WO2020218549A1 - 単一生物単位の遺伝情報またはその他の生体分子の情報を使用した、サンプルのスクリーニング法 - Google Patents

単一生物単位の遺伝情報またはその他の生体分子の情報を使用した、サンプルのスクリーニング法 Download PDF

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春子 竹山
西川　洋平
小川　雅人
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Definitions

  • the present disclosure is based on the structures and sequences of nucleic acids or other biomolecules prepared in parallel from various organisms and bioequivalents (eg, microorganisms, cell structures, artificial cells, etc.), individually with reference to the structures and sequences. It relates to a method of detecting and selecting an individual-specifically.
  • a simple operation is performed to analyze a single biological unit captured in a gel, and the genetic information of a single biological unit or other biomolecules is analyzed.
  • a library of molecular information can be prepared.
  • data will be accumulated according to the composition ratio of a single biological unit contained in the original sample. .. That is, if the sample contains a single biological unit that exists as a preferred species, the genetic information of many single biological units or other biomolecular information (eg, sequence data) is derived from that single biological unit.
  • the present disclosure simply relies on a set containing two or more single biological units based on the genetic information of the single biological unit or other biomolecular information (eg, a nucleic acid sequence or a particular subsequence).
  • biomolecular information eg, a nucleic acid sequence or a particular subsequence.
  • a method for producing a subset containing a single biounit which comprises the step of producing a subset containing at least one biounit.
  • cells are encapsulated in the droplets one by one, the droplets are gelled to form a gel capsule, the gel capsule is immersed in a lysis reagent to dissolve the cells in the gel capsule, and the cells in the gel capsule are dissolved.
  • a gel capsule containing an amplified and retained 1-cell genome-derived polynucleotide is prepared by the method of amplifying the polynucleotide of.
  • the present disclosure has been completed by detecting and selecting a sample to be analyzed in detail from the nucleic acid amplification product by any of the methods described in the present specification.
  • the present disclosure also presents, in another aspect, information on nucleic acids or other biomolecules derived from two or more single biological units (cells or cell-like structures) (eg, nucleic acid sequences or specific subsequences).
  • Embodiments of the present disclosure include the following.
  • (Item 1) Includes the step of generating a subset containing at least one single biological unit from a set containing two or more single biological units based on the genetic information of the single biological unit or information on other biomolecules. , How to generate a subset containing a single biounit.
  • (Item 2) A) The process of providing each of two or more single biological units separately, B) A step of selecting two or more separately provided single biological units based on genetic information derived from the single biological unit or information on other biomolecules. C) A method comprising the step of analyzing the selected single biological unit, if necessary. (Item 3) A) above (A) Encapsulating one cell or cell-like structure in a droplet using a sample containing two or more cells or components.
  • the solubilizing reagents are lysoteam, labiase, yatarase, achromopeptidase, protease, nuclease, zymolyase, chitinase, lysostaphin, mutanolaicin, sodium dodecyl sulfate, sodium lauryl sulfate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, phenol, chloroform, guanidine hydrochloride.
  • nucleic acid information is selected from the presence or absence of a particular gene sequence, the yield of a particular gene or the total nucleic acid yield.
  • Reagents for specifically detecting the presence or absence of the specific gene sequence, molecular weight measuring means (agarose gel electrophoresis, microchip electrophoresis), gene amplification method (PCR, qPCR) The method according to item 10, wherein the method is detected by means selected from the group consisting of gene sequencing (Sanger sequencing, NGS).
  • the reagent for specifically detecting the particular gene sequence is selected from the group consisting of antibodies, nucleic acid probes, DNA-binding fluorescent dyes, and fluorescent dye-binding nucleotides.
  • (Item 15) The method of item 14, wherein the genetic information or other biomolecule information is nucleic acid information.
  • A) comprises sequencing nucleic acids derived from cells or cell-like structures to obtain nucleic acid information.
  • B) comprises assessing the presence or absence of a specific gene sequence and / or identity with a specific gene sequence.
  • the steps of analyzing the selected genetic information or other biomolecule information include analysis of the possibility of disease, diagnosis of health condition, identification of a person, selection of treatment method, analysis of microflora, detection of gene mutation, and pathogen.
  • a device for sorting genetic information or other biomolecular information by a single biological unit A) A provider that provides genetic information or other biomolecule information derived from two or more single biological units as a set of genetic information or other biomolecule information for each single biological unit. B) A sorting unit that sorts the genetic information or other biomolecular information for each single biological unit based on all or part of the genetic information or other biomolecular information. C) An apparatus including an analysis unit for analyzing the selected genetic information or other biomolecule information, if necessary.
  • (Item 20) The device according to item 19, wherein the genetic information or other biomolecule information is nucleic acid information.
  • the analysis unit that analyzes the selected genetic information or information on other biomolecules is capable of analyzing the possibility of a disease, diagnosing a health condition, identifying a person, selecting a treatment method, analyzing a microflora, and detecting a gene mutation.
  • apparatus. (Item 24) A program that implements on a computer a method of sorting genetic information or other biomolecular information by cell or cell-like structure.
  • A) comprises sequencing nucleic acids derived from cells or cell-like structures to obtain nucleic acid information.
  • B) comprises assessing the presence or absence of a particular gene sequence and / or identity with a particular gene sequence.
  • the steps of analyzing the selected genetic information or other biomolecule information include analysis of the possibility of disease, diagnosis of health condition, identification of a person, selection of treatment method, analysis of microflora, detection of gene mutation, and pathogen.
  • the program according to any one of items 24-27, which comprises an analysis selected from the group consisting of detection of, drug candidate-producing microorganisms, search for industrial enzyme-producing microorganisms, microbial product assurance and environmental hygiene assessment. .. (Item 29) A recording medium containing a program that implements a computer-implemented method for sorting genetic information or other biomolecule information by cell or cell-like structure.
  • A) comprises sequencing nucleic acids derived from cells or cell-like structures to obtain nucleic acid information.
  • B) comprises evaluating the presence or absence of a specific gene sequence and / or identity with a specific gene sequence.
  • the steps of analyzing the selected genetic information or other biomolecule information include analysis of the possibility of disease, diagnosis of health condition, identification of a person, selection of treatment method, analysis of microflora, detection of gene mutation, and pathogen.
  • the record according to any one of items 29 to 32 including analysis selected from the group consisting of detection of, drug candidate producing microorganisms, search for industrial enzyme producing microorganisms, microbial product assurance and environmental hygiene assessment. Medium.
  • nucleic acid amplification, detection, selection, etc. can be performed while holding individual single biological units (for example, "single cell") as a set, and when it is desired to acquire rare bacterial data, host DNA When a large amount of such substances are mixed, data on only specific bacteria is required, and it can be applied when evaluation of diversity is unnecessary.
  • the present disclosure can also narrow down the innumerable samples to be used for whole-genome sequencing prior to whole-genome sequencing. Further, in the present disclosure (in the case of dry), after decoding the entire genome sequence, the information to be analyzed can be narrowed down from the digital sequence information.
  • the micro flow path is composed of a first flow path 5, a second flow path 6, a third flow path 7, and a fourth flow path 8, and the micro flow path 2 in which adjacent flow paths are arranged at right angles is shown. Fine droplets are introduced by introducing the intestinal microbial suspension 1 from the first flow path 5, introducing oil 10 from the second flow path 6 and the fourth flow path 8 and shearing the intestinal microbial suspension 1. 3 is produced. It is a figure which shows the microdroplet 3 housed in a tube 9.
  • a plurality of microdroplets 3 and oil 10 are housed in the tube 9, but the microdroplets 3 have a lighter specific gravity than the oil 10 and therefore accumulate in the upper layer.
  • the fine droplets 3 gelled by cooling the tube 9 on ice are the gel capsules 11.
  • the lytic reagent 13 is allowed to permeate into each gel capsule 11.
  • the microdroplets 3 containing the cells 4 are prepared by introducing oil 10 and shearing the intestinal microbial suspension 1 and housed in a tube 9.
  • the tube 9 is then cooled on ice to make a gel capsule 11.
  • the gel capsule 11 After removing the oil 10, centrifugation is performed with PBS to make the gel capsule 11 suspended in the aqueous layer 12, and the gel capsule 11 is immersed in the lytic reagent 13 to bring the lytic reagent 13 into each gel capsule 11.
  • the part other than the object to be collected such as the cell wall of the cell 4 is lysed, and the genomic DNA 14 is eluted into the gel capsule 11.
  • the amplification reagent 15 is added to the tube 9 to carry out a whole genome amplification reaction.
  • the gel capsule 11 containing the genomic DNA 14 is collected on the plate 16 and the secondary amplification by the MDA method is performed in the well of each plate 16.
  • the production device 18 includes a droplet production unit 19 that encloses one cell 4 in the microdroplets 3 by the microchannel 2, and the generated microdroplets 3 are housed in the tube 9.
  • the manufacturing apparatus 18 includes a gel capsule generation unit 20 that gels the fine droplets 3 to generate a gel capsule 11, and the gel capsule generation unit 20 can cool the fine droplets 3 in a state of being housed in the tube 9.
  • the manufacturing apparatus 18 includes a dissolving reagent immersion unit 23 in which the lytic reagent 13 is injected into the tube 9 containing the gel capsule 11 and the gel capsule 11 is immersed in the lytic reagent 13. Further, the manufacturing apparatus 18 includes a removing unit 25 having a centrifugal cleaning unit 26 for removing contaminants including oil 10 and lytic reagent 13 from the gel capsule 11.
  • the production apparatus 18 includes an amplification reagent dipping unit 27 for immersing the genomic DNA 14 held in the gel capsule 11 in the amplification reagent 15, and the amplification reagent 15 is an amplification reagent injection unit 28. Is injected into the tube 9 from.
  • the production device 18 includes a sorting unit 29 that sorts gel capsules 11 that retain the genomic DNA 14 amplified above a predetermined level.
  • the sorting unit 29 sorts the gel capsule 11 having the flow cytometer 30 and holding the genomic DNA 14 amplified more than a predetermined value, and collects it on the plate 16.
  • the gel capsule 11 that does not retain the genomic DNA 14 amplified above a predetermined level is collected in another container 31.
  • FIG. 7 shows an overall view of a method for screening amplified DNA based on sequence.
  • the amplified DNA is screened prior to whole-genome sequencing and / or after full-genome sequencing. Screening (wet) prior to whole-genome sequencing is performed using a portion of the amplified DNA sample and involves experiments such as sequencing and agarose gel electrophoresis. Screening (dry) after decoding the entire genome sequence targets digital sequence data and does not involve actual experiments.
  • FIG. 8 shows a schematic diagram of performing the steps for preparing amplified DNA. DNA derived from a single biological unit by encapsulating the sample in a droplet one by one, gelling the droplet to generate a gel capsule, and dissolving the single biological unit in the gel capsule with a solubilizing reagent.
  • FIG. 9 shows a schematic diagram of wet screening. Experiments such as sequencing and agarose gel electrophoresis will be performed using a portion of the amplified DNA sample. A target sample can be screened from an infinite number of samples based on the presence or absence of a specific gene sequence, the amount of a specific gene, the yield of amplified DNA, and the like.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of the sequence determination after selection.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing a dry screening step.
  • FIG. 12 is a diagram showing the completion rate and the contamination rate of the entire genome sequence for each sample derived from bacteria. CheckM was used to evaluate the genome decoding rate (complete rate) and the degree of contamination.
  • FIG. 13 is an electrophoretic image of the genomic data of the target bacterium. The rightmost lane is a PC using Escherichia coli, and the 4, 19, and 20th lanes from the left except for the marker are derived from bacteria.
  • cell refers to a particle that contains a molecule that carries the genetic information and is any particle that can be replicated (whether or not it is possible alone).
  • the term “cell” as used herein includes cells of unicellular organisms, bacteria, cells derived from multicellular organisms, fungi and the like.
  • cell-like structure refers to any particle containing a molecule having genetic information.
  • cell-like structures include organelles such as mitochondria, cell nuclei, and chloroplasts, and viruses.
  • the "single biological unit” refers to a unit having genetic information or other biomolecular information.
  • a single biological unit may include cells, cell-like structures, etc., but is not limited to these, including artificially produced cells (so-called artificial cells) and digital cells (provided as information).
  • a “single biological unit” refers to a unit having a structure corresponding to structural information and can be a tangible (in the case of wet treatment) or an intangible concept (in the case of dry treatment). ..
  • genetic information or other biomolecule information refers to information that defines a biomolecule or an analog thereof. Genetic information or other biomolecule information may include, but is not limited to, structural information of nucleic acids, amino acids, lipids or sugar chains or their analogs, but is not limited to in vivo molecules such as metabolites or their analogs. It can also include information on the diversity of body interactions.
  • genetic information or other biomolecule information refers to a structure that corresponds to genetic information or other biomolecular information.
  • genetic information is also referred to as "nucleic acid information”, and both are synonymous.
  • biomolecule refers to a molecule possessed by any organism or virus.
  • In vivo molecules can include nucleic acids, proteins, sugar chains, lipids, and the like.
  • biomolecular analog refers to a natural or non-natural variant of a biomolecule.
  • Analogs of in vivo molecules can include modified nucleic acids, modified amino acids, modified lipids or modified sugar chains.
  • aggregate refers to an aggregate containing two or more single biological units, cells or structures for cells.
  • subset when used in conjunction with a “set,” refers to a portion of a set that has a smaller number of single biological units, cells or cell structures.
  • gel refers to a colloidal solution (sol) in which a polymer substance or colloidal particles interact with each other to form a network structure as a whole and contain a large amount of a liquid phase as a solvent or a dispersion medium. A state in which fluidity is lost.
  • gelling means changing a solution into a “gel” state.
  • the "gel capsule” refers to a gel-like fine particle structure capable of holding a cell or a cell-like structure therein.
  • gene analysis means examining the state of nucleic acids (DNA, RNA, etc.) in a biological sample.
  • the gene analysis can include those that utilize a nucleic acid amplification reaction.
  • Examples of gene analysis including these include sequencing, genotyping / polymorphism analysis (SNP analysis, copy number polymorphism, restriction enzyme fragment length polymorphism, repeat number polymorphism), expression analysis, fluorescence quenching probe ( Quenching Probe: Q-Probe), SYBR green method, melting curve analysis, real-time PCR, quantitative RT-PCR, digital PCR and the like can be mentioned.
  • single biological unit level refers to genetic information contained in one single biological unit or information on other biomolecules, as opposed to genetic information contained in another single biological unit or other information. It refers to processing in a state that can be distinguished from the information of biomolecules.
  • single cell level refers to genetic information contained in one cell or cell-like structure or information on other biomolecules, as opposed to genetic information contained in another cell or cell-like structure. Or, it means that the processing is performed in a state of being distinguished from the information of other biomolecules. For example, when amplifying a polynucleotide at the "single biological unit level” or “single cell level”, the polynucleotide in one single biological unit or cell or cell-like structure, and another single organism, respectively. Each amplification takes place with the polynucleotides in the unit, or other cell or cell-like structure, distinguishable.
  • single biounit analysis refers to genetic information or other biomolecule information contained in one single biological unit (eg, cell or cell-like structure) as another single organism. It refers to analysis in a state of being distinguished from genetic information contained in a unit (for example, a cell or a cell-like structure) or information on other biomolecules.
  • single cell analysis refers to genetic information or other biomolecule information contained in one cell or cell-like structure, and genetic information or other information contained in another cell or cell-like structure. It refers to analysis in a state that is distinguished from the information on biomolecules.
  • genetic information refers to information on a nucleic acid encoding a gene or other information contained in one cell or cell-like structure, and refers to the presence or absence of a specific gene sequence, the yield of a specific gene, or the total nucleic acid. Including yield.
  • biomolecule information refers to a biomolecule contained in one cell or cell-like structure (in addition to nucleic acid, proteins, sugars, lipids and the like are also included in addition to nucleic acid) or the like. Refers to information on analogs, including the presence or absence of structure or sequence of a particular biomolecule, structural or sequence identity, yield of a particular biomolecule and yield of all biomolecules.
  • nucleic acid information refers to information on nucleic acids contained in one cell or cell-like structure, and includes the presence or absence of a specific gene sequence, the yield of a specific gene, or the total nucleic acid yield.
  • identity refers to the structural or sequence similarity between two biomolecules. If the subject is a sequence, identity can also be determined by comparing the positions in each sequence that can be aligned for comparison.
  • the present disclosure generally comprises at least one single biological unit from a set containing two or more single biological units, based on the genetic information of the single biological unit or other biomolecular information.
  • a method for producing a subset containing a single biological unit which comprises the step of producing a subset containing.
  • a single biological unit can be a cell or cell-like structure, in which case the disclosure is based on the nucleic acid sequence of the cell or cell-like structure from a collection comprising two or more cells or cell-like structures.
  • Provide a method of producing a subaggregate containing a cell or cell-like structure comprising the step of producing a subaggregate containing at least one cell or cell-like structure.
  • This method may be performed wet, dry (information processing), or both.
  • subsets are generated from the set obtained at the single biological unit (single cell in the case of cells) level obtained based on a specific sequence or other structural information to streamline further analysis. Can be transformed into. It will be described individually below.
  • screening refers to an experiment involving physical manipulation, that is, screening using, for example, at least a part of a biomolecule. Screening (wet) does not cover digital biomolecular data. Screening prior to analysis of genetic information or other biomolecule information (eg, omics analysis) allows only the sample of interest to be analyzed, leading to a reduction in time and cost required for the experiment. Screening (wet) may be performed before or after analysis of the genetic information or other biomolecules (eg, omics analysis).
  • Screening may be any screening using a part of biomolecules.
  • the biomolecule may be a nucleic acid, protein, amino acid, sugar chain, lipid or the like.
  • screening can be performed based on the presence or absence of a specific gene sequence, the yield of a specific gene sequence, the yield of total DNA, and the like.
  • the present disclosure A) provides each of two or more single biological units (eg, cells or cell-like structures) separately, and B) said separately provided 2 Selection of one or more single biological units (eg, cells or cell-like structures) based on genetic information or other biomolecule information derived from the single biological unit (eg, cells or cell-like structures) Provided is a method comprising the steps of C) analyzing the selected single biological unit (eg, cell or cell-like structure), if desired.
  • step A) encloses one single biological unit (eg, a cell or cell-like structure) in a droplet using (a) a sample containing two or more cells or components.
  • the polynucleotide in the component is eluted in the gel capsule and retained in the gel capsule with the substance binding to the polynucleotide removed, and (d) the polynucleotide is brought into contact with the amplification reagent. Amplification of the polynucleotide in the gel capsule may be included.
  • the step of contacting the polynucleotide with an amplification reagent to amplify the polynucleotide in a gel capsule can also amplify the polynucleotide while maintaining a gel state in the gel capsule. ..
  • the droplet is a single organism by flowing one single organism unit (eg, a cell or cell-like structure) into a microchannel and shearing the suspension with oil. It can be made by encapsulating a unit (eg, a cell or cell-like structure).
  • the gel capsule may be a hydrogel capsule.
  • the disclosure A) presents genetic information or other biomolecule information from two or more single biounits (eg, cells or cell-like structures) to the single biounit (eg, cell or cell-like structure). , Cells or cell-like structures) as a set of genetic information or other biomolecular information, and B) the nucleic acid based on all or part of the genetic information or other biomolecular information.
  • a method comprising a step of analyzing genetic information or other biomolecular information in a cell-like structure) is provided.
  • the step of separately providing each of two or more single biological units is carried out, for example, by the technique using gel encapsulation described herein. can do.
  • genetic information or other biomolecule information is selected from the group consisting of nucleic acid information, protein information, lipid information and sugar chain information.
  • the genetic information or other biomolecule information is nucleic acid information.
  • nucleic acid information is selected from the presence or absence of a particular gene sequence, the yield of a particular gene, or the total nucleic acid yield.
  • a single biological unit (eg, a cell or cell-like structure) may be selected in the absence of a particular gene sequence, or a single biological unit (eg, in the absence of a particular gene sequence).
  • Cells or cell-like structures may be selected.
  • a single biological unit (eg, a cell or cell-like structure) may be selected if the yield of a particular gene is greater than the baseline yield, or a single biological unit (eg, a cell or cell-like structure). For example, cells or cell-like structures) may be selected.
  • a single biological unit eg, a cell or cell-like structure
  • a single biological unit eg, cell or cell-like structure
  • Cells or cell-like structures may be selected.
  • a reagent for specifically detecting the presence or absence of a specific gene sequence, a molecular weight measuring means (agarose gel electrophoresis, microchip electrophoresis), a gene amplification method (PCR, qPCR), gene sequencing (Sanger sequencing, NGS) by means selected from the group.
  • reagents that specifically detect a particular gene sequence include antibodies, probes, DNA-binding fluorescent dyes, fluorescent dye-binding nucleotides.
  • the yield of a specific gene or the total nucleic acid yield can be measured by absorbance measurement, fluorescence measurement, agarose gel electrophoresis, or microchip electrophoresis.
  • sorting is performed by first dispensing gel capsules containing amplified polynucleotides onto plates using flow cytometry, a continuous automatic dispenser, a microfluidic device, and then from the polynucleotides of each sorted gel capsule.
  • a specific gene is amplified by PCR or the like, and the gene sequence is determined by Sanger sequence or NGS or the molecular weight is determined by electrophoresis or absorbance / fluorescent nucleic acid quantification.
  • nucleic acid information two or more separately provided single biomolecules (eg, cells or cell-like structures) are referred to as nucleic acid information or nucleic acid information derived from the single biounit (eg, cells or cell-like structures).
  • the step of selecting based on the information of other biomolecules is to screen using, for example, a probe capable of detecting a specific sequence (for example, a probe capable of recognizing 18S or other specific gene products). Can go and carry out.
  • the genetic information or other biomolecule information is protein information.
  • protein information is selected from total protein amount, specific protein amount, or presence or absence of specific protein.
  • the protein may be whole or partial (eg, subunit, domain).
  • the protein information may be information about the primary, secondary, tertiary or quaternary structure of the protein.
  • a single biological unit (eg, a cell or cell-like structure) may be selected if a particular protein is present, otherwise a single biological unit (eg, a cell or cell-like structure) may be selected. You may select the thing).
  • a single biological unit (eg, a cell or cell-like structure) may be selected if the total protein content is greater than the baseline yield, or a single biological unit (eg, cell or cell-like structure) if lower. Cells or cell-like structures) may be selected.
  • a single biological unit eg, a cell or cell-like structure
  • a single biological unit eg, cell or cell-like structure
  • Cells or cell-like structures may be selected.
  • the presence or absence of a specific protein can be detected by means of antibodies, peptides, nucleic acids and the like.
  • total protein content or specific protein content can be detected using means such as protein concentration measuring means (BCA assay, Bradford, ELISA), nucleic acid amplification and the like.
  • sorting begins by first sorting the gel capsules into plates with flow cytometry, a continuous automatic dispenser, a microfluidic device. Furthermore, a specific protein is extracted from each of the separated gel capsules. Using a part of this protein, the total amount of protein by protein concentration measurement or specific protein detection using antibody or diffusion is performed to evaluate the presence or absence of the specific protein. With reference to the result, the sample is selected and transferred to another plate or the like.
  • the genetic information or other biomolecule information is sugar chain information.
  • the sugar chain information is selected from the presence or absence of sugar chains, the amount of specific sugar chains or the amount of total sugar chains. In a particular embodiment, it may be the whole sugar chain or a part of it. In one embodiment, the sugar chain information can be detected by any means.
  • the genetic information or other biomolecule information is lipid information.
  • the lipid information is selected from the presence or absence of lipids, the amount of specific lipids or the amount of total lipids. In certain embodiments, it may be whole or part of the lipid. In one embodiment, lipid information can be detected by any means.
  • a single biological unit (eg, a cell or cell-like structure) may be selected using multiple genetic information or other biomolecular information.
  • the selection may be performed multiple times and the genetic information or other biomolecule information used in each selection may be the same or different.
  • a step of analyzing the selected single biological unit can be carried out, and for example, it can be analyzed by a gene analysis method.
  • the analysis of a single biological unit is an arbitrary omics analysis (eg, genome analysis, proteomics analysis, transcriptome analysis, glycome analysis, lipidome analysis or metabolome analysis). ) May be.
  • the information obtained from the analysis may be used to create a data library. In other embodiments, the analysis may be followed by an additional selection and analysis.
  • digital biomolecule data can be obtained by analysis.
  • the digital biomolecular data may be genomic information, transcriptome information, proteome information, glycome information or lipidome information.
  • the technique of the present disclosure can be used for analysis of sub-strains.
  • the purpose was to obtain genomic data of one or more specific microorganisms of interest to those skilled in the art among animal symbiotic microorganisms such as gut flora and marine / soil microorganisms, they were amplified with gel capsules.
  • By confirming the presence or absence of the target gene fragment in advance for the polynucleotide it is possible to reduce the cost required for acquisition of unnecessary gene sequence data and data analysis.
  • gene sequence data can be acquired in a single biological unit, and by mutual comparison of mutation sites, sub-strains can be identified and their diversity. Evaluation is possible. For example, it can be used for gene mutation analysis of pathogens and search for high-producing strains of industrial enzymes.
  • the number occupied in the sample becomes clear. Furthermore, by acquiring gene sequence data for each single organism and performing comparative genome analysis such as storage of metabolic pathways, genomic identity, and evolutionary phylogenetic classification, differences in microorganisms can be clarified, and diversity of host samples can be obtained. And analyze the relationship with the background information of the sample.
  • the sample may be feces, saliva, sputum or skin, oral cavity, nasal cavity, ears, genital lavage, surgical cleaning solution, tissue extract or blood of a specific disease patient, and microorganisms contained in the sample. It is assumed that it will be analyzed.
  • This disclosure is for detecting a target in a sample in which cells and organelles derived from multiple organisms are mixed. It can be applied.
  • the analysis sample is feces, saliva, sputum or skin, oral cavity, nasal cavity, ears, genital lavage fluid, surgical cleaning solution, tissue extract or blood, and the microorganisms contained in the sample are analyzed. Contains cells, intracellular small organs, and nucleic acids from many host animals in the sample. Some of these can also be encapsulated inside the gel capsule to perform polynucleotide amplification.
  • Stepwise detection of a target from a sample containing a mixture of cells and organelles derived from multiple organisms This disclosure describes a target from a sample containing a mixture of cells and organelles derived from multiple organisms. It can be applied to stepwise detection. Analysis samples include feces, saliva, sputum and skin, oral cavity, nasal cavity, ears, genital lavage fluid, surgical cleaning fluid, tissue extract and blood, or crushed fluid of plants, insects, and animals containing symbiotic microorganisms. , It is assumed that both the microorganism and the host cell contained in the sample are to be analyzed.
  • each gel capsule is encapsulated with host-derived cells, organelles, nucleic acids, and nucleic acids derived from symbiotic microorganisms. All of these can be encapsulated inside the gel capsule and polynucleotide amplification can be performed. Therefore, by stepwise detecting and selecting gene fragments derived from the target host and gene fragments derived from microorganisms in the gel capsule containing the amplified polynucleotide, only the gene sequence data to be analyzed can be specifically detected. You can get it and reduce the cost of it. For example, the reference gene detection is repeated a plurality of times, and a sample is selected as needed.
  • a gene fragment derived from a microorganism is amplified and detected in a gel capsule with respect to the residual sample, and then selected as necessary.
  • the order after the second time can be changed as needed.
  • the target may be a combination of two or more microorganisms or host-derived substances.
  • the present disclosure is also applicable to evaluation of preservation of specific species.
  • the specified organism contains an amplified polynucleotide by using the disclosed technology.
  • the content rate can be shown by detecting and selecting from the gel capsule.
  • it is possible to evaluate the degree of coincidence with the standard at the genome level, preservation, and the like. It is expected to be used for quality assurance of microbial preparations.
  • the present disclosure provides a dry (in silico) method of producing a subset containing a single biological unit.
  • Screening (dry) refers to screening using digital biomolecule data performed after analysis of genetic information or other biomolecule information (eg, omics analysis). Screening (wet) targets digital sequence data. Screening after analysis of genetic information or other biomolecules can reduce the time required for experiments because more samples can be screened in a shorter amount of time.
