CN114264828B - 鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的生物标志物及其应用。本发明通过差异筛选、集成特征选择算法(EFS)、ROC分析等生信分析方法，得到了用于鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的角蛋白II型细胞骨架1b、角蛋白I型细胞骨架14、可变免疫球蛋白抗雌二醇重链、1,7‑二甲基尿酸、副黄嘌呤和酪氨酰苯丙氨酸6种生物标志物。基于本发明的生物标志物，可以构建相应的试剂盒和诊断设备，有效区分良性甲状腺结节和甲状腺癌。

Description

鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及六个用于诊断良性甲状腺结节和甲状腺癌的生物标志物。

背景技术

甲状腺癌(TC)是头颈部最常见的恶性肿瘤。它占所有恶性肿瘤的1％和内分泌恶性肿瘤的95％。近年来甲状腺癌的发病率呈上升趋势。到2030年，它可能成为女性第二大癌症诊断。

值得注意的是，大多数甲状腺结节是良性的，只有5％～15％是恶性的。一直以来，如何鉴别甲状腺癌和良性结节一直是临床医生关心的问题。目前，广泛使用且有效的区分良性甲状腺结节(BTN)和TC的方法是超声控制下的细针穿刺活检(FNAB)。然而，大约15-30％的甲状腺FNAB不能在细胞学上区分恶性和良性，因此甲状腺FNAB必须重复检查不确定的病变。为了避免不必要的手术，提高诊断的准确性，探索新的无创诊断方法具有重要意义。

近年来，研究人员发现了一些潜在的辅助诊断生物标志物，包括galectin-3、fibronectin-1、cited-1、hbme1、cytokeratin-19和TPO等。然而这些标志物特异性低或阳性预测值差，并不能准确区分BTN和TC。同时，在血液分析方面，甲状腺癌的诊断过程也没有取得突破。

如何寻找易于检测且特异性高的生物标志物，用于鉴别甲状腺癌和良性结节，是目前亟需解决的技术问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的生物标志物及其应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的生物标志物，所述生物标志物为存在于人体血浆中的角蛋白II型细胞骨架1b、可变免疫球蛋白抗雌二醇重链、角蛋白I型细胞骨架14、1,7-二甲基尿酸、副黄嘌呤和酪氨酰苯丙氨酸中的一种或多种组合。

作为上述第一方面的优选，所述生物标志物为角蛋白II型细胞骨架1b、可变免疫球蛋白抗雌二醇重链、角蛋白I型细胞骨架14、1,7-二甲基尿酸、副黄嘌呤和酪氨酰苯丙氨酸共6种标志物的组合。

第二方面，本发明提供了一种用于检测如第一方面中任一方案所述生物标志物的试剂在制备鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的试剂盒或检测装置中的应用。

第三方面，本发明提供了一种鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的试剂盒，其包括用于检测如第一方面中任一方案所述生物标志物的试剂。

作为上述第三方面的优选，所述试剂盒优选为ELISA试剂盒。

第四方面，本发明提供了一种如第一方面中任一方案所述生物标志物在非疾病诊断或治疗目的的鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌中的应用。

第五方面，本发明提供了一种鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的诊断设备，其包括：

数据获取设备，用于获取诊断对象的检测数据，所述检测数据为从具有甲状腺结节的诊断对象的人体血浆中检测得到的如第一方面中任一方案所述生物标志物中每一种标志物的水平值，其中若标志物为蛋白则以蛋白的表达量作为其水平值，若标志物为代谢物则以代谢物在血浆中的含量作为其水平值；

数据处理设备，用于根据诊断对象的检测数据计算得到每一个标志物的指标值，其中每一个标志物的指标值为该标志物在诊断对象人体血浆中的水平值与在没有良性甲状腺结节和甲状腺癌的正常人体血浆中的水平值之间的比值，然后判断计算得到的每一个标志物的指标值是否处于对应标志物的风险范围内，若所有标志物中存在一个或多个标志物的指标值处于甲状腺癌的风险范围内，则给出甲状腺癌的诊断结果提示。

作为上述第五方面的优选，各标志物的风险范围可采用如下优选范围中的一种或多种：优选的，所述角蛋白II型细胞骨架1b对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；优选的，所述可变免疫球蛋白抗雌二醇重链对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；优选的，所述角蛋白I型细胞骨架14对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；优选的，所述1,7-二甲基尿酸对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；优选的，所述副黄嘌呤对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；优选的，所述酪氨酰苯丙氨酸对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1。

