TWI805739B - 阻斷緊迫導致腫瘤生成之方法 - Google Patents

Abstract

本發明係相關於一種預防或治療腫瘤生成或腫瘤復發之新穎方法，包含投予有需要個體治療有效量之破壞Musashi-1 (MSI1)/Argonaute 2 (AGO2)交互作用之試劑。亦提供一種用於預防或治療腫瘤生成或腫瘤復發之組合物或醫藥組合物，其包含破壞Musashi-1 (MSI1)/Argonaute 2 (AGO2)交互作用之試劑。

Description

阻斷緊迫導致腫瘤生成之方法

本發明相關於一種阻斷緊迫導致腫瘤生成之新穎方法。

RNA結合蛋白(RBP)在各種細胞過程中扮演重要角色，經由調節其mRNA標靶之轉錄後控制而達成，例如微小RNA之生物發生學、RNA定位、轉譯和穩定性^1-6。由Musashi-1(MSI1)和Musashi-2組成的Musashi蛋白RBP家族，對多種細胞功能發揮必要控制作用⁷，例如維持幹細胞的自我更新和多能性狀態⁸。已顯示該家族的表現或活性功能失常會導致膠質母細胞瘤(GBM)或胰導管腺癌(PDAC)的腫瘤發生^9,10。最近報導MSI1直接靶向其標靶mRNA的3'端未轉譯區(3’UTR)，以抑制其轉譯¹¹。MSI1亦與LIN28 RBP合作抑制胚胎幹細胞中的miRNA的轉錄後生成¹²。愈來愈多的證據指出MSI1在腫瘤發生和癌症增殖上的角色¹³。MSI1的高表現量已於數種腫瘤組織中觀察到^9,10,14-17，並與第III/IV期膠質瘤患者的生存率有關¹⁸。儘管這些研究顯示MSI1與惡性腫瘤有關，但其在癌症復發中的功能角色與分子機制仍大部分未知。

Argonaute(AGO)蛋白，亦為RBP家族之一員，在RNA靜默過程中扮演關鍵角色，藉由介導其標的物之降解與轉譯抑制而達成^19-21。在許多癌症中， AGO2被發現會異位過度表現¹⁹，以及數種研究顯示AGO2可直接涉及癌症發生，藉由與致癌因子如EGFR交互作用而達成²²。AGO2亦反應緊迫刺激，藉由重新建構其與標靶mRNAs之交互作用，以及藉由調節其轉錄後控制²³。藉由重新建構其在3′UTR，以及標靶mRNAs的編碼序列區(CDS)的占據，AGO2可調整特定基因群組的轉譯率²³。然而，AGO2協調特定標靶轉譯率，以回應造成惡性腫瘤發生之緊迫的機制仍不清楚。

在本發明中出乎意料地發現，回應於緊迫，Musashi-1(MSI1)會易位至細胞質中，在該處它會召集Argonaute 2(AGO2)，並進行轉錄後調節特定標靶mRNA的表現，且MSI1/AGO2與標靶mRNA的3' UTR之結合會增強它們的降解，而與CDS的結合則會阻止它們的快速降解。藉由協調這兩種機制，MSI1/AGO2錯合物會增強腫瘤增殖，並確保在缺氧或化學藥物治療下癌細胞的存活。在範例中證實，MSI1誘餌胜肽對於MSI1/AGO2交互作用的破壞，降低了緊迫誘導的致腫瘤性。因此，使用小型胜肽作為治療敏化劑，來預防或治療腫瘤生成或腫瘤復發是相當有潛力的。

在一方面，本發明提供一種用於預防或治療腫瘤生成或腫瘤復發的方法，其包括投予有需要個體一治療有效量之破壞Musashi-1(MSI1)/Argonaute 2(AGO2)交互作用之試劑。

在本發明的一具體實施例中，該破壞MSI1/AGO2交互作用之試劑為一MSI1誘餌胜肽。

在本發明的一實施例中，該破壞MSI1/AGO2交互作用之試劑為一抗體、一結合蛋白、一可結合至AGO2之胜肽或分子。

在本發明的一特定實施例中，該破壞MSI1/AGO2交互作用之試劑為一具有胺基酸序列YQFPEFRVERTPLPS(SEQ ID NO：284)或HSLGGPLIATAFTNG(SEQ ID NO：299)之胜肽。

當結合附圖閱讀時，將更清楚地理解前述發明內容以及本發明以下的詳細描述。然而，應當理解，本發明不受限於該具體實施例。

圖1顯示MSI1易位至細胞質中，係與緊迫條件下的腫瘤生成和細胞增殖相關。圖1(a)顯示了原發性(n=67)和復發性(n=32)GBM中MSI1的IHC染色。放大倍數：200倍(上圖)和600倍(下圖)。表現細胞質性或細胞核性MSI1的細胞定量顯示在右側的條形圖中。圖1(b)顯示在常氧或缺氧條件下，使用或不用細胞核輸出抑制劑普黴素B(leptomycin B)(LMB)(10ng/mL，2小時)預處理24小時的05MG細胞，進行抗MSI1(綠色)免疫染色和DAPI(藍色)核對比染色。圖像得自Carl Zeiss共聚焦顯微鏡系統。定量細胞核和細胞質中的綠色螢光強度，並在右邊的圖中以相對百分比表示。圖1(c)顯示在LMB(10ng/mL)存在或不存在的情況下，常氧或缺氧(24小時)下，05MG細胞的總蛋白(T)、細胞核(N)和細胞質(C)分液，係以MSI1、核纖層蛋白A/C(細胞核內對照物)和GAPDH(細胞質對照物)抗體進行免疫墨點試驗。圖1(d)提供顯示人類MSI1的NLS(橙色)和NES(紅色)中的突變位點的示意圖。將所有構築體再選殖至p-3xFlag-Myc-CMV表現載體中。圖1(e)顯示經Flag標記的MSI1-wt、MSI1-NES-mut或MSI1-NLS-mut穩定轉染的05MG細 胞，置於常氧或缺氧下24小時，然後使用抗-Flag抗體(綠色)進行免疫染色。圖像得自Carl Zeiss共聚焦顯微鏡系統，細胞核和細胞質區室中螢光強度的定量以左圖中的相對百分比表示。圖1(f)顯示裸鼠皮下移植有05MG/MSI1-wt、05MG/MSI1-NES-mut、05MG/MSI1-NLS-mut或05MG-親代細胞。在指定的時間點以卡尺測量腫瘤大小。05MG/MSI1-NES-mut和05MG/MSI1-NLS-mut腫瘤顯示與親代細胞相似的生長曲線，而05MG/MSI1-wt腫瘤生長則快許多(N=6，**P<0.05 vs.親代細胞)。圖1(g)顯示切除異種移植腫瘤(上圖)，並對腫瘤組織進行免疫染色，以評估經Flag標記的MSI1-wt、MSI1-NES-mut和MSI1-NLS-mut蛋白的表現和分佈(下圖)。圖像得自Carl Zeiss共聚焦顯微鏡系統。圖1(h)顯示腫瘤組織經收獲並均質化。全腫瘤裂解物進行西方墨點分析。三次獨立實驗、每次三重複之數據以平均值±S.D表示。(i)描繪皮下移植和原位移植(orthotropic transplanted)的實驗設計示意圖。(j-k)裸鼠以05MG/Flag對照組、05MG/MSI1-wt、05MG/MSI1-NES-mut或05MG/MSI1-NLS-mut細胞進行皮下移植。在腫瘤大小達到50mm³後兩天，小鼠開始經由尾靜脈注射投予DDP(20mg/kg)或PBS總共3次，間隔2天。在指定的時間點以卡尺測量腫瘤大小。在DDP處理後40天切除異種移植腫瘤(N=6，**P<0.05)。圖1(l)顯示SCID小鼠原位移植(orthotropic transplanted)有05MG/Flag對照組、05MG/MSI1-wt、05MG/MSI1-NES-mut或05MG/MSI1-NLS-mut GFP細胞。移植後20天，每2天經由尾靜脈注射投予DDP(20mg/kg)或PBS共3次。在DDP處理後20天，切除異種移植腫瘤。GFP陽性腫瘤的代表性圖像(N=6，**P<0.05)。

圖2顯示MSI1與AGO2交互作用，以介導下游mRNA標靶的穩定性。圖2(a)提供示意圖說明辨識缺氧-誘導MSI1的結合配偶體之方法。圖2(b)顯示在缺氧條件下，內源性AGO2與MSI1抗體在05MG細胞的細胞質或細胞核分液 中，共免疫沉澱一段指定的時間。圖2(c)顯示經純化的由桿狀病毒表現之His-標記的AGO2，和經Flag-標記的MSI1蛋白之體外結合試驗。圖2(d)顯示由05MG細胞表現的MSI1-橙和AGO2-GFP之FRET對，在黃色框表示的有興趣區域(ROI)處進行漂白(bleach)。亦同時顯示未漂白的對照組(漂白前)。左圖，在光漂白實驗之前和之後的MSI1(橙色)和AGO2(綠色)的代表性圖像。右圖，藉由計算MSI1(橙色)-AGO2(綠色)FRET對之FRET效率，來進行FRET光漂白實驗的定量。圖2(e)顯示05MG/Flag-對照組、05MG/Flat-MSI1-wt和05MG/MSI1-wt，與AGO2-減弱(knockdown)組(Flag-MSI1/shAGO2)，進行MTT生存率測定。圖中顯示每天活細胞數量的相對倍數變化。圖2(f)顯示05MG/Flag-對照組、05MG/MSI1-wt和05MG/MSI1-wt/shAGO2細胞，進行集落形成試驗5天，並經由ImageJ軟體定量集落數。圖2(g)顯示皮下移植有05MG/MSI1-wt和05MG/MSI1-wt/shAGO2細胞之免疫受損小鼠。之後監測腫瘤大小22天(N=6，*P<0.05 vs.05MG/MSI1-wt細胞)。圖2(h)顯示在常氧和缺氧條件下，親代和MSI1-或AGO2-減弱細胞進行基因表現微陣列檢測。微陣列數據的生物資訊學分析側重於以RIP-Seq辨識出的MSI1和AGO2的336個共同標靶，顯示熱圖中這些共同標靶的層次聚類。紅色和綠色分別表示差異性(differentially)上調或下調之基因。每組在三個不同的生物樣品重複中完成，並且平均訊號轉化為log2等級。圖2(i)顯示將放線菌素D(Act.D，5μg/ml)加入到親代和MSI1-或AGO2-減弱細胞中一段指定的時間。我們比較親代和MSI1-或AGO2-減弱細胞之間的TP53、NF2、CDKN1A、CCND1、CDK4和HELLS之mRNA量的半衰期分佈。RNA表現量顯示在各個方塊圖下方。圖2(j)和圖2(k)顯示親代和MSI1-或AGO2-減弱之05MG細胞，以及經MSI1-wt、MSI1-NES-mut和MSI1-NIS-mut轉染的05MG細胞，以常氧或缺氧條件處理24小時。經純化的RNA 進行RT-PCR，使用特異於TP53、NF2、CDKN1A、CCND1、CDK4和HELLS之引子。缺氧條件下的mRNA量，係以常氧條件下的mRNA量進行標準化，並在圖表中以相對值表示。