  • the digital biomolecule data used in the present disclosure may be genomic information, proteome information, glycome information or lipidome information.
  • the disclosure A) presents genetic information or other biomolecule information from two or more single biounits (eg, cells or cell-like structures) to the single biounit (eg, cell or cell-like structure). , Cells or cell-like structures) as a set of genetic information or other biomolecular information, and B) the inheritance based on all or part of the genetic information or other biomolecular information.
  • a method including a step of analyzing information.
  • A) genetic information or other biomolecule information derived from two or more single biological units is presented to the single biological unit (eg, cells or cell-like).
  • the step of providing as a set of genetic information or other biomolecule information for each structure is carried out by separately providing two or more single biological units to obtain genetic information or other biomolecule information. It can be performed, for example, by encapsulating each of two or more single biological units and analyzing the genetic information or other biomolecule information in each capsule.
  • the step of separately providing each of two or more single biological units is carried out, for example, by the technique using gel encapsulation described herein. can do.
  • the single biological unit may be a cell or cell-like structure or the like, or may be cell information such as a digital cell.
  • the cell information may be artificially designed or digitized information of natural cells or cell-like structures.
  • the genetic information or other biomolecule information is digital information.
  • the genetic information or other biomolecule information is information obtained by any omics analysis (eg, genome analysis, proteome analysis, transcriptome analysis, glycome analysis, lipidome analysis or metabolome analysis). There may be.
  • the genetic information or other biomolecule information may be from cells or cell-like structures, or may be artificially designed.
  • genetic information or other biomolecule information is selected from the group consisting of nucleic acid information, protein information, lipid information and sugar chain information.
  • step A) involves sequencing nucleic acids from a single biological unit (eg, a cell or cell-like structure) to obtain nucleic acid information.
  • step A) uses a detection molecule for a protein, sugar chain or lipid derived from a single biological unit (eg, cell or cell-like structure) to provide protein information, sugar chain information or lipid. Including getting information.
  • B) genetic information or other biomolecular information is provided for each single biological unit (eg, cell or cell-like structure) based on all or part of the genetic information or other biomolecular information.
  • the step of sorting can be carried out, for example, based on the identity of genetic information or other biomolecular information.
  • the genetic information or other biomolecule information can be nucleic acid information.
  • nucleic acid information is selected from the presence or absence of a particular gene sequence, the amount of a particular gene or the identity with a particular gene sequence, or a combination thereof.
  • the genetic information or other biomolecule information may be a contig produced by assembling sequence data.
  • the genetic information or other biomolecule information may be the genome decoding rate (complete rate) and the degree of contamination calculated from Contig.
  • step B) comprises assessing the presence or absence of a particular gene sequence and / or identity with a particular gene sequence.
  • identity with a particular gene sequence can be assessed using BLAST, DIAMOND, BWA, bowtie2, hmmer.
  • step B) may sort nucleic acid information by single biological unit (eg, cell or cell-like structure) based on the presence or absence of a particular gene sequence.
  • step B) provides nucleic acid information based on the identity of a particular gene sequence with nucleic acid information derived from two or more single biological units (eg, cells or cell-like structures). It may be sorted by 3 single biological units (eg, cells or cell-like structures).
  • the identity is 50% or higher, 55% or higher, 60% or higher, 65% or higher, 70% or higher, 75% or higher, 80% or higher, 85% or higher, 90% or higher, 91% or higher, It may be 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 100%.
  • the identity is 50% or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, 9% or less, It may be 8% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less, 1% or less, 0%.
  • step B) includes evaluating the presence or absence of a specific amino acid sequence or the like.
  • step B) includes evaluating the presence or absence of a specific sugar chain or the like. In one embodiment, step B) comprises assessing the presence or absence of a particular lipid or the like.
  • the samples may be selected by comparing the contigs between the samples. In one embodiment, selection may be performed using the genome decoding rate (complete rate) and the degree of contamination. In some embodiments, the genome decoding rate (complete rate) and the degree of contamination may be evaluated using CheckM.
  • the complete rates are 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95. %, 96%, 97%, 98% or 99% or more samples may be selected. In a preferred embodiment, samples with a completion rate of 90% or more may be selected.
  • samples with a contamination rate of 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% or 1% or less may be selected. In a preferred embodiment, samples having a contamination rate of 5% or less may be selected.
  • a step of analyzing the selected genetic information or information of other biomolecules can be performed, and this step can be performed by, for example, a search engine such as blast or an analysis web such as Ensembl.
  • assembly evaluation tools such as QUAST and CheckM, annotation tools such as Prokka, InterProScan, and DFAST, and metabolic / physiological function potential evaluation systems such as MetaCyc and MAPLE can be used.
  • QUAST and CheckM assembly evaluation tools
  • annotation tools such as Prokka, InterProScan, and DFAST
  • metabolic / physiological function potential evaluation systems such as MetaCyc and MAPLE
  • the genes in the genome are identified, and the conservativeness as a metabolic pathway is evaluated by MAPLE.
  • the conservativeness and identity of each gene will be evaluated, and comparative genome analysis with related species will be performed.
  • the analysis involves clustering based on genetic information or other biomolecular information, searching for markers, comparative analysis of identical strains of microorganisms (eg, analysis of subspecies in a group of microbial strains related to a disease or the like).
  • Search for microorganisms having a specific gene for example, secondary metabolites and enzymes produced by microorganisms
  • analysis of individually selected bacteria, archia, fungi, other eukaryotic cells, etc. from among various biological species Includes detection of microorganisms from human-derived samples (eg, search for pathogenic microorganisms in blood and sputum and analysis of microorganisms that coexist inside tissues).
  • the number occupied in the sample becomes clear. Furthermore, by acquiring gene sequence data for each single organism and performing comparative genome analysis such as storage of metabolic pathways, genomic identity, and evolutionary phylogenetic classification, differences in microorganisms can be clarified, and diversity of host samples can be obtained. And analyze the relationship with the background information of the sample.
  • the sample may be feces, saliva, sputum or skin, oral cavity, nasal cavity, ears, genital lavage, surgical cleaning solution, tissue extract or blood of a specific disease patient, and microorganisms contained in the sample. It is assumed that it will be analyzed.
  • the characteristics of the sample when analyzing the microbial diversity, for example, as an example of analyzing the microbial flora in feces, proceed with the analysis as in Examples 1 to 3 below.
  • the characteristics of individual specimens can be known by estimating the lineage of intestinal bacteria in the 1-cell amplified genomic library, analyzing the diversity, and comparing them.
  • DPBS phosphate buffered saline
  • the supernatant was filtered using a filter having a diameter of 5 ⁇ m (SMWP04700, Sigma-Aldrich) and then centrifuged at 10,000 ⁇ g for 5 minutes (75004263, Thermo Fisher Scientific) to remove the supernatant.
  • the pellets are resuspended in 10 mL PBS, dispensed in 1 mL each in a 1.5 mL tube (MCT-150-C, Axygen), and then centrifuged at 10,000 xg for 5 minutes to collect soil bacteria.
  • Bacteria Bacterial pellets were combined into a single 1.5 mL tube, washed twice by centrifugation with PBS, and then suspended in PBS to obtain a cell suspension of soil bacteria.
  • the cell concentration in the prepared cell suspension was measured (microscope: CKX41, OLYMPUS, bacterial calculator A161,2-5679-01, AS ONE), and ultra-low melting point agarose (A5030) was adjusted to a final concentration of 1.5%.
  • -10G, Sigma-Aldrich was added to prepare a soil bacterial suspension used for gel capsule preparation (cell final concentration: 1.5 ⁇ 10 3 cells / ⁇ L). Subsequently, the analysis can proceed in the same procedure as the flow described in Examples 1 to 3.
  • a microbial suspension For aquatic microorganisms, prepare a microbial suspension according to the following procedure. After that, the work is performed in the same operation as in Examples 1 to 3. In the experiment, 4 L of seawater or fresh water was collected in a sterilized plastic tank, filtered using a 5 ⁇ m diameter filter (SMWP04700, Sigma-Aldrich), and then filtered through a 0.22 ⁇ m diameter filter (GSWP04700, Sigma-Aldrich). By doing so, the bacterial fraction was trapped on the filter.
  • SSWP04700 5 ⁇ m diameter filter
  • GSWP04700 Sigma-Aldrich
  • a 0.22 ⁇ m diameter filter is placed in a 25 mL tube (2362-025, Iwaki) containing 10 mL of Phosphate Buffered Saline (DPBS) (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 14190-144, Thermo Fisher Scientific). , Suspended well. Bacteria derived from seawater or freshwater are collected by dispensing 1 mL of a 10 mL bacterial suspension into a 1.5 mL tube (MCT-150-C, Axygen) and centrifuging at 10,000 xg for 5 minutes. Bacteria.
  • DPBS Phosphate Buffered Saline
  • Bacterial cell suspensions derived from seawater or freshwater are obtained by collecting the bacterial cell pellets in a single 1.5 mL tube, washing them by centrifugation twice with PBS, and then suspending them in PBS. did.
  • the cell concentration in the prepared cell suspension was measured (microscope: CKX41, OLYMPUS, bacterial calculator A161,2-5679-01, AS ONE), and ultra-low melting point agarose (A5030) was adjusted to a final concentration of 1.5%.
  • -10G, Sigma-Aldrich was added to prepare seawater or freshwater-derived bacterial suspensions used for gel capsule preparation (cell final concentration: 1.5 ⁇ 10 3 cells / ⁇ L). Subsequently, the analysis can proceed in the same procedure as the flow described in Examples 1 to 3.
  • the analysis is carried out as in Examples 1 to 3, and as shown in Table 1, the lineage of intestinal bacteria in the 1-cell amplified genomic library is estimated.
  • Table 1 the lineage of intestinal bacteria in the 1-cell amplified genomic library is estimated.
  • BLAST homology search in BLAST, the presence of microorganisms classified into Lachnospiraceae (Lachnospiraceae) and Bacteroides (Bacteroides) is specifically detected.
  • Specific procedures include (1) homology search of single organism-derived gene sequences using BLAST and hmmer, or (2) mapping of single-organism-derived sequence data using BWA and bowtie2. To evaluate the homology between a single organism-derived gene sequence and a target gene sequence, and screen samples carrying a specific gene.
  • a homology search for a single organism-derived gene sequence is performed based on a gene that metabolizes dietary fiber inulin or a gene marker that identifies the microbial Bacteroides species.
  • the microorganisms and gene groups responsible for the degradation of the dietary inulin could be identified, and their functions could be estimated from the homology of known genes and the prediction of the three-dimensional structure based on the amino acid sequence.
  • This disclosure can also be applied to evaluation of gene mutation in single cell unit. Mutational diversity on the genome sequence can be evaluated on a single cell basis to track the genomic heterogeneity of cells in the sample and the development and progression of mutant lines. By selectively amplifying and detecting the target gene mutation site of the target cell for the gel capsule containing the amplified polynucleotide, only the gene sequence data to be analyzed can be specifically acquired, and the cost for it can be reduced. can do. It can be used for cancer evolution analysis, detection of drug-resistant mutations, and detection of gene-mutated microorganisms and virus strains.
  • a homology search for a single organism-derived gene sequence is performed based on a gene that metabolizes dietary fiber inulin or a gene marker that identifies the microbial Bacteroides species.
  • a gene that metabolizes dietary fiber inulin or a gene marker that identifies the microbial Bacteroides species.
  • Detection of coral coexisting microorganisms Contains 5 mL of seawater obtained by collecting 1.5 cm coral branches (obtained from Ishikawara in the sea area around Sesoko, Motobu-cho, Kunigami-gun, Okinawa) and filtering with a 0.22 ⁇ m diameter filter (DURAPORE membrane filter, GVW P04700, MERCK). It was collected in a 25 mL tube (2 362-025, IWAKI). After sufficiently crushing the coral branches using a scalpel (replacement blade scalpel holder (61-3813-28), replacement blade No. 10 (1-8545-11), AS ONE)), leave it on ice for 3 minutes. Then, large particles such as bone fragments were precipitated.
  • a scalpel replacement blade scalpel holder (61-3813-28), replacement blade No. 10 (1-8545-11), AS ONE
  • the supernatant was collected in a 1.5 mL tube (122-10, SSIbio) and centrifuged at 8,000 xg for 5 min (himac CF15RX, Koki Holdings). The supernatant was removed leaving the pellets, and 800 ⁇ L of seawater filtered through a 0.22 ⁇ m diameter filter (DURAPORE membrane filter, GVWP04700, MERCK) was added to suspend the pellets again. Next, 250 xg was centrifuged for 5 minutes, and the supernatant was collected in a new 1.5 mL tube.
  • DURAPORE membrane filter GVWP04700, MERCK
  • the concentration of bacterial cells in the prepared suspension was measured (microscope: CKX41, OLYMPUS, bacterial calculator A161,-5679-01, AS ONE), and ultra-low melting point agarose (A5030) was adjusted to a final concentration of 1.5%.
  • -10G, SIGMA-ALDRICH was added to prepare a mixed suspension of cells and cell-like structures used for gel capsule preparation (final bacterial cell concentration: 4.5 ⁇ 10 3 cells / ⁇ L). Subsequently, the process proceeds according to the method described in Examples 1 to 3. Subsequently, the following processing is performed.
  • nuclease-free water UltraPureDNase / RNase-Free Distilled Water, 10977-015, Thermo Fisher Scientific
  • 1 ⁇ L of the DNA amplification product in the library master plate was added to the library master plate.
  • a 40-fold diluted solution was prepared.
  • the DNA concentration was quantified by a Qubit fluorometer (Q33226, Thermo Fisher Scientific) and a Qubit dsDNA HS Assay Kit (Q32854, Thermo Fisher Scientific) using 1 ⁇ L of the diluent.
  • PCR was performed on the V3V4 region of the 16S rRNA gene using 1 ⁇ L of the diluted solution as a template (6.25 ⁇ L PrimeSTAR Max DNA Polymerase (R045B, Takara Bio), 0.5 ⁇ L 10 ⁇ M Primer Forward (5).
  • '-TCGTCGGCAGGCCGTCAGATAGTGTAGTAAGAGACAGCCTACGGGGNGNGGCWGCAG-3'(SEQ ID NO: 1) 0.5 ⁇ L 10 ⁇ M Primer Revere (5'-GTCTCGTGGGCTCGAGTAGGAGT RNase-Free Distilled Water (10977-015, ThermoFisher Scientific) (S1000 Thermal Cycler, Bio-Rad).
  • PCR reaction conditions are 95 ° C.
  • Stepwise detection of a target from a sample containing a mixture of cells and organelles derived from multiple organisms This disclosure describes a target from a sample containing a mixture of cells and organelles derived from multiple organisms. It can be applied to stepwise detection. Analysis samples include feces, saliva, sputum and skin, oral cavity, nasal cavity, ears, genital lavage fluid, surgical cleaning fluid, tissue extract and blood, or crushed fluid of plants, insects, and animals containing symbiotic microorganisms. , It is assumed that both the microorganism and the host cell contained in the sample are to be analyzed.
  • each gel capsule is encapsulated with host-derived cells, organelles, nucleic acids, and nucleic acids derived from symbiotic microorganisms. All of these can be encapsulated inside the gel capsule and polynucleotide amplification can be performed. Therefore, by stepwise detecting and selecting gene fragments derived from the target host and gene fragments derived from microorganisms in the gel capsule containing the amplified polynucleotide, only the gene sequence data to be analyzed can be specifically detected. You can get it and reduce the cost of it. For example, the reference gene detection is repeated a plurality of times, and a sample is selected as needed.
  • a gene fragment derived from a microorganism is amplified and detected in a gel capsule with respect to the residual sample, and then selected as necessary.
  • the order after the second time can be changed as needed.
  • the target may be a combination of two or more microorganisms or host-derived substances. Specifically, there is a method such as repeating the procedure shown in Application Example 5.
  • the present disclosure is also applicable to evaluation of preservation of specific species.
  • the purpose was to prove or reject a specific species of drug, pesticide, food, etc.
  • a specific organism can be detected and selected from a gel capsule containing an amplified polynucleotide, and the content rate can be shown.
  • the degree of coincidence with the standard at the genome level, preservation, and the like. It is expected to be used for quality assurance of microbial preparations.
  • the abundance ratio of the target bacterium may be evaluated by the procedure shown in the examples.
  • the technique of the present invention can be used for analysis of sub-strains.
  • the purpose was to obtain genomic data of one or more specific microorganisms of interest to those skilled in the art among animal symbiotic microorganisms such as gut flora and marine / soil microorganisms, they were amplified with gel capsules.
  • By confirming the presence or absence of the target gene fragment in advance for the polynucleotide it is possible to reduce the cost required for acquisition of unnecessary gene sequence data and data analysis.
  • gene sequence data can be acquired in a single biological unit, and by mutual comparison of mutation sites, sub-strains can be identified and their diversity. Evaluation is possible. For example, it can be used for gene mutation analysis of pathogens and search for high-producing strains of industrial enzymes.
  • the following procedure can be used for analysis of human intestinal flora composition.
  • Human feces were collected in a stool collection container (FS-0007 or FS-0008, Technosurgarabo).
  • the preservation solution was removed, and the container was washed once with 1000 ⁇ L of DPBS.
  • Frozen stool in 1.5 ml tube was naturally thawed by placing it on ice for 30 minutes. Fresh stools that do not contain a preservative solution are not treated before crushing.
  • DPBS Phosphate Buffered Saline
  • the cell concentration in the prepared cell suspension was measured (microscope: CKX41, OLYMPUS, bacterial calculator A161,2-5679-01, AS ONE), and ultra-low melting point agarose (A5030) was adjusted to a final concentration of 1.5%.
  • -10G, SIGMA-ALDRICH an intestinal microbial suspension used for gel capsule preparation was prepared (cell final concentration: 1.5 ⁇ 10 3 cells / ⁇ L).
  • microdroplets were prepared and human intestinal microbial cells were encapsulated in the microdroplets.
  • a microchannel consisting of a first channel, a second channel, a third channel, and a fourth channel, in which adjacent channels are arranged at right angles, is used, but they are connected in a substantially T shape. It is also possible to use a microchannel.
  • the microchannel of this example used had a width of 34 ⁇ m and a height of 50 ⁇ m, but the size of the microchannel can be appropriately changed depending on the size of the microdroplets to be produced and the size of one cell to be encapsulated.
  • the intestinal microbial suspension was introduced from the first channel (aqueous phase inlet), and Pico-Surf1 (2% in Novec7500) (Sphere Fluidics) from the second channel and the fourth channel (oil phase inlet). ) (Hereinafter referred to as "oil") is introduced to shear the intestinal microbial suspension to prepare fine droplets having a diameter of 50 ⁇ m, and the third flow path 7 is allowed to flow to form a tube having a capacity of 0.2 mL. Collected in. Approximately 450,000 microdroplets were produced at a rate of 500 droplets / second. The cell concentration in the microdroplets is 0.1 cells / droplet.
  • the diameter of the microdroplets is made uniform to 50 ⁇ m, so that each cell can be easily encapsulated in the microdroplets.
  • the diameter of the microdroplets is, for example, 1 to 250 ⁇ m, preferably 10 to 200 ⁇ m.
  • microdroplets and oil are stored in the tube, but the microdroplets have a lighter specific gravity than oil, so they accumulate in the upper layer.
  • the tube was cooled on ice for 15 minutes, and microdroplets were gelled with ultra-low melting point agarose.
  • the gelled microdroplets are gel capsules. Since the diameter of the microdroplets is 50 ⁇ m, the diameter of the gel capsule is also 50 ⁇ m. The diameter of the gel capsule is preferably 1 to 250 ⁇ m. By making the diameter of the gel capsule uniform, the penetration rate of the lytic reagent described later into each gel capsule can be made more uniform.
  • the gel capsule was sequentially immersed in a lytic reagent as a lysis reagent, and a part other than the object to be collected such as a cell wall of a cell was dissolved inside the gel capsule, and genomic DNA was eluted into the gel capsule.
  • lysozyme (10 U / ⁇ L) (R1804M, Epicenter), which is one of the lytic reagents, was added to the tube to lyse the cells.
  • achromopeptidase (850 U / mL) (015-09951, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is one of the lytic reagents, was added to the tube.
  • protease K (1 mg / mL) (MC5005, Promega) and sodium dodecyl sulfate (SDS) 0.5% (71736-100ML, SIGMA-ALDRICH), which are one of the lytic reagents, to the tube to add cells.
  • the gel capsule was immersed in Buffer D2 (QIAGEN), which is an aqueous solution containing potassium hydroxide, which is one of the lytic reagents, to dissolve the residual components and denature the genomic DNA.
  • Buffer D2 QIAGEN
  • the lytic test solution used in this example was lysozyme, achromopeptidase, proteinase K, sodium dodecyl sulfate, and Buffer D2.
  • Potassium hydroxide is also used in a normal DNA amplification reaction step, but since it also has a lytic effect, it was used as one of the lytic reagents in this example. Since the gel capsule is immersed in the lytic reagent for a short time, the eluted genomic DNA is not discharged from the gel capsule by the lytic reagent and is retained in the gel capsule. In this example, the lytic reagent permeated into the gel capsule is also included in the contaminants.
  • a sufficient washing effect can be obtained by sequentially adding lysozyme, achromopeptidase and protease K, adding sodium dodecyl sulfate to lyse the cells, and then performing centrifugation only before adding Buffer D2. ..
  • centrifugation may be performed after lysing the cells with each lytic reagent.
  • the target genomic DNA can be collected by lysing the cells with a plurality of types of lytic reagents, and the lytic reagent and the poly of the lysed cells can be collected by centrifugation after immersion in the lytic reagent. Contaminants such as components other than nucleotides can be removed, and genomic DNA can be purified without inhibiting the subsequent genomic DNA amplification reaction.
  • the amplification reagent was added to the tube containing the gel capsule holding the denatured genomic DNA in the potassium hydroxide solution (Buffer D2), and the gel capsule was immersed in the amplification reagent.
  • MDA using phi29 DNA polymerase, which is a strand-substituted DNA synthase.
  • the (Multiple Displacement Amplification) method was used.
  • the whole genome amplification reaction reagent was immersed in REPLI-g Single Cell Kit (QIAGEN), and the whole genome amplification reaction was carried out for 3 hours (S1000 thermal cycler, Bio-Rad).
  • the amplification reagent (REPLI-g Single Cell Kit) contains a component that neutralizes the potassium hydroxide solution (Buffer D2).
  • a fluorescent DNA intercalator SYBR Green I nucleic acid gel st ain 10,000 in DMSO, (S7563, Thermo Fisher Scientific)
  • BD FACSMelody cell sorter BD Biosciences
  • the MDA method (REPLI-g Single Cell Kit, 150345) is used in the wells of each plate. , QIAGEN) was performed to prepare a library master plate containing 10 ⁇ L of DNA amplification product for each well.
  • Dispense 39 ⁇ L of nuclease-free water (UltraPure DNase / RNase-Free Distilled Water, 10977-015, Thermo Fisher Scientific) into each well of the new plate, add 1 ⁇ L of the DNA amplification product in the library master plate, and add 1 ⁇ L of the DNA amplification product in the library master plate to the library master plate.
  • a 40-fold diluted solution was prepared.
  • the DNA concentration was quantified by a Qubit fluorometer (Q33226, Thermo Fisher Scientific), Qubit dsDNA HS Assay Kit (Q32854, Thermo Fisher Scientific) using 1 ⁇ L of the diluent.
  • PCR targeting the V3V4 region of the 16S rRNA gene was performed using 1 ⁇ L of the diluted solution as a template (6.25 ⁇ L PrimeSTAR Max DNA Polymerase (R045B, Takara Bio), 0.5 ⁇ L 10 ⁇ M Primer Forward (5'-TCGTCGGCAGCGTCAGGTGTATAAGGCAGCGCAGCGTACAGGTGTATAAGGCAGGCAGGCAGCGAGTGAGCAGCGAGCAGCGAGCGCAGGCAGCGATGTGTATAAGCAGGCAGGCAGCGAGCAGGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGCGAGCAGGC '(SEQ ID NO: 1)), 0.5 ⁇ L 10 ⁇ M Primer Reverse (5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3' (SEQ ID NO
  • PCR reaction conditions are 95 ° C, 5 minutes for initial thermal degeneration, 9 8 ° C, 10 seconds for thermal degeneration, 51 ° C, 15 seconds for annealing, and 72 for elongation reaction. Performed 27 cycles at °C for 5 seconds, reacted at 72 °C for 5 minutes, and then stored at 4 °C.
  • Agalose gel electrophoresis (translocation tank: Mupid-exU, EXU-1, Mupid, marker: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder, # After confirming the presence or absence of PCR products by SM0318, Primeras, staining: Midori Green Direct, NE-MG06, Nippon Genetics, loading buffer: 6 ⁇ Loading Buffer, 9157, Takara Bio) (migration conditions: 100V, 15 min), amplification is performed. Sequence analysis was performed on the found samples using the Sanger method (DNA sequence outsourced service of Fasmac Co., Ltd.).
  • the evolutionary phylogenetic classification analysis of bacteria was performed from the genomic data of each sample. As a result, it was shown that many data are derived from the phylum Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes, and Proteob acteria, which are the preferred species of gut flora. Bacterial species can be identified and counted, and the composition ratio can be calculated by referring to the index related to such phylogenetic classification and the identity of the 16S rRNA gene.
  • analyzing the digital sequence information of the bacterium it is possible to analyze the metabolic function of the bacterium, possess a drug resistance gene, analyze a gene mutation, compare with a known bacterium, and compare with another sample.
  • This process includes, for example, search engines such as blast, analysis websites such as Ensembl, assembly evaluation tools such as QUAST and CheckM, annotation tools such as Prokka, InterProScan, and DFAST, and metabolism / physiology such as MetaCyc and MAPLE. It can be carried out using a functional potential evaluation system.
  • search engines such as blast
  • analysis websites such as Ensembl
  • assembly evaluation tools such as QUAST and CheckM
  • annotation tools such as Prokka, InterProScan, and DFAST
  • metabolism / physiology such as MetaCyc and MAPLE.
  • the genes in the genome are identified, and the conservativeness as a metabolic pathway is evaluated by MAPLE.
  • the conservativeness and identity of each gene will be evaluated, and comparative genome analysis with related species will be performed.
  • genomes derived from allogeneic microorganisms based on the single copy marker gene sequences detected by Average Nucleotide Identity, CheckM, and GTDB-tk. Create a genome set containing genetic information derived from a single organism that is presumed to be and genetic information of known microorganisms. Subsequently, differences between genomes such as the presence or absence of a specific gene, a locus, and a mutation in a common gene sequence are identified and extracted by a homology search tool such as BLAST or hmmer. By performing clustering based on characteristic intergenomic differences, classification of allogeneic microorganisms at the strain level or substrain level of homologous microorganisms is performed.
  • the disclosure is a device for sorting genetic information or other biomolecular information by cell or cell-like structure, A) derived from two or more cells or cell-like structures.
  • a provider that provides information on genetic information or other biomolecules to be used as a set of genetic information or other biomolecule information for each cell or cell-like structure, and B) the genetic information or other biomolecules.
  • a sorting unit that sorts the genetic information or other biomolecule information for each cell or cell-like structure based on all or part of the information, and C) the sorted genetic information or, if necessary.
  • an apparatus including an analysis unit for analyzing information on other biomolecules.
  • genetic information or other biomolecule information is selected from the group consisting of nucleic acid information, protein information, lipid information and sugar chain information. In certain embodiments, the genetic information or other biomolecule information is nucleic acid information. In some embodiments, the donor sequences nucleic acids from cells or cell-like structures to obtain nucleic acid information. In some embodiments, the sorter assesses the presence or absence of a particular gene sequence and / or identity with a particular gene sequence.
  • the present disclosure is a program that implements on a computer a method of sorting genetic information or other biomolecular information for each cell or cell-like structure, the method of which is A) two or more cell or cell-like structures.
  • a program including a step of analyzing information on other biomolecules is provided.
