JP7460203B2 - 細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列を解析する方法、その装置、及び、そのプログラム - Google Patents
細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列を解析する方法、その装置、及び、そのプログラム Download PDFInfo
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Description
[2] 上記宿主細胞が、宿主細菌である、[1]に記載の方法。
[3] 上記参照配列が、上記第1試料のメタゲノム解析によって得られた塩基配列である、[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 上記参照配列が、上記宿主細胞のゲノム配列である、[1]~[3]のいずれかに記載の方法。
[5] 上記参照配列が、ゲノム配列が既知の細胞の上記ゲノム配列の集合であり、上記第1塩基配列が上記参照配列にマップされる場合、上記マップされたゲノム配列を有する上記細胞を上記宿主細胞と決定することを更に含む、[1]又は[2]に記載の方法。
[6] 上記第1塩基配列を決定した後、上記第1塩基配列におけるタンパク質コード領域を検出し、上記タンパク質コード領域をクエリー配列とした相同性検索によって、上記タンパク質コード領域と相同のタンパク質コード配列を有する上記細胞を選択し、上記細胞のゲノム配列から上記参照配列を作成することを含む、[5]に記載の方法。
[7] 更に、上記第1試料を核酸分解酵素で処理することを含む[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8] 更に、上記宿主細胞と、上記膜小胞とを含む懸濁液から、上記宿主細胞と上記膜小胞とを分離させ、上記膜小胞を含む上記第1試料と、上記宿主細胞を含む第2試料とを得ることと、を含む[1]~[7]のいずれかに記載の方法。
[9] 更に、上記第2試料を用いて、上記参照配列を得ることと、を含む[8]に記載の方法。
[10] 上記参照配列を得ることが、上記第2試料をメタゲノム解析して、得られる塩基配列を上記参照配列とすることである、[9]に記載の方法。
[11] 上記参照配列を得ることが、上記第2試料を16S rRNA解析して、上記第2試料の細菌組成を推定し、上記細菌組成の塩基配列を上記参照配列とすることである、[9]に記載の方法。
[12] 上記参照配列を得ることが、上記第2試料をシングルセル解析して、得られる塩基配列を上記参照配列とすることである、[9]に記載の方法。
[13] 上記参照配列を得ることが、上記第2試料をメタゲノム解析して得られた塩基配列と、上記第2試料をシングルセル解析して得られた塩基配列とをマージして上記参照配列とすることである、[9]に記載の方法。
[14] 上記懸濁液が、ヒト又は動物から採取した、糞便、唾液、喀痰、手術洗浄液、血液、並びに、皮膚又は身体粘膜の拭い液、及び、スワブからなる群より選択される少なくとも1種の採取試料である、[8]~[13]のいずれかに記載の方法。
[15] 上記宿主細菌が、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、ベイヨネラ属、フソバクテリウム属、パルビモナス属、アグリゲイティバクター属、アクチノマイセス属、アクチノバチルス属、バクテロイデス属、タンネレラ属、トレポネーマ属、カンピロバクター属、エイケネラ属、ストレプトコッカス属、及び、カプノサイトファーガ属からなる群より選択される少なくとも1種の細菌である、[2]に記載の方法。
[16] 更に、上記第1塩基配列をクラスタリングして、上記膜小胞の異種性を確認すること、を含む[1]~[15]のいずれかに記載の方法。
