KR20210126921A

KR20210126921A - Gcc2 단백질을 과발현하는 엑소좀 기반 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물

Info

Publication number: KR20210126921A
Application number: KR1020200044608A
Authority: KR
Inventors: 김현구; 최병현; 유화 콴; 노지윤
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2020-04-13
Filing date: 2020-04-13
Publication date: 2021-10-21
Also published as: US20230145939A1; KR102318328B1; WO2021210826A1; KR102318328B9

Abstract

본 발명의 일 실시예에 따르면, GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 단백질 과발현 엑소좀을 포함하는, 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물이 제공된다.

Description

GCC2 단백질을 과발현하는 엑소좀 기반 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물{COMPOSITION FOR DIAGNOSING OR PROGNOSING CANCER INCLUDING EXOSOME OVEREXPRESSING GCC2 PROTEIN}

본 발명은 GCC2 단백질을 과발현하는 엑소좀 기반 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물로서, 보다 상세하게는 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물에 관한 것이다.

종양(tumor)은 비정상적인 세포의 과잉으로 인하여 발생하는 비제어적이고 무질서한 세포증식의 산물이며, 이와 같은 종양이 파괴적인 증식성, 침윤 및 전이성을 가지면 악성종양(malignant tumor), 즉 암으로 분류하게 된다.

현재 암을 진단하기 위한 검사 수단은 X선 촬영, 내시경 검사, 조직검사 등을 이용하는 방법이 있다. 그러나, 이와 같은 방법들은 검사 과정이 비교적 간단하다는 장점에도 불구하고, 진단 성공률이 높지 않거나 위생상의 문제점 및 검사가 진행되는 과정에서 환자의 고통이 수반되는 문제가 있기 때문에 이를 대체하기 위한 암의 진단 방법이 필요하다.

암을 치료하기 위해서는 치료 이전 단계에서 높은 민감도와 특이도를 가진 암의 진단이 중요하다 할 것이며, 이러한 진단을 통해 초기 단계에서 암이 발견되어야 높은 완치율을 나타낼 수 있다.

따라서, 비침습성이며 고감도 및 고특이성으로 암을 조기에 진단할 수 있는 방법의 개발이 요구되는 실정이나, 현재까지 암 진단에 있어서 초기에 특이적으로 병소를 감지하여 발병 여부를 판단하는 분자적 진단 기술은 미미하고, 더욱이 특정 암에 특이적으로 적용되는 방법은 전무한 상황이다.

대한민국 공개특허 제10-2015-0087580호

본 발명의 목적은 비침습적인 방법으로 이용할 수 있으면서도 식도암 진단의 정확도를 향상시킬 수 있는 마커 조성물로서, GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 단백질 과발현 엑소좀을 포함하는, 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 엑소좀 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 를 포함하는, 식도암 또는 췌장암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 엑소좀(exosome) 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 엑소좀(exosome) 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물을 포함하는, 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 키트가 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 엑소좀 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 측정된 GCC2 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 소정의 컷오프(cut-off) 값과 비교하는 단계를 더 포함하고, 상기 소정의 컷오프 값은 521.9695 pg/ml일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 엑소좀 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 흉선암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 측정된 GCC2 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 소정의 컷오프(cut-off) 값과 비교하는 단계를 더 포함하고, 상기 소정의 컷오프 값은 909.4513 pg/ml일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, (a) 식도암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 식도암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 엑소좀 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 식도암 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, (a) 흉선암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 식도암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 엑소좀 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 흉선암 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.

본 발명의 마커 조성물은 식도암 환자 또는 흉선암 환자의 엑소좀에서 과발현되는 유전자 내지 단백질을 포함하므로, 이의 발현 수준 측정을 통해 비침습적이면서 높은 정확도로 식도암 또는 흉선암을 진단하거나 예후를 예측할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 식도 세포주와 식도암세포주로부터 추출한 엑소좀을 정량한 표준곡선을 나타낸다.
도 2는 식도 세포주와 식도암세포주로부터 추출한 엑소좀 내 단백질 구성을 비교한 것이다.
도 3은 정상인과 식도암 환자의 혈중 엑소좀 내 GCC2 단백질 발현 수준을 비교한 ELISA 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 정상인과 식도암 환자의 혈중 엑소좀 내 GCC2 단백질 농도의 컷오프 값을 도출하기 위한 ROC 곡선을 나타낸다.
도 5는 정상인과 흉선암 환자의 혈중 엑소좀 내 GCC2 단백질 발현 수준을 비교한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 6은 정상인과 흉선암 환자의 혈중 엑소좀 내 GCC2 단백질 농도의 컷오프 값을 도출하기 위한 ROC 곡선을 나타낸다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.