作为上述第五方面的优选，所述数据处理设备中，当所述生物标志物中所有标志物的指标值均处于各自的风险范围内时，才给出甲状腺癌的诊断结果提示。

作为上述第五方面的优选，所述数据获取设备为用于输入数据的输入设备或者用于通过接口从外部数据存储设备上读取数据的通信设备。

本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：

本发明提供了可用于判别良性甲状腺结节与甲状腺癌的新型分子标志物，可用于构建甲状腺癌的检测试剂盒及其诊断设备。

本发明提供的用于鉴别良性甲状腺结节和癌的生物标志物为包括角蛋白II型细胞骨架1b、可变免疫球蛋白抗雌二醇重链、角蛋白I型细胞骨架14、1,7-二甲基尿酸、副黄嘌呤和酪氨酰苯丙氨酸的任意结合，根据检测角蛋白II型细胞骨架1b、可变免疫球蛋白抗雌二醇重链、角蛋白I型细胞骨架14、1,7-二甲基尿酸、副黄嘌呤和酪氨酰苯丙氨酸在血液中的含量，结合比值预测甲状腺癌的风险，有助于诊断是否存在甲状腺癌或是良性甲状腺结节。

附图说明

图1为用于鉴别甲状腺结节与甲状腺癌的六个生物标志物ROC分析结果。

图2为六个组合标志物逻辑回归模型ROC曲线分析。

图3为标志物的验证与分析结果箱线图(每张箱线图中从左到右的三个组依次为HC、BTN、TC)。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。本发明各个实施例中的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。

甲状腺结节可以分为良性结节和恶性结节，其中恶性结节即甲状腺癌。本发明中针对良性甲状腺结节与甲状腺癌给出了能够鉴别甲状腺结节良恶性的生物标志物。本发明中提供的鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的生物标志物为存在于人体血浆中的角蛋白II型细胞骨架1b、可变免疫球蛋白抗雌二醇重链、角蛋白I型细胞骨架14、1,7-二甲基尿酸、副黄嘌呤和酪氨酰苯丙氨酸中的一种或多种组合。在这6种标志物中，前三种角蛋白II型细胞骨架1b、可变免疫球蛋白抗雌二醇重链、角蛋白I型细胞骨架14均属于蛋白，而后三种1,7-二甲基尿酸、副黄嘌呤和酪氨酰苯丙氨酸均属于代谢物。

需要说明的是，本发明中角蛋白II型细胞骨架1b、可变免疫球蛋白抗雌二醇重链、角蛋白I型细胞骨架14均为人体内的已知蛋白质，其具体序列均已知。

其在公共蛋白数据库uniprot中的蛋白质ID如表1所示，具体而言：

角蛋白II型细胞骨架1b的英文名为Keratin,type II cytoskeletal 1b，蛋白数据库uniprot中的登录号为Q7Z794，序列如SEQ ID No：1所示。

可变免疫球蛋白抗雌二醇重链的英文名为Variable immnoglobulin anti-estradiol heavy chain，蛋白数据库uniprot中的登录号为A2NZ55，序列如SEQ ID No：2所示。

角蛋白I型细胞骨架14的英文名为Keratin,type I cytoskeletal 14，蛋白数据库uniprot中的登录号为P02533，序列如SEQ ID No：3所示。

表1蛋白质的ID与中英文名称

另外，本发明中酪氨酰苯丙氨酸是由酪氨酸和苯丙氨酸组成的二肽，其英文名为Tyrosyl-Phenylalanine，HMDB ID为HMDB0029112，结构式为：

需要说明的是，上述鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的生物标志物中，可以用6种标志物中的任意一种单独作为鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的依据，但是由于单一标志物可能存在误判可能性，因此优选采用6种标志物中的多种组合起来作为生物标志物来鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌。在一优选实施例中，用来鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的生物标志物为角蛋白II型细胞骨架1b、可变免疫球蛋白抗雌二醇重链、角蛋白I型细胞骨架14、1,7-二甲基尿酸、副黄嘌呤和酪氨酰苯丙氨酸共6种标志物的组合。

在本发明的另一实施例中，提供了一种用于检测上述生物标志物(单一标志物或多种标志物的组合)的试剂在制备鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的诊断试剂盒或检测装置中的应用。

需要说明的是，由于上述生物标志物可能是一种标志物，也可能是多种标志物的组合，因此对应的诊断试剂盒或检测装置也可以是单一标志物的诊断试剂盒或检测装置，或者多种标志物各自的诊断试剂盒或检测装置的组合。

需要说明的是，本发明中具体的试剂盒内所包含的试剂可以根据每一种标志物的检测方法进行设定，这6种标志物都属于已知化合物，现有技术中均已存在相应的检测方法，因此可参照现有技术选择检测上述生物标志物的试剂，并按照现有技术构建相应的诊断试剂盒或检测装置。

