JP6829888B2 - 非アルコール性脂肪性肝炎診断用キット及び試験方法 - Google Patents
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Description
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎マーカー及びその使用に関する。本願は、２０１５年１０月１３日に、日本に出願された特願２０１５−２０２４１８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
近年、食生活の欧米化と運動不足による肥満人口の増加に伴い、非アルコール性脂肪性肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease、ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis、ＮＡＳＨ）の患者が増加している。
ＮＡＦＬＤとは、飲酒歴がないにもかかわらずアルコール性肝障害に類似した脂肪性肝障害が認められる疾患である。ＮＡＦＬＤの約９０％は非進行で予後良好な単純性脂肪肝であるが、残りの約１０％は、肝硬変、肝細胞癌へと進行し得るＮＡＳＨに分類される（例えば、非特許文献１を参照）。
Khan F. Z., et al., Advances in hepatocellular carcinoma: Nonalcoholic steatohepatitis-related hepatocellular carcinoma., World J. Hepatol., 7 (18), 2155-2161, 2015.
ＮＡＳＨの病態に陥ると、肝臓の線維化が進行し、肝硬変へと進展する。しかしながら、肝臓の線維化が進行する機序はほとんどわかっていない。現在、ＮＡＳＨの診断方法としては、肝臓生検による侵襲的手法しか存在しない。このため、ＮＡＳＨを容易に診断できるマーカーの開発が求められている。そこで、本発明は、新たなＮＡＳＨマーカーを提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
（１）Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｃ−ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＰＣＰＥ−１）遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質からなる、ＮＡＳＨマーカー。
（２）ＰＣＰＥ−１タンパク質に対する特異的結合物質、ＰＣＰＥ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、又はＰＣＰＥ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、を備える、ＮＡＳＨ診断用キット。
（３）生体試料中の、ＰＣＰＥ−１遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質の発現量を定量する工程を備える、ＮＡＳＨの検出方法。
（１）Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｃ−ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＰＣＰＥ−１）遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質からなる、ＮＡＳＨマーカー。
（２）ＰＣＰＥ−１タンパク質に対する特異的結合物質、ＰＣＰＥ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、又はＰＣＰＥ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、を備える、ＮＡＳＨ診断用キット。
（３）生体試料中の、ＰＣＰＥ−１遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質の発現量を定量する工程を備える、ＮＡＳＨの検出方法。
本発明により、新たなＮＡＳＨマーカーを提供することができる。
［ＮＡＳＨマーカー］
１実施形態において、本発明は、ＰＣＰＥ−１遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質からなる、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）マーカーを提供する。
１実施形態において、本発明は、ＰＣＰＥ−１遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質からなる、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）マーカーを提供する。
ＰＣＰＥ−１遺伝子は、ＰＣＯＬＣＥ遺伝子とも呼ばれ、ＰＣＰＥ−１タンパク質をコードする遺伝子である。ヒトＰＣＰＥ−１遺伝子のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＭ＿００２５９３であり、マウスＰＣＰＥ−１遺伝子のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＭ＿００８７８８である。配列番号１にヒトＰＣＰＥ−１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号２にヒトＰＣＰＥ−１タンパク質のアミノ酸配列を示す。また、配列番号３にマウスＰＣＰＥ−１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を示し、配列番号４にマウスＰＣＰＥ−１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
