KR20150087580A - Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트, 상기 조성물을 이용한 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법 및 상기 조성물을 포함하는 암 치료물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Del-1 단백질 양성 엑소좀은 여러 종류의 암을 신속하게 진단할 수 있고, 특히, 유방암 0 내지 4기 중 기존에 알려진 마커 및 방법으로 측정하기 쉽지 않았던 0기 상피내암(Ductal Carcinoma in Situ, DCIS) 상태까지 측정이 가능하다. 또한, 유방암 4기에만 높은 민감도를 보이는 기존의 유방암 바이오 마커인 CA 15-3 보다 민감도가 높아 모든 유방암 진행 단계를 진단할 수 있으므로, 정확하고 신속하게 암을 진단하거나 예후를 예측하는데 유용하게 이용할 수 있다.

Description

Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물{Composition for diagnosing or prognosising cancer comprising Del-1 protein positive exosome}

본 발명은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트, 상기 조성물을 이용한 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공방법 및 암 치료물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

종양(Tumor)은 비정상적인 세포의 과잉으로 인하여 발생하는 비제어적이고, 무질서한 세포증식의 산물로서, 이러한 종양이 파괴적인 증식성, 침윤 및 전이성을 가지게 되면 악성종양(malignant tumor), 즉 암으로 분류하게 된다. 암의 종류는 현재까지 밝혀진 것만 해도 수십 종에 이르며, 주로 발병 조직의 위치에 따라 구분된다. 이러한 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암등이 있다. 또한 이러한 암의 발병 기전 또는 형태에 따라 다른 분류 체계에 의해 구분되기도 한다. 또한, 암은 그 진행 정도에 따라, 암세포가 점막 내에 국한되어 있는 상태를 조기암으로 분류하고 있는데, 다양한 암에 있어, 조기암 상태에서 발견된 환자의 치료의 예후는 비교적 좋은 것으로 나타난다. 따라서 암의 조기 진단 및 치료는 암의 사망률을 낮추고, 암의 치료비용을 낮추는데 기여할 것으로 판단되고 있다. 그러나 암은 많은 경우에 있어서 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하므로, 이는 암의 사망률을 높이는 원인이 되고 있다.

암의 진단수단은 물리적인 방법으로 이중조영법, 압박촬영법 또는 점막촬영법 등이 있다. 또한, 조직 검사(생검)하여 암이 의심스러운 부분을 직접 진단할 수 있다. 그러나, 상기 방법들은 위생상의 문제가 있고, 검사가 진행되는 동안 환자가 고통을 감수해야 하는 단점이 있어, 이를 대체할 만한 진단 방법이 필요하다.

한편, 엑소좀은 대부분의 세포에서 분비되는 작은 형태의 소포체(membrane vesicle)이다. 엑소좀 안에는 그 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA), 지질 등이 포함되어 있는 것으로 보고되었다. 또한, 조직 유래 엑소좀은 엑소좀을 분비한 조직의 상태를 반영하기 때문에, 질병의 진단에 이용될 수 있음이 보고된 바 있다.

이에 본 발명자는 신규한 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 개발하기 위한 연구를 지속한 결과, Del-1 단백질 양성 엑소좀을 이용할 경우, 여러 종류의 암을 정확하고 신속하게 암을 진단하거나 예후를 예측할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 (a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;를 포함하는 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 (a) 암 세포에 암 치료용 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 세포에서 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현 수준을 대조구와 비교하는 단계;를 포함하는 암 치료물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;를 포함하는 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 암 세포에 암 치료용 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 세포에서 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현 수준을 대조구와 비교하는 단계;를 포함하는 암 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 Del-1 단백질 양성 엑소좀은 여러 종류의 암을 신속하게 진단할 수 있고, 특히, 유방암 0 내지 4기 중 기존에 알려진 마커 및 방법으로 측정하기 쉽지 않았던 0기 상피내암(Ductal Carcinoma in Situ, DCIS) 상태까지 측정이 가능하다. 또한, 유방암 4기에만 높은 민감도를 보이는 기존의 유방암 바이오 마커인 CA 15-3 보다 민감도가 높아 모든 유방암 진행 단계를 진단할 수 있으므로, 정확하고 신속하게 암을 진단하거나 예후를 예측하는데 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 MCF-7 세포의 침윤 활성 분석 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포의 침윤 활성을 분석한 측정 값을 나타낸 도이다.
도 3은 MDA-MB-231 세포를 속도차 원심분리하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 속도차 원심분리한 MDA-MB-231 세포 배양액에 의해 유도된 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 침윤 활성을 분석한 측정값을 나타낸 도이다.
도 5는 속도차 원심분리한 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 펠렛을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 속도차 원심분리한 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 펠렛을 유세포 분석하여 그 개수 및 크기 분포를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 속도차 원심분리한 MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포의 펠렛을 투과전자현미경으로 관찰하여 직경 구조를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 불연속 밀도 구배 원심분리하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 정상 MDA-MB-231 세포, shRab27a MDA-MB-231세포 및 비히클(vehicle) MDA-MB-231세포의 shRab27a 단백질 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 shRab27a MDA-MB-231 세포 배양액에 의해 유도된 MCF-7 세포의 침윤 활성을 분석한 측정값을 나타낸 도이다.
도 11은 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀을 웨스턴 블랏한 결과를 나타낸 도이다(EQ; Exoquick 방법, UC; 초원심분리방법).
도 12는 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀을 베지클 사이즈 분석기로 분석한 결과를 나타낸 도이다(EQ; Exoquick 방법, UC; 초원심분리방법).
도 13은 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀을 전자투과현미경으로 관찰한 것을 나타낸 도이다(EQ; Exoquick 방법, UC; 초원심분리방법).
도 14는 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀에 의해 유도된 MCF-7 세포의 침윤 분석을 실시한 측정값을 나타낸 도이다.
도 15는 MDA-MB-231 세포의 엑소좀에 열을 가한 후 침윤 활성 분석한 결과값을 나타낸 도이다.
도 16은 Del-1 단백질 발현을 웨스턴 블랏 분석하여 나타낸 도이다.
도 17은 각 siRNA에 의해 유도된 MDA-MB-231 세포의 침윤 활성을 분석한 측정값을 나타낸 도이다.
도 18은 각 siRNA 또는 MDA-MB-231 세포 배양액을 이용하여 침윤 활성을 분석한 측정값을 나타낸 도이다.
도 19는 Del-1 단백질이 과발현된 MCF-7 세포의 침윤 활성을 분석한 측정값을 나타낸 도이다.
도 20은 투과전자현미경으로 Del-1 단백질을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 면역금표지(immunogold)하여 Del-1 단백질을 관찰한 측정값을 나타낸 도이다.
도 22는 표준 Del-1 단백질의 농도에 따른 MCF-7 세포의 침윤 분석을 나타낸 도이다.
도 23은 엑소좀, 표준 Del-1 단백질, PGNase F를 처리한 엑소좀 또는 PGNase F를 처리한 표준 Del-1 단백질에 의해 유도된 MCF-7 세포의 침윤 분석을 나타낸 도이다.
도 24는 인테그린 타입의 항체에 의해 유도된 MCF-7 세포의 침윤 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 인테그린 신호 전달 하위에 있는 FAK, SRC, ERK의 인산화 및 MMP-9, MMP-2를 처리하여 웨스턴 블롯한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 다른 유방암 세포에 대한 Del-1 단백질 발현을 웨스턴 블랏 분석하여 나타낸 도이다.
도 27은 다른 유방암 세포에 의해 유도된 MCF-7 세포 침윤 분석을 실시한 결과값을 나타낸 도이다.
도 28은 다른 유방암 세포의 엑소좀에 의해 유도된 MCF-7 세포 침윤 분석을 실시한 결과값을 나타낸 도이다.
도 29는 Del-1 단백질의 매커니즘을 동물모델에서 확인하기 위한 실험을 모식화 것을 나타낸 도이다.
도 30은 유방암 동물모델의 조직을 면역조직화학검사하여 병변의 크기를 측정한 값을 나타낸 도이다.
도 31은 유방암 동물모델의 혈중 엑소좀에 의해 유도된 MCF-7 세포 침윤 분석을 실시한 결과값을 나타낸 도이다.
도 32는 MDA-MB-231 유래 엑소좀의 Del-1 단백질을 중성화하는 항체를 반응시킨 후 병변의 크기를 측정한 값을 나타낸 도이다.
도 33은 변형된 ELISA 방법으로 Del-1 단백질을 포함하는 혈중 엑소좀의 수준을 측정하는 방법에 대한 모식도를 나타낸 도이다.
도 34는 항암제인 시스플라틴을 투여한 뒤 종양의 크기, 혈중 엑소좀 및 Del-1 단백질을 포함하는 혈중 엑소좀의 변화를 측정한 값을 나타낸 도이다.
도 35는 유방암 환자의 혈중 엑소좀에 Del-1 항체 또는 PNGaseF를 처리한 것에 의해 유도된 MCF-7 세포의 침윤 분석을 실시한 결과값을 나타낸 도이다.
도 36은 유방암 환자 및 수술 후 환자 혈중 Del-1 단백질 포함 엑소좀 발현을 ELISA 하여 확인한 결과를 나타낸 도이다(C: control, D: DCIS, S1: stage 1, S2: stage 2, S3: stage 3, S4: stage 4, AS: After surge).
도 37은 CA 15-3 및 혈중 엑소좀의 Del-1 단백질 발현을 비교한 도이다.
도 38은 CA 15-3 및 혈중 엑소좀의 Del-1 단백질 발현 민감도를 비교한 도이다.
도 39는 유방암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 담도암에서 Del-1 단백질 발현을 확인한 도이다.

