WO2019146841A1 - 간암의 진단 및 예후 예측용 바이오 마커 및 이의 용도 - Google Patents

간암의 진단 및 예후 예측용 바이오 마커 및 이의 용도 Download PDF

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WO2019146841A1
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liver cancer
sf3b4
tcirg1
expression
gene
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PCT/KR2018/004314
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남석우
양희두
은정우
신청유
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가톨릭대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to the use of BANF1, PLOD3, and SF3B4 as biomarkers capable of diagnosing and predicting early stage liver cancer in precancerous lesions, and also relates to the use of TCIRG1 as a biomarker capable of predicting and diagnosing liver cancer recurrence and post- .
  • Cancer is a representative disease that threatens human health, and is the most common cause of death in an industrialized country.
  • the cause of cancer has not yet been clarified, but it is considered that a combination of internal factors, genetic factors and external factors, carcinogens acting as cancer inducing factors, continuous inflammation and damage, and cancer-induced viral infection .
  • cancer is not desperate enough to be diagnosed as incurable disease, and it can be cured by early diagnosis and active treatment. Therefore, early detection and early treatment are crucial for enhancing the effectiveness of cancer treatment. In advanced cancer, multiple and aggressive methods can be used to cure or extend life and aggravate symptoms.
  • liver cancer is known as one of the most deadly cancers in the world, and more than half a million people die from liver cancer each year in Asia and sub-Saharan Africa. Liver cancer can be classified into primary hepatocellular carcinoma (hepatocellular carcinoma) originating from hepatocyte itself and metastatic liver cancer in which cancer of other tissues has been transferred to liver. About 90% or more of liver cancer is primary liver cancer. Although many of the causes of these cancers have been reported to be acute or chronic infections due to hepatitis B virus or hepatitis C virus, the molecular mechanism of the disease in the pathogenesis and progression of liver cancer remains unclear .
  • AFP Serum alpha-fetoprotein (HBeAg) testing is used for the diagnosis of non-invasive early liver cancer in high-risk patients.
  • AFP was 20 ng / mL, which is the standard value for achieving both sensitivity and specificity at the time of development.
  • sensitivity is only 60% in this case, and 200 ng / mL , The specificity increases but sensitivity is only 22%.
  • Previous studies have shown that AFP has a sensitivity of about 66% overall and a specificity of 82%, which limits the diagnosis of all liver cancer patients.
  • Serum markers that are not established as diagnostic criteria but are useful for the diagnosis of liver cancer include Descarboxyprothrombin (DCP), Prothrombin Induced by Vitamin K Absence II (PIVKA-II), Glycosylated AFP versus Total AFP (L3 fraction) fucosidase, glypican 3, and HSP-70.
  • DCP Descarboxyprothrombin
  • PIVKA-II Prothrombin Induced by Vitamin K Absence II
  • Glycosylated AFP versus Total AFP (L3 fraction) fucosidase glypican 3, and HSP-70.
  • Early diagnosis of liver cancer is considered to be different from the limit.
  • patients diagnosed at the stage of radical treatment such as actual surgery or high-frequency thermal therapy are limited to about 30% of all patients with liver cancer. Therefore, it is urgent to develop new diagnostic markers with improved specificity and sensitivity that can be diagnosed as early as possible at the stage where fundamental treatment of liver cancer is possible.
  • the prognosis of hepatocellular carcinoma refers to predicting various conditions of the patient due to liver cancer such as the possibility of recurrence of hepatocellular carcinoma, the possibility of recurrence after treatment, the survival possibility of the patient after diagnosis of hepatocellular carcinoma, The duration of treatment, and the like.
  • Hepatocellular carcinoma can be effectively treated by various treatment methods according to its prognosis. For example, patients who are presumed to have good prognosis need to avoid dangerous treatment methods that can cause serious adverse effects to patients, such as aggressive chemotherapy or surgery, radiation therapy, and are relatively moderate and conservative And should choose safe treatment methods.
  • hepatocellular carcinoma which has already progressed, has a poor prognosis and died within 6 months after diagnosis.
  • HCC small-sized hepatocellular carcinoma
  • the survival rate is 90% for 1 year without special treatment, and the 5-year survival rate is 40-50% have.
  • accurate estimation of the prognosis of patients with liver cancer is very difficult with conventional techniques. In order to accurately estimate the prognosis, an analysis method that classifies the patients according to the risk group is needed.
  • the prognosis depends on the stage of pathological clinic liver cancer and the primary surgical treatment without diagnosing the prognosis .
  • the stage of liver cancer alone can not accurately determine the prognosis for each patient with liver cancer. Therefore, it is necessary to develop diagnostic markers that can determine the prognosis of liver cancer and further determine the possibility of recurrence after surgery.
  • RNA interference has been shown to act on sequence-specific mRNAs in a wide variety of mammalian cells since its discovery (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764773).
  • siRNA small interfering RNA
  • RNA double strand is processed by endonuclease Dicer and converted into siRNA of 21-23 base pairs (bp), and the siRNA is bound to RNA-induced silencing complex (RISC) (Antisense) strand recognizes and degrades the target mRNA, thereby specifically inhibiting the expression of the target gene in a sequence-specific manner (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS, Nature Reviews Drug Discovery 2002. 1, 503 -514).
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • siRNAs against the same target gene are superior to the antisense oligonucleotide (ASO) in inhibiting mRNA expression in vivo / in vitro (in vitro and in vivo) (Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. 296: 1000-1004).
  • ASO antisense oligonucleotide
  • siRNA-based RNAi technology-based therapeutics has been analyzed by the global market size to be more than KRW 12 trillion by 2020, and the number of targets to which the technology can be applied has been dramatically expanded to include existing antibodies and compound-based drugs It is being evaluated as a next-generation gene therapy technology that can treat diseases that are difficult to treat.
  • siRNA since the action mechanism of siRNA is complementary to the target mRNA and regulates the expression of the target gene in a sequence-specific manner, it has been known for a long time until the existing antibody-based drug or small molecule drug is optimized for a specific protein target The development period and the development cost of the protein can be significantly extended and the development period can be shortened so that the optimized lead compound can be developed for all the protein targets including the target substance which can not be medicated (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY 2006 13 (4): 664-670). Recently, the ribonucleic acid-mediated interference phenomenon has been proposed to solve the problems that occur in the development of existing chemical synthetic medicine, and to selectively suppress the expression of a specific protein at the transcript level and to use it in the development of various disease treatments, .
  • BANF1 barrier to autointegration factor 1
  • PLOD3 procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3
  • SF3B4 splicing factor 3b subunit 4
  • Yet another object of the present invention is to provide a method for detecting the expression level of mRNA or protein in a biological sample separated from a patient, the method comprising: measuring an expression level of mRNA or protein on one or more genes selected from the group consisting of BANF1, PLOD3 and SF3B4; And comparing the expression level of the measured BANF1, PLOD3 or SF3B4 with the expression level of the corresponding gene of the control sample, to provide an information providing method for diagnosis of early liver cancer.
  • TCIRG1 T-Cell Immune Regulator 1
  • Yet another object of the present invention is to provide a method for detecting the expression level of mRNA or TCIRG1 protein of TCIRG1 (T-Cell Immune Regulator 1) gene from a biological sample isolated from a patient; And comparing the expression level of the measured TCIRG1 with the expression level of the corresponding gene of the control sample, to provide a method for providing information for diagnosis of liver cancer.
  • TCIRG1 T-Cell Immune Regulator 1
  • BANF1 barrier to autointegration factor 1
  • PLOD3 procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3
  • SF3B4 splicing factor 3b subunit 4
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer comprising an inhibitor for protein as an active ingredient.
  • TCIRG1 T-Cell Immune Regulator 1
  • the present invention provides a method for inhibiting the proliferation of cells selected from the group consisting of BANF1 (barrier to autointegration factor 1), PLOD3 (procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) and SF3B4 (splicing factor 3b subunit 4) And an agent for measuring an expression level of mRNA or protein on the above gene.
  • BANF1 barrier to autointegration factor 1
  • PLOD3 procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3
  • SF3B4 splicing factor 3b subunit 4
  • the BANF1 gene comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the BANF1 protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • the PLOD3 gene comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
  • the PLOD3 protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • the SF3B4 gene comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5
  • the SF3B4 protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the agent may be a primer, a probe, an aptamer, an antibody or a substrate specific to BANF1, PLOD3 or SF3B4.
  • the measurement may be of a precancerous lesion.
  • the measurement may be performed using a reverse transcription polymerase chain reaction, competitive polymerase chain reaction, real-time PCR, Nuclease protection assay (RNase, S1 nuclease assay), in situ hybridization, Immunoprecipitation, Immunoelectrophoresis, Immunoprecipitation, Immunoprecipitation, Complement fixation, FACS, Mass spectrometry, and Protein microarray analysis. Or an array method.
  • the present invention also provides an early liver cancer diagnostic kit comprising the composition according to the present invention.
  • the present invention provides a method for detecting the expression level of mRNA or protein, comprising: measuring the level of mRNA or protein expression of at least one gene selected from the group consisting of BANF1, PLOD3 and SF3B4 from a biological sample separated from a patient; And comparing the measured expression level of BANF1, PLOD3 or SF3B4 with the expression level of the corresponding gene of the control sample.
  • the present invention also provides a method for providing information for the diagnosis of early liver cancer.
  • the sample may be a precancerous lesion tissue.
  • the expression level of any one or more genes selected from the group consisting of BANF1, PLOD3, and SF3B4 is determined to be higher than the expression level of the control sample to determine that the liver cancer has occurred.
  • the present invention provides a composition for predicting the diagnosis or prognosis of liver cancer, which comprises an agent for measuring the expression level of mRNA or protein on TCIRG1 (T-Cell Immune Regulator 1) gene.
  • TCIRG1 T-Cell Immune Regulator 1
  • the TCIRG1 gene comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 43 and 44, and the TCIRG1 protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45.
  • the agent may be a primer, a probe, an aptamer, an antibody or a substrate specific for TCIRG1.
  • the measurement may be performed using a reverse transcription polymerase chain reaction, competitive polymerase chain reaction, real-time PCR, Nuclease protection assay (RNase, S1 nuclease assay), in situ hybridization, Immunoprecipitation, Immunoelectrophoresis, Immunoprecipitation, Immunoprecipitation, Complement fixation, FACS, Mass spectrometry, and Protein microarray analysis. Or an array method.
  • the liver cancer diagnosis or prognosis prediction may include progression, recurrence, metastasis and prognosis evaluation of liver cancer.
  • the present invention also provides a kit for diagnosis or prognosis of liver cancer comprising the composition according to the present invention.
  • the present invention provides a method for measuring the expression level of mRNA or TCIRG1 protein of TCIRG1 (T-Cell Immune Regulator 1) gene from a biological sample isolated from a patient; And comparing the measured expression level of the TCIRG1 with the expression level of the corresponding gene of the control sample.
  • the present invention also provides a method for providing information for diagnosis of liver cancer.
  • the sample may be tissue, whole blood, blood or plasma.
  • the information providing method may determine that the prognosis is poor due to high recurrence of liver cancer, tumor growth or metastasis if the expression level of TCIRG1 is higher than that of the control sample.
  • the comparison of the expression levels may be performed by standard or cut-off values, the cutoff value for determining the likelihood of liver cancer metastasis is 11.0112, The cutoff value is 6.2821, the cutoff value for determination of mid-term liver cancer is 6.4371, the cutoff value for determination of late-stage liver cancer is 11.3794, and the cutoff value for determining the likelihood of recurrence of liver cancer is 2.5687.
  • the present invention provides a method for detecting a gene or a protein, which is selected from the group consisting of BANF1 (barrier to autointegration factor 1), PLOD3 (procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3), and SF3B4 (splicing factor 3b subunit 4)
  • BANF1 barrier to autointegration factor 1
  • PLOD3 procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3
  • SF3B4 splicing factor 3b subunit 4
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating hepatocellular carcinoma,
  • the inhibitor may be siRNA, shRNA, antisense oligonucleotide, aptamer or an antibody specific for BANF1, PLOD3 or SF3B4.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for inhibiting metastasis and recurrence of liver cancer, which comprises an inhibitor against TCIRG1 (T-Cell Immune Regulator 1) gene or protein as an active ingredient.
  • TCIRG1 T-Cell Immune Regulator 1
  • the inhibitor may be an siRNA, shRNA, antisense oligonucleotide, aptamer or an antibody specific for TCIRG.
  • the present invention provides a method for detecting a gene or a protein, which is selected from the group consisting of BANF1 (barrier to autointegration factor 1), PLOD3 (procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3), and SF3B4 (splicing factor 3b subunit 4)
  • BANF1 barrier to autointegration factor 1
  • PLOD3 procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3
  • SF3B4 splicing factor 3b subunit 4
  • the present invention also provides a method for inhibiting metastasis and recurrence of liver cancer, comprising the step of administering an inhibitor for TCIRG1 (T-Cell Immune Regulator 1) gene or protein.
  • TCIRG1 T-Cell Immune Regulator 1
  • the method for treating cancer of the present invention comprises administering to a subject a therapeutically effective amount of the gene or protein expression inhibitor or the activity inhibitor.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular individual will depend upon a variety of factors, including the type and extent of the response to be achieved, the specific composition, including whether or not other agents are used, the age, weight, general health status, sex and diet, The route of administration and the fraction of the composition, the duration of the treatment, the drugs used or co-used with the specific composition, and the like, well known in the medical arts. Therefore, the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the above-mentioned factors.
  • the subject is applicable to any mammal and includes mammals such as cows, pigs, sheep, horses, dogs and cats, as well as humans and primates.
  • the present invention also relates to a method for screening a cell, which comprises the steps of: (a) contacting a cell to be analyzed with a sample containing BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene or a protein thereof; (b) measuring the expression level of the BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene, the expression level of the protein or the activity of the protein; And (c) when the level of expression of BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene, the expression level of the protein or the activity of the protein is decreased as a result of the measurement in the step (b), the sample is judged to be a substance for prevention or treatment of liver cancer A method for screening a substance for preventing or treating liver cancer.
  • the present invention provides a method for screening a cell, which comprises (a) contacting a cell containing a TCIRG1 gene or a TCIRG1 protein with a sample to be analyzed; (b) measuring the expression level of the TCIRG1 gene, the expression level of the protein or the activity of the protein; And (c) determining, as a result of the measurement in the step (b), that the sample is a substance for prevention or treatment of liver cancer when the expression level of the TCIRG1 gene, the expression level of the protein or the activity of the protein is decreased, And a method for screening a substance for prophylactic or therapeutic treatment thereof.
  • composition for diagnosing early liver cancer comprising the agent for measuring the expression level of BANF1, PLOD3 and SF3B4 gene or protein according to the present invention can be used for early detection of liver cancer by measuring the expression level of the marker in pre- And can be used for prevention and treatment of liver cancer.
  • composition for diagnosing or prognosing the prognosis of liver cancer which comprises the agent for measuring the expression level of the TCIRG1 gene or protein according to the present invention, can more accurately determine the cancer diagnosis accuracy of the patient by accurately determining the onset, And to better predict the condition of the lesion and the clinical outcome of the patient after treatment to determine the appropriate treatment regimen or to increase the survival rate after the onset of liver cancer.
  • the inhibitor for BANF1, PLOD3 and SF3B4 gene or protein according to the present invention can be useful for the treatment of liver cancer.
  • the inhibitor for TCIRG1 gene or protein inhibits metastasis and recurrence of liver cancer. It can be useful.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a procedure for identifying a novel liver cancer diagnostic marker of the present invention in hepatocarcinoma.
  • FIG. 2 shows the result of identifying markers capable of diagnosing early-stage hepatocellular carcinoma.
  • 2a is a heat map of 3,628 genes showing significant expression differences in various stages of hepatocellular carcinoma and premalignant lesion ; Welch's t-test (p ⁇ 0.05) and 1.5-fold difference in expression between the normal sample and the normal sample) and a heat map and a graph of the mean value of each disease (bottom).
  • 2b shows a heat map of 1,730 genes (one way ANOVA p ⁇ 0.005) showing significant abnormalities in LGDN, HGDN, eHCC and G1 (top), hierarchical analysis of mean values of LGDN, HGDN, eHCC and G1 The results are shown (bottom).
  • 2c is a Venn diagram showing genes expressing differences between specific groups (left), showing a heat map for 690 genes with differential expression in all groups (intermediate), showing progressive progression in early stage hepatocellular carcinoma (Right).
  • This is a strategic model for the identification of 85 genes that have been up-regulated to 2d shows the ROC curve analysis for 13 genes, showing a statistically significant difference in AUC compared to the standard line.
  • 2e shows the immunochemical analysis results for 10 candidate gene markers in HCC TMA in the photograph (top) and the expression rate (bottom).
  • FIG. 3 shows the expression profile of a novel cancer detection (diagnosis) marker.
  • 3a shows the analysis of the expression level of 10 marker genes in non-tumor tissues and tumor tissues of HCC patients derived from the TCGA_LIHC data set
  • 3b shows the analysis of the expression level of 10 marker genes in stepwise HCC patient tissues from cohort 1.
  • FIG. 4 shows the results of analysis of the possibility of BANF1, PLOD3 and SF3B4 as early stage HCC diagnostic markers in precancerous lesion sites.
  • 4a shows the results of immunohistochemical staining for 10 candidate markers in the whole section of early stage HCC
  • 4b is a bar graph showing the positive expression level of each of the existing marker (CM) and the novel marker (NM) of the present invention (left), and the image of the immunohistochemical staining result Right side).
  • 4c shows the positive expression level for each of the existing marker (CM) and the novel marker (NM) of the present invention (left), the positive expression rate of the novel marker of the present invention in the HCC of the existing marker negative expression, The positive expression rate of the existing markers in the negative expression HCC is shown as a bar graph (middle), and the negative expression results of all conventional markers are shown as immunohistochemical staining results (right).
  • 4d are graphical representations of NM-negative expression in CM-positive RN tissues and CM-negative expression in NM-positive RN tissues.
  • 4e shows the ROC curve for each marker
  • 4f shows Kaplan-Meier survival curve analysis results for the protein expression of three novel markers of the present invention in patients with hepatocellular carcinoma.
  • FIG. 5 shows the results of ROC analysis for the 10 new candidate gene markers, and ROC analysis results for 3 existing markers and 3 new markers in the cohort 2 HCC patient group.
  • FIG. 6 shows abnormal expression patterns of BANF1, PLOD3 and SF3B4 in HCC and inhibition of hepatocarcinoma growth by inactivation thereof in vitro.
  • 6a shows the expression levels of BANF1, PLOD3 and SF3B4 in the TCGA_LIHC HCC 50 pair (Each left panel), showing expression levels in 13 pairs of randomly selected HCC tissues (each right drawing).
  • 6b shows Western blot results of BANF1, PLOD3 and SF3B4 expression levels in three pairs of early hepatocellular carcinoma (bottom) with six pairs of early hepatocellular carcinoma (top) and DL.
  • 6c shows the results of confirming the expression levels of BANF1, PLOD3 and SF3B4 in the mice (upper) and mice (lower) induced by hepatocellular carcinoma.
  • 6d shows Western blot analysis of BANF1, PLOD3 and SF3B4 expression levels in H-ras-transgenic mice (top) and DEN-induced hepatocellular carcinoma models (bottom).
  • 6e shows the cell viability (left) and cell growth rate (right) of SNU-449 cells transfected with control si-RNA (si-Cont) and siRNA for each gene (si-BANF1, si-PLOD3 and si-SF3B4) MTT analysis and BruD analysis, respectively.
  • 6f shows the result of analyzing the degree of colony formation of transfected SNU-449 cells.
  • FIG. 7 shows the results of analysis of inhibition of tumorigenesis and inhibition of metastasis of hepatocellular carcinoma cell line by targeting BANF1, PLOD3 and SF3B4.
  • 7a represents si-BANF1 (left) and the number of migrating cells (right) in the SNU-449 cell line transfected with si-PLOD3, si-PLOD3 and si-SF3B4,
  • the results of the wound healing analysis are shown in terms of cell images (left) and moving rates (right).
  • 7c shows Western blotting of the EMT regulatory protein in the SNU-449 cell line transfected with the control si-RNA (si-Cont) and the siRNA for each gene (si-BANF1, si-PLOD3 and si-SF3B4) Shows a mouse photograph and a tumor size measurement result of a mouse model transplanted with SNU-449 cell line transfected with control siRNA and si-BANF1, si-PLOD3 or si-SF3B4.
  • 7e is a schematic representation of the time of administration of MSNs to H-ras transgenic mice (top), MSNs alone and MSNs_ siRNA were administered to H-ras transformed mice and the number of tumors formed over time was measured The results are shown (bottom).
  • 7f shows Western blot results of BANF1, PLOD3 and SF3B4 expression levels in liver tissues of mice transfected with H-ras.
  • 8 shows results using mesoporous silica nanoparticles (MSN) containing siRNA.
  • MSN mesoporous silica nanoparticles
  • 8a shows the levels of BANF1, PLOD3 and SF3B4 expression in Hepa-1c1c7 mouse liver cancer cells
  • 8b shows the expression levels of BANF1, PLOD3 and SF3B4 in mesenchymal silica nanoparticles (MSN) and Hepa-1c1c7 mouse liver cancer cells transfected with siRNA of each gene
  • 8c shows meso-pore silica nanoparticles MSN) and BANF1, PLOD3 and SF3B4 expression levels in Hep3B cells transfected with siRNA of each gene.
  • Figure 9 shows the clinical validity of the possibility of liver cancer markers in SF3B4, wherein 9a represents BANF1, PLOD3 and SF3B4 mRNA expression levels in the TCGA_LIHC dataset, 9b represents the entire HCC patient (left) and disease free survival The Kaplan-Meier survival curve with mRNA expression of the three new markers in the patient (right) is shown. 9c shows Kaplan-Meier survival curves for BANF1, PLOD3 and SF3B4 mRNA expression in HCC patients.
  • 9d shows the Kaplan-Meier survival curve for the combination of copy number amplification and mRNA upregulation of SF3B4 in all HCC patients (left) and disease free survivors (right), and 9e shows the gene copy number of SF3B4 in the TCGA_LIHC data set (Left), showing the correlation between the number of copies and the mRNA expression value (right).
  • 9f shows the results of qRT-PCR analysis of gene copy number (left) and mRNA expression level (right) of SF3B4 in twenty pairs of HCC patient tissues.
  • 10 shows the inhibition of cell cycle and inhibition of EMT progression in hepatocellular carcinoma cells according to the destruction of SF3B4.
  • 10a shows the genetic variation of the SF3b complex subunit in 366 HCC patients in the TCGA_LIHC data set
  • 10 shows the relative expression levels of SF3b complex subunits in tumors and non-tumors in the GEO database
  • 10c shows the expression of SF3B4 mRNA in two normal hepatocyte and eight HCC cell lines by qRT-PCR (top) and Western Bott (bottom) analysis results.
  • 10d shows a heat map for autonomous hierarchical clustering analysis of 342 SF3B4 correlated genes (left), and Kaplan-Meier survival curves for the SF3B4 high cluster and SF3B4 low cluster patients in the GSE16757 dataset.
  • 10e shows the GSEA gene set associated with SF3B4, and a total of 11 gene lists were identified by MSigDB (top).
  • the growth-related gene set (KEGG_CELL_CYCLE) is characterized by SF3B4, and the barcode represents the position of the gene (bottom).
  • 10f shows the results of FACS analysis of two HCC cell lines after transfection with si-SF3B4, showing the histogram on the left and the percentage of each cell cycle phase on the right (p ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, p ≪0.001; t test).
  • 11 shows the results of analysis of the effect of SF3B4 knockdown in the HCC cell line.
  • 11a was transfected with si-RNA Cont (control) and si-RNA SF3B4 against SNU-449 and SNU-368 cell lines, (Left) and cell proliferation rate (right).
  • 11b shows the result of analysis of the degree of cell colonization
  • 11c shows the degree of migration and invasion of liver cancer cells through transwell migration and invasion analysis (Left) and the number of mobile cells (right).
  • 11d shows the result of analyzing the wound healing effect at 0 and 24 hours after knocking down SF3B4, 11e shows Western blot analysis of the expression level of EMT regulatory proteins, 11f is knockdown of SF3B4, And histograms of PI-stained cells using FASC.
  • 12 shows the analysis of the regulators of SF3B4 in the course of hepatocarcinogenesis.
  • 12a shows Western blot analysis of expression of each protein in HeLa cells and hepatocellular carcinoma cell lines treated with siRNA and SSA for SF3B4, respectively (Upper), and the mRNA levels of the genes were analyzed by qRT-PCR.
  • 12b shows Western blot analysis of the expression of cell cycle regulators for each experimental group of 12a and 12c shows a pipeline of gene expression analysis and selective splicing event analysis using the GSE80861 RNA-seq data set Left), pie charts show distributions of differentially expressed genes (DEG, upper right) and selective splicing event (AS) types.
  • DEG differentially expressed genes
  • AS selective splicing event
  • 12d shows the relative expression levels of GRIP1, PLP1, KLF4 and KRT80 in the TCGA_LIHC data set
  • 12e shows the results of qRT-PCR analysis of the expression level of KLF4 in cells transfected with SF3B4 siRNA
  • 12f shows the results of Sashimi plot (P ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, p ⁇ 0.001; t test), indicating alternative splicing of KLF4 and a skipped exon (SE).
  • FIG. 13 shows the results of MTT analysis of SNU-449 and SNU-368 cell lines in which SF3B4 siRNA (left) or SSA-treated (right) cell survival rate was analyzed for KLF4, which is a tumor suppressor of SF3B4 in liver cancer cell lines
  • 13b shows the relative expression changes and selective splicing (comparison of cell lines knocked down with SF3B4 versus control) relative to 8 genes in the GSE80861 data set.
  • 13c and 13e show the analysis of the expression levels of GRIP1, PLP1 and KLF4 in the SNU-449 and SNU-368 cell lines transfected with SF3B4 siRNA
  • 13d and 13e show the results of analysis of the expression levels of TCGA_LIHC data set 13d and GSE77314 data set 13e
  • the analysis of expression correlations between SF3B4 and 8 genes in 50 pairs of HCC patients is shown.
  • FIG. 14 shows the function of SF3B4.
  • 14a shows the expression of p27 Kip1 in the SF3B4 knockdown or KLF4 overexpressed HCC cell line And Slug
  • 14b shows expression levels of p27 Kip1 in SNU-449 cells overexpressing SF3B4 knockdown or KLF4 Or Slug promoter sequence
  • 14c shows the RT-PCR product image of KLF4 mRNA and two KLF4 mRNA isoforms in SF3B4 knockdown cells (left), and the HCC cell line Two KLF4 mRNA isoforms identified and a splicing site at the bottom of each diagram (middle) and a red line showing the splicing junction (right).
  • 14d is the tumor growth curve (left) and fluorescence image (right) of the tumor growth in a nude mouse model transplanted with SF3B4 knockdown SNU-449 cells
  • 14e shows the tumor growth in the cancer tissue obtained from the 14d mouse animal model SF3B4, and KLF4
  • 14f shows a model of carcinogenic action of SF3B4 through inhibition of wild-type KLF4 expression in HCC.
  • FIG. 15 shows identification and selection results of genes involved in recurrence of hepatocellular carcinoma.
  • FIG. 15a shows the differential expression level of the 7,550 gene in a two-dimensional diagram.
  • tissues derived from non-recurrent or recurrent HCC patients .
  • Dendrograms are derived from clustering of patients with total hepatic resection (TH) and partial hepatic resection (PH).
  • 15b shows the results of the Ben diagram analysis of the gene characteristics between the TH and the PH groups
  • 15c shows the differential characteristics of the up-regulated genes among the non-recurrence and recurrence groups in the patients with total liver resection by Volcano plot, TH metastatic trait and GSE 39791 metastatic trait
  • 15e shows a bar chart for the top 10 gene sets from 953 apparent metastatic molecules analyzed with MSigDB
  • 15f shows the TH characteristic And the LIAO_METASTASIS gene set.
