FR3133609A1 - Ligands spécifiques de la glycoprotéine PCPE-1 et leurs utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente demande concerne un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un nanocorps. Elle concerne également un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1, caractérisé en ce qu’il inhibe son activité. Figure à publier avec l’abrégé : Fig 3A
Description
La présente invention concerne des ligands spécifiques de la protéine PCPE-1 (Procollagen C-proteinase enhancer-1). Elle concerne également leur utilisation en imagerie médicale et dans des méthodes de diagnostic et de traitement. Plus particulièrement elle porte sur deux types de ligands : certains capables de se lier à PCPE-1 pour une utilisation en imagerie, et d’autres ligands dit antagonistes capables de se lier à PCPE-1 et d’inhiber son activité, pour une utilisation en thérapeutique. Dans un mode de réalisation de l’invention, ces ligands antagonistes sont utilisés pour le diagnostic et le traitement des fibroses et du cancer.
Les collagènes fibrillaires sont les protéines les plus abondantes dans le corps humain et les principaux composants des matrices extracellulaires. Ils façonnent les organes et les tissus et jouent un rôle crucial dans le maintien de leur homéostasie ou de leur réparation après des blessures. Longtemps considérés comme ayant un rôle structurel dans les tissus, les collagènes sont maintenant reconnus comme étant des acteurs à part entière de nombreux processus cellulaires tels que l’adhésion, la prolifération, la migration et la différenciation cellulaire.
Cependant ces collagènes sont également associés à de nombreux processus pathologiques et sont des cibles de choix pour le développement de nouveaux outils de diagnostic ou de nouveaux traitements.
Ainsi, la fibrose, qui se caractérise par un dépôt excessif de matrice extracellulaire composée principalement de fibres de collagène, est un dénominateur commun majeur de nombreuses pathologies qui affecte fortement la progression de la maladie, l’efficacité et la délivrance de thérapies (Henderson et coll. 2020). Par ailleurs, la production de collagène anormal par des cellules tumorales ou par le microenvironnement joue un rôle majeur dans l’échappement immunitaire de ces cellules et contribue fortement à leur capacité métastatique ainsi qu’à leur dormance et leur résistance aux traitements (Shi et coll. 2022).
De fait, le ciblage du collagène et plus précisément de toutes les étapes clés permettant sa biosynthèse, sa sécrétion, sa maturation ou sa macrostructuration sont autant de cibles d’intérêt pour limiter la production excessive de collagène associée à ces processus. On peut citer LARP6, le complexe P4H, l’HSP47, SHMT2, les LOX, … (Shi et coll. 2022). Parmi les cibles évoquées, celles impliquées dans la maturation protéolytique des régions N- et C-terminales semblent particulièrement intéressantes. Ainsi les BTP (bone morphogenetic protein-1 (BMP1)/tolloid-like proteinases) sont les principales protéases responsables de l'élimination des C-propeptides des procollagènes fibrillaires, généralement considérée comme l'étape limitant la vitesse de formation des fibrilles de collagène de type 1. Cependant, bien que les BTP soient des cibles de choix, elles possèdent, outre les collagènes, une activité dirigée contre de nombreux autres substrats impliqués dans plusieurs voies (activation de facteurs de croissance, angiogenèse, minéralisation, progression tumorale...), ce qui signifie qu'inhiber leur activité pourrait entraîner des effets secondaires indésirables.
Un autre régulateur clé de la fibrillogenèse du collagène est PCPE-1 (Procollagen C-Proteinase Enhancer-1), une glycoprotéine sécrétée qui stimule spécifiquement le traitement C-terminal du procollagène fibrillaire par les BTP. PCPE-1 est composé de deux domaines CUB (Complement-Uegf-BMP-1) et d'un domaine C-terminal NTR (Netrin-like), séparés par un long linker. Les domaines CUB sont nécessaires et suffisants pour l'activité de PCPE-1 (Kronenberg 2009 ; Vadon 2011) et cela est dû à leur interaction directe et étroite avec le C-propeptide des procollagènes. On pense que cette interaction permet la déstructuration locale du trimère du procollagène qui facilite le clivage par les BTP, et explique pourquoi PCPE-1 n'a aucun effet sur les autres substrats de BMP-1. Par ailleurs, des données ont décrit la surexpression de PCPE-1 dans différents contextes fibrotiques (Lagoutte et al. Matrix Biol Plus 2021), la désignant comme une cible prometteuse pour suivre et/ou traiter la fibrose. En particulier, une corrélation entre le taux d’expression de PCPE-1 et les fibroses, en particulier la fibrose cardiaque, a été établie (Lagoutte et al., BioRxiv, 2021). La détection directe de PCPE-1 dans les fluides biologiques par immuno-essai a également été proposée comme méthode de diagnostic (US2012270246 pour la formation des os, WO2017065206A1 pour la NASH).
Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode robuste pour détecter PCPE-1 de manière non invasive dans les tissus, et ainsi suivre l’accumulation du collagène fibrotique. D’autre part, l’absence d’outils performants permettant d’inhiber l’action de PCPE-1 empêchait jusqu’à présent d’évaluer une stratégie pharmacologique ciblant cette protéine.
De plus, à ce jour, aucun médicament capable de bloquer l'interaction entre PCPE-1 et les C-propeptides du procollagène n'a été rapporté.
Au niveau du diagnostic de la fibrose cardiaque, l’analyse histologique de biopsies cardiaques reste la technique traditionnelle, malgré son caractère invasif et le fait que cette technique ne permet d’analyser qu’une petite portion du tissu cardiaque, pas forcément représentative de l’ensemble. L’utilisation de l’IRM associée à l’injection de gadolinium permet désormais l’imagerie de grandes zones fibrotiques mais n’est pas complètement spécifique de la fibrose, et ne détecte pas la fibrose interstitielle.
Une des caractéristiques des pathologies fibrosantes et des cancers est leur caractéristique évolutive, ce qui implique que même si, notamment dans le cas de la fibrose elle est la résultante d’un stress ou d’une blessure, la production excessive de collagène est continue et ne conduit à des effets pathologiques et fonctionnels qu’au terme d’une période parfois très longue. De-là un besoin important de pouvoir détecter précocement et suivre dans le temps l’évolution de cette production excessive de collagène. A ce titre, l’imagerie moléculaire, couplée à des systèmes de détection de plus en plus sensibles (imagerie isotopique, fluorescence, …), apparaît aujourd’hui comme un outil indispensable pour le suivi longitudinal de ces pathologies ainsi que pour le suivi de l’effet thérapeutique de nouveaux traitements.
A ce jour, la principale approche retenue pour l’imagerie moléculaire directe du collagène, notamment dans des contextes fibrotiques, repose sur l’utilisation de sondes ciblant directement le collagène, principalement par hybridation. On peut citer les peptides collagelin, EP-3533 ou CBP8 (Désogèreet al., 2019).
Bien que les résultats soient prometteurs, d’autres voies indirectes, comme celle décrite dans la présente invention, présenteraient des avantages certains en limitant possiblement le rapport signal/bruit de fond. C’est le cas notamment des sondes ciblant les récepteurs intégrines au collagène.
Le recours à des immunoglobulines pour le ciblage de protéines d’intérêt a largement fait ses preuves, aussi bien dans une finalité thérapeutique que d’imagerie moléculaire et celles-ci représentent aujourd’hui la majorité des biomédicaments commercialisés. Au cours des dernières années, les échafaudages d'immunoglobulines, dépourvus des propriétés indésirables des immunoglobulines conventionnelles (grand poids moléculaire, composition hétérotétramérique, liaisons disulfure), sont apparus comme des alternatives aux anticorps classiques. Parmi eux, les nanocorps, également appelés VHH (Variable Heavy-chain domains of Heavy-chain antibodies), dérivés de la chaîne lourde des immunoglobulines de camélidés, découverts au début des années 90, ont démontré leur intérêt aussi bien en thérapeutique qu’en diagnostic (Muyldermans 2021). Les nanocorps sont les plus petits fragments d'anticorps (environ 15 kDa), hautement solubles et stables, ils peuvent être facilement produits en grande quantité dans des systèmes procaryotes. De plus, leur paratope convexe est bien adapté pour se lier aux cavités difficiles à cibler à la surface de l'antigène.
Trois types d’approches peuvent être utilisés pour sélectionner des nanocorps spécifiques d'un antigène : à partir de banques immunitaires, de banques naïves ou de banques synthétiques. Une banque immunitaire est générée par l'immunisation d'un camélidé avec la cible. Ce sont les banques de nanocorps les plus utilisées, avec cependant une limite pour certaines cibles qui ne sont pas immunogènes ou trop toxiques pour l'immunisation des animaux. En raison de ces limitations, plusieurs banques synthétiques ont été développées. Une sélection peut être effectuée parmi ces banques, pour identifier des nanocorps spécifiques d’une ou plusieurs protéine(s) cible(s). A ce jour, plus de 1400 VHH ont été sélectionnés avec succès et sont utilisés comme outils de recherche, dans des applications biotechnologiques ou diagnostiques.
