CN114231624A - 一种环状非编码rna在肾癌骨转移早期诊断及治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环状非编码RNA在肾癌骨转移早期诊断及治疗中的应用,涉及生物医学技术领域。本发明包括:用于检测cRCCBM的试剂在制备肾癌骨转移早期诊断试剂盒中的应用;所述肾癌骨转移早期诊断试剂盒的诊断原理是基于NR3C4/cRCCBM/has‑miR‑149‑3p/M‑CSF促进肾癌骨转移的信号通路轴;所述肾癌骨转移早期诊断试剂盒的检测样品为肾癌组织;具有cRCCBM抑制作用的试剂在制备治疗肾癌骨转移的药物中的应用。本发明通过研究发现cRCCBM在肾癌骨转移组织中高度上调,并伴有不良预后,促进了RCC细胞的体外迁移及其在体内的转移,cRCCBM受雄激素受体负向调控,通过ceRNA机制调节促进集落刺激因子1表达充当肾癌骨转移的诱导剂,cRCCBM是促进肾癌骨转移的关键分子,具有早期肾癌骨转移的诊断和治疗潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,特别是涉及一种环状非编码RNA在肾癌骨转移早期诊断及治疗中的应用。
背景技术
肾细胞癌(RCC)是一种高度恶性的泌尿系统肿瘤,占所有新发恶性病例的4.1%,且发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势。肾细胞癌(RCC)具有较高的恶性倾向,除外科手术外,放疗和化疗均不敏感,所以发生局部浸润和远处转移较早。肾细胞癌(RCC)患者五年生存率接近93%,而转移性肾细胞癌(mRCC)可下降至12%。骨骼是mRCC患者最常见的转移部位之一,约35-40%的mRCC患者发生肾癌骨转移(RBM)。肾癌骨转移(RBM)患者存在发生骨骼相关事件风险,包括病理性骨折、骨痛、脊髓压迫、高钙血症等,严重影响生活质量甚至总体生存时间。目前肾癌骨转移(RBM)的发生机制尚不清楚,因此,了解肾癌骨转移(RBM)的内在机制对于将来的临床治疗至关重要。
流行病学研究表明肾脏肿瘤的发生有明显的性别差异,即男性与女性的发病比率约为1.9:1,提示激素水平或激素受体(NR3C4)在肾脏肿瘤中可能具有重要作用。临床研究表明肾癌患者肾脏原发肿瘤中的NR3C4表达显著高于肿瘤旁组织。细胞学实验显示雄激素受体在SW839、CAKI-2及OS-RC-2三种细胞系中有相对高的表达,但在ACHN、786-O及769-P中表达相对较低。近年来,雄激素受体对肾癌的远处靶器官差异转移调控的研究越来越受到人们关注。但NR3C4是否在肾癌的骨转移中起调控作用及其机制尚不得知。
非编码RNA包括微RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA),占真核转录总RNA的95%,并因其在基因调控中的功能越来越受到重视。circRNA是由外显子或内含子型剪切形成的首尾相连的环状结构构成,具有高丰度、稳定性和进化保守性,表明circRNA具有重要的生物调节功能。circRNA的表达具有细胞或组织特异性,目前研究发现多种circRNA在肾癌肿瘤组织中存在异常表达,并且在肾癌发生发展中circRNA的表达谱也不尽相同。虽然circRNA在基因调控中的确切作用和机制仍有待近一步证实,但是circRNA作为潜在的肾癌骨转移的早期诊断标志物和治疗靶标具有重要意义。
目前circRNA的机制研究较多的是ceRNA(竞争性内源RNA)机制。ceRNA假说表明circRNA可以竞争性结合miRNA,从而减少miRNA与靶基因结合而影响转录后水平的mRNA稳定性和转录。许多circRNA具有不同类型和数量的miRNA结合位点,可以特异性结合多种miRNA。
总的来说,目前并无关于环状非编码RNA-hsa_circRNA_400037(cRCCBM)通过ceRNA机制调节从而促进M-CSF充当肾细胞癌骨转移诱导剂的作用的相关技术。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测cRCCBM的试剂以及具有cRCCBM抑制作用的试剂在肾癌骨转移早期诊断中的应用,以解决了上述背景技术中的问题,提供一种与肾癌骨转移相关的RNA分子及其应用。
为解决上述技术问题,本发明是通过以下技术方案实现的:用于检测cRCCBM的试剂在制备肾癌骨转移早期诊断试剂盒中的应用。
进一步地,所述肾癌骨转移早期诊断试剂盒的诊断原理是基于NR3C4/cRCCBM/has-miR-149-3p/M-CSF促进肾癌骨转移的信号通路轴。
进一步地,所述肾癌骨转移早期诊断试剂盒的检测样品为肾癌组织。
具有cRCCBM抑制作用的试剂在制备治疗肾癌骨转移的药物中的应用。
