CN114460307A - 用于诊断甲状腺功能异常的生物标志物、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于诊断甲状腺功能异常的生物标志物、试剂盒及其应用。本发明通过差异筛选、集成特征选择算法(EFS)、ROC分析等生信分析方法，得到了用于诊断甲状腺功能亢进症的补体C4‑A，C3/C5转化酶，谷胱甘肽过氧化物酶3，L‑精氨酸，L‑脯氨酸和L‑谷氨酸6种生物标志物，以及用于诊断甲状腺功能减退症的的载脂蛋白L1，α‑胰蛋白酶抑制剂重链H4，激肽原‑1，可的松，皮质醇，L‑苏氨酸6种生物标志物。基于本发明的生物标志物，可以构建相应的试剂盒和诊断设备，用于精准诊断甲状腺功能异常。

Description

用于诊断甲状腺功能异常的生物标志物、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及用于诊断甲状腺功能异常患者的生物标志物、试剂盒及其应用。
背景技术
甲状腺激素对于人的生长发育、新陈代谢以及一些器官的活动具有重要意义。甲状腺疾病是一个全球性的健康问题，严重影响人类的正常生活。甲状腺疾病一般分为甲状腺功能障碍与甲状腺结节。甲状腺功能障碍属于常见疾病，但具有潜在的严重危害健康的后果。甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减退症通常属于原发性甲状腺疾病，一般情况是因为甲状腺内的病理过程，但也存在着由外周原因引起的情况。
甲状腺功能亢进症的特征是甲状腺激素合成和分泌增加。在碘充足地区，甲状腺功能亢进症患病率为0.2％至1.3％。有关研究报告称，甲亢的发病率约为每十万人中每年100至200例，其中女性患病率为2.7％，男性为0.23％。甲状腺功能减退症属于甲状腺激素缺乏症的一种常见疾病，易诊断和治疗，但未经治疗，严重情况会致命。甲状腺功能减退症的定义主要是生化的，鉴于其临床表现存在较大差异，并且与一般缺乏症相比存在特异性。显性或临床原发性甲状腺功能减退症的定义为促甲状腺激素浓度高于参考范围，游离甲状腺素低于参考范围。在碘充足地区，没有特定年龄的促甲状腺激素参考范围的情况下，人口老龄化可能导致甲减患病率更高，女性甲减发病率大约是男性的10倍。
目前对于甲亢的诊断是先测量血清促甲状腺激素水平，这主要是因为促甲状腺激素在诊断甲状腺疾病方面具有最高的敏感性和特异性。如果促甲状腺激素水平较低，需要进一步测量血清游离的T4或T3水平，进而区分亚临床甲亢和显性甲亢。然而对于甲亢的治疗，全球范围内存在较大差异，大致有以下几种选择：抗甲状腺药物(ATD)、放射性碘消融和手术。另外针对甲亢检测的参考值范围受到较多因素影响，首先是所处区域是否为碘充足地区，其次包括年龄，性别，其他疾病史都会干扰临床的诊断。目前对于甲状腺功能减退症的诊断主要是根据其定义来判断。以原发性甲减为例，其定义是促甲状腺激素浓度高于参考范围和游离甲状腺素低于参考范围，另外根据监测类型和研究人群的不同，这一定义也会有所不同。促甲状腺激素昼夜波动大，夜晚浓度高，重度患者的促甲状腺激素分泌不规则，且有季节性改变。尽管甲状腺功能减退症患病率高、诊断容易且治疗费用低廉，但尚未就普通人群特定亚组的促甲状腺激素筛查达成共识。对于甲减，目前首选治疗方法是左旋甲状腺素单一疗法。并且针对不同甲减人群，使用剂量也是不同。
如何寻找易于检测且受干扰程度小的生物标志物，用来制备预测和诊断甲状腺功能异常的试剂盒及诊断装置，是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于诊断甲状腺功能异常的生物标志物、试剂盒及其应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于诊断甲状腺功能异常的生物标志物，所述生物标志物为存在于人体血浆中的甲状腺功能亢进症标志物和/或甲状腺功能减退症标志物；
所述甲状腺功能亢进症标志物为补体C4-A、C3/C5转化酶、谷胱甘肽过氧化物酶3、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酸中的一种或多种组合；
所述甲状腺功能减退症标志物为载脂蛋白L1、α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、激肽原-1、可的松、皮质醇和L-苏氨酸中的一种或多种组合。
作为上述第一份方面的优选，所述甲状腺功能亢进症标志物为补体C4-A、C3/C5转化酶、谷胱甘肽过氧化物酶3、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酸共6种标志物的组合。
作为上述第一份方面的优选，所述甲状腺功能减退症标志物为载脂蛋白L1、α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、激肽原-1、可的松、皮质醇和L-苏氨酸共6种标志物的组合。
第二方面，本发明提供了一种用于检测如第一方面中任一方案所述生物标志物的试剂在制备甲状腺功能异常诊断试剂盒或检测装置中的应用。
第三方面，本发明提供了一种诊断甲状腺功能异常的试剂盒，其包括用于检测如第一方面中任一方案所述生物标志物的试剂。
作为上述第三份方面的优选，试剂盒优选为ELISA试剂盒。
第四方面，本发明提供了一种如第一方面中任一方案所述生物标志物在非疾病诊断或治疗目的的甲状腺功能异常诊断中的应用。
第五方面，本发明提供了一种诊断甲状腺功能异常的诊断设备，其包括：
数据获取设备，用于获取诊断对象的检测数据，所述检测数据为从诊断对象的人体血浆中检测得到的如第一方面中任一方案所述生物标志物中每一种标志物的水平值，其中若标志物为蛋白则以蛋白的表达量作为其水平值，若标志物为代谢物则以代谢物在血浆中的含量作为其水平值；
数据处理设备，用于根据诊断对象的检测数据计算得到每一个标志物的指标值，其中每一个标志物的指标值为该标志物在诊断对象人体血浆中的水平值与在没有甲状腺功能异常的正常人体血浆中的水平值之间的比值，然后判断计算得到的每一个标志物的指标值是否处于对应标志物的风险范围内，若所有标志物中存在一个或多个标志物的指标值处于甲状腺功能亢进症或甲状腺功能减退症的风险范围内，则给出对应的甲状腺功能异常的诊断结果提示。
作为上述第五方面的优选，各标志物的风险范围可采用如下优选范围中的一种或多种：优选的，所述补体C4-A对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值小于0.95；优选的，所述C3/C5转化酶对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值大于1.04；优选的，所述谷胱甘肽过氧化物酶3对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值小于0.98；优选的，所述L-精氨酸对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值大于1.04；优选的，所述L-脯氨酸对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值大于1.01；优选的，所述L-谷氨酸对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值大于1.02；优选的，所述载脂蛋白L1对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.25；优选的，所述α-胰蛋白酶抑制剂重链H4对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.31；优选的，所述激肽原-1对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.35；优选的，所述可的松对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.05；优选的，所述皮质醇对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.06；优选的，所述L-苏氨酸对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.07。
作为上述第五方面的优选，所述数据处理设备中，当所述甲状腺功能亢进症标志物中所有标志物的指标值均处于各自的风险范围内或者当所述甲状腺功能减退症标志物中所有标志物的指标值均处于各自的风险范围内时，才给出对应的甲状腺功能异常的诊断结果提示。
作为上述第五方面的优选，所述数据获取设备为用于输入数据的输入设备或者用于通过接口从外部数据存储设备上读取数据的通信设备。