  • genetic information or other biomolecule information is selected from the group consisting of nucleic acid information, protein information, lipid information and sugar chain information. In certain embodiments, the genetic information or other biomolecule information is nucleic acid information. In some embodiments, A) comprises sequencing nucleic acid from a cell or cell-like structure to obtain nucleic acid information. In some embodiments, B) comprises assessing the presence or absence of a particular gene sequence and / or identity with a particular gene sequence.
  • the present disclosure is a recording medium containing a program that implements a method for sorting genetic information or other biomolecular information for each cell or cell-like structure on a computer, and the method is A) two or more.
  • a recording medium including a step of analyzing selected genetic information or information of other biomolecules.
  • genetic information or other biomolecule information is selected from the group consisting of nucleic acid information, protein information, lipid information and sugar chain information.
  • the genetic information or other biomolecule information is nucleic acid information.
  • A) comprises sequencing nucleic acid from a cell or cell-like structure to obtain nucleic acid information.
  • B) comprises assessing the presence or absence of a particular gene sequence and / or identity with a particular gene sequence.
  • the disclosure makes use of methods for amplifying polynucleotides in cells.
  • This amplification method uses a sample containing two or more single biomolecules (eg, including cells or cell-like structures (including viruses, organs (Mt, Nuc), etc.)) and said the single biounit (eg, including Mt, Nuc).
  • Cells or cell-like structures are encapsulated in droplets one by one (eg, cells or cell-like structures), and the droplets are gelled to form gel capsules.
  • the polynucleotide or other biomolecule of interest in the structure) is eluted into the gel capsule and retained in the gel capsule with the polynucleotide or other biomolecule of interest removed.
  • the step of contacting the polynucleotide with an amplification reagent to amplify the polynucleotide in a gel capsule can also amplify the polynucleotide while maintaining a gel state in the gel capsule.
  • the amplification method used in the present disclosure is capable of individually amplifying a genome at the so-called single biological unit (eg, single cell) level or a similar gene assembly or other biomolecular assembly.
  • these nucleic acids or other biomolecules can be individually amplified or analyzed, and the amplification or analysis can be achieved in a very simple manner. Therefore, genomic information or other biomolecular information can be obtained at one time for cells in units of 100, 1000, 10,000, 100,000 or more, and therefore, it is used as a library. It can also be done.
  • any embodiment detailed in the following (droplet generation) section or other sections can be adopted.
  • the cells or cell-like structures that can be of interest in the amplification methods used in the present disclosure are any number of two or more, eg, 10 or more, 50 or more, 100 or more. It can be 500 or more, 1000 or more, 5000 or more, 10,000 or more, 50,000 or more, 100,000 or more, 500,000 or more, 1 million or more, 5 million or more, 10 million or more.
  • the cell or cell-like structure which is a single biological unit that can be of interest in the amplification methods utilized in the present disclosure, is any of those described in the section (Single Biological Unit, Cell and Cell-like Structure). Can be adopted.
  • cells can be targeted.
  • cell-like structures are targeted, among which viruses or organelles such as mitochondria and nuclei can be targeted.
  • the sample containing the provided cell or single biological unit may be provided in any form.
  • the medium contained in the sample is a suitable medium (buffer, salt) for any single biological unit (eg, cell or cell-like structure) selected from the section (Unit Biological Unit, Cell and Cell-like Structure). , Including nutrients and other ingredients) can be selected.
  • a suitable medium buffer, salt
  • any component may be used as long as it is a component suitable for droplet generation. It is preferable that the component is also suitable for gelation. Examples of such components include, but are not limited to, buffer solutions such as PBS, Tris-HCl, TE, and HEPES, as well as sterilized water, seawater, and artificial seawater.
  • encapsulation of a single biological unit for example, a cell or a cell-like structure
  • a droplet of one single biological unit for example, a cell or a cell-like structure
  • droplet preparation Any embodiment described in the section may be adopted.
  • microchannels are used to flow a suspension of single biological units (eg, cells or cell-like structures) into the microchannel and shear the suspensions one by one. It is possible to prepare droplets encapsulating a single biological unit (for example, a cell or a cell-like structure) of Those skilled in the art can appropriately prepare and carry out the components and parameters.
  • any embodiment described in the following (gelling) section can be adopted as the step of gelling the droplet to form a gel capsule.
  • gelation cools a droplet made so that the material of the droplet or droplet (eg, a sample containing a cell or cell-like structure) contains the material of a gel capsule.
  • the material of the droplet or droplet eg, a sample containing a cell or cell-like structure
  • gelation can be gelled by giving a stimulus such as light.
  • any material described in the following (gelation) section can be used.
  • the step of lysing a single biological unit can be realized by immersing the gel capsule in one or more lysing reagents, and the following (dissolution) items. Any embodiment described in the above can be adopted.
  • the polynucleotide in the cell is eluted into the gel capsule and the substance binding to the polynucleotide is removed. It is important that the treatment is carried out so that it is retained within the gel capsule.
  • the step of contacting the polynucleotide with an amplification reagent to amplify the polynucleotide in a gel capsule can also amplify the polynucleotide while maintaining a gel state in the gel capsule. ..
  • various solubilizers are added stepwise or simultaneously.
  • a protein contained within a single biological unit eg, cell or cell-like structure
  • a single biological unit eg, cell or cell-like structure
  • Lysis is achieved by adding reagents step by step from the destruction of the extracellular layer.
  • the lysate remaining in the gel capsule and the lysis reagent after the dissolution operation are passed through the gel capsule using an appropriate washing solution, and the inhibitor is transferred to the outside of the gel capsule. Need to be released to.
  • the residual reagent can be diluted while retaining the genetic material. This step can be repeated. By diluting the reagent to a level that does not cause inhibition, downstream operations, such as amplification reactions, can be performed smoothly.
  • the step of amplifying a polynucleotide in a gel capsule can be realized by contacting the polynucleotide with an amplification reagent, and any embodiment defined in the following (amplification) can be adopted. it can.
  • the present disclosure uses a sample containing two or more single biological units (eg, cells or cell-like structures) and one single biological unit (eg, cells or cell-like structures). , Cells or cell-like structures) can be included in the droplets.
  • the apparatus is a droplet preparation unit that encapsulates a single biological unit (for example, a cell or a cell-like structure) in a droplet one by one (for example, a cell or a cell-like structure). Can be equipped.
  • Droplet production can be performed using, for example, a microchannel.
  • the droplet making section may include a microchannel.
  • a suspension of a single biological unit eg, a cell or cell-like structure
  • the suspension is sheared so that each single biological unit (eg, a cell or cell).
  • a droplet containing a similar structure) can be produced.
  • Shearing can be done at regular intervals.
  • Shearing of the suspension can be done with oil.
  • oil for example, mineral oil (for example, light mineral oil), vegetable oil, silicone oil, and fluorinated oil can be used.
  • the diameter of the droplet may be about 1 to 250 ⁇ m.
  • the diameter of the droplet may be about 20 ⁇ m, about 50 ⁇ m, about 80 ⁇ m, about 100 ⁇ m, about 150 ⁇ m, or about 200 ⁇ m.
  • the present disclosure may include the step of gelling a droplet to form a gel capsule.
  • the device may include a gel capsule generating unit that gels droplets to form gel capsules.
  • Gelation of the droplets can be performed by configuring the droplets to contain the material of the gel capsule and cooling the prepared droplets. Alternatively, gelation can be performed by giving a stimulus such as light to the droplet.
  • gelation can be performed by giving a stimulus such as light to the droplet.
  • a single biological unit eg, a cell or cell-like structure. it can.
  • the diameter of the gel capsule may be about 1 to 250 ⁇ m.
  • the diameter of the gel capsule may be about 1 ⁇ m, about 10 ⁇ m, about 20 ⁇ m, about 50 ⁇ m, about 80 ⁇ m, about 100 ⁇ m, about 150 ⁇ m, about 200 ⁇ m or about 250 ⁇ m.
  • the diameter of the gel capsule may be the same as that of the droplet to be produced, but the diameter may change during gelation.
  • the gel capsule may be a hydrogel capsule.
  • the material of the gel capsule may include agarose, acrylamide, a photocurable resin (for example, PEG-DA), PEG, gelatin, sodium alginate, matrigel, collagen and the like.
  • a photocurable resin for example, PEG-DA
  • the gel capsule may be a hydrogel capsule.
  • hydrogel refers to one in which the solvent or dispersion medium held by the network structure of the polymer substance or colloidal particles is water.
  • DNA can be purified by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • the amount of the genetic substance per cell is very small, and it is necessary to individually convert the genetic substance into a nucleic acid-only state without loss.
  • nucleic acid purification is attempted by a general bulk scale procedure, the result is that no nucleic acid can be extracted or only nucleic acid derived from impurities can be extracted.
  • Contamination is a major problem in single-cell experiments, but by using gel capsules containing a single cell or cell-like structure, purified genetic material (eg, DNA) can be retained in the gel capsule.
  • the possibility of contamination of molecules from the outside can be eliminated.
  • a large amount of one cell can be processed in parallel with a very simple operation.
  • the steps of centrifuging the test tube containing the gelled droplets, removing the supernatant and replacing it with a cleaning solution can be performed.
  • the residual reagent can be diluted while retaining the genetic material. This step can be repeated.
  • downstream operations, such as amplification reactions can be performed smoothly.
  • a composition comprising a gel capsule or a material thereof may be provided. From the points described above or below, such compositions amplify or analyze nucleic acids or other biomolecules in a single biological unit (eg, cell or cell-like structure) at the single biological unit (eg, single cell) level. Can be useful for Also, such compositions can be useful for making genomic libraries.
  • a composition comprising a gel capsule or a material thereof and a single biological unit in a single cell state (eg, a cell or cell-like structure) may be provided.
  • compositions may be useful for amplifying nucleic acids in a single biological unit (eg, a cell or cell-like structure) at the single cell level.
  • compositions can be useful for making genomic libraries.
  • compositions can be useful for sequencing nucleic acids in a single biological unit (eg, a cell or cell-like structure) at the single biological unit (eg, single cell) level.
  • the present disclosure may include immersing a gel capsule in one or more lysis reagents to lyse the single biological unit (eg, a cell or cell-like structure). Further, in the present disclosure, the device may include a dissolution reagent immersion portion for immersing the gel capsule in the dissolution reagent.
  • a polynucleotide or other biomolecule in a single biological unit eg, cell or cell-like structure
  • Dissolving reagents include, for example, enzymes, surfactants and pH regulators, and combinations thereof can also be used.
  • a composition comprising a lysis reagent for amplifying nucleic acids in a single biological unit (eg, a cell or cell-like structure) at the single biological unit (single cell) level.
  • a single biological unit eg, a cell or cell-like structure
  • the step of contacting the polynucleotide with an amplification reagent to amplify the polynucleotide in a gel capsule can also amplify the polynucleotide while maintaining a gel state in the gel capsule. ..
  • Reagents for lysis include lysoteam, labiase, yatarase, achromopeptidase, protease, nuclease, zymolyase, chitinase, lysostaphin, mutanolaicin, sodium dodecyl sulfate, sodium lauryl sulfate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, phenol, chloroform, guanidine hydrochloride.
  • the lysis reagent may be selected from at least one group consisting of lysozyme, achromopeptidase, protease, sodium dodecyl sulfate and potassium hydroxide.
  • an aggressive single biological unit eg, a cell or cell-like structure
  • detection can be based on leakage of nucleic acid from a single biological unit (eg, cell or cell-like structure) by physical or thermal stimulation. is there.
  • a single biological unit for example, a cell or a cell-like structure
  • the genetic material in the single cell is completely destroyed. It is preferably isolated from cells.
  • thermal / mechanical irritation may lead to disintegration of the gel capsule, and it may be preferable to use a dissolving reagent.
  • screening can be performed by a technique such as FISH in which a nucleic acid probe for detection is reacted.
  • a lytic reagent or a combination of lytic reagents that is strong to some extent.
  • Gram-positive bacteria have a cell wall with a thick peptidoglycan layer, so mild ones alone may not be sufficient to lyse cells.
  • screening can be performed by a method such as FISH in which a nucleic acid probe for detection is reacted.
  • a strong lysing reagent may inhibit a reaction such as DNA amplification, and is preferably sufficiently removed before the downstream reaction.
  • the gel capsules hold the genetic material to be analyzed or amplified, so that in a single biological unit (eg, a cell or cell-like structure) with a small amount of genetic material.
  • the lysis reagent can also be removed in the analysis, so that a strong solubilizer or combination of solubilizers can be used.
  • potent lysing reagents or combinations of lysing reagents allows for comprehensive nucleic acid amplification or genome analysis, regardless of the type of cell (including those with cell walls and other types of microorganisms). Can be.
  • the method may include removing the lysing reagent and / or contaminants from the gel capsule.
  • the dissolution reagent immersion portion includes means for removing the dissolution reagent and / or contaminants from the gel capsule.
  • screening can be performed by a method such as FISH in which a nucleic acid probe for detection is reacted after lysis.
  • the target molecule is part of a cell surface marker or nucleic acid and the goal is to detect its presence itself, the goal may be achieved even if the lysis operation is partial or undissolved. There is.
  • the genomic DNA when attempting to amplify the full length of genomic DNA, the genomic DNA usually has only one molecule in the cell, so that the cell or cell-like structure is completely dissolved and bound from the DNA. It is necessary to sufficiently remove proteins. As a result, even when a sample consisting of hundreds or more kinds of microorganisms such as intestinal microorganisms is targeted, all of them can be uniformly dissolved and whole genome amplification can be performed from all of them. It also makes it possible to prepare the library and finally obtain whole genome sequence information.
  • the present disclosure may include contacting the polynucleotide with an amplification reagent to amplify the polynucleotide within a gel capsule.
  • the device may include an amplification reagent immersion portion for immersing the gel capsule in the amplification reagent.
  • the amplification reagent immersion portion may be provided with means for adjusting the temperature of the gel capsule, if necessary, after immersion in the amplification reagent.
  • screening can be performed by a method such as FISH that reacts a nucleic acid probe for detection, a DNA-binding fluorescent dye for detecting an amplified polynucleotide, or a Taqman probe.
  • Reactions involving heat treatment can lead to redissolve of gels (eg, agarose gels), thus disrupting the individualized forms and single biological units (eg, cells or cell-like). It may invalidate the isolation in the structure).
  • gels eg, agarose gels
  • single biological units eg, cells or cell-like
  • an enzymatic reaction of about 60 degrees or less is desirable to maintain the gel droplet shape.
  • Homeothermic chain substitution amplification reaction (multiple) Displacement amplification) is preferable in that it can be performed within this temperature range and amplification of the entire genomic DNA is possible.
  • the enzyme used include phi29 polymerase, Bst polymerase, Aac polymerase, and recombinase polymerase.
  • RNA Ribonucleic acid
  • the purpose is to determine the type and expression level of a gene in an absolute (relative) manner. It is possible to quantify whether it is expressed only.
  • Treatment in gel capsules is advantageous for such amplification.
  • the single biological unit (eg, cell or cell-like structure) of interest in the present disclosure is not particularly limited, but is, for example, a cell of a microorganism (eg, a bacterium, a fungus, a single cell animal), or a cell of a multicellular organism.
  • a microorganism eg, a bacterium, a fungus, a single cell animal
  • a cell of a multicellular organism e.g, somatic cells, germ cells, cultured cells, tumor cells), intracellular organs (mitochonium, nucleus, chloroplast), viruses.
  • a single biological unit also includes artificial objects such as artificial cells.
  • RNA For cells of organisms with known genome sequences, which genes are expressed in them RNA In the case of analysis of an organism whose genome sequence and / or gene information is unknown, it is necessary to obtain information on the genome itself before RNA analysis. In that case, amplification or analysis of genomic sequences or other biomolecules at the single biological unit (eg, single cell) level by the methods of the present disclosure using gel capsules is advantageous.
  • samples containing two or more single biological units can be used.
  • the two or more cells may be derived from a plurality of organisms.
  • examples of the sample include a microbial sample, a tissue sample, a mixed sample of a symbiotic microorganism and a host organism, and a sample containing microorganisms and cells taken from an animal / human sample.
  • the microorganisms that can be targeted are not limited, but are eubacteria, Escherichia coli, bacilli, indigo bacteria, cocci, bacilli, spiral bacteria, gram-negative bacteria, gram-positive bacteria, archaea, fungi, etc. Can be mentioned.
  • Bacteria that can be targeted by the present disclosure for example, Negibacteria, Eobacteria, Deinococci, Deinococci, Deinococcales, Thermales, Chloroflexi, Anaerolineae, Anaerolineales, Caldilineae, Chloroflexales, Herpetosiphonales, Thermomicrobia, Thermomicrobiales, Sphaerobacterales, Ktedonobacteria, Ktedonobacterales, Thermogemmatisporales, Glycobacteria, Cyanobacteria , Gloeobacterophyceae, Gloeobacterales, Nostocophyceae, Synechococcophycidae, Synechococcales, Nostocophycidae, Chroococcales, Oscillatoriales, Nostocales, Pseudanabaenales, Spirochaetes, Spirochaetes, Spirochaetales, Fibrobacteres
  • gel capsules are sorted and collected in a microplate or the like for each single biological unit (for example, cell or cell-like structure). Further, the polynucleotide in each gel capsule is re-amplified in the plate as a template, and this is used as a library master plate. Then, a part of the reaction solution in the library master plate is separated to prepare a replica plate. Amplification is performed with a primer set specific to the target gene using this replica as a template. Method (1) The sequence of the amplified product is specified by a Sanger sequence or the like, and the well containing the target cell or gene is specified from the replica plate. A sample corresponding to the identified well is selected from the master plate and used for whole genome sequencing.
  • the above primer set contains a barcode sequence
  • each sample is subjected to an amplification reaction in which a different barcode is added, and PCR products derived from multiple replica plates are pooled to perform a next-generation sequence. Then, by specifying the plate well number by the barcode sequence and specifying the sequence of the PCR product, it is possible to screen hundreds to thousands of samples at once.
  • the primer set may be a mixture of primer sets targeting a plurality of gene regions. More specifically, from a primer set that targets the v3-v4, v1-v2 regions of the 16S rRNA gene, and a primer set that distinguishes bacteria, archaea, fungi, etc.
  • 18S rRNA, ITS, etc. specific enzymes and two It may be a gene group involved in the production of next metabolites, or a primer set for detecting these in order to remove host-derived DNA, mitochondria, etc. in non-microbial organisms.
  • Example 1 Examination of microbial flora in mouse feces
  • DPBS buffered saline
  • microdroplets 3 were prepared and mouse intestinal microorganisms 1 cell 4 were encapsulated in the microdroplets 3. ..
  • the micro flow path is composed of a first flow path 5, a second flow path 6, a third flow path 7, and a fourth flow path 8, and adjacent flow paths are arranged at right angles.
  • 2 is used, it is also possible to use a microchannel 2 connected in a substantially T shape.
  • the microchannel 2 of this example used had a width of 34 ⁇ m and a height of 50 ⁇ m, but the size of the microchannel 2 was appropriately changed depending on the size of the microdroplets 3 to be produced and the size of 1 cell 4 to be encapsulated. It is possible.
  • the intestinal microbial suspension 1 was introduced from the first flow path 5 (aqueous phase inlet), and Pico-Surf1 (2% in Novec7500) was introduced from the second flow path 6 and the fourth flow path 8 (oil phase inlet).
  • Sphere Fluids (hereinafter referred to as "oil 10") is introduced and the intestinal microbial suspension 1 is sheared to prepare fine droplets 3 having a diameter of 50 ⁇ m, and the third flow path 7 is allowed to flow.
  • the mixture was collected in a tube 9 having a capacity of 0.2 mL.
  • Approximately 450,000 microdroplets 3 were prepared at a rate of 500 droplets / second.
  • the cell concentration in the microdroplets 3 is 0.1 cells / droplet.
  • the diameter of the microdroplet 3 may be, for example, about 1 to 250 ⁇ m, more preferably about 10 to 200 ⁇ m, for example, about 1 ⁇ m, about 5 ⁇ m, about 10 ⁇ m, about 15 ⁇ m, It may be about 20 ⁇ m, about 25 ⁇ m, about 30 ⁇ m, about 40 ⁇ m, about 50 ⁇ m, about 80 ⁇ m, about 100 ⁇ m, about 150 ⁇ m, about 200 ⁇ m, or about 250 ⁇ m.
  • a plurality of microdroplets 3 and oil 10 are housed in the tube 9, but the microdroplets 3 have a lighter specific gravity than the oil 10 and therefore accumulate in the upper layer.
  • the tube 9 was cooled on ice for 15 minutes, and the fine droplet 3 was gelled with an ultra-low melting point agarose.
  • the gelled microdroplets 3 are gel capsules 11. Since the diameter of the microdroplet 3 is 50 ⁇ m, the diameter of the gel capsule 11 is also 50 ⁇ m.
  • the diameter of the gel capsule 11 may be, for example, about 1 to 250 ⁇ m, more preferably about 10 to 200 ⁇ m, for example, about 1 ⁇ m, about 5 ⁇ m, about 10 ⁇ m, about 15 ⁇ m, about 20 ⁇ m, about 25 ⁇ m, about 30 ⁇ m, about.
  • the gel capsule 11 is sequentially immersed in the lytic reagent 13 as a lysis reagent, a portion other than the collection target such as the cell wall of the cell 4 is dissolved inside the gel capsule 11, and the genomic DNA 14 is eluted in the gel capsule 11. I let you.
  • lysozyme (10 U / ⁇ L) (R1804M, Epicenter), which is one of the lytic reagents 13, was added to the tube 9 to lyse the cells 4.
  • achromopeptidase (850 U / mL) (015-09951, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is one of the lytic reagents 13, was added to the tube 9.
  • protease K (1 mg / mL) (MC5005, Promega) and sodium dodecyl sulfate (SDS) 0.5% (71736-100ML, SIGMA-ALDRICH), which is one of the lytic reagents 13, were added to the tube 9.
  • the gel capsule 11 was immersed in Buffer D2 (QIAGEN), which is an aqueous solution containing potassium hydroxide, which is one of the lytic reagents 13, to dissolve the residual components and denature the genomic DNA 14.
  • Buffer D2 QIAGEN
  • the lytic test solution 13 used in this example is lysozyme, achromopeptidase, proteinase K, sodium dodecyl sulfate, and Buffer D2.
  • potassium hydroxide is also used in a normal DNA amplification reaction step, it is used as one of the lytic reagents 13 in this example because it also has a lytic effect. Since the gel capsule 11 is immersed in the lytic reagent 13 for a short time, the eluted genomic DNA 14 is not discharged to the outside of the gel capsule 11 by the lytic reagent 13 and is retained in the gel capsule 11. In this example, the lytic reagent 13 that has permeated the gel capsule 11 is also included in the contaminants.
  • lysozyme, achromopeptidase, and protease K are added in sequence, sodium dodecyl sulfate is added to dissolve cells 4, and then centrifugation is performed only before adding Buffer D2 to obtain a sufficient cleaning effect. Can be done.
  • the cells 4 may be lysed with each lytic reagent 13 and then centrifuged.
  • the target genomic DNA 14 can be collected by lysing the cells 4 with a plurality of types of lytic reagents 13, and the lytic reagent 13 and lysis can be obtained by performing centrifugal washing after immersion in the lytic reagent 13. Contaminants such as components other than the polynucleotide of the cell 4 can be removed, and the genomic DNA 14 can be purified without inhibiting the subsequent genomic DNA amplification reaction.
  • the amplification reagent 15 was added to the tube 9 containing the gel capsule 11 holding the denatured genomic DNA 14 in the potassium hydroxide solution (Buffer D2), and the gel capsule 11 was immersed in the amplification reagent 15.
  • the MDA (Multiple Replication Replication) method using phi29 DNA polymerase which is a strand-substitution type DNA synthase, was used.
  • the whole genome amplification reaction reagent was immersed in REPLI-g Single Cell Kit (QIAGEN), and the whole genome amplification reaction was carried out for 3 hours (S1000 thermal cycler, Bio-Rad).
  • the MDA method (REPLI-g Single Cell Kit, 150345) is used in the wells of each plate. , QIAGEN) was performed to prepare a library master plate containing 10 ⁇ L of DNA amplification product for each well.
  • the production device 18 includes a droplet production unit 19 that encloses 1 cell 4 in the microdroplet 3 by the microchannel 2.
  • the generated microdroplets 3 are housed in the tube 9.
  • the manufacturing apparatus 18 includes a gel capsule generation unit 20 that gels the fine droplets 3 to generate the gel capsule 11.
  • the gel capsule generation unit 20 has a cooling unit 21 and can cool the fine droplets 3 in a state of being housed in the tube 9.
  • the gel capsule generation unit 20 has an ultraviolet irradiation unit 22 that irradiates ultraviolet rays while the fine droplets 3 are contained in the tube 9, and the gel capsule 11 can be generated using a photocurable resin. it can. It should be noted that only one of the cooling unit 21 and the ultraviolet irradiation unit 22 may be provided.
  • the manufacturing apparatus 18 includes a dissolving reagent immersion unit 23 in which the lytic reagent 13 is injected into the tube 9 containing the gel capsule 11 and the gel capsule 11 is immersed in the lytic reagent 13.
  • the lytic reagent 13 is injected into the tube 9 from the lysis reagent injection unit 24.
  • the manufacturing apparatus 18 includes a removing unit 25 for removing contaminants including oil 10 and lytic reagent 13 from the gel capsule 11.
  • the removing unit 25 has a centrifugal cleaning unit 26, and after immersing the gel capsule 11 in the lytic reagent 13 for a predetermined time, the lytic reagent 13 and contaminants are removed from the gel capsule 11 and the tube 9 by the centrifugal cleaning unit 26. ..
  • the production device 18 includes an amplification reagent immersion unit 27 for immersing the amplification reagent 15 for amplifying the genomic DNA 14 held in the gel capsule 11.
  • the amplification reagent 15 is injected into the tube 9 from the amplification reagent injection unit 28.
  • the production apparatus 18 includes a sorting unit 29 that sorts gel capsules 11 that retain the genomic DNA 14 amplified more than a predetermined value.
  • the sorting unit 29 sorts the gel capsule 11 having the flow cytometer 30 and holding the genomic DNA 14 amplified more than a predetermined value, and collects it on the plate 16.
  • the gel capsule 11 that does not retain the genomic DNA 14 amplified above a predetermined level is collected in another container 31.
  • Dispense 39 ⁇ L of nuclease-free water (UltraPure DNase / RNase-Free Distilled Water, 10977-015, Thermo Fisher Scientific) into each well of a new plate, add 1 ⁇ L of DNA amplification product in the library master plate, and add 1 ⁇ L of DNA amplification product to the library master.
  • a 40-fold diluted solution of the plate was prepared.
  • the DNA concentration was quantified by a Qubit fluorometer (Q33226, Thermo Fisher Scientific) and a Qubit dsDNA HS Assay Kit (Q32854, Thermo Fisher Scientific) using 1 ⁇ L of the diluted solution.
  • PCR was performed on the V3V4 region of the 16S rRNA gene using 1 ⁇ L of the diluted solution as a template (6.25 ⁇ L PrimeSTAR Max DNA Polymerase (R045B, Takara Bio), 0.5 ⁇ L 10 ⁇ M Primer Forward (5).
  • PCR reaction conditions are initial heat denaturation at 95 ° C., 5 minutes, heat denaturation at 98 ° C., 10 seconds, annealing at 51 ° C.
  • extension reaction was carried out at 72 ° C. for 5 seconds for 27 cycles, and after reaction at 72 ° C. for 5 minutes, storage was performed at 4 ° C.
  • Markers GeneRuler TM 1 kb DNA Ladyr, # SM0318, Primers, Staining: Midori Green Direct, NE-MG06, Nippon Genetics, Loading buffer: 6 x Loading Buffer, 9157, Takara Bio) (Migration conditions: 100V, min After confirming the presence or absence of the PCR product, the sample in which amplification was observed was subjected to sequence analysis using the Sanger method (DNA sequence outsourced service of Fasmac Co., Ltd.).
  • the homology of the base sequence between each sample is 99% or more for the marker gene group detected using CheckM, and (2) between each sample for the sequence of all Contigs. Samples satisfying the two conditions that the homology in the above was 95% or more were collectively analyzed as genomic information derived from the same species. However, for the integration of genomic information, ccSAG (Kogawa et al., Sci Rep. 2018 Feb 1; 8 (1): 2059. https: // doi.org / 10.1038 / s41598-018-20384-3) It was used.