본 발명은 Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 암의 발병 여부를 확인하는 것이다. 본 발명에서 용어 "예후"란 암의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 바람직하게는 개체의 시료로부터 본 발명의 Del-1 단백질 양성 엑소좀 발현 수준을 확인함으로써 해당 개체의 암 발병 여부뿐만 아니라, 향후 해당 개체의 생존 예후가 좋을지 여부에 대해서까지 예측이 가능하다.

상기 암은 유방암(breast cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 뇌암(brain cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 대장암(colorectal cancer), 식도암(esophageal cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 두경부암(head and neck cancer), 신장암(kidneycancer), 폐암(소세포 및/또는 비-소세포)(lung cancer (small and/or non-small cell)), 흑색종(melanoma), 암(ovarian cancer), 생식세포암(ovary (germ cell) cancer), 전립선암(prostate cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 음경암(penile cancer), 피부암(skin cancer), 연조직 육종(soft-tissue sarcoma), 편평상피세포암(squamous cell carcinomas), 위암(stomach cancer), 고환암(testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 담도암(bile duct cancer) 및 자궁암(uterine cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암일 수 있으나, 바람직하게는, 유방암, 갑상선암, 위암, 췌장암 및 담도암이며, 더욱 바람직하게는 유방암이다.

상기 Del-1 단백질은 당화(glycosylation)된 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 '당화'는 진핵세포의 소포체에서 일어나는 대표적인 번역후 과정(post translational modification) 중의 하나이다. 이는 단백질의 구조와 기능에 변화를 가져옴으로써 단백질의 활성에 큰 영향을 미친다.

상기 Del-1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시될 수 있으며, 상기 단백질의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 단백질의 변이체란 Del-1 단백질 또는 이의 단편의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 단편에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

상기 Del-1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체를 포함하고, 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명은, 상기 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.

상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트, 또는 단백질 칩 키트를 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 키트는 마커 단백질에 해당하는 Del-1 단백질 양성 엑소좀의 발현 수준을 확인하여 이를 검출함으로써 암의 진단 및 예후 예측을 할 수 있다. 본 발명의 키트에는 암의 진단 및 예후 예측을 위한 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(O-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

또한 본 방법은,

(a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및

(b) 상기 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;를 포함하는 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군에서 1종 이상을 선택할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 혈장을 이용하는 것이다.

상기 (b) 단계의 단백질의 발현 수준을 확인하는 방법은 웨스턴블랏, 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Ouchterlony) 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS(Flow Cytometry) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 1종 이상을 선택할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 웨스턴 블랏은 하기와 같은 실험을 통해 수행될 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 단백질의 양을 확인하여, 암의 진단 및 예후를 예측할 수 있다. 상기 검출 방법은 정상 대조군에서의 Del-1 단백질의 발현량과 암 의심개체에서의 Del-1 단백질의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. 단백질 수준은 상기한 Del-1 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대강도) 차이로 나타낼 수 있다.

상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 예를 들어, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다.

상기 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, Del-1 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 암의 진단 및 예후 예측을 확인할 수 있다.

또한 본 발명은,

(a) 암 세포에 암 치료용 후보물질을 처리하는 단계;

(b) 상기 후보물질이 처리된 세포에서 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 엑소좀의 Del-1 단백질 발현 수준을 대조구와 비교하는 단계;를 포함하는 암 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "대조구"란 암에 걸리지 않은 정상개체를 의미한다.

구체적으로, 암 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 Del-1 단백질 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 엑소좀의 Del-1 단백질 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 본 발명에서 개시하고 있는 암의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 암의 치료 후보 물질의 부재하에 본 발명에서 개시된 암 세포에서의 본 발명의 엑소좀의 Del-1 단백질 발현 수준을 특정하고, 또한 암 치료 후보 물질의 존재하에서 본 발명의 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현 수준을 특정하여 양자를 비교한 후, 암 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 암 치료 후보 물질의 부재 하에서의 마커의 발현 수준보다 감소시키는 물질을 본 발명에서 개시된 암의 치료제로 예측할 수 있는 것이다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 유방암 세포의 침윤과 관련된 인자 분리 및 확인

실시예 1-1. 유방암 세포의 침윤 분석

유방암 세포의 배양액에 유방암 세포의 침윤과 관련된 인자가 존재하는지의 여부를 확인하기 위하여, 인간 유방암 세포 MDA-MB-231 및 약한 침윤성을 가지는 인간 유방암 세포 MCF-7을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 포함하는 DMEM 고농도 글루코오스(Eagle's minimal essential medium-high glucose) 배지에 각 상기 세포를 넣고 37℃에서 배양하였다. 상기 배양된 세포가 90% 이상이 되면, 1% 우태아혈청을 포함하는 배지로 교환한 후 다시 48시간 동안 배양하여 배양액을 수득하였다.

