BR112015023275B1 - Método in vitro de detecção de biomarcador de câncer - Google Patents

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Abstract

MÉTODO IN VITRO DE DETECÇÃO DE BIOMARCADOR DE CÂNCER E COMPOSIÇÃO Métodos para diagnóstico e tratamento do câncer pelo uso de exossomos compreendendo miRNAs e seus precursores. Por exemplo, em alguns aspectos, um câncer pode ser diagnosti-cado ou avaliado pela determinação do teor de miRNA de exossomos em uma amostra de um sujeito ou através da detecção de processamento de miRNA em exossomos.

Description

[0001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do pedido provisório dos Estados Unidos n° de série 61/791.301, depositado em 15 de março de 2013, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[0002] A invenção foi feita com apoio do governo sob n ° s de concessão. EB003472, EB006462, CA135444, CA125550, CA155370, CA151925, DK081576 e DK055001, concedidos pelo National Institutes of Health e Grant n ° s. EFRI-1240410, CBET-0922876 e CBET-1144025, concedido pela National Science Foundation. O governo tem certos direitos na invenção.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção
[0003] A presente invenção se relaciona geralmente ao campo da biologia molecular, oncologia e medicina. Mais particularmente, diz respeito a métodos para detecção de câncer por seu conteúdo exclusivo de exossomo e métodos para terapias melhoradas baseadas em RNA.
2. Descrição do Estado da Técnica Relacionado
[0004] Todas as células se comunicam com o seu ambiente circundante por várias vias, incluindo fatores de crescimento, citocinas, hormônios, quimiocinas, proteínas limitadas por membranas e lipídios. Exossomos são capazes de mediar tais comunicações e alcançar este objetivo por longas distâncias ((Mathivanan et al., 2010; Kahlert e Kalluri, 2013). Comunicação por meio de exossomos pode provavelmente superar as limitações associadas com estabilidade e difusão de fatores de crescimento/citocinas/quimiocinas/hormônios (Mathivanan et al., 2010). Exossomos são nano-vesículas de 30-140 nm em tamanho, que contêm proteínas, mRNA e microRNAs (miRNAs) protegidos por uma bicamada lipídica (Cocucci et al., 2009; Simonsand Raposo, 2009; Simpson et al., 2008; Thery et al., 2002). Vários estudos recentes demonstraram que os exossomos são secretados por vários tipos de células, incluindo as células cancerosas, células-tronco, células do sistema imunológico e neurônios (Simpson et al., 2008; Thery, 2001). É notado que as células cancerosas secretam mais exossomos do que as células normais (Taylor e Gercel- Taylor, 2011). Além disso, os exossomos estão em maior número na circulação de pacientes com câncer se comparados a indivíduos normais (Logozzi et al, 2009; Taylor e Gercel-Taylor, 2008); no entanto, um papel funcional permanece desconhecido. Evidências recentes sugerem que os exossomos podem desempenhar um papel importante na progressão do câncer e metástase (Luga et al., 2012; Peinado et al., 2012; Yang et al., 2011).
[0005] A ideia de que os exossomos mediam a transferência de RNAs e miRNAs entre células aumenta ainda mais a complexidade da comunicação célula a célula no corpo. RNAi é um processo biológico natural dentro de células vivas que participa no controle da expressão genética e atividade. Inicialmente, pensava-se que os miRNAs eram contidos apenas dentro de exossomos (Valadi et al., 2007). Desde então, vários relatórios confirmaram a existência de miRNAs em corpos apoptóticos (Zernecke et al, 2009), lipoproteínas de alta e baixa densidade (Vickers et al, 2011) (HDL/LDL), grandes vesículas extracelulares, denominadas microvesículas e estão associadas com AGO2 (Arroyo et al., 2011; Li et al., 2012;Turchinovich et al., 2011).. No entanto, um relatório recente sugere que a maioria dos miRNAs detectados na saliva e soro humano estão concentrados principalmente dentro dos exossomos (Gallo et al, 2012). A presença de miRNAs em exossomos oferece a possibilidade de regular a expressão gênica de células em locais distantes (Guescini et al., 2010; Valadi et al.,2007; Mittelbrunn et al., 2011; van Balkom et al., 2013). Através do seu regulação de tradução do mRNA, miRNAs coordenam a expressão de conjuntos inteiros de genes e moldam o transcriptoma do organismo (Bartel, 2009).
[0006] miRNAs são enriquecidos em exossomos derivados de vários tipos de células diferentes (Valadi et al, 2007). Eles são pequenos RNAs não-codificantes de 18-24 nucleotídeos (nt) de comprimento que controlam a expressão genética pós transcrição. Eles são sintetizados por ações sequenciais de endonucleases de Drosha e Dicer e carregados para o RISC (sigla em inglês para 'RNA induced silencing complex' - complexo silenciador induzido por RNA) para atingir mRNAs (Bartel, 2009; Maniataki e Mourelatos, 2005).. Nos camundongos nocaute para Dicer, falha na biossíntese do miRNA resulta em letalidade devido a proliferação e diferenciação de células tronco embrionárias defeituosas (Bernstein et al.,2003; Fukagawa et al., 2004).
[0007] MicroRNAs operam por meio de interação de sequência específica e emparelhamento do RISC associado ao miRNA (composto por proteínas Dicer, TRBP e AGO2) com os mRNAs alvo (Bartel, 2009). Esta ação consequentemente inibe a tradução e/ou provoca a desestabilização do mRNA (Filipowicz, 2005). O grau de complementaridade entre o miRNA e seu mRNA alvo dita o processo do silenciamento do mRNA, seja por meio de desestabilização/degradação do mRNA ou por meio da inibição da tradução (Ambros, 2004; Bartel, 2009). Se a complementação completa é encontrada entre a sequência de miRNA e o mRNA alvo, o complexo RISC atua para clivar o mRNA ligado para degradação (Ambros, 2004; Bartel, 2009). Se complementação absoluta não é encontrada, como na maioria dos casos de miRNAs em células animais, a tradução é impedida de alcançar o silenciamento genético (Ambros, 2004; Bartel, 2009).
[0008] Para um miRNA ser funcional e alcançar o silenciamento genético eficiente mediado por miRNA, deve ser complexado com proteínas Dicer RLC (complexo RISCloading) TRBP e AGO2. Dentro do RLC, Dicer e TRBP são necessários para processar miRNAs precursores (pre-miRNAs), após eles emergirem do núcleo por meio de exportina-5, para gerar os miRNAs e associar à AGO2. AGO2 ligada ao miRNA maduro constitui o RISC mínimo e posteriormente pode se dissociar de Dicer e TRBP (Chendrimada et al., 2005;Gregory et al., 2005; Haase et al., 2005; MacRae et al., 2008;Maniataki and Mourelatos, 2005; Melo et al., 2009) Por si mesmos, miRNAs de fita única incorporam RISC muito mal e, portanto, não podem ser eficientemente conduzidos ao seu alvo mRNA para regulação pós-transcricional (Tang, 2005; Thomson et al, 2013).
[0009] siRNAs sintéticos (de fita dupla) causam deterioração de mRNA por meio de emparelhamento de base perfeita com seus mRNAs alvo (Ambros, 2004; Bartel, 2009). Tais siRNAs são carregados diretamente para as proteínas RISC Dicer, TRBP e AGO2 devido à sua natureza de fita dupla (Tang, 2005). Um miRNA de fita única não pode incorporar em RISC e, portanto, não pode ser direcionado ao seu mRNA alvo para inibição de tradução ou degradação (Tang, 2005).
[0010] Alguns relatórios sugeriram que os miRNAs contido nos exossomos podem influenciar a expressão genética em células alvo (Ismail et al., 2013; Kogure et al., 2011;Kosaka et al., 2013; Narayanan et al., 2013; Pegtel et al., 2010;Valadi et al., 2007; Zhang et al., 2010), mas uma pergunta permanece sobre como eficientes são estes miRNAs no silenciamento de mRNA se eles não são incorporados ao RISC como pre- miRNAs para reconhecimento apropriado de mRNA e eficiente contenção de tradução. Enquanto miRNAs maduros (de fita única) não podem se associar com RISC de células alvo, pre-miRNAs de exossomos podem, em certa medida, induzir silenciamento genético por cooptação das proteínas RISC das células alvo. No entanto, tal processo é altamente ineficiente e lento devido ao potencial estado saturado de proteínas envolvidas na via de biogênese de miRNA das células alvo. Um relatório recente mostrou a presença de Drosha e Dicer nos exossomos da cultura de célula sobrenadante de células infectadas pelo HIV-1 e soros de pacientes com HIV (Narayanan et al., 2013). Adicionalmente, um outro estudo mostrou co fracionamento de Dicer, TRBP e AGO2 em endossomos/MVB (corpo multivesicular) tardios (Shen et al., 2013).
RESUMO DA INVENÇÃO
[0011] Exossomos secretados pelas células cancerígenas são exclusivos em relação aos exossomos não-cancerosos, os exossomos cancerosos compreendendo um repertório exclusivo de miRNAs, bem como RNA ativo processando complexos RISC. Tais complexos RNA-RISC encapsulados também podem ser utilizados para biogênese de miRNA independente de célula e silenciamento de mRNA altamente eficiente nas células alvo.
[0012] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um método de detecção de um biomarcador de câncer em um indivíduo compreendendo (a) obtenção de uma amostra biológica do indivíduo; (b) medição do nível de (i) um ou mais miRNA(s) selecionado(s) a partir dos miRNAs fornecidos na Tabela 5 em uma fração do exossomo da amostra; (ii) um precursor miRNA ; (iii) uma proteína RISC em uma fração do exossomo da amostra; ou (iv) uma atividade de processamento de miRNA (por exemplo, miRNA primário e/ou atividade de processamento do precursor-miRNA) em uma fração do exossomo da amostra; e (c) identificação do indivíduo tendo ou não ter um biomarcador de câncer baseado no nível medido do(s) referido(s) miRNA(s), precursor miRNA, proteína RISC ou atividade de processamento de miRNA. Em alguns aspectos, o método compreende a medição do nível pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de tais miRNAs. Em mais aspectos, o método compreende a medição do nível das proteínas AGO2, TRBP ou DICER.
[0013] Em alguns aspectos, a amostra biológica é essencialmente livre de células. Por exemplo, a amostra pode ter menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 célula(s). Em um aspecto, a amostra biológica não contém células. Em certos aspectos, a amostra biológica pode ser uma amostra de linfa, saliva, urina ou sangue (por exemplo, plasma). Em um outro aspecto, o método pode compreender adicionalmente a purificação de uma fração do exossomo da amostra e/ou o aumento da produção de uma fração do exossomo da amostra.
[0014] Em aspectos particulares, o câncer é câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cabeça a pescoço, câncer de próstata, câncer de esôfago, câncer de traqueia, câncer no cérebro, câncer de fígado, câncer renal, câncer de estômago, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer de útero, câncer cervical, câncer de testículos, câncer de cólon, câncer retal ou câncer de pele. Em certos aspectos, o câncer é um câncer de mama. Em um aspecto, o indivíduo passou por um tratamento de câncer anteriormente ou teve um tumor cirurgicamente removido anteriormente.
[0015] Em alguns aspectos, identificação do indivíduo como tendo ou não um biomarcador de câncer compreende adicionalmente a correlação do(s) nível(is) de miRNA medidos, nível de precursor miRNA, nível RISC ou atividade de processamento de miRNA com um risco para câncer. Em um outro aspecto, identificação do indivíduo como tendo ou não um biomarcador de câncer compreende adicionalmente a correlação do(s) nível(is) de miRNA medidos, nível de precursor miRNA, nível RISC ou atividade de processamento de miRNA usando um algoritmo. Em alguns casos, uma análise pode ser realizada por um computador.
[0016] Em determinados aspectos, o método das modalidades compreende adicionalmente a medição do nível de (i) (i) um ou mais miRNA(s) selecionado(s) a partir dos miRNAs fornecidos na Tabela 5 em uma fração do exossomo da amostra; (ii) um precursor miRNA ; (iii) uma proteína RISC em uma fração do exossomo da amostra e uma amostra de referência; ou (iv) uma atividade de processamento de miRNA em uma fração do exossomo da amostra e uma amostra de referência; e (c) identificação do indivíduo tendo ou não ter um biomarcador de câncer pela comparação do nível de miRNA(s), um precursor miRNA, atividade de processamento RISC ou miRNA na amostra do indivíduo ao nível de miRNA(s), um precursor miRNA, atividade de processamento RISC miRNA na amostra de referência.
[0017] Em alguns aspectos, medir os níveis de proteína RISC compreende a realização de um Western blot, um ELISA ou vinculação a um arranjo de anticorpo. Em outros aspectos, medição de níveis de miRNA compreende a medição de níveis de miRNA processados. Em alguns casos, medição de níveis de miRNA compreende realização de RT-PCR, Nothern blot ou um arranjo de hibridização.
[0018] Em alguns aspectos, o método compreende adicionalmente o relato se o sujeito tem ou não tem um biomarcador de câncer. Relatórios podem compreender a preparação de um relatório escrito, oral ou eletrônico. Por exemplo, o relatório pode ser fornecido ao paciente, um médico, um hospital ou uma companhia de seguros.
[0019] Em uma outra modalidade, a presente divulgação fornece um método para tratamento de um indivíduo compreendendo a seleção de um indivíduo identificado como tendo um biomarcador de câncer em conformidade com as modalidades e administração de uma terapia anticâncer ao indivíduo. Por exemplo, o método pode compreender (a) obtenção do nível de (i) um ou mais miRNA(s) selecionado(s) a partir dos miRNAs fornecidos na Tabela 5; (ii) um precursor miRNA ; (ii) uma proteína RISC; ou (iii) uma atividade de processamento de miRNA em uma fração do exossomo da amostra do sujeito; (b) seleção de um indivíduo com biomarcador de câncer baseado no nível de tal miRNA(s), precursor miRNA, proteína RISC ou atividade de processamento de miRNA; e (c) tratamento do indivíduo selecionado com uma terapia anti câncer. Em certos aspectos, a terapia anticâncer é uma quimioterapia, uma radioterapia, uma terapia hormonal, uma terapia-alvo, uma imunoterapia ou um tratamento cirúrgico.
[0020] Em uma modalidade adicional, a presente divulgação fornece um método de seleção de um indivíduo para um procedimento diagnóstico compreendendo (a) obtenção do nível de (i) um ou mais miRNA(s) selecionado(s) a partir dos miRNAs fornecidos na Tabela 5; (ii) nível de precursor miRNA ; (ii) uma proteína RISC; ou (iii) uma atividade de processamento de miRNA em uma fração do exossomo da amostra do sujeito; (b) seleção de um indivíduo com biomarcador de câncer baseado no nível de tal miRNA(s), proteína RISC ou atividade de processamento de miRNA; e (c) execução de uma procedimento diagnóstico no indivíduo. Em um aspecto, o procedimento diagnóstico compreende diagnósticos por imagem. A imagem pode ser uma imagem de biópsia, raios-x, tomografia, ressonância magnética ou PET.
[0021] Ainda em uma outra modalidade, a presente divulgação fornece um meio concreto legível por computador compreendendo um código legível por computador que, quando executado por um computador, faz com que o computador execute operações que compreendem (a) recebimento de informações correspondentes a um nível de (i) um ou mais miRNA(s) selecionado(s) a partir dos miRNAs fornecidos na Tabela 5 em uma fração do exossomo da amostra; (ii) um precursor miRNA ; (iii) uma proteína RISC; ou (iv) uma atividade de processamento de miRNA em uma fração do exossomo da amostra do indivíduo; e (b) determinação de um nível relativo de uma ou mais de tal miRNAs, um precursor miRNA, proteínas RISC ou uma atividade de processamento de miRNA comparada a um nível de referência, em que o nível alterado comparado a um nível de referência indica que o indivíduo tem um biomarcador de câncer.
[0022] Em certos aspectos, a operação central concreto legível por computador compreende adicionalmente receber informações correspondentes a um nível de referência de (i) um ou mais miRNA(s) selecionados a partir de miRNAs fornecidos na Tabela 5; (ii) um precursor miRNA; (iii) uma proteína RISC; ou (iv) uma atividade de processamento miRNA, em uma fração do exossomo de um indivíduo que não tem câncer.
[0023] Em certos aspectos, o meio concreto legível por computador compreende adicionalmente um código legível por computador que, quando executado por um computador, faz com que o computador execute uma ou mais operações adicionais compreendendo: envio de informações correspondentes ao nível relativo de miRNA; um precursor miRNA, proteína RISC ou atividade de processamento de miRNA para um dispositivo de armazenamento de dados concreto.
[0024] Em um outro aspecto, o nível de referência é armazenado no referido concreto legível por computador. Em um aspecto, receber informações compreende o recebimento de um meio concreto legível por computador correspondente a um nível de miRNA; um nível de precursor miRNA, proteína RISC ou atividade de processamento miRNA, em uma amostra de um indivíduo. Em alguns aspectos, recebimento de informações compreende adicionalmente o recebimento de informações correspondentes a um nível de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de tais miRNAs em uma amostra de um indivíduo.
[0025] Em alguns aspectos, o código legível por computador, quando executado por um computador, faz com que o computador execute operações que compreendem adicionalmente (c) cálculo de uma pontuação diagnóstica para a amostra, em que a pontuação diagnóstica é indicativa da probabilidade de que a amostra seja de um indivíduo com câncer.
[0026] Em uma outra modalidade, a presente divulgação fornece um método de detecção de biomarcador de câncer em um indivíduo compreendendo (a) obtenção de uma amostra biológica do indivíduo; (b) medição do nível de um ou mais miRNA(s) na amostra selecionada dos miRNAs fornecidos na Tabela 5 ou um precursor miRNA dos mesmos e (c) identificação do indivíduo tendo ou não tendo um biomarcador de câncer baseado no nível medido de tal miRNA(s). Em um aspecto, a amostra biológica é essencialmente livre de células. Em certos aspectos, a amostra biológica pode ser uma amostra de linfa, saliva, urina ou sangue. Em um aspecto, o método pode compreender adicionalmente a purificação de uma fração do exossomo de um fluido corporal.
[0027] Ainda em outra modalidade, a presente divulgação fornece um método para entrega do RNA inibitório ativo compreendendo o contato de uma célula com um RNA inibitório que é fornecido em associação com um complexo de proteínas RISC. Em um aspecto, o complexo de proteínas RISC compreende TRBP, DICER e AGO2. Em alguns aspectos, o RNA inibitório é um siRNA ou shRNA. Em um aspecto, o RNA inibitório é um miRNA humano.
[0028] Em certos aspectos,o RNA inibitório e o complexo de proteína RISC estão compreendidos em um lipossoma, uma nanopartícula ou um micro cápsula composta por uma bicamada lipídica. Em um aspecto, a microcápsula é um exossomo.
[0029] Em alguns aspectos, um método compreende adicionalmente a transfecção de uma célula com o RNA inibitório e o complexo de proteína RISC. Em outro aspecto, o método compreende adicionalmente a administração do RNA inibitório e o complexo de proteína RISC a um indivíduo.
[0030] Ainda em outra modalidade, a presente divulgação fornece uma composição compreendendo um RNA inibitório recombinante ou sintético em associação com um complexo de proteína RISC, tal complexo compreendido em um lipossoma, uma nanopartícula ou uma micro cápsula. Em um aspecto, o complexo de proteínas RISC compreende TRBP, DICER e AGO2. Em alguns aspectos, o RNA inibitório é um siRNA ou shRNA. Em alguns aspectos, o RNA inibitório é um miRNA humano. Em certos aspectos, o complexo é compreendido em um lipossoma sintético, uma nanopartícula ou uma microcápsula. Em um aspecto, a microcápsula é um exossomo.
[0031] Certos aspectos das modalidades como detalhadas supra compreendem a medição de um nível de um ou mais miRNA(s) (ou precursor miRNA) em uma fração do exossomo de uma amostra selecionada à partir aquelas fornecidas na Tabela 5. Por exemplo, um método pode compreender a medição de um nível de um ou mais miRNA selecionados a partir do grupo consistindo em mmu-miR-709, hsa-miR- 1308, mmu-miR-615-3p, hsa-miR-1260b, mmu-miR-1937a, mmu-mir-321-A, hsa-miR-615-3p, hsa-miR-1979, mmu-miR-1937b, hsa-mir-373, mmu-miR- 1937c, hsa-miR-1273d-P, mmu-miR-720, mmu-miR-1274a, hsa-mir-565-A, mmu-miR-1931, hsa-miR-1246, hsa-mir-594-P, hsa-mir-321-A, mmu-miR- 2145-1-P, hsa-mir-639-P, hsa-miR-720, hsa-miR-1280, mmu-miR-3473, hsa-miR-1260, hsa-miR-1281, mmu-miR-1224-P, mmu-miR-690, hsa-miR- 375-P, hsa-miR-4301, mmu-miR-700, mmu-miR-125b-5p, mmu-miR-1191- P, hsa-miR-1274a, hsa-miR-3197, mmu-miR-1935, hsa-miR-1975-P, hsa- miR-4324, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-1274b, mmu-miR-1957, hsa-miR-933, hsa-mir-675, hsa-miR-595, mmu-miR-2137, hsa-mir-572-P, mmu-miR-1195, hsa-miR-4294-P, mmu-mir-1899-P, mmu-miR-689-P, hsa-miR-199b-3p, hsa-miR-3117-P, mmu-mir-321-P, mmu-miR-1961-P, hsa-mir-10a, mmu- miR-669d-P, mmu-miR-1937b-2-P, hsa-miR-3125-P, mmu-miR-1934-P, hsa-miR-574-3p, hsa-miR-718, mmu-miR-1198, mmu-miR-2182-P, hsa- miR-1273, mmu-miR-2133-P, hsa-miR-92b*, hsa-miR-1290, hsa-miR-448, mmu-miR-689, mmu-miR-449a, mmu-miR-1937b-4-P, hsa-miR-4286, mmu- miR-1947, mmu-miR-342-3p, hsa-miR-1303-P, mmu-miR-2132, hsa-miR- 4321-P, hsa-miR-4256-P, hsa-miR-4311, mmu-miR-130a, mmu-miR-1939, hsa-miR-1268-P, mmu-miR-31, mmu-miR-99b, mmu-miR-2141, hsa-miR- 1202-P, mmu-miR-466b-3p, mmu-miR-2133, hsa-miR-1268, hsa-miR-466, mmu-miR-494, hsa-miR-1289, hsa-miR-320b, hsa-miR-4254, hsa-mir-7-3-P, hsa-miR-923, hsa-miR-764, mmu-miR-291a-3p, mmu-miR-883b-3p, hsa- mir-594-A, mmu-miR-1948-P, hsa-miR-206, hsa-mir-565-P, mmu-miR- 467e*, hsa-miR-1826, mmu-miR-467a*, mmu-miR-1983, hsa-miR-324-5p, mmu-let-7c, mmu-miR-1965, hsa-mir-632-P, hsa-miR-181a*MM2GT/AC, hsa-miR-1265, hsa-miR-323b-5p, hsa-mir-1914, hsa-mir-1910, hsa-miR-21, hsa-miR-431*, hsa-miR-3135-P, mmu-miR-187-P, mmu-miR-126-3p, mmu- miR-669a-P, hsa-miR-367, mmu-mir-320-P, hsa-miR-181a*MM1G/C, mmu- miR-484-P, mmu-miR-467c-P, hsa-miR-3154, mmu-miR-466d-3p, hsa-miR- 3162-P, mmu-miR-201, mmu-miR-1946a, hsa-miR-937, hsa-miR-3147, hsa- mir-596-P, hsa-miR-3148, hsa-miR-1304, hsa-miR-222MM2GG/AC, mmu- miR-125a-5p, hsa-miR-1272-P, hsa-miR-638, hsa-mir-320, hsa-miR-545*, hsa-mir-1908-P, hsa-let-7d-v2-P, mmu-mir-30d-P, hsa-miR-4297, mmu- miR-182, hsa-miR-3166-P, hsa-miR-494, mmu-miR-669o-P, hsa-miR-566, mmu-miR-1188, mmu-miR-2134-AP, hsa-miR-4259-P, mmu-miR-152, mmu-miR-2134, hsa-miR-3193-AP, hsa-miR-125b, hsa-miR-3124-P, hsa- miR-10b, hsa-miR-455-5p, mmu-miR-144, hsa-miR-130a, hsa-miR-1285, hsa-miR-516b*, hsa-miR-27a, hsa-miR-138-1*, mmu-miR-471, hsa-miR- 4298-P, hsa-miR-301b, hsa-mir-147-P, hsa-miR-362-5p, mmu-mir-471-P, mmu-miR-466a-3p, hsa-miR-561, hsa-miR-486-5p, mmu-miR-2861, hsa- miR-587, mmu-miR-375, hsa-mir-329-2-P, mmu-miR-2861-P, hsa-miR- 144*, hsa-miR-1255a-P, hsa-mir-519a-2-P, hsa-miR-34c-5p, mmu-miR- 466e-3p, mmu-miR-743b-5p, mmu-mir-350-P, mmu-miR-181d, hsa-miR- 376a*, hsa-miR-1308-P, mmu-miR-467g, mmu-miR-1946a-P, hsa-miR-147- P, hsa-miR-923-P, mmu-miR-465c-5p, hsa-miR-891a, hsa-miR-28-5p, hsa- miR-4292, mmu-miR-677-P, hsa-miR-4257, hsa-miR-4326, hsa-miR- 17*MM2GG/AA, hsa-miR-939-P, mmu-miR-2182, hsa-miR-220c-P, hsa- miR-3132-P, hsa-miR-532-5p, mmu-miR-1947-P, mmu-miR-29a, hsa-miR- 3162, hsa-miR-375MM1C/G, hsa-miR-768-3p, mmu-miR-182-P, mmu-miR- 205-P, hsa-miR-505, hsa-miR-3146-P, mmu-miR-721, mmu-miR-376c, hsa- miR-1179-P, mmu-miR-1970, hsa-miR-3133-P, hsa-miR-200c, hsa-miR- 220a, mmu-miR-100, hsa-miR-1255b, hsa-miR-222MM1G/A, hsa-miR-885- 3p, hsa-miR-517b, hsa-miR-200a, hsa-miR-3141, mmu-miR-669h-3p, hsa- miR-1301, hsa-miR-877, hsa-mir-941-2, hsa-mir-487b-P, hsa-miR-4302, hsa-miR-99b, hsa-miR-1253, hsa-let-7a*, hsa-miR-34aMM2CT/TC, hsa- miR-3181-P, hsa-miR-3200, hsa-miR-3129-P, hsa-miR-93*, hsa-miR-548q- P, mmu-miR-466g, mmu-miR-155, hsa-miR-2278-P, hsa-miR-3065-5p, hsa- miR-633, hsa-miR-4265, mmu-miR-2135-P, hsa-miR-190, mmu-miR-669f, hsa-miR-1323, hsa-miR-588, mmu-miR-183*, hsa-mir-941-4, hsa-mir-1913, hsa-miR-2116*, hsa-miR-1178, mmu-miR-196a, mmu-miR-574-3p, hsa- miR-346, mmu-miR-1199, mmu-miR-681, hsa-miR-4292-P, hsa-miR-522, hsa-mir-611-P, hsa-miR-3171, hsa-miR-635, hsa-miR-1197-P, hsa-miR- 604, mmu-let-7a*, hsa-miR-335, mmu-miR-466c-3p, mmu-miR-466i, hsa- miR-1297, mmu-miR-338-5p, hsa-mir-526a-2-P, hsa-miR-181aMM2GC/AG, hsa-miR-18, hsa-miR-924-P, mmu-miR-190-P, hsa-miR-345, mmu-miR-711, hsa-miR-3116-2-P, hsa-miR-99a, mmu-miR-26a, hsa-miR-1248-P, mmu- miR-721-P, mmu-miR-801-P, hsa-miR-1826-P, hsa-miR-1236, hsa-miR- 339-5p, mmu-miR-804, mmu-miR-467d*, mmu-miR-1191, hsa-miR-148a, hsa-miR-141, mmu-miR-1937a-P, mmu-miR-696 e hsa-miR-302a (isto é, aqueles listados na Tabela 5).