同样的，本发明的另一实施例中，提供了一种鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的试剂盒，其包括用于检测上述生物标志物(单一标志物或多种标志物的组合)的试剂。考虑到检测效率和方便性，该试剂盒优选为ELISA试剂盒。

在本发明的另一实施例中，提供了一种上述生物标志物(单一标志物或多种标志物的组合)在非疾病诊断或治疗目的的鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌中的应用，即利用上述生物标志物来鉴别甲状腺结节的良恶性。非疾病诊断或治疗目的甲状腺癌鉴别可以是用于科学研究、非医疗的商业性检测或测试等目的。

在本发明的另一实施例中，提供了一种鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的诊断设备，其包括：

数据获取设备，用于获取诊断对象的检测数据，所述检测数据为从具有甲状腺结节的诊断对象的人体血浆中检测得到的上述生物标志物(单一标志物或多种标志物的组合)中每一种标志物的水平值，其中若标志物为蛋白则以蛋白的表达量作为其水平值，若标志物为代谢物则以代谢物在血浆中的含量作为其水平值；

数据处理设备，用于根据诊断对象的检测数据计算得到每一个标志物的指标值，其中每一个标志物的指标值为该标志物在诊断对象人体血浆中的水平值与在没有良性甲状腺结节和甲状腺癌的正常人体血浆中的水平值之间的比值，然后判断计算得到的每一个标志物的指标值是否处于对应标志物的风险范围内，若所有标志物中存在一个或多个标志物的指标值处于甲状腺癌的风险范围内，则给出甲状腺癌的诊断结果提示。

需要注意的是，本发明中的标志物的指标值，由于标志物存在蛋白和代谢物两类，因此若标志物为蛋白，需要以蛋白的表达量作为其水平值，则对应的指标值是丰度值比AR，若标志物为代谢物，需要以代谢物的含量作为其水平值，则对应的指标值是密度值比IR。

需要注意的是，本发明中每一个标志物的风险范围都需要根据大量实验数据中不同人群的标志物指标值进行统计分析得到，使得该风险范围能够区分甲状腺癌人群和良性甲状腺结节人群。在本发明中，通过大量实验数据的统计分析，可以得到6种标志物各自的风险范围如下：

所述角蛋白II型细胞骨架1b对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；所述可变免疫球蛋白抗雌二醇重链对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；所述角蛋白I型细胞骨架14对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；所述1,7-二甲基尿酸对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；所述副黄嘌呤对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；所述酪氨酰苯丙氨酸对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1。

当然，上述6种标志物各自的风险范围仅仅是本发明中的推荐范围，本领域技术人员亦可根据实际选择部分使用，或者进一步优化调整后使用。

另外，在上述给出甲状腺癌的诊断结果提示的诊断设备中，由于一共有6个可选的标志物，实际使用时并不一定要所有标志物都纳入其中，可以选择6个中的一种或者多种。假如6个标志物中被纳入了多种标志物进行风险范围判断，理论上任意一个标志物在其风险范围内，都可以视为存在甲状腺癌的风险。但在实际应用时，为了考虑降低误检率，尽量应当所有纳入的标志物中存在多个标志物的指标值处于风险范围内时，才提示存在甲状腺癌的风险。

作为本发明的一个较佳实施例，上述数据处理设备中，也可以设置当纳入风险范围判断的所有标志物的指标值均处于各自的风险范围内时，才给出对应的甲状腺癌的诊断结果提示。也就是说，如果纳入风险范围评估的所有标志物中，任意有一个不在其对应风险范围内，则可以不给出甲状腺癌的诊断结果提示。

当然，在其他的实施例中，也可以根据处于风险范围内的标志物的数量设置对应呈正比的风险等级，即使有标志物不在风险范围内，也可以对应给出不同的风险等级，以便于评估其风险性高低，为临床提供参考。例如，将6个标志物全部纳入风险范围判断，则一共设置6个风险等级，如果其中有N个标志物在其风险范围内，则提示甲状腺癌的第N个风险等级，N越大存在甲状腺癌的风险越大。

需要说明的是，数据获取设备为用于输入数据的输入设备或者用于通过接口从外部数据存储设备上读取数据的通信设备。当采用输入设备时，可以将外部设备检测得到的数据输入该诊断设备中，进而给出诊断结果。当采用通信设备时，其对应的外部数据存储设备可以是自动化测定前述生物标志物的设备上的数据存储器，本发明的诊断设备可以集成在生物标志物的自动化测定设备中，从而直接在测定结束后输出诊断结果，实现一体化的检测诊断功能。