침윤 활성 분석을 수행하기 위하여, 공극 지름(pore diameter)이 8㎛인 웰(well)을 24 웰에 삽입하고 25%의 마트리겔(Matrigel)로 2시간동안 코팅하였다. 상기 코팅된 챔버에 10,000개의 MCF-7 세포를 넣어 챔버 상부에 깔고, 여기에 MDA-MB-231 세포 배양액 500 ㎕를 희석하여 첨가하였으며, 하부 웰에는 1% 우태아혈청을 포함하는 배지를 넣어 배양하였다. 48시간 뒤 코팅된 챔버를 통과한 MCF-7 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하고 현미경으로 관찰한 후 상기 통과된 MCF-7 세포를 계수하여 침윤정도를 분석하였다. 상기와 동일한 방법으로 코팅 챔버에 10,000개의 MDA-MB-231 세포를 넣어 챔버 상부에 깔고, MCF-7 배양액을 첨가하여 침윤정도를 분석하였다. 상기 침윤분석 방법에 대한 모식도를 도 1에 나타내었다. 또한, 상기 침윤분석 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, MCF-7 세포 배양액과는 다르게 MDA-MB-231 세포 배양액이 MCF-7 세포의 침윤을 2-3배 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, MDA-MB-231 세포의 침윤 능력은 MDA-MB-231 배양액에 의해서 향상되었지만 MCF-7 배양액에서는 변화하지 않았음을 확인하였다.

실시예 1-2. 유방암 세포의 침윤과 관련된 인자 분리 및 확인

상기 실시예 1-1에서 확인한 유방암 세포의 침윤과 관련된 인자를 분리하기 위하여, 유방암 세포 배양액을 가지고 속도차 원심분리 또는 불연속 밀도 구배 원심분리를 수행하였다.

보다 구체적으로, 속도차 원심분리를 수행하기 위하여, MDA-MB-231 세포가 페트리 디쉬에 80-90%로 가득찼을 때 1% 우태아혈청을 포함하는 배지로 교환한 후 다시 48시간 동안 배양하여 배양액을 수득하였다. 상기 배양액을 순차적으로 300 x g에서 3 분, 1500 x g에서 15 분 및 2500 x g에서 15분 조건으로 원심분리하여 세포, 세포 파괴물 및 세포 소기관 등을 제거하였다. 상기 원심분리된 시료의 상층액을 0.2 ㎛의 필터를 이용하여 걸러내고, 100,000 x g 에서 한시간 동안 다시 원심분리하여 엑소좀 펠렛을 수득하고 이를 PBS에 녹였다. 상기 분획 과정을 도 3에 나타내었다. 상기 실시예 1-1의 침윤 활성 분석 방법을 이용하여, 코팅 챔버에는 MDA-MB-231 또는 MCF-7 유방암 세포를 깔았다. 여기에 대조군, MDA-MB-231 유방암 세포 배양액, 상기 수득한 엑소좀을 포함한 분획 펠렛; 또는 엑소좀이 제거된 MDA-MB-231 세포 배양액(상층액 3 + 펠렛 2, 도 3 참고) 등 총 4종류를 각각 첨가하여 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 엑소좀을 포함한 분획 펠렛(펠렛 3)에서 현저하게 유방암 세포 침윤 활성이 나타났고, 엑소좀이 제거된 MDA-MB-231 세포 배양액(상층액 3 + 펠렛 2) 에서는 유방암 세포 침윤 활성이 나타나지 않았다.

또한, 상기 수득한 펠렛이 엑소좀의 고유한 특성을 지니고 있는지 확인하기 위하여, CD63 및 CD9 엑소좀 마커를 이용한 웨스턴 블랏을 수행하였고, 유세포분석기(Flow Cytometry, FACS)를 이용하여 개수 및 크기 분포를 확인하였다. 또한, 펠렛을 그리드(grid)에 부착한 후 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색하여 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)(Hitachi H-7000)을 이용하여 직경구조를 관찰하였다. 그 결과를 도 5, 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포에서 수득한 펠렛 모두 CD63 및 CD의 엑소좀 마커를 발현함을 확인하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 분리한 엑소좀이 전형적인 엑소좀의 크기를 가지고 있음을 확인하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 투과전자현미경으로 펠렛을 관찰한 결과 상기 과정을 통해 수득된 엑소좀이 전형적인 약 100 nm의 직경 구조를 가지고 있음을 확인하였다.

따라서, MDA-MB-231 또는 MCF-7 세포에서 수득한 펠렛은 엑소좀의 고유한 특성을 가지고 있음을 확인하였다.

상기 확인된 결과를 좀 더 정확하게 확인하기 위하여, 상기 수득한 펠렛을 불연속 밀도 구배 원심분리 하였다. 보다 구체적으로, 각 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 및 5% 농도의 OptiPrep 용액을(1.25―0.941 g/cm^-3) 튜브에 로딩한 후 상기 수득한 펠렛을 최상층에 로딩하여 210,000g 에서 16시간 초원심분리(ultracentrifuge) 후 각각의 분획을 다시 200,000g에서 1시간 초원심분리하였다. 상기 실시예 1-1의 침윤 활성 분석 방법을 이용하여, 코팅 챔버에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 상기 불연속 밀도 구배 원심분리한 분획물을 첨가한 후, 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 상기 침윤 활성 분석된 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 주요 분획 활성은 엑소좀이 있는 1.14-1.19 mg/ml의 밀도 분획임을 확인하였다.

따라서, 유방암 세포의 침윤에 엑소좀이 주요 역할을 함을 확인하였다.

실시예 1-3. 엑소좀과 유방암 세포의 침윤과의 관련성 확인

유방암 세포의 침윤이 분비된 엑소좀의 파생과 관련이 있는지 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 정상 MDA-MB-231 세포, Rab27a의 발현을 저해하기 위하여 shRNA 벡터를 발현하는 MDA-MB-231세포, 그리고 아무런 유전자를 발현하지 않는 벡터를 가진 비히클(vehicle) MDA-MB-231세포를 이용하였다. 상기 3 종류의 세포에서 Rab27a 단백질의 발현량을 확인하고, 10⁷ 개의 각 세포로부터 수득한 세포 배양액을 모아 원심분리하여 엑소좀 펠렛을 얻고 이를 단백질 정량하였다.

또한, 상기 실시예 1-1의 침윤 활성 분석 방법을 이용하여, 코팅 챔버에는 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 대조군, 정상 MDA-MB-231 세포 배양액, 비히클(vehicle) MDA-MB-231 세포 배양액 또는 shRab27a MDA-MB-231 세포 배양액을 첨가한 후, 유방암 세포의 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, shRab27a MDA-MB-231 세포에서의 엑소좀 분비는 종래에 보고된 바와 같이 대조군에 비해 40-50% 줄어들었음을 확인하였다.

도 10에 나타낸 바와 같이, shRab27a 발현을 감소시킨 shRab27a MDA-MB-231 세포 배양액에 의한 MCF-7 세포의 침윤 능력은, MDA-MB-231 세포 배양액에 의해 유도된 MCF-7 세포의 침윤 능력에 비해 50% 가량 감소됨을 확인하였다.

따라서, 세포 침윤 능력은 엑소좀의 분비 수준과 관련이 있음을 확인하였다.