  • the bar code shows the position of the gene and the y-axis shows the content (expression level) of the gene.
  • FIG. 16 shows the overexpression of TCIRG1 in hepatocellular carcinoma (HCC) and its clinical relevance analysis.
  • FIG. 16a shows TCGA_LIHC data analysis.
  • Figure 16b shows the Kaplan-Meier survival curves of TCIRG1 mRNA expression levels in TCGA_LIHC for the first half (left) and disease free survival (right), and the P value was derived by log-rank test.
  • FIG. 16c shows the results of the TCIRG1 ROC curve analysis on TCGA_LIHC (left) and GSE39791 (right). The statistical significance of AUC was compared with the control (* P ⁇ 0.05; *** P ⁇ 0.001).
  • 16d shows the results of qRT-PCR analysis of the mRNA expression level of TCIRG1 in HCC tissues.
  • FIG. 16E shows the results of immunochemical analysis (left) and expression rate of TCIRG1 (right) of non-tumor tissues or tumor tissues (*** P ⁇ 0.001).
  • FIG. 16f shows the result of Western blotting the expression level of TCIRG1 in HCC tissues (NT: adjacent non-tumor tissue, T: tumor tissue) and glycerol aldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as a loading control Respectively.
  • FIG. 16g shows the Kaplan-Meier survival curves for positive expression or negative expression of TCIRG1 (left) and the intensity of the tumor range by TCIRG1 expression in the untransfected cohort (right).
  • Figure 16h shows the Kaplan-Meier survival curves for positive expression or negative expression of TCIRG1 (left) and the intensity of the tumor range by TCIRG1 expression in the transplanted cohort (right).
  • Figure 16i shows the results of analysis of TCIRG1 mRNA expression levels using the Gene Expression Omnibus (GEO) databases (accession numbers: GSE14520, GSE16757, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE36411, GSE45436 and GSE89337) * P ⁇ 0.01; *** P ⁇ 0.001).
  • Figure 16j plots the parallel coordinates for TCIRG1 expression in the HCC published genomic data of the NCBI GEO database (accession numbers: GSE39791 and GSE77314; mean ⁇ SD; ** P ⁇ 0.01; *** P ⁇ 0.001, paired ttest) will be.
  • GEO Gene Expression Omnibus
  • FIG. 16k shows the expression of TCIRG1 (left) (N: normal, eHCC: early liver cancer, ovHCC: overtHCC) and TCIRG1 expression in the hepatocellular carcinoma patient (right: accession number: GSE89337, mean ⁇ D, ** P ⁇ 0.01) Lt; / RTI >
  • FIG. 17 shows the results of analysis of anticancer effects of TCIRG1 targeting in hepatocarcinoma cell line.
  • 17a shows the results of two normal cell lines (THLE3 and MIHA) and 12 hepatocellular carcinoma cells (Hep3B, HepG2, Huh7, PLC / PRF /
  • the results of qRT-PCR analysis of TCIRG1 expression in SK-Hep1, SNU354, SNU368, SNU387, SNU398, SNU423, SNU449, and SNU475 are shown in Table 1.
  • 17b shows Western blot analysis of intrinsically expressed TCIRG1 GAPDH was used as a loading control and the number at the bottom of each band indicates the expression level.
  • 17c shows the results of analysis of colony forming ability in SNU475 and Huh7 cell lines
  • 17d shows transfection of SNU475 and Huh7 cell lines with TCIRG1 specific siRNA and negative control siRNA and cell number measurement through trypan blue staining
  • 17e shows the results of transfection of SNU475 and Huh7 cell lines with TCIRG1 specific siRNA and negative control siRNA and cell growth rate by MTT assay
  • 17f shows BrdU (Bromodeoxyuridine) influx analysis on SNU475 and Huh7 cell lines The results are shown in Fig.
  • FIG. 17h was obtained by transfecting cells with TCIRG1 specific siRNA (siTCIRG1) and negative control siRNA (NC) and performing FACS analysis with PI and Annexin V staining.
  • the bar graph shows the percentage of annexin V positive cells .
  • 17i was treated with 3-MA (5 mM) and then subjected to FACS analysis.
  • the bar graph shows the percentage of annexin V negative and PI positive cells.
  • FIG. 18 is a graph showing the inhibitory effect of TCIRG1 on cancer metastasis in hepatocarcinoma cell line, showing inhibition of migration (18a) and inhibition of metastasis (18b) in SNU475 and Huh7 cell lines by TCIRG1 knockdown.
  • 18c and 18e show the extent of recovery of cell migration.
  • 18d and 18e inhibit cell migration by TCIRG1 knockdown in fibroblasts of ras-transformed NIH-3T3 mice (18d ) And metastasis inhibition (18e).
  • 18f shows Western blot analysis of expression levels of EMIR-related factors TCIRG1, E-cadherin, N-cadherin, Fibronectin, Vimentin, Snail and Slug.
  • FIG. 19 is an analysis of the effect of TCIRG1 on cancer metastasis.
  • 19a is a CT image of ras-transformed NIH-3T3 cells after suppression of TCIRG1 expression (left), and the tumor volume is measured and plotted (Right side).
  • eHCC normal -> early liver cancer
  • avHCC severe hepatoma
  • BANF1 Barrier to autointegration factor 1
  • BANF1 can protect retroviruses from integration between molecules It was first identified as a protein with the ability to promote intermolecular integration into the host cell genome. However, the relationship between BANF1 and cancer has not yet been elucidated.
  • PLOD3 procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3
  • PLOD3 is a carbohydrate of hydroxy lysine-binding due to the activity of galactosyl- and glucosyl-transferase important for cross-linking of procollagen molecules and stabilization of supramolecular collagen structure of the fiber Is known to be the only isoenzymes that produce.
  • PLOD3 is known to be involved in the recruitment of MMP9, but the progression of cancer and its relation to cancer are unknown.
  • SF3B4 (splicing factor 3b subunit 4) encodes the core protein of the mammalian SF3b complex and is known to bind U2 snRNP to the junction site as part of the U2-type spliceosome. There is no known relationship between the two.
  • the present inventors In order to identify novel biomarkers capable of predicting and diagnosing liver cancer early, the present inventors have used different expression levels in normal liver tissue, early liver cancer tissue and advanced liver cancer tissue using a whole transcriptome expressing microarray , We found that BANF1, PLODS3, and SF3B4 were overexpressed more strongly than normal tissues. These genes were overexpressed in all six sections of early hepatocellular carcinoma that metastasized from HGDN . In particular, the markers discovered in the present invention are characterized in that they can detect and diagnose early liver cancer in pre-cancerous lesions.
  • Hepatocellular carcinoma has a developmental pattern of multifactorial lesions such as normal liver, chronic hepatitis, liver cirrhosis, and liver cancer. Recently, small nodules are found in the liver due to development of radiologic examination technique, and large nodules are likely to progress to liver cancer. Dysplastic nodule (DN), which is difficult to distinguish from liver cancer and has some characteristics of hepatocellular carcinoma (DN), is a part of multilevel development of hepatocellular carcinoma and is known as a representative form of carcinoma of hepatocellular carcinoma.
  • nodular lesions observed in cirrhosis are regenerative nodules, dysplastic nodules, hepatocellular carcinoma, and focal fatty lesions.
  • the regenerative nodules are 1 to 10 mm in size, spread throughout the liver and uniform in size.
  • Giant regenerating nodules larger than surrounding recurrent nodules have no cellular nodule and normal context within the nodule.
  • Dysplastic nodules are usually 1 to 1.5 cm in size and do not have a coating.
  • a low grade dysplastic nodule is a monoclonal proliferative disease with no cellular or structural abnormality but may be accompanied by a single artery.
  • High-grade dysplastic nodules show abnormalities of the nucleus of the cells and polymorphism of the nucleus of small cell changes.
  • the markers of the present invention can detect early liver cancer in a precancerous lesion.
  • the precancerous lesion refers to a stage prior to the transition to liver cancer. It does not require treatment equivalent to liver cancer, and a low grade dysplastic nodule (DN) or a dysplastic nodule (DN) including a high-grade DN (HGDN).
  • DN low grade dysplastic nodule
  • DN dysplastic nodule
  • HGDN high-grade DN
  • 3 genes were overexpressed compared with normal tissues.
  • GPC3, GS which is known to be able to distinguish early tumor from other tumor lesions including dysplastic nodule (DN), hepatocellular adenoma and local nodule proliferation
  • HSP70 markers and markers of the present invention were analyzed for expression pattern in hepatocarcinoma tissues.
  • the positive expression rate in which the conventional marker was expressed in hepatocarcinoma tissue was found to be 50.9%, while the positive expression rate in which the marker of the present invention was expressed was 72.7%.
  • the negative expression rate of the conventional marker in hepatocarcinoma tissue was found to be 49.1%, while the negative expression rate of the new marker of the present invention was found to be 27.3%. Therefore, it can be seen that the BANF1, PLODS3 and SF3B4 markers identified in the present invention can diagnose liver cancer with higher efficiency and accuracy than GPC3, GS and HSP70 which are conventional markers.
  • Kaplan-Meier survival curves of hepatocellular carcinoma patients were analyzed.
  • the disease-free survival rate of patients exhibiting high expression of the novel markers of the present invention was higher than that of the low-
  • the markers of the present invention were found to be significantly lower than those of the markers of the present invention.
  • the novel markers of the present invention were found to have a carcinogenic effect leading to the development of hepatocellular carcinoma, and the expression level of these markers can be used to diagnose early liver cancer and further predict the survival prognosis of the patient could know.
  • the present invention relates to a method for inhibiting the proliferation of a cell, which comprises at least one selected from the group consisting of BANF1 (barrier to autointegration factor 1), PLOD3 (procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) and SF3B4 (splicing factor 3b subunit 4)
  • BANF1 barrier to autointegration factor 1
  • PLOD3 procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3
  • SF3B4 splicing factor 3b subunit 4
  • the present invention can provide a composition for diagnosing early liver cancer comprising an agent for measuring the expression level of mRNA or protein on any one or more genes selected from the group consisting of BANF1, PLOD3 and SF3B4.
  • TCIRG1 T-Cell Immune Regulator 1
  • TCIRG1 T-Cell Immune Regulator 1
  • hepatocellular carcinoma tissues In order to identify biomarkers that can accurately predict and diagnose liver cancer, the present inventors first classify hepatocellular carcinoma tissues as hepatocellular carcinoma (HCC) and recurrent hepatocellular carcinoma Clustering analysis was performed on the expressed genes. As a result, we confirmed the TCIRG1 gene, which is specifically overexpressed in the tissues of patients with liver cancer recurrence after hepatectomy.
  • HCC hepatocellular carcinoma
  • TCIRG1 gene is overexpressed in liver cancer
  • TCIRG1 was overexpressed at the onset of liver cancer, and TCIRG1 could be used as a specific biomarker for the diagnosis of liver cancer.
  • the correlation between the expression level of TCIRG1 and the recurrence and prognosis of liver cancer was analyzed.
  • the TCIRG1 expression positive group showed lower disease free survival rate than the TCIRG1 negative group and the poor prognosis I could confirm.
  • TCIRG1 can be used not only for the development of liver cancer but also for the possibility of recurrence after liver cancer surgery and the prognosis of the patient.
  • TCIRG1 is over expressed in comparison to normal, liver cancer is developed, Recurrence, possibility of metastasis, or poor prognosis of the patient.
  • the present invention can provide a marker marker composition for liver cancer comprising the TCIRG1 gene or the TCIRG1 protein encoded from the gene.
  • a composition for predicting the diagnosis or prognosis of liver cancer which comprises an agent for measuring the expression level of mRNA or TCIRG1 protein against the TCIRG1 gene.
  • the term "diagnosis” means confirming a pathological condition.
  • the diagnosis is to confirm the presence or absence of a marker for liver cancer, The presence or absence of expression of the diagnostic marker, and the degree of expression of the diagnostic marker, thereby determining whether or not the liver cancer develops, development and alleviation.
  • the prognosis of early liver cancer or liver cancer can be diagnosed by using the marker.
  • the term "prognosis” refers to predicting various conditions of the patient such as the possibility of cancer cure, possibility of recurrence after treatment, and survival probability of the patient after cancer is diagnosed.
  • the prognosis of cancer can be estimated from various perspectives, but it can be judged from the viewpoint of possibility of recurrence, possibility of survival, disease free survival.
  • the prognosis may mean the prognosis of survival after diagnosis of liver cancer.
  • the use of the biomarker provided in the present invention can more easily predict the survival prognosis of patients with liver cancer and can be used to classify patients in high risk group or to determine whether to use additional treatment methods, Thereby contributing to the later survival rate.
  • the "prediction" relates to the likelihood and / or likelihood that a patient will respond favorably or non-favorably to the therapy and survive after treatment of the patient.
  • the method of the present invention can be used clinically to make treatment decisions by selecting the most appropriate treatment regimen for cancer-causing patients.
  • the predictive method of the present invention may also be used to confirm that the patient preferentially responds to a treatment regimen, such as, for example, a prescribed treatment or combination, surgical intervention, chemotherapy, or the like, Can be used to predict whether a patient's long-term survival is possible.
  • diagnosis marker refers to a substance capable of distinguishing cells or tissues of liver cancer from normal cells or tissues.
  • the markers for the diagnosis of liver cancer provided by the present invention are preferably BANF1, PLOD3 or SF3B4 which increase the expression level in the cells (or tissues) of the liver cancer cell (or tissue) or hepatocellular carcinoma Lt; / RTI >
  • the marker for diagnosing liver cancer provided by the present invention may be a TCIRG1 gene or protein whose expression level is increased in cells (or tissues) of liver cancer as compared with normal cells.
  • the expression level of the marker gene preferably indicates the level of the mRNA at which the marker gene is expressed, that is, the amount of mRNA.
  • the substance capable of measuring the expression level BANF1, PLOD3, A primer, a probe, an aptamer, an antibody or a substrate specific for the SF3B4 or TCIRG1 gene.
  • the term "primer” refers to a single-stranded DNA strand that can act as a starting point for template-directed DNA synthesis at a suitable temperature and suitable conditions (ie, four different nucleoside triphosphates and polymerase) Means an oligonucleotide.
  • the appropriate length of the primer may vary depending on various factors, such as temperature and use of the primer.
  • the sequence of the primer does not need to have a sequence completely complementary to a partial sequence of the template, and it is sufficient that the primer has sufficient complementarity within a range capable of hybridizing with the template and acting as a primer.
  • the primer of the present invention does not need to have a perfectly complementary sequence to the nucleotide sequence of the BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 gene of the template, and is sufficiently complementary within a range that hybridizes to this gene sequence and can perform the primer action It is enough to have.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • LCR Ligase chain reaction
  • TMA electron mediated amplification
  • NASBA nucleic acid sequence substrate amplification
  • the term "probe” means a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides, capable of specifically hybridizing to a target nucleotide sequence, Or artificially synthesized.
  • the probes according to the present invention may be single-stranded, preferably oligodeoxyribonucleotides.
  • Probes of the invention can include natural dNMPs (i.e., dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), nucleotide analogs or derivatives.
  • the probe of the present invention may also include a ribonucleotide.
  • the probes of the present invention can be used in combination with a framework-modified nucleotide such as a peptide nucleic acid (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365: 566-568 (1993)), phosphorothioate DNA, phosphorodithioate DNA, phosphoamidate DNA, amide-linked DNA, MMI-linked DNA, 2'-O-methyl RNA, alpha-DNA and methylphosphonate DNA, sugar modified nucleotides such as 2'- 2'-O-alkyl DNA, 2'-O-allyl DNA, 2'-O-alkynyl DNA, hexose DNA, pyranosyl RNA, and anhydrohexy Tolyl DNA, and nucleotides with base modifications such as C-5 substituted pyrimidines wherein the substituents are fluoro, bromo, chloro, iodo-, methyl-, ethyl-, vinyl-
  • the expression level of the BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 protein in the present invention is preferably a polypeptide for each marker produced through translation from mRNA expressing BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 gene, Substances capable of measuring the level of the protein may include "antibodies” such as polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies that can specifically bind to BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 proteins.
  • BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 protein has been identified as a marker protein capable of diagnosing liver cancer as described above
  • a method of producing an antibody using the protein can be carried out by a person skilled in the art Can be easily produced by using a known technique.
  • BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 can be produced by a method well known in the art of injecting an antigen into an animal and obtaining an antibody-containing serum from the animal, Can be prepared from any animal species host, such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog.
  • Monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method (Kohler et al., European Jounal of Immunology , 6, 511-519, 1976) well known in the art or can be prepared using the phage antibody library Clackson et al., Nature , 352, 624-628, 1991, Marks et al . , J. Mol. Biol ., 222: 58, 1-597, 1991).
  • an antibody according to the present invention may comprise a functional fragment of an antibody molecule as well as a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen binding function, and includes Fab, F (ab ') 2, F (ab') 2 and Fv.
  • the present invention can provide an early liver cancer diagnostic kit comprising a composition containing an agent capable of measuring the expression level of BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene or protein, wherein the expression level of the TCIRG1 gene or protein can be measured
  • an early liver cancer diagnostic kit comprising a composition containing an agent capable of measuring the expression level of BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene or protein, wherein the expression level of the TCIRG1 gene or protein can be measured
  • the present invention provides a kit for the diagnosis or prognosis of liver cancer, which comprises a composition containing the agent of the present invention.
  • the composition for early liver cancer diagnosis contained in the kit of the present invention may include a primer, a probe, an aptamer, an antibody or a substrate capable of measuring the expression level of BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene or protein, May include a primer, a probe, an aptamer, an antibody or a substrate capable of measuring the level of expression of the TCIRG1 gene or protein, and their definitions are as described above.
  • the kit of the present invention may optionally comprise a reagent, such as a buffer, a DNA polymerase (e.g., Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth) Thermostable DNA polymerases obtained from Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis or Pyrococcus furiosus (Pfu), DNA polymerase joins and dNTPs, and when the liver cancer diagnostic kit of the present invention is applied to immunoassay,
  • the kit of the present invention may optionally comprise a secondary antibody and a labeling substrate.
  • the kit according to the present invention may be manufactured from a number of separate packaging or compartments containing the reagent components described above.
  • the present invention also provides a microarray for early liver cancer diagnosis comprising a composition for the diagnosis of early liver cancer capable of measuring the expression level of BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene or protein, and a liver cancer cell line capable of measuring the expression level of TCIRG1 gene or protein
  • a diagnostic microarray for liver cancer comprising a diagnostic composition is provided.
  • a primer, a probe or an antibody capable of measuring the expression level of BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 gene or protein is used as a hybridizable array element, Is immobilized.
  • Preferred substrates may include, for example, membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic beads or nonmagnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, microparticles and capillaries, as suitable rigid or semi-rigid supports have.
  • the hybridization array elements are arranged and immobilized on the substrate, and such immobilization can be performed by chemical bonding methods or covalent bonding methods such as UV.
  • the hybridization array element may be bonded to a glass surface modified to include an epoxy compound or an aldehyde group, and may also be bound by UV on a polylysine coating surface.
  • the hybridization array element can be coupled to the substrate via a linker (e.g., ethylene glycol oligomer and diamine).
  • the sample to be applied to the microarray of the present invention is a nucleic acid
  • it may be labeled and hybridized with an array element on a microarray.
  • Hybridization conditions may vary, and detection and analysis of hybridization degree may be variously performed depending on the labeled substance.
  • the present invention can provide a method for detecting one or more early stage liver cancer diagnostic markers selected from the group consisting of BANF1, PLOD3 and SF3B4 from a sample of a patient to provide information necessary for diagnosis of liver cancer.
  • the present invention provides a method for detecting the expression level of mRNA or protein, comprising: measuring the level of mRNA or protein expression of at least one gene selected from the group consisting of BANF1, PLOD3 and SF3B4 from a biological sample separated from a patient; And comparing the measured expression levels of BANF1, PLOD3, or SF3B4 with the expression levels of the corresponding genes of the control sample, thereby providing an information providing method for early liver cancer diagnosis.
  • the present invention also provides a method for measuring the expression level of the TCIRG1 mRNA or TCIRG1 protein from a biological sample isolated from a patient, And comparing the measured expression level of TCIRG1 with the expression level of the corresponding gene of the control sample.
  • the method of measuring the expression level or protein level of the BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 gene in the above can be performed by a known process for detecting or isolating mRNA or protein from a biological sample using a known technique.
  • the "biological sample” refers to a sample collected from a living body different from the normal control group in expression level or protein expression level of the BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 gene according to the degree of liver cancer development or progression, but are not limited to, tissues, cells, blood, serum, plasma, saliva, urine, and the like.
  • the diagnosis of early liver cancer may be a precancerous lesion, and the precancerous lesion may be all of a stage prior to progression to liver cancer.
  • HGDN high grade heterogeneity node
  • the expression level of the marker gene is preferably measured by measuring the expression level of mRNA.
  • Examples of the method for measuring the expression level of mRNA include RT-PCR, RT-PCR, RNase protection Methods, Northern blots, and DNA chips.
  • the marker protein in the biological sample and the antibody specific thereto form a conjugate, that is, an antigen-antibody complex, and the amount of the antigen- can be quantitatively measured through the magnitude of the signal of the detection label.
  • detection labels can be selected from the group consisting of enzymes, minerals, ligands, emitters, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not limited thereto.
  • Analysis methods for measuring protein expression levels include Western blotting, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, Oucheroton immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immuno staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, Protein chips, and the like, but are not limited thereto.
  • the present invention can confirm the mRNA expression level or the protein expression level of the marker gene of the control group and the marker gene mRNA expression level or the expression level of the protein in the liver cancer patient or suspected liver cancer patient through the above detection methods , And the expression level is compared with a control sample, that is, a sample of a normal person, thereby predicting and diagnosing the incidence, progression or prognosis of liver cancer.
  • a tissue lysate is obtained from liver cancer tissues and normal liver tissues obtained from patients with liver cancer, and then Western blotting using antibodies against BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 is carried out, The level of expression of the protein was measured from the sample, and the measured value was compared with a normal control.
  • the present invention also provides a cutoff value for the diagnosis of liver cancer, specifically, the amount of TCIRG1 expression that can predict the onset, recurrence, progression, or prognosis of liver cancer.
  • the cutoff value is a cutoff value for TCIRG1 in a sample according to the present invention, for example, tissue, serum, plasma and the like.
  • the cancer gene can be diagnosed or the prognosis can be estimated in comparison with the measurement result of the gene expression level in the control group.
  • cancer can be diagnosed or a prognosis estimated based on a predetermined cut-off value.
  • a control group a normal sample can be used as a negative control, or a patient-derived sample treated after cancer, such as a non-tumor sample, and a positive control group can be a patient-derived sample determined to be liver cancer.
  • a sample derived from a healthy person, a normal tissue sample collected from a cancer-determining patient, or a patient-derived sample treated with a cancer can be used as a control and used for a comparison of obtained profiles.
  • a variety of methods known in the art can be used to compare the marker profile between the control and sample groups. For example, a digital image comparison of the expression profile and a comparison using the DB for the expression data can be referred to.
  • the profile obtained through marker detection according to the present application can be processed using known data analysis methods. For example, nearest neighbor classifier, partial-least squares, SVM, AdaBoost, and clustering-based classification methods can be used.
  • various statistical processing methods can be used.
  • a logistic regression analysis method can be used in one embodiment.
  • Statistical analysis can also be used to determine the level of confidence regarding the significant differences between the test substance and the control group to diagnose cancer.
  • the data used in the statistical processing are the values analyzed by double, triple or multiple for each marker. This statistical analysis method is very useful for making clinically meaningful judgment through statistical treatment of biomarkers as well as clinical and genetic data.
  • the present inventors have analyzed the TCIRG1 cutoff value for diagnosis of liver cancer.
  • the amount of TCIRG1 expression in liver tissue of liver cancer patients and non-liver cancer patients was quantitatively determined, After quantitating the amount of TCIRG1 expression in non-tumor tissue and advanced hepatocellular carcinoma tissue, the expression level in liver cancer tissue tissue was deduced from the expression level of non-liver cancer tissue tissue, and the expression level in hepatocarcinoma tissue As a result of deriving the cutoff value based on the amount of expression in the non-tumor tissue, the cutoff value was found to be 11.0112. Therefore, if the cut-off value of TCIRG1 of the sample is 11.0112 or more, it can be predicted that the liver cancer has developed, and it is also predicted as the advanced liver cancer having the possibility of metastatic liver cancer metastasis.
  • the TCIRG1 cutoff value in the non-tumor tissue and the recurrent hepatocellular carcinoma tissue of the patient who underwent hepatectomy showed a cut-off value of 2.5687. Therefore, if the cut-off value of TCIRG1 in patients after surgery is 2.5687 or more, it is predicted that liver cancer may recur after surgical treatment.
  • TCIRG1 expression in cancer tissues of patients with liver cancer (G1), liver cancer (G2), liver cancer (G3) and liver cancer (G4) EHCC
  • the cutoff value was 6.4371 for early hepatocarcinoma (eHCC) and mid-term liver cancer (avHCC)
  • the cutoff value for G3 (third stage liver cancer) and G4 4th stage liver cancer) the cutoff value was 11.3794. Therefore, when the TCIRG1 cutoff value is 6.2821, it can be judged as early liver cancer. If 6.4371, it can be judged as middle-term liver cancer, and if it is 11.3794, it can be judged as terminal liver cancer.
  • BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 inhibitors can be used as agents for treating liver cancer.
  • knockdown was performed using siRNA that inhibits the expression of these genes as BANF1, PLOD3, SF3B4, or TCIRG1 inhibitor, and the growth and proliferation of hepatocellular carcinoma were analyzed.
  • a substance capable of inhibiting the activity and expression of BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 can be used as a therapeutic agent for liver cancer.
  • the present invention relates to a pharmaceutical agent for prevention or treatment of liver cancer comprising BANF1, PLOD3 or SF3B4 inhibitor as an active ingredient
  • the present invention can also provide a pharmaceutical composition for inhibiting the metastasis and recurrence of liver cancer comprising TCIRG1 inhibitor as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may include any substance capable of inhibiting the expression or activity of BANF1, PLOD3, SF3B4, or TCIRG1, preferably a chemical substance, a nucleotide, an antisense, an siRNA oligonucleotide or a natural product extract And more preferably an antisense or siRNA (small interference RNA) oligonucleotide having a sequence complementary to the nucleotide sequence of BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 gene of the present invention as an active ingredient, Even more preferably, siRNA can be used.
  • siRNA small interference RNA
  • the term "antisense oligonucleotide” means a DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, and binds to a complementary sequence in mRNA to bind to BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 It acts to inhibit the translation into protein.
  • the antisense sequence of the present invention refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 mRNA and capable of binding to BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 mRNA.
  • the antisense sequence of BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 mRNA And may inhibit essential activities for translocation, maturation, or all other overall biological functions into the cell.
  • the antisense nucleic acid can be modified at one or more bases, sugar or backbone locations to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol ., 5, 3, 343-55, 1995 ).
  • the nucleic acid backbone can be modified with phosphorothioate, phosphotriester, methylphosphonate, short chain alkyl, cycloalkyl, short chain heteroatomic, heterocyclic biantennary bond, and the like.
  • the antisense nucleic acid may comprise one or more substituted sugar moieties.
  • the antisense nucleic acid may comprise a modified base.
  • Modified bases include hypoxanthane, 6-methyladenine, 5-methylpyrimidine (especially 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, genentioyl HMC, -Thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6-aminohexyl) adenine, 2,6-diaminopurine .
  • the antisense nucleic acid of the present invention may be chemically combined with one or more moieties or conjugates that enhance the activity and cytotoxicity of the antisense nucleic acid.
  • Oligonucleotides, including liposoluble moieties, and methods of preparation are well known in the art (U.S. Pat. Nos. 5,138,045, 5,218,105 and 5,459,255).
  • the modified nucleic acid may increase the stability to nuclease and increase the binding affinity of the antisense nucleic acid with the target mRNA.
  • the antisense oligonucleotides may be synthesized in vitro in a conventional manner and administered in vivo or may allow the synthesis of antisense oligonucleotides in vivo.