下面本发明通过一个具体实例来进一步展示上述生物标志物的选择原理、过程以及效果，以便于本领域技术人员理解本发明的实质。

实施例1

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，本发明中所用试剂均为分析纯或以上规格，其中所用的色谱柱，型号：ACQUITY UPLC BEHC18，厂家：Waters；液相色谱仪，型号：UltiMate 3000UHPLC，厂家：Thermo。

血浆样本来自45名参与者。这45名参与者包括15名甲状腺癌患者、15名良性甲状腺结节患者和15名健康对照。所有参与者都是女性。在禁食过夜后，从所有参与者的外周静脉采集血浆样本。EDTA血样在收集后4小时内离心10分钟，提取分离的上清液并储存在-80℃直至进一步分析。

本发明所用的试剂：甲酸，甲醇，甲酸铵，乙腈，二硫苏糖醇(DTT)，碘乙酰胺(IAM)。

一、针对蛋白质标志物，往100μL血液样本中加入无SDS L3，将体积补足1mL；然后进行还原烷基化反应，具体操作步骤如下：蛋白提取，蛋白富集，富集质控，蛋白酶解

将抽干的肽段样品用流动相A(2％乙腈，0.1％甲酸)复溶，20,000g离心10min后，取上清进样。通过Thermo公司UltiMate3000 UHPLC进行分离。样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱(150μm内径，1.8μm柱料粒径，约35cm柱长)串联，以500nL/min流速通过如下有效梯度进行分离：0～5min，5％流动相B(98％乙腈，0.1％甲酸)；5～120min，流动相B从5％线性升至25％；120～160min，流动相B从25％升至35％；160～170min，流动相B从35％升至80％；170～175min，80％流动相B；175～180min，5％流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪并按如下参数进行检测：

1.DDA建库检测

经过液相分离的肽段通过nano ESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive HFX(Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA)进行DDA(Data Dependent Acquisition)模式检测。

2.DIA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nano ESI源离子化后进入到串联质谱仪Q Exactive HFX(Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA)进行DIA(Data Independent Acquisition)模式检测。

二、针对代谢物标志物，首先是代谢物提取：将样本在4℃条件下缓慢解冻后，取100μL置于96孔板中，加入300μL提取液(甲醇：乙腈＝2:1,v:v，-20℃预冷)+10μL内标1+10μL内标2，涡旋混匀1min,-20℃静置2h后，4℃，4000rcf离心20min。离心后取300μL上清，置于冷冻真空浓缩仪抽干后，加入150μL复溶液(甲醇：水＝1:1，v:v)进行复溶，涡旋震荡1min,4℃，4000r·min^-1离心30min，取上清置于进样瓶中。每个样本的上清液各取10μL混合成QC质控样本，用于评估LC-MS分析过程的重复性和稳定性。

之后是LC-MS/MS分析本实验采用Waters 2D UPLC(waters,USA)串联Q Exactive高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific,USA)来进行代谢物的分离和检测。

三、生信分析寻找标志物

主要通过差异筛选、集成特征选择算法(EFS)、ROC分析等生信分析方法，来得到生物标志物。筛选差异的标准主要是Fold change>＝1.2,P value<0.05.然后对差异蛋白和代谢物进行EFS rank以及t-test,综合结果，选出潜在标志物，再接ROC分析得出最终的生物标志物。

经过生信分析，在综合排名前十的差异蛋白和差异代谢物中，三种蛋白即角蛋白II型细胞骨架1b(蛋白KRT77)、可变免疫球蛋白抗雌二醇重链(VIHC)、角蛋白I型细胞骨架14(KRT14)以及三种代谢物即1,7-二甲基尿酸(1,7-Dimethylurate)、(副黄嘌呤Xanthine)、酪氨酰苯丙氨酸(Tyrosyl-phenylalanine)在甲状腺结节、甲状腺癌以及健康组中差别最大。如图1所示，展示了本实施例中6个生物标志物ROC分析结果，对单一标志物的ROC曲线分析可以发现AUC值在0.8-0.9之间，表明任一单一标志物均可用于鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌。

四、LASSO与逻辑回归，将代谢物和蛋白质组合为多组学模型，来检测甲状腺结节疾病。

单一标志物用于鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌容易存在误判，因此本实施例中可将上述单一标志物进行组合，进一步的回归模型分析及ROC曲线预测分析。