圖3顯示在缺氧條件下，MSI1/AGO2錯合物對mRNA的差異性調節。圖3(a)顯示使用抗-MSI1或抗-AGO2抗體，在MSI1或AGO2減弱細胞中免疫沉澱出內源性MSI1或AGO2。免疫沉澱(IP)的西方墨點結果證實經缺氧處理的親代細胞中有MSI1/AGO2交互作用，但在MSI1或AGO2減弱細胞中則無此現象(上圖)。從IP分離出的總RNA進行NF2、TP53、CCND1和HELLS之mRNA定量，藉由使用具有特異性引子的qPCR進行。使用IgG對照物進行標準化，以定量mRNA表現量。三次獨立實驗、每次三重複之數據以平均值±S.D表示(* P<0.05 vs IgG訊號)。圖3(b)顯示05MG/MSI1-wt、05MG/MSI1-NES-mut和05MG/MSI1-NLS-mut細胞的細胞核和細胞質分液，以Flag抗體進行免疫沉澱，以拉下(pull down)與經Flag-標記之MSI1交互作用的錯合物。左圖，免疫沉澱物進行西方墨點分析，以評估AGO2與全長或突變的MSI1之間的結合。右方，經由qRT-PCR分析從免疫沉澱出的錯合物中分離出的總RNA中之NF2、TP53、CCND1和HELLS之mRNA量。將mRNA量的倍數變化以IgG沉澱對照組進行標準化。圖3(c)提供在標靶mRNA上的MSI1和AOG2結合區之RNA-ChIP分析結果。使用抗-MSI1或抗-AGO2進行RIP，然後進行RNA片段化，以及NF2、TP53、CCND1和HELLS之編碼序列(CDS)和3' UTR的qPCR。MSI1或AGO2回文結合序列存在於尖峰內。訊號倍數變化的定量係以IgG沉澱對照組進行標準化。此實驗在三個不同的生物樣品中重複完成。圖3(d)說明由MSI1-AGO2錯合物決定的mRNA命運之示意圖。MSI1-AGO2經由兩種方式調節特定RNA的RNA穩定性，以維持腫瘤在緊迫下的生長：1)MSI1- AGO2促進腫瘤抑制基因的mRNA降解，以預防緊迫誘導的細胞死亡(可能經由常規的UTR結合，隨後是轉錄後抑制)，以及2)MSI1-AGO2穩定並保護細胞週期基因的mRNA，以促進移除緊迫後的快速轉譯(可能藉由CDS結合和隨後的緊迫顆粒聚集)。

圖4顯示MSI1的C端對於AGO2的結合和細胞活力具關鍵地位。圖4(a)提供示意圖說明人類MSI1的全長和C-端(C-term)片段。將MSI1之C-端構築體再選殖至p-3×Flag-Myc-CMV表現載體中。圖4(b)顯示用Flag-對照組或經Flag-標記的MSI1之C-端(Flag-C-term)短暫轉染的細胞，進行內源性AGO2和MSI1蛋白質-蛋白質交互作用的共免疫沉澱試驗。Flag-C-term的轉染阻斷了缺氧誘導的MSI1/AGO2結合。圖4(c)顯示在共聚焦顯微鏡下分析經Flag-對照組或Flag-C-term轉染的細胞，用於MSI1(紅色)和AGO2(綠色)的細胞內共定位。圖4(d)顯示使用抗-MSI1或抗-AGO2抗體，針對經flag-對照組和Flag-C-term轉染的細胞進行RNA-ChIP試驗，然後進行RNA片段化和qRT-PCR分析，以決定NF2、TP53、CCND1和HELLS mRNA的編碼序列(CDS)和3' UTR的倍數變化富集度。以IgG沉澱對照組將IP訊號標準化，以定量結合訊號的倍數變化。各尖峰指出MSI1或AGO2回文結合序列。Flag-C-term阻斷了AGO2，而非MSI1，與mRNA中的標靶序列的結合。圖4(e)顯示經Flag-對照組和Flag-C-term轉染的細胞，在常氧或缺氧狀態下24小時。經純化的總RNA進行RT-PCR，使用特異於NF2、TP53、CDKN1A、CCND1、CDK4和HELLS的引子。缺氧條件下的mRNA量係使用常氧條件標準化，並在圖表中以相對倍數的變化表示。圖4(f)顯示經Flag對照組或Flag標記的MSI1 C-term短暫轉染的05MG細胞，進行MTT存活率測定。圖中顯示每天存活細胞數的相對倍數變化。圖4(g)顯示經flag-對照組和Flag-C-term轉染的細胞，進行集落 形成試驗5天，並經由ImageJ軟體定量。圖4(h)顯示經Flag-對照組和Flag-C-term轉染的細胞之細胞凋亡百分比，由在常氧和缺氧條件下測定外部膜聯蛋白-V(Annexin-V)決定。圖4(i)提供示意圖顯示使用體內傳送Flag-C-term(10μg，使用體內-jetPEI體內核酸傳送試劑)的動物實驗設計。在注射Flag-對照組或Flag-C-term後第2天，監測異種移植腫瘤大小。圖4(j)顯示免疫功能不全的小鼠皮下移植05MG/Flag-MSI1穩定細胞。在腫瘤大小達到50mm³後兩天，於小鼠腫瘤內注射10μg之Flag-對照組或Flag-C-term，3回合，間隔2天。然後監測腫瘤大小22天。經由西方墨點法評估異種移植腫瘤組織中MIS1-C-term的表現。圖4(k)顯示免疫受損小鼠皮下移植MIA-PaCa2細胞。在腫瘤大小達到50mm³後兩天，於小鼠腫瘤內注射Flag-對照組或Flag-C-term，3回合，間隔2天。然後監測腫瘤大小22天。經由西方墨點法評估異種移植腫瘤組織中MIS1-C-term的表現。

圖5顯示模擬MSI1-C-term與AGO2結合的MSI1/AGO2交互作用區的誘餌胜肽。圖5(a)顯示重組AGO2蛋白與硝酸纖維素膜胜肽陣列一起靜置，該硝酸纖維素膜胜肽陣列已點上由MSI1的C端設計的27個胜肽片段。該陣列揭示出兩種可能與重組AGO2交互作用的胜肽。圖5(b)顯示分別以10μM之兩種誘餌胜肽(TAT-11和TAT-26)或胜肽對照組(TAT-C)處理的細胞，進行共同-IP免疫墨點法，以在缺氧條件下，證實此二胜肽阻斷MSI1/AGO2的交互作用的功效。圖5(c)顯示在10μM TAT-11和TAT-26存在下，偵測MSI1和AGO2蛋白質-蛋白質交互作用的體外Gaussia螢光酶試驗。圖5(d)和圖5(e)顯示了由分子嵌合(molecular docking)網站(http：//galaxy.seoklab.org/index.html)預測的AGO2-胜肽(TAT-11或TAT-26)錯合物的結構。AGO2以四種顏色顯示出不同的功能結構域，且該胜肽以橙色(TAT-11)和紅色(TAT-26)顯示。描繪出該胜肽結合位點和AGO2口袋的相 對位向。在右圖中顯示AGO2-胜肽交互作用的特寫視圖。圖5(f)顯示在共聚焦顯微鏡下，分析以10μM之TAT-11-FITC、TAT-26-FITC或胜肽對照組(TAT-C-FITC)處理的細胞，用於TAT-胜肽的細胞內共定位(綠色)和AGO2(紅色)。圖5(g)顯示經由表面等離子共振(SPR)檢驗TAT-11和TAT-26的結合親和力。將重組AGO2蛋白固定在CM5晶片上，並分別與兩種胜肽的連續稀釋液(625至10000nM)一起靜置。藉由SPR測試TAT-11、TAT-26和經固定的AGO2之間的結合和解離(上圖)。計算結合速率常數(K_a)、解離速率常數(K_d)和平衡解離常數(K_D)，並顯示於圖表中(下圖)。

圖6顯示誘餌胜肽會破壞MSI1/AGO2交互作用，並抑制腫瘤異種移植模型中的腫瘤生長。圖6(a)和圖6(b)顯示TAT-11和TAT-26胜肽的細胞上調曲線。在05MG細胞株中測試該胜肽的生物活性。細胞以不同濃度的螢光素標記胜肽處理，並使用ELISA讀取器測量。該二胜肽的半消耗濃度(EC50)值分別為9.096和9.021μM/ml。圖6(c)顯示05MG/MSI1-wt和05MG/MSI1-wt/shAGO2細胞，在免疫受損小鼠中進行皮下移植。一旦腫瘤大小達到50mm³，TAT-C或TAT-11/TAT-26(150μg)的混合物在腫瘤部位注射6次，間隔3天。每2天監測腫瘤大小(N=6，* P<0.05，相對於經TAT-C處理的對照組)。圖6(d)和圖6(e)顯示免疫受損小鼠皮下移植有Pt3或Pt11初代GBM細胞或MIA-PaCa2 PDAC細胞。一旦腫瘤大小達到50mm³，TAT-C或TAT-11/TAT-26(150μg)的混合物在腫瘤部位注射6次，間隔3天。每2天監測腫瘤大小(N=6，*P<0.05 vs.05MG/MSI1-wt細胞)。圖6(f)提供示意圖說明用於評估原位傳送(orthotropically delivered)的TAT-11/TAT-26(150μg)之腫瘤抑制作用的動物實驗設計。圖6(g)顯示在螢光和光學顯微鏡下觀察相同小鼠的連續腦切片中的經GFP標記之GBM腫瘤。在每種條件下使用六隻小鼠， 該圖顯示了每一條件的代表性小鼠。圖6(h)顯示過度表現MSI1的05MG細胞(上圖)和來自GBM復發患者的初代培養腫瘤細胞(下圖)的原位異種移植小鼠的存活分析結果。小鼠接受兩輪治療，間隔一周，使用TAT-C或TAT-11/TAT-26(150μg)搭配順鉑，經由靜脈注射。N=6。圖6(i)提供示意圖說明動物實驗設計，以評估原位傳送(orthotropically delivered)的TAT-11/TAT-26(150μg)，對於PDAC腫瘤生長的影響。圖6(j)顯示免疫受損小鼠經由腹膜內注射，移植經GFP標記的MIA-PaCa2 PDAC細胞。移植後14天，小鼠腹膜內注射TAT-C或TAT-11/TAT-26(150μg)6輪，間隔2天。在第30天犧牲小鼠以確認GFP腫瘤訊號。圖6(k)顯示切除經GFP標記的異種移植腫瘤，並以抗-MSI1抗體進行IP試驗。圖6(1)顯示經由qPCR分析經GFP標記的異種移植腫瘤，以定量靶mRNA的表現量。條形圖顯示注射TAT-11/TAT-26的小鼠與注射TAT-C的小鼠之相對mRNA量。