本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
本发明提供了可用于判别甲状腺功能异常的新型分子标志物，可用于构建早期发现、诊断和预测甲状腺功能异常的检测试剂盒及其诊断设备。
本发明提供的用于诊断甲状腺功能亢进症的生物标志物为包括补体C4-A，C3/C5转化酶，谷胱甘肽过氧化物酶3，L-精氨酸，L-脯氨酸和L-谷氨酸的任意结合，根据检测补体C4-A，C3/C5转化酶，谷胱甘肽过氧化物酶3，L-精氨酸，L-脯氨酸和L-谷氨酸在血液中的含量，结合比值预测甲状腺功能亢进症的风险，有助于诊断是否存在甲状腺功能亢进症；用于诊断甲状腺功能减退症的生物标志物为包括载脂蛋白L1，α-胰蛋白酶抑制剂重链H4，激肽原-1，可的松，皮质醇，L-苏氨酸的任意结合，根据检测载脂蛋白L1，α-胰蛋白酶抑制剂重链H4，激肽原-1，可的松，皮质醇，L-苏氨酸在血液中的含量，结合比值预测甲状腺功能减退症的风险，有助于诊断是否存在甲状腺功能减退症。
附图说明
图1为蛋白质组与代谢组结果的PCA分析。
图2为甲亢六个生物标志物ROC分析结果。
图3为甲减六个生物标志物ROC分析结果。
图4为甲亢多个标志物组合模型ROC。
图5为甲减多个标志物组合模型ROC。
图6为甲亢六个生物标志物分析与验证的箱线图结果(每张图中从左到右的三个组依次为THE、THO、N)。
图7为甲减六个生物标志物分析与验证的箱线图结果(从左到右为THE、THO、N)。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。本发明各个实施例中的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减退症属于两种典型的甲状腺功能异常，在本发明中分别针对甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减退症给出了相应的生物标志物，分别称为甲状腺功能亢进症标志物和甲状腺功能减退症标志物，以便于根据这些标志物来诊断甲状腺功能异常。
其中，甲状腺功能亢进症标志物为补体C4-A、C3/C5转化酶、谷胱甘肽过氧化物酶3、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酸中的一种或多种组合。在这6种标志物中，前三种补体C4-A、C3/C5转化酶、谷胱甘肽过氧化物酶3均属于蛋白，而后三种L-精氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酸均属于代谢物。
另外，甲状腺功能减退症标志物为载脂蛋白L1、α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、激肽原-1、可的松、皮质醇和L-苏氨酸中的一种或多种组合。在这6种标志物中，前三种载脂蛋白L1、α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、激肽原-1均属于蛋白，而后三种可的松、皮质醇和L-苏氨酸均属于代谢物。
需要说明的是，本发明中补体C4-A、C3/C5转化酶、谷胱甘肽过氧化物酶3、载脂蛋白L1、α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、激肽原-1均为人体内的已知蛋白质，其具体序列均已知。其在公共蛋白数据库uniprot中的蛋白质ID如表1所示，具体而言：
补体C4-A的英文名为Complement C4-A，蛋白数据库uniprot中的登录号为P0C0L4，序列如SEQ ID No：1所示。
C3/C5转化酶是能够既作为C3转化酶又作为C5转化酶的一种转化酶，其的英文名为C3/C5 convertase，蛋白数据库uniprot中的登录号为B4E1Z4，序列如SEQ ID No：2所示。
谷胱甘肽过氧化物酶3的英文名为Glutathione peroxidase 3，蛋白数据库uniprot中的登录号为P22352，序列如下：
MARLLQASCLLSLLLAGFVSQSRGQEKSKMDCHGGISGTIYEYGALTIDGEEYIPFKQYAGKYVLFVNVASYUGLTGQYIELNALQEELAPFGLVILGFPCNQFGKQEPGENSEILPTLKYVRPGGGFVPNFQLFEKGDVNGEKEQKFYTFLKNSCPPTSELLGTSDRLFWEPMKVHDIRWNFEKFLVGPDGIPIMRWHHRTTVSNVKMDILSYMRRQAALGVKRK。
载脂蛋白L1的英文名为Apolipoprotein L1，蛋白数据库uniprot中的登录号为O14791，序列如SEQ ID No：3所示。
α-胰蛋白酶抑制剂重链H4的英文名为Inter-alpha-trypsin inhibitor heavychain H4，蛋白数据库uniprot中的登录号为Q14624，序列如SEQ ID No：4所示。
激肽原-1的英文名为Kininogen-1，蛋白数据库uniprot中的登录号为P01042，序列如SEQ ID No：5所示。
表1蛋白质的ID与中英文名称
Figure BDA0003493414700000061
需要说明的是，上述甲状腺功能亢进症标志物中，可以用6种标志物中的任意一种单独作为诊断甲状腺功能亢进症的依据，但是由于单一标志物可能存在误判可能性，因此优选采用6种标志物中的多种组合起来作为生物标志物来诊断甲状腺功能亢进症，在一优选实施例中，用来诊断甲状腺功能亢进症的甲状腺功能亢进症标志物为补体C4-A、C3/C5转化酶、谷胱甘肽过氧化物酶3、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酸共6种标志物的组合。
同样需要说明的是，上述甲状腺功能减退症标志物中，可以用6种标志物中的任意一种单独作为诊断甲状腺功能减退症的依据，但是由于单一标志物可能存在误判可能性，因此优选采用6种标志物中的多种组合起来作为生物标志物来诊断甲状腺功能减退症，在一优选实施例中，用来诊断甲状腺功能减退症的甲状腺功能减退症标志物为载脂蛋白L1、α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、激肽原-1、可的松、皮质醇和L-苏氨酸共6种标志物的组合。
在本发明的另一实施例中，提供了一种用于检测上述生物标志物(单一标志物或多种标志物的组合)的试剂在制备甲状腺功能异常诊断试剂盒或检测装置中的应用。
需要说明的是，由于上述生物标志物可能是一种标志物，也可能是多种标志物的组合，因此对应的诊断试剂盒或检测装置也可以是单一标志物的诊断试剂盒或检测装置，或者多种标志物各自的诊断试剂盒或检测装置的组合。
需要说明的是，本发明中具体的试剂盒内所包含的试剂可以根据每一种标志物的检测方法进行设定，这些12种标志物都属于已知化合物，现有技术中均已存在相应的检测方法，因此可参照现有技术选择检测上述生物标志物(单一标志物或多种标志物的组合)的试剂，并按照现有技术构建相应的诊断试剂盒或检测装置。
同样的，本发明的另一实施例中，提供了一种诊断甲状腺功能异常的试剂盒，其包括用于检测上述生物标志物(单一标志物或多种标志物的组合)的试剂。考虑到检测效率和方便性，该试剂盒优选为ELISA试剂盒。
需要说明的是，一般而言，同一诊断对象在某一时刻仅会患有甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减退症中的一种，因此本发明中的上述诊断试剂盒或检测装置中可以仅用于检测甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减退症中的一种的6种标志物。
在本发明的另一实施例中，提供了一种上述生物标志物(单一标志物或多种标志物的组合)在非疾病诊断或治疗目的的甲状腺功能异常诊断中的应用。非疾病诊断或治疗目的甲状腺功能异常诊断可以是用于科学研究、非医疗的商业性检测或测试等目的。
在本发明的另一实施例中，提供了一种诊断甲状腺功能异常的诊断设备，其包括：
数据获取设备，用于获取诊断对象的检测数据，所述检测数据为从诊断对象的人体血浆中检测得到的上述生物标志物(单一标志物或多种标志物的组合)中每一种标志物的水平值，其中若标志物为蛋白则以蛋白的表达量作为其水平值，若标志物为代谢物则以代谢物在血浆中的含量作为其水平值；
数据处理设备，用于根据诊断对象的检测数据计算得到每一个标志物的指标值，其中每一个标志物的指标值为该标志物在诊断对象人体血浆中的水平值与在没有甲状腺功能异常的正常人体血浆中的水平值之间的比值，然后判断计算得到的每一个标志物的指标值是否处于对应标志物的风险范围内，若所有标志物中存在一个或多个标志物的指标值处于甲状腺功能亢进症或甲状腺功能减退症的风险范围内，则给出对应的甲状腺功能异常的诊断结果提示。