[17] 宿主細胞で産生され、上記宿主細胞外に放出された膜小胞の1個体ずつを液滴中に封入する液滴作製部と、上記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲル化部と、上記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させる溶解部と、上記ゲルカプセルから夾雑物質を除去する除去部と、上記ゲルカプセルを増幅試薬に接触させ、ゲルカプセル内のポリヌクレオチドを増幅する増幅部と、上記ポリヌクレオチドの配列である第1塩基配列の決定を行う配列決定部と、上記第1塩基配列を参照配列に整列させて上記第1塩基配列が上記参照配列にマップするかを調べる参照部と、上記第1塩基配列が上記参照配列にマップされる場合、上記第1塩基配列が、上記宿主細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列であると確認するための情報を提供する確認部と、を有する装置。
[18] 宿主細胞で産生され、上記宿主細胞外に放出されたた膜小胞の1個体ずつを液滴中に封入する液滴作製部と、上記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲル化部と、上記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させる溶解部と、上記ゲルカプセルから夾雑物質を除去する除去部と、上記ゲルカプセルを増幅試薬に接触させ、ゲルカプセル内のポリヌクレオチドを増幅する増幅部と、を有する装置に、コンピュータにより、宿主細胞で産生され、上記宿主細胞外に放出された膜小胞を含む第1試料を用い、上記膜小胞の1個体ずつを液滴中に封入する手順と、上記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する手順と、上記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させて、上記膜小胞を溶解させ、上記膜小胞中のポリヌクレオチドが上記ゲルカプセルに溶出し、上記ゲルカプセル内に保持させる手順と、上記増幅したポリヌクレオチドから、上記ポリヌクレオチドの塩基配列である第1塩基配列を決定する手順と、上記第1塩基配列を参照配列に整列させて上記第1塩基配列が上記参照配列にマップするかを調べる手順と、上記第1塩基配列が上記参照配列にマップされる場合、上記第1塩基配列が、上記宿主細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列であると確認する手順と、を実行させるプログラム。
[19] [1]~[16]のいずれかに記載の方法により得られた上記膜小胞に由来する塩基配列。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「~」を用いて表される数値範囲は、「~」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
宿主細胞としては特に制限されず、真核生物、細菌、又は、古細菌のいずれの細胞であってもよいが、以下では、典型例として、宿主細胞が宿主細菌である場合について述べる。なお、本明細書において「宿主細胞」とは、分析対象となる膜小胞を産生した細胞を意味し、「宿主細菌」とは、分析対象となる膜小胞を産生した細菌を意味する。
図1は、本発明の方法の第1の実施形態(以下「本方法」ともいう。)のフローチャートである。
ステップS101は、宿主細菌が産生した膜小胞の1個体ずつを液滴中に封入する工程(封入工程)である。封入工程で用いられる第1試料は、膜小胞を含む。試料に含まれる膜小胞は、1種でも2種以上でもよい。この膜小胞は、宿主細菌が産生し、菌体外に放出したものであり、第1試料は、典型的には、宿主細菌と、膜小胞とを含む懸濁液から、宿主細菌等の膜小胞以外の成分を分離除去することで得られたものである。
膜小胞を含む第1試料は、精製されたものであることが好ましい。第1試料に対する膜小胞以外の核酸成分の混入を抑制することで、最終的に、膜小胞の(膜小胞に由来する)ポリヌクレオチドが得られやすい。
懸濁液には、宿主細菌が含まれてもよく、宿主細菌が含まれている場合、上記工程は、膜小胞を含む第1試料と、細菌を含む第2試料とを得る工程であってもよい。
また、懸濁液は、ヒトや動物から取得され、複数種の細菌(このうちの1種以上が難培養性細菌であってもよい)が含まれるものでもよい。
このような採取試料を上記懸濁液として用いる場合、採取試料から膜小胞と細菌群とを分離して、第1試料と第2試料とにすればよい。
細菌株の産生する膜小胞の機能解析には、細菌株を培養して膜小胞を大量に産生させて、それを解析する、という手法が適用できる。一方、難培養性細菌では、その手法が適用できなかった。難培養性細菌の産生する膜小胞の機能解析が進まないことは、それが一因となっていた。