圖7顯示細胞質性MSI1的表現與患者中的GBM復發和PDAC復發相關。圖7(a)顯示在18對原發性和復發性GBM組織中，藉由IHC檢驗MSI1的表現。提出三個代表性案例(Pt 1至3)。各框型明確顯示MSI1的表現模式。圖7(b)顯示來自18對原發性和復發性GBM切片的顯微切割腫瘤(T)和基質(S)樣品之NF2、TP53、p21、CCND1、CDK4和HELLS mRNA表現量的qPCR分析結果。T部分中的所有mRNA表現量首先以各自的S對應物進行標準化，然後將每一mRNA的總共36個表現量(原發性和復發性)評定為從0%(綠色)至100%(紅色)的百分位數。熱圖顯示成對的原發性和復發性GBM組織之間的相對mRNA表現量。圖7(c)顯示了一群原發性(N=67)和復發性(N=32)的GBM組織中，NF2、TP53、p21、CCND1、CDK4和HELLS mRNA量的qPCR分析(*P<0.01)。通過對數秩檢定估計P值。圖7(d)顯示收集61個復發性PDAC患者樣品，且MSI1經IHC染色。三個代表性病例 顯示細胞質性MSI1的陽性染色。圖7(e)顯示細胞質性MSI1陽性(細胞質陽性；N=37)和細胞質性MSI1陰性(細胞質陰性；N=24)之復發PDAC患者的存活分析結果，顯示細胞質性MSI1陽性患者的生存結果比細胞質性MSI1陰性患者差。圖7(f)顯示在37個細胞質陽性PDAC病例中，經由IHC評分評估細胞質性MSI1的表現量。在20例細胞質性MSI1患者(IHC評分<0.5)中，復發後存活10個月以上者有13例；而在17例細胞質性MSI1 IHC評分>0.5的患者中，僅有2例在復發後存活10個月以上(P=0.001；卡方=10.80)。圖7(g)顯示了細胞質陽性PDAC患者的兩組(IHC評分>0.5和IHC評分<0.5)復發後存活分析的結果。

圖8顯示在緊迫環境下，MSI1和AGO2交互作用會促進腫瘤生成。示意圖摘錄已辨識出的在調節緊迫誘導的腫瘤生成中的MSI1/AGO2途徑，以及針對腫瘤復發的潛在治療方法。在正常情況下，MSI1主要位於細胞核中，與AGO2分離，AGO2主要在細胞質中(左上)。在緊迫條件下，如順鉑治療或缺氧等條件，MSI1會與其標靶mRNA一同從細胞核轉位至細胞質，召集AGO2形成蛋白質錯合物，其位於細胞週期促進基因的mRNA CDS或凋亡基因的mRNA 3'UTR上，分別導致mRNA保護或降解，最終促進腫瘤惡性化(右上)。以誘餌胜肽(其模擬MSI1的特異性C端區域)破壞MSI1/AGO2的交互作用，細胞質性MSI1/mRNA錯合物便無法召集AGO2，因而使細胞週期促進基因的mRNA不受保護，而凋亡基因的mRNAs仍保持完整。誘餌胜肽可最終抑制MSI1/AGO2錯合物在治療抗性癌細胞中的促致癌作用(下圖)。

補充圖1顯示MSI1的運輸在MSI1介導的致癌事件中是必需的。補充圖1(a)和1(b)顯示經由IHC分析來自臨床患者的非腫瘤和不同等級的腦腫瘤組織，以評估MSI1的表現量。各組中MSI1表現的比例顯示在圖中。數據以三次重 複實驗的平均值±SD表示(* p<0.001，學生t檢定)。補充圖1(c)和1(d)左圖：兩個患者來源的原發性GBM細胞(Pt 3和Pt 11)的細胞核和細胞質區室中的MSI1、層黏連蛋白A/C和GAPDH，以及經24小時缺氧處理的MIA-PaCa2 PDAC細胞(T：總蛋白，C：細胞質，N：細胞核)之蛋白質表現的免疫墨點結果。右圖：在常氧或缺氧下24小時的Pt 3、Pt 11和MIA-PaCa2，進行抗-MSI1(綠色)免疫螢光染色和DAPI(藍色)細胞核對比染色。圖像得自Carl Zeiss共聚焦顯微鏡系統。在缺氧條件下，兩種細胞均顯示細胞質性MSI1增加。補充圖1(e)顯示，順鉑會誘導05MG細胞中MSI1的易位。上圖：使用或未使用細胞核輸出抑制劑細黴素B(leptomycin B)(LMB)(10ng/mL，2小時)預處理的05MG細胞，進一步使用順鉑(30μM)處理24小時。MSI1和細胞核的定位分別使用抗-MSI1(綠色)和DAPI(藍色)染色。補充圖1(f)顯示使用經GFP標記的表現載體對辨識出的細胞核輸出訊號(NES)的功能驗證。經GFP、與NES融合的GFP(NES-wt-GFP)，或與突變NES融合的GFP(NES-mut-GFP)轉染的細胞，使用或未使用LMB(10ng/ml，2小時)處理。上圖：構築野生型NES和與GFP蛋白融合的突變NES的流程圖；下圖：顯示GFP分佈的共聚焦顯微鏡成像。補充圖1(g)和1(i)顯示使用野生型或突變MSI1轉染的05MG細胞進行功能分析，以評估細胞增殖、凋亡和選殖生長。缺氧誘導的細胞凋亡會經由野生型MSI1的過度表現而抑制，但突變MSI1組卻不會，此現象經由膜聯蛋白V(annexin V)染色、MTT試驗和集落形成試驗測定。

補充圖2顯示在缺氧和順鉑處理下，MSI1與細胞質中的AGO2交互作用。補充圖2(a)顯示待用於LC-MS/MS的常氧和缺氧樣品之考馬斯亮藍(Coomassie blue)染色SDS-PAGE。補充圖2(b)提供在05MG細胞中，經LC-MS/MS分析辨識出的與MSI1-結合和緊迫相關的蛋白質列表。補充圖2(c)顯示以免疫墨 點法確認經由蛋白質體學分析辨識出的候選物。補充圖2(d)提供在經過或未經缺氧處理24小時的MIA-PaCa2 PDAC細胞株中，內源性AGO2與MSI1的共免疫沉澱結果。補充圖2(e)顯示內源性AGO2在順鉑(30μM)刺激24小時下，以抗-MSI1抗體在05MG細胞裂解物中免疫沉澱。MSI1被MSI1抗體拉下(pull-down)，然後使用抗-MSI1和抗-AGO2抗體進行免疫墨點試驗。補充圖2(f)顯示表現FRET對的MSI1-橙和AGO2-GFP的05MG細胞，在由框形表示的有興趣區域(ROI)處被漂白(底部)。亦進行未漂白的對照組(上圖)。受器進行光漂白實驗期間，MSI1(紅色)和AGO2(綠色)的螢光發射強度顯示在左圖中，並在右圖中定量。經由計算FRET對MSI1(紅色)-AGO2(綠色)的FRET效率，來進行FRET光漂白實驗的定量。三次獨立實驗以三重複進行，數據以平均值±S.D表示(* P<0.05及**P<0.01 vs對照組)。圖2(g)和圖2(h)顯示05MG細胞在有或無LMB(10ng/mL)的情況下，經缺氧或順鉑(30μM)處理24小時。經由共聚焦顯微鏡觀察到MSI1(綠色)和AGO2(紅色)的共定位。圖像得自Carl Zeiss共聚焦顯微鏡系統。補充圖2(i)顯示西方墨點分析證實在MSI1過度表現之細胞中，AGO2(選殖物# 1和# 2)的減弱(knockdown)效率。補充圖2(i)顯示05MG/Flag-對照組、05MG/MSI1-wt和05MG/MSI1-wt/shAGO2細胞的細胞凋亡試驗，係以受膜聯蛋白V染色測定。缺氧誘導的細胞凋亡由於MSI1的過度表現，而非額外的AGO2減弱，而被抑制。

補充圖3顯示MSI1/AGO2的mRNA結合標靶的辨識。補充圖3(a)提供製備用於NGS分析(RIP-seq)的RNA結合蛋白免疫沉澱(RIP)樣品的流程圖。補充圖3(b)顯示MSI1和AGO2靶向的mRNA的重疊部分。補充圖3(c)顯示基因功能分類(GO)富集分析是由DAVID軟體，根據生物過程的類別進行的。Benjamini

0.05被選為有興趣的GO。GO取得、名稱和相對應的p值顯示在圖表中。 補充圖3(d)顯示在常氧或缺氧條件下的細胞之免疫沉澱(IP)分離出的總RNA，係使用特異性引子以qPCR進行mRNA定量。補充圖3(e)顯示經或未經LBM(10ng/mL，2小時)預處理，並在缺氧條件下培養24小時的05MG細胞中，染色TP53和CCND1 mRNA(TAS-cy5，櫻桃紅)、MSI1(綠色)和AGO2(紅色)。顯示共聚焦顯微鏡下，MSI1/AGO2/mRNA(白色)之共定位合併圖像。補充圖3(f)顯示05MG/MSI1-wt和05MG/MSI1-wt/shAGO2細胞，使用常氧或缺氧條件處理24小時。經純化的RNA進行定量RT-PCR，使用特異於TP53、NF2、CDKN1A、CCND1、CDK4和HELLS的引子。缺氧條件下的mRNA量係以常氧條件進行標準化，並在圖表中以相對值顯示(* P<0.05)。

補充圖4顯示MSI1/AGO2的mRNA結合標靶的辨識。補充圖4(a)左圖：呈現異種移植腫瘤模型的實驗設計的示意圖。右圖：對異種移植腫瘤組織進行切片並進行ICH，以評估Flag-MSI1、NF2、p53、p21、cyclinD1、CDK4和ki67表現量。補充圖4(b)顯示收獲腫瘤組織(每組五個)並均質化。經由qPCR分析全腫瘤裂解物。補充圖4(c)顯示使用Flag抗體在05MG/MSI1-WT、05MG/MSI1-NES-mut和05MG/MSI1-NLS-mut異種移植腫瘤組織中，內源性AGO2與經Flag標記的MSI1之共免疫沉澱。

補充圖5顯示MSI1突變體保留其RNA結合能力。補充圖5(a)提供RNA-蛋白質拉下(pull-down)試驗，其顯示野生型MSI1的RNA結合能力。經T4RNA連接酶標記的總RNA、AR-3'UTR(陽性對照組)和Poly(A)RNA(陰性對照組)沉澱出，並在SDS-PAGE上分析。AR-3’UTR作為陽性對照組且被HuR靶向，而Poly(A)RNA作為陰性對照組。以抗Flag抗體進行默點分析，顯示經Flag標記的MSI1之RNA結合能力。補充圖5(b)顯示MSI1上的NES-和NLS-突變不妨礙其RNA 結合能力。經T4連接酶標記的RNA用於從各自的細胞裂解物中拉下(pull down)Flag-對照組、MSI1-wt、MSI1-NES-mut和MSI1-NLS-mut蛋白。使用抗-Flag抗體，以西方墨點法評估RNA-蛋白質拉下(pull down)之特異性。

補充圖6顯示MSI1-C-Term或誘餌胜肽在體外和體內破壞MSI1/AGO2的交互作用。補充圖6(a)提供用於純化重組蛋白的MSI1全長、C端和N端構築體，以及野生型AGO2的示意圖。補充圖6(b)提供以重組MSI1和AGO2蛋白的拉下(pull down)分析，顯示MSI1的C端為MSI1/AGO2直接交互作用所必需的。補充圖6(c)顯示經MSI1-C-term注射的異種移植物之腫瘤組織，係以抗-Flag抗體免疫染色，以觀察腫瘤中MSI1-C-term的表現。補充圖6(d)提供了分裂螢光酶重構成像系統的示意圖，以即時監測MSI1和AGO2之間的交互作用。補充圖6(e)顯示分裂螢光酶重構成像系統允許MSI1/AGO2交互作用，以即時方式在體內非侵入性地監測和定量。補充圖6(f)顯示MSI1-AGO2交互作用能夠經由分裂螢光酶報導子系統即時監測，其指出該交互作用會回應順鉑處理而增加。標準化結果以條形圖顯示。

