CN113767289A - 结直肠癌筛选检查及早期检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于在对象中的癌症（优选结直肠癌（CRC））的诊断、预后、分层和/或疗法监测的新方法。该方法基于确定从对象中获得的生物样本中的一组至少1种（优选3、4以及最优选至少5种）蛋白质生物标志物的水平，所述蛋白质生物标志物选自蛋白质生物标志物双调蛋白（AREG）、癌胚抗原（CEA）、胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）、角蛋白I型细胞骨架19（KRT19）、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶1（MASP1）、骨桥蛋白（OPN）、血清对氧磷酶内酯酶3（PON3）和转铁蛋白受体蛋白1（TR）。本发明的新生物标志物组能够对各种癌症疾病进行诊断甚至进行分层。此外，本发明提供了用于执行本发明的非侵入性方法的诊断试剂盒。由于本发明的生物标志物组提供了一种独立于所使用的蛋白质检测技术的统计上稳健的方法，并且考虑到本发明的生物标志物组是在对象的血浆样本中检测到的，因此本发明提供了一种应用于更大人群的早期检测筛查。

Description

结直肠癌筛选检查及早期检测方法
技术领域
本发明涉及一种用于对象中的癌症（优选结直肠癌（CRC））的诊断、预后、分层（stratification）和/或治疗监测的新方法。该方法基于确定从对象中获得的生物样本中的一组至少一种（优选3、4和最优选至少5种）蛋白质生物标志物的水平，该蛋白质生物标志物选自蛋白质生物标志物双调蛋白（AREG）、癌胚抗原（CEA）、胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）、角蛋白I型细胞骨架19（KRT19）（Keratin, type I cytoskeletal 19）、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶1（MASP1）、骨桥蛋白（OPN）、血清对氧磷酶内酯酶3（PON3）和转铁蛋白受体蛋白1（TR）。本发明的新生物标志物组能够对各种癌症疾病进行诊断甚至进行分层。此外，本发明提供了用于执行本发明的非侵入性方法的诊断试剂盒。由于本发明的生物标志物组提供了一种独立于所使用的蛋白质检测技术的统计上稳健的方法，并且考虑到本发明的生物标志物组在对象的血浆样本中进行检测，因此本发明提供了一种可应用于更大人群的早期检测筛查。
描述
与癌症等疾病相关的多方面研究的重要步骤是鉴定适合于开发有效和改进的诊断方法、预后和治疗方式的特异性和敏感的生物标志物。本发明的一个目的是提供新的生物标志物和生物标志物组，其用作新的诊断和/或预后标志物和/或用于开发新疗法。虽然质谱法、鸟枪（shot gun）蛋白质组学和DNA/RNA微阵列分析以及深度测序已经使列表中报告的潜在肿瘤生物标志物越来越多，但很少有进入临床验证阶段，甚至更少被用作可靠的治疗靶点或诊断标志物。
结直肠癌（CRC）以每年185万例病例和约880,000例死亡导致了巨大的全球癌症负担。CRC是全球第三大常见癌症和第二大癌症死亡原因[1]。越来越多的证据表明筛查可以有效降低CRC的发病率和死亡率[2-5]。然而，由于基于内窥镜检查的程序的不便性和侵入性[6, 7]以及在基于粪便检测的筛查程序中对粪便的收集、处理和储存有所保留[8]，筛查程序的参与率通常较低。通过微创血液检测，对基于人群的筛查程序的参与可能会得到改善[9]。
人类蛋白质组估计由超过20,000种蛋白质组成[10]，并且正在深入探索用于基于血液的生物标志物研究。如液相色谱-多反应监测/质谱（LC-MRM/MS）[11，12] 和邻位延伸分析（proximity extension assay，PEA）[13，14]等的多重平台可以促进一次过同时准确检测多种蛋白质，并且已经被用于基于血液的生物标志物研究。LC-MRM/MS和PEA两者都具有检测低丰度标志物的能力，其分析灵敏度在纳克/毫升到皮克/毫升的范围内。
近年来已经鉴定了一些基于血液的蛋白质标志物特征，但只有很少的研究在独立的验证集中验证了这些特征，到目前为止，还没有研究在同一样本集中使用不同的蛋白质检测方法重复蛋白质测量[15，16]。
因此，本发明是以基于三阶段设计中的鉴定、评估和验证用于CRC早期检测的蛋白质生物标志物特征为目标来进行构思。首先使用LC-MRM/MS在CRC病例和对照的血液样本中检测蛋白质，以鉴定一种有前景的多重标志物算法。然后使用PEA来评估所鉴定的算法，所述PEA是另一种对来自同一群体的样本的高度敏感的方法。最后，在前瞻性收集的CRC和晚期腺瘤（AA）病例和无结直肠肿瘤的对照的样本中独立验证了估计值，这些样本是在真正的筛查环境中专门招募的。
由于对快速、灵敏和特异的癌症诊断的持续需要，本发明寻求提供一种用于诊断或监测各种癌症疾病的简单且微创而又特异且灵敏的测试系统的新方法。特别是结直肠癌的筛查，目前进行的程序对患者来说非常不愉快并且伴有不适，需要新的方法来说服受试者接受CRC筛查。
发明简述
一般地，通过简要描述，本发明的主要方面可以描述如下：
在第一方面，本发明涉及一种用于对象中的癌症疾病的诊断、预后、分层和/或治疗监测的方法，其包括以下步骤：
（a）提供来自所述对象的生物样本，
（b）确定所述生物样本中至少一种生物标志物的水平（浓度），该生物标志物选自生物标志物双调蛋白 （AREG）、癌胚抗原（CEA）、胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）、角蛋白I型细胞骨架19（KRT19）、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶1（MASP1）、骨桥蛋白（OPN）、血清对氧磷酶内酯酶3（PON3）和转铁蛋白受体蛋白1（TR），
其中与健康对照或参考值相比，在步骤（b）中所确定的来自所述对象的生物样本中的所述至少一种（优选两种、三种、四种和最优选5种）生物标志物的差异水平，表明所述对象中癌症疾病的存在。
在第二方面，本发明涉及用于执行根据本发明第一方面所述的方法的诊断试剂盒。
在第三方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段在执行根据第一方面所述的方法中的应用，所述抗体或其抗原结合片段针对选自TR、OPN、IGFBP2、MASP1、PON3、AREG、CEA和/或KRT19的蛋白质生物标志物中的任意一种。
在第四方面，本发明涉及用于在之前未被诊断出患有癌症疾病的对象中的癌症疾病（优选CRC）的早期检测的筛选检查方法，该方法包括
（a）提供待筛选的对象的生物样本，
（b）用如此提供的所述对象的生物样本执行第一方面所述的方法。
发明的详细描述
