WO2018088826A2 - 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention is a composition, kit for predicting colorectal cancer metastasis or predicting prognostic colorectal cancer, comprising an agent for measuring the level of mRNA of the squalene epoxidase gene or a protein thereof and a method for providing information for diagnosing or predicting colorectal cancer metastasis It is about.
  • Colorectal cancer refers to a tumor composed of cancer cells of the large intestine. Specifically, in the large intestine, polyps are grown from adenomas, most of which grow into benign tumors, but some are known to develop into malignant tumors.
  • Colorectal cancer can be expected to be cured if it is found early, but the later it is found, the more metastatic the cancer will be in the lungs, liver, lymph nodes or peritoneum.
  • the average time of recurrence of colorectal cancer is 12 to 24 months, and about 70% of recurrences are known to occur within 24 months, and 90% of recurrences are known after 3 to 5 years.
  • stages 1 to 4 As a major symptom of the disease, no symptoms appear initially, and in the absence of symptoms, anemia, anorexia and weight loss due to invisible bowel bleeding appear. Colorectal cancer is classified into stages 1 to 4 according to the degree of progression. Specifically, stages 1 and 2 mean that the cancer cells infiltrate only to the submucosa or the muscle layer, and lymph node metastasis occurs in stage 3 or more.
  • colon cancers have no symptoms in the early stages, and if they are present, they are already quite advanced. Therefore, it is important to diagnose this early, but since there are many cases of no special abnormality, it is difficult to diagnose colon cancer metastasis.
  • Korean Patent Nos. 10-1007573 and 10-0969692 have developed a method for diagnosing colorectal cancer using a colon cancer overexpression gene. However, this is only to check whether colorectal cancer is developed and thus, colorectal cancer is developed. There is still a need to develop a method for diagnosing the prognosis and prognosis of colorectal cancer.
  • the present invention is confirmed by measuring the expression level of squalene epoxidase, thereby confirming that it is possible to diagnose colon cancer metastasis and prognosis more effectively.
  • the present invention is confirmed by measuring the expression level of squalene epoxidase, thereby confirming that it is possible to diagnose colon cancer metastasis and prognosis more effectively.
  • An object of the present invention is to provide a composition for diagnosing or predicting colon cancer metastasis, comprising an agent for measuring the level of mRNA of the squalene epoxidase gene or a protein thereof.
  • Another object of the present invention to provide a kit for diagnosing or predicting colon cancer metastasis, comprising the composition.
  • Another object of the present invention is to measure the mRNA level or protein level of the squalene epoxidase gene in a sample isolated from a subject with colorectal cancer; And (b) comparing the measured mRNA level or protein level thereof with the mRNA level or protein level thereof of a control sample in which stage 1 or 2 colorectal cancer develops. It is to provide a method.
  • Another object of the present invention is to measure the mRNA level or protein level of the squalene epoxidase gene in a sample isolated from a subject with colorectal cancer; And (b) comparing the measured mRNA level or protein level thereof with the mRNA level or protein level of the control sample who died due to colorectal cancer, thereby providing an information providing method for predicting the prognosis of colorectal cancer. will be.
  • the present invention provides a composition comprising an agent for measuring the level of mRNA of the squalene epoxidase gene or a protein thereof, to diagnose colon cancer metastasis or prognosis.
  • Figure 1 confirms the accumulation of cholesterol in the cells by cholesterol treatment by concentration.
  • Figure 2 confirms the mobility of colorectal cancer cells by cholesterol treatment.
  • Figure 3 confirms the epithelial-mesenchymal transitional induction of colon cancer cells and increased survival of colon cancer cells by cholesterol treatment.
  • Figure 4 confirms the decrease in SqE and p53 expression by cholesterol treatment.
  • Figure 5 confirms the promotion of degradation of SqE protein by cholesterol.
  • Figure 6 confirms the colorectal cancer cell migration by siSqE treatment.
  • Figure 7 confirms the induction of epithelial-mesenchymal transition in colorectal cancer cells by reduced SqE expression.
  • Figure 8 confirms the increased survival of colorectal cancer cells by cholesterol treatment using an adhesion inhibitory cell culture dish.
  • 9 is a statistical treatment of the increase in survival of colorectal cancer cells by cholesterol treatment using an adhesion inhibitory cell culture dish.
  • Figure 11 confirms the increase in metastatic capacity of colorectal cancer cells by reducing SqE expression.
  • Figure 15 confirms the promotion of colorectal cancer metastasis by high cholesterol intake and reduced SqE expression in a mouse model.
  • Figure 17 confirms the changes in SqE, p53 and GSK3 ⁇ (serine9) expression according to the progression of colorectal cancer in human colorectal cancer tissues.
  • 21 is a comparative analysis results of prognostic efficiency of colon cancer patients of each biomarker based on the ROC curve.
  • compositions for diagnosing colorectal cancer metastasis comprising an agent for measuring the level of mRNA of the squalene epoxidase gene or a protein thereof.
  • squalene epoxidase is an enzyme that oxidizes squalene to 2,3-oxidosqualene using oxygen and NADPH.
  • the enzyme is one of the rate limiting enzymes in sterol biosynthesis and is known to catalyze the step of oxygenation in the sterol biosynthesis pathway.
  • squalene epoxidase is encoded by the SQLE gene.
  • Squalene epoxidase is another name is called squalene monooxygenase (SqMO), SQLE and the like.
  • the squalene epoxidase may be mixed with SqE. Genetic information thereof may be obtained from a known database. Examples thereof include GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI), but are not limited thereto.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • squalene epoxidase is NCBI GenBank Accession No. NM_003129.3, but is not limited thereto.
  • Such squalene epoxidase of the present invention is not only an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 but also at least 80%, specifically at least 90%, more specifically at least 95%, particularly at least 97% homology with the sequence It may include an amino acid sequence having a.
  • sequence having such homology any amino acid sequence representing a protein exhibiting the same or corresponding efficacy as that of each of the above proteins is included without limitation.
  • it is an amino acid sequence having such homology it is obvious that the amino acid sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added is also included in the scope of the present invention.
  • the gene encoding the respective proteins of the present invention is not only a base sequence encoding the amino acid described by the respective SEQ ID NO, but also 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more of the sequence More specifically, 98% or more, and more specifically, 99% or more, as long as it is a gene sequence encoding a protein that exhibits substantially the same or corresponding potency as each of the above proteins, without limitation.
  • the base sequence having such homology it is obvious that the base sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added is also included in the scope of the present invention.
  • homology refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Homology between sequences from one moiety to another may be determined by known techniques. For example, homology can be determined by aligning sequence information and directly aligning sequence information between two polynucleotide molecules or two polypeptide molecules using readily available computer programs.
  • the computer program may be BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign TM (DNASTAR Inc), or the like, but any program capable of determining homology may be used without limitation.
  • homology between polynucleotides can be determined by hybridizing polynucleotides under conditions of stable double-stranding between homologous regions, and then digesting them with single-strand-specific nucleases to determine the size of the digested fragments. no.
  • the squalene epoxidase protein of the present invention or the gene encoding the same is a squalene epoxidase protein derived from various mammals, including humans, genes encoding the same or functional thereof, as long as it has an active function of oxidizing squalene to 2,3-oxido squalene. It is a concept that includes homologous proteins as equivalent.
  • the squalene epoxidase protein of the present invention is not only a protein having its native amino acid sequence, but also a homologous protein thereof is included in the scope of the present invention.
  • the squalene epoxidase protein or homologous protein thereof may be extracted or synthesized in nature and prepared by genetic recombination method based on DNA sequence.
  • the gene encoding the squalene epoxidase protein in the present invention may be isolated or artificially modified by nature.
  • agent to measure the level of protein means an agent to be used in a method of measuring the level of a target protein included in a sample.
  • Agents for measuring the level of the protein may comprise an antibody, or aptamer, specific for the protein.
  • the preparation may be Western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis (rocket immunoelectrophoresis), immunohistochemical staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, immunofluorescence, immunochromatography, FACS (fluorescenceactivated cell sorter) It may include, but is not limited to, antibodies used in methods such as analysis) and protein chip technology assays.
  • antibody refers to a proteinaceous molecule capable of specifically binding to the antigenic site of a protein or peptide molecule. Such an antibody can be produced by a conventional method from the obtained protein by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method to obtain a protein encoded by the marker gene.
  • the form of the antibody is not particularly limited and may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a part thereof as long as it has antigen binding, and all immunoglobulin antibodies may be included in the antibody of the present invention.
  • special antibodies such as humanized antibodies may be included.
  • the antibodies include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least antigen binding function and may be Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • aptamer refers to a single stranded oligonucleotide, and refers to a nucleic acid molecule having binding activity to a predetermined target molecule.
  • the aptamer may have various three-dimensional structures according to its nucleotide sequence, and may have a high affinity for a specific substance, such as an antigen-antibody reaction. Aptamers can inhibit the activity of a given target molecule by binding to the desired target molecule.
  • the aptamers of the invention may be RNA, DNA, modified nucleic acids, or mixtures thereof, and may be linear or cyclic in form, but are not limited thereto.
  • the aptamers of the present invention can be used for squalene epoxidase. Aptamers having a binding activity to the squalene epoxidase can be easily prepared according to methods known to those skilled in the art with reference to the respective base sequences.
  • the term "agent for measuring mRNA level” refers to an agent used in a method for measuring the level of mRNA transcribed from the target gene in order to confirm expression of a target gene included in a sample.
  • the agent may be RT-PCR, quantified real time PCR, competitive RT-PCR, real time quantitative RT-PCR, RNase protection assay (RPA; RNase). It may include, but is not particularly limited to, primers or probes that can specifically bind to target genes used in methods such as protection assays, Northern blotting, DNA chip assays, and the like.
  • the "primer” is a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, which can form complementary templates and base pairs and serves as a starting point for template strand copying. Short nucleic acid sequence. Primers can be initiated for DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures.
  • the "probe” may be a probe capable of complementarily binding to a squalene epoxidase gene, and the nucleotide sequence of the probe is not limited as long as it can bind complementarily to each of the genes.
  • composition in the present invention may further comprise an agent for measuring the mRNA level of the p53 gene or the level of protein expressed therefrom.
  • agent for measuring mRNA levels and "agent for measuring protein levels” are as described above.
  • p53 is a tumor suppressor gene and plays an important role in regulating responses such as cell cycle changes, cell death, DNA damage repair and cell aging caused by various stresses such as DNA damage, hypoxia and abnormal expression of tumor genes.
  • p53 activation of p53 following DNA damage is known to regulate the expression of genes involved in cell cycle congestion, DNA damage repair, and cell death such as p21, Bax, PUMA and MDM2 (Juven et al ., Oncogene, 8: 3411). -3416, 1993; Barak et al ., EMBO J, 12: 461-468, 1993).
  • p53 is reduced in expression during colorectal cancer metastasis, and can be used together with squalene epoxidase to more accurately diagnose colorectal cancer metastasis.
  • colonal cancer metastasis of the present invention means that tumor cells of colorectal cancer migrate and settle and proliferate in other places. Specifically, unlike normal cells, colorectal cancer cells grow by invading surrounding tissues, and thus, when they meet tube-like structures such as blood vessels or lymphatic vessels, they may move to other places by taking blood or lymph fluid. When the colon cancer cells migrated to other organs or tissues, the cells divide and grow again, which is called colon cancer.
  • diagnosis of the present invention means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether or not metastatic colorectal cancer.
  • the survival of colorectal cancer cells is increased by the decreased expression of squalene epoxidase (FIG. 7), the expression of p53 is suppressed, and the metastatic capacity of colorectal cancer cells is increased. (Figs. 10 and 11). Accordingly, the present inventors have developed the present invention by deciding that the expression of squalene epoxidase may be a target for diagnosing colorectal cancer metastasis. This corresponds to a mechanism opposite to that known in the field of colorectal cancer, which diagnoses colorectal cancer through overexpression of conventional squalene epoxidase.
