CN112662752B

CN112662752B - 一种诊断用生物标志物的应用

Info

Publication number: CN112662752B
Application number: CN202110064427.8A
Authority: CN
Inventors: 李向东; 张珊珊
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2041-01-18
Also published as: CN112662752A

Abstract

本发明提供一种多囊卵巢综合征诊断用miRNA生物标志物，所述miRNA生物标志物为miR‑615‑5p。本发明检测PCOS病人和健康对照的壁层颗粒细胞、卵丘颗粒细胞和血清中miR‑615‑5p的表达，发现miR‑615‑5p水平显著降低。在人原代颗粒细胞和人卵巢颗粒细胞系KGN中过表达miR‑615‑5p促进颗粒细胞增殖和雌激素的产生。采用DHT(双氢睾酮)诱导小鼠多囊卵巢综合征小鼠模型，发现miR‑615‑5p在多囊卵巢综合征模型小鼠卵巢中低表达。本研究表明，miR‑615‑5p可以作为多囊卵巢综合征的生物标志物，为临床制药提供理论基础。

Description

一种诊断用生物标志物的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和疾病基因研究和诊断领域。具体的，本发明涉及多囊卵巢综合征(PCOS)的microRNA生物标记物，以及所述microRNA在制备用于诊断或检测多囊卵巢综合征的试剂盒或基因芯片的应用。

背景技术

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)影响6-8％的生殖年龄妇女，是最常见的内分泌疾病之一。该疾病最常见的临床表现是女性出现高雄激素血症，导致月经紊乱、稀少、闭经或不规则阴道出血、不孕、肥胖、多毛、子宫内膜过度增生及恶性变化、以及双侧或单侧卵巢呈多囊性改变并多伴有肥胖表型；在糖脂内分泌代谢方面出现胰岛素抵抗，继而引发糖尿病等并发症，远期并发症还包括心血管疾病和子宫内膜癌等。PCOS的临床表现存在异质性，在基础研究方面该病的相关机制研究一直是热点和难点。因此，进一步了解PCOS病理生理学的分子机制可能有助于鉴定新的诊断和治疗靶点。

miRNA是内源性长度约为21-25nt的非编码小RNA，对靶基因mRNA的降解和抑制起重要调控作用。miRNA作为潜在的组织特异性疾病的生物标志物，可为许多病理诊断提供有效措施。miRNA的异常表达与一些代谢紊乱(包括肥胖，糖尿病和PCOS等)有关，并且几项研究突出发现了miRNAs维持代谢体内平衡的功能。因此，miRNA是代谢过程的潜在调节因子，并且是调节PCOS和相关疾病相关复杂途径的有希望的靶标。

发明内容

本发明提供了表明多囊卵巢综合征(PCOS)的miRNA生物标记物。本发明提供了通过在样品，特别是颗粒细胞样品中检测所述生物标记物的miRNA的表达水平变化来检测或诊断PCOS的方法以及用于这些方法的试剂盒或基因芯片。

本发明提供的多囊卵巢综合征诊断用miRNA生物标志物，所述miRNA生物标志物为miR-615-5p。其成熟序列为：GGGGGUCCCCGGUGCUCGGAUC。

本发明还提供miR-615-5p在制备或筛选人多囊卵巢综合征的诊断及治疗药物中的应用。

本发明还提供miR-615-5p在制备人多囊卵巢综合征检测试剂中的应用。所述检测试剂选自用于southern印迹法、northern印迹法、PCR法、逆转录酶PCR法、实时定量PCR法、纳米阵列法、宏阵列法、放射自显影法或原位杂交法等方法检测生物标志物miR-615-5p的相关试剂。

本发明进一步提供一种多囊卵巢综合征诊断用试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种特异性检测miR-615-5p表达水平的引物和/或探针。

所述引物是基于实时定量PCR法检测miR-615-5p而设计的，所述引物序列如下：

miR-615-5p-RT:5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACCATCCGA-3’

miR-615-5p-F:5’-TGCACGGGGGTCCCCGGTGCTCG-3’

miR-615-5p-R:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3’

miRNA在女性生殖道卵巢、子宫、子宫内膜、输卵管以及胚胎发育过程中广泛表达，通过与其靶基因特异性结合，引起靶mRNA的降解或抑制其翻译。有关miRNA的研究完善和丰富了疾病发生、发展的分子生物学与遗传学机制。研究表明，过表达miR-615-5p促进颗粒细胞的增殖和雌激素的生成。miR-615-5p在颗粒细胞的低表达，导致颗粒细胞雌激素和卵泡膜雄激素分泌失调，引起多囊卵巢综合征。