需要注意的是，本发明中的标志物的指标值，由于标志物存在蛋白和代谢物两类，因此若标志物为蛋白，需要以蛋白的表达量作为其水平值，则对应的指标值是丰度值比AR，若标志物为代谢物，需要以代谢物的含量作为其水平值，则对应的指标值是密度值比IR。
需要注意的是，本发明中每一个标志物的风险范围都需要根据大量实验数据中不同人群的标志物指标值进行统计分析得到，使得该风险范围能够区分甲状腺功能异常人群和没有甲状腺功能异常的正常人群。在本发明中，通过大量实验数据的统计分析，可以得到12种标志物各自的风险范围如下：
所述补体C4-A对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值小于0.95；所述C3/C5转化酶对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值大于1.04；所述谷胱甘肽过氧化物酶3对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值小于0.98；所述L-精氨酸对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值大于1.04；所述L-脯氨酸对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值大于1.01；所述L-谷氨酸对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值大于1.02；所述载脂蛋白L1对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.25；所述α-胰蛋白酶抑制剂重链H4对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.31；所述激肽原-1对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.35；所述可的松对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.05；所述皮质醇对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.06；所述L-苏氨酸对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.07。
当然，上述12种标志物各自的风险范围仅仅是本发明中的推荐范围，本领域技术人员亦可根据实际选择部分使用，或者进一步优化调整后使用。
另外，在给出甲状腺功能异常的诊断结果提示时，需要区分甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减退症。而且由于两种甲状腺异常都各自具有最多6个标志物，但实际使用时并不一定要所有标志物都纳入其中，可以选择6个中的一种或者多种。但是对于甲状腺功能亢进症或甲状腺功能减退症任意一种甲状腺异常而言，假如6个标志物中纳入了多种标志物进行风险范围判断，理论上任意一个标志物在其风险范围内，都可以视为存在甲状腺功能异常的风险。但在实际应用时，为了考虑降低误检率，尽量应当所有纳入的标志物中存在多个标志物的指标值处于甲状腺功能亢进症或甲状腺功能减退症的风险范围内，才提示存在对应甲状腺功能异常的风险。
作为本发明的一个较佳实施例，上述数据处理设备中，也可以设置当所述甲状腺功能亢进症标志物中所有标志物的指标值均处于各自的风险范围内或者当所述甲状腺功能减退症标志物中所有标志物的指标值均处于各自的风险范围内时，才给出对应的甲状腺功能异常的诊断结果提示。也就是说，如果纳入风险范围评估的所有标志物中，有任意一个不在其对应风险范围内，则可以不给出甲状腺功能异常的诊断结果提示。
当然，在其他的实施例中，也可以根据处于风险范围内的标志物的数量设置对应呈正比的风险等级，即使有标志物不在风险范围内，也可以对应给出不同的风险等级，以便于评估其风险性高低，为临床提供参考。例如，对于甲状腺功能亢进症标志物而言，一共有6个标志物纳入风险范围判断，则一共设置6个风险等级，如果其中有N个标志物在其风险范围内，则提示甲状腺功能亢进症的第N个风险等级，N越大存在甲状腺功能亢进症的风险越大。同样的，对于甲状腺功能减退症标志物而言，一共有6个标志物纳入风险范围判断，则一共设置6个风险等级，如果其中有N个标志物在其风险范围内，则提示甲状腺功能减退症的第N个风险等级，N越大存在甲状腺功能减退症的风险越大。
需要说明的是，数据获取设备为用于输入数据的输入设备或者用于通过接口从外部数据存储设备上读取数据的通信设备。当采用输入设备时，可以将外部设备检测得到的数据输入该诊断设备中，进而给出诊断结果。当采用通信设备时，其对应的外部数据存储设备可以是自动化测定前述生物标志物的设备上的数据存储器，本发明的诊断设备可以集成在生物标志物的自动化测定设备中，从而直接在测定结束后输出诊断结果，实现一体化的检测诊断功能。
下面本发明通过一个具体实例来进一步展示上述生物标志物的选择原理、过程以及效果，以便于本领域技术人员理解本发明的实质。
实施例1
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，本发明中所用试剂均为分析纯或以上规格，其中所用的色谱柱，型号：ACQUITY UPLC BEHC18，厂家：Waters；液相色谱仪，型号：UltiMate 3000UHPLC，厂家：Thermo。
血浆样本来自40名参与者。这40名参与者包括15名甲亢患者、10名甲减患者和15名健康对照。所有参与者都是女性。在禁食过夜后，从所有参与者的外周静脉采集血浆样本。EDTA血样在收集后4小时内离心10分钟，提取分离的上清液并储存在-80℃直至进一步分析。
本发明所用的试剂：甲酸，甲醇，甲酸铵，乙腈，二硫苏糖醇(DTT)，碘乙酰胺(IAM)。
一、针对蛋白质标志物，往100μL血液样本中加入无SDS L3，将体积补足1mL；然后进行还原烷基化反应，具体操作步骤如下：蛋白提取，蛋白富集，富集质控，蛋白酶解
将抽干的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10min后，取上清进样。通过Thermo公司UltiMate3000 UHPLC进行分离。样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱(150μm内径，1.8μm柱料粒径，约35cm柱长)串联，以500nL/min流速通过如下有效梯度进行分离：0～5min，5％流动相B(98％乙腈，0.1％甲酸)；5～120min，流动相B从5％线性升至25％；120～160min，流动相B从25％升至35％；160～170min，流动相B从35％升至80％；170～175min，80％流动相B；175～180min，5％流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪并按如下参数进行检测：
1.DDA建库检测
经过液相分离的肽段通过nano ESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive HFX(Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA)进行DDA(Data Dependent Acquisition)模式检测。
2.DIA质谱检测
经过液相分离的肽段通过nano ESI源离子化后进入到串联质谱仪Q Exactive HFX(Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA)进行DIA(Data Independent Acquisition)模式检测。
二、针对代谢物标志物，首先是代谢物提取：将样本在4℃条件下缓慢解冻后，取100μL置于96孔板中，加入300μL提取液(甲醇:乙腈＝2:1,v:v，-20℃预冷)+10μL内标1+10μL内标2，涡旋混匀1min，-20℃静置2h后，4℃，4000rcf离心20min。离心后取300μL上清，置于冷冻真空浓缩仪抽干后，加入150μL复溶液(甲醇:水＝1:1,v:v)进行复溶，涡旋震荡1min,4℃，4000r·min-1离心30min，取上清置于进样瓶中。每个样本的上清液各取10μL混合成QC质控样本，用于评估LC-MS分析过程的重复性和稳定性。
之后是LC-MS/MS分析本实验采用Waters 2D UPLC(waters,USA)串联QExactive高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific,USA)来进行代谢物的分离和检测。