本发明具有以下有益效果:
1.本发明通过发现cRCCBM在肾癌骨转移组织中高度上调,并伴有不良预后,促进了肾癌细胞的体外迁移及其在体内的转移。功能丧失和功能增强试验表明,cRCCBM受NR3C4调控,可通过ceRNA机制吸附has-miR-149-3p发挥作用,阻止了其与M-CSF mRNA的结合,从而促进肾癌细胞的生长及侵袭能力。总之,我们的结果表明,cRCCBM是肾细胞癌进展的驱动力,可作为肾癌骨转移的早期诊断标志物或治疗靶标。
2.本发明发现在RCC细胞中过表达cRCCBM可增加RCC细胞的骨侵袭能力;体内沉默cRCCBM表达,明显抑制了肾细胞癌定向骨侵袭的能力,使小鼠中肿瘤骨转移的发生率显著降低。因此,cRCCBM抑制剂可作为治疗RBM的药物。
3.本发明发现在RCC细胞中下调M-CSF的表达,降低了RCC细胞的骨侵袭能力;体内实验发现具有较高骨组织侵袭力的肾癌组织中M-CSF表达高,因此,M-CSF的抑制剂可作为治疗RBM的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一实施例中NR3C4负向调控肾癌细胞的增殖及向破骨细胞分化示意图;
A,B:肾癌组织样本中NR3C4的表达情况(AT.肿瘤旁正常组织;PT.原发肿瘤组织;BM.骨转移组织);C:GEO数据库肾癌骨转移样本NR3C4 mRNA的表达情况(non-BM.非骨转移组织;BM.骨转移组织);D:SW839中沉默NR3C4后CM促进BMMs增殖;E:SW839中沉默NR3C4后CM促进BMMs向破骨细胞分化;F:OS-RC-2细胞中过表达NR3C4后CM抑制BMMs增殖;G:OS-RC-2细胞中过表达NR3C4后CM抑制BMMs增殖。
图2为本发明一实施例中cRCCBM在RBM组织中上调示意图;
A:差异circRNA的总体表达热图情况;B:分别沉默和过表达NR3C4后对候选circRNA的表达影响。
图3为本发明一实施例中cRCCBM促进RCC细胞骨转移示意图;
A:SW839肾癌细胞沉默NR3C4、cRCCBM后破骨细胞数量检测;B:OS-RC-2肾癌细胞过表达NR3C4、cRCCBM后破骨细胞数量检测;C:SW839肾癌细胞沉默NR3C4、cRCCBM后BMMs细胞增殖情况;D:OS-RC-2肾癌细胞过表达NR3C4、cRCCBM后BMMs细胞增殖情况。
图4为本发明一实施例中M-CSF调控BMMs细胞增殖及破骨细胞分化示意图;
A:SW839及OS-RC-2细胞中NR3C4对肿瘤细胞源性破骨激活因子mRNA水平的影响;B:SW839及OS-RC-2细胞中NR3C4对肿瘤细胞源性破骨激活因子蛋白水平的影响;C:SW839细胞中M-CSF中和抗体实验验证BMMs分化情况(NA.中和抗体);D:SW839细胞中NR3C4/cRCCBM对下游M-CSF蛋白水平的调节情况;E:OS-RC-2细胞中NR3C4/cRCCBM对下游M-CSF蛋白水平的调节情况。
图5为本发明一实施例中cRCCBM通过ceRNA机制结合has-miR-149-3p进而调控靶基因M-CSF表达示意图;
A:韦恩图显示多个网站预测M-CSF结合miRNA的情况;B:circRNA-miRNA pulldown实验检测circRNA与miRNA结合的情况,NC为对照组,Biotin为circRNA探针组;C:调控NR3C4及has-miR-149-3p后M-CSF蛋白表达情况;D:调控cRCCBM及has-miR-149-3p后M-CSF蛋白表达情况;E:构建cRCCBM野生型及突变型质粒;F:野生型及突变型cRCCBM对下游蛋白的影响;G:野生型及突变型cRCCBM对BMMs细胞分化的影响(WT.野生型,MT.突变型)。
图6为本发明一实施例中NR3C4/cRCCBM/M-CSF致癌轴驱动小鼠肾癌细胞骨转移示意图;
A:IVIS检查显示不同组别肿瘤大小情况。B:沉默NR3C4组可见明显的局部骨组织破坏(红色箭头所示)。C:小鼠肿瘤组织学AlcianBlue/OrangeG&TRAP+染色及M-CSF蛋白的IHC染色情况。
图7:NR3C4/cRCCBM/has-miR-149-3p/M-CSF轴介导的BMMs增殖及向破骨细胞分化作用可促进肾细胞癌骨转移。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。若未特别指明,实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,可以参照《分子克隆实验指南》第3版或者相关产品进行,所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法,所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者,均在首次出现时标明,其后所用相同试剂如无特殊说明,均以首次标明的内容相同。
