WO2022054976A1 - 전립선암 진단 점수 계산 방법 및 그 용도 - Google Patents

전립선암 진단 점수 계산 방법 및 그 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2022054976A1
WO2022054976A1 PCT/KR2020/012128 KR2020012128W WO2022054976A1 WO 2022054976 A1 WO2022054976 A1 WO 2022054976A1 KR 2020012128 W KR2020012128 W KR 2020012128W WO 2022054976 A1 WO2022054976 A1 WO 2022054976A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
value
prostate cancer
sample
subject
mir
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/012128
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김원재
정필두
Original Assignee
(주)유로테크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)유로테크 filed Critical (주)유로테크
Priority to EP20953378.5A priority Critical patent/EP4212632A4/en
Priority to PCT/KR2020/012128 priority patent/WO2022054976A1/ko
Priority to JP2022581715A priority patent/JP2023540426A/ja
Publication of WO2022054976A1 publication Critical patent/WO2022054976A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H10/00—ICT specially adapted for the handling or processing of patient-related medical or healthcare data
    • G16H10/40—ICT specially adapted for the handling or processing of patient-related medical or healthcare data for data related to laboratory analysis, e.g. patient specimen analysis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/30—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for calculating health indices; for individual health risk assessment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation

Definitions

  • the present invention is a technology for calculating a diagnostic score that can provide information on the diagnosis of the onset of prostate cancer by measuring the expression level of a biomarker contained in the urine of a subject.
  • a standard method for diagnosing prostate cancer is to collect a small amount of prostate tissue from a subject and then perform a biopsy to determine whether cancer cells have developed.
  • the biopsy entails a very painful process for the subject, it is not appropriate to perform the biopsy only because it shows symptoms suspected of developing prostate cancer (eg, urination symptoms such as frequent urination and dysuria). Therefore, if a subject shows symptoms suspected of developing prostate cancer, first, the subject's body fluid (eg, blood or urine) is collected and indirectly tested for prostate cancer, and based on the results, it is determined whether a biopsy is necessary.
  • the subject's body fluid eg, blood or urine
  • PSA test is generally performed by collecting blood from a subject and measuring the concentration of a prostate specific antigen (PSA) in a blood sample.
  • PSA test is controversial in its accuracy and diagnostic ability, the development of a reliable non-invasive prostate cancer diagnosis method is required.
  • An object of the present specification is to provide a method of calculating a diagnostic score that can provide information on whether a subject has prostate cancer.
  • An object of the present specification is to provide a method for determining a diagnostic test criterion based on the diagnostic score.
  • An object of the present specification is to provide a method for providing information on diagnosis of prostate cancer using the diagnostic score.
  • a method of calculating a diagnostic score for prostate cancer by combining at least two values comprising: preparing a sample of a subject, wherein the sample is a urine sample; A process of obtaining a first value related to the content of a first target in the sample, wherein the first target is hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679 derived from extracellular vesicles contained in the sample , and the first value reflects first information having a diagnostic ability on whether or not the subject has prostate cancer, provided that the first value cannot be used alone for diagnosing whether or not the prostate cancer develops, which is the first This is because the value reflects the first noise together with the first information, and the first noise is caused by an endogenous factor, the endogenous factor being independent of the prostate cancer-related factor; A process of obtaining a second value related to the content of a second target in the sample, wherein the second target is an extracellular vesicle-derived miRNA in the sample, and the second value is
  • the second target is hsv2-miR-H9-5p, or hsa-miR-1913.
  • the diagnostic score is calculated as a ratio of the first value and the second value.
  • the endogenous factor comprises: a first condition associated with the sample; and a second condition associated with the subject.
  • the first condition is one or more selected from the group consisting of: the amount of the sample, the collection time of the sample, the method of collecting the sample, the storage period of the sample, the storage temperature of the sample, A method of subdivision of the sample.
  • the second condition is one or more selected from the group consisting of: the subject's gender, the subject's age, the subject's race, the subject's weight, the subject's kidney function, and the subject's hydration status.
  • the process of obtaining the first value may include: synthesizing a first cDNA of a first target in the sample; A process of amplifying the first cDNA by a polymerase chain reaction using a first primer, wherein the first primer is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 2; and determining the first value from the first cDNA amplification result.
  • the process of obtaining the second value may include: synthesizing a second cDNA of a second target in the sample; A process of amplifying the first cDNA by a polymerase chain reaction using a second primer, wherein the second primer is a sequence having homology with the second target, or with the second target It includes a sequence capable of complementary binding, and further comprises the step of determining the second value from the second cDNA amplification result.
  • the second target is hsv2-miR-H9-5p, or hsa-miR-1913, and the second primer is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 and 5.
  • a process of acquiring a first dataset wherein the first dataset includes a list of whether each subject in a cohort has prostate cancer, and each subject in the cohort for, a list of diagnostic scores calculated according to the method for calculating a diagnostic score for prostate cancer, wherein the cohort includes at least one normal subject or subject with an enlarged prostate, and at least one subject with prostate cancer; and determining a diagnostic criterion for diagnosing prostate cancer from the first dataset.
  • the diagnostic criterion is a single value having the same dimension as the diagnostic score.
  • the diagnostic criterion includes one or more prostate cancer incidence probability values.
  • a method of providing information for diagnosing whether a subject has prostate cancer comprising: calculating a prostate cancer diagnosis score for the subject according to the diagnosis score calculation method; And with the prostate cancer diagnosis score, it provides a method comprising the process of determining a risk factor with reference to at least one predetermined value.
  • the predetermined value is a diagnostic criterion determined according to the method for determining the diagnostic criterion.
  • diagnostic score calculation method it is possible to provide information for diagnosing prostate cancer non-invasively with a urine sample of a subject.
  • FIG. 1 shows a flowchart of a method for calculating a prostate cancer diagnosis score.
  • the process of acquiring the first value and the process of acquiring the second value represent processes that can be independently performed in parallel.
  • Example 2 is a graph showing the statistical significance of the difference between the prostate hypertrophy target group (BPH) and the prostate cancer onset target group (PCa) of the diagnostic scores of Examples 1 and 2 for the entire experimental group.
  • BPH prostate hypertrophy target group
  • PCa prostate cancer onset target group
  • Example 3 is a graph showing the statistical significance of the difference between the prostate enlargement target group (BPH) and the prostate cancer onset target group (PCa) of the diagnostic scores of Examples 3 and 4 for the entire experimental group.
  • BPH prostate enlargement target group
  • PCa prostate cancer onset target group
  • Example 4 is a graph showing the statistical significance of the difference between the prostate enlargement target group (BPH) and the prostate cancer onset target group (PCa) of the diagnostic scores of Examples 5 and 6 for the entire experimental group.
  • BPH prostate enlargement target group
  • PCa prostate cancer onset target group
  • FIG. 5 is a graph showing the statistical significance of the difference between the prostate enlargement target group (BPH) and the prostate cancer onset target group (PCa) of the diagnostic scores of Comparative Examples 1 and 2 for the entire experimental group.
  • BPH prostate enlargement target group
  • PCa prostate cancer onset target group
  • Example 6 is a diagram of the difference between the target group for PSA gray zone (3 to 10 ng/mL) and the target group for prostate cancer (PCa) in the diagnostic scores of Examples 1 and 2 It is a graph showing statistical significance.
  • Example 7 is a diagram of the difference between the hypertrophy of the prostate (BPH) and the target group of prostate cancer (PCa) in the diagnostic scores of Examples 3 and 4 for the PSA gray zone (3 to 10 ng/mL) group. It is a graph showing statistical significance.
  • FIG. 8 is a graph showing the difference between the hypertrophy of the prostate (BPH) and the target group of prostate cancer (PCa) in the diagnostic scores of Examples 5 and 6 for the PSA gray zone (3 to 10 ng/mL) group. It is a graph showing statistical significance.
  • 10 is a graph showing the ROC curve of the PSA test for the entire target group.
  • FIG. 11 is a graph showing ROC curves of Examples 1 and 2 for the entire target group.
  • FIG. 12 is a graph showing ROC curves of Examples 3 and 4 for the entire target group.
  • FIG. 13 is a graph showing the ROC curves of Examples 5 and 6 for the entire target group.
  • the diagnostic performance did not meet the standard, the values of sensitivity and specificity are not separately shown.
  • FIG. 14 is a graph showing ROC curves of Comparative Examples 1 and 2 for the entire target group.
  • the diagnostic performance did not meet the standard, the values of sensitivity and specificity are not separately shown.
  • 15 is a graph showing the ROC curve of the PSA test for the target group of the PSA gray zone (3 to 10 ng/mL). At this time, since the diagnostic performance did not meet the standard, the values of sensitivity and specificity are not separately shown.
  • FIG. 16 is a graph showing ROC curves of Examples 1 and 2 for a target group of PSA gray zone (3 to 10 ng/mL).
  • FIG. 17 is a graph showing ROC curves of Examples 3 and 4 for a target group of PSA gray zone (3 to 10 ng/mL).
  • ROC curves of Examples 5 and 6 are a graph showing ROC curves of Examples 5 and 6 for a target group of PSA gray zone (3 to 10 ng/mL).
  • the diagnostic performance did not meet the standard, the values of sensitivity and specificity are not separately shown.
  • FIG. 19 is a graph showing ROC curves of Comparative Examples 1 and 2 for a target group of PSA gray zone (3 to 10 ng/mL).
  • the diagnostic performance did not meet the standard, the values of sensitivity and specificity are not separately shown.
  • the term “about” refers to 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7 with respect to a reference amount, level, value, number, frequency, percent, dimension, size, amount, weight or length. , means an amount, level, value, number, frequency, percent, dimension, size, amount, weight or length varying by as much as 6, 5, 4, 3, 2 or 1%.
  • the term “subject” refers to an organism that is an object exposed to a specific substance (eg, a peptide, etc.).
  • the subject may refer to an independent organism such as a human or an animal, or may refer to a part of the independent organism such as a part of a tissue or a cell. This meaning may be appropriately interpreted according to the context.
  • the term “object” may include all other meanings recognized by those skilled in the art.
  • diagnosis refers to all direct and indirect actions of determining whether a subject is related to a specific disease.
  • “relationship with a specific disease” may include information on whether the disease has occurred, and whether the disease has progressed.
  • diagnosis a specific disease includes not only determining whether the specific disease has occurred, but also determining the probability, risk, and/or probability that the specific disease has occurred. should be broadly understood. This meaning may be appropriately interpreted according to the context.
  • the term “diagnosis” may include all other meanings recognized by those of ordinary skill in the art.
  • biomarker generally refers to an indicator capable of detecting changes in a subject's body, and refers to proteins, DNA, RNA, and/or other metabolites.
  • the term biomarker in a narrower sense, also refers to a target substance (eg, a specific protein or miRNA) that reflects information on whether the target has a specific disease.
  • micro RNA refers to a small non-expressing RNA molecule of 20 to 25 nucleotides found in plants, animals, viruses, and the like. It is known that miRNA functions such as regulating gene expression. miRNAs are found not only in cells but also extracellularly, and especially in humans, they are found in almost all body fluids in the body, such as urine, saliva, and tears, as well as serum and plasma. Therefore, research to use miRNA found in extracellular space as a diagnostic biomarker for a specific disease (eg, cancer) is being actively conducted.
  • the term “” or “micro RNA” may include all other meanings recognized by those skilled in the art.
  • extracellular vesicle refers to a particle-type structure with no self-replication function surrounded by a cell-derived lipid bilayer.
  • the diameter of the extracellular vesicles varies widely, ranging from about 20-30 nanometers to about 10 microns.
  • the extracellular vesicles perform various functions in the body of a subject, and a typical function of encapsulating proteins, lipids, etc. having various functions in the extracellular vesicles is to transport them to the outside of the cell.
  • the extracellular vesicles are ectosomes, microvesicles, microparticles, exosomes, apoptotic bodies, large oncosomes, and exophers. It is referred to as including all, but is not limited thereto.
  • the term "extracellular vesicle” may include all other meanings recognized by those skilled in the art.
  • a standard method for diagnosing prostate cancer is to collect a small amount of prostate tissue from a subject and then perform a biopsy to determine whether cancer cells have developed.
  • the biopsy entails a very painful process for the subject, it is not appropriate to perform the biopsy only because it shows symptoms suspected of developing prostate cancer (eg, urination symptoms such as frequent urination and dysuria). Therefore, when a subject shows symptoms suspected of developing prostate cancer, it is common to first determine whether a biopsy is necessary through a PSA test.
  • the PSA test is a diagnostic method for estimating the probability that a subject has prostate cancer by taking blood from a subject and measuring the concentration of a prostate specific antigen (PSA) in the blood sample.
  • PSA prostate specific antigen
  • the PSA test is a type of diagnostic method that collects blood from a vein of a subject suspected of developing prostate cancer, measures the concentration of prostate-specific antigen (PSA) in the blood, and predicts the probability of developing prostate cancer according to the concentration.
  • PSA prostate-specific antigen
  • Prostate-specific antigen is a protein primarily produced by cells in the prostate.
  • the PSA is included in a small amount in the blood of a normal subject who has not developed prostate cancer, the concentration generally tends to increase in the blood of a prostate cancer patient.
  • the concentration of PSA in the blood can be usefully used as an indicator for the development of prostate cancer, 1) the concentration of PSA in the blood tends to increase with age in general, 2) depending on the type of prostate cancer, In light of the fact that there are cases in which the concentration of PSA in the blood does not rise even after cancer has developed, there is a divided opinion among experts on the accuracy of the PSA. Although the specific values vary slightly in each literature, in general, when the PSA concentration in the blood is measured within the range of 3 ng/mL to 10 ng/mL, it is difficult to determine whether a subject is a risk group for prostate cancer with a PSA test alone ( is considered to be in the gray zone).
  • diagnosis through a biopsy is essential. This is done through a method of directly examining whether there are cancer cells by collecting a small amount of the target prostate tissue. This is very painful for the patient because 1) the test needle is pierced through the anus of the subject to collect the necessary sample, and 2) it only collects the sample around the area where the test needle has penetrated, so there are actual cancer cells If the exact location is not captured, there is a risk of misdiagnosis, and 3) there is a risk that a wound may occur on the subject's rectum during the examination process, which may lead to infection.
  • auxiliary diagnostic method in order to increase the reliability of the biopsy and to perform the biopsy limitedly only for patients who actually need the test.
  • the PSA test is used as one of these auxiliary diagnostic methods, its reliability is low, and when it is located in a gray zone, it is not possible to accurately determine whether or not prostate cancer occurs, and there are many limitations.
  • a representative of the methods for selecting the specific miRNA is a miRNA microarray.
  • the miRNA microarray is a method of screening the expression level of most miRNAs known to be expressed in humans with a body fluid sample of a subject, and mainly a kit prepared in advance (eg, RNA 6000 Pico Chip Kit, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) was used to measure the expression level of miRNA in the subject's sample.
  • miRNAs expressed in humans There are about 1,400 types of miRNAs expressed in humans (including about 1,200 human-derived species and about 150 virus-derived species), which are relatively few compared to the number of known human genes, and since their sequences are also well known, almost all miRNAs are You can proceed with screening.
  • the expression level of miRNA in a target sample can be roughly obtained.
  • the kit only an approximate expression level can be obtained for screening purposes, and there is also an issue of normalizing, so additional analysis is needed to find a biomarker with accurate diagnostic ability.
  • the miRNA microarray has the advantage of rapidly finding biomarker candidates that can be used for diagnosis of prostate cancer, and thus is widely used for analysis target selection prior to full-scale analysis.
  • Extracellular vesicles are characterized by a stable structure as they are composed of a lipid bilayer. Therefore, nucleic acids (eg, DNA, RNA, or miRNA) or protein fragments contained in the extracellular vesicle can be preserved in a stable state over time as long as the extracellular vesicle is not artificially destroyed. there is. This is in contrast to the fact that fragments of nucleic acids or proteins directly contained in body fluid samples such as blood and urine are easily degraded by external factors over time. Therefore, when a material contained in the extracellular vesicle is targeted as a biomarker, there is an advantage in that the sample can be stored for a long time. Since the extracellular vesicles are also included in the urine sample, the extracellular vesicle-derived material can be used as a biomarker target of the urine sample if appropriate pretreatment is performed.
  • nucleic acids eg, DNA, RNA, or miRNA
  • protein fragments contained in the extracellular vesicle
  • the present specification provides a method of calculating a diagnostic score for prostate cancer using at least two values.
  • the diagnostic score calculation method includes a sample preparation process, a first value measurement process, a second value measurement process, and a diagnostic score calculation process.
  • a urine sample of the subject is used as the sample.
  • the first value is a value related to hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679 derived from extracellular vesicles as a first target, and the miRNA includes information on whether or not prostate cancer occurs.
  • normalizing is required to be used in the diagnosis of prostate cancer.
  • the second value is a value related to an extracellular vesicle-derived miRNA in a second target sample.
  • the second target may be hsv2-miR-H9-5p or hsa-miR-1913 derived from extracellular vesicles, but is not limited thereto.
  • the second value may be used as a normalizing factor of the first value, and the second value also includes information on whether prostate cancer occurs.
  • Measuring the first value and/or measuring the second value may include amplifying the first target and/or the second target using polymerase chain reaction (PCR), and measuring the result.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the diagnostic score calculation method provided herein is a value that can be used to diagnose whether a subject has prostate cancer.
  • the diagnostic score calculation method is characterized in that the biomarker contained in the urine sample is measured using the urine sample. This is advantageous in that the sampling method is simple and economical, and there is no fear of causing pain to the subject.
  • the diagnostic score calculation method since the urine may contain substances secreted from prostate cells, the diagnostic score calculation method has the advantage that it can be a more direct method than measuring a prostate cancer-related biomarker from a blood sample.
  • the diagnostic score calculation method provided herein is to calculate the prostate cancer diagnostic score by measuring the expression level of at least two or more biomarkers in a sample.
  • the biomarker is characterized in that the miRNA contained in the extracellular vesicles in the urine. Since the extracellular vesicle is surrounded by a lipid bilayer to form a stable structure, substances (eg, miRNA) contained therein are effectively blocked from the influence of the external environment. Accordingly, as long as the extracellular vesicle is not destroyed, its internal materials are also well preserved. Therefore, when miRNA contained in the extracellular vesicle is a measurement target, there is an advantage in that the sample can be stored for a long time after taking a sample from the target. In addition, it has an advantage that the storage state of the sample does not have a large effect on the diagnosis score calculation result.
  • Diagnostic score calculation method Feature 3 - Measurement of expression level of hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679
  • hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679 can be used as a biomarker for prostate cancer. Since the diagnostic score calculation method provided herein basically uses a value related to the expression level of the hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679 of the subject, the diagnostic score calculated by the method is based on whether or not prostate cancer occurs. have diagnostic capabilities for
  • the diagnostic score calculation method provided herein is characterized by using a normalizing factor specialized for the expression level of hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679 contained in the urine sample.
  • a biomarker for a housekeeping gene is discovered and used to normalize the expression level of the biomarker, but the diagnostic score calculation method provided herein is a target hsa-miR-3659 or hsa-miR- 3679-specific regularization factors are used.