三、生信分析寻找标志物
主要通过差异筛选、集成特征选择算法(EFS)、ROC分析等生信分析方法，来得到生物标志物。筛选差异的标准主要是Fold change>＝1.2,P value<0.05.然后对差异蛋白和代谢物进行EFS rank以及t-test,综合结果，选出潜在标志物，再接ROC分析得出最终的生物标志物。
如图1所示，展示了本实施例中蛋白质组(上)与代谢组(下)的PCA结果，图中N代表健康对照组，THE代表甲亢组，THO代表甲减组。PCA分析图反映了各组样本的整体分布情况，从中可以筛选出12个标志物，其中6个为甲状腺功能亢进症标志物，6个为甲状腺功能减退症标志物。甲状腺功能亢进症标志物中6个标志物为补体C4-A、C3/C5转化酶、谷胱甘肽过氧化物酶3、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酸，其中补体C4-A、C3/C5转化酶、谷胱甘肽过氧化物酶3属于蛋白质，L-精氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酸属于代谢产物；而甲状腺功能减退症标志物中6个标志物为载脂蛋白L1、α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、激肽原-1、可的松、皮质醇和L-苏氨酸，其中载脂蛋白L1、α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、激肽原-1属于蛋白质，可的松、皮质醇和L-苏氨酸属于代谢产物。
如图2所示，为本实施例中生信分析得到的甲状腺功能亢进症标志物中六个标志物的ROC曲线分析，即受试者工作特征曲线分析，同样的，如图3所示，为本实施例中生信分析得到的甲状腺功能减退症标志物中六个标志物的ROC曲线分析。ROC曲线中，AUC值为ROC曲线所覆盖的区域面积，其值越大，表明模型预测的准确率越高。从中可见，本实施例中筛选出12个标志物均具有较高的甲状腺功能异常诊断准确率。补体C4-A、C3/C5转化酶、谷胱甘肽过氧化物酶3、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酸中任意一个标志物都可以用来诊断是否存在甲状腺功能亢进症，载脂蛋白L1、α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、激肽原-1、可的松、皮质醇和L-苏氨酸中任意一个标志物都可以用来诊断是否存在甲状腺功能减退症。
四、LASSO与逻辑回归，将代谢物和蛋白质组合为多组学模型，来检测甲状腺功能异常。
首先，使用LASSO回归算法选择最小的特征集对三个样本组进行分类。快速缺失值插补是通过“NAguide”R软件包在每个单独数据集中的链式随机森林实现的。在每个数据集上通过链式随机森林进行快速插补后，它们被分别缩放到Z-score并连接到正则化(L1范数)机器学习方法。随后，使用“caret”和“glmnet”R软件包进行常规机器学习以训练、测试和评估LASSO逻辑分类模型。使用LASSO参数化(alpha＝1)，在lambda值的搜索网格上调整模型：0.001到0.3，步长为0.01。该模型针对ROC曲线下的最高面积(AUC)进行了优化。对于多类比较，模型计算为所有适用的一类与所有其他类比较的平均AUC。本实施例中，通过在插入符号中使用“varImp()”并保持所有特征的重要性非零，获得特征重要性和整体LASSO蛋白质组学-代谢组学特征；同时使用Python v3中的Sklearn包，逻辑回归分析生成最优预测模型，并采用LOOCV(留一法交叉验证)来提高模型的稳健性。
针对甲亢组，将之前得到的甲亢6个候选蛋白生物标志物及6个候选代谢生物标志物结合，应用Python中的Sklearn包构建逻辑回归模型，并采用LOOCV算法来增强模型的鲁棒性，从而进行ROC曲线分析评价，图4展示了甲状腺功能亢进症标志物的6个标志物组合模型ROC分析结果，结果表明AUC值为0.991。相比较与前述单一的蛋白标志物或者单一代谢标志物来说，蛋白与代谢的组合生物标志物具有更好的预测准确性。
针对甲减组，将之前得到的甲减6个候选蛋白生物标志物及6个候选代谢生物标志物结合，应用Python中的Sklearn包构建逻辑回归模型，并采用LOOCV算法来增强模型的鲁棒性，从而进行ROC曲线分析评价，图5展示了甲状腺功能减退症标志物的6个标志物组合模型ROC结果，结果表明，AUC值为0.993。相比较与前述单一的蛋白标志物或者单一代谢标志物来说，蛋白与代谢的组合生物标志物具有更好的预测准确性。
五、验证实验
为了验证本发明中上述6种标志物在诊断甲状腺功能异常中的实际效果，设计了验证实验。验证实验所用试剂盒为Human Complement C4-A,C3/C5convertase,Glutathionperoxidase 3,L-Arginine,L-Proline,L-Glutamic acid等ELISA检测试剂盒，品牌为(Signalway Antibody)。采用ELISA检测试剂盒针对各自检测的标志物进行验证实验的具体做法如下：
1、试剂准备：
洗涤缓冲液：缓冲液的稀释与水的比例为1:25，30mL缓冲液720mL水配成洗涤缓冲液。
标准品：加入2mL的标品稀释液重组，然后通过对半稀释法将标品分为6份(50.0，25.0，12.5，6.25，3.12，1.56，0.78单位：ng/mL)加一份空白对照。
检测试剂：检测试剂A和B分别按1:100比例用稀释液A和B进行稀释。
2、具体实验过程：
2.1)每个样本取40μL血浆，标准品同样每份取40μL，重复一次，全部放入96孔板，盖上封板膜，放在37度下2小时。
2.3)移除每个孔内的液体，向每个孔内加入100μL检测试剂A,盖上封板膜并且放在37度下1小时。
2.3)移除每个孔内的液体，用洗涤缓冲液洗涤每个孔3次，每次每孔300μL洗涤缓冲液。
2.4)向每个孔加入100μL检测试剂B，盖上封板膜，同样放在37度下1h。
2.5)移除孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤五次。
2.6)向每个孔加入90μL底物，盖上封板膜，放在37度下孵育10-20min。
2.7)向每个孔加入50μL终止液，发现每个孔内的颜色有明显变化。
2.8)设置波长为450nm，通过酶标仪检测出每孔的OD值，根据OD值换算标志物的水平值。
图6展示了甲状腺功能亢进症标志物分析与验证结果，THE代表甲亢组，THO代表甲减组，N代表正常对照组。由于是甲亢的标志物，因此在甲亢组的表达情况要区别于甲减组与正常对照组。图6中依次展示了对应的补体C4-A，C3/C5转化酶，谷胱甘肽过氧化物酶3，L-精氨酸，L-脯氨酸和L-谷氨酸。以补体C4-A为例，其在甲亢组中的表达明显低于甲减组和正常组，并且结合它的ROC结果(大于0.7)认为其能作为甲亢的潜在生物标志物，其他标志物箱线图同样表明标志物甲亢组中的表达异于另外两组且ROC结果均表现良好。由此证明，补体C4-A、C3/C5转化酶、谷胱甘肽过氧化物酶3、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酸中任意一个标志物都可以用来诊断是否存在甲状腺功能亢进症。
图7展示了甲状腺功能减退症标志物分析与验证结果，THE代表甲亢组，THO代表甲减组，N代表正常对照组。由于是甲减的标志物，因此在甲减组的表达情况要区别于甲亢组与正常对照组。图7中依次展示了对应的载脂蛋白L1，α-胰蛋白酶抑制剂重链H4，激肽原-1，可的松，皮质醇，L-苏氨酸。以载脂蛋白L1为例，其在甲减组的表达明显高于在甲亢组与正常组，并结合ROC结果推断，可作为甲减的潜在生物标志物。其他标志物箱线图同样表明标志物甲减组中的表达异于另外两组且ROC结果均表现良好。由此证明，载脂蛋白L1、α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、激肽原-1、可的松、皮质醇和L-苏氨酸中任意一个标志物都可以用来诊断是否存在甲状腺功能减退症。
在实际用于诊断甲状腺功能异常时，可对诊断对象的血浆样本进行补体C4-A，C3/C5转化酶，谷胱甘肽过氧化物酶3，L-精氨酸，L-脯氨酸和L-谷氨酸检测来鉴定甲状腺功能亢进症，或者对血浆样本进行载脂蛋白L1，α-胰蛋白酶抑制剂重链H4，激肽原-1，可的松，皮质醇，L-苏氨酸检测来鉴定甲状腺功能减退症。根据前述图6和图7的结果，根据每个标志物在各组样本的平均水平统计分析，可以得到12个标志物各自用于诊断时的判定标准，具体如下：
补体C4A在不同组别中的表达水平不同，在甲亢患者体内表达明显低于甲减与正常组别,诊断对象血浆中补体C4A的表达量记作Abundance，正常人体血浆中补体C4A的表达量记作N，AR＝Abundance/N，根据丰度值比AR，若AR<0.95,则判定为甲状腺功能亢进症。