La présente invention concerne un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un nanocorps, aussi désigné par l’abbréviation VHH (Variable domain of the Heavy chain of Heavy chain-only antibodies).
La présente invention est également relative à un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1, caractérisé en ce qu’il inhibe son activité. Ce ligand spécifique est également dénommé ligand antagoniste de PCPE-1. Il s’agit en particulier d’un nanocorps antagoniste de PCPE-1.
Un autre objet de l’invention est un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 constitué d’une combinaison de deux ou trois nanocorps tels que décrits ci-dessus.
La présente invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un nanocorps ou une combinaison de deux ou trois nanocorps, tel(le) que décrit(e) dans la présente demande.
La présente invention a également pour objet un ligand spécifique antagoniste de la glycoprotéine PCPE-1 pour son utilisation en tant que médicament, et plus spécifiquement pour son utilisation médicale dans le traitement du cancer ou d’une fibrose, notamment de la fibrose cardiaque.
La présente invention concerne aussi un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 tel que décrit dans la présente demande, caractérisé en ce qu’il est couplé à un marqueur détectable, notamment un marqueur utilisé en imagerie médicale.
Un autre objet de l’invention est l’utilisation d’un tel ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 couplé à un marqueur détectable, pour le suiviin vivod’un état pathologique par imagerie médicale.
Un autre objet de l’invention est un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 tel que décrit ci-dessus, pour son utilisation théranostique pour le traitement et le suiviin vivod’un état pathologique par imagerie médicale.
Enfin, la présente demande concerne un kit pour déterminer l’activité et/ou la quantité de la glycoprotéine PCPE-1 dans un échantillon biologiquein vitroouex vivo, comprenant :
- un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 tel que décrit ci-dessus, et
- des réactifs de détection.
- un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 tel que décrit ci-dessus, et
- des réactifs de détection.
Figure 1: Caractérisation par SPR de l’interaction PCPE-1 / VHHs
D, E : Les interactions sont modélisées (en pointillé) à l’aide du modèle de Langmuir (logiciel Biacore T200 Evaluation, Cytiva)
Figure 3: Inhibition de l’activité de PCPE-1 par les VHHs
Figure 4: Caractérisation du diacorps D1 (H4-GS 8 -I5) de séquence SEQ ID NO. 21
La présente invention concerne un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un nanocorps (aussi dit VHH).
La glycoprotéine PCPE-1 (Procollagen C-proteinase enhancer-1) est un régulateur clé de la fibrillogenèse des collagènes. La protéine humaine est référencée dans la base UniProt sous la référence Q15113, où sa séquence polypeptidique est décrite.
Les collagènes sont synthétisés sous la forme de précurseurs solubles désignés pro-collagènes. Ces derniers subissent une maturation protéolytique avant de pouvoir s’assembler sous forme de fibres de collagène. Cette étape limitante est régulée par la glycoprotéine PCPE-1, qui stimule spécifiquement le traitement C-terminal du procollagène fibrillaire par les protéases BTP, responsables de l'élimination des C-propeptides des procollagènes fibrillaires. Pour cela, PCPE-1 interagit de manière étroite avec le C-propeptide du collagène via ses deux domaines CUB (Complement-Uegf-BMP-1).
Le terme « ligand spécifique » désigne un composé interagissant avec une protéine de manière non-covalente, réversible et spécifique.
Un ligand est dit « spécifique » lorsqu’il présente une affinité, c’est-à-dire une force d’interaction entre ledit ligand et la protéine cible, jugée comme suffisamment forte. L’affinité est quantitativement mesurée par la constante d’équilibre association/dissociation, également appelée constante d’affinité ou constante de dissociation à l’équilibre, en abrégé « KD». Plus la valeur KDest basse, plus l'affinité de liaison entre le ligand et sa protéine cible est élevée.
Au sens de la présente invention, un ligand est considéré comme se liant spécifiquement à PCPE-1 si sa constante d’affinité KDest inférieure à 100 nM, ou inférieure à 80 nM, ou inférieure à 50 nM, et plus préférentiellement si elle est inférieure à 30 nM.
Un nanocorps désigne un anticorps à domaine unique, qui correspond à un fragment d'anticorps composé d'un seul domaine d'anticorps variable monomère, qui correspond au domaine variable de la chaîne lourde unique d'anticorps du type de ceux trouvés chez les camélidés, qui sont naturellement dépourvus de chaînes légères. Un nanocorps est capable de se lier sélectivement à un antigène spécifique. Il présente l’avantage de présenter un poids moléculaire de seulement 12 à 15 kDa, soit environ 10 fois moins que les anticorps communs qui ont un poids moléculaire de 150 à 160 kDa. Un nanocorps est également bien moins encombrant qu’un anticorps classique. De plus, le procédé de synthèse, notamment en cellules bactériennes, est facilité du fait de cette structure simplifiée. Les premiers anticorps à domaine unique ont été conçus à partir d'anticorps à chaîne lourde trouvés chez les camélidés ; ceux-ci sont désignés fragments VHH.
Dans la présente demande, les termes nanocorps et VHH sont utilisés indifféremment et désignent tous deux un anticorps à domaine unique.
Les nanocorps ont chacun trois CDRs, désignés CDR1, CDR2, et CDR3 respectivement.
Les nanocorps selon l'invention peuvent en particulier être des nanocorps de lama ou des nanocorps synthétiques.
Une combinaison de deux nanocorps, couplés de façon covalente, avec ou sans peptide de liaison, est désignée par le terme « diabody » ou « diacorps » en français, ou encore par le terme « nanocorps bivalent ».
Une combinaison de trois nanocorps est désignée par le terme « tribody » ou « tricorps » en français, ou encore « nanocorps trivalent ».
D’autres ligands spécifiques de la glycoprotéine PCPE-1 sont également inclus dans l’invention, notamment toute structure protéique équivalente à un nanocorps, à l’exclusion des anticorps. Des exemples de telles structures protéiques («protein scaffold») capables de se lier spécifiquement à des épitopes cibles sont présentés dans la revue de (Gebauer & Skerra, 2019)
L’invention concerne également un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1, caractérisé en ce qu’il inhibe son activité, en particulier en inhibant son interaction avec le domaine C-terminal des procollagènes.
En effet, certains ligands spécifiques de PCPE-1 ont, outre la capacité de se lier à cette glycoprotéine, la capacité d’inhiber l’activité de ladite glycoprotéine PCPE-1. On les désigne alors « ligands antagonistes de PCPE-1 ».
Le terme « antagoniste » désigne un composé interagissant avec une protéine cible présentant une activité physiologique, en diminuant voire en supprimant l’activité physiologique de ladite protéine.
Comme cela est montré dans l’exemple 3, une inhibition significative de l’activité de PCPE-1 correspond à :
- soit une inhibition de son interaction avec les domaines C-terminaux du procollagène ;
- soit une action inhibitrice sur le clivage du procollagène, qui est en conditions normales stimulé par l’action de PCPE-1.
- soit une inhibition de son interaction avec les domaines C-terminaux du procollagène ;
- soit une action inhibitrice sur le clivage du procollagène, qui est en conditions normales stimulé par l’action de PCPE-1.
Plus particulièrement, cette inhibition de l’activité se caractérise par une inhibition de l’interaction de PCPE-1 avec les domaines C-terminaux du procollagène.
Cette inhibition de l’activité de PCPE-1 est considérée comme étant significative dès lors qu’elle est supérieure à 40%, voire d’au moins 50%, et préférentiellement supérieure à 60%.
Ces ligands antagonistes de PCPE-1 pourront être de toute nature, et notamment être des composés chimiques synthétiques, des acides nucléiques, ou encore des structures protéiques, et en particulier une chaine polypeptidique.
Selon une mise en œuvre préférée, le ligand antagoniste de PCPE-1 est une chaine polypeptidique, et en particulier est un nanocorps (VHH). Il est entendu que toute structure polypeptidique équivalente à un nanocorps est incluse dans l’invention.
Les inventeurs ont identifié deux familles de nanocorps possédant soit une activité de liaison à PCPE-1 pour une utilisation en imagerie médicale et en diagnostic, soit une activité de liaison et une activité inhibitrice de PCPE-1 pour une utilisation comme médicament.
Ces nanocorps ont été sélectionnés à partir d’une banque synthétique de nanocorps ou après immunisation d’un lama et possèdent une activité de liaison à PCPE-1 mesurée par résonance plasmonique de surface comme présenté dans la Figure 1. Ils ont été sélectionnés pour posséder un KDinférieur à 100 nM et plus précisément inférieur à 30 nM (voir tableau 2 dans les exemples).