在下文中将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列出，然而，应当理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建其他的实施方案。各种描述的实施方案和优选实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。该描述应当被理解为支持并涵盖将两个或更多个明确描述的实施方案组合或将一个或多个明确描述的实施方案与任意数量的所公开和/或优选元素组合的实施方案。此外，除非上下文另有指示，否则应认为本申请中的描述中公开了本申请中所有描述的元素的任何排列和组合。
在第一方面，本发明涉及一种用于对象的癌症疾病的诊断、预后、分层和/或治疗监测的方法，包括以下步骤：
（a）提供来自所述对象的生物样本，
（b）确定所述生物样本中至少一种生物标志物的水平（浓度），该生物标志物选自生物标志物双调蛋白 （AREG）、癌胚抗原（CEA）、胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）、角蛋白I型细胞骨架19（KRT19）、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶 1（MASP1）、骨桥蛋白（OPN）、血清对氧磷酶内酯酶3（PON3）和转铁蛋白受体蛋白1（TR），
其中与健康对照或参考值相比，在步骤（b）中所确定的来自所述对象的生物样本中的所述至少一种（优选两种、三种、四种和最优选5种）生物标志物的差异水平，表明所述对象中癌症疾病的存在。
在本发明的上下文中，术语蛋白质生物标志物应指作为蛋白质分子的标志物，优选为不是抗体的蛋白质。本发明所述的生物标志物优选选自TR、OPN、IGFBP2、MASP1、PON3、AREG、CEA和KRT19。作为参考，蛋白质生物标志物的名称指的是它们各自在UniProt数据库2019年5月7日的版本中的条目（UniProt: a worldwide hub of protein knowledgeNucleic Acids Research, Volume 47, Issue D1, 08 January 2019, Pages D506–D515; “www.uniprot.org/”）。所公开的蛋白质生物标志物的UniProt识别号在本文的图6的表4中提供。作为参考，本发明所述的8种生物标志物的此类蛋白质条目的氨基酸序列通过引用并入本文。
在本发明的上下文中，“诊断”或术语“诊断性的”是指鉴定病理状况的存在或性质。诊断方法的灵敏度和特异性不同。诊断测定的“灵敏度”是检测呈阳性的患病个体的百分比（“真阳性”的百分比）。检测未检测到的患病个体是“假阴性”。未患病且在测定中测试为阴性的受试者被称为“真阴性”。诊断检测的“特异性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率定义为检测呈阳性的未患病患者的比例。虽然特定的诊断方法可能无法提供对病症的明确诊断，但如果该方法提供有助于诊断的阳性指示也已经足够。
术语“预后”是指对疾病的可能产生的结果以及病例的性质和症状所表明的疾病的康复前景的预测。因此，阴性或不良预后定义为较低的治疗后存活期或存活率。相反，阳性或良好预后定义为治疗后较高的存活期或存活率。通常预后提供为无进展生存期或总生存期的时间。
本发明目的的术语“分层”是指根据本发明的方法为患者的治疗和疗法的提供可能的决策的优势，无论是患者的住院治疗、一种或多种药物的使用、效果和/或剂量、治疗措施或对疾病过程的监测以及治疗过程或病因或疾病分类，例如，划分为新的或现有的亚型或疾病及患病患者的类型。特别是关于结直肠癌，“分层”在本文中是指将癌症分类为早期或晚期结直肠癌。
本发明目的的术语“监测治疗”是指在接受癌症治疗的受试者中观察疾病进展。换句话说，在治疗期间定期监测受试者所采用的治疗的效果，这能够让医生在治疗的早期阶段预估所制定的治疗是否有效，从而因此调整治疗方案。
如本文所用，术语“受试者/对象”或“患者”是指任何动物（例如哺乳动物），其包括但不限于人类、非人类灵长类动物、啮齿类动物等，它们是特定治疗的接受者。通常，术语“受试者/对象”和“患者”在本文中就人类受试者而言可互换使用。如本文所用，术语“疑似患有癌症的受试者”是指表现出一种或多种指示癌症的症状（例如，明显的肿块或团块）的受试者。疑似患有癌症的受试者也可能具有一种或多种风险因素。疑似患有癌症的受试者通常没有接受过癌症检测。然而，“疑似患有癌症的受试者”包含已接受初步诊断（例如，CT扫描显示肿块）但不知道癌症亚型或分期的个体。该术语还包括曾经患过癌症的人（例如，处于缓解期的个人），以及患有癌症并怀疑原发肿瘤发生转移性扩散的人。在这方面，本发明也可用作监测患者癌症复发的后续护理。
术语“癌症”和“癌细胞”是指在多细胞生物的组织或器官中表现出不受控制的生长的任何细胞。本发明上下文中特别优选的癌症选自结直肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌、恶性上皮癌（carcinoma）、黑色素瘤、白血病或脑癌。
如本文所用，术语“结直肠癌”包括广为接受的医学定义，其将结肠直肠癌定义为以小肠以下的肠道（即大肠（结肠），包括盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠）的细胞的癌症为特征的医学病症。此外，如本文所用，术语“结直肠癌”还进一步包括医学病症，其特征在于十二指肠和小肠（空肠和回肠）的细胞癌。
如本文所用，术语“胃癌”是指胃的癌症。最常见的胃癌类型是影响胃上皮细胞的恶性上皮癌，例如但不限于腺癌。胃癌还可包括例如影响胃结缔组织的肉瘤和影响胃原始细胞组织的胚细胞瘤。
术语“胰腺癌”包括胰腺癌的良性或恶性形式，以及源自胰腺细胞的任何特定类型的癌症（例如，导管细胞癌、腺泡细胞癌、乳头状癌、腺鳞癌、未分化癌、粘液癌、巨细胞癌、混合型胰腺癌、小细胞癌、囊腺癌、未分类的胰腺癌、胰腺母细胞瘤、乳头状囊性肿瘤等）。
如本文所用，术语“生物样本”是指所取得的并且能够检测如本发明所公开的任何一种生物标志物或其基因表达的样本。所述生物样本可以包括生物流体（例如，血液、脑脊液、尿液、血浆、血清）、组织活检等。在一些实施方案中，所述样本是组织样本，例如肿瘤组织，并且可以是新鲜、冷冻或存档石蜡包埋的组织。用于本发明所述目的的优选样本是体液，特别是血液或血浆样本。
在本发明的上下文中，“生物标志物”或“标志物”是指有机生物分子，特别是多肽，与取自没有某种病况的受试者（例如，阴性诊断、正常或健康受试者、或非癌症患者，取决于患者是否接受癌症或转移性癌症测试）的对照样本相比，所述生物标志物在取自具有所述病况的受试者的样本中差异地存在。例如，标志物可以是多肽或蛋白质（具有特定的表观分子量），其与阴性诊断的患者样本相比，所述标志物在癌症患者的样本中以升高或降低的水平存在。就本发明而言，本发明包括蛋白质生物标志物的水平、相应全长蛋白质或其任何片段的存在的确定。所述片段优选地具有足以具体确定它们源自亲本全长蛋白质的长度，此类片段优选地至少具有8、9、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸的长度。
