KR102310302B1 - 엑소좀 기반 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로서 더 상세하게는 종래 바이오 마커 보다 우수한 특이도와 민감도로 부작용 없이 방광암을 효과적으로 진단할 수 있는 엑소좀 기반 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

Description

엑소좀 기반 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법{Method of providing information for diagnosing bladder cancer based on exosomes}
본 발명은 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 엑소좀 기반 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
방광암(bladder cancer)은 발병률이 꾸준히 증가하고 있는 전 세계적으로 10번째로 흔한 암으로 재발 및 진행이 흔하며 매우 다양한(heterogeneous) 예후를 보이는 것으로 알려져 있는데, 방광암 중 70~80%는 표재성 방광암으로 발견되고, 20~30%는 근침윤성 방광암으로 발견된다. 표재성 방광암은 수술로 종양을 완전 절제하여도 30~70%에 이르는 환자들에서 재발하고, 이 중 10~30%의 환자에서는 근침윤성 방광암으로 진행하여 매우 다양한 예후를 보인다. 근침윤성 방광암의 경우 근치적 방광적출술로 치료하여도 장기 종양 특이생존률이 50~60%로 매우 불량하다 (Sylvester, R.J. et al., Eur Urol, 49(3): p. 466-5; discussion 475-7. 2006). 현재 방광암의 진단 및 추적관찰에는 정기적인 방광경(Cystoscopy) 검사와 소변을 이용한 세포학적 검사를 이용하고 있으나 방광경 검사는 가장 확실한 검사법이지만, 암 종에 따라 민감도가 낮아, 상피내암(carcinoma-in-situ)이나 편평 병변(flat lesion)의 경우 종양의 재발을 놓칠 가능성이 있다. 또한 검사 자체가 환자에게 고통스러울 뿐만 아니라 검사 후 통증이나 빈뇨, 혈뇨 등의 불편함을 겪기 때문에 환자의 삶의 질을 크게 저하시키는 단점을 지닌다(Biardeau, X. et al., Can Urol Assoc J. 11(3-4): p. 104-110. 2017). 또한 요세포 검사(urine cytology)는 비침습적 진단방법이지만, 저등급 방광암에서 민감도가 매우 낮아 고등급 악성 종양이 있을 때 방광경 검사와 함께 보조적인 검사로 사용되고 있다. 이와 같이 방광암의 기존 진단 방법에는 제한점이 있기 때문에, 환자 입장에서 비침습적(non-invasive)이면서 방광암을 정확하게 진단할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
한편 세포외 소포(Extracellular Vesicles, EV)는 세포에서 분비되는 매우 작은 미세소포로 주로 크기와 생물학적 기원에 기초하여 크게 세 가지 유형으로 나눌 수 있다; (i) 직경 800 nm 이상의 세포가 세포사멸 중 분비하는 apoptotic bodies; (ii) 원형질막을 가지고 배출되는 지름 100~1,000 nm의 microvesicle; (iii) 직경이 50~100 nm의 세포 내 엔도솜에서 기원한 엑소좀(Ramirez, M.I., et al, Nanoscale, 10(3): p. 881-906. 2018). 상기 EV에는 세포에서 만들어진 DNA, mRNA, miRNA, non-cording RNA 및 단백질 등 여러 물질들이 포함되어 있으며, 그 표면에는 다양한 수용체와 리간드를 가지고 있는데 이러한 물질 구성은 EV를 분비하는 세포의 종류와 활성상태에 따라 달라지며 다양한 세포에서 분비되는 EV가 혈액, 복수, 소변 등의 인체 체액에 존재하는 것이 확인되었다. 특히 종양세포는 건강한 세포보다 더 많은 EV를 분비하는 것으로 알려져 있는데 암 환자의 혈장에서 건강한 사람에 포함된 양의 2배 정도 많은 EV가 확인되었다(Kalluri, R., J Clin Invest, 126(4): p. 1208-15. 2016). 종양세포에서 나오는 EV는 특정 종양 고유의 표지를 가질 수 있을 뿐만 아니라 종양 세포 주변의 미세환경 변화에 따라 다양한 세포에서 분비되는 EV 구성성분의 변화가 나타나기 때문에, EV는 잠재적 종양 생물지표(cancer biomarker)로 높은 관심을 받고 있다(Franzen, C.A. et al., J Urol, 195(5): p. 1331-1339. 2016).
그러나 상기 선행기술의 경우, 특이도와 민감도가 낮아 방광암 조기 진단에 적용하기에는 부적합하다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 종래 바이오 마커 보다 우수한 특이도와 민감도로 부작용 없이 방광암을 효과적으로 진단할 수 있는 엑소좀 기반 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 환자로부터 분리된 소변 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 상기 분리된 엑소좀 내의 A2M(alpha 2-macroglobulin) 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 엑소좀 기반 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법은 방광암 환자 유래 엑소좀을 이용하여 높은 민감도와 특이도로 부작용 없이 비침습적으로 방광암을 신속하고 정확하게 진단함으로써 방광암 환자 상태에 적합한 조기 치료에 활용할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명에서 사용한 EV 분리 방법 과정을 개략적으로 나타내는 개요도이다. 소변 샘플은 동일한 부피로 각각 다른 방법에 의해 분리되었다. (i) 분획 원심분리: 소변을 4 단계의 원심분리를 거쳐 EV를 분리했다. (ii)ExoLutE Exosome isolation kit from Rosetta Exosome: 소변 잔해물을 원심분리와 여과로 제거하고 크기배제 크로마토그래피를 포함한 프로세스로 EV를 분리했다. (iii) LabSpinner의 Exodisc: 원심분와 여과로 잔해물을 제거한 소변을 20 nm 크기의 나노 필터를 기반으로 하는 Exodisc에 적용했다.
도 2는 도 1의 각각 다른 방법을 사용하여 분리된 EV 입자의 수를 분석한 그래프이다. DC: 분획 원심분리를 사용하여 분리된 EV. eLutE: ExoLutE 엑소좀 분리 키트를 사용하여 분리된 EV. eDisc: LabSpinner의 Exodisc를 사용하여 분리된 EV. 데이터는 평균 ± SD, n = 3, ** p <0.01로 표시된다. 정상: 정상 소변. 환자: 환자의 소변.
도 3은 도 1의 각각 다른 방법을 사용하여 분리된 EV 입자의 크기를 분석한 그래프이다. DC: 분획 원심분리를 사용하여 분리된 EV. eLutE: ExoLutE 엑소좀 분리 키트를 사용하여 분리된 EV. eDisc: LabSpinner의 Exodisc를 사용하여 분리된 EV. 데이터는 평균 ± SD, n = 3, ns: 유의하지 않음. 정상: 정상 소변. 환자 : 환자의 소변.
도 4는 도 1의 각각 다른 방법을 사용하여 분리된 EV 크기 분포를 NTA (nanotracking analysis)로 분석한 그래프이다. 정상: 정상 소변. 환자: 환자의 소변.
도 5는 도 1의 각각 다른 방법을 사용하여 분리된 EV 단백질의 정량한 결과를 분석한 그래프이다. 단백질의 총량은 BCA를 사용하여 계산되었으며 10 mL의 소변에서 분리된 EV를 기반으로 표시된다. DC: 분획 원심분리를 사용하여 분리된 EV. eLutE : ExoLutE 엑소좀 분리 키트를 사용하여 분리된 EV. eDisc: LabSpinner의 Exodisc를 사용하여 분리된 EV. 데이터는 평균 ± SD, n = 3, ** p <0.01로, ns: 유의하지 않음으로 표시된다.
도 6은 본 발명의 EV 마커의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내는 겔 사진이다. 각 방법에 의해 분리된 동일한 부피의 EV를 겔에 로딩하고 EV 마커를 웨스턴 블롯팅으로 분석했다.
도 7은 용해(lysis) 또는 비-용해(non-lysis)된 소변 EV에 대한 단백질 어레이 결과를 나타내는 사진이다. 동일한 양의 소변 EV 단백질을 Proteom Profiler 항체 어레이에 적용했다: 인간 가용성 수용체 항체 어레이, 비 조혈 및 일반 분석물 패널. EV 전처리 방법에 따른(비 용해-용해) 단백질 어레이 분석의 결과를 나타내고 있다. 수술-전 및 수술-후: 수술-전 또는 수술-후 방광암 환자의 소변 EV, 고등급 및 저등급: 고등급 또는 저등급 방광암 환자의 소변 EV. 비용해 및 용해: 비 용해 또는 용해된 소변 EV.
도 8은 용해 또는 비-용해된 샘플을 사용한 소변 EV에 대한 단백질 어레이데이터 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 일반 분석물(A) 및 비-조혈(non-hematopoietic)(B) 인간 가용성 수용체 항체 어레이에 대한 데이터 분석 결과이다. 각 단백질의 신호 값(Pre-OP/Post-OP)에 대한 폴드 비율은 Y축에 표시되었다. 표시된 번호는 어레이 패널의 스팟 사이트이다. 수술-전 및 수술-후: 수술-전 또는 수술-후 방광암 환자의 소변 EV, 고등급 및 저등급: 고등급 또는 저등급 방광암 환자의 소변 EV. 비용해 및 용해: 비 용해 또는 용해된 소변 EV.