  • genomic information derived from 44 types of intestinal bacteria with a completion rate of more than> 50% was obtained from 347 genomic information (Fig. 12).
  • Completion rate (90% or more), contamination rate (5% or more) according to the international standard Minimum information about a single amplified genome (MISAG) (https://doi.org/10.1038/nbt.3893).
  • MISAG single amplified genome
  • CheckM it was clarified that 15 kinds of samples were classified into High-quality single. Of these, 7 were Lachnospiraceae bacteria and 4 were Bacteroidaceae bacteria (Table 2).
  • Example 4 When it is desired to selectively acquire data of cells having specific characteristics from various cells) A gel containing a polynucleotide when the purpose is to obtain genomic data of one or more specific microorganisms of interest to those skilled in the art among animal symbiotic microorganisms such as gut flora and marine / soil microorganisms. By confirming the presence or absence of the gene fragment of the target microorganism in advance for the capsule, it is possible to reduce unnecessary gene sequence data acquisition and the cost involved.
  • measurement targets include comparative analysis of microorganisms of the same strain (for example, analysis of subspecies in a group of microorganisms related to diseases, etc.) and microorganisms having a specific gene (for example, secondary metabolites and enzymes produced by microorganisms). It is assumed that the purpose is to search for or analyze bacteria, archaea, fungi, and other eukaryotic cells individually from among various species.
  • Example 5 When a large amount of DNA derived from a host animal or the like is mixed, the analysis sample is feces, saliva, sputum or skin, oral cavity, nasal cavity, ears, genital lavage fluid, surgical cleaning solution, tissue extract or blood, and the microorganisms contained in the sample are analyzed. Contains cells, intracellular small organs, and nucleic acids from many host animals in the sample. Some of these can also be encapsulated inside the gel capsule to perform polynucleotide amplification.
  • the polynucleotide derived from the host can be applied to the analysis combined with the analysis of the target microorganism or other cells.
  • the intestinal flora and host animals present in the gastrointestinal tract have a symbiotic relationship in which the host provides an anaerobic environment for colonization of the gastrointestinal tract, while the intestinal flora affects the health of the host. It is known to have.
  • the major effects on the health status of the host include the production of nutrients, the defense against infectious diseases, and the development of the immune system.
  • inflammatory bowel disease is a disease caused by an abnormality of intestinal environmental factors such as intestinal bacteria in addition to a genetic predisposition.
  • the function of biotransformers derived from gut flora is analyzed in a complex manner, including genetic analysis, metabolome analysis, biochemical analysis, etc. on the host side, and the gut flora
  • the function can be inferred from the genome sequence information of the bacterium, and the correlation with various data such as the biotransformate and metabolome produced can be seen.
  • This disclosure is useful in industries that use single cell analysis.
  • SEQ ID NO: 1 16S rRNA gene V3V4 region Forward Primer
  • SEQ ID NO: 2 16S RRNA gene V3V4 region Revere Primer

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Abstract

本開示はシングルセルの目的に合ったターゲット解析を提供する。詳細には本開示は、単一生物単位を２つ以上含む集合から、該単一生物単位の遺伝情報またはその他の生体分子の情報に基づいて、単一生物単位を少なくとも１つを含むサブ集合を生成する工程を包含する、単一生物単位を含むサブ集合を生成する方法を提供する。本開示はまた、遺伝情報またはその他の生体分子の情報の解析前に、無数のサンプルから、遺伝情報またはその他の生体分子の情報の解析に供するものを絞り込むことができ、本開示は、遺伝情報またはその他の生体分子の情報の解析後に、生体分子のデジタル情報から、解析対象の情報を絞り込むことができる。

Description

単一生物単位の遺伝情報またはその他の生体分子の情報を使用した、サンプルのスクリーニング法
　本開示は、多様な生物や生物同等物（例えば、微生物、細胞構造物、人工細胞など）から並列調製された核酸またはその他の生体分子の構造や配列から、その構造や配列を参照して個別の個体特異的に検出し、選抜する方法に関するものである。
　単一生物単位の遺伝情報またはその他の生体分子の情報のライブラリーの作製技術では、簡易な操作でゲル中に捕捉した単一生物単位の解析行い、単一生物単位の遺伝情報またはその他の生体分子の情報のライブラリーを調製することができる。一方で、本ライブラリーのサンプル１つずつから解析を行う場合、サンプル非選別に解析を行うと、元サンプル中に含まれる単一生物単位の組成比に応じてデータが蓄積されることとなる。すなわち、サンプル中に優先種として存在する単一生物単位が含まれた場合、多くの単一生物単位の遺伝情報またはその他の生体分子の情報（例えば、シーケンスデータ）が当該単一生物単位由来となり、多数の重複単一生物単位由来データが蓄積される。重複データを統合することでデータの確度が向上する一方で、希少な単一生物単位をもれなく捉え、多様な単一生物単位の遺伝情報またはその他の生体分子の情報を取得するためには、大量の解析を行わなければならない。過度な重複データの取得は不要であるため、事前に単一生物単位を特定し、解析に移行するサンプルを選抜することが有効である。また、単一生物単位の遺伝情報またはその他の生体分子の情報（例えば、特異的な特定遺伝子の有無）を事前に調べることで、ある種の単一生物単位を選択的に選抜あるいは排除して、効果的な解析を実施することが必要である。
　総じて、本開示は、単一生物単位を２つ以上含む集合から、該単一生物単位の遺伝情報またはその他の生体分子の情報（例えば、核酸配列、や特定の部分配列）に基づいて、単一生物単位を少なくとも１つを含むサブ集合を生成する工程を包含する、単一生物単位を含むサブ集合を生成する方法を提供する。
　一つの局面では、液滴に１細胞ずつ細胞を封入し、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成し、ゲルカプセルを溶解用試薬に浸漬してゲルカプセル内の細胞を溶解し、ゲルカプセル内のポリヌクレオチドを増幅する方法により、増幅保持された１細胞ゲノム由来ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルを調製する。
　本明細書において説明される何れかの方法で核酸増幅物から、詳細分析すべきサンプルを検出・選抜することで、本開示を完成するに至った。
　本開示はまた、別の局面において、２つ以上の単一生物単位（細胞または細胞様構造物）に由来する核酸情報またはその他の生体分子の情報（例えば、核酸配列や特定の部分配列）を、該単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ごとの核酸情報またはその他の生体分子の情報（例えば、核酸配列や特定の部分配列）の集合として提供する工程と、該核酸情報またはその他の生体分子の情報（例えば、核酸配列や特定の部分配列）の全部または一部に基づいて、該核酸情報またはその他の生体分子の情報（例えば、核酸配列や特定の部分配列）を該単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ごとに選別する工程と、必要に応じて、該選別された核酸情報またはその他の生体分子の情報（例えば、核酸配列や特定の部分配列）について分析する工程とを包含する方法を提供することで、効率よい分析が可能となることを見出し、本開示を完成させた。
　本開示の実施形態として、以下のものが挙げられる。
（項目１）
　単一生物単位を２つ以上含む集合から、該単一生物単位の遺伝情報またはその他の生体分子の情報に基づいて、単一生物単位を少なくとも１つを含むサブ集合を生成する工程を包含する、単一生物単位を含むサブ集合を生成する方法。
（項目２）
　Ａ）２つ以上の単一生物単位の各々を別々に提供する工程と、
　Ｂ）該別々に提供された２つ以上の単一生物単位を、該単一生物単位に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報に基づいて選別する工程と、
　Ｃ）必要に応じて、該選別された単一生物単位を、分析する工程と
を包含する方法。
（項目３）
　前記Ａ）が、
　（ａ）２つ以上の細胞または成分を含む試料を用い、液滴中に１つの細胞または細胞様構造物を封入することと、
　（ｂ）該液滴をゲル化してゲルカプセルを生成することと、
　（ｃ）該ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して該細胞または成分を溶解する工程であって、該細胞または成分中のポリヌクレオチドが該ゲルカプセル内に溶出し該ポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態で前記ゲルカプセル内に保持される、ことと、
　（ｄ）該ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させて該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅することと
を包含する、項目２に記載の方法。
（項目４）
　前記１つの細胞または細胞様構造物をマイクロ流路中に流動させ、オイルで前記懸濁液をせん断することにより該１つの細胞または細胞様構造物を封入した前記液滴が作製されることを特徴とする、項目３に記載の方法。
（項目５）
　前記ゲルカプセルがアガロース、アクリルアミド、ＰＥＧ、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、マトリゲル、コラーゲン又は光硬化性樹脂から形成されることを特徴とする、項目３～４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
　前記溶解用試薬がリゾチーム、ラビアーゼ、ヤタラーゼ、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ザイモリアーゼ、キチナーゼ、リソスタフィン、ムタノライシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、フェノール、クロロホルム、グアニジン塩酸塩、尿素、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ＴＣＥＰ－ＨＣｌ、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｂｒｉｊ－３５、Ｂｒｉｊ－５８、Ｔｗｅｅｎ　２０、Ｔｗｅｅｎ　８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ドデシル－β－Ｄ－マルトシド、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０、およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　３－１２からなる群から少なくとも１種選択されることを特徴とする、項目３～５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
　前記ゲルカプセルがヒドロゲルカプセルであることを特徴とする、項目３～６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
　前記遺伝情報またはその他の生体分子の情報が、核酸情報、タンパク質情報、脂質情報および糖鎖情報からなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目９）
　前記遺伝情報またはその他の生体分子の情報が、核酸情報である、項目２に記載の方法。
（項目１０）
　前記核酸情報が、特定の遺伝子配列の有無、特定の遺伝子の収量または全核酸収量から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
　前記特定の遺伝子配列の有無を、該特定の遺伝子配列を特異的に検出する試薬（核酸プローブなど）、分子量測定手段（アガロースゲル電気泳動、マイクロチップ電気泳動）、遺伝子増幅法（ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）、遺伝子配列決定（サンガーシーケンシング、ＮＧＳ）からなる群から選択される手段により検出する、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
　前記特定の遺伝子配列を特異的に検出する試薬が、抗体、核酸プローブ、ＤＮＡ結合性蛍光色素、および蛍光色素結合ヌクレオチドからなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
　前記特定の遺伝子の収量または前記全核酸収量を吸光度測定、蛍光光度測定、アガロースゲル電気泳動およびマイクロチップ電気泳動により測定する、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
　Ａ）２つ以上の単一生物単位に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該単一生物単位ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する工程と、
　Ｂ）該遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、該遺伝情報またはその他の生体分子の情報を該単一生物単位ごとに選別する工程と、
　Ｃ）必要に応じて、該選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程と
を包含する方法。
（項目１５）
　前記遺伝情報またはその他の生体分子の情報が核酸情報である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
　前記Ａ）が、細胞または細胞様構造物に由来する核酸をシーケンシングして核酸情報を得ることを含む、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１７）
　前記Ｂ）が、特定の遺伝子配列の有無および／または特定の遺伝子配列との同一性を評価することを含む、項目１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
　前記選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程は、疾患の可能性の分析、健康状態の診断、人物の特定、治療法の選択、微生物叢の分析、遺伝子変異の検出、病原菌の検出、薬剤候補物生産微生物の探索、産業用酵素生産微生物の探索、微生物製品保証および環境衛生評価からなる群から選択される分析を含む、項目１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
　遺伝情報またはその他の生体分子の情報を単一生物単位ごとに選別するための装置であって、
Ａ）２つ以上の単一生物単位に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該単一生物単位ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する提供部と、
Ｂ）該遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、該遺伝情報またはその他の生体分子の情報を該単一生物単位ごとに選別する選別部と、
Ｃ）必要に応じて、該選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する分析部と
を備える、装置。
（項目２０）
　前記遺伝情報またはその他の生体分子の情報が核酸情報である、項目１９に記載の装置。
（項目２１）
　前記提供部が、細胞または細胞様構造物に由来する核酸をシーケンシングして核酸情報を得る、項目１９または２０に記載の装置。
（項目２２）
　前記選別部が、特定の遺伝子配列の有無および／または特定の遺伝子配列との同一性を評価する、項目１９～２１のいずれか一項に記載の装置。
（項目２３）
　前記選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する分析部は、疾患の可能性の分析、健康状態の診断、人物の特定、治療法の選択、微生物叢の分析、遺伝子変異の検出、病原菌の検出、薬剤候補物生産微生物の探索、産業用酵素生産微生物の探索、微生物製品保証および環境衛生評価からなる群から選択される分析を行う、項目１９～２２のいずれか一項に記載の装置。
（項目２４）
遺伝情報またはその他の生体分子の情報を細胞または細胞様構造物ごとに選別する方法をコンピュータに実装するプログラムであって、該方法は、
Ａ）２つ以上の細胞または細胞様構造物に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該細胞または細胞様構造物ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する工程と、
Ｂ）該遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、該遺伝情報またはその他の生体分子の情報を該細胞または細胞様構造物ごとに選別する工程と、
Ｃ）必要に応じて、該選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程とを包含する、プログラム。
（項目２５）
　前記遺伝情報またはその他の生体分子の情報が核酸情報である、項目２４に記載のプログラム。
（項目２６）
　前記Ａ）が、細胞または細胞様構造物に由来する核酸をシーケンシングして核酸情報を得ることを含む、項目２４または２５に記載のプログラム。
（項目２７）
　前記Ｂ）が、特定の遺伝子配列の有無および／または特定の遺伝子配列との同一性を評価することを含む、項目２４～２６のいずれか一項に記載のプログラム。
（項目２８）
　前記選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程は、疾患の可能性の分析、健康状態の診断、人物の特定、治療法の選択、微生物叢の分析、遺伝子変異の検出、病原菌の検出、薬剤候補物生産微生物の探索、産業用酵素生産微生物の探索、微生物製品保証および環境衛生評価からなる群から選択される分析を含む、項目２４～２７のいずれか一項に記載のプログラム。
（項目２９）
遺伝情報またはその他の生体分子の情報を細胞または細胞様構造物ごとに選別する方法をコンピュータに実装するプログラムを格納した記録媒体であって、該方法は、
Ａ）２つ以上の細胞または細胞様構造物に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該細胞または細胞様構造物ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する工程と、
Ｂ）該遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、該遺伝情報またはその他の生体分子の情報を該細胞または細胞様構造物ごとに選別する工程と、
Ｃ）必要に応じて、該選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程とを包含する、記録媒体。
（項目３０）
　前記遺伝情報またはその他の生体分子の情報が核酸情報である、項目２９に記載の記録媒体。
（項目３１）
　前記Ａ）が、細胞または細胞様構造物に由来する核酸をシーケンシングして核酸情報を得ることを含む、項目２９または３０に記載の記録媒体。
（項目３２）
　前記Ｂ）が、特定の遺伝子配列の有無および／または特定の遺伝子配列との同一性を評価することを含む、項目２９～３１のいずれか一項に記載の記録媒体。
（項目３３）
　前記選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程は、疾患の可能性の分析、健康状態の診断、人物の特定、治療法の選択、微生物叢の分析、遺伝子変異の検出、病原菌の検出、薬剤候補物生産微生物の探索、産業用酵素生産微生物の探索、微生物製品保証および環境衛生評価からなる群から選択される分析を含む、項目２９～３２のいずれか一項に記載の記録媒体。
　本開示において、上記１又は複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態及び利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　本開示により、個別の単一生物単位（例えば、「シングルセル」）を集合として保持したままで核酸増幅や検出、選別などを行うことができ、レアな細菌のデータを獲得したい場合、ホストＤＮＡなどが多量に混在する場合、特定の細菌だけのデータが求められ、多様性の評価が不要な場合などに応用可能である。
　本開示はまた、全ゲノム配列解読前に、無数のサンプルから、全ゲノム配列解読に供するものを絞り込むことができる。
　また、本開示は、（ドライの場合）、全ゲノム配列解読後に、デジタル配列情報から、解析対象の情報を絞り込むことができる。
マウス腸内微生物１細胞を封入した液滴を作製するためのマイクロ流路を示す図である。マイクロ流路は、第一流路５、第二流路６、第三流路７及び第四流路８からなり、隣接する流路が直角に配置されたマイクロ流路２を図示されている。第一流路５から腸内微生物懸濁液１を導入し、第二流路６および第四流路８からオイル１０を導入して腸内微生物懸濁液１をせん断することで、微小液滴３を作製する。 チューブ９に収容した微小液滴３を示す図である。チューブ９内には複数の微小液滴３とオイル１０が収容されるが、微小液滴３はオイル１０よりも比重が軽いため上層に集積する。 チューブ９に収容したゲルカプセル１１を示す図である。チューブ９を氷上で冷却することによりゲル化した微小液滴３がゲルカプセル１１である。ゲルカプセル１１を溶菌試薬１３に浸漬することで、溶菌試薬１３を各ゲルカプセル１１内へと浸透させる。 １細胞増幅ゲノムライブラリーの作製工程を示す図である。細胞４を含む微小液滴３は、オイル１０を導入して腸内微生物懸濁液１をせん断すること作製され、チューブ９に収容される。次いで、チューブ９を氷上で冷却することによりゲルカプセル１１を作製する。オイル１０の除去後、ＰＢＳで遠心洗浄を行い、ゲルカプセル１１を水層１２に懸濁した状態とし、ゲルカプセル１１を溶菌試薬１３に浸漬することで、溶菌試薬１３を各ゲルカプセル１１内へと浸透させ、ゲルカプセル１１内部で細胞４の細胞壁等の収集目的物以外の部分を溶解し、ゲルカプセル１１内にゲノムＤＮＡ１４を溶出させる。夾雑物質の除去後、チューブ９に増幅用試薬１５を加え、全ゲノム増幅反応を行う。ゲノムＤＮＡ１４を含むゲルカプセル１１をプレート１６に回収し、各プレート１６のウェル内でＭＤＡ法による二次増幅を行う。このゲルカプセル１１を収容したプレート１６を多数蓄積することでマウス腸内微生物由来の１細胞増幅ゲノムライブラリー１７とすることができる。 ＳＹＢＲグリーンにより染色したゲルカプセル１１内の細胞４を示す図である。 ゲノムライブラリーの作製装置１８を示す略図である。作製装置１８は、マイクロ流路２により１細胞４を微小液滴３中に封入する液滴作製部１９を備えており、生成された微小液滴３はチューブ９に収容される。作製装置１８は、微小液滴３をゲル化してゲルカプセル１１を生成するゲルカプセル生成部２０を備えており、ゲルカプセル生成部２０は、微小液滴３をチューブ９に収容した状態で冷却可能な冷却部２１および／または微小液滴３をチューブ９に収容した状態で紫外線を照射する紫外線照射部２２を有している。また、作製装置１８は、ゲルカプセル１１を収容したチューブ９に溶菌試薬１３を注入し、ゲルカプセル１１を溶菌試薬１３に浸漬させる溶解用試薬浸漬部２３を備えている。また、作製装置１８は、ゲルカプセル１１からオイル１０や溶菌試薬１３を含む夾雑物質を除去する、遠心洗浄部２６を有する除去部２５を備えている。また、作製装置１８は、ゲルカプセル１１内に保持されたゲノムＤＮＡ１４を増幅させる増幅用試薬１５に浸漬する増幅用試薬浸漬部２７を備えており、増幅用試薬１５は、増幅用試薬注入部２８からチューブ９内に注入される。また、作製装置１８は、所定以上に増幅したゲノムＤＮＡ１４を保持するゲルカプセル１１を選別する選別部２９を備える。選別部２９は、フローサイトメーター３０を有し、所定以上に増幅したゲノムＤＮＡ１４を保持するゲルカプセル１１を選別しプレート１６に回収する。なお、所定以上に増幅したゲノムＤＮＡ１４を保持しないゲルカプセル１１は他の容器３１に回収する。 図７は、増幅ＤＮＡを配列に基づきスクリーニングする方法の全体図を示す。増幅ＤＮＡは、全ゲノム配列解読前にスクリーニングに供されるか、および／または全ゲノム配列解読後にスクリーニングに供される。全ゲノム配列解読前のスクリーニング（ウェット）は、増幅ＤＮＡサンプルの一部を使用して実施し、シーケンシングやアガロースゲル電気泳動などの実験を伴う。全ゲノム配列解読後のスクリーニング（ドライ）は、デジタル配列データを対象とするものであり、実際の実験は伴わない。 図８は、増幅ＤＮＡを調製するためのステップを行う模式図を示す。サンプルを液滴に１単一生物単位ずつ封入し、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成し、ゲルカプセル中の単一生物単位を溶解用試薬で溶解することで単一生物単位由来のＤＮＡを溶出させ、次いで増幅用試薬を用いてＤＮＡを増幅させる。 図９は、ウェットのスクリーニングの模式図を示す。増幅ＤＮＡサンプルの一部を使用して、シーケンシングやアガロースゲル電気泳動などの実験を行う。特定の遺伝子配列の有無、特定の遺伝子の量または増幅ＤＮＡの収量などに基づき、無数のサンプルから目的のサンプルをスクリーニングすることができる。 図１０は、選抜後の配列決定の模式図である。 図１１、ドライのスクリーニングステップを示す模式図である。デジタル配列データを対象とするスクリーニングであり、特定の遺伝子配列の有無または配列のクオリティ等に基づき、無数のサンプルから目的のサンプルをスクリーニングすることができる。 図１２は、細菌由来のサンプル毎の全ゲノム配列のコンプリート率およびコンタミネーション率を示す図である。ゲノム解読率（コンプリート率）およびコンタミネーション度の評価にはＣｈｅｃｋＭを用いた。 図１３は、標的細菌のゲノムデータの泳動像である。一番右のレーンが大腸菌を用いたPCであり、マーカーを除いて左から４、１９、２０番目のレーンが細菌由来である。
　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　（定義等）
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
　本明細書において、「細胞」とは、遺伝情報を有する分子を内包する粒子であって、（単独で可能かどうかにかかわらず）複製されることが可能である任意の粒子を指す。本明細書における「細胞」としては、単細胞生物の細胞、細菌、多細胞生物由来の細胞、真菌などが包含される。
　本明細書において、「細胞様構造物」とは、遺伝情報を有する分子を内包する任意の粒子を指す。本明細書における「細胞様構造物」としては、細胞内小器官、例えば、ミトコンドリア、細胞核、および葉緑体、ならびにウイルスなどが包含される。
　本明細書において、「単一生物単位」とは、遺伝情報またはその他の生体分子の情報を有する単位を指す。単一生物単位は、細胞、細胞様構造物などを含み得るが、これらに限定されず、人工的に生産したもの（いわゆる人工細胞）やデジタル上の細胞（情報として提供される）なども含み得る。ウェットのスクリーニングの文脈においては、「単一生物単位」とは、構造情報に対応する構造物を有する単位を指し、有体物（ウェット処理の場合）または無体の概念（ドライ処理の場合）であり得る。
　本明細書において、「遺伝情報またはその他の生体分子の情報」とは、生体分子またはその類似体を規定する情報を指す。遺伝情報またはその他の生体分子の情報には、核酸、アミノ酸、脂質もしくは糖鎖またはそれらの類似体の構造情報などを含み得るが、これらに限定されず、代謝物質などの生体内分子またはその類似体の相互作用の多様性情報なども含み得る。ウェットのスクリーニングの文脈においては、「遺伝情報またはその他の生体分子の情報」とは、遺伝情報またはその他の生体分子の情報に対応する構造物を指す。なお、「遺伝情報」は、「核酸情報」とも称され、両者は同義である。
　本明細書において、「生体分子」とは、任意の生物またはウイルスが有する分子を指す。生体内分子には、核酸、タンパク質、糖鎖または脂質などを含み得る。本明細書において、「生体分子の類似体」とは、生体分子の天然または非天然の変種を指す。生体内分子の類似体には、修飾核酸、修飾アミノ酸、修飾脂質または修飾糖鎖などを含み得る。
　本明細書において、「集合」とは、２つ以上の単一生物単位、細胞または細胞用構造物を含む集まりをいう。
　本明細書において、「サブ集合」とは、「集合」と一緒に使用される場合、集合よりも少ない数の単一生物単位、細胞または細胞用構造を有する集合の一部分を指す。
　本明細書において、「ゲル」とは、コロイド溶液（ゾル）において、高分子物質またはコロイド粒子がその相互作用により全体として網目構造をつくり、溶媒あるいは分散媒である液相を多量に含んだまま流動性を失った状態のことをいう。本明細書において、「ゲル化」とは、溶液を「ゲル」の状態に変化させることをいう。
　本明細書において、「ゲルカプセル」とは、その中に細胞または細胞様構造物を保持することが可能なゲル状の微粒子状構造体を指す。
　本明細書において、「遺伝子分析」とは生体サンプル中の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）の状態を調べることをいう。１つの実施形態では、遺伝子分析は、核酸増幅反応を利用するものを挙げることができる。これらを含め、遺伝子分析の例としては、配列決定、遺伝子型判定・多型分析（ＳＮＰ分析、コピー数多型、制限酵素断片長多型、リピート数多型）、発現解析、蛍光消光プローブ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ　Ｐｒｏｂｅ：Ｑ－Ｐｒｏｂｅ）、ＳＹＢＲ　ｇｒｅｅｎ法、融解曲線分析、リアルタイムＰＣＲ、定量ＲＴ－ＰＣＲ、デジタルＰＣＲなどを挙げることができる。
　本明細書において「単一生物単位レベル」とは、１つの単一生物単位に含まれる遺伝情報またはその他の生体分子の情報に対して、他の単一生物単位に含まれる遺伝情報またはその他の生体分子の情報と区別し得る状態で処理を行うことをいう。
　本明細書において、「シングルセルレベル」とは、１つの細胞または細胞様構造物に含まれる遺伝情報またはその他の生体分子の情報に対して、他の細胞または細胞様構造物に含まれる遺伝情報またはその他の生体分子の情報と区別した状態で処理を行うことをいう。例えば、「単一生物単位レベル」または「シングルセルレベル」でのポリヌクレオチドを増幅する場合、それぞれある単一生物単位、またはある細胞もしくは細胞様構造物中のポリヌクレオチドと、他の単一生物単位、または他の細胞もしくは細胞様構造物中のポリヌクレオチドが区別可能な状態でそれぞれの増幅が行われる。
　本明細書において、「単一生物単位解析」とは、１つの単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）に含まれる遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、他の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）に含まれる遺伝情報またはその他の生体分子の情報と区別した状態で解析することを指す。
　本明細書において、「シングルセル解析」とは、１つの細胞または細胞様構造物に含まれる遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、他の細胞または細胞様構造物に含まれる遺伝情報またはその他の生体分子の情報と区別した状態で解析することを指す。
　本明細書において、「遺伝情報」とは、１つの細胞または細胞様構造物に含まれる遺伝子その他情報をコードする核酸の情報を指し、特定の遺伝子配列の有無、特定の遺伝子の収量または全核酸収量を含む。
　本明細書において、「生体分子の情報」とは、１つの細胞または細胞様構造物に含まれる生体分子（核酸の他、核酸以外には、タンパク質、糖、脂質なども含まれる。）またはその類似体の情報を指し、特定の生体分子の構造または配列の有無、構造または配列の同一性、特定の生体分子の収量および全生体分子の収量を含む。
　本明細書において、「核酸情報」とは、１つの細胞または細胞様構造物に含まれる核酸の情報を指し、特定の遺伝子配列の有無、特定の遺伝子の収量または全核酸収量を含む。