また、採取試料中に難培養性細菌に由来する膜小胞が含まれていたとしても、絶対量、及び、相対量ともに従来法による網羅的解析に十分な量は含まれてないことが多いと考えられ、このことが解析をより一層困難にしていた。
遠心上清には、細菌体以外にもタンパク質等の夾雑物質が含まれている場合があるので、例えば、100~200kDaカットオフフィルタで濃縮した後、超遠心によって膜小胞を沈殿させて回収する方法も使用できる。
まず、所定の条件で所望の増殖相が達成されたら、培養液を容量が1~100mLの遠心管に入れ、3000~9000rpm、1~20℃で、1~30分間遠心する。
デオキシリボヌクレアーゼの添加量としては特に制限されないが、例えば、上記懸濁液の10μLを10倍希釈して、そこへ2μLのDNase(2000U)を添加する方法が挙げられる。
膜小胞の濃度の観察方法としては、粒子にレーザを照射し、その散乱光から各粒子のブラウン運動を追跡し(トラッキング法)、その拡散速度から、Stokes-Einsteinの式に基づき粒子の径と個数とを計算する方法が好ましい。
液滴の直径は、1~250μmが好ましく、10~200μmがより好ましい。
また、溶解試薬は、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ドデシル硫酸ナトリウム、及び、水酸化カリウム等を含むことが好ましい。
また、操作面でも非常に簡単な操作で、1単位ごとの大量の膜小胞を並列処理することができる。ゲル化した液滴を含む試験管を遠心し、上清を除去し、洗浄液に置換するというステップを行うことができる。あるいは、ゲル化した液滴をフィルターでろ過し、上清を除去したのち、洗浄液を通液させ、最後にゲルカプセルを回収するというステップでも行うことができる。ゲルカプセルを用いることにより、遺伝物質を保持したまま、残留試薬を希薄化することができる。このステップは繰り返すことも可能である。阻害が出ないレベルにまで試薬を希薄化することで、下流の操作、例えば、増幅反応をスムーズに行うことができる。
そして、強力な溶解試薬又は溶解試薬の組み合せを用いることは、より確実な核酸の増幅、及び、塩基配列の解析を可能にし得る。
増幅に用いる酵素としては、例えば、phi29ポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Aacポリメラーゼ、及び、リコンビナーゼポリメラーゼが挙げられる。
本方法では、ゲル内の全DNAの増幅を行うために、ランダムプライマーを用いることが好ましい。
これが、参照配列にマップされる場合(ステップS108:YES)、第1塩基配列が宿主細菌で産生された膜小胞に由来する塩基配列である(膜小胞の内部の塩基配列)と確認される(ステップS109、確認工程)。
ここで、「マップされる」とは、第1塩基配列が、参照配列が有する塩基配列の一部の領域と一致することを意味する。一致とは、配列の90%以上が同一であることを意味し、95%以上が好ましく、99%以上がより好ましく、完全に同一であることが更に好ましい。
また、その単一の細胞株のゲノム配列を解析(例えば、シングルセル解析)して、その配列を参照配列としてもよい。その際の解析法としては特に制限されず、例えば、国際公開2019-216271号に記載の方法等を用いることができる。
本方法は、ゲルカプセル内でポリヌクレオチドを増幅する工程を有している。増幅工程においては、使用するプライマー同士が結合したり、キメラ配列が生成したりして、膜小胞のポリヌクレオチド以外のヌクレオチドが増幅される可能性がある。このようなポリヌクレオチドのコンタミネーションが起こったか否かを、本工程によって確認できる。
一方、宿主細菌の候補となるべき細菌(上記「複数種の細菌」)の組成、及び/又は、ゲノム配列が未知であれば、後述するように、第2試料の網羅的解析の結果を参照配列としてもよい。その場合、本方法は、第2試料のメタゲノム解析、及び/又は、シングルセル解析を行って参照配列を決定する工程を更に有していてもよい。
上記参照配列は、上記「複数種の細菌」を含む第2試料の解析から得られた塩基配列でもよいし、「Genbank」等の公共データベースに収録された既知の細菌のゲノム配列のリスト、及び、このゲノム配列から選択して取得されたゲノム配列のリスト等であってもよい。