  • biomarkers for housekeeping genes as normalizing factors, 1) discovering biomarkers for housekeeping genes in general is a very difficult task, and 2) housekeeping genes for miRNAs derived from extracellular vesicles in urine.
  • the normalization factor also includes information on whether the subject has prostate cancer.
  • one or more processed information may be derived by combining information on prostate cancer including the expression level of hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679 and information on prostate cancer included in the normalization factor.
  • the processed information may be amplified information on whether prostate cancer occurs.
  • the diagnostic score provided herein may 1) be used to determine a diagnostic criterion for the onset of prostate cancer, and 2) may be used in a prostate cancer diagnosis method referring to the diagnostic criterion.
  • a sample preparation process for a subject included in the diagnostic score calculation method provided herein includes preparing a urine sample for the subject.
  • the process may further include an appropriate pretreatment process for measuring the amount of extracellular vesicle-derived miRNA contained in the urine sample.
  • the sample preparation may include disrupting extracellular vesicles contained in the urine sample.
  • the sample is a urine sample of the subject.
  • the urine sample may be the subject's first morning urine sample.
  • the urine may be a sample of a supernatant of urine collected from a subject.
  • the urine sample may be a sample of a supernatant of the subject's urine after centrifugation.
  • the volume of the urine sample is not particularly limited and may be appropriately selected according to need.
  • the storage temperature of the urine sample is not particularly limited as long as it is a temperature at which the target biomarker contained in the sample can be stably stored.
  • Sample contains extracellular vesicles
  • the urine sample includes extracellular vesicles secreted from cells of the subject.
  • the extracellular vesicle may be an exosome.
  • the extracellular vesicle may be one or more selected from the group consisting of exosomes, microvesicles, and apoptotic bodies.
  • the urine sample may be divided and used as needed.
  • the first sample may be divided into a first subsample and a second subsample.
  • the second sample may be divided into three or more sub-samples.
  • the urine sample preparation process is not particularly limited as long as it is a process necessary to obtain the first value and the second value.
  • the sample preparation may be preparing a urine supernatant sample of the subject. Preparing the sample may further include pre-treating the sample. Pretreatment of the sample is not particularly limited as long as it is necessary to measure a value related to the expression level of the target extracellular vesicle-derived miRNA.
  • the preparation of the urine sample may further include extracting miRNA in the urine using a kit suitable for the urine sample of the subject.
  • the kit may use a known one, for example, may be a Genolution urine miRNA purification kit (Genolution Pharmaceuticals Inc., Seoul, Korea), but is not limited thereto.
  • the first value is a value related to hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679 derived from extracellular vesicles having prostate cancer diagnostic ability.
  • the first value may be a value related to the amount of the first target included in the sample.
  • the first target is hsa-miR-3659 and/or hsa-miR-3679 derived from extracellular vesicles.
  • the first value reflects information on whether the subject has prostate cancer. However, it is difficult to determine whether the subject has prostate cancer by using the first value alone, which includes information on whether the subject has prostate cancer and various endogenous factors. This is because the effects are reflected simultaneously.
  • the first value may simultaneously reflect first information having a diagnostic ability for prostate cancer and a first noise generated by an endogenous factor independent of the first information.
  • a method of obtaining the first value is not particularly limited as long as it is a method capable of obtaining a value related to the amount of hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679 derived from the extracellular vesicle.
  • obtaining the first value may include amplifying one or more miRNAs in the sample using polymerase chain reaction (PCR), and obtaining the amount of the one or more miRNAs in the sample from the result. .
  • PCR polymerase chain reaction
  • the first value is a value related to hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679 derived from extracellular vesicles with prostate cancer diagnostic ability.
  • This is a biomarker containing information on whether or not prostate cancer is developed using the miRNA Assay method. corresponds to The present inventors found that, through a study, hsa-miR-3659 and hsa-miR-3679 derived from extracellular vesicles in the urine of subjects were down-expressed in subjects with prostate cancer compared to normal subjects.
  • the diagnostic score calculation method targets the extracellular vesicle-derived hsa-miR-3659 and/or hsa-miR-3679 contained in the subject's urine sample, and the amount of the target contained in the sample includes finding
  • obtaining the first value is to amplify hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679 derived from extracellular vesicles in the urine sample through PCR (polymerase chain reaction), and from the result, the first value may include obtaining
  • the method of amplification through PCR may be appropriately selected by a method known to those skilled in the art.
  • obtaining the first value comprises: targeting hsa-miR-3659 and/or hsa-miR-3679 derived from extracellular vesicles in a sample as a first target, and synthesizing cDNA of the first target; making a mixture for PCR amplification by mixing the cDNA with a reaction reagent containing one or more primers selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 2; amplifying the PCR amplification mixture through RT-PCR; and obtaining an amount of the first target contained in the sample from the RT-PCR result.
  • the RT-PCR result is a reaction cycle number (cycle number) vs.
  • obtaining the first value may be using a known PCR equipment.
  • the PCR equipment may be a Rotor Gene 6000 instrument (Qiagen, Hilden, Germany), but is not limited thereto.
  • the amount of the extracellular vesicle-derived hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679 contained in the subject's sample reflects information on whether the subject has prostate cancer
  • the first value alone It cannot be used to diagnose the onset of and/or the progression of prostate cancer. This is because, in the first value, the influence of an endogenous factor independent of the information is simultaneously reflected in addition to the information on whether or not the prostate cancer occurs. Therefore, unless the effect of the endogenous factor is eliminated, reduced, and/or controlled, it is difficult to use the first value alone to diagnose the onset of prostate cancer and/or the degree of progression of prostate cancer.
  • the endogenous factors collectively refer to various factors independent of prostate cancer, which will be described in more detail below.
  • the term “endogenous factor” refers to factors related to the sample or subject itself among factors affecting the expression level of the biomarker in addition to factors related to the specific disease (eg, onset and progression). collectively referred to as Since the amount of the biomarker in the sample reflects not only the effect of the specific disease but also the effect of the endogenous factor, in order to use the expression level of the biomarker for the diagnosis of a specific disease, the effect of the endogenous factor It is very important to eliminate, reduce, and/or control.
  • the endogenous factor may include a factor associated with the sample.
  • the sample-related factors refer to factors related to the properties of the sample itself among factors that may affect the expression level of biomarkers in the sample.
  • the endogenous factor may include one or more sample-related factors.
  • the sample-related factor may be an amount of a sample, a sample collection time, a sample collection method, a sample storage period, a sample storage temperature, or a sample division method, but is not limited thereto.
  • the endogenous factor may include a factor associated with a subject.
  • the subject-related factors refer to factors that may affect the expression level of biomarkers in a sample, including factors related to physiological activities and conditions independent of whether the subject has prostate cancer or not.
  • the endogenous factor may include one or more subject-related factors.
  • the subject-related factor may be the subject's gender, the subject's age, the subject's race, the subject's weight, the subject's kidney function, or the subject's hydration status before sample collection, but is not limited thereto.
  • the second value is a value related to an extracellular vesicle-derived miRNA in the sample.
  • the second value may be a value related to the amount of extracellular vesicle-derived miRNA included in the sample.
  • the extracellular vesicle-derived miRNA may be hsv2-miR-H9-5p or hsa-miR-1913, but is not limited thereto.
  • the second value also includes information on whether the subject has prostate cancer.
  • the effect of the endogenous factor reflected in the second value is reflected, and the influence of the endogenous factor reflected in the second value has a close correlation with the degree of influence of the endogenous factor reflected in the first value.
  • the first value may be normalized with the second value.
  • the second value may be a value in which second information related to whether the subject has prostate cancer and third information related to the endogenous factor are reflected.
  • the third information has a close correlation with the first noise, so that the first value may be normalized by the second value.
  • the second value is a value related to an extracellular vesicle-derived miRNA in the sample.
  • a value independent of the first value and in which the same influence of the endogenous factor is reflected is required.
  • the second value it is preferable to use a value related to the expression level of extracellular vesicle-derived miRNA, which is the first value as well as the expression level of extracellular vesicle-derived miRNA (hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679) Because it is a related value, it can be considered that the influence of the endogenous factor is the same or similar.
  • the second value may be a value related to the amount of extracellular vesicle-derived miRNA contained in the sample.
  • Second value feature 1 with information about endogenous factors
  • the second value reflects the influence of the endogenous factor.
  • the endogenous factors include one or more sample-related factors and/or one or more subject-related factors.
  • the second value also includes information on whether the subject has prostate cancer. However, the information on whether prostate cancer occurs included in the second value is independent of the information included in the first value.
  • the second value may be a value related to the amount of the second target included in the sample. In this case, the second value may reflect second information on whether the subject has prostate cancer.
  • the second target may be up-expressed in a subject with prostate cancer compared to a normal subject or a subject with an enlarged prostate.
  • the second target may be down-expressed in a subject having prostate cancer compared to a normal subject or a subject having an enlarged prostate.
  • the second target may be hsv2-miR-H9-5p, hsv1-miR-H18 or hsa-miR-1913 derived from extracellular vesicles.
  • Second Value Feature 3 - Close Correlation with Endogenous Factor Effect Reflected in First Value
  • the second value 1) targets extracellular vesicle-derived miRNA, 2) includes information related to prostate cancer, and 3) includes information on the endogenous factor.
  • the second value of the diagnostic score calculation method provided in the present specification. This is because the purpose of obtaining the second value is to eliminate, reduce, and/or control the influence of the endogenous factor reflected in the first value. Accordingly, the influence of the endogenous factor reflected in the second value should have a close correlation with the influence of the endogenous factor reflected in the first value.
  • the second value may include third information having a close correlation with first noise, which is an effect of an endogenous factor reflected in the first value.
  • obtaining the second value may include amplifying miRNA derived from extracellular vesicles in the urine sample through PCR, and obtaining the second value from the result.
  • the specific PCR method is as described in the ⁇ Example of first value acquisition method-PCR> section.
  • the specific sequence of the primer included in the reaction reagent mixed with the cDNA may vary depending on the sequence of the extracellular vesicle-derived miRNA, the target for which the second value is obtained.
  • the primer included in the reaction reagent is SEQ ID NO: It may be one or more selected from the group consisting of 3 to 4.
  • each order and method is particularly limited doesn't happen
  • obtaining the first value and obtaining the second value may be performed simultaneously.
  • obtaining the first value and obtaining the second value may be sequentially performed.
  • the second value may be obtained.
  • the first value may be obtained.
  • obtaining the first value and obtaining the second value may be performed in the same manner. Specifically, obtaining the first value and obtaining the second value may be performed through the same PCR method.
  • obtaining the first value and obtaining the second value may be performed using the same PCR equipment. In another embodiment, obtaining the first value and obtaining the second value may be performed in different ways. In an embodiment, obtaining the first value and obtaining the second value may be performed without another separation process in the sample. In another embodiment, obtaining the first value and obtaining the second value may be performed on the subsamples after dividing the sample into two or more subsamples. Specifically, after dividing the sample into a first subsample and a second subsample, the first value may be obtained from the first subsample, and the second value may be obtained from the second subsample.
  • the diagnostic score calculation method provided herein includes obtaining the first value and calculating the diagnostic score using the first value and the second value obtained in the obtaining of the second value.
  • calculating the diagnostic score for the prostate cancer is calculated using the first value and the second value, and as a result, the diagnostic score may be used for diagnosing prostate cancer.
  • the diagnostic score is a result of normalizing the effect of the endogenous factor reflected in the first value using the second value, it is related to the occurrence and/or progression of prostate cancer reflected in the first value. include information. Therefore, the diagnostic score has a diagnostic ability for prostate cancer.
  • the diagnosis score may be calculated as a ratio of the first value and the second value.
  • the method for determining the diagnostic test criteria for prostate cancer includes: acquiring a dataset including information on whether or not prostate cancer develops from subjects included in a cohort and a diagnostic score for prostate cancer; and determining a prostate cancer diagnostic test criterion from the dataset.
  • the cohort includes subjects with at least one prostate cancer and subjects without at least one prostate cancer.
  • the prostate cancer diagnosis score is calculated by the method of calculating a diagnosis score for prostate cancer provided herein.
  • the method for determining the prostate cancer diagnostic test criterion requires information on whether or not the at least one subject has prostate cancer and a diagnostic score for the prostate cancer. Accordingly, the method is intended for a cohort comprising one or more subjects not having prostate cancer and one or more subjects having prostate cancer. In one embodiment, the method for determining the diagnostic test criteria for prostate cancer may be performed on a cohort including one or more normal subjects or subjects with an enlarged prostate, and one or more subjects with prostate cancer.
  • the method for determining the prostate cancer diagnostic test criterion includes acquiring a dataset including information on whether or not prostate cancer has occurred and a diagnostic score for the prostate cancer from each subject included in the cohort.
  • the method for determining the diagnostic test criteria for prostate cancer includes obtaining a first dataset, wherein the first dataset includes a list of information on whether or not prostate cancer occurs for each subject in a cohort and a list of information on each subject in the cohort. Includes a list of diagnostic scores for In this case, the diagnostic score is calculated using the diagnostic score calculation method for prostate cancer provided herein.
  • the method for determining a diagnostic test criterion for prostate cancer includes determining a diagnostic test criterion from the dataset.
  • the diagnostic test criterion is a criterion for determining whether the subject has prostate cancer when the diagnosis score is obtained for a subject whose prostate cancer is unknown.
  • the determination of the diagnostic test criterion from the dataset may be determined in consideration of sensitivity and specificity of the test criterion.
  • the test criterion may be a criterion for maximizing the sensitivity and specificity.
  • the test criterion may be a criterion indicating more than a specific sensitivity value.
  • the test criterion may be a criterion indicating more than a specific specificity value.
  • the diagnostic test criterion may be to provide a probability of developing prostate cancer according to the diagnostic score value.
  • the diagnostic test criteria may be used.
  • the method of providing the prostate cancer diagnostic information comprises: calculating the diagnostic score for a subject; and with reference to one or more predetermined values, determining a risk factor for prostate cancer from the diagnostic score.
  • the one or more predetermined values may be the diagnostic test criteria.
  • the present specification provides a method of calculating a prostate cancer diagnostic score by combining at least two values.
  • the method for calculating a prostate cancer diagnosis score includes a process of preparing a sample, a process of acquiring a first value, a process of acquiring a second value, and a process of calculating a diagnostic score.
  • the sample is a urine sample of a subject
  • the first value is hsa-miR-3659 or hsa-miR-3679-5p derived from extracellular vesicles contained in the sample as a first target
  • the second value is a value related to the content of the second target using the extracellular vesicle-derived miRNA included in the sample as the second target.
  • Both the first value and the second value include information on whether the target has prostate cancer, and the second value corresponds to a normalizing factor specialized for the first value. Therefore, the prostate cancer diagnosis score calculated according to the above method is characterized in that it has a diagnostic ability for prostate cancer.
  • the prostate cancer diagnostic score may be used to determine a prostate cancer diagnostic criterion
  • the prostate cancer diagnostic score and the prostate cancer diagnostic criterion may be used to provide information for diagnosing whether or not prostate cancer occurs.
  • the prostate cancer diagnostic score a group of subjects was prepared from which samples were taken.
  • the experimental group included both patients with Benign prostatic hyperplasia (BPH) without prostate cancer and patients with prostate cancer.
  • BPH Benign prostatic hyperplasia
  • the characteristics of the test target group are shown in Table 1 below.
  • BPH enlarged prostate
  • PCa prostate cancer
  • SD standard deviation
  • PSA prostate-specific antigen
  • TURP transurethral resection of the prostate.
  • P-values are values obtained through Mann-Whitney U-test with urine samples from BPH subjects and PCa subjects.
  • Samples were prepared for each of the target groups prepared in Experimental Example 1.1.
  • the sample preparation process is as follows.
  • Genolution urine miRNA purification kit (Genolution Pharmaceuticals Inc., Seoul, Korea) was used to purify the urine sample.
  • step (3) The tube after step (3) was centrifuged at 4°C and 13,000 rpm for 10 minutes.
  • step (6) The tube after step (6) was centrifuged at 4°C and 15,000 rpm for 20 minutes.
  • step (7) the tube was removed by decanting the liquid phase by tilting it in the opposite direction of the RNA pellet.
  • step (10) The tube after step (9) was centrifuged at 4°C and 15,000 rpm for 20 minutes.
  • the amount of target miRNA contained in the sample prepared in Experimental Example 1 was obtained by PCR.
  • the specific PCR method is as follows.
  • cDNA was synthesized with the Mir-XTM miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit (TAKARA BIO, Otsu, Japan). At this time, the cDNA synthesis method followed the manufacturer's protocol.
  • RNA oligonucleotides SEQ ID NO) hsa-miR-3659 5'- TGA GTG TTG TCT ACG AGG GCA -3' One hsa-miR-3679-5p 5'- TGA GGA TAT GGC AGG GAA GGG GA -3' 2 hsv2-miR-H9 5'- CTC GGA GGT GGA GTC GCG GT -3' 3 hsv1-miR-H18 5'- CCC GCC CGC CGG ACG CCG GGA CC -3' 4 hsa-miR-1913 5'- TCT GCC CCC TCC GCT GCT GCC A -3' 5 hsa-miR-30a-5p 5'-TGT AAA CAT CCT CGA CTG GAA G -3' 6 hsa-miR-30c-5p 5'- TGT AAA CAT CCT
  • the diagnostic score was calculated by using the target miRNA content in the sample obtained in Experimental Example 2 as the first value (first target) or the second value (second target).
  • the diagnostic score was calculated as the ratio of the amount of the two target miRNAs contained in the sample, and specific targets for each example are shown in Table 3 below.
  • Example 1 hsa-miR-3659 hsv2-miR-H9
  • Example 2 hsa-miR-3659 hsa-miR-1913
  • Example 3 hsa-miR-3679-5p hsv2-miR-H9
  • Example 4 hsa-miR-3679-5p hsa-miR-1913
  • Example 5 hsa-miR-3659 hsv1-miR-H18
  • Example 6 hsa-miR-3679-5p hsv1-miR-H18 Comparative Example 1 hsa-miR-31-5p hsa-miR-30a-5p Comparative Example 2 hsa-miR-31-5p hsa-miR-30c-5p
  • a Receiver Operating Characteristic (ROC) curve was derived for the test subject group for each example.
  • AUC rea Under Curve
  • optimal sensitivity and specificity were derived for the ROC curve, respectively.
  • the ROC curves were derived for i) the entire subject group, and ii) the PSA gray zone subject group, respectively.
  • the diagnostic score calculation method and the prostate cancer diagnostic test criterion determination method using the same provided herein may be used to derive information for diagnosing whether or not prostate cancer occurs and its risk.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Primary Health Care (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 명세서에서는 적어도 두 값을 조합하여 전립선암 진단 점수를 계산하는 방법을 제공한다. 상기 전립선암 진단 점수 계산 방법은 샘플을 준비하는 과정, 제1 값을 획득하는 과정, 제2 값을 획득하는 과정, 및 진단 점수 계산 과정을 포함한다. 상기 샘플은 대상의 소변 샘플임을 특징으로 하고, 상기 제1 값은 상기 샘플 내 포함된 세포 외 소포(extracellular vesicle) 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679-5p를 제1 타겟으로 하며, 상기 제1 타겟의 포함량과 관련된 값이며, 상기 제2 값은 상기 샘플 내 포함된 세포 외 소포 유래 miRNA를 제2 타겟으로 하며, 상기 제2 타겟의 포함량과 관련된 값이다. 상기 제1 값 및 제2 값 모두 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 포함하고 있으며, 상기 제2 값은 상기 제1 값에 특화된 정규화 인자(normalizing factor)에 해당한다. 따라서, 상기 방법에 따라 계산된 전립선암 진단 점수는 전립선암에 대한 진단능을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서는 상기 전립선암 진단 점수의 용도를 제공한다. 1) 상기 전립선암 진단 점수를 사용하여 전립선암 진단 기준을 결정할 수 있으며, 2) 상기 전립선암 진단 점수 및 상기 전립선암 진단 기준을 사용하여 전립선암 발병 여부 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.