作为替代，本发明所述的蛋白质生物标志物也可以通过检测针对所述蛋白质生物标志物的自身抗体间接检测。
如本文所述，样本、对照物或参照物中生物标志物的术语“水平的确定”是指测试样本中所述生物标志物存在的量化。例如，所述样本中生物标志物的浓度能够通过测量测试样本中存在的蛋白质/多肽/多糖的量直接定量。然而，也可能通过评估生物标志物的编码基因的基因表达来间接量化生物标志物的量，例如通过对编码相应生物标志物的mRNA表达进行量化。本发明不应被任何能够确定给定生物标志物水平的特定方法所限制，而是应包括能够直接或间接量化或估计所述生物标志物水平的所有方式。因此，本发明上下文中的“水平”是描述给定样本中生物标志物的绝对量的参数，例如绝对重量、体积或摩尔量；或者，“水平”涉及相对量，例如并且优选地是所测试样本中所述生物标志物的浓度，例如mol/l、g/l、g/mol等。在优选的实施方案中，“水平”指以g/l为单位的所测试生物标志物的浓度。
样本中生物标志物水平相对于对照组的“增加”在优选的实施方案中应指本发明的优选方面的统计学显著增加。
在本发明的替代实施方案中，在受试者患癌症的情况下，本文公开的某些生物标志物也可能显著减少。
在一个优选的实施方案中，本发明公开的发明的方法是非侵入性的，例如体外（in vitro）或间接体内（ex vivo）方法。到目前为止，本文描述的诊断方法都是非侵入性的，术语“提供生物”样本应优选地解释为不包括对受试者进行的外科手术。
本发明的优选实施方案涉及如本文所描述的用于鉴定所述诊断目的的多种生物标志物组。将所述生物标志物相组合（特别是蛋白质生物标志物和自身抗体生物标志物的组合）的优点是如本文所公开的诊断测定的灵敏度和/或特异性增加。因此，本发明的优选实施方案涉及本发明公开的方法，其中步骤（b）包含确定生物样本中至少两种、三种、四种或优选五种，最优选所有八种生物标志物的水平。
在本发明的上下文中，所公开的8种生物标志物列表中的4种蛋白质生物标志物的任何组合都是有利的并且构成本发明的一部分。
在一些特定实施方案中，本发明涉及第一方面的方法，其中步骤（b）包括确定所述生物标志物中的至少4种的组合，优选（i）MASP1、OPN、PON3和TR，或（ii）AREG、MASP1、OPN、PON3和TR，或（iii）AREG、MASP1、OPN、PON3、TR、CEA和KRT19。
在这方面，优选地，本发明的诊断方法的步骤（b）中的四个生物标志物组的分析的特征在于所测试的生物标志物组具有根据图7和8的曲线下表观面积（AUC）。
在本发明的一些优选实施方案中，第一方面的方法的步骤（b）包括确定生物样本中至少蛋白质生物标志物TR、OPN、IGFBP2、MASP1和PON3（五生物标志物组）的水平。
关于包含标志物TR、OPN、IGFBP2、MASP1和PON3的五生物标志物组，优选地，本发明的诊断方法的步骤（b）中生物标志物组的分析的特征在于所测试的标志物组具有根据图4、5和8的曲线下表观面积（AUC）。
在本发明的一些优选实施方案中，第一方面的方法的步骤（b）包括确定生物样本中的TR、OPN、IGFBP2、MASP1和PON3的水平以及进一步地，确定选自AREG、CEA和/或KRT19的一种或多种额外生物标志物的水平。
在本发明的一些优选实施方案中，第一方面的方法的步骤（b）包括确定生物样本中至少蛋白质生物标志物TR、OPN、IGFBP2、MASP1、PON3、AREG、CEA和KRT19（八生物标志物组）的水平。
在这方面，优选的是，本发明的诊断方法的步骤（b）中的八生物标志物组的分析的特征在于所测试的生物标志物组具有根据图5的曲线下表观面积（AUC）.
迄今为止，尚未鉴定出有资格进行大规模筛查的单一血液生物标志物。多个标志物的组合可能是一种更有前景的方法，以实现大规模筛选的应用所需的灵敏度和特异性。尽管在现有技术中测试了其他标志物组，但与本文提供的所述生物标志物组的明显差异可以通过以下事实来解释，即那些现有技术研究是在临床环境中进行的，并且由于过度乐观，没有做出任何调整。许多其他关于CRC检测的血液生物标志物的研究也存在上述局限性。由于背景介绍中详细概述的原因，鉴定和评估来自筛选设置的样本中的生物标志物以在筛选条件下获得有效的性能特征是一个关键问题。此外，如本文所示，为了调整诊断性能的潜在高估，过度拟合（交叉验证、引导技术）和/或外部验证的校正也是必不可少的。因此，本发明的标志物组优于先前的现有技术标志物组。本发明的生物标志物组具有令人惊奇的技术优势，它们提供独立于所使用的蛋白质检测技术的可靠诊断结果。因此，本发明的优势还在于这样一个事实，即使用本发明的生物标志物组通过PEA和LC-MRM/MS两者都取得了相似的结果。
本发明所述的生物标志物优选是蛋白质生物标志物。
本文公开的生物标志物组在癌症筛查环境中尤其有用。本发明公开的癌症筛查应指用于检测未建立过诊断的受试者中的癌症疾病的存在的程序。这不应被解释为将本发明的生物标志物用于诊断已经被诊断出患有癌症疾病的患者的应用排除在外。这种应用的非限制性实施方案是确认诊断、监测或治疗成功或在已经接受治疗并且在其中癌症在缓解期或被治愈的受试者中监测癌症的复发。
本领域技术人员将理解，可以使用多种方法来选择特定标志物或多个标志物的阈值或参考值。在诊断方面，阈值可以通过对从患有某种类型癌症的患者群体和从没有癌症的第二受试者群体中获得的样本进行测定方法来获得。对于预后或治疗的监测应用，可以在感兴趣的时间段（例如，分别在诊断或治疗后六个月）跟踪所有患有例如卵巢癌的患者群体，然后将群体划分分成两组：进展到终点（例如，疾病复发、死亡）的第一组患者；和没有进展到终点的第二组患者。用这些患者为所测量的标志物分别建立“低风险”和“高风险”人群值。其他合适的终点包括但不限于5年死亡率或进展为转移性疾病。
一旦建立了这些组，就能够选择一个或多个阈值以提供合理的预测诊断、预后风险、治疗成功等的能力。在实践中，通常会通过绘制一个变量的值与其在两个群体（例如，任意称为“疾病”和“正常”或“低风险”和“高风险”）中的相对频率计算接受者操作特性曲线（Receiver Operating Characteristic）或“ROC”曲线。对于任何特定标志物，患有和未患有疾病的受试者的标志物水平分布可能会重叠。在这种情况下，测试并不能以100%的准确度绝对区分“疾病”和“正常”，重叠区域表示测试无法区分“疾病”和“正常”的地方。选择一个阈值，高于该阈值（或低于该阈值，取决于标志物如何随疾病变化），测试被认为是“阳性”，低于该阈值，测试被认为是“阴性”。ROC曲线下面积（AUC）是对能够正确鉴定疾病状况的感知测量概率的测量。
此外，可以通过从同一患者中取得的较晚期的结果与较早期标志物的结果进行比较来建立阈值。在某些方面，所述患者个体充当他们自己的“对照组”。在随疾病严重程度或预后风险而增加的标志物中，同一患者中所述标志物随时间的增加可指示疾病恶化或治疗方案失败，而随时间减少可指示疾病缓解或治疗方案成功。