本方法は膜小胞由来のポリヌクレオチドを増幅する工程を有しており、増幅工程を経ない解析方法により得られたゲノム配列にマップすることにより増幅によるエラーをより高感度に検知できるからである。
しかし、本方法を用いれば、従来必要と考えられていたサンプル量の100分の1未満の量で、かつ、正確なOMVの配列を得ることができる。
図6は、本発明の方法の第2の実施形態(以下、「本方法」ともいう。)のフローチャートである。以下では、すでに説明した、本発明の方法の第1の実施形態との相違点を中心に説明する。
このとき、選択された上記「細菌」は、いわば宿主細菌の候補となる細菌であり、複数種が含まれてもよい。その場合、参照配列は、複数の「細菌」のゲノム配列を含むリストとなる。
そのため、膜小胞の宿主細菌が不明である場合も、より簡便に参照配列の範囲を絞り込むことができ、後段の、第1塩基配列の参照配列への整列とマップの可否評価をより迅速に、かつ、より確実に行うことができる。
本発明の装置の第1の実施形態は、宿主細胞で産生され、宿主細胞外に放出された膜小胞を1個体ずつ液滴中に封入する液滴作製部と、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲル化部と、ゲルカプセルを溶解試薬と接触させる溶解部と、ゲルカプセルから夾雑物質を除去する除去部と、ゲルカプセルを増幅試薬に接触させ、ゲルカプセル内のポリヌクレオチドを増幅する増幅部と、ポリヌクレオチドの配列である第1塩基配列の決定を行う配列決定部と、第1塩基配列を参照配列に整列させて第1塩基配列が参照配列にマップするかを調べる参照部と、第1塩基配列が参照配列にマップされる場合、第1塩基配列を宿主細菌で産生された膜小胞であると確認するための情報を提供する確認部と、を有する装置である。
装置200は、プロセッサ201と、記憶デバイス202と、入力デバイス203と、表示デバイス204と、マイクロ流路205と、温調器206と、分注器207(溶解試薬タンク208、及び、増幅試薬タンク209が接続されている)と、遠心分離器210と、シークエンサ211と、フローサイトメータ212と、を有しており、各ハードウェアはバスを介して相互にデータを授受できるよう構成されている。
記憶デバイス202は、例えば、ROM(Read Only Memory)、RAM(Random Access Memory)、HDD(Hard Disk Drive)、フラッシュメモリ、及び、SSD(Solid State Drive)等である。
また、表示デバイス204は、入力デバイス203と一体として構成されていてもよい。この場合、表示デバイス204がタッチパネルディスプレイであって、GUI(Graphical User Interface)を提供する形態が挙げられる。
図3は、マイクロ流路205の実施形態を示す模式的な断面図である。マイクロ流路205は、2本の流路が略直交して形成された十字型の流路301から構成されている。図面の上から下方向に延びる流路には、膜小胞303を含む第1試料302が図面上から下に流れており、これと略直交する方向の流路には、図面の左右から中央に向けてオイル304が流れている。
膜小胞303を含む第1試料302は、図面の左右から中央に流れるオイル304により剪断を受け、膜小胞303を含む液滴305となる。
第1試料302中の膜小胞303の含有量を調整することで、液滴305に膜小胞303の1個体が封入されるよう、調整することができ、この場合、膜小胞303が封入されていない液滴306も生成される場合があってもよい。
分注器207は、増幅試薬タンク209から増幅試薬を吸引し、それを吐出するための流路を有している。
ゲルカプセルを洗浄し、余剰の溶解試薬、及び、増幅試薬等を取り除くことができる。
ステップS501において、制御部401は液滴作製部407を制御して、細菌が産生し、菌体外に放出した膜小胞を含む第1試料から、膜小胞の1個体ずつを液滴中に封入させる。
本発明の装置の第2の実施形態は、すでに説明した本発明の装置の第1の実施形態が有する、液滴作製部と、ゲル化部と、溶解部と、除去部と、増幅部と、配列決定部と、整列部と、参照部とを有し、更に、宿主決定部と、参照配列作成部とを含む装置である。
本実施形態は、宿主決定部と参照配列作成部を有すること以外は第1の実施形態と同様なので、以下では相違点についてのみ説明する。