Ces nanocorps ont été séquencés, ainsi que leurs CDRs ; les séquences sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous.
| SEQ ID NO. | Séquence polypeptidique | Objet |
| 1 | FTSEISN |
CDR1 de H4 |
| 2 | GTHTTQT |
CDR2 de H4 |
| 3 | AEQDMSDLWLGS |
CDR3 de H4 |
| 4 | YGWWIYE |
CDR1 de H10 |
| 5 | WADGTRT |
CDR2 de H10 |
| 6 | IYILEGTQGVPI |
CDR3 de H10 |
| 7 | NIFSSNT |
CDR1 de I5 |
| 8 | ISKGGSTN |
CDR2 de I5 |
| 9 | NPVPDSDNYASGQG |
CDR3 de I5 |
| 10 | SIFSSNV |
CDR1 de I7 |
| 11 | ISRGGGTN |
CDR2 de I7 |
| 12 | PIPYSGDYVSGQG |
CDR3 de I7 |
| 13 | STFSMNV |
CDR1 de I3 |
| 14 | IGTGGGTN |
CDR2 de I3 |
| 15 | NKIPHNWGWGQG |
CDR3 de I3 |
| 16 | MAEVQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASGFTSEISNMGWFRQAPGKEREFVSAISGTHTTQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAAEQDMSDLWLGSYWGQGTQVTVSS | H4 |
| 17 | MAEVQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASGYGWWIYEMGWFRQAPGKEREFVSAISWADGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAIYILEGTQGVPIYWGQGTQVTVSS | H10 |
| 18 | MAQVQLVESGGGLVQPGGFLRLLCTASGNIFSSNTMGWYRRAPGKQREWVASISKGGSTNYADSVKDRFTISRSITKNTVYLQMVNLKPEDTAVYYCNPVPDSDNYASGQGTQVTVSS | I5 |
| 19 | MAQVQLVESGGGLVPPGGSLKLSCTASGSIFSSNVMGWYRRAPGKQREWVASISRGGGTNYPDSVKGRFTVSRDIAKNTVYLQISSLKPEDTAVYYCNPIPYSGDYVSGQGTQVTVSS | I7 |
| 20 | MAQVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAVSGSTFSMNVMGWYRQAPGKHREWVGSIGTGGGTNYPDSVKGRFTISRDNVKKTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNKIPHNWGWGQGTQVTVSS | I3 |
| 21 | MAEVQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASGFTSEISNMGWFRQAPGKEREFVSAISGTHTTQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAAEQDMSDLWLGSYWGQGTQVTVSSAAAGSGSGSGSGSGSGGSQVQLVESGGGLVQPGGFLRLLCTASGNIFSSNTMGWYRRAPGKQREWVASISKGGSTNYADSVKDRFTISRSITKNTVYLQMVNLKPEDTAVYYCNPVPDSDNYASGQGTQVTVSS | D1 = H4 + I5 |
| 22 | MAEVQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASGRTWSFYAMGWFRQAPGKEREFVSAISWNGGGEHYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAHMEFSQSDYIISKWIYWGQGTQVTVSS | H1 |
| 23 | MAEVQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASGSTSRDEGMGWFRQAPGKEREFVSAISRDHGWREYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAPVIIDTMEVIPLYWGQGTQVTVSS | H2 |
| 24 | MAEVQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASGATYWFSSMGWFRQAPGKEREFVSAISYWFDDIEYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAMWNEQTGEEYWGQGTQVTVSS | H3 |
| 25 | MAEVQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASGGTSFAYDMGWFRQAPGKEREFVSAISRSNSDINYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAEAIFWGHEVIPLYWGQGTQVTVSS | H5 |
| 26 | MAEVQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASGFTSARYNMGWFRQAPGKEREFVSAISRHTDRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAVGMMPKQKQYWGQGTQVTVSS | H6 |
| 27 | MAEVQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASGYYFRGEDMGWFRQAPGKEREFVSAISDDSTATIYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAPGWYIYLDWSESGSAYWGQGTQVTVSS | H7 |
| 28 | MAEVQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASGYTSDLTVMGWFRQAPGKEREFVSAISSHFGPPHYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAMRERRHSWWYWGQGTQVTVSS | H8 |
| 29 | MAEVQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASGDTFNLTTMGWFRQAPGKEREFVSAISSSNTHIAYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCAYTYYGKNGKGMVYWGQGTQVTVSS | H9 |
| 30 | MAQVQLVESGGGLVQAGESLKLSCRMSGSTSSIQAMGWYRQTPGKQREWVASISKGGSTNYADSVKDRFTISRSITKNTVYLQMVNLKPEDTAVYYCNPVPDSDNYASGQGTQVTVSS | I1 |
| 31 | MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGSIFSSNVMGWYRRAPGKQREWVASISRGGGTNYPDSVKGRFTVSRDIAKNTVYLQISSLKPEDTAVYYCNPIPYSGDYVSGQGTQVTVSS | I6 |
| 32 | MADVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGSTFSMNVMGWYRQAPGKHREWVGSIGTGGGTNYPDSVKGRFTISRDNVKKTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNKIPHNWGWGQGTQVTVSS |
I8 |
| 33 | MMAQVQLVESGGGSVAAGESLTLSCRMSGSTSSIQAMGWYRRAPGNQREWLATISPRGNTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPADTAVYYCNTVPSGGIPWGQGTQVTVSS | I4 |
| 34 | MADVQLVESGGGSVPPGGSLRLSCAASGSIFTINSMGWFRQAPGNQREWLATISPRGNTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPADTAVYYCNTVPSGGIPWGQGTQVTVSS | I9 |
| 35 | MAQVQLVESGGGWVQPGGSLRLSCAASGITFSTKTMGWYRQRPGKRREWIGSISPTGFTNYADAVKGRVTISRDNGENTVYLQMNSLKPEDTAVYFCNGVPPVIIDGQSVAYWGQGTQVTVSS | I2 |
| 36 | MAQVQLVESGGGLVQPGGSLTLSCVISGTIFNDGSSVNAMNWYREAPGKGRVLIASLDSAGITKYADSVNGRFTISADNARETVTLQMNNLAPEDTAVYYCAATKVWNSWYATYGIDYWGKGTQVTVSS | I10 |
| 37 | MAQVQLVESGGGTVQAGGSLRLSCTASGRGRNAMGWYRQVPGGKRELVASINRGGTTDYTDSVKDRFTISRDSAKNTVYLQMDSLQPEDTAVYYCNAESTVIPGHIYDYWGRGTQVTVSS | I11 |
Comme il est bien connu de l’homme du métier, la combinaison des CDR1, CDR2 et CDR3 suffit pour définir un site de liaison à l’antigène.
Au sens de l'invention, le terme « CDR » pour « région déterminant la complémentarité » fait référence aux séquences d'acides aminés, qui, ensemble, définissent l'affinité de liaison et la spécificité de la région Fv naturelle d'un site de liaison natif d'une immunoglobuline.
Selon une mise en œuvre spécifique de l’invention, le ligand spécifique de PCPE-1 est un nanocorps dont la séquence polypeptidique inclut trois régions déterminant la complémentarité (CDRs) avec PCPE-1, chaque CDR présentant au moins 80% d’identité avec l’une des séquences suivantes :
i. CDR1: SEQ ID NO. 1, 4, 7, 10 ou 13;
ii. CDR2: SEQ ID NO. 2, 5, 8, 11 ou 14;
iii. CDR3: SEQ ID NO. 3, 6, 9, 12 ou 15.
i. CDR1: SEQ ID NO. 1, 4, 7, 10 ou 13;
ii. CDR2: SEQ ID NO. 2, 5, 8, 11 ou 14;
iii. CDR3: SEQ ID NO. 3, 6, 9, 12 ou 15.
Selon une mise en oeuvre particulière :
- le CDR1 du nanocorps présente au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR1 mentionnées au (i) ci-dessus, et
- le CDR2 du nanocorps présente au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR2 mentionnées au (ii) ci-dessus, et
- le CDR3 du nanocorps présente au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR3 mentionnées au (iii) ci-dessus.
- le CDR1 du nanocorps présente au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR1 mentionnées au (i) ci-dessus, et
- le CDR2 du nanocorps présente au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR2 mentionnées au (ii) ci-dessus, et
- le CDR3 du nanocorps présente au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR3 mentionnées au (iii) ci-dessus.
Les pourcentages d’identité auxquels il est fait référence dans le cadre de l’exposé de la présente invention sont déterminés après alignement optimal des séquences à comparer, qui peuvent donc comprendre une ou plusieurs additions, délétions, troncatures et/ou substitutions.
Ce pourcentage d’identité peut être calculé par toute méthode d’analyse de séquences bien connue de l’homme du métier.