C3/C5转化酶在不同组别中的表达水平不同，在甲亢患者体内表达明显高于甲减与正常组别，诊断对象血浆中C3/C5转化酶的表达量记作Abundance，正常人体血浆中C3/C5转化酶的表达量记作N，AR＝Abundance/N，根据丰度值比AR，若AR>1.04,则判定为甲状腺功能亢进症。
谷胱甘肽过氧化物酶3在不同组别中的表达水平不同，在甲亢患者体内表达明显高于甲减与正常组别,诊断对象血浆中谷胱甘肽过氧化物酶3的表达量记作Abundance，正常人体血浆中谷胱甘肽过氧化物酶3的表达量记作N,AR＝Abundance/N，根据丰度值比AR，若AR<0.98,则判定为甲状腺功能亢进症。
L-精氨酸在不同组别中的表达水平不同，在甲亢患者体内表达明显高于甲减与正常组别，诊断对象血浆中L-精氨酸含量记作Intensity，正常人体血浆中L-精氨酸含量记作N,IR＝Intensity/N，根据密度值比IR，若IR>1.04,则判定为甲状腺功能亢进症。
L-脯氨酸在不同组别中的表达水平不同，在甲亢患者体内表达明显高于甲减与正常组别，诊断对象血浆中L-脯氨酸含量记作Intensity，正常人体血浆中L-脯氨酸含量记作N,IR＝Intensity/N，根据密度值比IR，若IR>1.01,则判定为甲状腺功能亢进症。
L-谷氨酸在不同组别中的表达水平不同，在甲亢患者体内表达明显高于甲减与正常组别，诊断对象血浆中L-谷氨酸含量记作Intensity，正常人体血浆中L-谷氨酸含量记作N，IR＝Intensity/N，根据密度值比IR，若IR>1.02,则判定为甲状腺功能亢进症。
载脂蛋白L1在不同组别中的表达水平不同，在甲减患者体内表达明显高于甲亢与正常组别，诊断对象血浆中载脂蛋白L1的表达量记作Abundance，正常人体血浆中载脂蛋白L1的表达量记作N，AR＝Abundance/N，根据丰度值比AR，若AR>1.25,则判定为甲状腺功能减退症。
α-胰蛋白酶抑制剂重链H4在不同组别中的表达水平不同，在甲减患者体内表达明显高于甲亢与正常组别，诊断对象血浆中α-胰蛋白酶抑制剂重链H4的表达量记作Abundance，正常人体血浆中α-胰蛋白酶抑制剂重链H4的表达量记作N，AR＝Abundance/N，根据丰度值比AR，若AR>1.31,则判定为甲状腺功能减退症。
激肽原-1在不同组别中的表达水平不同，在甲减患者体内表达明显高于甲亢与正常组别，诊断对象血浆中激肽原-1的表达量记作Abundance，正常人体血浆中激肽原-1的表达量记作N，AR＝Abundance/N，根据丰度值比AR，若AR>1.35,则判定为甲状腺功能减退症。
可的松在不同组别中的表达水平不同，在甲减患者体内表达明显高于甲亢与正常组别，诊断对象血浆中可的松的含量记作Intensity，正常人体血浆中可的松的含量记作N，IR＝Intensity/N，根据密度值比IR，若IR>1.05,则判定为甲状腺功能减退症。
皮质醇在不同组别中的表达水平不同，在甲减患者体内表达明显高于甲亢与正常组别，诊断对象血浆中皮质醇的含量记作Intensity，正常人体血浆中皮质醇的含量记作N，IR＝Intensity/N，根据密度值比IR，若IR>1.06,则判定为甲状腺功能减退症。
L-苏氨酸在不同组别中的表达水平不同，在甲减患者体内表达明显高于甲亢与正常组别，诊断对象血浆中L-苏氨酸的含量记作Intensity，正常人体血浆中L-苏氨酸的含量记作N，IR＝Intensity/N，根据密度值比IR，若IR>1.07,则判定为甲状腺功能减退症。
虽然上述6个甲状腺功能亢进症标志物和6个甲状腺功能减退症单独均可以用于诊断是否存在甲状腺功能异常，但是如前所述，将标志物的组合检测更为有效，具有更高准确率。针对每一种甲亢或甲减异常的6个标志物，当将多个标志物组合进行诊断时，需要分别利用前述的AR或者IR值，判断是否在风险范围内，当每一种甲状腺异常的所有标志物都在风险范围内时可以给出该种甲状腺异常的风险提示，或者如前所述根据在风险范围内的标志物在所有标志物中的占比，给出风险等级。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国科学院基础医学与肿瘤研究所（筹）
<120> 用于诊断甲状腺功能异常的生物标志物、试剂盒及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1744
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Arg Leu Leu Trp Gly Leu Ile Trp Ala Ser Ser Phe Phe Thr Leu
1 5 10 15
Ser Leu Gln Lys Pro Arg Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Val Val His
20 25 30
Leu Gly Val Pro Leu Ser Val Gly Val Gln Leu Gln Asp Val Pro Arg
35 40 45
Gly Gln Val Val Lys Gly Ser Val Phe Leu Arg Asn Pro Ser Arg Asn
50 55 60
Asn Val Pro Cys Ser Pro Lys Val Asp Phe Thr Leu Ser Ser Glu Arg
65 70 75 80
Asp Phe Ala Leu Leu Ser Leu Gln Val Pro Leu Lys Asp Ala Lys Ser
85 90 95
Cys Gly Leu His Gln Leu Leu Arg Gly Pro Glu Val Gln Leu Val Ala
100 105 110
His Ser Pro Trp Leu Lys Asp Ser Leu Ser Arg Thr Thr Asn Ile Gln
115 120 125
Gly Ile Asn Leu Leu Phe Ser Ser Arg Arg Gly His Leu Phe Leu Gln
130 135 140
Thr Asp Gln Pro Ile Tyr Asn Pro Gly Gln Arg Val Arg Tyr Arg Val
145 150 155 160
Phe Ala Leu Asp Gln Lys Met Arg Pro Ser Thr Asp Thr Ile Thr Val
165 170 175
Met Val Glu Asn Ser His Gly Leu Arg Val Arg Lys Lys Glu Val Tyr
180 185 190
Met Pro Ser Ser Ile Phe Gln Asp Asp Phe Val Ile Pro Asp Ile Ser
195 200 205
Glu Pro Gly Thr Trp Lys Ile Ser Ala Arg Phe Ser Asp Gly Leu Glu
210 215 220
Ser Asn Ser Ser Thr Gln Phe Glu Val Lys Lys Tyr Val Leu Pro Asn
225 230 235 240
Phe Glu Val Lys Ile Thr Pro Gly Lys Pro Tyr Ile Leu Thr Val Pro
245 250 255
Gly His Leu Asp Glu Met Gln Leu Asp Ile Gln Ala Arg Tyr Ile Tyr
260 265 270
Gly Lys Pro Val Gln Gly Val Ala Tyr Val Arg Phe Gly Leu Leu Asp
275 280 285
Glu Asp Gly Lys Lys Thr Phe Phe Arg Gly Leu Glu Ser Gln Thr Lys
290 295 300
Leu Val Asn Gly Gln Ser His Ile Ser Leu Ser Lys Ala Glu Phe Gln
305 310 315 320
Asp Ala Leu Glu Lys Leu Asn Met Gly Ile Thr Asp Leu Gln Gly Leu
325 330 335
Arg Leu Tyr Val Ala Ala Ala Ile Ile Glu Ser Pro Gly Gly Glu Met
340 345 350
Glu Glu Ala Glu Leu Thr Ser Trp Tyr Phe Val Ser Ser Pro Phe Ser
355 360 365
Leu Asp Leu Ser Lys Thr Lys Arg His Leu Val Pro Gly Ala Pro Phe