実施例において後述するように、発明者らは、ＮＡＳＨ患者の血清中でＰＣＰＥ−１タンパク質の存在量が増加することを見出した。また、肥満ストレスにより、褐色脂肪組織特異的にＰＣＰＥ−１遺伝子の発現レベルが上昇することを明らかにした。
係る知見から、ＰＣＰＥ−１遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質をＮＡＳＨマーカーとして用いることができる。本実施形態のＮＡＳＨマーカーにより、ＮＡＳＨを簡便に診断することが可能になる。また、低侵襲に診断することが可能になる。
本実施形態のマーカーにより、ＮＡＳＨに罹患していることが疑われる患者に対しては、運動療法や食餌療法を積極的に行うことにより、肝硬変、肝細胞癌への進行を抑制又は防止することができる。
［ＮＡＳＨ診断用キット］
１実施形態において、本発明は、ＰＣＰＥ−１タンパク質に対する特異的結合物質、ＰＣＰＥ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、又はＰＣＰＥ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、を備える、ＮＡＳＨ診断用キットを提供する。
１実施形態において、本発明は、ＰＣＰＥ−１タンパク質に対する特異的結合物質、ＰＣＰＥ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、又はＰＣＰＥ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、を備える、ＮＡＳＨ診断用キットを提供する。
特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物にＰＣＰＥ−１タンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫することにより作製してもよい。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することもできる。
抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。
アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。ＰＣＰＥ−１タンパク質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、ＰＣＰＥ−１タンパク質に対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
特異的結合物質は、ＰＣＰＥ−１タンパク質に特異的に結合することができれば特に制限されず、市販のものであってもよい。また、特異的結合物質は、担体上に固定されてプロテインチップ等を構成していてもよい。
本実施形態のＮＡＳＨ診断用キットを用いて、生体試料中のＰＣＰＥ−１遺伝子の発現又はタンパク質の発現を検出することができる。ＰＣＰＥ−１遺伝子又はタンパク質の発現量が健常人と比較して上昇していた場合には、生体試料が由来する被検者がＮＡＳＨに罹患している可能性が高い。
プライマーセットとしては、診断対象の動物種のＰＣＰＥ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができるものであれば特に限定されない。例えば、ヒトＰＣＰＥ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマーとしては、配列番号５に示す塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーのセット等が挙げられる。
ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブとしては、ＰＣＰＥ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。
生体試料としては、血清、血漿、尿、組織等が挙げられる。組織としては、褐色脂肪組織、肝臓生検等が挙げられる。生体試料が、血清、血漿、尿等である場合、本実施形態のＮＡＳＨ診断用キットは、上記の特異的結合物質であってもよい。この場合、低侵襲で簡便にＮＡＳＨの診断を行うことができる。また、生体試料が組織等である場合、本実施形態のＮＡＳＨ診断用キットは、上記のプライマーセット又はプローブを備えるものであることが好ましい。
［ＮＡＳＨの検出方法］
１実施形態において、本発明は、生体試料中の、ＰＣＰＥ−１遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質の発現量を定量する工程を備える、ＮＡＳＨの検出方法を提供する。本実施形態の検出方法は、ＮＡＳＨの診断方法であるということもできる。
１実施形態において、本発明は、生体試料中の、ＰＣＰＥ−１遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質の発現量を定量する工程を備える、ＮＡＳＨの検出方法を提供する。本実施形態の検出方法は、ＮＡＳＨの診断方法であるということもできる。