Le pourcentage d’identité peut être déterminé après alignement global des séquences à comparer prises dans leur intégralité, sur toute leur longueur. Outre manuellement, il est possible de déterminer l’alignement global de séquences au moyen de l’algorithme de Needleman et Wunsch (1970).
Pour les séquences nucléotidiques, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : «Gap Open» égal à 10,0, «Gap Extend» égal à 0,5 et la matrice EDNAFULL (Version EMBOSS du NCBI NUC4.4).
Pour les séquences d’acides aminés, la comparaison des séquences peut être effectuée à l’aide de tout logiciel bien connu de l’homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : «Gap Open» égal à 10,0, «Gap Extend» égal à 0,5 et la matrice BLOSUM62.
De préférence, le pourcentage d’identité défini dans le cadre de la présente invention est déterminé au moyen d’un alignement global des séquences à comparer sur toute leur longueur.
Selon une autre mise en œuvre, le ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 est un nanocorps qui comprends trois régions déterminant la complémentarité (CDRs) avec PCPE-1, lesdits trois CDRs présentant au moins 80% d’identité de séquence avec les séquences suivantes :
a) CDR1 : SEQ ID NO. 1, CDR2 : SEQ ID NO. 2 et CDR3 : SEQ ID NO. 3 ; ou
b) CDR1 : SEQ ID NO. 4, CDR2 : SEQ ID NO. 5 et CDR3 : SEQ ID NO. 6 ; ou
c) CDR1 : SEQ ID NO. 7, CDR2 : SEQ ID NO. 8 et CDR3 : SEQ ID NO. 9 ; ou
d) CDR1 : SEQ ID NO. 10, CDR2 : SEQ ID NO. 11 et CDR3 : SEQ ID NO. 12 ; ou
e) CDR1 : SEQ ID NO. 13, CDR2 : SEQ ID NO. 14 et CDR3 : SEQ ID NO. 15.
a) CDR1 : SEQ ID NO. 1, CDR2 : SEQ ID NO. 2 et CDR3 : SEQ ID NO. 3 ; ou
b) CDR1 : SEQ ID NO. 4, CDR2 : SEQ ID NO. 5 et CDR3 : SEQ ID NO. 6 ; ou
c) CDR1 : SEQ ID NO. 7, CDR2 : SEQ ID NO. 8 et CDR3 : SEQ ID NO. 9 ; ou
d) CDR1 : SEQ ID NO. 10, CDR2 : SEQ ID NO. 11 et CDR3 : SEQ ID NO. 12 ; ou
e) CDR1 : SEQ ID NO. 13, CDR2 : SEQ ID NO. 14 et CDR3 : SEQ ID NO. 15.
Selon une mise en oeuvre particulière :
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (a) ci-dessus, ou
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (b) ci-dessus, ou
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (c) ci-dessus, ou
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (d) ci-dessus, ou
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (e) ci-dessus.
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (a) ci-dessus, ou
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (b) ci-dessus, ou
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (c) ci-dessus, ou
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (d) ci-dessus, ou
- les trois CDRs du nanocorps présentent au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences de CDR mentionnées au (e) ci-dessus.
Selon une autre mise en œuvre, le ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 est un nanocorps qui comprends trois régions déterminant la complémentarité (CDRs) avec PCPE-1, lesdits trois CDRs présentant les séquences suivantes:
a) CDR1 : SEQ ID NO. 1, CDR2 : SEQ ID NO. 2 et CDR3 : SEQ ID NO. 3 ; ou
b) CDR1 : SEQ ID NO. 4, CDR2 : SEQ ID NO. 5 et CDR3 : SEQ ID NO. 6 ; ou
c) CDR1 : SEQ ID NO. 7, CDR2 : SEQ ID NO. 8 et CDR3 : SEQ ID NO. 9 ; ou
d) CDR1 : SEQ ID NO. 10, CDR2 : SEQ ID NO. 11 et CDR3 : SEQ ID NO. 12 ; ou
e) CDR1 : SEQ ID NO. 13, CDR2 : SEQ ID NO. 14 et CDR3 : SEQ ID NO. 15.
a) CDR1 : SEQ ID NO. 1, CDR2 : SEQ ID NO. 2 et CDR3 : SEQ ID NO. 3 ; ou
b) CDR1 : SEQ ID NO. 4, CDR2 : SEQ ID NO. 5 et CDR3 : SEQ ID NO. 6 ; ou
c) CDR1 : SEQ ID NO. 7, CDR2 : SEQ ID NO. 8 et CDR3 : SEQ ID NO. 9 ; ou
d) CDR1 : SEQ ID NO. 10, CDR2 : SEQ ID NO. 11 et CDR3 : SEQ ID NO. 12 ; ou
e) CDR1 : SEQ ID NO. 13, CDR2 : SEQ ID NO. 14 et CDR3 : SEQ ID NO. 15.
Selon une autre mise en œuvre de l’invention, le ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 est un nanocorps dont la séquence polypeptidique présente au moins 90% d’identité avec l’une des séquences SEQ ID NO. 16 à SEQ ID NO. 20.
En particulier, ce nanocorps présente une séquence polypeptidique ayant au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec les séquences SEQ ID NO. 16 à SEQ ID NO. 20.
De préférence, les substitutions observées dans les séquences polypeptidiques seront placées dans les domaines en dehors des CDRS, dénommés régions « charpente » du nanocorps.
Plus préférentiellement, les CDRs sont conservés et présentent 100% d’identité avec les séquences mentionnées ci-dessus au (a) pour SEQ ID NO. 16 ; au (b) pour SEQ ID NO. 17 ; au (c) pour SEQ ID NO. 18 ; au (d) pour SEQ ID NO. 19 ; et au (e) pour SEQ ID NO. 20.
Selon une mise en œuvre préférée, le nanocorps de l’invention présente une séquence polypeptidique consistant en la séquence SEQ ID NO. 16 ; ou SEQ ID NO. 17 ; ou SEQ ID NO. 18 ; ou SEQ ID NO. 19 ; ou SEQ ID NO. 20.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention décrit l’association de ces nanocorps au sein d’une même structure protéique de type diacorps ou tricorps. Cette association est réalisée de préférence via l’ajout d’un peptide de liaison entre les séquences protéiques de chaque nanocorps. L’homme de métier saura sélectionner le peptide de liaison le plus adapté, notamment parmi ceux décrits dans la revue de Kwon, 2019. Selon une mise en œuvre préférée, la séquence GS8(GSGSGSGSGSGSGSGS, SEQ ID NO. 38) est utilisée comme peptide de liaison.
Selon une mise en œuvre de l’invention, le ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 est constitué d’une combinaison de deux ou trois nanocorps tel que décrits ci-dessus, c’est-à-dire d’un diacorps ou d’un tricorps, optionnellement comprenant un ou deux peptides de liaison (un pour un diacorps, deux pour un tricorps).
Selon une mise en œuvre particulière de l’invention, un diacorps est constitué de l’association d’un nanocorps possédant une activité de liaison à CUB1 et un autre ayant une activité de liaison à CUB2, étant entendu que chaque nanocorps peut être positionné soit en amont soit en aval du peptide de liaison.
Un diacorps selon l’invention pourra notamment être constitué de toute combinaison de deux séquences polypeptidiques présentant chacune au moins 90% d’identité de séquence avec l’une des séquences SEQ ID NO. 16, 17, 18, 19 ou 20, optionnellement comprenant de plus un peptide de liaison.
Plus spécifiquement, un diacorps sera constitué de toute combinaison de deux séquences polypeptidiques présentant chacune une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO. 16 à SEQ ID NO. 20, optionnellement reliées par un peptide de liaison.
Cette combinaison de deux nanocorps (diacorps) pourra notamment présenter une séquence polypeptidique ayant au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO. 21, et en particulier au moins 95%, 98%, 99% ou 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO. 21.
Plus préférentiellement, dans ce diacorps, les CDRs des nanocorps sont conservés et présentent 100% d’identité avec les séquences mentionnées ci-dessus au (a) pour SEQ ID NO. 16 (H4) et au (c) pour SEQ ID NO. 18 (I5).
Selon la présente invention, ce type de diacorps peut correspondre à I5-linker-H4 ou H4-linker-I5. Un exemple de séquence d’acides aminés pour le diacorps I5-linker-H4 correspond à la séquence SEQ ID NO. 21.
Selon une mise en œuvre préférée, un diacorps selon l’invention présente une séquence polypeptidique consistant en la séquence SEQ ID NO. 21.
Un autre objet de l’invention concerne un acide nucléique comprenant une séquence nucléique codant pour un nanocorps ou une combinaison de deux ou trois nanocorps selon la présente invention.
