾液、喀痰、手術洗浄液、血液、皮膚・身体粘膜の拭い液、及び、スワブ等の採取試料であってもよい。一般に、採取試料中には、細菌群と、それに含まれる宿主細菌により産生された膜小胞とが含まれる場合がある。
　このような採取試料を上記懸濁液として用いる場合、採取試料から膜小胞と細菌群とを分離して、第１試料と第２試料とにすればよい。
　一般に、採取試料には難培養性細菌が含まれていることがある。従来、難培養性細菌に由来する膜小胞の分類、機能研究、及び、利用は特に困難で進まなかった。
　細菌株の産生する膜小胞の機能解析には、細菌株を培養して膜小胞を大量に産生させて、それを解析する、という手法が適用できる。一方、難培養性細菌では、その手法が適用できなかった。難培養性細菌の産生する膜小胞の機能解析が進まないことは、それが一因となっていた。
　また、採取試料中に難培養性細菌に由来する膜小胞が含まれていたとしても、絶対量、及び、相対量ともに従来法による網羅的解析に十分な量は含まれてないことが多いと考えられ、このことが解析をより一層困難にしていた。
　一方で、本発明の方法によれば、採取試料、及び、培養試料に含まれる膜小胞の量が少なかったとしても、その１個体ずつを分離し、膜小胞の１個体の（１固体に由来する）ポリヌクレオチドを増幅して解析するため、所望のデータを得ることができる。
　解析対象とする膜小胞を産生する宿主細菌としては特に制限されないが、真正細菌、大腸菌、枯草菌、藍色細菌、球菌、桿菌、ラセン菌、グラム陰性菌、グラム陽性菌、古細菌、及び、真菌等が挙げられる。細菌としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｎｅｇｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｅ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｌｅｓ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘａｌｅｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｇｅｍｍａｔｉｓｐｏｒａｌｅｓ、Ｇｌｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｎｏｓｔｏｃｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｏｐｈｙｃｉｄａｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｎｏｓｔｏｃｏｐｈｙｃｉｄａｅ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ、Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａｌｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｂｅａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｉｇｎａｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｉｇｎａｖｉｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｉａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃｙｔｏｐｈａｇｉａ、Ｃｙｔｏｐｈａｇａｌｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｌｅｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅｓ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｏｐｉｔｕｔａｅ、Ｏｐｉｔｕｔａｌｅｓ、Ｐｕｎｉｃｅｉｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｓｐａｒｔｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒｉａ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｌｅｓ、Ｖｉｃｔｉｖａｌｌａｌｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ、Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａｌｅｓ、Ｋｏｒｄｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｓｎｅａｔｈｉｅｌｌａｌｅｓ、Ｋｉｌｏｎｉｅｌｌａｌｅｓ、Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌａｌｅｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｌｅｓ、Ｐｒｏｃａｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｈｒｏｍａｔｉａｌｅｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｔｈｉｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｅｌｌａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆａｒｃｕｌａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｅｐｓｉｌｏｎｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｎａｕｔｉｌｉａｌｅｓ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｈｏｌｏｐｈａｇａｅ、Ｈｏｌｏｐｈａｇａｌｅｓ、Ａｃａｎｔｈｏｐｌｅｕｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ａｑｕｉｆｉｃａｌｅｓ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｇｅｏｖｉｂｒｉａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉａ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃｉａ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａｌｅｓ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｉａ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｈｔｈｏｎｏｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｃｈｔｈｏｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄｉａ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｐｏｓｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａｌｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｎｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｅｎｔｏｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａｌｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｆｒａｎｋｉａｌｅｓ、Ｇｌｙｃｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｊｉａｎｇｅｌｌａｌｅｓ、Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａｌｅｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｌｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｌｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉａｌｅｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉａ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍａｌｅｓ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎａｌｅｓ、Ｈａｌｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ等が挙げられる。