Description

전립선암 진단 점수 계산 방법 및 그 용도
본 발명은 대상의 소변에 포함된 바이오마커의 발현량을 측정하여 전립선암의 발병 여부 진단에 대한 정보를 제공할 수 있는 진단 점수 계산 방법에 대한 기술이다.
원칙적으로 전립선암을 진단하는 표준적인 방법은 대상의 전립선 조직을 소량 채취한 후, 암세포의 발생 여부를 확인하는 조직 검사이다. 하지만, 조직 검사는 대상에게 매우 고통스러운 과정을 수반하기 때문에, 전립선암 발병 의심 증상(예를 들어, 빈뇨, 배뇨통 등의 배뇨증상)을 보인다는 이유 만으로 조직 검사를 수행하는 것은 적절하지 않다. 따라서, 대상이 전립선암 발병 의심 증상을 보이는 경우, 우선 대상의 체액(예를 들어, 혈액 또는 소변)을 채취해 전립선암 발병 여부에 대한 간접적인 검사를 행하고, 그 결과를 통해 조직 검사가 필요할 지 여부를 타진하는 것이 일반적이다. 현재 임상에서는 대상의 혈액을 채취하여 혈액 샘플 내 전립선 특이항원(PSA, Prostate Specific Antigen)의 농도를 측정하는 PSA 테스트를 일반적으로 실시하고 있다. 다만, 상기 PSA 테스트는 그 정확도 및 진단능에 논란이 있기 때문에, 신뢰할 수 있는 비침습적 전립선암 진단 방법의 개발이 요구되는 실정이다.
본 명세서에서는 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 제공할 수 있는 진단 점수를 계산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 명세서에서는 상기 진단 점수를 가지고 진단 테스트 기준 결정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 명세서에서는 상기 진단 점수를 가지고 전립선암 진단에 대한 정보 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 명세서에서는 적어도 두 값을 조합하여 전립선암에 대한 진단 점수를 계산하는 방법으로: 대상의 샘플을 준비하는 과정으로, 이때, 상기 샘플은 소변 샘플이고; 상기 샘플 내의 제1 타겟의 포함량과 관련된 제1 값을 획득하는 과정으로, 이때, 상기 제1 타겟은 샘플 내 포함된 세포외 소포(extracellular vesicle) 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679이고, 상기 제1 값은 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 진단능을 가지는 제1 정보를 반영하고, 다만, 상기 제1 값은 상기 전립선암 발병 여부 진단에 단독으로 사용할 수 없는데, 이는 상기 제1 값은 상기 제1 정보와 함께 제1 노이즈를 동시에 반영하고 있기 때문이며, 상기 제1 노이즈는 내생성 인자에 의해 야기된 것으로, 상기 내생성 인자는 전립선암 관련 인자와는 독립된 것이고; 상기 샘플 내의 제2 타겟의 포함량과 관련된 제2 값을 획득하는 과정으로, 이때, 상기 제2 타겟은 샘플 내 세포외 소포 유래 miRNA이고, 상기 제2 값은 전립선암 발병 여부와 관련된 제2 정보를 반영하고 있고, 상기 제2 값은 상기 내생성 인자와 관련된 제3 정보를 반영하고 있고, 상기 제3 정보는 상기 제1 노이즈와 유의한 상관 관계를 가지며, 이로 인해 상기 제1 값에 반영된 상기 제1 노이즈는 상기 제2 값을 사용하여 통제될 수 있고; 상기 제1 값 및 상기 제2 값을 사용하여 전립선암에 대한 진단 점수를 계산하는 과정으로, 이로 인해 상기 진단 점수는 전립선암에 대한 진단에 사용될 수 있음; 을 포함하는 진단 점수 계산 방법을 제공한다.
일 실시예로, 상기 제2 타겟은 hsv2-miR-H9-5p, 또는 hsa-miR-1913이다.
일 실시예로, 상기 진단 점수는 제1 값 및 제2 값의 비로 계산된다.
일 실시예로, 상기 내생성 인자는 다음을 포함한다: 상기 샘플과 관련된 제1 컨디션; 및 상기 대상과 관련된 제2 컨디션.
일 실시예로, 상기 제1 컨디션은 다음으로 이뤄진 군에서 선택되는 하나 이상이다: 상기 샘플의 양, 상기 샘플의 수집 시간, 상기 샘플의 수집 방법, 상기 샘플의 보관 기간, 상기 샘플의 보관 온도, 상기 샘플의 소분 방법.
일 실시예로, 상기 제2 컨디션은 다음으로 이뤄진 군에서 선택되는 하나 이상이다: 상기 대상의 성별, 상기 대상의 나이, 상기 대상의 인종, 상기 대상의 몸무게, 상기 대상의 신장 기능, 상기 대상의 수분 공급 상태.
일 실시예로, 상기 제1 값을 구하는 과정은: 상기 샘플 내 제1 타겟의 제1 cDNA를 합성하는 과정; 상기 제1 cDNA를 제1 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction)으로 증폭시키는 과정으로, 이때, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1 내지 2로 이뤄진 군에서 선택되고; 및 상기 제1 cDNA 증폭 결과로부터 상기 제1 값을 결정하는 과정을 더 포함한다.
일 실시예로, 상기 제2 값을 구하는 과정은: 상기 샘플 내 제2 타겟의 제2 cDNA를 합성하는 과정; 상기 제1 cDNA를 제2 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction)으로 증폭시키는 과정으로, 이때, 상기 제2 프라이머는 상기 제2 타겟과 상동성을 가지는 서열, 또는 상기 제2 타겟과 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 포함하고, 상기 제2 cDNA 증폭 결과로부터 상기 제2 값을 결정하는 과정을 더 포함한다.
일 실시예로, 상기 제2 타겟은 hsv2-miR-H9-5p, 또는 hsa-miR-1913이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 3 및 5로 이뤄진 군에서 선택된다.
본 명세서에서는 전립선암 진단을 위한 진단 기준 결정 방법으로: 제1 데이터셋을 획득하는 과정으로, 이때, 상기 제1 데이터셋은, 코호트 내 각 대상의 전립선암 발병 여부 목록, 및 상기 코호트 내 각 대상에 대해, 상기 전립선암 진단 점수 계산 방법에 따라 계산된 진단 점수 목록을 포함하고, 상기 코호트는, 적어도 하나의 정상 대상 또는 전립선 비대증 발병 대상, 및 적어도 하나의 전립선암 발병 대상을 포함하고; 및 상기 제1 데이터셋으로부터 전립선암 진단을 위한 진단 기준을 결정하는 과정을 포함하는 방법을 제공한다.
일 실시예로, 상기 진단 기준은 상기 진단 점수와 동일한 차원을 가지는 단일 값이다.
일 실시예로, 상기 진단 기준은 하나 이상의 전립선암 발병 확률 값을 포함한다.
본 명세서에서는 대상의 전립선암 발병 여부 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로: 상기 대상에 대해 상기 진단 점수 계산 방법에 따른 전립선암 진단 점수를 계산하는 과정; 및 상기 전립선암 진단 점수를 가지고, 적어도 하나의 미리 결정된 값을 참조하여 리스크팩터를 결정하는 과정을 포함하는 방법을 제공한다.
일 실시예로, 상기 미리 결정된 값은 상기 진단 기준 결정 방법에 따라 결정된 진단 기준이다.
본 명세서에서 제공하는 상기 진단 점수 계산 방법을 사용하여, 대상의 소변 샘플을 가지고 비 침습적으로 전립선암 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 전립선암 진단 점수 계산 방법의 순서도를 나타낸다. 이때, 제1 값 획득 과정 및 제2 값 획득 과정은 병렬적으로 독립해서 수행될 수 있는 과정을 나타낸다.
도 2는 전체 실험 대상군에 대해, 실시예 1 및 실시예 2의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 1(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3659)에 대한 결과, (b) 실시예 2(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3659)에 대한 결과.
도 3은 전체 실험 대상군에 대해, 실시예 3 및 실시예 4의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 3(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 결과, (b) 실시예 4(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 결과.
도 4는 전체 실험 대상군에 대해, 실시예 5 및 실시예 6의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 5(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3659)에 대한 결과, (b) 실시예 6(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 결과.
도 5는 전체 실험 대상군에 대해, 비교예 1 및 비교예 2의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 비교예 1(hsa-miR-30a-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 결과, (b) 비교예 2(hsa-miR-30c-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 결과.
도 6은 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 실시예 1 및 실시예 2의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 1(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3659)에 대한 결과, (b) 실시예 2(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3659)에 대한 결과.
도 7은 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 실시예 3 및 실시예 4의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 3(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 결과, (b) 실시예 4(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 결과.
도 8은 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 실시예 5 및 실시예 6의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 5(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3659)에 대한 결과, (b) 실시예 6(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 결과.
도 9는 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 비교예 1 및 비교예 2의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 비교예 1(hsa-miR-30a-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 결과, (b) 비교예 2(hsa-miR-30c-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 결과.
도 10은 전체 대상군에 대해, PSA 테스트의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다.
도 11은 전체 대상군에 대해, 실시예 1 및 실시예 2의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 1(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3659)에 대한 ROC 커브, (b) 실시예 2(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3659)에 대한 ROC 커브.
도 12는 전체 대상군에 대해, 실시예 3 및 실시예 4의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 3(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 ROC 커브, (b) 실시예 4(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 ROC 커브.
도 13은 전체 대상군에 대해, 실시예 5 및 실시예 6의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 5(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3659)에 대한 ROC 커브, (b) 실시예 6(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 ROC 커브. 이때, 진단 성능이 기준에 미달했으므로, 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 값은 따로 도시되지 않았다.
도 14는 전체 대상군에 대해, 비교예 1 및 비교예 2의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 비교예 1(hsa-miR-30a-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 ROC 커브, (b) 비교예 2(hsa-miR-30c-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 ROC 커브. 이때, 진단 성능이 기준에 미달했으므로, 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 값은 따로 도시되지 않았다.
도 15는 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, PSA 테스트의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. 이때, 진단 성능이 기준에 미달했으므로, 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 값은 따로 도시되지 않았다.
도 16는 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 실시예 1 및 실시예 2의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 1(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3659)에 대한 ROC 커브, (b) 실시예 2(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3659)에 대한 ROC 커브.
도 17은 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 실시예 3 및 실시예 4의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 3(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 ROC 커브, (b) 실시예 4(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 ROC 커브.
도 18은 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 실시예 5 및 실시예 6의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 5(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3659)에 대한 ROC 커브, (b) 실시예 6(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 ROC 커브. 이때, 진단 성능이 기준에 미달했으므로, 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 값은 따로 도시되지 않았다.
도 19는 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 비교예 1 및 비교예 2의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 비교예 1(hsa-miR-30a-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 ROC 커브, (b) 비교예 2(hsa-miR-30c-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 ROC 커브. 이때, 진단 성능이 기준에 미달했으므로, 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 값은 따로 도시되지 않았다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여, 발명의 내용을 특정한 구현예와 예시들을 통해 더욱 상세하게 설명한다. 상기 첨부된 도면은 발명의 일부 구현예를 포함하지만, 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 의해 개시되는 발명의 내용은 다양한 형태로 구체화될 수 있으며, 여기에 설명되는 특정 구현예로 제한되지 않는다. 이러한 구현예들은 본 명세서에 적용되는 법적 요건을 만족시키기 위해 제공되는 것으로 보아야 한다. 본 명세서에 개시된 발명이 속한 기술분야에 있어 통상의 기술자라면, 본 명세서에 개시된 발명의 내용에 대한 많은 변형 및 다른 구현예들을 떠올릴 수 있을 것이다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 구현예로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 구현예들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
용어의 정의(DEFINITIONS)
약
본 명세서에서 사용되는 “약”이라는 용어는 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
대상
본 명세서에서 사용되는 “대상”이라는 용어는 특정 물질(예를 들어, 펩타이드 등)에 노출되는 객체가 되는 유기체를 의미한다. 상기 대상은 인간, 동물 등의 독립적인 유기체를 의미할 수도 있고, 조직의 일부, 세포 등 상기 독립적인 유기체의 일부 구성을 의미할 수도 있다. 이러한 의미는 문맥에 따라 적절하게 해석될 수 있다. 또한, 상기 “대상”이라는 용어는 그 외 당업계 통상의 기술자에게 인식되는 의미를 모두 포함할 수 있다.