Dans un mode de réalisation particulier, l’acide nucléique selon l’invention comprend ou consiste en une séquence nucléique codant un nanocorps défini par l’une des séquences d’acides aminés SEQ ID NO. 16 à 20 ou codant pour un diacorps défini par la séquence SEQ ID NO. 21.
Cet acide nucléique est une molécule d'ADN ou d'ARN, qui peut être incluse dans n'importe quel vecteur approprié, tel qu'un plasmide, un cosmide, un épisome, un chromosome artificiel, un phage ou un vecteur viral.
Le terme "vecteur" désigne le véhicule par lequel la séquence d'ADN ou d'ARN peut être introduite dans une cellule hôte, de manière à transformer l'hôte et promouvoir l'expression (e.g. transcription et traduction) de la séquence d’acide nucléique introduite. Un tel vecteur comprend avantageusement des éléments régulateurs, tels qu'un promoteur, un activateur, un terminateur, etc., pour induire l'expression du polypeptide.
Par conséquent, un autre objet de l'invention concerne un vecteur comprenant un acide nucléique selon l'invention.
Un autre objet de l’invention est une cellule hôte ayant intégré un vecteur tel que décrit ci-dessus, et pouvant ainsi exprimer le nanocorps, diacorps ou tricorps selon l’invention.
Utilisations des ligands spécifiques de PCPE-1 selon l’invention
La présente invention concerne également les ligands spécifiques de PCPE-1 tels que définis ci-dessus pour une utilisation comme agent de contraste dans l’imagerie médicale non invasive, pour une utilisation dans des méthodes de diagnostic et pour une utilisation comme médicament.
Par ailleurs, les ligands décrits dans la présente invention, possédant à la fois une activité de liaison et une activité inhibitrice de PCPE-1, sont des candidats parfaits pour une approche dite théranostique.
Elle concerne enfin une composition pharmaceutique comprenant un de ces ligands en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les composés selon l’invention peuvent être utilisés dans des immunoessais (ELISA, Western-blot, immunofluorescence, immunohistochimie) pour détecter PCPE-1 dans des fluides biologiques ou des tissus,in vitroouex vivo.
En particulier, la présente invention concerne un ligand antagoniste de la glycoprotéine PCPE-1 tel que décrit ci-dessus, pour son utilisation en tant que médicament.
La présente invention concerne également un ligand antagoniste de la glycoprotéine PCPE-1 tel que décrit ci-dessus, pour son utilisation thérapeutique dans le traitement du cancer ou d’une fibrose, notamment de la fibrose cardiaque.
La fibrose, également désignée sclérose, survient à la suite d'une destruction substantielle des tissus ou lorsqu'une inflammation a lieu à un endroit où les tissus ne se régénèrent pas. Les fibroses sont des pathologies caractérisées par une synthèse et un dépôt excessif de matrice extracellulaire (MEC), conduisant à une cicatrisation pathologique et à une rigidification qui peuvent conduire à la mort lorsque des organes vitaux sont touchés (cœur, foie, poumon etc…). Il existe plusieurs types de fibrose : fibrose cardiaque, fibrose pulmonaire, fibrose hépatique, fibrose rénale, fibrose musculaire, etc.
Le cancer est également une maladie où le collagène joue un rôle important, bien que ce rôle soit complexe et dépendant du type de tumeur (Shiet al., 2021).
La présente invention concerne également une méthode de traitement du cancer ou d’une fibrose, en particulier de la fibrose cardiaque, comprenant l’administration à un patient souffrant d’un cancer ou d’une fibrose, d’un ligand antagoniste de PCPE-1, inhibant son activité, tel que décrit ci-dessus.
Dans le contexte de l'invention, un "patient" désigne un mammifère humain ou non-humain, tel qu'un rongeur (rat, souris, lapin), un primate (chimpanzé), un félin (chat), ou un canin (chien). De préférence, le patient est un être humain, en particulier souffrant d’un cancer ou d’une fibrose, et notamment d’une fibrose cardiaque.
La présente invention est également relative à un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu’il est couplé à un marqueur détectable en imagerie médicale.
Par "ligand spécifique de PCPE-1 couplé à un marqueur détectable", on entend ici que le marqueur détectable est lié, de manière directe ou indirecte, au ligand, ou est incorporé dans le ligand. Le marqueur détectable peut en particulier être lié au ligand par substitution, par complexion ou par chélation.
Au sens de la présente invention, un "marqueur détectable" désigne un composé qui produit un signal détectable. Lorsqu'il est associé à un traceur, il permet de suivre le devenir du traceur dans l'organisme. Un marqueur détectable désigne ici en particulier un marqueur détectable en imagerie médicale.
Le marqueur détectable utilisé peut notamment être un agent de contraste IRM, un agent de contraste en scintigraphie, un agent de contraste en imagerie aux rayons X, un agent de contraste ultrason, ou un agent de contraste en imagerie optique.
Des exemples de marqueurs détectables incluent des radioéléments, des fluorophores tels que la fluorescéine, l'Alexa, la cyanine ; les composés chimioluminescents tels que le luminol ; les composés bioluminescents tels que la luciférase ou la phosphatase alcaline ; et les agents de contraste tels que les nanoparticules ou le Gadolinium.
Le choix du marqueur détectable approprié, qui dépend du système de détection utilisé, est à la portée de l'homme du métier.
Le marquage peut être orienté, via l’introduction d’une cystéine terminale, d’une séquence de reconnaissance par la sortase ou autre ligase. Le marquage peut aussi être réalisé par couplage direct après activation des lysines.
Le marqueur détectable est notamment un fluorophore, un composé chromophore ou luminescent ou une étiquette détectable par un anticorps. Il peut également s’agir d’un chélatant, comme le NODAGA, qui est ensuite couplé à un radioisotope, comme le Ga68.
Avantageusement, le ligand ainsi modifié conserve ses capacités à se lier à PCPE-1.
Le ligand spécifique de PCPE-1 couplé à un marqueur détectable peut être utilisé pour détecter la protéine PCPE-1 dans un immuno-essai ou en culture cellulaire.
La présente invention est également relative à l’utilisation d’un ligand spécifique de PCPE-1 couplé à un marqueur détectable tel que défini ci-dessus, pour le suiviin vivod’un état pathologique par imagerie médicale.
En particulier, l’invention se rapporte à l’utilisation dudit ligand spécifique de PCPE-1 couplé à un marqueur détectable comme agent de contraste dans l'imagerie médicale, en particulier l'imagerie médicalein vivo, non invasive.
Au sens de l’invention, un agent de contraste désigne une substance qui, administrée dans l'organisme, permet de marquer de manière détectable des organes ou des structures (tissu, cellule, récepteur) qui, sans agent de contraste, sont peu ou non visibles en imagerie médicale.
Avantageusement, le ligand spécifique de PCPE-1 couplé au marqueur possède des caractéristiques pharmacocinétiques compatibles avec son utilisation comme agent de contraste (clairance rapide mais persistance suffisante pour permettre l’imagerie, élimination rénale, pas d’accumulation chez l’animal sain). Ces propriétés peuvent si nécessaire être modulées par PEGylation, ou autre modification de la charge ou de la lipophilicité des molécules.
La présente invention concerne également une méthode d'imagerie médicale, en particulier d'imagerie médicalein vivo, non invasive, dans laquelle un ligand spécifique de PCPE-1 couplé à un marqueur détectable tel que défini ci-dessus est administré à un patient, puis le patient est soumis à un protocole d’imagerie médicale.
Elle concerne également l'utilisation d'un ligand spécifique de PCPE-1 couplé à un marqueur détectable tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d'un agent de contraste utile pour l'imagerie médicale, en particulier l'imagerie médicalein vivo, non invasive.
Le terme théranostique est un néologisme construit à partir des termes thérapie et diagnostic, qui correspond à une approche médicale visant à privilégier le développement simultané des aspects diagnostic et thérapeutique. En particulier, il s’agit d’utiliser des composés permettant à la fois de visualiserin vivola situation clinique d’un patient, et de traiter l’affection concernée avec le même composé.
Les ligands spécifiques de PCPE-1 selon l’invention, en particulier ceux présentant une action inhibitrice de l’activité de PCPE-1 et couplés à un marqueur détectable, sont tout à fait adaptés à une utilisation théranostique.
Ainsi, la présente invention concerne un ligand spécifique de PCPE-1 couplé à un marqueur détectable, pour son utilisation théranostique pour le traitement et le suiviin vivod’un état pathologique par imagerie médicale. De préférence, ce ligand est un antagoniste de PCPE-1.
La présente invention concerne également un kit pour déterminer l’activité et/ou la quantité de la glycoprotéine PCPE-1 dans un échantillon biologiquein vitroouex vivo, comprenant :
- un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’invention, et
- des réactifs de détection.
- un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’invention, et
- des réactifs de détection.