[0032] Como usado neste documento, a especificação, "um" ou "uma" significa um ou mais. Como usado neste documento, nas reivindicações, quando usado em conjunto com a palavra "compreendendo", as palavras "um" ou "uma" podem significar um ou mais de um.
[0033] O uso do termo "ou" na reivindicação é usado para significar "e/ou" a menos que explicitamente indicado para se referir a apenas alternativas ou se as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação suporte uma definição que se refere a apenas alternativas e "e/ou". Como usados neste documento, "outro(a)" pode significar pelo menos um segundo ou mais.
[0034] Em todo este pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o dispositivo, o método sendo empregado para determinar o valor ou a variação que existe entre os indivíduos do estudo.
[0035] Outros objetivos, características e vantagens da invenção atual serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deve-se compreender, entretanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, ao indicarem as modalidades preferidas da invenção, são apresentados apenas a título de ilustração, uma vez que várias mudanças e modificações dentro do princípio e escopo da invenção se tornarão evidentes àquelas pessoas versadas na técnica à partir desta descrição detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0036] As figuras a seguir fazem parte do presente relatório descritivo e estão incluídas para demonstrar adicionalmente certos aspectos da presente invenção. A patente ou arquivo de pedido contém pelo menos um desenho executado em cor. Cópias desta publicação de patente ou pedido de patente com desenho(s) coloridos serão fornecidas pelo escritório mediante solicitação e pagamento das taxa necessárias. A invenção pode ser melhor compreendida por referência a uma ou mais destas figuras em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas neste documento.
[0037] As FIGs. 1A-F. Caracterização de Exossomos - Oncossomos são enriquecidos em miRNAs oncogênicos em comparação com normossomos. (A) Micrografia eletrônica de transmissão de oncossomos (foto superior esquerda e foto inferior esquerda e zoom inserido; linhas pontilhadas retratam a área de zoom). Imagens inferiores a direita produzidas por rotulação por immunogold usando anticorpo anti-CD9 e microscopia de transmissão de elétrons. (transmission electron microscopy, TEM na sigla em inglês) Partículas de ouro são retratadas como pontos pretos. O gráfico representa o tamanho médio das preparações de exossomos analisados a partir de 112 fotos do TEM. (B) Imagem de microscópio de força atômica (Atomic Force Microscopy, AFM na sigla em inglês) de exossomos de células de câncer de mama. O gráfico central representa a dispersão de partículas na lamela com faixa de tamanho de exossomos. O gráfico a direita representa o tamanho médio das preparações de exossomos analisados a partir de 26 fotos do AFM. (C) Immunoblot usando anticorpo anti-Dicer em exossomos coletados de: linhas de células (blot a esquerda, primeiro painel) de camundongo (NMuMG) e humano (MCF10A) não tumorigênicas; linhas de células de câncer de camundongo, 67NR e 4T1 (blot central, primeiro painel); linhas de células de câncer humano MCF7 e MDA-MB231 (blot a direita, primeiro painel). Os controles usados foram: exossomos tratados com TritonX seguido de proteinase K (Triton + PK), para induzir lise de exossomos e subsequente degradação de proteínas exossomais; exossomos tratados com proteinase K para degradar proteínas extra-exossomais (PK); sobrenadante após ultracentrifugação para coletar exossomos (sobrenadante). Immunoblots TSG101 (segunda linha) e CD9 (terceira fila) foram usados para confirmar a presença de exossomos. (D) Análise de citometria de fluxo usando marcadores de exossomos TSG101, CD9, flotillina-1 e anticorpos CD63 de exossomos derivados de MDA-MB231 acoplados a grânulos de 0,4 μm. (E) Dimensionamento de exossomos com Espectroscopia de Dispersão de Luz (Light Scattering Spectroscopy, LSS na sigla em inglês). Calibração do sistema foi feita usando sinais de suspensões de tampão fosfato-salino (PBS) de microesferas de vidro com diâmetros nominais de 24 nm e 100 nm e microesferas de poliestireno com diâmetros nominais de 119 nm, 175 nm, 356 nm e 457 nm. Os espectros experimentais e ajustes resultantes são mostrados no gráfico à esquerda por microesferas de vidro com diâmetro nominal de 100 nm e microesferas de poliestireno com diâmetro nominal de 356 nm. Gráfico a direita representa a medição do tamanho de uma suspensão de PBS de exossomos de câncer. Inset mostra o mesmo gráfico com uma escala até 10 μm para eliminar a contaminação potencial das nossas preparações de exossomos com células e restos celulares. (F) Distribuição de tamanho de exossomos usando NanoSight. Gráfico esquerdo representa a distribuição de tamanho de partículas em solução, apresentando um tamanho médio de 105 nm e também não demonstrando picos em tamanhos maiores. Gráfico a esquerda representa a distribuição por tamanho e concentração de partículas em solução por NanoSight. Os dados representados nesta figura são o resultado de três experimentos independentes cada um com três repetições, sendo representados como ± s.d.
[0038] As FIGs. 2A-F. Oncossomos tornam-se enriquecidos em miRNAs. (A) Gráfico de correlação de miRNAs expressados em exossomos MDA-MB231 e exossomos MCF10A. (B) Gráficos de correlação entre miRNAs nas células e respectivos exossomos usando 6 dos miRNAs expressos diferencialmente entre normossomos e oncossomos (miR-10a, 10b-miR, miR-21, miR-27a, miR-155 e miR-373) após 72h de cultura celular-livre. (C) Normossomos e oncossomos foram ressuspensos no meio DMEM e mantidos em cultura celular livre por 24 e 72 h. Após 24 e 72 h, exossomos foram recuperados e 15 miRNAs (ver Tabela 4) foram quantificados por qPCR. A modulação de cada miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 72h foi quantificada em relação ao mesmo miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 24 h. As parcelas gráficas representam uma média de modulação para o MiRNA supressor de tumor (ST) e oncogênico (ONC) em exossomos coletados após 72h em comparação com os coletados após 24h. (D) Northern blots de miR-10b e miR-21 de normossomos após 24 e 72 h de cultura celular livre e oncossomos sem cultura e com 24h, 72h e 96h de cultura celular livre. O tRNAMet foi usado como um controle de carregamento. Quantificação foi feita utilizando o software Image J. (E) Plots de correlação entre os 15 miRNAs quantificados em células MCF10A, MDA-MB231 e 4T1 e seus respectivos exossomos após 72h de cultura celular livre. Oncossomos apresentam valores de correlação baixos com sua célula de origem (gráficos central e direita) quando comparados a normossomos (gráfico à esquerda). (F) Representação gráfica do bioanalisador retratada em unidades de fluorescência (UF) por segundos (s) e imagens de gel do conteúdo de exossomos de RNA de normossomos e oncossomos.
[0039] As FIGs. 3A-E. Exossomos contêm pre-miRNAs. (A) Quinze pre-miRNAs correspondentes aos miRNAs maduros estudados foram quantificados usando exossomos qPCR de MCF10A e MDA-MB231. O inverso do valor ΔCt para cada pre-miRNA foi plotado para refletir sua abundância e os valores são representados como ± s.d. (B) Oncossomos e normossomos foram ressuspensos em meio DMEM e mantidos em condições de cultura celular livre por 24 e 72 h. Após 24 e 72 h os exossomos foram extraídos mais uma vez e 15 pre-miRNAs foram quantificados por qPCR. Gráficos mostram modulação de cada pre-miRNA em exossomos MCF10A e MDA-MB231 após 72h de cultura celular livre em relação à 24h de cultura celular livre e são representados como ± s.d. (C) Northern blots de premiR-10b e pre-miR-21 usando normossomos MCF10A após 24h e 72h de cultura celular livre e oncossomos MDA- MB231 com 0 h, 24 h, 72h e 96 h de cultura celular livre. O tRNAMet foi usado como um controle de carregamento. Quantificação foi feita utilizando o software Image J. (D) Gráficos superiores: pre-miRNAs oncogênicos (gráfico à esquerda) e miRNAs oncogênicos (gráfico à direita) de oncossomos (MDA-MB231) foram quantificados após 24h e 72h de condições de cultura celular livre. O inverso do valor ΔCt para cada pre- miRNA (gráfico à esquerda) e miRNA (gráfico à direita) em diferentes pontos de tempo foi plotado para refletir sua abundância e uma tendência exponencial foi observada. Os dados apresentados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD. Gráficos inferiores: pre- miRNAs (gráfico à esquerda) e miRNAs maduros (gráfico à direita) de oncossomos (MDA-MB231) foram quantificados após 6h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h e 96h de condições de cultura celular livre. O inverso do valor ΔCt para cada pre-miRNA (gráfico à esquerda) e miRNA (gráfico à direita) em diferentes pontos de tempo foi plotado e uma tendência exponencial foi observada. Os dados apresentados nesta figura são o resultado de três experimentos independentes cada um com três repetições, sendo representados como ± s.d. (E) Oncossomos e normossomos foram ressuspensos em meio DMEM e mantidos em condições de cultura celular livre por 0h, 24h, 72h e 96h Exossomos foram extraídos de pontos de tempo diferentes e pre-miRNAs foram quantificados por qPCR. O inverso do valor ΔCt para cada pre-miRNA em pontos de tempo diferentes foi plotado para refletir sua abundância.
[0040] As FIGs. 4A-N. Oncossomos contêm proteínas RLC. (A) Immunoblot usando anticorpo anti-Dicer em exossomos coletados de: linhas de células (blot a esquerda, primeiro painel) de camundongo (NMuMG) e humano (MCF10A) não tumorigênicas; linhas de células de câncer de camundongo, 67NR e 4T1; e linhas de células de câncer humano MCF7 e MDA-MB231. Os controles usados foram: exossomos tratados com TritonX seguido de tratamento proteinase K (Triton + PK), para induzir lise de exossomos e subsequente degradação de proteínas exossomais; e exossomos tratados com proteinase K para degradar proteínas extra- exossomais (PK). Immunoblots TSG101 (segunda linha) e CD9 (terceira fila) foram usados para confirmar a presença de exossomos. (B) Micrográficos de transmissão de elétron da rotulação por immunogold usando anticorpo anti-Dicer em oncossomos (MDA-MB231). Imagem superior a direita é digitalmente ampliada à partir de uma nova imagem independente da extração. Controle negativo refere-se a IgG. Partículas de ouro são retratadas como pontos pretos e são indicadas por setas pretas da imagem inferior. Gráfico representa a quantificação das duas imagens superiores à esquerda. (C) Immunoblot usando anticorpo anti-sinalizador (painel superior) em exossomos MCF10A e MDA-MB231 coletados de células transfectadas com vetor vazio (pCMV-Tag4B; primeira e terceira faixas, respectivamente) e vetor Sinalizador-Dicer (segunda e quarta faixas). Immunoblot CD9 foi usado para confirmar a presença de exossomos e como um controle de carregamento (painel inferior). (D) Immunoblot para Dicer em exossomos coletados de células MCF10A e MDA-MB231 tratadas com o ionóforo de cálcio A23187 (painel superior). Exossomos extraídos de células não tratadas foram utilizados como controle. Immunoblot CD9 (painel inferior) foi usado como controle para mostrar aumento na secreção de exossomos. (E) Immunoblot para Dicer em exossomos extraídos de células parentais MCF10A e MDA-MB231 e células transfectadas com plasmídeos shScramble e shDicer (blot superior). Immunoblot CD9 foi usado para mostrar a presença de exossomos e como um controle de carregamento (blot inferior). Quantificação de immunoblot foi feita utilizando o software Image J. (F) Micrográficos de transmissão de elétron da rotulação por immunogold usando anticorpo anti-Dicer em oncossomos derivados de células MDAMB231shDicer. Partículas de ouro são retratadas como pontos pretos. Gráfico à direita retrata a quantificação de partículas de ouro em imagens EM. (G) Immunoblot usando anticorpo anti-AGO2 em exossomos coletados de oncossomos (MCF7 e MDA- MB231) e normossomos (MCF10A). O controles usados foram: exossomos tratados com TritonX seguido de proteinase K (TritonX + PK), para induzir lise de exossomos e subsequente degradação de proteínas exossomais; exossomos tratados com proteinase K para degradar proteínas extra- exossomais (PK); sobrenadante após ultracentrifugação para coletar exossomos (sobrenadante). Immunoblots TSG101 (segunda linha) e CD9 (terceira linha) foram usados para confirmar a presença de exossomos. (H) Immunoblot usando anticorpo anti-TRBP em exossomos coletados de oncossomos (MCF7 e MDA-MB231) e normossomos (MCF10A). O controles usados foram: exossomos tratados com TritonX seguido de proteinase K (TritonX + PK), para induzir lise de exossomos e subsequente degradação de proteínas exossomais; exossomos tratados com proteinase K para degradar proteínas extra-exossomais (PK); sobrenadante após ultracentrifugação para coletar exossomos (sobrenadante). Immunoblots TSG101 (segunda linha) e CD9 (terceira fila) foram usados como marcadores de exossomos. (I) Immunoblot usando anticorpo anti-GFP nas células MCF10A e MDA-MB231 transfectadas com plasmídeo GFP-AGO2 (painel superior). Beta-actina foi usada como controle de carregamento (painel inferior). (J) Immunoblot usando anticorpo anti-GFP em exossomos extraídos das células MCF10A e MDA-MB231 transfectadas com plasmídeo GFP-AGO2 (painel superior). TSG101 (painel central) e CD9 (painel inferior) foram utilizados como marcadores de exossomos e controles de carregamento. (K) Expressão de mRNA AGO2 em células MCF10A e MDA- MB231 transfectadas com siAGO2. Células parentais MCF10A e MDA- MB231 foram usadas como controles relativos para comparação de alteração de modulação. Os dados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD. (L) Immunoblot usando anticorpo AGO2 em exossomos extraídos de células parentais MCF10A e MDA- MB231 ou células transfectadas com sicontrol ou siAGO2 (painel superior). TSG101 (blot central) e CD9 (blot inferior) foram utilizados como marcadores de exossomos e controles de carregamento. Quantificação foi feita utilizando o software Image J. (M) Immunoblot usando o anticorpo AGO2 em proteínas exossomais extraídas de células MCF10A e MDA- MB231 imunoprecipitadas com anticorpo Dicer ou IgG (painel superior). 5% da entrada do lisado de exossomos extraído de células MDA-MB231 foi usado como controle. Immunoblot de Dicer foi usado como controle para a imunoprecipitação (painel inferior). (N) Immunoblot usando o anticorpo TRBP em proteínas exossomais extraídas de células MCF10A e MDA- MB231 imunoprecipitadas com anticorpo Dicer ou IgG (painel superior). Entrada do lisado de exossomos (5%) extraído de células MDA-MB231 foi usado como controle. Immunoblot de Dicer foi usado como controle (painel inferior).
[0041] As FIGs. 5A-E. Oncossomos processam pre-miRNAs para gerar miRNAs maduros. (A) Exossomos foram coletados de células MCF10A, MCF10A, shScramble, MCF10A shDicer (gráfico superior), células MDA-MB231, shScramble MDA-MB231 e MDA-MB231 shDicer (gráfico inferior) e mantidos sob condições de cultura celular livre por 24 e 72 h. Após 24 e 72 h, exossomos foram recuperados e 15 pre-miRNAs foram quantificados por qPCR. Gráficos mostram a modulação de cada pre- miRNA nos diferentes exossomos após 72h de cultura celular livre em relação à 24h de cultura celular livre e são representados como ± s.d. (B) Exossomos foram coletados de células MCF10A, MCF10A, shScramble, MCF10A shDicer (gráfico superior), células MDA-MB231, MDA-MB231 shScramble e MDA-MB231 shDicer (gráfico inferior) e mantidos sob condições de cultura celular livre por 24 e 72 h. Após 24 e 72 h os exossomos foram extraídos mais uma vez e 15 pre-miRNAs foram quantificados por qPCR. Gráficos mostram a modulação de cada pre- miRNA nos diferentes exossomos após 72h de cultura celular livre em relação à 24h de cultura celular livre e são representados como ± s.d. (C) Immunoblot usando anticorpo secundário anticoelho e antimouse para detectar o anticorpo primário Dicer e o anticorpo primário Actina de cadeia pesada (CP) e de cadeia leve (CL) eletroporados em exossomos de células MDA-MB231. Exossomos eletroporados sem anticorpos derivados de células MDA-MB231 foram utilizados como controle negativo. Tratamentos de proteinase K foram realizados após eletroporação para garantir depleção dos anticorpos não incluídos em exossomos. (D) Oncossomos (MDA- MB231) foram coletados em duplicata (gráfico inferior) ou quadruplicata (gráfico superior). As amostras foram eletroporadas com anticorpo antiDicer, anticorpo anti-actina ou anticorpo anti-TRBP. As amostras e o controle foram deixados em condições de cultura celular livre por 24 e 72 h. Após 24 e 72h os exossomos foram extraídos mais uma vez e os 6 pre- miRNAs oncogênicos (gráfico superior) ou 15 pre-miRNAs (gráfico inferior) foram quantificados por qPCR. A modulação de cada pre-miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 72h foi quantificada em relação ao mesmo pre-miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 24 h em cada amostra. As parcelas gráficas representam uma modulação média para pre-miRNAs (no gráfico inferior - ST = supressor do tumor; ONC = oncogênicos) em exossomos de 72h em relação a exossomos de 24 h e são representados como ± s.d. (E) Oncossomos (MDA-MB231) foram coletados em quadruplicata (gráfico superior) ou duplicata (gráfico inferior). As amostras foram eletroporadas com anticorpo anti-Dicer, anticorpo anti- actina ou anticorpo anti-TRBP. As amostras e o controle foram deixados em condições de cultura celular livre por 24 e 72 h. Após 24 e 72h os exossomos foram extraídos mais uma vez e os 6 miRNAs oncogênicos (gráfico superior) ou 15 miRNAs (gráfico inferior) foram quantificados por qPCR. A modulação de cada miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 72h foi quantificada em relação ao mesmo miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 24 h em cada amostra. As parcelas gráficas representam uma modulação média para os miRNAs (no gráfico inferior - ST = supressor do tumor; ONC = oncogênicos) em exossomos de 72h em relação a exossomos de 24 h e são representados como ± s.d.
[0042] As FIGs. 6A-F. Oncossomos processam pre-miRNAs para gerar miRNAs maduros. (A) Exossomos de células MDA-MB231 foram coletados e eletroporados com Geldanamicina. As amostras foram deixadas em condições de cultura celular livre por 24 e 72 h, depois das quais exossomos foram extraídos e os 6 miRNAs foram quantificados por qPCR. A modulação de cada miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 72h foi quantificada em relação ao mesmo miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 24 h em cada amostra. As parcelas gráficas representam a modulação média para os miRNAs em exossomos de 72h em relação a exossomos de 24 h e são representados como ± s.d. (B) pre- miRNAs sintéticos -10b, -21 e - cel-1 foram eletroporados em exossomos coletados de células MCF10A (MCF10A eletrop.), MCF10AshDicer(MCF10AshDicer eletrop.), MDAMB231 (MDA-MB231 eletrop.) e MDA-MB231shDicer (MDAMB231shDicer eletrop.) Células TIRARTIRARTIRARTIRARTIRARTIRARTIRARTIRAR Exossomos foram recuperados após condições de cultura celular livre por 72h. pre-miR-10b, - 21 e -cel-1 foram quantificados por qPCR antes e após 72 h de eletroporação e cultura. Cada barra nos plots mostra a modulação de pre- miR-10b, -21 e - cel-1 72 h após a eletroporação em relação à 0h após a eletroporação e são representados como ± s.d. Exossomos MCF10A e MDA-MB231 eletroporados na ausência de pre-miRNAs foram usados como controles para realçar níveis basais. (C) pre-miRNAs sintéticos -10b, - 21 e - cel-1 foram eletroporados em exossomos coletados de células MCF10A (MCF10A eletrop.), MCF10AshDicer(MCF10AshDicer eletrop.), MDAMB231 (MDA-MB231 eletrop.) e MDAMB231shDicer (MDA- MB231shDicer eletrop.) Células TIRARTIRARTIRARTIRARTIRARTIRARTIRARTIRAR Exossomos foram recuperados após condições de cultura celular livre por 72h. MiR-10b, -21 e -cel-1 foram quantificados por qPCR antes e após 72 h de eletroporação e cultura. Cada barra nos plots mostra a modulação de pre-miR-10b, -21 e - cel-1 72 h após a eletroporação em relação à 0h (gráficos superiores) ou 24hrs (gráfico inferior) após a eletroporação e são representados como ± s.d. Exossomos MCF10A e MDA-MB231 eletroporados na ausência de pre- miRNAs foram usados como controles para determinar níveis basais. (D) Northern blot sem sonda de detecção, utilizando amostras do ensaio de corte em cubos. Diferentes extratos de proteína exossomais e pre-miR-10b sintéticos internamente marcados com biotina foram utilizados para o ensaio de corte em cubos. Amostras utilizadas foram MCF10A, MCF10AshDicer, exossomos MDA-MB231 (MDA231 Exos), exossomos de MDA-MB231shDicer clone1 e clone2 (MDA231shDicer 1 exos e MDA231shDicer 2 exos, respectivamente), células MDA-MB231shDicer e exossomos MDA-MB231 eletroporados com anticorpo Dicer (MDA231 exos + Dicer AB). (E) Northern blot sem sonda de detecção, utilizando amostras do ensaio de corte em cubos. Diferentes extratos de proteína exossomais e pre-miR-21 sintéticos internamente marcados com biotina foram utilizados para o ensaio de corte em cubos. Amostras utilizadas foram MCF10A, MCF10AshDicer, exossomos MDA-MB231 (MDA231 Exos), exossomos de MDA-MB231shDicer clone1 e clone2 (MDA231shDicer 1 exos e MDA231shDicer 2 exos, respectivamente), células MDA-MB231shDicer e exossomos MDA-MB231 eletroporados com anticorpo Dicer (MDA231 exos + Dicer AB). (F) Northern blot sem sonda de detecção utilizando amostras do ensaio de corte em cubos. Diferentes extratos de proteína exossomais e pre-cel-miR-1 sintéticos internamente marcados com biotina foram utilizados para o ensaio de corte em cubos. Amostras utilizadas foram MCF10A, MCF10AshDicer, exossomos MDA-MB231 (MDA231 Exos), exossomos MDAMB231shDicer (MDA231shDicer exos) e exossomos MDAMB231 eletroporados com anticorpo Dicer (MDA231 exos + Dicer AB).. Os dados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD.