진단
본 명세서에서 사용되는 “진단”이라는 용어는 대상이 특정 질환과 관련이 있는지 여부를 판단하는 직접, 간접적 모든 행위를 통틀어서 일컫는다. 이때, “특정 질환과의 관련성”은 해당 질병의 발병 여부, 해당 질병이 발병했다면 그 진행 여부에 대한 정보 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 “특정 질환을 진단한다”고 기재하는 경우, 상기 특정 질환의 발병 여부를 확정 짓는 것뿐 아니라, 상기 특정 질환이 발병했을 확률, 위험도, 및/또는 개연성 등을 판단하는 것도 포함하는 것으로 넓게 이해되어야 한다. 이러한 의미는 문맥에 따라 적절하게 해석될 수 있다. 또한, 상기 “진단”이라는 용어는 그 외 당업계 통상의 기술자에게 인식되는 의미를 모두 포함할 수 있다.
바이오마커(biomarker)
본 명세서에서 사용되는 “바이오마커”는 일반적으로 대상 체내의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하며, 단백질, DNA, RNA, 및/또는 기타 대사 물질들을 일컫는다. 상기 바이오마커라는 용어는, 조금 더 좁은 의미에서는, 대상이 특정 질환에 걸렸는지 여부에 대한 정보를 반영하고 있는 대상 물질(예를 들어, 특정 단백질, 또는 miRNA)을 의미하기도 한다. 이러한 의미는 문맥에 따라 적절하게 해석될 수 있으며, 상기 “바이오마커”라는 용어는 그 외 당업계 통상의 기술자에게 인식되는 의미를 모두 포함할 수 있다.
miRNA
본 명세서에서 사용되는 “”또는 “마이크로 RNA”는, 식물, 동물, 바이러스 등에서 발견되는 20 내지 25개의 뉴클레오타이드로 이뤄진 작은 비발현 RNA 분자를 지칭한다. miRNA는 유전자 발현 조절 등의 기능을 하는 것으로 알려져 있다. miRNA는 세포 내에서 발견되는 것은 물론, 세포 외에서도 발견되며, 특히 인간의 경우 혈청, 혈장 뿐 아니라 소변, 타액, 눈물 등 신체 내 거의 모든 체액에서 발견된다. 따라서, 세포 외에서 발견되는 miRNA를 특정 질환(예를 들어, 암)에 대한 진단 바이오마커로 사용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 상기 “”또는 “마이크로 RNA”라는 용어는 그 외 당업계 통상의 기술자에게 인식되는 의미를 모두 포함할 수 있다.
세포외 소포(extracellular vesicles)
본 명세서에서 사용되는 “세포외 소포”라는 용어는 세포에서 유래된 지질 이중막(lipid bilayer)으로 둘러쌓인, 자기복제 기능이 없는 입자 형태의 구조체를 일컫는다. 상기 세포외 소포의 직경은 약 20 내지 30 나노미터에 이르는 것부터 약 10 마이크론에 이르는 것까지 매우 다양하다. 상기 세포외 소포는 대상 체내에서 다양한 기능을 수행하는데, 상기 세포외 소포 내에 다양한 기능을 가진 단백질, 지질 등을 봉입해 세포외로 운반하는 기능이 대표적이다. 상기 세포외 소포는 엑토좀(ectosome), 마이크로낭포(microvesicle), 마이크로파티클(microparticle), 엑소좀(exosome), 자멸 사체(apoptotic body), 거대 온코좀(large oncosome), 및 엑소퍼(exopher)를 모두 포함하여 일컬으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 “세포외 소포”라는 용어는 그 외 당업계 통상의 기술자에게 인식되는 의미를 모두 포함할 수 있다.
배경지식 - 전립선암 진단(BACKGROUND - DIAGNOSIS OF PROSTATE CANCER)
전립선암 진단 - 개괄
원칙적으로 전립선암을 진단하는 표준적인 방법은 대상의 전립선 조직을 소량 채취한 후, 암세포의 발생 여부를 확인하는 조직 검사이다. 하지만, 조직 검사는 대상에게 매우 고통스러운 과정을 수반하기 때문에, 전립선암 발병 의심 증상(예를 들어, 빈뇨, 배뇨통 등의 배뇨증상)을 보인다는 이유 만으로 조직 검사를 수행하는 것은 적절하지 않다. 따라서, 대상이 전립선암 발병 의심 증상을 보이는 경우, 우선 PSA 테스트를 통해 조직 검사가 필요할 지 여부를 타진하는 것이 일반적이다. PSA 테스트는 대상의 혈액을 채취하여 혈액 샘플 내 전립선 특이항원(PSA, Prostate Specific Antigen)의 농도를 측정하여 대상이 전립선암에 걸렸을 확률을 가늠하는 진단 방법이다. 이하 각각의 진단 방법에 대해 더 자세히 서술한다.
PSA 테스트
PSA 테스트는 전립선암 발병이 의심되는 대상의 정맥에서 혈액을 채취, 혈액 내 전립선 특이항원(이하, PSA)의 농도를 측정하여 그 농도에 따라 전립선암 발병 확률을 예측하는 진단 방법의 일종이다. 전립선 특이항원은 전립선 내 세포에 의해 일차적으로 생산되는 단백질이다. 상기 PSA는 전립선암이 발병하지 않은 정상 대상의 혈액 내에서도 소량 포함되어 있지만, 전립선암 환자의 혈액에서 일반적으로 그 농도가 증가하는 경향을 보인다. 따라서, 혈액 내 PSA 농도를 전립선암의 발병 여부에 대한 지표로 유용하게 사용할 수 있지만 1) 일반적으로 나이가 들 수록 혈액 내 PSA 농도가 상승하는 경향이 있는 점, 2) 전립선암의 종류에 따라, 암이 발병했음에도 혈액 내 PSA 농도가 상승하지 않는 케이스도 존재하는 점 등에 비추어, 그 정확성에 대해서는 전문가들 사이에서도 의견이 분분한 실정이다. 문헌 마다 구체적인 수치는 다소 차이가 있지만, 일반적으로 혈액 내 PSA 농도가 3 ng/mL 내지 10 ng/mL 범위 내로 측정되는 경우, PSA 테스트 만으로는 대상이 전립선암 발병 위험군인지 여부를 확정하기 힘든 그레이 존(gray zone)에 있는 것으로 취급된다.
조직검사
실제로 대상에게 전립선암이 발병했는지 여부를 확정하기 위해서는 조직 검사를 통한 진단이 필수적이다. 이는, 대상의 전립선 조직을 미량 채취하여 암세포가 있는지 여부를 직접 살펴 보는 방법을 통해 이루어진다. 이는, 1) 대상의 항문을 통해 검사 바늘을 관통시켜 필요한 검체를 채취하는 방식이기 때문에 환자에게 매우 고통스럽고, 2) 검사 바늘이 관통한 부위의 주변부 검체를 채취하는 데 그치기 때문에, 실제 암세포가 존재하는 위치를 정확히 포착하지 못한 경우 오진의 위험이 있으며, 3) 검사 과정에서 대상의 직장 등에 상처가 발생, 이를 통해 감염증 등이 발생할 수 있다는 위험이 있다. 따라서, 조직 검사의 신뢰도를 높이고, 실제로 검사가 필요한 환자에 한해서 제한적으로 조직 검사를 수행하기 위해 보조적인 진단 방법이 필요한 실정이다. 상기 PSA 테스트가 이러한 보조적인 진단 방법의 하나로 사용되고 있으나, 그 신뢰도가 떨어지고, 그레이 존(gray zone) 영역에 있는 경우 전립선암 발병 여부를 정확히 판단할 수 없는 등 많은 제한이 따른다.
배경지식 - miRNA 바이오마커 스크리닝 방법(BACKGROUND - SCREENING miRNA BIOMARKER)
특정 miRNA를 대상이 특정 질환에 걸렸는지 여부를 확인하는 바이오마커로 활용하기 위해서는, 우선 특정 질환이 발병한 대상이 정상인 대상에 비해 특정 miRNA를 이상 발현하는지 여부를 판별해야 한다. 상기 특정 miRNA를 선별하는 방법 중 대표적인 것이 miRNA microarray이다. 상기 miRNA microarray는 대상의 체액 샘플을 가지고, 인간에서 발현되는 것으로 알려져 있는 miRNA 대부분의 발현량을 스크리닝하는 방법으로, 주로 미리 제조되어 있는 키트(예를 들어, RNA 6000 Pico Chip Kit, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 대상의 샘플 내 miRNA의 발현량을 측정한다. 인간에게서 발현되는 miRNA의 종류는 약 1,400종 (인간 유래 약 1,200종, 바이러스 유래 약 150종 포함)으로, 알려진 인간 유전자 수에 비해 상대적으로 적으며, 그 서열 또한 잘 알려져 있기 때문에, 거의 모든 miRNA를 대상으로 스크리닝을 진행할 수 있다. 상용화된 키트를 사용하면 대상의 샘플 내에 있는 miRNA의 발현량을 대략적으로 구할 수 있다. 이를 이용해 전립선암이 발병한 대상 및 정상 대상의 샘플을 통해 상기 miRNA의 발현량을 비교하면, 어떤 miRNA가 전립선암이 발병한 대상에서 이상 발현하는지 찾아낼 수 있다. 다만, 상기 키트를 가지고는 스크리닝 목적으로 대략적인 발현량만을 구할 수 있고, 정규화(normalizing) 이슈 또한 있기 때문에, 정확한 진단능을 가진 바이오마커를 찾아내기 위해서는 추가적인 분석이 더 필요하다. 상기 miRNA microarray는 전립선암의 진단에 사용할 수 있는 바이오마커 후보군을 신속하게 찾아낼 수 있다는 장점이 있어, 본격적인 분석 작업 이전에 분석 대상 선별을 위해 널리 사용된다.
종래 기술의 한계점(LIMITATIONS OF THE PRIOR ART)
소변 샘플 사용 시 장점
대상의 체액 샘플을 가지고 특정 질환 감염 여부, 진행 정도 등을 진단하려 할 때, 체액 샘플로 대상의 소변을 사용하는 경우 여러 가지 장점이 있다. 우선, 혈액 또는 조직을 샘플로 사용할 때와는 달리 주사바늘 등을 사용할 필요가 없어 샘플 채취가 간편하고, 대상에게 고통을 줄 염려가 없다. 더 나아가, 상기 특정 질환이 남성의 비뇨기 질환인 경우, 소변이 배출되는 경로와 비뇨기 질환이 발생한 장소가 비교적 가까이 위치하기 때문에, 남성 비뇨기 질환에 한해서는 혈액 샘플보다 더 직접적인 정보가 포함될 가능성이 크다. 따라서, 남성의 비뇨기 질환에 대해 진단하려 할 때, 소변 샘플을 사용하는 것이 여러 모로 유리하다.
세포외 소포 유래 바이오마커 표적 시 장점
세포외 소포(extracellular vesicles)는 지질 이중막으로 구성되어 그 구조가 안정적이라는 특징이 있다. 따라서, 상기 세포외 소포 내에 포함되어 있는 핵산(예를 들어, DNA, RNA, 또는 miRNA 등) 또는 단백질 조각 등은 상기 세포외 소포를 인위적으로 파괴하지 않는 한, 시간이 지나도 안정적인 상태로 보존될 수 있다. 이는 혈액, 소변 들의 체액 샘플 내에 직접적으로 포함되어 있는 핵산 또는 단백질 조각 등이 시간이 지남에 따라 외부 요인에 의해 쉽게 분해되는 것과는 대조적이다. 따라서, 상기 세포외 소포 내에 포함되어 있는 물질을 바이오마커 표적으로 하는 경우, 샘플을 장기간 보관할 수 있다는 장점이 있다. 상기 세포외 소포는 소변 샘플에도 포함되어 있어 적절한 전처리 작업을 거친다면, 상기 세포외 소포 유래 물질을 상기 소변 샘플의 바이오마커 표적으로 이용 가능하다.
소변 내 세포외 소포 유래 바이오마커 측정 시 문제점
소변 내 세포외 소포 유래 물질을 바이오마커 표적으로 사용하는 경우, 전술한 특징 덕에 1) 샘플 확보가 용이하고, 2) 남성 비뇨기 질환 진단에 유리하며, 3) 샘플을 보관하기 용이하다는 장점이 있다. 하지만, 장점 만큼이나 단점도 뚜렷한데, 이는 1) 소변에 포함된 세포외 소포 유래 물질(예를 들어, miRNA 등)의 절대량 자체가 적고, 2) 샘플 또는 대상의 상태에 따라 상기 바이오마커 표적 포함량의 변동성이 심하다는 것이다. 샘플 내 포함된 바이오마커 표적의 발현량을 통해 특정 질환을 진단하기 위해서는 다수의 대상으로부터 복수의 샘플을 채취하여, 각 샘플 내 바이오마커 표적의 발현량을 비교하는 과정이 필수적이다. 따라서 소변 내 세포외 소포 유래 물질을 바이오마커 표적으로 사용하는 진단 방법을 개발하기 위해서는 상기한 단점을 극복해야 한다. 상기한 단점을 극복하기 위해서는 샘플 내 포함된 바이오마커 표적의 발현량에 대한 신뢰할 수 있는 정규화(normalizing) 과정이 필수적이다.
종래 기술적인 해결책 및 한계점
종래 문헌에 따르면, 상기 정규화 과정의 하나로 소변 내 세포외 소포 유래 바이오마커(예를 들어, miRNA)에 대해 하우스키핑 유전자(Housekeeping gene)를 찾으려는 시도가 있었으나 실패하였고, 샘플 내 miRNA의 총량으로 정규화하는 방법(H9, H18 논문), 전립선암 발병에 따라 상향 발현되는 바이오마커 및 하향 발현되는 바이오마커의 비율을 구해 정규화 필요성을 우회하려는 시도가 있었으나(Qiagen 특허), 그 효과가 제한적이라는 한계가 있다.
전립선암 진단 점수 계산 방법(A METHOD FOR CALCULATING DIAGNOSTIC SCORE)
진단 점수 계산 방법 - 개괄
본 명세서에서는 적어도 두 개의 값을 사용하여 전립선암에 대한 진단 점수를 계산하는 방법을 제공한다. 상기 진단 점수 계산 방법은 샘플 준비 과정, 제1 값 측정 과정, 제2 값을 측정 과정, 및 진단 점수를 계산 과정을 포함한다. 이때, 상기 샘플로는 대상의 소변 샘플을 사용한다. 상기 제1 값은 제1 타겟인 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679와 관련된 값으로, 상기 miRNA는 전립선암의 발병 여부에 대한 정보를 포함한다. 다만, 상기 제1 값은 내생성 인자의 영향이 반영되어 있어 전립선암 진단에 사용하기 위해서는 정규화(normalizing)가 필요하다. 상기 제2 값은 제2 표적인 샘플 내 세포외 소포 유래 miRNA와 관련된 값이다. 예를 들어, 상기 제2 표적은 세포외 소포 유래 hsv2-miR-H9-5p 또는 hsa-miR-1913일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제2 값은 상기 제1 값의 정규화 인자(normalizing factor)로 사용될 수 있으며, 상기 제2 값 또한 전립선암의 발병 여부에 대한 정보를 포함한다. 상기 제1 값을 측정하는 것 및/또는 상기 제2 값을 측정하는 것은 상기 제1 표적 및/또는 상기 제2 표적을 PCR(polymerase chain reaction)을 이용해 증폭하고, 그 결과를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 과정에서 획득한 제1 값 및 제2 값을 가지고 진단 점수를 계산하는데, 상기 진단 점수는 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 진단 능력을 가진다.
진단 점수 계산 방법 특징 1 - 소변 샘플 사용
본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은, 대상이 전립선암에 걸렸는지 여부를 진단하기 위해 사용할 수 있는 값이다. 상기 진단 점수 계산 방법은 소변 샘플을 사용하여 소변 샘플 내 포함된 바이오마커를 측정하는 것이 특징이다. 이는, 샘플 채취 방법이 간편하고 경제적이며, 대상에게 고통을 유발할 염려가 없다는 것이 장점이다. 또한, 상기 소변에는 전립선 세포에서 분비된 물질들이 직접 포함될 수 있으므로, 상기 진단 점수 계산 방법은 혈액 샘플로부터 전립선암과 관련된 바이오마커를 측정하는 것보다 더 직접적인 방법이 될 수 있다는 장점을 포함한다.
진단 점수 계산 방법 특징 2 - 세포외 소포 유래 miRNA 측정
본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은 샘플 내 적어도 둘 이상의 바이오마커 발현량을 측정해 전립선암 진단 점수를 계산하는 것이다. 이때, 상기 바이오마커는 소변 내 세포외 소포 내에 포함된 miRNA임을 특징으로 한다. 상기 세포외 소포는 지질 이중층(lipid bilayer)으로 둘러쌓여 안정적인 구조를 이루고 있으므로, 그 내부에 포함된 물질들(예를 들어, miRNA)을 외부 환경의 영향으로부터 효과적으로 차단한다. 따라서, 상기 세포외 소포가 파괴되지 않는 한 그 내부 물질들도 잘 보존된다는 특징이 있다. 따라서, 상기 세포외 소포 내에 포함된 miRNA를 측정 대상으로 하는 경우, 대상에서 샘플을 채취한 후 상기 샘플을 장기간 보관할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 상기 샘플의 보관 상태가 진단 점수 계산 결과에 미치는 영향이 크지 않다는 장점도 가진다.
진단 점수 계산 방법 특징 3 - hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679의 발현량 측정
종래 특허 제00호에 개시된 바에 따르면, hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679는 전립선암에 대한 바이오마커로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은 기본적으로 대상의 상기 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679의 발현량과 관련된 값을 사용하므로, 상기 방법에 의해 계산된 진단 점수는 전립선암의 발병 여부에 대한 진단능을 가진다.
진단 점수 계산 방법 특징 4 - hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679에 특화된 정규화 인자 사용
본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은 상기 소변 샘플 내 포함된 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679의 발현량에 특화된 정규화 인자(normalizing factor)를 사용하는 것이 특징이다. 일반적으로 바이오마커 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)에 대한 바이오마커를 발굴하여 사용하지만, 본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은 표적이 되는 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679에 특화된 정규화 인자를 사용한다. 정규화 인자로 하우스키핑 유전자에 대한 바이오마커를 사용하는 것에 대해, 1) 일반적으로 하우스키핑 유전자에 대한 바이오마커를 발굴하는 것은 매우 어려운 작업이고, 2) 소변 내 세포외 소포 유래 miRNA에 대해서는 하우스키핑 유전자와 관련 있는 바이오마커가 명확히 밝혀지지 않았다는 어려움이 있다. 이에 반해, 상기 표적에 특화된 정규화 인자를 사용하는 것은 1) 상기 하우스키핑 유전자에 대한 바이오마커 발굴의 어려움을 피할 수 있고, 2) 상기 표적의 발현량에 대한 더 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있다는 장점이 있다.
진단 점수 계산 방법 특징 4 - 전립선암 관련 인자를 정규화 인자로 사용
본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법에서, 상기 정규화 인자 또한 상기 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 포함하는 것이 특징이다.