Un échantillon biologique désigne tout type d’échantillon issu d’un corps vivant, notamment du corps d’un patient, et inclut notamment le sang, le sérum, le plasma, l’urine, le liquide céphalo-rachidien et les larmes.
Production et purification des protéines
Les protéines PCPE-1 (humaine native ou comportant une étiquette 8his en C-terminal), Mini-procollagène III (étiquette C-myc en N-terminal), et BMP-1 (étiquette flag en C-terminal) ont été produites en cellules HEK 293-EBNA et purifiées comme déjà décrit. Les domaines CUB de PCPE-1 ont été préparés par protéolyse limitée de CUB1NTR et CUB2NTR comme décrit par Kronenberg et coll. CPIII-Long et PCPE-2 (avec une étiquette 6-his en N-terminal) ont été produits par transfection transitoire de cellules HEK 293T et purifiés comme indiqué.
L’antigène utilisé pour la sélection des nanocorps est la zone CUB1CUB2 de la protéine PCPE-1 (correspondant aux acides aminés 1 à 279). Il a été cloné dans le vecteur pHLsec, en fusion avec un tag 6-His et une séquence de clivage par la protéase HRV-3C en N-terminal. Il a ensuite été produit par transfection transitoire de cellules 293-F, cultivées à 37°C, 125 rpm, 8% CO2en milieu FreeStyleTM293 (Gibco), selon la procédure décrite par Pulidoet al. CUB1CUB2 a été purifié sur colonne Ni-excel (5 ml; Cytiva), puis traité par la protéase HRV-3C à 4°C pendant une nuit pour éliminer l’étiquette histidine. Après gel filtration sur colonne HiLoad Superdex 75 16/600 SEC (size exclusion chromatography, Cytiva) équilibrée en 20 mM HEPES pH 7.4, 0.3 M NaCl, la protéine est stockée à -80°C dans le même tampon. La concentration des protéines a été déterminée à l’aide d’un Nanodrop 2000 (Thermo Scientific).
Une forme biotinylée de CUB1CUB2 a été préparée pour le bio-panning et le phage-ELISA. Pour cela, la séquence codante pour la région CUB1CUB2 a été clonée dans le vecteur pHL-Avitag3 entre les sites EcoRI et KpnI puis la protéine a été exprimée en 293-T comme ci-dessus. Après purification sur résine Cobalt, 60 µM de CUB1CUB2avi ont été biotinylés à l’aide de 1 µM de GST-BirA (Biotin-protein ligase) dans 50 mM de tampon bicine, 300 mM potassium glutamate pH 8.3 en présence de 10 mM ATP et 50 µM de d-biotine pendant 5 h at 30 °C. La GST-BirA (clonée dans le vecteur pGex, don de Y. Zhao, STRUBI, Oxford, GB) a été produite en bactériesE. Coli BL21(DE3)pLysS.Une purification sur résine cobalt puis une gel filtration sur colonne superdex S75 (tampon 20 mM HEPES pH 7.4, 0.3 M NaCl) permettent l’élimination de la BirA et de la biotine en excès et l’obtention d’une protéine pure et biotinylée à 95%.
Sélection des nanocorps chez le lama
Les nanocorps de lama ont été générés par la plateforme du LaboratoireArchitecture et Fonction des Macromolécules Biologiques(Marseille, France). Brièvement, unLlama glamaa été immunisé par cinq injections successives de 1 mg de CUB1CUB2 à une semaine d’intervalle. Au bout de 39 jours, le sang a été collecté, et la bibliothèque de nanocorps a été générée comme décrit précédemment. Deux étapes de bio-panning sur 50 nM de CUB1CUB2 biotinylé ont permis d’enrichir des phages exprimant des nanocorps reconnaissant spécifiquement CUB1CUB2. 48 clones (phagemid) ont été sélectionnés et leur affinité pour PCPE-1 humain déterminée par phage ELISA. Les clones positifs ont été séquencés et leurs séquences alignées et analysées à l’aide de ESPript 3.0. Huit nanocorps ont été retenus pour être caractérisés plus en détails : I1, I2, I3, I4, I5, I7, I10 et I11.
Génération des nanocorps synthétiques
Les nanocorps synthétiques ont été sélectionnés par Hybrigenics Services SAS. Après trois étapes de bio-panning sur CUB1CUB2 biotinylé utilisant la bibliothèque de nanocorps hsd2ab (Moutelet al., 2016), 90 clones ont été testés par phage ELISA pour leur capacité à se fixer sur PCPE1. Après séquençage, une librairie de 24 clones uniques positifs a été obtenue. Dix d’entre eux ont été sélectionnés pour être caractérisés plus en détail : H1 à H10.
Production et purification des nanocorps
Les nanocorps synthétiques ont été clonés dans le vecteur pET29b(+), en fusion avec la séquence signalepelBet une étiquette 6-His en position C-terminale. Les Nanocorps de lama ont été clonés dans le vecteur pHEN6 à la suite de la séquencepelBet en fusion avec une étiquette 6-His en position C-terminale.
Pour construire le diabody, le nanobody VHH-I5 a été amplifié par PCR avec addition d’un site de restriction NotI et d’une séquence GS8(GSGSGSGSGSGSGSGS) en N-terminal. La construction GS8-VHH-I5 a ensuite été clonée à la suite du VHH-H4 en pET29b(+) par digestion NotI/ XhoI pour conduire au nanobody bivalent VHH-H4-GS8-VHH-I5 (D1) .
Les plasmides obtenus sont ensuite transformés en bactériesE. coliT7 express (NEB). Lorsque la densité bactérienne atteint DO600 = 0.8, l’expression protéique est déclenchée par traitement avec 0.1 mM IPTG (β-D-1-thiogalactopyranoside) et les cellules sont incubées pendant une nuit à 28°C, dans un milieu Terrific Broth contenant 0.1 % de glucose. Les cellules sont ensuite récoltées par centrifugation à 4000 rpm 15 min à 4 °C et resuspendues en tampon TES (200 mM Tris HCl pH 8.0, 500 mM Sucrose, 50 nM EDTA). La fraction périplasmique est préparée par choc osmotique et les Nanocorps sont purifiés par chromatographie d’affinité sur résine nickel (Qiagen) et gel filtration (Superdex 75 16/600; Cytiva) en tampon 20 mM HEPES, 0.3 M NaCl pH 7.4.
Certains nanocorps ont également été clonés dans le vecteur pHEN contenant la séquence LPETG (site de reconnaissance pour la Sortase) et une étiquette 6-His en position C-terminale (don du Dr. Leo Hanke, Karolinska Institut, Stockholm, Suède), et produits et purifiés comme décrit dans (Hankeet al., 2020). En parallèle, la Sortase A 5M clonée dans le vecteur pET30b (Addgene #51140), avec une étiquette 6-His en C-terminal, a été produite et purifiée selon les instructions du fournisseur. Les nanocorps ont été biotinylés sur leur extrémité C-terminale à l’aide de 50 µM de Sortase A 5M et 200 µM de GGGK-biotin (Covalab) en tampon 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 2 h à 25 °C. La Sortase A 5M et l’excès de Nanocorps ont été éliminés par passage sur résine Ni-NTA (Qiagen; 2 ml), puis l’excès de biotine par un passage sur Zeba spin (7K MWCO, Thermo Fisher Scientific).
Analyses par SPR
Les expériences de résonance plasmonique de surface (SPR) ont été réalisées sur un appareil Biacore T200 (Cytiva). Les protéines ligands, en solution dans un tampon 10 mM HEPES pH 7.4 pour PCPE-1 ou 10 mM acétate de sodium pH 4.5 pour le mini-procollagen III et la streptavidine, sont immobilisées sur puce CM5 par couplage amine. Les analytes sont dilués en tampon de course (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.05 % P20) et injectés à un débit de 30 ou 50 µL/min. Les expériences de compétition, d’épitope binning et de cinétique ont toutes été réalisées à 25°C. La régénération est obtenue par injection successive de chlorure de guanidine 2M et d’EDTA 0.5 M pendant 30 sec. Les sensorgrammes ont été analysés à l'aide du logiciel d'évaluation Biacore T200 Evaluation v3.2.1 (Cytiva), en utilisant les modèles les plus adaptés. La CI50 a été déterminée par régression non linéaire à l'aide de GraphPad Prism (v8.2.1).
Tests d’activité
Pour caractériser les effets des nanocorps sur l'activité de PCPE-1, 400 nM de CPIII-Long ont été incubés pendant 1 h à 37 °C avec 2.5 nM de BMP-1 et 73 nM de PCPE-1 (lorsqu'il est présent) en présence ou en l'absence de 2 µM de nanocorps dans le tampon suivant : 20 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.02 % n-octyl-β-D-glucopyranoside. Les échantillons ont été analysés par SDS-PAGE sur gels gradient 4-20 % (Criterion ; Biorad) et coloration Instant Blue (Euromedex). Le niveau d'activation par PCPE-1 a été évalué comme le rapport entre l'intensité de la bande du C-propeptide et l'intensité de toutes les bandes de CPIII long (clivé et non clivé), après normalisation avec la condition BMP-1 seul, en utilisant le logiciel ImageQuantTL (Cytiva).