  • kits for diagnosing colorectal cancer comprising a composition for diagnosing colorectal cancer metastasis.
  • the kit may be a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, a DNA chip kit, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit. It may be, but is not limited thereto.
  • the kit for measuring the mRNA expression level of the squalene epoxidase or p53 gene of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • the RT-PCR kit includes a test tube or other suitable container, reaction buffers (pH and magnesium concentrations vary), deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymers, in addition to each primer pair specific for squalene epoxidase or p53 gene.
  • Enzymes such as enzymes and reverse transcriptases, DNases, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. It may also comprise primer pairs specific for the genes used as quantitative controls.
  • kits of the present invention may include the necessary elements necessary to perform DNA chip assays.
  • the DNA chip analysis kit may include a substrate on which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached with a probe, and a reagent, a preparation, an enzyme, or the like for preparing a fluorescence-labeled probe.
  • the substrate may comprise cDNA corresponding to the quantitative control gene or fragment thereof.
  • the kit of the present invention may be a protein chip analysis kit for measuring the level of the protein expressed from the squalene epoxidase gene
  • the kit is not particularly limited thereto, but is described, suitable for immunological detection of antibodies It may include a secondary antibody, a chromogenic substrate, and the like labeled with a buffer solution, a chromogenic enzyme or a fluorescent substance.
  • the substrate is not particularly limited thereto, but a nitrocellulose membrane, a 96 well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96 well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like may be used.
  • peroxidase alkaline phosphatase
  • the fluorescent material is not particularly limited, but may be FITC, RITC, and the like, and the colorant substrate solution is not particularly limited thereto.
  • Another aspect of the invention (a) measuring the mRNA level or protein level of the squalene epoxidase gene in a sample isolated from a subject with colorectal cancer; And (b) comparing the measured mRNA level or protein level thereof with the mRNA level or protein level thereof of a control sample in which stage 1 or 2 colorectal cancer develops. It is to provide a method.
  • the information providing method may further comprise the step of (a) measuring the mRNA level or protein level of the p53 gene in a sample isolated from the individual with colorectal cancer.
  • the term "individual” may refer to any animal, including humans, who have metastasized or are likely to have metastasized, assuming colon cancer has developed.
  • the animal may be a mammal such as, but not limited to, a human, a cow, a horse, a sheep, a pig, a goat, a camel, a antelope, a dog, a cat, and the like, which require treatment of similar symptoms.
  • MRNA levels of the squalene epoxidase gene are reverse transcriptase polymerase (RT-PCR), competitive reverse transcriptase polymerase (competitive RT-PCR) and real time quantitative RT-PCR (real time quantitative RT-PCR). ), RNase protection method (RNase protection method), Northern blotting (Northern blotting) or DNA chip technology (DNA chip technology assay), but is not limited thereto.
  • the protein level of the squalene epoxidase, p53 is Western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunoasiffusion (radial immunodiffusion), oukteroni immunodiffusion method (Ouchterlony immunodiffusion), rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, immunofluorescence, immunochromatography (immunochromatography), FACS (fluorescenceactivated cell sorter analysis) and protein chip technology (protein chip technology assay) can be measured using any one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • control group refers to an individual who develops colorectal cancer, and specifically, an individual whose colorectal cancer cells do not metastasize to another organ or tissue, for example, lymph node metastasis or blood. More specifically, the individual may have stage 1 or 2 colorectal cancer. Colorectal cancer can be divided into stages 1 through 4 based on the Asler-Coller staging system or TNM classification. Specifically, according to the TNM method, cancer cells may be classified as colon cancer 1 if they are limited to the submucosa or near mucosa, and cancer cells may be classified as colon cancer 2 if they invade adjacent neighboring organs without penetrating the submucosa or lymph nodes. National Cancer Information Center http://www.cancer.go.kr.
  • sample refers to a direct subject separated from a patient suffering from colorectal cancer and measuring the expression level of the squalene epoxidase gene.
  • the sample may be colorectal cancer cells or colorectal cancer tissue.
  • the information providing method may further include determining the colorectal cancer metastasis when the expression level of squalene epoxidase, p53 protein measured in the sample is lower than the protein expression level of the normal control sample.
  • Another aspect of the invention (a) measuring the mRNA level or protein level of the squalene epoxidase gene in a sample isolated from a subject with colorectal cancer; And (b) comparing the measured mRNA level or protein level thereof with the mRNA level or protein level of the control sample who died due to colorectal cancer, thereby providing an information providing method for predicting the prognosis of colorectal cancer.
  • the information providing method may further comprise the step of (a) measuring the mRNA level or protein level of the p53 gene in a sample isolated from the individual with colorectal cancer.
  • control group refers to an individual who has died of colorectal cancer, and specifically, may be an individual who has died of metastasis of colon cancer cells to another organ or tissue, for example, lymph node metastasis or blood.
  • sample refers to a direct subject which is isolated from a patient who has died from colorectal cancer and measures the expression level of the squalene epoxidase gene. Specifically, the sample may be colorectal cancer cells or colorectal cancer tissue. have.
  • the term "prognosis” refers to the act of predicting the progress of a disease and the consequences of death or survival in advance. More specifically, the prognosis or prognosis prediction may vary according to the physiological or environmental condition of the patient, and means all actions for predicting the progress of pre and post-treatment in consideration of the patient's condition. It can be interpreted as. For the purposes of the present invention, the prognosis may be interpreted as an act of predicting disease-free survival or survival rate of colon cancer patients by predicting before and after treatment of colon cancer and the progress and cure of the disease.
  • predicting "good prognosis" indicates a high level of disease-free survival or survival in patients with colorectal cancer regardless of treatment, indicating that patients with colorectal cancer are more likely to be treated, and "prognosis is poor.”
  • Predicting that the patient has low disease-free survival or survival after colorectal cancer treatment means that the cancer is more likely to recur or die from colorectal cancer.
  • disease free survival refers to the possibility that a patient can survive without recurrence of cancer regardless of treatment.
  • survival rate of the present invention means the possibility that the patient can survive whether the cancer recurred or not, regardless of treatment.
  • the information providing method may be to judge that the colon cancer prognosis is bad when the expression level of the squalene epoxidase protein measured in the sample is lower than the corresponding protein expression level in the control sample of survival colon cancer patients. Specifically, when the expression level of squalene epoxidase protein is lower than the corresponding protein expression level of the control sample of surviving colorectal cancer, colorectal cancer patients (e.g., patients with colorectal cancer, metastasized colorectal cancer, or relapse after colorectal cancer treatment) Predict the likelihood of death.
  • colorectal cancer patients e.g., patients with colorectal cancer, metastasized colorectal cancer, or relapse after colorectal cancer treatment
  • the viability of colorectal cancer patients with an expression level of squalene epoxidase of 0.01438 ⁇ 0.0071 is related to the viability of colorectal cancer patients in the range of -0.002650 ⁇ 0.0062. Means higher than, but not limited to.
  • the degree of expression of squalene epoxidase is -0.002650 ⁇ 0.0062 means that the mortality of colorectal cancer patients is significantly higher than, but not limited to, the mortality of colorectal cancer patients belonging to 0.001438 ⁇ 0.0071.
  • ROC curve analysis optimal cut-off value analysis of SqE, p53 and combinations thereof.
  • the analysis of the optimal cut-off value predicted by the maximum Youden index and the combination of SqE, p53 or SqE and p53 showed that the prognosis of the colorectal cancer patients could be predicted.
  • Colorectal cancer cell lines HCT116 and HT29 were cultured to confirm specific expression of SqE (squalene epoxidase) and related proteins by cholesterol and to confirm the function of the gene.
  • HCT116 was incubated in DMEM-high glucose (Corning, USA) and HT29 in RPMI-high glucose (Corning, USA).
  • the cell lines were 10% fetal calf serum, 100 mg / ml streptomycin, and 100 IU / ml empicillin. Cultured in the included medium.
  • the measurement of intracellular cholesterol was investigated by the following method using filin (Cayman, UK) which binds cholesterol. Cholesterol was treated to colon cancer cells by concentration and incubated for 3 days, and then fixed with methanol, followed by filin (filip III). After incubation at 37 ° C. for 60 minutes, images were obtained using an ultra-precision confocal microscope and quantitative calculations were performed using a program (Zen lite, Carl Zeiss, Germany).
  • transwell In order to observe colon cancer cell migration by cholesterol treatment, cell migration experiments using a transwell were performed. First, the bottom surface of a transwell (Corning Incorporated Costar, USA) having a pore size of 8 ⁇ m was coated with 2% gelatin (Sigma-Aldrich, USA), and then cell-free suspension of serum-free medium was added to the inside of the transwell. In this case, a medium containing 20 ⁇ M cholesterol and 20% serum was added to the external container. The cell suspension was incubated for 72 hours, and after the incubation, the inner surface of the insert was wiped with a cotton swab to remove the endothelial cells that did not move. The number of cells moved downward was counted in a 200-fold microscope field after staining with a crystal violet solution and then plotted and compared (FIG. 2).
  • Example 3 Epithelial of Colorectal Cancer Cells by Cholesterol Treatment- Mesenchyme Induced transition and increased survival of colorectal cancer cells
  • epithelial-mesenchymal transition reduction of E-cadherin and increased expression of N-cadherin, Vimenting
  • degradation of SqE protein were confirmed by 20 ⁇ M cholesterol treatment of colon cancer cells (FIG. 3).
  • Example 4 caused by cholesterol SqE And reduced expression of p53
  • the cells were planted in the same amount in 6-well plates and treated with 10 (HCT116) and 20 (HT29) ⁇ M cholesterol hourly (0, 4, 12, 24, 48 hours). Then, intracellular proteins were collected using RIPA buffer (Invitrogen, USA), and then Western blots were performed using antibodies to each. The antibodies used are shown in Table 2.
  • the degree of degradation of SqE protein by cholesterol in colorectal cancer cells was confirmed by the following method based on Western blot.
  • Colorectal cancer cell lines were inoculated into 6-well plates and after 24 hours 5% lipoprotein deficient serum with a group of cells treated with 200 nM siRNAs (siCont, siSqE) established in Example 5-1 under DMEM-high glucose medium conditions. ) And 20 ⁇ M of cholesterol in cells at 20 ⁇ g / ml cyclodextrin (LPDS / CD) medium under the conditions of time, and then the cells were blasted with RIPA buffer (invitrogen, USA) to collect proteins and use antibodies against SqE and GAPDH. Western blot was performed.
  • composition (10 ⁇ l) of the reverse transcriptase (cDNA) performed in Example 4-3 and the semiquantitative reverse transcriptase chain reaction (Semiquantative RT-PCR) performed with the primers shown in Table 3 is as follows: 2X premix PCR mixture (Nanohelix, South Korea) 5 ⁇ l, primers each 0.5 ⁇ M, template cDNA 1 ⁇ l. Semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction was performed for 2 minutes and 30 seconds at 95 ° C, followed by amplification reaction at 95 ° C for 20 seconds, 58 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 30 seconds, and stabilized amplification products at 72 ° C for 5 minutes. I was. Derived PCR results were confirmed using a 1% agarose gel.
  • Example 5 SqE Of colorectal cancer cells due to decreased expression Mobility Of Infiltration ability increase
  • siRNAs (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3) consisting of 20 nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO (SEQ ID NO: 1) were prepared.
  • the amino acid sequence of SqE is shown in SEQ ID NO: 16.