[0043] As FIGs. 7A-H. Oncossomos induzem alterações no transcriptoma nas células recipientes e formação de tumor em uma forma dependente de Dicer. (A) Immunoblot usando anticorpo anti-PTEN e extratos de proteína de células MCF10A tratadas por 0, 30min, 1h, 12h e 24h com oncossomos MDA-MB231 após cultura celular livre. Beta-actina foi usada como controle de carregamento. (B) Immunoblot usando anticorpo anti-HOXD10 e extratos de proteína de células MCF10A tratadas por 0, 30min, 1h, 12h e 24h com oncossomos MDA-MB231 após cultura celular livre. Beta-actina foi usada como controle de carregamento. (C) Gráfico mostrando a atividade repórter da luciferase nas células MCF10A transitoriamente transfectadas com 3’UTR-PTEN-WT, 3’UTRPTEN-Mut, 3’UTR-HOXD10-WT e 3’UTR-HOXD10-Mut e tratadas com oncossomos derivados de células MDA-MB231. (D) Immunoblot usando anticorpo anti- PTEN (painel superior) e anticorpo anti-HOXD10 (painel central) e extratos de proteínas de células MCF10A tratadas por 0, 30min, 1h, 12h e 24h com oncossomos MDAMB231 eletroporados com anticorpo Dicer após condições de cultura celular livre. Beta-actina foi usada como controle de carregamento. (E) Immunoblot usando anticorpo anti-Smad4 (painel superior) e extratos de proteína de células MCF10A e células MCF10A tratadas com exossomos MDA-MB231 com exossomos anti-miR-182-5 p e MDA-MB231 sem tempo de cultura celular livre. Beta-actina foi usada como controle de carregamento. (F) Viabilidade da célula medida pelo ensaio MTT durante 5 dias da cultura de células MCF10A, as células MCF10A tratadas com exossomos MDA-MB231 sem tempo de cultura celular livre (MCF10A + MDA231 exos), as células MCF10A tratadas com exossomos MDA-MB231 com tempo de cultura celular livre (células MCF10A + cultura exos MDA231) e as células MCF10A tratadas com exossomos MDA-MB231 eletroporados com o anticorpo de Dicer com tempo de cultura celular livre (células MCF10A + MDA231 exos Dicer AB) e são representadas como ± s.d. * p=0.0027. (G) O ensaio de formação de colônia mostra a formação de colônias na placa de cultura e rotulados com MTT reagente após 8 dias de cultura de células MCF10A, , as células MCF10A tratadas com exossomos MDA-MB231 sem tempo de cultura celular livre (MCF10A + MDA231 exos), as células MCF10A tratadas com exossomos MDA-MB231 com tempo de cultura celular livre (células MCF10A + cultura exos MDA231) e células MCF10A tratadas com exossomos MDA-MB231 eletroporados com anticorpo Dicer com tempo de cultura celular livre (células MCF10A + MDA231 exos Dicer AB). (H) Gráfico superior: Células MCF10A, células MCF10A expostas a oncossomos MDA-MB-231 (células MCF10A + cultura exos MDA231), células MCF10A expostas a oncossomos MDA-MB231 eletroporados com anticorpo Dicer (células MCF10A + MDA231 exos Dicer AB) e células MCF10A expostas a oncossomos MDAMB231 eletroporados com anticorpo Actina (células MCF10A + MDA231 exos Actina AB) foram ortotopicamente injetados nas glândulas mamárias de camundongos nude atímicos. Gráfico mostra o volume do tumor em relação ao tempo e são representados como ± s.d. *p=0,005. Gráfico inferior: Células MCF10A, células MDA-MB231 e células MCF10A expostas a oncossomos (MDA- MB231) foram ortotopicamente injetadas nas glândulas mamárias de camundongos nude atímicos. Gráfico retrata o volume do tumor em relação ao tempo.
[0044] As FIGs. 8A-I. Soro de pacientes com câncer de mama contêm Dicer e processam pré-miRNAs. (A) Immunoblot usando anticorpo anti-Dicer, que reconhece Dicer humano e de camundongo, e extratos de proteína de exossomos de soro coletados de camundongo xenoenxertados com tumores humanos (como mostrado na FIG. 18A). OVA1-5 representa xenoenxertos de ovário humano; END1-3 representa xenoenxertos de endrométrio humano; e BRST1 e 2 representam xenoenxertos de mama humana. Exossomos 4T1 e células foram usados como controles para Dicer murino. hsa-Dicer representa o peso molecular de Dicer humano e mmu-Dicer representa o peso molecular do Dicer murino. Ver FIG. 18D para coloração Comassie das membranas como controle de carregamento. (B) Análise de rastreamento de partícula NanoSight mostrando a distribuição de tamanho de exossomos extraídos do soro de 8 doadores saudáveis (gráfico à esquerda) e 11 pacientes com câncer de mama (gráfico à direita). Concentração das amostras foi padronizada para mostrar melhor o tamanho. (C) Micrografia de transmissão de elétron de exossomos coletados do soro de pacientes com câncer de mama. (D) Concentração de exossomos do soro de 8 doadores saudáveis e 11 pacientes com câncer de mama avaliados pela análise de rastreamento de partícula Nanosight. *p = 0,012 (E) Exossomos foram coletados do soro fresco de 8 doadores saudáveis e 11 pacientes com câncer de mama. As amostras extraídas foram deixadas em condições de cultura celular livre por 24 e 72 h. Após 24 e 72 h, exossomos foram recuperados e 6 pré-miRNAs foram quantificados por qPCR. A modulação de cada pré-miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 72h foi quantificada em relação ao mesmo pré-miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 24 h em cada amostra. As parcelas gráficas em pontos representam a modulação média para os pre- miRNAs em exossomos de 72h em relação a exossomos de 24 h e são representados como ± s.d. (F) Exossomos foram coletados do soro fresco de 8 doadores saudáveis e 11 pacientes com câncer de mama. As amostras extraídas foram deixadas em condições de cultura celular livre por 24 e 72 h. Após 24 e 72 h, exossomos foram recuperados e 6 miRNAs foram quantificados por qPCR. A modulação de cada miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 72h foi quantificada em relação ao mesmo miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 24 h em cada amostra. As parcelas gráficas em pontos representam a modulação média para os pre-miRNAs em exossomos de 72h em relação a exossomos de 24h. Ambos os painéis E e F são o resultado de três experimentos independentes cada um com três repetições, sendo representados como ± s.d. (G) Células MCF10A, células MCF10A misturadas com exossomos de doadores saudáveis (H1-8) e células MCF10A misturadas com exossomos de pacientes com câncer de mama (BC1-11) foram ortotopicamente injetadas nas glândulas mamárias de camundongos nude atímicos. O número de exossomos usado foi calculado por peso corporal, refletindo a concentração inicial coletada do soro. Amostras que não formaram um tumor aparecem sobrepostas no EIXO X do gráfico. Este gráfico mostra o volume do tumor em relação ao tempo e é representado como ± s.d. (H) Immunoblots usando o anticorpo anti-Dicer e extratos de proteína de exossomos de soro coletados de 5 indivíduos saudáveis (C46, C45, C44, C43 e C41) e 4 cânceres de mama metastáticos (Met219, Met354, Met299 e Met356) usando o CD9 blot como controle de carregamento. (I) Duplicação de tempo de HDF e HDF tratado com oncossomos (MDA- MB231). * p=0,0114. Quantificação de immunoblot foi feita utilizando o software Image J.
[0045] As FIGs. 9A-B. Dicer está presente nos corpos multivesiculares e CD43 citoplasmático mobiliza Dicer em exossomos. (A) Immunoblot de CD43 em extratos de proteínas de células MDA-MB231 imunoprecipitadas com anticorpo Dicer (IP Dicer) ou IgG (painel superior, faixas direita e central, respectivamente). Apenas immunoblot de Dicer foi usado como controle (painel inferior). (B) Immunoblot de Dicer em extratos de proteínas de exossomos derivados MDA-MB231 e exossomos derivados MDA-MB231 siCD43. Immunoblot CD9 foi usado como um controle de carregamento. Quantificação foi feita utilizando o software Image J.
[0046] As FIGs. 10A-E. Caracterização de exossomos. (A) Fotografia de exossomos PKH26 corados, na parte inferior do tubo de ultracentrifugação. Inset representa a imagem digital ampliada dos exossomos. (B) Representação esquemática do sistema experimental usado para coletar espectros LSS. (C) Viabilidade celular medida pelo ensaio MTT durante 5 dias de cultura de células MCF10A, NMuMG, MDA- MB231 e 4T1. (D) Análise de fluxo de citometria para iodeto de propídeo (PI) e Anexina V de células MDA-MB231 e 4T1. Células MDA-MB231 tratadas com etoposida foram utilizadas como controle positivo para apoptose. (E) Análise immunoblot de citocromo C em exossomos usando células MDA-MB231 como um controle positivo e TSG101 como um controle de carregamento para exossomos. Os dados apresentados nesta figura são o resultado de três experimentos independentes cada um com três repetições, sendo representados como ± s.d.
[0047] As FIGs. 11A-E. Oncossomos são enriquecidos em miRNAs em comparação a normossomos. (A) Representação gráfica bioanalisadora retratada em unidades de fluorescência (UF) por nucleotídeos (nt) (gráficos) e imagens de gel (imagem à direita) do conteúdo do RNA de linhas de célula mamárias humanas MCF10A (não tumorigênicas) e MDA-MB231 (câncer de mama). (B) Exossomos coletados de células 4T1, MCF10A e MDA-MB231 foram resuspensos em meio DMEM e mantidos em condições de cultura celular livre por 24 e 72 hrs. Após 24 e 72 h, exossomos foram recuperados e 15 miRNAs (ver Tabela 4) foram quantificados por qPCR. Gráficos mostram modulação de cada miRNA em oncossomos após a cultura celular livre para 24h (gráficos superiores) e 72h (gráficos inferiores) em relação aos normossomos após 24 e 72 h de cultura celular livre, respectivamente. Os dados representados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD. (C) Quinze miRNAs maduros (ver Tabela 4) foram quantificados por qPCR em células MCF10A (gráfico à esquerda), MDA-MB231 (gráfico central) e 4T1 (gráfico à direita) e seus respectivos exossomos. A modulação de cada miRNA em exossomos foi quantificada em relação ao mesmo miRNA em células. ST: miRNAs supressores de tumor; ONC: miRNAs oncogênicos. Os dados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD. (D) Exossomos coletados de células MCF10A, MDA-MB231 e 4T1 foram resuspensos em meio DMEM e mantidos em condições de cultura celular livre por 24 e 72 hrs. Após 24 e 72 h os exossomos foram extraídos mais uma vez e 15 miRNAs (ver Tabela 4) foram quantificados por qPCR. A modulação de cada miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 72h foi quantificada em relação ao mesmo miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 24 h. Dados correspondem aos gráficos detalhados dos gráficos de média de modulação na FIG. 2C. Os dados apresentados nesta figura são o resultado de três experimentos independentes cada um com três repetições, sendo representados como ± s.d. (E) Plots de correlação entre os 15 miRNAs quantificados em células MCF7 e 67NR e seus respectivos exossomos após 72h de cultura celular livre.
[0048] As FIGs. 12A-E. Exossomos contêm pre-miRNAs. (A) Quinze pre-miRNAs correspondentes aos miRNAs maduros previamente quantificados (ver Tabela 4) foram quantificados por qPCR em exossomos NMuMG e 4T1. O inverso do valor ΔCt para cada pre-miRNA foi plotado para refletir sua abundância. Os dados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como ± s.d. (B) Exossomos coletados de células NMuMG e 4T1 foram resuspensos em meio DMEM e mantidos em condições de cultura celular livre por 24 e 72 hrs. Após 24 e 72 h os exossomos foram extraídos mais uma vez e 15 pré-miRNAs foram quantificados por qPCR. Gráficos mostram a modulação de cada pré- miRNA nos exossomos NMuMG e 4T1 após 72h de cultura celular livre em relação à 24h de cultura celular livre. Os dados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD. (C) Expressão de mRNA de XPO5 em células MDAMB231 com dois siRNAs transitoriamente transfectados direcionado ao XPO5 comparado conforme uma modulação controla as células. (D) Células MDA-MB231 foram transfectadas com construtos de XPO5 siRNA e expressão de miR-21 foi avaliada em vários pontos de tempo 12h pós-transfecção (0h, 6h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h e 96h). Como uma comparação para mostrar o efeito de períodos longos de centrifugação células MDA-MB231 transfectadas com construtos de XPO5 siRNA foram centrifugadas a 4°C por 3h e colocadas de volta na cultura. Expressão de miR-21 foi avaliada em vários pontos de tempo pós centrifugação de pontos de tempo (0h, 6h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h e 96h). Processamento de premiR21 a miR-21 é atrasado nas células centrifugadas (barra verde). Os dados apresentados nesta figura são o resultado de três experimentos independentes cada um com três repetições, sendo representados como ± s.d. (E) Exossomos coletados de células NMuMG e 4T1 foram resuspensos em meio DMEM e mantidos em condições de cultura celular livre por 0, 24, 72 e 96h em condições de cultura celular livre. Exossomos foram extraídos de pontos de tempo diferentes e pre-miRNAs foram quantificados por qPCR. O inverso do valor ΔCt para cada pré-miRNA em pontos de tempo diferentes foi plotado para refletir sua abundância. Os dados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD.
[0049] As FIGs. 13A-H. Oncossomos contêm Dicer. (A) Imagem de micrografia de transmissão de elétrons produzida por rotulação por immunogold usando anticorpo anti-Dicer (foto à direita) e o controle negativo (foto à esquerda) em exossomos derivado de células MCF10A. Compare com FIG. 4B para rotulação positiva por immunogold de exossomos MDA-MB231. (B)Imagem de micrografia de transmissão de elétrons produzida por rotulação por immunogold usando anticorpo anti- GFP exossomos derivados de MDA-MB231. (C) Immunoblot usando anticorpo anti-sinalizador (painel superior) em células MCF10A e MDA- MB231 transfectadas com vetor vazio (pCMV-Tag4B; primeira e terceira faixas, respectivamente) e vetor Sinalizador-Dicer (segunda e quarta faixas). Immunoblot beta-actina foi usado como controle de carregamento (painel inferior). (D) Immunoblot usando anticorpo anti-Dicer (painel superior) em células de MCF10A, MCF10AshScramble e MCF10AshDicer clones 1 e 2, respectivamente (MCF10AshDicer clone1 e MCF10AshDicer clone2). Immunoblot beta-actina foi usado como controle de carregamento (painel inferior). (E) Immunoblot usando anticorpo anti-Dicer (painel superior) em células MB231-MDA, MDA-MB231shScramble e MDA- MB231shDicer clones 1 e 2, respectivamente (MDA-MB231shDicer clone1 e MDA-MB231shDicer clone2). Immunoblot beta-actina foi usado como controle de carregamento (painel inferior). Quantificação de immunoblot foi feita utilizando o software Image J. (F) Immunoblot usando o anticorpo AGO2 em proteínas exossomais extraídas de células MCF10A e MDA- MB231 imunoprecipitadas com anticorpo Dicer ou IgG (painel superior). 5% da entrada do lisado de exossomos extraído de células MDA-MB231 foi usado como controle. Immunoblot de Dicer foi usado como controle para a imunoprecipitação (painel inferior). (G) Immunoblot usando o anticorpo anti- TRBP em proteínas exossomais extraídas de células MCF10A e MDA- MB231 imunoprecipitadas com anticorpo Dicer ou IgG (painel superior). Entrada do lisado de exossomos (5%) extraído de células MDA-MB231 foi usado como controle. Immunoblot de Dicer foi usado como controle para a imunoprecipitação (painel inferior). (H) Immunoblot de Dicer em oncossomos de linhas de célula (blot superior) A549 (câncer de pulmão humano), SW480 (câncer de cólon humano), HeLa (câncer de colo deútero humano) e 4T07 (câncer de mama murino). Immunoblot TSG101 foi usado para confirmar a presença de exossomos e carregamento (blot inferior).
[0050] As FIGs. 14A-F. Detecção de Dicer em exossomos. (A) Immunoblot usando anticorpo anti-Dicer em células 4T1, 4T1shScramble e 4T1shDicer e exossomos coletados de 4T1 (exos 4T1) e células 4T1shDicer (exos 4T1shDicer) (blot superior). Immunoblot GADPH foi usado como controle de carregamento (blot inferior). Quantificação foi feita utilizando o software Image J. (B) Exossomos foram coletados das células 4T1, 4T1shScramble e 4T1shDicer e mantidos em condições de cultura celular livre por 24 e 72 h. Após 24 e 72 h os exossomos foram extraídos mais uma vez e 15 pré-miRNAs foram quantificados por qPCR. Gráficos mostram a modulação de cada pré-miRNA nos diferentes exossomos após 72h de cultura celular livre em relação à 24h de cultura celular livre. Os dados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD. (C) Exossomos foram coletados das células 4T1, 4T1shScramble e 4T1shDicer e mantidos em condições de cultura celular livre por 24 e 72 h. Após 24 e 72 h os exossomos foram extraídos mais uma vez e 15 pré- miRNAs foram quantificados por qPCR. Gráficos mostram a modulação de cada pré-miRNA nos diferentes exossomos após 72h de cultura celular livre em relação à 24h de cultura celular livre. Os dados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD. (D) Exossomos foram coletados das células MDA-MB231 duplicadas. Uma das amostras foi eletroporada com anticorpo anti-Dicer. Ambas amostras foram deixadas em condições de cultura celular livre por 24 e 72 h. Após 24 e 72 h os exossomos foram extraídos mais uma vez e 15 pre-miRNAs (ver Tabela 4) foram quantificados por qPCR. A modulação de cada pre-miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 72h foi quantificada em relação ao mesmo pré-miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 24h em cada amostra. As parcelas gráficas representam modulação de pre-miRNAs em exossomos de 72h em relação a exossomos de 24h e são uma análise detalhada do gráfico representado na FIG. 5D. Os dados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD. (E) Exossomos foram coletados das células MDA-MB231 duplicadas. Uma das amostras foi eletroporada com anticorpo anti-Dicer. Ambas amostras foram deixadas em condições de cultura celular livre por 24 e 72 h. Após 24 e 72 h os exossomos foram extraídos mais uma vez e 15 miRNAs (ver Tabela 4) foram quantificados por qPCR. A modulação de cada miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 72h foi quantificada em relação ao mesmo miRNA em exossomos após a cultura celular livre de 24h em cada amostra. As parcelas gráficas representam modulação de miRNAs em exossomos de 72h em relação a exossomos de 24h e são uma análise detalhada do gráfico representado na FIG. 5E. Os dados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD. (F) Representação gráfica das categorias (Oncogênica, Supressor de Tumor e Não- determinado relacionadas ao Câncer) dos miRNAs negativamente regulados em exossomos MDA-MB231 eletroporados com Dicer (MDA- MB231 exos Dicer AB) comparados aos exossomos MDA-MB231 (exos MDA-MB231). MicroRNAs foram atribuídos a cada categoria, com base na literatura. Os dados apresentados nesta figura são o resultado de três experimentos independentes cada um com três repetições, sendo representados como ± s.d.
[0051] As FIGs. 15A-C. Detecção de Dicer em exossomos. (A) Exossomos foram coletados de células MCF10, MCF10AshDicer, MDA- MB231 e MDA-MB231shDicer e eletroporados com pré-miRNA-10b, -21 e - cel-1 sintéticos. Cada pre-miRNA foi quantificado por qPCR nos exossomos de eletroporados e representado como uma modulação em relação ao exossomos que foram eletroporados com apenas tampão de eletroporação. (8) Dot blot de biotina internamente rotulada pre-miR-21, -10b e -cel-1. (C) Análise de expressão miR-10b, -21 e -cel-1 de células MCF10A transfectadas com pre-miR-10b, -21 e -cel-1. Cada barra representa a modulação das células transfectadas em comparação com as não transfectadas. Os dados apresentados nesta figura são o resultado de três experimentos independentes cada um com três repetições, sendo representados como ± s.d.
[0052] As FIGs. 16A-I. Dicer está presente nos corpos multivesiculares e CD43 citoplasmático mobiliza Dicer em exossomos. (A) Gráfico representa a porcentagem de co-localização nas imagens confocais como quantificada utilizando software Image J. (B) Expressão de mRNA de hrs, TSG101 e BiG2 após regulação negativa usando dois siRNAs diferentes para Hrs e TSG101 e dois clones sh diferentes para BiG2. Células shScramble não transfectadas e transfectadas foram utilizadas como controle. (C) Quantificação da proteína por ensaio de Bradford de exossomos extraídos de MCF10A, MCF10AsiHrs, MDA-MB231 e MDA- MB231siHrs (gráfico à esquerda),MCF10shScramble, MCF10AshBiG2, MDA-MB231shScramble, MDA-MB231shBiG (gráfico central) e MCF10AsiTSG101 e MDA-MB231siTSG101 (gráfico à direita). Células parentais não transfectadas foram usadas como controles relativos para análise de modulação. Dados foram normalizados pelo número celular e são o resultado de três repetições biológicas representadas como SD. (D) Immunoblot de CD9 em extratos de proteínas exossomais de células (blot superior) MCF10A, MCF10AsiTSG101 (siTSG101), MCF10AsiHrs (siHrs) e MCF10AshBiG2 (shBiG2); immunoblot de CD9 em extratos de proteínas exossomais de células MDA-MB231, MDA-MB231siTSG101 (siTSG101), MDA-MB231siHrs (siHrs) e MDA-MB231shBiG2 (shBiG2). (E) Análise de rastreamento de partícula Nanosight de exossomos derivados de MDA- MB231, MDA-MB-231siTSG101, -siHrs e shBiG2 mostrando regulação negativa do número de exossomos em células reguladas negativamente Hrs, TSG101 e BiG2 e a distribuição de tamanho de exossomos esperada. (F) Expressão de mRNA de Dicer em células MCF10A, MCF10AshScramble, MCF10AsiHrs,MCF10AshBiG2, MCF10AsiTSG101, MDA-MB231, MDA-MB231shScramble,MDA-MB231siHrs, MDA- MB231shBiG2, MDA-MB231siTSG101, 4T1, 4T1siHrs,4T1shBiG2 e 4T1siTSG101. Células parentais foram usadas como controles relativos para comparação de modulação. Os dados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD. (G) Immunoblot de Dicer em extratos de proteína de células de câncer MDA-MB231 e 4T1 imunoprecipitadas com anticorpo anti-Dicer (blot superior, duas faixas da esquerda) juntamente com 5% da entrada que corresponde ao lisado de proteína usado para a imunoprecipitação (blot superior, duas faixas de direita). Immunoblot de poli-ubiquitina em extratos de proteína de células MDA-MB231 e 4T1 imunoprecipitadas com anticorpo anti-Dicer (blot inferior, duas faixas da esquerda) juntamente com 5% da entrada que corresponde ao lisado de proteína usado para a imunoprecipitação (blot superior, duas faixas de direita). (H) Expressão mRNA de CD43 nas células MCF10A, MCF10AsiCD43, MDA-MB231 e MDA-MB231siCD43. Células parentais MCF10A e MDA-MB231 foram usadas como controles relativos para comparação de modulação. Os dados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD. (I) Expressão mRNA de Dicer nas células MCF10A, MCF10AsiCD43, MDA-MB231 e MDA-MB231siCD43. Células parentais MCF10A e MDA-MB231 foram usadas como controles relativos para comparação de modulação. Os dados são o resultado de três réplicas biológicas e são representados como SD.