  • An example of synthesizing an antisense oligonucleotide in a test tube is to use RNA polymerase I.
  • One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to allow the antisense RNA to be transcribed using a vector whose recognition site (MCS) origin is in the opposite direction.
  • MCS recognition site
  • Such antisense RNAs are preferably made such that translation stop codons are present in the sequence so that they are not translated into the peptide sequence.
  • siRNA means a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (WO00 / / 44914). siRNA is provided as an efficient gene knock-down method or gene therapy method since it can inhibit the expression of a target gene.
  • the siRNA molecule of the present invention may have a structure in which a sense strand (a sequence corresponding to an mRNA sequence) and an antisense strand (a sequence complementary to an mRNA sequence) are positioned on opposite sides to form a double strand,
  • the molecule may have a single-stranded structure with self-complementary sense and antisense strands.
  • siRNAs are not limited to the complete pairing of double-stranded RNA moieties in RNA pairs, but may be mated by mismatch (corresponding bases are not complementary), bulge (no bases corresponding to one strand) And a portion that is not achieved may be included.
  • the siRNA terminal structure can be blunt or cohesive, as long as it can inhibit the expression of the TCIRG1 gene by the RNAi effect, and the adhesive terminal structure has a 3'-terminal protruding structure and a 5'- Both protruding structures are possible.
  • the siRNA molecule of the present invention may have a form in which a short nucleotide sequence is inserted between self-complementary sense and antisense strands, in which case the siRNA molecule formed by the expression of the nucleotide sequence is Thereby forming a hairpin structure, which in turn forms a stem-and-loop structure.
  • This stem-and-loop structure is processed in vitro or in vivo to produce an active siRNA molecule capable of mediating RNAi.
  • Methods for preparing siRNA include a method of directly synthesizing siRNA in a test tube, introducing the siRNA into a cell through transformation, and a method of expressing siRNA expression vector or PCR-derived siRNA expression cassette into a cell There is a way to convert or infect.
  • composition of the present invention comprising a gene-specific siRNA may include an agent that promotes intracellular infiltration of siRNA.
  • Agents that promote intracellular inflow of siRNA can generally include agents that promote nucleic acid inflow. Examples of such agents include liposomes or one lipophilic one of a number of sterols, including cholesterol, cholate, and deoxycholic acid Can be combined with the carrier.
  • poly-L-lysine spermine, polysilazane, polyethylenimine (PEI), polydihydroimidazolenium, polyallylamine Cationic polymers such as chitosan, chitosan and the like
  • succinylated PLL succinylated PEI
  • polyglutamic acid polyaspartic acid
  • anionic polymers such as polyaspartic acid, polyacrylic acid, polymethacylic acid, dextran sulfate, heparin, hyaluronic acid, and the like.
  • an antibody specific to BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 protein is used as a substance that reduces the expression and activity of the BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 protein, the antibody can be directly or indirectly (E.
  • Therapeutic agents capable of binding to the antibody include, but are not limited to, radionuclides such as 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, ); A biologically reactive variant or drug, such as methotrexate, adriamycin, and lympokine, such as interferon; Toxins such as lysine, avrine, diphtheria and the like; Heterofunctional antibodies, that is, antibodies that bind to other antibodies to bind the complex to both cancer cells and effector cells (e. G., K cells such as T cells) - associated or non-conjugated antibodies.
  • radionuclides such as 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re,
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder, dizziness, or the like when administered to humans.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for oral administration such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like, water for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols And may further contain stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1995).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated into a suitable form according to a method known in the art. That is, the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various parenteral or oral administration forms according to known methods, and isotonic aqueous solutions or suspensions are preferred for injection formulations typical of parenteral administration formulations.
  • the injectable formulations may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. For example, each component may be formulated for injection by dissolving in saline or buffer.
  • formulations for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, pills, and capsules.
  • composition formulated as described above may be administered in an effective amount through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous, or muscular.
  • routes of administration of the agent can be administered through any conventional route so long as it can reach the target tissue.
  • the "effective amount” as used herein refers to an amount that shows a preventive or therapeutic effect when administered to a patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may be varied depending on various factors such as the type and severity of the patient, age, sex, body weight, sensitivity to the drug, kind of the current treatment method, administration method, target cell, Can be easily determined by experts of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in combination with a conventional therapeutic agent, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or in multiple doses.
  • the amount capable of achieving the maximum effect in a minimal amount without side effects can be administered, more preferably 1 to 10000 ⁇ g / kg of body weight / day, and even more preferably 10 to 1000 mg / Kg body weight per day, which may be repeated several times a day.
  • the present invention relates to a method for screening a cell, which comprises (a) contacting a cell to be analyzed with a sample containing BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 gene or a protein thereof; (b) measuring the level of expression of the BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 gene, the expression level of the protein or the activity of the protein; And (c) when the level of expression of BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 gene, the expression level of the protein or the activity of the protein is decreased as a result of the measurement in the step (b), the sample is judged to be a substance for prevention or treatment of liver cancer
  • a method for screening a substance for preventing or treating hepatocellular carcinoma.
  • a sample to be analyzed can be firstly contacted with cells containing or expressing the BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 gene or a protein thereof.
  • sample means an unknown substance used in screening to check whether the expression level of the BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 gene, the expression level of the protein or the activity of the protein is affected.
  • the sample may include, but is not limited to, chemicals, nucleotides, antisense-RNA, small interference RNA (siRNA), and natural extracts.
  • the expression level of BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 gene, the expression level of the protein or the activity of the protein can be measured in the cells treated with the sample.
  • the expression level of the BANF1, PLOD3, SF3B4 or TCIRG1 gene, Or a decrease in the activity of the protein is measured the sample can be determined as a substance capable of treating or preventing liver cancer.
  • the activity measurement method may be performed by various methods known in the art, for example, a reverse transcriptase-polymerase chain reaction, a real time-polymerase chain reaction ), Western blot, Northern blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, and immunoprecipitation assay. It is not.
  • Coats 1 107 tissues from 81 patients, snap-frozen tissues
  • tissue microarrays were used in tissue microarrays
  • cohort 3 160 tissues from 70 patients, full section
  • Progression free survival was defined as the interval between the date of surgery and the date that a particular type of recurrence was diagnosed. All subjects also received written consent on the basis of the Declaration, and this study was approved by the Institutional Review Board of the clergy School (IRB approval number: MC12EISI0106, MC12SNMI0184).
  • Liver cancer tissues were collected at the Seoul National University Hospital from January, 1995 to May, 2006. Liver cancer tissues were immediately frozen and stored in liquid nitrogen. We also obtained informed consent from patients enrolled in this study. We obtained written consent from each subject according to the Declaration of Helsinki and received the approval of the Institutional Review Board (IRB approval number: MC12SNMI0184) of the Catholic University Medical School.
  • IRB approval number: MC12SNMI0184 Institutional Review Board
  • Table 2 list of antibodies used in Western blots and tissue microarrays
  • Liver cancer tissues were rechecked for hematoxylin and eosin (H & E) slides, fixed in formalin for a period of time, and paraffin-embedded (FFPE) recording blocks were selected for each case.
  • FFPE paraffin-embedded
  • Core tissue biopsies (2 mm in diameter) were taken from individual FFPE blocks (donor blocks) and placed in the beneficial paraffin block (3 tissue block array) using the trafficking.
  • Eight array blocks containing 302 HCC cancer tissues were prepared (Superbiochips Laboratories, Seoul, Korea).
  • RNA quality control was performed using the Experion TM system (Bio-Rad, Hercules, Calif.)
  • microarray analysis was performed using the Human HT-12 V4 Expression BeadChips (Illumina, Inc., San Diego, Calif.).
  • the biotinylated cRNA was purified using a MessageAmp kit (Ambion, Inc.), and chips were hybridized and scanned according to Illumina's standard method. Primary microarray data is available in the GEO database (GSE89377).
  • the patient's frozen tissue proteins and whole cell lysates were prepared using RIPA butter containing PMSF (phenylmethane-sulfonylfluoride) and 1X protease inhibitor cocktail tablets (Roche, Indianapolis, IN, USA). Total protein was electrophoresed on SDS-PAGE, electrophoretically transferred to PVDF membrane, blocking reaction was performed with blocking buffer (5% skimmed milk in Tris-buffered saline, 0.1% Tween-20)
  • Anti-E-cadherin, anti-GABDH, anti-fibronectin both from Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA
  • anti-Vimentin and anti-Slug both from Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA
  • the chemiluminescent signal was detected using Immobilon TM horseradish peroxidase substrate (Millipore, Billerica, MA, USA) and visualized using aLAS-4000 image analyzer (
  • Cell migration and invasion analysis were performed in vitro.
  • Cell migration was performed using modified Boyden chamber analysis (BD Bioscience) and infiltration analysis was performed using Matrigel (BD Biosciences).
  • Matrigel was diluted with a coating buffer to a concentration of 0.3 mg / ml.
  • the diluted Matrigel solution which was then dispensed at 100 ul, was covered with a portion of the Transwell cell culture insert and incubated at 37 ° C for 1 hour before being seeded with inserts (inserts).
  • siRNA such as si-SF3B4
  • cells were applied to transwell inserts and cultured using serum-free medium containing 2% or 5% FBS as chemoattractant.
  • siRNAs for BANF1, PLOD3 and SF3B4 were added at a concentration of 3 nmol to 80 ⁇ l InViVojection TM RNAi-nano reagent (Cat. No. DHMSN-vivoRNA; Lemonex Inc., Seoul, Korea) Of PBS solution was prepared. MSNs and si-RNA were intravenously injected weekly into the tail for 9-23 weeks in an H-ras transformed HCC mouse model. Ultrasound images were taken at 17 weeks, 19 weeks, and 21 days using ultrasonography.
  • Cells were cultured overnight and stained with Diff-Quik staining kit (Sysmex, Chuo-ku, Cobe, Japan). Cell images were viewed using an Axiovert 200 inverted microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany) at ⁇ 200 magnification and cell counts were counted in three random image fields.
  • Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an endogenous control to normalize the difference in the total amount of cDNA added
  • qRT-PCR was performed as described above, and glycerol aldehyde-3-phosphate dehydrogenase was used as an endogenous loading control.
  • the sequences of primers used for RT-PCR and qRT-PCR are shown in Table 3 below.
  • Hep3B Human HCC cell line
  • Huh7 Huh7
  • PLC / PRF / 5 SK-Hep-1, SNU- Cell lines were obtained from Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, South Korea).
  • THLE3 normal liver cell lines were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Va., USA), and immortalized liver cell lines MIHA and L-02 Jayanta Roy-Chowdhury (Albert Einstein College of Medicine, New York, NY).
  • All cell lines were cultured in RPMI 1640, DMEM (GenDEPOT, Barker, TX, USA) supplemented with 10% FBS (GenDEPOT, Barker, TX, USA) and 100 units / ml penicillin-streptomycin (GenDEPOT, Barker, EMEM (ATCC, Manassas, VA, USA) medium. All cell lines were incubated at 37 < 0 > C and 5% CO2.
  • SiRNA for transfection was synthesized by Genolution (Seoul, Korea) or by Bioneer (Daejeon, Korea), and negative control RNA duplexes were synthesized by Bioneer (Daejeon, Korea). RNA duplexes were transfected into cell lines at a concentration of 100 nM.
  • the nucleotide sequence of si-RNA is shown in Table 4, the TCIRG1 siRNA sequence is shown in SEQ ID NO: 46, and the control siRNA sequence is shown in SEQ ID NO: 47.
  • a KLF4 expression plasmid in which 1.4 Kb human KLF4 ORF (NM_004235) was subcloned into pcDNA3.1 + / C- (K) -DYK plasmid was purchased from Genscript (Piscataway, NJ). Transfection was performed using Lipofectamine RNAiMAX or Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen). Spliceostatin A (SSA), an SF3b complex inhibitor, was purchased from AdooQ Bioscience (Cat No. A12700; Irvine, CA, USA).
  • the cells were first divided into 12 well plates so that the cells were about 30%. After treatment with the transfection and inhibitor, 0.5 mg / mL MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) was treated and reacted for 1 hour. Formazan crystals were dissolved in DMSO and absorbance was measured at 570 nm using a VICTOR3 TM multilabel plate reader (PerkinElmer, Boston, MA).
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • the cells were divided into 24 well plates so that the cells were about 30%. After transfection, cells were treated with BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine), allowed to react for 2 hours, and then fixed at room temperature for 30 minutes. Cells were reacted with anti-BrdU antibody for 1 hour at room temperature. Unreacted antibodies were removed by washing with wash buffer. A Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody was added to each well, followed by addition of the substrate solution, followed by the addition of the reaction stop solution to terminate the reaction. The final reaction product was measured at an absorbance of 490 nm using a VICTOR3 TM multilabel plate reader (PerkinElmer).
  • BrdU 5-bromo-2'-deoxyuridine
  • a 6-well plate or a 60 mm 2 cell culture plate Dispensing the cells ((1000 cells / well) were transfected si- the control group, the cell-si SF3B4 TCIRG1 or siRNA. After transfection, 12 hours, and then 1x10 3 and 2x10 3 cells in 6-well plates can again The cells were washed with PBS buffer and fixed with 1% paraformaldehyde for 30 minutes at room temperature. The fixed cells were stained with 0.5% crystal violet at room temperature for 1 hour, Were analyzed using a clone counter program.
  • Cells were plated in 6-well plates, transfected with negative control siRNA or TCIRG1 siRNA, cultured for 72 hours, and cells were collected by trypsinization. Cells were then stained with trypan blue solution and stained cells were counted using a hematocytometer (Marienfeld Superior, Lauda Konigshofen, Germany).
  • the cells were plated on a 6-well plate and filled with 100% cells.
  • the micropipette tip was used to scratch the cells. Then, the image of the area with the stretch was observed with an IX70 fluorescence inverted microscope (Olympus, Tokyo, Japan) over time.
  • Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Jose, Calif.) was used. After transfection, liver cancer cells were washed with cold PBS buffer and suspended in 1x binding buffer. 1 ⁇ 10 5 cells were transferred to 5 ml culture tubes and 5 ⁇ l of annexin V-FITC and 10 ⁇ l of propidium iodide solution were added and mixed. After incubation for 15-20 minutes at room temperature under dark conditions, 400ul of 1X binding buffer was added to each tube and analyzed for FACS Calibur flow cytometer (BD Biosciences).
  • Hepatoma cell lines were transfected with si-SF3B4, cultured for 48 hours, and then transfected with trypsin. Then, the cells were washed with cold PBS buffer, fixed with 70% ethanol, suspended in 200 ⁇ l of PBS containing 1 mg / ml of RNase, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes under dark conditions. Nuclei were stained with 50 ug / ml propidium iodide (BD Biosciences), and stained cell fractions were analyzed using Cell-Quest FACS analysis software (BD Biosciences).
  • cells were seeded on a 60 mm 2 cell culture plate, cells were transfected with negative control siRNA and TCIRG1 siRNA, cultured for 72 hours, and cells were collected through trypsin treatment. Cells were fixed with 70% ethanol, washed with PBS buffer, and resuspended in 1 mg / mL RNase (Sigma-Aldrich), 0.05% Triton X-100 and 50 ug / mL propidium iodide (BD Biosciences, USA).
  • the suspended cells were incubated for 1 hour at 37 ° C in the absence of carbon dioxide and analyzed with a FACS Caliburflow cytometer (BD Biosciences) equipped with FLOWJO software (Tree Star, Ashland, OR, USA).
  • xenotransplantation tumorigenesis 1 x 107 cells of transfected cells were mixed with 0.2 ml PBS (pH 7.4) and 30% (v / v) Matrigel matrix (BD Biosciences). The cell suspension was subcutaneously injected into 6-week-old male Balb / c nude mice. Mice were observed twice a week for tumor formation at the injection site. Tumor volume was calculated as 0.5 ⁇ length (L) ⁇ width 2 (W 2 ). Each experimental group consisted of 10 mice. Tumor growth was measured in three orthogonal directions using a caliper. Results were expressed as mean tumor volume and 95% confidence interval. H-ras12V-activated homozygous transgenic mice were obtained from Dr.
  • Transgenic mice are H-ras12V-activated mice.
  • HCC was spontaneously developed in male mice at 15 weeks of age.
  • the present inventors obtained by subtracting non-tumor tissues and HCC tissues from five 35-week-old mice, and three pairs of HCC tissues were selected for pathological investigation.
  • induction of HCC was carried out using DEN (Diethylnitrosamine).
  • mice For the preparation of a lung metastatic mouse model, 3 ul of ras-transformed NIH-3T3 cells transfected with negative control siRNA and TCIRG1 siRNA, respectively, were mixed with 0.1 ml PBS and injected intravenously into the tail of a male nude mouse without thymus at 5 weeks of age. The state of the mice was examined daily after the injection, and after 12 days of intravenous injection, the mice were anesthetized for micro-computed tomography (Micro-CT) imaging. The mouse was placed on a scanner bed and micro CT images were obtained using a Triumph II PET / CT System instrument (Trifoil Imaging, Chatsworth, CA, USA). The images were reconstructed and the tumor volume of the total lung per mouse was quantified using MicroView analysis software (GE Healthcare, Pittsburgh, Pa., USA). After CT imaging, the mouse was sacrificed to obtain lung images and the number of nodules on the lung surface was calculated.
  • Micro-CT micro-computed tomography
  • a gene set was downloaded from MSigDB (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb) of the Broad Institute Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) (http: // www. broadinstitute.org/gsea).
  • GSEA Broad Institute Gene Set Enrichment Analysis
  • the GSEA was performed to access the presence of the LIAO_METASTASIS gene set and a clear metastatic gene signal.
  • the primary GSEA test quantifies the degree to which a given set of genes is enriched to the highest (positive correlation) or lowest (negative correlation) Indicates the score.
  • the proximity of the gene set was measured using the Kolmogorov-Smirnoff (KS) score, and the higher the score, the higher the proximity.
  • the analyzed KS scores were compared with the 1000 substituted KS score distributions for all gene sets to assess significance.
  • the pre-cancerous lesion refers to the stage before the patient is transferred to liver cancer, and does not require treatment equivalent to that of liver cancer.
  • Hierarchical clustering analysis revealed three distinct subclusters: chronic liver disease (LGCH, HGCH, liver cirrhosis and LGDN), early liver cancer (HGDN, eHCC and G1) and liver cancer HCC (G2 and G3) (See FIG. 2A). Also, as a result of reanalysis of LGDN, HGDN, eHCC and G1, LGDN was found to be an early stage of hepatocellular carcinoma (see FIG. 2B). Therefore, it was found that HGDN is a characteristic of the onset of early stage hepatocellular carcinoma. Precancerous lesion can be the starting site of driver gene activity and can be developed into hepatocellular carcinoma. Through these results, the present inventors have designed a gene selection strategy to identify a precancerous lesion, a set of genes that predicts potential hepatocellular carcinoma in HGDN.
  • ROC receiver operating characteristic
  • 13 out of 85 genes showed an area under the curve (AUC) value of 0.8 or more, and it was predicted that they could be used as markers having specificity and sensitivity (see Table 5 below, 13 candidates 13 genes were analyzed in a large cohort of HCC patients provided in the Cancer Genome Atlas Hepatocellular Carcinoma (TCGA_LIHC) data collection and the National Biotechnology Information Center (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) database.
  • AUC area under the curve
  • TMA tissue microarrays containing 546 HCCs (140 G1, 297 G2 and 109 G3) were used to confirm over-expression of these 10 genes in HCC as compared to surrounding non-tumor tissues Immunohistochemical analysis (IHC) was performed.
  • IHC immunohistochemistry
  • BANF1, PLODS3 and SF3B4 among the 10 candidate markers were strongly overexpressed or positively expressed in early hepatocellular carcinoma (eHCC) and HGDN.
  • eHCC early hepatocellular carcinoma
  • HGDN hepatocellular carcinoma
  • only one tumor was positive in the non-tumor area (see FIG. 4A).
  • the remaining 6 markers showed no significant difference in the eNOS and the surrounding area of the non-tumor tissue within the regenerating nodules (RNs).
  • CMs GPC3, GS and HSP70
  • NMs NMs
  • the positive expression rate (> 2 (+) / 3 CM or more) of two or more conventional marker genes in HCC was 50.9% (28/55), whereas in HCC, two or more new markers
  • the positive expression rate of the gene (more than two (+) / 3 NM) was 72.7% (40/55) (see FIG. 4B and Table 8, Table 8: early marker of hepatocellular carcinoma Of the expression level of.
  • the negative expression rate (? 1 (+) / 3 CM) of the conventional marker in HCC was 49.1% (27/55), and the negative expression rate (? 1 (+) / 3 NMs) (15/55).
  • Kaplan-Meier survival curves (cohort 2) analysis of HCC patients showed that the disease-free survival rate of patients with hepatocellular carcinoma showing high expression of the novel marker genes of the present invention was higher than that of patients with low expression levels of the novel marker genes of the present invention (FIG. 4f), indicating that the novel marker genes of the present invention can induce an early stage of HCC.
  • Example 5 Anticancer effect analysis of overexpression of BANF1, PLODS3 and SF3B4 in hepatocarcinoma and suppression of their activity
  • Banf1, Plod3 and Sf3b4 expression was reconstituted in chemically induced mouse and rat HCC models available in the GEO database.
  • the expression of Banf1, Plod3 and Sf3b4 showed upregulation of the corresponding NL in epithelial tumor (AD), eHCC and progressive HCC (aHCC) in both mouse and mouse models.
  • AD epithelial tumor
  • aHCC progressive HCC
  • HCCs were transfected with H-ras transgenic mice and DEN (diethylnitrosamine), and the expression of BANF1, PLOD3 and SF3B4 in these animal groups was examined by western blotting. As a result, as shown in Fig. 6D, all of these three markers were found to have increased expression.
  • BANF1, PLODS3, and SF3B4 inhibit cancer cell proliferation and colonization formation
  • RNAi and 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) was knocked down and the cell growth rate was measured.
  • BrdU bromodeoxyuridine
  • introduction and clonogenic assay were performed to measure the proliferation rate of SNU-449 HCC cells.
  • BANF1, PLOD3 and SF3B4 inhibited the growth and proliferation of SNU-449 HCC cells (FIGS. 6E and 6F), respectively.
  • BANF1, PLOD3 and SF3B4 inhibited the growth of hepatocellular carcinoma (See Table 1). In addition, it is associated with cancer metastasis, such as vascular invasion and differentiation.
  • EMT regulatory factors were analyzed via western blotting. N-cadherin, Fibronectin, Snail and Slugs, typical markers of EMT, were knocked down by the genes of the present invention, respectively, and these expressions were markedly decreased.
  • the epithelial cell marker Ecadherin was increased in the same cells (see FIG. 7C). From these results, the present inventors have found that BANF1, PLOD3 and SF3B4 according to the present invention selectively regulate the expression of EMT regulatory factors in hepatocarcinoma cells and have cancer metastatic ability.
  • tumor cells which were knocked down by BANF1, PLODS3 and SF3B4 genes were injected subcutaneously into nude mice without thymus, and then tumor growth and tumor volume were measured .
  • tumor growth and tumor volume decreased significantly compared with the group injected with cells knocked down by BANF1, PLODS3 and SF3B4, compared with the group treated with si-Cont, which is a control group.
  • mesoporous silica nanoparticles with very large pores were used as a method for inducing anticancer effect through specific si-RNA transfer to BANF1, PLOD3 and SF3B4.
  • MSN_si-RNA Mesoporous silica nanoparticles containing si-RNAs targeting BANF1, PLOD3 and SF3B4 were injected into the prepared mice, and the mice were injected with MSN alone without siRNA And hepatocellular carcinoma in mouse liver was analyzed by ultrasonography until 23 weeks after sacrifice at 16 weeks after birth.
  • the present inventors confirmed that the substances capable of inhibiting the expression or activity of BANF1, PLOD3 and SF3B4 can be used as a therapeutic agent for liver cancer, particularly hepatocellular carcinoma.
  • SF3B4 is one of six SF3b (splicing factor 3b) complexes and is an important protein in the U2 snRNP super-complex. Analysis of the expression levels and frequency of changes in the six subunits of the SF3b (splicing factor 3b) complex in TCGA_LIHC and GEO databases revealed that only SF3B4 was specifically overexpressed in hepatocarcinoma cells and gene copy number was amplified 10a and 10b).
  • SF3B4 expression level of SF3B4 was analyzed by qRT-PCR in 10 different kinds of liver cell lines, MIHA immortalized normal hepatocarcinoma cells and 8 human hepatocellular carcinoma cell lines.
  • SF3B4 expression in cell lines of hepatocellular carcinoma cells Of mRNA and protein were overexpressed (see Fig. 10C).
  • inhibition of the expression of SF3B4 resulted in inhibition of cell growth and proliferation of both SNU-449 and SNU-368 HCC cells (FIGS. 11A and 11B).
  • GSEA gene set enrichment analysis
  • MsigDB Molecular Signatures Database
  • Example 7 Abnormal splicing action of SF3B4 against KLF4 and hepatocyte cancer induction
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • next generation sequencing (NGS) -RNA sequence data of SF3B4 knockdown HepG2 cells were analyzed.
  • This data set is available from the GEO database (GSE80861) and was performed as part of the ENCODE project (the Encyclopedia of DNA Elements).
  • This analysis identified 3,182 genes (differentially expressed genes (DEG)) in the SF3B4 knockdown cells (> 1.5-fold difference from the control).
  • DEG differentially expressed genes
  • paired-end reads were mapped to the ENCODE database and the exclusion inclusion was quantified using the MATV (Multivariate Analysis of Transcript Splicing Analysis) analysis tool.
  • KLF4 and SF3B4 showed a significant negative correlation with hepatocellular carcinoma (Figs. 13d and 13e). These results indicate that the SF3B4 knockdown induces the regeneration of transcriptional expression of wild-type KLF4 and exhibits an antitumor effect against HCC cells.
  • NGS-RNA analysis shows that wild-type KLF4 transcript is suppressed in HCC tissue And KLF4 SE transcript was increased in hepatocellular carcinoma patients (Fig. 12f).
  • the present inventors applied a plasmid in which SF3B4 knockdown and KLF4 is ectopic expression is applied to a hepatocellular carcinoma cell line Respectively.
  • SF3B4 knockdown and KLF4 is ectopic expression is applied to a hepatocellular carcinoma cell line Respectively.
  • p27Kip1 and Slug which regulate SF3B4
  • ectopic expression of KLF4 as expected, showed the effect of SF3B4 knockdown in the same cells (Fig. 14A).
  • the luciferase activity of the p27Kip1 promoter transfectant was significantly increased in both the SF3B4 knockdown cell line and the KLF4 overexpressing cell line, and the luciferase activity of the Slug-promoter transfectant was significantly inhibited in the same cells (Fig. 14B).
  • SF3B4 knockdown and KLF4-overexpressing cells were injected subcutaneously into thymic nude mice to determine whether inactivation of SF3B4 induced tumor suppression through the recovery of the tumor suppressor, KLF4, in vivo.
  • both the tumor growth rate and the mean volume at sacrifice decreased significantly in both SF3B4 knockdown and KLF4 expressing SNU-449 cells (Fig. 14d).
  • immunoblot analysis confirmed the induction of KLF4 in both SF3B4 knockdown and xenografts expressing KLF4 (Fig. 14E).
  • BANF1, PLOD3, and SF3B4 can be used as biomarkers capable of predicting early liver cancer accurately, and in particular, it is possible to use two or more of these markers as a single marker When used in combination, it was found that the diagnostic accuracy was higher. Especially, these markers can be confirmed in pre-cancerous lesion samples.
  • Example 8 Large-scale gene identification associated with recurrence of hepatocellular carcinoma
  • HCC hepatocellular carcinoma
  • recurrence and metastasis after liver transplantation remain the most common and fatal problem. Therefore, it is necessary to develop molecular markers to determine the possibility of HCC metastasis and recurrence in primary tumors.
  • HCC tissues from patients who underwent partial or total hepatectomy, and transcriptomic analysis was performed to confirm gene expression patterns associated with recurrence after hepatectomy.