도 9는 CD9 양성 소변 EV에 대한 단백질 어레이 데이터 분석 결과를 나타내는 그래프이다. Exodisc 방법으로 분리된 소변 EV는 항-CD9 항체가 결합된 자성비드로 다시 분리되었다. 동일한 양의 소변 EV 단백질을 Proteom Profiler 항체 어레이에 적용했다: 인간 가용성 수용체 항체 어레이, 비 조혈 및 일반 분석물 패널. 다양한 조건의 소변 EV를 사용한 단백질 어레이 분석의 결과. 수술-전 및 수술-후: 수술-전 또는 수술-후 방광암 환자의 소변 EV, 고등급 및 저등급: 고등급 또는 저등급 방광암 환자의 소변 EV. Non-captured: Exodisc 방법으로만 분리된EV. CD9 captured: Exodisc 및 항-CD9 항체 결합 자성비드에 의해 분리된 EV.
도 10은 CD9 양성 소변 EV에 대한 단백질 어레이 데이터 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 일반 분석물(A) 및 비-조혈(non-hematopoietic)(B) 인간 가용성 수용체 항체 어레이에 대한 데이터 분석 결과이다. 각 단백질의 신호 값 (Pre-OP/Post-OP)에 대한 폴드 비율은 Y 축에 표시되었다. 표시된 번호는 어레이 패널의 스팟 사이트이다.
도 11은 인간 가용성 수용체의 일반적인 분석물에 대한 단백질 어레이 데이터 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 각 단백질에 대한 수술 전 신호와 수술 후 신호 사이의 폴드 비율을 분석했다. 데이터는 평균 ± SD, n = 2, * p < 0.05로 표시된다.
도 12는 비-조혈 인간 가용성 수용체에 대한 단백질 어레이 데이터 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 각 단백질에 대한 수술 전 신호와 수술 후 신호 사이의 폴드 비율을 분석했다. 데이터는 평균 ± SD, n = 2, * p < 0.05, ** p < 0.01로 표시된다.
도 13은 방광암 환자의 소변 EV에 대한 A2M의 농도 및 분포를 ELISA로 분석한 것으로 a)는 정상 및 방광암 환자군의 A2M의 농도 및 분포를 분석한 그래프이고 b)는 저등급 및 고등급 방광암 환자군의 A2M의 농도 및 분포를 분석한 그래프이다. a)는 *p < 0.015이고 b)는 p = 0.052이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 "방광암(bladder cancer)"은 방광에 생기는 악성종양으로 비뇨기계 종양 중 전립선암 다음으로 높은 사망률을 보이고 90% 이상은 이행상피세포암이며, 그 가운데 60% 정도는 저등급 분화도의 표재성 방광암이다. 하지만 경요도절제술을 시행한 경우 재발이 빈번하며 16-25% 정도는 고등급 분화도의 암으로 진행하고 또한 10%의 경우에서는 병기의 진행 및 종양의 전이가 발생한다. 이러한 잦은 재발과 병기의 진행은 방광암 환자 및 비뇨기과 의사에게 자주 제기되는 문제점이며, 따라서 방광암의 재발을 예방하고 침윤성으로 진행되는 것을 억제하는데 더욱 효과적인 예후 지표의 발견이나 치료법의 개발이 필요한 실정이다.
본 문서에서 사용되는 "엑소좀(exosome)"은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭으로 직경은 대략 30-100 ㎚인 것으로 보고되어 있다. 엑소좀은 원형질막(plasma membrane)으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포내 특정 구획에서 기원하여 세포 밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면 그러한 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데 이것을 엑소좀이라고 부른다. 엑소좀이 어떤 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나 정상 상태 및 병적 상태 모두에서 다수의 세포 유형으로부터 분리되어 방출된다고 알려져 있다.
본 문서에서 사용되는 "A2M(alpha 2-macroglobulin)"은 혈액에서 발견되는 큰(720 KDa) 혈장 단백질로 주로 간에서 생성되며 대식세포, 섬유아세포 및 부 신피질 세포에 의해 국부적으로 합성된다. 인간에서는 A2M 유전자에 의해 암호화되고 항 프로테아제(antiprotease) 역할을 하여 매우 다양한 단백질 분해 효소를 비활성화 할 수 있으며 플라스민(plasmin)과 칼리크레인(kallikrein)을 억제하여 섬유소 용해 억제제로 기능한다.
본 문서에서 사용되는 "CDH13(Cadherin-13)"은 H-cadherin, T-cadherin 이라고도 하며,'cell to cell' adhesion에 중요한 역할을 하며, 종양세포의 증식과 전이를 억제하는 유전자로 알려져 있으나, 방광암 환자와 대조군을 비교한 연구에서 방광암을 포함한 일부 암에서 CDH13 methylation이 근침윤성 방광암 환자에서 비 근침윤성 방광암 환자에서 보다 높게 나타나 다발성 종양 및 고등급 방광암, 근침윤성 방광암 환자에서 CDH13 인산화가 방광암의 재발을 예측할 수 있는 생체 표지자로서의 가능성을 밝혔다(Chen, F. et al., BMC Urol, 16(1): p. 52. 2016).
본 문서에서 사용되는 "CLU(clusterin)"은 세포 부착과 세포자멸에 관여하고 엑소좀에 존재하며 종양세포의 성장에 도움을 주며 암 발생과 전이에 영향을 미치는 단백질로 결장, 방광, 간, 신장세포 암 등의 전이성 암세포에서 과발현 되고, 침습성 종양에서 clusterin 발현 증가는 전이에 중요한 요소로 알려져 있다(Wang, C. et al., Int J Biochem Cell Biol, 44(12): p. 2308-20. 2012).
본 문서에서 사용되는 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징, 즉 암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미한다. 또한, "예후"는 암 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 여부를 판단하는 것을 의미한다. 이는 개체의 시료로부터 분리된 엑소좀 내 A2M의 발현 수준을 측정함으로써 해당 개체의 암 발병 여부만이 아니라, 향후 해당 개체의 생존 예후가 좋은 지 여부에 대해서 예측하는 개념까지 포함할 수 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 환자로부터 분리된 소변 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 상기 분리된 엑소좀 내의 A2M(alpha 2-macroglobulin) 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법이 제공된다.
상기 정보 제공 방법에 있어서, 측정된 A2M의 농도가 0.625 ng/ml 이상일 경우 방광암에 걸렸을 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있고 상기 엑소좀을 분리하는 단계는 분획원심법(Differential centrifugation), 크기배제 크로마토그래피 또는 나노필터 여과법으로 수행될 수 있으며 상기 나노필터 여과법은 10 내지 30 nm의 공극을 갖는 나노필터를 이용하여 수행될 수 있다.
상기 정보 제공 방법에 있어서, 상기 A2M 단백질의 농도는 질량분석법(masss-pectrometry), 웨스턴 블랏(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay) 또는 단백질 어레이(protein array)를 이용하여 수행될 수 있고 상기 웨스턴 블랏, ELISA, 면역침전분석법 또는 단백질 어레이는 상기 A2M 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 기능성 단편, 또는 항체 유사체를 이용하여 수행될 수 있다.
상기 정보 제공 방법에 있어서, 상기 항체의 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, di-scFv, sdAb, VHH 또는 VNAR일 수 있고 상기 항체 유사체는 애필린(Affilin), 애피바디(Affibody), 애피머(Affimer), 애피틴(Affitin), 알파바디(Alphabody), 앤티클린(Anticlin), 아비머(Avimer), 다르핀(DARpin), 피노머(Fynomoer), 쿠니츠 도메인 펩타이드(Kunitz domain peptide), 모노바디(monobody), 가변 림프구 수용체(VLR), Minibody, Diabody, Tetrabody, Triabody, 또는 Peptabody일 수 있으며 상기 방광암은 고등급 방광암일 수 있다.
본 발명에서 단백질의 발현 수준 측정은 암의 진단 또는 예후 예측을 위하여 생물학적 시료에서 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 엑소좀 표면의 A2M(alpha 2-macroglobulin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용해 단백질의 양을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(O-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다. 바람직하게는 개체의 시료로부터 본 발명의 엑소좀 발현 수준을 확인함으로써 해당 개체의 암 발병 여부뿐만 아니라, 향후 해당 개체의 생존 예후가 좋을지 여부에 대해서까지 예측할 수 있다.
상기 엑소좀의 발현 수준을 확인하는 방법은 웨스턴 블랏(Western blot), 효소면역분석법(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Ouchterlony) 면역 전기영동, 조직면역 염색, 면역 침전 분석(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS(Flow Cytometry) 및 단백질 칩(protein chip)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 웨스턴 블랏은 하기와 같은 방법으로 수행될 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 단백질의 양을 확인하여, 암의 진단 및 예후를 예측할 수 있다. 상기 검출 방법은 정상 대조군에서의 엑소좀의 발현양과 암 의심개체에서의 엑소좀의 발현양을 조사하는 방법으로 이루어진다. 단백질 수준은 상기 엑소좀의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대강도) 차이로 나타낼 수 있다. 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA 및 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA를 포함하는 다양한 ELISA 방법을 의미한다. 구체적으로, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나, 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다. 다만, 이러한 검출 방법에 제한되지 않는다.