[0053] As FIGs. 17A-G. Oncossomos induzem alterações no transcriptoma no recebimento de células e formação de tumor em uma forma dependente de Dicer. (A) Análise de rastreamento de partícula Nanosight de exossomos derivado de células MDA-MB231 CD63-GFP. A linha preta representa uma medida da população total de exossomos e a linha verde retrata a população de exossomos que é rotulada com CD63- GFP usando o NanoSight equipado com um feixe de laser 488nm . Cinza claro e verde claro representam as barras de erro de cada medida. (B) Immunoblot usando anticorpo anti-PTEN e extratos de proteína de células MCF10A tratadas por 0, 30min, 1h, 12h e 24h com oncossomos MDA- MB231 extraídos recentemente. Beta-actina foi usada como controle de carregamento. (C) Immunoblot usando anticorpo anti-HOXD10 e extratos de proteína de células MCF10A tratadas por 0, 30min, 1h, 12h e 24h com oncossomos MDA-MB231 extraídos recentemente. Beta-actina foi usada como controle de carregamento. (D) Células MCF10A foram transfectadas com siRNA para XPO5 para regular negativamente o fluxo de pre-miRNAs para o citoplasma do núcleo. O processamento de pre-miR15 foi avaliado pela medição dos níveis de miR-15 ao longo do tempo (6h, 12h, 24h, 36h e 48h) em células MCF10AsiXPO5 e células MCF10AsiXPO5 tratadas com exossomos MDA-MB231 com e sem o anticorpo Dicer. Não houve mudanças significativas. (E) Expressão miR182-5P foi monitorada em exossomo derivado de MDA-MB231 ao longo do tempo (0h, 6h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h e 96h). Cada barra representa a modulação de cada ponto de tempo em comparação com 0h. Não houve mudanças significativas. (F) Gráfico fornece quantificação número de colônia da FIG. 7G. * p=0.0006. (G) Immunoblot usando anticorpo anti-Dicer e extratos de proteína de células MCF10A tratadas por 0, 30min, 1h, 12h e 24h com oncossomos MDA-MB231 eletroporados com anticorpo Dicer após condições de cultura celular livre. Tubulina alfa foi usada como controle de carregamento.
[0054] As FIGs. 18 A-D Exossomos de pacientes com câncer de mama, processam pré-miRNAs e inserem células em diferentes órgãos. (A) Fotos representativas de xenoenxertos ortotópicos derivados de fragmentos de ovário humano fresco primário, tumores endometriais e de mama em camundongos nude. (B) Coloração de ovário por hematoxilina-eosina (HE), xenoenxertos ortotópicos de endométrio e câncer de mama. (C) Micrografia de transmissão de elétrons de exossomos de soro coletados de camundongos com xenoenxertos ortotópicos de tumor. (D) Coloração Comassie das membranas de immunoblots representadas na FIG. 8A.
DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS
[0055] Progressão de câncer é dependente de uma comunicação eficaz entre as células no tumor. Exossomos são nanovesículas secretadas por todos os tipos de células e contêm proteínas e ácidos nucleicos. Exossomos secretados pelas células de câncer contêm especificamente microRNAs (miRNAs) associados ao RISC (RNA Induced Silencing Complex, Complexo Silenciador Induzido por RNA - Dicer/TRBP/AGO2) e possuem capacidade autônoma de célula para processar microRNAs precursores (pre-miRNAs) em miRNAs maduros. A existência de miRNAs associados ao RISC ao invés de miRNAs puros permite um silenciamento altamente eficiente e rápido dos mRNAs em células-alvo, alterando efetivamente seu transcriptoma. As proteínas do RISC em células cancerosas são direcionadas especificamente a corpos multivesiculares (MVBs) e posteriormente, em exossomos em uma forma dependente de CD43. MiRNAs com RISC incorporado de exossomos estimulam células epiteliais não tumorigênicas para formar tumores por meio de indução específica de vias oncogênicas e ativar os fibroblastos estromais. Este estudo desvenda o possível papel dos exossomos de câncer na indução de um "efeito de campo" oncogênico, que subjuga ainda mais as células normais a participar no desenvolvimento e progressão do câncer. Além disso, a biogênese do miRNA pode ocorrer de forma independente de célula em exossomos, oferecendo novas oportunidades para projetar uma terapia alvo eficiente mediada por miRNA para uma variedade de doenças. I. Exossomos derivados de câncer
[0056] Tumores contêm células cancerosas e elementos estromais (Tse e Kalluri, 2011). Indícios emergentes sugerem que a comunicação entre as células dos tumores e seus arredores também determinam a taxa e intensidade de disseminação sistêmica no câncer (Luga et al., 2012). Alguns estudos sugerem que os tumores primários podem formar e preparar locais de tumor secundário para futuras metástases por meio de fatores de secreção de células de câncer (Hood et al., 2011; Peinado et al., 2012). Foram identificados vários destes mediadores, que incluem fatores de crescimento solúveis, metabólitos de glicose, quimiocinas, enzimas, micropartículas, microvesículas, exossomos e ácidos nucleicos livres (Guermonprez et al., 2002; Luga et al., 2012; Peinado et al., 2012; Simons e Raposo, 2009; Thery e Casas, 2002).
[0057] Nos últimos anos houve uma infinidade de publicações relacionadas a exossomos e sua associação com câncer (Yang and Robbins, 2011). A maioria dos estudos mostra que células cancerosas secretam maior número de exossomos quando comparadas a células normais (Yang and Robbins, 2011). Células cancerosas hipóxicas verteram mais exossomos do que as células cancerosas normóxicas (King et al., 2012). É esperado que exossomos derivados de câncer transportem cargas úteis específicas de proteínas e ácidos nucleicos, incluindo miRNAs (Valadi et al, 2007). Ao mesmo tempo que são estimulantes, tais estudos ficam aquém ao explicar como proteínas e miRNAs podem induzir alterações funcionais significativas nas células alvo, perto ou longe. A maioria dos estudos identificaram miRNAs maduros em exossomos, mas sua função é desconhecida. Além disso, miRNAs de fita única são altamente ineficientes no silenciamento de mRNAs alvo sem incorporação de RISC para facilitar o reconhecimento do mRNA. Proteínas do RLC reconhecem o pre-miRNA e o processam em um duplex de RNA de 22 nucleotídeos. AGO2 seleciona uma fita para silenciamento genético subsequente enquanto a outra fita é por vezes degradada. A reação geral é espontânea e não requer quaisquer fatores para além das três proteínas e do pre-miRNA incorporado (Maniataki and Mourelatos,2005). Portanto, para que um miRNA seja totalmente funcional ele precisa de processamento com RLC incorporado de seu pre-miRNA e reconhecimento e silenciamento de mRNA mediado por AGO.
[0058] Neste documento, os perfis de miRNA de exossomos de células cancerígenas (oncossomos) e células de controle (normossomos) foram analisados e as capacidades funcionais de miRNAs exossomais foram avaliadas na realização de silenciamento de genes e alteração do transcriptoma da célula alvo. Especificamente, oncossomos contêm Dicer, TRBP e AGO2 como um complexo funcional com uma capacidade de processar pre-miRNAs em miRNAs. Os pre-miRNAs estavam presentes em todos os exossomos mas apenas processados nos oncossomos devido à presença de RLC. Curiosamente houve preferência por acumulação de pre- miRNAs/miRNAs oncogênicos nos oncossomos, isso podendo ser mero reflexo do conteúdo de pre-miRNA de células cancerígenas, que foram geralmente enriquecidas em miRNAs/pre-miRNAs oncogênicos (Bartels e Tsongalis, 2009; Nicoloso et al., 2009).
[0059] Relatórios anteriores sugeriram a presença de miRNA em exossomos e houve especulação sobre a sua função (Valadi et al., 2007; Zhang et al., 2010). Dado que os miRNAs precisam estar presentes em uma concentração estequiométrica para silenciamento apropriado de alvos mRNA, é improvável que exossomos em circulação proporcionariam concentrações suficientes de miRNAs maduros para reprimir o transcriptoma alvo. O processamento dos pre-miRNAs originados de exossomos nas células recipientes é algo improvável porque a biogênese de miRNA em células recipientes é limitante da taxa não só devido à quantidade total de pre-miRNAs disponíveis para processamento já existentes no interior da célula, mas também devido a limitação da taxa de quantidades de enzimas necessárias. Portanto, é mais eficiente ter miRNAs maduros inserindo células recipientes para alteração direta da expressão de gene de maneira pós transcricional sem ter que passar por uma via de processamento, como aconteceria no caso onde pre-miRNAs fossem transferidos para células recipientes, e não os respectivos miRNAs maduros. Biogênese de miRNA específica em exossomos resolve este dilema para as células cancerosas. Oncossomos ficam altamente enriquecidos em um subconjunto de miRNAs maduros que são associados ao RISC e podem desempenhar um papel biológico importante na formação do fenótipo das células alvo.
[0060] Além disso, as células cancerosas superexpressam miRNAs com potencial oncogênico, como o miR-21 e miR-155, que lhes proporcionam uma vantagem proliferativa e de sobrevivência e estão associados a estágio clínico avançado, metástase e mau prognóstico (Yan et al, 2008). Também foi anteriormente relatado que estes miRNAs são superexpressos na circulação de pacientes com câncer (Mao et al., 2013). A síntese de miRNAs em células é uma reação enzimática e, portanto, depende da quantidade de enzimas-chave, tais como Dicer, presentes em seu citoplasma. Dicer tem sido descrito como regulado negativamente em células de câncer de mama e tumores (Grelier et al., 2009; Martello et al., 2010). Portanto, a quantidade de miRNAs que estas células cancerosas podem sintetizar é limitada. Porque a produção de exossomos é um processo contínuo, é hipotético que as células cancerosas empacotam pre- miRNAs específicos com proteínas RLC para permitir o enriquecimento do miRNA maduro em exossomos e ao mesmo tempo, mantenham estes miRNAs regulados positivamente nas células de origem. Oncossomos são altamente enriquecidos em miRNAs maduros que são associados ao RISC e podem desempenhar um papel biológico importante na formação do fenótipo das células alvo. Ao mesmo tempo, as células de origem mantêm sua superexpressão de miRNAs oncogênicos vantajosos, enquanto as células recipientes não têm sua via de biogênese super saturada com a entrada de pre-miRNAs através de exossomos.
[0061] Estudos presentes revelam o mecanismo dependente de RISC pelo qual exossomos de câncer se enriquecem em um subconjunto de miRNAs. O uso de siRNA/shRNA contra Dicer em células cancerosas não era uma opção viável para analisar o conteúdo de miRNA em exossomos, já que qualquer diminuição no miRNA exossomal poderia ser um mero reflexo do baixo nível de miRNAs devido à supressão de Dicer. Portanto, um método de eletroporação foi desenvolvido para fornecer anticorpos neutralizantes diretamente para exossomos. Este método funcionou eficientemente para inibir a atividade de Dicer em exossomos e evitar o processamento de pre-miRNAs.
[0062] Enquanto determinados miRNAs são regulados positivamente em tumores específicos (Volinia et al, 2006), também há relatos de uma redução global de miRNA que ocorre em cânceres humanos (Kumar et al., 2007; Lu et al., 2005; Melo et al., 2011; Melo et al.,2010; Melo et al., 2009; Ozen et al., 2008). Dicer é descrito como suprimido em células cancerosas, mas baixos níveis são suficientes para sustentar o crescimento do tumor (Kumar et al, 2009). Regulação negativa parcial de Dicer por meio do miR- 103/107 aumenta a invasão de células cancerosas sem afetar a proliferação celular (Martello et al, 2010). Perda completa de Dicer é prejudicial para a sobrevivência da célula (Fukagawa et al, 2004). Baixos níveis de Dicer são associados a pouca sobrevivência de pacientes com câncer de ovário e pulmão (Karube et al., 2005; Merritt et al., 2008). Da mesma forma, perda de heterozigotos de Dicer se correlaciona com metástase em pacientes com câncer de mama (Martello et al, 2010). regulação negativo de Dicer em câncer de mama também ocorre de maneira pós transcricional porque os níveis do mRNA permanecem inalterados (Grelier et al, 2009; Wiesen e Tomasi, 2009). Em células cancerosas, uma fração de Dicer é direcionada a endossomos/MVBs de uma maneira dependente de CD43. Eventualmente, Dicer é secretado por meio de exossomos. regulação negativo de Hrs, BiG2 e TSG101, componentes da via biogênese exossomal, levou a mudanças drásticas na localização celular de proteínas Dicer. Uma possível explicação para níveis de Dicer suprimidos em células cancerosas pode ser devido a exportação ativa por meio de exossomos. Se a via de secreção de exossomos for fechada, as células cancerosas sentem o aumento em proteína Dicer e regulam negativamente sua expressão de mRNA. Além disso, eles transportam a proteína no compartimento nuclear, onde este já não pode auxiliar na produção de miRNAs maduros. No que diz respeito a isto, regulação positiva de Dicer em células de câncer agressivo torna-os mais indolentes (Parque et al, 2011).
[0063] CD43 é uma proteína transmembranar que é predominantemente presente em leucócitos. Em algumas células cancerosas, observa-se um CD43 truncado no citoplasma e núcleo (Shelley et al 2012.) Mostrou-se anteriormente que CD43 poderia mirar certas proteínas de membrana para exossomos (Shen et al, 2011a). Supressão de CD43 em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de mama reduz a carga de tumor em 76% (Shelley et al., 2012). Estudos clínicos sugerem que a expressão CD43 se correlaciona a pouca sobrevivência de pacientes de câncer de mama (de Laurentiis et al., 2011) Este relatório identifica que o CD43 está funcionalmente envolvido em direcionar o Dicer a oncossomos.
[0064] Estudos recentes mostram que os exossomos derivados de melanoma desempenham um papel na metástase e exossomos derivados de fibroblastos desempenham um papel na migração de células de câncer de mama (Luga et al., 2012; Peinado et al., 2012). Exossomos derivados de células cancerosas têm um papel pro-tumorigênico associado à transferência de proteínas mRNA e pro-angiogênicas (Luga et al., 2012;Peinado et al., 2012; Skog et al., 2008). Exossomos derivados de células cancerosas também podem contribuir para uma transferência horizontal de oncogenes, como EGFRvIII (Skog et al, 2008). Oncossomos mediam alterações significantes no transcriptoma em células-alvo por meio de miRNAs associadas ao RISC. Uma infinidade de processos biológicos são afetados nas células alvo, induzindo a proliferação e convertendo células não tumorigênicas em células formadoras de tumor. No entanto, o potencial efeito in vivo de oncossomos sobre células recipientes provavelmente depende de vários outros parâmetros ambientais e barreiras de acessibilidade.
[0065] Oncossomos também ativam fibroblastos estromais para adquirir um fenótipo de miofibroblastos. Por exemplo, a capacidade de oncossomos para silenciar supressores de tumor PTEN e HOXD10 por meio de oncossomos derivados de miR-21 e miR-10b, respectivamente, foram ilustrados (Ma et al, 2007; Maehama, 2007). Esses resultados destacam a natureza complexa da comunicação adotada por células cancerosas para alcançar a malignidade. Estes dados ilustram que as células cancerosas podem usar exossomos para manipular as células normais ao redor para acelerar a progressão do câncer e recrutar estroma reativo.
[0066] Muitos estudos têm demonstrado que fibroblastos e células epiteliais normais, também apresentam regulação negativa de supressores de tumor e ativação dos oncogenes sem mutações óbvias. Coletivamente, este estudo desvenda o possível papel dos exossomos de câncer na indução de um "efeito de campo" oncogênico, que subjuga as células normais subjacentes a participar no desenvolvimento e progressão do câncer. Oncossomos podem converter células não tumorigênicas em células formadoras de tumor por meio de ativação das vias oncogênicas. Adicionalmente, os oncossomos também podem participar na geração de estroma reativo. Isto provavelmente é alcançado sem a necessidade de mutações genéticas definidas e explica a natureza complexa de como células de câncer mutantes estendem sua agenda para recrutar apoio de seus micro e macro ambientes.
II. Detecção de biomarcador
[0067] A expressão de biomarcadores ou de genes pode ser medida por uma variedade de técnicas que são bem conhecidas na técnica Quantificação dos níveis do RNA mensageiro (mRNA) de um biomarcador pode ser usada para medir a expressão do biomarcador. Alternativamente, quantificação dos níveis do produto de proteína de um biomarcador da proteína pode ser usada para medir a expressão do biomarcador. Informações adicionais sobre os métodos discutidos abaixo podem ser encontradas em Ausubel et al. (2003) ou Sambrook et al. (1989). Aquele versados na técnica saberá quais parâmetros podem ser manipulados para otimizar a detecção do mRNA ou proteína de interesse.
[0068] Em algumas modalidades, tal obtenção de informações de expressão pode compreender a quantificação de RNA, por exemplo, microarranjo de cDNA, RT-PCR quantitativo, hibridação in situ, Nothern bot ou proteção de nuclease. Tal obtenção de informações de expressão pode compreender a quantificação de proteínas, por exemplo, quantificação de proteína compreendendo imuno-histoquímica, um ELISA, um radioimunoensaio (RIA), um ensaio imunorradiométrico, um fluoroimunoensaio, um ensaio quimioluminescente, um ensaio bioluminescente, uma eletroforese em gel, uma técnica Western blot, uma análise de espectrometria de massa ou um microarranjo da proteína.
[0069] Um microarranjo de ácido nucleico pode ser usado para quantificar a expressão diferencial de uma pluralidade de biomarcadores. Análise de microarranjo pode ser realizada usando um equipamento comercialmente disponível, seguindo os protocolos do fabricante, como por exemplo usando a tecnologia de Affymetrix GeneChip ® (Santa Clara, CA) ou o sistema de microarranjo da Incyte (Fremont, CA). Por exemplo, ácidos nucleicos de fita única (por exemplo, cDNAs ou oligonucleotídeos) podem ser plaqueados ou arranjados sobre um substrato de microchip. As sequências arranjadas em seguida são hibridizadas com sondas específicas de ácidos nucleicos das células de interesse. Sondas de cDNA marcadas de modo fluorescente podem ser geradas por meio da incorporação de desoxinucleotídeos marcados de modo fluorescente por transcrição reversa do RNA extraído de células de interesse. Alternativamente, o RNA pode ser amplificado pela transcrição in vitro e marcado com um marcador, como a biotina. As sondas marcadas são então hibridizadas aos ácidos nucleicos imobilizados sobre o microchip sob condições altamente restritivas. Após a lavagem rigorosa para remover as sondas acopladas não especificas, o chip é examinado por microscopia confocal de laser ou por outro método de detecção, como uma câmera CCD. Geralmente, os dados brutos de intensidade de fluorescência nos arquivos de hibridização são pré-processados com RMA para gerar valores de expressão.
[0070] PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) também pode ser usado para medir a expressão diferencial de uma pluralidade de biomarcadores. No qRT-PCR, o modelo de RNA é geralmente transcrito de modo inverso em cDNA, que é então amplificado por meio de uma reação de PCR. A quantidade de produto de PCR é seguida ciclo-por-ciclo em tempo real, que permite a determinação das concentrações iniciais de mRNA. Para medir a quantidade de produto PCR, a reação pode ser realizada na presença de um corante fluorescente, como o SYBR Green, que se liga ao DNA de fita dupla. A reação também pode ser realizada com uma sonda repórter fluorescente que é específica para o DNA a ser amplificado.
[0071] Um exemplo não limitante de uma sonda repórter fluorescente é uma sonda TaqMan ® (Applied Biosystems, Foster City, CA). A sonda repórter fluorescente fica fluorescente quando o corante silenciador é removido durante o ciclo de extensão PCR. qRT-PCR multiplex pode ser executado pelo uso de várias sondas repórter de genes específicos, cada uma das quais contém um fluoróforo diferente. Valores de fluorescência são registrados durante cada ciclo e representam a quantidade de produto amplificado àquele ponto na reação de amplificação. Para minimizar erros e reduzir qualquer variação de amostra para amostra, qRT-PCR pode ser realizado usando um padrão de referência. O padrão de referência ideal é expresso em um nível constante entre tecidos diferentes e não é afetado pelo tratamento experimental. Normas de referência adequados incluem, mas não estão limitadas a, mRNAs para os genes constitutivos gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) e b-actina. O nível de mRNA na amostra original ou a modulação na expressão de cada biomarcador podem ser determinados usando cálculos conhecidos na técnica.
[0072] Coloração imuno-histoquímica também pode ser usada para medir a expressão diferencial de uma pluralidade de biomarcadores. Esse método permite a localização de uma proteína nas células de uma amostra de tecido pela interação da proteína com um anticorpo específico. Por isso, o tecido pode ser fixado em formol ou outro fixador adequado, incorporado em cera ou plástico, e cortado em seções finas (a partir de cerca de 0,1 mm até vários mm de espessura) usando um micrótomo. Alternativamente, o tecido pode ser congelado e cortado em seções finas usando um criostato. As seções de tecido podem ser arranjadas sobre e fixadas em uma superfície sólida (ou seja um microarranjo do tecido). As seções de tecido são incubadas com um anticorpo primário contra o antígeno de interesse, seguido de lavagens para retirar os anticorpos desvinculados. O anticorpo primário pode ser acoplado a um sistema de detecção, ou o anticorpo primário pode ser detectado com um anticorpo secundário, que é acoplado a um sistema de detecção. O sistema de detecção pode ser um fluoróforo ou pode ser uma enzima, como a peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina, que pode converter um substrato em um produto colorimétrico, fluorescente ou quimioluminescente. As seções de tecido corado geralmente são verificadas sob um microscópio. Porque uma amostra de tecido de um indivíduo com câncer pode ser heterogênea, ou seja, algumas células podem ser normais e outras podem ser cancerosas, a percentagem de células coradas positivamente no tecido pode ser determinada. Essa medida, juntamente com uma quantificação da intensidade da coloração, pode ser usada para gerar um valor de expressão para o biomarcador.
[0073] Um ensaio de imunoabsorção enzimática, ou ELISA, pode ser usado para medir a expressão diferencial de uma pluralidade de biomarcadores. Há muitas variações de um ensaio ELISA. Todos são baseados na imobilização de um antígeno ou anticorpo sobre uma superfície sólida, geralmente uma placa de microtitulação. O método ELISA original compreende a preparação de uma amostra contendo as proteínas de biomarcador de interesse, revestimento dos poços de uma placa de microtitulação com a amostra, incubando cada poço com um anticorpo primário que reconhece um antígeno específico, lavagem para retirar os anticorpos desvinculados e em seguida, detecção dos complexos antígeno- anticorpo. Os complexos anticorpo-anticorpo podem ser detectados diretamente. Para isto, os anticorpos primários são conjugados a um sistema de detecção, tais como uma enzima que produz um produto detectável. Os complexos anticorpo-anticorpo podem ser detectados indiretamente. Para isso, o anticorpo primário é detectado por um anticorpo secundário, que é conjugado a um sistema de detecção, como descrito acima. A placa de microtitulação é então examinada e os dados brutos de intensidade podem ser convertidos em valores de expressão usando meios conhecidos na técnica.
[0074] Um microarranjo de anticorpos também pode ser usado para medir a expressão diferencial de uma pluralidade de biomarcadores. Para isso, uma pluralidade de anticorpos é arranjada e covalentemente ligada à superfície do microarranjo ou biochip. Um extrato de proteína contendo as proteínas de biomarcador de interesse geralmente é rotulado com um corante fluorescente ou biotina. As proteínas de biomarcador marcadas são incubadas com o microarranjo de anticorpo. Após lavagens para remover as proteínas desvinculadas, o microarranjo é examinado. Os dados brutos de intensidade podem ser convertidos em valores de expressão usando meios conhecidos na técnica.
[0075] Microesferas Luminex de multiplexação também pode ser usadas para medir a expressão diferencial de uma pluralidade de biomarcadores. Estes grânulos de poliestireno microscópicos são internamente codificados por cores com corantes fluorescentes, de modo que cada grânulo tem uma assinatura espectral única (das quais existem até 100). Grânulos com a mesma assinatura são marcadas com um oligonucleotídeo específico ou anticorpo específico que vinculará o alvo de interesse (ou seja, biomarcador mRNA ou proteínas, respectivamente). O alvo, por sua vez, também está marcado com um repórter fluorescente. Portanto, há duas fontes de cor, um do grânulo e o outro da molécula repórter no alvo. Os grânulos são então incubados com a amostra contendo os alvos, dos quais até 100 podem ser detectados em um poço. O pequeno tamanho/área de superfície dos grânulos e a exposição tri dimensional dos grânulos para os alvos permite uma cinética de fase de solução durante a reação de ligação. Os alvos capturados são detectados por fluidos de alta tecnologia baseados em citometria de fluxo em que lasers excitam os corantes internos que identificam cada grânulo e também qualquer corante repórter capturado durante o ensaio. Os dados dos arquivos de aquisição podem ser convertidos em valores de expressão usando meios conhecidos na técnica.