本发明为一种环状非编码RNA(cRCCBM)在肾癌骨转移早期诊断及治疗中的应用。
实施例1:
1.材料与方法
1.1动物
所有动物研究均获得上海交通大学实验动物管理及使用委员会的批准。所有小鼠均保持无病原体状态,并根据上海交通大学医学院附属仁济医院的动物伦理道德规范进行管理。除非另有说明,实验小鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,肿瘤种植后定期行小动物活体成像(IVISSpectrum)监测及X线检查(X-ray),4周后处死小鼠。随后给予转移组织行特定染色。病理诊断由两位病理医师独立完成。本研究所有小鼠的遗传背景均为Balb/c雄性裸鼠。
1.2细胞培养
人肾癌细胞系SW839,786-O,Caki-1,ACHN购自美国模式菌种收集中心(ATCC),OS-RC-2细胞购自国家实验细胞资源共享平台(NICLR)。在含10%胎牛血清(FBS)、100mg/mL链霉素(Invitrogen)和100U/mL青霉素的DMEM培养基中培养,以上细胞均于37℃、5%CO2的潮湿培养箱中培养。
1.3质粒插入慢病毒
依照氯化钙转染方法,HEK293T细胞用目标质粒(pLKO-has-miR-149-3p、pLKO-shM-CSF、pLKO-shcRCCBM、pLKO-shNR3C4、pWPI-NR3C4或pWPI-cRCCBM)和封装质粒(psPAX2和pMD2.G)转染。收集、浓缩慢病毒培养基并储存在-80℃冰箱。环状非编码RNA-hsa_circRNA_400037(cRCCBM)的序列经PCR扩增后插入到空载的pBSK(Addgene)载体中成为pBSK_cRCCBM,利用引物(正义:5'-GTGAGGAATTTCGACATTTAAATTTAAAAGTGCTGAATTACAGGCG-3',反义:5'-TCCTGCAGCCCGTAGTTTTGCTGGGATTACAGGTGTGA-3')将特定片段克隆到pWPI载体中。所有引物及片段序列见序列表。
1.4RNA提取和定量RT-qPCR测定
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从组织或细胞中提取总RNA。使用PrimeScriptRT试剂盒(TaKNR3C4a)在标准条件下使用随机引物将RNA(1mg)逆转录成最终体积为20mL。使用SYBRPremixExTaq(TaKNR3C4a)进行实时PCR分析。cRCCBM(引物:正义:5'-TGCTACTTGAAAACTACCAGCCA-3'(SEQIDNO:2),反向5'-AACAGCACAGCTATGACCTTGA-3'(SEQIDNO:3)和M-CSF(引物:正向5'-GAAGGAGGACCAGCAAGTG-3'(SEQIDNO:4),反向5'-GTTCCACCTGTCTGTCATCC-3'(SEQIDNO:5))的水平根据甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达进行标准化。RT-qPCR和数据收集是在ABI7500实时PCR系统(AppliedBiosystems)上进行的。分析RT-qPCR结果并相对于阈值循环(Ct)值进行表达,然后转换为倍数变化。
1.5蛋白免疫印迹测定和抗体
用RIPA提取试剂裂解细胞,该试剂补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)。细胞蛋白裂解物用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,转移到0.22mm的聚偏二氟乙烯膜(Millipore)上,并用特异性抗体进行探测。通过ECL生色底物检测特定条带。GAPDH、β-actin抗体用作对照。GAPDH,雄激素受体(NR3C4)的抗体购自SantaCruzBiotechnology,集落刺激因子1(M-CSF)抗体购自GeneTex。
1.6细胞分化和增殖试验
提取雄性小鼠大腿骨髓,将骨髓接种至24孔板中72小时,培养基中包含30%条件培养基及PTH(100ng/ml)。培养5-7天后使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP+)进行染色,并用Image-proPlus(MediaCybernetics)软件进行计数。噻唑蓝(MTT)实验用于分析BMMs细胞的增殖。在特定时间在细胞培养液中加入MTT试剂,37℃保温孵育2h,结束前加入DMSO溶解晶体,并于450nm处测定吸光度。每个样品均重复三次。