아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질 과발현 엑소좀을 포함하는, 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물이 제공된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "GCC2 유전자 또는 단백질 과발현 엑소좀"은 정상인으로부터 분리된 엑소좀의 GCC2 발현량 또는 소정의 컷오프 값과 비교하여 GCC2 유전자나 단백질을 높은 수준으로 발현하는 엑소좀을 의미한다.

엑소좀(exosome)은 대부분의 세포에서 분비되는 나노 크기(30~150㎚)의 작은 소포체이다. 엑소좀 내부 및 인지질 이중측막에는 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA), 지질 등이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 조직 유래의 엑소좀은 이를 분비한 조직의 상태를 반영하기 때문에, 질병의 진단에 이용될 수 있음이 보고된 바 있다.

이에 본 발명자들은 식도암 및 흉선암 유래 엑소좀에서 특이적으로 발현하는 GCC2 유전자 또는 단백질을 이용하는 경우 정확하고 신속하게 암을 진단하거나 예후를 예측할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징, 즉 식도암 또는 흉선암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미한다. 또한, "예후"는 식도암 또는 흉선암의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 여부를 판단하는 것을 의미한다. 이는 개체의 시료로부터 분리된 엑소좀 내 GCC2의 발현 수준을 측정함으로써 해당 개체의 식도암 발병 여부뿐만 아니라, 향후 해당 개체의 생존 예후가 좋은지 여부에 대해서 예측하는 개념까지 포함할 수 있다.

상기 GCC2 유전자 또는 단백질의 발현 수준 측정을 통해 식도암 또는 흉선암을 진단하거나 예후를 예측할 수 있으므로, 이의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머나 프로브, 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 조성물로 이용할 수 있다.

뿐만 아니라, GCC2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 GCC2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 키트에 적용함으로써 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공할 수도 있다.

상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트, 단백질 칩 키트 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 키트는 마커에 해당하는 GCC2 유전자 또는 단백질의 엑소좀 내 발현 수준을 확인하여 이를 검출함으로써 식도암 진단 또는 예후 예측을 할 수 있다.

상기 키트에는 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측을 위하여 선택적으로 마커를 인지하는 프라이머, 프로브 또는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치를 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있으며, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(O-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 엑소좀 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 엑소좀 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 흉선암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.

상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 전혈 또는 세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 유전자 발현 수준 측정은 식도암의 진단 또는 예후 예측을 위해 생물학적 시료로부터 GCC2 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA 발현량을 측정하는 것을 의미한다.

이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 단백질 발현 수준 측정은 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측을 위해 생물학적 시료로부터 GCC2 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 의미한다.

상기 단백질의 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량 분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 정보제공 방법은 상기 측정된 GCC2의 유전자 또는 단백질 발현 수준을 정상 대조군의 GCC2 유전자 또는 단백질의 발현 수준이나 소정의 컷오프(cut-off) 값과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

피검체의 엑소좀 내 GCC2 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군보다 높거나, 소정의 컷오프 값인 521.9695 pg/ml 보다 높은 경우, 식도암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있고, 소정의 컷오프 값인 909.4513pg/ml 보다 높은 경우에는 흉선암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, (a) 식도암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 식도암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 엑소좀 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 를 포함하는, 식도암 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.

또한, (a) 흉선암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 흉선암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 엑소좀 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 흉선암 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.

식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법의 연장선에서, 상기 치료제 후보물질 스크리닝이 적용될 수 있다. 즉, 식도암 또는 흉선암 치료제 후보물질을 식도암 환자나 흉선암 환자로부터 분리한 생물학적 시료에 처리한 뒤, 그 내부에 존재하는 엑소좀에서 GCC2 유전자 또는 단백질의 발현 수준 감소를 확인하는 경우, 해당 후보물질이 식도암 치료제로서 효과적으로 기능한다는 것을 유추할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 정상 세포와 식도암 세포의 엑소좀 내 GCC2 비교

3종의 식도(암) 세포주(HET1A, TE8, TE12)를 각각 지름 150㎜의 디쉬에서 배양하였다. 이 때, 초고속 원심분리기를 이용하여 120,000g로 4시간 동안 원심 분리하여 엑소좀을 제거한 FBS(Fetal Bovine Serum)의 상층액을 배양액으로 사용하였다. 상기 배양액을 이용하여 세포가 70-80% confluency 상태가 되도록 2-3일 동안 연속 배양하였다. 얻어진 배양액을 10,000g에서 30분 동안 원심 분리하여 세포 데브리스(debris)를 제거하고, 0.45㎛, 0.22㎛ 필터에 순차로 통과시켜 상대적으로 부피가 큰 물질들을 우선적으로 제거하였다. 여과된 세포배양액은 Amicon tube 100K(Millipore, USA)를 이용하여 원하는 크기의 입자만 남기고 농축하였다.