　本明細書において、「同一性」とは、２つの生体分子間の構造または配列の類似性を指す。対象が配列の場合、同一性は、比較のためにアライメントしうる各配列中の位置を比較することによって決定することもできる。
　（好ましい実施形態）
　以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本開示の例示であり、本開示の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本開示の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、１または複数の任意の実施形態を組み合わせ得る。
　（スクリーニング）
　１つの局面において、本開示は、総じて、単一生物単位を２つ以上含む集合から、該単一生物単位の遺伝情報またはその他の生体分子の情報に基づいて、単一生物単位を少なくとも１つを含むサブ集合を生成する工程を包含する、単一生物単位を含むサブ集合を生成する方法を提供する。単一生物単位は、細胞または細胞様構造物であり得、その場合、本開示は、細胞または細胞様構造物を２つ以上含む集合から、該細胞または細胞様構造物の核酸配列に基づいて、細胞または細胞様構造物を少なくとも１つを含むサブ集合を生成する工程を包含する、細胞または細胞様構造物を含むサブ集合を生成する方法を提供する。この方法は、ウェットで行ってもよく、ドライ（情報処理）で行ってもよく、両方を行ってもよい。いずれの場合でも、特定の配列またはその他の構造情報に基づいて、得られた単一生物単位（細胞の場合、シングルセル）レベルで得られた集合から、サブ集合を生成し、さらなる解析を効率化することができる。以下個別に説明する。
　（スクリーニング（ウェット））
　１つの局面において、単一生物単位を含むサブ集合の生成をウェットで実施する方法を提供する。本明細書において、スクリーニング（ウェット）とは、物理的な操作を伴う実験、すなわち、例えば生体分子の少なくとも一部を用いたスクリーニングを指す。スクリーニング（ウェット）は、デジタルの生体分子データを対象としない。遺伝情報またはその他の生体分子の情報の解析（例えば、オミックス解析）前にスクリーニングを行うことで、目的のサンプルのみを解析に供することができるため、実験に要する時間および費用の削減につながる。スクリーニング（ウェット）は、遺伝情報またはその他の生体分子の解析（例えば、オミックス解析）前に行ってもよく、後に行ってもよい。
　スクリーニング（ウェット）は、生体分子の一部を用いた任意のスクリーニングであってよい。一部の実施形態において、生体分子は、核酸、タンパク質、アミノ酸、糖鎖または脂質等であってもよい。スクリーニング（ウェット）では、特定の遺伝子配列の有無、特定の遺伝子配列の収量、全ＤＮＡの収量などに基づいてスクリーニングすることができる。
　したがって、１つの局面において、本開示は、Ａ）２つ以上の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）の各々を別々に提供する工程と、Ｂ）該別々に提供された２つ以上の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を、該単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報に基づいて選別する工程と、Ｃ）必要に応じて、該選別された単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を、分析する工程とを包含する方法を提供する。
　一部の実施形態において、工程Ａ）が、（ａ）２つ以上の細胞または成分を含む試料を用い、液滴中に１つの単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を封入することと、（ｂ）液滴をゲル化してゲルカプセルを生成することと、（ｃ）ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して細胞または成分を溶解する工程であって、細胞または成分中のポリヌクレオチドがゲルカプセル内に溶出し該ポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態でゲルカプセル内に保持される、ことと、（ｄ）ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させてポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅することを包含してもよい。本開示の一実施形態において、当該ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させて当該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程は、当該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内でゲル状態を保ちながら増幅することもできる。
　他の実施形態において、液滴は、１つの単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）をマイクロ流路中に流動させ、オイルで懸濁液をせん断することにより１つの単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を封入することで作製され得る。一部の実施形態において、ゲルカプセルはヒドロゲルカプセルであってもよい。
　１つの局面において、本開示は、Ａ）２つ以上の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する工程と、Ｂ）該遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、該核酸情報またはその他の生体分子の情報を該単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ごとに選別する工程と、Ｃ）必要に応じて、該選別された単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）中の遺伝情報またはその他の生体分子の情報を分析する工程とを包含する方法を提供する。
　本開示において、２つ以上の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）の各々を別々に提供する工程は、例えば、本明細書で説明されるゲルカプセル化を用いた手法で実施することができる。
　１つの実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は、核酸情報、タンパク質情報、脂質情報および糖鎖情報からなる群から選択される。好ましい実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は、核酸情報である。特定の実施形態において、核酸情報が、特定の遺伝子配列の有無、特定の遺伝子の収量または全核酸収量から選択される。
　一部の実施形態において、特定の遺伝子配列がある場合に単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を選択してもよく、特定の遺伝子配列が無い場合に単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を選択してもよい。一部の実施形態において、特定の遺伝子の収量が基準となる収量より多い場合に単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を選択してもよく、低い場合に単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を選択してもよい。一部の実施形態において、全核酸収量が基準となる収量より多い場合に単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を選択してもよく、低い場合に単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を選択してもよい。
　特定の実施形態において、特定の遺伝子配列の有無を、該特定の遺伝子配列を特異的に検出する試薬（核酸プローブなど）、分子量測定手段（アガロースゲル電気泳動、マイクロチップ電気泳動）、遺伝子増幅法（ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）、遺伝子配列決定（サンガーシーケンシング、ＮＧＳ）からなる群から選択される手段により検出する。一部の実施形態において、特定の遺伝子配列を特異的に検出する試薬として、抗体、プローブ、ＤＮＡ結合性蛍光色素、蛍光色素結合ヌクレオチドが挙げられる。
　特定の実施形態において、特定の遺伝子の収量または全核酸収量を吸光度測定、蛍光光度測定、アガロースゲル電気泳動、マイクロチップ電気泳動により測定することができる。
　１つの実施形態において、選別は、はじめに増幅ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルをフローサイトメトリー、連続自動分注機、マイクロ流体デバイスにてプレートに分取し、さらに分取した各ゲルカプセルのポリヌクレオチドから核酸の再増幅を行い、増幅ポリヌクレオチドライブラリーを調製する。本増幅核酸の一部を用いて、ＰＣＲなどで特定の遺伝子増幅を行い、サンガーシーケンスまたはＮＧＳなどで遺伝子配列決定または電気泳動や吸光度／蛍光核酸定量にて分子量決定を行って、増幅した遺伝子の配列情報や収量を評価し、ポリヌクレオチドライブラリー中の各サンプルの特定の遺伝子の有無を評価する。その結果を参考に、サンプルを選抜し別のプレート等へ移送する。
　本開示において、別々に提供された２つ以上の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を、該単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）に由来する核酸情報またはその他の生体分子の情報に基づいて選別する工程は、例えば、特定の配列を検出し得るプローブ（例えば、１８Ｓのほかその他の特異的な遺伝子産物を認識し得るプローブなど）を用いて、スクリーニングを行って実施することができる。
　１つの実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は、タンパク質情報である。一部の実施形態において、タンパク質情報は、全タンパク質量、特定のタンパク質量または特定のタンパク質の有無から選択される。特定の実施形態において、タンパク質は、全体であってもよく、一部（例えば、サブユニット、ドメイン）であってもよい。一部の実施形態において、タンパク質情報は、タンパク質の１次構造、２次構造、３次構造または４次構造に関する情報であってもよい。
　一部の実施形態において、特定のタンパク質がある場合に単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を選択してもよく、無い場合に単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を選択してもよい。一部の実施形態において、全タンパク質量が基準となる収量より多い場合に単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を選択してもよく、低い場合に単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を選択してもよい。一部の実施形態において、特定のタンパク質量が基準となる収量より多い場合に単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を選択してもよく、低い場合に単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を選択してもよい。
　１つの実施形態において、特定のタンパク質の有無を、抗体、ペプチド、核酸などの手段を用いて、検出することができる。他の実施形態において、全タンパク質量または特定のタンパク質量を、タンパク質濃度測定手段（ＢＣＡアッセイ、ブラッドフォード、ＥＬＩＳＡ）、核酸増幅などの手段を用いて、検出することができる。
　１つの実施形態において、特定配列の収量または全核酸の収量に基づいて選択する場合、選別は、はじめにゲルカプセルをフローサイトメトリー、連続自動分注機、マイクロ流体デバイスにてプレートに分取し、さらに分取した各ゲルカプセルから特定タンパク質を抽出する。本タンパク質の一部を用いて、タンパク質濃度測定による全タンパク質量または抗体や拡散を用いた特定のタンパク質検出を行って、特定タンパク質の有無を評価する。その結果を参考に、サンプルを選抜し別のプレート等へ移送する。
　１つの実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は、糖鎖情報である。一部の実施形態において、糖鎖情報は、糖鎖の有無、特定糖鎖の量または全糖鎖の量から選択される。特定の実施形態において、糖鎖全体であってもよく、一部であってもよい。１つの実施形態において、糖鎖情報は任意の手段によって検出され得る。
　１つの実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は、脂質情報である。一部の実施形態において、脂質情報は、脂質の有無、特定脂質の量または全脂質の量から選択される。特定の実施形態において、脂質全体であってもよく、一部であってもよい。１つの実施形態において、脂質情報は任意の手段によって検出され得る。
　１つの実施形態において、複数の遺伝情報またはその他の生体分子の情報を用いて、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を選択してもよい。一部の実施形態において、選別は複数回行ってもよく、各選別において用いる遺伝情報またはその他の生体分子の情報は同一であってもよく、異なってもよい。
　本開示において、必要に応じて、該選別された単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を分析する工程を実施することができ、例えば、遺伝子解析手法で分析することができる。
　１つの実施形態において、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）の分析は、任意のオミックス解析（例えば、ゲノム解析、プロテオーム解析、トランスクリプトーム解析、グライコーム解析、リピドーム解析またはメタボローム解析）であってもよい。特定の実施形態において、分析により得られた情報を用いてデータライブラリを作製してもよい。他の実施形態において、分析を行った後に、さらに１回または複数回の選別および分析を行ってもよい。
　１つの実施形態において、分析によりデジタルの生体分子データを得ることができる。特定の実施形態において、デジタルの生体分子データは、ゲノム情報、トランスクリプトーム情報、プロテオーム情報、グライコーム情報またはリピドーム情報であってもよい。
　分析により得られた情報に基づいて、以下のような応用が可能である。
（応用例１）亜株の解析
　一例として、本開示の技術は、亜株の解析に使用することができる。腸内細菌などの動物共生微生物や海洋・土壌微生物の中で、当業者が注目する特定の１種以上の微生物のゲノムデータを獲得することが目的であった場合には、ゲルカプセルで増幅したポリヌクレオチドに対し、標的とする遺伝子断片の有無を事前確認しておくことで、不要な遺伝子配列データ取得とデータ解析に要するコストを削減することができる。測定対象例として、同一系統微生物のデータを選抜して取得することで、遺伝子配列データを単一生物単位で取得し、その変異箇所などを相互比較することで、亜株の特定やその多様性評価が可能である。例えば、病原菌の遺伝子変異解析や産業用酵素の高生産株の探索などに活用できる。
（応用例２）検体の特性と多様性の解析
　本開示は、検体の特性と多様性の解析に応用可能である。腸内細菌などの動物共生微生物の中で、当業者が特定の１種以上の微生物に着目し、多数の検体間での当該微生物の数・種類・遺伝子配列情報を比較することで、検体毎の特性を知ることを目的とした場合がある。この際、ゲルカプセルで増幅したポリヌクレオチドに対し、標的とする微生物に特有な遺伝子断片の有無を事前確認しておくことで、不要な遺伝子配列データ取得とデータ解析に要するコストを削減することができる。測定対象例として、同一系統微生物のデータを選抜して取得することで、その検体中に占める数が明らかとなる。さらに、遺伝子配列データを単一生物単位で取得し、代謝経路の保管性やゲノムの同一性や進化系統分類などの比較ゲノム解析を行うことで、微生物の差異を明らかとし、ホスト検体の多様性や検体の背景情報との関連について解析を行う。例えば検体としては、特定の疾患患者の糞便、唾液、喀痰や皮膚、口腔、鼻腔、耳、生殖器などの拭い液、手術洗浄液、あるいは組織抽出物や血液であり、当該試料中に含まれる微生物を解析対象とした場合が想定される。
（応用例３）特定遺伝子保有生物のスクリーニング
　本開示はまた、特定遺伝子保有生物のスクリーニングに応用可能である。腸内細菌などの動物共生微生物や海洋・土壌微生物の中で、当業者が注目する特定の１種以上の微生物のゲノムデータを獲得することが目的であった場合には、ゲルカプセルで増幅したポリヌクレオチドに対し、標的とする遺伝子断片の有無を事前確認しておくことで、不要な遺伝子配列データ取得とデータ解析に要するコストを削減することができる。測定対象例としては、微生物の生産する二次代謝産物や酵素をターゲットとして遺伝子増幅反応や遺伝子配列データからスクリーニングを行う。得られた配列情報を蓄積することで、組み換え生産にて高生産や高活性の遺伝子を活用する事が可能である。
（応用例４）複数生物に由来する細胞・細胞内小器官が混在する試料からの標的の検出
　本開示は、複数生物に由来する細胞・細胞内小器官が混在する試料からの標的の検出に応用可能である。解析試料が、糞便、唾液、喀痰や皮膚、口腔、鼻腔、耳、生殖器などの拭い液、手術洗浄液、あるいは組織抽出物や血液であり、当該試料中に含まれる微生物を解析対象とした場合には、試料中に多くのホスト動物由来の細胞、細胞内小器官、核酸が含まれる。これらの一部も、ゲルカプセル内部に封入されポリヌクレオチド増幅が実行されうる。このため、増幅ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルに対し、標的とする微生物の遺伝子断片あるいはホスト由来の遺伝子断片の有無を事前確認しておくことで、ホスト由来のポリヌクレオチドを含む不要な遺伝子配列データ取得を避け、それにかかるコストを削減することができる。測定例としては、ヒト由来試料からの微生物検出、例えば、血液や喀痰からの病原性微生物の探索や組織内部に共生する微生物解析などが想定される。
（応用例５）複数生物に由来する細胞・細胞内小器官が混在する試料からの標的の段階的検出
　本開示は、複数生物に由来する細胞・細胞内小器官が混在する試料からの標的の段階的検出に応用可能である。解析試料が、糞便、唾液、喀痰や皮膚、口腔、鼻腔、耳、生殖器などの拭い液、手術洗浄液、あるいは組織抽出物や血液、または共生微生物を含む植物、昆虫、動物の破砕液などであり、当該試料中に含まれる微生物とホスト細胞の双方を解析対象とする場合が想定される。この場合は、各ゲルカプセルにホスト由来の細胞、細胞内小器官、核酸、共生微生物由来の核酸が封入される。これらのすべてが、ゲルカプセル内部に封入されポリヌクレオチド増幅が実行されうる。このため、増幅ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルに対し、標的とするホスト由来の遺伝子断片・微生物由来の遺伝子断片を段階的に検出・選抜することで、解析対象とする遺伝子配列データのみを特異的に取得し、それにかかるコストを削減することができる。例えば、複数回の参照遺伝子検出を繰り返し、その必要に応じてサンプルを選抜する。その後に、残余サンプルに対し、微生物由来の遺伝子断片をゲルカプセル内で増幅・検出したのち、必要に応じて選抜する。２回目以降の順序は、必要に応じて変更しうる。また対象は、２以上の微生物同士あるいはホスト由来物同士などの組み合わせであっても良い。
（応用例６）遺伝子変異の単一細胞単位での評価
　本開示は、遺伝子変異の単一細胞単位での評価にも応用可能である。ゲノム配列上の変異多様性を単一細胞単位で評価し、検体中の細胞のゲノム不均質性や変異系統の発生や進展の追跡を実行することができる。増幅ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルに対し、標的とする細胞の標的遺伝子変異箇所を選択的に増幅・検出することで、解析対象とする遺伝子配列データのみを特異的に取得し、それにかかるコストを削減することができる。がんの進化解析、薬剤抵抗性変異の検出や遺伝子変異微生物やウイルス株の検出などに利用できる。
（応用例７）特定生物種の保存性評価
　本開示はまた、特定生物種の保存性評価に応用可能である。例えば、薬剤、農薬、食品などで、特定の生物種を包含することを立証する、あるいは棄却することが目的であった際に、本開示技術を用いることで特定生物を、増幅ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルから検出・選抜することで、その含有率を示すことができる。また得られた遺伝情報を詳細に解析することで、標品とのゲノムレベルでの一致度、保存性などを評価することができる。微生物製剤等の品質保証などに利用が想定される。
（応用例８）特定生物種の検出
　本開示は、特定生物種の検出に応用可能である。解析試料が、糞便、唾液、喀痰や皮膚、口腔、鼻腔、耳、生殖器などの拭い液、手術洗浄液、あるいは組織抽出物や血液などであり、特定の１種以上の微生物の存在を検知し、薬剤奏効性、薬剤耐性を判定することや食品の代謝能力を評価することがある。本開示技術を用いることで特定生物を増幅ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルから検出・選抜することで、その含有率を示すことができる。また得られた遺伝情報を詳細に解析することで、ゲノムレベルでの機能推定と保存性などを評価することができる。
　（スクリーニング（ドライ））
　別の局面において、本開示は、単一生物単位を含むサブ集合を生成する方法をドライ（インシリコ）で実施する方法を提供する。スクリーニング（ドライ）とは、本明細書において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報の解析（例えば、オミックス解析）後に行う、デジタルの生体分子データを用いたスクリーニングを指す。スクリーニング（ウェット）は、デジタル配列データを対象とする。遺伝情報またはその他の生体分子の解析後にスクリーニングを行うことで、より多くのサンプルをより短い時間でスクリーニングすることができるため、実験に要する時間の削減につながる。本開示において用いるデジタルの生体分子データは、ゲノム情報、プロテオーム情報、グライコーム情報またはリピドーム情報であってもよい。
　１つの局面において、本開示は、Ａ）２つ以上の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する工程と、Ｂ）該遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、該遺伝情報またはその他の生体分子の情報を該単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ごとに選別する工程と、Ｃ）必要に応じて、該選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報を分析する工程とを包含する方法を提供する。
　本開示において、Ａ）２つ以上の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する工程は、２つ以上の単一生物単位を別々に提供して遺伝情報またはその他の生体分子の情報を得ることにより実施することができ、例えば、２つ以上の単一生物単位の各々をカプセル化し、各カプセル中の遺伝情報またはその他の生体分子の情報を分析することで実施することができる。
　本開示において、２つ以上の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）の各々を別々に提供する工程は、例えば、本明細書で説明されるゲルカプセル化を用いた手法で実施することができる。
　１つの実施形態において、単一生物単位は、細胞または細胞様構造物などであってもよく、デジタル細胞などの細胞情報であってもよい。特定の実施形態において、細胞情報は、人工的にデザインしたものであってもよく、天然の細胞または細胞様構造物の情報をデジタル化したものであってもよい。
　１つの実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は、デジタル情報である。特定の実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は、任意のオミックス解析（例えば、ゲノム解析、プロテオーム解析、トランスクリプトーム解析、グライコーム解析、リピドーム解析またはメタボローム解析）により得られた情報であってもよい。他の実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は、細胞または細胞様構造物由来の情報であってもよく、人工的にデザインされたものであってもよい。
　１つの実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は、核酸情報、タンパク質情報、脂質情報および糖鎖情報からなる群から選択される。
　一部の実施形態において、工程Ａ）は、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）に由来する核酸をシーケンシングして核酸情報を得ることを含む。他の実施形態において、工程Ａ）は、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）に由来するタンパク質、糖鎖または脂質に対する検出分子を用いることで、タンパク質情報、糖鎖情報または脂質情報を得ることを含む。
　本開示において、Ｂ）遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、遺伝情報またはその他の生体分子の情報を該単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ごとに選別する工程は、例えば、遺伝情報またはその他の生体分子の情報の同一性に基づいて実施することができる。
　１つの実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は核酸情報であり得る。特定の実施形態において、核酸情報は、特定の遺伝子配列の有無、特定の遺伝子の量もしくは特定の遺伝子配列との同一性またはこれらの組合せから選択される。
　１つの実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は、シークエンスデータのアセンブリを行い作製したＣｏｎｔｉｇであってもよい。一部の実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は、Ｃｏｎｔｉｇから算出したゲノム解読率（コンプリート率）およびコンタミネーション度であってもよい。
　１つの実施形態において、工程Ｂ）が、特定の遺伝子配列の有無および／または特定の遺伝子配列との同一性を評価することを含む。一部の実施形態において、特定の遺伝子配列との同一性は、ＢＬＡＳＴ、ＤＩＡＭＯＮＤ、ＢＷＡ、ｂｏｗｔｉｅ２、ｈｍｍｅｒを用いることで評価することができる。特定の実施形態において、工程Ｂ）は、特定の遺伝子配列の有無に基づき、核酸情報を単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ごとに選別してもよい。他の実施形態において、工程Ｂ）は、特定の遺伝子配列と、２つ以上の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）に由来する核酸情報との同一性に基づき、核酸情報を３単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ごとに選別してもよい。一部の実施形態において、一定以上の同一性を有する場合に選択してもよく、一定以下の同一性の場合に選択してもよい。特定の実施形態において、同一性は、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％であってもよい。他の実施形態において、同一性は、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０％であってもよい。
　１つの実施形態において、工程Ｂ）が、特定のアミノ酸配列の有無などを評価することを含む。
　１つの実施形態において、工程Ｂ）が、特定の糖鎖の有無などを評価することを含む。１つの実施形態において、工程Ｂ）が、特定の脂質の有無などを評価することを含む。
　１つの実施形態において、サンプル間のＣｏｎｔｉｇを比較することにより、サンプルを選別してもよい。１つの実施形態において、ゲノム解読率（コンプリート率）およびコンタミネーション度を用いて、選別を行ってもよい。一部の実施形態において、ゲノム解読率（コンプリート率）およびコンタミネーション度の評価は、ＣｈｅｃｋＭを用いて行ってもよい。
　一部の実施形態において、コンプリート率が５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上のサンプルを選別してもよい。好ましい実施形態において、コンプリート率が９０％以上のサンプルを選別してもよい。
　一部の実施形態において、コンタミネーション率が１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％以下のサンプルを選別してもよい。好ましい実施形態において、コンタミネーション率が５％以下のサンプルを選別してもよい。
　本開示において、必要に応じて、該選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報を分析する工程を行うことができ、この工程は、例えば、ｂｌａｓｔなどの検索エンジンや、Ｅｎｓｅｍｂｌ等の解析ウェブサイトなどのほか、ＱＵＡＳＴ、ＣｈｅｃｋＭなどのアセンブリ評価ツール、Ｐｒｏｋｋａ、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ、ＤＦＡＳＴなどのアノテーションツール、ＭｅｔａＣｙｃ、ＭＡＰＬＥなどの代謝・生理機能ポテンシャル評価システムを用いて実施することができる。遺伝情報の解析の一連の流れとして、ｄｅ　ｎｏｖｏ　アセンブリを行って得た遺伝情報に対し、ＱＵＡＳＴでアセンブリの実効性を評価し、ＣｈｅｃｋＭでゲノムセットとしての質評価を行う。その後、Ｐｒｏｋｋａなどのアノテーションツールを用いて、ゲノム中の遺伝子を同定し、ＭＡＰＬＥにて代謝経路としての保存性を評価する。ＰｆａｍおよびＣＯＧデータベースを用いて、各遺伝子の保存性や同一性を評価し、近縁種生物との比較ゲノム解析を実行する。
　１つの実施形態において、分析は、遺伝情報またはその他の生体分子の情報に基づいたクラスタリング、マーカーの探索、同一系統微生物の比較解析（例えば、疾患等に関連する微生物系統群における亜種の解析）、特定の遺伝子（例えば、微生物の生産する二次代謝産物や酵素）を有する微生物の探索、多系統の生物種を含む中から細菌・アーキア・真菌・その他真核細胞等を個別に選択した解析、ヒト由来試料からの微生物検出（例えば、血液や喀痰からの病原性微生物の探索や組織内部に共生する微生物解析）を含む。
　分析により得られた情報に基づいて、以下の応用が可能である。
（応用例１）検体の特性と多様性の解析
　本開示は、検体の特性と多様性の解析に応用可能である。腸内細菌などの動物共生微生物の中で、当業者が特定の１種以上の微生物に着目し、多数の検体間での当該微生物の数・種類・遺伝子配列情報を比較することで、検体毎の特性を知ることを目的とした場合がある。この際、ゲルカプセルで増幅したポリヌクレオチドに対し、標的とする微生物に特有な遺伝子断片の有無を事前確認しておくことで、不要な遺伝子配列データ取得とデータ解析に要するコストを削減することができる。測定対象例として、同一系統微生物のデータを選抜して取得することで、その検体中に占める数が明らかとなる。さらに、遺伝子配列データを単一生物単位で取得し、代謝経路の保管性やゲノムの同一性や進化系統分類などの比較ゲノム解析を行うことで、微生物の差異を明らかとし、ホスト検体の多様性や検体の背景情報との関連について解析を行う。例えば検体としては、特定の疾患患者の糞便、唾液、喀痰や皮膚、口腔、鼻腔、耳、生殖器などの拭い液、手術洗浄液、あるいは組織抽出物や血液であり、当該試料中に含まれる微生物を解析対象とした場合が想定される。
　具体的な検体の特性の評価として、微生物多様性の解析を行う際には、例えば糞便内の微生物菌叢の解析を行う例としては、以下の実施例１～３のとおりに解析を進め、表１にあるように、１細胞増幅ゲノムライブラリー中の腸内細菌の系統を推定し、多様性を解析し、それを比較することで検体個々の特性を知ることができる。
　同様に土壌微生物の場合は、下記の手順で微生物懸濁液を調製する。その後、以下の実施例１～３と同一の操作で作業を行う。１０ｇの土壌を容量５０ｍＬのチューブ（2342-050, Iwaki）に採取し(n=3)、リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Dulbecco’s　Phosphate-Buffered　Saline,　14190-144,　Thermo　Fisher　Scientific）を全量が４０ｍＬとなるまで加えて十分に懸濁した。懸濁後のチューブを氷上にて5分間静置した後、上清を新しい容量５０ｍＬのチューブに移した。上清を５μｍ径のフィルター（SMWP04700,Sigma-Aldrich）を用いて濾過した後、１０，０００×ｇで５分間遠心分離し（75004263, Thermo Fisher Scientific）、上清を除去した。ペレットを１０ｍＬのＰＢＳ中に再度懸濁し、１．５ｍＬのチューブ（MCT-150-C,Axygen）に１ｍLずつ分注した後、１０，０００×ｇで５分間遠心分離することで土壌細菌を集菌した。菌体のペレットを１本の１．５ｍＬのチューブにまとめ、ＰＢＳを用いて２回遠心分離により洗浄した後、ＰＢＳ中に懸濁することで土壌細菌の細胞懸濁液を取得した。調製した細胞懸濁液中の細胞濃度を測定し（顕微鏡：CKX41,OLYMPUS、バクテリア計算盤A161,2-5679-01, アズワン）、終濃度１．５％になるように超低融点アガロース（A5030-10G, Sigma-Aldrich）を加えることで、ゲルカプセル作製に用いる土壌細菌懸濁液を調製した（細胞終濃度：１．５×１０３ｃｅｌｌｓ／μＬ）。続いて、実施例１～３に記載の流れと同様の手順で解析を進めることができる。
　水圏微生物の場合は下記の手順で微生物懸濁液を調製する。その後、実施例１～３と同一の操作で作業を行う。実験は、４Lの海水または淡水を滅菌済のポリタンクに回収し、５μm径のフィルター（SMWP04700, Sigma-Aldrich）を用いて濾過したのち、０．２２μm径のフィルター（GSWP04700,Sigma-Aldrich）で濾過することによって細菌画分をフィルター上にトラップした。０．２２μm径のフィルターを、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（DＰＢＳ）（Dulbecco’s　Phosphate-Buffered　Saline,　14190-144,　Thermo　FisherScientific）を含んだ容量２５ｍＬのチューブ（2362-025, Iwaki）内に入れ、十分に懸濁した。１０ｍLの細菌懸濁液を１．５ｍＬのチューブ（MCT-150-C,Axygen）に１ｍLずつ分注した後、１０，０００×ｇで５分間遠心分離することで海水または淡水由来の細菌を集菌した。菌体のペレットを１本の１．５ｍＬのチューブにまとめ、ＰＢＳを用いて２回遠心分離により洗浄した後、ＰＢＳ中に懸濁することで海水または淡水由来の細菌の細胞懸濁液を取得した。調製した細胞懸濁液中の細胞濃度を測定し（顕微鏡：CKX41,OLYMPUS、バクテリア計算盤A161,2-5679-01, アズワン）、終濃度１．５％になるように超低融点アガロース（A5030-10G,Sigma-Aldrich）を加えることで、ゲルカプセル作製に用いる海水または淡水由来細菌懸濁液を調製した（細胞終濃度：１．５×１０３ｃｅｌｌｓ／μＬ）。続いて、実施例１～３に記載の流れと同様の手順で解析を進めることができる。
（応用例２）特定生物種の検出
　本開示は、特定生物種の検出に応用可能である。解析試料が、糞便、唾液、喀痰や皮膚、口腔、鼻腔、耳、生殖器などの拭い液、手術洗浄液、あるいは組織抽出物や血液などであり、特定の１種以上の微生物の存在を検知し、薬剤奏効性、薬剤耐性を判定することや食品の代謝能力を評価することがある。本発明技術を用いることで特定生物を増幅ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルから検出・選抜することで、その含有率を示すことができる。また得られた遺伝情報を詳細に解析することで、ゲノムレベルでの機能推定と保存性などを評価することができる。