따라서, 상기 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679의 발현량이 포함하는 전립선암에 대한 정보 및 상기 정규화 인자에 포함된 전립선암에 대한 정보를 조합하여 하나 이상의 가공된 정보를 도출할 수 있다. 예를 들어, 상기 가공된 정보는 전립선암 발병 여부에 대한 정보가 증폭된 것일 수 있다.
진단 점수의 용도
본 명세서에서 제공하는 진단 점수는 1) 전립선암 발병 여부에 대한 진단 기준을 결정하기 위해 사용될 수 있으며, 2) 상기 진단 기준을 참조하는 전립선암 진단 방법에 사용될 수 있다.
샘플 준비 과정(PREPERATION OF A SAMPLE)
샘플 준비 과정 - 개괄
본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법에 포함된 대상에 대한 샘플 준비 과정은, 대상에 대한 소변 샘플을 준비하는 것을 포함한다. 상기 과정은 상기 소변 샘플 내에 포함된 세포외 소포 유래 miRNA의 양을 측정하기 위한 적절한 전처리 과정을 더 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 샘플 준비는 상기 소변 샘플에 포함된 세포외 소포를 파괴하는 것을 포함할 수 있다.
샘플 종류
상기 샘플은 대상의 소변 샘플이다. 일 구현예로, 상기 소변 샘플은 대상의 아침 첫 소변 샘플일 수 있다. 일 구현예로, 상기 소변은 대상에서 채취한 소변의 상층액 샘플일 수 있다. 일 구현예로, 상기 소변 샘플은 대상의 소변을 원심분리한 후, 상기 결과물의 상층액 샘플일 수 있다.
샘플 분량
상기 소변 샘플의 부피는 특별히 제한되지 않고, 필요에 따라 적절히 선택될 수 있다.
샘플 보관 온도
상기 소변 샘플의 보관 온도는 상기 샘플 내 포함된 표적 바이오마커를 안정적으로 보관할 수 있는 온도라면 특별히 제한되지 않는다.
샘플이 세포 외 소포를 포함
상기 소변 샘플은 대상의 세포에서 분비된 세포외 소포를 포함한다. 일 구현예로, 상기 세포외 소포는 엑소좀(exosome)일 수 있다. 일 구현예로, 상기 세포외 소포는 엑소좀(exosome), 마이크로낭포(microvesicle), 및 자멸 사체(apoptotic body)로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
샘플 소분 가능
상기 소변 샘플은 필요에 따라 소분하여 사용될 수 있다. 일 구현예로, 제1 샘플은 제1 서브 샘플(subsample) 및 제2 서브 샘플로 나눠질 수 있다. 일 구현예로, 제2 샘플은 3개 이상의 서브 샘플로 나눠질 수 있다.
샘플 준비 과정 - 예시
상기 샘플 준비에서 소변 샘플 준비 과정은 상기 제1 값 및 제2 값을 획득하기 위해 필요한 과정이라면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 샘플 준비는 상기 대상의 소변 상층액 샘플을 준비하는 것일 수 있다. 상기 샘플을 준비하는 것은 샘플을 전처리하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 샘플을 전처리하는 것은 상기 목적하는 세포외 소포 유래 miRNA의 발현량과 관련된 값을 측정하기 위해 필요한 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 소변 샘플 준비는 상기 대상의 소변 샘플에 적절한 키트를 사용하여 소변 내의 miRNA를 추출하는 것을 추가로 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 키트는 공지된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어, Genolution urine miRNA purification kit (Genolution Pharmaceuticals Inc., Seoul, Korea)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
제1 값 획득(OBTAINING A FIRST VALUE)
제1 값 획득 - 개괄
본 명세서에서 제공하는 상기 진단 점수 계산 방법에서, 상기 제1 값은 전립선암 진단능이 있는 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679와 관련된 값이다. 일 구현예로, 상기 제1 값은 상기 샘플 내 포함된 제1 타겟의 양과 관련된 값일 수 있다. 이때, 상기 제1 타겟은 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 및/또는 hsa-miR-3679이다. 상기 제1 값은 대상이 전립선암에 걸렸는지 여부에 대한 정보를 반영하고 있다. 다만, 상기 제1 값 단독으로는 대상이 전립선암에 걸렸는지 여부를 판단하기 힘든데, 이는 상기 제1 값에는 대상이 전립선암에 걸렸는지 여부에 대한 정보와 더불어 다양한 내생성 인자(endogenous factor)의 영향이 동시에 반영되어 있기 때문이다. 일 구현예로, 상기 제1 값은 전립선암에 대한 진단능을 가지는 제1 정보 및 상기 제1 정보와는 독립적인 내생성 인자에 의해 발생한 제1 노이즈가 동시에 반영되어 있을 수 있다. 상기 제1 값을 획득하는 방법은 상기 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679의 양과 관련된 값을 구할 수 있는 방법이라면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것은 상기 샘플 내 하나 이상의 miRNA를 PCR(polymerase chain reaction)을 이용해 증폭하고, 그 결과로부터 상기 샘플 내 상기 하나 이상의 miRNA의 양을 구하는 것을 포함할 수 있다.
소변 내 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679를 표적으로 함
상기 제1 값은 전립선암 진단능이 있는 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679와 관련된 값이다.이는 miRNA Assay 방법을 이용해 찾아낸 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 포함하는 바이오마커에 해당한다. 본 발명자들은 연구를 통해 대상의 소변 내 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 및 hsa-miR-3679가 정상 대상에 비해 전립선암이 발병한 대상에게서 하향 발현한다는 사실을 발견하였다. 따라서, 본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은 대상의 소변 샘플 내 포함된 상기 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 및/또는 hsa-miR-3679를 타겟으로 하여, 상기 타겟의 상기 샘플 내 포함량을 구하는 것을 포함한다.
제1 값 획득 방법 예시 - PCR
일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것은 상기 소변 샘플 내 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679를 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 증폭시키고, 그 결과로부터 제1 값을 획득하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 PCR을 통해 증폭시키는 방법은 통상의 기술자가 공지된 방법을 적절히 선택한 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것은 샘플 내 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 및/또는 hsa-miR-3679를 제1 타겟으로 하고, 상기 제1 타겟의 cDNA를 합성하는 것; 상기 cDNA에 서열번호 1 내지 2로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머를 포함하는 반응 시약과 혼합하여 PCR 증폭용 혼합물을 만드는 것; 상기 PCR 증폭용 혼합물을 RT-PCR을 통해 증폭시키는 것; 및 상기 RT-PCR 결과로부터 상기 제1 타겟의 샘플 내 포함량을 구하는 것을 더 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 RT-PCR 결과는 반응 사이클 수(cycle number) vs.　형광 신호 세기(fluorescence signal intensity) 그래프 및/또는 멜팅 커브를 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것은 공지의 PCR 장비를 사용하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 장비는 Rotor Gene 6000 instrument (Qiagen, Hilden, Germany)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제1 값 단독 사용의 한계 - 내생성 인자의 영향
대상의 샘플 내 포함된 상기 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679의 양이 상기 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 반영하고 있음에도 불구하고, 제1 값을 단독으로 전립선암의 발병 여부 및/또는 전립선암의 진행 정도를 진단하는 데 사용할 수 없다. 이는, 제1 값에는 상기 전립선암 발병 여부에 대한 정보 외에, 상기 정보와는 독립적인 내생성 인자(endogenous factor)의 영향이 동시에 반영되어 있기 때문이다. 따라서, 상기 내생성 인자의 영향을 제거하거나, 감소시키거나, 및/또는 통제하지 않는 한 상기 제1 값은 전립선암의 발병 여부 및/또는 전립선암의 진행 정도를 진단하는 데 단독으로 사용하기 힘들다. 상기 내생성 인자는 전립선암과는 독립적인 다양한 인자들을 통틀어 일컫는데, 이하 더 자세히 서술한다.
내생성 인자(ENDOGENOUS FACTOR)
내생성 인자 - 정의
특정 질환에 대한 바이오마커의 발현량을 측정할 때, 상기 바이오마커의 발현량에 영향을 주는 요인은 여러 가지가 있다. 본 명세서에서 “내생성 인자”라 함은, 상기 특정 질환과 관련된 요인(예를 들어, 발병 여부 및 진행 정도) 외 상기 바이오마커의 발현량에 영향을 주는 요소 중 샘플 또는 대상 자체에 관련된 인자를 통틀어서 일컫는다. 상기 바이오마커의 샘플 내 포함량은 상기 특정 질환의 영향 뿐 아니라 상기 내생성 인자의 영향도 동시에 반영하고 있으므로, 상기 바이오마커의 발현량을 특정 질환의 진단에 사용하기 위해서는 상기 내생성 인자의 영향을 제거하거나, 감소시키거나, 및/또는 통제하는 것이 매우 중요하다.
내생성 인자 예시 1 - 샘플 관련 인자
상기 내생성 인자는 샘플과 관련된 인자를 포함할 수 있다. 상기 샘플과 관련된 인자라 함은, 샘플 내 바이오마커의 발현량에 영향을 줄 수 있는 인자들 중 샘플 자체의 속성과 관련된 인자를 통틀어 일컫는다. 일 구현예로, 상기 내생성 인자는 하나 이상의 샘플 관련 인자를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 샘플 관련 인자는 샘플의 분량, 샘플 수집 시기, 샘플 수집 방법, 샘플 보관 기간, 샘플 보관 온도, 또는 샘플 소분 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
내생성 인자 예시 2 - 대상 관련 인자
상기 내생성 인자는 대상과 관련된 인자를 포함할 수 있다. 상기 대상과 관련된 인자라 함은, 샘플 내 바이오마커의 발현량에 영향을 줄 수 있는 인자들 중, 대상의 전립선암 발병 여부와는 독립적인 생리 활동, 조건 등과 관련된 인자를 통틀어 일컫는다. 일 구현예로, 상기 내생성 인자는 하나 이상의 대상 관련 인자를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 대상 관련 인자는 대상의 성별, 대상의 연령, 대상의 인종, 대상의 체중, 대상의 신장 기능, 또는 샘플 수집 전 대상의 수분 공급 상황일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제2 값 획득(OBTAINING A SECOND VALUE)
제2 값 획득 - 개괄
상기 제2 값은 샘플 내 세포외 소포 유래 miRNA와 관련된 값이다. 일 구현예로, 상기 제2 값은 상기 샘플 내 포함된 세포외 소포 유래 miRNA의 양과 관련된 값일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포외 소포 유래 miRNA는 hsv2-miR-H9-5p 또는 hsa-miR-1913일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제2 값 역시 상기 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 포함하고 있다. 또한, 상기 제2 값에는 상기 내생성 인자의 영향이 반영되어 있는데, 제2 값에 반영된 내생성 인자의 영향은 상기 제1 값에 반영된 내생성 인자의 영향 정도와 밀접한 상관 관계를 가지고 있다. 따라서, 상기 제1 값은 상기 제2 값을 가지고 정규화(normalizing)될 수 있다. 달리 말해, 상기 제1 값에 반영된 상기 내생성 인자의 영향은 상기 제2 값을 사용함으로써 제거되거나, 감소되거나, 및/또는 통제될 수 있다. 일 구현예로, 상기 제2 값은 상기 대상이 전립선암에 걸렸는지 여부와 관련 있는 제2 정보 및 상기 내생성 인자와 관련 있는 제3 정보가 반영된 값일 수 있다. 이때, 상기 제3 정보는 상기 제1 노이즈와 밀접한 상관 관계가 있으며, 이로 인해 제1 값이 제2 값에 의해 정규화될 수 있다.
세포외 소포 유래 miRNA를 표적으로 함
상기 제2 값은 샘플 내 세포외 소포 유래 miRNA와 관련된 값이다. 상기 제1 값에 반영된 내생성 인자의 영향을 제거하기 위해서는, 상기 제1 값과는 독립적인 값이면서, 동일한 상기 내생성 인자의 영향이 반영된 값이 필요하다. 상기 제2 값으로는 세포외 소포 유래 miRNA의 발현량과 관련된 값을 사용하는 것이 바람직한데, 이는 상기 제1 값 역시 세포외 소포 유래 miRNA(hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679)의 발현량과 관련된 값이므로, 내생성 인자의 영향이 동일하거나, 유사할 것이라고 생각할 수 있기 때문이다. 일 구현예로, 상기 제2 값은 샘플 내 포함된 세포외 소포 유래 miRNA의 양과 관련된 값일 수 있다.
제2 값 특징 1 - 내생성 인자에 대한 정보 포함
상기 제2 값은 상기 제1 값과 마찬가지로, 상기 내생성 인자의 영향이 반영되어 있다. 전술한 바, 상기 내생성 인자는 하나 이상의 샘플 관련 인자 및/또는 하나 이상의 대상 관련 인자를 포함한다.
제2 값 특징 2 - 전립선암 관련 정보 포함
상기 제2 값은 상기 제1 값과 마찬가지로, 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보도 함께 포함한다. 다만, 상기 제2 값에 포함된 전립선암 발병 여부에 대한 정보는 상기 제1 값에 포함된 정보와는 독립적이다. 일 구현예로, 상기 제2 값은 샘플 내 포함된 제2 타겟의 양과 관련된 값일 수 있다. 이때, 상기 제2 값은 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 제2 정보를 반영하고 있을 수 있다. 일 구현예로, 상기 제2 타겟은 정상 대상 또는 전립선 비대증이 있는 대상에 비해 전립선암이 발병한 대상에서 상향 발현하는 것일 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 제2 타겟은 정상 대상 또는 전립선 비대증이 있는 대상에 비해 전립선암이 발병한 대상에서 하향 발현하는 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 제2 타겟은 세포외 소포 유래 hsv2-miR-H9-5p, hsv1-miR-H18 또는 hsa-miR-1913일 수 있다.
제2 값 특징 3 - 제1 값에 반영된 내생성 인자 영향과의 밀접한 상관 관계
상기한 바 제2 값은 1) 세포외 소포 유래 miRNA를 표적으로 하고, 2) 전립선암 관련 정보를 포함하며, 3) 상기 내생성 인자에 대한 정보를 포함하는 것을 특징으로 한다. 하지만, 상기 세 가지 조건을 만족한다고 해서 본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법의 제2 값으로 활용될 수 있는 것은 아니다. 이는, 상기 제2 값을 구하는 목적이 제1 값에 반영된 내생성 인자의 영향을 제거하거나, 감소시키거나, 및/또는 통제하기 위함이기 때문이다. 따라서, 제2 값에 반영된 내생성 인자의 영향은, 제1 값에 반영된 내생성 인자의 영향과 밀접한 상관 관계(correlation)를 가져야 한다. 본 명세서에서 제공하는 상기 제2 값을 사용하면, 제1 값에 반영된 내생성 인자의 영향을 제거하거나, 감소시키거나, 및/또는 통제할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제2 값은 상기 제1 값에 반영된 내생성 인자의 영향인 제1 노이즈와 밀접한 상관 관계를 가진 제3 정보를 포함하고 있을 수 있다.
제2 값 획득 방법 예시 - PCR
일 구현예로, 상기 제2 값을 획득하는 것은 상기 소변 샘플 내 세포외 소포 유래 miRNA를 PCR을 통해 증폭시키고, 그 결과로부터 제2 값을 획득하는 것을 포함할 수 있다. 구체적인 PCR 방법은 <제1 값 획득 방법 예시 - PCR> 단락에 기재한 바와 같다. 이때, 상기 cDNA와 혼합하는 반응시약에 포함된 프라이머의 구체적인 서열은 제2 값을 구하는 대상인 상기 세포외 소포 유래 miRNA의 서열에 따라 달라질 수 있다. 일 구현예로, 상기 제2 값을 획득하는 것이 세포외 소포 유래 hsv2-miR-H9-5p 및/또는 hsa-miR-1913를 제2 타겟으로 하는 경우, 상기 반응시약에 포함된 프라이머는 서열번호 3 내지 4로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
제1 값 획득 및 제2 값 획득 과정 간의 관계