在一些实施例中，可以确定多个阈值或参考值。在所谓的“三分位数”、“四分位数”或“五分位数”分析中可能就是这种情况。在这些方法中，“疾病”组和“正常”组（或“低风险”和“高风险”）组可以一起视为一个群体，并分为具有相同数量的个体的3、4或5（或更多）的“取值区间”。这些“取值区间”中的两个之间的边界可被视为“阈值”。可以基于测试对象落入哪个“取值区间”来分配（例如特定诊断或预后的）风险。
在优选的实施方案中，所述样本选自体液或组织，优选其中所述体液样本是血液样本，更优选血浆或血清样本。
在本发明的所有方面和实施方案中，可以优选地，通过核酸检测方法或蛋白质检测方法确定所述样本中所述至少一种生物标志物的水平。然而，核酸检测方法仅适用于表达的蛋白质是所述生物标志物的情况。通常，本发明应包含能够对本文公开的任何一种生物标志物的表达进行量化的所有手段。因此，本文所描述的发明还包含启动子分析和评估编码本发明蛋白质生物标志物的基因座的表观遗传状态的程序。
在本文所描述的发明的上下文中优选的检测方法，所述样本中所述至少一种生物标志物的水平是通过选自质谱法、质谱免疫分析法（MSIA）、基于抗体的蛋白质芯片、二维凝胶电泳、用抗肽抗体进行的稳定同位素标准捕获（SISCAPA）、高效液相色谱（HPLC）、蛋白质印迹、细胞计数微珠阵列（CBA）、蛋白质免疫沉淀、放射免疫测定、配体结合测定和酶联免疫吸附测定（ELISA）的检测方法确定的，优选其中所述蛋白质检测方法为ELISA。用于量化本发明所述的生物标志物的合适的替代检测方法是本领域技术人员已知的。然而，特别优选的是例如如上文所述的液相色谱-多反应监测/质谱（LC-MRM/MS）和/或邻位延伸分析（PEA）。
关于自身抗体生物标志物，优选使用蛋白质或蛋白质片段的免疫捕获测定。在这类测定中，通过检测自身抗体与其各自抗原或包含结合表位的抗原片段的结合来检测自身抗体。此类用于自身抗体检测的方法是本领域技术人员公知的。
在另一方面，本发明提供用于辅助癌症诊断的试剂盒，其中所述试剂盒可用于检测本发明所述的生物标志物。例如，所述试剂盒可用于检测上述生物标志物的任何一种或组合，这些生物标志物在患有癌症的患者的样本和健康患者的样本中差异地存在。本发明所述的试剂盒具有许多应用。例如，所述试剂盒可用于区分受试者是否患有所述癌症，或是否具有阴性诊断，从而有助于癌症诊断。在另一个实施方案中，所述试剂盒可用于鉴定体外癌细胞或体内癌症动物模型中调节生物标志物表达的化合物。
任选地，所述试剂盒可以进一步包含以标签形式或单独插入物的形式的合适的操作参数的说明书。例如，所述试剂盒可以含有告知消费者在血浆样本接触探针后如何清洗探针的标准说明书。
在另一个实施方案中，试剂盒包含（a）特异性结合标志物的抗体；以及（b）检测试剂。此类试剂盒可由所述材料制备，并且之前关于所述材料（例如抗体、检测试剂、固定化支持物等）的讨论完全适用于本节，无需重复。
在任一实施方案中，所述试剂盒可任选地进一步包含标准或对照信息，使得测试样本能够与对照信息标准进行比较以确定样本中检测到的标志物的测试量是否是与癌症诊断的诊断量一致。
优选地，本发明所述的试剂盒是用于执行本发明的所述方法的诊断试剂盒，包含用于量化所述至少一种生物标志物的水平的装置。优选地，本发明所述的试剂盒包含定量选自TR、OPN、IGFBP2、MASP1、PON3、AREG、CEA和KRT19的蛋白质生物标志物的装置。此类定量工具是例如至少一种抗体或其抗原结合片段，优选其中所述抗体是单克隆抗体，例如特异性结合任何上述生物标志物的单克隆抗体。此类抗体是本领域已知的并且可从商购获得。替代地或另外地，本发明的诊断试剂盒可包含用于检测针对本文公开的任何蛋白质生物标志物的自身抗体的存在或不存在及其量化的装置。
本发明的另一方面则涉及抗体或其抗原结合片段在执行根据本发明的方法中的应用，所述抗体或其抗原结合片段针对选自TR、OPN、IGFBP2、MASP1、PON3、AREG、CEA和/或KRT19的蛋白质生物标志物中的任何一种。
本发明的另一个方面涉及一种筛选检查方法，用于在之前未被诊断患有癌症疾病的对象中的癌症疾病（优选地CRC）的早期检测，所述方法包含
（a）提供待筛选的对象的生物样本，
（b）用如此提供的对象的生物样本执行根据本发明任一方面的方法。
在本发明的一些实施方案中，优选筛选检查方法，其中，如果所确定的生物标志物的水平指示癌症疾病的存在，则（i）用所述对象的提供的独立的生物样本重复该方法，并且/或（ii）安排所述对象进行所述癌症疾病的二次诊断。在所述癌症疾病是CRC的情况下，二次诊断是例如结肠镜检查。
还提供了治疗疑似患有癌症的对象的方法，该方法包括执行根据本发明的诊断方法的步骤，任选地随后执行诊断的二次验证，然后用足以减轻诊断出的癌症疾病的疗法治疗所述对象。
如本文所用，术语“本发明的”、“根据本发明”、“根据本发明的” 等在本文中的使用意在指本文中所描述和/或所要保护的本发明的所有方面和实施方案。
如本文所用，术语“包含”将被解释为涵盖“包括”和“由……组成”，这两种含义都是特别意图的，因此单独公开根据本发明的实施方案。在本文中使用时，“和/或”应被视为具有或不具有彼此的两个指定特征或组件中的每一个的特定公开。例如，“A和/或B”将被视为 （i）A、（ii）B 和（iii）A和B中每一个的具体公开，就如同它们每一个在本文中单独列出一样。在本发明的上下文中，术语“大约”和“约”表示本领域技术人员将理解为仍能确保所讨论特征的技术效果的精度范围。该术语通常表示与所示数值相差±20%、±15%、±10%，例如±5%。如本领域技术人员将理解的，对于给定技术效果，数值的这种特定偏差将取决于技术效果的性质。例如，自然或生物技术效果通常可能比人为或工程技术效果具有更大的偏差。如本领域技术人员将理解的，对于给定的技术效果，数值的这种特定偏差将取决于技术效果的性质。例如，自然或生物技术效果通常可能比人为或工程技术效果具有更大的偏差。当提到单数名词时使用不定冠词或定冠词，除非另有说明，否则例如“一个”、“一”或“该”包括该名词的复数形式。
应当理解，将本发明的教导应用于特定问题或环境，以及包括本发明的变体或其他特征（例如进一步的方面和实施方案），将在根据本文包含的教导下具有本领域普通技术的人员的能力范围内。
除非上下文另有指示，否则以上阐述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案并且等同地适用于所描述的所有方面和实施方案。
本文引用的所有参考文献、专利和出版物均通过引用整体并入本文。
附图和序列的简要说明
附图显示出：
图1显示了STARD（诊断准确性报告标准）流程图BLITZ-研究；缩写：AA-晚期腺瘤；CRC-结直肠癌；HPP-增生性息肉；NAA-非晚期腺瘤；NCP-非分类息肉；SP-锯齿状聚合物。
图2显示了用五个和八个标志物特征检测（全阶段/早期/晚期）CRC和AA阶段相比于无肿瘤对照的ROC曲线的比较。缩写：AA-晚期腺瘤；AUC-曲线下面积；CRC-结直肠癌；ROC-接受者操作特性曲线。
图3显示了表1：研究人群的特征。缩写：AA-晚期腺瘤；CRC-结直肠癌；N-数值；SD-标准偏差。