  • Fifty-six hepatocellular carcinoma tissues included nine relapsed cancer tissues from a total of 36 patients with total hepatectomy and 15 patients from 20 patients who underwent partial hepatectomy (See Table 11 below, number of relapsed patients undergoing liver resection).
  • GSEA gene set enrichment analysis
  • Example 9 Analysis of TCIRG1 expression pattern in recurrent tissue of hepatocellular carcinoma after liver resection
  • the TCIRG1 gene was significantly over-expressed in TCGA_LIHC data.
  • This database contains 50 non-tumor liver tissue and 373 HCC tissue gene expression (mRNA) data sets, including 50 matched sets (50 HCCs corresponding to noncoronary tissues).
  • the matching set also showed a significant difference between the non-cancer group and the HCC group.
  • TCIRG1 in HCC compared the degree of expression of the TCIRG1 gene in various GEO data sets (accession numbers GSE14520, GSE16757, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE36411, GSE45436 and GSE89337) ). Since TCIRG1 expression was upregulated (overexpressed) in patients with TCGA_LIHC tumors, we analyzed the TCIRG1 expression prognostic relevance of HCC patients using TCGA_LIHC data at cBioPortal (www.cbioportal.org). As a result, % Were overexpressed in the TCIRG1 gene. The Kaplan-Meier survival curves of HCC patients were significantly lower than those of HCC patients without increased TCIRG1 expression (see FIG. 16b) with a 5-year disease free survival (DFS) in patients with increased TCIRG1 expression.
  • DFS 5-year disease free survival
  • the present inventors compared and analyzed the ROC curve to verify whether TCIRG1 can be used as a biomarker for prediction of prognosis for HCC after hepatectomy (see FIG. 16C).
  • the area under curve (AUC) was 0.74 in the TCGA_LIHC group and 0.74 in the GSE39791 group. Suggesting its potential for use as a potential biomarker for the diagnosis of HCC.
  • TCIRG1 expression in the matching sets (GSE 39791 and GSE77314) providing gene expression information in the two HCC patient cohorts was significantly overexpressed in hepatocellular carcinoma tissue (HCC) compared to the non-tumor tissue Reference).
  • TCIRG1 protein in HCC tissues was confirmed by Western blot analysis on 14 randomly selected human liver cancer tissues and non-cancer liver tissues, and the expression was increased in liver cancer tissues compared to noncancerous tissues 16F).
  • the disease free survival rate (DFS rate) of TCIRG1-positive patients was significantly lower in the cohort of 546 non-transplanted HCC patients and 285 transplanted HCC patients than in those with negative TCIRG1 expression (See Figs. 16G and 16H). That is, the progression of cancer was significantly greater in the TCIRG1-positive patients in both cohorts (see Table 13 below), and the results were similar to those of the two cohorts of hepatocellular carcinoma patients with liver transplantation Suggesting that TCIRG1 is a significant marker for predicting the recurrence of hepatocellular carcinoma after liver resection.
  • TCIRG1 in liver tumor formation conducted experiments on cell viability, cell proliferation, BrdU staining, and colony formation with TCIRG1 knocked down through RNA interference.
  • the expression level of TCIRG1 in the cells was analyzed in 14 different liver cell lines through qRT-PCR and Western blot.
  • the liver cell lines were analyzed for the presence of MIHA and THLE3 in the immortalized normal liver Cell lines were also included.
  • TCIRG1 expression was overexpressed in human liver cancer cell lines Hep3B, HepG2, Huh7, PLC / PRF / 5, SK-Hep1, SNU354, SNU368, SNU387, SNU398, SNU423, SNU449 and SNU475 compared with MIHA cells (See Figs. 17A and 17B).
  • TCIRG1 knockdown SNU475 and Huh7 liver cancer cell lines were decreased in TCIRG1 knockdown SNU475 and Huh7 liver cancer cell lines, and the number of G1 phase cells was significantly increased (see Fig. 17g).
  • FACS analysis showed that TCIRG1 siRNA In the infected SNU475 cells, cell death was significantly induced as compared with cells transfected with negative control siRNA (NC) (see FIG. 17h).
  • apoptosis (plotted as a dotted outline at the top left) was induced in Huh7 cells transfected with TCIRG1 siRNA.
  • GSEA with a molecular signal associated with recurrence shows that the LIAO_METASTASIS gene significantly implies a recurrent signal (see FIG. 15g).
  • cell migration and invasion analysis were performed in vitro .
  • E-cadherin showed a significant increase in TCIRG1 knockdown SNU475 and Huh7 cell lines, while N-cadherin, Fibronectin, Vimentin, Snail and Slug decreased in the same cells (see FIG.
  • TCIRG1 expression analysis in two large HCC patient cohorts showed gene expression patterns of matching sets (GSE39791 and GSE77314), and expression of E-cadherin (CDH1) was significantly reduced in hepatocellular carcinoma compared to non-tumor tissue , TCIRG1 and E-cadherin showed inverse correlation in the same data set (see Fig. 18g).
  • TCIRG1 as a biomarker capable of predicting the prognosis of hepatocellular carcinoma, and furthermore, it can be used as a marker for predicting the relapse or metastasis after surgery of hepatocellular carcinoma , And that the TCIRG1 overexpression group was significantly lower in the disease - free survival rate, indicating that TCIRG1 inhibitor could be used as a therapeutic agent for preventing or inhibiting recurrence and metastasis of HCC.
  • Example 11 Providing a cut-off value for TCIRG1 expression level that predicts onset, progression and recurrence of liver cancer
  • the inventors of the present invention have shown that the expression level of TCIRG1 is increased during the development of hepatocellular carcinoma and that the expression of TCIRG1 is also increased in a patient who has recurred liver cancer after hepatectomy, And it can be used as a marker to predict the progression, prognosis and possibility of recurrence of liver cancer.
  • the TCIRG1 cut-off value for the advanced liver cancer was 11.0112 (cut-off value: 11.0112, log2 RSEM), as shown in Fig. 20A. Therefore, quantitative analysis of the expression level of TCIRG1 indicates that the cut-off value is 11.0112, which can be judged as advanced liver cancer, and the liver cancer is highly likely to be transferred.
  • the cut-off value of TCIRG1 was 8.25 (8.25, log2 expression) as shown in FIG. 20B.
  • TCIRG1 expression was high in the TCGA_LIHC cohort according to the high stage of liver cancer.
  • the cut-off value of TCIRG1 expression level in G3 (third stage liver cancer) and G4 (fourth stage liver cancer) was 11.3794 (log 2 RSEM), respectively, as a result of analysis of cutoff value for each hepatocellular carcinoma progress stage Reference).
  • the cutoff value for the amount of TCIRG1 expression in advanced liver cancer is 11.3794, it can be judged to be terminal liver cancer, that is, stage IV liver cancer.
  • eHCC normal liver cancer
  • eHCC normal liver cancer
  • avHCC mid-stage liver cancer
  • the cutoff value for the amount of TCIRG1 expression can be judged as early liver cancer when the cut-off value is 6.2821, and it can be judged as middle-stage liver cancer if 6.4371.
  • TCIRG1 was analyzed to determine whether the prognosis for patients after hepatectomy could be predicted.
  • the level of TCIRG1 expression was measured in tumor tissues in which hepatocellular carcinoma recurred and in non-recurrent tissues after liver resection, Respectively.
  • the TCIRG1 expression cutoff value was found to be 2.5687.

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Abstract

본 발명은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 조기 간암 진단용 조성물 및 TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암의 진단 또는 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.

Description

간암의 진단 및 예후 예측용 바이오 마커 및 이의 용도
본 발명은 전암성 병변에서 조기 간암을 진단 및 예측할 수 있는 바이오마커로서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 용도에 관한 것이고, 간암의 재발 및 수술 후 예후를 예측하고 진단할 수 있는 바이오마커로서 TCIRG1의 용도에 관한 것이다.
암은 인류의 건강을 위협하는 대표적인 질병으로서 산업화된 국가에서 단일 질병으로는 가장 대표적인 사망 원인이다. 암의 발생원인은 아직도 규명되지 않고 있으나 내적 요인인 유전적 요소와 외적 요인인 암 발생 유발요소로 작용되는 발암화학물질, 계속적인 염증과 손상, 암 유발 바이러스 감염의 복합적 요소가 작용하는 것으로 간주된다.
그러나 암은 불치의 병으로 단정할 만큼 절망적인 것은 아니며 조기진단과 함께 적극적인 치료에 임하면 완치될 수 있다. 따라서 조기발견과 조기치료가 암치료의 효과를 높이는 데 결정적으로 중요하며, 진행된 암에서도 다각적이고 적극적인 방법들을 동원한다면 완치 내지 생명을 연장시키고 괴로운 증세를 호전시킬 수 있다.
암 중에서도 간암은 세계적으로 가장 치명적인 암의 하나로 알려져 있으며, 특히 아시아와 사하라 이남 아프리카에서 해마다 약 오십만 명 이상이 간암으로 사망하고 있는 것으로 보고되고 있다. 간암은 크게 간세포 자체로부터 발생한 원발성 간암 (간세포암; hepatocellular carcinoma)과 다른 조직의 암이 간으로 전이되어 온 전이성 간암으로 구분할 수 있는데, 간암의 약 90% 이상은 원발성 간암이다. 이러한 간암의 발병 원인 중 대다수는 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 의한 급성 또는 만성적인 감염이라는 것이 보고되고 있지만, 간암의 발병 및 진행에 관한 세포 내의 분자적 메커니즘은 아직도 명확히 규명되지 못한 상태이다. 종래의 연구에 따르면 각종 성장인자 유전자와 같은 전-종양형성유전자 (protooncogene)가 다양한 원인에 의하여 종양형성유전자(oncogene)로 돌연변이되어 과발현하거나 과활성을 갖는 경우, 또는 Rb 단백질이나 p53 단백질과 같은 종양형성 억제 유전자 (tumor suppressor gene) 가 다양한 원인에 의하여 돌연변이 되어 저발현하거나 기능을 잃는 경우 간암을 비롯한 다양한 암의 발병과 진행을 유발하는 것으로 보고되어 있다. 최근에는 간암을 비롯한 대부분의 암의 발병 및 진행은 특정 몇몇 유전자들에 의하여 이루어지는 것이 아니라 세포주기, 신호전달 등과 관련된 다양한 각종 유전자들의 복합적인 상호작용에 발병하는 것으로 인식되고 있으며, 따라서 개별적인 유전자나 단백질의 발현이나 기능에만 중점을 두는 것에서 벗어나 다양한 유전자나 단백질에 대한 총체적인 연구의 필요성이 대두되고 있다.
한편, 정상인에서 간암을 조기에 정확하게 발견해 낼 수 있는 바이오마커 검사는 아직까지 개발되지 못했으며, 고위험군에서 비침습적인 조기 간암 진단을 위하여 사용하고 있는 검사 방법이 혈청 알파태아단백 검사이다. AFP는 개발 당시 민감도와 특이도를 모두 양호한 수준으로 달성할 수 있는 기준값으로 20 ng/mL로 제시되었으나, 이 경우 민감도가 60%에 지나지 않으며 현재 국제 학회의 간암 진단 가이드라인에 따라 200 ng/mL를 기준으로 간암을 진단할 경우 특이도는 상승하지만 민감도가 22%에 불과하다. 기존의 연구 결과, AFP는 전체적으로 약 66%의 민감도와 82%의 특이도를 갖는 것으로 알려져 있어 모든 간암 환자를 진단하는 데에 제한이 있다.
그 외 진단 기준으로 확립되어 있지는 않으나 간암 진단에 도움이 되는 혈청 마커로는 Descarboxyprothrombin (DCP), Prothrombin Induced by Vitamin K Absence II (PIVKA-II), 글리코실화 AFP 대 총 AFP (L3 fraction) 분포, alpha fucosidase, glypican 3, HSP-70 등이 있다. 그러나 각각은 예후 인자로서 의미를 가지는 것이 대부분이고, 단독으로 사용하였을 때 정확도가 낮아 아직 선별 검사로 사용되지 못하고 있으며, 간암을 조기 진단하는 것은 이미 한계에 다다른 것으로 판단된다. 아울러 실제 수술이나 고주파 열치료술과 같은 근치적 치료가 가능한 단계에서 진단되는 환자들은 전체 간암 환자의 30% 정도에 국한된다. 따라서, 간암의 근본적인 치료가 가능한 단계에서 최대한 조기진단 할 수 있는 특이성과 민감도가 향상된 새로운 진단 마커의 개발이 시급하다.
간암의 예후 (prognosis)는 간암이 진단된 이후에 간암의 완치가능성, 치료 후 재발가능성, 환자의 생존가능성 등 간암에 따른 환자의 각종 상태를 예측하는 것을 일컫는데, 이는 질병의 심각성, 진단 시점, 치료경과 등의 다양한 조건에 의존하여 달라진다. 간암은 그 예후에 따라 적합하게 다양한 치료방법이 적용되어야만 효율적인 치료가 가능하다. 예를 들어, 예후가 양호할 것으로 추정되는 환자들에 대해서는 공격적인 화학치료나 수술, 방사선 치료 등 환자에게 심각한 부작용을 야기할 가능성이 있는 위험한 치료방법은 지양할 필요가 있고, 상대적으로 온건하고 보존적이며 안전한 치료방법을 선택하여야 한다. 반대로 예후가 불량할 것으로 추정되는 환자들에 대해서는 화학치료나 수술, 방사선 치료와 같은 치료방법을 적극적으로 동원하여 생존의 기간이나 확률을 높이고자 시도하여야 한다. 그러나 간암의 예후를 정확하게 진단하고 판단할 수 있는 기술이 부족한 상태이며, 현재까지의 연구에 따르면, 이미 진행되어버린 간암은 그 예후가 극히 불량하여 진단 후 6개월 이내에 사망하여 평균 생존 기간이 4개월밖에 되지 않는 높은 치명율을 보이는데 비해, 크기가 3cm 미만인 작은 간암은 예후가 양호하여 특별한 치료 없이도 1년간 생존할 확률이 90%에 이르고 수술을 한 경우 5년 생존율이 40-50% 정도가 되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 간암 환자의 예후를 정확하게 추정하는 것은 종래의 기술로는 매우 어렵다. 예후의 정확한 추정을 위해서는 환자들을 위험군별로 분류하는 분석방법이 필요한데, 현재까지는 간암의 예후를 정확하게 추정할 수 있는 수단 없이 진단 시의 병리임상학적인 간암의 단계와 1차적 외과 치료에만 의존하여 예후를 판단하고 있는 실정이다. 그러나, 불행하게도 간암의 단계만으로는 각 간암 환자에 대한 예후를 정확하게 판단할 수 없다. 따라서 간암의 예후를 판단할 수 있고, 나아가 수술 후 재발 가능성 여부를 판단할 수 있는 진단 마커의 개발이 필요한 실정이다.
또한, 유전자의 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제 개발 및 표적 검증에서 중요한 도구이다. 간섭 RNA(RNA interference, 이하 RNAi라고 한다)는 그 역할이 발견된 이후로, 다양한 종류의 포유동물세포(mammalian cell)에서 서열 특이적 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다 (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764773). RNAi는 21-25개의 뉴클레오타이드 크기의 이중나선 구조를 가진 작은 간섭 리보핵산 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 siRNA라고 한다)이 상보적인 서열을 가지는 전사체(mRNA transcript)에 특이적으로 결합하여 해당 전사체를 분해함으로써 특정 단백질의 발현을 억제하는 현상이다. 세포 내에서는 RNA 이중가닥이 Dicer라는 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 의해 프로세싱되어 21 내지 23개의 이중가닥(base pair,bp)의 siRNA로 변환되며, siRNA 는 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하여 가이드(안티센스) 가닥이 타겟 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 타겟 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다 (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514). 베르트랑(Bertrand) 연구진에 따르면 동일한 타겟 유전자에 대한 siRNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO)에 비하여 생체 내/외(in vitro 및 in vivo)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고, 해당 효과가 오랫동안 지속되는 효과를 포함하는 것으로 밝혀졌다 (Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res.Commun. 2002. 296: 1000-1004). siRNA를 포함하는 RNAi 기술 기반 치료제 시장은 향후 세계 시장규모가 2020년경에 총 12조원 이상을 형성하는 것으로 분석되었으며, 해당 기술을 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대되어 기존의 항체, 화합물 기반 의약품으로 치료하기 어려운 질병을 치료할 수 있는 차세대 유전자 치료기술로 평가되고 있다. 또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타겟 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질(small molecule drug)이 특정한 단백질 표적에 최적화되기까지 오랜 동안의 개발 기간 및 개발 비용이 소요되는 것에 비하여, 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있고, 개발 기간이 단축되면서, 의약화가 불가능한 표적 물질을 포함한 모든 단백질 표적에 대하여 최적화된 리드 화합물을 개발할 수 있다는 장점을 가진다 (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670). 이에, 최근 이 리보핵산 매개 간섭현상이 기존의 화학 합성 의약 개발에서 발생되는 문제의 해결책을 제시하면서 전사체 수준에서 특정 단백질의 발현을 선택적으로 억제하여 각종 질병 치료제, 특히 종양 치료제 개발에 이용하려는 연구가 진행되고 있다.
본 발명의 목적은 BANF1(barrier to autointegration factor 1), PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) 및 SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 조기 간암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는 조기 간암의 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자의 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 TCIRG1의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는 간암의 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 BANF1(barrier to autointegration factor 1), PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) 및 SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 단백질에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자 또는 단백질에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 전이 및 재발 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BANF1(barrier to autointegration factor 1), PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) 및 SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 조기 간암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 BANF1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 BANF1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, 상기 PLOD3 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 PLOD3 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, 상기 SF3B4 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 SF3B4 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4에 특이적인 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 전암성 병변에서 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 선택되는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 조성물을 포함하는 조기 간암 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는 조기 간암의 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 전암성 병변 조직인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현수준이 대조군 시료의 발현수준보다 증가하면 간암이 발병된 것으로 판단하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 TCIRG1 유전자는 서열번호 43 및 44의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 TCIRG1 단백질은 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 TCIRG1에 특이적인 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 선택되는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간암 진단 또는 예후 예측은 간암의 진행, 재발, 전이 및 예후 평가를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 조성물을 포함하는 간암 진단 또는 예후 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자의 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 TCIRG1의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는 간암의 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 조직, 전혈, 혈정 또는 혈장인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 정보 제공방법은 TCIRG1의 발현수준이 대조군 시료에서의 발현수준보다 증가하면 간암의 재발, 종양성장 또는 전이 가능성이 높아 예후가 좋지 않을 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발현수준의 비교는 표준 또는 컷오프(cut-off) 값에 의해 수행되는 것일 수 있고, 간암의 전이 가능성 판단에 대한 컷오프 값이 11.0112 이고, 조기 간암 판단에 대한 컷오프 값이 6.2821이고, 중기 간암 판단에 대한 컷오프 값이 6.4371이며, 말기 간암 판단에 대한 컷오프 값이 11.3794 이고, 간암 재발 가능성 판단에 대한 컷오프 값이 2.5687인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 BANF1(barrier to autointegration factor 1), PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) 및 SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 단백질에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4에 특이적인 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머 또는 항체인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자 또는 단백질에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 전이 및 재발 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 TCIRG에 특이적인 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머 또는 항체인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 BANF1(barrier to autointegration factor 1), PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) 및 SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 단백질에 대한 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 간암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자 또는 단백질에 대한 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 간암의 전이 및 재발 억제 방법을 제공한다.
본 발명의 암의 치료 방법은 상기 유전자 또는 단백질의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
또한, 본 발명은 (a) BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자 또는 이의 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현수준, 단백질의 발현수준 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현수준, 단백질의 발현수준 또는 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) TCIRG1 유전자 또는 TCIRG1 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 TCIRG1 유전자의 발현수준, 단백질의 발현수준 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, TCIRG1 유전자의 발현수준, 단백질의 발현수준 또는 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 유전자 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 조기 간암 진단용 조성물은 간암으로 발전하기 이전 단계인 전암성 병변에서 상기 마커의 발현수준을 측정함으로써 간암을 조기에 진단할 수 있어 간암의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 TCIRG1 유전자 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암의 진단 또는 예후 예측용 조성물은 간암의 발병 여부, 재발 여부 및 진행 단계를 보다 정확히 판별함으로써 환자의 암 진단 정확도를 향상시킬 수 있고, 병변에 대한 상태 및 치료 후 환자의 임상적 결과를 보다 잘 예측할 수 있도록 하여 적절한 치료 방법을 결정하도록 하거나 간암 발병 후의 생존율을 높이는 데 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 유전자 또는 단백질에 대한 억제제에 의하여 간암의 치료에 유용하게 사용할 수 있고, TCIRG1 유전자 또는 단백질에 대한 억제제에 의하여 간암의 전이 및 재발 억제를 통해 간암의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 간세포암에서 본 발명의 신규 간암 진단 마커를 동정하는 순서를 나타낸 모식도이다.
도 2는 초기 단계의 간세포암을 진단할 수 있는 마커 동정 결과에 관한 것으로, 2a는 다양한 단계별 간세포암 및 전암성 병변 부위(premalignant lesion)에서 의미있는 발현차이를 보이는 3,628개의 유전자의 히트맵(상단; Welch’s t-test p<0.05이고 정상 시료와 1.5배 발현 차이를 보이는 것을 선정) 및 각 질환의 평균값에 대한 히트맵 및 계통도를 나타낸 것이다(하단). 2b는 LGDN, HGDN, eHCC 및 G1에서 유의하게 발현이상을 나타내는(one way ANOVA p<0.005) 1,730개 유전자의 히트맵을 나타낸 것이고(상단), LGDN, HGDN, eHCC 및 G1의 평균값에 대한 계층분석 결과를 나타낸 것이다(하단). 2c는 특정 그룹 간 발현 차이를 나타내는 유전자를 벤다이어그램 결과로 나타낸 것이고(왼쪽), 모든 그룹에서 차등적 발현을 보이는 690개의 유전자에 대한 히트맵을 나타낸 것이며(중간), 초기 단계의 간세포암에서 점진적으로 상향 조절된 85개 유전자의 동정에 대한 전략적 모델을 나타낸 것이다(오른쪽). 2d는 13개 유전자에 대한 ROC 곡선 분석을 나타낸 것으로, 표준선과 비교하여 AUC의 통계적 유의미한 차이를 나타낸 것이다. 2e는 HCC TMA에서 10개의 후보 유전자 마커에 대한 면역화학적 분석 결과를 사진(상단) 및 발현율(하단)로 나타낸 것이다.
도 3은 신규한 암 결정(진단) 마커의 발현 프로파일을 나타낸 것으로, 3a는 TCGA_LIHC 데이터셋 유래의 HCC 환자의 비종양 조직 및 종양 조직에 대한 10개 마커 유전자의 발현 정도를 분석한 것을 나타낸 것이며, 3b는 코호트 1 유래의 단계별 HCC 환자 조직에서 10개 마커 유전자의 발현정도를 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 전암성 병변부위에서 초기 단계의 HCC 진단 마커로서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 가능성에 대한 분석 결과를 나타낸 것으로, 4a는 초기 단계 HCC의 전체 섹션에서 10개 후보 마커들에 대한 면역조직화학염색 결과의 이미지를 나타낸 것이고, 4b는 기존 마커(CM) 및 본 발명의 신규마커(NM) 각각에 대한 양성 발현정도를 막대그래프로 나타낸 것이며(왼쪽), 면역조직화학염색 결과의 이미지를 나타낸 것이다(오른쪽). 4c는 기존 마커(CM) 및 본 발명의 신규마커(NM) 각각에 대한 양성 발현정도를 나타낸 것이며(왼쪽), 기존마커 음성발현의 HCC에서 본 발명의 신규 마커의 양성 발현율 또는 본 발명의 신규마커 음성발현의 HCC에서 기존마커의 양성 발현율을 막대 그래프로 나타낸 것이고(중간), 모든 종래 마커의 음성 발현 결과를 면역조직화학염색 결과 이미로 나타낸 것이다(오른쪽). 4d는 CM-양성 RN 조직에서의 NM 음성 발현율과 NM-양성 RN 조직에서의 CM 음성 발현율을 그래프로 나타낸 것이다. 4e는 각 마커별 ROC 곡선을 나타낸 것이고, 4f는 간세포암 환자에서 3개의 본 발명의 신규 마커에 대한 단백질 발현율에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 신규한 10개 후보 유전자 마커에 대한 ROC 분석 결과를 나타낸 것으로, 코호트 2 HCC 환자군에서의 3개의 기존 마커 및 3개의 신규 마커에 대한 ROC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 HCC에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 비정상적인 발현양상 및 in vitro에서 이들의 비활성화에 의한 간세포암의 성장 억제 효과를 확인한 것으로, 6a는 TCGA_LIHC HCC 50쌍에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 발현수준을 나타낸 것이고(각 왼쪽 도면), 무작위적으로 선별된 13쌍의 HCC 조직에서의 발현 수준을 나타낸 것이다(각 오른쪽 도면). 6b는 6쌍의 조기 간세포암(상단) 및 DL을 갖는 3쌍의 조기 간세포암(하단)에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 웨스턴 블럿 결과로 나타낸 것이다. 6c는 간세포암이 유발된 마우스(상단) 및 쥐(하단)에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 발현정도를 확인한 결과이다. 6d는 H-ras로 형질전환된 마우스(상단) 및 DEN으로 유도된 간세포암 쥐 모델(하단)에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과이다. 6e는 대조군 si-RNA(si-Cont) 및 각 유전자에 대한 siRNA(si-BANF1, si-PLOD3 및 si-SF3B4)로 형질감염된 SNU-449 세포의 세포생존율(왼쪽) 및 세포 성장률(오른쪽)을 MTT 분석 및 BruD 분석으로 각각 측정한 결과를 나타낸 것이다. 6f는 형질감염된 SNU-449 세포의 집락형성 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 타겟팅하여 간세포암 세포주의 종양발생 억제 및 전이 억제를 분석한 결과를 나타낸 것으로, 7a는 대조군 si-RNA(si-Cont) 및 각 유전자에 대한 siRNA(si-BANF1, si-PLOD3 및 si-SF3B4)로 형질감염된 SNU-449 세포주에 대한 이동 및 침윤정도를 세포 이동(왼쪽) 및 이동 세포수(오른쪽)로 측정한 결과를 나타낸 것이고, 7b는 7a와 동일한 실험군에 대한 상처 치유 분석 결과를 세포 이미지로 나타낸 것이고(왼쪽), 이동율로 나타낸 것이다(오른쪽). 7c는 대조군 si-RNA(si-Cont) 및 각 유전자에 대한 siRNA(si-BANF1, si-PLOD3 및 si-SF3B4)로 형질감염된 SNU-449 세포주에서의 EMT 조절 단백질을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이며, 7d는 대조군 si-RNA 및 si-BANF1, si-PLOD3 또는 si-SF3B4로 형질 감염된 SNU-449 세포주가 이식된 마우스 모델의 마우스 사진 및 종양 크기를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 7e는 H-ras로 형질전환된 마우스에 대한 MSNs의 투여시점을 모식도로 나타낸 것이고(상단), MSNs 단독 및 MSNs_ siRNA를 H-ras로 형질전환된 마우스에 투여 후, 시간별 형성된 종양수를 측정한 결과를 나타낸 것이다(하단). 7f는 H-ras로 형질전환된 마우스의 간 조직에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 웨스턴 블럿 결과로 나타낸 것이다.
도 8은 siRNA를 함유한 메조기공 실리카 나노입자(MSN)를 이용한 결과를 나타낸 것으로, 8a는 각 유전자에 대한 siRNA로 형질감염 후, Hepa-1c1c7 마우스 간암 세포에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이고, 8b는 메조기공 실리카 나노입자(MSN)와 각 유전자의 siRNA로 형질감염된 Hepa-1c1c7 마우스 간암 세포에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 나타낸 것이며, 8c는 메조기공 실리카 나노입자(MSN)와 각 유전자의 siRNA로 형질감염된 Hep3B 세포에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 나타낸 것이다.