다음으로, 농축된 세포배양액을 크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography)법을 이용하여 엑소좀 크기(50-250㎚)의 입자만을 분리하고, Amicon tube 100K를 이용하여 다시 농축하였다. 농축된 엑소좀은 RIPA lysis buffer(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 단백질을 얻어내고 수득한 엑소좀 내 GCC2 단백질의 발현 수준을 확인하기 위해, 웨스턴 블랏팅을 실시하였다.

구체적으로, 단백질 분해효소 저해제 칵테일을 포함하는 RIPA lysis buffer를 사용하여 정상 식도 세포주와 식도암 세포주로부터 엑소좀을 추출하였고, 각각의 엑소좀을 용해하여 단백질을 수득하였다. 수득된 단백질은 Bradford assay 법을 이용하여 정량 하였고, 표준 곡선(standard curve)을 얻었다(도 1). 식은 y=0.219+0.141x이고 R-square 값은 0.994로 산출되었다. 엑소좀에서 얻은 단백질의 OD 값은 595nm 파장에서 측정하였으며 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

먁	HET1A	TE8	TE12
OD 값(OD value)	0.4	0.53	0.61

HET1A, TE8, TE12의 농도는 각각 1243㎍/㎖ 2213㎍/㎖, 2766㎍/㎖로 확인되어, 이를 토대로 세포에서 얻어진 단백질 30㎍, 엑소좀에서 얻은 단백질 30㎍ 각각을 열로 비활성시켜 샘플을 준비하였다.

10% SDS-PAGE gel에 총 단백질 분해물을 각 레인에 로딩하여 크기별로 분별하였다. 니트로셀룰로오스 막에 분리한 단백질을 부착하고 5% 탈지유를 포함하는 트리스-완충 식염수-Tween 20으로 블록하였다. GCC2(1:500, Santa Cruz), CD63(1:500, Santa Cruz), beta-actin(1:1000, Santa Cruz) 일차 항체로 상기 니트로셀룰로오스 막을 4

에서 밤새 처리하였다. 그 후, 항-고트 IgG-HRP, 항-마우스 IgG-HRP, 항-토끼 IgG-HRP 결합 이차 항체로 처리한 뒤 세척하여 ECL buffer(Bio-rad, USA)와 반응시키고, FluorChem E system (proteinsimple, USA)를 이용하여 얻은 이미지를 도 2에 나타냈다.

도 2를 참고하면, 동량의 엑소좀 단백질 내에 정상 식도세포와 식도암세포의 단백질 구성 비율이 상이함을 알 수 있다. 즉, 암세포가 정상세포와 다른 단백 구성을 갖고 있으며, 정상 식도세포와 달리 식도암세포에서 유래한 엑소좀에서 GCC2가 강하게 발현되는 것을 알 수 있다.

실시예 2: 식도암 환자 유래 엑소좀 내 GCC2 단백질 발현 수준 측정

식도암과 환자의 혈장(plasma)을 4°C, 5,000 x g에서 15분동안 원심분리 하여 혈장 샘플에 존재하는 데브리스(debris)를 제거하였다. 500ul의 혈장 샘플을 취하여 크기 배제 컬럼 크로마토그래피(size exclusion column chromatography)법을 통해 엑소좀을 추출하였다.

GCC2 단백질을 포함한 엑소좀이 식도암의 진단 또는 예후 예측용 마커로서 이용 가능성이 있는지 확인하기 위하여, Mybiosource사의 GRIP and coiled-coil domain containing proten 2 ELISA KIT을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA assay를 수행하였다.

구체적으로, GCC2 항체가 코팅되어 있는 96-well ELISA 플레이트에 표준 시료(standards sample), 바탕 시료(blank sample) 및 상기 실시예 1에서 추출한 엑소좀 시료(exosome sample)를 2개씩(duplicate) 준비하여 50ul씩 주입하였다. 모든 well에 100ul HRP-conjugated regent를 넣고, closure plate membrane으로 플레이트를 덮은 후 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, 워싱 버퍼(Washing buffer)를 이용하여 4회 플레이트를 워싱한 후 Cromogen solution A와 Cromogen solution B를 1:1 비율로 혼합하여 각 well당 100ul씩 주입하고, 암 조건(dark condition), 37°C에서 15분 동안 반응시켰다. 각 well에 50ul의 정지액(Stop solution)을 넣고, 15분 이내에 ELISA reader기를 이용하여 O.D 450nm에서 GCC2 단백질의 농도를 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 정상군(Control)에 비해 식도암 환자군(Esophageal cancer)의 엑소좀에서 GCC2 의 농도가 12.8 (p < 0.000) 배 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는, 엑소좀 내 GCC2 농도가 식도암의 진단 마커로 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.