　また、一形態として、宿主細菌は歯周病菌（歯周病の原因菌）が好ましい。歯周病菌としては、例えばポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、ベイヨネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、パルビモナス（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ）属、アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ）属、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｒｉｄｅｓ）属、タンネレラ（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ）属、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔａｒ）属、エイケネラ（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、及びカプノサイトファーガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）属等が挙げられる。
　より具体的には、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）又はバクテロイデス・ジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｒｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ベイヨネラ・パルブーラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｐａｒｖｕｌａ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ　ｍｉｃｒａ）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）又はアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、アクチノマイセス・ネスランディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、タンネレラ・フォーサイセンシス（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、カンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔａｒ　ｒｅｃｔｕｓ）、エイケネラ・コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ　ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、カプノサイトファーガ・オクラセア（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｏｃｈｒａｃｅａ）、及び、ストレプトコッカス　ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）等が挙げられる。
　なかでも、宿主細菌としては、「レッドコンプレックス」と呼ばれる、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、及び、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）からなる群より選択される少なくとも１種の細菌が好ましい。
　懸濁液において細菌（群）と膜小胞とを分離する方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、単一の細胞株の液体培養液であれば、膜小胞は培養上清に含まれているため、遠心分離によって、培養液から菌体を取り除くことにより分離できる。細菌株を固体培養した場合には、コロニーを緩衝液中に懸濁して、同様の方法で分離できる。
　分離した遠心上清をメンブランフィルター（例えば、孔径０．１～０．９μｍ）を用いてろ過すれば、上清に残留する菌体を容易に除去することができる。
　遠心上清には、細菌体以外にもタンパク質等の夾雑物質が含まれている場合があるので、例えば、１００～２００ｋＤａカットオフフィルタで濃縮した後、超遠心によって膜小胞を沈殿させて回収する方法も使用できる。
　また、このようにして得られた沈殿物には、微生物由来の構造体（例えば、せん毛、及び、べん毛等）が含まれていることがあり、これらを除去するために、例えば、スクロース等を用いた密度勾配遠心法を用いて、更に精製する方法を用いてもよい。
　また、本発明者らは、膜小胞の表面には、膜小胞に由来しない核酸成分が付着している場合が多いことを知見している。そこで、本方法は、得られた第１試料に更に核酸分解酵素を作用させ、これらの核酸成分を分解する工程を有することが好ましい。このような酵素としては、公知のものを使用でき、例えば、デオキシリボヌクレアーゼ等が挙げられる。
　単一細胞株の培養液から第１試料を得る具体的な方法について説明する。
　まず、所定の条件で所望の増殖相が達成されたら、培養液を容量が１～１００ｍＬの遠心管に入れ、３０００～９０００ｒｐｍ、１～２０℃で、１～３０分間遠心する。
　上清と沈殿物とに分離できたら沈殿物を廃棄し、上清を０．１～０．９μｍのフィルターに通し、別の遠心管に収容し、１～１０℃で保存する。
　次に、上清を超遠心チューブに加え、例えば、遠心力として１５０，０００～３００，０００×ｇで、１～１０℃で１～３時間超遠心する。超遠心後、上清を破棄し、沈殿した外膜小胞（ＯＭＶ）を緩衝液（例えば、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー）に再懸濁し、１～１０℃で保存する。更に、この超遠心の工程を複数回繰り返してもよい。
　この懸濁液を第１試料としてもよい。この懸濁液に対して、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を加えて、外膜小胞に付着した核酸を分解処理し、これを第１試料としてもよい。デオキシリボヌクレアーゼ処理を行うことで、夾雑物質（核酸成分）の混入が抑制されるため、より精度の高い測定ができる。
　デオキシリボヌクレアーゼの添加量としては特に制限されないが、例えば、上記懸濁液の１０μＬを１０倍希釈して、そこへ２μＬのＤＮａｓｅ（２０００Ｕ）を添加する方法が挙げられる。
　また、懸濁液の単位量あたりに含まれる膜小胞の数（濃度）を調整するために、懸濁液を希釈し、それを第１試料としてもよい。懸濁液を希釈して、膜小胞の濃度を調整することで、１つの液滴に膜小胞の２つ以上が封入される可能性がより低くなる。言い換えれば、より確実に１個体ずつを液滴中に封入しやすくなる。
　懸濁液の希釈の方法としては特に制限されないが、例えば、膜小胞の濃度を動的光散乱法等により懸濁液中の膜小胞の濃度を観察しながら、適当な濃度に希釈する方法が挙げられる。
　膜小胞の濃度の観察方法としては、粒子にレーザを照射し、その散乱光から各粒子のブラウン運動を追跡し（トラッキング法）、その拡散速度から、Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎの式に基づき粒子の径と個数とを計算する方法が好ましい。
　第１試料を用いて、第１試料に含まれる膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入する方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。
　液滴の作製は、例えば、マイクロ流路を用いて行うことができる。上述した懸濁液をマイクロ流路中に流動させ、懸濁液の流れをせん断することにより、１個体ずつの膜小胞を封入した液滴を作製できる。せん断は、一定間隔で行うことができる。懸濁液のせん断の方法としては、例えば、オイルを用いればよい。オイルとしては、例えば、鉱物油、植物油、シリコーンオイル、及び、フッ素化オイル等が挙げられる。懸濁液中の膜小胞の量（濃度）、流路中の流速、せん断の間隔を調整し、当業者は、液滴あたり１個体の膜小胞が封入されるように液滴作製を行うことが可能である。
　液滴の直径は、１～２５０μｍが好ましく、１０～２００μｍがより好ましい。
　ステップＳ１０２は、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程である。ゲル化方法としては特に制限されない。液滴のゲル化は、液滴にゲルカプセルの材料が含まれるように構成し、作製した液滴を冷却することによって行うことができる。あるいは、液滴に対して光等の刺激を与えることによってゲル化を行うこともできる。液滴にゲルカプセルの材料が含まれるようにするには、例えば、第１試料にゲルカプセルの材料を含めておくことによって行うことができる。