도 9는 SF3B4의 간암 마커로서의 가능성에 대한 임상학적 타당성을 분석한 결과로서, 9a는 TCGA_LIHC 데이터 셋에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 mRNA 발현수준을 나타낸 것이고, 9b는 HCC 환자 전체(왼쪽) 및 무병생존 환자(오른쪽)에서 신규 3개의 마커의 mRNA 발현을 갖는 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이다. 9c는 HCC 환자 전체에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 mRNA 발현에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이다. 9d는 HCC 환자 전체(왼쪽) 및 무병생존 환자(오른쪽)에서 SF3B4의 카피수 증폭과 mRNA의 상향조절의 조합에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이고, 9e는 TCGA_LIHC 데이터 셋에서 SF3B4의 유전자 카피수 변이빈도를 나타낸 것이며(왼쪽), 카피수 변이값과 mRNA 발현값의 상관관계를 나타낸 것이다(오른쪽). 9f는 20쌍의 HCC 환자조직에 대한 SF3B4 의 유전자 카피수(왼쪽) 및 mRNA 발현 수준(오른쪽)을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 SF3B4의 파괴에 따른 간암 세포의 세포 주기 억제 및 EMT 진행 억제를 나타낸 것으로, 10a는 TCGA_LIHC 데이터 셋에서 366명의 HCC 환자에서의 SF3b 복합체 서브유닛의 유전적 변이를 나타낸 것이고, 10b는 지정된 HCC GEO 데이터베이스에서 종양과 비종양에 대한 SF3b 복합체 서브유닛의 상대적인 발현수준을 비교한 것을 나타낸 것이고, 10c는 2개의 정상 간세포주 및 8개의 HCC 세포주에서의 SF3B4 mRNA 발현을 qRT-PCR(상단) 및 웨스턴 블럿(하단)으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 10d는 342 개의 SF3B4 상관 유전자에 대한 자율적인 계층 클러스터링 분석에 대한 히트맵을 나타낸 것이고(왼쪽), GSE16757 데이터셋의 SF3B4 고클러스터 환자군 및 SF3B4 저클러스터 환자군의 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이다. 10e는 SF3B4와 관련된 GSEA의 유전자 셋트를 나타낸 것이며, 총 11개 유전자 리스트들이 MSigDB에 의해 확인되었고(상단). 성장-관련 유전자 세트(KEGG_CELL_CYCLE)가 SF3B4과 관련된 특징으로 나타났고, 바코드는 유전자의 위치를 나타낸다(하단). 도 10f는 si-SF3B4 로 형질감염 후 2개의 HCC 세포주에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸 것으로, 왼쪽은 히스토그램을 나타낸 것이고 오른쪽은 각 세포주기 단계의 퍼센트를 나타낸 것이다(p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001; t test).
도 11은 HCC 세포주에서 SF3B4의 넉다운이 미치는 영향을 분석한 것으로, 11a는 SNU-449 및 SNU-368 세포주에 대해 si-RNA Cont(대조군) 및 si-RNA SF3B4로 각각 형질감염시킨 후, 세포생존율(왼쪽)과 세포증식율(오른쪽)을 분석한 결과를 나타낸 것이고, 11b는 세포집락 형성 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이며, 11c는 트랜스웰 이동 및 침윤 분석을 통해 간암 세포의 이동 및 침윤 정도를 이미지화하고(왼쪽) 이동 세포수를(오른쪽) 분석한 것을 나타낸 것이다. 11d는 SF3B4을 넉다운 시킨 후, 0 및 24시간에서의 상처치유 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이고, 11e는 EMT 조절 단백질들의 발현정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 것을 나타낸 것이며, 11f는 SF3B4을 넉다운 시키고 48시간째에 FASC를 이용하여 PI 염색된 세포에 대한 히스토그램 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 간암 발생과정에서 SF3B4의 조절자들을 분석한 것을 나타낸 것으로, 12a는 SF3B4에 대한 siRNA 및 SSA로 각각 처리된 HeLa 세포 및 간세포암 세포주에서 각 단백질의 발현정도를 웨스턴 블럿으로 분석한 것으로 나타낸 것이고(상단), 해당 유전자들의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 12b는 12a의 각 실험군에 대한 세포주기 조절자들의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 것이며, 12c는 GSE80861 RNA-seq 데이터 세트를 이용한 유전자 발현 분석 및 선택적인 스플라이싱 이벤트 분석의 파이프 라인을 나타낸 것이고(왼쪽), 원형 차트는 다르게 차등적 발현을 보이는 유전자(DEG, 오른쪽 상단) 및 선택적 스플라이싱 이벤트(AS) 유형의 분포를 나타낸 것이다. 12d는 TCGA_LIHC 데이터셋에서 GRIP1, PLP1, KLF4 및 KRT80의 상대적인 발현 정도를 나타낸 것이고, 12e는 SF3B4 siRNA로 형질감염된 세포에서 KLF4의 발현정도를 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이며, 12f는 Sashimi 플롯은 KLF4의 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)을 나타낸 것이고, 스킵된 엑손(SE)을 나타낸 것이다(p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001; t test).
도 13은 간암 세포주에서 SF3B4의 종양억제자인 KLF4 조절능을 분석한 것으로, 13a는 SF3B4 siRNA(왼쪽) 또는 SSA가 처리된(오른쪽) SNU-449 및 SNU-368 세포주들의 세포생존율을 MTT 분석 결과로 나타낸 것이고, 13b는 GSE80861 데이터셋에서 8개의 유전자에 대한 상대적인 발현 변화 및 선택적 스플라이싱(대조군 대비 SF3B4이 넉다운된 세포주 비교)을 나타낸 것이다. 13c는 SF3B4 siRNA로 형질감염된 SNU-449 및 SNU-368 세포주에서 GRIP1, PLP1, KLF4의 발현정도를 분석한 것으로 나타낸 것이고, 13d 및 13e는 TCGA_LIHC 데이터셋(13d) 및 GSE77314 데이터셋(13e) 유래의 50쌍의 HCC 환자군에서 SF3B4와 8개 유전자들 사이의 발현 상관관계를 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 14는 SF3B4의 기능을 규명한 것으로, 14a는 SF3B4 넉다운 또는 KLF4 과발현된 HCC 세포주에서 p27 Kip1 및 Slug 의 발현수준을 나타낸 것이고, 14b는 SF3B4 넉다운 또는 KLF4 과발현된 SNU-449 세포에서 p27 Kip1 또는 Slug 프로모터 서열을 함유한 리포터 플라스미드의 루시퍼라제 활성도를 측정한 것이며, 14c는 SF3B4 넉다운된 세포에서 KLF4 mRNA 및 2개의 KLF4 mRNA isoform에 대한 RT-PCR 산물 이미지를 나타낸 것이고(왼쪽), HCC 세포주에서 확인된 2개의 KLF4 mRNA isoform과 각 다이아그램 하단에는 스플라이싱 사이트를 표기한 것이며(중간), 붉은색 라인은 splicing junction을 나타낸 것이다(오른쪽). 14d는 SF3B4 넉다운된 SNU-449 세포가 이식된 누드 마우스 모델에서 종양의 성장 정도를 종양성장 곡선(왼쪽)과 형광이미지(오른쪽)로 나타낸 것이고, 14e는 14d의 마우스 동물모델로부터 수득한 암 조직에서 SF3B4 및 KLF4의 발현수준을 분석한 결과를 나타낸 것이며, 14f는 HCC에서 야생형 KLF4 발현 억제를 통한 SF3B4의 발암 작용 가설 모델을 나타낸 것이다.
도 15는 간세포암의 재발과 관련된 유전자들의 동정 및 선택 결과들을 나타낸 것으로, 15a는 7,550 유전자의 차별적 발현수준을 2차원 다이어그램으로 나타낸 것으로 간 절제술 후, 비재발 또는 재발된 HCC 환자 유래의 조직을 대상으로 분석한 데이터를 나타낸 것으로 Dendrograms은 총 간 절제술(TH)과 부분적 간 절제술 (PH) 환자의 클러스터링으로부터 유래된 것이다. 15b는 TH와 PH 그룹 간의 유전자 특성에 대한 벤 도식분석 결과를 나타낸 것이고, 15c는 총 간 절제술 환자에서 비재발 및 재발군 사이의 상향 조절된 유전자의 차별적인 특성을 Volcano 플롯으로 나타낸 것이며, 15d는 TH 전이성 특성 및 GSE39791 전이성 특징 간에 공통적으로 상향 조절된 953개의 유전자를 나타낸 것이고, 15e는 MSigDB로 분석된 953개의 명백한 전이성 분자로부터 상위 10개의 유전자 세트에 대한 막 대형 차트를 나타낸 것이고, 15f는 TH 특성 및 LIAO_METASTASIS 유전자 세트로 분석한 GSEA를 나타낸 것으로, 바코드는 유전자의 위치를 나타낸 것이고 y 축은 해당 유전자의 함량(발현정도)을 나타낸 것이다.
도 16은 간세포암(HCC)에서 TCIRG1의 과발현 및 이의 임상학적 관련 분석결과를 나타낸 것으로서, 16a는 TCGA_LIHC 데이터 분석을 나타낸 것으로 TCGA_LIHC 데이터는 총 세트 (n = 423, 왼쪽결과) 및 쌍 세트 (n = 100, 중간결과) 와 비교하여 HCC에서 유의하게 과발현되어 있는 것으로 나타났고, 종양 진행단계가 중증일수록(higher tumor grade) (오른쪽 결과)에서 과발현되는 것으로 나타났다(평균 ± SD; * P <0.05; *** P <0.001). 도 16b는 전반 생존 (왼쪽)과 무병 생존 (오른쪽)에 대한 TCGA_LIHC에서 TCIRG1 mRNA 발현수준을 Kaplan-Meier 생존 곡선으로 나타낸 것으로, P 값은 log-rank test를 통해 도출하였다. 도 16c는 TCGA_LIHC (왼쪽)와 GSE39791 (오른쪽)에서의 TCIRG1 ROC 곡선 분석결과를 나타낸 것으로, AUC의 통계적 유의한 차이는 대조군과 비교하였다(* P <0.05; *** P <0.001). 도 16d는 HCC 조직에서 TCIRG1의 mRNA 발현수준을 qRT-PCR 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 16e는 비종양 조직 또는 종양 조직의 면역화학적 분석(왼쪽) 및 TCIRG1의 발현율(오른쪽)을 분석한 결과를 나타낸 것이다(***P< 0.001). 도 16f는 HCC 조직들(NT : 인접한 비 종양 조직, T : 종양 조직)에서 TCIRG1의 발현수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 글리세롤 알데히드 -3- 인산 탈수소 효소 (GAPDH)는 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 16g는 TCIRG1의 양성발현 또는 음성발현에 따른 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이고(왼쪽), 비 이식 코호트에서 TCIRG1 발현에 의한 종양 범위의 강도를 나타낸 것이다(오른쪽). 도 16h는 TCIRG1의 양성발현 또는 음성발현에 따른 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이고(왼쪽), 이식된 코호트에서 TCIRG1 발현에 의한 종양 범위의 강도를 나타낸 것이다(오른쪽). 도 16i는 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스 (accession number: GSE14520, GSE16757, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE36411, GSE45436 및 GSE89337)를 이용하여 TCIRG1 mRNA 발현수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다(mean ± SD; **P< 0.01; ***P< 0.001). 도 16j는 NCBI GEO 데이터베이스(accession number: GSE39791 및 GSE77314; mean ± SD; **P< 0.01; ***P< 0.001, paired ttest)의 HCC 공개 게놈 데이터에서 TCIRG1 발현에 대한 평행 좌표를 도표로 나타낸 것이다. 도 16k는 간세포 암 환자에서 TCIRG1의 발현 (좌측) (N : 정상, eHCC : 초기 간암, ovHCC : overtHCC) 및 TCIRG1의 발현 (우측) (accession number : GSE89337, 평균 ± D, ** P <0.01)을 나타낸 것이다.
도 17은 간암 세포주에서 TCIRG1을 타겟팅으로 한 항암 효과를 분석한 결과를 나타낸 것으로, 17a는 2개의 정상 세포주(THLE3 및 MIHA) 및 12개의 간암 세포주(Hep3B, HepG2, Huh7, PLC/PRF/5, SK-Hep1, SNU354, SNU368, SNU387, SNU398, SNU423, SNU449, and SNU475)에서의 TCIRG1 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이고, 17b는 세포에서 내재적으로 발현되고 있는 TCIRG1을 웨스턴 블럿으로 수행한 결과를 나타낸 것으로, GAPDH는 로딩 대조군으로 사용한 것이며 각 밴드 하단의 숫자는 발현수준을 나타낸 것이다. 17c는 SNU475 및 Huh7 세포주에서 콜로니 형성능을 분석한 결과를 나타낸 것이고, 17d는 TCIRG1 특이적 siRNA 및 음성대조군 siRNA로 SNU475 및 Huh7 세포주를 형질감염 시키고 트립판 블루 염색을 통해 세포수를 측정한 결과를 나타낸 것이며, 17e는 TCIRG1 특이적 siRNA 및 음성대조군 siRNA로 SNU475 및 Huh7 세포주를 형질감염 시키고 MTT 분석으로 세포 성장 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이고, 17f는 SNU475 및 Huh7 세포주에 대해 BrdU(Bromodeoxyuridine) 유입 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 17g는 TCIRG1 특이적 siRNA 및 음성대조군 siRNA로 세포를 형질감염 시키고 FACS 분석을 수행한 것으로, SNU475 및 Huh7 세포주에서 TCIRG1의 넉다운은 G1/S 어레스트를 유도하는 것으로 나타났고, 각 퍼센트는 해당 세포수의 분포도를 나타낸 것이다. 17h는 TCIRG1 특이적 siRNA(siTCIRG1) 및 음성대조군 siRNA(N.C)로 세포를 형질감염 시키고 PI 및 아넥신 V 염색으로 FACS 분석을 수행한 것으로, 바 그래프는 아넥신 V 양성 세포수의 퍼센트를 나타내는 것이다. 17i는 형질감염 후, 세포에 3-MA (5mM)을 처리한 다음 FACS 분석을 수행한 것으로, 바 그래프는 아넥신 V 음성 및 PI 양성 세포수의 퍼센트를 나타낸 것이다.
도 18는 간암 세포주에서 TCIRG1을 타겟팅으로 한 암전이능 억제 효과를 분석한 것으로, TCIRG1 넉다운에 의한 SNU475 및 Huh7 세포주에서의 이동 억제(18a) 및 전이 억제(18b)를 나타낸 결과이다. 18c는 상처 치유능 분석을 수행한 것으로, 바 그래프는 세포이동으로 회복된 정도를 나타낸 것이며, 18d 및 18e는 ras-형질전환된 NIH-3T3 마우스의 섬유아세포에서 TCIRG1 넉다운에 의한 세포이동 억제(18d) 및 전이 억제(18e) 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다. 18f는 EMT와 관련된 인자들인 TCIRG1, E-cadherin, N-cadherin, Fibronectin, Vimentin, Snail 및 Slug에 대한 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 18g는 NCBI GEO 데이터베이스 분석 결과로서, accession numbers GSE39791 및 GSE77314의 GEO 데이터 세트는 TCIRG1 및 CDH1 간의 발현 분석에 사용하였고, 왼쪽 패널은 GSE39791 및 GSE77314에서 CDH1의 발현을 나타낸 것이고, 오른쪽 패널은 GSE39791 (Pearson correlation coefficient r = -0.21, **P<0.01) 및 GSE77314 (Pearson correlation coefficient r = -0.36, ***P< 0.001)에서 TCIRG1 및 CDH1 발현의 음성적 관계를 나타낸 것이다.
도 19는 암 전이에서 TCIRG1이 미치는 영향을 분석한 것으로, 19a는 TCIRG1의 발현 억제 후, ras-transformed NIH-3T3 세포의 CT 이미지를 나타낸 것이고(왼쪽), 각 종양 부피를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(오른쪽). 19b는 ras-transformed NIH-3T3 세포를 이식한 마우스 동물 모델에서 음성 대조군 siRNA (n=5) 및 TCIRG1 siRNA (n=5)을 주입한 후, 폐로의 암 전이를 분석한 결과를 나타낸 것이다(왼쪽). 이때 마우스의 폐 결절(nodules)의 수를 막대 그래프로 나타내었다(오른쪽).
도 20a는 비종양조직 (Non tumor, n=50)과 진행성 간세포암 (G2,G3,G4, n=301)을 대상으로 분석한 TCIRG1 cut-off 분석 결과를 나타낸 것이고, 20b는 GSE39791에서 간 절제술을 받은 동일 환자의 비종양조직 (Non tumor, n=72)과 재발성 간세포암 (Tumor, n=72)에 대한 TCIRG1의 발현량의 cut-off 분석 결과를 나타낸 것이며, 20c는 간세포암 단계별(G1, G2, G3, G4) TCIRG1의 발현량의 cut-off 분석 결과를 나타낸 것이고, 20d는 정상-> 조기간암(eHCC) -> 중증간암(avHCC)에 따른 TCIRG1의 발현량의 cut-off 분석 결과를 나타낸 것이고, 20e는 간절제술 후 암이 재발된 조직과 재발되지 않은 조직에서의 TCIRG1 발현양 컷오프 값을 분석한 결과이다.
BANF1(barrier to autointegration factor 1)은 보존된 인간 염색질 단백질로서 핵 어셈블리(nuclear assembly) 및 염색질 탈응축(chromatin decondensation)에 주로 관여하는 것으로 알려져 있고, BANF1는 분자들 간의 통합으로부터 레트로바이러스를 보호할 수 있는 단백질로 처음 규명되었고, 숙주 세포게놈으로 분자간의 통합을 촉진시킨다는 기능이 알려져 있다. 그러나 아직까지 BANF1과 암과의 관련성에 대한 내용은 밝혀진 바 없다.
PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3)은 프로콜라겐 분자간 가교결합 및 섬유의 초분자 콜라겐 구조의 안정화에 중요한 갈락토실- 및 글루코실-트랜스퍼라제의 활성 때문에 하이드록시라이신-결합의 탄수화물을 생성하는 유일한 이소 효소라고 알려져 있다. 또한, PLOD3은 MMP9를 모집하는데 관여하는 것으로 알려져 있을 뿐, 암의 진행 및 암과의 관련성에 대해 알려진 바가 없다.
SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)는 포유동물 SF3b 복합체의 핵심 단백질을 암호화하며, U2-type 스플라이소솜(spliceosome)의 일부분으로 U2 snRNP를 연결 부위에 묶는 역할에 대해 알려져 있을 뿐, SF3B4 역시 암과의 관련성에 대해서는 알려진 바가 없다.
본 발명자들은 간암을 조기에 예측하고 진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하기 위해, 전체 전사체학(transcriptome) 발현 마이크로어레이를 이용하여 정상 간조직, 조기 간암조직 및 진행 간암 조직에서의 차별적 발현수준을 보이는 유전자들을 스크리닝한 결과, BANF1, PLODS3 및 SF3B4이 정상 조직에 비해 모두 강하게 과발현되고 있음을 확인하였고, HGDN으로부터 암이 전이된(transitioning) 6개의 조기 간세포암 전체 섹션 모두에서 이들 유전자가 과발현되고 있는 것으로 나타났다. 특히, 본 발명에서 발굴한 상기 마커들은 전암성 병변에서 조기 간암 여부를 검출 및 진단할 수 있는 특징이 있다.
간암은 정상간, 만성간염, 간경화, 간암에 이르는 다단계 병변의 발전 양상을 가지며, 최근 방사선학적 검사 기술이 발달하면서 간 내의 작은 결절들이 발견되어지며 큰 결절들은 간암으로 진행할 가능성이 높다. 특히 간암과 구분이 어렵고 간암의 특성을 일부 갖고 있는 이형성 결절(DN; dysplastic nodule)은 간암의 다단계 발생 과정의 일부이며 간암의 전암성 병변의 대표적인 형태로 알려져 있다.
또한, 간경변에서 관찰되는 결절성 병변은 재생성 결절, 이형성 결절, 간세포암, 국소성 지방병변이 있으며, 재생성 결절은 1~10mm의 크기이며, 간 전체에 퍼져있고 크기가 균일하다. 주변의 재성성 결절보다 크기가 큰 거대 재생성 결절은 세포의 비정향이 없고 결절 내에 정상적인 문맥을 가지고 있다. 이형성 결절은 크기가 대부분 1~1.5cm이며 피막을 가지지 않는다. 저등급 이형성 결절은 단일 클론의 증식으로 발생한 것으로 세포나 구조상의 이상이 없으나 단독 동맥을 동반할 수 있다. 고등급 이형성 결절은 세포의 이정형과 구족 이상을 보이고 소세포 변화의 핵의 다형성을 나타낸다.
본 발명의 마커들은 전암성 병변(precancerous lesion)에서 조기 간암을 검출할 수 있는데, 상기 전암성 병변은 간암으로 넘어가기 전 단계를 말하며 간암에 준하는 치료를 요구하지 않는 상태로서, 저등급 이형성 결절(LGDN; low-grade DN) 또는 고등급 이형성 결절(HGDN; high-grade DN)을 포함하는 이형성 결절(DN; dysplastic nodule)일 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 전암성 병변인 HGDN 조직에서 상기 3개의 유전자들이 정상 조직에 비해 과발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다.
나아가 본 발명의 마커들이 종래 마커들에 비해 정확도가 더 우수한지 확인하기 위해, 이형성 결절(DN), 간세포 선종 및 국소 결절 증식을 포함하는 다른 종양 병소와 조기 간암의 구별이 가능한 것으로 알려진 GPC3, GS 및 HSP70 마커들과 본 발명의 마커들에 대해, 간세포암 조직에서의 발현양상을 분석하였다. 그 결과, 간세포암 조직에서 종래 마커가 발현되는 양성 발현율은 50.9%인 것으로 나타난 반면, 본 발명의 마커가 발현되는 양성 발현율은 72.7%인 것으로 나타났다. 또한, 간세포암 조직에서 종래 마커의 음성 발현율은 49.1%인 것으로 나타난 반면, 본 발명의 신규 마커의 음성 발현율은 27.3%로 나타났다. 따라서, 이러한 결과를 통해 본 발명에서 동정한 BANF1, PLODS3 및 SF3B4 마커가 종래 마커인 GPC3, GS 및 HSP70에 비해 간암을 더 우수한 효율과 정확도로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
뿐만 아니라, 본 발명의 일실시예에서는 간세포암 환자의 Kaplan-Meier 생존 곡선을 분석한 결과, 본 발명의 신규 마커들의 높은 발현을 보인 환자의 무병 생존율은 본 발명의 마커들의 발현 수준이 낮은 환자보다 유의하게 낮은 것으로 나타났으며, 특히 본 발명의 마커를 단독으로 사용한 경우에 비해 조합으로 사용한 경우 정확도가 더 높은 것으로 나타났다. 이를 통해 본 발명의 신규 마커들은 간세포암의 발병을 유도하는 발암 작용이 있음을 알 수 있었고, 이들 마커의 발현수준 측정을 통해 조기 간암을 진단할 수 있으며, 나아가 환자의 생존율 예후도 예측할 수 있음을 알 수 있었다.
그러므로, 본 발명은 BANF1(barrier to autointegration factor 1), PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) 및 SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조기 간암 진단용 마커 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 조기 간암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 간암을 정확하게 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하기 위해 연구하던 중, TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1)의 간암 진단 마커로서의 사용 가능성을 확인하였고, 나아가 간암 수술 후 재발여부 및 예후를 판단할 수 있는 용도로도 사용가능함을 확인하였다. 특히 본 발명에서 발굴한 간암 진단용 마커인 TCIRG1은 간암 환자로부터 수득한 시료를 대상으로 발굴된 마커로서, 실제적인 사용 가능성이 임상 수준에서 확보되었다고 볼 수 있다.
우선적으로 본 발명자들은 간암을 정확하게 예측하고 진단할 수 있는 바이오마커 발굴을 위해, 간 절제술을 시행한 환자로부터 간암 조직을 확보하여 간암이 재발된 군과 재발되지 않은 군으로 구분한 후, 각 조직에서 발현되는 유전자들에 대해 클러스터링 분석을 수행하였다. 그 결과, 간 절제수술 후, 간암이 재발된 환자의 조직에서 특이적으로 과발현되는 TCIRG1 유전자를 확인하였다.
이에, TCIRG1 유전자가 간암 특이적으로 과발현되는 양상을 보이는지를 검증하기 위해, 간암 환자로부터 수득한 비종양 간조직과 간암조직에 대해 TCIRG1 발현수준을 분석하였는데, 그 결과, 비종양 간조직에 비해 간암 조직에서 월등히 발현이 증가되어 있는 것으로 확인되었다.
따라서, TCIRG1은 간암 발병 시, 특이적으로 과발현되는 양상을 나타냄을 알 수 있었고, TCIRG1을 간암 진단을 위한 특이적 바이오마커로 사용 가능함을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는 TCIRG1의 발현수준과 간암의 재발 및 예후와의 상관성을 분석하였는데, TCIRG1 발현 양성 환자군이 TCIRG1 음성 환자군에 비해 무병생존율이 낮은 것으로 나타났고, 예후가 좋지 않은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, TCIRG1은 간암의 발병여부 뿐만 아니라 간암 수술 후 재발 가능성 여부 및 환자의 예후까지도 예측할 수 있는 용도로 사용 가능함을 알 수 있었고, TCIRG1이 정상에 비해 과다 발현될 경우, 간암이 발병되었거나, 수술 후 다시 재발되었거나, 전이 가능성이 있거나, 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 TCIRG1 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 TCIRG1 단백질로 이루어지는 간암 진단용 마커 조성물를 제공할 수 있다. 또한, TCIRG1 유전자에 대한 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서, 상기 "진단" 이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 간암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 간암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 간암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다. 특히 본 발명에서는 상기 마커를 이용하여 조기 간암 또는 간암의 예후를 진단할 수 있다.
본 발명에서, 상기 "예후"는 암이 진단된 이후에 암의 완치 가능성, 치료 후 재발 가능성, 환자의 생존 가능성 등 암에 따른 환자의 각종 상태를 예측하는 것을 말한다. 암의 예후는 다양한 관점에서 추정될 수 있지만, 대표적으로 재발가능성, 생존가능성, 무병생존가능성의 관점에서 판단될 수 있다. 본 발명의 목적상 예후는 간암의 진단 이후 생존의 예후를 의미할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 바이오 마커를 사용하면, 간암 환자의 생존 예후를 보다 용이하게 예측할 수 있어, 고 위험군의 환자를 분류하거나, 추가 필요한 치료 방법의 사용 여부를 결정하는 데 활용할 수 있고, 이로써 간암 발병 후의 생존율을 높이는 데 기여할 수 있다.
또한, 상기 "예측"이란 환자가 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자의 치료 후 생존할 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 추정 방법은 암 발병 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 예측 방법은 환자가 예를 들어, 소정 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정 치료 처방과 같은 치료 처방에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존이 가능한지 여부를 예측하는 데 사용될 수 있다.
또한, 상기 "진단용 마커(diagnosis marker)"란 간암의 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 조직과 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 간암의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 간암 진단용 마커, 바람직하게 간암 조기 진단용 마커는 정상 세포에 비해 간암의 세포(또는 조직) 또는 간암으로 발전하기 전단계의 세포(또는 조직)에서 발현양이 증가하는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4일 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공하는 간암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 간암의 세포(또는 조직)에서 발현양이 증가하는 TCIRG1 유전자 또는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 상기 마커 유전자의 발현수준은, 바람직하게 마커 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 발현수준을 측정할 수 있는 물질로는 본 발명의 마커인 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"란 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
상기 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 "프로브"라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준은, 바람직하게 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자가 발현된 mRNA로부터 번역과정을 거쳐 생성된 각 마커에 대한 폴리펩티드를 의미하며, 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 "항체"를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 간암을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명은 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자 또는 단백질의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 함유하는 조성물을 포함하는 조기 간암 진단용 키트를 제공할 수 있으며, TCIRG1 유전자 또는 단백질의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 함유하는 조성물을 포함하는 간암 진단 또는 예후 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 조기 간암 진단용 조성물은 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자 또는 단백질의 발현수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질을 포함할 수 있으며, 간암 진단 또는 예후 진단용 조성물은 TCIRG1 유전자 또는 단백질의 발현수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질을 포함할 수 있고, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 간암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자 또는 단백질의 발현수준을 측정할 수 있는 조기 간암 진단용 조성물을 포함하는 조기 간암 진단용 마이크로어레이를 제공하며, TCIRG1 유전자 또는 단백질의 발현수준을 측정할 수 있는 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자 또는 단백질의 발현수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 간암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 조기 간암 진단마커를 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는 조기 간암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 TCIRG1 유전자의 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 TCIRG1의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는 간암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공할 수 있다.