[0076] Hibridização in situ também pode ser usada para medir a expressão diferencial de uma pluralidade de biomarcadores. Este método permite a localização de mRNAs de interesse nas células de uma amostra de tecido. Para este método, o tecido pode ser congelado, ou fixo e incorporado e então cortado em seções finas, que são dispostas e afixadas em uma superfície sólida. As seções de tecido são incubadas com uma sonda anti-sense marcada que irá hibridizar com um mRNA de interesse. A hibridação e etapas de lavagem geralmente são executadas sob condições altamente rigorosas. A sonda pode ser marcada com um fluoróforo ou uma pequena tag (como biotina ou digoxigenina) que pode ser detectada por outra proteína ou anticorpo, de modo que o híbrido marcado pode ser detectado e visualizado sob um microscópio. Vários mRNAs podem ser detectados simultaneamente, uma vez que cada sonda anti-sense tem uma marca distinguível. A matriz de tecido hibridizada geralmente é examinada sob um microscópio. Porque uma amostra de tecido de um indivíduo com câncer pode ser heterogênea, ou seja, algumas células podem ser normais e outras podem ser cancerosas, a percentagem de células coradas positivamente no tecido pode ser determinada. Essa medida, juntamente com uma quantificação da intensidade da coloração, pode ser usada para gerar um valor de expressão para cada biomarcador.
[0077] Em uma outra modalidade, o nível do marcador pode ser comparado ao nível do marcador de um controle, no qual o controle pode incluir uma ou mais amostras de tumor retiradas de um ou mais pacientes determinados como tendo um determinado tumor metastático ou não tendo um determinado tumor metastático ou ambos.
[0078] O controle pode compreender dados obtidos ao mesmo tempo (por exemplo, no mesmo experimento de hibridação) do que os dados individuais do paciente, ou pode ser um valor armazenado ou um conjunto de valores , por exemplo,armazenado em um computador, ou em um meio legível por computador. Se este último for usado, novos dados do paciente para o(s) marcador(es) selecionado(s), obtidos de amostras iniciais ou de acompanhamento podem ser comparados aos dados armazenados para o(s) mesmo(s) marcador(es) sem a necessidade de experimentos de controle adicionais.
III. Definições
[0079] Como usado neste documento, "obtenção de uma amostra biológica" ou "obtenção de uma amostra de sangue" referem-se a receber uma amostra biológica ou de sangue, por exemplo, seja direta ou indiretamente. Por exemplo, em algumas modalidades, a amostra biológica, como uma amostra de sangue ou uma amostra contendo células mononucleares de sangue periférico (PBMC), é obtida diretamente de um indivíduo em ou perto do laboratório ou o local onde a amostra biológica será analisada. Em outras modalidades, a amostra biológica pode ser retirada ou tomada por terceiros e transferida em seguida, por exemplo, para uma entidade separada ou local para análise. Em outras modalidades, a amostra pode ser obtida e testada no mesmo local usando um ponto de teste de cuidados. Nestas modalidades, tal obtenção refere-se a receber a amostra, por exemplo, do paciente, de um laboratório, um consultório médico, pelo correio, caixa postal ou agência dos correios, etc. Em alguns aspectos adicionais, o método pode compreender adicionalmente relatórios de uma determinação para o indivíduo, ao pagador do plano de saúde, um médico, farmacêutico, gerente de benefícios farmacêuticos ou qualquer pessoa a quem a determinação pode ser de interesse.
[0080] Por "indivíduo" ou "paciente" entende-se que seja qualquer indivíduo único para o qual a terapia ou teste de diagnóstico é desejado. Neste caso, os indivíduos ou pacientes geralmente se referem a seres humanos. Também se destina a ser incluído como um indivíduo são quaisquer indivíduos envolvidos em experimentos de pesquisa clínica que não mostrem qualquer sinal clínico de doença, ou indivíduos envolvidos em estudos epidemiológicos ou indivíduos utilizados como controles.
[0081] Como usado neste documento, "aumento da expressão" refere-se a um nível elevado ou aumento de nível de expressão em uma amostra de câncer em relação a um controle apropriado (por exemplo, um tecido não canceroso ou amostra de célula, uma padrão de referência), no qual a elevação ou o aumento do nível de expressão genética é estatisticamente significativo (p < 0,05). Se um aumento na expressão de um gene em uma amostra de câncer em relação a um controle é estatisticamente significante, este pode ser determinado usando um teste t apropriado (por exemplo, teste t de uma amostra, teste t de duas amostras, teste t de Welch) ou outro teste estatístico conhecido por aqueles versados na técnica. Genes que são superexpressos em um câncer podem ser, por exemplo, genes que são conhecidos, ou foram previamente determinados, para serem superexpressos em um câncer.
[0082] Como usado neste documento, "diminuição da expressão" refere-se a um nível reduzido ou diminuído de nível de expressão em uma amostra de câncer em relação a um controle apropriado (por exemplo, um tecido não canceroso ou amostra de célula, uma padrão de referência), no qual a redução ou a diminuição do nível de expressão genética é estatisticamente significativo (p < 0,05). Em algumas modalidades, o nível reduzido ou diminuído da expressão genética pode ser uma completa ausência de expressão genética ou um nível de expressão de zero. Se uma diminuição na expressão de um gene em uma amostra de câncer em relação a um controle é estatisticamente significante, este pode ser determinado usando um teste t apropriado (por exemplo, teste t de uma amostra, teste t de duas amostras, teste t de Welch) ou outro teste estatístico conhecido por aqueles versados na técnica. Genes que são subexpressos em um câncer podem ser, por exemplo, genes que são conhecidos, ou foram previamente determinados, para serem subexpressos em um câncer.
[0083] O termo "fragmento ligante de antígeno" é usado neste documento no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo.
[0084] O termo "iniciador" (primer), como usado neste documento, deve englobar qualquer ácido nucleico que é capaz de iniciar a síntese de ácidos nucleicos nascente em um processo dependente do modelo. Os iniciadores podem ser oligonucleotídeos de dez a vinte ou trinta pares de bases em comprimento, mas sequências maiores podem ser empregadas. os inciadores demão podem ser fornecidos nas formas de fita dupla e/ou fita única, embora a forma de fita única seja preferencial.
IV. Exemplos
[0085] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar modalidades preferenciais da invenção. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas que os inventores descobriram funcionar bem na prática da invenção e, assim, podem ser consideradas para constituir os exemplos dos modos preferenciais para sua prática. No entanto, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas as quais são divulgadas e ainda obter um resultado parecido ou semelhante, sem se desviar do espírito e do escopo da invenção. Exemplo 1 - Procedimentos Experimentais
[0086] Isolamento e purificação do exossomo Exossomos foram purificados por centrifugação diferencial como descrito anteriormente (Thery et al., 2006; Luga et al., 2012). Em suma, sobrenadante de células cultivadas por 24 hr foram submetidos às etapas de centrifugação sequencial de 800g e 2000g e o sobrenadante foi filtrado usando filtro de 0,2 μm em frascos de cultura. Exossomos foram peletizados em 100,000g em um rotor de êmbolo oscilante SW40Ti por 2hr (Beckman). Sobrenadante foi descartado e PBS foi adicionado para uma etapa de 1hr de lavagem. O pélete foi analisado para exossomo. Exossomos para extração de RNA foram ressuspensos em 500ul de Trizol; exossomos para extração de proteína foram ressuspensos em 250ul de tampão de lise (8M Ureia/2,5%SDS, 5 μg/ml de leupeptina, 1 μg/ml de pepstatina e 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil); e exossomos para os tratamentos foram ressuspensos em PBS. Amostras de soro congeladas foram descongeladas no gelo e 500 μl foram adicionados a 12 mL de PBS e se seguiu o mesmo procedimento referido anteriormente. Exossomos purificados por centrifugação foram tratados (37°C por 60 minutos) com 500 g/mL de proteinase K (Sigma-Aldrich) dissolvida em água livre de RNase, seguida por inativação do calor da protease (60°C por 10 minutos) e incubação (37°C por 15 minutos) com 2g/mL de RNaseA livre de protease (Sigma- Aldrich), seguido pela adição de 10X do inibidor de RNase concentrado (Ambion). Para o tratamento de exossomos, os exossomos foram purificados em duplicado e uma das pelotas foi usada para a quantificação de proteínas.
[0087] Análise de citometria de fluxo de exossomos. Preparações de exossomos (5-10 μg) foram incubadas com 5μl de grânulos de látex de aldeído/sulfato com 4-μm de diâmetro (Interfacial Dynamics, Portland, OR) e ressuspensos em 400 μl de PBS contendo 2% de BSA. Grânulos revestidos de exossomos (20 μl) foram incubados com os seguintes anticorpos: anti-CD63 (Santa Cruz), anti-CD9 (abcam), anti-TSG101 (abcam), anti-flotillina-1 (Santa Cruz) durante 30 minutos a 4°C, seguido, quando necessário, por incubação com anticorpo secundário conjugado FITC e analisados em um citômetro de fluxo FACS Calibur (BD Biosciences).
[0088] Eletroporação de Exossomos Exossomos em uma concentração total de proteína de 100 μg (medida pelo ensaio de Bradford) e 5 μg de anticorpo Dicer (SC-30226 policlonais, Santa Cruz, CA), 5 ug de anticorpo de Actina ou 10 μg de pre-miRNA-21,-10b e -cel1 foram misturados em 400 μl de tampão de eletroporação (1,15 mM de fosfato de potássio com pH 7,2, cloreto de potássio de 25 milímetros, 21% Optiprep) e eletroporados em uma cubeta de 4mm usando um sistema de eletroporação Gene Pulser Xcell (Biorad) conforme descrito anteriormente (Alvarez-Erviti et al2011). Depois da eletroporação, os exossomos foram tratados com proteinase K e/ou RNAse quando apropriado.
[0089] Espectroscopia de Dispersão de Luz (LSS). Espectros LSS foram coletados usando o sistema experimental descrito na FIG. 10B. O laser super contínuo de banda larga Fianium SC-450-2 foi usado como uma fonte de luz branca. A luz do laser super contínuo foi focada na amostra com uma lente de comprimento de foco longo. As amostras consistindo de suspensões líquidas de exossomos ou microesferas foram colocadas em um suporte de amostra de quartzo em forma cúbica personalizado. Os sinais de fundo foram coletados de amostras de solvente sem exossomos ou microesferas. A luz espalhada por exossomos ou microesferas a 90° ao feixe incidente foi coletada com a outra lente de comprimento de foco longo e entregue ao espectrógrafo de imagem Princiton InstrumentActon 2300i juntamente com um detector de alta eficiência Andor TechnologyiXon DV885 EMCCD. A detecção realizou-se na faixa de comprimento de onda de 470-870-nm. O detector foi controlado por um computador, ao qual os dados foram transferidos, armazenados e processados.
[0090] Para calibrar o sistema e estabelecer sua capacidade de detectar com precisão os tamanhos das partículas, que podem ser menores que o comprimento de onda, os sinais de suspensões de tampão fosfato salino (PBS) de microesferas de vidro com diâmetros nominais de 24 nm e 100 nm e microesferas de poliestireno com diâmetros nominais de 119 nm, 175 nm, 356 nm e 457 nm foram medidos. Os espectros previstos pela teoria de Mie foram ajustados aos dados usando o método dos mínimos quadrados desenvolvido anteriormente (Fang et al, 2003). Os espectros experimentais e ajustes resultantes são mostrados na FIG. 1E para microesferas de vidro com diâmetro nominal de 100 nm e microesferas de poliestireno com diâmetro nominal de 356 nm. Aqui o desvio em relação a dispersão de Rayleigh multiplicado pelo poder diante do comprimento de onda é mostrado para enfatizar o comportamento não-Rayleigh dos espectros de LSS. Comparando as distribuições de tamanho de rendimento de LSS para microesferas com as especificações fornecidas pelo fabricante, concluiu-se que a precisão do método LSS é estimada em 10 nm. Também foi estabelecido que as distribuições de tamanho reconstituídas são insensíveis aos índices de refração das microesferas e do solvente. Deve ser salientado aqui que uma vez que a dispersão de luz de pequenas partículas é proporcional à potência seis de seu tamanho, detecção de partículas menores que 50 nm na presença de partículas maiores exigiria um aumento substancial na relação sinal-ruído do sistema experimental.
[0091] Experimentos de LSS com suspensão de PBS de exossomos foram então realizados. O espectro de LSS experimental dos exossomos e o ajuste Mie correspondente são apresentados na FIG. 1B. O ajuste do espectro reconstruído é excelente. Usando a técnica de reconstrução mencionada acima (Fang et al. 2003; Itzkan et al. 2007; Fang et al. 2007) foi encontrada a distribuição de tamanho dos exossomos (ver FIG. 1R gráfico à esquerda e inserção), que atingiu um pico em 104 nm. Esta distribuição de tamanho extraída foi comparada às medidas morfométricas realizadas nas fotografias TEM das amostras de exossomos semelhantes (FIG. 1A). Uma vez que o número de partículas nas fotos TEM não era grande o suficiente para traçar uma distribuição estatisticamente significativa, o tamanho médio das partículas maiores do que 50 nm foi calculado a partir da fotografia TEM, descoberto como sendo igual a 95nm. Assim, a distribuição de tamanho reconstruída de LSS e medidas morfométricas realizadas nas fotografias TEM de exossomos estão de acordo com todos os dados.
[0092] Tratamentos N-Rh-PE. As células foram marcadas com N-Rh- PE incubando com 8 μM N-Rh-PE (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) diluído em 1X de tampão Hanks gelado (Invitrogen, Carlsbad, CA) por uma hora no gelo. As células foram então lavadas 3 vezes com tampão Hanks gelado antes de serem plaqueadas de volta no meio DMEM. As células N- Rh-PE foram usadas para imagem confocal aproximadamente 24 horas após a marcação.
[0093] Marcação do Immunogold e Microscopia Eletrônica. Espécimes fixos em uma concentração ideal foram pingados em uma grade revestida de carbono/formvar e permitidos para absorver o formvar por um período mínimo de 1 minuto. Para coloração por immunogold, as grades foram colocadas em um tampão de bloqueio para uma etapa de bloqueio/permeabilização por 1 hora. Sem enxágue, as grades foram imediatamente colocadas no anticorpo primário na diluição adequada durante a noite a 4°C (anti-Dicer policlonal 1:10 30226-SC, Santa Cruz; anti-CD9 1:10 monoclonal, Abcam). Como controles, algumas grades não foram expostas ao anticorpo primário. No dia seguinte, todas as grades foram enxaguadas com PBS e então flutuadas em gotas do anticorpo secundário apropriado anexado a partículas de ouro de 10nm (AURION, Hatfield, PA) por 2 horas em temperatura ambiente. Grades foram enxaguadas com PBS e foram colocadas em 2,5% de glutaraldeído em tampão fosfato 0,1 M durante 15 minutos. Após o enxague em PBS e água destilada, as grades foram deixadas para secar e coradas para contraste com acetato de uranil. As amostras foram vistas com um microscópio de transmissão de elétrons Tecnai Bio Twin (FEI, Hillsboro, OR) e imagens feitas com uma câmera AMT CCD Camera (AdvancedMicroscopy Techniques, Danvers, MA).
[0094] Blot de Proteína e Anticorpos. Para monitorar respostas genéticas endógenas, as células foram coletadas no tampão RIPA e exossomos em 8M de ureia/2.5%SDS, 5 μg/ml de leupeptina, 1 μg/ml de pepstatina e 1mM de tampão de fluoreto de fenilmetilsulfonil. As proteínas foram carregadas de acordo com a quantificação de Bradford em géis de acrilamida e transferidas para membranas PVDF (ImmobilonP) por transferência eletroforética molhada. Para exemplos de amostras de proteínas dos exossomos de soro coletados a partir dos modelos de xenoenxertos ortotópicos, um gel com 4% de acrilamida com 15 cm de altura foi usado para resolver bandas de Dicer humanas e de camundongos. Em geral, os blots foram bloqueados por 1hr a RT com 5% leite desnatado seco em PBS/0,05% Tween e incubados durante a noite a 4°C, com os seguintes anticorpos primários: 1:500 anti-Dicer (SC-30226) Santa Cruz; 1:1000 proteínas anti-Ubiquitiniladas, clone FK2 Millipore; 1:500 anti-sinalizador M2-Peroxidase Clone M2 Sigma; 1:500 anti-CD43 ab9088 Abcam; 1:500 anti-PTEN, ab32199, Abcam; 1:300 anti-CD9 ab92726, Abcam; 1:500 anti-GADPH ab9483, Abcam; 1:250 anti-TRBP ab72110, Abcam; 1:300 anti-TSG101 ab83, Abcam; 1:400 anti-AGO2 ab32381, Abcam; 1:4000 anti-β-actina Peroxidase Clone AC-15, Sigma; 1:500 anti-GFP ab6556, Abcam; 1:500 anti-HOXD10 ab76897 Abcam. Anticorpos secundários foram incubados por 1hr no RT Lavagem após incubação de anticorpos foram feitas em um agitador orbital, quatro vezes em intervalos de 10 min, com 1X PBS 0,05% Tween20. Blots foram desenvolvidos com reagentes quimioluminescentes de Pierce.
[0095] Análise PCR em Tempo Real RNA tratado por DNase foi retrotranscrito com MultiScribe ReverseTranscriptase (Applied Biosystems) e iniciadores oligo-d(T) após purificação total de RNA com Trizol (Invitrogen). PCR em tempo real para os mRNAs foi realizado em um Instrumento de Detecção de Sequência ABI PRISM 7300HT usando SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) e β-actina como o controle. Os iniciadores são listados na Tabela 1.
[0096] Pré-miRNAs foram quantificados usando 150ng de RNA tratado por DNase e pelo kit SuperScript III Platinum One-Step RT-qPCR (Invitrogen) (Schmittgen et al, 2004). Os iniciadores são listados na Tabela 1.
[0097] Para análise da expressão do miRNA, 10ng de RNA foi misturado com o kit de transcrição reversa TaqManMicroRNA reagente que contem iniciadores específicos do miRNA e reverso transcrito de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems). Misturas de reação foram incubadas a 16°C durante 30 minutos, 42°C por 30 minutos e 85°C por 5 minutos. PCR em tempo real foi realizado usando ABI PRISM 7300HT Sequence Detection System Instrument (Applied Biosystems) usando usando o Ensaio Sob Demanda comercialmente disponível (Applied Biosystems) para cada miRNA estudado. Expressão de miRNAs foi normalizada para a expressão de 18S rRNA (Reagente de Ensaio Pré- Desenvolvido TaqMan; Applied Biosystems) que serviu como controle interno para quantidade e integridade de RNA. Cada medida foi realizada em triplicata. Limite de ciclo (Ct), o número de ciclo fracional no qual a quantidade de alvo amplificado atingiu um limite fixo, foi determinado e a expressão foi medida usando a fórmula 2-ΔCt, como anteriormente relatado (Livak e Schmittgen, 2001). Tabela 1 Sequências Iniciadoras de qPCR
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[0098] Nothern Blot. Nothern Blot foi realizado utilizando oligonucleotídeos 3'Bio [TEG] DNA do complemento reverso para o miRNA maduro como sondas (ver Tabela 2). Géis de 15% de acrilamida/ureia foram usados para carregar 40 μg de RNA exossomal (tratado por DNase) juntamente com 1 X de corante de carregamento RNA após 2 minutos a 95°C seguido de um período de 2 minutos no gelo. Marcador de MicroRNA foi usado de acordo com as instruções do fabricante (N2102, New England BioLabs). Eletroforese foi realizada a 4°C durante 3 hr usando TBE 1x. Transferência foi feita usando papéis de blotting Whatman e a membrana de nylon positivamente carregada BrightStar-Plus (Ambion) durante 2 horas a 4°C com TBE 0,5 X. O RNA foi reticulado para a membrana usando um transiluminador UV durante 20 minutos. Membranas foram pre-hibridizadas girando por 1 hora a 42°C em solução de hibridação Ambion's ULTRAhyb®- Oligo (Ambion). As sondas foram descongeladas em gelo e 150 ng foram adicionados por mL de tampão de hibridização após incubação de 5 minutos a 95°C, após o qual as membranas foram deixadas em rotação durante a noite a 42°C. As lavagens seguintes foram feitas: 2 x SSPE/0,5%SDS - duas vezes por 15 minutos; 0,2SSPE/0,5%SDS - duas vezes por 30 minutos e 2 X SSPE - 5 minutos. Estas etapas de lavagem inicial foram seguidas por mais lavagens e em seguida os blots foram desenvolvidos usando o kit BrightStar BioDetect de acordo com as instruções do fabricante (Ambion). Os blots foram expostos durante a noite com duas películas empilhadas. Os blots foram retirados e reanalisados por mais duas vezes com êxito. Tabela 2. Sequências de Sonda Norte
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[0099] Cultura de células, Plasmídeos, Pre-miRNAs e siRNAs. Linhas de célula humanas MCF10A, MCF7, MDA-MB231, A549, SW480 e HeLa, assim as como linhas de células mamárias de camundongo NMuMG, 67NR e 4T1 foram cultivadas em DMEM 10% FBS (todas as células originadas de American Type Culture Collection - ATCC). Transfecções foram realizadas usando o reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen) para siRNA. Para transfecções sintéticas pre-miRNA o RNAiFect (Qiagen) foi usado em todas as linhas de célula. As sequências de siRNAs são listadas na Tabela 3. Tabela 3. Sequências siRNA
Figure img0004
[00100] Plasmídeos. p-CMV-Tag4B-Dicer (Melo et al., 2009); p- CMV6-CD63-GFP de Origene (RG217238); GFP-hAGO2 de Addgene (plasmídeo 11590); pGFP-shBiG2 de Origene (TG314697); pGFP-shDicer de Origene (TG304991); pre-miR-10b sintético, -21 e -cel-1 foram comprados de Ambion; 3’UTR-WTPTEN, 3’UTR-Mutant-PTEN (Dr. Joshua Mendell laboratory), 3’UTR-WTHOXD10 e 3’UTR-Mutant-HOXD10 (Dr. Robert Weinberg laboratory) são de Addgene.
[00101] Imunocitoquímica e Microscopia Confocal. As células foram plaqueadas na confluência apropriada em 12 placas de poço em lamelas inseridas e cultivadas durante a noite. As células do dia seguinte foram lavadas com PBS frio 1X e fixadas por 20 min em RT com 4% PFA/PBS. Slides foram permeabilizados durante 10 minutos em RT com PBS 0,5% Triton X-100, bloqueado 1 hr a RT com BSA 5% e incubado durante a noite a 4°C, com os anticorpos primários em PBST (PBS, 0,1% Triton) 2% BSA: 1:100 anti-Dicer (SC-30226) Santa Cruz; 1:500 anti-sinalizador Sigma; 1:50 anti-CD43 ab9088 (Abcam); 1:100 anti-TSG101 ab83 (Abcam); 1:500 anti- GFP ab6556 (Abcam); 1:100 anti-LAPM-1 ab25630 (Abcam); 1:100 anti-Hrs ab56468 (Abcam); 1:100 anti-BiG2 ab75001 (Abcam); 1:500 anti-biotina ab66233 (Abcam). Anticorpos secundários Alexa 543 cabra anti-coelho ou Alexa-488 cabra anti-camundongo foram incubados 1hr no RT diluído 1:200 em PBST 2% BSA. DAPI foi usado para corar os núcleos. Para análise de exossomos, exossomos coletados foram incubados com Triton X-0.05% por 15 min e, posteriormente, com 5% de BSA para 1 hr a RT. O primeiro anticorpo primário (anti-CD9, 1:50) foi incubado durante a noite em 100ul PBST a 4°C e o segundo anticorpo primário, anti-sinalizador (1:50), foi adicionado no dia seguinte e incubado durante 1 hr a RT. Anticorpos secundários foram adicionados consecutivamente e incubados também por 1 hr a RT. Exossomos foram plaqueados em cima de lamelas em placas de 12 poços em 4% PFA por 45 min e lavadas com PBS frio. Imagens foram obtidas com um Sistema Confocal Vertical Zeiss LSM510 usando a ferramenta de reciclagem para manter configurações idênticas. Exossomos agregados levam a estruturas maiores que 200 nm visíveis em microscopia confocal. Para análise de dados, imagens foram selecionadas de um pool de pelo menos dois experimentos independentes. Figuras mostram campos representativos.
[00102] Ensaios de corte em cubos In Vitro Extratos de proteína exossomais (10 μg) foram incubados a 37°C, com 3 pmol de hairpins internamente marcados com biotina pre-miR-10b, -21 e - cel-1 na presença de 3 mM MgCl2, 30 mM de NaCl e 100 mM Hepes, pH 7,5. O volume final de cada reação foi 10 μl. As reações foram paradas pela adição de 10 μl de tampão de carregamento de gel de formamida. RNA foi resolvido usando a eletroforese em gel de poliacrilamida de desnaturação e desenvolvido com o kit BrightStar BioDetect de acordo com as instruções do fabricante (Ambion).