　ゲルカプセルの直径としては、１～２５０μｍが好ましく、１０～２００μｍがより好ましい。ゲルカプセルの直径は、作製する液滴と同じであってもよいが、ゲル化に際して直径が変化してもよい。
　ゲルカプセルの材料は、アガロース、アクリルアミド、光硬化性樹脂（例えば、ＰＥＧ-ＤＡ）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、マトリゲル、及び、コラーゲン等を含んでもよい。
　ゲルカプセルは、ヒドロゲルカプセルであってよい。「ヒドロゲル」とは、高分子物質又はコロイド粒子の網目構造によって保持されている溶媒あるいは分散媒が水であるものを意味する。
　ステップＳ１０３は、ゲルカプセルを溶解試薬と接触させて、膜小胞を溶解させ、ポリヌクレオチドを溶出させ、ゲルカプセル内に保持する工程である。膜小胞を溶解することで、膜小胞中のポリヌクレオチドがゲルカプセル内に溶出し、ポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態でゲルカプセル内に保持され得る。溶解試薬としては、酵素、界面活性剤、その他変性剤、還元剤、及び、ｐＨ調製剤、並びに、これらの組合せ等が使用できる。
　溶解試薬は、リゾチーム、ラビアーゼ、ヤタラーゼ、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ザイモリアーゼ、キチナーゼ、リソスタフィン、ムタノライシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、フェノール、クロロホルム、グアニジン塩酸塩、尿素、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）－ＨＣｌ、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標） Ｐ－４０、Ｂｒｉｊ（登録商標）－３５、Ｂｒｉｊ－５８、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ　８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＣＨＡＰＳＯ（３－［（３－Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ドデシル－β－Ｄ－マルトシド、及び、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３－１２等が挙げられる。
　また、溶解試薬は、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ドデシル硫酸ナトリウム、及び、水酸化カリウム等を含むことが好ましい。
　ステップＳ１０４は、ゲルカプセル内の夾雑物質を除去する工程である。本方法では、膜小胞の１個体を封入したゲルカプセルを用いるため、精製した遺伝物質（例えば、ＤＮＡ）をゲルカプセル内に保持することができ、また、外部からの分子の夾雑の可能性を排除することができる。
　また、操作面でも非常に簡単な操作で、１単位ごとの大量の膜小胞を並列処理することができる。ゲル化した液滴を含む試験管を遠心し、上清を除去し、洗浄液に置換するというステップを行うことができる。あるいは、ゲル化した液滴をフィルターでろ過し、上清を除去したのち、洗浄液を通液させ、最後にゲルカプセルを回収するというステップでも行うことができる。ゲルカプセルを用いることにより、遺伝物質を保持したまま、残留試薬を希薄化することができる。このステップは繰り返すことも可能である。阻害が出ないレベルにまで試薬を希薄化することで、下流の操作、例えば、増幅反応をスムーズに行うことができる。
　溶解試薬が下流の反応の前に十分に除去されると、ＤＮＡ増幅等の反応が阻害されにくい点で好ましい。ゲルカプセルを用いる場合、ゲルカプセルによって解析又は増幅の対象となる遺伝物質が保持されるため、遺伝物質が少量である膜小胞１つあたりの解析においても溶解試薬の除去を行うことができ、そのため、強力な溶解試薬又は溶解試薬の組合せを用いることが可能である。
　そして、強力な溶解試薬又は溶解試薬の組み合せを用いることは、より確実な核酸の増幅、及び、塩基配列の解析を可能にし得る。
　ステップＳ１０５は、ポリヌクレオチドを増幅試薬に接触させてポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅させる工程である。増幅試薬に浸漬した後、必要に応じて、ゲルカプセルの温度を調整してもよい。
　加熱は、ゲル（例えば、アガロースゲル）が溶解しにくい観点で、６０℃以下が好ましい。この範囲内での加熱は、ＤＮＡの増幅をより促進する点で好ましい。
　増幅に用いる酵素としては、例えば、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ａａｃポリメラーゼ、及び、リコンビナーゼポリメラーゼが挙げられる。
　本方法では、ゲル内の全ＤＮＡの増幅を行うために、ランダムプライマーを用いることが好ましい。
　ステップＳ１０６は、増幅したポリヌクレオチドから、第１塩基配列を決定する工程である。増幅したポリヌクレオチドからその塩基配列を決定する方法としては、ライブラリー調製、シークエンス、及び、アセンブリ等のいずれも市販の試薬キット、装置、及び、アプリケーションソフトウェア等を特に制限なく使用できる。
　ステップＳ１０７は、得られた第１塩基配列を参照配列に整列させて第１塩基配列が参照配列にマップするかを調べる工程である。
　これが、参照配列にマップされる場合（ステップＳ１０８：ＹＥＳ）、第１塩基配列が宿主細菌で産生された膜小胞に由来する塩基配列である（膜小胞の内部の塩基配列）と確認される（ステップＳ１０９、確認工程）。
　ここで、「マップされる」とは、第１塩基配列が、参照配列が有する塩基配列の一部の領域と一致することを意味する。一致とは、配列の９０％以上が同一であることを意味し、９５％以上が好ましく、９９％以上がより好ましく、完全に同一であることが更に好ましい。
　一形態として、参照配列は、第１試料のメタゲノム解析によって得られた塩基配列であってもよい。本明細書において、「第１試料のメタゲノム解析」とは、第１試料からＤＮＡを抽出して、網羅的解析法により塩基配列を得る方法を意味する。メタゲノム解析の具体的な方法は、当業者にとって公知である。
　本方法は、ゲルカプセル内でポリヌクレオチドを増幅する工程を有している。増幅工程においては、使用するプライマー同士が結合したり、キメラ配列が生成したりして、膜小胞のポリヌクレオチド以外のヌクレオチドが増幅される可能性がある。一方、第１試料をメタゲノム解析する場合、増幅を介さずに配列情報を得るため、これにより得られる配列を参照配列とすれば、この参照配列に第１塩基配列がマップすれば、増幅工程等におけるエラーが生じていないことが確認できる。
　他の形態として、第１試料に含まれる膜小胞が単一の細胞株に由来するとき、すなわち、第１試料が、単一の細菌株が産生した膜小胞を精製したものであるとき、参照配列は、その細胞株のゲノム配列であってもよい。その細胞株のゲノム配列が既知であれば、その既知配列が参照配列となる。
　また、その単一の細胞株のゲノム配列を解析（例えば、シングルセル解析）して、その配列を参照配列としてもよい。その際の解析法としては特に制限されず、例えば、国際公開２０１９－２１６２７１号に記載の方法等を用いることができる。
　参照配列が細菌株のゲノム配列であるとき、第１塩基配列が参照配列にマップされることは、膜小胞がその細菌株に由来することを強く示唆する情報であり、正しく解析が行われたことの目安となる。
　本方法は、ゲルカプセル内でポリヌクレオチドを増幅する工程を有している。増幅工程においては、使用するプライマー同士が結合したり、キメラ配列が生成したりして、膜小胞のポリヌクレオチド以外のヌクレオチドが増幅される可能性がある。このようなポリヌクレオチドのコンタミネーションが起こったか否かを、本工程によって確認できる。
　すなわち、本工程において、第１塩基配列が参照配列にマップされる場合には、その塩基配列（第１塩基配列）は、各工程においてエラーやコンタミネーションが生じていないことを示すものであり、これによって、第１塩基配列が、上述した宿主細菌に由来することが確認できる。
　一方で、第１塩基配列が参照配列にマップされない場合（ステップＳ１０８：ＮＯ）、上流の各工程において何らかのエラー（例えば、上述した増幅の問題）が生じている可能性が強く示唆されるため、解析を終了し、その第１塩基配列を破棄すればよい。
　他の形態として、第１塩基配列に含まれる膜小胞の宿主（由来）が不明、すなわち、解析対象が、複数種の細菌が含まれる検体から精製した膜小胞である場合等は、参照配列は、複数種の細菌のゲノム配列の集合とすればよい。ゲノム配列の集合は、上記の「複数種の細菌」の組成が明らかであれば、「Ｇｅｎｂａｎｋ」等のデータベース等から「複数種の細菌」のそれぞれのゲノム配列を取得し、それをリスト化して用いればよい。