　例えば糞便内の微生物菌叢の解析を行う例としては、実施例１～３のとおりに解析を進め、表１にあるように、１細胞増幅ゲノムライブラリー中の腸内細菌の系統を推定し、ＢＬＡＳＴでの相同性検索の結果Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ（ラクノスピラ科）およびＢａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ（バクテロイデス科）に分類される微生物の存在を特異的に検出している。
（応用例３）特定遺伝子保有生物のスクリーニング
　本開示はまた、特定遺伝子保有生物のスクリーニングに応用可能である。腸内細菌などの動物共生微生物や海洋・土壌微生物の中で、当業者が注目する特定の１種以上の微生物のゲノムデータを獲得することが目的であった場合には、ゲルカプセルで増幅したポリヌクレオチドに対し、標的とする遺伝子断片の有無を事前確認しておくことで、不要な遺伝子配列データ取得とデータ解析に要するコストを削減することができる。測定対象例としては、微生物の生産する二次代謝産物や酵素をターゲットとして遺伝子増幅反応や遺伝子配列データからスクリーニングを行う。得られた配列情報を蓄積することで、組み換え生産にて高生産や高活性の遺伝子を活用する事が可能である。
　具体的な手順として、標的遺伝子を対象とした（１）BLAST、hmmerを用いた単一生物由来遺伝子配列の相同性検索、もしくは（２）BWA、bowtie2を用いた単一生物由来シーケンスデータのマッピングによって、単一生物由来遺伝子配列と標的遺伝子配列の相同性を評価し、特定遺伝子を保有するサンプルをスクリーニングする。
　例えば、マウス腸内微生物の単一細胞由来配列データを得た場合、食物繊維イヌリンを代謝する遺伝子あるいは微生物Bacteroides種を特定する遺伝子マーカーを元に、単一生物由来遺伝子配列の相同性検索を行うことで、当該食品イヌリンの分解を担う微生物および遺伝子群を特定し、既知遺伝子の相同性、アミノ酸配列に基づく立体構造予測からその機能を推定することができた。また、複数の腸内微生物の単一細胞由来配列データ中での当該微生物種の占める比率(含有率)までを評価することができた。
（応用例４）遺伝子変異の単一細胞単位での評価
　本開示は、遺伝子変異の単一細胞単位での評価にも応用可能である。ゲノム配列上の変異多様性を単一細胞単位で評価し、検体中の細胞のゲノム不均質性や変異系統の発生や進展の追跡を実行することができる。増幅ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルに対し、標的とする細胞の標的遺伝子変異箇所を選択的に増幅・検出することで、解析対象とする遺伝子配列データのみを特異的に取得し、それにかかるコストを削減することができる。がんの進化解析、薬剤抵抗性変異の検出や遺伝子変異微生物やウイルス株の検出などに利用できる。
　具体的な手順として、標的遺伝子を対象とした（１）BLAST、hmmerを用いた単一生物由来遺伝子配列の相同性検索、もしくは（２）BWA、bowtie2を用いた単一生物由来シーケンスデータのマッピングによって、単一生物由来遺伝子配列と標的遺伝子配列の差異を検出し、遺伝子変異を特定する。
　例えば、マウス腸内微生物の単一細胞由来配列データを得た場合、食物繊維イヌリンを代謝する遺伝子あるいは微生物Bacteroides種を特定する遺伝子マーカーを元に、単一生物由来遺伝子配列の相同性検索を行うことで、当該食品イヌリンの分解を担う微生物および遺伝子群を特定し、既知遺伝子の相同性、遺伝子クラスター上の差異を評価することができた。
（応用例５）複数生物に由来する細胞・細胞内小器官が混在する試料からの標的の検出
　本開示は、複数生物に由来する細胞・細胞内小器官が混在する試料からの標的の検出に応用可能である。解析試料が、糞便、唾液、喀痰や皮膚、口腔、鼻腔、耳、生殖器などの拭い液、手術洗浄液、あるいは組織抽出物や血液であり、当該試料中に含まれる微生物を解析対象とした場合には、試料中に多くのホスト動物由来の細胞、細胞内小器官、核酸が含まれる。これらの一部も、ゲルカプセル内部に封入されポリヌクレオチド増幅が実行されうる。このため、増幅ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルに対し、標的とする微生物の遺伝子断片あるいはホスト由来の遺伝子断片の有無を事前確認しておくことで、ホスト由来のポリヌクレオチドを含む不要な遺伝子配列データ取得を避け、それにかかるコストを削減することができる。測定例としては、ヒト由来試料からの微生物検出、例えば、血液や喀痰からの病原性微生物の探索や組織内部に共生する微生物解析などが想定される。
　サンゴ共在微生物の検出
（材料および方法）
　１．５ｃｍのサンゴ枝（沖縄県国頭郡本部町瀬底周辺海域の石川原から入手）を採取し、０．２２μｍ径のフィルター（ＤＵＲＡＰＯＲＥメンブレンフィルター， ＧＶＷ Ｐ０４７００， ＭＥＲＣＫ）でろ過した海水５ ｍＬを含んだ２５ ｍＬチューブ（２ ３６２－０２５， ＩＷＡＫＩ）に回収した。メス（替刃メスホルダー（６１－３８１３－２８），替刃Ｎｏ．１０（１－８５４５－１１）を使用，アズワン））を用いてサンゴ枝を十分に破砕した後、氷上で３分間静置して骨片等の大きな粒子を沈殿させた。上清を１．５ｍＬチューブ（１２１２－１０，ＳＳＩｂｉｏ）に回収し、８，０００ｘｇで５ｍｉｎ遠心分離（ｈｉｍａｃ　ＣＦ１５ＲＸ，工機ホールディングス）した。ペレットを残して上清を除き、０．２２μｍ径のフィルター（ＤＵＲＡＰＯＲＥメンブレンフィルター，ＧＶＷＰ０４７００，ＭＥＲＣＫ）でろ過した海水８００μＬを加えてペレットを再度懸濁した。次に、２５０ｘｇで５ｍｉｎ遠心分離を行い、上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収した。８，０００ｘｇでの遠心分離、上清の除去および２５０ｘｇでの遠心と上清の回収操作を再度繰り返した後、８，０００ｘｇでの遠心分離と上清の除去をさらに３回行った。得られたペレットに対し、０．２２μｍ径のフィルター（ＤＵＲＡＰＯＲＥメンブレンフィルター，ＧＶＷＰ０４７００，ＭＥＲＣＫ）でろ過した海水１００μＬを加えて懸濁し、サンゴ組織内微生物、サンゴ細胞およびサンゴミトコンドリアの混合懸濁液を取得した。調製した懸濁液中の細菌細胞濃度を測定し（顕微鏡：ＣＫＸ４１，ＯＬＹＭＰＵＳ、バクテリア計算盤Ａ１６１，２－５６７９－０１，アズワン）、終濃度１．５％になるように超低融点アガロース（Ａ５０３０－１０Ｇ，ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）を加えることで、ゲルカプセル作製に用いる細胞および細胞様構造物の混合懸濁液を調製した（細菌細胞終濃度：４．５×１０３ｃｅｌｌｓ／μＬ）。続いて、実施例１～３に記載の方法に従って処理を進める。続いて以下の処理を行う。
　新しいプレートの各ウェルに３９ μＬのヌクレアーゼフリー水（ＵｌｔｒａＰｕｒｅＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ， １０９７７－０１５， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を分注し、ライブラリマスタープレート中のＤＮＡ増幅産物１μＬを加え、ライブラリマスタープレートの４０倍希釈溶液を調製した。次に、希釈液１ μＬを用いてＱｕｂｉｔフルオロメーター（Ｑ３３２２６， Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｑ３２８５４， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅ ｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ）によるＤＮＡ濃度の定量を行った。また、希釈液１μＬ をテンプレートに用いて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３Ｖ４領域を対象としたＰＣＲを行った（６．２５ μＬ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒ０４５Ｂ，タカラバイオ）， ０．５μＬ １０ μＭ Ｐｒｉｍｅｒ Ｆｏｒｗａ ｒｄ （５‘－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ－３‘（配列番号１）），０．５μＬ １０ μ Ｍ Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ （５‘－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴ ＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ－３’（配列番号２）），１．０μＬ ＤＮＡ希釈液， ４．２５μＬ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（１０９７７－ ０１５，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Ｓ１０００ サーマルサイクラー，Ｂｉｏ－Ｒａｄ）。ＰＣＲの反応条件は、初期熱変性を９５℃，５分、熱変性を９８℃，１０秒、アニーリング５１℃，１５秒、伸長反応を７２℃，５秒で２７サイクル行い、７２℃，５分の反応後、４℃で保存した。アガロースゲル電気泳動（泳動槽：Ｍｕｐｉｄ－ｅｘＵ， ＥＸＵ－１，Ｍｕｐｉｄ、マーカー：Ｇｅｎｅ ＲｕｌｅｒTM  １ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ，＃ＳＭ０３１８，Ｆｅｒｍｅｎｔａ ｓ、染色：Ｍｉｄｏｒｉ Ｇｒｅｅｎ Ｄｉｒｅｃｔ，ＮＥ－ＭＧ０６，日本ジェネティクス、ローディングバッファー：６×ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ，９１５７，タカラバイオ）（泳動条件：１００Ｖ，１５ ｍｉｎ）によってＰＣＲ産物のサイズを確認し、細菌由来（５００ｂｐ付近）の増幅が確認されたサンプルについてサンガー法（株式会社ファスマックのＤＮＡシーケンス外注サービス）を用いてシークエンス解析を行い、細菌種の同定を行った。また、３５０ｂｐ付近に増幅が確認されたサンプルについてサンガー法を用いてシークエンス解析を行った結果、全てのサンプルが宿主のミトコンドリアに由来する配列であった。この過程を経て、細胞内小器官（ミトコンドリア）が混在する試料から細菌由来の１細胞ゲノム増幅産物を検出することができた。泳動像データを図１３に示す。
　この後、検出した細菌由来増幅ゲノムサンプルに対して、Ｎｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　ＤＮＡ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｐ　ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社，ＦＣ－１３１－１０９６）を用いてライブラリー調製を行い、Ｍｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社，ＳＹ－４１０－１００３）を用いた全ゲノムシークエンスによって２×７５ｂｐのペアエンドリード（３．９９Ｇｂ）を取得した。ＳＰＡｄｅｓ（Ｂａｎｋｅｖｉｃｈ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　ＣｏｍｐｕｔＢｉｏｌ．２０１２　Ｍａｙ；１９（５）：４５５－７７．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ． ｏｒｇ／１０．１０８９／ｃｍｂ．２０１２．００２１）を用いてシークエンスデータのアセンブリを行い、Ｃｏｎｔｉｇを作製した。また、ゲノム解読率（コンプリート率）およびコンタミネーション度の評価にはＣｈｅｃｋＭ（Ｐａｒｋｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．２０１５．２５：１０４３－１０５５，ｄｏｉ：１０．１１ ０１／ｇｒ．１８６０７２．１１４）を用いてデフォルト条件で解析を行うことで、標的細菌のゲノムデータを取得することができる。
（応用例６）複数生物に由来する細胞・細胞内小器官が混在する試料からの標的の段階的検出
　本開示は、複数生物に由来する細胞・細胞内小器官が混在する試料からの標的の段階的検出に応用可能である。解析試料が、糞便、唾液、喀痰や皮膚、口腔、鼻腔、耳、生殖器などの拭い液、手術洗浄液、あるいは組織抽出物や血液、または共生微生物を含む植物、昆虫、動物の破砕液などであり、当該試料中に含まれる微生物とホスト細胞の双方を解析対象とする場合が想定される。この場合は、各ゲルカプセルにホスト由来の細胞、細胞内小器官、核酸、共生微生物由来の核酸が封入される。これらのすべてが、ゲルカプセル内部に封入されポリヌクレオチド増幅が実行されうる。このため、増幅ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルに対し、標的とするホスト由来の遺伝子断片・微生物由来の遺伝子断片を段階的に検出・選抜することで、解析対象とする遺伝子配列データのみを特異的に取得し、それにかかるコストを削減することができる。例えば、複数回の参照遺伝子検出を繰り返し、その必要に応じてサンプルを選抜する。その後に、残余サンプルに対し、微生物由来の遺伝子断片をゲルカプセル内で増幅・検出したのち、必要に応じて選抜する。２回目以降の順序は、必要に応じて変更しうる。また対象は、２以上の微生物同士あるいはホスト由来物同士などの組み合わせであっても良い。具体的には応用例５で示した手順を繰り返すなどの方法がある。
（応用例７）特定生物種の保存性評価
　本開示はまた、特定生物種の保存性評価に応用可能である。例えば、薬剤、農薬、食品などで、特定の生物種を包含することを立証する、あるいは棄却することが目的であった

際に、本技術を用いることで特定生物を、増幅ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルから検出・選抜することで、その含有率を示すことができる。また得られた遺伝情報を詳細に解析することで、標品とのゲノムレベルでの一致度、保存性などを評価することができる。微生物製剤等の品質保証などに利用が想定される。具体的には実施例で示したような手順で、標的細菌の存在比を評価すれば良い。
（応用例８）亜株の解析
　一例として、本発明の技術は、亜株の解析に使用することができる。腸内細菌などの動物共生微生物や海洋・土壌微生物の中で、当業者が注目する特定の１種以上の微生物のゲノムデータを獲得することが目的であった場合には、ゲルカプセルで増幅したポリヌクレオチドに対し、標的とする遺伝子断片の有無を事前確認しておくことで、不要な遺伝子配列データ取得とデータ解析に要するコストを削減することができる。測定対象例として、同一系統微生物のデータを選抜して取得することで、遺伝子配列データを単一生物単位で取得し、その変異箇所などを相互比較することで、亜株の特定やその多様性評価が可能である。例えば、病原菌の遺伝子変異解析や産業用酵素の高生産株の探索などに活用できる。
　具体的な手順としては、ヒト腸内細菌叢組成の解析であれば、以下の手順とすることができる。
（ヒト糞便からの試料回収）
　ヒト糞便を採便容器(FS-0007またはFS-0008、テクノスルガラボ社)に回収した。保存液を含む採便容器では、8000xg, 5min, 4℃の遠心の後、保存液を取り除き、1000μLのDPBSでの洗浄を1度行った。冷凍便（in 1.5ml tube）は、氷上に30分置くことで自然解凍した。保存液を含まない新鮮便では特に破砕前の処理はない。その後、５００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（DＰＢＳ）（Dulbecco's　Phosphate-Buffered　Saline,　14190-144,　Thermo　Fisher　Scientific）中で破砕機を用いて固形物がなくなるまですり潰した。２，０００×ｇで２秒間遠心分離し（himac　CF15RX,　工機ホールディングス）、上清を回収する操作を２回繰り返した後、１５，０００×ｇで３分間遠心分離することでマウス  腸内微生物を集菌した。菌体のペレットをＰＢＳを用いて２回遠心分離により洗浄した後、ＰＢＳ中に懸濁することでマウス腸内微生物の細胞懸濁液を取得した。調製した細胞懸濁液中の細胞濃度を測定し（顕微鏡：CKX41,　OLYMPUS、バクテリア計算盤A161,2-5679-01,アズワン）、終濃度１．５％になるように超低融点アガロース（A5030-10G,SIGMA- ALDRICH）を加えることで、ゲルカプセル作製に用いる腸内微生物懸濁液を調製した（細胞終濃度：１．５×１０３ｃｅｌｌｓ／μＬ）。
（回収した試料の処理（ウェット））
ポリジメチルシロキサン(Sylgard　184:Dow　Corning社)を用いて自作したマイクロ流路を用いて、微小液滴の作製および微小液滴内へのヒト腸内微生物細胞の封入を行った。本実施例では、第一流路、第二流路、第三流路及び第四流路からなり、隣接する流路が直角に配置されたマイクロ流路を用いたが、略Ｔ字状に接続したマイクロ流路を使用することも可能である。本実施例のマイクロ流路は、幅３４μｍ、高さ５０μｍのものを使用したが、作製する微小液滴の大きさや封入する１細胞の大きさによりマイクロ流路のサイズは適宜変更可能である。
　次に、第一流路（水相インレット）から腸内微生物懸濁液を導入し、第二流路及び第四流路（油相インレット）からＰｉｃｏ－Ｓｕｒｆ１（２％ｉｎ Ｎｏｖｅｃ７５００） (Sphere Fluidics社)（以下、「オイル」という）を導入して腸内微生物懸濁液をせん断することで、直径５０μｍの微小液滴を作製し、第三流路７を流動させて容量０．２ｍＬのチューブに回収した。微小液滴は、５００液滴／秒の速度で約４５万個作製した。微小液滴内の細胞濃度は、０．１ ｃｅｌｌｓ／ｄｒｏｐｌｅｔである。
　本実施例では、微小液滴の直径を５０μｍと均一にすることで、１細胞ずつ微小液滴に封入され易くしている。１細胞の大きさを考慮すると、微小液滴の直径は、例えば１～２５０μｍであり、１０～２００μｍであることが好ましい。
　チューブ内には複数の微小液滴とオイルが収容されるが、微小液滴はオイルよりも比重が軽いため上層に集積する。
　次に、チューブを氷上で１５分間冷却し、超低融点アガロースにより微小液滴をゲル化した。ゲル化した微小液滴がゲルカプセルである。微小液滴の直径が５０μｍであることからゲルカプセルの直径も５０μｍとなる。また、ゲルカプセルの直径は１～２５０μｍであることが好ましい。ゲルカプセルの直径を均一とすることにより、後述する溶菌試薬の各ゲルカプセル内への浸透率をより均一化することができる。
　次に、チューブに２０μＬの１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－パーフルオロ－１－オクタノール(SIGMA-ALDRICH社)を加え、下層のオイルを取り除いた後、アセトン(富士フイルム和光   純薬社)（５００μＬ）、イソプロパノール(富士フイルム和光純薬社)（５００μＬ）のを順に加えて遠心洗浄し、オイルの除去を行った。オイルを除去するための遠心洗浄は後述の除去部により行った。本実施例では、ゲルカプセルに浸透したオイルも夾雑物質に含まれるものとする。さらに、５００μＬのＰＢＳを添加して遠心洗浄を３回行い、ゲルカプセルを水層（ＰＢＳ）に懸濁した状態とした。ゲルカプセルは水層よりも比重が重いため下層に集積した。
　続いて、溶解用試薬としての溶菌試薬にゲルカプセルを順次浸漬し、ゲルカプセル内部で細胞の細胞壁等の収集目的物以外の部分を溶解し、ゲルカプセル内にゲノムＤＮＡを溶出させた。
　具体的には、チューブに溶菌試薬の１種であるリゾチーム（１０Ｕ／μＬ）（R1804M、Epicentre）を加え、細胞を溶解した。次に、チューブに溶菌試薬の１種であるアクロモペプチダーゼ（８５０Ｕ／ｍＬ）（015-09951、富士フイルム和光純薬社）を加えた。次に、チューブに溶菌試薬の１種であるプロテアーゼＫ（１ｍｇ／ｍＬ）（MC5005、Promega）及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．５％（71736-100ML、SIGMA-ALDRICH社） を加え、細胞を溶解した後に遠心洗浄を５回行いプロテアーゼ及び溶解した細胞のゲノムＤＮＡ以外の成分（夾雑物質）をチューブから除去した。続いて、溶菌試薬の１種である水酸化カリウムを含む水溶液であるＢｕｆｆｅｒ　Ｄ２（ＱＩＡＧＥＮ社)にゲルカプセルを浸漬し、残存成分の溶解とゲノムＤＮＡの変性を行った。本実施例で使用する溶菌試液は、上述のとおり、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼＫ、ドデシル硫酸ナトリウム及びＢｕｆｆｅｒ　Ｄ２であった。なお、水酸化カリウムは通常のＤＮＡ増幅反応工程でも使用するが、溶菌の効果も兼ねていることから、本実施例では溶菌試薬の一つとした。ゲルカプセルの溶菌試薬への浸漬は短時間であるため、溶出させたゲノムＤＮＡが溶菌試薬によりゲルカプセル外に流出されることはなく、ゲルカプセル内に保持される。本実施例では、ゲルカプセルに浸透した溶菌試薬も夾雑物質に含まれるものとする。
　本実施例は、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ及びプロテアーゼＫを順次加え、ドデシル硫酸ナトリウムを加えて細胞を溶解した後、ＢｕｆｆｅｒＤ２を入れる前にのみ遠心洗浄を行うことで十分な洗浄効果を得ることができる。しかしながら、各溶菌試薬により細胞を溶解した後に遠心洗浄を行ってもよい。
　このように、複数種類の溶菌試薬により細胞の溶解を行うことで、目的のゲノムＤＮＡを採取することができ、溶菌試薬への浸漬後に遠心洗浄を行うことで、溶菌試薬や溶解した細胞のポリヌクレオチド以外の成分等の夾雑物質を除去し、続くゲノムＤＮＡ増幅反応を阻害することのなくゲノムＤＮＡを精製することができる。
　水酸化カリウム溶液（Ｂｕｆｆｅｒ Ｄ２）中で変性したゲノムＤＮＡを保持するゲルカプセルを含むチューブに増幅用試薬を加え、ゲルカプセルを増幅用試薬に浸漬した。具体的には、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素であるｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いたＭＤＡ
（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を使用した。ここでは、全ゲノム増幅反応試薬ＲＥＰＬＩ－ｇＳｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｋ ｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社)に浸漬し、３時間の全ゲノム増幅反応を行った（S1000 サーマルサイクラー,Bio-Rad社）。増幅用試薬（ＲＥＰＬＩ－ｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｋ ｉｔ）には水酸化カリウム溶液（Ｂｕｆｆｅｒ Ｄ２）を中和する成分が含まれている。
　さらに、蛍光性ＤＮＡインターカレーター（SYBR　Green　I　nucleic　acid　gel　st ain　10,000　in　DMSO,　（S7563、Thermo       Fisher　Scientific社））による染色を行い、フローサイトメーター（BD　FACSMelody　セルソーター,BD　Biosciences）を用いて、各糞便由来のサンプル(n=2)から蛍光を示すゲルカプセルをプレート（PCR-96-FS-C、Axygen社）に94個ずつ個別に回収した（計188個）。
　回収した個々のゲルカプセルに対して６５℃で加熱を行う（S1000　サーマルサイクラー,Bio-Rad）ことによりゲルカプセルを溶解した後、各プレートのウェル内でＭＤＡ法（REPLI-g　Single　Cell　Kit,150345,QIAGEN）による二次増幅を実施し、各ウェルにつき10μLのDNA増幅産物を含むライブラリマスタープレートを作成した。
　新しいプレートの各ウェルに39μLのヌクレアーゼフリー水（UltraPure　DNase/RNase- Free　Distilled　Water,10977-015,Thermo　Fisher　Scientific）を分注し、ライブラリマスタープレート中のDNA増幅産物1μLを加え、ライブラリマスタープレートの40倍希釈溶液を調製した。次に、希釈液1μLを用いてQubitフルオロメーター（Q33226,Th ermo　Fisher　Scientific）Qubit　dsDNA　HS　Assay　Kit(Q32854,Thermo　FisherScientific)によるDNA濃度の定量を行った。また、希釈液1μLをテンプレートに用いて１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３Ｖ４領域を対象としたＰＣＲを行った（6.25μL　PrimeSTAR　Max　DNA　Polymerase(R045B,　タカラバイオ),　0.5μL　10μM　Primer　Forward　(5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’（配列番号１）),0.5μL　10μM　Primer　Reverse (5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’（配列番号２）),1.0μL DNA希釈液, 4.25μL UltraPure DNase/ RNase-Free Distilled Water(10977-015,  Thermo  Fisher  Scientific）（S1000 サーマルサイクラー,Bio-Rad）。PCRの反応条件は、初期熱変性を95℃, 5分、熱変性を9 8℃, 10秒、アニーリング51℃, 15秒、伸長反応を72℃, 5秒で27サイクル行い、72℃,5分の反応後、4℃で保存した。アガロースゲル電気泳動（泳動槽：Mupid-exU,　EXU-1,Mupid、マーカー：GeneRulerTM　1kb　DNA　Ladder,　#SM0318,　Fermentas、染色：Midori　Green　Direct,　NE-MG06,日本ジェネティクス、ローディングバッファー：6×LoadingBuffer, 9157, タカラバイオ）（泳動条件：100V, 15 min）によってＰＣＲ 産物の有無を確認後、増幅が見られたサンプルについてサンガー法（株式会社ファスマックのＤＮＡシーケンス外注サービス）を用いてシークエンス解析を行った。
（シングルセルレベルで得られたデータの解析）
（選抜条件）
　MDAによる増幅を行った188個のサンプルの内の96個を対象とし、本実施例では（１）MDA増幅後のDNA収量が200ng以上である、（２）１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のPCR後に増幅が確認される、の基準を設定し、DNA収量がその後の解析に十分であり、細菌由来物であることの基準を満たすサンプルの選抜を行った。サンプル選抜の結果、9５個のサンプルが選抜された。また、PCR産物のシーケンス解析により得られた配列情報に対してBLASTを用いた相同性検索（デフォルト条件）を行い、ライブラリマスタープレートに含まれる細菌の種類や数の情報を取得した。
　上記の95個のサンプルに対して、Ｎｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　ＤＮＡ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｐ　ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社,　FC-131-1096）を用いてライブラリー調製を行い、Ｍｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社,　SY-410-1003）を用いた全ゲノムシークエンスによって２×７５ｂｐのペアエンドリードを取得した。ＳＰＡｄｅｓ（Bankevich　A　et　al.,J　Comput　Biol.　2012　May;19(5):455-77.　http://doi.org/10.1089/cmb.2012.002 1)を用いてシークエンスデータのアセンブリを行い、Contigを作製した。また、ゲノム解読率(コンプリート率)およびコンタミネーション度の評価にはＣｈｅｃｋＭ（Ｐａｒｋｓ　ｅｔ　ａｌ.,　Genome　Res.　2015.　25:　1043-1055,　doi:10.1101/gr.186072.114）を用いてデフォルト条件で解析を行った。この結果、新鮮便サンプルで平均コンプリート率は37.8%、平均コンタミネーション率は1.3%、保存液便サンプルで平均コンプリート率は52.6%、平均コンタミネーション率は4.8%と算出された。
　さらに、ＣｈｅｃｋＭを用いて検出されたマーカー遺伝子群を参照して、各サンプルのゲノムデータから細菌の進化系統分類解析を行った。この結果、多くのデータが、腸内細菌の優先種として存在するFirmicutes門、Actinobacteria門、Bacteroidetes門、Proteob acteria門に由来することが示された。この様な系統分類に関する指標や16SrRNA遺伝子の同一性を参照して、細菌種を特定・カウントし、組成比を算出することが可能である。また、当該細菌のデジタル配列情報を解析することで、当該細菌の代謝機能解析、薬剤耐性遺伝子の保有、遺伝子変異の解析、既知細菌との比較、他検体との比較なども可能である。この工程は、例えば、ｂｌａｓｔなどの検索エンジンや、Ｅｎｓｅｍｂｌ等の解析ウェブサイトなどのほか、ＱＵＡＳＴ、ＣｈｅｃｋＭなどのアセンブリ評価ツール、Ｐｒｏｋｋａ、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ、ＤＦＡＳＴなどのアノテーションツール、ＭｅｔａＣｙｃ、ＭＡＰＬＥなどの代謝・生理機能ポテンシャル評価システムを用いて実施することができる。遺伝情報の解析の一連の流れとして、ｄｅｎｏｖｏアセンブリを行って得た遺伝情報に対し、ＱＵＡＳＴでアセンブリの実効性を評価し、ＣｈｅｃｋＭでゲノムセットとしての質評価を行う。その後、Ｐｒｏｋｋａなどのアノテーションツールを用いて、ゲノム中の遺伝子を同定し、ＭＡＰＬＥにて代謝経路としての保存性を評価する。ＰｆａｍおよびＣＯＧデータベースを用いて、各遺伝子の保存性や同一性を評価し、近縁種生物との比較ゲノム解析を実行する。
　より具体的には、遺伝子変異の単一細胞単位での評価を目的とした際は、標的遺伝子を対象とした（１）BLAST、hmmerを用いた単一生物由来遺伝子配列の相同性検索、もしくは、（２）BWA、bowtie2を用いた単一生物由来シーケンスデータのマッピングによって、単一生物由来遺伝子配列と標的遺伝子配列の差異を検出し、遺伝子変異を特定する。
　既知細菌との比較、他検体との比較、亜種の解析を目的とした場合は、Average Nucleotide IdentityおよびCheckM、GTDB-tkで検出されるシングルコピーマーカー遺伝子配列をもとに、同種微生物由来ゲノムと推定される単一生物由来遺伝子情報および既知微生物遺伝子情報を含んだゲノムセットを作成する。続いて、特定遺伝子の有無、遺伝子座、共通遺伝子配列の変異、など各ゲノム間の差異をBLAST、hmmerなどの相同性検索ツールによって特定・抽出する。特徴的なゲノム間差異に基づいたクラスタリングを行うことで、同種微生物の株レベルでの分類もしくは同株微生物の亜株レベルでの分類を行う。
　１つの局面において、本開示は、遺伝情報またはその他の生体分子の情報を細胞または細胞様構造物ごとに選別するための装置であって、Ａ）２つ以上の細胞または細胞様構造物に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該細胞または細胞様構造物ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する提供部と、Ｂ）該遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、該遺伝情報またはその他の生体分子の情報を該細胞または細胞様構造物ごとに選別する選別部と、Ｃ）必要に応じて、該選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する分析部とを備える、装置を提供する。１つの実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報が、核酸情報、タンパク質情報、脂質情報および糖鎖情報からなる群から選択される。特定の実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は核酸情報である。一部の実施形態において、提供部が、細胞または細胞様構造物に由来する核酸をシーケンシングして核酸情報を得る。一部の実施形態において、選別部が、特定の遺伝子配列の有無および／または特定の遺伝子配列との同一性を評価する。
　本開示は、遺伝情報またはその他の生体分子の情報を細胞または細胞様構造物ごとに選別する方法をコンピュータに実装するプログラムであって、該方法は、Ａ）２つ以上の細胞または細胞様構造物に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該細胞または細胞様構造物ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する工程と、Ｂ）該遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、該遺伝情報またはその他の生体分子の情報を該細胞または細胞様構造物ごとに選別する工程と、Ｃ）必要に応じて、該選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程とを包含する、プログラムを提供する。１つの実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報が、核酸情報、タンパク質情報、脂質情報および糖鎖情報からなる群から選択される。特定の実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は核酸情報である。一部の実施形態において、前記Ａ）が、細胞または細胞様構造物に由来する核酸をシーケンシングして核酸情報を得ることを含む。一部の実施形態において、前記Ｂ）が、特定の遺伝子配列の有無および／または特定の遺伝子配列との同一性を評価することを含む。
　本開示は、遺伝情報またはその他の生体分子の情報を細胞または細胞様構造物ごとに選別する方法をコンピュータに実装するプログラムを格納した記録媒体であって、該方法は、Ａ）２つ以上の細胞または細胞様構造物に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該細胞または細胞様構造物ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する工程と、Ｂ）該遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、該遺伝情報またはその他の生体分子の情報を該細胞または細胞様構造物ごとに選別する工程と、Ｃ）必要に応じて、該選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程とを包含する、記録媒体を提供する。１つの実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報が、核酸情報、タンパク質情報、脂質情報および糖鎖情報からなる群から選択される。特定の実施形態において、遺伝情報またはその他の生体分子の情報は核酸情報である。一部の実施形態において、前記Ａ）が、細胞または細胞様構造物に由来する核酸をシーケンシングして核酸情報を得ることを含む。一部の実施形態において、前記Ｂ）が、特定の遺伝子配列の有無および／または特定の遺伝子配列との同一性を評価することを含む。
　以下、スクリーニングで使用する個別の技術についてその好ましい実施形態とともに詳説する。
　（細胞中のポリヌクレオチド増幅方法）