補充圖7顯示05MG細胞中誘餌胜肽的細胞內定位、細胞吸收和穩定性。補充圖7(a)，在共聚焦顯微鏡下，經兩種FITC標記的誘餌胜肽TAT-11-FITC和TAT-26-FITC處理的細胞，係於0、0.5和1小時分析。可於05MG細胞的細胞質中觀察到經FITC標記的胜肽。補充圖7(b)顯示細胞分別以兩種經FITC標記的誘餌胜肽處理。在0.5、1、2、4和6小時後，收集細胞裂解物，並經由ELISA讀數器偵測其螢光強度。每個時間點的N=3。在處理後，在05MG親代細胞中可在第1小時觀察到最大胜肽吸收。補充圖7(c)顯示細胞分別以兩種經FITC標記的誘餌胜肽處理4小時。洗滌細胞並在指定的時間點在顯微鏡下觀察。補充圖7(d)顯示收 集來自(c)的細胞裂解物，並經由ELISA讀數器測量其螢光強度。為了便於比較吸收和降解動力學，平均螢光值係經標準化以描述螢光值。所有數據代表三個獨立實驗。在處理後4小時，經FITC標記的誘餌胜肽能夠在細胞中維持至少50%的初始劑量。

補充圖8顯示誘餌胜肽逆轉MSI1/AGO2途徑的下游作用，而不影響內源性MSI1的細胞內定位。補充圖8(a)顯示以胜肽對照組(TAT-C)、TAT-11或TAT-CP26轉染的細胞，處於常氧或缺氧條件下，並進行qRT-PCR，以測定MSI1-AGO2的六個下游標靶之相對表現量。缺氧條件下的mRNA量與常氧條件下的mRNA量顯示在條形圖中(與常氧相較，P<0.05)。補充圖8(b)和8(c)顯示經胜肽處理的MSI1過度表現之05MG，以及MIA-PaCa2異種移植物的腫瘤組織，係以抗-MSI1和抗-AGO2抗體染色，以觀察在胜肽處理下，MSI1和AOG2的細胞內定位。

材料與方法

1. 細胞培養與臨床組織

人類GBM細胞株05MG(Denver Brain Tumor Research Group 05)、人類胰導管腺癌細胞株(MIA-PaCa2)及其衍生之穩定細胞株、MSI1-WT、MSI1-NES-mut和MSI1-NLS-mut穩定細胞株，在Dulbecco's Modified Eagle's培養液(DMEM,Life Technologies Inc.,Carlsbad,CA,USA)中培養，其補充有10%胎牛血清(HyClone Laboratories Inc.,South Logan,UT,USA)、150g/mL G418(SIGMA,Cat#A1720)、100單位/mL青黴素和100μg/mL鏈黴素(Life Technologies Inc.,Carlsbad,CA,USA)，在標準培養條件下(37℃，95%濕潤空氣和5%CO₂)。以0.25% 胰蛋白酶-EDTA(Sigma-Aldrich Co.LLC.,St.Louis,MI,USA)進行分代培養。所有細胞株皆經過微生物污染測試。臨床組織樣品和腫瘤細胞培養物得自榮民總醫院神經學研究所和三軍總醫院神經外科。所有組織獲取程序都遵循赫爾辛基宣言的原則，並由榮民總醫院和三軍總醫院的機構審查委員會審查。

2. 動物照顧、腫瘤細胞移植和非侵入性成像

所有涉及動物的程序均根據榮民總醫院的機構動物福利指南進行。用於皮下移植，係收獲細胞、洗滌、懸浮於PBS中。將總注射體積100μL皮下注射到8週齡雄性BALB/C裸鼠(國家實驗動物中心，台北，台灣)脅腹區的背外側，按照榮民總醫院實驗動物指南進行培育和維持。皮下注射後14天，經由尾靜脈注射，每週兩次注射2mg/kg順鉑，持續兩週，以模擬臨床化學療法。使用卡尺測量腫瘤大小³⁸。每一實驗中每種條件使用六隻小鼠。

用於原位移植，係收獲細胞、洗滌、懸浮於PBS中。將總體積10μl原位注射至8週齡雄性SCID小鼠(國家實驗動物中心，台北，台灣)的腦中，根據榮民總醫院的實驗動物指南進行培育和維持。皮下注射14天後，經由尾靜脈每週兩次注射2mg/kg順鉑，持續兩週，以模擬臨床化學療法。用於生物發光成像，以吸入式1%異氟烷麻醉具有異種移植腫瘤的小鼠，並且每週經由IVIS 50成像系統(Caliper Co.,Hopkinton,MA)成像。腹膜內注射D-螢光素(150mg/kg)在試驗前15分鐘注射。每種條件使用6隻小鼠。

3. 質體構築與轉染

MSI1基因係由人類基因組DNA中倍增與選殖出。p3XFlag-MSI1和pmOrange-MSI1質體係經由將全長人類MSI1 cDNA的1038-bp片段插入p3XFlag-myc-CMV-26載體(Sigma，No.E 6401)和pmOrange載體(Clontech,No. 632592)的HindIII/BamHI位點而產生。具有適當限制酶切割位點的PCR擴增DNA片段，係藉由PCR引入。用於擴增的引子列於補充表4中。MSI1-NES-突變體和MSI1-NLS-突變體³⁸。根據製造商的說明(QuikChange II定點誘變套組，#200523/200524)，選殖物係經由定點突變產生。使用的引子列於補充表4中

使用p3XFlag-MSI1作為模板，經由PCR擴增產生MSI1 C-端缺失選殖物。該DNA片段經由PCR引入另一限制酶切割位點。藉由將539-bp片段插入p3XFlag-myc-CMV-26載體或pEGFP-C1-Vector(Clontech，No.632592)，產生3xFlag-MSI1-C-term質體或pEGFP-MSI1-C-term。使用的引子列於補充表5中。使用p3XFlag-MSI1質體作為模板，經由PCR擴增產生MSI1 C-端截短選殖物。藉由 將870、804、770和732-bp片段插入p3XFlag-myc-CMV-26載體的HindIII/BamHI位點，產生3xFlag-MSI1-缺失質體。使用的引子列於補充表6中。

根據製造商的說明，使用jetPEI DNA轉染試劑(Polyplus Transfection，Huntingdon，UK)進行體外質體轉染。使用體內jetPEI體內核酸傳送試劑(Polyplus-tranfection,Illkirch,France)進行小鼠體內質體轉染。就每次腫瘤內轉染而言，將10μg之FLAG-C-term表現質體與2μl體內-jetPEI混合，總體積為50μl。

4. 基因表現分析

使用TRIzol分離來自05MG細胞的RNA樣品，並以NanoDrop ND-1000確認。經由瓊膠凝膠電泳評估RNA的完整性。基因表現陣列(Agilent Technologies)是一種客製化設計，從NGS數據中辨識出336個基因。定量結果最初以bowtie-1.1.2比對，並使用express-1.5.1，依據先前報告^40,41計算定量性能。平均轉錄物的最高數值視為基因表現，且隨後經由(表現量-平均值)/標準差進行標準化。

5. 使用小型干擾RNA(siRNA)進行基因靜默

針對MSI1、AGO2和亂序對照組的靶向基因靜默，係購自GE Dharmacon On-TARGETplus siRNA智能庫。使用INTERFERin siRNA轉染試劑(Polyplus Transfection,Huntingdon,UK)，根據製造商的說明進行短暫轉染(針對MSI1的siRNA：SASI_Hs01_00145278，針對AGO2的siRNA：SASI_Hs01_00161740，針對NC cont的siRNA：SG00217942，Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA)。培養2天後進行細胞基礎實驗。

6. 細胞存活試驗

將MSI1過度表現細胞中的MSI1-WT、MSI1-NES-mut、MSI1-NLS-mut和MSI1-C-term，接種於具有完全生長培養液的24孔盤(每孔3000個細胞)中。該完全培養液可以具有指定濃度的溶劑或化學品之完全培養基取代。然後進行細胞存活試驗。簡言之，細胞以0.1mg/ml之溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑(MTT,SIGMA,Cat#M2003)染色2小時，該甲

晶體之後溶於DMSO中。之後測量相對吸收值，經由TECAN Sunrise ELISA盤讀取儀(Thermo Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)，在570nm光吸收下測量。

7. 集落形成試驗

將MSI1-WT、MSI1-NES-mut和MSI1-NLS-mut接種在6孔盤(每孔1,000個細胞)中並培養24小時。之後將細胞在缺氧條件下繼續處理24小時。進一步培養10天，用10%福馬林固定細胞，用4%台盼藍(trypan blue)(w/v)染色20分鐘。以PBS洗滌染色的集落並計數。

8. 細胞凋亡之測定

細胞凋亡事件係經由膜聯蛋白V(BD Pharmingen^TM，#556547)測定。就流式細胞術而言，收獲細胞並以膜聯蛋白V和PI染色10分鐘。以PBS洗滌細胞並重新懸浮於HEPES中，用於隨後的流式細胞術分析。

9. 細胞核與細胞質萃取物之製備

細胞核與細胞質萃取物係以細胞核和細胞質萃取套組(Pierce Chemical,Rockford,IL)分離出。靜置期過後，藉由在4℃下，以1000rpm離心5分鐘收集細胞。以冰冷的PBS洗滌沉澱物兩次，之後加入0.2ml細胞質萃取緩衝液A並劇烈混合15秒。於溶液中加入冰冷的細胞質萃取緩衝液B(11μl)。渦旋混合後，細胞核和細胞質分液係以13000rpm離心5分鐘而分離。將細胞質萃取物(上清液)儲存在-80℃。將細胞核萃取緩衝液加入細胞核分液(沉澱物)中，然後在最高設定值下渦旋混合15秒。將混合物冷卻，每10分鐘進行15秒渦旋，總共40分鐘。將細胞核分液以13,000rpm離心10分鐘。將細胞核萃取物(上清液)儲存於-80℃直至使用。

10. 西方墨點法(Western blotting)

以含有1%蛋白酶抑制劑的RIPA緩衝液(Thermo Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)製備蛋白質樣品。在SDS/PAGE上通過電泳分離等重量的總蛋白質。將蛋白質轉移到聚亞乙基二氟化物膜(Millipore,Bedford,MA,USA)上後，將印漬物與阻斷緩衝液(1×PBST和5%脫脂乳)在室溫下靜置1小時，然後在4℃下，與一級抗體雜合整夜，然後在室溫下與辣根過氧化酶偶聯的二級抗體靜置1小時。經由X射線膠片曝光獲得印漬物，並經由光密度分析(Digital Protein DNA Imagineware,Huntington Station,NY)定量該強度。所有抗體列於補充表9中。