　一方、宿主細菌の候補となるべき細菌（上記「複数種の細菌」）の組成、及び／又は、ゲノム配列が未知であれば、後述するように、第２試料の網羅的解析の結果を参照配列としてもよい。その場合、本方法は、第２試料のメタゲノム解析、及び／又は、シングルセル解析を行って参照配列を決定する工程を更に有していてもよい。
　例えば、第１試料が、複数種の細菌と膜小胞とを有する懸濁液から分離されたものであり、膜小胞が上記複数種の細菌のいずれかによって産生されたものである場合、言い換えれば、複数種の細菌の中に、宿主細菌が含まれている場合について説明する。
　このとき、第１塩基配列が、上記「複数種の細菌」のゲノム配列のリストである参照配列にマップされる場合、第１塩基配列は、マップされたゲノム配列に対応する細菌によって産生されたものと確認できる。また同時に、宿主細菌が、上記「対応する細菌」であると決定できる。
　上記参照配列は、上記「複数種の細菌」を含む第２試料の解析から得られた塩基配列でもよいし、「Ｇｅｎｂａｎｋ」等の公共データベースに収録された既知の細菌のゲノム配列のリスト、及び、このゲノム配列から選択して取得されたゲノム配列のリスト等であってもよい。
　一方で、第１塩基配列が参照配列に含まれるいずれの配列にもマップされない場合、第１塩基配列は上流工程における何らかのエラーによって生成されたことが強く示唆されるため、その場合、その第１塩基配列を破棄すればよい。
　懸濁液に含まれる複数種の細菌から参照配列を得る方法としては、特に制限されないが、一形態として、第２試料を用いて参照配列を得る方法が好ましい。第２試料を用いて参照配列を得るには、例えば、第２試料をメタゲノム解析して参照配列を得る方法、第２試料を１６Ｓ　ｒＲＮＡ解析して、既存のデータベースを用いて第２試料の細菌組成を推定し、その細菌組成から参照配列を推測する方法、及び、第２試料をシングルセル解析して参照配列を得る方法等が挙げられ、増幅工程を経ない観点では、第２試料をメタゲノム解析して参照配列を得る方法が好ましい。
　本方法は膜小胞由来のポリヌクレオチドを増幅する工程を有しており、増幅工程を経ない解析方法により得られたゲノム配列にマップすることにより増幅によるエラーをより高感度に検知できるからである。
　また、参照配列を得る方法としては、第２試料をメタゲノム解析して得られた配列と、第２試料をシングルセル解析して得られた配列とをマージして参照配列を得る方法であってもよい。シングルセル解析して得られる配列の全体と、メタゲノム解析して得られる配列とを対比して合成することで、互いの結果の不明確な部分が補完されてより解像度の高い参照配列が得られる。
　第２試料をメタゲノム解析して得られた配列と、シングルセル解析して得られた配列とをマージする方法としては特に制限されず、従来公知の相同性検索アルゴリズムを使用して、アラインメントすればよい。より具体的には、公知のパラメータにより「ＦＡＳＴＡ」プログラム等のコンピュータアルゴリズムを利用して、相同性検索を実施すればよい。また、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズムを用いてもよい。ＢＬＡＳＴ、又は、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてもよい。
　本方法は、更に、得られた第１塩基配列をクラスタリングして、膜小胞の異種性を確認する工程を有していてもよい。従来、膜小胞のＤＮＡの網羅的解析では、試料に１種の膜小胞が含まれているのか、又は、複数種の膜小胞が含まれているのかを確認するのは困難だった。例えば、ショットガンメタゲノミクス解析で得られた配列から、試料にいくつの膜小胞が含まれるのかを判断することは困難だった。なぜなら、膜小胞のポリヌクレオチドがどれほどの塩基長を有しているか、また、試料に複数の膜小胞が含まれているとして、そもそも何種類の膜小胞が含まれているのか、それぞれの塩基長が同一なのか異なるのか、という事すらも不明な場合が多く、得られた配列のどの部分が個々の膜小胞に対応しているのかを判別するのが困難だからである。
　一方、本方法は、あらかじめ膜小胞を１固体ずつ分離し、そのＤＮＡを解析するとともに、増幅等の工程によるエラーを排除するための工程（確認工程）を有しているため、確実に、膜小胞の各々に由来するポリヌクレオチドの塩基配列を得ることができる。そのため、これをクラスタリングすることで、第１試料に含まれる膜小胞の異種性を確認することができる。
　膜小胞の異種性を確認することは、従来法では困難であり、本方法により初めて可能になったものである。第１試料中の膜小胞の異種性を確認することは、各々の膜小胞の機能解析、及び、その利用に不可欠である。
　従来、ＯＭＶをメタゲノミクス解析しようとすると、解析に必要な量のＤＮＡを得るために、大スケールで実験を行う必要があり、理論上は可能であるものの実現には多くの困難があり、実現しなかった。
　しかし、本方法を用いれば、従来必要と考えられていたサンプル量の１００分の１未満の量で、かつ、正確なＯＭＶの配列を得ることができる。
[方法（２）]
　図６は、本発明の方法の第２の実施形態（以下、「本方法」ともいう。）のフローチャートである。以下では、すでに説明した、本発明の方法の第１の実施形態との相違点を中心に説明する。
　すでに説明した本発明の方法の第１の実施形態と本方法との相違点の１つは、ステップＳ１０６（増幅したポリヌクレオチドから、第１塩基配列を決定する工程）の後に、ステップＳ６０１として、第１塩基配列におけるタンパク質コード領域を検出し、このタンパク質コード領域をクエリー配列とした相同性検索（リファレンスは、後述のデータベースのタンパク質コード配列でよい）によって、上記タンパク質コード領域と相同のタンパク質コード配列を有する細菌を選択し、上記細胞のゲノム配列から参照配列を作成する工程（参照配列作成工程）を有することである。
　第１塩基配列におけるタンパク質コード領域の検出方法としては特に制限されず、当業者にとって公知の方法を使用することができる。例えば、ゲノムアノテーションのためのソフトウェアツールである「ｐｒｏｋｋａ」（Ｓｅｅｍａｎｎ，　Ｐｒｏｋｋａ：　ｒａｐｉｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，　３０，　１４，　２０１４）等を用いると、より容易に行うことができる。
　検出されたタンパク質コード領域について、相同性検索を行う方法としては特に制限されないが、典型的には、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、及び、ＥＢＩ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）等が提供する公共データベースの全ドメインにわたる生物のタンパク質コード配列をリファレンスとして相同性検索を行う方法が挙げられる。なお、相同性検索には公知のソフトウェアツールを用いることができる。
　相同性検索の結果から得られた、相同なタンパク質コード配列をもとに細菌を選択する方法としては、データベース上でマッチングした各タンパク質コード配列情報にタグ付けされている注釈をもとに、対応する細菌を特定する方法が挙げられる。
　上記の手順によって選択された細菌のゲノム配列（こちらも上記公共データベースから取得される）が参照配列となる。
　このとき、選択された上記「細菌」は、いわば宿主細菌の候補となる細菌であり、複数種が含まれてもよい。その場合、参照配列は、複数の「細菌」のゲノム配列を含むリストとなる。
　本方法は、上述のとおり、第１塩基配列のタンパク質コード領域を用いた相同性検索によって宿主細菌の候補となる細菌種を絞って、公共データベースの全体よりも小さなリストである参照配列を作成する工程を有する。
　そのため、膜小胞の宿主細菌が不明である場合も、より簡便に参照配列の範囲を絞り込むことができ、後段の、第１塩基配列の参照配列への整列とマップの可否評価をより迅速に、かつ、より確実に行うことができる。
　本発明の方法の第１の実施形態と本方法との相違点の２つ目は、ステップＳ１０７（得られた第１塩基配列を参照配列に整列させて第１塩基配列が参照配列にマップするかを調べる工程）の後に、これが、参照配列にマップされる場合（ステップＳ１０８：ＹＥＳ）、ステップＳ６０２として、マップされたゲノム配列を有する細胞を宿主細胞と決定する工程を含むことである。
　解析対象の膜小胞が、ヒト又は動物から採取した採取試料から精製される等して、宿主細菌が不明な場合に、参照配列の中に、第１塩基配列がマップされる塩基配列があった場合（すなわち、第１塩基配列が参照配列にマップされた場合）、そのマップされた配列（ゲノム配列）を有する細菌は、その膜小胞の宿主細菌であると強く示唆される。
　本方法は、上記工程を有するため、膜小胞がヒト又は動物から採取した採取試料から精製されたものである場合に好ましく適用できる。多くの場合、採取試料中に含まれる細菌種は不明であり、膜小胞の宿主細菌が不明であるからである。本方法によれば、第１塩基配列の確認とともに、宿主細菌の特定もできる。
［装置（１）］