　一つの局面において、本開示は、細胞中のポリヌクレオチドを増幅する方法を利用することができる。この増幅方法は、２つ以上の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物（ウイルス、小器官（Ｍｔ，Ｎｕｃ）等を含む））を含む試料を用い、該単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を１単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）単位ずつ液滴中に封入する工程と、該液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程と、該ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して前記単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を溶解する工程であって、該単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）中のポリヌクレオチドまたはその他の目的とする生体分子が該ゲルカプセル内に溶出し該ポリヌクレオチドまたはその他の目的とする生体分子に結合する物質が除去された状態で前記ゲルカプセル内に保持される、工程と、必要に応じて該ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させて該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程、あるいは必要に応じて該目的とする生体分子を分析する工程とを含む。本開示の一実施形態において、当該ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させて当該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程は、当該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内でゲル状態を保ちながら増幅することもできる。本開示で利用される増幅方法は、いわゆる単一生物単位（例えば、シングルセル）レベルでのゲノムまたはそれに類似する遺伝子集合物またはその他の生体分子集合物を個別に増幅し得るものである。本開示では、これらの核酸または他の生物分子は、個別に増幅または分析することができ、その増幅または分析は非常に簡便な手法で実現され得る。そのため、１００個単位、１０００個単位、１万個単位、１０万個単位あるいはそれ以上の単位の細胞について一時期にゲノム情報またはその他の生体分子情報を取得することができ、それゆえライブラリーとすることもできるものである。
　本開示で利用される方法における液滴中への封入工程は、下記（液滴生成）の項または他の項に詳述されている任意の実施形態を採用することができる。
　１つの実施形態では、本開示で利用される増幅方法において対象としうる細胞または細胞様構造物は、２つ以上の任意の数字であり、例えば、１０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１０００個以上、５０００個以上、１万個以上、５万個以上、１０万個以上、５０万個以上、１００万個以上、５００万個以上、１０００万個以上であり得る。
　本開示で利用される増幅方法において対象とし得る単一生物単位である、細胞または細胞様構造物は、（単一生物単位、細胞および細胞様構造物）の項に説明されている任意のものを採用することができる。１つの好ましい実施形態では、細胞が対象とされ得る。別の実施形態では、細胞様構造物が対象とされ、その中でも、ウイルス、あるいはミトコンドリア、核等の細胞小器官等を対象とすることができる。
　本開示で利用される増幅方法において、提供される細胞または単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を含む試料は、どのような形で提供されてもよい。試料に含まれる媒体は、（単位生物単位、細胞および細胞様構造物）の項から選択した任意の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）に対して適切な媒体（バッファー、塩、栄養素や他の成分等を含む）を選択することができる。このような成分としては、液滴生成に適した成分であればどのような成分を使用してもよい。ゲル化する際にも適切な成分であることが好ましい。そのような成分としては、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＴＥ、ＨＥＰＥＳなどの緩衝液のほか、滅菌水、海水、人工海水等を挙げることができるがこれらに限定されない。
　本明細書において、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を１単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ずつの液滴中への封入は、（液滴作製）の項に記載される任意の実施形態を採用することができる。代表的には、マイクロ流路を用い、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）の懸濁液をマイクロ流路中に流動させ、懸濁液をせん断することにより、１つずつの単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を封入した液滴を作製することができ、（液滴作製）での説明の他、実施例において例示される代表例を参考に、当業者は、適宜成分やパラメータを調製して実施することができる。
　本開示で利用される増幅方法において、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程は、下記（ゲル化）の項に記載される任意の実施形態を採用することができる。
　１つの実施形態では、ゲル化は、液滴あるいは液滴の材料（例えば、細胞または細胞様構造物を含む試料）にゲルカプセルの材料が含まれるように構成した作製した液滴を冷却することによって行うことができるし、あるいは、光等の刺激を与えることでゲル化させることもできる。
　ゲルカプセルの材料としては、下記（ゲル化）の項に記載される任意の材料を用いることができる。
　本開示において、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を溶解する工程は、ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して実現することができ、下記（溶解）の項目に記載される任意の実施形態を採用することができる。
　ここで、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を溶解する工程では、細胞中のポリヌクレオチドが該ゲルカプセル内に溶出しそのポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態でこのゲルカプセル内に保持されるように処理されることが重要である。本開示の一実施形態において、当該ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させて当該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程は、当該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内でゲル状態を保ちながら増幅することもできる。
　このように、ポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態を維持するためまたはポリヌクレオチドをゲルカプセル内でゲル状態を保ちながら増幅するためには、多種類の溶解剤を段階的あるいは同時に加えることで、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）の細胞壁・細胞膜構造あるいはその他の障壁を確実に破壊し、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）内に含まれるタンパク質、ポリヌクレオチドに結合する物質までを変性させることが必要である。溶解は細胞外層の破壊から段階的に試薬を加えて達成される。さらに、溶解操作後にゲルカプセル内に残存する溶解物および前記溶解試薬は、後段のポリヌクレオチド増幅を阻害するため、適切な洗浄液を用いてゲルカプセル内を通液させ、前記阻害物質をゲルカプセル外に放出する必要がある。これらの操作をゲルカプセル内で完遂するために、ポリヌクレオチドをゲルカプセル内に保持しながら、各種薬液と細胞溶解物の浸透・放出を達成するヒドロゲル構造を取る必要がある。ゲルカプセルを用いることにより、遺伝物質を保持したまま、残留試薬を希薄化することができる。このステップは繰り返すことも可能である。阻害が出ないレベルにまで試薬を希薄化することで、下流の操作、例えば、増幅反応をスムーズに行うことができる。
　本開示において、ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程は、ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させることにより実現することができ、下記（増幅）に規定される任意の実施形態を採用することができる。
　（液滴生成）
　本開示は、２つ以上の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を含む試料を用い、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を１単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ずつ液滴中に封入することを包含し得る。また、本開示において、装置は、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を１単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ずつ液滴中に封入する液滴作製部を備え得る。
　液滴作製は、例えば、マイクロ流路を用いて行うことができる。液滴作製部は、マイクロ流路を備え得る。単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）の懸濁液をマイクロ流路中に流動させ、懸濁液をせん断することにより、１つずつの単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を封入した液滴を作製し得る。せん断は、一定間隔で行い得る。懸濁液のせん断は、オイルを用いて行うことができる。オイルとしては、例えば、鉱物油（例えば、ライトミネラルオイル）、植物油、シリコーンオイル、フッ素化オイルを用い得る。懸濁液の濃度、流路中の流速、せん断の間隔を調整し、当業者は、液滴あたり１つ以上の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）が封入されないように液滴作製を行うことが可能である。
　液滴の直径は、約１～２５０μｍであってよい。例えば、液滴の直径は、約２０μｍ、約５０μｍ、約８０μｍ、約１００μｍ、約１５０μｍ、または約２００μｍであってよい。
　（ゲル化）
　本開示は、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程を包含し得る。また、本開示において、装置は、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成するゲルカプセル生成部を備え得る。液滴のゲル化は、液滴にゲルカプセルの材料が含まれるように構成し、作製した液滴を冷却することによって行うことができる。あるいは、液滴に対して光等の刺激を与えることによってゲル化を行うこともできる。液滴にゲルカプセルの材料が含まれるようにするには、例えば、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）の懸濁液にゲルカプセルの材料を含めておくことによって行うことができる。
　ゲルカプセルの直径は、約１～２５０μｍであってよい。例えば、ゲルカプセルの直径は、約１μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約５０μｍ、約８０μｍ、約１００μｍ、約１５０μｍ、約２００μｍまたは約２５０μｍであってよい。ゲルカプセルの直径は、作製する液滴と同じであってもよいが、ゲル化に際して直径が変化してもよい。前記ゲルカプセルがヒドロゲルカプセルであってもよい。
　ゲルカプセルの材料は、アガロース、アクリルアミド、光硬化性樹脂（例えば、ＰＥＧ－ＤＡ）、ＰＥＧ、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、マトリゲル、コラーゲンなどを含み得る。
　ゲルカプセルは、ヒドロゲルカプセルであってよい。本明細書において、「ヒドロゲル」とは、高分子物質またはコロイド粒子の網目構造によって保持されている溶媒あるいは分散媒が水であるものを指す。
　大量の細胞からまとめてＤＮＡを取り出す際などは、フェノール・クロロホルム抽出とエタノール沈殿によってＤＮＡを精製し得る。しかしながら、単一細胞からの遺伝物質の取得・分析を企図する場合、１細胞毎の遺伝物質の量は非常に微量であり、ロスなく個別に核酸のみの状態に変換する必要がある。単一細胞に対しては、一般的なバルクスケールでの手順で核酸精製を試みても、全く核酸が取り出せないか、あるいは、夾雑物由来の核酸しか抽出できない結果になる。１細胞実験ではコンタミは大きな問題となるが、単一の細胞または細胞様構造物を封入したゲルカプセルを用いることによって、精製した遺伝物質（例えば、ＤＮＡ）をゲルカプセル中に保持することができ、また、外部からの分子の夾雑の可能性を排除することができる。また、操作面でも非常に簡単な操作で、大量の１細胞を並列処理することができる。ゲル化した液滴を含む試験管を遠心し、上清を除去し、洗浄液に置換するというステップを行うことができる。ゲルカプセルを用いることにより、遺伝物質を保持したまま、残留試薬を希薄化することができる。このステップは繰り返すことも可能である。阻害が出ないレベルにまで試薬を希薄化することで、下流の操作、例えば、増幅反応をスムーズに行うことができる。
　本開示の１つの局面において、ゲルカプセルまたはその材料を含む組成物が提供され得る。上述または後述の点から、かかる組成物は、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）中の核酸またはその他の生体分子を単一生物単位（例えば、シングルセル）レベルで増幅または分析するために有用であり得る。また、かかる組成物は、ゲノムライブラリーを作製するために有用であり得る。さらなる実施形態において、ゲルカプセルまたはその材料と、シングルセル状態の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）とを含む組成物が提供され得る。上述または後述の点から、かかる組成物は、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）中の核酸をシングルセルレベルで増幅するために有用であり得る。また、かかる組成物は、ゲノムライブラリーを作製するために有用であり得る。かかる組成物は、単一生物単位（例えば、シングルセル）レベルで単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）中の核酸を配列決定するために有用であり得る。
　（溶解）
　本開示は、ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して前記単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を溶解することを包含し得る。また、本開示において、装置は、ゲルカプセルを溶解用試薬に浸漬する溶解用試薬浸漬部を備え得る。溶解の際、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）中のポリヌクレオチドまたはその他の生体分子がゲルカプセル内に溶出しポリヌクレオチドまたはその他の生体分子に結合する物質が除去された状態でゲルカプセル内に保持され得る。溶解用試薬には、例えば、酵素、界面活性剤およびｐＨ調節剤があり、それらの組み合わせもまた用いることができる。本開示の１つの局面では、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）中の核酸を単一生物単位（シングルセル）レベルで増幅するための、溶解用試薬を含む組成物が提供され得る。本開示の一実施形態において、当該ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させて当該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程は、当該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内でゲル状態を保ちながら増幅することもできる。
　溶解用試薬は、リゾチーム、ラビアーゼ、ヤタラーゼ、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ザイモリアーゼ、キチナーゼ、リソスタフィン、ムタノライシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、フェノール、クロロホルム、グアニジン塩酸塩、尿素、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ＴＣＥＰ－ＨＣｌ、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｂｒｉｊ－３５、Ｂｒｉｊ－５８、Ｔｗｅｅｎ　２０、Ｔｗｅｅｎ　８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ドデシル－β－Ｄ－マルトシド、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０、およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　３－１２からなる群から選択される少なくとも１つを含み得る。溶解用試薬は、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ドデシル硫酸ナトリウム及び水酸化カリウムからなる群から少なくとも１種選択される場合がある。
　単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）における一部の配列の有無を検出することのみを目的とする場合には、積極的な単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）の溶解を行う必要は必ずしもなく、物理的な刺激または熱的な刺激による、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）からの核酸の漏出に基づいて検出を行うことも可能である。しかしながら、ゲノム全域などの大量の情報を単一細胞から得るためには、積極的に単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を破壊し、その中の遺伝物質を完全な状態で細胞から単離することが好ましい。また、ゲルカプセルを用いている場合、熱的・機械的な刺激は、ゲルカプセルの崩壊につながるおそれもあり、溶解試薬を用いることが好ましい場合があり得る。溶解の後に、検出用の核酸プロープを反応させるＦＩＳＨなどの手法によりスクリーニングを行うことができる。
　多様な微生物について、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ごとに核酸の増幅または分析を行う場合、溶解試薬または溶解試薬の組合せとして、ある程度強力なものを用いることが望ましい。例えば、グラム陽性菌は厚いペプチドグリカン層を有する細胞壁を有するため、緩和なもののみでは細胞が十分に溶解できない可能性がある。この場合でも、溶解の後に、検出用の核酸プロープを反応させるＦＩＳＨなどの手法によりスクリーニングを行うことができる。
　強力な溶解試薬は、ＤＮＡ増幅等の反応を阻害する可能性があり、下流の反応の前に十分に除去されることが好ましい。ゲルカプセルを用いている場合には、ゲルカプセルによって解析または増幅の対象となる遺伝物質が保持されるため、遺伝物質が少量である単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）での解析においても溶解試薬の除去を行うことができ、そのため、強力な溶解試薬または溶解試薬の組合せを用いることが可能である。そして、強力な溶解試薬または溶解試薬の組合せを用いることは、多様な細胞（細胞壁を有するものやその他の種類の微生物を含む）の種類を問わず、網羅的な核酸の増幅またはゲノム解析を可能にし得る。方法は、ゲルカプセルから溶解用試薬および／または夾雑物質を除去する工程を含み得る。また、溶解用試薬浸漬部は、ゲルカプセルから溶解用試薬および／または夾雑物質を除去する手段を備える。この場合もまた、溶解の後に、検出用の核酸プロープを反応させるＦＩＳＨなどの手法によりスクリーニングを行うことができる。
　標的分子が細胞表面マーカーや核酸の一部であり、その存在自体を検知することが目的である場合には、溶解操作が部分的、あるいは溶解操作がなされなくても、目的を達成できる可能性がある。他方で、ゲノムＤＮＡの全長の増幅を企図する場合、ゲノムＤＮＡは、細胞中に１分子しか存在しないことが通常であるため、完全に細胞または細胞様構造物の溶解が進み、またＤＮＡから結合タンパク質類を十分に除去する必要がある。これにより、腸内微生物のような数百種以上の微生物からなる検体を対象とした際にも、そのすべてを均質に溶解し、その全てから全ゲノム増幅を行うことが可能となる。また、それにより、ライブラリー調製を行い、最終的に全ゲノム配列情報を得ることが可能となる。
　（増幅）
　本開示は、ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させてポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅することを包含し得る。また、本開示において、装置は、ゲルカプセルを増幅用試薬に浸漬する増幅用試薬浸漬部を備え得る。増幅用試薬浸漬部は、増幅用試薬への浸漬後、必要に応じて、ゲルカプセルの温度を調節するための手段を備え得る。増幅の後に、検出用の核酸プロープを反応させるＦＩＳＨや、増幅ポリヌクレオチドを検知するためのＤＮＡ結合性蛍光色素、Ｔａｑｍａｎプローブなどの手法によりスクリーニングを行うことができる。
　加熱処理（８０度以上）を伴う反応はゲル（例えば、アガロースゲル）の再溶解を招く可能性があるため、個別粒子化していた形状を崩壊させ、単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）での隔離を無効化してしまう場合がある。この場合、約６０度以下の酵素反応がゲル液滴形状を保つために望ましい。恒温鎖置換増幅反応（ｍｕｌｔｉｐｌｅ
　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、この温度の範囲内で実行可能であり、また、ゲノムＤＮＡ全域の増幅が可能である点で好ましい。用いる酵素としては、例えば、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ａａｃポリメラーゼ、リコンビナーゼポリメラーゼが挙げられる。
　特定の細胞（例えば、特定の微生物）またはその等価物を検出することを目的としたＰＣＲを実施する場合、その微生物に応じた特定プライマーを使用することが一般的である。しかしながら、ゲノム全体の増幅を行う場合には、ランダムプライマーを用いることが好ましい。
　ｍＲＮＡはゲノムＤＮＡを元に細胞内に数千から数万種存在し、個々の分子量も多い。このためＲＮＡを対象とした発現解析では、遺伝子の種類や発現量を絶対（相対）的に求めることが目的となるため、遺伝子の一部（数十塩基）だけを読み取って、どの遺伝子がどれだけ発現しているかを定量することが可能である。ゲノムＤＮＡを対象とする場合、原則的にゲノムＤＮＡは１細胞に１分子しか存在しないため、その１分子しか無い配列情報を漏らさず増やすことが、その数百万塩基の全てを解読するためには必要となり得る。ゲルカプセル中での処理は、そのような増幅にとって有利である。また、配列決定のための核酸を、１細胞から一部ずつの断片的な情報ではなく、全体として得られることはシングルセル解析において有利である。
　（単位生物単位、細胞および細胞様構造物）
　本開示において対象とする単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）は、特段限定されるものではないが、例えば、微生物（例えば、細菌、真菌、単細胞動物）、多細胞生物の細胞（例えば、体細胞、生殖細胞、培養細胞、腫瘍細胞）、細胞内器官（ミトコンドリア、核、葉緑体）、ウイルスが挙げられる。このほか、単一生物単位には、人工細胞などの人工物も含まれることが理解される。
　ゲノム配列既知の生物の細胞については、その中でどの遺伝子が発現しているかＲＮＡ
　を計測するという意図が発生し得るが、ゲノム配列および／または遺伝子の情報が未知の生物の解析の場合には、ＲＮＡ解析の前に、ゲノム自体の情報を得る必要がある。その場合には、ゲルカプセルを用いる本開示の方法による単一生物単位（例えば、シングルセル）レベルでのゲノム配列またはその他の生体分子の増幅または分析は有利である。
　本開示においては、２つ以上の単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）を含む試料を用いることができる。２つ以上の細胞は、複数の生物に由来するものであってもよい。試料として、例えば、微生物試料、組織試料、共生微生物および宿主生物の混合試料、動物・ヒト検体より取り出した微生物および細胞を含む試料が挙げられる。
　本開示において、対象とし得る微生物は、限定されるものではないが、真正細菌、大腸菌、枯草菌、藍色細菌、球菌、桿菌、ラセン菌、グラム陰性菌、グラム陽性菌、古細菌、真菌などが挙げられる。本開示で対象とし得る細菌は、例えば、Ｎｅｇｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｅ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｌｅｓ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘａｌｅｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｇｅｍｍａｔｉｓｐｏｒａｌｅｓ、Ｇｌｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｎｏｓｔｏｃｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｏｐｈｙｃｉｄａｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｎｏｓｔｏｃｏｐｈｙｃｉｄａｅ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ、Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａｌｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｂｅａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｉｇｎａｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｉｇｎａｖｉｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｉａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃｙｔｏｐｈａｇｉａ、Ｃｙｔｏｐｈａｇａｌｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｌｅｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅｓ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｏｐｉｔｕｔａｅ、Ｏｐｉｔｕｔａｌｅｓ、Ｐｕｎｉｃｅｉｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｓｐａｒｔｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒｉａ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｌｅｓ、Ｖｉｃｔｉｖａｌｌａｌｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ、Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａｌｅｓ、Ｋｏｒｄｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｓｎｅａｔｈｉｅｌｌａｌｅｓ、Ｋｉｌｏｎｉｅｌｌａｌｅｓ、Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌａｌｅｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｌｅｓ、Ｐｒｏｃａｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｈｒｏｍａｔｉａｌｅｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｔｈｉｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｅｌｌａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆａｒｃｕｌａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｅｐｓｉｌｏｎｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｎａｕｔｉｌｉａｌｅｓ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｈｏｌｏｐｈａｇａｅ、Ｈｏｌｏｐｈａｇａｌｅｓ、Ａｃａｎｔｈｏｐｌｅｕｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ａｑｕｉｆｉｃａｌｅｓ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｇｅｏｖｉｂｒｉａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉａ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃｉａ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａｌｅｓ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｉａ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｈｔｈｏｎｏｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｃｈｔｈｏｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄｉａ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｐｏｓｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａｌｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｎｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｅｎｔｏｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａｌｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｆｒａｎｋｉａｌｅｓ、Ｇｌｙｃｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｊｉａｎｇｅｌｌａｌｅｓ、Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａｌｅｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｌｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｌｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉａｌｅｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉａ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍａｌｅｓ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎａｌｅｓ、Ｈａｌｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓなどの細菌が挙げられる。また、それらのうちの複数が混在する試料において、細胞毎の網羅的な解析を行うことができる。
　上記の方法で、ゲルカプセルを１単一生物単位（例えば、細胞または細胞様構造物）ごとにマイクロプレートなどに分別収集する。さらに、プレート内で各ゲルカプセル中のポリヌクレオチドを鋳型として再増幅し、これをライブラリマスタープレートとする。ついで、ライブラリマスタープレート中の反応液の一部を分取し、レプリカプレートを調製する。本レプリカを鋳型として標的遺伝子特異的なプライマーセットで増幅を行う。方法（１）増幅物をサンガーシーケンスなどにより、配列を特定し目的の細胞や遺伝子を含むウェルをレプリカプレートから特定する。特定したウェルに相当するサンプルをマスタープレートから選択し、同サンプルを全ゲノムシーケンスに用いる。
　より効果的には、上記プライマーセットにバーコード配列を含ませて、各サンプルに異なるバーコードが付与される増幅反応を行い、複数レプリカプレート由来のＰＣＲ産物をプールして次世代シーケンスを行う。その後、バーコード配列でプレート・ウェル番号を特定するとともに、ＰＣＲ産物の配列を特定することで一挙に数百から数千のサンプルのスクリーニングが可能となる。なお、上記プライマーセットは複数の遺伝子領域を対象としたプライマーセットの混合物であってもよい。より具体的には、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のｖ３－ｖ４，　ｖ１－ｖ２領域などを対象としたものや、１８Ｓ　ｒＲＮＡ，　ＩＴＳ，　など細菌やアーキア、真菌などを見分けるプライマーセットから、特異的な酵素や二次代謝物生産に関わる遺伝子群を対象とした物、あるいは非微生物でホスト由来のＤＮＡやミトコンドリアなどを除去するためにこれらを検出するプライマーセットであってもよい。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
　以下、本開示の実施例を記載する。
　試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬、ナカライ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＣＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ＩＮＣ等）の同等品でも代用可能である。
　（実施例１：マウスの糞便内の微生物菌叢の検査）
　実験は、雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（７，　９週齢）（日本クレア株式会社）の糞便を容量１．５ｍＬのチューブ（１２１２－１０，　ＳＳＩｂｉｏ）に採取し（ｎ＝５）、５００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ，　１４１９０－１４４，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で破砕機を用いて固形物がなくなるまですり潰した。２，０００×ｇで２秒間遠心分離し（ｈｉｍａｃ　ＣＦ１５ＲＸ，　工機ホールディングス）、上清を回収する操作を２回繰り返した後、１５，０００×ｇで３分間遠心分離することでマウス腸内微生物を集菌した。菌体のペレットをＰＢＳを用いて２回遠心分離により洗浄した後、ＰＢＳ中に懸濁することでマウス腸内微生物の細胞懸濁液を取得した。調製した細胞懸濁液中の細胞濃度を測定し（顕微鏡：ＣＫＸ４１，　ＯＬＹＭＰＵＳ、バクテリア計算盤Ａ１６１，２－５６７９－０１，　アズワン）、終濃度１．５％になるように超低融点アガロース（Ａ５０３０－１０Ｇ，　ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）を加えることで、ゲルカプセル作製に用いる腸内微生物懸濁液を調製した（細胞終濃度：１．５×１０３ｃｅｌｌｓ／μＬ）。