補充表9. 抗體表

11. RNA萃取

細胞經由TRIzol試劑(Life Technologies Inc.,Carlsbad,CA,USA)裂解細胞，之後進行苯酚：氯仿純化，以及乙醇沉澱。單股cDNA係經由SuperScript III反轉錄酶(Life Technologies Inc.,Carlsbad,CA,USA)進行反轉錄。使用Primer Express 2.0(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)設計用於PCR分析的寡核苷酸。

12. 定量即時PCR(qRT-PCR)

核苷酸特異性係經電腦測試(BLAST,National Center for Biotechnology Information,Bethesda,MD,USA)，藉由與人類基因組進行同源性搜索達成，隨後經由鏈解曲線(melting curve)分析確認。根據製造商的說明，使用強力SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)進行qRT-PCR。使用7900HT快速即時PCR系統(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)偵測訊號。將每個基因的表現量以內源18S和實驗對照組標準化，使用△Ct法進行。所使用的所有抗體和PCR引子都列在補充表中。使用ggplot2套件，以R統計語言顯示qPCR陣列數據的熱圖。

13. 共免疫沉澱(Co-IP)

以冰冷的PBS洗滌細胞三次並藉由胰蛋白酶消化收集細胞。離心後，將細胞沉澱物重新懸浮於含有100000 U之RNasin Plus RNase抑制劑(Promega Inc.,Waltham,MA,USA,N2615)的緩衝液-G(50mM Tris pH 7.5、170mM NaCl、13mM MgCl2、0.5% NP40、0.3% Triton X-100、蛋白酶抑制劑混合液)中。首先，將Dynabeads Protein-G(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA,USA,10003D)與2.5μl抗體在室溫下靜置30分鐘。接下來，將1mg蛋白質裂解物與蛋白質-G偶聯的抗體微珠一起靜置6小時，或於4℃下靜置整夜。經由磁珠分離台(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA,USA)分離出Dynabeads Protein-G，並在緩衝液G中洗滌3次。藉由SDS-PAGE分析蛋白質。所有使用的抗體皆列於補充表7中。

14. 重組蛋白和拉下(pull-down)試驗

人類AGO2和MSI1的cDNA係由Addgene獲得、進行PCR擴增，並分別進行框內再選殖至pFASTBAC載體之N-端6xHis或FLAG標籤。根據Bac-To-Bac桿狀病毒表現系統(Thermo Fisher Scientific)的手冊製備His-AGO2和FLAG-MSI1的桿狀病毒。簡言之，從經pFastbac-HisAGO2或pFastbac-FlagMSI1轉型的DH10Bac細胞中，分離出重組Bacmid DNA，轉染到Sf9昆蟲細胞中，以產生桿狀病毒。為了分離重組蛋白，將High Five昆蟲細胞以含有基因的桿狀病毒感染48小時。收獲感染的細胞並在冰冷的PBS中洗滌，於4℃下，在裂解緩衝液(20mM Tris-HCl pH 7.9、0.5mM EDTA、300mM KCl、10%甘油、0.2% Triton X 100、10μM MG132)中裂解30分鐘。將粗裂解物以13K rpm(20000×g)離心，並通過Nickel(Quiagen)或抗-FLAG M2(Sigma)樹脂，以分別含有100mM咪唑或150ug/mL 3X FLAG胜肽的裂解緩衝液(含有100mM KCl)中，沖提分離出該重組蛋白。就拉下試驗而言，將2ug HisAGO2和2ug FLAG-MSI1如說明靜置於裂解緩衝液(含100mM KCl)中，在4℃靜置2小時，然後以蛋白A-固定的抗-AGO2抗體拉下。以裂解緩衝液(100mM KCl)大量洗滌後，經由凝膠電泳分離沉澱的蛋白質，並使用指定的抗體進行免疫墨點分析。

15. RNA-結合蛋白免疫沉澱(RIP)

Magna RIP套組(Millipore,Merck Co.,Berlin,Germany,Catalog No.17-700)⁴²係用於RNA結合蛋白免疫沉澱和RNA萃取。以冰冷的PBS洗滌細胞兩次，並使用細胞刮板以10ml PBS收集細胞。收集的細胞在4℃下以1500rpm離心10分鐘沉澱。然後將沉澱物重新懸浮於等體積的RIP裂解緩衝液(RIP裂解緩衝液(CS203176)、蛋白酶抑制劑混合液(CS203220)和RNase抑制劑(CS203219))中。磁珠在室溫下以2.5μl抗體製備30分鐘，將蛋白質裂解物與微珠-抗體錯合物，在4℃，900μl之RIP免疫沉澱緩衝液(35μl之0.5M EDTA(CS203175)、5μl之RNase抑制劑和860μl RIP洗滌緩衝液(CS203177))中混合並旋轉整夜。在RNA分離之前以冰冷的RIP洗滌緩衝液洗滌微珠三次，然後在55℃下進行蛋白酶K消化30分鐘，並劇烈搖動進行RNA純化。將上清液置於新試管中並加入250μl之RIP洗滌緩衝液。加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)進行RNA分離。渦旋15秒，以14000rpm離心10分鐘，以分離各相。移出350μl水相置於新試管中，並加入400μl氯仿。渦旋15秒並以14000rpm離心10分鐘。移出300μl水相置於新試管中，加入50μl鹽類溶液I(CS203173)、15μl鹽類溶液II(CS203185)、5μl沉澱增強劑(CS203208)和850μl無水乙醇，並在-80℃下冷凍該樣品整夜。第二天，將每個樣品以14000rpm離心30分鐘，除去上清液，以80%乙醇洗滌沉澱物，並以14000rpm離心15分鐘。除去上清液並空氣乾燥沉澱物。然後將分離的RNA重新懸浮於20μl不含RNase的水(CS203217)中。本節中使用的所有抗體和PCR引子列於補充表⁴³中。

16. 經修飾的RNA結合蛋白免疫沉澱(經修飾-RIP)

我們使用RNA ChIP-IT套組(目錄號53024)⁴⁴進行經修飾的RIP試驗，以研究RNA結合蛋白在其標靶RNA上的交互作用區域。在培養皿中加入175 μl之37%甲醛每6.5ml培養液樣品(最終濃度必須為約1%)5分鐘，以固定樣品。然後在室溫下，於樣品中加入825μl甘胺酸(最終濃度必須為0.125M)5分鐘，以停止固定反應。去除上清液並丟棄。洗滌細胞沉澱物，並在4℃下以1000rpm離心5分鐘收集。將細胞重新懸浮於冰冷的完全裂解緩衝液中，在冰上靜置30分鐘，並將細胞轉移至4℃，5000rpm離心10分鐘。除去上清液，將沉澱物重新懸浮於完全剪切緩衝液中。將樣品置於超音波震盪處理，使用Bioruptor^®剪切染色質1至4次，每次5個循環：每一次(20個循環)[30秒「開啟」，30秒「停止」]。將對照組和超音波處理樣品以12,000rpm旋轉10分鐘。收集上清液，上部脂質層除外。在37℃以10μl DNase I處理染色質20分鐘，並在實施IP之前加入10μl 0.5M EDTA終止反應。

首先，將Dynabeads Protein-G與2.5μl抗體在4℃靜置30分鐘。接著，將蛋白質裂解物1mg與蛋白質-G-偶聯的抗體微珠在4℃下靜置整夜，用於親代細胞。Dynabeads Protein-G係以Complete RNA-ChIP沖提緩衝液，在室溫下之端對端轉子(end-to-end rotor)中旋轉15分鐘而分離出。轉移上清液，在42℃下，加入2μl之5M NaCl和2μl蛋白酶K至每一樣品中1小時，以消化蛋白質。之後，在65℃下靜置1.5小時以逆轉交聯。RNA以苯酚/氯仿/異戊醇萃取出，溶於20μl之KAPA蒸餾水中，使用作為終點RT-PCR分析的RNA來源(KAPA SYBR FAST通用一步驟qRT-PCR套組，KR0393)。每個實驗在三個不同的生物樣品重複中完成。以IgG沉澱對照組進行標準化，來完成訊號倍數變化的定量。所有抗體和PCR引子均列於補充表中。

17. RNA-蛋白質拉下(pull-down)試驗

我們使用Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down套組(Thermo Cat.20164)研究MSI1的不同突變選殖物的RNA結合效率。RNA經純化並在4℃下經T4 RNA連接酶標記整夜。在室溫下，該標記的RNA被鏈黴親合素(streptavidin)磁性微珠捕獲30分鐘。除去上清液，以蛋白質-RNA結合緩衝液洗滌微珠三次。將Master Mix的蛋白質添加到RNA結合的微珠中，然後經由溫和的渦旋混合。在4℃下旋轉靜置60分鐘。清洗微珠，並以SDS-PAGE載入緩衝液沖提出。蛋白質經SDS-PAGE分析。所有使用的抗體列於補充表9中。

18. RNA-螢光原位雜合(RNA-FISH)

細胞係於12孔細胞培養盤中的約18mm蓋玻片上分代培養24小時。培養整夜後，細胞經缺氧刺激。將細胞以3.7%甲醛固定5分鐘。在室溫下以0.1% Triton X-100通透化5分鐘。免疫染色係分別以溶於雜合緩衝液(Biosearch Technologies Cat # SMF-HB1-10)中之指定一級抗體，在4℃下進行整夜，之後以溶於洗滌緩衝液A中的經FITC-標記的或經PE-標記的二級抗體(Biosearch Technologies Cat)# SMF-WA1-60)染色。最後，進行DAPI細胞核染色(5ng/mL DAPI的洗滌緩衝液A)，以對比染色，使細胞核成像。本研究中使用的抗體列於補充關鍵資源表和RNA FISH探針如下：具Quasar 670染劑之人類TP53(Cat.VSMF-2423-5)，以及具Quasar 670染劑之人類CCND1(Cat.VSMF-2047-5)⁴⁵。

19. 免疫螢光(IF)染色

在實驗前24小時，將細胞在玻璃蓋玻片或室玻片上進行分代培養。之後使細胞在完全培養液中經歷指定時間的缺氧。將細胞以4%聚甲醛固定10分鐘。以0.1% Triton X-100通透化10分鐘，並與阻斷緩衝液(5% BSA)在室溫下靜置1小時。分別在4℃下以指定的一級抗體進行免疫染色整夜，然後使用經FITC 標記的或經PE標記的二級抗體進行成像。本研究中使用的二級抗體列於補充表9中。

20. 螢光共振能量轉移(FRET)試驗

產生螢光融合蛋白MSI1-pmOrange和AGO2-EGFP⁴⁶的質體，係共轉染至GBM細胞中。轉染後24小時，細胞經缺氧刺激。以冰冷的PBS洗滌細胞兩次，並以4%聚甲醛固定10分鐘。以514nm波長之雷射進行光漂白，暴露於最大強度下。GFP使用488nm的激發波長和520±20nm的發射波長，且mOrange光譜使用555nm的激發波長和580±20nm的發射波長。FRET能量轉移效率(E_f)以FRET_eff=(I_post-I_pre)/I_post計算，其中I_pre和I_post是漂白前後ROI的總螢光值⁴⁷。