图4显示了表2：用于检测CRC的单个蛋白质生物标志物的诊断性能。缩写：AUC-接受者操作特性曲线下的面积；AUCBS-AUC的.632+自举估计；AUC*-表观AUC；CRC-结直肠癌；95%CI-95%置信区间；Se-灵敏度；Sp-特异性。所有蛋白质缩写：AREG-双调蛋白；CDH5-钙粘蛋白5；CEA-癌胚抗原；Gal3-半乳糖凝集素3；IGFBP2-胰岛素样生长因子结合蛋白2；KRT19-角蛋白I型细胞骨架19；MASP1-甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶 1；MMP9-基质金属蛋白酶9；MPO-髓过氧化物酶；OPN-骨桥蛋白；PON3-血清对氧磷酶内酯酶3；PRTN3-成髓细胞素；SPARC-SPARC蛋白；TR-转铁蛋白受体蛋白1。
图5显示了表3：用于检测CRC（全阶段/早期/晚期）和AA的多标志物特征的诊断性能。缩写：AA-晚期腺瘤；AUC-接受者操作特性曲线下的面积；AUCBS-AUC的.632+自举估计；AUC*-表观AUC；CRC-结直肠癌；95% CI-95%置信区间；Se-灵敏度；Sp-特异性。所有蛋白质缩写：AREG-双调蛋白；CEA-癌胚抗原；IGFBP2-胰岛素样生长因子结合蛋白2；KRT19-角蛋白I型细胞骨架19；MASP1-甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶1；OPN-骨桥蛋白；PON3-血清对氧磷酶内酯酶3；TR-转铁蛋白受体蛋白1。
图6显示了表4：多标志物特征的蛋白质的功能。所有蛋白质缩写：AREG-双调蛋白；CEA-癌胚抗原；IGFBP2-胰岛素样生长因子结合蛋白2；KRT19-角蛋白I型细胞骨架19；MASP1-甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶 1；OPN-骨桥蛋白；PON3-对氧磷酶3；TR-转铁蛋白受体蛋白1。
图 7显示了表5：用于检测CRC（全阶段/早期/晚期）和AA的多标志物特征的诊断性能。缩写：AA-晚期腺瘤；AUC-接受者操作特性曲线下的面积；AUCBS-AUC的.632+自举估计；AUC*-表观AUC；CRC-结直肠癌；95%CI-95%置信区间；Se-灵敏度；Sp-特异性。所有蛋白质缩写：AREG-双调蛋白；CEA-癌胚抗原；IGFBP2-胰岛素样生长因子结合蛋白2；KRT19-角蛋白I型细胞骨架19；MASP1-甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶1；OPN-骨桥蛋白；PON3-血清对氧磷酶内酯酶3；TR-转铁蛋白受体蛋白1。
图8显示了表6：用于检测CRC（全阶段/早期/晚期）和AA的多标志物特征的诊断性能。缩写：AA-晚期腺瘤；AUC-接受者操作曲线下的面积；AUCBS-AU的.632+自举估计；AUC*-表AUC；CRC-结直肠癌；95%CI-95%置信区间；灵敏度；Sp-特异性。所有蛋白质缩写：AREG-双调蛋白；CEA-癌胚抗原；IGFBP2-胰岛素样生长因子结合蛋白2；KRT19-角蛋白I型细胞骨架19；MASP1-甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶 1；OPN-骨桥蛋白；PON3-血清对氧磷酶内酯酶3；TR-转铁蛋白受体蛋白1。
实施例
本发明的某些方面和实施方案现在将通过实施例和参考本文阐述的描述、图和表的方式来说明。本发明的方法、应用和其他方面的此类实施例仅是代表性的，并且不应将本发明的范围限制为仅此类代表性实施例。
实施例显示：
实施例1：研究人群的特征
图1提供了STARD图表，其中分别显示了参加iDa、ASTER和BLITZ的研究参与者的选择。用于LC-MRM/MS的发现集A由100名临床招募的CRC病例和100名无肿瘤的对照组组成，以及对于使用PEA的发现集B，其由98例CRC病例和100名无肿瘤对照组组成，他们分别来自iDa和ASTER研究。然后，在包括从结肠镜筛查的参与者中选出的CRC病例和性别和年龄相匹配的无结直肠肿瘤的对照组的验证集中对三阶段特定预测算法进行外部评估和验证。由于AA参与者或无肿瘤对照组的性别和年龄分布实际上与真实筛查实践中CRC病例的相应分布不同，因此在分析中对 AA 参与者和无肿瘤对照组的观察进行加权，以这样的方式让他们的性别和年龄分布分别反映了结肠镜筛查参与者中所有的患有AA的参与者和没有肿瘤的对照组的性别和年龄分布，以便在真正的筛查环境中提供算法性能的有效估计。由结肠镜筛查参与者组成的验证集中包括来自BLITZ研究的58名CRC、106名AA和106名无肿瘤对照组。所有三个集的人群的特征如图3中的表1所示。所有三个集的特征分布基本相似，男性占人群的60%以上，所有集的中位年龄均在65岁左右。与发现集A和B相比，验证集包括更高比例的I阶段CRC和更低比例的IV阶段CRC。
实施例2：单个标志物
三个不同集中的所有上述蛋白质标志物的诊断性能列于图4中的表2。经过多次校正调整后，CRC和对照组之间的具有显著差异的蛋白质数量在发现集A和B以及验证集中分别为（N=6、7和1）。在发现集A和B以及验证集中分别观察到（N=6、7和3）AUC≥0.60和（N=6、7和3）蛋白质生物标志物在90%特异性时灵敏度>25%。在由两个平台常规量化的11个蛋白质生物标志物中，以发现集合A中AUCBS为0.72（95%CI，0.63-0.81），发现集合B中AUCBS为0.74（95%CI, 0.65-0.84）和TR验证集中AUCBS为0.72（95%CI，0.64-0.85）观察到PON3的最佳个体诊断性能。从图4中的表2可以看出，11个标志物中的9个在发现集A 和B中的诊断性能相似，这两个发现集具有96个CRC病例和94个没有结直肠肿瘤的对照组的重叠。
实施例 3：相关性分析
对于由190名参与者（CRC=96和对照组=94）组成的发现集A和B的同一样本中测量的蛋白质生物标志物的皮尔逊（Pearson）积矩相关分析结果显示，相关系数最高的是PON3（0.79）并且11个生物标志物中的8个≥0.6。蛋白质生物标志物所观察到的良好一致性不仅证实了这些标志物的诊断潜力，而且表明了研究结果的稳健性。
实施例4：多标志物特征
为了评估单个蛋白质生物标志物的诊断性能是否可以进一步提高，发明人推导了用于CRC检测的多标志物特征。图5中的表3和图2概述了三个集的诊断性能指标。对于由生物标志物 IGFBP2、MASP1、OPN、PON3和TR组成的五标志物特征，观察到对于全阶段CRC检测，AUCsBS在发现集A和B中分别为0.80和0.84，在验证集AUC中为0.72（95%CI，0.64-0.80），对于早期CRC检测，所述五标志物特征在发现集A和B以及验证集中分别产生0.74、0.78的AUCsBS和0.72（95%CI，0.60-0.82）的AUC。对于晚期CRC检测，发现集A和 B 中的AUCsBS分别为0.85和0.90，在独立验证集中观察到的AUC为0.69（95%CI，0.59-0.79）。