首先，使用LASSO回归算法选择最小的特征集对三个样本组进行分类。快速缺失值插补是通过“NAguide”R软件包在每个单独数据集中的链式随机森林实现的。在每个数据集上通过链式随机森林进行快速插补后，它们被分别缩放到Z-score并连接到正则化(L1范数)机器学习方法。随后，使用“caret”和“glmnet”R软件包进行常规机器学习以训练、测试和评估LASSO逻辑分类模型。使用LASSO参数化(alpha＝1)，在lambda值的搜索网格上调整模型：0.001到0.3，步长为0.01。该模型针对ROC曲线下的最高面积(AUC)进行了优化。对于多类比较，模型计算为所有适用的一类与所有其他类比较的平均AUC。本实施例中，通过在插入符号中使用“varImp()”并保持所有特征的重要性非零，获得特征重要性和整体LASSO蛋白质组学-代谢组学特征；同时使用Python v3中的Sklearn包，逻辑回归分析生成最优预测模型，并采用LOOCV(留一法交叉验证)来提高模型的稳健性。

在本实施例中，为了进一步整合代谢和蛋白组结果分析，将前述6个潜在的蛋白和代谢物标志物进行组合，通过Python的Sklearn包构建逻辑回归模型，并且采用LOOCV来增强模型的鲁棒性，再经过ROC曲线分析。如图2所示，展示了上述6个标志物组合的逻辑回归模型ROC曲线，可见其AUC值为0.96，表明6种标志物组合用于预测甲状腺结节和甲状腺癌的准确性将明显优于单一标志物。

五、验证实验

为了验证本发明中上述6种标志物在诊断甲状腺癌中的实际效果和可信性，本实施例采用6种标志物各自的ELISA试剂盒对独立的血浆样本进行靶向蛋白和靶向代谢物的定量分析设计了验证实验。验证实验所用ELISA检测试剂盒品牌为(Signalway Antibody)。采用ELISA检测试剂盒针对各自检测的标志物进行验证实验的具体做法如下：

1、试剂准备：

洗涤缓冲液：缓冲液的稀释与水的比例为1:25，30mL缓冲液720mL水配成洗涤缓冲液。

标准品：加入2mL的标品稀释液重组，然后通过对半稀释法将标品分为6份(50.0，25.0，12.5，6.25，3.12，1.56，0.78单位：ng/mL)加一份空白对照。

检测试剂：检测试剂A和B分别按1:100比例用稀释液A和B进行稀释。

2、具体实验过程：

2.1)每个样本取40μL血浆，标准品同样每份取40μL，重复一次，全部放入96孔板，盖上封板膜，放在37度下2小时。

2.2)移除每个孔内的液体，向每个孔内加入100μL检测试剂A,盖上封板膜并且放在37度下1小时。

2.4)移除每个孔内的液体，用洗涤缓冲液洗涤每个孔3次，每次每孔300μL洗涤缓冲液。

2.4)向每个孔加入100μL检测试剂B，盖上封板膜，同样放在37度下1h。

2.5)移除孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤五次。

2.6)向每个孔加入90μL底物，盖上封板膜，放在37度下孵育10-20min。

2.7)向每个孔加入50μL终止液，发现每个孔内的颜色有明显变化。

2.8)设置波长为450nm，通过酶标仪检测出每孔的OD值，根据OD值换算标志物的水平值。

图3展示了标志物的验证与分析结果箱线图，其中HC为健康人群对照组，BTN为良性甲状腺结节组，TC为甲状腺癌组。结果表明，本发明得到的鉴别结果与多组学分析结果一致，例如酪氨酰苯丙氨酸在代谢组学结果中甲状腺结节与甲状腺癌组中具有显著性差异，而验证结果与此一致。

在实际用于诊断甲状腺癌时，可对具有甲状腺结节的诊断对象的血浆样本进行角蛋白II型细胞骨架1b、可变免疫球蛋白抗雌二醇重链、角蛋白I型细胞骨架14、1,7-二甲基尿酸、副黄嘌呤和酪氨酰苯丙氨酸检测来鉴定甲状腺结节的良恶性，即区分良性甲状腺结节和甲状腺癌。根据前述图3的结果，根据每个标志物在各组样本的平均水平统计分析，可以得到6个标志物各自用于诊断时的判定标准，具体如下：

角蛋白II型细胞骨架1b在良性甲状腺结节和甲状腺癌患者中的表达水平不同，在良性甲状腺结节患者体内表达明显高于甲状腺癌和正常组，诊断对象血浆中角蛋白II型细胞骨架1b的表达量记作Abundance，没有甲状腺癌的正常人体血浆中角蛋白II型细胞骨架1b的表达量记作N，AR＝Abundance/N，根据丰度值比AR，若AR<1,则判定为甲状腺癌。