  • Example 6 SqE Epithelium of Colorectal Cancer Cells due to Reduced Expression- Mesenchyme Induced transition and increased survival of colorectal cancer
  • Anoikis is a type of cell death that occurs when cells do not adhere to the cell substrate or are attached to a non-intrinsic position. Cells can survive or grow in places other than the original organs. As a result, cancer metastasis is induced.
  • colonic cancer cells were cultured in ultra low attachment plates (Corning, USA) to confirm the increased viability of colon cancer cells in suspension by cholesterol treatment and simultaneously 20 ⁇ M cholesterol After treatment, the cells were photographed under a microscope to confirm cell survival. Simultaneously, 200 nM siRNAs established in Example 5 (5-1) were treated in colon cancer cells as a comparison group, and cultured under the same conditions to confirm cell survival (FIG. 8).
  • Example 7 Reduction of expression of p53 by inhibition of SqE expression
  • the protein expression level of p53 was decreased by the induction of the expression of hdm2, the inducer of p53 degradation by 200 nM siSqE treatment, and E-cadherin, an indicator of epithelial-mesenchymal transition, was also identified by the higher regulator of GSK3 ⁇ .
  • Induction of epithelial-mesenchymal transition of colorectal cancer cells by cholesterol was observed by observing that expression was significantly reduced through inactivation (increase of phospho-ser9 GSK3 ⁇ ) and activation of ⁇ -catenin (FIG. 10).
  • Example 8 Confirmation of promoting colorectal cancer metastasis by reducing SqE expression
  • Colorectal cancer cells stably inhibited SqE expression was constructed in accordance with the following method to confirm the increased metastatic capacity of colorectal cancer cells by reducing the SqE expression.
  • HCT11 and HT29 colorectal cancer cells were infected with SqE Mission shRNA Lentiviral Transduction Particles (Sigma: TRCN0000046155) and Mission pLKO.1-puro Non-Target shRNA Control Transduction Particles (Sigma: SHC016V). Thereafter, 4 ⁇ g PGL4.17, a luciferase vector, was treated with lipofectamine 3000 (invitrogen, USA) to observe the in vivo migration of human colorectal cancer cells.
  • cells were selected for about 3 weeks with 10 ⁇ g / ml puromycin and 0.3 mg / ml G418, and cells were propagated.
  • the transwell method was used to confirm the migration and invasion of colorectal cancer cells by SqE expression inhibition
  • the semi-quantative RT-PCR method was used to identify SqE of colorectal cancer cells. The degree of inhibition of expression was confirmed.
  • quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (quantative RT-PCR) method was used to confirm the expression level and luciferase activity of PGL4.17 inserted into colon cancer cells (FIG. 11).
  • HCT116-based shCont / shSqE cells established in Example 8 into the subcutaneou and the orthotopic of an experimental animal and comparing the control cells (shCont) for 100 days, the degree of metastasis of shSqE colon cancer cells in vivo was measured in vivo. Monitoring was performed using the luciferase method (IVIS Lumina II, Caliper Life Science). In addition, after 100 days, lung and liver were extracted and the progress of cancer was confirmed using the Hematoxylin / eosin staining method.
  • metastasis of colorectal cancer cells stably inhibited SqE expression was significantly increased compared to metastasis of control colorectal cancer cells (shCont), and also in liver and lung of experimental animals injected with shSqE.
  • a significant increase in cancer cells was confirmed.
  • lung tissue of experimental animals injected with shSqE cells significant increase of cancer cells and decrease of cell death were confirmed, and thus, significant increase of in vivo cell survival of colon cancer cells by SqE expression inhibition was confirmed. .
  • the lung tissue of rats established in Example 9-2 was extracted, and the progress of cancer was confirmed using the Hematoxylin / eosin staining method, and it was significantly higher in the high cholesterol or reduced SqE expression group than in the shCont / control feed group. Cancer production was confirmed (FIG. 16A). In addition, a significant increase in Vimentin, which indicates cancer cell invasion, was confirmed (FIG. 16B). In addition, increased survival of cancer cells and cells by the increase of the cancer cell marker Minichromosome maintenance complex component 7 (MCM7) and the decrease of Histone H2A.X and the apoptosis indicator caspase-3 (C3) in the high cholesterol intake or SqE expression group Inhibition of death was confirmed (FIG. 16C-D). In addition, the presence of a significant colorectal cancer cell marker CUB domain-containing protein 1 (CDCP1) was confirmed in the high cholesterol intake group and the SqE expression reduction group (FIG. 16M).
  • CCM7 cancer cell marker Minichromosome maintenance complex component
  • Tumor boundaries are not recognized as independent prognostic factors for colorectal cancer, but less than five tumor buddings are observed in the multiplex (x250-fold) field of view invading tumors that show invasive growth. It is reported that the prognosis is significantly worse.
  • Example 11 Tissue Microarray microarray ; TMA Expression Analysis of SqE and p53 by Image Analysis
  • TMA slides consisting of colorectal cancer tissue, colorectal cancer metastatic tissue, and normal tissue were purchased from US Biomax and stained using fluorescent immunostaining techniques using antibodies of SqE and p53 (x200). SqE and p53 expression patterns were analyzed. Quantitative expression analysis of each protein was performed using ZEN (blue edition) provided by Carl Zeiss. The obtained values were then converted through Global equalization, and then statistically analyzed using GraphPad Prism (Idikio et al., International Journal of Clinical Experimental Pathology 2011; 4: 505-512) (Table 6).
  • the area under the curve (AUC) of SqE was 0.7101 (95% CI: 0.6174-0.8029), which was higher than 0.5827 (95% CI: 0.4619-0.7035) of p53.
  • the combination (SqE + p53) AUC of the two proteins was found to be 0.6530 (95% CI: 0.5783-0.7276). This means that metastasis of colorectal cancer can be diagnosed by SqE alone or a combination of SqE and p53, p53 alone (FIG. 18).
  • the optimal cut-off values of SqE and p53 were calculated from the Table 6 data of Example 11 (primary cancer vs metastatic cancer), based on the optimal cut-off values of SqE and p53. Colorectal cancer metastasis diagnosis efficiency was confirmed.
  • Example 13 SqE prognostic sensitivity and specificity analysis of colorectal cancer patients
  • the AUC value of SqE was 0.6443 (95% CI (confidence interval): 0.5030-0.7856), which was higher than the AUC value of 0.6131 (95% CI: 0.4291-0.7971).
  • the combination (SqE + p53) AUC of the two proteins was found to be 0.6261 (95% CI: 0.5178-0.7344). This confirmed that the prognosis of colorectal cancer patients can be predicted by SqE alone or by a combination of SqE and p53 (FIG. 19).
  • the optimal cut-off values of SqE and p53 were calculated from the Table 6 data of Example 11 (survival vs death patients in colorectal cancer patients) to calculate optimal cut-off values of SqE and p53.
  • the prognostic sensitivity and specificity of colorectal cancer patients based on their values) were investigated.
  • Example 14 Tissue Microarray microarray ; TMA Analysis of Expression Patterns of CAF, CA19-9 and SqE, p53 in Clinical Use by Image Analysis
  • TMA slides consisting of various types of colorectal cancer, metastatic cancer and normal tissues from US Biomax, carcinoembryonic antigen (CEA), carbohydrate antigen (CA19-9), SqE using the method described in Example 11 was used.
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • CA19-9 carbohydrate antigen
  • SqE SqE using the method described in Example 11 was used.
  • p53 antibody was used and reacted under the same conditions, and the expression pattern was analyzed. The obtained values were then converted through Global equalization and then statistically analyzed using GraphPad Prism (Table 11).
  • Example 15 CEA , CA-19-9 and SqE sensitivity and specificity of colorectal cancer metastasis
  • the AUC value of CEA was 0.8867 (95% CI (confidence intervals): 0.8144-0.9590)
  • the AUC value of CA19-9 was 0.8075 (95% CI: 0.7140-0.9010)
  • the AUC value of SqE was 0.9983 (95 % CI (confidence intervals): 0.9938-1.003)
  • the AUC of p53 was 0.5208 (95% CI: 0.3734-0.6682).
  • SqE showed a significantly higher diagnostic efficiency of colorectal cancer metastasis than CEA and CA19-9. This means that SqE is a biomarker showing high efficiency in diagnosing colorectal cancer metastasis (FIG. 20).
  • the optimal cut-off values of CEA, CA19-9, SqE, p53 were calculated from the Table 11 data of Example 14 (primary cancer vs metastatic cancer) to optimize the CEA, CA19-9, SqE, p53. Colorectal cancer metastasis diagnostic efficiency based on cut-off value was confirmed.
  • SqE showed significantly higher Y-index, sensitivity, specificity than CEA and CA19-9 used in the clinic.
  • p53 was found to have lower Y-index and sensitivity and specificity than other biomarkers.
  • SqE showed significantly higher Y-index, sensitivity and specificity than biomarkers used in the clinic. This means that SqE is a biomarker with clinically high colorectal cancer metastasis diagnostic efficiency (Table 13).
  • Example 16 Comparative Analysis of the Prognosis of Colorectal Cancer Patients with CEA, CA-19-9 and SqE, p53
  • the AUC value of CEA was 0.6220 (95% CI (confidence intervals): 0.4653-0.7788), and the AUC value of CA19-9 was 0.5818 (95% CI: 0.4099-0.7538), and the AUC value of SqE was 0.6443 (95 % CI (confidence intervals): 0.5030-0.7856) and 0.6414 (95% CI: 0.4903-0.7924), an AUC value of p53.
  • SqE and p53 can predict the prognosis of colorectal cancer patients higher than CEA and CA19-9 used in the clinic. This means that SqE and p53 are biomarkers showing high efficiency in predicting the prognosis of colorectal cancer patients (FIG. 21).
  • Optimal cut-off values of CEA, CA19-9 and SqE, p53 were calculated from the Table 11 data of Example 14 (survival vs death) to determine optimal cut-off of CEA, CA19-9 and SqE, p53. Prognostic sensitivity and specificity of colorectal cancer patients based on cut-off values were investigated.
  • Example 14 To assess the accuracy of CEA, CA19-9, SqE, p53 as a diagnostic indicator of colorectal cancer patient death, the optimal cut predicted by the maximum Youden index from the Table 11 data (survival vs death) of Example 14 The prognostic sensitivity and specificity (%) of colorectal cancer patients with CEA, CA19-9 and SqE, p53 according to -off values were investigated.
  • SqE showed a Y-index similar to CEA and CA19-9 used in the clinic, but the sensitivity was confirmed to be significantly high. In contrast, p53 showed lower Y-index and specificity than other biomarkers. This means that SqE is a biomarker with clinically high diagnostic efficiency in predicting mortality outcome for colorectal cancer patients (Table 15).

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Abstract

본 발명에서는 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 및/또는 p53 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 전이 진단용 조성물을 이용하여, 대장암 전이를 진단 및/또는 대장암의 예후를 예측할 수 있다.

Description

대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물, 키트 및 대장암 전이 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
대장은 맹장과, 결장 (상행 결장, 횡행 결장, 하행 결장, S상 결장), 직장으로 분류되며, 수분과 비타민의 일부, 쓸개즙염, 빌리루빈 등을 흡수하고, 찌꺼기를 대변으로 몸 밖으로 배출하는 동시에 여러 종류의 많은 세균이 서식하는 곳이기도 하다. 대장암(colorectal cancer)은 대장에 생긴 암세포로 이루어진 종양을 의미한다. 구체적으로, 대장에서 폴립이 선종으로부터 성장된 것으로 대부분의 경우에는 양성종양으로 성장하나, 일부는 악성종양으로 발전하는 것으로 알려져 있다.