当与三个额外的生物标志物AREG、CEA和KRT19结合分析所述五标志物特征的蛋白质的诊断性能时，性能得到改善（图5）。对于八标志物特征（AREG、CEA、IGFBP2、KRT19、MASP1、OPN、PON3和TR），在发现集B中，对于全阶段、早期和晚期CRC检测，AUCsBS提高到0.88、0.84和0.91。在由结肠镜筛查参与者组成的独立验证集中，对于全阶段、早期和晚期CRC检测比较，分别观察到AUC为0.82（95%CI，0.75-0.89）、0.80（95%CI，0.71-0.89）和0.79（95%CI，0.69-0.87）。对于验证集中的八标志物特征，对于全阶段、早期和晚期CRC检测，80%特异性的灵敏度分别为69%、57%和66%，在产生90%特异性的临界值时的灵敏度分别为50%、43%和51%。当将所述五标志物特征和八标志物特征用于检测AA病例时，两个特征都观察到相同的AUC，其值为0.57（95%CI，0.49-0.65）。将年龄和性别纳入特征不会导致诊断性能发生任何变化。如图6中的表4所描述的，选自两个特征中的所有八种生物标志物都具有多种生物学和分子功能。此外，当使用通路分析软件（Ingenuity Pathway Analysis）（QIAGENInc., https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis, version 01-10; Ingenuity Systems, Redwood City, USA）了解这些蛋白质之间的相互作用时，观察到所述蛋白质在癌的发展过程中虽然功能不同，但这些蛋白质在细胞或细胞外水平相互作用。
其他的优选诊断算法能够使用如图7和8所示的类似优势的AUC进行计算。
在图8中，分析了包含MASP1、OPN、PON3和TR的组合的四标志物特征的诊断性能，并与包含AREG、MASP1、OPN、PON3和TR的组合的五标志物特征进行了比较。在通过LC-MRM/MS测量分析的发现集中，对于全阶段、早期和晚期CRC检测，测量的四标志物特征（MASP1、OPN、PON3和TR）的AUCsBS分别为0.80、0.75和0.84。所述发现集还通过 PEA测量进行了分析。当通过PEA测量分析发现集时，对于全阶段、早期和晚期CRC检测，所述四标志物特征（MASP1、OPN、PON3和TR）测量的AUCsBS为0.84、0.79和0.90，相比之下，对于全阶段、早期和晚期CRC检测，五标志物特征（AREG、MASP1、OPN、PON3和TR）的AUCsBS为0.88、0.84和0.92。
在包含有结肠镜筛查参与者的独立验证集中，当通过 LC-MRM/MS 测量进行分析时，对于全阶段、早期和晚期CRC检测比较，观察到四标志物特征（MASP1、OPN、PON3 和 TR）的AUC为0.76（95%CI，0.67-0.85）、0.78（95%CI，0.66-0.88）和0.71（95%CI，0.59-0.83）。当通过PEA测量分析包含结肠镜筛查参与者的独立验证集时，对于全阶段、早期和晚期CRC 检测比较，观察到四标志物特征（MASP1、OPN、PON3 和TR）的AUC为0.75（95%CI，0.65-0.84）、0.75（95%CI，0.63-0.86）和0.72（95%CI，0.59-0.83），相比之下，对于全阶段、早期和晚期CRC检测，五标志物特征（AREG、MASP1、OPN、PON3和TR）的AUCsBS为0.82（95%CI, 0.74-0.89）、0.86（95%CI, 0.77-0.92）和 0.76（95%CI, 0.64-0.86）。
当通过LC-MRM/MS进行测量分析时，对于验证集中的四标志物特征（MASP1、OPN、PON3和TR），其在80%特异性下的灵敏度分别为46%、43%和48%。当通过PEA测量进行分析时，四标志物特征（MASP1、OPN、PON3和TR）在80%特异性下的灵敏度分别为46%、52%和55%，相比之下，五标志物特征（AREG、MASP1、OPN、PON3和TR）在80%特异性下的灵敏度分别为71%、83%和58%。此外，当通过LC-MRM/MS测量进行分析时，对于四标志物特征（MASP1、OPN、PON3 和TR）的全阶段、早期和晚期CRC检测，在产生90%特异性的临界值时的灵敏度分别为36%、30%和21%，当通过PEA测量进行分析时，对于四标志物特征（MASP1、OPN、PON3和TR）的全阶段、早期和晚期CRC检测，则为36%、35%和33%。作为比较，当通过PEA测量进行分析时，对于全阶段、早期和晚期CRC检测，对五标志物特征（AREG、MASP1、OPN、PON3和TR）分析的产生90%特异性的临界点的灵敏度分别为50%、43%和45%。源自包含筛查结肠镜的参与者的独立验证集的数据AUC代表了标志物在一般筛查人群中的表现如何，其中病例和对照组并没有按年龄和性别匹配。
结论：近年来，一些研究已经鉴定了基于血液的蛋白质标志物组和特征，其已经显示了有可能为CRC检测产生高于0.8的AUC。然而，这些研究的参与者并不是在筛查环境中招募的[15, 16]。发明人先前的两项研究已经鉴定了用于CRC的八个和六个标志物组的AUC分别为0.76 [13]和0.84 [27]。然而，与当前研究不同的是，CRC病例是在这些研究中临床招募的验证集。其他两项公开研究的外部验证仅由临床前样本组成，对于两项单独的5标志物特征，其CRC检测的AUC为0.59 [28]和0.82 [14]。在当前本发明的研究中，包括了进行结肠镜筛查的参与者的CRC和AA病例，并且验证集中的CRC病例数高于之前的研究。
此外，目前研究中的蛋白质是用两种高度靶向的特定蛋白质组学技术分别测量的。对于除 COLOX（29个基因的基因表达）、COLODETECT（4个蛋白质+3个噬菌体）和CANCERSEEK（16个基因+8个蛋白质）等蛋白质以外的基于血液的生物标志物的先前研究具有在部分或完全临床环境中招募的CRC病例，以及尚不清楚这些测试在筛查设置样本中早期检测 CRC的诊断性能。对于COLOSENTRY（7 个基因），当在筛选设置中评估其性能时，对于所有阶段在77%的特异性下都观察到61%的灵敏度。本发明鉴定的八标志物算法在产生80%特异性的临界值产生了57%的灵敏度。基于Sept9基因（Sept9gene）甲基化的血液测试EpiproColon 2.0对早期 CRC在79%的特异性时显示出59%的灵敏度[29]，这与当前研究的八标志物特征显示的诊断性能相当。因此，当前特征的诊断性能与少数研究的结果一致，这些研究验证了基于血液的测试在真正筛查环境中的诊断性能，如关于Sept9基因甲基化的PRESEPT临床试验[30]。