可变免疫球蛋白抗雌二醇重链在良性甲状腺结节和甲状腺癌患者中的表达水平不同，在良性甲状腺结节患者体内表达明显高于甲状腺癌和正常组，诊断对象血浆中可变免疫球蛋白抗雌二醇重链的表达量记作Abundance，没有甲状腺癌的正常人体血浆中可变免疫球蛋白抗雌二醇重链的表达量记作N，AR＝Abundance/N，根据丰度值比AR，若AR<1,则判定为甲状腺癌。

角蛋白I型细胞骨架14在良性甲状腺结节和甲状腺癌患者中的表达水平不同，在良性甲状腺结节患者体内表达明显高于甲状腺癌和正常组，诊断对象血浆中角蛋白I型细胞骨架14的表达量记作Abundance，没有甲状腺癌的正常人体血浆中角蛋白I型细胞骨架14的表达量记作N，AR＝Abundance/N，根据丰度值比AR，若AR<1,则判定为甲状腺癌。

1,7-二甲基尿酸在良性甲状腺结节和甲状腺癌患者中的表达水平不同，在良性甲状腺结节患者体内表达明显高于甲状腺癌和正常组，诊断对象血浆中1,7-二甲基尿酸的含量记作Intensity，没有甲状腺癌的正常人体血浆中1,7-二甲基尿酸的含量记作N，IR＝Intensity/N，根据密度值比IR，若IR<1,则判定为甲状腺癌。

副黄嘌呤在良性甲状腺结节和甲状腺癌患者中的表达水平不同，在良性甲状腺结节患者体内表达明显高于甲状腺癌和正常组，诊断对象血浆中副黄嘌呤的含量记作Intensity，没有甲状腺癌的正常人体血浆中副黄嘌呤的含量记作N，IR＝Intensity/N，根据密度值比IR，若IR<1,则判定为甲状腺癌。

酪氨酰苯丙氨酸在良性甲状腺结节和甲状腺癌患者中的表达水平不同，在良性甲状腺结节患者体内表达明显高于甲状腺癌和正常组，诊断对象血浆中酪氨酰苯丙氨酸的含量记作Intensity，没有甲状腺癌的正常人体血浆中酪氨酰苯丙氨酸的含量记作N，IR＝Intensity/N，根据密度值比IR，若IR<1,则判定为甲状腺癌。

虽然上述6个甲状腺癌标志物均可以用于诊断是否存在甲状腺癌，但是如前所述，将标志物的组合检测更为有效，具有更高准确率。当将多个标志物组合进行诊断时，需要分别利用前述的AR或者IR值，判断是否在风险范围内，当甲状腺癌的所有标志物都在风险范围内时可以给出甲状腺癌的风险提示；或者如前所述根据在风险范围内的标志物在所有标志物中的占比，给出诊断对象可能患有甲状腺癌的风险等级。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院基础医学与肿瘤研究所（筹）

<120> 鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的生物标志物及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 578

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ser His Gln Phe Ser Ser Gln Ser Ala Phe Ser Ser Met Ser Arg

1 5 10 15

Arg Val Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro

20 25 30

Ala Val Gly Ser Val Cys Tyr Ala Arg Gly Arg Cys Gly Gly Gly Gly

35 40 45

Tyr Gly Ile His Gly Arg Gly Phe Gly Ser Arg Ser Leu Tyr Asn Leu

50 55 60

Gly Gly Ser Arg Ser Ile Ser Ile Asn Leu Met Gly Arg Ser Thr Ser

65 70 75 80

Gly Phe Cys Gln Gly Gly Gly Val Gly Gly Phe Gly Gly Gly Arg Gly

85 90 95

Phe Gly Val Gly Ser Thr Gly Ala Gly Gly Phe Gly Gly Gly Gly Phe

100 105 110

Gly Gly Ala Gly Phe Gly Thr Ser Asn Phe Gly Leu Gly Gly Phe Gly

115 120 125

Pro Tyr Cys Pro Pro Gly Gly Ile Gln Glu Val Thr Ile Asn Gln Ser

130 135 140

Leu Leu Glu Pro Leu His Leu Glu Val Asp Pro Glu Ile Gln Arg Ile

145 150 155 160

Lys Thr Gln Glu Arg Glu Gln Ile Met Val Leu Asn Asn Lys Phe Ala

165 170 175

Ser Phe Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu Glu Gln Gln Asn Gln Val Leu