또한, 대장암은 고지방식품과 육식, 가공 식품과 인스턴트 식품의 섭취가 주요원인이 된다. 이들 식품을 많이 먹으면 콜레스테롤과 발암물질인 담즙산이 많이 분비되고, 콜레스테롤은 대사과정에서 발암물질을 만들며 담즙산은 대장 세포를 암세포로 변하게 하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
대장암은 이른 시기에 발견되면 완치를 기대해 볼 수 있으나, 발견시기가 늦어질수록 폐, 간, 림프절이나 복막 등 절제하기 어려운 곳으로의 전이가 일어난다. 대장암의 평균 재발 시기는 12 내지 24개월 후로 재발의 약 70%가 24개월 이내에 발생한다고 알려져 있으며, 수술 후 3 내지 5년에 90%가 재발되는 것으로 알려져 있다.
상기 질환의 주요 증상으로 초기에는 아무런 증상도 나타나지 않으며, 증상이 없는 경우에도 눈에 띄지 않는 장 출혈로 인한 빈혈, 식욕부진과 체중감소가 나타난다. 대장암은 진행 정도에 따라 1기에서 4기로 분류하며, 구체적으로 1기 및 2기는 암세포가 점막하증 또는 근육층까지만 침윤된 것을 의미하며, 3기 이상인 경우에 림프절 전이가 일어난 것을 의미한다.
대장암은 초기에는 대부분 아무런 증상이 없으며, 증상이 나타난 경우에는 이미 상당히 진행된 경우가 많다. 따라서, 이를 조기 진단하는 것이 중요하나, 특별한 이상 징후가 없는 경우가 많기 때문에, 대장암 전이의 진단에 어려움이 있다.
또한, 국내등록특허 제10-1007573호, 제10-0969692호에서는 대장암 과발현 유전자를 이용하여 대장암을 진단하는 방법을 개발하였으나, 이는 대장암 발병여부를 확인하는 것일 뿐이므로, 대장암 발병을 전제로 한 대장암 전이 여부 및 예후를 진단하는 방법을 개발하여야 할 필요성은 여전히 요구되는 실정이었다.
보다 효과적으로 대장암 전이 및 예후를 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 스쿠알렌 에폭시다제의 발현 수준을 측정하여, 대장암 전이 및 예후를 보다 효과적으로 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 1기 또는 2기의 대장암이 발병한 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암 전이의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 대장암으로 인해 사망한 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 제공하여, 대장암 전이 또는 예후를 진단할 수 있다.
도 1은 농도별 콜레스테롤 처리에 의한 세포내부의 콜레스테롤 축적을 확인한 것이다.
도 2는 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 이동능을 확인한 것이다.
도 3은 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 상피-중간엽 이행유도 및 대장암 세포의 생존 증가를 확인한 것이다.
도 4는 콜레스테롤 처리에 의한 SqE 및 p53 발현 감소를 확인한 것이다.
도 5는 콜레스테롤에 의한 SqE 단백질의 분해 촉진을 확인한 것이다.
도 6은 siSqE 처리에 의한 대장암 세포 이동을 확인한 것이다.
도 7은 SqE 발현 저하에 의한 대장암 세포에서 상피-중간엽 이행 유도를 확인한 것이다.
도 8은 부착저해 세포배양 접시를 이용한 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 생존 증가를 확인한 것이다.
도 9는 부착저해 세포배양 접시를 이용한 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 생존 증가를 통계적으로 처리한 것이다.
도 10은 siSqE 처리에 의한 p53 발현 감소를 확인한 것이다.
도 11은 SqE 발현 감소에 의한 대장암 세포의 전이능 증가를 확인한 것이다.
도 12, 13, 14는 in vivo 루시퍼라제법을 이용한 shSqE 대장암 세포의 전이 정도를 확인한 것이다.
도 15는 마우스 모델에서 고콜레스테롤 섭취 및 SqE 발현 감소에 의한 대장암 전이 촉진을 확인한 것이다.
도 16은 마우스 모델에서 고콜레스테롤 섭취 및 SqE 발현 감소에 의한 암의 악성화를 확인한 것이다.
도 17는 인간 대장암 조직에서 대장암 진행에 따른 SqE, p53 및 GSK3β (serine9) 발현 변화를 확인한 것이다.
도 18은 ROC (Receiver Operating Characteristic)곡선을 이용한 SqE 및 p53의 대장암 진단 민감도 및 특이도 분석 결과이다.
도 19는 ROC (Receiver Operating Characteristic)곡선을 이용한 SqE의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도 분석 결과이다.
도 20은 ROC curve에 기반한 각 바이오마커의 대장암 전이진단 효율 비교 분석 결과이다.
도 21는 ROC curve에 기반한 각 바이오마커의 대장암 환자 예후진단 효율 비교 분석 결과이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 전이 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "스쿠알렌 에폭시다제 (squalene epoxidase, SqE)"는 산소와 NADPH를 사용하여 스쿠알렌 (squalene)을 2,3-옥시도스쿠알렌 (2,3-oxidosqualene)으로 산화시키는 효소이다. 상기 효소는 스테롤(sterol) 생합성에서 속도를 제한하는 효소 중 하나로서 스테롤(sterol) 생합성 경로에서 산소화 하는 단계를 촉매하는 것으로 알려져 있다. 또한, 스쿠알렌 에폭시다제는 SQLE 유전자에 의해 암호화된다.
스쿠알렌 에폭시다제는 다른 이름으로 스쿠알렌 모노옥시게나제(squalene monooxygenase, SqMO), SQLE 등으로 불리워지고 있다. 또한, 본 발명에서는 상기 스쿠알렌 에폭시다제는 SqE와 혼용될 수 있다. 이의 유전적 정보는 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 미국 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 스쿠알렌 에폭시다제는 NCBI GenBank Accession No. NM_003129.3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이와 같은 본 발명의 스쿠알렌 에폭시다제는 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 특히 구체적으로는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 나타내는 아미노산 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
아울러, 본 발명의 상기 각 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 각 서열번호로 기재한 아미노산을 코딩하는 염기서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench(CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있으나, 상동성을 결정할 수 있는 프로그램이라면 제한 없이 이용할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스쿠알렌 에폭시다제는 대장암 전이시 발현이 감소하였으며, 또한 발현 감소에 따른 환자의 생존이 감소하는 것을 확인하였는바, 대장암 전이 진단 및 예후 예측에 유용하게 사용될 수 있음을 본 발명자들이 처음으로 규명하였다.
본 발명의 스쿠알렌 에폭시다제 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 스쿠알렌을 2,3-옥시도 스쿠알렌으로 산화시키는 활성 기능을 갖고 있는 한 인간을 포함한 다양한 포유류 유래의 스쿠알렌 에폭시다제 단백질, 이를 코딩하는 유전자 또는 이와 기능적으로 동등한 상동 단백질을 포함하는 개념이다.
본 발명의 스쿠알렌 에폭시다제 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 상동단백질 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 스쿠알렌 에폭시다제 단백질 또는 이의 상동단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있고, DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 본 발명에서 스쿠알렌 에폭시다제 단백질을 코딩하는 유전자는 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "단백질의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다.
상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 제제는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 등의 방법에 사용되는 항체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미한다. 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있다. 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
상기 "앱타머"는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명의 앱타머는 스쿠알렌 에폭시다제에 대하여 사용될 수 있다. 상기 스쿠알렌 에폭시다제에 결합 활성을 갖는 앱타머는 각각의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명의 용어 "mRNA 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 구체적으로 상기 제제는 RT-PCR, 정량 실시간 PCR(quantified real time PCR), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
한편, 상기 "프로브"는 스쿠알렌 에폭시다제 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 각 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
한편, 본 발명에서 상기 조성물은 p53 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 "mRNA 수준을 측정하는 제제" 및 "단백질 수준을 측정하는 제제"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "p53"은 종양 억제 유전자로서 DNA 손상, 저산소증 및 종양 유전자의 비정상적 발현과 같은 여러 스트레스에 의해 일어나는 세포 주기 변화, 세포 사멸, DNA 손상복구 및 세포노화 등과 같은 반응을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Vousden, Cell, 103:691-694, 2000; Vogelstein et al., Nature, 408:307-310, 2000). 또한, DNA 손상 후 일어나는 p53의 활성화는 p21, Bax, PUMA 및 MDM2와 같은 세포 주기 정체, DNA 손상복구, 세포 사멸에 관련된 유전자의 발현을 조절한다고 알려져 있다(Juven et al., Oncogene, 8:3411-3416, 1993; Barak et al., EMBO J, 12:461-468, 1993).
본 발명에서 p53은 대장암 전이시 발현이 감소하는바, 스쿠알렌 에폭시다제와 함께 대장암 전이를 더욱 정확하게 진단하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 콜레스테롤을 처리한 대장암 세포에서 SqE와 p53의 단백질 발현량이 유의하게 감소됨을 확인하였다(도 4). 또한, 일 실시예에서는 SqE 발현 저하에 의한 p53 발현 감소를 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯을 수행한 결과 siSqE 처리에 의한 p53 분해 유도자인 hdm2의 발현 증가 유도에 의한 p53의 단백질 발현량의 감소를 확인할 수 있었다(도 10).
이를 통해, 스쿠알렌 에폭시다제의 발현 억제에 의한 p53의 발현 감소가 대장암 전이의 진단 키트 제작을 위한 타겟이 될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 용어 "대장암 전이"란, 대장암의 종양세포가 이동하여 다른 장소에 정착하여 증식하는 것을 의미한다. 구체적으로, 대장암 세포는 정상세포와 달리 주위조직을 침범하면서 성장하기 때문에 혈관이나 림프관 등 튜브 형태의 구조물을 만나면 혈액이나 림프액 등을 타고 다른 곳으로 이동할 수 있다. 이렇게 이동하던 대장암 세포가 다른 장기나 조직에 자리를 잡으면 또다시 세포분열을 하면서 성장하게 되는데 이것을 대장암의 전이라고 한다.
본 발명의 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 대장암의 전이 여부 또는 전이 가능성 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 스쿠알렌 에폭시다제의 발현 저하에 의해 대장암 세포의 생존이 증가함을 확인하였고(도 7), p53의 발현이 억제되고, 대장암 세포의 전이능이 증가됨이 확인되었다 (도 10 및 도 11). 이에 본 발명자들은 스쿠알렌 에폭시다제의 발현 저하가 대장암 전이를 진단할 수 있는 타겟이 될 수 있을 것으로 판단하여 본 발명을 개발하게 되었다. 이는 종래 스쿠알렌 에폭시다제의 과발현을 통해 대장암을 진단하는 대장암 관련 분야에서 알려진 바와 반대되는 메커니즘에 해당한다. 또한, 본 발명에서의 SqE 및 p53의 발현 수준이 기존 임상에서 사용되고 있는 CAF, CA19-9보다 우수한 바이오마커임을 확인하기 위해 ROC 곡선 분석, 최적 컷-오프 값 (cut-off value)분석, 및 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값 분석을 수행한 결과, SqE는 임상에 사용되고 있는 CEA와 CA19-9보다 유의한 대장암 전이 진단 효율을 나타냄을 확인하였다. 이는 SqE가 대장암 전이 진단에 있어 높은 효율을 나타내는 바이오마커 임을 의미한다(도 20).