　本発明の装置の第１の実施形態は、宿主細胞で産生され、宿主細胞外に放出された膜小胞を１個体ずつ液滴中に封入する液滴作製部と、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲル化部と、ゲルカプセルを溶解試薬と接触させる溶解部と、ゲルカプセルから夾雑物質を除去する除去部と、ゲルカプセルを増幅試薬に接触させ、ゲルカプセル内のポリヌクレオチドを増幅する増幅部と、ポリヌクレオチドの配列である第１塩基配列の決定を行う配列決定部と、第１塩基配列を参照配列に整列させて第１塩基配列が参照配列にマップするかを調べる参照部と、第１塩基配列が参照配列にマップされる場合、第１塩基配列を宿主細菌で産生された膜小胞であると確認するための情報を提供する確認部と、を有する装置である。
　上記装置について、図面を参照しながら詳述する。図２は、本装置のハードウェア構成図である。
　装置２００は、プロセッサ２０１と、記憶デバイス２０２と、入力デバイス２０３と、表示デバイス２０４と、マイクロ流路２０５と、温調器２０６と、分注器２０７（溶解試薬タンク２０８、及び、増幅試薬タンク２０９が接続されている）と、遠心分離器２１０と、シークエンサ２１１と、フローサイトメータ２１２と、を有しており、各ハードウェアはバスを介して相互にデータを授受できるよう構成されている。
　プロセッサ２０１は、例えば、マイクロプロセッサ、プロセッサコア、マルチプロセッサ、ＡＳＩＣ（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｃｉｒｃｕｉｔ）、ＦＰＧＡ（ｆｉｅｌｄ　ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　ｇａｔｅ　ａｒｒａｙ）、及び、ＧＰＧＰＵ（Ｇｅｎｅｒａｌ－ｐｕｒｐｏｓｅ　ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ　ｏｎ　ｇｒａｐｈｉｃｓ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ）等である。
　記憶デバイス２０２は、各種プログラム、及び、データを一時的に、及び／又は、非一時的に記憶する機能を有し、プロセッサ２０１の作業エリアを提供する。
　記憶デバイス２０２は、例えば、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ　Ｏｎｌｙ　Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｃｅｓｓ　Ｍｅｍｏｒｙ）、ＨＤＤ（Ｈａｒｄ　Ｄｉｓｋ　Ｄｒｉｖｅ）、フラッシュメモリ、及び、ＳＳＤ（Ｓｏｌｉｄ　Ｓｔａｔｅ　Ｄｒｉｖｅ）等である。
　入力デバイス２０３は、測定条件、及び、検体名等の入力を受け付け、また、装置２００への指示の入力を受け付けることができる。入力デバイス２０３は、キーボード、マウス、スキャナ、及び、タッチパネル等でよい。
　表示デバイス２０４は、測定結果、検体名、及び、操作手順等を表示できる。表示デバイス２０４は、液晶ディスプレイ、及び、有機ＥＬ（Ｅｌｅｃｔｒｏ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）ディスプレイ等でよい。
　また、表示デバイス２０４は、入力デバイス２０３と一体として構成されていてもよい。この場合、表示デバイス２０４がタッチパネルディスプレイであって、ＧＵＩ（Ｇｒａｐｈｉｃａｌ　Ｕｓｅｒ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を提供する形態が挙げられる。
　データバスにより相互にデータを通信可能なプロセッサ２０１、記憶デバイス２０２、入力デバイス２０３、及び、表示デバイス２０４は、典型的にはコンピュータである。
　マイクロ流路２０５は、液滴を作製し、液滴中に膜小胞の１個体ずつを封入することができるデバイスである。
　図３は、マイクロ流路２０５の実施形態を示す模式的な断面図である。マイクロ流路２０５は、２本の流路が略直交して形成された十字型の流路３０１から構成されている。図面の上から下方向に延びる流路には、膜小胞３０３を含む第１試料３０２が図面上から下に流れており、これと略直交する方向の流路には、図面の左右から中央に向けてオイル３０４が流れている。
　この流路の直径としては特に制限されず、目的に応じて適宜選択されればよいが、一般に、１０～６０μｍが好ましい。
　膜小胞３０３を含む第１試料３０２は、図面の左右から中央に流れるオイル３０４により剪断を受け、膜小胞３０３を含む液滴３０５となる。
　第１試料３０２中の膜小胞３０３の含有量を調整することで、液滴３０５に膜小胞３０３の１個体が封入されるよう、調整することができ、この場合、膜小胞３０３が封入されていない液滴３０６も生成される場合があってもよい。
　温調器２０６は、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成することができるデバイスである。液滴に含まれるゲル化剤が低融点の場合、温調器で液滴の温度を低下させることによって液滴からゲルを生成できる。ゲル化の温度としては特に制限されないが、４～１０℃が好ましい。
　分注器２０７は溶解試薬タンク２０８から溶解試薬を取得し、それを各ゲルと接触させることにより、ゲルカプセル内に封入された膜小胞３０３を溶解させることができるデバイスである。分注器２０７は具体的には、溶解試薬タンク２０８から溶解試薬を吸引し、容器（例えば、マイクロチューブ、及び、マイクロプレートの各ウェル）に保持されたゲルカプセルに対して溶解試薬を吐出するための流路、及び、そのためのポンプ、弁等から構成されていてよい。
　また、分注器２０７は、増幅試薬タンク２０９から増幅試薬を取得し、それを膜小胞３０３の溶解後の各ゲルカプセルと接触させることにより、ゲルカプセル内のＤＮＡ分子を増幅させることもできる。
　分注器２０７は、増幅試薬タンク２０９から増幅試薬を吸引し、それを吐出するための流路を有している。
　また、装置２００は溶解試薬タンク２０８と、増幅試薬タンク２０９とに加えて更に、図示しない洗浄液タンクを有しており、これが分注器２０７と流路により接続され、ゲルカプセルに対して洗浄液を吐出できるよう構成されている。
　ゲルカプセルを洗浄し、余剰の溶解試薬、及び、増幅試薬等を取り除くことができる。
　遠心分離器２１０は、溶解試薬、増幅試薬、及び、洗浄液をゲルカプセルから取り除くことができる。すなわち、遠心分離器２１０によってゲルカプセルと液体成分（溶解試薬、増幅試薬、及び、洗浄液）を分離し、ゲルカプセルを取り出すことができる。
　フローサイトメータ２１２は、所定以上に増幅したＤＮＡを保持するゲルカプセルを選別し、収容容器に個別に回収するためのデバイスである。
　シークエンサ２１１は、増幅されたＤＮＡの塩基配列である第１塩基配列を決定する。シークエンサとしては、キャピラリシークエンサ、及び、次世代シークエンサ等が使用できる。
　図４は、本装置の機能ブロック図である。装置４００は、制御部４０１、記憶部４０２、入力部４０３、表示部４０４、配列決定部４０５、確認部４０６、液滴作製部４０７、ゲル化部４０８、溶解部４０９、除去部４１０、増幅部４１１、選択部４１２、及び、参照部４１３を有する。
　制御部４０１はプロセッサ２０１を含んで構成される。制御部４０１は、各部を制御して、装置２００の機能を実現する。
　記憶部４０２は、記憶デバイス２０２を含んで構成される。記憶部４０２には予め各部の制御のためのプログラムが記憶され、また、後述する配列決定部４０５により決定された第１塩基配列等を記憶することができる。記憶部４０２は、制御部４０１によって制御され、データを読み出したり、書き込んだりすることができる。
　入力部４０３は入力デバイス２０３を含んで構成される。また、表示部４０４は、表示デバイス２０４を含んで構成される。制御部４０１がこれらを制御することで、装置２００の使用者からの入力を受け付けて、これを記憶部４０２に記憶させたり、記憶部４０２に記憶された配列情報を装置２００の使用者に対して表示したりできる。
　配列決定部４０５はシークエンサ２１１を含んで構成され、記憶部４０２に記憶されたプログラムを制御部４０１が実行し、シークエンサ２１１が制御されて実現される機能である。ゲルカプセル内で増幅された膜小胞に由来するポリヌクレオチドの塩基配列である第１塩基配列が配列決定部４０５により決定される。
　確認部４０６は、記憶部４０２に記憶されたプログラムを制御部４０１が実行して実現される機能である。確認部４０６は、後述する参照部４１３によって参照配列に整列された第１塩基配列が参照配列にマップされる場合、第１塩基配列が宿主細菌で産生された膜小胞に由来する塩基配列だと確認するための情報を提供する。提供された情報は、制御部４０１により制御された表示部４０４に表示される。
　液滴作製部４０７は、マイクロ流路２０５を含んで構成され、記憶部４０２に記憶されたプログラムを制御部４０１が実行し、マイクロ流路２０５が制御されて実現される機能である。液滴作製部４０７は第１試料に含まれる膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入する。
　ゲル化部４０８は、温調器２０６を含んで構成され、記憶部４０２に記憶されたプログラムを制御部４０１が実行し、温調器２０６が制御されて実現される機能である。ゲル化部４０８は、液滴作製部４０７により作製された液滴の温度を下げて、ゲル化させ、ゲルカプセルを生成する。