180 185 190

Gln Thr Lys Trp Glu Leu Leu Gln Gln Val Asn Thr Ser Thr Gly Thr

195 200 205

Asn Asn Leu Glu Pro Leu Leu Glu Asn Tyr Ile Gly Asp Leu Arg Arg

210 215 220

Gln Val Asp Leu Leu Ser Ala Glu Gln Met Arg Gln Asn Ala Glu Val

225 230 235 240

Arg Ser Met Gln Asp Val Val Glu Asp Tyr Lys Ser Lys Tyr Glu Asp

245 250 255

Glu Ile Asn Lys Arg Thr Gly Ser Glu Asn Asp Phe Val Val Leu Lys

260 265 270

Lys Asp Val Asp Ala Ala Tyr Val Ser Lys Val Asp Leu Glu Ser Arg

275 280 285

Val Asp Thr Leu Thr Gly Glu Val Asn Phe Leu Lys Tyr Leu Phe Leu

290 295 300

Thr Glu Leu Ser Gln Val Gln Thr His Ile Ser Asp Thr Asn Val Ile

305 310 315 320

Leu Ser Met Asp Asn Asn Arg Ser Leu Asp Leu Asp Ser Ile Ile Asp

325 330 335

Ala Val Arg Thr Gln Tyr Glu Leu Ile Ala Gln Arg Ser Lys Asp Glu

340 345 350

Ala Glu Ala Leu Tyr Gln Thr Lys Tyr Gln Glu Leu Gln Ile Thr Ala

355 360 365

Gly Arg His Gly Asp Asp Leu Lys Asn Ser Lys Met Glu Ile Ala Glu

370 375 380

Leu Asn Arg Thr Val Gln Arg Leu Gln Ala Glu Ile Ser Asn Val Lys

385 390 395 400

Lys Gln Ile Glu Gln Met Gln Ser Leu Ile Ser Asp Ala Glu Glu Arg

405 410 415

Gly Glu Gln Ala Leu Gln Asp Ala Trp Gln Lys Leu Gln Asp Leu Glu

420 425 430

Glu Ala Leu Gln Gln Ser Lys Glu Glu Leu Ala Arg Leu Leu Arg Asp

435 440 445

Tyr Gln Ala Met Leu Gly Val Lys Leu Ser Leu Asp Val Glu Ile Ala

450 455 460

Thr Tyr Arg Gln Leu Leu Glu Gly Glu Glu Ser Arg Met Ser Gly Glu

465 470 475 480

Leu Gln Ser His Val Ser Ile Ser Val Gln Asn Ser Gln Val Ser Val

485 490 495

Asn Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Ser Gly Gly Tyr Gly

500 505 510

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Arg Ser Tyr Arg Gly Gly

515 520 525

Gly Ala Arg Gly Arg Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Cys Gly Gly

530 535 540

Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Gly Ser Gly Arg Ser Gly Arg Gly Ser Ser

545 550 555 560

Arg Val Gln Ile Ile Gln Thr Ser Thr Asn Thr Ser His Arg Arg Ile

565 570 575

Leu Glu

<210> 2

<211> 131

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Leu Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Gln Pro Phe Glu Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala

115 120 125

Pro Lys Leu

130

<210> 3

<211> 472

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Thr Thr Cys Ser Arg Gln Phe Thr Ser Ser Ser Ser Met Lys Gly

1 5 10 15

Ser Cys Gly Ile Gly Gly Gly Ile Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ile Ser

20 25 30

Ser Val Leu Ala Gly Gly Ser Cys Arg Ala Pro Ser Thr Tyr Gly Gly

35 40 45

Gly Leu Ser Val Ser Ser Ser Arg Phe Ser Ser Gly Gly Ala Cys Gly

50 55 60

Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Phe Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe

65 70 75 80

Gly Ser Gly Phe Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Leu Gly Ala Gly Leu

85 90 95

Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Phe Ala Gly Gly Asp Gly Leu Leu Val

100 105 110

Gly Ser Glu Lys Val Thr Met Gln Asn Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser

115 120 125

Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Leu Glu Glu Ala Asn Ala Asp Leu Glu