본 발명의 다른 하나의 양태는, 대장암 전이 진단용 조성물을 포함하는, 대장암 전이 진단용 키트를 제공한다. 구체적으로, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 스쿠알렌 에폭시다제 또는 p53 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 스쿠알렌 에폭시다제 또는 p53 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명의 키트는 스쿠알렌 에폭시다제 유전자로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 1기 또는 2기의 대장암이 발병한 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암 전이의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
또한, 상기 정보제공방법은 (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 p53 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 "스쿠알렌 에폭시다제", "p53" 및 "대장암 전이"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개체"란, 대장암이 발병되었음을 전제로 대장암이 전이되었거나 전이될 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay)에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 스쿠알렌 에폭시다제, p53의 단백질 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "대조군"이란, 대장암이 발병된 개체를 의미하는 것으로, 구체적으로는 대장암 세포가 다른 장기나 조직, 예를 들어 림프절 전이 또는 혈액 등으로 전이 되지 않은 대장암이 발병된 개체, 더욱 구체적으로는 1기 또는 2기의 대장암이 발병한 개체일 수 있다. 대장암은 애슬러-콜러 분류법(Astler-Coller staging system)이나 TNM 분류법을 바탕으로 병기를 1기에서 4기까지로 나눌 수 있다. 구체적으로 TNM법 분류법에 따라, 암세포가 점막하층 또는 근츅층까지만 국한된 경우를 대장암 1기로 분류하고, 암세포가 장막하층을 뚫거나 림프절 전이없이 인접한 주위 장기까지 침윤한 경우를 대장암 2기로 분류할 수 있다 (국가암정보센터 http://www.cancer.go.kr).
본 발명의 용어 "시료"란, 대장암이 발병된 환자로부터 분리되어 스쿠알렌 에폭시다제 유전자의 발현수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하며, 구체적으로 상기 시료는 대장암 세포 또는 대장암 조직일 수 있다.
상기 정보제공방법은 상기 시료에서 측정한 스쿠알렌 에폭시다제, p53 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 낮은 경우, 대장암 전이로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 대장암으로 인해 사망한 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
또한, 상기 정보제공방법은 (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 p53 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 "스쿠알렌 에폭시다제", "p53" 및 "대장암 전이"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "대조군"이란, 대장암이 발병되어 사망한 개체를 의미하는 것으로, 구체적으로는 대장암 세포가 다른 장기나 조직, 예를 들어 림프절 전이 또는 혈액 등으로 전이되어 사망한 개체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 용어 "시료"란, 대장암이 발병되어 사망한 환자로부터 분리되어 스쿠알렌 에폭시다제 유전자의 발현수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하며, 구체적으로 상기 시료는 대장암 세포 또는 대장암 조직일 수 있다.
본 발명의 용어 "예후"란, 질환의 경과 및 사망 또는 생존의 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후 또는 예후 예측이란 질환의 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 전/후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 예후는 대장암의 치료 전/후, 질환의 경과 및 완치여부를 미리 예상하여 대장암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 치료여부에 관계없이 대장암 환자의 무병생존율 또는 생존율이 높은 수준을 나타내어, 대장암 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 대장암 치료 후 환자의 무병생존율 또는 생존율이 낮은 수준을 나타내어, 대장암 환자로부터 암이 재발하거나 또는 대장암으로 인하여 사망할 가능성이 높다는 것을 의미한다. 일 예로, 기준점에서 스쿠알렌 에폭시다아제의 대장암 환자의 사망예후 진단률을 검증한 결과 64.43%로 확인되었으며, 이는 기존에 임상에서 사용되고 있는 CEA보다 높은 사망예후 진단률을 가짐을 확인하였다.
본 발명의 용어 "무병생존율"이란, 치료여부에 관계없이 환자가 암의 재발없이 생존할 수 있는 가능성을 의미한다.
본 발명의 용어 "생존율"이란, 치료여부에 관계없이 암이 재발하든 안하든 환자가 생존할 수 있는 가능성을 의미한다.
상기 정보제공방법은 상기 시료에서 측정한 스쿠알렌 에폭시다제 단백질의 발현 수준이 생존 대장암 환자 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 낮은 경우, 대장암 예후가 나쁘다고 판단하는 것일 수 있다. 구체적으로 스쿠알렌 에폭시다제 단백질의 발현 수준이 생존 대장암 환자 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 낮은 경우 대장암 환자 (예: 대장암이 발병된 환자, 대장암이 전이된 환자 또는 대장암 치료 후 재발한 환자 등)가 사망할 가능성을 예측할 수 있다. 일 예로, 스쿠알렌 에폭시다아제의 발현 정도가 0.01438±0.0071(최적 컷-오프 값 (cut-off value))인 대장암 환자의 생존가능성은 -0.002650±0.0062의 범위에 속하는 대장암 환자의 생존가능성에 비해 높음을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 반대로, 스쿠알렌 에폭시다아제의 발현 정도가 -0.002650±0.0062에 속하는 대장암 환자의 사망 가능성은 0.001438±0.0071에 속하는 대장암 환자의 사망가능성에 비해 유의하게 높음을 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 대장암 환자의 예후 마커로서의 SqE와 p53의 활용성을 조사하기 위해, SqE, p53 및 이들의 조합의 ROC 곡선 분석, 최적 컷-오프 값 (cut-off value)분석, 및 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값 분석을 수행한 결과, SqE, p53 또는 SqE 및 p53의 조합에 의해 대장암 환자의 예후를 예측할 수 있음을 알 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포내 콜레스테롤 축적
1-1. 세포의 배양
콜레스테롤에 의한 SqE(squalene epoxidase) 및 관련 단백질들의 특이적 발현을 확인하고 상기 유전자의 기능을 확인하기 위하여 대장암 세포주인 HCT116 및 HT29을 배양하였다. HCT116은 DMEM-고 글루코스(Corning, USA)에 HT29은 RPMI-고 글루코스(Corning, USA)에서 배양하였으며, 상기 세포주들은 10% 우태아 혈청, 100mg/ml 스트렙토마이신, 그리고 100 IU/ml 엠피실린이 포함된 배지에서 배양하였다.
1-2. 세포내 콜레스테롤의 측정
세포내 콜레스테롤의 측정은 콜레스테롤과 결합하는 필린(filin) (Cayman, UK)을 사용하여 다음의 방법을 통해 조사하였다. 농도별로 콜레스테롤을 대장암 세포에 처리하고 3일 동안 배양한 후, 메탄올로 고정후 필린(filin) (filip III)을 반응 시켰다. 60분 동안 37℃에서 배양 후 초정밀 공초점 현미경을 이용하여 이미지를 얻은 후 프로그램 (Zen lite, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 양적 계산을 수행하였다.
그 결과, 농도별 콜레스테롤 처리에 의한 세포내부의 콜레스테롤 축적을 확인하였다(도 1).
실시예 2: 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 이동능 / 침윤능 증가
콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포 이동을 관찰하기 위하여 트랜스웰 (transwell)을 이용한 세포 이동실험을 수행하였다. 먼저 기공 크기 8μm의 트랜스웰 (Corning Incorporated Costar, USA)의 아래면을 2% 젤라틴 (Sigma-Aldrich, USA)으로 코팅한 다음 트랜스웰 삽입의 내부에 무혈청배지의 세포 부유액을 각각 첨가하였다. 이때 외부용기에는 20μM 콜레스테롤과 20% 혈청을 포함한 배지를 넣어주었다. 세포 부유액을 72 시간동안 배양하였고, 배양이 끝나면 삽입(insert)의 내면을 면봉으로 닦아 이동하지 않은 내피세포를 제거하였다. 아래쪽으로 이동한 세포의 수는 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색한 후 200배 현미경 시야에서 계수한 후 도식화하여 비교하였다(도 2).
그 결과, 20μM 콜레스테롤 처리에 의한 유의한 대장암 세포의 침윤능, 이동능을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 상피- 중간엽 이행유도 및 대장암 세포의 생존 증가 확인
대장암 세포의 상피-중간엽 이행 및 SqE 단백질 분해를 확인하기 위해, 다음의 방법으로 수행하였다. 세포를 6 웰 플레이트에 심은 후 20μM 콜레스테롤을 매일 3일 동안 처리한 후 RIPA 버퍼 (Invitrogen, USA)을 이용하여 세포내 단백질을 모은 후 상피-중간엽 이행 표시자인 E-cahderin, N-cadherin, Viment과 GAPDH에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 (western blot)을 수행하였다. 사용된 항체는 표 1과 같다.
항체 Catalog No. 회사
E-cadherin sc-21791 Santa Cruz
N-cadherin 4061s Cell Signaling Technology
Vimentin 5741s Cell Signaling Technology
GAPDH LF PA-0212 AbFrontier
그 결과, 20μM 콜레스테롤 처리에 의한 대장암세포의 상피-중간엽 이행 (E-cadherin의 발현 감소 및 N-cadherin, Vimenting의 발현 증가) 및 SqE 단백질의 분해를 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 4: 콜레스테롤에 의한 SqE 및 p53의 발현 감소
4-1 콜레스테롤 처리에 의한 SqE 및 p53 발현 감소확인
콜레스테롤 처리에 의한 SqE 및 p53 발현 감소확인을 위해 6 웰 플레이트에 세포를 동일한 양으로 심은 후 10 (HCT116) 및 20 (HT29)μM 콜레스테롤을 시간별로 (0, 4, 12, 24, 48 시간) 처리 후 RIPA 버퍼 (Invitrogen, USA)을 이용하여 세포내 단백질을 모은 후 각각에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 시행하였다. 사용된 항체는 표 2와 같다.
항체 Catalog No. 회사
SQE sc-21791 Santa Cruz
E-cadherin sc-21791 Santa Cruz
GSK3 sc-377213 Santa Cruz
GAPDH LF PA-0212 AbFrontier
b-catein sc-7963 Santa Cruz
pGSK3b 9336s Cell Signaling Technology
pGSK3b sc-135653 Santa Cruz
hdM2 OP-46 Calbiochem
p53 sc-56180 Santa Cruz
p-p53 (S315) 2528s Cell Signaling Technology
p-p53 (S376) ab60021 Abcam
그 결과, 10, 20μM 콜레스테롤에 의한 대장암세포에서 유의한 SqE와 p53의 단백질 발현량의 감소를 확인할 수 있었으며, 또한, 상피-중간엽 이행의 표시자인 E-cadherin 또한 상위조절자인 GSK3β의 비활성화 및 β-catenin의 활성화를 통해 유의하게 발현이 감소됨을 관찰함으로써 콜레스테롤에 의한 대장암 세포의 상피-중간엽 이행 유도를 확인하였다(도 4).
4-2. 웨스턴 블럿을 이용한 콜레스테롤에 의한 SqE 단백질의 분해 촉진확인
대장암 세포에서 콜레스테롤에 의한 SqE 단백질의 분해 정도를 웨스턴 블럿을 기반을 두어 다음의 방법을 통해 확인하였다. 대장암 세포주을 6웰 플레이트에 접종하고 24 시간 후에 DMEM-고 글루코스 배지 조건에서 실시예 5-1에서 확립된 200nM siRNAs (siCont, siSqE)를 처리한 세포그룹과 함께 5% 지단백질 결핍 혈청 (lipoprotein deficient serum)과 20μg/ml 시클로덱스트린 (LPDS/CD) 배지 조건에서 20μM의 콜레스테롤을 세포에 시간별로 처리한 후, 세포를 RIPA 버퍼 (invitrogen, 미국)로 터트린 후 단백질을 모아서 SqE와 GAPDH에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.
4-3. 총 RNA 분리 및 역전사 반응물 (cDNA) 생성
상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy Total RNA 키트 (Nanohelix co., 한국)을 사용하여 대장암 세포에서 총 RNA를 추출하였다. 페놀-클로로포름법에 의하여 총 RNA만을 정제하였다. 이후, 1mg RNA를 주형으로 하고 올리고 dT를 프라이머로 하여 역전사 반응을 수행하였다 (Nanohelix, South Korea).
4-4. 반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 ( Semiquantative RT- PCR )
실시예 4-3에서 수행한 역전사 반응물 (cDNA) 및 표 3에 제시된 프라이머를 가지고 수행한 반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (Semiquantative RT-PCR)의 조성 (10μl)은 다음과 같다: 2X premix PCR mixture (Nanohelix, 한국) 5μl, 프라이머 각 0.5μM, 주형 cDNA 1μl. 반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응의 조건은 95℃에서 2분 30초간 초기변성 시행 후, 95℃ 20초, 58℃ 45초, 72℃ 30초간 증폭반응을 하였고, 72℃에서 5분간 증폭산물을 안정화시켰다. 도출된 PCR 결과물은 1% 아가로스 겔을 이용하여 확인하였다.