1.7统计分析
软件SPSS 23.0(SPSS Inc)和Graphpad Prism V6(GraphPad SoftwNR3C4e)用于处理所有统计分析。计量数据统计指标用平均数±标准差来表示数。对于两组独立计量数据,使用t检验进行统计分析;大于两组的独立计量数据,使用方差分析及Dunnett检验的进行统计分析;当P≤0.05时,统计结果被认为是有意义的。
2结果
2.1 NR3C4负向调控肾癌细胞的增殖及向破骨细胞分化
我们通过免疫组织化学(IHC)的方法检测了NR3C4的表达情况,结果显示NR3C4在肾组织中低表达,在NR3C4阳性的肾癌组织中高表达,而在肾癌骨转移(RBM)中显著低表达(图1A、B)。为了进一步明确肾癌骨转移(RBM)中NR3C4表达下调,我们通过分析GEO数据库中GSE72304数据集,选取样本中非骨转移标本与骨转移标本进行对照,结果显示骨转移样本中NR3C4 mRNA表达显著降低(图1C)。沉默SW839肾癌细胞NR3C4后,肾癌细胞的条件培养基(CM)可明显促进BMMs的细胞增殖(图1D)及向破骨细胞分化(图1E);过表达OS-RC-2肾癌细胞NR3C4后,肾癌细胞CM可明显抑制BMMs的细胞增殖(图1F)及向破骨细胞分化(图1G)。
2.2 cRCCBM在肾癌骨转移(RBM)组织中上调
通过基因芯片检测肾癌原发灶与骨转移灶的circRNA表达差异,检测包含大约13600个circRNA,发现746个circRNA表达上调,1138个circRNA表达下调。然后通过生物信息学筛选,选择表达量大于100、变化倍数大于3.8倍的且P值小于0.05的circRNA(图2A)。为了进一步缩小候选基因的范围,我们选择了高表达的16个circRNA和低表达的16个circRNA进行下一步筛选(图2A)。我们选择在SW839细胞系中沉默NR3C4,在OS-RC-2细胞系中过表达NR3C4,然后通过qRT-PCR检测circRNA的表达情况。结果显示有5个circRNA明显受NR3C4调控,其中3个表现为被NR3C4抑制,2个表现为被NR3C4促进(图2B)。
2.3 cRCCBM促进肾细胞癌(RCC)细胞骨转移
调控NR3C4的同时干扰circRNA的表达,观察circRNA的改变是否可以逆转调控NR3C4所产生的表型。结果显示在NR3C4相对表达高的SW839细胞中沉默NR3C4后,骨髓巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化的数量明显增多,再分别沉默5个circRNA后可见,仅沉默cRCCBM后破骨细胞数量减少明显(图3A);相反,在相对低表达NR3C4的OS-RC-2细胞中过表达NR3C4后,BMMs向破骨细胞分化的数量明显减少,过表达cRCCBM可回复由调控NR3C4所至的破骨细胞数量改变(图3B)。同样,我们发现在SW839细胞中沉默NR3C4后,BMMs细胞增殖明显增多,再沉默cRCCBM后BMMs细胞增殖数量减少明显(图3C);相反,在OS-RC-2细胞中过表达NR3C4后,BMMs细胞增殖数量明显减少,过表达cRCCBM可回复由调控NR3C4所至细胞增殖改变(图3D)。
2.4 M-CSF调控BMMs细胞增殖及破骨细胞分化
qRT-PCR实验证明,在NR3C4相对高表达的SW839细胞中沉默NR3C4后,多种破骨激活因子的mRNA水平无变化,在相对低表达NR3C4的OS-RC-2细胞中过表达NR3C4后,仅有IL6的mRNA明显升高,但综合两个细胞系的结果可知,NR3C4对多种肿瘤细胞源性破骨激活因子mRNA水平无影响(图4A)。Western-blot检测结果提示M-CSF蛋白水平表达受NR3C4的负向调控(图4B)。选用抗体中和实验验证M-CSF在我们研究体系中的作用。结果显示,在SW839细胞中沉默NR3C4后,BMMs向破骨细胞分化的数量明显增多,加入M-CSF中和抗体后破骨细胞数量减少明显(图4C)。进一步我们检测NR3C4/cRCCBM对下游M-CSF蛋白水平的调节,Western-blot检测结果显示,在NR3C4相对表达高的SW839细胞中沉默NR3C4后,M-CSF蛋白表达增加;再同时沉默cRCCBM时,可回复由调控NR3C4所至的M-CSF增加(图4D);相反,我们选用在相对低表达NR3C4的OS-RC-2细胞中过表达NR3C4后,Western-blot检测可见M-CSF蛋白表达被抑制,而同时过表达cRCCBM时,可回复由调控NR3C4所至的M-CSF减少(图4E)。
2.5 cRCCBM通过ceRNA机制结合has-miR-149-3p进而调控靶基因M-CSF表达