370 375 380
Leu Leu Gln Ala Leu Val Arg Glu Met Ser Gly Ser Pro Ala Ser Gly
385 390 395 400
Ile Pro Val Lys Val Ser Ala Thr Val Ser Ser Pro Gly Ser Val Pro
405 410 415
Glu Val Gln Asp Ile Gln Gln Asn Thr Asp Gly Ser Gly Gln Val Ser
420 425 430
Ile Pro Ile Ile Ile Pro Gln Thr Ile Ser Glu Leu Gln Leu Ser Val
435 440 445
Ser Ala Gly Ser Pro His Pro Ala Ile Ala Arg Leu Thr Val Ala Ala
450 455 460
Pro Pro Ser Gly Gly Pro Gly Phe Leu Ser Ile Glu Arg Pro Asp Ser
465 470 475 480
Arg Pro Pro Arg Val Gly Asp Thr Leu Asn Leu Asn Leu Arg Ala Val
485 490 495
Gly Ser Gly Ala Thr Phe Ser His Tyr Tyr Tyr Met Ile Leu Ser Arg
500 505 510
Gly Gln Ile Val Phe Met Asn Arg Glu Pro Lys Arg Thr Leu Thr Ser
515 520 525
Val Ser Val Phe Val Asp His His Leu Ala Pro Ser Phe Tyr Phe Val
530 535 540
Ala Phe Tyr Tyr His Gly Asp His Pro Val Ala Asn Ser Leu Arg Val
545 550 555 560
Asp Val Gln Ala Gly Ala Cys Glu Gly Lys Leu Glu Leu Ser Val Asp
565 570 575
Gly Ala Lys Gln Tyr Arg Asn Gly Glu Ser Val Lys Leu His Leu Glu
580 585 590
Thr Asp Ser Leu Ala Leu Val Ala Leu Gly Ala Leu Asp Thr Ala Leu
595 600 605
Tyr Ala Ala Gly Ser Lys Ser His Lys Pro Leu Asn Met Gly Lys Val
610 615 620
Phe Glu Ala Met Asn Ser Tyr Asp Leu Gly Cys Gly Pro Gly Gly Gly
625 630 635 640
Asp Ser Ala Leu Gln Val Phe Gln Ala Ala Gly Leu Ala Phe Ser Asp
645 650 655
Gly Asp Gln Trp Thr Leu Ser Arg Lys Arg Leu Ser Cys Pro Lys Glu
660 665 670
Lys Thr Thr Arg Lys Lys Arg Asn Val Asn Phe Gln Lys Ala Ile Asn
675 680 685
Glu Lys Leu Gly Gln Tyr Ala Ser Pro Thr Ala Lys Arg Cys Cys Gln
690 695 700
Asp Gly Val Thr Arg Leu Pro Met Met Arg Ser Cys Glu Gln Arg Ala
705 710 715 720
Ala Arg Val Gln Gln Pro Asp Cys Arg Glu Pro Phe Leu Ser Cys Cys
725 730 735
Gln Phe Ala Glu Ser Leu Arg Lys Lys Ser Arg Asp Lys Gly Gln Ala
740 745 750
Gly Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile Leu Gln Glu Glu Asp Leu Ile Asp
755 760 765
Glu Asp Asp Ile Pro Val Arg Ser Phe Phe Pro Glu Asn Trp Leu Trp
770 775 780
Arg Val Glu Thr Val Asp Arg Phe Gln Ile Leu Thr Leu Trp Leu Pro
785 790 795 800
Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile His Gly Leu Ser Leu Ser Lys Thr
805 810 815
Lys Gly Leu Cys Val Ala Thr Pro Val Gln Leu Arg Val Phe Arg Glu
820 825 830
Phe His Leu His Leu Arg Leu Pro Met Ser Val Arg Arg Phe Glu Gln
835 840 845
Leu Glu Leu Arg Pro Val Leu Tyr Asn Tyr Leu Asp Lys Asn Leu Thr
850 855 860
Val Ser Val His Val Ser Pro Val Glu Gly Leu Cys Leu Ala Gly Gly
865 870 875 880
Gly Gly Leu Ala Gln Gln Val Leu Val Pro Ala Gly Ser Ala Arg Pro
885 890 895
Val Ala Phe Ser Val Val Pro Thr Ala Ala Ala Ala Val Ser Leu Lys
900 905 910
Val Val Ala Arg Gly Ser Phe Glu Phe Pro Val Gly Asp Ala Val Ser
915 920 925
Lys Val Leu Gln Ile Glu Lys Glu Gly Ala Ile His Arg Glu Glu Leu
930 935 940
Val Tyr Glu Leu Asn Pro Leu Asp His Arg Gly Arg Thr Leu Glu Ile
945 950 955 960
Pro Gly Asn Ser Asp Pro Asn Met Ile Pro Asp Gly Asp Phe Asn Ser
965 970 975
Tyr Val Arg Val Thr Ala Ser Asp Pro Leu Asp Thr Leu Gly Ser Glu
980 985 990
Gly Ala Leu Ser Pro Gly Gly Val Ala Ser Leu Leu Arg Leu Pro Arg
995 1000 1005
Gly Cys Gly Glu Gln Thr Met Ile Tyr Leu Ala Pro Thr Leu Ala Ala
1010 1015 1020
Ser Arg Tyr Leu Asp Lys Thr Glu Gln Trp Ser Thr Leu Pro Pro Glu
1025 1030 1035 1040
Thr Lys Asp His Ala Val Asp Leu Ile Gln Lys Gly Tyr Met Arg Ile
1045 1050 1055
Gln Gln Phe Arg Lys Ala Asp Gly Ser Tyr Ala Ala Trp Leu Ser Arg
1060 1065 1070
Asp Ser Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Val Leu Lys Val Leu Ser Leu
1075 1080 1085
Ala Gln Glu Gln Val Gly Gly Ser Pro Glu Lys Leu Gln Glu Thr Ser
1090 1095 1100
Asn Trp Leu Leu Ser Gln Gln Gln Ala Asp Gly Ser Phe Gln Asp Pro
1105 1110 1115 1120
Cys Pro Val Leu Asp Arg Ser Met Gln Gly Gly Leu Val Gly Asn Asp
1125 1130 1135