[00103] Viabilidade Celular e Ensaios de Formação de Colônia. As células foram banhadas em placas de 96 poços e exossomos coletados foram adicionados no dia 1, em uma concentração de 100 μg/mL. Viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de brometo de 3-(4,5- dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT). Para experimentos de formação de colônia, as células foram banhadas em placas de 12 poços e exossomos foram adicionados no dia 1 e 5 da cultura em uma concentração de 100 μg/mL. Após 8 dias as colônias foram fixadas e coradas com reagente MTT.
[00104] Arranjo de Expressão de mRNA Illumina Human-HT12. RNA foi hibridizado em uma matriz de arranjo de expressão de mRNA Illumina Human-HT12. Dados foram normalizados usando a rotina neqc oferecida pelo pacote R "limma"(Shi et al, 2010). Abundâncias genéticas foram determinadas pela mediana das sondas por gene. Agrupamento é feito pela média aritmética das distâncias euclidianas de genes (linhas) e amostras (colunas).
[00105] Arranjo de Expressão miRNA. Um arranjo de miRNA personalizado foi usado como descrito em 9. O arranjo contém 1833 sondas de microRNA humano, 1084 sondas de microRNA de camundongo e outras 78 sondas de RNA não codificadas. As sondas são impressas em duplicata. O ID de acesso GenBank associado a cada sonda está incluído. Análise bioinformática foi realizada usando R (versão 2.14.2) (na internet em r-project.org) e Bioconductor (na internet em bioconductor.org/). A intensidade bruta para cada sonda é a intensidade do pixel de característica mediana com a mediana de fundo subtraída. Definir um deslocamento 1 garante que não haverá nenhum valor negativo após transformação de dados em log. Dados foram normalizados seguidos por log2 transform. Sinais de sondas medindo o mesmo miRNA sofreram uma média. A análise foi realizada usando as funções da biblioteca LIMMA. Os mapas de calor foram gerados usando a função heatplot da biblioteca made4. Quando repetições técnicas foram realizadas, o mapa de calor representou os valores de expressão média obtidos de medições repetidas.
[00106] Xenoenxertos Ortotópicos de Ovário, Endométrio e Tumores de Mama. Camundongos atímicos nu/nu (Harlan) entre 4 a 6 semanas de idade foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente em um ciclo de claro-escuro de 12 horas de 21 a 23°C e de 40% a 60% de umidade. Os camundongos tiveram acesso livre a uma dieta irradiada e água esterilizada. Todos os protocolos de animais foram revistos e aprovados de acordo com o cuidado Spanish Institutional Animal Care and Use Committees.
[00107] As espécimes de tumor primário foram obtidas no Hospital Universitari de Bellvitge (L’Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Espanha). O Institutional Review Board aprovou o estudo. O termo de consentimento foi coletado dos pacientes. Pedaços de tecido não necrótico (ca. 2-3mm3) de cinco representantes ressecados de tumor de ovário epitelial humano (EOCs): serosa, endometrial, tumor de células claras e mucinoso, foram selecionados e colocados em DMEM (BioWhittaker) suplementados com 10% FBS e penicilina/estreptomicina em temperatura ambiente. Sob anestesia induzida pelo isofluorano, os animais foram submetidos a uma laparotomia lateral, seus ovários expostos e pedaços de tumor ancorados à superfície do ovário com 7,0 suturas de prolene. Além disso, pedaços de mama humana e tumores endometriais foram implantados nas glândulas de gordura mamárias e na parede endometrial, respectivamente.
[00108] Tumores ortotopicamente enxertados foram autorizados a crescer e, no momento do sacrifício 2 ml de sangue foram obtidos de camundongos anestesiados por punção cardíaca. As amostras foram centrifugadas a 14,000 rpm e congeladas a -80°C.
[00109] Imunoprecipitação Células e exossomos foram coletados, lavados em PBS e centrifugados ou ultracentrifugados, respectivamente para recolher péletes. Tampão RIPA gelado ou tampão de 8M de ureia/SDS foram adicionados a células e exossomos, respectivamente. Suspensões foram gentilmente balançadas a 4°C, 15 min para células e 2 hr para exossomos. Os lisados foram centrifugados a 14,000 g em uma centrífuga pre-refrigerada por 15 minutos e o pélete foi descartado. Grânulos de proteína A ou G agarose/sefarose foram lavados duas vezes com PBS e restaurados com 50% de pasta com PBS. Uma mistura de grânulo/pasta (100 μl) foi adicionada a 1 mL de lisado celular e 500 μl de lisado exossomal e incubada a 4°C por 10 min. Os grânulos foram removidos por centrifugação a 14.000 x g a 4°C durante 10 minutos e os péletes descartados. Anticorpo Dicer (5 μg para células e 10 μg para exossomos) foi adicionado a 500 μl de lisado celular ou 250 μl de lisado exossomal (1 μg/μl células, 10 μg/μl exossomos) e incubado durante a noite a 4°C em um agitador orbital. 100 μl de grânulos/pasta de proteína A ou G agarose/sefarose foram adicionados e deixados durante a noite a 4°C. Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e os grânulos lavados 3 vezes com tampão RIPA gelado para células ou tampão Ureia/SDS para exossomos. Os grânulos de agarose/sefarose foram fervidos por 5 minutos para dissociar os imunocomplexos dos grânulos. Os grânulos foram coletados por centrifugação e blot de proteína foi realizado com o sobrenadante.
[00110] Condições de cultura na presença de Ionóforo A23187 Ca2 + Células (células 8 x 107) foram semeadas a 5 x io5 céluias/mi em DMEM. Para tratar as células, A23187 (200 nM concentração final, Calbiochem, La Jolla, CA) foi adicionado às culturas quatro horas mais tarde. Meios de células tratadas e não tratadas foi coletado e exossomos recolhidos.
[00111] Injeção ortotópica das células em camundongos nude. O crescimento do tumor ortotópico foi medido pela injeção de células epiteliais de mama não tumorigênicas, células epiteliais de mama não tumorigênicas MCF10A expostas aos exossomos derivados de MDA-MB231 e células de câncer de mama MDA-MB-231 (células 1 x 105 em 0,2 ml de PBS) nas glândulas mamárias de camundongos atímico feminino de 3 semanas de idade, conforme descrito anteriormente (Welch, 1997). O crescimento do tumor foi monitorado semanalmente, medindo-se o comprimento do tumor e largura com um paquímetro e foi relatado como o diâmetro médio do tumor como descrito anteriormente (Welch, 1997). Todos os animais foram sacrificados 21 dias após a injeção de célula de tumor.
[00112] Estatísticas. Barras de erro indicam desvio padrão entre repetições biológicas. Triplicatas técnicas, assim como as biológicas de cada experimento foram realizadas. Significância estatística foi calculada pelo teste t de Student.
Exemplo 2 - Resultados
[00113] Isolação e Identificação de Exossomos. Exossomos das células cancerosas (carcinoma de mama humano metastático negativo triplo MDA-MB231, adenocarcinoma de mama humano MCF7, carcinoma de mama não-metastático de rato 67NR e carcinoma de mama metastático de rato 4T1) e as células de controle (mama epitelial humano não- tumorigênico MCF10A e mama epitelial de rato não-tumorigênico NMuMG) foram isolados usando métodos de ultracentrifugação estabelecidos (FIG. 10A) (Luga et al., 2012; Thery et al., 2006). Os exossomos colhidos foram analisados por microscopia de elétron de transmissão (TEM) e por microscopia de força atômica (AFM). As partículas entre 40-140 nm em tamanho foram identificadas (FIGs. 1A-B) (Thery et al., 2002). Adicionalmente, a identidade dos exossomos foi confirmada detectando TSG101 e CD9, dois marcadores dos exossomos (FIG. 1C) (Ostrowski et al., 2010). Os estabelecidos isolados eram também positivos para o marcador CD9 quando analisados por microscopia de elétron de imunogold-coloração (FIG. 1A). Exossomos acoplados aos grânulos de latex foram analisado também por citometria de fluxo, mostrando a expressão de superfície dos tetraspaninas CD9, CD63, TSG101 e flotillin1, que são marcadores dos exossomos tipicamente usados (FIG. 1D). Adicionalmente, a espectroscopia da difusão de luz (LSS) (Fang et al., 2007; Itzkan et al., 2007; Bang and Setabutr, 2010; Benitez-vieyra et al., 2009; Khairkar et al., 2010; Min et al., 2010) foi usada para mostrar que as amostras isoladas revelam uma distribuição de tamanho apertado com pico em 104 nm no diâmetro (FIG. 1E, painel direito). O sistema de LSS permitiu a deteção exata de todos os tamanhos das partículas em extratos dos exossomos usando as microesferas de vidro de diâmetros diferentes como controles internos. LSS também excluiu microvesículas potenciais e contaminação por restos bacterianos ou celulares nestes isolados (FIG. 1E, vide a inserção no gráfico direito). Além disso, e de acordo com dados de LSS, a análise de monitoramento de nanopartícula de NanoSight revelou partículas com uma distribuição de tamanho com pico em 105 no ± 1,0 nm no diâmetro (FIG. 1F) ainda excluindo a existência de contaminadores potenciais das escalas diferentes de tamanho que existem na solução quando não é filtrada (FIG. 1F, gráfico direito). O ensaio de viabilidade de célula colorimétrico (MTT), ensaio de inserção de uma uracila marcada no desoxinucleotídeo terminal pela enzima transferase (TUNEL), análise de citometria do fluxo para Anexin V e iodeto de propídio, e imunoblots de citocromo C dos exossomos (FIGs. 10C-E) foram usados para demonstrar a viabilidade das células antes da extração dos exossomos a fim de excluir a possibilidade de contaminação dos isolados com corpos apoptóticos ou restos aleatórios da célula. Exossomos isolados das células cancerosas são denominados coletivamente de oncossomos, conforme definido previamente (Lee et al., 2011). Exossomos isolados das células de controle são denominados coletivamente de normossomos.
[00114] Oncossomos são enriquecidos especificamente em miRNAs oncogênicos quando comparados a normossomos. O índice global de miRNA dos oncossomos e os normossomos foram investigados. A análise de microfluídica do RNA isolado dos exossomos revelou um aumento no índice pequeno do RNA dos oncossomos quando comparado aos normossomos (FIG. 2F). Além disso, uma correlação baixa entre os níveis dos miRNAs nos normossomos (derivado de MCF10A) e os oncossomos (derivado de MDA-MB-231) foi observada, com um valor de R2 de 0,35 (FIG. 2A). A análise global da disposição do miRNA mostrou um enriquecimento do índice dos miRNAs nos oncossomos quando comparado com os normossomos. Esta análise revelou também um perfil muito distinto da expressão do miRNA nos oncossomos quando comparado aos normossomos. Os dados da disposição do miRNA mostraram 305 miRNAs diferencialmente expressados entre oncossomos e normossomos (Tabela 5), com um enriquecimento total do índice do miRNA nos oncossomos quando comparados com os normossomos. O enriquecimento dos miRNAs nos oncossomos não era uma mera reflexão de um aumento nos miRNAs nas células cancerosas porque as células cancerosas mostraram uma diminuição na quantidade total de RNAs pequenos totais quando comparadas às células não-tumorigênicas (FIG. 11A). Conseqüentemente, a acumulação dos miRNAs nos exossomos pareceu ser específica e direcionada.
[00115] A expressão de 15 miRNAs nas células cancerosas e nos exossomos derivados destas células que foram encontradas para ser expressadas diferencialmente na disposição do miRNA entre oncossomos e os normossomos foram avaliados adicionalmente (Tabelas 4 e 5). Seis miRNAs desta coleção foram implicados na progressão do câncer (miRNAs oncogênicos: miR-10a, miR-10b, miR-21, miR-27a, miR-155 e miR-373) e nove miRNAs foram relatados para possuir funções suppressivas de tumor (miRNAs do supressor do tumor: let7a, miR15b, miR26a, miR31, miR125a, miR125b, miR200a, miR200c, miR335) e são expressados nas células e nos exossomos derivados daquelas células (FIGs. 11B-C e Tabela 4). Para determinar a meia vida dos miRNAs nos exossomos, um sistema livre de células foi desenvolvido para estudá-los em exossomos isolados. Os exossomos purificados, livres das células, foram colocados em meios de cultura e incubados por 24h ou 72h a 37°C. Após o período de incubação, os exossomos foram analisados para seu índice do miRNA e comparados às células das quais originaram. Havia uma diminuição nos valores da correlação destes miRNAs nos oncossomos comparados às células em 72h quando comparado a 24h (R2 = 0,60 a R2 = 0,43), quando uma correlação elevada foi mantida entre normossomos e células MCF10A (as células usadas para derivar os normossomos; R2 = 0,98 a R2 = 0,98) (FIG. 2B). Um regulamento superior impressionante dos seis miRNAs oncogênicos analisados foi observado exclusivamente nos oncossomos cultivados por 72h quando comparado aos oncossomos cultivados por 24h, com um médio de mudança de dobra de 17,6 e de 13,2 para MDA-MB231 e os oncossomos derivados de 4T1, respectivamente, ainda suportando um aumento específico no índice do miRNA nos oncossomos em tempo (FIG. 2C gráficos de meio e de baixo e FIG. 11D, e gráficos da direita, de cima e de baixo). As diferenças insignificantas são anotadas para miRNAs suppressivos do tumor quando os oncossomos foram cultivados por 24h ou 72h (FIG. 2C e FIG. 11D). Normossomos não revelaram nenhuma diferença em seu índice do miRNA irrespectivo do tempo da cultura (FIG. 2C e FIG. 11D). A presença de todos os 15 miRNAs era idêntica em normossomos e em células cultivados por 72h foram derivados a partir de, com um coeficiente de correlação de 0,93 (FIG. 2E, esquerda). Os coeficientes de correlação dos exossomos MDA-MB231 e 4T1 eram significativamente mais baixos (r2 = 0,56 e 0,42, respectivamente), ainda suportando uma alteração específica em níveis do miRNA dos oncossomos em tempo (FIG. 2E, meio e direita). Adicionalmente, os níveis da correlação diminuem com malignidade crescente das linhas das células quando os oncossomos são comparados a partir de MCF7 (r2 = 0,76), MDA-MB231 (r2 = 0,56), 67NR (r2 = 0,64) e 4T1 (r2 = 0,42) (FIG. 2E e FIG. 11E). Conseqüentemente, o índice do miRNA dos normossomos era uma reflexão de sua célula de origem em todas as vezes, quando os oncossomos alteraram seu índice dos miRNAs em tempo em uma maneira de célula independente.
[00116] Quando o índice do miRNA dos oncossomos MDA-MB231 e 4T1 foi comparado cm aquele dos normossomos das células de MCF10A e de NMuMG, um enriquecimento foi observado de miRNAs oncogênicos nos oncossomos cultivados por 24h com uma mudança média da dobra de 2,7 e de 2,0 respectivamente (FIG. 11B). No ponto do tempo de 72h, um médio de mudança de dobra de 30 e 18,2 foi detectado em miRNAs oncogênicos em MDA-MB231 e em oncossomos derivados de 4T1, respectivamente, quando comparado a MCF10A e NMuMG derivado de normossomos (FIG. 11B). Os blots do norte confirmaram o regulamento superior de miR-10b e de miR-21 oncogênico exclusivamente nos oncossomos, suportando ambos a disposição do miRNA assim como a análise de qPCR (FIG. 2D).
[00117] Oncossomos contêm pré-miRNAs e as proteínas do núcleo RLC. A cultura livre de células de oncossomos recentemente isolados resultou em um aumento no índice do miRNA, sugerindo o biogenesis ativo nos exossomos. Adicionalmente, a análise da microfluídica sugeriu também a presença de moléculas maiores do RNA (FIG. 2F). Conseqüentemente, a presença potencial dos pré-miRNAs em preparações de normossomo e oncossomo foi explorada. A cultura livre de células dos exossomos por 24h ou 72h após sua isolação foi executada e sujeitada ao tratamento do RNAse para a depleção de todo o RNA extra-exossomal possível. Isto foi seguido pela deteção dos pré-miRNAs nos exossomos. Os pré-miRNAs analisados eram esses que corresponderam aos 15 miRNAs maduros avaliados previamente (Tabela 4). Tabela 4 Os 15 miRNAs expressados diferencialmente entre oncossomos e normossomos.
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[00118] Todos os 15 pré-miRNAs analisados estavam presentes nos exossomos (normossomos e oncossomos) (FIG. 3A e FIG. 12A). Como observado com miRNAs, os oncossomos foram enriquecidos altamente em pré-miRNAs oncogênicos, enquanto os pré-miRNAs suppressivos de tumor eram mal representados (FIG. 3A e FIG. 12A). Quando os exossomos foram cultivados por 24h ou 72h, um regulamento inferior significativo de pré-miRNAs oncogênicos foi observado nos oncossomos cultivados por 72h quando comparado aos oncossomos cultivados por 24h. Tal variação não foi encontrada nos normossomos (FIG. 3B e FIG. 12B). Os pré-miRNAs suppressivos de tumor não mostraram nenhuma diferença nos oncossomos nem nos normossomos (FIG. 3B e FIG. 12B). Além disso, as quantidades decrescentes de pré-miRNAs oncogênicos nos oncossomos, mas não nos normossomos, foi anotado após 96h da cultura, em que ponto os níveis oncogênicos do pré-miRNA alcançaram os níveis de pré-miRNAs suppressivos de tumor (FIG. 3E e FIG. 12E). O regulamento inferior de pré- miRNAs oncogênicos nos oncossomos foi confirmado por Northern blotting para pré-miR10b e pré-miR21 (FIG. 3C). Em seguida, uma análise do curso de tempo dos pré-miRNAs e os miRNAs nos exossomos foram executados. Cultivando oncossomos isolados por 6h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h e 96h, observou-se que os níveis dos 6 pré-miRNAs analisados eram inversamente proporcionais a seus miRNAs respectivos com tempo aumentado da cultura (FIG. 3D). Os miRNAs maduros aumentaram em uma quantidade entre 24 e 72h da cultura, depois do qual alcançaram um platô (FIG. 3D). Conseqüentemente, os oncossomos esgotam seu índice dos pré-miRNAs com um aumento concomitante em seus miRNAs maduros respectivos com tempo. Esta observação levou à hipótese que os oncossomos têm a habilidade de biogênese do miRNA.
[00119] Para compreender por que o processamento dos pré- miRNAs em exossomos cultivados começa após 24h e não imediatamente, todos os seis miRNAs nas células MDA-MB-231 silenciadas para exportin-5 (XPO5) foram monitorados (FIGs. 12C e D). XPO5 é responsável para o transporte dos pré-miRNAs do núcleo ao citoplasma (Yi et al., 2003). Silenciar XPO5 impede o fluxo dos pré-miRNAs do núcleo ao citoplasma e permite uma avaliação do processamento de pré-miRNA citoplásmico sem a introdução do pré-miRNA citoplásmico novo do núcleo. MicroRNA-21 foi monitorado nas células MDA-MB-231siXPO5 antes e depois de centrifugação (FIGs. 12C e D), que ocorreu a 4°C por 3 horas para imitar as condições da isolação dos exossomos. Um regulamento superior significativo do miR-21 não foi observado aos mesmos pontos de tempo entre células centrifugadas e não centrifugadas, onde as células precedentes sofrem um período da retardação de 24h (FIGs. 12C e D). Conseqüentemente, as células e os exossomos requerem um período de tempo de recuperar do estresse da centrifugação a 4°C para iniciar a processar os pré-miRNAs. Espera-se tal aclimatização para atividades enzimáticas em células cultivadas após a passagem da cultura do tecido.
[00120] Oncossomos contêm as proteínas do núcleo RISC (RLC). Os oncossomos esgotam sua concentração dos pré-miRNAs com um aumento concomitante em seus miRNAs maduros respectivos com tempo. Isto levou-nos examinar o biogenesis do miRNA e potencialidades de processamento do pre-miRNA nos exossomos. O biogenesis de MicroRNA requer os componentes de proteína chaves de RLC, Dicer, TRBP e AGO2 (Chendrimada et al., 2005). Tem-se mostrado previamente que Dicer e TRBP formam um complexo que fornece a estabilidade à proteína de Dicer, quando AGO2 é recrutado mais tarde no caminho do biogenesis para ajudar com a seleção de filamento e o processo de desenrolar o RNA (Chendrimada et al., 2005). A proteína de Dicer foi detectada nos oncossomos derivados das células cancerosas MCF7, MDA-MB231, 67NR e 4T1 (FIG. 1C e FIGs. 4A-B). A possibilidade de detectar a proteína de Dicer extra-exossomal contaminante foir removida tratando todas as preparações dos exossomos com o proteinase K antes de extração da proteína exossomal como descrito previamente (Montecalvo et al., 2012) (FIG. 1C e FIGs. 4A-B). Além disso, as várias linhas de célula cancerosa tais como A549 (câncer de pulmão humano), SW480 (câncer colorretal humano), HeLa (câncer cervical humano) e 4T07 (câncer de mama de rato) produzem também exossomos que contêm Dicer (FIG. 13H). A proteína de Dicer não foi detectada nos normossomos produzidos por MCF10A (células epiteliais de mama não tumorigênico humano) e as linhas de células NMuMG (células epiteliais de mama não tumorigênico de rato) (FIG. 1C e FIG. 4A). A imunogold coloração dos exossomos que usam microscopia de elétron de transmissão corroborou a presença da proteína de Dicer nos oncossomos mas não nos normossomos (FIG. 4B e FIG. 13A). Adicionalmente, o anticorpo do anti-GFP foi usado como outro controle negativo em experiências de imunogold coloração, e nada foi detectado nos exossomos (FIG. 13B).
[00121] A proteína de Dicer era superexpressada mais mais com um marcador da bandeira do terminal N nas células MCF10A e MDA-MB231 (FIG. 13C). Immunoblotting e microscopia confocal adicionalmente confirmaram a presença da proteína da Bandeira-Dicer especificamente nos oncossomos e não nos normossomos (FIG. 4C). Os níveis de Ca2+ intracellular aumentando estimula a secreção dos exossomos (Savina et al., 2003). O ionóforo A23187 do CA2+ foi adicionado aos meios de cultura de MCF10A e as células MDA-MB231 e os exossomos foram coletados. Nós observamos um aumento significativo na produção dos exossomos como julgado pela expressão CD9 (FIG. 4D). A proteína de Dicer foi detectada nos oncossomos mas não foi nos normossomos (FIG. 4D). Estes resultados adicionalmente sugeriram que isto não é a quantidade dos exossomos que determinam o índice mas sim um mecanismo específico que leva à acumulação de Dicer. Além disso, a expressão de Dicer foi diminuída através de uma expressão estável de duas construções de curto-hairpin nas células MCF10A e MDA-MB-231 (FIGs. 13D-E). Os oncossomos derivados das células de MDA-MB-231shDicer continham significativamente menos Dicer em comparação com as células MDA-MB- 231 de origem ou shScramble detectadas por immunoblotting e immunogold coloração (FIGs. 4E-F). Dicer não foi detectado também nos normossomos derivados das cjélulas de MCF10AshDicer (FIG. 4E).
[00122] Adicionalmente, as proteínas de RLC, AGO2 e TRBP, foram detectadas também nos oncossomos mas não nos normossomos (FIGs. 4G-H). Exossomos foram extraídos de MCF10A e as células MDA-MB231 transfectadas com um AGO2 marcado de GFP (FIG. 4I). Usando um anticorpo do anti-GFP, a presença de GFP-AGO2 foi detectada nos exossomos extraídos das células MDA-MB231-GFP-AGO2 (FIG. 4J). Ao silenciar de siRNA do AGO2 nas células MCF10A e MDA-MB231, um regulamento inferior da proteína AGO2 em oncossomos derivados de MDA- MB231 foi observado (FIGs. 4K-L). Nós mostramos por imunoprecipitação que AGO2 liga Dicer nos oncossomos quando ambos não forem detectáveis nos normossomos (FIG. 4M). Um sócio fundamental que induza a estabilidade de Dicer e ajuda com sua atividade de clivagem do pré- miRNA é TRBP (Chendrimada et al., 2005; Melo et al., 2009). Immunoprecipitação revelou a presença do complexo de Dicer/TRBP nos oncossomos mas não nos normossomos (FIG. 4N).
[00123] Immunoprecipitação que usa o anticorpo do anti-Dicer revelou que AGO2 liga a Dicer nos oncossomos, quando ambos forem indetectáveis nos normossomos (FIG. 13F). Um sócio fundamental que induza a estabilidade de Dicer e ajuda com sua atividade de clivagem do pré-miRNA é TRBP (Chendrimada et al., 2005; Melo et al., 2009). Immunoprecipitação com anticorpo de anti-Dicer revelou a presença do complexo de Dicer/TRBP nos oncossomos mas não nos normossomos (FIG. 13G).