방광암의 진단에 있어 소변에서 유래된 세포외 소포(Extracellular vesicles, EV)의 단백질 표지자들은 비침습적으로 분석 및 활용이 가능한 대상이지만, 소변에서 단백질 선별 검사에 필요한 충분한 양의 EV를 추출하는 방법이 우선 확보되어야 한다. 이에 본 발명자들은 방광암 환자에서 EV 단백을 추출하는 방법을 정립하였고, 단백질 어레이 방법을 통해 방광암 환자에서 유의하게 상승하는 소변 EV 단백을 발굴하였다. 구체적으로 본 발명에서는 먼저 EV 단백 추출에 효율적이라고 보고된 새로운 두 가지 방법(Rosetta exosome사의 ExoLute urine kit 및 LabSpinner사의 ExoDisc)을 전통적으로 EV 분리에 가장 널리 사용되는 차등원심분리 방법과 비교 분석하여, EV 단백 추출에 효과적인 방법을 비교분석 하였다. Exodisc를 이용하여 분리한 경우, 소변 EV의 입자수는 차등원심분리 방법으로 분리한 것보다 약 9.4배 많았고, 단백질의 약 7배 정도의 많은 양이 추출되었다. EV 단백질 추출에 가장 유리한 방법으로 평가된 ExoDisc 방법을 이용해 방광암 환자의 수술 전-후 소변에서 EV를 분리하고, 분리된 EV의 단백질 어레이(protein array) 분석을 진행하여 진단 표지자로써의 가능성을 평가하였다. EV 단백질 샘플을 단백질 어레이 적용을 위해 최적화하는 과정을 수행하였고, 4명의 방광암 환자를 대상으로 수술 전후의 소변 EV를 단백질 어레이에 적용한 결과, 저등급 방광암 환자의 수술 전-후 소변에서 분리된 EV에서는 발현에 유의하게 차이가 있는 단백질이 없었으나, 고등급 방광암 환자의 경우 alpha 2-macroglobulin(A2M), cadherin-13(CDH13), clusterin(CLU) 등 세 가지 단백질의 발현이 수술 전-후 유의하게 차이나는 것을 확인하였다. 가장 많은 차이를 보였던 A2M의 진단적 가치를 검증하기 위해 비암대조군, 저등급 방광암 환자군, 고등급 방광암 환자군 각 20명씩 총 60명의 소변 EV를 분리하여 A2M에 대한 효소면역정량법(Enzyme Linked Immunosorbent assay, ELISA)를 진행한 결과 비암대조군의 소변 EV에서는 A2M이 전혀 검출되지 않았고, 저등급 방광암 환자군에서 70%, 고등급 방광암 환자군에서 90%의 A2M 검출률을 확인하였다.
구체적으로 본 발명에서는 인간 소변 검체를 대상으로 하여 소변으로부터 EV를 분리하여 단백질 어레이 분석에 적용하는 최적의 방법을 확립하고, 방광암 환자에서 수술 전후의 소변 EV 단백질을 대상으로 확립된 방법을 적용하여 통계적으로 차이가 있는 몇 가지 표지자를 확인하였으며, 임상에서 얻은 60명의 소변 검체를 이용해 선별된 EV 단백질에 대한 유효성을 평가하여 최종적으로 소변 EV를 이용한 진단적 가능성을 검증하였다. 종양 환경에서 EV는 암과 주변 미세환경 간의 통신을 통해 암 진행의 여러 단계에 영향을 미치고 결과적으로 종양 변형, 증식, 이동, 침입 및 혈관 신생을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Xue, M., et al., Mol Cancer, 16(1): p. 143. 2017). 현재 암 진단에 EV가 활발하게 연구되고 있는데, 종래 연구에 따르면 BC환자 129명과 대조군 62명의 소변 엑소좀을 수집하여 MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight) 단백질체 분석을 통해 Alpha-1 antitrypsin (SERPINA1)과 Histone H2B 1-K (H2BIK)이 대조군에 비해 약 2.9배, 4.8배 높게 나오는 것을 확인하고, 조직 표본에서 면역화학염색(Immunohistochemistry, IHC)을 통해 정상 요로 표피보다 방광암 조직에서 IHC 발현 점수가 높게 나오는 것을 확인하여 소변 EV에서 발현되는 SERPINA1과 H2B1K가 요로상피세포 암의 진단과 예후를 예측가능한 표지자로서의 가능성을 보고하였다(Lin et al., Sci Rep, 6: p. 34446. 2016). 비뇨기암에서 EV의 역할에 대해서 지금까지 보고된 연구결과를 하기 표 8에 정리하였다. 본 발명에서 소변 EV 분리 방법의 최적화를 위해 differential centrifugation(DC), ExoLute urine kit (eLute), ExoDisc(eDisc) 이렇게 세 가지 방법으로 소변으로부터 EV를 분리하여 단백질 정량과 나노입자추적분석, 웨스턴 블롯을 진행하여 EV 분석을 진행한 결과 eDisc 방법으로 분리한 EV의 수율이 다른 방법으로 분리된 EV에 비해 유의하게 높은 것을 확인하였다. 방광암 환자의 수술 전과 수술 후 3개월에 소변을 수집하여 EV를 분리하고 수술 전-후 EV 단백질의 차이를 알아보기 위해 단백질 어레이를 진행한 결과. 고등급 방광암 환자의 소변 EV에서 수술 전-후에 약간의 차이를 보였고 용해시키지 않은 것에 비해 용해시킨 EV의 발현이 더 약하게 나타났으나, 기준점(reference spot) 발현정도의 차이에 따른 결과로 볼 수 있으며, 용해 유무에 따라 수술 전-후에 차이가 나는 단백질 결과는 달라지지 않아 두 조건 모두 단백질 분석에 적용할 수 있음을 확인했다. 또한 방광 상피세포에 특이적인 CD9+ EV 분리 후 단백질 분석 진행 결과 저등급 환자의 EV는 CD9+ 전 후 모두에서 결과에 차이가 없었고, 고등급 환자에서 분리한 EV의 경우 CD9+ 분리 전 단백질 어레이에서 차이가 있는 단백질이 있었으나, CD9+ EV 분리 후 대부분의 단백질에서 분리 전에 비해 차이가 다소 감소하는 결과를 보여 anti-CD9 항체와 결합된 자기 비드(magnetic beads)로 CD9+ EV를 분리하는 것은 방광암 소변 EV에서 단백질 표지자를 검사하는데 유용하지 않은 방법임을 확인하였다.
본 발명자들은 상기 진행된 실험을 통해 EV를 분리하고 단백질 분석을 위한 EV 전처리 방법을 확립하고, 단백질 분석을 진행하여 고등급 방광암 환자의 수술 전 EV에서 수술 후에 비해 alpha 2-macroglobulin(A2M)의 발현이 유의하게 더 높게 발현되는 것을 확인하였다. A2M은 혈액 및 체액에 존재하는 가장 큰 혈장 단백질 중 하나로 A2M이 방광암 환자의 혈뇨와 관련이 있는지 조사하기 위해, 중증 혈뇨를 보인 방광암 환자 2명의 수술 전후 소변을 수집하여 추가적으로 단백질 어레이를 진행한 결과, 고등급 방광암 환자의 소변 EV에서만 A2M이 높은 값을 보였다. 상기 결과는 고등급 방광암의 소변 EV에서 A2M이 높게 나타나는 것이 혈뇨와 연관되지 않음을 시사하는 것이다. 그 후, 2명의 고등급 방광암 환자와 2명의 저등급 방광암 환자의 결과를 종합한 통계 분석 결과 저등급 방광암 환자의 EV에서는 통계적으로 유의한 차이가 발견되지 않았으나, 고등급 방광암 소변 유래 수술 전-후 EV에서 A2M, cadherin-13, clusterin 3개의 단백질에 유의한 차이를 보였다.