명칭 Accession 프라이머 염기서열 서열번호
E-cadherin XM_011525788 정방향 5’-CAACGACCCAACCCAAGAAT-3’ 4
역방향 5’-TCCGCCTCCTTCTTCATCAT-3’ 5
N-cadherin NM_004360 정방향 5’-ACAGTGGCAGCTGGACTTGA-3’ 6
역방향 5’-TCCCTTGGCTAATGGCACTT-3’ 7
Vimentin XM_011519649 정방향 5’-CCTTGAACGCAAAGTGGAAT-3’ 8
역방향 5’-GCTTCAACGGCAAAGTTCTC-3’ 9
TP53 NM_001276698.1 정방향 5’-CCTCACCATCATCACACTGC-3’ 10
역방향 5’-CCTCATTCAGCTCTCGGAAC-3’ 11
Squalene epoxidase NM_003129 정방향 5’-GCTTCCTTCCTCCTTCATCA-3’ 12
역방향 5’-ACACATTCGCCACCAAGTTT-3’ 13
GAPDH NM_001289746 정방향 5’-ACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’ 14
역방향 5’-AGTGATGGCATGGACTGTGG-3’ 15
그 결과, 20 μM 콜레스테롤 처리에 의한 시간별 유의한 SqE 단백질의 분해 및 소폭의 mRNA 발현 저하를 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 5: SqE 발현 저하에 의한 대장암 세포의 이동능 / 침윤능 증가
5-1. SqE siRNA 제조
SqE 유전자의 발현 억제에 의한 세포 내 기능을 조사하기 위하여, SqE의 염기서열 (서열번호 1) 중에서 20개의 뉴클레오티드로 이루어진 siRNAs (서열번호 2 및 서열번호 3)을 제작하였다. SqE의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시하였다.
5-2. SqE 발현 저하에 의한 대장암 세포 이동 실험
siSqE 처리에 의한 대장암 세포 이동을 관찰하기 위하여 트랜스웰 (transwell)을 이용한 세포 이동실험을 실시하였다. 먼저 기공 크기 8μm의 트랜스웰 (Corning Incorporated Costar, USA)의 아래면을 2% 젤라틴 (Sigma-Aldrich, USA)으로 코팅한 다음 트랜스웰 삽입의 내부에 무혈청 배지의 조건으로 200 nM siCont 또는 siSqE가 이틀 동안 처리된 세포 부유액을 각각 첨가하였다. 이때 외부용기에는 20% 혈청을 포함한 배지를 넣어주었다. 세포 부유액을 48시간 동안 배양하였고, 배양이 끝나면 삽입(insert)의 내면을 면봉으로 닦아 이동하지 않은 내피세포를 제거하였다. 아래쪽으로 이동한 세포의 수는 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색한 후 200배 현미경 시야에서 계수한 후 도식화하여 비교하였다(도 6).
그 결과, siSqE 처리에 의한 유의한 대장암 세포의 침윤능, 이동능을 확인할 수 있었다.
실시예 6: SqE 발현 저하에 의한 대장암 세포의 상피- 중간엽 이행유도 및 대장암 세포 생존 증가 확인
6-1. 웨스턴 블럿법과 반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 SqE 발현 저하에 의한 대장암 세포에서 상피- 중간엽 이행 유도 확인
대장암 세포의 상피-중간엽 이행을 확인하기 위해, 세포를 6 웰 플레이트에 심은 후 200 nM siSqE을 3일 동안 처리한 후 RIPA 버퍼 (Invitrogen, USA)을 이용하여 세포내 단백질을 모은 후 상피-중간엽 이행 표시자인 E-cahderin, N-cadherin, Viment과 GAPDH에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블럿과 실시예 4 (4-2)에 서술한 방법에 기초하여 반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
그 결과, SqE 발현 저해에 의한 대장암세포의 상피-중간엽 이행 (E-cadherin의 단백질, mRNA 발현 감소 및 N-cadherin, Viment의 단백질 및 mRNA의 발현 증가)를 확인할 수 있었다(도 7).
6-2 부착저해 세포배양 접시를 이용한 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 생존 증가 확인
아노이키스(anoikis)는 세포사멸의 한 종류로 세포가 세포기질과의 부착이 되지 않거나 본래의 위치가 아닌 곳에 부착되어 있을 경우에 발생하는 세포 죽음으로 이러한 아노이키스가 잘 이루어지지 않게 되면 부유 상태에서의 세포가 생존하거나 본래의 기관이 아닌 곳에서의 생장이 가능하게 된다. 결과적으로, 암의 전이가 유도가 된다.
따라서, 콜레스테롤 처리에 의한 부유상태에서 대장암 세포의 생존 증가능을 확인하기 위해 대장암 세포를 부착저해 세포 배양 접시 (ultra low attachment plates, Corning, USA)에 배양 하며 동시에 20 μM 콜레스테롤을 매일 3일 동안 처리한 후 현미경으로 촬영하여 세포 생존을 확인하였다. 동시에 비교군으로 대장암 세포에 실시예 5 (5-1)에서 확립한 200 nM siRNAs를 처리한 후 동일한 조건에서 배양하며 세포 생존을 확인하였다(도 8).
6-3 부착저해 세포배양 접시를 이용한 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 생존 증가의 통계적 확인
앞선 6-2에서 확인된 콜레스테롤 및 SqE에 대한 siRNA에 의한 대장암 세포의 생존증가를 통계적으로 확인하기 위해 MTT법을 기반으로 다음의 방법으로 수행하였다. 비부착성 플레이트에서 20 μM 콜레스테롤 또는 실시예 5 (5-1)에서 확립한 200 nM의 SqE에 대한 siRNA를 3일 동안 처리한 후 세포를 모아서 96 웰 플레이트로 옮긴 후 2mg/ml MTT를 처리한 후 2시간 동안 37에서 반응 시킨 후 DMSO로 반응을 중단시켰다. Microplate reader (570nm)로 흡광도를 읽은 후 퍼센트로 환산하여 세포의 사멸/생존을 확인하였다. 또한, 대조군으로 SqE의 활성저해제인 50 μM 터비나핀(Terbinafine)을 처리하여 동일한 방법으로 대장암 세포의 사멸/생존을 확인하였다(도 9).
그 결과, 거의 모든 세포가 사멸된 대조군에 비해 20 μM 콜레스테롤 (도 9A) 또는 200 nM siSqE (도 9B) 처리에 의한 대장암세포의 유의한 생존 증가를 확인할 수 있었다. 하지만, SqE 활성 저해 (도 9C)에 의한 대장암 세포의 유의한 생존은 확인할 수 없었다.
실시예 7: SqE 발현 저해에 의한 p53의 발현 감소
SqE 발현 저하에 의한 p53 발현 감소확인을 위해 6 웰 플레이트에 세포를 동일한 양으로 심은 후 200 nM siCont 및/또는 siSqE를 3일 동안 처리한 후 RIPA 버퍼 (Invitrogen, USA)을 이용하여 세포내 단백질을 모은 후 각각에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯법을 시행하였다.
그 결과, 200 nM siSqE 처리에 의한 p53 분해 유도자인 hdm2의 발현 증가 유도에 의한 p53의 단백질 발현량의 감소를 확인할 수 있었으며 또한, 상피-중간엽 이행의 표시자인 E-cadherin 또한 상위조절자인 GSK3β의 비활성화 (phospho-ser9 GSK3β 증가)및 β-catenin의 활성화를 통해 유의하게 발현이 감소됨을 관찰함으로써 콜레스테롤에 의한 대장암 세포의 상피-중간엽 이행 유도를 확인할 수 있었다(도 10).
실시예 8: SqE 발현 감소에 의한 대장암 전이 촉진 확인
SqE 발현 감소에 의한 대장암 세포의 전이능 증가 확인을 위해 안정적으로 SqE의 발현이 저해되는 대장암 세포 (shSqE)를 다음의 방법에 따라 구축하였다. SqE의 안정적 발현 저해를 위해, HCT11, HT29 대장암 세포를 SqE Mission shRNA Lentiviral Transduction Particles (Sigma: TRCN0000046155)와 Mission pLKO.1-puro Non-Target shRNA Control Transduction Particles (Sigma: SHC016V)에 감염시켰다. 이후, 인간 대장암 세포의 생체내 이동을 관찰하기 위해 루시퍼라제 백터(Luciferase vector)인 4 μg PGL4.17를 리포펙타민(lipofectamine) 3000 (invitrogen, USA)을 이용하여 세포에 처리하였다. 이후, 10 μg/ml 퓨로마이신(puromycin)과 0.3 mg/ml G418로 세포를 약 3주간 콜로니를 선택 및 세포를 증식시켰다. 일차적으로, 트랜스웰법을 이용하여 SqE 발현 저해에 의한 대장암 세포의 이동 및 침윤을 확인하였으며, 이차적으로 반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(semi-quantative RT-PCR)법을 이용하여 대장암 세포의 SqE의 발현 저해 정도를 확인하였다. 마지막으로 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (quantative RT-PCR)법을 이용하여 대장암 세포내 삽입된 PGL4.17의 발현 정도와 루시퍼라제 활성 정도를 확인하였다(도 11).
그 결과, SqE의 안정적인 발현 저해 및 그에 따른 유의한 대장암 세포의 이동능 및 침윤능 증가를 HCT116(도 11A), HT29(도 11B) 세포 모두에서 확인하였으며, 또한, 두 세포 모두 유사한 정도의 PGL4.17의 발현 및 루시퍼라제 활성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 9: 동물모델에서의 SqE 발현 감소에 의한 대장암 전이 촉진 확인
9-1. in vivo 루시퍼라제법을 이용한 shSqE 대장암 세포의 전이 정도 확인
앞선 실시예 8에서 확립된 HCT116기반 shCont/shSqE 세포를 실험동물의 등 (Subcutaneou)과 대장 (Orthotopic)에 주입한 후 100일 동안 대조군 세포 (shCont)와 비교해 shSqE 대장암 세포의 전이 정도를 in vivo 루시퍼라제법을 이용하여 모니터링 하였다 (IVIS Lumina II, Caliper Life Science). 또한, 100일 후, 폐, 간을 적출하여 암의 진행정도를 Hematoxylin/eosin 염색법을 이용하여 확인하였다. 그 외에, 암세포의 in vivo 아노이키스 저항능을 확인하기 위해 폐조직을 이용하여 caspase-3 (세포사 마커) 및 MCM-7 (암세포의 세포증식 마커)에 대한 항체를 이용하여 면역형광염색법 및 초정밀 공초점 형광현미경을 이용하여 확인하였다(도 12, 도 13, 도 14).
그 결과, SqE의 발현이 안정적으로 저해된 대장암 세포 (shSqE)의 전이가 대조군 대장암 세포 (shCont)의 전이에 비해 유의하게 증가됨을 확인할 수 있었으며 또한, shSqE가 주입된 실험동물의 간과 폐에서 유의한 암세포의 증가를 확인하였다. 이외에도, shSqE 세포가 주입된 실험동물의 폐 조직을 염색한 결과, 유의한 암세포의 증가 및 세포사의 감소를 확인함으로써, SqE 발현 저해에 의한 대장암 세포의 유의한 in vivo 세포 생존 증가를 확인할 수 있었다.