본 명세서에서 제공하는 전립선암에 대한 진단 점수 계산 방법에 포함된 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 전술한 조건 및 특징을 만족한다면, 각각의 순서 및 방법은 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 동시에 수행될 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 순차적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 값을 획득한 후, 상기 제2 값을 획득할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 제2 값을 획득한 후, 상기 제1 값을 획득할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 동일한 방법으로 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 동일한 PCR 방법을 통해 수행될 수 있다. 더 나아가, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 동일한 PCR 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 서로 다른 방법으로 수행될 수 있다. 일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 상기 샘플 내에서 다른 분리 과정 없이 수행될 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 상기 샘플을 두 개 이상의 서브 샘플로 소분한 후, 상기 서브 샘플에 대해 각각 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 샘플을 제1 서브 샘플 및 제2 서브 샘플로 소분한 후, 상기 제1 서브 샘플로부터 상기 제1 값을 획득하고, 상기 제2 서브 샘플로부터 상기 제2 값을 획득할 수 있다.
진단 점수 계산(CALCULATING DIAGNOSTIC SCORE)
진단 점수 계산 - 개괄
본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은 전술한 제1 값을 획득하는 것 및 제2 값을 획득하는 것에서 얻어진 제1 값 및 제2 값을 사용하여 진단 점수를 계산하는 것을 포함한다. 일 구현예로, 상기 전립선 암에 대한 진단 점수를 계산하는 것은 상기 제1 값 및 상기 제2 값을 사용하여 계산하며, 그 결과, 상기 진단 점수는 전립선암 진단에 사용할 수 있다.
진단 점수 특징 - 전립선암 관련 바이오마커 정보 반영
상기 진단 점수는 상기 제1 값에 반영되어 있는 내생성 인자의 영향을 상기 제2 값을 사용하여 정규화(normalization)한 결과이므로, 제1 값에 반영된 전립선암의 발병 여부 및/또는 진행 정도와 관련된 정보를 포함한다. 따라서, 상기 진단 점수는 전립선암에 대한 진단능을 가진다.
진단 점수 계산 방법 예시
상기 진단 점수 계산은 1) 상기 제1 값 및 상기 제2 값을 모두 사용할 것, 2) 상기 진단 점수에서는 상기 제1 값 및 상기 제2 값에 반영된 내생성 인자의 영향이 제거되거나, 감소되거나, 및/또는 통제되어 있을 것, 두 가지 조건을 만족한다면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 진단 점수는 상기 제1 값 및 상기 제2 값의 비율로 계산될 수 있다.
전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법(A METHOD FOR DETERMINING TEST CRITERIA TO DIAGNOSE PROSTATE CANCER)
전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법 - 개괄
본 명세서에서는 전립선암에 대한 진단 점수를 사용하여 전립선암 진단 테스트 기준을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 전립선암에 대한 진단 점수는 전립선암이 발병한 대상군 및 전립선암이 발병하지 않은 대상군에 대해 서로 다른 양상(예를 들면, 각 대상군 별 상기 진단 점수의 평균값이 상이함)으로 나타나므로, 각 대상 별 전립선암 발병 여부를 미리 알고 있는 코호트에 대해 각 대상 별 상기 진단 점수의 분포를 분석하면 전립선암 진단 테스트 기준을 결정할 수 있다. 일 구현예로, 상기 전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법은 코호트에 포함된 대상으로부터 전립선암 발병 여부에 대한 정보 및 전립선암에 대한 진단 점수를 포함하는 데이터셋을 획득하는 것; 및 상기 데이터셋으로부터 전립선암 진단 테스트 기준을 결정하는 것을 포함한다. 이때, 상기 코호트는 하나 이상의 전립선암이 발병한 대상 및 하나 이상의 전립선암이 발병하지 않은 대상을 포함한다. 또한, 상기 전립선암 진단 점수는 본 명세서에서 제공하는 전립선암에 대한 진단 점수 계산 방법으로 계산된 것이다.
코호트
상기 전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법은 하나 이상의 대상에 대해 전립선암 발병 여부 정보 및 상기 전립선암에 대한 진단 점수를 필요로 한다. 따라서, 상기 방법은 전립선암이 발병하지 않은 하나 이상의 대상 및 전립선암이 발병한 하나 이상의 대상을 포함하는 코호트를 대상으로 한다. 일 구현예로, 상기 전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법은 하나 이상의 정상 대상 또는 전립선 비대증 발병 대상, 및 하나 이상의 전립선암 발병 대상을 포함하는 코호트에 대해 수행될 수 있다.
데이터셋 획득
상기 전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법은 상기 코호트에 포함된 각각의 대상으로부터 전립선암 발병 여부 정보 및 상기 전립선암에 대한 진단 점수를 포함하는 데이터셋을 획득하는 것을 포함한다. 일 구현예로, 상기 전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법은 제1 데이터셋을 구하는 것을 포함하고, 상기 제1 데이터셋은 코호트 내 각 대상에 대한 전립선암 발병 여부에 대한 정보 목록 및 코호트 내 각 대상에 대한 진단 점수 목록을 포함한다. 이때, 상기 진단 점수는 본 명세서에서 제공하는 전립선암에 대한 진단 점수 계산 방법으로 계산된 것이다.
진단 테스트 기준 결정
상기 전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법은, 상기 데이터셋으로부터 진단 테스트 기준을 결정하는 것을 포함한다. 상기 진단 테스트 기준은 전립선암 발병 여부를 알 수 없는 대상에 대해 상기 진단 점수를 획득한 경우, 상기 대상이 전립선암이 발병했는지 여부를 판단하는 기준이 된다. 일 구현예로, 상기 데이터셋으로부터 진단 테스트 기준을 결정하는 것은 상기 테스트 기준의 민감도(sensetivity) 및 특이도(specificity)를 고려하여 결정하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 테스트 기준은 상기 민감도 및 특이도를 최대화하는 기준일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 테스트 기준은 특정 민감도 값 이상을 나타내는 기준일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 테스트 기준은 특정 특이도 값 이상을 나타내는 기준일 수 있다. 일 구현예로, 상기 진단 테스트 기준은, 상기 진단 점수 값에 따라 전립선암 발병 확률을 제공하는 것일 수 있다.
전립선암 진단 정보 제공 방법(A METHOD FOR PROVIDING AN INFORMATION TO DIAGNOSE PROSTATE CANCER)
본 명세서에서는 상기 진단 점수를 가지고 전립선암 진단 정보를 제공하는 방법을 개시한다. 이때, 상기 진단 테스트 기준을 사용할 수 있다. 일 구현예로, 상기 전립선암 진단 정보를 제공하는 방법은 대상에 대해 상기 진단 점수를 계산하는 것; 및 하나 이상의 미리 결정된 값을 참조하여, 상기 진단 점수로부터 전립선암에 대한 리스크 팩터를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 미리 결정된 값은 상기 진단 테스트 기준일 수 있다.
전립선암 진단 점수 계산 방법 - 정리
본 명세서에서는 적어도 두 값을 조합하여 전립선암 진단 점수를 계산하는 방법을 제공한다. 상기 전립선암 진단 점수 계산 방법은 샘플을 준비하는 과정, 제1 값을 획득하는 과정, 제2 값을 획득하는 과정, 및 진단 점수 계산 과정을 포함한다. 상기 샘플은 대상의 소변 샘플임을 특징으로 하고, 상기 제1 값은 상기 샘플 내 포함된 세포 외 소포(extracellular vesicle) 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679-5p를 제1 타겟으로 하며, 상기 제1 타겟의 포함량과 관련된 값이며, 상기 제2 값은 상기 샘플 내 포함된 세포 외 소포 유래 miRNA를 제2 타겟으로 하며, 상기 제2 타겟의 포함량과 관련된 값이다. 상기 제1 값 및 제2 값 모두 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 포함하고 있으며, 상기 제2 값은 상기 제1 값에 특화된 정규화 인자(normalizing factor)에 해당한다. 따라서, 상기 방법에 따라 계산된 전립선암 진단 점수는 전립선암에 대한 진단능을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서는 상기 전립선암 진단 점수의 용도를 제공한다. 1) 상기 전립선암 진단 점수를 사용하여 전립선암 진단 기준을 결정할 수 있으며, 2) 상기 전립선암 진단 점수 및 상기 전립선암 진단 기준을 사용하여 전립선암 발병 여부 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.
이하, 실험예 및 실시예를 통해 본 명세서가 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1 실험 대상 및 샘플 준비
실험예 1.1 실험 대상
전립선암 진단 점수 계산을 위해, 샘플을 채취할 실험 대상군을 준비했다. 실험 대상군은 전립선암이 발병하지 않은 전립선 비대증(BPH, Benign prostatic hyperplasia) 환자 및 전립선암이 발병한 환자가 모두 포함되어 있었다. 상기 실험 대상군의 특징은 하기 표 1과 같다.
실험 대상에 대한 정보
Variables BPH PCa p-value
Patients number 14 12
Patients number(PSA 3 to 10 ng/mL) 6 5
Age (mean ± SD) 74.21 ± 7.50 68.83 ± 5.87 0.080
PSA ± SD (ng/mL) 3.28 ± 3.88 6.92 ± 181.30 0.035
Operation (%) < 0.001
TURP 14 (100.00) 2 (16.67)
Radical prostatectomy 10 (83.33)
Gleason Score (%)
7 (3+4) 7 (58.33)
7 (4+3) 3 (25.00)
8 ≥ 2 (16.67)
TNM Stage (%)
T2 6 (50.00)
T3 4 (33.33)
T4 or metastasis 2 (16.67)
BPH, 전립선 비대증; PCa, 전립선암; SD, 표준 편차; PSA, prostate-specific antigen; TURP, 전립선 경요도 절제술. P-values는 BPH 대상 및 PCa 대상의 소변 샘플을 가지고, Mann-Whitney U-test를 통해 구한 값이다.
실험예 1.2 샘플 준비
실험예 1.1에서 준비한 대상군 각각에 대한 샘플을 준비했다. 샘플 준비 과정은 다음과 같다.
(1) 아침에 대상의 소변을 수집했다.
(2) 상기 소변 샘플을 원심 분리기(제원)를 사용하여 2,500 rpm에서 15분 간 원심 분리했다.
(3) 상기 소변의 상층액을 샘플로 채집하여, 다음 과정에서 사용할 때까지 -20℃에서 보관했다.
실험예 1.3 샘플 전처리
실험예 1.2에서 준비한 소변 샘플에 대해, 제1 값 및 제2 값을 구하기 위한 전처리 작업을 수행했다. 이는 다음과 같다.
(1) 상기 소변 샘플을 정제하기 위해 Genolution urine miRNA purification kit (Genolution Pharmaceuticals Inc., Seoul, Korea)가 사용됐다.
(2) 상기 소변 샘플의 상층액 500 μL를 Genolution proprietary miRNA separation solution를 포함하는 튜브에 첨가하고 20초간 볼텍싱(vortexing) 시켰다.
(3) 상기 튜브에 클로로포름(chloroform) 200 μL를 첨가하고 10초간 볼텍싱 시켰다.
(4) (3)과정 후의 튜브를 4℃13,000 rpm에서 10분 간 원심분리했다.
(5) (4)과정 후의 튜브 상층의 650 μL 액체상을 제거했다. 이때, 상기 튜브 내 백색 침전물은 제거되지 않도록 하였다.
(6) (5)과정 후 튜브 내에 남은 샘플을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고, 0.8 mL의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가했다.
(7) (6)과정 후의 튜브를 4℃15,000 rpm에서 20분 간 원심분리했다.
(8) (7)과정 후의 튜브를 RNA pellet의 반대 방향으로 기울여 액체상을 따라내 제거했다.
(9) (8)과정 후의 튜브에 500 μL의 70% EtOH를 첨가했다.
(10) (9)과정 후의 튜브를 4℃15,000 rpm에서 20분 간 원심분리했다.
(11) (10)과정 후의 튜브에서 잔여 에탄올을 제거한 후, 남은 펠렛을 40 μL의 RNase-free water에 용해시키고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관했다.
실험예 2 샘플 내 타겟 miRNA 포함량 측정
실험예 1에서 준비된 샘플 내에 포함된 타겟 miRNA의 포함량을 PCR 방법으로 구했다. 구체적인 PCR 방법은 다음과 같다.
(1) 실험예 1.3에서 준비된 샘플에 대해, Mir-X™miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit (TAKARA BIO, Otsu, Japan)으로 cDNA를 합성했다. 이때, 상기 cDNA 합성 방법은 제조사의 프로토콜을 따랐다.
(2) (1) 과정의 결과물을, SYBR Premix EX Taq (TAKARA BIO)가 포함된 micro-reaction 튜브(Corbett Research, Mortlake, Australia) 내 최종 10 μL의 부피로 첨가하고, Rotor-Gene Q instrument (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 RT-PCR 분석하였다. 이때, 상기 타겟 miRNA 각각과 상응하는 프라이머(RNA oligonucleotides)(Integrated DNA Technologies (IDT), Seoul, Korea)를 각 타겟 miRNA의 standard curve를 생성하기 위해 사용하였다. 사용한 상기 타겟 miRNA와 이에 상기 프라이머의 서열은 다음 표 2와 같다.
타겟 miRNA 및 상응하는 프라이머 서열 목록
타겟 miRNA 프라이머 서열(RNA oligonucleotides) 서열 번호(SEQ ID NO)
hsa-miR-3659 5'- TGA GTG TTG TCT ACG AGG GCA -3' 1
hsa-miR-3679-5p 5'- TGA GGA TAT GGC AGG GAA GGG GA -3' 2
hsv2-miR-H9 5'- CTC GGA GGT GGA GTC GCG GT -3' 3
hsv1-miR-H18 5'- CCC GCC CGC CGG ACG CCG GGA CC -3' 4
hsa-miR-1913 5'- TCT GCC CCC TCC GCT GCT GCC A -3' 5
hsa-miR-30a-5p 5'-TGT AAA CAT CCT CGA CTG GAA G -3' 6
hsa-miR-30c-5p 5'- TGT AAA CAT CCT ACA CTC TCA GC -3' 7
hsa-miR-31-5p 5'- AGG CAA GAT GCT GGC ATA GCT -3' 8
(3) 상기 standard curve는 2.25 x 105 내지 2.25 x 108 범위에서 생성되었고, 모든 샘플에 대해 3회 측정되었으며, RT-PCR 조건은 각 제조사의 프로토콜을 따랐다.
(4) 결과물인 스펙트럼 데이터의 수집 및 분석을 위해 Rotor-Gene Q software 2.3.1.49를 사용했다.
실험예 3 통계 분석
실험예 3.1 진단 점수 계산
상기 실험예 2에서 구한 샘플 내 타겟 miRNA 포함량을 제1 값(제1 타겟) 또는 제2 값(제2 타겟)으로 하여 진단 점수를 계산하였다. 상기 진단 점수는 두 타겟 miRNA의 샘플 내 포함량의 비로 계산하였으며, 실시예 별 구체적인 타겟은 다음 표 3에 나타나있다.
실시예 및 비교예 목록
번호 제1 타겟 제2 타겟
실시예 1 hsa-miR-3659 hsv2-miR-H9
실시예 2 hsa-miR-3659 hsa-miR-1913
실시예3 hsa-miR-3679-5p hsv2-miR-H9
실시예4 hsa-miR-3679-5p hsa-miR-1913
실시예5 hsa-miR-3659 hsv1-miR-H18
실시예 6 hsa-miR-3679-5p hsv1-miR-H18
비교예 1 hsa-miR-31-5p hsa-miR-30a-5p
비교예2 hsa-miR-31-5p hsa-miR-30c-5p
실험예 3.2 각 실시예 별 진단능 검증
실험예 3.1에서 구한 각 실시예 별로 전립선암에 대한 진단능을 검증하기 위해 다음과 같은 통계 분석을 실시하였다.
(1) 각 실시예의 진단 점수가 대상군 별로 통계적으로 유의한 차이가 있는지, Mann-Whitney U-test를 사용하여 계산했다. 상기 통계적 유의성은 i) 전체 BPH 대상 대비 전체 전립선암 발병 대상, ii) PSA Gray zone (PSA 농도 3 ng/L 내지 10 ng/L)인 BPH 대상군 대비 PSA Gray zone인 전립선암 발병 대상군에 대하여 계산되었다.
(2) 가장 높은 특이도(specificity) 및 민감도(sensetivity)를 도출할 수 있는 최적의 컷오프 기준을 구하기 위해, 각 실시예 별로 실험 대상군에 대해 ROC(Receiver Operating Characteristic) 커브를 도출했다. 또한, 상기 ROC 커브에 대해 AUC(Area Under Curve), 및 최적의 민감도, 특이도를 각각 도출하였다. 상기 ROC 커브는 i) 전체 대상군, 및 ii) PSA Gray zone인 대상군에 대해 각각 도출되었다.
본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법 및 이를 이용한 전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법은 전립선암 발병 여부 및 그 위험도 진단을 위한 정보를 도출하는 데 사용될 수 있다.