실시예 1-4. 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀의 침윤 특성 분석

유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀의 특성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 1 내지 4기의 유방암 환자의 혈액은 경북대학교 병원에서 제공받았고, 상기 유방암 환자의 혈액 채취는 경북대학교병원의 임상시험감사위원회의 규정에 따라 진행하였다. 두 가지의 엑소좀 분리 방법을 이용하여 분리한 엑소좀의 순도를 확인하기 위하여, 서로 다른 임상단계의 유방암 환자 100명의 혈장에서 Exoquick (Systembio) 또는 플라즈마 순환 엑소좀을 분리하는 초원심분리법을 이용하여 엑소좀을 분리하였다. 상기 두 가지 방법으로 분리된 엑소좀을 CD63 및CD9 엑소좀 마커를 이용한 웨스턴 블랏, 베지클 사이즈 분석기(Model　ELS-Z　(Otsuka　Electronics Co.) 및 전자투과현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 11, 도 12 및 도 13에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 초원심분리법 또는 Exoquick 분리법으로 수득한 엑소좀은 CD63 및 CD9 엑소좀 마커를 발현함을 확인하였다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 초원심분리법으로 수득한 엑소좀의 평균 크기는 91.1nm, Exoquick 분리법으로 수득한 엑소좀의 평균 크기는 101.8nm로 두 분리법으로 수득한 엑소좀간의 크기 차이가 없음을 확인 하였다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 초원심분리법 또는 Exoquick 분리법으로 수득한 엑소좀의 크기 차이가 없음을 확인 하였다.

또한, 상기 유방암 환자에서 채취한 혈액을 17000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 혈장을 얻었다. 상기 원심분리한 시료에 Exoquick-Exosome Precipitation Solution (System biosciences)을 혈장부피의 1/4로 섞어준 다음 2시간 동안 4℃에서 휴지시킨 후 1500 x g 에서 30분간 다시 원심분리하였다. 상기 원심분리한 시료의 상층액을 제거하고 엑소좀 펠렛을 PBS에 녹여 이용하였다. 상기 실시예 1-1의 방법을 이용하여, 코팅 챔버에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 0 기를 의미하는 상피내암(Ductal Carcinoma in Situ, DCIS) 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀, 1 내지 4기 유방암 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀, 수술 후 환자의 혈장에서 분리한 엑소좀; 또는 정상인의 혈장에서 분리한 엑소좀을 첨가하여 MCF-7 세포의 침윤 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 1 내지 4 기의 유방암 환자 혈장 엑소좀이 정상인의 엑소좀에 비해 MCF-7 세포 침윤이 3 ~ 4 배에 증가됨을 확인하였다. 또한, 다른 장기나 림프 노드(lymph node)로의 전이가 일어나지 않은 0 단계인 상피내암(DCIS) 상태의 혈중 엑소좀이 높은 단계 환자의 혈중 엑소좀과 비슷한 수준으로 MCF-7 세포의 침윤을 유도한다는 것을 확인하였다.

따라서, 기관 수준에서 미세 전이가 관찰되지 않은 초기 단계의 유방암 세포에서도 이미 침윤능력을 지닌 엑소좀이 분비될 수 있음을 확인하였다. 또한, 수술로 인해 암 조직을 제거한 경우 정상인과 비슷한 수준으로 혈중 엑소좀의 침윤 능력이 줄어듦을 확인하였다.

실시예 2. 유방암 세포의 침윤과 관련된 엑소좀의 특성 확인

실시예 2-1. 엑소좀 구성 요소 중 침윤을 유도하는 요소 확인

엑소좀의 단백질, RNA 및 지질 중 어느 요소가 유방암 세포의 침윤을 유도하는지 확인하기 위하여, 엑소좀을 고온으로 변성시켜 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 1-1의 침윤 활성 분석 방법을 이용하여, 코팅 챔버에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 대조군, MDA-MB-231 엑소좀, 90℃에 5분간 열을 가한 MDA-MB-231 엑소좀 및 65℃에 5분간 열을 가한 MDA-MB-231 엑소좀을 넣어 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 90℃ 및 65℃로 열을 가한 엑소좀의 침윤 활성이 열을 가하지 않은 엑소좀 보다 더 낮은 것은 것으로 보아 엑소좀의 단백질이 유방암 세포의 침윤과 관련되어 있음을 확인하였다.

실시예 2-2. 엑소좀 단백질 중 Del-1 확인

엑소좀 단백질 중 어느 단백질이 유방암 세포의 침윤을 유도하는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 질량 분석기를 이용한 비 표지 정량법을 이용하였다. 엑소좀 단백질 시료는 효과적인 펩타이드화를 위하여 10mM의 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 처리한 후 60℃에서 20분간 환원시키고, 50mM의 요오드아세트아미드(iodoacetamide)를 처리하여 알킬화(alkylation)하여 상기 엑소좀 단백질의 변성을 유도하였다. 반응이 끝난 상기 엑소좀 단백질 시료에 아크릴아미드(acrylamide), 과산화황산암모늄(ammonium persulfate) 및 테트라메틸에틸렌디아민(Tetramethylethylenediamine, TEMED)을 넣고 겔 상태로 만들어 굳혔다. 상기 굳은 젤을 작은 조각으로 자른 후 100mM TEAB(triethylammonium bicarbonate) 용액 및 아세토니트릴(acetonitrile) 용액으로 세척하고 완전히 감압 건조하였다. 상기 건조된 겔 조각에 트립신(trypsin)을 처리하여 37℃에서 15시간 동안 반응시켜 펩타이드화하였다. 상기 펩타이드는 겔에서 추출하여 염을 제거하고 nano-UPLC와 Q-Tof Premier (waters) 기기의 질량 분석법(Mass spectrometry)을 이용하여 프로테옴을 분석하였다. 상기 분석된 데이터는 MASCOT 프로그램을 통해 단백질을 동정하고, IDEAL-Q 프로그램으로 정량 정보를 분석하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

AccNo	Description	Protein score	No. of peptides	MB231/MCF7 ratio	SD
IPI00306046	EDIL3 Isoform 1 of EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3	507	16	6.422	0.476
IPI00022418	FN1 Isoform 1 of Fibronectin	464	19	2.505	4.863

표 1에 나타낸 바와 같이, MCF-7 엑소좀과 비교하여 MDA-MB-231 엑소좀에서 높은 발현을 보이는 단백질을 확인하였다. 특히, MDA-MB-231 엑소좀에서 높은 발현을 보이는 단백질 중에서, 인테그린 신호 전달 경로를 통해 암의 혈관 신생에 중요한 역할을 하고, 세포의 외부 막에 위치한 것으로 알려진 Del-1 단백질을 확인하였다.

또한, 상기 과정을 통해 확인한 Del-1 단백질 양성 엑소좀이 인테그린 신호 전달 경로를 통해 유방암의 전이를 매개하는지 확인하기 위하여, 유방암 세포인 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포를 배양하여 수득한 엑소좀; 정상 유방 세포주인 MCF10A; 및 유방암 세포주인 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포를 각각 용해하여 수득한 세포 용해물을 이용하였다. 상기 시료를 Del-1 단백질 항체를 이용하여 웨스턴 블랏한 후, Del-1 단백질 발현을 확인하고 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)로 단백질 로딩(loading)하여 확인하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, Del-1 단백질 발현이 각 MCF-7 엑소좀 및 이의 세포 용해물에서는 그 발현이 줄어듦을 확인하였고, MDA-MB-231 엑소좀 및 이의 세포 용해물에서는 그 발현이 증가함을 확인하였다. 또한, 정상의 유방 세포주인 MCF10A 에서 Del-1 단백질의 발현이 거의 없는 것과 MCF10A 세포에서 분비된 엑소좀의 양이 웨스턴 블랏 분석이 불가능할 정도로 적다는 것을 확인하였다.