我们通过多种miRNA预测网站(TNR3C4getScan:http://www.tNR3C4getscan.org、miRDB:http://www.mirdb.org/、miRwalk:http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de),结合cRCCBM自身序列特征,将结果取交集,选取14个候选miRNA做后续实验(图5A)。通过circRNA-miRNA pulldown实验,在候选miRNA中检测能与cRCCBM结合的miRNA。结果显示,相比于对照组,circRNA探针组有3个候选miRNA与circRNA结合明显增多(图5B)。通过生物信息学预测及RNA pull-down实验筛选出3个候选miRNA。首先构建3个miRNA的过表达质粒,在SW839细胞中,沉默NR3C4后观察M-CSF蛋白表达增高,同时分别转染3个过表达的miRNA质粒,结果显示,仅有has-miR-149-3p对NR3C4的作用有明显的回复作用,即使M-CSF蛋白表达下降(图5C)。进一步,我们构建沉默has-miR-149-3p的质粒,即has-miR-149-3p的抑制剂,验证对其对cRCCBM的回复作用。选择OS-RC-2细胞,沉默cRCCBM后观察M-CSF蛋白表达降低,同时转染沉默has-miR-149-3p质粒,结果显示,沉默has-miR-149-3p对cRCCBM的作用有回复作用,即使M-CSF蛋白表达增加(图5D)。
我们已经证明cRCCBM可以通过ceRNA机制与下游M-CSF蛋白竞争性结合has-miR-149-3p。但具体的结合部位及真实性需进一步证实。通过RNA22网站(https:// cm.jefferson.edu/tools/)寻找两者的结合位点,并构建野生型(Wildtype)和结合位点突变型(Mutant)质粒(图5E)。进一步,我们需要验证突变型circRNA是否对下游蛋白表达及表型有影响。在OS-RC-2细胞中,转染circRNA野生型质粒可见M-CSF蛋白表达增加,而突变型质粒对M-CSF蛋白表达无明显作用(图5F);同时,转染circRNA野生型质粒后肾癌细胞条件培养基可使BMMs破骨分化增加,而突变型无此作用(图5G)。
2.6 NR3C4/cRCCBM/M-CSF致癌轴驱动小鼠肾癌细胞骨转移
16只NSG小鼠平均分为4组,每组4只。Luciferase标记的OS-RC-2肾癌细胞分别转染pLKO.1、sh-NR3C4、sh-cRCCBM及sh-NR3C4+sh-cRCCBM质粒,分别种植到胫骨骨髓腔内,4周后IVIS检测肿瘤大小。结果显示沉默NR3C4组肿瘤体积明显大于pLKO.1对照组,而同时沉默cRCCBM组未见肿瘤有明显增加(图6A)。小动物X-Ray检查显示沉默NR3C4组可见明显的局部骨皮质破坏(图6B)。对肿瘤标本进行AlcianBlue/OrangeG&TRAP+染色及IHC染色,结果显示沉默NR3C4后,肿瘤组织中M-CSF表达增高、破骨细胞及骨破坏增加;同时沉默cRCCBM可部分回复由于沉默NR3C4所产生的下游蛋白的变化(图6C)。这些发现表明,NR3C4/cRCCBM/M-CSF为促进肾细胞癌骨转移的信号轴,具有临床早期诊断及治疗潜力。
综合上述,我们可以得知:
cRCCBM在肾癌骨转移组织中高度上调,并伴有不良预后,促进了肾癌细胞的体外迁移及其在体内的转移。功能丧失和功能增强试验表明,cRCCBM受NR3C4调控,可通过ceRNA机制吸附has-miR-149-3p发挥作用,阻止了其与M-CSF mRNA的结合,从而促进肾癌细胞的生长及侵袭能力。总之,我们的结果表明,cRCCBM是肾细胞癌进展的驱动力,可作为肾癌骨转移的早期诊断标志物或治疗靶标,cRCCBM可以在肾癌骨转移的诊断和治疗中进行应用,cRCCBM可以在制备肾癌骨转移早期诊断试剂盒中进行应用;
在RCC细胞中过表达cRCCBM可增加RCC细胞的骨侵袭能力;体内沉默cRCCBM表达,明显抑制了肾细胞癌定向骨侵袭的能力,使小鼠中肿瘤骨转移的发生率显著降低。因此,cRCCBM抑制剂可作为治疗RBM的药物
在RCC细胞中下调M-CSF的表达,降低了RCC细胞的骨侵袭能力;体内实验发现具有较高骨组织侵袭力的肾癌组织中M-CSF表达高,因此,M-CSF的抑制剂可作为治疗RBM的药物。
以下为相关序列表:
cRCCBM序列(SEQIDNO:1)
200DNA智人(Homo sapiens)
GCTTCTCTGGTCCTCTTTCTTCCTGGCTTTGTTTCTTCCCTTTGAATGTGTCTACCTCTTCCTTCTCATTTATCTGCCCTCCACTCCTTTCTTTCTCATCTGTTTCTCCATCTTAGTTTGCCACGATATTGATGTGAAGTATAGTTGACAGTATTTGTCCAATTTATTGAACACTCAAGTGTTTCCTAATGTTATCTCAA