21. 液相層析-質譜(LC-MS/MS)分析

如前所述，LC-MS/MS分析係使用LTQ Orbitrap(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)進行。簡而言之，每一經消化的胜肽樣品重製成20μl的0.1%甲酸(FA)溶液。首先將胜肽注入奈米流式HPLC(Agilent 1100,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)並進行分離，使用C18管柱(75μm ID×360μm OD×15cm；Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)，且一旦通過後續之奈米噴霧尖端(New Objective,Woburn,MA)，即成為電離粒子。在操作HPLC時，通過分流器後的流速為0.4μl/min。LC-MS/MS系統之LC梯度係於120分鐘內從2% ACN升至40% ACN，系統在自動數據相關採集設定下進行，模式為200-2000m/z全掃描，每次Orbitrap MS掃描最多有3個最強峰。具有+2或+3電荷狀態的胜肽進一步進行CID。使用Xcalibur(版本2.0 SR2)在原始數據文件中取得光譜。使用UniProt數據庫，經由TurboSEQUEST(Thermo Finnigan,San Jose,CA, USA)完成蛋白質辨識。一旦具有Xcorr>2.5的3種胜肽在定序中匹配出，便可確認該蛋白質⁴⁸。

22. PepSpot高通量胜肽平鋪陣列

為了快速篩選沿著MSI1的C-端假設的結合熱點，我們藉由將合成的短胜肽點在硝酸纖維素膜上，並與純化的AGO2蛋白一起靜置，來模擬表位篩選方法³⁹。將MSI1的C端(201-262)分成27個單獨的合成胜肽，其具有N-端胺連接在硝酸纖維素上。每一胜肽的長度為15個胺基酸，且具有8個胺基酸與前一個相鄰胜肽重疊(補充表IV)。購入的PepSpot膜(JPT peptide technologies,Berlin,Germany)首先以甲醇潤洗5分鐘，然後以補充有0.1% Tween-20的Tris緩衝生理食鹽水(TBS-T)洗滌三次。然後將膜以Superblock T20阻斷緩衝液(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)阻斷2小時，加入2μg具有His標籤的AGO2重組蛋白靜置整夜。該膜係以TBS-T洗滌三次，並在4℃下與辣根過氧化酶(HRP)偶聯的6xHis標籤一級抗體(Genetex Inc.,Hsinchu,Taiwan)靜置4小時。增強的化學發光試劑用於進一步墨點試驗。

23. 生物素化的胜肽合成和細胞穿透肽標記試驗

體外結合試驗係以我們的胜肽陣列篩選為基礎，以N-端生物素化的合成肽(補充表8)進行。合成的胜肽(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)溶解於10%DMSO，濃度為1mg/ml，並與等量的AGO2重組蛋白(各2μg)在T20阻斷溶液(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)中一起靜置。靜置16小時後，以經固定的鏈黴親和素(streptavidin)(Pierce 21115,Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)進行該胜肽之拉下(pull-down)試驗。將沉澱出的胜肽/蛋白質錯合物進行免疫墨點試驗，使用6xHis一級抗體(GeneTex Inc., Hsinchu,Taiwan)進行雜合和偵測。根據製造商的說明，使用Proteojuice(Millipore 71281,Merck Co.,Darmstadt,Germany)進行胜肽轉染。對於經體內相容的細胞穿透肽(CPP)修飾之胜肽而言，我們測試兩種不同C端的CPP，包括來自HIV的TAT(48-60)和精胺酸串聯重複(R7-R9)^50-52。

24. 分裂螢光酶重建報導子試驗

為了使用高斯螢光酶(Gluc)偵測蛋白質-蛋白質交互作用，我們將高斯螢光酶分裂成NGluc(N-端Gluc,106 a.a.)和CGluc(C-端Gluc,79 a.a.)^53,54。經由聚合酶連鎖反應(PCR)擴增此二片段，並分別藉由pcDNA 3.1和pCMV骨架與MSI1和AGO2構築融合蛋白。每一融合蛋白在蛋白質和分裂螢光酶^55,56的多胜肽之間含有彈性聯結物(GGGGS)₂。穩定細胞株係以該二融合蛋白表現質體穩定轉染05MG GBM細胞株而獲得，使用潮黴素B(Hygromycin B)(Sigma Aldrich Co., St.Louis,MI,USA)和G418硫酸鹽(Merck Co.,Berlin,Germany)。為了建立標準化標準，我們使用慢病毒將多個報導子基因轉導到上述穩定細胞株中，以穩定表現綠色螢光蛋白(GFP)、螢火蟲螢光酶(FLuc)和單純皰疹病毒第I型胸苷激酶(HSV1-tk)，如前所述⁵⁷。對於體外研究，將細胞在溫和的報導子裂解緩衝液(Promega Co.,Madison,WI,USA)中，以冷凍-解凍循環裂解。短暫離心後，收集上清液並分配到96孔黑色平底盤中。首先將GLuc的受質-腔腸素(Coelenterazine)(Nanolight Technologies,Ltd.,Pinetop,AZ,USA)溶解在甲醇中，並在報導子試驗緩衝液(15mM磷酸鉀、25mM甘胺基甘胺酸、15mM MgSO₄、4mM EDTA)中稀釋。將D-螢光素鈉鹽(Promega Co.,Madison,WI,USA)溶解於無菌水中，並稀釋於補充有2mM ATP的報導子試驗緩衝液中。生物發光訊號由Wallac 1420 Victor² Microplate Reader(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)獲得，其配備有自動分配器以避免GLuc的快速衰變。對於體內研究，在取得體內成像系統(IVIS 50,PerkinElmer,Waltham,MA,USA)之前，藉由吸入異氟醚(1%，於O₂補充下)麻醉該異種移植小鼠。經由尾靜脈注射腔腸素(coelenterazine)，每隻小鼠總共15μg，並在5分鐘內取得圖像。休息30分鐘後，小鼠從發光狀態回復；之後，小鼠進行腹膜內注射D-螢光素(150mg/kg)，用於腫瘤大小標準化。Living Image 4.2軟體自動選出感興趣區域(ROI)，並將其量化為每秒特定區域的光子通量(光子/s/cm²)。

25. 免疫組織化學染色和免疫墨點(IHC)

來自小鼠的腫瘤樣品以4%聚甲醛(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA)固定。將切片脫石蠟並在染色前再水合。在10mmol/L(pH 6)檸檬酸鹽緩衝液(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA)中煮沸10分鐘，以回收組織抗原。切片於PBS中冷卻10分鐘，之後以3% H₂O₂處理。將樣品於5mg/ml BSA(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA)之PBS溶液中阻斷30分鐘，之後與100倍稀釋的一級抗體雜合。根據製造商的指示，以TSA生物素系統(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)擴增訊號，之後以蘇木精(hematoxylin)(Sigma Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA,#201708)對比染色30分鐘⁵⁸。本研究中使用的抗體列於補充表9中。

26. 雷射捕捉微切割(LCM)

由經甲醛固定的石蠟包埋(FFPE)之每一樣品中切下連續切片(n=3-20，8μm)，並在4℃下儲存直至使用。切下4-μm厚的切片用於H & E染色。恰於LCM之前，將切片除去石蠟，以蘇木精染色1分鐘，經由酒精梯度脫水30秒，最後在二甲苯中再浸泡3分鐘並風乾。使用ArcturusXT Laser Capture Microdissector(Applied Biosystems-Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)，根據製造商的儀器指示進行微切割。使用ArcturusXT LCM儀器時，AutoScan^TM分析軟體模組得以實施，該儀器允許用戶目視檢查感興趣的區域。每一樣品捕捉大約5000個細胞，隨後用於以下研究。從每區塊切下兩個5-μm厚的切片，並置於無菌的1.5mL離心管中進行萃取。含有用於RNA純化之該切下的FFPE切片之試管，儲存在-80℃直至使用。包括小型RNA的總RNA，係根據說明書使用FFPE RNA分離套組(Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA,USA)萃取。RNA產率係以NanoDrop ND-1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)，由A 260/A 280吸光度比測定。

27. 表面等離子共振(SPR)的親和力測量

Biacore T200(GE Healthcare)係用於研究TAT-11和TAT-26胜肽與重組His-標記的AGO2蛋白之結合親和力。將重組His-AGO2和TAT胜肽稀釋於HBS-P緩衝液中(10mM HEPES、150mM NaCl和0.005% P20，pH 7.4)。為了評 估結合親和力，將重組His-AGO2固定在CM5感測器晶片上(GE Healthcare，BR100012)，經由胺基偶聯(~7000 RU)，以5μl/分鐘的速率進行3600秒，然後解離600秒。注射每一胜肽後，表面係經由注射10mM NaOH再生。所有感測圖皆進行雙重參考，藉由減去對照組流動胜肽的表面效應，以及空白緩衝液中的緩衝效應而進行。動力學數值Ka、Kd和K_D係使用Biacore T2000評估軟體(GE healthcare)獲得，假設為Langmuir 1：1結合模式。

28. 統計分析

數據係以來自至少三次獨立實驗的平均值±SD表示。使用學生T檢定進行統計分析。當p

0.05或p

0.01時，差異被認為是顯著的。

29. 數據可獲得性

作者可確認所有相關數據都包括在文章及/或其補充資訊檔案中。

結果

實施例1. MSI1的細胞內易位為其在緊迫下之促癌基因效應所必須

已經在數種腫瘤組織中報導了MSI1的過度表現^9,10,13-17。我們首先藉由免疫組織化學(IHC)染色在一組膠質瘤患者樣品上檢驗MS1I與腫瘤生成之間的相關性。我們發現高程度的MSI1表現與嚴重的癌症惡性腫瘤和復發呈正相關(補充圖1(a)和圖1(b))，並且與非復發樣品相較，亦觀察到復發性膠質瘤樣品中，具有顯著比例的細胞質性MSI1蛋白(圖1(a))。我們好奇是否MSI1可動態調節，以回應缺氧狀態或化學治療劑。為了解決這種可能性，我們首先將來自患有膠質母細胞瘤(GBM)的患者的人類神經膠質細胞05MG細胞暴露於缺氧處理。細胞暴露於缺氧下不會影響MSI1的總量，但會增加細胞質區室中的MSI1量(圖1(b)和圖 1(c))。親代GBM細胞(補充圖1(c))和胰導管腺癌(PDAC)細胞株獲得類似的結果(補充圖1(d))。加入萊普黴素B(Leptomycin B)(LMB)，其為一種細胞核輸出受器CRM1的抑制劑，在缺氧和順鉑治療後會強烈降低MSI1易位至細胞質內(圖1(b)、圖1(c)和補充圖1(e))，說明活化和CRM1-依賴性之MSI1易位，係回應環境緊迫。細胞內定位通常依賴於細胞核定位訊號(NLS)和細胞核輸出訊號(NES)。已報導在MSI的N-端結構域中有兩個NLS位點²⁴(圖1(d))。我們在MSI1的C端辨識出潛在的NES模體(263-LTAIPL-268)，並確認此模體的功能(圖1(d)和補充圖1(f))。產生MSI1的NLS和NES模體的突變體；經Flag標記的野生型MSI1(MSI1-wt)、NES-突變體MSI1(MSI1-NES-mut)和NLS-突變體MSI1(MSI1-NLS-mut)，係於GBM細胞中穩定表現(圖1(e))。在缺氧條件下，MSI1-NES-mut和MSI1-NLS-mut分別位於細胞核和細胞質中，而MSI1-wt易位至細胞質(圖1(e))，說明NES模體在緊迫處理下之MSI1的細胞內易位中扮演主動角色。