Glu Thr Val Ala Leu Thr Ala Phe Val Thr Ile Ala Leu His His Gly
1140 1145 1150
Leu Ala Val Phe Gln Asp Glu Gly Ala Glu Pro Leu Lys Gln Arg Val
1155 1160 1165
Glu Ala Ser Ile Ser Lys Ala Asn Ser Phe Leu Gly Glu Lys Ala Ser
1170 1175 1180
Ala Gly Leu Leu Gly Ala His Ala Ala Ala Ile Thr Ala Tyr Ala Leu
1185 1190 1195 1200
Thr Leu Thr Lys Ala Pro Val Asp Leu Leu Gly Val Ala His Asn Asn
1205 1210 1215
Leu Met Ala Met Ala Gln Glu Thr Gly Asp Asn Leu Tyr Trp Gly Ser
1220 1225 1230
Val Thr Gly Ser Gln Ser Asn Ala Val Ser Pro Thr Pro Ala Pro Arg
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Asn Pro Ser Asp Pro Met Pro Gln Ala Pro Ala Leu Trp Ile Glu Thr
1250 1255 1260
Thr Ala Tyr Ala Leu Leu His Leu Leu Leu His Glu Gly Lys Ala Glu
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Met Ala Asp Gln Ala Ser Ala Trp Leu Thr Arg Gln Gly Ser Phe Gln
1285 1290 1295
Gly Gly Phe Arg Ser Thr Gln Asp Thr Val Ile Ala Leu Asp Ala Leu
1300 1305 1310
Ser Ala Tyr Trp Ile Ala Ser His Thr Thr Glu Glu Arg Gly Leu Asn
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Val Thr Leu Ser Ser Thr Gly Arg Asn Gly Phe Lys Ser His Ala Leu
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1525 1530 1535
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1635 1640 1645
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1650 1655 1660
Arg Asn Phe Leu Val Arg Ala Ser Cys Arg Leu Arg Leu Glu Pro Gly
1665 1670 1675 1680
Lys Glu Tyr Leu Ile Met Gly Leu Asp Gly Ala Thr Tyr Asp Leu Glu
1685 1690 1695
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<210> 2
<211> 1266
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
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1 5 10 15
Leu Ala Asp Ser Ala Pro Ser Cys Pro Gln Asn Val Asn Ile Ser Gly
20 25 30
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260 265 270
Leu Gly Ser Lys Lys Asp Gly Glu Arg His Ala Phe Ile Leu Gln Asp
275 280 285
Thr Lys Ala Leu His Gln Val Phe Glu His Met Leu Asp Val Ser Lys
290 295 300
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385 390 395 400
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405 410 415
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Met Glu Ala Asn Leu Ala Leu Arg Arg Pro Gln Gly Ser Thr Cys Arg
435 440 445
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660 665 670
Pro Ile Gly Thr Arg Lys Val Gly Ser Gln Tyr Arg Leu Glu Asp Ser
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1250 1255 1260
Phe Leu
1265
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<211> 398
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
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1 5 10 15
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290 295 300
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
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Leu Ser Leu Leu Ala Ile His Gln Thr Thr Thr Ala Glu Lys Asn Gly
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35 40 45
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Asn Phe Ser Met Ile Ile Asp Gly Met Thr Tyr Pro Gly Ile Ile Lys
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Glu Lys Ala Glu Ala Gln Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Val Ala Lys Gly
100 105 110
Lys Ser Ala Gly Leu Val Lys Ala Thr Gly Arg Asn Met Glu Gln Phe
115 120 125
Gln Val Ser Val Ser Val Ala Pro Asn Ala Lys Ile Thr Phe Glu Leu
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165 170 175
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Ser Pro Glu Gln Gln Glu Thr Val Leu Asp Gly Asn Leu Ile Ile Arg
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Tyr Asp Val Asp Arg Ala Ile Ser Gly Gly Ser Ile Gln Ile Glu Asn
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Gly Tyr Phe Val His Tyr Phe Ala Pro Glu Gly Leu Thr Thr Met Pro
260 265 270