9-2: HT29 세포를 이용하여 구축된 마우스 모델에서 고콜레스테롤 섭취 및 SqE 발현 감소에 의한 대장암 전이 촉진 확인
마우스를 고콜레스테롤 사료 및 대조 사료로 한달 동안 섭취시킨 후 마우스 모델 구축 직전에 혈중 콜레스테롤을 측정한 결과 고콜레스테롤 섭취 쥐의 혈중 콜레스테롤 양이 유의하게 증가하였음을 확인하였다 (200mg/dl, 도 15가). 또한, 실시예 8에서 확립된 HT29기반 shCont/shSqE cells을 마우스의 대장 (Orthotopic)에 주입하고 고콜레스테롤 사료 및 대조 사료를 120일 동안 섭취하게 한 후, 대조군 세포 (shCont)와 비교해 shSqE 대장암 세포의 전이 정도를 in vivo luciferase 법을 이용하여 모니터링하였다 (IVIS Lumina II, Caliper Life Science). 그 결과, 암세포의 유의한 전이를 확인하였다 (도 15나-라).
또한, 120일 후, 폐, 간을 적출하여 암의 진행 정도를 Hematoxylin/eosin 염색법을 이용하여 조사하였다 (도 15마). 그 결과, 암의 형성을 확인하였다.
또한, 각 그룹의 생존을 확인한 결과 대조사료 섭취 및 shCont이 주입된 쥐에 대비해서 나머지 그룹들의 생존률이 유의하게 감소함을 확인하였다 (도 15바). 이는 고콜레스테롤 섭취에 의한 SqE 발현 감소가 대장암의 전이를 촉진시킴을 의미한다 (도 15).
9-3: HT29 세포를 이용하여 구축된 마우스 모델에서 고콜레스테롤 섭취 및 SqE 발현 감소에 의한 암의 악성화 및 혈중 암세포 증가 확인
실시예 9-2에서 확립된 쥐의 폐 조직을 적출하여 암의 진행 정도를 Hematoxylin/eosin 염색법을 이용하여 확인 한 결과, shCont/대조군 사료 섭취군에 비해 고콜레스테롤 섭취 또는 SqE 발현감소 그룹에서 유의한 암 생성이 확인되었다(도 16가). 또한 암세포의 침윤을 나타내는 Vimentin의 유의한 증가가 확인되었다 (도 16나). 그 외에도 고콜레스테롤 섭취 또는 SqE 발현감소 그룹에서 암세포 표시자인 Minichromosome maintenance complex component 7 (MCM7)의 증가 및 Histone H2A.X와 세포사멸 표시자인 caspase-3 (C3)의 감소에 의한 암세포의 생존 증가 및 세포 사멸 저해가 확인되었다 (도 16다-라). 또한, 유의한 대장암 세포 표시자인 CUB domain-containing protein 1 (CDCP1)의 존재를 고콜레스테롤 섭취 그룹과 SqE 발현 감소 그룹에서 확인하였다 (도 16마).
이는 고콜레스테롤 섭취에 의한 SqE 발현 감소에 의한 혈중 암세포의 증가에 의한 암의 악성화가 촉진됨을 의미한다 (도 16).
실시예 10: 대장암 진행에 따른 SqE와 p53의 유의한 발현 저해 확인
대장암 진행에 따른 SqE와 p53 발현 변화를 확인하기 위해, 인간 대장암 마이크어레이 슬라이드 (CO702, CO803, US Biomax, USA)를 구입하여 면역형광염색법 및 초정밀 공초점 현미경을 이용하여 조직 촬영을 수행한 후 분석 프로그램 (Zen lite, Germany)을 이용하여 환자들의 대장암 진행정도에 따라 SqE 및 p53의 발현 변화 및 동시 위치성 (co-localization)에 대해 조사하였다(표 4 및 표 5).
Figure PCTKR2017012691-appb-T000001
Figure PCTKR2017012691-appb-I000001
Figure PCTKR2017012691-appb-T000002
종양의 경계부는 대장암의 독립적인 예후 인자로 인정받지 못하고 있으나, 침윤성 성장을 보이는 종양의 침습면에서 5개 미만의 암세포군들 (tumor budding)이 중배율 (x250배) 시야에서 10개 이상 관찰될 때는 유의하게 예후가 나쁘다고 보고되고 있다.
형광면역염색법과 초정밀 공초점 형광현미경을 이용하여 각 조직에서 SqE, p53의 발현 정도를 분석한 결과, low tumor budding에 비해 high tumor budding, 즉, 대장암의 진행정도가 악성으로 갈수록 유의하게 SqE (도 17A) 및 p53 (도 17B) 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한, SqE와 p53의 해리도가 높아질수록 GSK3β의 Ser9 인산화 (pSer9-GSK3β) 정도가 높아짐을 알 수 있었다 (도 17C 및 도 17D).
이를 통해, 대장암의 악성으로의 진행 정도 즉, 대장암 전이 정도에 따라 유의하게 SqE와 p53의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다.
실시예 11: 조직 마이크로 어레이 (Tissue microarray ; TMA ) 이미지분석에 의한 SqE 및 p53의 발현 분석
대장암 조직, 대장암 기원 전이 조직, 및 정상 조직으로 이루어진 TMA 슬라이드를 US Biomax로부터 구매하고 SqE와 p53의 항체를 이용하여 형광 면역염색화학적 기법을 통해 염색한 후 촛점형광현미경 관찰 (x200)을 수행하여 SqE와 p53의 발현패턴을 분석하였다. 각 단백질의 양적 발현 분석은 Carl Zeiss에서 제공하는 ZEN (blue edition)을 이용하여 수행하였다. 이후 획득한 값은 Global equalization을 통해 변환 후 GraphPad Prism을 이용하여 이후 통계분석을 수행하였다 (Idikio et al., International Journal of Clinical Experimental Pathology 2011; 4:505-512) (표 6).
Figure PCTKR2017012691-appb-T000003
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Figure PCTKR2017012691-appb-I000003
Figure PCTKR2017012691-appb-I000004
Figure PCTKR2017012691-appb-I000005
Figure PCTKR2017012691-appb-I000006
Figure PCTKR2017012691-appb-I000007
Figure PCTKR2017012691-appb-I000008
실시예 12: SqE 및 p53의 대장암 전이 진단 민감도 및 특이도 분석
12-1: ROC (Receiver Operating Characteristic)곡선을 이용한 SqE 및 p53의 대장암 전이 진단 민감도 및 특이도 분석
대장암 환자의 전이 진단 마커로서의 SqE와 p53의 활용성을 조사하기 위해, GraphPad Prism을 이용하여 실시예 11의 표 6 데이터 (원발암 vs 전이암)로부터 ROC 곡선 분석을 수행하였다.
그 결과 SqE의 AUC(Area Under the Curve) 값은 0.7101 (95% CI: 0.6174-0.8029)로 p53의 0.5827 (95% CI: 0.4619-0.7035) 보다 더 높게 나타났다. 또한 2종 단백질의 조합 (SqE+p53) AUC값은 0.6530 (95% CI: 0.5783-0.7276)로 확인되었다. 이는 SqE 단독 또는 SqE 및 p53의 조합, p53 단독에 의해 대장암의 전이 여부를 진단할 수 있음을 의미한다 (도 18).
12-2: SqE 및 p53의 최적 컷- 오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 전이 진단
실시예 11의 표 6 데이터 (원발암 vs 전이암)로부터 SqE 및 p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)을 계산하여 SqE 및 p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 전이 진단 효율을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 7에 도시한 바와 같이, 대장 전이암에서 SqE의 높은 민감도를 확인하였다 (86.96%). 이와는 달리 p53에서는 높은 특이도를 확인하였으며 (94.38%), SqE+p53의 경우 72.1%의 높은 민감도가 확인되었다. 이러한 결과는 SqE 또는 p53 단독이 각각 민감도와 특이도에서 대장암 전이 예후 (prognotics marker)에 더욱 특이적임을 의미한다.
대장 전이암 SqE SqE/p53 p53
민감도 (sensitivity, %) 86.96(0.7668-0.9386) 72.07(0.6276-0.8017) 7.143(0.01498-0.1948)
특이도(specificity, %) 12.36(0.0634-0.2104) 28.09(0.2162-0.3530) 94.38(0.8737-0.9815)
12-3: 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)를 이용한 SqE 및 p53의 대장암 전이 진단 민감도 및 특이도 분석
SqE, p53 및 SqE+p53의 대장암 전이 진단 지표로서의 정확도를 평가하기 위하여, 실시예 11의 표 6 데이터 (원발암 vs 전이암)로부터 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값에 따른 SqE, p53 및 SqE+p53의 대장암 전이 진단의 민감도 및 특이도 (%)를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 8에 나타낸 바와 같이, SqE의 민감도는 59.4%, 특이도는 91%로 나타났고, 이와는 달리 p53의 민감도는 64.3%, 특이도는 71.9%로 나타났다. 그리고 SqE와 p53을 조합하였을 때에는 민감도 64%, 특이도 79.2%로 나타났다. 이는 SqE 또는 SqE+p53 조합이 p53 단독에 비하여 대장암 전이 진단 특이성이 높은 것을 의미한다.
대장 전이암 SqE SqE/p53 p53
Y-index 0.5043 0.4374 0.3732
민감도 (sensitivity, %) 59.42(0.4837-0.7240) 63.96(0.5430-0.7286) 64.29(0.4803-0.7845)
특이도(specificity, %) 91.01(0.8305-0.9604) 79.21(0.7251-0.8492) 71.91(0.6138-0.8093)
실시예 13: SqE의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도 분석
13-1: ROC (Receiver Operating Characteristic)곡선을 이용한 SqE의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도 분석
대장암 환자의 예후 마커로서의 SqE와 p53의 활용성을 조사하기 위해, 실시예 11의 표 6 데이터 (대장암 환자 중 생존환자 vs 사망환자)로부터 GraphPad Prism을 이용하여 ROC 곡선 분석을 수행하였다.
그 결과 SqE의 AUC 값은 0.6443 (95% CI (confidence interval): 0.5030-0.7856)로 p53의 AUC 값인 0.6131 (95% CI: 0.4291-0.7971) 보다 높게 나타났다. 또한 2종 단백질의 조합 (SqE+p53) AUC값은 0.6261 (95% CI: 0.5178-0.7344)로 확인되었다. 이는 SqE 단독 또는 SqE 및 p53의 조합에 의해 대장암 환자의 예후를 예측할 수 있음을 확인하였다 (도 19).
13-2: SqE 및 p53의 최적 컷- 오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 환자 예후 진단
실시예 11의 표 6 데이터 (대장암 환자 중 생존환자 vs 사망환자)로부터 SqE 및 p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)을 계산하여 SqE 및 p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 환자 예후 민감도와 특이도를 조사하였다.
그 결과, 하기 표 9에 기재한 바와 같이, 대장암 환자 예후 진단에서 SqE의 높은 민감도를 확인하였다 (64.3 %). 이와는 달리 p53의 예후 진단 특이도는 100 %였으며, SqE+p53의 경우 예후진단 특이도는 96.88 %로 확인되었다. 이러한 결과는 SqE 또는 p53 단독이 각각 민감도와 특이도에서 대장암 환자 예후 (prognotics marker)에 더욱 특이적임을 의미한다.
대장암 예후 SqE SqE/p53 p53
민감도(95% CI, %) 64.29(0.4803-0.7845) 3.571(0.007427-0.1008) 2.381(0.0006026-0.1257)
특이도(95% CI, %) 31.25(0.1102-0.5866) 96.88(0.8378-0.9992) 100.0(0.7941-1.000)
13-3: 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)를 이용한 SqE 및 p53의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도 분석
SqE, p53 및 SqE+p53의 대장암 환자 예후 지표로서의 정확도를 평가하기 위하여, 실시예 11의 표 6 데이터 (대장암 환자 중 생존환자 vs 사망환자)로부터 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값에 따른 SqE, p53 및 SqE+p53의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도 (%)를 조사하였다.