　溶解部４０９は、溶解試薬タンク２０８に接続された分注器２０７を含んで構成され、記憶部４０２に記憶されたプログラムを制御部４０１が実行し、分注器２０７が制御されて実現される機能である。溶解部４０９は、ゲル化部４０８により生成されたゲルカプセルに対して、溶解試薬タンク２０８に収容されている溶解試薬を接触させ、ゲルカプセル内の膜小胞を溶解させる。
　除去部４１０は、遠心分離器２１０を含んで構成され、記憶部４０２に記憶されたプログラムを制御部４０１が実行し、遠心分離器２１０が制御されて実現される機能である。除去部４１０は、ゲルカプセル、余剰の溶解試薬（又は後述する余剰の増幅試薬タンク）、及び、これらの反応により生じた夾雑物質を含む分散液から、ゲルカプセルを分離し、精製する。
　増幅部４１１は、増幅試薬タンク２０９に接続された分注器２０７を含んで構成され、記憶部４０２に記憶されたプログラムを制御部４０１が実行し、分注器２０７が制御されて実現される機能である。増幅部４１１は、除去部４１０により精製されたゲルカプセルに増幅試薬を吐出し、ゲルカプセル内で膜小胞に由来するポリヌクレオチドを増幅する。
　選択部４１２は、フローサイトメータ２１２を含んで構成され、記憶部４０２に記憶されたプログラムを制御部４０１が実行し、フローサイトメータ２１２が制御された実現される機能である。選択部４１２は、増幅部４１１により、所定以上に増幅されたポリヌクレオチドを保持するゲルカプセルを選別し、収容容器に個別に回収する。
　参照部４１３は、記憶部４０２に記憶されたプログラムを制御部４０１が実行して実現される機能である。参照部４１３は、第１塩基配列を参照配列に整列させて、第１塩基配列が参照配列にマップするかを調べる。
　図５は、本装置の制御部４０１の動作を示すフローチャートである。
　ステップＳ５０１において、制御部４０１は液滴作製部４０７を制御して、細菌が産生し、菌体外に放出した膜小胞を含む第１試料から、膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入させる。
　ステップＳ５０２において、制御部４０１は、ゲル化部４０８を制御して、液滴の温度を低下させ、液滴をゲル化させてゲルカプセルを生成する。液滴の温度を低下させる方法としては、ゲル化部４０８を構成する温調器２０６の出力を記憶部４０２に記憶されたプログラムに基づいて制御する方法が挙げられる。
　ステップＳ５０３において、制御部４０１は溶解部４０９を制御して、ゲルカプセルを溶解試薬と接触させる。膜小胞の１個体ずつが封入されたゲルカプセルは、ゲル化部４０８によって溶媒とともに容器に収容されており、この容器に溶解試薬が吐出される。これにより、ゲルカプセルに封入された膜小胞が溶解し、ＤＮＡがゲルカプセル内で溶出する。
　ステップＳ５０４において、制御部４０１は除去部４１０を制御して、余剰の溶解試薬、及び、ゲルカプセルと溶解試薬との反応により生じた夾雑物質を除去する。具体的には、容器に収容されたゲルカプセル、溶解試薬、及び、夾雑物質から、遠心分離器２１０によって、ゲルカプセルを分離する。
　ステップＳ５０５において、制御部４０１は増幅部４１１を制御して、精製されたゲルカプセルと増幅試薬とを接触させる。ゲルカプセル内には、膜小胞に由来するＤＮＡが封入されており、これが増幅される。具体的には、増幅試薬タンク２０９から吸引された増幅試薬が分注器２０７により吐出され、ゲルカプセルと接触されることで、ＤＮＡが増幅される。
　ステップＳ５０６において、制御部４０１は配列決定部４０５を制御して、ポリヌクレオチドの塩基配列である、第１塩基配列を決定する。具体的には、シークエンサ２１１によって、第１塩基配列が決定される。
　なお、ステップＳ５０５とステップＳ５０６の間に、制御部４０１によって制御された選択部４１２によって、所定以上の増幅されたＤＮＡを有するゲルカプセルを選択する工程を経てもよい。この工程により、ステップＳ５０１において膜小胞を含まずに生成された液滴をステップＳ５０６の測定対象から除外することができるため、装置の時間当たりの処理能力が向上することがある。
　ステップＳ５０７において、制御部４０１は、参照部４１３を制御して、第１塩基配列を参照配列に整列させて第１塩基配列が参照配列にマップされるかを調べる。
　第１塩基配列が参照配列にマップされる場合（ステップＳ５０８：ＹＥＳ）、制御部４０１は、確認部４０６を制御して、第１塩基配列が細菌で産生された膜小胞に由来する塩基配列であると確認するための情報を提供する。この情報は、制御部４０１により制御された表示部４０４に表示される。
　一方、第１塩基配列が参照配列にマップされない場合（ステップＳ５０８：ＮＯ）、確認部４０６は、第１塩基配列には何らかのエラー（例えば、増幅のエラー）が含まれると判断するための情報を提供してもよい。この場合、制御部４０１は、表示部４０４を制御して、その情報を表示部４０４に表示させてもよい。
　本装置は、膜小胞の１個体ずつを封入したゲルカプセル内でポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を増幅し、更に、それを参照配列に整列し、マップした場合にそのＤＮＡが細菌によって産生された膜小胞に由来すると確認するための情報を提供する。そのため、例えば、ＤＮＡをＰｈｉ２９　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＤＮＡ増幅した場合にバイアスが生じたとしても、得られた塩基配列を参照配列に整列し、マップした場合に膜小胞由来と判断するため、より正確に膜小胞に由来する塩基配列を解析することができる。
［装置（２）］
　本発明の装置の第２の実施形態は、すでに説明した本発明の装置の第１の実施形態が有する、液滴作製部と、ゲル化部と、溶解部と、除去部と、増幅部と、配列決定部と、整列部と、参照部とを有し、更に、宿主決定部と、参照配列作成部とを含む装置である。
　本実施形態は、宿主決定部と参照配列作成部を有すること以外は第１の実施形態と同様なので、以下では相違点についてのみ説明する。
　図７は、本装置の機能ブロック図である。
　装置７００は、制御部４０１、記憶部４０２、入力部４０３、表示部４０４、配列決定部４０５、確認部４０６、液滴作製部４０７、ゲル化部４０８、溶解部４０９、除去部４１０、増幅部４１１、選択部４１２、参照部４１３、参照配列作成部７０１、及び、宿主決定部７０２を有する。
　参照配列作成部７０１は、記憶部４０２に記憶されたプログラムを制御部４０１が実行して実現される機能である。参照配列作成部７０１は、配列決定部４０５によって決定された第１塩基配列のタンパク質コード領域を検出し、このタンパク質コード領域をクエリー配列としたこの相同性検索の結果から、相同のタンパク質コード配列を有する細菌を選択し、この細菌のゲノム配列から参照配列を作成する。
　宿主決定部７０２は、記憶部４０２に記憶されたプログラムを制御部４０１が実行して実現される機能である。宿主決定部７０２は、第１塩基配列が参照配列にマップされる場合、マップされたゲノム配列を有する細菌を宿主細菌と決定する。
　図８は、本装置の制御部４０１の動作を示すフローチャートである。以下では、本発明の装置の第１の実施形態と異なる点を中心に説明する。
　ステップＳ８０１において、制御部４０１は、参照配列作成部７０１を制御して、第１塩基配列のタンパク質コードを検出し、公共データベース等に収録されたゲノム配列が既知の細菌のタンパク質コード配列と相同性検索を行う。その結果、相同のタンパク質コード配列を有する細菌を選択し、その細菌のゲノム配列から参照配列を作成させる。
　ステップＳ８０２において、制御部４０１は、宿主決定部７０２を制御して、マップされた塩基配列を有する細菌を細菌と決定する。
　また、本装置は、ステップＳ５０９において、表示部に、上記宿主細胞（細菌）の情報を併せて表示してもよい。
　本装置は、膜小胞がヒト又は動物から採取した採取試料から精製されたものである場合に好ましく適用できる。多くの場合、採取試料中に含まれる細胞（細菌）種は不明であり、膜小胞の宿主細胞（細菌）は不明であるからである。
　本装置は、膜小胞のより高品質な塩基配列を得られるうえ、その膜小胞の宿主細胞（細菌）の情報も併せて提供することができる。
　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[実施例１]
（単一細胞株に由来する膜小胞を含む検体の準備）
ストレプトコッカス　ミュータンス（以下「ＳＭ」：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ　ＮＧ８）、カプノサイトファーガ・オクラセア（以下、「ＣＯ」：Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｏｃｈｒａｃｅａ　ＤＳＭ　７２７１）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（以下、「ＰＧ」：Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　Ｗ８３）、及び、シュードモナス　エルギノーザ（以下、「PAO1」：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＰＡＯ１）を細菌株として用いて、それらをＤＳＭＺ培地又はＧｉｆｕ培地を用いて３７℃で培養した。