生体試料は、上述したものと同様である。ＰＣＰＥ−１遺伝子の発現量の定量方法としては、ＰＣＰＥ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ；ＰＣＰＥ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを固定したマイクロアレイによる遺伝子発現解析；ＰＣＰＥ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを用いたノーザンブロッティング等が挙げられる。
また、ＰＣＰＥ−１タンパク質の発現量の定量方法としては、ＰＣＰＥ−１タンパク質に対する特異的結合物質を用いたウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、逆相タンパク質アレイを用いた検出等が挙げられる。なお、逆相タンパク質アレイを用いた検出とは、試料を固相にアレイ状に固定し、特定物質に対する特異的結合物質を反応させることにより、試料中の特定物質を検出する解析方法である。
本実施形態の検出方法は、生検試料がＮＡＳＨ患者由来のものであるか否かを判定する方法であるということもできる。すなわち、生検試料中のＰＣＰＥ−１遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質の発現量が、健常人由来の生検試料中のＰＣＰＥ−１遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質の発現量と比較して高い場合、生検試料はＮＡＳＨ患者由来のものであると判定することができる。
また、生体試料中のＰＣＰＥ−１タンパク質の発現量は、生体試料中のＰＣＰＥ−１タンパク質の存在量といい換えることもできる。実施例において後述するように、ＰＣＰＥ−１タンパク質は、褐色脂肪組織で転写、翻訳、分泌され、血流を通じて肝臓に到達するものと考えられる。
ＮＡＳＨを検出する場合には標準を設けてもよい。このような標準としては、例えば、健常人由来の生体試料等が挙げられる。健常人と比較して、ＰＣＰＥ−１遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質の発現量が高い場合、被検者はＮＡＳＨに罹患している可能性が高い。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（褐色脂肪組織から分泌されるタンパク質の探索）
発明者らは、褐色脂肪組織から分泌されるタンパク質を解析した。その結果、ＮＡＳＨマーカーを見出した。本実験例の内容について、以下に、より詳細に説明する。
（褐色脂肪組織から分泌されるタンパク質の探索）
発明者らは、褐色脂肪組織から分泌されるタンパク質を解析した。その結果、ＮＡＳＨマーカーを見出した。本実験例の内容について、以下に、より詳細に説明する。
脂肪組織には、褐色脂肪組織と白色脂肪組織が存在する。褐色脂肪組織は熱産生器官であることが知られているが、内分泌器官としての機能についてはほとんど知られていなかった。そこで、発明者らは、褐色脂肪組織の内分泌器官としての機能を検討するために、ＤＮＡマイクロアレイ解析により褐色脂肪組織が分泌するタンパク質を探索した。
具体的には、４週齢のマウスに高脂肪食を８ヶ月間与えた肥満マウスモデルの褐色脂肪組織、及び脂肪組織特異的に低酸素状態にしたマウスの褐色脂肪組織において、共通に発現する分泌タンパク質を探索した。脂肪組織特異的に低酸素状態にしたマウスの褐色脂肪組織を用いたのは、肥満マウスの脂肪組織は低酸素状態になることが知られているためである。つまり、肥満させる以外の方法で脂肪組織を低酸素状態にしたマウスの褐色脂肪組織を用いた。より具体的には、脂肪組織特異的にVascular Endothelial Growth Factor（ＶＥＧＦ）−Ａをノックアウトしたマウスを用いた。
肥満食を与えた肥満マウスモデルの褐色脂肪組織で発現が上方制御される遺伝子の情報としては、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の遺伝子発現情報データベース（Gene Expression Omnibus；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）にアクセッション番号ＧＳＥ２８４４０として公開されている情報を使用した。
その結果、褐色脂肪組織が分泌するタンパク質として、２３種類のタンパク質が同定された。それらのタンパク質のうちの１つがＰＣＰＥ−１遺伝子であった。
［実験例２］
（肥満ストレスで褐色脂肪組織におけるＰＣＰＥ−１の発現レベルが上昇した）
４週齢のマウスに高脂肪食を８週間与えた肥満マウスモデルの各臓器におけるＰＣＰＥ−１遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。対照として通常食を与えたマウスを使用した。マウスＰＣＰＥ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーとしては、センスプライマー（配列番号７）及びアンチセンスプライマー（配列番号８）を使用した。また、臓器としては、褐色脂肪組織、白色脂肪組織、肝臓、心臓、腎臓、肺、筋、脾臓を用いた。
（肥満ストレスで褐色脂肪組織におけるＰＣＰＥ−１の発現レベルが上昇した）
４週齢のマウスに高脂肪食を８週間与えた肥満マウスモデルの各臓器におけるＰＣＰＥ−１遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。対照として通常食を与えたマウスを使用した。マウスＰＣＰＥ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーとしては、センスプライマー（配列番号７）及びアンチセンスプライマー（配列番号８）を使用した。また、臓器としては、褐色脂肪組織、白色脂肪組織、肝臓、心臓、腎臓、肺、筋、脾臓を用いた。