또한, Del-1 단백질의 엑소좀을 통한 기능을 확인하기 위해, Del-1 단백질의 siRNA를 MDA-MB-231 세포에 형질주입(transfection) 시켜 넉다운(knockdown) 실험을 진행하였다. Del-1 단백질의 각 siRNA의 3가지 서열(sequence)과 대조군 (siScrambled) 서열을 METAFECTENE SI (Biontex) 형질주입 시약(transfection reagent)과 섞어 리포플렉스(lipoplex)로 결합시켰다. 상기 결합시킨 리포플렉스를 형질주입 배양액에 섞어 MDA-MB-231 세포를 형질전환 시켜 Del-1 단백질의 발현이 감소하도록 유도하였다. 세포 용해물과 엑소좀에서 Del-1 단백질의 발현이 감소하였는지를 확인하였다. 또한, 상기 실시예 1-1의 침윤 활성 분석방법을 이용하여, 코팅 챔버에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 상기 Del-1 단백질의 발현에 영향이 없는 Scrambled 서열과 Del-1 단백질의 발현을 억제시킨 siRNA 세가지 서열을 처리하여 얻은 각 배양액과 MDA-MB-231의 엑소좀, 정상 MDA-MB-231의 배양액을 농축하여 첨가하여 처리하였다.

추가적으로, Del-1 단백질의 발현이 적은 MCF-7에 Del-1 단백질을 과발현시켜 Del-1 단백질의 역할을 확인하였다. 먼저 MCF-7 세포에 인간 Del-1 단백질 코딩 플라스미드를 형질전환물질과 함께 처리하여 세포가 Del-1 단백질을 발현하도록 유도하고, 단백질을 코딩(coding)하지 않는 비히클 플라스미드(vehicle plasmid)를 대조군으로 처리하였다. 형질전환된 MCF-7의 세포 용해물을 Del-1 단백질로 웨스턴블랏하여 Del-1 단백질이 과발현된 것을 확인하였다. 이들 세포로부터 얻은 배양액을 세포 침윤 분석하였다. 그 결과를 도 17, 도 18 및 도 19에 나타내었다.

도 17에 나타낸 바와 같이, Del-1 단백질 발현의 양이 약 25-50 % 감소함을 확인하였다.

도 18에 나타낸 바와 같이, MCF-7 세포 침윤 분석을 통해 Del-1 단백질 발현이 줄어든 MDA-MB-231 세포 배양액은 정상상태에 비해 약 2-3배 가량 침윤 능력 유도가 감소함을 확인하였다.

도 19에 나타낸 바와 같이, Del-1 단백질이 과발현된 MCF-7 세포의 침윤 능력은 정상상태에 비해 증가함을 확인하였다.

또한, 엑소좀의 Del-1 단백질을 관찰하기 위해, 면역금표지(immunogold)하였다. 보다 구체적으로, MDA-MB-231 세포에서 분리한 엑소좀을 포름알데히드로 고정시킨 뒤 순수한 탄소가 코팅된 그리드(pure carbon coated grid)에 흡착시킨 후 1% BSA로 블로킹(blocking) 하고 Del-1 단백질의 항체와 9 내지 11 ㎛ 크기의 금표지된 2차 항체를 순차적으로 결합시켰다. 결합된 시료를 0.5% 우라닐 아세테이트 용액으로 염색한 뒤 투과전자현미경으로 확인하였다. 또한, 상기 실시예 1-1의 침윤 활성 분석방법을 이용하여, 코팅 챔버에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 MDA-MB-231 세포에서 분리한 엑소좀에 Del-1 단백질 항체를 이용하여, Del-1 단백질 기능이 중성화된 배양액을 첨가하여 침윤 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 20 및 도 21에 나타내었다.

도 20에 나타낸 바와 같이, 엑소좀의 표면에 Del-1 단백질이 존재함을 확인하였다.

도 21에 나타낸 바와 같이, 중성화된 MDA-MB-231 세포의 침윤 활성 능력이 중성화시키지 않은 엑소좀에 비해 감소함을 확인하였다.

실시예 3. 엑소좀 Del-1 단백질의 특징 확인

실시예 3-1. 엑소좀 Del-1 단백질의 유방암 세포 침윤 유도 확인

Del-1 단백질이 유방암 세포의 침윤을 유도함을 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로. 상기 실시예 1-1의 침윤 활성 분석 방법을 이용하여, 코팅 챔버에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 표준 Del-1 단백질(R&D systems)을 0.05 내지 2 ㎍으로 첨가 처리하여 침윤 분석을 실시하였다. 또한, 코팅 챔버에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 엑소좀, 표준 Del-1 단백질, PGNase F를 처리한 엑소좀 또는 PGNase F를 처리한 표준 Del-1 단백질을 첨가하여 처리하였다. 상기 PNGase F는 Del-1 단백질의 N-당화(N-glycosylation) 그룹을 제거할 수 있는 것이다. 그 결과를 도 22 및 도 23에 나타내었다.

도 22에 나타낸 바와 같이, MCF-7 세포의 침윤 능력은 Del-1 단백질의 양과 정비례 관계가 있음을 확인하였다.

도 23에 나타낸 바와 같이, 표준 Del-1 단백질의 분자량이 세포 용해물보다 엑소좀이 더 큼을 확인하였다. 또한, 표준 Del-1 단백질과 엑소좀의 Del-1 단백질은 세포 용해물의 분자량과 비슷하게 변화하고, PNGase F 처리를 한 엑소좀 및 표준 Del-1 단백질을 이용하여 MCF-7 세포 침윤 분석을 진행하였을 때 PNGase F 의 처리에 의해 당화를 제거한 경우에 침윤 능력이 떨어짐을 확인하였다.

실시예 3-2. Del-1 단백질의 수용체 확인

MCF-7세포의 침윤과 관련된 Del-1 단백질의 수용체를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, MCF-7 세포 침윤 분석을 통하여 여러 인테그린 타입의 항체를 이용하여 표준 Del-1 단백질과 인테그린의 상호작용을 확인하였다. 상기 실시예 1-1의 침윤 활성분석 방법을 이용하여, 각 β1, β5, αv, αvβ5 및 αvβ6 타입의 인테그린의 항체와 RGD 펩타이드(RGD peptide), RGE 펩타이드(RGE peptide) 및 IgG (일반 항체로, 실험의 control로 사용됨)와 MCF-7 세포를 10분동안 배양한 뒤 코팅 챔버에 깔고, 표준 Del-1 단백질 또는 엑소좀을 첨가하여 침윤 활성 분석하였다.

또한, 단백질의 인산화 정도를 확인하기 위하여 MCF-7 세포에 표준 Del-1 단백질 및 엑소좀을 세포 신호 전달물질의 저해제와 함께 30분간 처리한 후 세포 용해물을 얻어 각 단백질의 인산화 타입 및 본 단백질의 항체들을(인테그린 신호 전달의 하위에 있는 FAK(focal adhesion kinase), SRC(family of protooncogenic tyrosine kinase), ERK(signal-regulated kinase)) 이용하여 웨스턴 블랏을 실시하였다. MMP9과 MMP2의 활성을 측정하기 위하여 표준 Del-1 단백질 및 엑소좀을 세포 신호 전달물질의 저해제와 함께 24시간 동안 처리한 후 세포 배양액을 얻어 이를 농축하여 젤라틴이 포함된 젤을 이용하여 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 MMP의 젤라틴 분해를 유도한 뒤 젤을 염색하여 분해된 젤라틴 밴드를 통해 MMP의 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 24 및 도 25에 나타내었다.