　始めに、細菌株と培地とを入れたバイアル瓶に、２０分間Ｎ２／ＣＯ２（８０：２０ｖ／ｖ）混合ガスを充填し、嫌気条件とした。
　その後、培養液の光学濃度（ＯＤ６００）が１．０に到達するまで培養を行なった。培養後、細菌株の培養液を７８００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。
　膜小胞はこの上清に含まれるため、以下の方法で精製した。
　まず、上清を０．２２μｍのフィルターに通して細胞の残骸を除去し、ろ過した上澄み液を得た。
　次に、ろ過した上澄み液を１２６，０００×ｇ、４℃で２時間超遠心した。超遠心分離後、上清を除去し、ペレット状になった膜小胞を再度懸濁し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に入れて４℃で保存した。
　更に、膜小胞の精製は、ヨードキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ）密度勾配を用いて行った。６０％ヨードキサノール原液をＰＢＳで３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％に希釈した。保存していた膜小胞を含む懸濁液を、４℃で１４０，０００×ｇ、２時間超遠心した。
　得られたペレットを３５％ヨードキサノール溶液に再懸濁した。準備した６つのヨードキサノール溶液を密度の低い順に超遠心チューブに充填した。この際、膜小胞を含む３５％の懸濁液が一番下に、１０％の溶液が一番上になるように７ｍＬ超遠心チューブに入れた。このチューブを、スイングローターを用いて１４０，０００×ｇ、４℃で１６時間超遠心分離した。超遠心後、各層から１ｍＬの画分を採取し、それぞれ別々のエッペンドルフチューブに入れて保存した。得られた各画分中に含まれる粒子の大きさと数を、ナノ粒子トラッキング装置を用いて測定し、直径１００～２００ｎｍ程度の粒子を最も多く含む画分を「膜小胞が濃縮されている画分」であるとし、更なる解析に用いた。
（シングルセル解析）
　国際公開２０１９－２１６２７１号を参考に各膜小胞ごとに得た、膜小胞由来ＤＮＡ断片を次世代シークエンサにより解析し、ショートリードの塩基配列を得た。
　これらのショートリード塩基配列（１５０　ｂｐ程度）の中でシークエンスのクオリティが低い配列を、「ｆａｓｔｐ」を用いて除去した。その後、「ＳＰＡｄｅｓ」を用いて、これらのショートリード配列を結合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）させ、数ｋ～数十ｋｂｐ程度のコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）と呼ばれる長い塩基配列を作成した。これらのより長く再構成された塩基配列を用いて、データベース上の参照配列に対する相同性検索を行なった。
　なお、「ｆａｓｔｐ」については、Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　ｆａｓｔｐ：　ａｎ　ｕｌｔｒａ－ｆａｓｔ　ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ　ＦＡＳＴＱ　ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｏｒ．　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　３４，１７，２０１８に記載され、「ＳＰＡｄｅｓ」についてはＢａｎｋｅｖｉｃ　ｅｔ　ａｌ．，　ＳＰＡｄｅｓ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．　Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．，１９，５，２０１２に記載されている。
（参照配列とのマップ）
　シングルセル解析で得られた各膜小胞に由来する塩基配列を、ｋ－ｍｅｒを指標として、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）にリファレンスゲノム配列として登録されている全ての生物のゲノム配列から生成されたｋ－ｍｅｒプロファイルとの間で、最も相同性の高い参照配列を、「ＢＢＳｋｅｔｃｈ」（Ｕ．Ｓ．　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｎｅｒｇｙ　（ＤＯＥ）　Ｊｏｉｎｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　（ＪＧＩ）が提供する次世代シークエンサ向け解析ツール）を用いて探索した。その結果、それぞれの宿主細菌株が属する種のレベルにおいて高い割合で一致した。
　図９は上記の結果である。
　図９のグラフは、横軸が宿主細菌の種類を表している。縦軸は、正しい宿主細菌由来と判定された膜小胞の割合を百分率（％）で示したものである。
　各宿主細菌から取得された９６個の膜小胞粒子について解析した結果、ＰＡＯ１、ＳＭ、ＣＯ、及び、ＰＧから取得された膜小胞粒子のコンティグは、９５％以上の割合で正しい宿主（すなわち、ＰＡＯ１、ＳＭ、ＣＯ、及び、ＰＧ）にマップされた。特に、ＰＡＯ１、ＳＭ、ＣＯについては、ほぼ１００％正しくマップされた。
[実施例２]
（唾液由来の膜小胞を含む検体の準備）
　唾液採取キットを用いて、歯周病患者の唾液を採取した。採取した唾液を０．２２μｍのフィルターに通して細胞の残骸を除去し、ろ過した上澄み液から、実施例１と同様の手順によって、膜小胞を精製した。その結果得られた１９２個の膜小胞粒子について、実施例１と同様の手順によってシングルセル解析を行った。
（参照配列とのマップ）
検出された塩基配列の情報を基に、各膜小胞内部の塩基配列が由来する細菌の分類群を特定した。
　具体的には、各膜小胞内部の塩基配列のうちタンパク質コード領域（ＣＤＳ）をゲノムアノテーションのためのソフトウェアツールである「ｐｒｏｋｋａ」を用いて予測・検出し、それらの塩基配列の一つ一つに対し、ＮＣＢＩに登録されている全ドメインにわたる生物のタンパク質コード配列（ｎｒ）との相同性検索を行なった。
　相同性検索には、シーケンスアライナー（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｅｒ）ソフトウェアツールである「ｄｉａｍｏｎｄ」（Ｂｕｃｈｆｕｎｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ　ａｔ　ｔｒｅｅ－ｏｆ－ｌｉｆｅ　ｓｃａｌｅ　ｕｓｉｎｇ　ＤＩＡＭＯＮＤ，　Ｎａｔ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ．，　１８，　２０２１）を使用した。
　データベース上でマッチした各タンパク質コード配列情報にタグ付けされている系統群情報を、ｔａｘｏｎｋｉｔ（Ｓｈｅｎ　ａｎｄ　Ｒｅｎ，　ＴａｘｏｎＫｉｔ：　Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ＮＣＢＩ　ｔａｘｏｎｏｍｙ　ｔｏｏｌｋｉｔ，　Ｊ．　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．，　２０２１）とｅｎｔｒｅｚ－ｄｉｒｅｃｔ（Ｋａｎｓ，　Ｅｎｔｒｅｚ　Ｄｉｒｅｃｔ：　Ｅ－ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｘ（登録商標）　Ｃｏｍｍａｎｄ　Ｌｉｎｅ，　２０２１）の二つのツールを組み合わせたパイプラインによって抽出し、各ＣＤＳが由来する細菌の分類群の特定を行なった。
　次に、膜小胞内部の塩基配列の出自を相同性検索によって明らかにした上で、出現頻度が高かった細菌株をリストアップした。それらの候補となる細菌株のゲノム配列に対し、膜小胞内部の塩基配列をｂｏｗｔｉｅ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ　ａｎｄ　Ｓａｌｚｂｅｒｇ，　Ｆａｓｔ　ｇａｐｐｅｄ－ｒｅａｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ｂｏｗｔｉｅ　２，　Ｎａｔ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　９，　４，　２０１２）を使ってアラインメントさせ、最もアラインメントできた塩基配列（リード）の割合が高かった細菌株を、その膜小胞の宿主細菌株とした。
　図１０は上記の結果であり、各細菌株を綱レベルで分け、１９２個の膜小胞の内部の塩基配列をマップした結果（頻度）を表すヒートマップである。各膜小胞が、参照配列にマップされ、かつ、その宿主細菌（網）が特定されていることがわかる。
２００　　：装置
２０１　　：プロセッサ
２０２　　：記憶デバイス
２０３　　：入力デバイス
２０４　　：表示デバイス
２０５　　：マイクロ流路
２０６　　：温調器
２０７　　：分注器
２０８　　：溶解試薬タンク
２０９　　：増幅試薬タンク
２１０　　：遠心分離器