상기에서 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자의 발현수준 또는 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 검출 또는 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 간암 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자의 발현수준 또는 단백질의 발현수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는 조기 간암의 진단에서는 전암성 병변일 수 있으며, 상기 전암성 병변은 간암으로 진행되기 전 단계라면 모두 포함될 수 있고, 본 발명의 일실시예에서는 전암성 병변으로 고등급 이형성 노드(HGDN; high-grade DN) 시료를 사용하였다.
상기 마커 유전자의 발현수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 발현양을 측정하는 것이며, mRNA의 발현양을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 마커 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
단백질 발현수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 마커 유전자에 대한 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현수준과 간암 환자 또는 간암 의심환자에서의 마커 유전자 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현수준을 확인할 수 있고, 상기 발현수준을 대조군, 즉, 정상인의 샘플과 비교함으로써 간암의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 간암 환자로부터 수득한 간암 조직과 정상 간 조직을 대상으로 조직 용해물을 수득한 다음, BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿 방법을 수행하여 각 시료로부터 해당 단백질의 발현수준을 측정한 다음, 상기 측정치를 정상의 대조군과 비교 분석하는 과정을 통해 수행하였다.
또한 본 발명은 간암의 진단, 구체적으로는 간암의 발병여부, 재발여부, 진행단계 또는 예후를 예측할 수 있는 TCIRG1 발현양에 대한 컷오프 값(cut off value)을 제공한다.
상기 컷오프 값(cut off value)은 본 발명에 따른 시료, 예를 들면, 조직, 혈청, 혈장 등의 시료에서 TCIRG1에 대한 컷오프 값이다.
본 발명에 따른 상기 간암 진단 또는 예후 추정 방법에서 상기 유전자 발현 수준 측정 결과를 대조군에 대한 측정 결과와 대비하여 암을 진단하거나 예후를 추정할 수 있다. 또는, 미리 결정된 기준치(cut-off) 값과 대비하여 암을 진단하거나 예후를 추정할 수 있다. 대조군으로는, 음성 대조군으로 정상 시료, 또는 암에 걸린 후 치료된 환자 유래의 시료, 예컨대 비종양 시료를 사용할 수 있고, 양성 대조군으로는 간암으로 판정된 환자 유래의 시료를 사용할 수 있다. 일례로, 정상인 유래의 시료, 암 판정 환자에서 채취한 정상 조직 시료, 암으로 판정 후 치료를 받은 환자 유래의 시료가 대조군으로 사용되어, 수득된 프로파일의 비교에 사용될 수 있다.
대조군과 시료를 이용한 시험군 사이의 마커 프로파일의 비교에는 당해 분야에서 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 발현 프로파일의 디지털 영상 비교, 발현 데이터에 대한 DB를 이용한 비교를 참조할 수 있다. 본원에 따른 마커 검출을 통하여 수득된 프로파일은 공지의 데이터 분석방법을 이용하여 처리될 수 있다. 일례로 nearest neighbor classifier, partial-least squares, SVM, AdaBoost 및 clustering-based classification 방법이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 간암 진단 및 예후 추정 방법의 유의성을 확인하기 위하여, 다양한 통계처리 방법이 사용될 수 있다. 통계적 처리 방법으로 일구현예에서는 로지스틱 회귀분석 방법이 사용될 수 있다. 또한, 통계처리를 통해 암으로 진단하기 위해 시험물질과 대조군간의 유의한 차이에 관한 신뢰수준을 결정할 수 있다. 통계 처리에 사용되는 데이터는 각 마커에 대하여 이중, 삼중 또는 다중으로 분석된 값이다. 이러한 통계적 분석 방법은 바이오 마커는 물론, 임상 및 유전적 데이터의 통계적 처리를 통하여 임상 적으로 유의한 판단을 하는데 매우 유용하다.
이에 본 발명자들은 간암의 진단을 위한 TCIRG1 컷오프 값을 분석하였는데, 본 발명의 일실시예에서는 비간암 환자의 간조직과 간암 환자의 간조직에서의 TCIRG1 발현양을 정량 측정하였고, 또한, 간암 환자의 비종양조직과 진행성 간세포암 조직에서의 TCIRG1 발현양을 정량 측정한 후, 간암 환자 조직에서의 발현양을 비간암 환자 조직의 발현양에 기초하여 컷오프 값을 도출하고, 간세포암 조직에서의 발현양을 비종양조직에서의 발현양에 기초하여 컷오프 값을 도출한 결과, 컷오프 값이 11.0112인 것으로 나타났다. 따라서, 시료의 TCIRG1의 컷오프 값이 11.0112 이상인 경우, 간암이 발병된 것으로 예측할 수 있고, 또한 발병 간암의 전이 가능성이 있는 진행성 간암으로 예측할 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 간 절제술을 받은 환자의 비종양조직과 재발된 간세포암 조직에서의 TCIRG1 컷오프 값 분석 결과, 컷오프 값이 2.5687로 나타났다. 따라서, 수술 후 환자의 시료에서 TCIRG1의 컷오프 값이 2.5687 이상인 경우, 수술적 치료 후 간암이 재발될 가능성이 있는 것으로 예측할 수 있다.
다른 일실시예에서는, 간암 1기(G1), 간암 2기(G2), 간암 3기(G3) 및 간암 4기(G4) 환자의 암 조직에서 TCIRG1 발현양을 정량분석하고 TCIRG1 컷오프 값을 분석하였는데, 정상과 조기간암(eHCC)에서의 컷오프 값이 6.2821인 것으로 나타났고, 조기간암(eHCC)와 중기간암(avHCC)에서는 컷오프 값이 6.4371인 것으로 나타났고, G3(3기 간암) 및 G4(4기 간암)에서는 컷오프 값이 11.3794인 것으로 나타났다. 따라서, TCIRG1 컷오프 값이 6.2821인 경우에는 조기 간암으로 판단할 수 있고, 6.4371인 경우에는 중기간암으로 판단할 수 있으며, 11.3794인 경우에는 말기 간암으로 판단할 수 있다.
나아가 본 발명자들은 간암 치료제로서 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 억제제들을 사용할 수 있음을 규명하였다. 본 발명의 일실시예에 의하면, BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 억제제로서 이들 유전자들의 발현을 억제하는 siRNA를 이용하여 넉다운 시킨 후, 간세포암의 성장 및 증식을 분석한 결과, 이들 유전자의 발현 또는 활성 억제시 암세포의 성장과 증식이 억제되는 것으로 나타났고, 세포주기 이상이 초래되고 세포사멸이 유도되어 궁극적으로 간암을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1의 활성 및 발현을 억제할 수 있는 물질은 간암 치료제로 사용할 수 있으며, 본 발명은 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있고, 또한, 본 발명은 TCIRG1 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 전이 및 재발 억제용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에는 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질이라면 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱더 바람직하게는 siRNA를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 mRNA에 상보적이고 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, "siRNA"란 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 TCIRG1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.
또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.
또한, 상기 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 단백질의 발현 및 활성을 감소시키는 물질로서 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
또한, 상기에서 "유효량" 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.
나아가 본 발명은 (a) BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자 또는 이의 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자의 발현수준, 단백질의 발현수준 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자의 발현수준, 단백질의 발현수준 또는 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.
발명의 방법에 따르면, 먼저 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자 또는 이의 단백질을 포함 또는 발현하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기 "시료"는 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자의 발현수준, 단백질의 발현수준 또는 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자의 발현수준, 단백질의 발현수준 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, BANF1, PLOD3, SF3B4 또는 TCIRG1 유전자의 발현수준, 단백질의 발현수준 또는 단백질의 활성이 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 간암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.
상기에서 활성 측정 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 시료 및 조직 준비
하기 실험을 위해 3개의 독립적인 간질환 환자 코호트를 사용하였다. 코호트 1(107 tissues from 81 patients, snap-frozen tissue)은 유전자 발현 마이크로어레이에 사용되었고, 코호트 2(546 tissues from 546 patients, tissue microarray)는 조직 마이크로어레이에 사용되었으며, 코호트 3((160 tissues from 70 patients, full section)은 면역조직화학법에 사용하였다. 이들 3개 군의 코호트에 대한 임상 병리학적 특징은 하기 표 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2018004314-appb-I000001
생존율(Progression free survival)은 수술 날짜와 특정 형태의 재발이 진단된 날짜 사이의 간격으로 정의하였다. 또한 모든 피험자로부터는 선언에 기초하여 서면 동의를 얻었고, 본 연구는 가톨릭대학교 의과대학의 기관 검토위원회(IRB 승인 번호 : MC12EISI0106, MC12SNMI0184)의 승인을 받아 진행하였다.
간암조직은 1995년 1월부터 2006년 5월까지 서울대학교 병원에서 HCC 환자를 대상으로 수술과정에서 제출된 것을 수집하여 사용하였다. 간암조직은 즉시 급속 동결시켰고 액체 질소에 저장하였다. 또한 본 실험에 등록한 환자로부터 정보 제공 동의를 얻었다. 헬싱키 선언에 따라 각 피험자로부터 서면 동의를 얻었으며, 가톨릭 대학교 의과 대학의 기관 검토위원회(IRB 승인 번호 : MC12SNMI0184)의 승인을 받아 하기 실험에 본 간암 조직을 사용하였다.
실시예 2. 실험방법
2.1. 조직 마이크로어레이 및 면역조직화학염색
조직 마이크로어레이(TMA; tissue microarray) 구축을 위해, 포르말린으로 고정시킨 후 파라핀으로 임베드한 코호트 2(n=546) 환자군의 간암 조직을 병리학자가 점수를 체크할 수 있도록 매핑하였다. 간 조직은 각각의 블록을 펀칭하였고 0.6mm 직경의 스틸레토(stylet)를 이용하여 5mm 두께의 섹션이 되도록 잘라 파라핀 블록에 넣었다. 섹션을 접착성 전사테이프 방법을 이용하여 슬라이드에 접착시켰고 자외선 조사로 교차결합 시켰다. 각 단백질 수준을 조사하기 위해 TMA 및 전체 절편 시료에 대해 하기 표 2(웨스턴블럿 및 조직마이크로 어레이에 사용된 항체 목록)의 항체들을 이용하여 면역조직염색을 수행하였다.
Figure PCTKR2018004314-appb-I000002
간암 조직은 헤마토크실렌과 에오신(H & E) 슬라이드를 재확인하고 한시적으로 포르말린에 고정하고 파라핀 - 임베디드(FFPE)된 기록 블록을 각 케이스별로 선택하였다. 코어 조직 생검 (직경 2mm)을 개별 FFPE 블록 (공여체 블록)에서 채취하고 트레핀을 사용하여 수혜 파라핀 블록 (조직 배열 3블록)에 배치시켰다. 302 개의 HCC 암 조직을 포함하는 8개의 어레이 블록을 준비하였다(Superbiochips Laboratories, Seoul, Korea).
2.2. TCGA 및 NCBI GEO 데이터 분석
HCC에서 HCC 마커 및 TCIRG1 mRNA의 발현수준을 재구성하기 위해, 데이터는 TCGA 간 간세포 암종 프로젝트와 NCBI GEO 데이터베이스 (수탁 번호: GSE14520, GSE16757, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE44106, GSE36411, GSE45436, GSE54236, GSE80861, GSE89377, GSE93392, GSE77314 및 GSE89337)로부터 수득하였다. TCGA RNA-seq 데이터는 먼저 모든 RPKM 값을 교체 한 후 log2로의 변형이 적용되도록 분석하였다. 또한, Cancer Genomics 웹 사이트 (http://www.cbioportal.org/public-portal/)에 대한 cBioPortal을 사용하여 TCGA mRNA 발현 데이터에 액세스 하였다. 각 유전자에 대해서 provisional RNASeq V2 RSEM z-score를 사용하였다. z 점수는 정규화 된 상대적인 발현 수준을 나타낸 것이며 mRNA 수준 대용으로 사용하였다.
2.3. 마이크로어레이 분석
대규모 유전자 발현 프로파일링을 위해 코호트 1 환자군의 냉동된 간 조직을 유전자 발현 마이크로 어레이 분석에 사용하였다. 코호트 1 환자군의 시료로부터 3개의 독립적인 세트를 선택하고 TRIzol 시약을 이용하여 총 RNA를 추출한 다음, Illumina Total-Prep RNA 증폭 Kit 컬럼(Ambion Inc., Austin, TX)을 이용하여 RNA를 분리하였다. RNA의 품질 조절은 ExperionTM 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 수행하였고, 마이크로어레이 분석은 HumanHT-12 V4 Expression BeadChips (Illumina, Inc., San Diego, CA)을 이용하여 분석하였다. 바이오틴화된 cRNA는 MessageAmp kit (Ambion, Inc.)를 이용하여 정제하였으며, 칩(chips)의 혼성과 스캐닝은 Illumina의 표준방법에 따라 수행하였다. 일차 마이크로어레이 데이터는 GEO 데이터베이스에서(GSE89377)에서 이용할 수 있다.
2.4. 웨스턴블럿 분석
환자의 냉동 조직 단백질 및 전체 세포 용해물은 PMSF(phenylmethane-sulfonylfluoride) 및 1X 복합 프로테아제 억제제 칵테일 타블렛(protease inhibitor cocktail tablets; Roche, Indianapolis, IN, USA)이 함유된 RIPA 버터를 이용하여 제조하였다. 총 단백질은 SDS-PAGE 상에서 전기영동하였고, PVDF 막으로 전기이동시킨 후, 블록킹 버퍼(5% skimmed milk in Tris-buffered saline, 0.1% Tween-20)로 블록킹 반응을 수행한 다음, 상기 표 2의 항체들, anti-TCIRG1, anti-Snail (both from Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-GAPDH, anti-fibronectin (both from Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-E-cadherin, anti-N-cadherin (both from BD Transduction, San Jose, CA, USA), anti-Vimentin 및 anti-Slug (both from Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)의 항체를 사용하여 반응시켰다. 이후 ImmobilonTMhorseradish peroxidase 기질(Millipore, Billerica, MA, USA)을 이용하여 화학적 발광신호를 검출하였으며, aLAS-4000 이미지 분석기(FujiPhoto Film Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 가시화 하였다.
2.5. 세포 이동 및 침윤 분석(Motilityand invasion assay)
In vitro 상에서 세포 이동 및 침윤 분석을 수행하였는데, 세포 이동은 수정된 Boyden chamber 분석(BD Bioscience)으로 수행하였고, 침윤 분석은 Matrigel (BD Biosciences)을 이용하여 수행하였다. 침윤 분석을 위해 Matrigel을 0.3mg/ml의 농도가 되도록 코팅 버퍼로 희석하였다. 이후 100ul로 분주한 희석된 Matrigel 용액을 트랜스웰 세포 배양 삽입물의 일부분으로 덮었고, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 삽입물(인서트)을 시드할 준비를 하였다. si-SF3B4 등의 siRNA로 세포를 형질감염시킨 후, 세포들을 트랜스웰 인서트에 도포하였고 화학유인물질로서 2% 또는 5%의 FBS가 함유된 혈청이 없는 배지를 사용하여 배양하였다. 각 분석을 위한 세포 배양 후(세포이동: 시간 배양, 침윤 분석: 12시간)이동되었거나 침윤된 세포들을 Diff-Quik staining kit (Sysmex, Japan)을 이용하여 염색하였으며, 세포 이미지는 ×200배 배율로 Axiovert 200 inverted microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 관찰하였고, 3개의 무작위 이미지 필드에서 세포수를 카운팅하였다.
2.6. 메조포러스 실리카 나노입자의 형질감염
BANF1, PLOD3 및 SF3B4에 대한 특이적 si-RNA는 80 ul InViVojectionTM RNAi-나노 시약(mesoporous silica nanoparticle, Cat. No. DHMSN-vivoRNA; Lemonex Inc., Seoul, Korea)에 3nmol의 농도로 첨가하였고, 200ul의 PBS 용액을 준비하였다. MSNs 및 si-RNA 의 혼합물을 H-ras 형질전환된 HCC 마우스 모델에 9~23주 동안 매주 꼬리에 정맥주사하였다. 이후 초음파 장비를 이용하여 17주, 19주 및 21일 주째에 각각 초음파 영상 촬영을 하여 영상이미지를 수집하였다.
세포들은 밤새도록 배양한 후, Diff-Quik 염색 키트(Sysmex, Chuo-ku, Cobe, Japan)를 이용하여 염색하였다. 세포 이미지는 ×200배 배율로 Axiovert 200 inverted microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 관찰하였고, 3개의 무작위 이미지 필드에서 세포수를 카운팅하였다.
2.7. RNA 및 DNA 분리, RT-PCR 및 qRT-PCR 분석
총 RNA는 동결된 조직 및 세포주로부터 TRIzol 시약을 이용하여 분리하였다.총 RNA의 1ug은 Tetro cDNA Synthesis Kit (Bioline, London, UK)을 이용한 역전사 반응으로 cDNA를 합성하였다. RT-PCR 반응은 nTaq DNA polymerase (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 수행하였고, Gel Doc XR image system (Bio-Rad, Hercules, CA)로 ethidium bromide 반응에 의한 DNA 여부를 확인하였다. qRT-PCR은 SensiFAST™ SYBR® NoROX Kit (Bioline)를 이용하여 수행하였고, 각 반응에 첨가된 총 cDNA 양의 차이를 정상화시키기 위해 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 내인성 대조군으로 사용하였으며, iQ™-5 (Bio-Rad)를 이용하여 실시간 모니터링 하였다. 3중 분석에 의한 평균 Ct는 추가 계산에 사용하였다. 정상화 된 유전자 발현은 상대적인 정량화 방법을 사용하여 결정하였다. 결과는 3 회의 실험 평균값으로 나타내었다. 조직 및 세포의 게놈 DNA는 DNAzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 설명서에 따라 추출 및 분리하였다. 카피수 변이분석을 위해, SF3B4 게놈 DNA 영역은 Genbank accession No. NC_000001.11의 게놈서열에 따라 엑손 -1에서 인트론 1까지를 커버하는 프라이머 세트를 이용하여 20쌍(비종양 및 종양)의 HCC 조직으로부터 증폭하였다. qRT-PCR은 상기 기술한 방법과 같이 반응시켰고, 글리세롤 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소는 내인성 로딩 대조군으로 사용하였다. RT-PCR 및 qRT-PCR에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 3에 나타내었다.
Figure PCTKR2018004314-appb-I000003
2.8. 세포배양 및 형질감염(transfection)
인간 HCC 세포주(Hep3B, HepG2, Huh7, PLC/PRF/5, SK-Hep-1, SNU-354, SNU-368, SNU-387, SNU-423, SNU-449 및 SNU475) 및 Hepa-1c1c7 마우스 간암 세포주는 한국세포주 은행(KCLB, Seoul, South Korea)으로부터 입수하여 사용하였다. THLE3 정상 간 세포주는 American-Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 입수하였고, 불멸화된 간 세포주인 MIHA 및 L-02는 Dr. Jayanta Roy-Chowdhury (Albert Einstein College of Medicine, New York, NY)가 제공하여 사용하였다. 이들 모든 세포주들은 10% FBS(GenDEPOT, Barker, TX, USA) 및 100 units/ml의 penicillin-streptomycin (GenDEPOT, Barker, TX, USA)이 첨가된 RPMI1640, DMEM (GenDEPOT, Barker, TX, USA) 또는 EMEM (ATCC, Manassas, VA, USA) 배지를 사용하여 배양하였다. 모든 세포주들은 37℃의 온도 및 5% 이산화탄소 조건에서 배양하였다.
형질감염을 위한 siRNA 는 Genolution (Seoul, Korea)에서 합성하여 사용하였거나 바이오니아(대전, 한국)에 의뢰하여 합성한 것이고, 음성 조절 RNA duplexes는 바이오니아(대전, 한국)에 의뢰하여 합성한 것을 사용하였다. RNA duplexe는 100nM의 농도로 세포주에 형질감염시켰다. si-RNA의 염기서열은 하기 표 4에 나타낸 바와 같고, TCIRG1 siRNA 서열은 서열번호 46, 대조군 siRNA 서열은 서열번호 47에 나타내었다. 1.4Kb human KLF4 ORF (NM_004235)가 pcDNA3.1+/C-(K)-DYK 플라스미드에 서브클로닝된 KLF4 발현 플라스미드는 GenscriptTM (Piscataway, NJ)로부터 구입하여 사용하였다. 형질감염은 Lipofectamine RNAiMAX 또는 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)을 이용하여 수행하였다. SF3b 복합체 억제제인 Spliceostatin A(SSA)는 AdooQ Bioscience (Cat No. A12700; Irvine, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
Figure PCTKR2018004314-appb-I000004
2.9. 세포성장 및 세포증식 분석
세포성장 분석을 위해, 먼저 12웰 플레이트에 세포가 30%정도 차도록 분주하였다. 형질감염 및 억제제를 처리한 후, 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. 포르마잔 크리스탈은 DMSO로 용해시키고 VICTOR3™ multilabel plate reader (PerkinElmer, Boston, MA)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포증식 분석을 위해, 24웰 플레이트에 세포가 30%정도 차도록 분주하였다. 형질감염 후, 세포에 BrdU(5-bromo-2'-deoxyuridine)를 처리하고 2시간 동안 반응시킨 후, 상온에서 30분 동안 고정시켰다. 세포들을 anti-BrdU에 대한 항체로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 미반응된 항체들은 세척 버퍼로 세척하여 제거하였다. Horseradish peroxidase-결합된 2차 항체를 각 웰에 첨가하고, 이후 기질 용액을 첨가하여 반응시킨 후, 반응정지 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 최종 반응산물을 VICTOR3™ multilabel plate reader (PerkinElmer)를 이용하여 490nm의 흡광도에서 측정하였다.
2.10. 집락형성 분석(Clonogenic assay)
6-웰 플레이트 또는 60mm2 세포배양 플레이트에 세포들을 분주하고((1000 cells/well) si-대조군, si-SF3B4 또는 TCIRG1 siRNA으로 세포들을 형질감염 시켰다. 형질감염 후, 12시간이 지난 다음 1x103 및 2x103 세포수로 다시 6-웰 플레이트에 분주하였고, 2주간 추가 배양하였다. 이후 PBS 버퍼로 세포들을 세척하였고 1% 파라포름알데히드로 30분간 상온에서 고정시켰다. 고정된 세포들은 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 1시간 동안 상온에서 염색하였고, 형성된 콜로니의 수는 클론 카운터 프로그램을 이용하여 분석하였다.
2.11. 세포 가시화(Cell viability)
세포들을 6웰 플레이트에 분주한 뒤, 음성 대조군 siRNA 또는 TCIRG1 siRNA로 형질감염 시킨 후, 72시간 동안 배양한 다음, 트립신 처리로 세포들을 수집하였다. 이후 트립판 블루 용액으로 세포들을 염색한 후, 헤마토사이토미터(Marienfeld Superior, LaudaKonigshofen, Germany)를 이용하여 염색된 세포를 관찰하여 카운팅 하였다.
2.12. 상처 치유 분석
형질감연된 세포들을 6웰 플레이트에 분주하고 세포들이 100%가 되도록 플레이트를 가득채우면, micropipette tip을 이용하여 스크래치를 내었다. 이후 스트래치가 있는 영역의 이미지를 시간별로 IX70 fluorescence inverted microscope (Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
2.13. 세포사멸 분석
세포사멸 정도를 분석하기 위해 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Jose, CA)을 이용하였다. 형질감염 후, 간암 세포들을 차가운 PBS 버퍼로 세척하였고 1× 바인딩버퍼로 현탁하였다. 1×105 세포들을 5ml 배양 튜브로 옮기고 5ul의 annexin V-FITC 및 10 ul propidium iodide 용액을 첨가하여 혼합하였다. 15분 내지 20분 동안 상온에서 암 조건하에 반응시키고 400ul의 1× 바인딩버퍼를 각 튜브에 첨가한 후, FACS Calibur flow cytometer (BD Biosciences)를 이용하여 세포사멸이 발생된 분획을 분석하였다.
2.14. 세포주기 분석
간암 세포주를 si-SF3B4로 형질감염 시키고, 48시간 동안 배양한 다음 트립신 처리로 형질감염된 세포를 수집하였다. 이후 차가운 PBS 버퍼로 세척하고 70% 에탄올로 고정시킨 후, 1mg/ml RNase가 함유된 200ul의 PBS로 현탁한 후, 암 조건에서 37℃의 온도로 30분 동안 반응시켰다. 핵은 50 ug/ml propidium iodide (BD Biosciences)로 염색하였고, 염색된 세포 분획들은 Cell-Quest FACS analysis software (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
2.15. FACS 분석(Fluorescence-activated cell sorting)
세포분포의 분석을 위해, 60mm2 세포배양 플레이트에 세포들을 분주하였고, 음성 대조군 siRNA 및 TCIRG1 siRNA로 각각 세포를 형질감염 시킨 후, 72시간 동안 배양한 다음, 트립신 처리를 통해 세포들을 수집하였다. 수집된 세포들은 70% 에탄올로 고정시켰고 PBS 버퍼로 세척한 다음, 1 mg/mL RNase (Sigma-Aldrich), 0.05% Triton X-100 및 50 ug/mL propidium iodide (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 함유한 200ul의 PBS 버퍼로 현탁시켰다. 현탁된 세포들은 이산화탄소가 없는 조건에서 37℃의 온도로 1시간 동안 배양한 다음, FLOWJO software (Tree Star, Ashland, OR, USA)가 장착된 FACS Caliburflow cytometer (BD Biosciences)로 분석을 수행하였다.
2.16. 간암 이식 마우스 모델제조
이종이식 종양 형성 분석을 위해, 1 × 107 세포의 형질감염용 세포를 0.2ml PBS (pH 7.4) 및 30 % (v / v) 마트리겔 매트릭스 (BD Biosciences)와 혼합하였다. 상기 세포 현탁액을 6 주령 수컷 Balb / c 누드 마우스에 피하 주사 하였다. 마우스를 일주일에 2번씩 주사 부위에서의 종양 형성 여부를 관찰하였다. 종양부피는 0.5 × 길이 (L) × 너비2 (W2)로 계산하였다. 각 실험군은 10 마리의 마우스로 구성하였고, 종양 성장은 캘리퍼스를 사용하여 세 직교 방향으로 종양 크기를 측정하였다. 결과는 평균 종양 부피 및 95%의 신뢰구간으로 표시하였다. H-ras12V가 활성화된 동형접합 형질전환 마우스는 유대열 박사(인간 유전체 연구실, 한국 연구실, 한국 생명 공학 연구소, 대전)로부터 입수하여 사용하였다. 형질전환 마우스는 H-ras12V가 활성화된 마우스이다. 수컷 마우스는 15주령부터 HCC가 자발적으로 발달되기 시작하였다. 이에 본 발명자들은 5마리의 35주령된 마우스로부터 비종양 조직과 HCC 조직을 절제하여 수득하였고, 3쌍의 HCC 조직을 선택하여 병리학적 조사를 수행하였다. 이때 HCC의 유도는 DEN(Diethylnitrosamine)를 이용하여 수행하였다.