도 24에 나타낸 바와 같이, 그 결과 인테그린의 중성화작용에 의하여 표준 Del-1 단백질 또는 엑소좀 처리에 의한 침윤 활성 증가가 떨어진 것을 확인하였으며, 이는 인테그린의 길항제(antagonist)인 RGD 및 RGD의 대응대조군인(counterpart control) RGE를 함께 처리하여 침윤 활성의 감소를 확인하였다.

도 25에 나타낸 바와 같이, 표준 Del-1 단백질 처리하였을 때 FAK, SRC, ERK의 인산화가 증가하고, MMP-2 및 MMP-9의 활성도 증가함을 확인하였다. 또한, MDA-MB-231 세포에서 분비된 Del-1 단백질을 지닌 엑소좀을 MCF-7 세포에 처리하였을 때도 FAK, SRC 및 ERK의 인산화와, MMP-2 및 MMP-9의 활성이 증가함을 확인하였다. 상기 현상은 RGD 펩타이드, FAK의 인산화 저해제인 PF573228, Del-1 단백질을 중성화시킬 수 있는 Del-1 항체를 처리하였을 때 감소됨을 확인하였다.

따라서, 엑소좀에 있는 Del-1 단백질뿐만 아니라 표준 Del-1 단백질도 MCF-7 세포의 인테그린 신호 전달 경로를 통해 침윤 능력을 유도하는 것을 확인하였다.

실시예 3-3. 다른 유방암 세포에서 Del-1 단백질의 발현 확인

다른 유방암 세포에서 Del-1 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 다른 유방암 세포인 BT-549, MDA-MB-453, UACC-812, UACC-893, UACC-3199, UACC-3133, UACC-1179 및 UACC-732을 이용하여 웨스턴 블랏하였다.

또한, 상기 실시예 1-1의 침윤 활성분석 방법을 이용하여, 코팅 챔버에 MCF-7 유방암 세포를 깔고, 여기에 상기 다른 유방암 세포들을 처리하여 MCF-7세포의 침윤 활성 여부를 실험하였다. 또한, 코팅 챔버에 MCF-7 유방암 세포를 깔고, 여기에 상기 다른 유방암 세포들에서 분리한 엑소좀을 처리하여 MCF-7세포의 침윤 활성 여부를 실험하였다. 그 결과를 도 26, 도 27 및 도 28에 나타내었다.

도 26에 나타낸 바와 같이, 다른 유방암 세포에서도 Del-1 단백질이 발현함을 확인하였다.

도 27에 나타낸 바와 같이, Del-1 단백질의 발현이 MCF-7 세포의 침윤을 증가시키고, 완전한 상관관계는 아니지만 다른 요인뿐만 아니라 Del-1 단백질이 유방암 세포의 침윤 활성에 관여할 수 있음을 확인하였다.

도 28 에 나타낸 바와 같이, 이러한 여러 종류의 세포에서 분리한 엑소좀도 MCF-7 세포의 침윤 능력을 증가시키고 Del-1 단백질 항체에 의해 활성이 저해됨을 확인하였다.

따라서, 유방암 세포에서 분비되는 Del-1 단백질 양성 엑소좀은 인테그린 신호 전달 경로를 통해 유방암 세포의 침윤과 연결되어 있다는 것을 확인하였다.

실시예 3-4. 동물모델을 이용한 유방암 세포 침윤에 대한 Del-1 단백질의 메커니즘 확인

상기 실시예 3-1 내지 3-3에서 확인한 유방암 세포 침윤에 대한 Del-1 단백질의 메커니즘을 동물모델에서 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, BALB/c Nude 마우스의 유방 지방 패드에 MCF-7, MDA-MB-231 및 MDA-MB-231shRab27a 세 종류의 세포를 주입하고 각 종류 마다 두 군으로 나누었다. 한 군은 3일마다 MDA-MB-231 유래 엑소좀을 주입하고 다른 한군은 PBS를 주입하였다. 암세포 주입 3 주후에 마우스를 희생하여 폐를 분석하였다. 이를 도 29에 나타내었다. 상기 폐의 전이성 병변을 인간의 비멘틴(vimentin)에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학검사(immunohistochemistry, IHC)하여 병변의 크기를 확인하였다. 또한, 상기 실시예 1-1의 침윤 활성분석 방법을 이용하여, 코팅 챔버에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 MB-231, MDA-MB-231 shRab27a 및 MCF-7 세포를 주입하여 만든 유방암 동물모델의 혈중 엑소좀을 첨가하여 침윤 활성 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 30 및 도 31에 나타내었다.

도 30에 나타낸 바와 같이, 폐의 전이성 병변은 예상대로 MDA-MB-231, MDA-MB-231shRab27a 및 MCF-7 세포 순서로 나타났고, 유방암 세포만 주입한 경우에 비하여 유방암 세포와 MDA-MB-231 엑소좀을 같이 주입한 군에서 병변의 크기가 유의하게 커졌음을 확인하였다. 특히, 약한 침윤성을 가지는 MCF-7 세포를 MDA-MB-231 엑소좀과 공동 주입하였을 때 전이성 병변의 크기가 2 ~ 3 배에 커졌음을 확인하였다.

도 31에 나타낸 바와 같이, MCF-7 세포의 침윤 능력은 MDA-MB-231 세포를 주입한 마우스의 혈중 엑소좀에 의해 증가하였고, MDA-MB-231shRab27a 세포를 주입한 마우스에서는 반으로 감소함을 확인하였다. 또한, MCF-7 세포를 주입한 마우스의 혈중 엑소좀에 의해서는 낮은 빈도로 침윤이 일어남을 확인하였다.

따라서, MDA-MB-231 세포에서 유래한 혈중 엑소좀은 유방암 세포의 전이에 영향을 미침을 확인하였다.

또한, 동물모델에서 엑소좀 Del-1 단백질의 역할을 알아내기 위해, 보다 구체적으로, BALB/c Nude 마우스의 유방 지방 패드에 2×10⁶의 MDA-MB-231 Rab27a KD 세포를 주입한 후 PBS, 정상 MDA-MB-231 세포 유래 엑소좀, MDA-MB-231 엑소좀에 Del-1 단백질 항체와 사전 반응시킨 것, MDA-MB-231 엑소좀에 IgG와 사전 반응 시킨 것을 암세포 주입 후 3일째부터 3주 동안 일주일에 3회씩 주입하였다. 3주 후 상기 마우스의 장기를 척출하여 각 장기로 옮겨간 유방암 세포를 비멘틴(vimentin) 단백질로 염색하여 그 결과를 관찰하였다. 그 결과를 도 32에 나타내었다.

도 32에 나타낸 바와 같이, 엑소좀의 Del-1 단백질은 동물 모델에서도 유방암 세포의 전이를 촉진함을 확인하였다.

또한, 동물모델에 MDA-MB-231 세포 주입에 따른 종양의 크기, 혈중 엑소좀 및 Del-1 단백질을 가지는 혈중 엑소좀의 변화를 관찰하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, MDA-MB-231 세포를 마우스에 투여한 후, 종양의 크기, 혈중 엑소좀, Del-1 단백질을 가지는 혈중 엑소좀의 변화를 관찰하였으며, 종양의 크기는 캘리퍼를 이용하여 장축과 단축의 길이를 이용하여 확인하였다. 혈중 엑소좀의 수준은 엑소좀 마커인 CD63을 이용한 ELISA 방법으로 측정하였다. 또한, Del-1 단백질을 포함하는 혈중 엑소좀의 수준은 도 33에 나타낸 바와 같이, 변형된 ELISA 방법으로 측정하였다. ELISA 플레이트에 엑소좀 마커인 CD63 항체를 도포한 후 혈장 1 ul를 넣고 반응시켜 엑소좀을 부착시켰다. 그 후 Del-1 항체를 이용하여 Del-1 단백질을 포함하는 엑소좀의 발현을 확인하였다.