Alpha 2-macroglobulin(A2M)은 척추동물의 혈장 및 체액에 광범위하게 존재하는 분자량 720 kDa의 동종 사량체 구조를 한 단백질로 단백질 분해효소 억제제 중 하나이다. A2M이 다른 혈장단백질 분해 효소 억제제와 구별되는 가장 독특한 특징으로 촉매 특이성과 mechanism에 관계없이 거의 모든 단백질 분해 효소를 억제할 수 있다는 것이다. A2M은 단백질 분해 효소를 비활성화하지 않고 단백질 분해 효소의 활성부위에 기질의 결합을 막는 독특한 방식으로 작용하며, 단백질 분해효소를 억제하는 것 외에 트랜스페린 표면 수용체에 대한 결합을 조절한다. 염기성섬유모세포성장인자(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF), 인터루킨-1b (Interleukin-1b, IL-1b), 혈소판유래성장인자 (Platelet Derived Growth Factor, PDGF), 신경성장인자 (Nerve Growth Factor, NGF) 사이토 카인과 결합하여 부분적으로 활성상태를 유지시키고, 다른 사이토카인의 생물학적 활성은 억제시키는 것으로 알려져 있다. 또한 A2M은 많은 호르몬과 결합하여 그 활동을 조절하고, 다양한 감염으로부터 신체를 보호하는 것으로 알려져 있어 여러 질병의 진단 및 예후를 위한 생물지표로 활용될 수 있다(Zia, M.K., et al., Int J Biol Macromol, 116: p. 721-727. 2018). A2M과 종양 발생과의 연관성은 아직 확립이 되지 않아 연구에 따라 다른 결과가 보고되고 있다. A2M의 종양 억제에 관한 연구로 종양 세포주 (A549, 1231N1, PC-3)에 A2M을 처리하면 세포의 부착 (adhesion)이 증가하는 것을 확인했고, 종양 억제제인 Phosphatase and tensin homolog(PTEN)과 그 상향 조절제인 miR-21을 억제하는 것이 확인되었다. 이와 상반되는 연구내용으로 A2M이 다른 프로테아제 억제제와 유사하게 난소의 염증성 및 종양성 병변이 있는 여성의 혈장에서 증가한다고 보고하였다(Zbroja-Sontag, W., Am J Reprod Immunol, 4(1): p. 11-20. 1983). A2M의 혈중 농도는 노화가 진행됨에 따라 현저히 감소하는데, 수명이 길고 암에 내성을 가진 벌거벗은 두더지 쥐와 야생쥐, 인간의 혈액과 간에서 A2M 수치를 비교 분석한 결과, 벌거벗은 두더지 쥐에서 A2M의 발현이 매우 높게 나타나(Kurz, S., et al., PLoS One, 12(12): p. e0189514. 2017), 혈청 내 A2M의 진행성 결핍이 종양 발달을 유도할 수 있음을 추측할 수 있다. 본 연구에서는 비암 대조군의 소변 EV에서는 A2M이 발현되지 않고 방광암 환자군의 소변 EV에서 A2M 발현양이 높게 났는데, 방광암에서의 A2M의 역할에 대해 명확히 규명하기 위해서는 추가적인 연구가 더 필요할 것으로 사료된다. 본 발명에서 고등급 방광암 환자의 수술 전 EV에서 유의하게 증가하는 양상을 보인 cadherin-13, clusterin은 종양에서 나쁜 예후를 예측할 수 있는 단백질로 EV의 진단 가능성을 확인할 수 있었다. EV를 이용한 암 진단에 대한 이전 연구가 많지 않고, 수술 전-후 EV에서 가장 큰 차이를 보였던 A2M의 방광암 표지자로의 가능성을 검증하기 위해 암이 아닌 비뇨기 질환을 가진 환자(비암 대조군), 저등급 방광암 환자, 고등급 방광암 환자 각 20명씩 총 60명의 검체로 부터 동일양의 EV 단백질(0.5μg)을 이용해 A2M ELISA를 진행한 결과 비암 대조군에서 0%, 저등급 방광암군에서 70%, 고등급 방광암군에서 90%의 통계적으로 유의한 A2M 검출률을 확인했다.
결론적으로 본 발명의 엑소좀 기반 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법은 부작용이 없고 비침습적으로 종래 바이오마커 보다 우수한 특이도와 민감도로 방광암을 정확하고 신속하게 진단하는데 활용가능하다. 상술한 비뇨기계 암에서 EV에 대한 종래연구는 하기 표 1에 요약하였다.
종래 EV 관련 연구
분비세포 수용 세포 EV 구성요소 기능
고등급 방광암 세포 (T24, TCC-SUP) 저등급 방광암 세포 (5637) EDIL 이동 촉진
고등급 방광암 세포 (T24, TCC-SUP) 내피 세포(HUVEC) EDIL 이동 및 혈관신생 촉진
근육 침습성 방광암 세포(TCC-SUP) 저등급 방광암 세포(5637) Periostin ERK 발암 신호 활성화를 통한 공격성 부여
근육 침습성 방광암 세포 (T24, UMUC3) 원발성 요로상피세포 알 수 없음 중간엽 마커의 발현 증가 및 상피 마커 감소
B저산소 상태의 방광암 세포(5637) 방광암 세포(UMUC2) lncRNA-UCA1 상피-간엽 전이 촉진
Rab27b 발현 수준이 높은 방광암 세포 없음 miR-23b 종양 억제제 miRNA 분비
원발성 신장 암 줄기 세포 내피 세포(HUVEC) 알 수 없음 혈관 신생을 유발하고 전이성 틈새 형성을 촉진
신장암 세포(786-O) 내피 세포 (HUVEC) 알 수 없음 혈관신생 촉진
수니티닙 내성 신장 암 세포 (7Su3rd, ACSu3rd) 수니티닙 민감성 신장 암 세포(786-O) lncARSR 경쟁적으로 결합하는 miR-34 / miR-449를 통해 수니티 닙 내성을 부여하여 AXL 및 c-MET 발현을 촉진함
전립선 상피세포 (PNT2) 전립선 암 세포 (PC3M) miR-143 증식 억제
전립선 암 세포 (DU145) 전립선 암 세포 (LNCaP) / 전립선 상피 세포 (RWPE-1) 알 수 없음 아폽토시스 감소, 증식 및 이동 증가
전립선 암 세포 (22RV1) 자연 살해 세포 / CD8 + 세포 (PBMC에서 분류) 알 수 없음 NKG2D 발현을 하향 조절하고 면역 억제를 촉진
도세탁셀 내성 전립선 암 세포 (DU145, 22RV1) 도세탁셀 민감성 전립선 암 세포 (DU145, 22RV1) MDR-1/P-gp 도세탁셀 내성 부여
전립선 암 세포 (PC3, DU145) 뮤린 골 쇄전 세포 (MC3T3-E1) Ets-1 분화 유도
전립선 암 세포 (MDA PCa 2b) 조골 세포 (hFOB1.19) miR-141-3p p38MAPK 경로 활성화를 통해 뼈 전이의 미세 환경 조절
쥐 전립선 암 세포 쥐 파골 세포 전구체 (RAW264.7, 1 차 마우스 골수 세포) 알 수 없음 융합 및 분화 감소
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
시료의 채취
본 발명에서 사용된 환자군 소변은 을지대학병원에 내원한 환자를 대상으로 방광암환자의 수술 전과 수술 후 3개월에 소변을 채취하였고, 비암 대조군 소변은 비뇨기과 외래에 내원한 암이 아닌 전립선비대증과 요로결석 환자의 사람의 소변을 채취하여 분석에 이용하였다. 또한 추가적인 결과 검증에 사용된 소변 검체는 을지대학교병원 인체유래물은행(Eulji Medical Center biobank)에 보관중인 시료를 분양 받아 이용하였다. 소변 채취 시간은 수술 전 검체의 경우 아침 첫 소변을 채취하였고, 수술 후 검체는 수술 3개월 후 추적관찰을 위한 비뇨기과 외래 내원 시 방광경 검사 시행 전 채취하였으며 비암 대조군 소변 검체의 경우 내원하는 시점에 무작위로 채취하였다.
EV의 분리 1(Differential centrifugation)
본 발명자들은 EV의 분리를 위해 환자의 소변 10 mL을 2,000 x g으로 10분간 25℃에서 원심분리 하여 죽은 세포와 apoptotic body를 제거하였다. 그 후 수득한 상층액을 4℃에서 10,000 x g에서 30분간 원심분리를 하고, 상층액을 다시 100,000 x g에서 70분간 원심분리를 했다. 그 후, 상층액을 모두 제거한 다음 튜브에 0.22 μm 필터로 여과된 차가운 Phosphate Buffer Saline(PSB)를 첨가하여 침전된 EV를 4℃에서 12시간 이상 충분히 용해시킨 뒤 수집하였다.
EV의 분리 2(ExoLute exosome isolation kit)
본 발명자들은 EV의 분리를 위해 ExoLute Exosome Isolation Kit(EX-02, Rosetta Exosome)를 사용하여 모두 상온에서 Swinging-bucket rotor 원심분리기로 분리하였다. 구체적으로 전 처리 단계로 2,000 x g에서 10분간 원심분리를 수행한 소변의 상층액을 0.45 μm의 주사기필터로 여과시켰고 15 mL 튜브에 7.2 mL의 소변을 첨가하고 0.8 mL의 sol U을 혼합한 뒤 37℃에서 10분간 반응시켰다. 그 후, 2,000 x g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 15 mL 튜브로 옮겼다. 상기 전 처리가 끝난 소변 8 mL에 0.25 mL의 Sol A를 첨가 후 튜브를 10회 invert 해주고, 1 mL의 Sol B를 넣고 10회 invert하였다. 상기 튜브에 4 mL의 Sol C를 첨가한 뒤 10회 invert 해주고, 15분간 rocker shaker에서 반응시킨 후 튜브 뚜껑을 느슨하게 하여 3,000 x g에서 15분간 원심분리를 수행하였으며 상층액을 제거 후 1~2분간 튜브를 거꾸로 놓아 남아있는 용액을 모두 제거하였다. 그 후, 300 μL의 Sol R을 첨가하여 피펫을 이용해 펠렛을 풀어주고, 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 샘플을 옮겨준 뒤 2,000 x g에서 5분간 원심분리 한 300 μL의 상층액을 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮겼다. 컬럼 준비 과정을 끝낸 컬럼 레진의 중앙에 1.5 mL 튜브에 옮겨 놓았던 300 μL의 상층액을 올려준 뒤 300 x g에서 3분간 원심분리하여 정제된 EV를 수득하였다.