本发明检测PCOS病人和正常人壁层颗粒细胞、卵丘颗粒细胞和血清中miR-615-5p的表达，发现miR-615-5p水平显著降低。颗粒细胞中过表达miR-615-5p促进颗粒细胞增殖，促进雌激素的产生。采用DHT(双氢睾酮)诱导小鼠多囊卵巢综合征模型，发现miR-615-5p在多囊卵巢综合征模型小鼠卵巢中低表达。可将miR-615-5p作为多囊卵巢综合征的生物标志物，为临床制药提供理论基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中来自健康对照(n＝8)，PCOS患者(n＝15)的壁层颗粒细胞中miR-615-5p的表达；

图2为本发明实施例1中来自健康对照(n＝16)，PCOS患者(n＝17)的卵丘颗粒细胞中miR-615-5p的表达；

图3为本发明实施例1中来自健康对照(n＝17)，PCOS患者(n＝16)的血清中miR-615-5p的表达；

图4为本发明实施例2中miR-615-5p超表达促进人原代颗粒细胞(hGC)雌激素的产生；

图5为本发明实施例2中miR-615-5p超表达促进KGN细胞系雌激素的分泌；

图6为本发明实施例3中PCOS模型小组，即DHT处理组后代成年雌鼠卵巢呈现多囊状；

图7为本发明实施例3中多囊卵巢综合征模型小鼠卵巢中miR-615-5p的表达量显著降低。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1miR-615-5p作为多囊卵巢综合征诊断用miRNA生物标志物中的应用

通过RNA提取、逆转录和实时(RT)-PCR，对miR-615-5p在人颗粒细胞中的表达进行定量分析。

1、根据制造商的说明，使用基于TRIzol的标准提取方案从人颗粒细胞中提取总RNA，使用NanoDrop 1000分光光度计对总RNA浓度进行定量，之后若不立即使用就保存于-80℃。

2、使用互补DNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific)在以下条件下进行RT：42℃持续90分钟，95℃持续5分钟，保持在4℃。miRNA的反转录是利用miRNA特异性的茎环结构(Stem-loop RT-Primer)作为引物来进行反转录。其内参为核内小RNAU6。U6的反转录引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-615-5p的反转引物为5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACCATCCGA-3’。

3、使用SYBR Green Master Mix Reagent(瑞士罗氏)在Roche LightCycler 480系统中扩增互补DNA。循环条件如下：在95℃变性10分钟，然后在95℃变性10秒，在60℃变性10秒，在72℃变性10次的40个循环。扩增引物如下：

U6-F:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；

U6-R:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；

miR-615-5p-F:5’-TGCACGGGGGTCCCCGGTGCTCG-3’；

miR-615-5p-R:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3’

所得数据用480software,Version 1.5进行分析。

分析结果显示，与对照组比较，PCOS患者壁层颗粒细胞、卵丘颗粒细胞和血清中的miR-615-5p的表达显著升高(图1-3)。

实施例2miR-615-5p在促进类固醇生成方面的影响

体外培养人原代颗粒细胞(hCG)和人卵巢颗粒细胞系(KGN)，分为miR-615-5p组和对照组，分别转染miR-615-5p(即miR-615-5p mimic，GGGGGUCCCCGGUGCUCGGAUC)和miR-NC，检测细胞上清中雌激素含量的变化。

1、miR-615-5p对颗粒细胞雌二醇分泌的影响

(1)细胞转染

使用Invitrogen公司生产的lipofectamine^TM 2000，按说明书操作(以6孔板，共A、B两组，每组一个孔为例，实际转染时每个处理组设置3个复孔)：

转染前24小时接种细胞(4×10⁵个/孔)，培养于含血清培养基，24小时后细胞贴壁率约为70％-80％；转染前2小时换无血清培养基；转染分以下A、B两组进行，C组为稀释的转染试剂。