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Lys Ile Gln Gln Thr Arg Glu Ala Leu Ile Lys Ile Leu Asp Asp Leu
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340 345 350
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420 425 430
Asn Gly Gly Leu Ala Arg Arg Ile His Glu Asp Ser Asp Ser Ala Leu
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Phe Lys Tyr Tyr Leu Gln Gly Ala Lys Ile Pro Lys Pro Glu Ala Ser
625 630 635 640
Phe Ser Pro Arg Arg Gly Trp Asn Arg Gln Ala Gly Ala Ala Gly Ser
645 650 655
Arg Met Asn Phe Arg Pro Gly Val Leu Ser Ser Arg Gln Leu Gly Leu
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755 760 765
Val Thr Gly Gln Tyr Glu Arg Glu Lys Ala Gly Phe Ser Trp Ile Glu
770 775 780
Val Thr Phe Lys Asn Pro Leu Val Trp Val His Ala Ser Pro Glu His
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Val Val Val Thr Arg Asn Arg Arg Ser Ser Ala Tyr Lys Trp Lys Glu
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885 890 895
Leu Arg Val Gln Gly Asn Asp His Ser Ala Thr Arg Glu Arg Arg Leu
900 905 910
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915 920 925
Glu Leu
930
<210> 5
<211> 644
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
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1 5 10 15
Leu Thr Gln Glu Ser Gln Ser Glu Glu Ile Asp Cys Asn Asp Lys Asp
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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165 170 175
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225 230 235 240
Ile Ala Ser Phe Ser Gln Asn Cys Asp Ile Tyr Pro Gly Lys Asp Phe
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Asp Gly Leu Ser

Claims (10)

1.一种用于诊断甲状腺功能异常的生物标志物，其特征在于，为存在于人体血浆中的甲状腺功能亢进症标志物和/或甲状腺功能减退症标志物；
所述甲状腺功能亢进症标志物为补体C4-A、C3/C5转化酶、谷胱甘肽过氧化物酶3、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酸中的一种或多种组合；
所述甲状腺功能减退症标志物为载脂蛋白L1、α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、激肽原-1、可的松、皮质醇和L-苏氨酸中的一种或多种组合。
2.如权利要求1所述的用于诊断甲状腺功能异常的生物标志物，其特征在于，所述甲状腺功能亢进症标志物为补体C4-A、C3/C5转化酶、谷胱甘肽过氧化物酶3、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酸共6种标志物的组合。
3.如权利要求1所述的用于诊断甲状腺功能异常的生物标志物，其特征在于，所述甲状腺功能减退症标志物为载脂蛋白L1、α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、激肽原-1、可的松、皮质醇和L-苏氨酸共6种标志物的组合。
4.一种用于检测如权利要求1～3任一所述生物标志物的试剂在制备甲状腺功能异常诊断试剂盒或检测装置中的应用。
5.一种诊断甲状腺功能异常的试剂盒，其特征在于，包括用于检测如权利要求1～3任一所述生物标志物的试剂；所述试剂盒优选为ELISA试剂盒。
6.一种如权利要求1～3任一所述生物标志物在非疾病诊断或治疗目的的甲状腺功能异常诊断中的应用。
7.一种诊断甲状腺功能异常的诊断设备，其特征在于，包括：
数据获取设备，用于获取诊断对象的检测数据，所述检测数据为从诊断对象的人体血浆中检测得到的如权利要求1～3任一所述生物标志物中每一种标志物的水平值，其中若标志物为蛋白则以蛋白的表达量作为其水平值，若标志物为代谢物则以代谢物在血浆中的含量作为其水平值；
数据处理设备，用于根据诊断对象的检测数据计算得到每一个标志物的指标值，其中每一个标志物的指标值为该标志物在诊断对象人体血浆中的水平值与在没有甲状腺功能异常的正常人体血浆中的水平值之间的比值，然后判断计算得到的每一个标志物的指标值是否处于对应标志物的风险范围内，若所有标志物中存在一个或多个标志物的指标值处于甲状腺功能亢进症或甲状腺功能减退症的风险范围内，则给出对应的甲状腺功能异常的诊断结果提示。
8.如权利要求7所述的诊断设备，其特征在于，优选的，所述补体C4-A对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值小于0.95；优选的，所述C3/C5转化酶对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值大于1.04；优选的，所述谷胱甘肽过氧化物酶3对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值小于0.98；优选的，所述L-精氨酸对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值大于1.04；优选的，所述L-脯氨酸对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值大于1.01；优选的，所述L-谷氨酸对应的提示甲状腺功能亢进症的所述风险范围为指标值大于1.02；优选的，所述载脂蛋白L1对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.25；优选的，所述α-胰蛋白酶抑制剂重链H4对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.31；优选的，所述激肽原-1对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.35；优选的，所述可的松对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.05；优选的，所述皮质醇对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.06；优选的，所述L-苏氨酸对应的提示甲状腺功能减退症的所述风险范围为指标值大于1.07。
9.如权利要求7所述的诊断设备，其特征在于，所述数据处理设备中，当所述甲状腺功能亢进症标志物中所有标志物的指标值均处于各自的风险范围内或者当所述甲状腺功能减退症标志物中所有标志物的指标值均处于各自的风险范围内时，才给出对应的甲状腺功能异常的诊断结果提示。
10.如权利要求7所述的诊断设备，其特征在于，所述数据获取设备为用于输入数据的输入设备或者用于通过接口从外部数据存储设备上读取数据的通信设备。
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