EV의 분리 3(ExoDisc)
본 발명자들은 2,000 x g 에서 10분간 25℃에서 원심분리하여 이물을 제거한 소변의 상층액을 0.8 μm의 필터로 여과해 전 처리를 하였다. 그 후, ExoDisc 필터 활성화를 위해 Disc hole에 0.22 μm로 여과된 PBS를 1 mL 첨가하여 5분간 ExoDiscovery(LabSpinner)를 이용하여 원심분리 과정을 거쳐 필터를 활성화시켰다. 그 다음 전 처리를 끝낸 소변을 각 1 mL씩 디스크에 분주하여 5분씩 원심분리를 수 회 반복 진행하여 EV 분리를 위한 소변의 농축을 진행하였다. 농축 마지막 과정에서 0.22 μm로 여과된 PBS 1 mL를 Disc hole에 넣어준 뒤 원심분리를 진행하여 남아있는 소변을 제거함과 동시에 농축된 EV를 2회 반복하여 세척하였다.
나노입자 추적 분석(Nano-particle Tracking Analysis, NTA)
본 발명자들은 상기 분리한 EV의 특성을 나노입자추적분석 기기인 ZetaView (Particle Metrix GmbH)를 이용하여 분석하였다. EVs는 0.22 μm로 여과된 PBS를 이용해 희석하여 준비하였으며, 0.8 μm 필터를 통과시켜 분석하였다. ZetaView분석에 적용된 분석매개변수는 하기와 같다: 최대면적: 1000, 최소면적: 10, 최소밝기: 10, 감도: 75, 셔터: 100, 온도: 25℃.
EV의 단백질 정량
본 발명자들은 단백질 침전법을 이용하여 소변 단백질에 대한 정성 또는 정량 테스트를 수행하였다. 구체적으로 소변에서 분리한 상기 EV의 총단백질 정량은 종래 연구문헌을 참고하여 BCA방법으로 정량하였다(Aitekenov et al., Talanta, 223(Pt 1): p. 121718. 2020). 기존 BCA 단백질 분석 키트는 검출 가능한 단백질의 최저 농도가 5 μg/mL 이상으로 EV내에 존재하는 소량의 단백질을 검출하기에는 적합하지 않아, 측정 가능한 단백질 최저농도 0.5 μg/mL 이상인 Micro BCA 단백질 분석 키트(Thermo Scientific)를 이용해 소변 EV의 단백질 정량을 수행하였다. 대조군으로 알부민 표준용액을 200 μg/mL 부터 0 μg/mL까지 희석하여 제조하였다. 단백질 정량 키트에 포함된 Micro BCA Reagent A, B, C 를 (MA : MB : MC)를 각 25 : 24 : 1 비율로 혼합하여 용액을 준비하였고 96 웰 플레이트에 상기 MA, MB, MC 혼합 용액을 150 μL씩 분주하고, 알부민 표준용액과 EV 희석액을 150 μL 씩 분주한 뒤 빛을 차단한 상태로 37℃에서 2시간 반응시킨 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질을 정량하였다.
웨스턴 블랏(Western blot)
본 발명에서 수행한 웨스턴 블랏 분석은 상술한 3가지 각각 다른 방법으로 추출하여 준비된 EV 시료의 양을 1 mL 기준으로 추출된 용량으로 환산하여 취한 다음 DTT(Dithiothreitol)이 없는 5 x Sodium dodecyl sulfate(SDS) 샘플 버퍼와 혼합하여 100℃에서 10분 동안 끓인 다음 분석에 필요한 샘플을 준비하였다. 단백질은 10% SDS-아크릴아마이드 겔을 이용해 전기영동을 진행하여 분리한 후, 니트로셀룰로오즈 블롯 멤브레인(0.45 μm NC, GE Healthcare Life Science)으로 이송하였다. 그 후 상기 멤브레인을 5% skim-milk/0.1% Tween-20 Tris-NaCl buffer(TBS-T)로 blocking 과정을 수행한 후, 1차 항체로 Mouse anti-CD63 antibody(sc-5275, Santa Cruz, CA), Mouse anti-CD81 antibody(sc-23962, Santa Cruz, CA)를 4℃에서 밤새(overnight) 반응시켰다. 상기 1차 항체 반응 후 3회 0.1% TBS-T로 상기 멤브레인을 3회 세척하였고 2차 항체로 HRP-conjugated Goat anti-Mouse IgG-heavy and light chain Antibody(A90-116P, BETHYL Laboratories)를 5% skim milk/TBS를 이용해 희석하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity substrate(34094, Thermo Scientific)를 사용하여 시각화하였고 ChemiDoc Touch Imaging system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 촬영하였다.
단백질 어레이(Protein array)
본 발명자들은 인간 가용성 수용체 항체 어레이(Human soluble Receptor antibody array), Non-Hematopoietic Panel kit(ARY012, R&D system)를 사용하여 수술 전 후 소변 EV를 분석하였다. 구체적으로 Part C(Common Analytes Panel) 니트로셀룰로오즈 멤브레인 및 Part N(Non-Hematopoietic Panel) 니트로셀룰로오즈 멤브레인을 4-웰 멀티 디쉬에 넣고, 2 mL 1X 어레이 버퍼 8/1로 1시간동안 상온에서 rocker shaker를 이용하여 상기 멤브레인을 블록(blocking)시켰다. 그 후 1 x 어레이 버퍼 8/1을 제거한 뒤, 희석된 EV를 멤브레인이 있는 각 웰에 분주하고 4℃에서 overnight rocking flatform shaker에서 반응시켰다. 이어서 다른 용기에 상기 멤브레인을 옮겨 10분씩 3회 충분한 양의 1x 세척 버퍼로 세척하였고 4-웰 멀티 디쉬를 증류수로 깨끗하게 씻어 남아있는 EV가 없도록 하였다. 그 후 상기 4-웰 멀티 디쉬를 Part C 및 Part N 항체 바이얼(antibody vial)에 증류수 100 μL를 넣어 워킹 솔루션(working solution)을 제조하였고 항체 30 μL를 1x 어레이 버퍼 1.5 mL에 희석하여 웰 마다 넣어주고, 세척이 끝난 멤브레인을 분주된 항체에 맞게 놓아준 뒤 2시간 동안 상온에서 rocker shaker를 이용해 반응시켰다. 이후 3회 세척과정을 반복하였고, HRP-결합 항체 희석액을 각 웰 당 2 mL 씩 분주하고 30분간 상온의 시소형진탕기에서 반응시킨 뒤 3회 세척하였다. 그 후 키트에 포함된 Chemi Reagent 1, 2를 1:1로 혼합한 후 각 멤브레인에 1 mL 씩 분주하고 1분간 반응시킨 뒤 ChemiDoc Touch Imaging system에서 1~10분간 촬영하였고 Quick Spot image analysis software(R&D system)를 이용해 결과를 분석하였다. 수술 전 후 소변 EV를 test 당 5 μg씩 사용하였으며, 용해 버퍼 17(895943, R&D system) 을 이용해 EV를 용해한 것과 용해하지 않은 두 가지 EV 전처리 방법을 사용하여 실험을 수행하였다.
CD9 양성 EV 분리
본 발명자들은 Exosome - human CD9 isolation Reagent(10614D, Invitrogen)를 사용하여 CD9 양성 EV를 추출하였다. 구체적으로 분리완충용액(isolation buffer)으로 0.1% 소혈청알부민(BSA)을 사용하였고 사용 전 bead solution reagent vial을 30초간 vertex 하여 잘 섞어준 다음 40 μL의 beads solution을 1 mL 분리 완충용액이 들어있는 튜브에 첨가하였다. 그 후, 튜브를 자기 분리장치에 1~2분간 방치한 뒤, 완충액를 제거하였고 비드(Beads)가 남아있는 튜브에 90 μL의 분리완충용액과 10 μL의 EV를 넣어준 뒤, tube를 교반기(Rotator)에 고정시키고 4℃에서 밤새(overnight) 반응시켰다. 이후 상기 튜브를 1~2초간 스핀다운 해준 뒤, 1 mL 분리완충용액 넣어주고 1~2분간 magnetic separator에 두었다가 모든 버퍼를 제거하였다. 이어서 500 μL의 분리완충용액을 첨가한 후 완충용액을 제거하는 과정을 반복하였고, 최종적으로 EV CD9이 capture된 비드를 수득하였다. CD9+ EV 분리 후 단백질 어레이에 사용할 때는 R&D사의 단백질 분석 키트(protein array kit)에 들어있는 용해 버퍼(Lysis Buffer) 17 (895943, R&D system)을 이용하여 비드를 용해시킨 뒤 실험하였다.