２１１　　：シークエンサ
２１２　　：フローサイトメータ
３０１　　：流路
３０２　　：第１試料
３０３　　：膜小胞
３０４　　：オイル
３０５　　：液滴
３０６　　：液滴
４０１　　：制御部
４０２　　：記憶部
４０３　　：入力部
４０４　　：表示部
４０５　　：配列決定部
４０６　　：確認部
４０７　　：液滴作製部
４０８　　：ゲル化部
４０９　　：溶解部
４１０　　：除去部
４１１　　：増幅部
４１２　　：選択部
４１３　　：参照部

 

Claims (19)

  1. 　宿主細胞で産生され、前記宿主細胞外に放出された膜小胞を含む第１試料を用い、前記膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入することと、
    　前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成することと、
    　前記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させて、前記膜小胞を溶解させ、前記膜小胞中のポリヌクレオチドが前記ゲルカプセルに溶出し、前記ゲルカプセル内に保持させることと、
    　前記ポリヌクレオチドを増幅試薬に接触させて、前記ポリヌクレオチドを前記ゲルカプセル内で増幅することと、
    　前記増幅したポリヌクレオチドから、前記ポリヌクレオチドの塩基配列である第１塩基配列を決定することと、
    　前記第１塩基配列を参照配列に整列させて前記第１塩基配列が前記参照配列にマップするかを調べることと、
    　前記第１塩基配列が前記参照配列にマップされる場合、前記第１塩基配列が、前記宿主細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列であると確認することと、
    を含む、方法。
  2. 　前記宿主細胞が、宿主細菌である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記参照配列が、前記第１試料のメタゲノム解析によって得られた塩基配列である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記参照配列が、前記宿主細胞のゲノム配列である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記参照配列が、ゲノム配列が既知の細胞の前記ゲノム配列の集合であり、
    　前記第１塩基配列が前記参照配列にマップされる場合、
    　前記マップされたゲノム配列を有する前記細胞を前記宿主細胞と決定することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 　前記第１塩基配列を決定した後、前記第１塩基配列におけるタンパク質コード領域を検出し、前記タンパク質コード領域をクエリー配列とした相同性検索によって、前記タンパク質コード領域と相同のタンパク質コード配列を有する前記細胞を選択し、前記細胞のゲノム配列から前記参照配列を作成することを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 　更に、前記第１試料を核酸分解酵素で処理することを含む請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　更に、前記宿主細胞と、前記膜小胞とを含む懸濁液から、前記宿主細胞と前記膜小胞とを分離させ、前記膜小胞を含む前記第１試料と、前記宿主細胞を含む第２試料とを得ることと、を含む請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　更に、前記第２試料を用いて、前記参照配列を得ることと、を含む請求項８に記載の方法。
  10. 　前記参照配列を得ることが、前記第２試料をメタゲノム解析して、得られる塩基配列を前記参照配列とすることである、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記参照配列を得ることが、前記第２試料を１６Ｓ　ｒＲＮＡ解析して、前記第２試料の細菌組成を推定し、前記細菌組成の塩基配列を前記参照配列とすることである、請求項９に記載の方法。
  12. 　前記参照配列を得ることが、前記第２試料をシングルセル解析して、得られる塩基配列を前記参照配列とすることである、請求項９に記載の方法。
  13. 　前記参照配列を得ることが、前記第２試料をメタゲノム解析して得られた塩基配列と、前記第２試料をシングルセル解析して得られた塩基配列とをマージして前記参照配列とすることである、請求項９に記載の方法。
  14. 　前記懸濁液が、ヒト又は動物から採取した、糞便、唾液、喀痰、手術洗浄液、血液、並びに、皮膚又は身体粘膜の拭い液、及び、スワブからなる群より選択される少なくとも１種の採取試料である、請求項８～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記宿主細菌が、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、ベイヨネラ属、フソバクテリウム属、パルビモナス属、アグリゲイティバクター属、アクチノマイセス属、アクチノバチルス属、バクテロイデス属、タンネレラ属、トレポネーマ属、カンピロバクター属、エイケネラ属、ストレプトコッカス属、及び、カプノサイトファーガ属からなる群より選択される少なくとも１種の細菌である、請求項２に記載の方法。
  16. 　更に、前記第１塩基配列をクラスタリングして、前記膜小胞の異種性を確認すること、を含む請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　宿主細胞で産生され、前記宿主細胞外に放出された膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入する液滴作製部と、
    　前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲル化部と、
    　前記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させる溶解部と、
    　前記ゲルカプセルから夾雑物質を除去する除去部と、
    　前記ゲルカプセルを増幅試薬に接触させ、ゲルカプセル内のポリヌクレオチドを増幅する増幅部と、
    　前記ポリヌクレオチドの配列である第１塩基配列の決定を行う配列決定部と、
    　前記第１塩基配列を参照配列に整列させて前記第１塩基配列が前記参照配列にマップするかを調べる参照部と、
    　前記第１塩基配列が前記参照配列にマップされる場合、前記第１塩基配列が、前記宿主細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列であると確認するための情報を提供する確認部と、を有する装置。
  18. 　宿主細胞で産生され、前記宿主細胞外に放出されたた膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入する液滴作製部と、前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲル化部と、前記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させる溶解部と、前記ゲルカプセルから夾雑物質を除去する除去部と、前記ゲルカプセルを増幅試薬に接触させ、ゲルカプセル内のポリヌクレオチドを増幅する増幅部と、を有する装置に、コンピュータにより、
    　宿主細胞で産生され、前記宿主細胞外に放出された膜小胞を含む第１試料を用い、前記膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入する手順と、
    　前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する手順と、
    　前記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させて、前記膜小胞を溶解させ、前記膜小胞中のポリヌクレオチドが前記ゲルカプセルに溶出し、前記ゲルカプセル内に保持させる手順と、
    　前記増幅したポリヌクレオチドから、前記ポリヌクレオチドの塩基配列である第１塩基配列を決定する手順と、
    　前記第１塩基配列を参照配列に整列させて前記第１塩基配列が前記参照配列にマップするかを調べる手順と、
    　前記第１塩基配列が前記参照配列にマップされる場合、前記第１塩基配列が、前記宿主細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列であると確認する手順と、を実行させるプログラム。
  19. 　請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法により得られた前記膜小胞に由来する塩基配列。

     
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