図１は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図中、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差があることを示す。その結果、肥満ストレスにより、褐色脂肪組織特異的にＰＣＰＥ−１遺伝子の発現レベルが上昇することが明らかとなった。
続いて、ＰＣＰＥ−１のタンパクレベルでの発現を検討した。４週齢のマウスに高脂肪食を８ヶ月間与えた肥満マウスモデル及び通常食を与えた対照のマウス由来の褐色脂肪組織からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティング法によりＰＣＰＥ−１タンパク質を検出した。ＰＣＰＥ−１タンパク質の検出には、抗ＰＣＰＥ−１抗体（型式「ＭＡＢ２２３９」、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を使用した。また、ローディングコントロールとして、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）タンパク質を検出した。ＧＡＰＤＨタンパク質の検出には、抗ＧＡＰＤＨ抗体（型式「＃３６８３Ｓ」、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用した。
図２は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、肥満ストレスにより、褐色脂肪組織特異的にＰＣＰＥ−１タンパク質の発現レベルが上昇することが明らかとなった。
［実験例３］
（肥満ストレスで血漿中のＰＣＰＥ−１レベルが上昇した）
４週齢のマウスに高脂肪食を８ヶ月間与えた肥満マウスモデル及び通常食を与えた対照のマウスの血漿中のＰＣＰＥ−１タンパク質の量をＥＬＩＳＡ法により定量した。ＰＣＰＥ−１タンパク質の定量には、市販のキット（型式「ＤＬ−ＰＣＰＥ１−Ｍｕ」、ＤＬＤＥＶＥＬＯＰ社）を使用した。
（肥満ストレスで血漿中のＰＣＰＥ−１レベルが上昇した）
４週齢のマウスに高脂肪食を８ヶ月間与えた肥満マウスモデル及び通常食を与えた対照のマウスの血漿中のＰＣＰＥ−１タンパク質の量をＥＬＩＳＡ法により定量した。ＰＣＰＥ−１タンパク質の定量には、市販のキット（型式「ＤＬ−ＰＣＰＥ１−Ｍｕ」、ＤＬＤＥＶＥＬＯＰ社）を使用した。
図３はマウスＰＣＰＥ−１タンパク質の定量結果を示すグラフである。図中、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差があることを示す。その結果、肥満ストレスにより、血漿中のＰＣＰＥ−１タンパク質の存在量が上昇することが明らかとなった。
［実験例４］
（肥満ストレスにより肝臓におけるＰＣＰＥ−１レベルが上昇した）
４週齢のマウスに高脂肪食を８ヶ月間与えた肥満マウスモデルの肝臓における、ＰＣＰＥ−１タンパク質の存在を、ウエスタンブロッティング法により検出した。対照として通常食を与えたマウスの肝臓を使用した。ＰＣＰＥ−１タンパク質の検出には、抗ＰＣＰＥ−１抗体（型式「ＭＡＢ２２３９」、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を使用した。また、ローディングコントロールとして、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）タンパク質を検出した。ＧＡＰＤＨタンパク質の検出には、抗ＧＡＰＤＨ抗体（型式「＃３６８３Ｓ」、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用した。
（肥満ストレスにより肝臓におけるＰＣＰＥ−１レベルが上昇した）
４週齢のマウスに高脂肪食を８ヶ月間与えた肥満マウスモデルの肝臓における、ＰＣＰＥ−１タンパク質の存在を、ウエスタンブロッティング法により検出した。対照として通常食を与えたマウスの肝臓を使用した。ＰＣＰＥ−１タンパク質の検出には、抗ＰＣＰＥ−１抗体（型式「ＭＡＢ２２３９」、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を使用した。また、ローディングコントロールとして、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）タンパク質を検出した。ＧＡＰＤＨタンパク質の検出には、抗ＧＡＰＤＨ抗体（型式「＃３６８３Ｓ」、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用した。
図４は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、肥満ストレスにより、肝臓におけるＰＣＰＥ−１タンパク質の存在量が上昇することが明らかとなった。実験例２で示されたように、肥満ストレスを与えても肝臓におけるＰＣＰＥ−１遺伝子の発現の上昇は認められない。したがって、本実験例で検出されたＰＣＰＥ−１タンパク質は肝臓以外の場所で発現されたものであると考えられた。
［実験例５］
（ＮＡＳＨ患者の血清中でＰＣＰＥ−１レベルが上昇した）
ＮＡＳＨ患者の血清中のＰＣＰＥ−１タンパク質の量を定量した（ｎ＝４６）。また、同時に、健常人（ｎ＝２９）及び肥満患者(ＢＭＩ２５以上)（ｎ＝２２）の血清中のＰＣＰＥ−１タンパク質の量を定量した。ＰＣＰＥ−１タンパク質の定量には、市販のキット（型式「ＭＢＳ７２２８３６」、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社）を使用した。
（ＮＡＳＨ患者の血清中でＰＣＰＥ−１レベルが上昇した）