Alpha 2-Macroglobulin 효소면역 정량분석
본 발명자들은 제조사의 매뉴얼에 따라 alpha 2-macroglobulin ELISA Duoset kit(DY1938, R&D system) 사용하여 ELISA를 수행하였다. 분석에 사용된 EV는 초음파 폐쇄기(Sonicator)를 이용해 용해시킨 뒤 micro BCA protein assay를 통해 정량하여 동일한 양의 EV를 취하여 사용하였다(0.5 μg/test).
통계분석
각 실험은 최소 3회 이상 독립적으로 수행되었으며 대표적인 결과로 나타냈다. 결과는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시했으며, 그룹 간 차이의 유의성을 평가하기 위해 two tailed Student's t-test를 사용했다. 모든 통계 분석에 Microsoft Excel 또는 Graphpad Prism (version 8)을 사용하였다. P 값에서 통계적 유의성 < 0.05, < 0.01은 각각 *와 **로 표시했다.
실시예 1: 분리 방법에 따른 EV 입자의 차이
소변 단백질을 이용한 단백질체 분석에서 가장 중요한 단계는 안정적 수율로 소변에서 충분한 양의 EV를 분리하는 것이다. 따라서 본 발명자들은 EV 분리 방법에 따른 EV 입자 및 추출 단백질의 차이를 조사하여 최적의 분리법을 확립하기 위해, 세 가지 다른 EV 분리 방법을 사용하여 비암 대조군과 방광암 환자 각각 1명의 소변에서 EV를 분리하였다(도 1). 분리 방법에는 EV 분리에 전통적으로 흔히 사용되는 분획원심법(Differential centrifugation, DC)을 기준으로 최근 개발되어 EV 단백질 수율이 높다고 알려진 2가지 다른 방법을 적용하였다. 첫 번째는 크기 배제 크로마토크래피(Size-exclusion chromatography) 과정이 포함된 Rosetta Exosome社의 다단계 복합 엑소좀 추출 키트인 ExoLutEㄾ Urine(eLute), 두 번째는 20 nm 크기 선택형 나노필터를 기반으로 하는 추출방법인 랩스피너社의 ExoDisc(eDisc)를 비교 분석하였다(Jeon, H. et al., PLoS One, 15(7): p. e0235793. 2020). 상기 세 가지 다른 방법을 사용하여 정상 또는 방광암 환자의 소변 검체에서 분리된 EV 입자의 수와 크기 분포에 대한 나노입자 추적 분석(Nano-particle Tracking Analysis, NTA)을 수행하였다.
그 결과, 상기 분리된 EV의 입자 수는 사용된 방법에 따라 유의한 차이를 나타내었다(도 2). 분획원심법(DC)으로 분리된 EV의 입자수가 가장 적었고, eLute urine에서 약 1.3배, eDisc에서 약 9배 더 많이 분리되어 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다. 또한 분리 방법에 따라 EV 입자 크기는 20~500 nm로 다양하게 나타났고(도 3), 중간 크기 분포는 직경 120 nm에서 140 nm 사이의 범위였으며 입자 크기에 대한 평균값은 각각의 분리 방법 간에 큰 차이를 나타내지 않았다(도 4).
실시예 2: 소변 유래 EV의 단백질양 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 3가지 다른 방법으로 분리된 EV의 단백질 양을 비교하기 위해 각각의 EV 단백질을 micro-bicinchoninic acid assay(BCA) 로 분석하였다.
그 결과, DC 방법으로 분리된 EV에 비해 eLute 방법으로 분리된 비암 대조군 EV에서 1.7배, 방광암 환자 EV에서 1.6배 많은 단백질이 검출됐으나 통계적으로 유의하지 않았고 eDisc로 분리된 EV 분획에서 DC 방법에 의해 분리된 EV에 비해 비암 대조군 6.2배, 방광암 환자에서 8.4배 많은 양의 단백질이 확인되었다(도 5)(p < 0.01). 상기 각 방법으로 분리된 EV 단백질 양을 확인하기 위해서 동일한 부피(10 μL)의 EV를 이용해 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과 EV 표지자로 알려진 CD63, CD81이 eDisc 방법으로 분리된 EV에서만 검출되었다(도 6). 상기 결과에 따라 eDisc 방법이 다른 방법에 비해 높은 수율의 EV를 얻기에 더 효과적이고, 특히 본 발명의 목적인 소변 EV에서 충분한 양의 EV 단백질을 추출한다는 점에서 최적의 방법임을 확인하였다.
실시예 3: 소변 EV를 이용한 단백질 어레이 분석
본 발명자들은 선행연구로 소변 EV를 이용한 LC-MS 분석을 수행하였으나, 안정적으로 분석을 하기 위해 필요한 소변의 양이 약 700 mL 이상으로 매우 많은 양의 소변을 필요했고, 분석에 필요한 단백질 양도 검체 당 100 μg 이상으로 매우 많은 양의 단백질을 필요로 하였다. 또한, 결과의 검증 과정에서 LC-MS의 결과가 웨스턴 블롯 결과에 반영되지 않았다. 소변에서 분리 가능한 단백질 양은 많지 않으므로 LC-MS를 대신할 수 있으면서 소량의 검체로 분석 가능한 단백질을 기반으로 하는 분석법을 찾기 위한 접근을 시도하기 위해 새로운 접근 방식을 이용한 분석이 필요하여 단백질 어레이의 경우 119 개의 서로 다른 수용체를 분석하는 R&D system사의 proteome profiler human soluble receptor array를 선택했다. 지금까지 소변 EV를 사용한 단백질체 분석에 대한 보고가 없었기 때문에 먼저 단백질 어레이로 방광암 표지자를 선별하기 위한 조건을 확립하기 위한 실험을 수행하였다. 소변은 방광암 환자로부터 수술 전과 수술 후 3개월에 소변을 받아 분석에 이용하였고, eDisc 방법을 사용하여 4 mL의 소변에서 EV를 분리하였으며 5 μg의 단백질을 119개의 다른 수용체 분석에 적용했다. 표적 단백질이 방광암 환자의 소변 유래 EV에서 원형질막 표면에 존재하는 단백질이 많이 발현되는지, 원형질막 내부에 있는 단백질이 많이 발현되는지 예측할 수 없었기 때문에 EV를 용해시킨 것과 용해시키지 않은 것 모두 단백질 분석을 수행하여(Ahram, M. et al., Expert Rev Proteomics, 1(3): p. 293-302. 2004) 전 처리 방법에 따라 멤브레인에 나타난 수용체의 발현 정도를 조사하였다.
그 결과, 단백질 어레이에서 두 명의 다른 방광암 환자의 소변 EV 중 고등급 환자의 소변 EV는 수술 전과 수술 후 사이에 약간의 차이를 나타내었다(도 7). 그 후 보다 정확한 분석을 위해 고등급 방광암 환자에서 EV를 용해시킨 것과 용해시키지 않은 샘플을 이용하여 Quick Spot image analysis software(R&D system) densitometer 분석을 통해 수치에 의한 단백질 분석을 수행한 결과, 용해시키지 않은 샘플에 비해 용해시킨 샘플의 발현 강도가 더 약하게 나타났으나, 용해시킨 샘플의 발현 강도가 음성 대조군인 PBS보다 높게 나타났다. 그러나 용해 유무에 따라 수술 전후에 차이가 나는 단백질 선별 결과가 달라지지는 않았다(도 8). 상기 결과는 두 조건 모두 단백질 어레이에 적용할 수 있음을 의미하지만, 이론적으로 용해시킨 샘플은 소변 EV에서 더 많은 단백질 표지자를 선별할 가능성이 더 높을 것으로 예상되었으므로 이후의 실험에 용해시킨 EV 전 처리 방법을 적용하기로 결정하였다. 상기 1차 단백질 분석을 위해 소변을 제공한 환자에 대한 정보는 하기 표 2에, 단백질 분석에 사용된 119개 수용체에 대한 정보는 하기 표 3 내지 6에 요약하였다.
1차 단백질 분석에 사용된 환자 샘플 정보.
#1 #2
병리학 T1, high grade & CIS Ta, Low grade
수술 전 UA: RBC/micro L ≤1 ≤1
수술 전 UA: OB*/microL ± (5) 1 plus (10)
수술 후 UA: RBC/micro L ≤1 5~9
수술 후 UA: OB/micro L 음성 1 plus (10)
post-op BCG여부 1 1
Primary vs. Recurrent 초기 반복
Multiplicity 단일 멀티
* OB : Occurt Blood.