装置700は、制御部401、記憶部402、入力部403、表示部404、配列決定部405、確認部406、液滴作製部407、ゲル化部408、溶解部409、除去部410、増幅部411、選択部412、参照部413、参照配列作成部701、及び、宿主決定部702を有する。
本装置は、膜小胞のより高品質な塩基配列を得られるうえ、その膜小胞の宿主細胞(細菌)の情報も併せて提供することができる。
(単一細胞株に由来する膜小胞を含む検体の準備)
ストレプトコッカス ミュータンス(以下「SM」:Streptococcus mutans NG8)、カプノサイトファーガ・オクラセア(以下、「CO」:Capnocytophaga ochracea DSM 7271)、ポルフィロモナス・ジンジバリス(以下、「PG」:Porphyromonas gingivalis W83)、及び、シュードモナス エルギノーザ(以下、「PAO1」:Pseudomonas aeruginosa PAO1)を細菌株として用いて、それらをDSMZ培地又はGifu培地を用いて37℃で培養した。
その後、培養液の光学濃度(OD600)が1.0に到達するまで培養を行なった。培養後、細菌株の培養液を7800rpm、4℃で10分間遠心分離した。
膜小胞はこの上清に含まれるため、以下の方法で精製した。
国際公開2019-216271号を参考に各膜小胞ごとに得た、膜小胞由来DNA断片を次世代シークエンサにより解析し、ショートリードの塩基配列を得た。
シングルセル解析で得られた各膜小胞に由来する塩基配列を、k-merを指標として、NCBI(National Center for Biotechnology Information)にリファレンスゲノム配列として登録されている全ての生物のゲノム配列から生成されたk-merプロファイルとの間で、最も相同性の高い参照配列を、「BBSketch」(U.S. Department of Energy (DOE) Joint Genome Institute (JGI)が提供する次世代シークエンサ向け解析ツール)を用いて探索した。その結果、それぞれの宿主細菌株が属する種のレベルにおいて高い割合で一致した。
図9のグラフは、横軸が宿主細菌の種類を表している。縦軸は、正しい宿主細菌由来と判定された膜小胞の割合を百分率(%)で示したものである。
各宿主細菌から取得された96個の膜小胞粒子について解析した結果、PAO1、SM、CO、及び、PGから取得された膜小胞粒子のコンティグは、95%以上の割合で正しい宿主(すなわち、PAO1、SM、CO、及び、PG)にマップされた。特に、PAO1、SM、COについては、ほぼ100%正しくマップされた。
(唾液由来の膜小胞を含む検体の準備)
唾液採取キットを用いて、歯周病患者の唾液を採取した。採取した唾液を0.22μmのフィルターに通して細胞の残骸を除去し、ろ過した上澄み液から、実施例1と同様の手順によって、膜小胞を精製した。その結果得られた192個の膜小胞粒子について、実施例1と同様の手順によってシングルセル解析を行った。
検出された塩基配列の情報を基に、各膜小胞内部の塩基配列が由来する細菌の分類群を特定した。
データベース上でマッチした各タンパク質コード配列情報にタグ付けされている系統群情報を、taxonkit(Shen and Ren, TaxonKit: A practical and efficient NCBI taxonomy toolkit, J. Genetics and Genomics., 2021)とentrez-direct(Kans, Entrez Direct: E-utilities on the Unix(登録商標) Command Line, 2021)の二つのツールを組み合わせたパイプラインによって抽出し、各CDSが由来する細菌の分類群の特定を行なった。
201 :プロセッサ
202 :記憶デバイス
203 :入力デバイス
204 :表示デバイス
205 :マイクロ流路
206 :温調器
207 :分注器
208 :溶解試薬タンク
209 :増幅試薬タンク
210 :遠心分離器
211 :シークエンサ
212 :フローサイトメータ
301 :流路
302 :第1試料
303 :膜小胞
304 :オイル
305 :液滴
306 :液滴
401 :制御部
402 :記憶部
403 :入力部
404 :表示部
405 :配列決定部
406 :確認部
407 :液滴作製部
408 :ゲル化部
409 :溶解部
410 :除去部
411 :増幅部
412 :選択部