실시예 3: 식도암 진단을 위한 엑소좀 내 GCC2 단백질의 컷오프 값

상기 실시예 2에서 확인한 GCC2 단백질 농도의 컷오프(cut-off) 값을 구하기 위해 SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 프로그램을 이용하여 ROC 곡선을 비교 분석하였다(도 4). ROC 곡선에서 얻어진 값을 이용하여 "특이도 = 1-(1-특이도)"수식을 통해 컷오프(cut-off) 값을 확인한 결과, 521.9695 pg/ml (p value = 0.015)로 확인되었다. AUC 값은 0.888, Sensitivity와 Specificity는 각각 85.7% 로 나타나, 엑소좀 내 GCC2 단백질이 식도암의 진단 마커로서 유용하게 이용 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 흉선암 환자의 엑소좀 분리

흉선암과 환자의 혈장(plasma)을 4°C, 5,000 x g에서 15분동안 원심분리 하여 혈장 샘플에 존재하는 데브리스(debris)를 제거하였다. 500ul의 혈장 샘플을 취하여 크기 배제 컬럼 크로마토그래피(size exclusion column chromatography)법을 통해 엑소좀을 추출하였다.

실시예 5: 흉선암 환자 유래 엑소좀 내 GCC2 단백질 발현 수준 측정

GCC2 단백질을 포함한 엑소좀이 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 마커로서 이용 가능성이 있는지 확인하기 위하여, Mybiosource사의 GRIP and coiled-coil domain containing proten 2 ELISA KIT을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA assay를 수행하였다.

구체적으로, GCC2 항체가 코팅되어 있는 96-well ELISA 플레이트에 표준 시료(standards sample), 바탕 시료(blank sample) 및 상기 실시예 4에서 추출한 엑소좀 시료(exosome sample)를 2개씩(duplicate) 준비하여 50ul씩 주입하였다. 모든 well에 100ul HRP-conjugated regent를 넣고, closure plate membrane으로 플레이트를 덮은 후 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음, 워싱 버퍼(Washing buffer)를 이용하여 4회 플레이트를 워싱한 후 Cromogen solution A와 Cromogen solution B를 1:1 비율로 혼합하여 각 well당 100ul씩 주입하고, 암 조건(dark condition), 37°C에서 15분 동안 반응시켰다. 각 well에 50ul의 정지액(Stop solution)을 넣고, 15분 이내에 ELISA reader기를 이용하여 O.D 450nm에서 GCC2 단백질의 농도를 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 흉선암 환자군의 엑소좀에서 GCC2의 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 앞서 확인한 GCC2 단백질 농도의 컷오프(cut-off) 값을 구하기 위해 SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 프로그램을 이용하여 ROC 곡선을 비교 분석하였다(도 6). ROC 곡선에서 얻어진 값을 이용하여 "특이도 = 1-(1-특이도)"수식을 통해 컷오프(cut-off) 값을 확인한 결과, 909.4513 pg/ml (p value = 0.016)로 확인되었다. AUC 값은 0.917, Sensitivity Specificity는 각각 83.3%로 나타나, 엑소좀 내 GCC2 단백질이 흉선암의 진단 마커로서 유용하게 이용 가능함을 확인할 수 있었다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims

GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 단백질 과발현 엑소좀을 포함하는, 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물.
엑소좀(exosome) 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
엑소좀(exosome) 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
제2항 또는 제3항의 조성물을 포함하는, 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 키트.
제4항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 식도암 또는 흉선암의 진단 또는 예후 예측용 키트.
(a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및
(b) 상기 엑소좀 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 를 포함하는, 식도암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 식도암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 측정된 GCC2 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 소정의 컷오프(cut-off) 값과 비교하는 단계를 더 포함하고, 상기 소정의 컷오프 값은 521.9695 pg/ml인, 식도암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
(a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및
(b) 상기 엑소좀 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 를 포함하는, 흉선암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 흉선암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 측정된 GCC2 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 소정의 컷오프(cut-off) 값과 비교하는 단계를 더 포함하고, 상기 소정의 컷오프 값은 909.4513pg/ml인, 흉선암 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
(a) 식도함 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 식도암 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및
(c) 상기 엑소좀 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 식도암 치료제의 스크리닝 방법.
(a) 흉선암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 흉선암 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 생물학적 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및
(c) 상기 엑소좀 내 GCC2(GRIP and coiled-coil domain-containing protein) 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 흉선암 치료제의 스크리닝 방법.