[00124] Oncossomos usam RLC para processar pré-miRNAs para gerar miRNAs maduros. A funcionalidade de proteínas de RLC (as propriedades cortando e silenciando) nos oncossomos foi testada para gerar o miRNA maduro do pré-miRNA. Exossomos que faltam Dicer foram extraídos das células MCF10AshDicer, MDA-MB231shDicer e 4T1shDicer (FIG. 14A). O contéudo de pré-miRNAs e miRNAs não revelaram nenhuma mudança significativa nos exossomos regulados inferiores de Dicer com o tempo, indicando que os pré-miRNAs não foram processados para gerar o miRNA na ausência de Dicer nos oncossomos (FIGs. 5A-B e FIGs. 14B-C). Em seguida, o anti-Dicer e os anticorpos do anti-TRBP foram introduzidos em exossomos por eletroporação e comparados aos oncossomos e aos normossomos eletroporados com um anticorpo de controle do anti-actin tratado com o proteinase K após eletroporação para evitar a presença dos anticorpos fora dos exossomos (FIG. 5C). Oncossomos eletroporados com o anticorpo do anti-actin de controle mostrou as mesmas variações em níveis do pré-miRNA e do mirNA como mencionados previamente (FIGs. 5D-E e FIGs. 14D-E). Nos oncossomos com os anticorpos do anti-Dicer e do anti-TRBP, as mudanças insignificantas nos níveis do pré-miRNA e o miRNA foram observados com o tempo, sugerindo uma inibição de processar o pré-miRNA (FIGs. 5D-E e FIGs. 14D-E). O índice total do miRNA foi avaliado por disposições da expressão do miRNA dos oncossomos (derivado de MDA-MB-231), oncossomos de anticorpo do antiDicer eletroporado (MDA-MB231 derivado) e os normossomos (derivado de MCF10A) após 72h da cultura livre de células. O índice total do miRNA dos oncossomos com anticorpo do anti-Dicer assemelhou-se mais pròxima àquele dos normossomos de MCF10A (R2 = 0,79) do que os oncossomos derivados de MDA-MB231 (R2 = 0,48). Ao comparar oncossomos com os oncossomos que contêm o anticorpo do anti-Dicer, 198 miRNAs diferencialmente expressados foram observados, 48% de que foram regulados inferiores significativamente (Tabela 6). Destes, 19% são oncogênicos quando somente 1% foi relatado para possuir as propriedades suppressivas de tumor baseadas na literatura previamente publicada (FIG. 14F, Tabela 6).
[00125] Sabe-se que a reação enzimática que transforma um pré- miRNA em um miRNA maduro é espontânea e não requer nenhum fator além das três proteínas de RLC, pré-miRNA incorporado, e Hsp90, uma proteína presente nos exossomos (Maniataki e Mourelatos, 2005; McCready et al., 2010). Para confirmar adicionalmente isto, os oncossomos foram eletroporados com Geldanamicina, uma droga que inibe seletivamente a atividade Hsp90 (Miyata, 2005). Uma diminuição significativa na quantidade de miRNAs maduros sintetizados na presença de Geldanamicina foi encontrada quando comparada aos controles (FIG. 6A). O efeito das proteínas Hsp90 na expressão do miRNA maduro podia ser mediado através de dois processos potenciais sobrepostos: um papel ativo em ajudar à atividade AGO2 no biogenesis do miRNA e a estabilização de miRNAs maduros ligados às proteínas AGO2 no RISC.
[00126] Para confirmar adicionalmente a potencialidade de processamento do pré-miRNA específico dos oncossomos, pré-miRNAs sintéticos -10b e -21 bem como pré-miRNA do precursor pré-cel-1 de C.elegans foram eletroporados em exossomos para estudar seu processamento (FIG. 15A). O regulamento inferior significativo dos pré- miRNAs e o regulamento superior de seus miRNAs respectivos foi observado nos oncossomos após a cultura de 72h (FIGs. 6B-C). Oncossomos com anticorpo de Dicer não revelaram uma diferença no índice do pré-miRNA após a cultura de 72h (FIGs. 6B-C). Oncossomos derivados de células shDicer não revelaram uma diferença no índice do pré-miRNA após a cultura de 72h (FIGs. 6B-C). Adicionalmente, pre-miR- 10b, -21 e - cel-1 foram internamente marcados com biotin-deoxitimidina (dT) e transfectaram-nos em células de MCF10A. Os pré-miRNAs modificados por dT foram processados e resultaram na geração de miRNAs maduros, confirmada a marcação não alterou seu potencial de processamento (FIGs. 15B-C). Os pré-miRNAs modificados foram usados em ensaios de 'dicing' para mostrar que o Dicer que contem exossomos era especificamente capaz de processar o pre-miRNA e gerar os miRNAs maduros (FIGs. 6D-F).
[00127] CD43 citoplásmico em células cancerosas contribui à mobilização de Dicer. Os corpos multivesiculares (MVBs) são organelas celulares que contêm os endossomos que são liberados eventualmente como exossomos por fusão com a membrana de plasma (Pant et al., 2012). Um mecanismo possível que permite o recrutamento de proteínas do RISC em endossomos e sua liberação subseqüente em exossomos foi explorado. Primeiramente, se Dicer assocía com MVBs em células cancerosas quando comparado às células do controle foi explorado. A distribuição celular de Dicer conjuntamente com marcadores de MVBs e o caminho do biogenesis dos exossomos foi comparado. Hrs e BiG2 são marcadores de endossomo cedo e TSG101 é um marcador para MVBs (Razi e Futter, 2006; Shin et al., 2004). Dicer co-localizado com Hrs, BiG2 e TSG101 nas células MDA- MB231 e 4T1 (FIG. 16A). Fosfotidiletanolamina marcada de N-rodamina administrada exogenosamente (NRhPE) é adsorvida por células e retida dentro de MVBs (Sherer et al., 2003). Coloração de Dicer nas células MDA- MB231 e 4T1 co-localizadas na maior parte com o NRhPE em MVBs, que geram eventualmente exossomos. Estes dados estão de acordo com observações precedentes em estudos de co-frationação eram Dicer, TRBP e AGO2 apareceram em frações atrasadas de endossomos/MVB (Shen et al., 2013). No contraste, não havia nenhuma co-localização de Dicer com Hrs, BiG2, TSG101 ou NRhPE em células do controle (NMuMG e MCF10A) (FIG. 16A). Adicionalmente, os genes Hrs e TSG101 foram silenciados usando dois siRNAs diferentes, bem como BiG2 usando dois shRNAS diferentes, em células de MDA-MB231 e de MCF10A, e a expressão da proteína de Dicer foi avaliada (FIG. 16B). Silenciar de Hrs, BiG2 e TSG101 danifica a formação de MVBs e levou ao regulamento inferior da produção dos exossomos (FIGs. 16C-E). A proteína aumentada de Dicer foi observada no citoplasma e no núcleo das células MDA-MB231 com siHrs, shBiG2 ou siTSG101. Os resultados similares foram obtidos quando as células 4T1 foram usadas em vez das células MDA-MB231. Quando os genes Hrs, BiG2 ou TSG101 foram silenciados em células de MCF10A, a expressão da proteína de Dicer e a posição alteradas (citoplasma) não foram observadas. Interessante, a expressão do mRNA de Dicer foi diminuída nas células siHrs, shBiG2 e siTSG101 MDA-MB231 e 4T1 (FIG. 16F). Isto podia representar um laço de gabarito negativo entre a quantidade de proteína de Dicer na célula e seus níveis de transcrição. Estes resultados sugerem que a exportação de exossomos mediados da proteína de Dicer é potencialmente uma etapa limitando a taxa para a depleção de Dicer em células cancerosas. A formação danificada de MVB levou à acumulação da proteína de Dicer durante todo o citoplasma e o núcleo, sem aumentar níveis da transcrição de Dicer.
[00128] MVBs também proteínas ubiquitiniladas sequestradoras para a degradação subseqüente por lissossomos (Luzio et al., 2009). Nós mostramos que a proteína de Dicer não é ubiquitinada e não co-localiza com LAMP-1, um marcador extensamente usado para lissossomos. Estes resultados sugerem que Dicer não está direcionado para a degradação em células cancerosas mas sim secretado através dos exossomos (FIG. 16G).
[00129] Os sinais que as proteínas alvos a MVBs e exossomos são pela maior parte desconhecidos. Recentemente, uma variedade de proteínas da escora da membrana do plasma, tais como CD43, especulado como mediadores prováveis do transporte da proteína em MVBs e em exossomos (Shen et al., 2011b). CD43 é predominantemente um sialoglicoproteína de transmembrana de leucócito, que seja expressado altamente em células cancerosas (em sua forma citoplásmica truncada) e não em células de controle (Shelley et al., 2012). CD43 é detectado em muitos tumors sólidos inclusive o câncer de mama, onde correlaciona com a progressão do câncer e metástase (Shelley et al., 2012). Nós exploramos se CD43 pôde contribuir ao transporte de proteínas do RISC a MVBs. Nós mostramos que imunoprecipitados de Dicer com a proteína CD43 nas células MDA-MB231 (FIG. 9A). Quando CD43 é de regulamento inferior usando siRNA nas células MCF10A e MDA-MB231, os níveis de Dicer diminuem significativamente nos oncossomos (FIG. 9B e 16H), com uma acumulação nuclear e citoplásmica da proteína de Dicer. Um regulamento inferior da expressão do mRNA de Dicer foi observado em células cancerosas MDA-MB231siCD43 mas não nas células MCF10AsiCD43 não- tumorigênicas, como observado também antes com siHrs, shBiG2 e siTSG101 (FIG. 16I).
[00130] Oncossomos alteram transcriptoma de células alvos em uma maneira dependente de Dicer. As células cancerosas (células MDA-MB231) eram transfectadas com CD63-GFP, um marcador para exossomos (Escola et al., 1998). As células CD63-GFP MDA-MB231 foram usadas para isolar os exossomos de GFP+, que foram incubadas subseqüentemente com células MCF10A. Exossomos de MDA-MB231-CD63-GFP se mostraram para ser verde usando NanoSight complementado com um feixe de laser que detecta partículas se emitindo o fluorescence verde (FIG. 17A.) Os oncossomos de CD63-GFP+ foram mostrados para incorporar as células MCF10A, onde apareceram no citoplasma. Usando disposições da expressão do miRNA, mostrou-se que as células de MCF10A expuseram aos oncossomos derivados de MDA-MB231 adquirem um perfil novo da expressão do miRNA distinto das células de origam de MCF10A e se assemelham às células MDA-MB231. Usando disposições da expressão do miRNA, mostrou-se que as células de MCF10A expostas aos oncossomos derivados de MDA-MB-231 adquirem um perfil novo da expressão do miRNA distinto das células de origam de MCF10A. Perfilagem global do transcriptoma de MCF10A tratado com os oncossomos assemelha-se mais pròxima às células MDA-MB231. Tais alterações significativas no perfil da expressão do mRNA são invertidas quando as células de MCF10A são expostas aos oncossomos MDA-MB231 com anticorpo de Dicer, e os reconjuntos do teste padrão da expressão com as células de origem de MC10A.
[00131] Uma análise profunda dos perfis da expressão do miRNA e do mRNA de células de MCF10A expôs aos oncossomos MDA-MB231 comparados às células de origem de MCF10A revelou o regulamento superior significativo de determinados miRNAs e um regulamento inferior de seus alvos descritos do mRNA em células tratadas de MCF10A. Como um exemplo, miRNA-21 e -10b foram regulados superiores (4,6 e 2,3 se dobram respectivamente) em células tratadas de MCF10A, entre com outros miRNAs oncogênicos. MicroRNA-21 e -10b foram implicados na progressão do câncer de mama, no invasivo e metástase (Maet al., 2007; Yan et al., 2011). Como mostrado antes, miR-21 e -10b sintetizados nos oncossomos de seus pré-miRNAs. PTEN e HOXD10 são descritos como alvos de miR-21 e de miR-10b e foram suprimidos na análise da disposição da expressão das células de MCF10A tratadas com os oncossomos quando comparados às células do controle MCF10A. A análise Western blot mostrou que os níveis de PTEN e HOXD10 estiveram suprimidos nas células de MCF10A expostas aos oncossomos (FIGs. 7A-B). Para examinar se miR-21 e miR-10b nos oncossomos podem silenciar PTEN e HOXD10 em células recipientes de MCF10A, as células de MCF10A eram transfectadas transientemente com os repórteres de luciferase que contêm o 3'UTR tipo selvagem de genes PTEN ou HOXD10 que são capazes de ligar miR-21 e miR-10b. O 3'UTR mutante dos vetores PTEN ou HOXD10 foi usado como controles. Uma diminuição na atividade do repórter de luciferase foi vista nas células de MCF10A incubadas com os oncossomos, confirmando a administração funcional dos miRNAs dos oncossomos às células recipientes (FIG. 7C). Nos oncossomos as células de MCF10A, os níveis incubados da expressão PTEN e HOXD10 foram avaliados em pontos diferentes do tempo. Uma diminuição significativa foi detectada em PTEN e a expressão HOXD10 imediatamente depois de tratar as células com 72h de exossomos cultivados (FIGs. 7A-B). Níveis da expressão PTEN e HOXD10 mudaram minimamente nas células de MCF10A tratadas com os exossomos recentemente isolados, sugerindo que a concentração suficiente dos miRNAs maduros não pode ter estado presente neste ponto do tempo (FIGs. 17B-C). As células de MCF10A tratadas com os oncossomos cultivados por 72h com anticorpo do anti-Dicer revelaram um regulamento inferior insignificante de PTEN e de HOXD10 (FIG. 7D e FIG. 17G). Adicionalmente, processamento de miR-15 nas células, um miRNA não detectado em oncossomos derivados de MDA-MB231, não era alterado devido ao tratamento de células de MCF10A com os exossomos MDA-MB- 231 que contêm o anticorpo de Dicer, mostrando um efeito insignificante do anticorpo de Dicer em células tratadas (FIG. 17D). Alguns relatórios mostram o regulamento inferior de alvos do miRNA nas células incubadas com exossomos sem uma necessidade de períodos longos da cultura (Kosaka et al., 2013; Narayanan et al.., 2013; Pegtel et al., 2010). MiR-182- 5p é um dos miRNAs regulados superiores em células de MCF10A em cima do tratamento dos oncossomos e Smad4, um alvo de miR-182-5p (Hirata et al.., 2012), é um dos genes regulados inferiores em cima do tratamento dos oncossomos destas células (FIG. 7E). O regulamento superior de miR-182- 5p nos oncossomos durante o período da cultura não foi observado e pré- miR182-5p não foi detectado nos oncossomos (FIG. 17E). Conseqüentemente, os oncossomos embalam também miRNAs maduros sem a necessidade de processar pré-miRs. Se tais miRs maduros estiverem em quantidades estoiquiométricos relevantes, podem regular a expressão do gene de células recipientes, como mostrado previamente (Ismail et al., 2013; Kogure et al., 2011; Kosaka et al.,2013; Narayanan et al., 2013; Pegtel et al., 2010; Valadi et al., 2007; Zhang et al., 2010).. Entretanto, se alguns miRNAs maduros não estiverem presentes nos exossomos mas seus pre-miRNAs estiverem, estes podem ter um efeito biológico em seus alvos já que serão processados em RLC maduros associados a miRNAs.
[00132] A viabilidade da célula e proliferação de células de MCF10A tratadas com os oncossomos cultivados por 72h foram aumentados, que não foi observado quando os oncossomos recentemente isolados foram usados (FIG. 7F). Uma diferença não foi observada quando as células de MCF10A foram tratadas com os oncossomos derivados de MDA-MB231 que contêm anticorpos do anti-Dicer (FIG. 7F). O mesmo padrão continua verdadeiro para a capacidade da formação da colônia das células de MCF10A tratadas com os oncossomos (FIGs. 7G e 17F). Células de MCF10A tratadas com oncossomos cultivados por 72h formam colônias quando comparado às células não tratadas (FIG. 7G). Tal formação da colônia não foi observada quando os oncossomos recentemente isolados ou os oncossomos do AB Dicer foram usados (FIG. 7G).
[00133] Oncossomos induzem a formação de tumor de células epiteliais não-tumorigênicas e ativam os fibroblastos. Os estudos recentes sugerem que os exossomos se derivaram das células estromais mesenquimais de medula óssea apoia o crescimento múltiplo da célula do mieloma (Roccaro et al., 2013). Para aproximar ao 'potencial oncogênico' funcional de células de MCF10A e de MCF10A com exposição prévia aos oncossomos (células-oncossomos de MCF10A), estas células foram injetadas ortotopicalmente na almofada de gordura mamária de ratos fêmeas de nu/nu, similares ao protocolo descrito recentemente (Luga et al., 2012). As células de MCF10A não formaram tumores nestes ratos como relatado também antes (Mavel et al., 2002; Thery et al., 2002) (FIG. 7H). As células-oncossomos de MCF10A formaram tumores após 21 dias, bem como as células do controle MDA-MB231 (FIG. 7H). As células de MCF10A incubadas com os oncossomos que contêm o anticorpo do anti-Dicer (mas não os anticorpos do anti-actin do controle) mostraram uma redução significativa no volume do tumor (FIG. 7H). Estes resultados suportam a conversão oncogênica de células de MCF10A quando expostas aos oncossomos que contêm a proteína de Dicer (FIGs. 7F-H e FIG. 17F).
[00134] Os exossomos de soro dos pacientes de câncer contêm Dicer e processam premiRNAs para gerar os miRNAs maduros. Exossomos de tumores humanos foram examinados para proteínas de RISC. Para conseguir a especificidade da célula cancerosa, partes de tumor endometrial e de mama, ovário preliminar humano recentemente isolado, foram enxertados ortotopicalmente em órgãos apropriados dos ratos fêmeas atímicos de nu/nu (FIGs. 18A-B). Os exossomos de soro destes ratos foram avaliados pelo microscópio de elétron (FIG. 18C). Blot da proteína da exclusão do tamanho do índice isolado destes exossomos demonstrou a existência da proteína de Dicer exclusivamente da origem humana (hsa-Dicer) (FIG. 8A e FIG. 18D). Os extratos da proteína dos exossomos derivados de 4T1 e das células 4T1 foram usados como controles para mostrar Dicer da origem do rato, que exibe um peso molecular diferente (mmu-Dicer) (FIG. 8A).
[00135] Oncossomos das células MDA-MB231 foram incubados com os fibroblastos dermais humanos (HDF). Perfilagem global da expressão do gene de fibroblastos incubados de oncossomos revela um impacto significativo em seu transcriptoma, quando comparado às células do controle. O regulamento inferior de αSMA (ACTA) (18 dobras), COL1A1 (12 dobras), TGFβ1 (15 dobras), CTGF (8 dobras), Ras (6 dobras) e ERK (4 dobras) foi observado. Os fibroblastos incubados com os oncossomos proliferados em uma taxa mais elevada (FIG. 8I). Estes resultados sugerem que os oncossomos podem ativar fibroblastos estromais para se assemelhar a um fenótipo do miofibroblasto e para indicar as características associadas aos fibroblastos associados a carcinoma.
[00136] Em seguida, exossomos foram isolados de 100 μl de amostras frescas de soro de 8 indivíduos saudáveis (H) e de 11 pacientes com carcinoma de mama (BC) (FIG. 8B). As membranas de bicamada lipídica foram distinguidas por microscopia de elétron em exossomos (FIG. 8C). O soro de pacientes de câncer de mama conteve significativamente mais exossomos quando comparado ao soro de doadores saudáveis (FIG. 8D). Quando o número igual dos exossomos foi colocado na cultura por 24 e 72h, os 6 pré-miRNAs foram encontrados para ser regulados inferiores exclusivamente em pacientes de câncer de mama e seus miRNAs maduros respectivos foram regulados superiores após 72h da cultura, sugerindo pré- miRNAs foram processados na forma madura nos exossomos do soro fresco de pacientes de câncer de mama e não nos controles saudáveis (FIGs. 8E-F). Em seguida, os exossomos sozinhos ou combinados com as células de MCF10A, foram injetados ortotopicalmente na almofada de gordura mamária de ratos fêmeas de nu/nu. Cinco de 11 exossomos do soro derivados dos pacientes de câncer de mama combinados com as células de MCF10A formaram tumores quando nenhum dos exossomos fornecedores saudáveis ou de exossomos sozinhos, formaram tumores (FIG. 8G). Interessante, os exossomos que formaram tumores foram mostrados também para ter o mais elevado aumento de mudança de dobra na quantidade de miRNAs maduros após a cultura de 72h (FIGs. 8E-F).
[00137] Exossomos foram isolados adicionalmente de um conjunto novo das amostras do soro obtidas de 5 indivíduos saudáveis (C46, C45, C44, C43, e C41) e de 4 pacientes com carcinoma de mama metastática (Met219, Met354, Met299 e Met356). A expressão de Dicer nos exossomos foi observada somente em amostras metastáticas do carcinoma de mama e não nos exossomos do soro de indivíduos saudáveis (FIG. 8H). Tabela 5. miRNAs diferencialmente expressados entre os oncossomos (derivado de MDA-MB231 e os normossomos (derivado de MCF10A).
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Tabela 6. miRNAs diferencialmente expressados entre os oncossomos (derivado de MDA-MB231) e os oncossomos com anticorpo de Dicer (derivado de MDA-MB-231).