Claims (14)

  1. 적어도 두 값을 조합하여 전립선암에 대한 진단 점수를 계산하는 방법으로, 다음을 포함함:
    대상의 샘플을 준비하는 과정,
    이때, 상기 샘플은 소변 샘플임;
    상기 샘플 내의 제1 타겟의 포함량과 관련된 제1 값을 획득하는 과정,
    이때, 상기 제1 타겟은 샘플 내 포함된 세포외 소포(extracellular vesicle) 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679이고,
    상기 제1 값은 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 진단능을 가지는 제1 정보를 반영하고,
    다만, 상기 제1 값은 상기 전립선암 발병 여부 진단에 단독으로 사용할 수 없는데, 이는 상기 제1 값은 상기 제1 정보와 함께 제1 노이즈를 동시에 반영하고 있기 때문이며,
    상기 제1 노이즈는 내생성 인자에 의해 야기된 것으로, 상기 내생성 인자는 전립선암 관련 인자와는 독립된 것임;
    상기 샘플 내의 제2 타겟의 포함량과 관련된 제2 값을 획득하는 과정,
    이때, 상기 제2 타겟은 샘플 내 세포외 소포 유래 miRNA이고,
    상기 제2 값은 전립선암 발병 여부와 관련된 제2 정보를 반영하고 있고,
    상기 제2 값은 상기 내생성 인자와 관련된 제3 정보를 반영하고 있고,
    상기 제3 정보는 상기 제1 노이즈와 유의한 상관 관계를 가지며,
    이로 인해 상기 제1 값에 반영된 상기 제1 노이즈는 상기 제2 값을 사용하여 통제될 수 있음;
    상기 제1 값 및 상기 제2 값을 사용하여 전립선암에 대한 진단 점수를 계산하는 과정,
    이로 인해 상기 진단 점수는 전립선암에 대한 진단에 사용될 수 있음.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제2 타겟은 hsv2-miR-H9-5p, 또는 hsa-miR-1913인 진단 점수 계산 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 진단 점수는 제1 값 및 제2 값의 비로 계산되는 진단 점수 계산 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 내생성 인자는 다음을 포함하는 진단 점수 계산 방법:
    상기 샘플과 관련된 제1 컨디션; 및
    상기 대상과 관련된 제2 컨디션.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1 컨디션은 다음으로 이뤄진 군에서 선택되는 하나 이상인 진단 점수 계산 방법:
    상기 샘플의 양, 상기 샘플의 수집 시간, 상기 샘플의 수집 방법, 상기 샘플의 보관 기간, 상기 샘플의 보관 온도, 상기 샘플의 소분 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 제2 컨디션은 다음으로 이뤄진 군에서 선택되는 하나 이상인 진단점수 계산 방법:
    상기 대상의 성별, 상기 대상의 나이, 상기 대상의 인종, 상기 대상의 몸무게, 상기 대상의 신장 기능, 상기 대상의 수분 공급 상태.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1 값을 구하는 과정은 다음을 더 포함하는 진단 점수 계산 방법:
    상기 샘플 내 제1 타겟의 제1 cDNA를 합성하는 과정;
    상기 제1 cDNA를 제1 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction)으로 증폭시키는 과정,
    이때, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1 내지 2로 이뤄진 군에서 선택됨; 및
    상기 제1 cDNA 증폭 결과로부터 상기 제1 값을 결정하는 과정;
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제2 값을 구하는 과정은 다음을 더 포함하는 진단 점수 계산 방법:
    상기 샘플 내 제2 타겟의 제2 cDNA를 합성하는 과정;
    상기 제1 cDNA를 제2 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction)으로 증폭시키는 과정,
    이때, 상기 제2 프라이머는 상기 제2 타겟과 상동성을 가지는 서열, 또는 상기 제2 타겟과 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 포함하고,
    상기 제2 cDNA 증폭 결과로부터 상기 제2 값을 결정하는 과정.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제2 타겟은 hsv2-miR-H9-5p, 또는 hsa-miR-1913이고,
    상기 제2 프라이머는 서열번호 3 및 5로 이뤄진 군에서 선택되는, 진단 점수 계산방법.
  10. 전립선암 진단을 위한 진단 기준 결정 방법으로, 다음을 포함함:
    제1 데이터셋을 획득하는 과정,
    이때, 상기 제1 데이터셋은,
    코호트 내 각 대상의 전립선암 발병 여부 목록, 및
    상기 코호트 내 각 대상에 대해, 제1항의 방법에 따라 계산된 진단 점수 목록을 포함하고,
    상기 코호트는,
    적어도 하나의 정상 대상 또는 전립선 비대증 발병 대상, 및
    적어도 하나의 전립선암 발병 대상을 포함하고; 및
    상기 제1 데이터셋으로부터 전립선암 진단을 위한 진단 기준을 결정하는 과정.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 진단 기준은 상기 진단 점수와 동일한 차원을 가지는 단일 값인, 진단 기준 결정 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 진단 기준은 하나 이상의 전립선암 발병 확률 값을 포함하는, 진단 기준 결정 방법.
  13. 대상의 전립선암 발병 여부 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로, 다음을 포함함:
    상기 대상에 대해 제1항에 따른 전립선암 진단 점수를 계산하는 과정; 및
    상기 전립선암 진단 점수를 가지고, 적어도 하나의 미리 결정된 값을 참조하여 리스크팩터를 결정하는 과정.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 미리 결정된 값은 제9항의 방법에 따라 결정된 진단 기준인,
    전립선암 발병 여부 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
PCT/KR2020/012128 2020-09-08 2020-09-08 전립선암 진단 점수 계산 방법 및 그 용도 WO2022054976A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20953378.5A EP4212632A4 (en) 2020-09-08 2020-09-08 PROSTATE CANCER DIAGNOSIS SCORE CALCULATION METHOD AND ASSOCIATED USES
PCT/KR2020/012128 WO2022054976A1 (ko) 2020-09-08 2020-09-08 전립선암 진단 점수 계산 방법 및 그 용도
JP2022581715A JP2023540426A (ja) 2020-09-08 2020-09-08 前立腺癌診断スコアを算出するための方法及びそれの使用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2020/012128 WO2022054976A1 (ko) 2020-09-08 2020-09-08 전립선암 진단 점수 계산 방법 및 그 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022054976A1 true WO2022054976A1 (ko) 2022-03-17

