JP2018085934A - 核酸増幅用組成物 - Google Patents
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Description
次世代シーケンサーでは膨大なデータが得られるが、予め濃度が判明しているDNAライブラリーサンプルのロード量が正確でないと、得られるデータの量および質の低下を招くため、ライブラリーサンプル濃度の定量を正確に求めることが重要となる。
項2.サイズが600bp以上のDNAシーケンサー用DNAライブラリーサンプルを定量するための組成であって、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物。
項3.前記ファミリーBに属するDNAポリメラーゼがサーモコッカス(Thermococcus)属又はパイロコッカス(Pyrococcus)属由来である項1または2に記載の核酸増幅用組成物。
項4.前記ファミリーBに属するDNAポリメラーゼがサーモコッカス・コダカラエンシス(Thermococcus kodakaraensis)由来である項3に記載の核酸増幅用組成物。
項5.前記サーモコッカス(Thermococcus)属由来のDNAポリメラーゼが3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損していることを特徴とする項3または4に記載の核酸増幅用組成物。
本発明の実施形態の一つは、GC含量が70%以上、好ましくは75%以上のGCリッチなターゲットを増幅することが可能である、DNAシーケンサー用DNAライブラリーサンプルを定量するための組成であって、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物である。
平均断片サイズが400bp、600bp、800bpのライブラリー調製を実施した。平均断片サイズ400bp、600bp、800bpを得るために、Kapa Hyper Plus Kit(Kapa Biosystems製)を用いて、キット付属のKapa Frag Enzymeで、ヒトゲノムDNA(Roche)100ngを5分(800bp用)、7分(600bp用)、10分(400bp用)の異なる処理時間で反応を行った。処理した産物を1%アガロースゲル電気泳動し、使用する断片サイズのDNAをゲルからMagExtractor−PCR&Gel Clean Up−(Toyobo製)で抽出および精製を行った。精製したDNA断片のライブラリー調製は、取扱説明書に準じて行った。
調製したライブラリーをテンプレートとして、サイズによる各社のPCR効率と定量値の違いを比較した。リアルタイムPCR試薬として、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を除去したKOD DNAポリメラーゼを使用しているKOD SYBR(商標登録)qPCR Mix(Toyobo製)を使用した。また、定量値を算出するためのDNAスタンダードとしてIllumina用 DNA定量スタンダード(Kapa Biosystems製)を使用した。リアルタイムPCRは、KOD SYBR(商標登録)qPCR Mix添付のマスターミックスを用い、1×qPCR Mix、1×ROX、各4pmolのプライマー(配列番号2、3)、ライブラリーテンプレートもしくはIllumina用 DNA定量スタンダードを含む20μlの反応液を調製した。反応は98℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→65℃、10秒→68℃、1分を35サイクル繰り返すスケジュールで行った。
平均GC含量が、50%、70%、80%のライブラリー調製を実施した。イルミナ社P5、P7タグを付加したプライマー(配列番号4〜21)を使用し、KOD FX Neo(Toyobo製)を用いて、ヒトゲノムDNA50ngをテンプレートとして増幅を行った。得られたPCR産物を、MagExtractor−PCR&Gel Clean Up−(Toyobo製)を用いて精製した。精製したPCR産物を組み合わせて、GC含量が50%、70%、80%となるライブラリーを作製した。
調製したDNAライブラリーをテンプレートとしてGC含量によるPCR効率の違いを比較した。リアルタイムPCR試薬として、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を除去したKOD DNAポリメラーゼを使用しているKOD SYBR(商標登録)qPCR Mixを使用した。また、定量値を算出するためのDNAスタンダードとしてIllumina用DNA定量スタンダードを使用した。 リアルタイムPCRは、KOD SYBR(商標登録)qPCR Mix添付のマスターミックスを用い、1×qPCR Mix、1×ROX、各4pmolのプライマー(配列番号2、3)、ライブラリーテンプレートまたはIllumina用DNA定量スタンダードを含む20μlの反応液を調製した。反応は98℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→65℃、10秒→68℃、1分を35サイクル繰り返すスケジュールで行った。
上記の定量値を使用して、Illumina(商標登録)製次世代であるシーケンサーMiseq(商標登録)にてMiseq Reagent Kit v2(300cycles)(Illumina製)を使用して、ランを実施した。
Claims (5)
- GC含量が70%以上のDNAシーケンサー用DNAライブラリーサンプルを定量するための組成であって、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物。
- サイズが600bp以上のDNAシーケンサー用DNAライブラリーサンプルを定量するための組成であって、ファミリーBに属するDNAポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用組成物。
- 前記ファミリーBに属するDNAポリメラーゼがサーモコッカス(Thermococcus)属又はパイロコッカス(Pyrococcus)属由来である請求項1または2に記載の核酸増幅用組成物。
- 前記ファミリーBに属するDNAポリメラーゼがサーモコッカス・コダカラエンシス(Thermococcus kodakaraensis)由来である請求項3に記載の核酸増幅用組成物。
- 前記サーモコッカス(Thermococcus)属由来のDNAポリメラーゼが3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損していることを特徴とする請求項3または4に記載の核酸増幅用組成物。
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