Effet des nanocorps sur la maturation C-terminale des collagènes fibrillaires in vitro
Des fibroblastes de cœur de rats ont été cultivés dans un milieu DMEM, 10 % SVF (Eurobio), 1 % AAS (Antibiotic-antimycotic solution; Thermo Fisher) à 37 °C, 5 % CO2. A 70 % de confluence des cellules, le sérum a été éliminé et remplacé par du milieu sans sérum, contenant PCPE-1 (5 µg-mL-1) ou/et 15 µg∙mL-1nanocorps. Après 48 h de culture, les surnageants sont récoltés et le procollagène est analysé par western-blotting à l’aide d’un anticorps anti-C-propeptide (LF41, don du Dr. Larry W. Fisher, Bethesda, USA). La quantification des bandes est réalisée à l’aide du logiciel ImageQuantTL (Cytiva).
Analyses statistiques
Sauf mention contraire, les données représentent la moyenne ± écart type d’au moins trois expériences indépendantes, calculées à l’aide du logiciel Graphpad Prism 8.2
Exemple 1.
Sélection et caractérisation de nanocorps dirigés contre PCPE-1
La Figure 1 présente les résultats de la sélection des nanocorps de liaison à PCPE-1 issus de la banque de nanocorps de lama ou d’une banque synthétique.
Les domaines CUB1 et CUB2 de PCPE-1 étant nécessaires et suffisants à son activité, nous avons choisi d’utiliser comme antigène une protéine contenant ces deux domaines, mais dépourvue du domaine NTR. Les étiquettes utilisées pour la purification ont été éliminées pour éviter la sélection de ligands non spécifiques. Deux stratégies ont été menées en parallèle : une sélectionin vivode nanocorps de lama par immunisation de l’animal et une sélectionin vitroà partir d’une bibliothèque de nanocorps synthétiques.
Pour la banque immune, les nanocorps ont été générés par cinq injections successives de CUB1CUB2 recombinant dans un lama, suivies de deux étapes de biopanning. 48 clones ont été analysés par phage-ELISA, conduisant à 11 clones uniques après séquençage. Ces 11 clones peuvent être classés en six familles en fonction de leurs CDR3. La première famille est la plus représentée avec 5 clones alors que les autres n’ont qu’un ou deux variants. 3 membres de la famille 1 (VHH-I1, VHH-I5 et VHH-I7) et un membre de chacune des autres familles ont été sélectionnés, produits dans le périplasme deE.coliet purifiés. Leur affinité pour PCPE-1 a été mesurée par résonance plasmonique de surface (SPR) ( ). Tous, sauf le VHH-I10, se fixent sur PCPE-1 (Table 2). On note que les nanocorps appartenant à une même famille ont des comportements très différents. Dans la famille 1, l’interaction du VHH-I1 avec PCPE-1 semble moins stable que celles des VHH-I5 et –I7, conduisant à une constante de dissociation nettement supérieure (Table 2). Parmi les autres nanocorps de lama, seul le VHH-I3 est un ligand puissant de PCPE-1, avec des constantes de dissociation de l’ordre du nanomolaire.
La sélection des nanocorps synthétiques a été effectuée à l’aide de trois cycles de phage display, puis 90 clones ont été choisis au hasard et testés par phage ELISA pour leur capacité à se fixer sur PCPE-1. 32 % des clones ont donné un signal positif, ce qui correspond à 24 clones uniques après séquençage. 7 de ces 24 clones ont également donné un signal positif lorsque testés contre CUB1NTR immobilisé. 10 clones (incluant ces 7) ont finalement été produits et purifiés, puis leur affinité pour PCPE-1 a été mesurée par SPR ( ). Sur les 10, seule la moitié donnent une interaction nette avec PCPE-1 lorsqu’ils sont injectés à 200 nM, les meilleurs résultats étant obtenus avec les VHH-H4 et VHH-H10 ( ) dont les KDs sont de l’ordre du nanomolaire (Table 2).
Mesure de la constante d’affinité K
D
des différents nanocorps étudiés
Les nanocorps issus de la banque de nanocorps synthétiques sont désignés par des appellations commençant par la lettre H ; les nanocorps issus du sérum d’un lama immunisé sont désignés par des appellations commençant par I.
La présente l’activité de liaison à PCPE-1 des huit nanocorps issus de sérum de lama : I1, I2, I3, I4, I5, I7, I10 et I11.
La présente l’activité de liaison à PCPE-1 des dix nanocorps synthétiques suivants : H1 à H10.
Le tableau 2 ci-dessous présente les constantes d’affinité KDde sept nanocorps issus de lama (comme indiqué ci-dessus, le nanocorps I10 ne se fixe pas du tout), et des dix nanocorps synthétiques.
| KD(nM) | |
| I1 | > 250 |
| I2 | 154 |
| I3 | 16.0 |
| I4 | > 250 |
| I5 | 7.2 |
| I7 | 12.8 |
| I11 | 161 |
| H1 | >250 |
| H2 | >250 |
| H3 | >250 |
| H4 | 30 |
| H5 | >250 |
| H6 | >250 |
| H7 | 152 |
| H8 | >250 |
| H9 | >250 |
| H10 | 18 |
Les constantes d’affinité inférieures à 100 nM sont représentatives d’une liaison forte ; c’est le cas des nanocorps suivants : I3, I5, I7, H4 et H10.
Exemple 2. Détermination des régions reconnues par les nanocorps
La figure 2 présente les résultats de la détermination des régions de PCPE-1 reconnues par les anticorps. Des expériences de compétitions par co-injection des nanocorps avec le domaine CUB1 ou CUB2 de PCPE-1 ont été réalisées ( ). Lorsqu’ils sont mélangés à CUB2, les nanocorps I3, I5 et I7 se sont révélés incapables de se lier à PCPE-1, alors que la co-injection avec CUB1 n’a pratiquement aucun effet, ce qui indique que ces nanocorps interagissent principalement avec le domaine CUB2 de PCPE-1. Au contraire, l’interaction des nanocorps synthétiques H4 et H10 avec PCPE-1 est empêchée par la co-injection avec CUB1 et pas avec CUB2, indiquant qu’ils interagissent avec le domaine CUB1.
Pour les meilleurs ligands de chaque banque (I5 et H4), nous avons ensuite déterminé si les autres nanocorps possédaient le même épitope ou s’ils étaient capables de se fixer simultanément à PCPE-1. Pour cela, la puce PCPE-1 a d’abord été saturée avec le nanocorps-I5 ou -H4. Si l’on n’observe pas de changement du signal lorsque le VHH-I5 est ensuite co-injecté avec les autres nanocorps de lama, la co-injection de VHH-I5 et des VHH-H4 ou -H10 conduit à une forte augmentation du signal ( ), indiquant qu’ils se fixent simultanément sur des sites distincts de PCPE-1. De la même manière, quand la surface est d’abord saturée avec le VHH-H4 ( ), les nanocorps de lama sont toujours capables d’interagir avec PCPE-1 alors que le VHH-H10 ne peut plus se fixer. Ces résultats confirment que les deux bibliothèques ont des épitopes différents, mais qu’à l’intérieur d’une bibliothèque, les épitopes sont plutôt conservés.
PCPE-2 est une protéine de la même famille que PCPE-1, avec une séquence en acides aminés à 43 % identique. Elle partage avec PCPE-1 certaines activités, mais possède également des fonctions spécifiques bien différentes. La spécificité de l’interaction des nanocorps pour PCPE-1 par rapport à PCPE-2 a été analysée par SPR. Pour cela les VHH-I5 et VHH-H4 ont été biotinylés sur leur extrémité C-terminale grâce à la sortase, puis immobilisés sur une surface streptavidine. Dans les deux cas, l’interaction avec PCPE-2 est quasi indétectable (KD> 1 µM) alors que PCPE-1 se fixe très fortement (KD= 1.5 nM (VHH-I5) et KD= 3.9 nM (VHH-H4), -E et tableau 3 ci-dessous). L’affinité des VHH-I5 et -H4 pour PCPE-1 est donc au moins 250 fois plus forte que pour PCPE-2.
| 1 :1 binding model | ka(M-1s-1) | kd(s-1) | KD(nM) | Rmax(RU) | X2 | |
| I5 | PCPE-1 | 9.375105 | 1.36 10-3 | 1.45 | 2643 | 206 |
| PCPE-2 | - | - | >1000 | - | - | |
| H4 | PCPE-1 | 5.04 106 | 1.95 10-2 | 3.88 | 1093 | 73.8 |
| PCPE-2 | - | - | >1000 | - | - |
Exemple 3 : Effets antagonistes inhibiteurs sur PCPE-1 des nanocorps selon l’invention
La Figure 3 présente les résultats de l’effet inhibiteur des nanocorps selon l’invention sur l’activité de PCPE-1. L’activité de PCPE-1 passe par son interaction directe avec les C-propeptides des procollagènes. Nous avons donc observé si les nanocorps étaient capables d’empêcher la fixation de PCPE-1 sur un mini-procollagène III (Mini III, composé des domaines C-terminaux du procollagène III : fin de la triple hélice, C-télopeptide et C-propeptide) à l’aide d’expériences de compétition par SPR.