　ポリジメチルシロキサン（Ｓｙｌｇａｒｄ　１８４：　Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を用いて自作したマイクロ流路２を用いて、微小液滴３の作製および微小液滴３内へのマウス腸内微生物１細胞４の封入を行った。図１に示すように、本実施例では、第一流路５、第二流路６、第三流路７及び第四流路８からなり、隣接する流路が直角に配置されたマイクロ流路２を用いたが、略Ｔ字状に接続したマイクロ流路２を使用することも可能である。本実施例のマイクロ流路２は、幅３４μｍ、高さ５０μｍのものを使用したが、作製する微小液滴３の大きさや封入する１細胞４の大きさによりマイクロ流路２のサイズは適宜変更可能である。
　次に、第一流路５（水相インレット）から腸内微生物懸濁液１を導入し、第二流路６及び第四流路８（油相インレット）からＰｉｃｏ－Ｓｕｒｆ１（２％　ｉｎ　Ｎｏｖｅｃ７５００）（Ｓｐｈｅｒｅ　Ｆｌｕｉｄｉｃｓ社）（以下、「オイル１０」という）を導入して腸内微生物懸濁液１をせん断することで、直径５０μｍの微小液滴３を作製し、第三流路７を流動させて容量０．２ｍＬのチューブ９に回収した。微小液滴３は、５００液滴／秒の速度で約４５万個作製した。微小液滴３内の細胞濃度は、０．１ｃｅｌｌｓ／ｄｒｏｐｌｅｔである。
　本実施例では、微小液滴３の直径を５０μｍと均一にすることで、１細胞４ずつ微小液滴３に封入され易くしている。１細胞４の大きさを考慮すると、微小液滴３の直径は、例えば約１～２５０μｍ、より好ましくは約１０～２００μｍであってよく、例えば、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約８０μｍ、約１００μｍ、約１５０μｍ、約２００μｍ、または約２５０μｍであってよい。
　図２に示すように、チューブ９内には複数の微小液滴３とオイル１０が収容されるが、微小液滴３はオイル１０よりも比重が軽いため上層に集積する。
　次に、チューブ９を氷上で１５分間冷却し、超低融点アガロースにより微小液滴３をゲル化した。ゲル化した微小液滴３がゲルカプセル１１である。微小液滴３の直径が５０μｍであることからゲルカプセル１１の直径も５０μｍとなる。また、ゲルカプセル１１の直径は例えば約１～２５０μｍ、より好ましくは約１０～２００μｍであってよく、例えば、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約８０μｍ、約１００μｍ、約１５０μｍ、約２００μｍ、または約２５０μｍであってよい。ゲルカプセル１１の直径を均一とすることにより、後述する溶菌試薬１３の各ゲルカプセル１１内への浸透率をより均一化することができる。
　次に、チューブ９に２０μＬの１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－パーフルオロ－１－オクタノール（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）を加え、下層のオイル１０を取り除いた後、アセトン（富士フイルム和光純薬社）（５００μＬ）、イソプロパノール（富士フイルム和光純薬社）（５００μＬ）のを順に加えて遠心洗浄し、オイル１０の除去を行った。オイル１０を除去するための遠心洗浄は後述の除去部２５により行う。本実施例では、ゲルカプセル１１に浸透したオイル１０も夾雑物質に含まれるものとする。さらに、５００μＬのＰＢＳを添加して遠心洗浄を３回行い、ゲルカプセル１１を水層（ＰＢＳ）１２に懸濁した状態とした。図３に示すように、ゲルカプセル１１は水層１２よりも比重が重いため下層に集積する。
　続いて、溶解用試薬としての溶菌試薬１３にゲルカプセル１１を順次浸漬し、ゲルカプセル１１内部で細胞４の細胞壁等の収集目的物以外の部分を溶解し、ゲルカプセル１１内にゲノムＤＮＡ１４を溶出させた。
　具体的には、チューブ９に溶菌試薬１３の１種であるリゾチーム（１０Ｕ／μＬ）（Ｒ１８０４Ｍ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を加え、細胞４を溶解した。次に、チューブ９に溶菌試薬１３の１種であるアクロモペプチダーゼ（８５０Ｕ／ｍＬ）（０１５－０９９５１、富士フイルム和光純薬社）を加えた。次に、チューブ９に溶菌試薬１３の１種であるプロテアーゼＫ（１ｍｇ／ｍＬ）（ＭＣ５００５、Ｐｒｏｍｅｇａ）及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．５％（７１７３６－１００ＭＬ、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）を加え、細胞４を溶解した後に遠心洗浄を５回行いプロテアーゼ及び溶解した細胞４のゲノムＤＮＡ１４以外の成分（夾雑物質）をチューブ９から除去した。続いて、溶菌試薬１３の１種である水酸化カリウムを含む水溶液であるＢｕｆｆｅｒ　Ｄ２（ＱＩＡＧＥＮ社）にゲルカプセル１１を浸漬し、残存成分の溶解とゲノムＤＮＡ１４の変性を行った。本実施例で使用する溶菌試液１３は、上述のとおり、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼＫ、ドデシル硫酸ナトリウム及びＢｕｆｆｅｒ　Ｄ２である。なお、水酸化カリウムは通常のＤＮＡ増幅反応工程でも使用するが、溶菌の効果も兼ねていることから、本実施例では溶菌試薬１３の一つとしている。ゲルカプセル１１の溶菌試薬１３への浸漬は短時間であるため、溶出させたゲノムＤＮＡ１４が溶菌試薬１３によりゲルカプセル１１外に流出されることはなく、ゲルカプセル１１内に保持される。本実施例では、ゲルカプセル１１に浸透した溶菌試薬１３も夾雑物質に含まれるものとする。
　本実施例は、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ及びプロテアーゼＫを順次加え、ドデシル硫酸ナトリウムを加えて細胞４を溶解した後、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｄ２を入れる前にのみ遠心洗浄を行うことで十分な洗浄効果を得ることができる。しかしながら、各溶菌試薬１３により細胞４を溶解した後に遠心洗浄を行ってもよい。
　このように、複数種類の溶菌試薬１３により細胞４の溶解を行うことで、目的のゲノムＤＮＡ１４を採取することができ、溶菌試薬１３への浸漬後に遠心洗浄を行うことで、溶菌試薬１３や溶解した細胞４のポリヌクレオチド以外の成分等の夾雑物質を除去し、続くゲノムＤＮＡ増幅反応を阻害することのなくゲノムＤＮＡ１４を精製することができる。
　水酸化カリウム溶液（Ｂｕｆｆｅｒ　Ｄ２）中で変性したゲノムＤＮＡ１４を保持するゲルカプセル１１を含むチューブ９に増幅用試薬１５を加え、ゲルカプセル１１を増幅用試薬１５に浸漬した。具体的には、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素であるｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いたＭＤＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を使用した。ここでは、全ゲノム増幅反応試薬ＲＥＰＬＩ－ｇ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）に浸漬し、３時間の全ゲノム増幅反応を行った（Ｓ１０００　サーマルサイクラー，　Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）。増幅用試薬１５（ＲＥＰＬＩ－ｇ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ）には水酸化カリウム溶液（Ｂｕｆｆｅｒ　Ｄ２）を中和する成分が含まれている。さらに、図５に示すように、蛍光性ＤＮＡインターカレーター（ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｇｅｌ　ｓｔａｉｎ　１０，０００　ｉｎ　ＤＭＳＯ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による染色を行い、フローサイトメーター（ＢＤ　ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ　セルソーター，　ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、各糞便由来のサンプル（ｎ＝５）から蛍光を示すゲルカプセルを９４個ずつ個別に回収した（計４７０個）。
　回収した個々のゲルカプセルに対して６５℃で加熱を行う（Ｓ１０００　サーマルサイクラー，　Ｂｉｏ－Ｒａｄ）ことによりゲルカプセルを溶解した後、各プレートのウェル内でＭＤＡ法（ＲＥＰＬＩ－ｇ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ，　１５０３４５　，ＱＩＡＧＥＮ）による二次増幅を実施し、各ウェルにつき１０　μＬのＤＮＡ増幅産物を含むライブラリマスタープレートを作成した。
　ここで、図６を参照して１細胞増幅ゲノムライブラリー１７の作製装置１８について説明する。作製装置１８は、マイクロ流路２により１細胞４を微小液滴３中に封入する液滴作製部１９を備えている。生成された微小液滴３はチューブ９に収容される。
　また、作製装置１８は、微小液滴３をゲル化してゲルカプセル１１を生成するゲルカプセル生成部２０を備えている。ゲルカプセル生成部２０は冷却部２１を有し、微小液滴３をチューブ９に収容した状態で冷却可能となっている。また、ゲルカプセル生成部２０は微小液滴３をチューブ９に収容した状態で紫外線を照射する紫外線照射部２２を有しており、光硬化性樹脂を使用してゲルカプセル１１を生成することもできる。なお、冷却部２１か紫外線照射部２２の何れか一方のみを有していてもよい。
　また、作製装置１８は、ゲルカプセル１１を収容したチューブ９に溶菌試薬１３を注入し、ゲルカプセル１１を溶菌試薬１３に浸漬させる溶解用試薬浸漬部２３を備えている。溶菌試薬１３は溶解用試薬注入部２４からチューブ９内に注入される。
　また、作製装置１８は、ゲルカプセル１１からオイル１０や溶菌試薬１３を含む夾雑物質を除去する除去部２５を備えている。除去部２５は遠心洗浄部２６を有し、ゲルカプセル１１を溶菌試薬１３に所定時間浸漬させた後、遠心洗浄部２６により溶菌試薬１３及び夾雑物質をゲルカプセル１１内及びチューブ９内から除去する。
　また、作製装置１８は、ゲルカプセル１１内に保持されたゲノムＤＮＡ１４を増幅させる増幅用試薬１５に浸漬する増幅用試薬浸漬部２７を備える。増幅用試薬１５は、増幅用試薬注入部２８からチューブ９内に注入される。
　また、作製装置１８は、所定以上に増幅したゲノムＤＮＡ１４を保持するゲルカプセル１１を選別する選別部２９を備える。選別部２９は、フローサイトメーター３０を有し、所定以上に増幅したゲノムＤＮＡ１４を保持するゲルカプセル１１を選別しプレート１６に回収する。なお、所定以上に増幅したゲノムＤＮＡ１４を保持しないゲルカプセル１１は他の容器３１に回収する。
　新しいプレートの各ウェルに３９　μＬのヌクレアーゼフリー水（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ　ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒ，　１０９７７－０１５，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を分注し、ライブラリマスタープレート中のＤＮＡ増幅産物１　μＬを加え、ライブラリマスタープレートの４０倍希釈溶液を調製した。次に、希釈液１　μＬを用いてＱｕｂｉｔフルオロメーター（Ｑ３３２２６，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｑｕｂｉｔ　ｄｓＤＮＡ　ＨＳ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｑ３２８５４，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　）によるＤＮＡ濃度の定量を行った。また、希釈液１　μＬをテンプレートに用いて１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３Ｖ４領域を対象としたＰＣＲを行った（６．２５　μＬ　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒ０４５Ｂ，　タカラバイオ），　０．５μＬ　１０　μＭ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｆｏｒｗａｒｄ　（５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ－３’（配列番号１）），　０．５μＬ　１０　μＭ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　（５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ－３’　（配列番号２）），　１．０μＬ　ＤＮＡ希釈液，　４．２５μＬ　ＵｌｔｒａＰｕｒｅ　ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒ（１０９７７－０１５，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Ｓ１０００　サーマルサイクラー，　Ｂｉｏ－Ｒａｄ）。ＰＣＲの反応条件は、初期熱変性を９５℃，　５分、熱変性を９８℃，　１０秒、アニーリング５１℃，　１５秒、伸長反応を７２℃，　５秒で２７サイクル行い、７２℃，　５分の反応後、４℃で保存した。アガロースゲル電気泳動（泳動槽：Ｍｕｐｉｄ－ｅｘＵ，　ＥＸＵ－１，　Ｍｕｐｉｄ、マーカー：ＧｅｎｅＲｕｌｅｒTM　１ｋｂ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ，　＃ＳＭ０３１８，　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、染色：Ｍｉｄｏｒｉ　Ｇｒｅｅｎ　Ｄｉｒｅｃｔ，　ＮＥ－ＭＧ０６，日本ジェネティクス、ローディングバッファー：６×　Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ，　９１５７，　タカラバイオ）（泳動条件：１００Ｖ，　１５　ｍｉｎ）によってＰＣＲ産物の有無を確認後、増幅が見られたサンプルについてサンガー法（株式会社ファスマックのＤＮＡシーケンス外注サービス）を用いてシークエンス解析を行った。
　（選抜条件）
　ＭＤＡによる増幅を行った４７０個のサンプルの内、本実施例では（１）ＭＤＡ増幅後のＤＮＡ収量が２００　ｎｇ以上である、（２）１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ後に増幅が確認される、の基準を設定し、ＤＮＡ収量がその後の解析に十分であり、細菌由来物であることの基準を満たすサンプルの選抜を行った。サンプル選抜の結果、４７０個のサンプル中３４７個（７４％）が選抜された。さらに、ＰＣＲ産物のシーケンス解析により得られた配列情報に対してＢＬＡＳＴを用いた相同性検索（デフォルト条件）を行い、ライブラリマスタープレートに含まれる細菌の種類や数の情報を取得した。本実施例では、ＢＬＡＳＴでの相同性検索の結果Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ（ラクノスピラ科）およびＢａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ（バクテロイデス科）に分類される１細胞増幅ゲノムライブラリーが多く確認され、１４７個がＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌、６８個がＢａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ細菌であった。結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記の３４７個のサンプルに対して、Ｎｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　ＤＮＡ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｐ　ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社，　ＦＣ－１３１－１０９６）を用いてライブラリー調製を行い、Ｍｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社，　ＳＹ－４１０－１００３）を用いた全ゲノムシークエンスによって２×７５ｂｐのペアエンドリード（３．９９Ｇｂ）を取得した。ＳＰＡｄｅｓ（Ｂａｎｋｅｖｉｃｈ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｃｏｍｐｕｔ　Ｂｉｏｌ．　２０１２　Ｍａｙ；１９（５）：４５５－７７．　ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８９／ｃｍｂ．２０１２．００２１）を用いてシークエンスデータのアセンブリを行い、Ｃｏｎｔｉｇを作製した。また、ゲノム解読率（コンプリート率）およびコンタミネーション度の評価にはＣｈｅｃｋＭ（Ｐａｒｋｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．　２０１５．　２５：　１０４３－１０５５，　ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１８６０７２．１１４）を用いてデフォルト条件で解析を行った。この結果、全測定サンプルの平均コンプリート率は３４．７％、平均コンタミネーション率は２．５％と算出された。
　さらに、（１）ＣｈｅｃｋＭを用いて検出されたマーカー遺伝子群を対象として、各サンプル間での塩基配列の相同性が９９％以上であること、（２）全Ｃｏｎｔｉｇの配列を対象として各サンプル間での相同性が９５％以上であること、の２つの条件を満たしたサンプルについては、同一種由来のゲノム情報としてまとめて解析を行った。ただし、ゲノム情報の統合には、ｃｃＳＡＧ（Ｋｏｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉ　Ｒｅｐ．　２０１８　Ｆｅｂ　１；８（１）：２０５９．　ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１８－２０３８４－３）を使用した。
　配列解析の結果、３４７個のゲノム情報から、コンプリート率：＞５０％を超える４４種類の腸内細菌由来のゲノム情報が獲得された（図１２）。
　国際基準Ｍｉｎｉｍｕｍ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｂｏｕｔ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｇｅｎｏｍｅ（ＭＩＳＡＧ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｂｔ．３８９３）の基準に順じて、コンプリート率（９０％以上）、コンタミネーション率（５％以下）をＣｈｅｃｋＭにて評価したところ、１５種類のサンプルはＨｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ　ｄｒａｆｔに分類されることが明らかとなった。このうち、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌は７種、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ細菌は４種であった（表２）。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
以上のように、作製したライブラリマスタープレートから、ＤＮＡ定量やＰＣＲの結果によってサンプルを選抜することにより、より効率的な１細胞ゲノム情報の獲得が可能になることが示された。
　（実施例４：多様な細胞の中から特定の特徴を有する細胞のデータを選択的に獲得したい場合）
　腸内細菌などの動物共生微生物や海洋・土壌微生物の中で、当業者が注目する特定の１種以上の微生物のゲノムデータを獲得することが目的であった場合には、ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルに対し、事前に標的とする微生物の遺伝子断片の有無を事前確認しておくことで、不要な遺伝子配列データ取得とそれにかかるコストを削減することができる。測定対象例としては、同一系統微生物の比較解析（例えば、疾患等に関連する微生物系統群における亜種の解析）や特定の遺伝子（例えば、微生物の生産する二次代謝産物や酵素）を有する微生物の探索、あるいは多系統の生物種を含む中から細菌・アーキア・真菌・その他真核細胞等を個別に選択して解析することなどを目的とした場合が想定される。
　（実施例５：ホスト動物由来のＤＮＡなどが多量に混在する場合）
　解析試料が、糞便、唾液、喀痰や皮膚、口腔、鼻腔、耳、生殖器などの拭い液、手術洗浄液、あるいは組織抽出物や血液であり、当該試料中に含まれる微生物を解析対象とした場合には、試料中に多くのホスト動物由来の細胞、細胞内小器官、核酸が含まれる。これらの一部も、ゲルカプセル内部に封入されポリヌクレオチド増幅が実行されうる。このため、増幅ポリヌクレオチドを含むゲルカプセルに対し、事前に標的とする微生物の遺伝子断片あるいはホスト由来の遺伝子断片の有無を事前確認しておくことで、ホスト由来のポリヌクレオチドを含む不要な遺伝子配列データ取得を避け、それにかかるコストを削減することができる。測定例としては、ヒト由来試料からの微生物検出、例えば、血液や喀痰からの病原性微生物の探索や組織内部に共生する微生物解析などが想定される。
　あるいは、ホスト由来のポリヌクレオチドを積極的に解析することで、目的とする微生物や他の細胞の解析と複合的な解析に応用することもできる。
　例えば、消化管に存在する腸内細菌叢と宿主動物は、宿主が消化管という細菌叢定着のための嫌気的環境を提供すると同時に、腸内細菌叢は宿主の健康に影響を及ぼすという共生関係を持つことが知られている。例えば、ホストの健康状態への影響として、大きなものは栄養素の産生と感染症に対する防御・免疫系の発達などが挙げられる。また、他の例を挙げると、炎症性腸疾患は、遺伝的素因に加え、腸内細菌を初めとする腸内環境因子の異常が相まって起こる疾患である。
　このような病態等については、ホスト自体の遺伝子情報等の解析と、腸内微生物叢、つまり細菌、ウイルス、真菌とを含めた統合的解析と、宿主生理機能への作用機序を明らかにすることが必要であり、本開示の技術はこれらに寄与し得る。また、腸内微生物叢と種々の疾患の病態との関わり。これは代謝産物を中心とした機能解析も、ホスト自体の遺伝子情報等も含めて解析することでより深化した解析を行うことができる。
　また、腸管においては、腸内細菌と生体側は栄養素を競合して取り合う関係である一方、生体のために腸内細菌は栄養素の代謝や分解も併せて行うことで、より統合的な解析を行うことができる。このように、腸内細菌に由来する代謝物がどのような働きを示すかについてはホスト側の、遺伝子解析、メタボローム解析や生化学的解析等も交えて複合的に解析し、腸内細菌の機能については細菌のゲノム配列情報から機能を類推し、生成する代謝物、メタボローム等種々のデータとの相関を見ることができる。
（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０１９年4月２６日に出願された、特願２０１９－８５８１９に対して優先権を主張するものであり、同出願の内容自体は具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
　本開示は、シングルセル解析を用いる産業において有用である。
配列番号１：１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３Ｖ４領域のＦｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ
配列番号２：１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３Ｖ４領域のＲｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ

Claims (33)

  1. 　単一生物単位を２つ以上含む集合から、該単一生物単位の遺伝情報またはその他の生体分子の情報に基づいて、単一生物単位を少なくとも１つを含むサブ集合を生成する工程を包含する、単一生物単位を含むサブ集合を生成する方法。
  2. 　Ａ）２つ以上の単一生物単位の各々を別々に提供する工程と、
    　Ｂ）該別々に提供された２つ以上の単一生物単位を、該単一生物単位に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報に基づいて選別する工程と、
    　Ｃ）必要に応じて、該選別された単一生物単位を、分析する工程と
    を包含する方法。
  3. 　前記Ａ）が、
    　（ａ）２つ以上の細胞または成分を含む試料を用い、液滴中に１つの細胞または細胞様構造物を封入することと、
    　（ｂ）該液滴をゲル化してゲルカプセルを生成することと、
    　（ｃ）該ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して該細胞または成分を溶解する工程であって、該細胞または成分中のポリヌクレオチドが該ゲルカプセル内に溶出し該ポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態で前記ゲルカプセル内に保持される、ことと、
    　（ｄ）該ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させて該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅することと
    を包含する、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記１つの細胞または細胞様構造物をマイクロ流路中に流動させ、オイルで前記懸濁液をせん断することにより該１つの細胞または細胞様構造物を封入した前記液滴が作製されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記ゲルカプセルがアガロース、アクリルアミド、ＰＥＧ、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、マトリゲル、コラーゲン又は光硬化性樹脂から形成されることを特徴とする、請求項３～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記溶解用試薬がリゾチーム、ラビアーゼ、ヤタラーゼ、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ザイモリアーゼ、キチナーゼ、リソスタフィン、ムタノライシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、フェノール、クロロホルム、グアニジン塩酸塩、尿素、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ＴＣＥＰ－ＨＣｌ、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４、ＮＰ－４０、Ｂｒｉｊ－３５、Ｂｒｉｊ－５８、Ｔｗｅｅｎ　２０、Ｔｗｅｅｎ　８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ドデシル－β－Ｄ－マルトシド、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０、およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　３－１２からなる群から少なくとも１種選択されることを特徴とする、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記ゲルカプセルがヒドロゲルカプセルであることを特徴とする、請求項３～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記遺伝情報またはその他の生体分子の情報が、核酸情報、タンパク質情報、脂質情報および糖鎖情報からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
  9. 　前記遺伝情報またはその他の生体分子の情報が、核酸情報である、請求項２に記載の方法。
  10. 　前記核酸情報が、特定の遺伝子配列の有無、特定の遺伝子の収量または全核酸収量から選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記特定の遺伝子配列の有無を、該特定の遺伝子配列を特異的に検出する試薬（核酸プローブなど）、分子量測定手段（アガロースゲル電気泳動、マイクロチップ電気泳動）、遺伝子増幅法（ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）、遺伝子配列決定（サンガーシーケンシング、ＮＧＳ）からなる群から選択される手段により検出する、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記特定の遺伝子配列を特異的に検出する試薬が、抗体、核酸プローブ、ＤＮＡ結合性蛍光色素、および蛍光色素結合ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記特定の遺伝子の収量または前記全核酸収量を吸光度測定、蛍光光度測定、アガロースゲル電気泳動およびマイクロチップ電気泳動により測定する、請求項１０に記載の方法。
  14. 　Ａ）２つ以上の単一生物単位に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該単一生物単位ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する工程と、
    　Ｂ）該遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、該遺伝情報またはその他の生体分子の情報を該単一生物単位ごとに選別する工程と、
    　Ｃ）必要に応じて、該選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程と
    を包含する方法。
  15. 　前記遺伝情報またはその他の生体分子の情報が核酸情報である、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記Ａ）が、細胞または細胞様構造物に由来する核酸をシーケンシングして核酸情報を得ることを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 　前記Ｂ）が、特定の遺伝子配列の有無および／または特定の遺伝子配列との同一性を評価することを含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　前記選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程は、疾患の可能性の分析、健康状態の診断、人物の特定、治療法の選択、微生物叢の分析、遺伝子変異の検出、病原菌の検出、薬剤候補物生産微生物の探索、産業用酵素生産微生物の探索、微生物製品保証および環境衛生評価からなる群から選択される分析を含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　遺伝情報またはその他の生体分子の情報を単一生物単位ごとに選別するための装置であって、
    Ａ）２つ以上の単一生物単位に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該単一生物単位ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する提供部と、
    Ｂ）該遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、該遺伝情報またはその他の生体分子の情報を該単一生物単位ごとに選別する選別部と、
    Ｃ）必要に応じて、該選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する分析部と
    を備える、装置。
  20. 　前記遺伝情報またはその他の生体分子の情報が核酸情報である、請求項１９に記載の装置。
  21. 　前記提供部が、細胞または細胞様構造物に由来する核酸をシーケンシングして核酸情報を得る、請求項１９または２０に記載の装置。
  22. 　前記選別部が、特定の遺伝子配列の有無および／または特定の遺伝子配列との同一性を評価する、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の装置。
  23. 　前記選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する分析部は、疾患の可能性の分析、健康状態の診断、人物の特定、治療法の選択、微生物叢の分析、遺伝子変異の検出、病原菌の検出、薬剤候補物生産微生物の探索、産業用酵素生産微生物の探索、微生物製品保証および環境衛生評価からなる群から選択される分析を行う、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の装置。
  24. 遺伝情報またはその他の生体分子の情報を細胞または細胞様構造物ごとに選別する方法をコンピュータに実装するプログラムであって、該方法は、
    Ａ）２つ以上の細胞または細胞様構造物に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該細胞または細胞様構造物ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する工程と、
    Ｂ）該遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、該遺伝情報またはその他の生体分子の情報を該細胞または細胞様構造物ごとに選別する工程と、
    Ｃ）必要に応じて、該選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程とを包含する、プログラム。
  25. 　前記遺伝情報またはその他の生体分子の情報が核酸情報である、請求項２４に記載のプログラム。
  26. 　前記Ａ）が、細胞または細胞様構造物に由来する核酸をシーケンシングして核酸情報を得ることを含む、請求項２４または２５に記載のプログラム。
  27. 　前記Ｂ）が、特定の遺伝子配列の有無および／または特定の遺伝子配列との同一性を評価することを含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のプログラム。
  28. 　前記選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程は、疾患の可能性の分析、健康状態の診断、人物の特定、治療法の選択、微生物叢の分析、遺伝子変異の検出、病原菌の検出、薬剤候補物生産微生物の探索、産業用酵素生産微生物の探索、微生物製品保証および環境衛生評価からなる群から選択される分析を含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載のプログラム。
  29. 遺伝情報またはその他の生体分子の情報を細胞または細胞様構造物ごとに選別する方法をコンピュータに実装するプログラムを格納した記録媒体であって、該方法は、
    Ａ）２つ以上の細胞または細胞様構造物に由来する遺伝情報またはその他の生体分子の情報を、該細胞または細胞様構造物ごとの遺伝情報またはその他の生体分子の情報の集合として提供する工程と、
    Ｂ）該遺伝情報またはその他の生体分子の情報の全部または一部に基づいて、該遺伝情報またはその他の生体分子の情報を該細胞または細胞様構造物ごとに選別する工程と、
    Ｃ）必要に応じて、該選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程とを包含する、記録媒体。
  30. 　前記遺伝情報またはその他の生体分子の情報が核酸情報である、請求項２９に記載の記録媒体。
  31. 　前記Ａ）が、細胞または細胞様構造物に由来する核酸をシーケンシングして核酸情報を得ることを含む、請求項２９または３０に記載の記録媒体。
  32. 　前記Ｂ）が、特定の遺伝子配列の有無および／または特定の遺伝子配列との同一性を評価することを含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の記録媒体。
  33. 　前記選別された遺伝情報またはその他の生体分子の情報分析する工程は、疾患の可能性の分析、健康状態の診断、人物の特定、治療法の選択、微生物叢の分析、遺伝子変異の検出、病原菌の検出、薬剤候補物生産微生物の探索、産業用酵素生産微生物の探索、微生物製品保証および環境衛生評価からなる群から選択される分析を含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の記録媒体。
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