2.17. 폐 전이 마우스 모델
폐 전이 마우스 모델 제조를 위해, 음성 대조군 siRNA 및 TCIRG1 siRNA로 각각 형질감염된 ras- transformed NIH-3T3 세포 3ul를 PBS 0.1 ml과 혼합한 다음, 5 주령의 흉선이 없는 수컷 누드 마우스 꼬리에 정맥주사 하였다. 주사 후 마우스의 상태를 매일 검사하였고, 정맥 주사한지 12 일 후, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (micro-computed tomography, Micro-CT) 영상을 위해 마우스를 마취시켰다. 마우스를 스캐너 베드에 놓고 Triumph II PET / CT System 장비 (Trifoil Imaging, Chatsworth, CA, USA)를 사용하여 마이크로 CT 이미지를 획득하였다. 이미지를 재구성하고 MicroView 분석 소프트웨어 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 마우스 당 총 폐의 종양 부피를 정량화 하였다. CT 영상 촬영 후 폐 영상을 얻기 위해 마우스를 희생시켰고, 폐 표면의 결절수를 계산하였다.
2.18. 분자경로 마이닝 및 유전자 세트 농축분석(Molecular pathway mining and gene set enrichment analysis)
공지된 분자 데이터베이스에서 유전자 특성을 조사하기 위해 Broad Institute Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)의 MSigDB (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)에서 유전자 세트를 다운로드 하였다(http : // www. broadinstitute.org/gsea). GSEA는 LIAO_METASTASIS 유전자 세트와 명백한 전이성 유전자 시그널의 존재에 엑세스(access)하기 위해 수행하였다. 유전자가 관심 표현형에 의한 발현 수준의 상관 관계에 의해 순위가 매겨진 데이터 세트를 감안할 때, 기본 GSEA 테스트는 주어진 유전자 세트가 최상위 (양성 상관관계) 또는 최하위 (음성 상관관계)에 농축되는 정도를 정량화한 점수를 나타낸다. 유전자 세트의 근접성은 Kolmogorov-Smirnoff (KS) 점수를 사용하여 측정하였고, 점수가 높을수록 근접성이 높다는 것을 의미한다. 분석된 KS 점수는 유의성을 평가하기 위해 모든 유전자 세트에 대한 1000개의 치환된 KS 점수 분포와 비교하였다.
2.19. 통계 분석
생존 곡선은 Kaplan-Meier 제품 한계법을 사용하여 플롯되도록 하였고, 생존 곡선의 차이는 log-rank test를 사용하여 결정하였다. 모든 실험은 적어도 3 회 수행하였고, 모든 샘플은 3 중으로 분석하였다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (SD) 또는 평균의 표준 에러(SEM)로 나타내었다. Graphpad ™ 5.0 (GraphPad software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 unpaired 양측 스튜던트 t- 테스트에 의해 그룹 간의 통계적 차이를 평가하였다. p < 0.05인 것에 대해 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였으며, 카이 제곱 검정 (2-양면)은 매개 변수 간의 연관을 결정하는데 사용하였다. Receiver operating characteristic curve (ROC) 분석은 MedCalc 버전 12.1.4.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium)으로 수행하였다. 연속 변수는 평균 ± SE 및 사분 범위(interquartile range)로 판단하였고, 범주 형 변수는 수와 백분율로 판단하였다. 범주 형 변수는 수와 백분율로 판단하고, 간질 및 다 변수 회귀 분석을 시행하여 간세포 암 환자의 시술 전 독립 예측 인자를 확인하였다. 단 변량 회귀 분석에서 2-테일의 명목 확률 값 <0.05에서 유의한 것으로 확인된 모든 수술 전 예측 변수는 다변량 로지스틱 회귀 분석 모델에 입력하였다.
실시예 3. 전암성 병변에서 잠재적 간암 진단 마커의 동정
전암성 병변(premalignant lesion)에서 간세포암(HCC)과 관련된 유전자의 발현 특성을 확인하기 위해 임상 병리학 데이터와 유전자 발현을 다음과 같은 비 편향분석 방법으로 분석하였다. 여기서 전암성 병변은 간암으로 넘어가기 전 단계를 말하는 것으로 간암에 준하는 치료를 요구하지 않는 상태이다.
먼저, 전체 전사체학(transcriptome) 발현 마이크로어레이를 이용하여 정상 간조직(13개 조직); 8개의 저등급 섬유증(LGCH; low-grade fibrosis) 및 12개의 고등급 섬유증(HGCH;high-grade fibrosi)를 포함하는 만성 간염 조직; 간 경화 조직 12개; 11개의 저등급 이형성 노드(LGDN; low-grade DN) 및 11개의 고등급 이형성 노드(HGDN; high-grade DN)을 포함하는 이형성 노드(DN; dysplastic nodule); 조기 간세포암 조직(eHCC) 5개; Edmonson Grade 1(G1) 9개, G2 12개 및 G3 14개를 포함하는 간세포암 조직;을 분석하였다. 상기와 같은 본 발명에 따른 잠재적 암 진단 마커의 동정 순서에 대한 모식도는 도 1에 나타내었다.
계층적 클러스터링 분석 결과, 만성 간 질환(LGCH, HGCH, 간경변증 및 LGDN), 초기 간암 (HGDN, eHCC 및 G1) 및 간암 HCC (G2 및 G3)과 같이 3개의 구별된 서브클러스터로 구분되는 계통도를 나타내었다(도 2a 참조). 또한 LGDN, HGDN, eHCC 및 G1에 대한 재분석 결과, LGDN은 간세포암의 초기 단계인 것으로 확인 되었다(도 2b 참조). 따라서 HGDN은 초기 단계의 간세포암의 시작을 나타내는 특징이라는 것을 알 수 있었으며, 전암성 병변(precancerous lesion)은 드라이버 유전자(driver gene) 활성의 시작 부위가 될 수 있으며 이후 간세포암으로 발전될 수 있다. 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 전암 병변, 즉 HGDN 내에서 잠재적 간세포암을 예측하는 유전자 세트를 확인하기 위한 유전자의 선택 전략을 디자인했다.
LGDN에서 G1 HCC까지의 각 분자 특성은 LGDN vs HGDN, LGDN vs eHCC /G1 HCC, HGDN vs eHCC / G1 HCC에 대해 분석하였다. 690개의 유전자들 중에서 8개의 유전자가 LGDN에서 간세포암(HCC)으로 진행될수록 점진적으로 발현이 증가되는 것으로 나타났다(도 2c 참조).
다음으로, HCC로의 진행을 전암성 병변인 HGDN에서 확인할 수 있는 분자를 선택하기 위해 ROC(receiver operating characteristic) 곡선의 비교 분석을 수행하였다(도 2d 참조).
분석 결과, 85개의 유전자 중에서 13개가 0.8 이상인 AUC(area under the curve) 값을 나타내어 특이성 및 민감성이 있는 마커들로의 사용 가능함을 예측할 수 있었고(하기 표 5 참조, ROC 분석 결과에 따른 13개의 후보 유전자), Cancer Genome Atlas 간세포 암종 (TCGA_LIHC) 데이터 수집 및 National Biotechnology Information Center (NCBI)의 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스에서 제공되는 HCC 환자의 대규모 코호트에서 13 가지 유전자의 발현을 분석하였다.
Figure PCTKR2018004314-appb-I000005
그 결과, 3 개의 유전자(ALKBH2, HSD3B7, PARP10)는 비종양과 비교하여 HCC에서 지속적인 과발현(>1.5배)을 보이지 않았기 때문에 제외시켰다(6개의 테스트 코호트에서 <50%, 하기 표 6 참조, 간암 환자의 대규모 코호트에서 초기 HCC 드라이버 유전자 후보들의 발현수준)).
Figure PCTKR2018004314-appb-I000006
이후, TCGA_LIHC 데이터 코호트와 107개의 HCC 세트 모두에서 과발현되는 것으로 나타나는 10 개의 후보 마커 유전자를 확인하였다(도 3a 및 3b 참조). 이후, 주위의 비종양 조직과 비교하여 HCC에서 이들 10개 유전자의 과발현을 확인하기 위해, 546개의 HCC(140개 G1, 297개 G2 및 109개 G3)를 함유하는 조직 마이크로 어레이 (TMA)를 사용하여 면역조직화학분석(IHC)을 수행하였다.
그 결과, 10개 마커 후보 유전자 중에서 정상 간 조직 (NL)에 비해 CYC1, FAM83H, MAD3 및 MELK는 간세포 암에서 유의하게 과발현되지 않는 것으로 나타났고(도 2e 참조), HCC 환자의 임상 병리학 데이터 및 발현의 다변량 분석을 바탕으로 BANF1, PLOD3 및 SF3B4를 후보 마커로 선택했다(하기 표 7 참조, 코호트 2에서(n=546) 10개 유전자에 대한 임상병리학적 특징과 발현 분석결과).
Figure PCTKR2018004314-appb-I000007
실시예 4. 전암성 병변에서 BANF1, PLODS3 및 SF3B4에 대한 간세포암 결정 마커로서의 검증
전암성 병변에서 간세포암에 대한 결정 마커로서 BANF1, PLODS3 및 SF3B4의 사용 가능성을 검증하기 위해, HGDN으로부터 전이된(transitioning) 6개의 조기 간세포암 전체 섹션을 이용하여 면역조직화학분석(IHC)을 수행하였다.
그 결과, 예상한 바와 같이 10개 후보 마커 중에서 BANF1, PLODS3 및 SF3B4이 조기 간세포암(eHCC) 및 HGDN에서 모두 강하게 과발현 또는 양성 발현되는 것으로 나타났다. 반면, 비종양 부위에서는 1개만 양성발현되는 것으로 나타났다(도 4a 참조). 또한, 나머지 6개의 마커는 재생 결절(regenerating nodules (RNs)) 내에서 비종양 조직 주변과 eHCC에서 유의한 차이를 보이지 않았다.
또한, 3개의 유전자인 GPC3, GS 및 HSP70은 DN, 간세포 선종 및 국소 결절 증식을 포함하는 다른 종양 병소와 eHCC의 구별이 가능한 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 55 명의 조기 간암과 105 명의 RN을 포함한 70 개의 전체 섹션을 대상으로 3 개의 기존 마커 (CMs; GPC3, GS 및 HSP70)와 본 발명에서 새롭게 동정한 신규 마커 (NMs; BANF1, PLOD1, SF3B4)에 대해 비교 IHC 분석을 수행하였다.
그 결과, HCC에서 2개 이상의 종래 마커 유전자의 발현 양성율(≥2 (+) / 3 CM 이상)은 50.9 % (28/55)로 나타났고, 반면 HCC에서 본 발명에서 규명한 2개 이상의 신규 마커 유전자의 발현 양성율(2개 이상 (+) / 3 NM)은 72.7 % (40/55)로 나타났다(도 4b 및 표 8 참조, 표 8: 기존마커와 본 발명의 신규마커에 대한 조기 간세포암에서의 발현양상 분석 결과). 또한, HCC에서 종래 마커의 음성 발현율(≤1 (+) / 3 CM)은 49.1% (27/55) 였고, 본 발명의 신규 마커의 음성 발현율(≤1 (+) / 3 NMs)은 27.3% (15/ 55)인 것으로 나타났다.
Figure PCTKR2018004314-appb-I000008
또한, 특히 종래마커의 음성발현을 보인 HCC에서 신규 마커의 양성 발현율은 59.3%(16/27)인 것으로 나타났고, 신규마커의 음성 발현을 보인 HCC에서 종래 마커의 양성 발현율은 26.6%(4/15)인 것으로 나타났다(도 4c 참조). 그러나 RNs에서 종래마커와 신규 마커들 간의 음성적인 비율에는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(도 4d 참조).
ROC 곡선 비교 분석 결과, 본원의 신규 마커들이(BANF1, PLOD1, SF3B4) 기존 마커(GPC3, GS 및 HSP70)에 비해 더 우수한 마커라는 것을 확인할 수 있었다(표 9 및 도 5 참조, 표 9: ROC 곡선평가에 의한 조기 HCC 진단용 6개 마커의 진단 성능 분석결과).
Figure PCTKR2018004314-appb-I000009
뿐만 아니라, 특히 2세트의 조합 (HSP70, GPC3, BANF1 및 SF3B4)을 사용한 경우, 전암성 병변에서 가장 민감하고 특이적으로 간세포암의 조기 진단이 가능함을 알 수 있었다(하기 표 10 및 도 4e 참조, 표 10: 기존마커, 본 발명의 신규마커 및 조합마커에 대한 조기 간암과 재생 결절 간의 ROC 분석 결과).
Figure PCTKR2018004314-appb-I000010
또한, HCC 환자의 Kaplan-Meier 생존 곡선(코호트 2) 분석을 통해, 본 발명의 신규 마커 유전자들의 높은 발현을 보인 간세포암 환자의 무병 생존율이 본 발명의 신규 마커 유전자들의 발현 수준이 낮은 환자보다 유의하게 낮은 것으로 나타났고(도 4f), 이를 통해 본 발명의 신규 마커 유전자들이 HCC의 초기 단계를 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 간세포암에서의 BANF1, PLODS3 및 SF3B4의 과발현과 이들의 활성 억제를 통한 항암 효과 분석
5.1. 간세포암에서의 BANF1, PLODS3 및 SF3B4 과발현 확인
HCC에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 비정상적인 조절은 TCGA_LIHC 데이터 세트 코호트에서 HCC 환자 50쌍과 일치된 쌍으로 확인되었고, 추가로 HCC 조직에서 무작위로 선택된 13 세트를 추가로 qRT-PCR 분석하였다(도 6a 참조). 그 결과, PLOD3과 SF3B4는 인접한 비종양 간 조직 (NL)과 비교하여 13개의 HCC 중에서 9-12개에서 (69-92 %)에서 과발현 되었다 (> 2 배 이상으로 과발현됨). 또한, NL을 가진 eHCC 6 쌍과 인접한 DN 및 NL을 갖는 3 쌍의 eHCC에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과, eHCC에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 단백질이 월등히 높은 발현 수준을 나타내었다(도 6b 참조).
다음으로, GEO 데이터베이스에서 이용 가능한 화학적으로 유도된 마우스 및 쥐 HCC 모델에서 Banf1, Plod3 및 Sf3b4 발현을 재구성하였다. 그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, Banf1, Plod3 및 Sf3b4의 발현은 마우스 및 쥐 모델 모두 상피 종양 (AD), eHCC 및 진행성 HCC (aHCC)에서 상응하는 NL의 상향 조절을 나타내었다.
이러한 결과 검증을 위해, H-ras 형질 전환 마우스와 DEN(diethylnitrosamine)으로 유도 쥐 HCC 모델을 제조한 후, 웨스턴 블럿을 통해 이들 동물 군에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현을 조사하였다. 그 결과, 도 6d에 나타낸 바와 같이, 이들 모두 3가지 마커들의 발현이 증가된 것으로 나타났다.
5.2. BANF1, PLODS3 및 SF3B4 억제에 따른 암세포의 증식 및 집락형성 억제
다음으로, 간암 발생 과정에서 BANF1, PLOD3, SF3B4의 생물학적 기능을 알아보기 위해 RNAi와 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 이용하여 각 유전자를 넉다운 시키고, 세포 성장 속도를 측정하였다. 또한, BrdU(bromodeoxyuridine) 도입 및 집락형성 분석(clonogenic assay)은 SNU-449 HCC 세포의 증식 속도를 측정하기 위해 수행하였다. 그 결과, 각각 BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 넉다운 시킨 경우, SNU-449 HCC 세포의 성장과 증식이 억제되는 것으로 나타났고(도 6e 및 6f), BANF1, PLOD3 및 SF3B4은 간세포암의 임상병리학적 특성에서 혈관침윤 및 분화와 같은 암 전이성과 관련되어 있는 것으로 나타났다(표 1 참조).
5.3. BANF1, PLODS3 및 SF3B4 억제에 따른 암 전이 억제효과 분석
in vitro에서 세포이동성 및 침윤 분석을 수행하여 이들 본 발명에 따른 신규 마커들이 HCC의 암 전이에 영향을 미치는지 분석하였다. 각각 BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 넉다운시킨 군에 대한 변형된 Boyden chamber 분석 결과, SNU-449 세포의 혈청 자극에 의한 세포 이동 및 침윤 현상이 유의적으로 억제되는 것으로 나타났고(도 7a), 유사하게 상처 치유 분석에서도 BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 각각 넉다운시킨 군의 경우, 혈청 자극에 의한 SNU-449 세포의 상처치유 효과가 감소되는 것으로 나타났다(도 7b 참조).
나아가 본 발명에 따른 신규 마커들이 EMT에도 영향을 미치는지 확인하기 위해, EMT 조절인자들에 대한 발현 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석하였다. EMT의 전형적인 마커인 N-cadherin, Fibronectin, Snail 및 Slug들이 본 발명의 유전자를 각각 넉다운 시킨 결과, 현저하게 이들 발현이 감소된 것으로 나타났다. 반면, 상피세포 마커인 Ecadherin은 동일 세포에서 증가한 것으로 나타났다(도 7c 참조). 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 BANF1, PLOD3 및 SF3B4이 간세포암에서 EMT 조절인자들의 발현을 선택적으로 조절하며 암 전이능을 갖는다는 것을 알 수 있었다.
5.4. in vivo 에서 BANF1, PLODS3 및 SF3B4 억제에 따른 항암 활성 분석
BANF1, PLODS3 및 SF3B4 억제에 따른 항암 활성 여부를 확인하기 위해, BANF1, PLODS3 및 SF3B4 유전자들이 각각 넉다운 시킨 종양 세포를 가슴샘이 없는 누드 마우스에 피하 주입시키고, 이후 종양의 성장과 종양의 부피를 측정하였는데, 그 결과, BANF1, PLODS3 및 SF3B4를 각각 넉다운시킨 세포를 주입한 군이 대조군인 si-Cont를 처리한 세포를 주입한 군에 비해 종양의 성장과 종양의 부피가 월등히 감소한 것으로 나타났다.
또한, 대조군 세포주를 쥐에 주입 후, 50일이 경과한 시점에서 분석한 결과, 10마리 중 6마리가 종양이 형성된 것으로 나타난 반면, BANF1, PLODS3 또는 SF3B4이 넉다운된 세포주를 쥐에 주입한 군에서는 10마리 중 0~2마리 만이 종양이 미약하게 발생한 것으로 나타났다(도 7d).
또한, BANF1, PLOD3 및 SF3B4에 대한 특이적인 si-RNA 전달을 통해 항암 효과를 유도하기 위한 방법으로, 매우 큰 기공을 갖는 메조 포러스 실리카 나노 입자 (MSNs)를 사용하였다. 먼저 12~15주령의 간세포암이 자발적으로 발달된 H-ras 형질전환 마우스를 준비하였다. BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 타겟으로 하는 si-RNAs 들을 함유한 메조 포러스 실리카 나노 입자 (MSN_si-RNA)를 상기 준비한 마우스에 주입하고 확인하였으며, 이때 대조군으로는 si-RNA가 없는 MSN만이 주입된 마우스군을 사용하였고, 마우스 간에서의 간세포암은 출생 후 16 주부터 희생되는 시점인 23 주까지 초음파 검사를 통해 분석하였다.
그 결과, MSN만이 주입된 대조군은 17주째에 4마리 중 3마리에서 간세포암이 발견되었으며, 반면 MSN_si-RNA를 주입한 군은 19주째에 4마리 중 2마리에서 작은 간세포암이 발견되었다(도 7e 참조). 웨스턴 블럿 결과, MSN_si-RNA를 주입한 군에서는 BANF1, PLOD3 및 SF3B4이 대조군에 비해 각각 넉다운 되어 있음을 확인함으로써, MSN_si-RNA에 의해 타겟 유전자들이 정확하게 발현 억제됨을 알 수 있었다(도 7f 참조).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질들은 간암, 특히 간세포암의 치료제로 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. SF3B4의 억제에 따른 간세포암 종양 발생 억제분석
HCC에서의 임상적 관련성을 조사하기 위해 TCGA_LIHC에서 360명의 HCC 환자의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 변화 빈도를 평가했다. BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 과발현은 360명 환자 중에서 140명에게 나타났다(도 9a 참조). Kaplan-Meier 생존 곡선은 BANF1, PLOD3 및 SF3B43의 상향 조절을 가진 HCC 환자의 전반적인 생존율 (OS)과 무병 생존율 (DFS)이 모두 정상 발현을 보이는 간세포암 환자 군에 비해 낮게 나타났다(OS; Logrank P = 0.002, DFS; Logrank P = 0.001, 도 9b 참조).
또한, 흥미롭게도 이들 유전자 중에서 오로지 SF3B43만 과발현되는 군은 HCC 환자의 전반적인 생존율 (OS)과 무병 생존율 (DFS)이 매우 낮은 것으로 나타났다(도 9c 참조). SF3B43의 증폭은 OS 및 DFS의 간세포암 환자에 매우 나쁜 결과를 초래하는 것으로 나타났고, 이는 SF3B43의 증폭이 간암 발생에서 SF3B43의 기작을 활성화시킨다는 것을 예상할 수 있었다(도 9d~9f).
SF3B4는 6개의 SF3b(splicing factor 3b) 복합체 중에 하나로, U2 snRNP super-complex에서 중요한 단백질이다. TCGA_LIHC 및 GEO databases에서 SF3b(splicing factor 3b) 복합체의 6개 서브유닛에 대한 발현 수준 및 변화 빈도를 분석한 결과, SF3B4만이 간세포암에서 특이적으로 과발현되어 있고 유전자 카피수가 증폭되어 있는 것으로 나타났다(도 10a 및 10b).
또한, 10개의 다른 종류의 간 세포주, MIHA 불멸화 정상 간세포주 및 8개의 인간 간세포암 세포주를 대상으로 qRT-PCR로 SF3B4의 발현수준을 분석하였는데, 그 결과, MIHA 세포주에 비해 간세포암의 세포주에서 SF3B4의 mRNA와 단백질이 모두 과발현되어 있는 것으로 나타났다(도 10c 참조). 나아가 SF3B4의 발현 억제 결과, SNU-449 및 SNU-368 HCC 세포의 세포 성장 및 증식은 모두 억제되는 것으로 나타났다(도 11a , 11b).
변형된 Boyden chamber 분석 및 상처 치유 분석의 결과에서도 SF3B4 넉다운 시, 동일 세포주의 암전이성 특징이 모두 억제되는 것으로 나타났다(도 11c 및 11d).
EMT에 관여하는 단백질들의 발현에 미치는 영향을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과, 간세포암 세포주에서 SF3B4 넉다운 시 N-cadherin, Fibronectin, Snail 및 Slug이 모두 억제되는 것으로 나타났고, E-cadherin만이 과발현되는 것으로 나타났다(도 11e).
앞서 실험 결과에 의하여, 간세포암에서는 SF3B4의 유전자 및 단백질이 과발현되고 있는 것으로 나타남에 따라, 100명의 HCC 환자의 코호트(GSE16757)에서 SF3B4의 발현과 예후에 대한 관련성을 분석하였다. SF3B4 발현과 높은 상관 관계를 보이는 발현 패턴을 가진 유전자(n = 342)를 군집 분석을 위해 선택하였다 (P <0.001, r> 0.5 또는 r <-0.5). 환자들은 SF3B4 high cluster (SF3B4_high) 그룹 또는 SF3B4 low cluster (SF3B4_low) 그룹으로 나누었다. HCC 환자의 Kaplan-Meier 생존 곡선은 SF3B4 발현이 높은 환자의 5 년 OS 비율이 SF3B4 발현이 낮은 환자보다 유의하게 낮았다 (P = 0.014, 도 10d).
다음으로, SF3B4 관련 유전자 표지의 생물학적 관련성을 조사하기 위해 Molecular Signatures Database (MsigDB)에서 SF3B4 관련 유전자 표지와 관련된 신호 전달 경로를 확인하기 위해 GSEA(gene set enrichment analysis)을 수행하였다. KEGG_CELL_CYCLE은 매우 의미있는 유전자 세트로 확인되었다(도 10e). 또한, FACS 분석 결과에 의하면, SF3B4이 넉다운된 간세포암 세포주에서는 G1기의 세포수가 현저하게 증가하였고, 동시에 S 기와 G2 / M 기의 세포수는 감소한 것으로 나타났다. 반면 SF3B4의 넉다운은 세포 사멸 과정에는 영향을 미치지 않았다(도 10f 및 도 11f).
실시예 7. SF3B4의 KLF4에 대한 비정상적인 스플라이싱 작용 및 간세포암 유도
간세포암 발생과정에서 SF3B4의 생물학적 역할 규명을 위해 SF3B4 넉다운에 의한 spliceosome 활성을 조사하였다. SF3B4 넉다운 SF3b 복합체에 의해 조절되는 대표적인 분자인 VEGF의 발현을 억제하는 반면, VEGF mRNA의 비스플라이싱 형태(VEGF pre-mRNA)는 HeLa 세포에서 SF3B4 넉다운에 의해 증가되었다(도 12a).
SF3b 복합체의 억제제인 Spliceostatin A (SSA)를 처리한 경우, VEGF 단백질 발현 억제가 SF3b 복합체의 스플라이싱 활성 억제에 관여함이 밝혀졌고, 두 개의 다른 HCC 세포주에서 동일한 결과로 나타났다. SF3B4 넉다운 SSA의 처리는 HCC 세포주의 종양 세포 성장을 억제하는 것으로 나타났다(도 13a).
세포주기 조절 단백질에 대한 웨스턴 블럿은 SF3B4를 타겟팅 한 암세포 성장 억제의 기작을 확인하기 위해 수행하였다. SF3B4 넉다운은 CDK4, CDK2, cyclin D1 및 cyclin E의 발현을 억제하고 동시에 HCC 세포주에서 p27Kip1을 유도하였으며, SSA 처리는 동일한 세포에서 이러한 결과를 반복적으로 나타났다(도 12b). 이러한 결과는 SF3B4 과발현이 p27Kip1을 포함한 음성 세포주기 조절 인자의 억제를 유도하고 동시에 HCC 세포의 세포주기 전이(transition)에서 특이적 조절인자인 CDK4, CDK2, cyclinD1, cyclin E의 발현을 유도함을 시사한다. 간세포암에서 SF3B4 넉다운은 pRb의 인산화 억제(hypophosphorylation)를 유도한다.
다음으로, HCC 세포에서 비정상적인 발현 SF3B4의 직접 표적을 조사하기 위해, SF3B4 넉다운 HepG2 세포의 차세대 시퀀싱 (NGS) -RNA 서열 데이타를 분석하였다. 이 데이터 세트는 GEO 데이터베이스 (GSE80861)에서 구할 수 있으며 ENCODE 프로젝트 (the Encyclopedia of DNA Element)의 일부로 수행하였다. 이 분석은 SF3B4 넉다운 세포에서 특이적인 발현양상을 보이는 유전자 (DEG; differentially expressed genes)들 3,182 개의 유전자를 확인하였다(대조군에 비해 1.5 배 이상 차이). SF3B4 넉다운 관련된 AS 현상을 확인하기 위해, paired-end reads를 ENCODE 데이터베이스에 매핑하고 MATS (Multivariate Analysis of Transcript Splicing Analysis) 분석 도구를 사용하여 엑손 포함을 정량화하였다.
분석 결과, 스킵된 엑손 (SE), 유지된 인트론 (RI), 대안 3 '스플라이싱 사이트(A3SS), 대안 5' 스플라이싱 사이트 (A5SS) 및 상호 배타적인 엑손 (MXE)과 같이 6개의 서로 다른 스플라이싱 현상이 일어나는 것으로 분석되었다(도 12c). 또한, 2가지 이상의 AS 사건과 함께 이 두 가지 분석을 조합하면 SF3B4가 넉다운된 HepG2 세포에서 8개의 유전자가 현저하게 전사가 억제된 것으로 나타났다(도 13b).
이를 보다 명확하게 확인하기 위해, 8개의 유전자를 TCGA_LIHC 데이터셋에 적용하였고, 이 중에서 4개의 유전자인 GRIP, PLP1, KLF4 및 KRT80을 SF3B4의 타겟 후보 유전자로 선택하였다(도 12d). 특이하게 KLF4만이 SF3B4가 넉다운된 2개의 간세포암 세포주에서 활성화 되어 있는 것으로 나타났다(도 12e 및 도 13c 참조).