ＮＡＳＨ患者の血清中のＰＣＰＥ−１タンパク質の量を定量した（ｎ＝４６）。また、同時に、健常人（ｎ＝２９）及び肥満患者(ＢＭＩ２５以上)（ｎ＝２２）の血清中のＰＣＰＥ−１タンパク質の量を定量した。ＰＣＰＥ−１タンパク質の定量には、市販のキット（型式「ＭＢＳ７２２８３６」、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社）を使用した。
図５はＰＣＰＥ−１タンパク質の定量結果を示すグラフである。図中、「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。その結果、ＮＡＳＨ患者の血清中では、ＰＣＰＥ−１タンパク質の存在量が上昇することが明らかとなった。この結果は、ＰＣＰＥ−１タンパク質がＮＡＳＨマーカーであることを示す。
［実験例６］
（ＰＣＰＥ−１は肝星細胞によるＩ型コラーゲンの分泌を促進した）
ＮＡＳＨ患者の肝臓においてＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−βの発現が上昇することが知られている。そこで、ヒト肝星細胞株ＬＸ−２を、終濃度１．０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β（型式「２４０−Ｂ−００２」、Ｒ＆Ｄ社）の存在下で培養した。上記の細胞の培地に、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｎ＝４）又は終濃度８．５μＭのＰＣＰＥ−１タンパク質（型式「２６２７−ＰＥ−０２０」、Ｒ＆Ｄ社）（ｎ＝４）を添加して２４時間培養し、Ｉ型コラーゲンの分泌量を定量した。対照として、ＴＧＦ−βの非存在下で培養したＬＸ−２細胞の培地に、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｎ＝６）又は終濃度８．５μＭのＰＣＰＥ−１タンパク質（ｎ＝８）を添加して２４時間培養し、Ｉ型コラーゲンの分泌量をＥＬＩＳＡ法により定量した。Ｉ型コラーゲンの定量には市販のキット（型式「ＡＣＥ−ＥＣ１−Ｅ２０５−ＥＸ」、コスモバイオ社）を使用した。
（ＰＣＰＥ−１は肝星細胞によるＩ型コラーゲンの分泌を促進した）
ＮＡＳＨ患者の肝臓においてＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−βの発現が上昇することが知られている。そこで、ヒト肝星細胞株ＬＸ−２を、終濃度１．０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β（型式「２４０−Ｂ−００２」、Ｒ＆Ｄ社）の存在下で培養した。上記の細胞の培地に、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｎ＝４）又は終濃度８．５μＭのＰＣＰＥ−１タンパク質（型式「２６２７−ＰＥ−０２０」、Ｒ＆Ｄ社）（ｎ＝４）を添加して２４時間培養し、Ｉ型コラーゲンの分泌量を定量した。対照として、ＴＧＦ−βの非存在下で培養したＬＸ−２細胞の培地に、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｎ＝６）又は終濃度８．５μＭのＰＣＰＥ−１タンパク質（ｎ＝８）を添加して２４時間培養し、Ｉ型コラーゲンの分泌量をＥＬＩＳＡ法により定量した。Ｉ型コラーゲンの定量には市販のキット（型式「ＡＣＥ−ＥＣ１−Ｅ２０５−ＥＸ」、コスモバイオ社）を使用した。
図６は、Ｉ型コラーゲンの分泌量の定量結果を示すグラフである。図中、「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示し、「＊＊」は、危険率１％未満で有意差があることを示す。
その結果、ＰＣＰＥ−１タンパク質の添加により、ＬＸ−２細胞によるＩ型コラーゲンの分泌量が増加することが明らかとなった。この結果は、ＰＣＰＥ−１タンパク質が、肝臓の線維化に関与することを示す。
本発明により、新たなＮＡＳＨマーカーを提供することができる。
Claims (3)
- Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｃ−ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＰＣＰＥ−１）タンパク質に対する特異的結合物質、
ＰＣＰＥ−１遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、又は
ＰＣＰＥ−１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、
を備える、非アルコール性脂肪性肝炎診断用キット。 - 被験者由来の褐色脂肪組織試料におけるＰＣＰＥ−１遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記発現量が、健常人由来の褐色脂肪組織におけるＰＣＰＥ−１遺伝子又はＰＣＰＥ−１タンパク質の発現量と比較して有意に高いことが、前記被験者が非アルコール性脂肪性肝炎に罹患している可能性が高いことを示す、褐色脂肪組織試料の試験方法。
- 被験者由来の血清又は血漿中のＰＣＰＥ−１タンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記発現量が、健常人由来の血清又は血漿中のＰＣＰＥ−１タンパク質の発現量と比較して有意に高いことが、前記被験者が非アルコール性脂肪性肝炎に罹患している可能性が高いことを示す、血清又は血漿の試験方法。
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