Family

ID=80632213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2020/012128 WO2022054976A1 (ko) 2020-09-08 2020-09-08 전립선암 진단 점수 계산 방법 및 그 용도

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4212632A4 (ko)
JP (1) JP2023540426A (ko)
WO (1) WO2022054976A1 (ko)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160006673A (ko) * 2013-03-15 2016-01-19 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 진단 및 치료를 위한 엑소좀 내 miRNA 생합성
US20170121779A1 (en) * 2014-06-12 2017-05-04 Toray Industries, Inc. Prostate cancer detection kit or device, and detection method
KR20180045062A (ko) 2011-01-24 2018-05-03 애브비 바이오테크놀로지 리미티드 주사기로부터 니들 실드의 제거 및 자동 주사 디바이스들
WO2019175786A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Fondazione Edo Ed Elvo Tempia Valenta Per La Lotta Contro I Tumori An in vitro diagnostic method for prostate cancer and related kit
KR20190110834A (ko) * 2018-03-21 2019-10-01 가톨릭대학교 산학협력단 딥러닝 기반의 전립선암 병리학적 단계 예측 방법
KR102052398B1 (ko) * 2018-04-18 2019-12-05 (주)유로테크 전립선암 진단용 바이오마커 및 이의 용도

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103797131A (zh) * 2011-06-16 2014-05-14 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 生物标志物组合物和方法
CA2844671A1 (en) * 2011-08-08 2013-02-14 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. Biomarker compositions and methods
KR20150108493A (ko) * 2014-03-17 2015-09-30 충북대학교 산학협력단 바이러스 인코딩된 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p의 전립선암에 대한 진단 용도

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180045062A (ko) 2011-01-24 2018-05-03 애브비 바이오테크놀로지 리미티드 주사기로부터 니들 실드의 제거 및 자동 주사 디바이스들
KR20160006673A (ko) * 2013-03-15 2016-01-19 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 진단 및 치료를 위한 엑소좀 내 miRNA 생합성
US20170121779A1 (en) * 2014-06-12 2017-05-04 Toray Industries, Inc. Prostate cancer detection kit or device, and detection method
WO2019175786A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Fondazione Edo Ed Elvo Tempia Valenta Per La Lotta Contro I Tumori An in vitro diagnostic method for prostate cancer and related kit
KR20190110834A (ko) * 2018-03-21 2019-10-01 가톨릭대학교 산학협력단 딥러닝 기반의 전립선암 병리학적 단계 예측 방법
KR102052398B1 (ko) * 2018-04-18 2019-12-05 (주)유로테크 전립선암 진단용 바이오마커 및 이의 용도

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP4212632A4
YUN ET AL., INT NEUROUROL J, vol. 19, 2015, pages 17 - 84

Also Published As

Publication number Publication date
EP4212632A1 (en) 2023-07-19
EP4212632A4 (en) 2024-07-17
JP2023540426A (ja) 2023-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2012081898A2 (ko) 위암의 예후 예측용 마커 및 이를 이용하는 위암의 예후 예측 방법
WO2018038452A1 (ko) 신장질환 조기 진단용 바이오마커 sbp1 및 이의 이용
US20100255481A1 (en) Method for detection of adenoma or cancer by genetic analysis
WO2018097646A1 (ko) 질환의 진단용 조성물
WO2014027831A1 (ko) 방광암 예후 진단 마커
WO2022075788A1 (ko) LINC01798 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물 및 이의 용도
WO2022054976A1 (ko) 전립선암 진단 점수 계산 방법 및 그 용도
WO2019225923A1 (ko) 질환의 진단용 조성물
WO2011081421A2 (en) Complement c9 as markers for the diagnosis of cancer
WO2017164568A1 (ko) V-ATPase subunit V1E1의 단백질 발현 수준을 측정하여 식도암 환자의 생존율과 예후를 예측하는 방법
WO2019132581A1 (ko) 유방암 및 난소암 등 암 진단용 조성물 및 이의 용도
WO2022203314A2 (ko) 악성말초신경초종의 감별진단을 위한 조성물
CN111518890B (zh) Galnt2作为子宫内膜增生或子宫内膜癌诊治标志物的应用
WO2017099414A1 (ko) 암 진단용 마이크로rna 바이오마커 발굴 방법 및 그 이용
WO2021025412A1 (ko) 보체 성분 c8 감마를 이용한 알츠하이머병의 진단방법
WO2012060636A2 (ko) 위암 진단 방법
WO2022250517A1 (ko) 전립선암 진단용 바이오마커 및 이의 용도
WO2018088826A2 (ko) 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이의 용도
WO2024096467A1 (ko) 종양주변 정상조직을 이용한 대장암 예후 예측용 마커
WO2016200246A1 (ko) 담도암의 항암제 내성 진단용 신규 바이오마커 및 이의 용도
WO2022039550A1 (ko) Srebp2의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단용 조성물
WO2023149608A1 (ko) 흑색종 치료 내성 예측용 trim51 바이오마커 및 이의 용도
WO2022149911A1 (ko) 전이성 고형암 환자의 예후 진단 및 치료 전략 결정용 전이기간 특이적 마커
WO2023234485A1 (ko) 위암 발병 가능성 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도
WO2023167544A1 (ko) Fam167a를 포함하는 bcr-abl 비의존성 타이로신 키나아제 억제제 내성을 진단하기 위한 바이오마커 및 fam167a를 타겟으로 하는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20953378

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022581715

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020953378

Country of ref document: EP

Effective date: 20230411