413 :参照部
Claims (20)
- 宿主細菌と、前記宿主細菌で産生され、前記宿主細菌外に放出された膜小胞と、を含む懸濁液から、前記宿主細菌と前記膜小胞とを分離し、前記膜小胞を含む第1試料を得ることと、
前記第1試料を用い、前記膜小胞の1個体ずつを液滴中に封入することと、
前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成することと、
前記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させて、前記膜小胞を溶解させ、前記膜小胞中のポリヌクレオチドが前記ゲルカプセルに溶出し、前記ゲルカプセル内に保持させることと、
前記ポリヌクレオチドを増幅試薬に接触させて、前記ポリヌクレオチドを前記ゲルカプセル内で増幅することと、
前記増幅したポリヌクレオチドから、前記ポリヌクレオチドの塩基配列である第1塩基配列を決定することと、
前記第1塩基配列を参照配列に整列させて前記第1塩基配列が前記参照配列にマップするかを調べることと、
前記第1塩基配列が前記参照配列にマップされる場合、前記第1塩基配列が、前記宿主細菌で産生された膜小胞に由来する塩基配列であると確認することと、
を含む、方法。 - 前記第1塩基配列を前記参照配列に整列させたとき、前記第1塩基配列が、前記参照配列が有する塩基配列の一部の領域と90%以上同一である場合、前記第1塩基配列が前記参照配列にマップされると判断する、請求項1に記載の方法。
- 前記参照配列が、前記第1試料のメタゲノム解析によって得られた塩基配列である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記参照配列が、前記宿主細菌のゲノム配列である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記参照配列が、ゲノム配列が既知の細胞の前記ゲノム配列の集合であり、
前記第1塩基配列が前記参照配列にマップされる場合、
前記マップされたゲノム配列を有する前記細胞を前記宿主細菌と決定することを更に含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記第1塩基配列を決定した後、前記第1塩基配列におけるタンパク質コード領域を検出し、前記タンパク質コード領域をクエリー配列とした相同性検索によって、前記タンパク質コード領域と相同のタンパク質コード配列を有する前記細胞を選択し、前記細胞のゲノム配列から前記参照配列を作成することを含む、請求項5に記載の方法。
- 更に、前記第1試料を核酸分解酵素で処理することを含む請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記懸濁液から、前記宿主細菌と前記膜小胞とを分離させ、前記膜小胞を含む前記第1試料と、前記宿主細菌を含む第2試料とを得ることと、を含む請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 更に、前記第2試料を用いて、前記参照配列を得ることと、を含む請求項8に記載の方法。
- 前記参照配列を得ることが、前記第2試料をメタゲノム解析して、得られる塩基配列を前記参照配列とすることである、請求項9に記載の方法。
- 前記参照配列を得ることが、前記第2試料を16S rRNA解析して、前記第2試料の細菌組成を推定し、前記細菌組成の塩基配列を前記参照配列とすることである、請求項9に記載の方法。
- 前記参照配列を得ることが、前記第2試料をシングルセル解析して、得られる塩基配列を前記参照配列とすることである、請求項9に記載の方法。
- 前記参照配列を得ることが、前記第2試料をメタゲノム解析して得られた塩基配列と、前記第2試料をシングルセル解析して得られた塩基配列とをマージして前記参照配列とすることである、請求項9に記載の方法。
- 前記懸濁液が、ヒト又は動物から採取した、糞便、唾液、喀痰、手術洗浄液、血液、並びに、皮膚又は身体粘膜の拭い液、及び、スワブからなる群より選択される少なくとも1種の採取試料である、請求項8~13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細菌が、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、ベイヨネラ属、フソバクテリウム属、パルビモナス属、アグリゲイティバクター属、アクチノマイセス属、アクチノバチルス属、バクテロイデス属、タンネレラ属、トレポネーマ属、カンピロバクター属、エイケネラ属、ストレプトコッカス属、及び、カプノサイトファーガ属からなる群より選択される少なくとも1種の細菌である、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。