如图6中的表4所示，从两个特征中鉴定的八种蛋白质参与不同的生物过程，并且还具有不同的分子功能。细胞因子AREG和OPN以及糖蛋白CEA先前已被鉴定为具有CRC诊断潜力的生物标志物 [13, 14, 27, 29, 31-33]。蛋白质生物标志物KRT19和TR都涉及宿主-病毒相互作用的生物过程，水解酶PON3和MASP1最近已与CRC检测相关联。IGFBP2是一种生长因子结合蛋白，参与生长调节。因此，当前本发明的组合是非显而易见且令人意外的，显示出了这八种生物标志物作为CRC早期检测特征的潜力，并在由结肠镜检查参与者的样本组成的独立集中进行最终验证。
由于蛋白质组学领域的进步，使低样本量的低丰度生物标志物的检测和定量成为可能。为LC-MRM/MS选择的肽具有良好的质谱（MS）响应，并唯一地识别目标蛋白质。此外，使用三重四极杆（triple-quadrupole）MS，实现高特异性首先需要通过仅允许选定的肽通过第一个四极杆并进入碰撞池，在所述碰撞池中肽解离成对前体肽的氨基酸序列具有特异性的片段。在第二个MS中添加了另一个第二阶段的技术特异性，并且只允许特定片段通过并撞击检测器。类似地，对于PEA，这对寡核苷酸标记的抗体或探针必须非常接近，并且只有对目标蛋白的这种双重识别才能启动放大信号检测。由于这些因素，LC-MRM/MS和PEA都是非常有靶向特异性的方法。LC-MRM/MS 的技术分析灵敏度在中高纳克/毫升范围内，并且使用具有相同能力的检测方法显然具有实用性。通常建议使用ELISA进行重复测量，但单个ELISA将需要比任何多重平台更多的样本量。因此，使用具有以皮克/毫升为单位的分析灵敏度的PEA进行重复测量。由于这两种技术都高度灵敏，并且在发现集A和B中生物标志物的性能几乎相似，因此可以肯定的是观察到的诊断性能不仅仅是偶然的问题。除了用于检测和定量的先进技术外，样本的预分析处理已被证明会影响蛋白质生物标志物研究中的测量[34-36]。在当前的研究中，尽管参与者是从三项不同的研究中选出的，但三项研究中样本的收集、处理、加工和储存都是按照类似的标准化操作程序（SOP）进行的。
这是第一项使用三阶段设计在两个不同平台上识别、评估和验证生物标志物的研究。在当前的研究中，发明人不仅用0.632+自举（bootstarp）方法纠正了过度乐观，而且还在独立的验证集中对结果进行了外部验证，该集由CRC、AA和在筛查结肠镜检查时完全没有结直肠肿瘤的参与者组成。此外，发明人在两种不同的独立检测方法（LC-MRM/MS和PEA）上重新测量了所鉴定的蛋白质生物标志物，这两种方法都是高度灵敏的靶向特异性技术，并且具有使用极少体积量血浆甚至低丰度标志物进行检测的检测能力。八种标志物的诊断性能对于基于血液的测试来说相当不错，全阶段CRC检测的AUC为0.82（95% CI 0.75-0.89）。因此，鉴定血浆蛋白生物标志物是进一步研究基于血液检测的CRC筛查和早期检查的潜在候选者。
利用两种竞争型靶向特异性蛋白质检测方法，本发明鉴定了具有用于CRC早期检测的诊断潜力的有前景的八标志物特征。蛋白质生物标志物 AREG、CEA、IGFBP2、KRT19、MASP1、OPN、PON3和TR表现出与所有现有检测相比具有竞争力的诊断性能，这些测试仅包含蛋白质或在真实筛查设置样本中验证的任何其他生物标志物。所鉴定的生物标志物构成了一种有前景的用于基于人群的筛查和早期检测CRC及其癌前病变的基于血液的检测。
材料和方法
研究设计
所述蛋白质生物标志物采用三步法进行评估，首先使用LC-MRM/MS在发现集A中进行测量。随后使用PEA重新评估发现集B中的相同研究人群的样本的性能，最后再次使用PEA在验证集的结肠镜筛查参与者的独立研究人群中验证该算法。
研究人群：发现集A和B
发现集A包括100名任何治疗干预之前的CRC病例，所述病例招募自2013年至2016年期间在德国西南部医院进行的iDa（“Durch innovative Testverfahren Darmkrebs früher erkennen”）研究。作为对照，发明人还包含了100名结肠镜筛查参与者，所述参与者招募自ASTER（“Mit ASS Darmtumore früher erkennen”）研究并且没有结直肠肿瘤。ASTER是一项多中心前瞻性随机对照试验（EudraCT No.2011-005603-32）。从2013年到2016年，在德国胃肠道实践中招募了ASTER的参与者并采集了参与者的血液样本[17]。发现集B包括来自iDa研究的 98例CRC病例和来自ASTER研究的100例无肿瘤对照组。两个发现集之间的研究人群几乎相同（96个CRC病例和94个对照在发现集A和B之间重叠），十名参与者的差异是由于样本量有限。使用样本以早期检查CRC用于iDa和ASTER研究已获得海德堡医学院伦理委员会和负责的州医学委员会的批准。
研究人群：验证集
用于算法的独立外部验证的血液样本是选自从BLITZ（“BegleitendeEvaluierung Innovationr Testverfahren zur Darmkrebs-Früherkennung”）研究中收集的结肠镜筛查参与者。BLITZ 研究设计的详细信息先前已有报告[13，14，18-20]，简而言之，BLITZ是一项为中风险人群提供的德国筛查结肠镜检查计划参与者的正在进行的前瞻性筛查研究。自2005年底以来，在 20个胃肠病学实践中招募了参与者。到2016年6月底，在BLITZ研究中，在9425名参与者中检测到CRC和AA分别为64名和633名参与者。在当前的研究中，分别在58名CRC参与者和 106名在结肠镜筛查中没有检查出结直肠肿瘤的参与者的血液样本中，对发现集A和B中识别和评估的特征进行了验证。此外，发明人用106名AA参与者（定义为直径>1厘米的腺瘤、管状绒毛状或绒毛状成分或高度不典型增生[21]）丰富了研究人群。无肿瘤对照和AA参与者与按性别和年龄与CRC病例匹配。使用BLITZ研究中的样本评估CRC的早期检测标志物已获得海德堡医学院（S-178/2005）伦理委员会和巴登-符腾堡州（Baden-Wuerttemberg）（M118-05-f）、莱茵兰-普法尔茨州（Rheinland-Palatinate）（837.047.06(5145) ）和萨尔州（Saarland）（217/13）的医师委员会的批准。图1显示了从BLITZ 研究中选择研究参与者的STARD图。
样本采集和储存
在ASTER和BLITZ中进行结肠镜筛查之前，以及在iDa中首次诊断出 CRC后，在进行任何癌症治疗之前收集乙二胺四乙酸（EDTA）血浆样本。抽血后，血浆样本在4℃下以2000-2500 g离心10分钟。然后将它们以冷链方式运送到德国癌症研究中心（DKFZ）的生物库，再次离心、等分并储存在-80℃条件下直至进行蛋白质测量。所有实验室分析均在对疾病状态或结肠镜检查结果不知情的情况下进行。
实验室检测
在发现集A中分析血浆样本，通过基于肽的分析使用LC-MRM/MS对两种方法之间重叠的 11种蛋白质进行靶向定量，即钙粘蛋白5（CDH5）、半乳糖凝集素3（Gal3）、胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶1（MASP1）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、髓过氧化物酶（MPO）、骨桥蛋白（OPN）、血清对氧磷内酯酶3（PON3）、成髓细胞素（PRTN3）、SPARC蛋白（SPARC）和转铁蛋白受体蛋白1（TR）。这些肽之前已根据临床蛋白质组肿瘤分析联盟 (CPTAC) 的检测开发指南（https://assays.cancer.gov)验证其在实验中的使用，并且LC-MRM/MS的详细信息已在别处发表[11, 22]。