我們接下來研究了MSI1易位的生物學後果。體外功能試驗顯示，與親代MSI1-NES-mut和MSI1-NLS-mut過度表現細胞相較，過度表現MSI1-wt的細胞表現出細胞凋亡減少，以及增殖和存活率增加(補充圖1(g)、1(h)和1(i))。一致地，體內研究顯示過度表現MSI1-wt的GBM細胞之異種移植物，比親代或突變GBM細胞生長出明顯更大的腫瘤(圖1(f)和圖1(g))。MSI1及其在異種移植物中的突變體之細胞內定位(圖1(g)和圖1(h))，與圖1e中觀察到的一致。我們使用順鉑治療皮下或原位異種移植物，進一步探討MSI1在氧化壓力下穿梭於GBM的結果(圖1(i))。與我們之前的實驗(圖1(f)和圖1(g))相較，順鉑治療會增強過度表現MSI1-wt的異種移植物之腫瘤生長(在第22天為774.365mm³ vs 477.437mm³腫瘤體積)(圖1(j)和圖1(k))。與其他組相較，顱內植入過量表現MSI1-wt並後續以順鉑處 理的異種移植物的小鼠，顯示出相當大的腫瘤侵襲(圖1(l))，說明MSI1的細胞核-細胞質穿梭，會嚴格控制其在致瘤性中的生物學功能。綜上，我們的研究結果表明，緊迫誘導的MSI1易位是其促致癌基因功能所必需的。

實施例2. 細胞質性MSI1直接結合至AGO2，以調節其標靶mRNA的表現

為了探討MSI1穿梭促進緊迫誘導之腫瘤生成的潛在分子機制，我們以質譜分析鑑定出MSI1交互作用蛋白。在常氧或缺氧條件下，05MG細胞的細胞質分液中的經Flag標記的MSI1蛋白錯合物，係經純化和鑑定²⁵(圖2(a)和補充圖2(a))。在與緊迫反應相關的交互作用蛋白中(補充圖2(b))，我們發現在GBM和PDAC癌細胞中，缺氧緊迫會顯著增強細胞質性MSI1對於AGO2的召集作用(圖2(b)和補充圖2(c)和2(d))。在體外結合試驗中證實重組MSI1和AGO2之間的直接交互作用(圖2(c))。螢光共振能量轉移(FRET)顯微圖(圖2(d)和補充圖2(f))，以及經順鉑處理(補充圖2g)和缺氧處理(補充圖2(h))的細胞之共聚焦顯微鏡結果，證實緊迫誘導的MSI1和AGO2之間的交互作用。我們接下來研究AGO2是否對MSI1的致癌功能至關重要。體外功能試驗顯示，MSI1過度表現細胞中的AGO2減弱(knockdown)(補充圖2(i))，會抑制存活率(圖2(e))和增殖(圖2(f))，此係經由增強的胞凋亡而達成(補充圖2(j))。同時，體內研究顯示AGO2減弱會抵消MSI1-加強的腫瘤生長(圖2(g))。這些數據顯示，AGO2為MSI1涉及癌症發展的重要下游效應因子。為了鑑定出緊迫誘導的AGO2-MSI1交互作用的功能角色，我們進行RNA免疫沉澱定序(RIP-Seq)，經由分別拉下(pull down)MSI1和AGO2而進行，並辨識出與MSI1/AGO2錯合物結合的336個共用mRNA標靶(補充圖3a-b)。與MSI1和AGO2二者皆相關的mRNA的基因功能分類(GO)分析顯示出細胞週期進程和凋 亡途徑的富集(補充圖3(c))，與我們觀察到的細胞表型一致。我們進一步證實在缺氧時，MSI1/AGO2錯合物會與一些mRNA標靶結合(補充圖3(d)和3(e))，並研究MSI1/AGO2的結合對於336個共同標靶mRNA之表現量的影響。穩態mRNA量係以在常氧或缺氧條件下培養的對照組、MSI1-和AGO2-減弱細胞中的微陣列分析。有趣的是，我們觀察到兩組不同的mRNA標靶，第一組(組1)富集凋亡基因，在缺氧條件下減弱MSI1和AGO2後，表現出增加的mRNA量，第二組(組2)基因主要涉及細胞循環調節，顯示出相反的調節趨勢(圖2(h))。我們從每組中選出三個mRNA標靶-來自第1組的NF2、TP53和p21，以及來自第2組的CCND1、CDK4、HELLS-並以經放線菌素D處理的細胞來評估它們在常氧和缺氧下的降解速率(圖2(h))。在對照組細胞中，缺氧緊迫降低第1組mRNA的半衰期，同時增加了第2組mRNA的穩定性。相較之下，我們觀察到MSI1-和AGO2-減弱細胞中的相反作用(圖2(i))，說明MSI1/AGO2錯合物可穩定回應與細胞週期相關的mRNA標靶亞群(第1組)，以後續促進腫瘤進展。隨著這個想法，MSI1/AGO2的結合亦可以負向調節與細胞凋亡相關的另一亞群mRNA標靶的穩定性(第2組)，以確保癌細胞存活。我們經由qPCR驗證我們的假設，並證實存在兩種不同類型的調節：1)來自第1組的mRNA標靶的穩定性在缺氧時降低；以及2)來自第2組的mRNA標靶在缺氧後仍然以相似量表現(圖2(j))。值得注意的是，AGO2對於緊迫-誘導和MSI1-介導的下游mRNA調節是必需的，因為MSI1-過度表現細胞中的AGO2減弱會抵消對第1組和第2組mRNA穩定性的調節(補充圖3(f))。與細胞質性MSI1-AGO2交互作用一致，我們發現過度表現MSI1突變體的細胞具有偏離的細胞內定位，重新獲得了mRNA穩定性的功能性結果，類似於由於缺氧引起的MSI1減弱所導致 者(圖2(k))。這種相反的效果亦於異種移植小鼠模型(補充圖4(a)和圖4(b))的體內試驗觀察到，其中證實了MSI1/AGO2的交互作用(補充圖4(c))。

實施例3. MSI1/AGO2與其標靶上特異性位置的結合介導不同的mRNA命運

為了解密MSI1/AGO2錯合物調節mRNA穩定性的分子機制，我們在常氧和缺氧條件下的對照組、MSI1-和AGO2-減弱細胞中進行RIP實驗。有趣的是，MSI1會在常氧和缺氧條件下與其mRNA標靶結合，而AGO2僅在缺氧條件下與其標靶結合(圖3(a))。AGO2的減弱不影響MSI1與其mRNA標靶的結合，而MSI1的減弱卻阻礙了AGO2的召集(圖3(a))，說明在缺氧條件下，MSI1-依賴性召集AGO2至mRNA標靶。我們接著研究MSI1穿梭對MSI1-mRNA錯合物形成的影響。為此，我們在常氧和缺氧條件下，使用培養的過量表現MSI1-wt的細胞之細胞質與細胞核分液進行RIP實驗。我們發現在常氧條件下，MSI1-mRNA錯合物位於細胞核中，缺氧時它們富集在細胞質中(圖3(b)，右上圖)，說明MSI1-mRNA錯合物會回應缺氧條件，主動易位至細胞質中。當MSI1無法穿梭進入細胞質(MSI1-NES-mut)時，MSI1-mRNA錯合物如預期一樣保留在細胞核區室中(圖3(b)，右中圖)。令人驚訝的是，MSI1的細胞質突變體(MSI1-NLS-mut)無法結合RNA(圖3(b)，下圖)。然而，這不是由於MSI1-NLS-mut的RNA結合特性被破壞，因為這兩種MSI1突變體都表現出與MSI1-wt類似的標靶RNA序列結合親和力(補充圖5(a)和5(b))。我們的數據顯示，MSI1首先需要在細胞核中與其標靶mRNA結合，之後再將它們帶入細胞質中，以回應缺氧狀況。一致地，MSI1-mRNA錯合物召集AGO2係於細胞質中發生(圖3(b)，左上圖)。然而，MSI1-NLS-mut不與AGO2相互作用(圖3b，左下圖)，說明它們的交互作用在細胞質中是RNA-依賴性的。接著，我們 進一步鑑定出MSI1-AGO2錯合物在其mRNA標靶上的結合區域，藉由進行RIP之後進行RNA片段化和qPCR(RIP-qPCR)而達成。我們發現，為了回應缺氧條件，MSI1/AGO2錯合物結合第1組標靶mRNA的三個主要非轉譯(3'-UTR)區域，同時它結合了第2組的編碼序列(CDS)區域(圖3(C))。總體而言，我們的數據顯示，在缺氧時，MSI1與其結合的mRNA標靶會易位至細胞質中，之後召集AGO2，以介導兩種不同類型的轉錄後調節：藉由結合其3'-UTR而降解mRNA(第1組)，以及藉由結合其CDS而穩定mRNA標靶(第2組)(圖3(d))。

實施例4. 破壞MSI1/AGO2交互作用而抑制腫瘤生長並改變mRNA的調節

當MSI1與AGO2結合以經由mRNA調節而促進腫瘤生成時，我們好奇MSI1/AGO2交互作用的破壞是否會影響由細胞質性MSI1驅動的腫瘤生長。為此，我們首先使用MSI1的缺失突變體描繪MSI1/AGO2交互作用(補充圖6(a))。我們藉由將MSI1的經純化全長、N端或C端結構域，與經純化的AGO2蛋白一起靜置進行體外結合試驗，發現AGO2傾向於與MSI1的C端結構域交互作用(補充圖6(b))。我們接著研究MSI1的C端結構域(圖4(a))是否可以作為誘餌，以消除MSI1/AGO2的蛋白質-蛋白質交互作用。Flag對照組(Flag)或經Flag標記的MSI1 C-端(Flag-C-term)，係於GBM細胞中短暫表現，之後在正常和缺氧條件下，對內源性MSI1進行免疫沉澱。我們發現Flag-C-term的過度表現會破壞內源性MSI1和AGO2之間的交互作用(圖4(b))，證實MSI1 C-端結構域在此蛋白質-蛋白質交互作用中的重要性。共聚焦顯微鏡進一步證實，經Flag-C-term轉染的細胞中，內源性MSI1和AGO2的未偶聯共定位(圖4(c))。為了精確確定Flag-C-term生物學效應的分子機制，我們進行了RIP-qPCR實驗，並證明Flag-C-term會干擾將AGO2召集至 其mRNA標靶，在3'UTR和CDS區域皆是(圖4(d))。之後我們分析MSI1/AGO2 mRNA標靶的表現並顯示，在經Flag-C-term轉染的細胞中，與對照細胞相較，缺氧後第1組mRNA標靶的表現增加，而第2組標靶的表現降低(圖4(e))。我們進一步經由分析經Flag或Flag-C-term轉染的細胞之細胞存活率而評估MSI1/AGO2錯合物破壞的下游效應。我們的結果顯示Flag-C-term表現後，細胞存活百分比降低(圖4(f))，這與軟瓊膠集落數量減少一致(圖4(g))，且膜聯蛋白V-陽性細胞的百分比增加(圖4(h))。綜上，這些結果顯示，藉由破壞MSI1/AGO2交互作用，Flag-C-term抑制集落生長並促進細胞凋亡。為了測試MSI1 C-端的治療效力，我們啟動了一項體內研究，其中將癌細胞植入小鼠的每一側，隨後進行Flag對照組或Flag-C-term的腫瘤內轉染(圖4(i))。我們觀察到來自MSI1-過度表現的GBM細胞或MIA-PaCa2胰腺癌細胞的腫瘤生長，由於投予Flag-C-term而被強烈延遲(圖4(j)和圖4(k)和補充圖6(c))。總體而言，我們的研究結果顯示，以MSI1-C-term誘餌破壞MSI1/AGO2交互作用，會抑制腫瘤生長，係藉由阻斷AGO2召集至其標靶mRNA，並隨後改變其穩定性而達成。