인간 비-조혈 어레이 프로테옴 프로파일러 단백질 ID 1
좌표 분석물/조절 대체 명명법 유전자 ID 입력
A1,A2,A3,A4 Reference Spots N/A -
A5, A6 ADAM15 N/A 8751
A7, A8 βIG-H3 N/A 7045
A9, A10 BMPR-IB/ALK-6 CDw293 658
A11, A12 Cadherin-4/R-Cadherin CAD4 1002
A13, A14 Cadherin-11 CAD11 1009
A15, A16 Cadherin-13 CDHH 1012
A17, A18 E-Cadherin CD324, ECAD 999
A19, A20 N-Cadherin CD325, NCAD 1000
A23, A24 Positive Control N/A -
B1, B2 Positive Control N/A -
B5, B6 P-Cadherin PCAD 1001
B7, B8 VE-Cadherin CD144, CDH5 1003
B9, B10 Cathepsin D N/A 1509
B11, B12 CD40/TNFRSF5 N/A 958
B13, B14 CEACAM-5/CD66e CEA 1048
B15, B16 CHL-1/L1CAM-2 CALL 10752
B17, B18 Clusterin N/A 1191
B19, B20 Coagulation Factor II/Thrombin N/A 2147
C1, C2 COMP/Thrombospondin-5 N/A 1311
C3, C4 CRELD2 N/A 79174
C5, C6 Desmoglein 2 N/A 1829
C7, C8 ECM-1 N/A 1893
C9, C10 EGF R/ErbB1 HER1 1956
C11, C12 Endoglycan PODXL2 50512
C13, C14 EpCAM/TROP-1 N/A 4072
C15, C16 ErbB2/HER2 N/A 2064
C17, C18 ErbB3/HER3 N/A 2065
C19, C20 ErbB4/HER4 N/A 2066
C21, C22 ESAM N/A 90952
C23, C24 Galectin-2 N/A 3957
D1, D2 HPRG N/A 3273
D3, D4 Integrin α3/CD49c ITGA3 3675
D5, D6 Integrin α5/CD49e ITGA5 3678
인간 비-조혈 어레이 프로테옴 프로파일러 단백질 ID 2
좌표 분석물/조절 대체 명명법 유전자 ID 입력
D13, D14 Jagged 1 JAG1, CD339 182
D15, D16 JAM-B/VE-JAM CD322, JAM2 58494
D17, D18 JAM-C JAM3 83700
D19, D20 LRP-6 N/A 4040
D21, D22 MCAM/CD146 MUC18 4162
D23, D24 MEPE N/A 56955
E1, E2 MUCDHL N/A 53841
E3, E4 Nectin-2/CD112 PVRR2, PVRL2 5819
E5, E6 Nectin-4 PVRL4 81607
E7, E8 Neurotrimin IGLON2 50863
E9, E10 Notch-1 N/A 4851
E11, E12 NrCAM N/A 4897
E13, E14 Periostin/OSF-2 N/A 10631
E15, E16 Podocalyxin PODXL 5420
E17, E18 E-Selectin/CD62e CD62E, ELAM 6401
E19, E20 Semaphorin 3A SEMA3A 10371
E21, E22 SREC-I/SR-F1 SCARF1 8578
E23, E24 SREC-II SCARF2 91179
F1, F2 Stanniocalcin 1 STC1 6781
F3, F4 Syndecan-1/CD138 SDC1 6382
F5, F6 Syndecan-4 SDC4 6385
F7, F8 Thrombospondin-2 TSP2, THBS2 7058
F9, F10 TIMP-4 N/A 7079
F11, F12 TROP-2 N/A 4070
F13, F14 VAP-1/AOC3 SSAO 8639
F15, F16 VCAM-1 CD106 7412
F17, F18 VEGF R1/Flt-1 N/A 2321
F19, F20 VEGF R2/KDR/Flk-1 CD309 3791
G1, G2 Reference Spots N/A -
G5, G6 IgM (Sample Control)* N/A 3507
G7, G8 α2-Macroglobulin
(Sample Control)*		 A2M 2
G9, G10 Transferrin R
(Sample Control)*		 CD71 7037
G11, G12 Vimentin
(Sample Control)*		 VIM 7431
G13, G14 PBS (Negative Control) N/A -
F15, F16 VCAM-1 CD106 7412
F17, F18 VEGF R1/Flt-1 N/A 2321
F19, F20 VEGF R2/KDR/Flk-1 CD309 3791
G1, G2 Reference Spots N/A -
G5, G6 IgM (Sample Control)* N/A 3507
G7, G8 α2-Macroglobulin
(Sample Control)*		 A2M 2
G9, G10 Transferrin R
(Sample Control)*		 CD71 7037
G11, G12 Vimentin
(Sample Control)*		 VIM 7431
G13, G14 PBS (Negative Control) N/A -
G23, G24 Reference Spots N/A -
인간 일반 분석물 어레이 프로테옴 프로파일러 단백질 ID 1
좌표 분석물/조절 대체 명명법 유전자 ID 입력
A1,A2,A3,A4 Reference Spots N/A _ -
A5, A6 ACE CD143 1636
A7, A8 ADAM8 CD156 101
A9, A10 ADAM9 N/A 8754
A11, A12 ADAM10 CD156c 102
A13, A14 ALCAM/CD166 N/A 214
A15, A16 Amphiregulin AR 374
A17, A18 APP (pan) N/A 351
A19, A20 BACE-1 N/A 23621
A23, A24 Reference Spots N/A -
B1, B2, B3, B4 Positive Control N/A -
B5, B6 BCAM CD239 4059
B7, B8 C1q R1/CD93 N/A 22918
B9, B10 CD9 N/A 928
B11, B12 CD23/Fc ε RII N/A 2208
B13, B14 CD31/PECAM-1 N/A 5175
B15, B16 CD36/SR-B3 FAT 948
B17, B18 CD40 Ligand/TNFSF5 CD154 959
B19, B20 CD44H N/A 960
C1, C2 CD58/LFA-3 N/A 965
C3, C4 CD90/Thy1 N/A 7070
C5, C6 CD99 N/A 4267
C7, C8 CD155/PVR N/A 5817
C9, C10 CEACAM-1/CD66a N/A 634
C11, C12 CX3CL1/Fractalkine Neurotactin 6376
C13, C14 CXCL8/IL-8 NAP-1 3576
C15, C16 EMMPRIN/CD147 BSG 682
C17, C18 Endoglin/CD105 N/A 2022
C19, C20 Epiregulin N/A 2069
C21, C22 Galectin-1 GAL1 3956
C23, C24 Galectin-3 GAL3 3958
D1, D2 Galectin-3BP/MAC-2BP N/A 3959
D3, D4 HB-EGF N/A 1839
D5, D6 ICAM-2/CD102 N/A 3384
인간 일반 분석물 어레이 프로테옴 프로파일러 단백질 ID 2
좌표 분석물/조절 대체 명명법 유전자 ID 입력
D7, D8 IL-1 RII CD121b 7850
D9, D10 IL-15 Rα N/A 3601
D11, D12 Integrin β1/CD29 ITGB1 3688
D13, D14 Integrin β2/CD18 ITGB2 3689
D15, D16 Integrin β3/CD61 ITGB3 3690
D17, D18 Integrin β4/CD104 ITGB4 3691
D19, D20 Integrin β5 ITGB5 3693
D21, D22 Integrin β6 ITGB6 3694
D23, D24 JAM-A CD321 50848
E1, E2 Lipocalin-2/NGAL N/A 3934
E3, E4 LOX-1/SR-E1 CLEC8A 4973
E5, E6 MD-1 LY86 9450
E7, E8 MMP-2 (total) N/A 4313
E9, E10 NCAM-1/CD56 N/A 4684
E11, E12 NCAM-L1 L1CAM, CD171 3897
E13, E14 Osteopontin OPN 6696
E15, E16 PAR1 N/A 2149
E17, E18 Pref-1/DLK-1/FA1 N/A 8878
E19, E20 RECK N/A 8434
E21, E22 Stabilin-1 CLEVER-1, FEEL-1 23166
E23, E24 TACE/ADAM17 CD156b 6868
F1, F2 Thrombospondin THBS, TSP 7057
F3, F4 TIMP-1 N/A 7076
F5, F6 TIMP-2 N/A 7077
F7, F8 TIMP-3 N/A 7078
F9, F10 TNF RII/TNFRSF1B CD120b 7133
G1, G2 Reference Spots N/A -
G5, G6 IgM (Sample Control) N/A 3507
G7, G8 α2-Macroglobulin
(Sample Control)*		 A2M 2
G9, G10 Transferrin R
(Sample Control)*		 CD71 7037
G11, G12 Vimentin (Sample Control)* VIM 7431
G13, G14 PBS (Negative Control) N/A -
G23, G24 Reference Spots N/A -
실시예 4: CD9 양성 소변 EV를 사용한 단백질 어레이 분석
종래 조직 특이적으로 분리된 EV와 혈액 EV에서 단백질 표지자의 발현패턴의 차이를 나타내는 연구가 보고되었다(Mustapic, M., et al., Frontiers in Neuroscience, 11(278). 2017). 이러한 접근법은 체액 전체에서 추출된 EV는 진단적 가치가 낮으나, 질환과 직접적으로 관련된 장기에서 유래하는 조직에 특이적인 EV를 선별할 경우 더 진단적 가치가 높을 것이라는 가설에 근거한다. 본 발명에서도 방광암과 관련된 조직 특이적 EV를 선별하면 보다 많은 종양 표지자를 선별할 가능성이 있는지 알아보기 위해, 방광암 환자의 수술 전후에 수집한 소변 EV를 대상으로 2차적으로 다시 조직 특이적 EV를 선별하여 단백질 어레이 분석에 적용하였다. 이를 위해 기존 연구 문헌을 조사한 결과, uroplakin-2, uroplakin-1A, uroplakin 1B, Uroplakin Ⅲ A cytokeratin, CD9 등 방광암과 요로상피세포의 몇 가지 특이적 표지자를 찾아 세포주 수준에서 확인하는 실험을 수행하였으나 CD9 외 다른 단백질에서는 의미있는 결과를 확인할 수 없었다(Li, W., et al., Am J Clin Pathol, 142(6): p. 864-71. 2014). 이에 근거하여 anti-CD9 항체가 결합된 자기 비드(magnetic bead)를 eDisc로 1차적으로 분리된 EV에 적용하여 CD9 양성 EV를 2차적으로 분리한 후, 단백질 어레이를 수행하였다. 상기 실험은 도 7과 표 1 및 2에 제시된 환자의 EV를 사용하여 수행했다.