在发现集B和验证集中，血浆样本中的蛋白质浓度是使用Olink [23]提供的PEA测量的。除了上述通过LC-MRM/MS检测定量的重叠11种蛋白质外，另外地，从先前的研究中鉴定出的三种蛋白质有望用于早期检测CRC[13，14]（Bhardwaj等人，也于2019年提交），即双调蛋白 （AREG）、癌胚抗原（CEA）和角蛋白I型细胞骨架19（KRT19）。
统计分析
使用Skyline定量分析软件对来自LC-MRM/MS的数据进行可视化和检查，并使用标准曲线计算血浆样本中以fmol/µl为单位的肽浓度。通过PEA获得的蛋白质浓度以标准化蛋白质表达（NPX）表示。
首先使用Wilcoxon秩和检验比较通过LC-MRM/MS和PEA获得的每个单独的生物标志物的蛋白质值，并通过Benjamini和Hochberg方法进行多重检验[24]。计算接收者操作特性曲线（ROC）下的每个单独的蛋白质面积（AUC）及其95%置信区间（95%CI）和在80%和90% 特异性下的灵敏度。此外，为了查看在发现集A和 B中完全相同的样本上测量的蛋白质之间的一致性，计算了Pearson积矩相关性。
为了测量用于检测CRC的多标志物组合的诊断性能，LASSO（最小绝对收缩和选择算子）回归模型具有0.632+自举[25]以调整过度拟合，其应用于发现集A中的蛋白质生物标志物。从 LASSO 逻辑回归模型中获得的生物标志物在发现集B中使用逻辑回归进行进一步重新评估。另一种预测算法通过将来自LASSO回归的生物标志物和AREG、CEA和KRT19组合以进行评估。两种预测算法都在验证集中进行了外部评估，所述验证集中专门包括了结肠镜筛查的参与者。通过计算在发现集A和 B中在80%和90%特异性下的灵敏度和表观AUC（即未针对95%CI过度拟合调整的AUC（AUC*））以及.632+自举调整的AUC（AUCBS）来评估诊断性能。所有统计分析均使用统计软件R语言和环境（版本3.5.0，R核心团队）来进行[26]。对于所有测试，两侧p值为0.05或更小视为具有统计显著性。
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Claims (15)

1.一种用于对象中的癌症疾病的诊断、预后、分层和/或治疗监测的方法，其包含以下步骤：
（a）提供来自所述对象的生物样本，
（b）确定所述生物样本中至少一种（2、3、4、5、6 或7或更多种）蛋白质生物标志物的水平（浓度），所述蛋白质生物标志物选自蛋白质生物标志物双调蛋白（AREG）、癌胚抗原（CEA）、胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）、角蛋白I型细胞骨架19（KRT19）、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶1（MASP1）、骨桥蛋白（OPN）、血清对氧磷酶内酯酶3（PON3）和转铁蛋白受体蛋白1（TR），
其中与健康对照或参考值相比，在步骤（b）中所确定的来自所述对象的生物样本中的至少一种、优选二、三、四和最优选5种生物标志物的差异水平，表明所述对象中癌症疾病的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（b）包含确定所述生物标志物中的至少4种的组合，优选（i）MASP1、OPN、PON3和TR，或（ii）AREG、MASP1、OPN、PON3和TR，或（iii）AREG、MASP1、OPN、PON3、TR、CEA和KRT19。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤（b）包含确定所述生物样本中至少蛋白质生物标志物TR、OPN、IGFBP2、MASP1和PON3的水平。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤（b）包含确定所述生物样本中选自AREG、CEA和/或KRT19的一种或多种额外的生物标志物的水平。
5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤（b）包含确定所述生物样本中至少蛋白质生物标志物TR、OPN、IGFBP2、MASP1、PON3、AREG、CEA和KRT19的水平。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述生物样本是组织样本或体液样本，优选血液样本，最优选血浆样本。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法是非侵入性方法，优选间接体内方法或体外方法。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法是用于建立所述对象中的癌症的首次诊断的筛选方法。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌、胃癌或胰腺癌，并且优选是早期或晚期CRC。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物标志物的水平是使用对相应生物标志物蛋白质中的一种或多种具有特异性的一种或多种抗体来确定的，优选其中所述蛋白质生物标志物通过蛋白质印迹、ELISA、邻位延伸分析或质谱来检测，最优选通过液相色谱-多反应监测/质谱（LC-MRM/MS）和/或邻位延伸分析（PEA）来检测。
11.一种诊断试剂盒，其用于执行前述权利要求中任一项所述的方法。
12.根据权利要求11所述的诊断试剂盒，其包含用于检测所述至少一种生物标志物的一种或多种抗体或其抗原结合片段。
13.抗体或其抗原结合片段在执行权利要求1至10中任一项所述的方法中的应用，所述抗体或其抗原结合片段针对选自TR、OPN、IGFBP2、MASP1、PON3、AREG、CEA和/或KRT19的蛋白质生物标志物中的任意一种。
14.一种筛选检查方法，其用于在之前没有被诊断出患有癌症疾病的对象中的所述癌症疾病的早期检测，所述癌症疾病优选为CRC，该方法包含
（a）提供待筛选的对象的生物样本，
（b）用如此提供的所述对象的生物样本执行权利要求1至12中任一项所述的方法。
15.根据权利要求14所述的方法，其中如果所确定的生物标志物的水平表明癌症疾病的存在，则（i）用所述对象的提供的独立的生物样本重复该方法，和/或（ii）安排所述对象进行所述癌症疾病的二次诊断。
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