그 결과, 종양의 크기는 세포 주입 후 1주차부터 점차적으로 증가하여 10주차 때 최대가 되었음을 확인하였다. 혈중 엑소좀의 수준은 10주간 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 또한, Del-1 단백질을 포함하는 혈중 엑소좀의 수준은 종양의 크기를 확인할 수 없는 초기 상태인 2주에 증가하여 10주까지 높은 수준을 유지함을 확인하였다.

따라서, 종양 크기가 작은 상태에서도 암세포는 계속 엑소좀을 분비함을 확인하였다.

실시예 4. Del-1 단백질 양성 엑소좀의 유방암 진단 또는 예후 예측용 마커로서의 이용 가능성 확인

실시예 4-1. 항암제 투여에 따른 혈중 Del-1 단백질 양성 엑소좀의 변화

항암제인 시스플라틴을 투여하여 유방암 종양의 크기, 혈중 엑소좀, Del-1 단백질을 가지는 혈중 엑소좀 변화를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 마우스에 MDA-MB-231 세포를 투여한 7주 및 8주 후에 항암제인 시스플라틴을 주사하고 종양의 크기, 혈중 엑소좀 및 Del-1 단백질을 가지는 혈중 엑소좀의 변화를 관찰하였다. 혈중 엑소좀의 수준은 엑소좀 마커 CD63을 사용하여 확인하였다. 또한, 상기 실시예 1-1의 침윤 활성분석 방법을 이용하여, 매 주마다 동물 모델의 혈중 엑소좀을 수집하여, MCF-7 세포의 침윤 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 34에 나타내었다.

도 34에 나타낸 바와 같이, 종양의 크기는 8주부터 더 이상 증가하지 않고 그 후 점차 감소함을 확인하였다. 또한 실험 기간 동안 혈중 엑소좀의 수준은 유의한 차이를 보이지 않았다. 혈중 Del-1 단백질을 포함하는 엑소좀의 수준은 시스플라틴 처리 후 1주후 (8주차)에 극적으로 감소하였고 10주차까지 유지함을 확인하였다.

따라서, 항암제인 시스플라틴에 의한 MDA-MB-231 세포의 증식 억제는 Del-1 단백질을 포함하는 엑소좀의 생산을 감소시킴을 확인하였다. 상기 결과에 따라, MDA-MB-231 세포로부터 분비된 Del-1 단백질을 포함하는 엑소좀은 유방암 세포의 현재 상태를 나타내는 좋은 초기 바이오 마커 후보로 이용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 4-2. 유방암 환자의 혈중에 침윤과 관련된 엑소좀 Del-1 단백질의 확인

유방암 환자의 혈중에 침윤과 관련된 엑소좀 Del-1 단백질을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 1-1의 침윤 활성분석 방법을 이용하여, 코팅 챔버에 MCF-7 세포를 깔고, 여기에 유방암 환자의 혈중 엑소좀에 Del-1 항체 처리한 것; 또는 PNGaseF를 처리한 것을 첨가하여 침윤 활성 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 35에 나타내었다.

도 35에 나타낸 바와 같이, 각 환자의 혈중 엑소좀을 MCF-7 세포에 처리하였을 때보다 엑소좀에 탈 당화를 시킨 시료와 엑소좀의 del-1을 중성화 시켰을 때 MCF-7 세포에 침윤능력이 감소함을 확인하였다. 이에 따라, 혈중 엑소좀에 있는 당화된 Del-1 단백질이 침윤능력의 주요한 형태라는 것을 확인하였다.

실시예 4-3. Del-1 단백질 양성 엑소좀의 유방암 진단 또는 예후 예측용 마커로서 이용 가능성 확인

Del-1 단백질을 포함한 엑소좀이 유방암의 진단 또는 예후 예측용 마커로서 이용 가능성이 있는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 96 웰 플레이트에 CD63 다클론성항체(poly clonal antibody)를 O/N으로 방치하여 코팅한 후 각 웰에 차단(blocking) 용액을 이용하여 차단하였다. 유방암 단계 0 기 (DCIS), 1, 2, 3 및 4기 환자 및 수술 후의 환자의 혈액 및 정상인의 혈액을 1ul 넣어준 후 2시간 반응시키고 충분히 세척한 후 검출 항체(detection antibody)로 단클론(mono clonal) Del-1 항체를 이용하여 엑소좀의 Del-1 단백질 발현을 확인하였다. 또한, 재조합 Del-1 단백질(recombinant Del-1)을 이용하여 표준 곡선을 그리고 그 곡선의 추세선(y=0.0197x + 0.1104, x, 혈중 엑소좀 del-1 농도, y, O.D)을 이용하여 혈중 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현을 계산하였다.

또한, 전이성(4 단계) 유방암을 검출하는 현재의 분자 진단 바이오 마커인 CA 15-3과 혈중 엑소좀의 Del-1 단백질 발현을 비교하였다. CA 15-3 실험은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 그 결과를 도 36 내지 도 38에 나타내었다.

도 36에 나타낸 바와 같이, 정상인과 유방암 환자에서 특이적인 차이가 있음을 확인하였다.

도 37에 나타낸 바와 같이, 전이성 유방암에서만 정상인과 비교하여 유의한 차이를 보임을 확인하였다.

도 38에 나타낸 바와 같이, CA 15-3은 낮은 단계의 유방암인 0, 1, 2, 3기에서 낮은 민감도를 보였고, 전이성 암인 4기에서만 민감도가 높음을 확인하였다. 또한, Del-1 단백질을 포함하는 혈중 엑소좀의 수준은 모든 단계의 유방암에서 증가하였고, 수술 후에는 감소하였는데, 이는 환자 혈중의 엑소좀의 기능을 반영하는 MCF-7 세포의 침윤 분석의 결과와 같은 추세를 보임을 확인하였다.

실시예 5. Del-1 단백질 양성 엑소좀의 다른 암 진단 또는 예후 예측용 마커로서의 이용 가능성 확인

Del-1 단백질을 포함한 엑소좀이 다른 암의 진단 또는 예후 예측용 마커로서 이용 가능성이 있는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 암에 걸리지 않은 정상인, 유방암 환자, 갑상선 암 환자, 위암 환자, 췌장암 환자, 담도 암 환자 및 류마티스 관절염 환자의 혈장을 이용하여 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현을 확인하였다. 96 웰 플레이트에 CD63 다클론성항체(poly clonal antibody)를 O/N으로 방치하여 코팅한 후 각 웰에 차단(blocking) 용액을 이용하여 차단하였다. 유방암 환자, 갑상선 암 환자, 위암 환자, 췌장암 환자, 담도 암 환자 및 류마티스 관절염 환자의 혈액 및 정상인의 혈액을 1ul 넣어준 후 2시간 반응시키고 충분히 세척한 후 검출 항체(detection antibody)로 단클론(mono clonal) Del-1 항체를 이용하여 엑소좀의 Del-1 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 39에 나타내었다.