그 결과, 상기 도 7에서 저등급 방광암 환자의 소변 EV 단백을 단백질 어레이 분석한 결과에서는 수술 전후에 양적 차이가 나는 단백질을 관찰할 수 없었고, CD9 양성 EV를 적용하면 차이가 나는 단백질의 수가 나타날 것을 기대하였으나 anti-CD9 항체와 결합된 자성 비드로 분리한 EV를 적용한 단백질 어레이 경우에도 여전히 수술 전후에 차이를 보이는 단백질이 검출되지 않았다. 오히려, 고등급 방광암 환자에서 분리한 EV의 경우 eDisc 방법으로 분리한 시료에서 수술 전후에 차이가 있는 단백질이 있었으나 anti-CD9 항체가 결합된 자성 비드로 분리한 후 대부분의 단백질에서 차이가 다소 감소하는 결과를 나타내었다(도 9 및 10). 상기 결과는 anti-CD9 항체와 결합된 자성 비드에 의해 분리된 CD9 양성 EV가 방광암의 EV에서 단백질 표지자를 검사하는데 유용하지 않음을 시사하는 것이다.
실시예 5: 방광암 단백질 표지자 선택
본 발명자들은 소변 EV 단백질 어레이 분석을 통해 방광암 단백질 표지자를 선택하였다. 구체적으로 소변 EV의 추출은 조직 특이적 표면 단백질 표지자인 CD9으로 분리된 EV를 사용하는 방법은 적용되지 않았고 eDisc 방법을 적용하여, 추출된 EV는 용해시켜 단백질 어레이에 적용하여 고등급 방광암 환자 1명과 저등급 방광암 환자 1명을 각각 추가하여 분석을 수행하였다. 상기 실시예 3에서 수술 전 고등급 방광암 환자의 EV에서 alpha 2-macroglobulin(A2M) 발현이 수술 후보다 훨씬 높게 나타났다. A2M은 방광암 환자의 혈뇨에서 비롯될 수 있는 가장 큰 혈장 단백질 중 하나로 알려져 있기 때문에, 추가적인 환자 선별 과정에서 A2M이 혈뇨를 반영하는 것이 아닌지 조사하기 위해, 명백한 혈뇨가 있는 방광암 환자로부터 수술 전-후의 소변을 수집하였다.
그 결과, 두 환자 모두 수술 전 중증 혈뇨를 보였으나, 고등급 방광암 환자의 소변 EV에서만 A2M 값이 높게 나타났다. 상기 결과는 고등급 방광암 환자의 소변 EV에서 A2M이 높게 나타나는 것이 혈뇨와 연관되지 않음을 시사하는 것이다. 고등급 방광암 환자 소변 유래 EV에서 수술 전-후 cadherin-13(CDH-13), clusterin(CLU) 및 A2M 등 3개의 단백질에 통계적으로 유의한 차이가 있었고, 저등급 방광암 환자의 수술 전-후 EV에서는 통계적으로 유의한 차이는 발견되지 않았다(도 11 및 12). 상기 방광암 환자의 샘플 정보를 하기 표 7에 요약하였다.
2차 단백질 어레이에 사용된 환자 샘플 정보
#3 #4
Pathology T1, high grade & CIS Ta, Low grade
수술 전 UA: RBC/micro L 30≥, 시야의 ≤0.5 30≥, 시야의 ≤0.5
수술 전 UA: OB*/microL 3 plus (250) 3 plus (250)
수술 후 UA: RBC/micro L ≤1 ≤1
수술 후 UA: OB/micro L 음성 음성
post-op BCG여부 1 0
Primary vs. Recurrent 초기 초기
Multiplicity 멀티 단일
* OB : Occurt Blood.
실시예 6: 방광암 진단 표지자로의 A2M 검증
본 발명자들은 소변 유래 EV에서 방광암 진단 표지자로의 A2M을 검증하였다. 구체적으로 방광암 환자의 소변 EV로 단백질 배열에서 확인된 3가지 단백질 중 수술 전-후 환자의 소변 EV에서 가장 큰 차이를 보인 A2M을 대상으로 더 많은 환자 샘플에서 유의성을 검증하였다. 소변은 방광암이 아닌 환자(양성 비암대조군) 20명, 저등급 방광암 환자 20명, 고등급 방광암 환자 20명 등 총 60여 명에게서 채취했고, 상기 양성 비암 대조군에는 전립선 비대증(BPH) 환자와 혈뇨가 있는 요로결석 환자가 포함됐다. 그 후 본 발명자들은 eDisc 방법으로 상기 환자의 소변으로부터 EV를 분리하였고, 각 EV 단백질은 micro BCA에 의해 정량화되었으며, 샘플 당 0.5 ㅅg의 EV를 사용하여 ELISA를 수행하였다.
그 결과 양성 비암 대조군에서 검출 가능한 신호는 없었으며, 방광암 환자에서 파생된 EV에서 A2M은 대조군보다 높게 나타났다. EV 단백질 0.5 ㅅg을 적용하여 ELISA 최소 검출 농도인 0.625 ng/ml을 기준으로 하였을 때, 방광암군에서는 A2M 검출률이 65%, 양성 비암 대조군에서는 0%로 나타났다. 또한, 고등급 방광암 환자군의 A2M 평균치가 저등급 방광암 환자군보다 높은 것으로 확인됐다(도 13). 상기 결과는 소변 유래 EV의 A2M 단백질이 방광암 진단 표지자로 활용될 수 있음을 시사하는 것이다. 상기 유의성 검증 분석에 사용된 환자의 샘플 정보를 하기 표 8에 요약하였다.
A2M에 사용되는 환자 샘플 정보
정상(BPH, stone) 낮은 등급 높은 등급










Age / Gender		 66 M 62 M 81 M
66 M 64 M 72 M
63 M 39 M 77 F
63 M 83 M 62 M
61 M 71 M 55 M
65 M 65 M 50 M
72 M 75 M 83 M
57 M 43 M 74 M
57 M 61 M 74 M
70 M 71 M 79 M
65 M 80 M 67 M
55 M 59 M 65 M
58 F 76 M 62 M
71 M 64 M 73 M
65 M 49 F 66 M
61 M 81 M 61 M
60 M 73 M 68 M
52 M 53 M 80 M
46 M 66 M 77 M
47 M 50 M 75 M
n = 20 20 20
Age average 64.2 64.3 70.1
*모든 값은 3회 실시한 평균값을 의미함.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (9)

  1. 환자로부터 분리된 소변 시료로부터 나노필터 여과법으로 엑소좀을 분리하는 단계;
    상기 분리된 엑소좀 내의 A2M(alpha 2-macroglobulin) 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 방광암 진단을 위한 정보 제공 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    측정된 A2M의 농도가 0.625 ng/ml 이상일 경우 방광암에 걸렸을 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노필터 여과법은 10 내지 30 nm의 공극을 갖는 나노필터를 이용하여 수행되는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 A2M 단백질의 농도는 질량분석법(masss-pectrometry), 웨스턴 블랏(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay) 또는 단백질 어레이(protein array)를 이용하여 수행되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 웨스턴 블랏, ELISA, 면역학적분석법 또는 단백질 어레이는 상기 A2M 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 기능성 단편, 또는 항체 유사체를 이용하여 수행되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항체의 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, di-scFv, sdAb, VHH 또는 VNAR인, 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 항체 유사체는 애필린(Affilin), 애피바디(Affibody), 애피머(Affimer), 애피틴(Affitin), 알파바디(Alphabody), 앤티클린(Anticlin), 아비머(Avimer), 다르핀(DARpin), 피노머(Fynomoer), 쿠니츠 도메인 펩타이드(Kunitz domain peptide), 모노바디(monobody), 가변 림프구 수용체(VLR), Minibody, Diabody, Tetrabody, Triabody, 또는 Peptabody인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 방광암은 고등급 방광암인, 방법.
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