Les résultats montrent que les VHH-I3, -I5, -I7, -H4 et -H10 inhibent la fixation de PCPE-1 sur le Mini III alors que les VHH-I1, -I2, -I4 et -I11 n’ont pas d’effet ( ).
Les VHH-H4 et VHH-I5 sont les plus efficaces, avec 75 % et 50 % d’inhibition à 250 nM.
De plus leurs effets antagonistes sont additifs, et la co-injection d’un mélange de VHH-I5 et VHH-H4 avec PCPE-1 élimine pratiquement son interaction avec le Mini III. Cet effet inhibiteur augmente avec la concentration, avec des CI50 estimées à environ 45 nM (VHH-H4), 24 nM (VHH-I5) et 20 nM (mix VHH-I5 et VHH-H4) en présence de 5 nM de PCPE-1.
Cependant, si l’on atteint une inhibition complète à forte concentration pour le VHH-H4, l’ajout de VHH-I5 seul ne permet pas de bloquer totalement l’interaction PCPE-1 / Mini III et une inhibition résiduelle de 40% environ reste présente, alors que l’inhibition est totale lorsque VHH-H4 et VHH-I5 sont combinés.
Puisque les nanocorps empêchent la fixation de PCPE-1 sur les procollagènes, l’étape suivante était de voir s’ils inhibent également l’activité de PCPE-1in vitro. CPIII-Long (un substrat modèle du procollagène III) est clivé par incubation avec la protéase BMP-1 et ce clivage est augmenté en présence de PCPE-1 ( , augmentation d’un facteur 2.4 dans ces conditions). L’ajout des VHH-I1, VHH-I2, VHH-I4 ou VHH-I11 n’a que très peu d’effet sur l’activité de PCPE-1. Par contre, l’ajout de VHH-I3, VHH-I5, VHH-I7, VHH-H4 ou VHH-H10 conduit à une baisse de 25 à 45 % de l’activation, et celle-ci est totalement inhibée par l’utilisation simultanée des VHH-I5 et VHH-H4. Il faut également noter que l’activité basale de BMP-1 ne semble pas modifiée par la présence des VHHs, et ce malgré le fait que BMP-1 contient aussi trois domaines CUB.
Enfin, les nanocorps ont été évalués dans un test cellulaire pour leur capacité à moduler le clivage du procollagène I.
Pour mimer des conditions fibrotiques, des fibroblastes de cœur de rats ont été traités avec la protéine recombinante PCPE-1 humaine ( ,D). L’ajout de PCPE-1 dans le milieu augmente la libération du C-propeptide du procollagène I d’un facteur environ 2.5 en moyenne. La présence des VHH-I5 et VHH-H4 inhibe l’effet de PCPE-1 (d’environ 40%), comme le montre la diminution du C-propeptide ( ). De façon très nette, le traitement conjoint par les VHH-I5 et VHH-H4 bloque complètement l’effet du PCPE-1 exogène, avec un retour à la quantité basale de C-propeptide libérée. Par ailleurs le traitement des cellules par les VHHs seuls (en absence de PCPE-1 ajouté) n’a pas d’effet sur la libération du C-propeptide.
Tous ces résultats suggèrent que les ligands sélectionnés sont des antagonistes puissants de PCPE-1, capables de bloquer la stimulation de la maturation C-terminale des procollagènes par PCPE-1.
Exemple 4 : Construction et caractérisation d’un diacorps (nanocorps divalent)
Les résultats précédents suggèrent que combiner les nanocorps I5 et H4 dans une même chaine polypeptidique pourrait encore améliorer leur affinité pour PCPE-1 grâce à la coopérativité des sites.
La Figure 4 présente les résultats obtenus pour le diacorps diab-D1 de SEQ ID NO. 21, produit en bactéries.
L’interaction du diab-D1 avec PCPE-1 a été évaluée par SPR, par injection de concentrations croissantes de diab-D1 sur PCPE-1 immobilisé. Le bénéfice lié à la fusion des VHHs est clairement visible avec l’avidité qu’elle procure, et qui se manifeste par une constante de dissociation améliorée (KD=0.32 nM) et une dissociation beaucoup plus lente ( ).
D’autre part, des expériences de compétition ont été réalisées pour déterminer si diab-D1 avait un pouvoir antagoniste plus puissant que les nanocorps utilisés individuellement ( ). La CI50calculée pour le diab-D1 est estimée à 3.5 nM, elle est sensiblement plus faible que celle des VHH-I5 et VHH-H4 seuls ou co-injectés (5 à 13-fois) dans les mêmes conditions. De même, l’ajout de diab-D1 bloque totalement la stimulation du clivage du CPIII-Long par PCPE-1 ( ).
En culture cellulaire ( ), diab-D1 est capable de bloquer totalement l’effet de l’ajout de PCPE-1 sur le clivage du procollagène I endogène par les fibroblastes de cœur de rat. D’autre part, et au contraire des VHHs individuels, le diacorps inhibe également le clivage du C-propeptide en absence de PCPE-1 ajouté.
US20120270246
WO2017065206A1
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Claims (14)
- Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 présentant une constante d’affinité KDinférieure à 100 nM, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un nanocorps.
- Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 présentant une constante d’affinité KDinférieure à 100 nM, caractérisé en ce qu’il inhibe son activité, en particulier en inhibant son interaction avec le domaine C-terminal des procollagènes.
- Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon la revendication 2, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un nanocorps.
- Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendications 1 ou 3, caractérisé en ce que chaque nanocorps comprend trois régions déterminant la complémentarité (CDRs) avec PCPE-1, lesdits trois CDRs présentant au moins 80% d’identité de séquence avec les séquences suivantes :
a) CDR1 : SEQ ID NO. 1, CDR2 : SEQ ID NO. 2 et CDR3 : SEQ ID NO. 3 ; ou
b) CDR1 : SEQ ID NO. 4, CDR2 : SEQ ID NO. 5 et CDR3 : SEQ ID NO. 6 ; ou
c) CDR1 : SEQ ID NO. 7, CDR2 : SEQ ID NO. 8 et CDR3 : SEQ ID NO. 9 ; ou
d) CDR1 : SEQ ID NO. 10, CDR2 : SEQ ID NO. 11 et CDR3 : SEQ ID NO. 12 ; ou
e) CDR1 : SEQ ID NO. 13, CDR2 : SEQ ID NO. 14 et CDR3 : SEQ ID NO. 15. - Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendications 1, 3 ou 4, dont la séquence peptidique présente au moins 90% d’identité avec l’une des séquences SEQ ID NO. 16 à SEQ ID NO. 20.
- Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 constitué d’une combinaison de deux ou trois nanocorps selon l’une des revendications 1, 3, 4 ou 5, en particulier d’une combinaison de deux séquences polypeptidiques présentant chacune au moins 90% d’identité avec l’une des séquences SEQ ID NO. 16 à SEQ ID NO. 20, optionnellement comprenant de plus un ou deux peptides de liaison.
- Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon la revendication 6, dont la séquence polypeptidique présente au moins 90% d’identité avec la séquence SEQ ID NO. 21.
- Acide nucléique codant pour un nanocorps selon l’une des revendications 1, 3, 4 ou 5, ou codant pour une combinaison de deux ou trois nanocorps selon l’une des revendications 6 ou 7.
- Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendication 2 à 7, pour son utilisation en tant que médicament.
- Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendication 2 à 7, pour son utilisation médicale dans le traitement du cancer ou d’une fibrose, notamment de la fibrose cardiaque.
- Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu’il est couplé à un marqueur détectable.
- Utilisation d’un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon la revendication 11, pour le suiviin vivod’un état pathologique par imagerie médicale.
- Ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon la revendication 11, pour son utilisation théranostique pour le traitement et le suiviin vivod’un état pathologique par imagerie médicale.
- Kit pour déterminer l’activité et/ou la quantité de la glycoprotéine PCPE-1 dans un échantillon biologiquein vitroouex vivo, comprenant :
- un ligand spécifique de la glycoprotéine PCPE-1 selon l’une des revendications 1 à 7, et
- des réactifs de détection.
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