- 更に、前記第1塩基配列をクラスタリングして、前記膜小胞の異種性を確認すること、を含む請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。
- 宿主細菌と、前記宿主細菌で産生され、前記宿主細菌外に放出された膜小胞とを含む懸濁液から、前記宿主細菌と前記膜小胞とを分離して得られた、前記膜小胞を含む第1試料を用いて、前記第1試料中の前記膜小胞の1個体ずつを液滴中に封入する液滴作製部と、
前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲル化部と、
前記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させる溶解部と、
前記ゲルカプセルから夾雑物質を除去する除去部と、
前記ゲルカプセルを増幅試薬に接触させ、ゲルカプセル内のポリヌクレオチドを増幅する増幅部と、
前記ポリヌクレオチドの配列である第1塩基配列の決定を行う配列決定部と、
前記第1塩基配列を参照配列に整列させて前記第1塩基配列が前記参照配列にマップするかを調べる参照部と、
前記第1塩基配列が前記参照配列にマップされる場合、前記第1塩基配列が、前記宿主細菌で産生された膜小胞に由来する塩基配列であると確認するための情報を提供する確認部と、
前記液滴作製部、前記ゲル化部、前記溶解部、前記除去部、前記増幅部、前記配列決定部、前記参照部、及び前記確認部を制御するように構成された制御部と、
を有する装置。 - 前記制御部は、前記参照部を制御して、前記第1塩基配列を前記参照配列に整列させたとき、前記第1塩基配列が、前記参照配列が有する塩基配列の一部の領域と90%以上同一である場合、前記第1塩基配列が前記参照配列にマップされると判断するように構成される、請求項17に記載の装置。
- 宿主細菌と、前記宿主細菌で産生され、前記宿主細菌外に放出された膜小胞とを含む懸濁液から、前記宿主細菌と前記膜小胞とを分離して得られた、前記膜小胞を含む第1試料を用いて、前記第1試料中の前記膜小胞の1個体ずつを液滴中に封入する液滴作製部と、前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲル化部と、前記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させる溶解部と、前記ゲルカプセルから夾雑物質を除去する除去部と、前記ゲルカプセルを増幅試薬に接触させ、ゲルカプセル内のポリヌクレオチドを増幅する増幅部と、を有する装置に、コンピュータにより、
前記第1試料を用い、前記膜小胞の1個体ずつを液滴中に封入する手順と、
前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する手順と、
前記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させて、前記膜小胞を溶解させ、前記膜小胞中のポリヌクレオチドが前記ゲルカプセルに溶出し、前記ゲルカプセル内に保持させる手順と、
前記増幅したポリヌクレオチドから、前記ポリヌクレオチドの塩基配列である第1塩基配列を決定する手順と、
前記第1塩基配列を参照配列に整列させて前記第1塩基配列が前記参照配列にマップするかを調べる手順と、
前記第1塩基配列が前記参照配列にマップされる場合、前記第1塩基配列が、前記宿主細菌で産生された膜小胞に由来する塩基配列であると確認する手順と、を実行させるプログラム。 - 前記第1塩基配列が前記参照配列にマップするかを調べる手順において、
前記第1塩基配列を前記参照配列に整列させたとき、前記第1塩基配列が、前記参照配列が有する塩基配列の一部の領域と90%以上同一である場合に、前記第1塩基配列が前記参照配列にマップされると判断する、請求項19に記載のプログラム。
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