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[00138] Todos os métodos divulgados e reivindicados neste documento podem ser realizados e executados sem experimentação imprópria devido a presente divulgação. Quando as composições e os métodos desta invenção forem descritos nos termos de modalidades preferidas, será aparente àqueles versados na técnica que as variações podem ser aplicadas aos métodos e nas etapas ou na seqüência das etapas do método descrito aqui sem partir do conceito, do espírito e do âmbito da invenção. Mais especificamente, será aparente que determinados agentes que são quimicamente e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos por agentes descritos aqui quando o mesmo ou os resultados similares estiverem alcançados. Todos tais substitutos e modificações similares aparentes àquelas versados na técnica são julgados serem dentro do espírito, do âmbito e do conceito da invenção como definidos pelas reivindicações anexas. REFERÊNCIAS As seguintes referências, na medida em que fornecem procedimentos exemplares ou outros detalhes complementares àqueles estabelecidos neste documento, estão especificamente incorporadas neste documento por referência. Al-Nedawi, K., Meehan, B., Micallef, J., Lhotak, V., May, L., Guha, A., and Rak, J. (2008). Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nature cell biology 10, 619-624. Alvarez-Erviti, L., Seow, Y., Yin, H., Betts, C., Lakhal, S., and Wood, M.J. (2011). Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature biotechnology 29, 341-345. Ambros, V. (2004). The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350-355. Arroyo, J. D., Chevillet, J. R., Kroh, E. M., Ruf, I. K., Pritchard, C. C., Gibson, D. F., Mitchell, P. S., Bennett, C. F., Pogosova-Agadjanyan, E. L., Stirewalt, D. L., et al. (2011). 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Claims (14)

1. Método in vitro de detecção de biomarcador de câncer em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma amostra biológica do sujeito; (b) medir o nível de: (i) Dicer em uma fração do exossomo da amostra; e/ou (ii) atividade de processamento de Dicer de precursor miRNA em uma fração do exossomo da amostra; e (c) identificar o sujeito tendo ou não tendo um biomarcador de câncer com base no nível de Dicer medido ou atividade de processamento de Dicer.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é: (i) essencialmente livre de células; ou (ii) uma amostra de linfa, saliva, urina ou plasma.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, purificar uma fração do exossomo da amostra ou aumentar a produção de uma fração do exossomo da amostra.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer de próstata, câncer de esôfago, câncer traqueal, câncer cerebral, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer uterino, câncer cervical, câncer de testículo, câncer de cólon, câncer retal, ou câncer de pele.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: (i) medir o nível de um ou mais miRNA(s) em uma fração do exossomo da amostra selecionados a partir de mmu-miR-709, hsa-miR-1308, mmu-miR-615-3p, hsa-miR-1260b, mmu-miR-1937a, mmu-mir-321-A, hsa-miR-615-3p, hsa-miR-1979, mmu-miR-1937b, hsa-mir-373, mmu-miR-1937c, hsa-miR-1273d-P, mmu-miR-720, mmu-miR-1274a, hsa-mir-565-A, mmu-miR-1931, hsa-miR-1246, hsa-mir-594-P, hsa-mir-321-A, mmu-miR-2145-1-P, hsa-mir-639-P, hsa-miR-720, hsa-miR-1280, mmu-miR-3473, hsa-miR-1260, hsa-miR-1281, mmu-miR-1224-P, mmu-miR-690, hsa-miR-375-P, hsa-miR-4301, mmu-miR-700, mmu-miR-125b-5p, mmu-miR-1191-P, hsa-miR-1274a, hsa-miR-3197, mmu-miR-1935, hsa-miR-1975-P, hsa-miR-4324, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-1274b, mmu-miR-1957, hsa-miR-933, hsa-mir-675, hsa-miR-595, mmu-miR-2137, hsa-mir-572-P, mmu-miR-1195, hsa-miR-4294-P, mmu-mir-1899-P, mmu-miR-689-P, hsa-miR-199b-3p, hsa-miR-3117-P, mmu-mir-321-P, mmu-miR-1961-P, hsa-mir-10a, mmu-miR-669d-P, mmu-miR-1937b-2-P, hsa-miR-3125-P, mmu-miR-1934-P, hsa-miR-574-3p, hsa-miR-718, mmu-miR-1198, mmu-miR-2182-P, hsa-miR-1273, mmu-miR-2133-P, hsa-miR-92b*, hsa-miR-1290, hsa-miR-448, mmu-miR-689, mmu-miR-449a, mmu-miR-1937b-4-P, hsa-miR-4286, mmu-miR-1947, mmu-miR-342-3p, hsa-miR-1303-P, mmu-miR-2132, hsa-miR-4321-P, hsa-miR-4256-P, hsa-miR-4311, mmu-miR-130a, mmu-miR-1939, hsa-miR-1268-P, mmu-miR-31, mmu-miR-99b, mmu-miR-2141, hsa-miR-1202-P, mmu-miR-466b-3p, mmu-miR-2133, hsa-miR-1268, hsa-miR-466, mmu-miR-494, hsa-miR-1289, hsa-miR-320b, hsa-miR-4254, hsa-mir-7-3-P, hsa-miR-923, hsa-miR-764, mmu-miR-291a -3p, mmu-miR-883b-3p, hsa-mir-594-A, mmu-miR-1948-P, hsa-miR-206, hsa-mir-565-P, mmu-miR-467e*, hsa-miR-1826, mmu-miR-467a*, mmu-miR-1983, hsa-miR-324-5p, mmu-let-7c, mmu-miR-1965, hsa-mir-632-P, hsa-miR-181a*MM2GT/AC, hsa-miR-1265, hsa-miR-323b-5p, hsa-mir-1914, hsa-mir-1910, hsa-miR-21, hsa-miR-431*, hsa-miR-3135-P, mmu-miR-187-P, mmu-miR-126-3p, mmu-miR-669a-P, hsa-miR-367, mmu-mir-320-P, tem-miR-181a*MM1G/C, mmu-miR-484-P, mmu-miR-467c-P, hsa-miR-3154, mmu-miR-466d-3p, hsa-miR-3162-P, mmu-miR-201, mmu-miR-1946a, hsa-miR-937, hsa-miR-3147, hsa-mir-596-P, hsa-miR-3148, hsa-miR-1304, hsa-miR-222MM2GG/AC, mmu-miR-125a-5p, hsa-miR-1272-P, hsa-miR-638, hsa-mir-320, hsa-miR-545*, hsa-mir-1908-P, hsa-let-7d-v2-P, mmu-mir-30d-P, hsa-miR-4297, mmu-miR-182, hsa-miR-3166-P, hsa-miR-494, mmu-miR-669o-P, hsa-miR-566, mmu-miR-1188, mmu-miR-2134-AP, hsa-miR-4259-P, mmu-miR-152, mmu-miR-2134, hsa-miR-3193-AP, hsa-miR-125b, hsa-miR-3124-P, hsa-miR-10b, hsa-miR-455-5 p, mmu-miR-144, hsa-miR-130a, hsa-miR-1285, hsa-miR-516b*, hsa-miR-27a, hsa-miR-138-1*, mmu-miR-471, hsa-miR-4298-P, hsa-miR-301b, hsa-mir-147-P, hsa-miR-362-5p, mmu-mir-471-P, mmu-miR-466a-3p, hsa-miR-561, hsa-miR-486-5p, mmu-miR-2861, hsa-miR-587, mmu-miR-375, hsa-mir-329-2-P, mmu-miR-2861-P, hsa-miR-144*, hsa-miR-1255a-P, hsa-mir-519a-2-P, hsa-miR-34c-5p, mmu-miR-466e-3p, mmu-miR-743b-5p, mmu-mir-350-P, mmu-miR-181d, hsa-miR-376a*, hsa-miR-1308-P, mmu-miR-467g, mmu-miR-1946a-P, hsa-miR-147-P, hsa-miR-923-P, mmu-miR-465c-5p, hsa-miR-891a, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-4292, mmu-miR-677-P, hsa-miR-4257, hsa-miR-4326, hsa-miR-17*MM2GG/AA, hsa-miR-939-P, mmu-miR-2182, hsa-miR-220c-P, hsa-miR-3132-P, hsa-miR-532-5p, mmu-miR-1947-P, mmu-miR-29a, hsa-miR-3162, hsa-miR-375MM1C/G, hsa-miR-768-3p, mmu-miR-182-P, mmu-miR-205-P, hsa-miR-505, hsa-miR-3146-P, mmu-miR-721, mmu-miR-376c, hsa-miR-1179-P, mmu-miR-1970, hsa-miR-3133-P, hsa-miR-200c, hsa-miR-220a, mmu-miR-100, hsa-miR-1255b, hsa-miR-222MM1G/A, hsa-miR-885-3p, hsa-miR-517b, hsa-miR-200a, hsa-miR-3141, mmu-miR-669h-3p, hsa-miR-1301, hsa-miR-877, hsa-mir-941-2, hsa-mir-487b-P, hsa-miR-4302, hsa-miR-99b, hsa-miR-1253, hsa-let-7a*, hsa-miR-34aMM2CT/TC, hsa-miR-3181-P, hsa-miR-3200, hsa-miR-3129-P, hsa-miR-93*, hsa-miR-548q-P, mmu-miR-466g, mmu-miR-155, hsa-miR-2278-P, hsa-miR-3065-5p, hsa-miR-633, hsa-miR-4265, mmu-miR-2135-P, hsa-miR-190, mmu-miR-669f, hsa-miR-1323, hsa-miR-588, mmu-miR-183*, hsa-mir-941-4, hsa-mir-1913, hsa-miR-2116*, hsa-miR-1178, mmu-miR-196a, mmu-miR-574-3p, hsa-miR-346, mmu-miR-1199, mmu-miR-681, hsa-miR-4292-P, hsa-miR-522, hsa-mir-611-P, hsa-miR-3171, hsa-miR-635, hsa-miR-1197-P, hsa-miR-604, mmu-let-7a*, hsa-miR-335, mmu-miR-466c-3p, mmu-miR-466i, hsa-miR-1297, mmu-miR-338-5p, hsa-mir-526a-2-P, hsa-miR-181aMM2GC/AG, hsa-miR-15b*, hsa-miR-924-P, mmu-miR-190-P, hsa-miR-345, mmu-miR-711, hsa-miR-3116-2-P, hsa-miR-99a, mmu-miR-26a, hsa-miR-1248-P, mmu-miR-721-P, mmu-miR-801-P, hsa-miR-1826-P, hsa-miR-1236, hsa-miR-339-5p, mmu-miR-804, mmu-miR-467d*, mmu-miR-1191, hsa-miR-148a, hsa-miR-141, mmu-miR-1937a-P, mmu-miR-696, hsa-miR-302a; ou (ii) medir o nível deAGO2 ou TRBP.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, medir o nível de um precursor miRNA compreendendo medir o nível de um precursor de um do(s) miRNA(s) selecionados a partir de: mmu-miR-709, hsa-miR-1308, mmu-miR-615-3p, hsa-miR-1260b, mmu-miR-1937a, mmu-mir-321-A, hsa-miR-615-3p, hsa-miR-1979, mmu-miR-1937b, hsa-mir-373, mmu-miR-1937c, hsa-miR-1273d-P, mmu-miR-720, mmu-miR-1274a, hsa-mir-565-A, mmu-miR-1931, hsa-miR-1246, hsa-mir-594-P, hsa-mir-321-A, mmu-miR-2145-1-P, hsa-mir-639-P, hsa-miR-720, hsa-miR-1280, mmu-miR-3473, hsa-miR-1260, hsa-miR-1281, mmu-miR-1224-P, mmu-miR-690, hsa-miR-375-P, hsa-miR-4301, mmu-miR-700, mmu-miR-125b-5p, mmu-miR-1191-P, hsa-miR-1274a, hsa-miR-3197, mmu-miR-1935, hsa-miR-1975-P, hsa-miR-4324, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-1274b, mmu-miR-1957, hsa-miR-933, hsa-mir-675, hsa-miR-595, mmu-miR-2137, hsa-mir-572-P, mmu-miR-1195, hsa-miR-4294-P, mmu-mir-1899-P, mmu-miR-689-P, hsa-miR-199b-3p, hsa-miR-3117-P, mmu-mir-321-P, mmu-miR-1961-P, hsa-mir-10a, mmu-miR-669d-P, mmu-miR-1937b-2-P, hsa-miR-3125-P, mmu-miR-1934-P, hsa-miR-574-3p, hsa-miR-718, mmu-miR-1198, mmu-miR-2182-P, hsa-miR-1273, mmu-miR-2133-P, hsa-miR-92b*, hsa-miR-1290, hsa-miR-448, mmu-miR-689, mmu-miR-449a, mmu-miR-1937b-4-P, hsa-miR-4286, mmu-miR-1947, mmu-miR-342-3p, hsa-miR-1303-P, mmu-miR-2132, hsa-miR-4321-P, hsa-miR-4256-P, hsa-miR-4311, mmu-miR-130a, mmu-miR-1939, hsa-miR-1268-P, mmu-miR-31, mmu-miR-99b, mmu-miR-2141, hsa-miR-1202-P, mmu-miR-466b-3p, mmu-miR-2133, hsa-miR-1268, hsa-miR-466, mmu-miR-494, hsa-miR-1289, hsa-miR-320b, hsa-miR-4254, hsa-mir-7-3-P, hsa-miR-923, hsa-miR-764, mmu-miR-291a -3p, mmu-miR-883b-3p, hsa-mir-594-A, mmu-miR-1948-P, hsa-miR-206, hsa-mir-565-P, mmu-miR-467e*, hsa-miR-1826, mmu-miR-467a*, mmu-miR-1983, hsa-miR-324-5p, mmu-let-7c, mmu-miR-1965, hsa-mir-632-P, hsa-miR-181a*MM2GT/AC, hsa-miR-1265, hsa-miR-323b-5p, hsa-mir-1914, hsa-mir-1910, hsa-miR-21, hsa-miR-431*, hsa-miR-3135-P, mmu-miR-187-P, mmu-miR-126-3p, mmu-miR-669a-P, hsa-miR-367, mmu-mir-320-P, tem-miR-181a*MM1G/C, mmu-miR-484-P, mmu-miR-467c-P, hsa-miR-3154, mmu-miR-466d-3p, hsa-miR-3162-P, mmu-miR-201, mmu-miR-1946a, hsa-miR-937, hsa-miR-3147, hsa-mir-596-P, hsa-miR-3148, hsa-miR-1304, hsa-miR-222MM2GG/AC, mmu-miR-125a-5p, hsa-miR-1272-P, hsa-miR-638, hsa-mir-320, hsa-miR-545*, hsa-mir-1908-P, hsa-let-7d-v2-P, mmu-mir-30d-P, hsa-miR-4297, mmu-miR-182, hsa-miR-3166-P, hsa-miR-494, mmu-miR-669o-P, hsa-miR-566, mmu-miR-1188, mmu-miR-2134-AP, hsa-miR-4259-P, mmu-miR-152, mmu-miR-2134, hsa-miR-3193-AP, hsa-miR-125b, hsa-miR-3124-P, hsa-miR-10b, hsa-miR-455-5 p, mmu-miR-144, hsa-miR-130a, hsa-miR-1285, hsa-miR-516b*, hsa-miR-27a, hsa-miR-138-1*, mmu-miR-471, hsa-miR-4298-P, hsa-miR-301b, hsa-mir-147-P, hsa-miR-362-5p, mmu-mir-471-P, mmu-miR-466a-3p, hsa-miR-561, hsa-miR-486-5p, mmu-miR-2861, hsa-miR-587, mmu-miR-375, hsa-mir-329-2-P, mmu-miR-2861-P, hsa-miR-144*, hsa-miR-1255a-P, hsa-mir-519a-2-P, hsa-miR-34c-5p, mmu-miR-466e-3p, mmu-miR-743b-5p, mmu-mir-350-P, mmu-miR-181d, hsa-miR-376a*, hsa-miR-1308-P, mmu-miR-467g, mmu-miR-1946a-P, hsa-miR-147-P, hsa-miR-923-P, mmu-miR-465c-5p, hsa-miR-891a, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-4292, mmu-miR-677-P, hsa-miR-4257, hsa-miR-4326, hsa-miR-17*MM2GG/AA, hsa-miR-939-P, mmu-miR-2182, hsa-miR-220c-P, hsa-miR-3132-P, hsa-miR-532-5p, mmu-miR-1947-P, mmu-miR-29a, hsa-miR-3162, hsa-miR-375MM1C/G, hsa-miR-768-3p, mmu-miR-182-P, mmu-miR-205-P, hsa-miR-505, hsa-miR-3146-P, mmu-miR-721, mmu-miR-376c, hsa-miR-1179-P, mmu-miR-1970, hsa-miR-3133-P, hsa-miR-200c, hsa-miR-220a, mmu-miR-100, hsa-miR-1255b, hsa-miR-222MM1G/A, hsa-miR-885-3p, hsa-miR-517b, hsa-miR-200a, hsa-miR-3141, mmu-miR-669h-3p, hsa-miR-1301, hsa-miR-877, hsa-mir-941-2, hsa-mir-487b-P, hsa-miR-4302, hsa-miR-99b, hsa-miR-1253, hsa-let-7a*, hsa-miR-34aMM2CT/TC, hsa-miR-3181-P, hsa-miR-3200, hsa-miR-3129-P, hsa-miR-93*, hsa-miR-548q-P, mmu-miR-466g, mmu-miR-155, hsa-miR-2278-P, hsa-miR-3065-5p, hsa-miR-633, hsa-miR-4265, mmu-miR-2135-P, hsa-miR-190, mmu-miR-669f, hsa-miR-1323, hsa-miR-588, mmu-miR-183*, hsa-mir-941-4, hsa-mir-1913, hsa-miR-2116*, hsa-miR-1178, mmu-miR-196a, mmu-miR-574-3p, hsa-miR-346, mmu-miR-1199, mmu-miR-681, hsa-miR-4292-P, hsa-miR-522, hsa-mir-611-P, hsa-miR-3171, hsa-miR-635, hsa-miR-1197-P, hsa-miR-604, mmu-let-7a*, hsa-miR-335, mmu-miR-466c-3p, mmu-miR-466i, hsa-miR-1297, mmu-miR-338-5p, hsa-mir-526a-2-P, hsa-miR-181aMM2GC/AG, hsa-miR-15b*, hsa-miR-924-P, mmu-miR-190-P, hsa-miR-345, mmu-miR-711, hsa-miR-3116-2-P, hsa-miR-99a, mmu-miR-26a, hsa-miR-1248-P, mmu-miR-721-P, mmu-miR-801-P, hsa-miR-1826-P, hsa-miR-1236, hsa-miR-339-5p, mmu-miR-804, mmu-miR-467d*, mmu-miR-1191, hsa-miR-148a, hsa-miR-141, mmu-miR-1937a-P, mmu-miR-696, hsa-miR-302a.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sujeito: (i) tenha sido tratado anteriormente para um câncer; ou (ii) tenha tido um tumor removido cirurgicamente anteriormente.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (i) identifica o sujeito como tendo ou não tendo um biomarcador de câncer compreendendo, adicionalmente, correlacionar o nível de Dicer medido ou atividade de processamento de Dicer com um risco para câncer; ou (ii) identifica o sujeito como tendo ou não tendo um biomarcador de câncer compreendendo, adicionalmente, análise do nível de Dicer medido ou atividade de processamento de Dicer usando um algoritmo.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a análise é executada por um computador.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: b) medir o nível de: (i) Dicer, AGO2 ou TRBP em uma fração do exossomo da amostra; (ii) um precursor miRNA em uma fração do exossomo da amostra; (iii) um ou mais miRNA(s) em uma fração do exossomo da amostra selecionado(s) a partir de mmu-miR-709, hsa-miR-1308, mmu-miR-615-3p, hsa-miR-1260b, mmu-miR-1937a, mmu-mir-321-A, hsa-miR-615-3p, hsa-miR-1979, mmu-miR-1937b, hsa-mir-373, mmu-miR-1937c, hsa-miR-1273d-P, mmu-miR-720, mmu-miR-1274a, hsa-mir-565-A, mmu-miR-1931, hsa-miR-1246, hsa-mir-594-P, hsa-mir-321-A, mmu-miR-2145-1-P, hsa-mir-639-P, hsa-miR-720, hsa-miR-1280, mmu-miR-3473, hsa-miR-1260, hsa-miR-1281, mmu-miR-1224-P, mmu-miR-690, hsa-miR-375-P, hsa-miR-4301, mmu-miR-700, mmu-miR-125b-5p, mmu-miR-1191-P, hsa-miR-1274a, hsa-miR-3197, mmu-miR-1935, hsa-miR-1975-P, hsa-miR-4324, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-1274b, mmu-miR-1957, hsa-miR-933, hsa-mir-675, hsa-miR-595, mmu-miR-2137, hsa-mir-572-P, mmu-miR-1195, hsa-miR-4294-P, mmu-mir-1899-P, mmu-miR-689-P, hsa-miR-199b-3p, hsa-miR-3117-P, mmu-mir-321-P, mmu-miR-1961-P, hsa-mir-10a, mmu-miR-669d-P, mmu-miR-1937b-2-P, hsa-miR-3125-P, mmu-miR-1934-P, hsa-miR-574-3p, hsa-miR-718, mmu-miR-1198, mmu-miR-2182-P, hsa-miR-1273, mmu-miR-2133-P, hsa-miR-92b*, hsa-miR-1290, hsa-miR-448, mmu-miR-689, mmu-miR-449a, mmu-miR-1937b-4-P, hsa-miR-4286, mmu-miR-1947, mmu-miR-342-3p, hsa-miR-1303-P, mmu-miR-2132, hsa-miR-4321-P, hsa-miR-4256-P, hsa-miR-4311, mmu-miR-130a, mmu-miR-1939, hsa-miR-1268-P, mmu-miR-31, mmu-miR-99b, mmu-miR-2141, hsa-miR-1202-P, mmu-miR-466b-3p, mmu-miR-2133, hsa-miR-1268, hsa-miR-466, mmu-miR-494, hsa-miR-1289, hsa-miR-320b, hsa-miR-4254, hsa-mir-7-3-P, hsa-miR-923, hsa-miR-764, mmu-miR-291a -3p, mmu-miR-883b-3p, hsa-mir-594-A, mmu-miR-1948-P, hsa-miR-206, hsa-mir-565-P, mmu-miR-467e*, hsa-miR-1826, mmu-miR-467a*, mmu-miR-1983, hsa-miR-324-5p, mmu-let-7c, mmu-miR-1965, hsa-mir-632-P, hsa-miR-181a*MM2GT/AC, hsa-miR-1265, hsa-miR-323b-5p, hsa-mir-1914, hsa-mir-1910, hsa-miR-21, hsa-miR-431*, hsa-miR-3135-P, mmu-miR-187-P, mmu-miR-126-3p, mmu-miR-669a-P, hsa-miR-367, mmu-mir-320-P, tem-miR-181a*MM1G/C, mmu-miR-484-P, mmu-miR-467c-P, hsa-miR-3154, mmu-miR-466d-3p, hsa-miR-3162-P, mmu-miR-201, mmu-miR-1946a, hsa-miR-937, hsa-miR-3147, hsa-mir-596-P, hsa-miR-3148, hsa-miR-1304, hsa-miR-222MM2GG/AC, mmu-miR-125a-5p, hsa-miR-1272-P, hsa-miR-638, hsa-mir-320, hsa-miR-545*, hsa-mir-1908-P, hsa-let-7d-v2-P, mmu-mir-30d-P, hsa-miR-4297, mmu-miR-182, hsa-miR-3166-P, hsa-miR-494, mmu-miR-669o-P, hsa-miR-566, mmu-miR-1188, mmu-miR-2134-AP, hsa-miR-4259-P, mmu-miR-152, mmu-miR-2134, hsa-miR-3193-AP, hsa-miR-125b, hsa-miR-3124-P, hsa-miR-10b, hsa-miR-455-5 p, mmu-miR-144, hsa-miR-130a, hsa-miR-1285, hsa-miR-516b*, hsa-miR-27a, hsa-miR-138-1*, mmu-miR-471, hsa-miR-4298-P, hsa-miR-301b, hsa-mir-147-P, hsa-miR-362-5p, mmu-mir-471-P, mmu-miR-466a-3p, hsa-miR-561, hsa-miR-486-5p, mmu-miR-2861, hsa-miR-587, mmu-miR-375, hsa-mir-329-2-P, mmu-miR-2861-P, hsa-miR-144*, hsa-miR-1255a-P, hsa-mir-519a-2-P, hsa-miR-34c-5p, mmu-miR-466e-3p, mmu-miR-743b-5p, mmu-mir-350-P, mmu-miR-181d, hsa-miR-376a*, hsa-miR-1308-P, mmu-miR-467g, mmu-miR-1946a-P, hsa-miR-147-P, hsa-miR-923-P, mmu-miR-465c-5p, hsa-miR-891a, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-4292, mmu-miR-677-P, hsa-miR-4257, hsa-miR-4326, hsa-miR-17*MM2GG/AA, hsa-miR-939-P, mmu-miR-2182, hsa-miR-220c-P, hsa-miR-3132-P, hsa-miR-532-5p, mmu-miR-1947-P, mmu-miR-29a, hsa-miR-3162, hsa-miR-375MM1C/G, hsa-miR-768-3p, mmu-miR-182-P, mmu-miR-205-P, hsa-miR-505, hsa-miR-3146-P, mmu-miR-721, mmu-miR-376c, hsa-miR-1179-P, mmu-miR-1970, hsa-miR-3133-P, hsa-miR-200c, hsa-miR-220a, mmu-miR-100, hsa-miR-1255b, hsa-miR-222MM1G/A, hsa-miR-885-3p, hsa-miR-517b, hsa-miR-200a, hsa-miR-3141, mmu-miR-669h-3p, hsa-miR-1301, hsa-miR-877, hsa-mir-941-2, hsa-mir-487b-P, hsa-miR-4302, hsa-miR-99b, hsa-miR-1253, hsa-let-7a*, hsa-miR-34aMM2CT/TC, hsa-miR-3181-P, hsa-miR-3200, hsa-miR-3129-P, hsa-miR-93*, hsa-miR-548q-P, mmu-miR-466g, mmu-miR-155, hsa-miR-2278-P, hsa-miR-3065-5p, hsa-miR-633, hsa-miR-4265, mmu-miR-2135-P, hsa-miR-190, mmu-miR-669f, hsa-miR-1323, hsa-miR-588, mmu-miR-183*, hsa-mir-941-4, hsa-mir-1913, hsa-miR-2116*, hsa-miR-1178, mmu-miR-196a, mmu-miR-574-3p, hsa-miR-346, mmu-miR-1199, mmu-miR-681, hsa-miR-4292-P, hsa-miR-522, hsa-mir-611-P, hsa-miR-3171, hsa-miR-635, hsa-miR-1197-P, hsa-miR-604, mmu-let-7a*, hsa-miR-335, mmu-miR-466c-3p, mmu-miR-466i, hsa-miR-1297, mmu-miR-338-5p, hsa-mir-526a-2-P, hsa-miR-181aMM2GC/AG, hsa-miR-15b*, hsa-miR-924-P, mmu-miR-190-P, hsa-miR-345, mmu-miR-711, hsa-miR-3116-2-P, hsa-miR-99a, mmu-miR-26a, hsa-miR-1248-P, mmu-miR-721-P, mmu-miR-801-P, hsa-miR-1826-P, hsa-miR-1236, hsa-miR-339-5p, mmu-miR-804, mmu-miR-467d*, mmu-miR-1191, hsa-miR-148a, hsa-miR-141, mmu-miR-1937a-P, mmu-miR-696, hsa-miR-302a; e/ou (iv) uma atividade de processamento de miRNA em uma fração do exossomo da amostra; e (c) identificar o sujeito como tendo ou não tendo um biomarcador de câncer, comparando o nível de RISC, precursor miRNA, miRNA(s) ou atividade de processamento de miRNA na amostra do sujeito ao nível de miRNA(s), precursor miRNA, atividade de processamento de RISC ou miRNA em um tecido não canceroso ou amostra de célula.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que: (i) mede o nível de Dicer, AGO2 ou TRBP compreendendo realizar um Western blot, um ELISA ou ligação a um arranjo de anticorpo; (ii) mede os níveis de miRNA compreendendo medir os níveis de miRNA processados; (iii) mede os níveis de miRNA compreendendo realizar RT-PCR, Northern blot ou uma hibridização de arranjo.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, relatar se o sujeito tem um biomarcador de câncer.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que relatar compreende preparar um relatório escrito ou eletrônico.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, prover o relatório para o paciente, um médico, um hospital ou uma companhia de seguros.
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