cRCCBM引物:
23DNA人工序列(NR3C4tificial Sequence)
正义:5'-TGCTACTTGAAAACTACCAGCCA-3'(SEQIDNO:2)
22DNA人工序列(NR3C4tificial Sequence)
反义:5'-AACAGCACAGCTATGACCTTGA-3'(SEQIDNO:3)
M-CSF引物:
19DNA人工序列(NR3C4tificial Sequence)
正义:5'-GAAGGAGGACCAGCAAGTG-3'(SEQIDNO:4)
20DNA人工序列(NR3C4tificial Sequence)
反义:5'-GTTCCACCTGTCTGTCATCC-3'(SEQIDNO:5))
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州大学附属第一医院
<120> 一种环状非编码RNA在肾癌骨转移早期诊断及治疗中的应用
<130> 11
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 200
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gcttctctgg tcctctttct tcctggcttt gtttcttccc tttgaatgtg tctacctctt 60
ccttctcatt tatctgccct ccactccttt ctttctcatc tgtttctcca tcttagtttg 120
ccacgatatt gatgtgaagt atagttgaca gtatttgtcc aatttattga acactcaagt 180
gtttcctaat gttatctcaa 200
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> NR3C4tificial Sequence
<400> 2
tgctacttga aaactaccag cca 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> NR3C4tificial Sequence
<400> 3
aacagcacag ctatgacctt ga 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> NR3C4tificial Sequence
<400> 4
gaaggaggac cagcaagtg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> NR3C4tificial Sequence
<400> 5
gttccacctg tctgtcatcc 20
Claims (4)
1.用于检测cRCCBM的试剂在制备肾癌骨转移早期诊断试剂盒中的应用,所述cRCCBM的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述肾癌骨转移早期诊断试剂盒的诊断原理是基于NR3C4/cRCCBM/has-miR-149-3p/M-CSF促进肾癌骨转移的信号通路轴。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述肾癌骨转移早期诊断试剂盒的检测样品为肾癌组织。
4.具有cRCCBM抑制作用的试剂在制备治疗肾癌骨转移的药物中的应用。
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CN109476718A (zh) * | 2016-05-18 | 2019-03-15 | 莫得纳特斯公司 | 编码免疫调节多肽的mrna的组合及其用途 |
CN110643711A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-01-03 | 广州医科大学附属第二医院 | 前列腺癌骨转移的生物标志物 |
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2021
- 2021-10-28 CN CN202111264939.5A patent/CN114231624A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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