JP2017175968A - Pcr反応溶液の検出感度を維持する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
項1.以下の(a)〜(d)の工程を含むことを特徴とする2種類以上の標的核酸を増幅することにより検出する方法。
(a) 核酸中の標的領域を増幅するための2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、エキソヌクレアーゼ活性を持たないDNAポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを含むPCR反応溶液を調製する工程、
(b) 該PCR反応溶液に試料を混合する工程、
(c) 該PCR反応により増幅する工程、及び、
(d) 標的領域の増幅産物を示すシグナルを検出する工程
項2.前記(a)のPCR反応溶液が2mM以上のマグネシウムイオンを含むことを特徴とする項1に記載の方法。
項3.前記(a)のPCR反応溶中液に、さらにインターカレーターを含むことを特徴とする項1又は2に記載の方法。
項4.前記(a)のPCR反応溶液の調製工程を20℃から30℃の温度条件下にて行うことを特徴とする項1から3のいずれかに記載の方法。
項5.調製後の前記(a)のPCR反応溶液を20℃から30℃の温度条件下にて4時間静置後に、前記(b)〜(d)の工程を実施した際に得られる標的核酸由来のシグナルが、前記(a)の調製後10分以内のPCR反応溶液を使用し、前記(b)〜(d)の工程を実施した際に得られる標的核酸由来のシグナルと比較して30%以上残存していることを特徴とする項1から4のいずれかに記載の方法。
項6.試料に含まれる標的核酸を増幅し、検出するための核酸増幅用キットであって、該核酸の標的領域を増幅するための少なくとも2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、エキソヌクレアーゼ活性を有しないDNAポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを同一溶液中に含むことを特徴とする核酸増幅用キット。
本発明の実施形態において、PCR反応液はオリゴヌクレオチドプライマーセット(プライマーセット)、エキソヌクレアーゼ活性を有しないDNAポリメラーゼ、マグネシウムイオンを含む。その他の構成は特に限定されないが、鋳型となる核酸、1種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸(dATP,dCTP,dTTP,dGTP)又は、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩などを含有することが好ましい。
なお、本発明において使用されるDNAポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を示さないDNAポリメラーゼであれば、その起源、製造方法、変異箇所は特に限定されない。
本キットはプライマー、DNAポリメラーゼ、マグネシウムイオンが混合物として収容されていることを特徴とするが、そのほかの試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合されていてもよい。
サルモネラ遺伝子、腸管出血性大腸菌(EHEC)、赤痢菌のゲノムDNA各10コピーを試料として用い、マルチプレックスPCR反応および融解曲線解析を実施した。内部標準遺伝子のピークが71℃に、サルモネラ菌のピークが76℃に、腸管出血性大腸菌のピークが80℃に、赤痢菌のピークが85℃に、それぞれTm値を与える。
サルモネラ遺伝子、腸管出血性大腸菌(EHEC)、赤痢菌のゲノムDNA各10コピーを試料として用い、マルチプレックスPCR反応及び融解曲線解析を実施した。内部標準遺伝子のピークが71℃に、サルモネラ菌のピークが76℃に、腸管出血性大腸菌のピークが80℃に、赤痢菌のピークが85℃に、それぞれTm値を与える。
サルモネラ遺伝子、腸管出血性大腸菌(EHEC)、赤痢菌のゲノムDNA各10コピーを試料として用い、マルチプレックスPCR反応および融解曲線解析を実施した。25℃にて表3に示す反応溶液を調製し、25℃にて4時間静置した。本反応溶液にはエキソヌクレアーゼ活性を有するrTaq DNA polymerase(TOYOBO)を使用した。静置後の反応溶液に終濃度3mMとなるよう硫酸マグネシウムを添加した。本PCR反応溶液に精製ゲノムDNA各10コピーを添加し、PCR反応及び融解曲線解析を実施した。融解曲線解析は表2に示すサイクル条件にてPCRを実施し、標的核酸由来のシグナルを検出した。解析には、リアルタイムPCR装置Light Cycler(登録商標)96(Roche)を使用した。
Claims (6)
- 以下の(a)〜(d)の工程を含むことを特徴とする2種類以上の標的核酸を増幅することにより検出する方法。
(a) 核酸中の標的領域を増幅するための2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、エキソヌクレアーゼ活性を持たないDNAポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを含むPCR反応溶液を調製する工程、
(b) 該PCR反応溶液に試料を混合する工程、
(c) 該PCR反応により増幅する工程、及び、
(d) 標的領域の増幅産物を示すシグナルを検出する工程 - 前記(a)のPCR反応溶液が2mM以上のマグネシウムイオンを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記(a)のPCR反応溶液中に、さらにインターカレーターを含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記(a)のPCR反応溶液の調製工程を20℃から30℃の温度条件下にて行うことを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 調製後の前記(a)のPCR反応溶液を20℃から30℃の温度条件下にて4時間静置後に、前記(b)〜(d)の工程を実施した際に得られる標的核酸由来のシグナルが、前記(a)の調製後10分以内のPCR反応溶液を使用し、前記(b)〜(d)の工程を実施した際に得られる標的核酸由来のシグナルと比較して30%以上残存していることを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 試料に含まれる標的核酸を増幅し、検出するための核酸増幅用キットであって、該核酸の標的領域を増幅するための少なくとも2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、エキソヌクレアーゼ活性を有しないDNAポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを同一溶液中に含むことを特徴とする核酸増幅用キット。
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