實施例5. 誘餌胜肽藉由與AGO2結合而干擾MSI1/AGO2的結合

以我們進行C-端誘餌的結果為基礎，我們隨後研究臨床使用較小胜肽來阻斷腫瘤生成的可能性。為此，我們首先使用客製化的胜肽陣列(PepSpot,JPT Inc.)精確決定MSI1與AGO2的交互作用結構域。此陣列點上有相互重疊的連續胜肽以覆蓋MSI1的整個C-端，然後與重組AGO2蛋白一起靜置。在27個胜肽中，AGO2傾向於與胜肽11和26結合(圖5(a))。發現至少兩種能夠與AGO2結合的胜肽分別具有YQFPEFRVERTPLPS和HSLGGPLIATAFTNG的胺基酸序列。之後我們的候選序列與HIV-1 Tat(48-60)細胞穿透胜肽(CPP)相結合，以促進細胞攝取 能力並增進體內轉導效率。我們發現經TAT標記的胜肽，即TAT-11和TAT-26，可有效消除MSI1/AGO2交互作用(圖5(b))。我們接著驗證這些胜肽是否對體內研究有效。我們開發了裂解螢光酶互補試驗，以偵測體內蛋白質-蛋白質交互作用。我們將Gaussia螢光酶(Gluc)分成兩個片段，N-端和C-端，其分別與MSI1和AGO2融合。在MSI1/AGO2交互作用後，兩個Gluc片段結合在一起，以重建螢光酶活性，使得在螢光酶受質存在下會發光(補充圖6d)。使用體內成像系統(IVIS)，我們顯示在順鉑存在下生物發光訊號增加(補充圖6(e)和圖6(f))，證實在緊迫條件下之體外與體內MSI1/AGO2蛋白質-蛋白質交互作用。接著，我們測試TAT-11和TAT-26胜肽的抑制作用，並顯示它們在體外和體內顯著降低生物發光訊號(圖5(c))，說明胜肽的競爭作用會降低MSI1和AGO2之間的交互作用。為了辨識誘餌胜肽如何與AGO2結合，我們測定這些胜肽在AGO2錯合物中的結構。我們使用分子嵌合(docking)網站(http：//galaxy.seoklab.org/index.html)來預測胜肽和AGO2之間的結合模式。晶體結構顯示TAT-11和TAT-26藉由氫鍵與AGO2的PIWI結構域交互作用(圖5(d))，而不會明顯改變AGO2的結構。共聚焦顯微鏡證實誘餌胜肽會穿透細胞並與細胞質中的內源性AGO2結合(圖5f)。我們亦評估胜肽和AGO2重組蛋白之間的親和力，藉由表面等離子體共振(SPR)而達成，並且顯示TAT-11和TAT-26的平衡解離常數(K_D)分別為3.33和4.63μM。總之，我們辨識出在MSI1 C-端與AGO2結合的特異性結合序列，且模擬這些序列的胜肽能夠與AOG2結合，並可在體外破壞MSI1/AOG2交互作用。

實施例6. 誘餌胜肽阻斷MSI1/AGO2交互作用而抑制腫瘤生成

為了決定誘餌胜肽與內源性MSI1競爭AGO2的效率，係使用經螢光素標記的HIV-TAT胜肽(TAT(FAM))進行螢光基礎偵測，以評估細胞之吸收速 率、濃度(KC50)和穩定性。誘餌胜肽之半最大反應濃度(KC50)為約9μM(圖6(a)和圖6(b))。此外，在1小時內發現TAT-11和TAT-26的顯著細胞吸收(補充圖7(a)和7(b))；而05MG細胞中，TAT-11和TAT-26的降解半衰期可達4小時(補充圖7(c)和7(d))。此外，MSI1/AGO2結合對下游mRNA的影響可被TAT-11和TAT-26胜肽逆轉(補充圖8(a))。為了評估胜肽療法的潛力，將MSI1過度表現的05MG細胞、MIA-PaCa2胰臟癌細胞、Pt 3和Pt 11初代GBM細胞皮下移植到小鼠中。一旦偵測到腫瘤，我們就進行腫瘤內注射TAT-11/TAT-26胜肽組合(150μg)，並觀察到衍生自MSI1過度表現的GBM細胞、親代GBM(Pt 3和Pt 11)或胰臟癌(MIA-PaCa2)的腫瘤生長，可藉由注射該胜肽而明顯降低(圖6(c)、6(d)和6(e))。腫瘤組織的免疫染色證實在胜肽處理下，內源性MSI1和AGO2保留在細胞質中，但無交互作用(補充圖8(b)和圖8(c))。此外，開發出原位異種移植小鼠模型，然後將組合的TAT-11/TAT-26胜肽注射到腫瘤部位內(圖6(f))。與對照組小鼠相較，以TAT-11/TAT-26胜肽處理的小鼠腫瘤大小顯著降低(圖6(g))。此外，注射胜肽的腫瘤顯示Ki67表現的嚴重減少，Ki67表現是與細胞增殖相關的標誌物(圖6(g)，右圖)。有趣的是，與對照組相較，以TAT-11/TAT-26胜肽處理並進行順鉑治療的小鼠，其移植有05MG細胞株或來自復發性GBM腫瘤的初代培養細胞，表現出顯著延長的壽命(圖6(h))，此說明TAT-11/TAT-26胜肽可藉由阻斷MSI1/AGO2交互作用來增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。在胰臟腫瘤異種移植小鼠模型中注射TAT-11/TAT-26胜肽，獲得類似的腫瘤生長結果(圖6(i)-6(1))。對異種移植腫瘤樣品的分析顯示，TAT-11/TAT-26胜肽對腫瘤生長(圖6(j))、MSI1/AGO2交互作用(圖6(k))和下游mRNA標靶的有效性(圖6(1))。綜上，我們的結果證實阻斷MSI1/AGO2交互作用的小型胜肽，對腫瘤生長和對化療藥物敏感性具強大治療潛力。

實施例7. MSI1/AGO2途徑在腫瘤復發的患者中被強化

細胞質性MSI1與AGO2結合會經由RNA調節以促進緊迫誘導的腫瘤生長。我們發現，在高度膠質瘤患者樣品中，顯著比例的MSI1為細胞質性(圖1(a))，但仍不清楚MSI1/AGO2路徑是否主動涉及患者的致瘤性，並且還可能對腫瘤復發有影響。為了解決此一問題，我們收集了來自初次手術後同時接受化療的患者之18對原發性和復發性GBM樣品(補充表1)，並經由IHC染色分析其MSI1的細胞內定位。我們發現在GBM復發樣品中顯著比例的MSI1蛋白是細胞質性，而在原發性GBM樣品的細胞質中幾乎偵測不到MSI1(圖7(a))。之後我們藉由雷射捕捉微切割術(LCM)，從腫瘤(T)和非腫瘤基質(S)收集組織樣品²⁶，並經由qPCR分析MSI1標靶mRNA的表現量。我們觀察到，就每對樣品而言，與原發性GBM相較，復發性GBM中與細胞凋亡相關的mRNA標靶之表現減少(第1組)，而與細胞週期相關的mRNA標靶的表現增加(第2組)(圖7(b))。在一組原發性(n=67)和復發性(n=32)GBM患者的追蹤調查中也觀察到相同的結果(圖7(c)和補充表2)。這些結果顯示，在復發性GBM患者中，MSI1/AGO2途徑被增強，以促進腫瘤生長並確保癌細胞存活。

為了解決MSI1/AGO2途徑與腫瘤復發之間的相關性是否可以推衍至其他癌症類型，我們從患有胰導管腺癌(PDAC)的患者中收集樣品，並且在 非復發性(n=18)與復發性(n=61)PDAC樣品中，進行MSI1的IHC染色(補充表3)。我們觀察到約5%的非復發性胰臟樣品顯示MSI1位於細胞質中(1/18病例；數據未顯示)，而60%的復發PDAC樣品(37/61病例)顯示細胞質性MSI1(圖7(d))，說明細胞質性MSI1與腫瘤復發有關。藉由分析復發性PDAC樣品的臨床數據，我們觀察到細胞質性MSI1-陽性的復發性PDAC患者，總體上比細胞質性MSI1-陰性的患者存活率更低(圖7(e))。我們進一步分析了37例細胞質性MSI1-陽性的復發PDAC病例，並根據IHC染色評分(IHC<0.5或IHC>0.5)對其進行分類。我們發現，高分(IHC>0.5)的患者組的生存結果低於低分組(IHC<0.5)(圖7(f)和圖7(g))，說明細胞質性MSI1的量可以預測患者的生存。總體來說，結果顯示細胞質性MSI1/AGO2途徑在腫瘤復發患者中會被增強，並與患者存活有關，這使得使用阻斷MSI1/AGO2交互作用的小型胜肽作為腫瘤復發治療的治療敏化劑是可行的(圖8)。

所提供的描述和申請專利範圍應被理解為說明性目的，而不是以任何方式限制本發明的範圍。

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<223> 胜肽

<400> 281

<210> 282

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 282

<210> 283

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 283

<210> 284

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 284

<210> 285

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 285

<210> 286

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 286

<210> 287

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 287

<210> 288

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 288

<210> 289

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 289

<210> 290

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 290

<210> 291

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 291

<210> 292

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 292

<210> 293

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 293

<210> 294

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 294

<210> 295

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 295

<210> 296

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 296

<210> 297

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 297

<210> 298

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 298

<210> 299

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 299

<210> 300

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 300

<210> 301

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 301

<210> 302

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 302

<210> 303

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 303

<210> 304

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 304

<210> 305

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 305

<210> 306

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 306

<210> 307

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 307

<210> 308

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 308

<210> 309

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 309

<210> 310

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 310

<210> 311

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 311

<210> 312

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胜肽

<400> 312

Claims (2)

1. 一種破壞Musashi-1(MSI1)/Argonaute 2(AGO2)交互作用之試劑用於製造阻斷緊迫導致腫瘤生成之藥物之用途，其中該破壞MSI1/AGO2交互作用之試劑為一MSI1誘餌胜肽，該MSI1誘餌胜肽為一具有SEQ ID NO：284或SEQ ID NO：299胺基酸序列之胜肽。
2. 一種破壞Musashi-1(MSI1)/Argonaute 2(AGO2)交互作用之試劑用於製造預防或治療腫瘤生成或腫瘤復發之藥物之用途，其中該破壞MSI1/AGO2交互作用之試劑為一MSI1誘餌胜肽，該MSI1誘餌胜肽為一具有SEQ ID NO：284或SEQ ID NO：299胺基酸序列之胜肽。

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