그 결과, 하기 표 10에 나타낸 바와 같이, SqE의 민감도는 52.4%, 특이도는 93.8%로 나타났고, 이와는 달리 p53의 민감도는 97.6%, 특이도는 43.8%로 나타났다. 그리고 SqE와 p53을 조합하였을 때에는 민감도 45.2%, 특이도 81.3%로 나타났다. 이는 SqE 단독 또는 SqE+p53 조합이 대장암 환자 예후 특이성을, p53 단독이 민감성을 가지는 것을 의미한다.
대장암 예후 SqE SqE/p53 p53
Y-index 0.461 0.265 0.414
민감도 (95% CI, %) 52.38(0.3642-0.6800) 45.24(0.3434-0.5648) 97.62(0.8743-0.9994)
특이도(95% CI, %) 93.75(0.6977-0.9984) 81.25(0.6356-0.9279) 43.75(0.1975-0.7012)
실시예 14: 조직 마이크로 어레이 (Tissue microarray ; TMA ) 이미지분석에 의한 임상에서 사용되고 있는 CAF, CA19-9와 SqE, p53의 발현 패턴 분석
US Biomax로부터 여러 종류의 대장암, 전이암, 정상조직으로 이루어진 TMA 슬라이드 (CO953)를 구매한 후, 실시예 11에서 제시된 방법을 이용하여 carcinoembryonic antigen (CEA), carbohydrate antigen (CA19-9), SqE, p53의 항체를 이용하여 동일한 조건하에 반응하고 발현 패턴을 분석하였다. 이후 획득한 값은 Global equalization을 통해 변환 후 GraphPad Prism을 이용하여 이후 통계분석을 수행하였다 (표 11).
Figure PCTKR2017012691-appb-T000004
Figure PCTKR2017012691-appb-I000009
실시예 15: CEA , CA-19-9 및 SqE , p53의 대장암 전이 진단 민감도 및 특이도 비교분석
15-1: ROC (Receiver Operating Characteristic)곡선을 이용한 CEA , CA-19-9 및 SqE, p53의 대장암 전이 진단 민감도 및 특이도 비교분석
대장암 전이 진단 마커로서의 SqE와 p53의 활용성을 조사하기 위해, 실시예 14의 표 11 데이터 (원발암 vs 전이암)를 사용하여 ROC 곡선 분석을 수행하고 임상에서 사용되고 있는 CEA 및 CA19-9와의 전이 진단효율을 비교하였다.
그 결과, CEA의 AUC 값은 0.8867 (95% CI (confidence intervals): 0.8144-0.9590), CA19-9의 AUC값은 0.8075 (95% CI: 0.7140-0.9010)이었으며, SqE의 AUC 값은 0.9983 (95% CI (confidence intervals): 0.9938-1.003), p53의 AUC 값은 0.5208 (95% CI: 0.3734-0.6682)로 나타났다. 즉, SqE는 임상에 사용되고 있는 CEA와 CA19-9보다 유의한 대장암 전이 진단 효율을 나타냈다. 이는 SqE가 대장암 전이 진단에 있어 높은 효율을 나타내는 바이오마커 임을 의미한다 (도 20).
15-2: CEA , CA19-9 및 SqE , p53의 최적 컷- 오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 전이 진단 효율 비교
실시예 14의 표 11 데이터 (원발암 vs 전이암)로부터 CEA, CA19-9, SqE, p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)을 계산하여 CEA, CA19-9, SqE, p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 전이 진단 효율을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 12에 기재한 바와 같이, 임상에서 사용되고 있는 CEA, CA19-9와 SqE에서 높은 민감도 (80%, 70%, 100%) 및 높은 특이도 (83.3%, 80%, 88.3%)를 확인하였으며, 이와 비교하여 p53에서는 낮은 민감도 (40%)와 높은 특이도 (68.3%)를 확인하였다. 즉, SqE는 임상에서 사용되고 있는 바이오마커보다 유의하게 높은 민감도와 특이도를 나타냈다. 이는 SqE가 대장암 전이진단에 있어 높은 진단 효율을 나타내는 바이오마커 임을 의미한다 (표 12).
대장 전이암
CEA 민감도 (95% CI, %) 80.0 (0.5634-0.9427)
특이도 (95% CI, %) 83.33 (0.7148-0.9171)
CA19-9 민감도 (95% CI, %) 70.0 (0.4572-0.8811)
특이도 (95% CI, %) 80.0 (0.6767-0.8922)
SqE 민감도 (95% CI, %) 100 (0.8316-1.000)
특이도 (95% CI, %) 88.33 (0.7743-0.9518)
p53 민감도 (95% CI, %) 40.0(0.1912-0.6395)
특이도 (95% CI, %) 68.33(0.5504-0.7974)
15-3: 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)를 이용한 CEA , CA19-9 및 SqE, p53의의 대장암 전이진단 민감도 및 특이도 분석
CEA, CA19-9, SqE, p53의 대장암 전이 진단 지표로서의 정확도를 평가하기 위하여, 실시예 14의 표 11 데이터 (원발암 vs 전이암)로부터 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값에 따른 CEA, CA19-9 및 SqE, p53의 대장암 전이 진단의 민감도 및 특이도 (%)를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 13에 나타낸 바와 같이, SqE는 임상에서 사용되고 있는 CEA와 CA19-9보다 유의하게 높은 Y-index, 민감도, 특이도를 나타냈다. 이와는 달리, p53은 다른 바이오마커에 비해 낮은 Y-index 및 민감도와 특이도를 가지는 것으로 확인되었다. 즉, SqE는 임상에서 사용되고 있는 바이오마커보다 유의하게 높은 Y-index, 민감도와 특이도를 나타냈다. 이는 SqE가 임상적으로 높은 대장암 전이진단 효율을 가지는 바이오마커임을 의미한다 (표 13).
대장 전이암
CEA 민감도 (95% CI, %) 95.0 (0.7513-0.9987)
특이도 (95% CI, %) 75 (0.6214-0.8528)
Y-index 70
CA19-9 민감도 (95% CI, %) 90.0(0.6830-0.9877)
특이도 (95% CI, %) 73.33(0.6034-0.8393)
Y-index 63.33
SqE 민감도 (95% CI, %) 100 (0.8316-1.000)
특이도 (95% CI, %) 76.67 (0.6396-0.8662)
Y-index 76.67
p53 민감도 (95% CI, %) 45.0 (0.2306-0.6847)
특이도 (95% CI, %) 58.33 (0.4488-0.7093)
Y-index 3.33
실시예 16: CEA, CA-19-9 및 SqE, p53의 대장암 환자 예후 비교분석
16-1: ROC (Receiver Operating Characteristic)곡선을 이용한 CEA , CA-19-9 및 SqE, p53의 대장암 환자 사망진단 비교분석
대장암 환자 예후 마커로서의 SqE와 p53의 활용성을 조사하기 위해, 실시예 14의 표 11 데이터(생존 vs 사망)를 사용하여 ROC 곡선 분석을 수행하고 임상에서 사용되고 있는 CEA 및 CA19-9와의 예후를 비교하였다.
그 결과, CEA의 AUC 값은 0.6220 (95% CI (confidence intervals): 0.4653-0.7788), CA19-9의 AUC값은 0.5818 (95% CI: 0.4099-0.7538)이었으며, SqE의 AUC 값은 0.6443 (95% CI (confidence intervals): 0.5030-0.7856), p53의 AUC 값인 0.6414 (95% CI: 0.4903-0.7924)로 나타났다. 즉, SqE와 p53는 임상에서 사용되는 CEA와 CA19-9보다 높게 대장암 환자의 예후를 예측할 수 있음을 확인하였다. 이는 SqE와 p53이 대장암 환자의 예후를 예측함에 있어 높은 효율을 나타내는 바이오마커 임을 의미한다 (도 21).
16-2: CEA , CA19-9 및 SqE , p53의 최적 컷- 오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 환자 예후 진단 비교
실시예 14의 표 11 데이터 (생존 vs 사망)로부터 CEA, CA19-9 및 SqE, p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)을 계산하여 CEA, CA19-9 및 SqE, p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 환자 예후 민감도와 특이도를 조사하였다.
그 결과, 대장암 환자에서 CEA, CA19-9, SqE, p53의 사망진단효율을 확인하였다. 그 결과, 하기 표 14에 기재한 바와 같이, 임상에서 사용되고 있는 CEA, CA19-9와 SqE, p53에서 유의한 민감도 (69%, 64%, 52%, 50%)를 확인하였다. 또한, CEA, CA19-9에 비해 SqE와 p53의 높은 특이도 (88%, 81%)를 확인하였다. 이러한 결과는 SqE가 임상에서 사용되고 있는 바이오마커보다 유의하게 높은 특이도를 가지며, 대장암 환자 예후 예측에 있어 유의한 진단 효율을 가짐을 의미한다 (표 14).
대장암 환자 예후 예측
CEA 민감도 (95% CI, %) 69.05(0.5291-0.8238)
특이도 (95% CI, %) 68.75(0.4134-0.8898)
CA19-9 민감도 (95% CI, %) 64.29 (0.4803-0.7845)
특이도 (95% CI, %) 56.25 (0.2988-0.8025)
SqE 민감도 (95% CI, %) 52.38 (0.3642-0.6800)
특이도 (95% CI, %) 87.50 (0.6165-0.9845)
p53 민감도 (95% CI, %) 50.0(0.3419-0.6581)
특이도 (95% CI, %) 81.25(0.5435-0.9595)
16-3: 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)를 이용한 CEA , CA19-9 및 SqE, p53의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도 분석
CEA, CA19-9, SqE, p53의 대장암 환자 사망 진단 지표로서의 정확도를 평가하기 위하여, 실시예 14의 표 11 데이터 (생존 vs 사망)로부터 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값에 따른 CEA, CA19-9 및 SqE, p53의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도(%)를 조사하였다.
그 결과, 하기 표 15에 나타낸 바와 같이, SqE는 임상에서 사용되고 있는 CEA와 CA19-9와 유사한 Y-index를 나타냈지만, 민감도는 유의하게 높은 것으로 확인되었다. 이와는 달리, p53은 다른 바이오마커에 비해 낮은 Y-index 및 특이도를 나타냈다. 이는 SqE는 대장암 환자 사망 예후 예측에 있어 임상적으로 높은 진단 효율을 가지는 바이오마커임을 의미한다 (표 15).
대장암 환자 예후 예측
CEA 민감도 (95% CI, %) 45.24 (0.2985-0.6133)
특이도 (95% CI, %) 68.75 (0.4134-0.8898)
Y-index 13.99
CA19-9 민감도 (95% CI, %) 45.24(0.2985-0.6133)
특이도 (95% CI, %) 68.75(0.4134-0.8898)
Y-index 13.99
SqE 민감도 (95% CI, %) 61.9 (0.4564-0.7643)
특이도 (95% CI, %) 50.0(0.2465-0.7535)
Y-index 11.9
p53 민감도 (95% CI, %) 57.14 (0.4096-0.7228)
특이도 (95% CI, %) 37.50 (0.1520-0.6457)
Y-index -0.0536
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

  1. 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 또는 앱타머를 포함하는 것인, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 예후는 사망 예후인 것인, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것인, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 p53 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가적으로 포함하는 것인, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것인, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 키트.
  8. (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 1기 또는 2기의 대장암이 발병한 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암 전이의 진단을 위한 정보제공방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 방법은 (a) 단계에서 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 p53 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 대장암 전이의 진단을 위한 정보제공방법.
  10. (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 대장암으로 인해 사망한 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 방법은 (a) 단계에서 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 p53 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 대장암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay)에 의하여 측정되는 것인, 정보제공방법.
  13. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질의 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정되는 것인, 정보제공방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 대장암 전이는 콜레스테롤에 의해 유도되는 것인, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물.
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