8개의 유전자들 중에서 KLF4과 SF3B4은 간세포암에서 서로 유의미한 음성적인 상관관계를 보였다(도 13d 및 13e). 이러한 결과는 SF3B4 넉다운이 야생형 KLF4의 전사 발현의 회복을 유도하고, HCC 세포에 대한 항종양 효과를 나타냄을 의미하며, 실제로, NGS-RNA 분석은 HCC 조직에서 야생형 KLF4의 전사체가 억제되어 있는 것으로 나타났으며, 간세포암 환자에서는 KLF4 SE 전사체가 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 12f).
나아가 본 발명자들은 SF3B4 과발현이 SF3b 복합체를 유발하여 KLF4 전사 체를 스플라이싱하여 비기능성 AS 전사체가 되도록 하는지 확인하기 위해, SF3B4 넉다운되고 KLF4가 이소성 발현(ectopic expression)되는 플라스미드를 간세포암 세포주에 적용하여 분석하였다. 이후 SF3B4가 넉다운되고 KLF4가 과발현되는 세포에서 SF3B4의 조절인자 인 p27Kip1과 Slug을 관찰하였다. 그 결과, 예상대로 KLF4의 이소성 발현은 동일한 세포에서 SF3B4 넉다운의 효과를 나타내었다(도 14a).
다음으로, SF3B4 활성화가 HCC 세포에서 KLF4 전사 활성을 통해 p27Kip1 및 Slug 발현을 직접적으로 조절하는지를 조사하기 위해, p27Kip1 또는 slug-promoter를 갖는 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 제조하고 SNU-449 세포로 형질 감염시켰고, 동시에 SF3B4 특이적인 siRNA 또는 KLF4 플라스미드를 형질감염시켰다. 그 결과, p27Kip1 프로모터 형질 감염체의 루시퍼라제 활성은 SF3B4 넉다운 세포주 및 KLF4 과발현 세포주 모두에서 유의하게 증가하였으며, Slug- 프로모터 형질 감염체의 루시퍼라제 활성은 동일한 세포에서 유의하게 억제되었다(도 14b).
이후, SF3B4 넉다운이 KLF4의 발현 유도와 동시에 KLF4, Liver-KLF4-iso1 및 Liver-KLF4-iso2의 다양한 스플라이싱 이성질체를 억제하는지 확인하였다. 직접적인 시퀀싱 분석으로 야생형 KLF4 전사체에서 스킵된 엑손 전사체가 생성되었음을 확인하였다(도 14c).
마지막으로, SF3B4의 불활성화가 생체 내에서 종양억제자인 KLF4의 회복을 통해 종양 억제 효과를 유발하는지 확인하기 위해, SF3B4 넉다운 및 KLF4 과발현 세포를 흉선 누드 마우스에 피하 주사 하였다. 그 결과, SF3B4 넉다운과 KLF4를 발현하는 SNU-449 세포 모두에서 전체적으로 종양 성장 속도와 희생시의 평균 체적이 유의하게 감소했다(도 14d). 또한, 면역블럿 분석에서는 SF3B4 넉다운 및 KLF4가 발현하는 이종 이식 조직 모두에서 KLF4의 유도를 확인할 수 있었다(도 14e).
따라서, 이상과 같은 실험 결과를 통해 본 발명자들은 초기 간암을 정확하게 예측할 수 있는 바이오마커로서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4를 사용할 수 있음을 알 수 있었고, 특히 이들 마커를 단일로 사용하는 것에 비해 2개 이상으로 조합하여 사용할 경우, 진단 정확도가 더 높은 것을 알 수 있었으며, 특히 이들 마커는 전암성 병변 시료에서 확인할 수 있다는 특징이 있다.
뿐만 아니라 SF3B4의 경우, 간암 발병시 KLF4의 발현 및 활성을 억제하여 간암을 진행 및 유발시키는 것을 알 수 있었고, SF3B4 발현을 억제할 경우, KLF4의 발현 증가를 통해 항암 활성을 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 8. 간세포 암의 재발과 관련된 대규모 유전자 동정
간 이식은 HCC(간세포암)에 대한 가장 이상적인 치료법이지만 간 이식 후 재발 및 전이가 가장 흔한 치명적인 문제가 남아있다. 따라서 원발 종양 시 HCC의 전이 및 재발 가능성을 판단할 수 있는 분자마커의 개발이 필요하다. 이를 위해 본 발명자들은 부분적 또는 전체적인 간 절제술을 받은 환자로부터 56개의 HCC 조직을 확보하였고, 간 절제술 후, 재발과 관련된 유전자 발현 양상을 확인하기 위해 전사체 분석(transcriptomic analysis)을 수행하였다. 56개의 간세포 암 조직은 총 36명의 전체 간 절제술 환자 유래의 재발된 암 조직 9개를 포함하고 있고, 20명의 부분 간 절제술을 받은 환자 중에서 암이 재발된 환자 유래의 암 조직 15개를 포함하고 있다(하기 표 11 참조, 간 절제술을 받은 재발 환자의 수).
Figure PCTKR2018004314-appb-I000011
분석을 위해 7,550 유전자 요소의 계층적 클러스터링 분석을 수행하였고, 비재발 그룹(하기 도 15a, 녹색표기 그룹) 및 재발 그룹(도 15a, 노란색 표기 그룹) 사이의 통계적 분석을 수행하였으며(1 차 ANOVA test, p <0.05), 그 결과, dendrogram 내에서 두 개의 구별된 서브클러스터 그룹, 즉 암 비재발 그룹 및 암 재발 그룹으로 그룹핑 되었다. 두 개의 간 절제술 군 모두를 이용한 재분석은 dendrograms에서 두 개의 재발군 모두에서 재발 관련 분자 표지를 나타내는 뚜렷한 군집을 보였다(도 15a, 오른쪽 상단 및 하단 참조). 이러한 분석으로 Welch 's ttest에 의한 전체 간 절제술 (6,682 유전자 요소)과 부분 간 절제술 (2,036) 그룹에서 각 환자에서 차별적으로 발현되는 유전자 (DEG) 특징을 확인할 수 있었다. 이후, 전체 간 절제술 및 부분 간 절제술로부터 수득한 조직들을 대상으로 Venn 다이어그램 분석을 통해 유전자 발현양상을 분석한 결과, 이들 그룹 모두에서 422개의 유전자 요소가 공동적인 발현양상을 갖는 분자들로 확인되었다(도 15b 참조). 그리고 간암 전 전막 병변의 퇴행성 결절의 암세포에서 부분적인 간 절제술 후 재발이 발생할 수 있으므로, 이들 422개의 유전자 요소를 6,682 개의 유전자 요소들로부터 제외시켰다. 또한 총 간세포암 조직을 대상으로 수행한 화산 플롯 분석(p <0.05 및 1.3-fold up-regulated) 결과, 간 세포암이 재발되지 않은 군에 비해 암이 재발된 군에서 총 2,760 개의 유전자가 과발현되고 있음을 확인할 수 있었다(도 15c 참조). 마지막으로, 간암의 재발에 특이적인 유전자 요소를 확인하기 위해, NCBI GEO 데이터베이스에서 간암의 재발 패턴에 대한 유전적 예측 인자를 확인하기 위해 GSE39791 데이터 세트와 비교 분석을 수행하였다. 분석 결과, 953 개의 유전자 요소를 검증된 재발 연관 분자로 확인할 수 있었다(도 15d 참조).
다음으로, 상기 분석에 의해 확인된 암 재발 관련 유전자와 생물학적 관련성을 조사하기 위해, 953 개의 유전자 요소를 대상으로 GSEA(gene set enrichment analysis) 분석을 수행하였다. 이 분석은 HCC의 재발과 관련된 953 유전자의 세포 내 신호 전달 경로를 확인할 수 있었고, LIAO_METASTASIS는 재발성 분자 표지로서 매우 중요한 유전자로 확인되었다(도 15e 및 15f 참조).
실시예 9. 간 절제술 후 간세포암 재발 조직에서의 TCIRG1 발현양상 분석
953개의 간세포암 재발 연관 분자 표지 중, TCIRG1 유전자가 TCGA_LIHC 데이터에서 유의적으로 과발현되는 것으로 나타났다. 이러한 데이터베이스는 50개의 비 종양 간 조직과 373개의 HCC 조직의 유전자 발현(mRNA) 데이터 세트를 포함하며, 50쌍의 일치된 세트(50개의 HCC는 비조양 조직과 상응함)를 포함한다. 또한 매칭되는 세트는 비종양(non-cancer) 군과 HCC 군 사이에서 유의한 차이를 보였다. 흥미롭게도 Edmondson 등급 I-II (G1-G2, n = 225) 및 III-VI (G3-G4, n = 132)에 의해 정의된 간세포암의 하위 집합(subset)에서 TCIRG1 유전자의 발현은 G1-G2와 비교하여 G3-G4에서 유의적으로 과발현되는 것으로 나타났다(도 16a 참조). HCC 에서 TCIRG1의 과발현은 다양한 GEO 데이터세트(accession numbers GSE14520, GSE16757, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE36411, GSE45436 및 GSE89337)에서 TCIRG1 유전자의 발현정도를 비교하였고, 데이터는 scatter polts로 표시하였다(도 16i 참조). TCIRG1 발현이 TCGA_LIHC 종양 환자에서 상향 조절(과발현) 되었기 때문에, 본 발명자들은 cBioPortal (www.cbioportal.org)에서 TCGA_LIHC 데이터를 이용하여 HCC 환자의 TCIRG1 발현 예후 관련성을 분석하였고, 그 결과, HCC 환자의 9 %가 TCIRG1유전자가 과발현되는 것으로 나타났다. HCC 환자의 Kaplan-Meier 생존 곡선은 TCIRG1 발현이 증가한 환자의 5 년 무병 생존율 (DFS)이 TCIRG1 발현 변화가 없는 HCC 환자보다 유의적으로 낮았다(도 16b 참조).
나아가 본 발명자들은 간 절제술 이후 HCC에 대한 예후 예측용 바이오마커로서 TCIRG1을 사용할 수 있는지를 검증하기 위해 ROC 곡선을 비교 분석 하였다(도 16c 참조). 그 결과, AUC(area under curve)은 TCGA_LIHC 군에서는 0.74, GSE39791 군에서 0.74인 것으로 나타났다. 이는 HCC의 진단을 위한 잠재적 바이오 마커로서의 사용 가능성을 암시한다. 또한, 2개 HCC 환자군 코호트에서 유전자 발현정보를 제공하는 매칭되는 세트(GSE39791 및 GSE77314)에서의 TCIRG1 발현은 비종양 조직과 비교하여 간세포암 조직(HCC)에서 유의적으로 과발현되는 것으로 나타났다(도 16j 참조). TCIRG1 유전자 발현은 높은 등급의 HCC 환자군에서 유의하게 과발현되었다(G3-G4, 도 16a 참조). 일관되게 TCIRG1 발현은 정상 간 조직 (정상, n = 13) 또는 초기 HCC (eHCC, n = 25) 조직(도 16k 참조) 보다 명백한 HCC 환자군(ovHCC, n = 26)에서 유의적으로 과발현되었다. 또한 동일한 환자군(GSE89337)에서의 비재발 또는 재발에 따른 차별적인 유전자 발현분석은 전체 간 절제술 후 재발한 간세포 암 환자에서 TCIRG1이 유의하게 과발현되는 것으로 나타났다(도 16k, 오른쪽 참조).
HCC 환자에서 TCIRG1의 과발현 확인을 위해, 인접한 비 암성 간 조직과 짝을 이루는 무작위로 선택된 35개의 간세포 암종에서 TCIRG1의 발현수준을 qRT-PCR로 분석하였다. 분석 결과, 35개의 HCC 조직 중에서 24개(68.6 %)는 TCIRG1의 과발현을 보였다(도 16d 참조).
다음으로, HCC 조직에서 TCIRG1 단백질의 과발현 여부를 확인하기 위해, TCIRG1 특이적인 항체를 이용하여 면역염색을 수행하였다. 그 결과, HCC 조직에서 TCIRG1에 대한 항체 양성율은 24.4 % (133/546)였고, 비 종양 그룹에서 TCIRG1에 대한 양성율은 1.0 % (1/100)인 것으로 나타났다(도 16e 참조). TCIRG1 단백질의 발현 증가는 무작위로 선택된 14개의 인간 간암 조직과 비- 암성 간 조직을 대상으로 웨스턴 블랏 (Western blot) 분석을 통해 재확인한 결과, 비암성 조직에 비해 간암 조직에서 발현이 증가되어 있었다(도 16f 참조).
또한, TCIRG1을 포함한 간 전이와 관련된 다양한 임상 변수에 대한 다변량 로지스틱 회귀 분석을 수행한 결과, TCIRG1의 과발현은 6개의 다른 전이 특징 중에서 가장 강한 연관성을 보였다(Odds ratio 1.768, p <0.001)(표 12 참조, 로지스틱 회귀 분석).
Figure PCTKR2018004314-appb-I000012
또한, TCIRG1 양성 환자의 무병생존율(DFS rate)는 546명의 간 이식을 하지 않은 HCC 환자군과 285명의 간이식을 수행한 HCC 환자군의 코호트에서 TCIRG1에 대한 음성 발현을 보이는 환자에 비해 수치가 유의하게 낮았다(도 16g 및 16h 참조). 즉 암의 진행은 2개 코호트 모두에서 TCIRG1 양성 환자군이 유의하게 더 많은 것으로 나타났고(하기 표 13 참조, 간 이식을 수행한 간세포암 환자의 두 가지 코호트에 대한 임상 병리학적 특징), 이러한 결과는 TCIRG1이 간 절제술 후 간세포암의 재발 가능성을 예측할 수 있는 유의한 마커임을 시사한다.
Figure PCTKR2018004314-appb-I000013
실시예 10. 간암 세포주에서 TCIRG1 결함에 따른 종양 억제효과 분석
본 발명자들은 간 종양 형성에서 TCIRG1이 미치는 기능을 더 확인하기 위해, RNA 간섭을 통해 TCIRG1을 녹다운시킨 상태에서 세포생존율, 세포증식, BrdU 염색 및 콜로니 형성에 대한 실험을 수행하였다. TCIRG1이 과발현되는 간암 세포주의 선택을 위해 세포에 내재된 TCIRG1의 발현수준을 qRT-PCR 및 웨스턴 블럿을 통해 14개의 다른 간 세포주를 대상으로 분석하였는데, 상기 간 세포주에는 MIHA 및 THLE3이 불멸화된 정상 간 세포주도 포함하도록 하였다.
분석 결과, 인간 간암 세포주인 Hep3B, HepG2, Huh7, PLC/PRF/5, SK-Hep1, SNU354, SNU368, SNU387, SNU398, SNU423, SNU449 및 SNU475에서는 TCIRG1의 발현이 MIHA 세포와 비교하여 과발현되는 것으로 나타났다(도 17a 및 17b 참조).
한편, RNA 간섭을 통해 TCIRG1이 넉다운된 SNU475 및 Huh7 간암 세포주의 경우, 세포 성장 및 증식이 모두 억제되는 것으로 나타났다(도 17c 내지 17f 참조). 간암 세포의 성장 억제는 부분적으로 TCIRG1을 표적화에 따른 세포주기 정지, 세포노화 또는 세포사멸과 같은 세포 성장 조절의 파괴로 유발되는 것일 수 있으며, 본 발명자들은 먼저 TCIRG1의 넉다운에 따른 세포주기 영향을 분석하고자 유세포분석기를 이용하여 분석하였고, 또한 세포 사멸 분석을 위해 TCIRG1 표적 siRNA (siTCIRG1)로 세포주를 형질 감염시킨 후, 아넥신 V-FITC와 PI를 사용하여 분석하였다.
그 결과, TCIRG1이 넉다운된 SNU475 및 Huh7 간암 세포주에서 S 기와 G2 / M 기의 세포수는 감소한 것으로 나타났고 G1 기의 세포 수가 현저히 증가한 것으로 나타났고(도 17g 참조), FACS 분석 결과 TCIRG1 siRNA로 형질감염된 SNU475 세포에서는 음성 대조군 siRNA (N.C)으로 형질감염된 세포와 비교하여 세포 사멸이 현저하게 유도되는 것으로 나타났다(도 17h 참조). 또한, TCIRG1 siRNA로 형질감염된 Huh7 세포에서 자가포식에 의한 세포 사멸(왼쪽 상단 부분의 점으로 표시된 플롯)이 유도되는 것으로 나타났다. 또한, 동일한 세포에 대해 자가포식의 특이적 억제제인 3- 메틸 아데닌을 처리한 경우, 자가포식(autophagic)으로 인한 세포 사멸이 억제되는 것으로 나타났다(도 17i 참조). 이러한 결과는 TCIRG1의 과발현이 간암 발생 과정에서 자가포식에 의한 세포사멸 억제를 촉진함으로써 간암 발병과 관련되어 있음을 의미한다.
또한, 재발과 연관된 분자 시그널을 가진 GSEA는 LIAO_METASTASIS 유전자가 재발 신호를 유의적으로 많이 내포하고 있다는 것을 보여준다(도 15g 참조). 이에 간암 세포의 악성 종양에서 TCIRG1의 작용을 규명하기 위해 in vitro에서 세포 이동성 및 침윤 분석을 수행하였다.
분석 결과, 변형된 Boyden 챔버 분석은 TCIRG1이 넉다운된 SNU475와 Huh7 세포주 모두 화학유인물질(2 % FBS)에 의한 세포 이동 및 침습이 유의하게 억제됨을 확인할 수 있었다(도 18a 및 18b 참조). 또한, 스크래치 치유 분석 결과, TCIRG1이 넉다운 된 세포군이 대조군에 비해 화학유인물질에 의한 간암 세포의 상처 치유 효과가 감소되는 것으로 나타났다(도 18c 참조). TCIRG1의 전이 잠재성을 확인하기 위해 Boyden 챔버 어세이 분석을 ras로 형질전환 된 NIH-3T3 세포를 이용하여 수행하였다. 그 결과, TCIRG1의 넉다운은 ras로 형질전환된 NIH-3T3 세포의 화학유인물질로 인한 세포 이동 및 침윤이 유의하게 억제되는 것으로 나타났다(도 18d 및 18e 참조).
나아가 본 발명자들은 EMT에 대한 TCIRG1의 조절 효과를 확인하기 위해, 간암 세포를 대상으로 EMT 조절 단백질들의 발현 현상을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 그 결과, E-cadherin은 TCIRG1이 넉다운된 SNU475 및 Huh7 세포주에서 현저하게 증가하는 것으로 나타난 반면, N-cadherin, Fibronectin, Vimentin, Snail 및 Slug는 동일한 세포에서 감소한 것으로 나타났다(도 18f 참조).
또한, 2개의 큰 HCC 환자 코호트에서의 TCIRG1 발현 분석은 매칭되는 세트(GSE39791 및 GSE77314)의 유전자 발현양상을 보였고, E-cadherin(CDH1)의 발현은 비 종양 조직에 비해 간세포 암종에서 유의하게 감소하였고, TCIRG1과 E-cadherin은 동일한 데이터 세트에서 역관계성을 보이는 것으로 나타났다(도 18g 참조).
마지막으로, 생체 외 실험 전이 분석은 micro-CT 영상 분석과 폐결핵 계수 분석 모두에 의해, TCIRG1 넉다운은 ras로 형질 전환된 NIH-3T3 세포의 전이 잠재력을 지연 또는 감소시킨다는 것을 알 수 있었다(도 19a 및 19b 참조).
상기의 결과를 통해, 본 발명자들은 TCIRG1을 간세포암의 예후를 예측할 수 있는 바이오 마커로서의 사용 가능성을 확인하였고, 나아가 간세포암의 수술 후 재발 또는 전이 여부를 예측할 수 있는 마커로도 사용 가능함을 알 수 있었으며, TCIRG1이 과발현된 군에서는 수술 후 무병 생존율이 현저하게 낮다는 것으로 통해, 간세포암의 재발 및 전이를 예방 또는 억제할 수 있는 치료제로서 TCIRG1의 억제제를 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 11. 간암의 발병, 진행 및 재발을 예측할 수 있는 TCIRG1 발현수준에 대한 컷오프 값 제시
본 발명자들은 상기와 같은 실험결과를 통해, TCIRG1의 간세포암 발병시 발현수준이 증가하고, 간 절제 수술 후 간암이 재발된 환자의 조직에서도 TCIRG1의 발현이 증가되어 있음을 확인함으로써 TCIRG1을 간암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었고, 나아가 간암의 진행, 예후 및 재발 가능성을 예측하는 마커로 사용할 수 있음을 알았다. 이에 TCIRG1의 발현수준을 정량화하여 간암에 대한 상태 정보를 제공할 수 있는 컷오프(cut off) 값을 도출하였다.
11.1. 간암 발병 여부를 예측할 수 있는 TCIRG1의 컷오프 값
앞서 실험에서 수행한 2개의 대규모 간암 환자의 코호트에서 간세포암 환자군과 비간암 환자군에 대한 ROC 분석결과를 확인하였다(도 16c 참조). 또한, TCGA_LIHC 에서는 환자의 비종양조직 (Non tumor, n=50)과 진행성 간세포암 (G2,G3,G4, n=301)에 대하여 평가하였을 때, AUC 값이 0.74로 분석되었다. 이에 본 발명자들은 이들 도출 값을 토대로 진행성 간암에 대한 TCIRG1 cut-off 값을 도출하였다. 보다 구체적으로, 바이오마커로써 효능을 평가하기 위하여, 리시버 오퍼레이터 특성(Receiver Operator Characteric, ROC) 커브 및 스캐터 플롯을 분석하였다. ROC는 민감도와 특이도가 서로 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면 상에 표현한 것인데, ROC 아래의 면적에 해당하는 AUC(Area Uder Curve) 값이 클수록 우수한 진단 방법이라고 할 수 있다. 모든 통계 분석 및 생성된 모든 스캐터 플롯 및 ROC는 Medcalc(MedCalc, Mariakerke, Belgium, version 12.2.1)를 이용하였다.
분석결과, 도 20a에 나타낸 바와 같이, 진행성 간암에 대한 TCIRG1 cut-off 값은 11.0112인 것으로 나타났다(컷오프 값:11.0112, log2 RSEM). 따라서 TCIRG1의 발현수준에 대한 정량분석을 통해 컷오프 값이 11.0112인 경우, 진행성 간암으로 판단할 수 있으며, 간암이 전이될 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
11.2. 간암 재발 여부를 예측할 수 있는 TCIRG1의 컷오프 값
상기 실험에서, GSE39791에서는 간 절제술을 받은 동일 환자의 비종양조직 (Non tumor, n=72)과 재발성 간세포암 (Tumor, n=72)에 대하여 평가하였을 때, 대부분의 환자에서 TCIRG1의 발현이 비조양조직에 비해 간세포암 조직에서 더 높은 것을 확인할 수 있었고, ROC 분석 결과 AUC=0.64의 값으로 나타났다. 이에 상기 값을 토대로 cut-off 값을 도출한 결과, 도 20b에 나타낸 바와 같이, TCIRG1의 cut-off 값은 8.25인 것으로 나타났다(8.25, log2 expression).
따라서, TCIRG1 발현수준에 대한 컷오프 값이 8.25인 경우, 간 절제 후에도 간세포암이 재발될 수 있을 것으로 판단할 수 있다.
11.3. 간세포암의 진행 단계별 TCIRG1의 컷오프 값
간세포암 단계별(G1, G2, G3, G4) 환자의 암 조직을 입수하여, TCIRG1 발현수준을 정량분석 하였고, 컷 오프 값을 도출하였다. 참고로, 앞서 수행한 실험을 통해 TCGA_LIHC 코호트에서 간암의 병기가 높음에 따라 TCIRG1의 발현이 높은 것을 확인하였다. 각 간세포암 진행 단계별 TCIRG1에 대한 컷오프 값을 분석한 결과, G3(3기 간암) 및 G4(4기 간암)에서의 TCIRG1 발현량의 cut-off값은 11.3794 (log2 RSEM)인 것으로 나타났다(도 20c 참조).
따라서, 진행성 간암에서 TCIRG1 발현양에 대한 컷오프 값이 11.3794 인 경우, 말기 간암, 즉, 4기 간암인 것으로 판단할 수 있다.
또한, 간 세포암 진행 단계에 대해 정상 => 조기간암(eHCC) => 중기간암(avHCC)에 따른 컷 오프 값 분석 결과, 정상과 조기간암(eHCC)에서의 cut-off 값은 6.2821인 것으로 나타났고, 조기간암(eHCC)와 중기간암(avHCC)에서는 cut-off 값이 6.4371인 것으로 나타났다(도 20d 참조).
따라서, 이러한 결과를 통해 TCIRG1 발현양에 대한 컷오프 값이 6.2821인 경우에는 조기 간암으로 판단할 수 있고, 6.4371인 경우에는 중기간암으로 판단할 수 있다.
11.4. 간 절제술 후, 예후 진단을 위한 TCIRG1의 컷오프 값
마지막으로 TCIRG1의 발현수준 분석을 통해, 간 절제술 후의 환자에 대한 예후를 예측할 수 있는지 확인하기 위해 간 절제술 후 간세포암이 재발된 종양조직 및 재발되지 않은 조직에서의 TCIRG1의 발현수준을 측정하였고, 컷오프 값을 도출하였다.
그 결과, 도 20e에 나타낸 바와 같이, 간절제술 후 간암이 재발된 암 조직에서의 TCIRG1 발현수준은 간암이 재발되지 않은 조직에 비해 유의하게 증가되어 있는 것으로 확인되었고, 재발된 조직과 재발되지 않은 조직의 TCIRG1 발현양 컷오프 값은 2.5687인 것으로 나타났다.
따라서, 간 절제 수술 후, 환자로부터 수득한 조직에 대한 TCIRG1의 컷오프 값이 2.5687인 경우에는 간암 재발 가능성이 높고 예후가 좋지 못할 것으로 판단할 수 있다.

Claims (28)

  1. BANF1(barrier to autointegration factor 1), PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) 및 SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 조기 간암 진단용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 BANF1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 BANF1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, 상기 PLOD3 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 PLOD3 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, 상기 SF3B4 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 SF3B4 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제제는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4에 특이적인 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 측정은 전암성 병변에서 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 선택되는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 따른 조성물을 포함하는 조기 간암 진단 키트.
  7. 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는 조기 간암의 진단을 위한 정보 제공방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 시료는 전암성 병변 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현수준이 대조군 시료의 발현수준보다 증가하면 간암이 발병된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 TCIRG1 유전자는 서열번호 43 및 44의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 TCIRG1 단백질은 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 제제는 TCIRG1에 특이적인 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 선택되는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 간암 진단 또는 예후 예측은 간암의 진행, 재발, 전이 및 예후 평가를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 10 항에 따른 조성물을 포함하는 간암 진단 또는 예후 진단용 키트.
  16. 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자의 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 TCIRG1의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는 간암의 진단을 위한 정보 제공방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 시료는 조직, 전혈, 혈정 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 정보 제공방법은 TCIRG1의 발현수준이 대조군 시료에서의 발현수준보다 증가하면 간암의 재발, 종양성장 또는 전이 가능성이 높아 예후가 좋지 않을 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16 항에 있어서,
    상기 발현수준의 비교는 표준 또는 컷오프(cut-off) 값에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 16 항에 있어서,
    상기 정보 제공방법은 간암의 전이 가능성 판단에 대한 컷오프 값이 11.0112 인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 16 항에 있어서,
    상기 정보 제공방법은 조기 간암 판단에 대한 컷오프 값이 6.2821이고, 중기 간암 판단에 대한 컷오프 값이 6.4371이며, 말기 간암 판단에 대한 컷오프 값이 11.3794 인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 16 항에 있어서,
    상기 정보 제공방법은 간암 재발 가능성 판단에 대한 컷오프 값이 2.5687인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. BANF1(barrier to autointegration factor 1), PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) 및 SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 단백질에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 억제제는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4에 특이적인 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머 또는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자 또는 단백질에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 전이 및 재발 억제용 약학적 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 억제제는 TCIRG에 특이적인 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머 또는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. BANF1(barrier to autointegration factor 1), PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) 및 SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 단백질에 대한 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 간암의 예방 또는 치료 방법.
  28. TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자 또는 단백질에 대한 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 간암의 전이 및 재발 억제 방법.
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