A：100pmol miR-NC mimic(模拟物)+250μL无血清DMEM/F12培养基

B：100pmol miR-615-5p mimic(模拟物)+250μL无血清DMEM/F12培养基

C：5μL Lipofectamine^TM 2000+250μL无血清DMEM/F12培养基

以上两组预混液配好后吹打混匀，室温静置5分钟。分别将两组预混液与C组预混液等体积混合，得到约500μL转染试剂(小RNA混合液)，吹打混匀，室温孵育20分钟，每孔加入500μL上述配制的转染试剂，37℃培养箱中孵育6小时后，换成正常10％FBS DMEM/F12培养基继续培养18-48小时，然后观察结果。

(2)细胞激素测定

转染细胞培养48小时，收集培养液，送至北京北方生物技术研究所，以测定雌二醇含量。

通过测定发现，miR-615-5p促进人原代颗粒细胞及KGN细胞系雌激素的分泌(图4、图5)。

实施例3miR-615-5p在多囊卵巢综合征模型小鼠卵巢中表达降低体内实验：将10只孕期为16天的雌鼠随机分成两组。

对照组每天皮下注射200ul芝麻油，实验组每天皮下注射200ul含DHT(双氢睾酮)的芝麻油(其中DHT用量为250ug)，连续注射3天。收集后代成年雌鼠的卵巢，做石蜡切片，HE染色，观察卵巢结构。同时提取卵巢的RNA，检测miR-615-5p的表达情况。

成年C57雌鼠与雄鼠在前1天下午4点合笼，合笼比例为2:1，次日早上捡栓，有栓雌鼠为做好标记并分为两组，此时记为第1天。在见栓后16、17、18天对照组小鼠每天背部皮下注射200ul芝麻油，实验组小鼠每天背部皮下注射200ul含DHT(双氢睾酮)的芝麻油(其中DHT用量为250ug)，连续注射3天。2个月后，收集后代的雌鼠的卵巢，4％多聚甲醛固定48小时，流水冲洗6小时，包埋，做HE染色，显微镜下观察卵巢结构。

结果显示，与对照组相比，DHT处理组后代成年雌鼠卵巢呈现多囊状(图6)。

包埋步骤如下：

70％乙醇15min---80％乙醇15min---90％乙醇15min---95％乙醇15min---无水乙醇1 15min---无水乙醇2 15min---酒精/二甲苯(1:1)7min---二甲苯1 6min---二甲苯26min---石蜡1 18min---石蜡2 18min---石蜡3 18min。

上述无水乙醇1是指在第一个无水乙醇平皿中浸泡15分钟，然后取出放在第二个无水乙醇平皿中再浸泡15分钟。二甲苯、石蜡同理。

HE染色步骤如下：

二甲苯1 15min---二甲苯2 15min---酒精/二甲苯(1:1)5min---无水乙醇15min---无水乙醇2 5min---95％乙醇5min---80％乙醇5min---70％乙醇5min—苏木精12min---蒸馏水洗2min---盐酸酒精10s---蒸馏水洗2min---70％乙醇3min---80％乙醇3min---伊红60s---90％乙醇3min---95％乙醇3min---无水乙醇1 3min---无水乙醇23min---酒精/二甲苯(1:1)3min---二甲苯1 3min---二甲苯2 3min---封片。

提取卵巢总RNA，检测miR-615-5p的表达情况。

结果显示，在多囊卵巢综合征模型小鼠卵巢中miR-615-5p的表达量显著降低(图7)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种诊断用生物标志物的应用

<130> MP21000735Z

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggggucccc ggugcucgga uc 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggggucccc ggugcucgga uc 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uccgagcacc ggggaccccc uu 22

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtgcac tggatacgac catccga 47

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgcacggggg tccccggtgc tcg 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcaactggt gtcgtggagt c 21

Claims

1.多囊卵巢综合征诊断用miRNA生物标志物miR-615-5p在制备人多囊卵巢综合征检测试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂选自用于Southern印迹法、Northern印迹法、PCR法、逆转录酶PCR法、实时定量PCR法、纳米阵列法、宏阵列法、放射自显影法或原位杂交法检测生物标志物miR-615-5p的相关试剂。

3.多囊卵巢综合征诊断用miRNA生物标志物miR-615-5p在制备多囊卵巢综合征诊断用试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒包括特异性检测miR-615-5p表达水平的引物和探针。

4.根据权利要求3中所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括利用实时定量PCR法检测miR-615-5p的引物，所述引物序列如下：

miR-615-5p-RT:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGG ATACGACCATCCGA-3′

miR-615-5p-F:5′-TGCACGGGGGTCCCCGGTGCTCG-3′

miR-615-5p-R:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′。