130 135 140

Val Lys Ile Arg Asp Trp Tyr Gln Arg Gln Arg Pro Ala Glu Ile Lys

145 150 155 160

Asp Tyr Ser Pro Tyr Phe Lys Thr Ile Glu Asp Leu Arg Asn Lys Ile

165 170 175

Leu Thr Ala Thr Val Asp Asn Ala Asn Val Leu Leu Gln Ile Asp Asn

180 185 190

Ala Arg Leu Ala Ala Asp Asp Phe Arg Thr Lys Tyr Glu Thr Glu Leu

195 200 205

Asn Leu Arg Met Ser Val Glu Ala Asp Ile Asn Gly Leu Arg Arg Val

210 215 220

Leu Asp Glu Leu Thr Leu Ala Arg Ala Asp Leu Glu Met Gln Ile Glu

225 230 235 240

Ser Leu Lys Glu Glu Leu Ala Tyr Leu Lys Lys Asn His Glu Glu Glu

245 250 255

Met Asn Ala Leu Arg Gly Gln Val Gly Gly Asp Val Asn Val Glu Met

260 265 270

Asp Ala Ala Pro Gly Val Asp Leu Ser Arg Ile Leu Asn Glu Met Arg

275 280 285

Asp Gln Tyr Glu Lys Met Ala Glu Lys Asn Arg Lys Asp Ala Glu Glu

290 295 300

Trp Phe Phe Thr Lys Thr Glu Glu Leu Asn Arg Glu Val Ala Thr Asn

305 310 315 320

Ser Glu Leu Val Gln Ser Gly Lys Ser Glu Ile Ser Glu Leu Arg Arg

325 330 335

Thr Met Gln Asn Leu Glu Ile Glu Leu Gln Ser Gln Leu Ser Met Lys

340 345 350

Ala Ser Leu Glu Asn Ser Leu Glu Glu Thr Lys Gly Arg Tyr Cys Met

355 360 365

Gln Leu Ala Gln Ile Gln Glu Met Ile Gly Ser Val Glu Glu Gln Leu

370 375 380

Ala Gln Leu Arg Cys Glu Met Glu Gln Gln Asn Gln Glu Tyr Lys Ile

385 390 395 400

Leu Leu Asp Val Lys Thr Arg Leu Glu Gln Glu Ile Ala Thr Tyr Arg

405 410 415

Arg Leu Leu Glu Gly Glu Asp Ala His Leu Ser Ser Ser Gln Phe Ser

420 425 430

Ser Gly Ser Gln Ser Ser Arg Asp Val Thr Ser Ser Ser Arg Gln Ile

435 440 445

Arg Thr Lys Val Met Asp Val His Asp Gly Lys Val Val Ser Thr His

450 455 460

Glu Gln Val Leu Arg Thr Lys Asn

465 470

Claims (9)

1.一种鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为角蛋白 II 型细胞骨架1b、可变免疫球蛋白抗雌二醇重链、角蛋白 I 型细胞骨架14、1,7-二甲基尿酸、副黄嘌呤和酪氨酰苯丙氨酸共6种标志物的组合。

2.一种用于检测如权利要求1所述生物标志物的试剂在制备鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的试剂盒或检测装置中的应用。

3.一种鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的试剂盒，其特征在于，包括用于检测如权利要求1所述生物标志物的试剂。

4.一种如权利要求3所述的鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA试剂盒。

5.一种如权利要求1所述生物标志物在非疾病诊断或治疗目的的鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌中的应用。

6.一种鉴别良性甲状腺结节与甲状腺癌的诊断设备，其特征在于，包括：

数据获取设备，用于获取诊断对象的检测数据，所述检测数据为从具有甲状腺结节的诊断对象的人体血浆中检测得到的如权利要求1所述生物标志物中每一种标志物的水平值，其中若标志物为蛋白则以蛋白的表达量作为其水平值，若标志物为代谢物则以代谢物在血浆中的含量作为其水平值；

数据处理设备，用于根据诊断对象的检测数据计算得到每一个标志物的指标值，其中每一个标志物的指标值为该标志物在诊断对象人体血浆中的水平值与在没有良性甲状腺结节和甲状腺癌的正常人体血浆中的水平值之间的比值，然后判断计算得到的每一个标志物的指标值是否处于对应标志物的风险范围内，若所有标志物的指标值均处于甲状腺癌的风险范围内，则给出甲状腺癌的诊断结果提示。

7. 如权利要求6所述的诊断设备，其特征在于，所述角蛋白 II 型细胞骨架1b对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；所述可变免疫球蛋白抗雌二醇重链对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；所述角蛋白 I 型细胞骨架14对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；所述1,7-二甲基尿酸对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；所述副黄嘌呤对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1；所述酪氨酰苯丙氨酸对应的提示甲状腺癌的所述风险范围为指标值小于1。

8.如权利要求6所述的诊断设备，其特征在于，所述数据处理设备中，当所述生物标志物中所有标志物的指标值均处于各自的风险范围内时，才给出甲状腺癌的诊断结果提示。

9.如权利要求6所述的诊断设备，其特征在于，所述数据获取设备为用于输入数据的输入设备或者用于通过接口从外部数据存储设备上读取数据的通信设备。