도 39에 나타낸 바와 같이, 정상인과 비교하여 유방암뿐만 아니라 다른 암 중에서도 Del-1 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for diagnosing or prognosising cancer comprising Del-1 protein positive exosome <130> KNU1-184 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 480 <212> PRT <213> Del-1 protein of exosome <400> 1 Met Lys Arg Ser Val Ala Val Trp Leu Leu Val Gly Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15 Val Pro Gln Phe Gly Lys Gly Asp Ile Cys Asp Pro Asn Pro Cys Glu 20 25 30 Asn Gly Gly Ile Cys Leu Pro Gly Leu Ala Asp Gly Ser Phe Ser Cys 35 40 45 Glu Cys Pro Asp Gly Phe Thr Asp Pro Asn Cys Ser Ser Val Val Glu 50 55 60 Val Ala Ser Asp Glu Glu Glu Pro Thr Ser Ala Gly Pro Cys Thr Pro 65 70 75 80 Asn Pro Cys His Asn Gly Gly Thr Cys Glu Ile Ser Glu Ala Tyr Arg 85 90 95 Gly Asp Thr Phe Ile Gly Tyr Val Cys Lys Cys Pro Arg Gly Phe Asn 100 105 110 Gly Ile His Cys Gln His Asn Ile Asn Glu Cys Glu Val Glu Pro Cys 115 120 125 Lys Asn Gly Gly Ile Cys Thr Asp Leu Val Ala Asn Tyr Ser Cys Glu 130 135 140 Cys Pro Gly Glu Phe Met Gly Arg Asn Cys Gln Tyr Lys Cys Ser Gly 145 150 155 160 Pro Leu Gly Ile Glu Gly Gly Ile Ile Ser Asn Gln Gln Ile Thr Ala 165 170 175 Ser Ser Thr His Arg Ala Leu Phe Gly Leu Gln Lys Trp Tyr Pro Tyr 180 185 190 Tyr Ala Arg Leu Asn Lys Lys Gly Leu Ile Asn Ala Trp Thr Ala Ala 195 200 205 Glu Asn Asp Arg Trp Pro Trp Ile Gln Ile Asn Leu Gln Arg Lys Met 210 215 220 Arg Val Thr Gly Val Ile Thr Gln Gly Ala Lys Arg Ile Gly Ser Pro 225 230 235 240 Glu Tyr Ile Lys Ser Tyr Lys Ile Ala Tyr Ser Asn Asp Gly Lys Thr 245 250 255 Trp Ala Met Tyr Lys Val Lys Gly Thr Asn Glu Asp Met Val Phe Arg 260 265 270 Gly Asn Ile Asp Asn Asn Thr Pro Tyr Ala Asn Ser Phe Thr Pro Pro 275 280 285 Ile Lys Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr Pro Gln Val Cys Arg Arg His 290 295 300 Cys Thr Leu Arg Met Glu Leu Leu Gly Cys Glu Leu Ser Gly Cys Ser 305 310 315 320 Glu Pro Leu Gly Met Lys Ser Gly His Ile Gln Asp Tyr Gln Ile Thr 325 330 335 Ala Ser Ser Ile Phe Arg Thr Leu Asn Met Asp Met Phe Thr Trp Glu 340 345 350 Pro Arg Lys Ala Arg Leu Asp Lys Gln Gly Lys Val Asn Ala Trp Thr 355 360 365 Ser Gly His Asn Asp Gln Ser Gln Trp Leu Gln Val Asp Leu Leu Val 370 375 380 Pro Thr Lys Val Thr Gly Ile Ile Thr Gln Gly Ala Lys Asp Phe Gly 385 390 395 400 His Val Gln Phe Val Gly Ser Tyr Lys Leu Ala Tyr Ser Asn Asp Gly 405 410 415 Glu His Trp Thr Val Tyr Gln Asp Glu Lys Gln Arg Lys Asp Lys Val 420 425 430 Phe Gln Gly Asn Phe Asp Asn Asp Thr His Arg Lys Asn Val Ile Asp 435 440 445 Pro Pro Ile Tyr Ala Arg His Ile Arg Ile Leu Pro Trp Ser Trp Tyr 450 455 460 Gly Arg Ile Thr Leu Arg Ser Glu Leu Leu Gly Cys Thr Glu Glu Glu 465 470 475 480 <210> 2 <211> 1353 <212> DNA <213> Del-1 cDNA of exosome <400> 2 gacctctgta ttcaacattc ctatcacttt tgtaggtaac tgtgctattg cataatatgg 60 ccatacttaa gtcattttcc ttgagaatag agaagtaaag gagaaaccaa tgatttttcc 120 cccacttcag atctcacctg ccagcactga tgtaagactt cacctcccta tttcaaggca 180 cattattatc atcagtctgg ataaatttgc aaaggaaaat gagagttact ggtgtgatta 240 cccaaggagc caagaggatt ggaagcccag agtatataaa atcctacaaa attgcctaca 300 gtaatgatgg aaagacttgg gcaatgtaca aagtgaaagg caccaatgaa gacatggtgt 360 ttcgtggaaa cattgataac aacactccat atgctaactc tttcgcaccc cccataaaag 420 ctcagtatgt aagactctat ccccaagttt gtcgaagaca ttgcactttg cgaatggaac 480 ttcttggctg tgaactgtcg ggttgttctg agcctctggg tatgaaatca ggacatatac 540 aagactatca gatcactgcc tccagcatct tcagaacgct caacatggac atgttcactt 600 gggaaccaag gaaagctcgg ctggacaagc aaggcaaagt gaatgcctgg acctctggcc 660 acaatgacca gtcacaatgg ttacaggaga actaaaggaa aggttttcaa aattaagtga 720 ccaccaggcc actggaaaca tttgtcaata tgaaggatta ttctgatttc caaatcacag 780 ttccaatatt tctcatttat gaaggttcac ctataaagaa gatctaaaag aggtcaagta 840 atgaaacttg tatatgattg tgagacagct tccgttcttc tatagtattg acatatgttg 900 gagtgtgcta agtgaatcga aggatgctca cactttccta ggactataag tcatctttat 960 gtattttttc atttttttaa accacatacc atgaataaga aatctttttg atttttataa 1020 ttttatgatg tcaaagggaa tccccactat ccaattagaa aaaagaactt tttataaaca 1080 aaacaaaatt gaaaggacat ttgtacagaa aatacttaag tgcaaacaaa agtgcagcca 1140 atatcaatgt agtataagga gtgcataatt tgaggtacaa aatatagatg tgagggctga 1200 caaattatat caatactctg agacttcaat attctttctt tttttatgta aaatggagat 1260 actacaaaaa aagatcagcc ccagcctatc ttctcctttt aaaattcctc acacaagtaa 1320 aattctggtg tctaaatcat gactggacga atc 1353

Claims (10)

1. Del-1 단백질 양성 엑소좀을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 Del-1 단백질은 당화(glycosylation)된 것을 특징으로 하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 Del-1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 Del-1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 암호화 되는 것을 특징으로 하는 암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트.
6. 제5항에 있어서,
   상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트, 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단 또는 예후 예측용 키트.
7. (a) 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
   (b) 상기 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;를 포함하는 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
9. 제7항에 있어서,
   상기 (b) 단계의 단백질의 발현 수준을 확인하는 방법은 웨스턴블롯팅, 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Ouchterlony) 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS(Flow Cytometry) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
10. (a) 암 세포에 암 치료용 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 후보물질이 처리된 세포에서 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 엑소좀의 Del-1 단백질의 발현 수준을 대조구와 비교하는 단계;를 포함하는 암 치료물질의 스크리닝 방법.
    

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